FI81116C - Metod foer tillverkning av cyklodextriner innehaollande maltodextriner, staerkelse- och maltossiraper. - Google Patents

Description

1 81116

Menetelmä syklodekstriinejä sisältävien maltodekstriinien ja tärkkelys- ja maltoosisiirappien valmistamiseksi

Keksinnön kohteena on syklodekstriinejä (CD) sisältävien 5 maltodekstriinien ja tärkkelys- ja maltoosisiirappien valmistusmenetelmä. Keksinnön mukaisessa valmistusmenetelmässä immobilisoidun syklomaltodekstriiniglukanotransferaasin (CGTaasi; E.C. 2.4.1.19) annetaan vaikuttaa esiprosessoituun (esimerkiksi happohydrolyysillä tai entsyymeillä pilkottuun) tärkkelykseen, 10 mahdollisesti etanolin läsnäollessa, jolloin muodostuu sokerikoostumukseltaan ainutlaatuista, CD:jä sisältävää maltodekstriiniä, tärkkelys- tai maltoosisiirappia.

CD:t ovat rengasmaisen molekyylirakenteen omaavia useista glukoosiyksiköistä muodostuneita sokereita. Kuten japanilaisissa 15 patenttijulkaisuissa J2 20,373. 75 63,189 ja 75 88,290 ja Hans Benderin julkaisussa (1977) Arch. Microbiol., Ill, 271-282 on esitetty CGTaasia tuottavat sekä Bacillus -suvun bakteerit, kuten Bacillus macerans. Bacillus megaterium. Bacillus circulans, Bacillus polymyxa ja Bacillus stearothermophilus että Klebsiella -suvun bakteerit, kuten Klebsiella 20 pneumoniae. Entsyymin vaikuttaessa tärkkelykseen muodostuu rengaskooltaan erilaisia CD:jä, joita nimitetään alfa-, beta- ja gammamuodoiksi sisältämiensä 6, 7 ja 8 glukoosiyksikön perusteella.

CD:ien merkitys perustuu niiden kykyyn muodostaa nk. inkluusiokomplekseja pienimolekyylisten yhdisteiden kanssa. 25 Pienimolekyyliset yhdisteet tulevat näin "paketoiduksi" sokerin sisälle ja suojatuiksi mm. ei-toivotuilta kemiallisilta reaktioilta. Tämän erityisominaisuutensa ansiosta CD:ien käyttösovellutukset ovat leviämässä useille eri aloille kattaen mm. elintarvike-, lääke-, väriaine-, saniteetti-, paperi- ja maatalouskemian teollisuudet. Näistä 30 elintarviketeollisuutta voidaan pitää yhtenä merkittävimmistä osa- alueista, sillä CD:t soveltuvat esimerkiksi suojaamaan aromeja tai vitamiineja valon, hapen tai lämmön vaikutukselta, estämään haihtumista, poistamaan haitallisia yhdisteitä tuotteista (paha haju tai maku) tai vähentämään tuotteen hygroskooppisuutta. CD:jä voidaan hyväksyttävästi 35 käyttää elintarvikkeissa Japanissa ja lainsäädäntö on kehittymässä 2 81116 siihen suuntaan, että ne sallittaisiin myös muissa maissa (Cyclodextrin News (1986), 1, (2), 2).

CD:ien valmistuksen yhteydessä syntyy CD:jä sisältäviä sokeriseoksia, joiden makeus ja sokerikoostumus ovat erilaisia kuin 5 keksinnön kohteena olevassa menetelmässä. Näiden valmistus on esitetty J. Szejtli'n toimittamassa kirjassa Proceedings of the First International Symposium on Cyclodextrins (1982), Akademiai Kiadö, Budapest, 25~40. Menetelmä perustuu tärkkelyksen pilkkomiseen liukoisella CGT-aasilla. Beta-CD:n kiteytyksen jälkeen saadaan 10 sokeriseos, joka sisältää lähinnä glukoosia, maltoosia sekä CD:jä.

Menetelmän haittapuolena on se, että entsyymit joudutaan poistamaan tuotteesta aktiivihiilikäsittelyn ja ioninvaihtimien avulla, joten prosessi on varsin työläs ja epätaloudellinen,

Immobilisoidun CGTaasin käyttöä CD:ien valmistamiseen on kuvattu 15 sekä patenttijulkaisuissa (japanilaiset patentit no:t 71 09.223 ja 80 124,494 ja saksalainen patentti no. 3.330.571) että tieteellisissä aikakauslehdissä (Nakamura N. ja Horikoshi K. (1977). Biotechnol. Bioeng., lf), 87_99; Ivony K., Szajäni B. ja Seres G. (1983). J. Appi. Biochem., 158-164; Kato T. ja Horikoshi K. (1983). Biotechnol. 20 Bioeng., 26, 595-598). Teknisten vaikeuksien, kuten viskositeetti- ja diffuusioesteiden vuoksi on käytetty yleensä suhteellisen alhaisia tärkkelyskonsentraatioita (2-4 %) ja viskositeettia on joissakin tapauksissa alennettu esihydrolyysillä alhaiseen DE-lukuun (S.P. Crump ja J.D. Rozzell, esitelmä kongressissa 4th International Symposium on 25 Cyclodextrins, 20-22.4.1988, Mlinchen, Saksan Liittotasavalta).

Immobilisoidun CGTaasin käyttöä keksinnön kohteena olevan menetelmän tavoin ts. korkean DE-luvun omaavien tärkkelyssiirappien käyttämistä reaktion lähtöaineena ei ole aikaisemmin kuvattu. Käsittelyn tuloksena saadaan CD:jä sisältäviä korkean DE-luvun siirappeja.

30 Edellä mainituista syistä on päädytty hakemuksen mukaiseen keksintöön, jolle on tunnusomaista päävaatimuksessa esitetyt seikat.

Keksinnön perusajatuksen muodostaa se, että immobilisoidun CGTaasin on havaittu muodostavan esiprosessoidusta tärkkelyksestä (maltodekstriineistä, tärkkelys- ja maltoosisiirapeista DE-luvultaan 35 5-60) sopivissa olosuhteissa CD: jä sisältäviä sokeriliuoksia. Keksinnön mukaisessa menetelmässä on mahdollisuus jatkuvaan prosessiin ja se 3 81116 voidaan lisätä jatkokäsittelyvaiheeksi ennestään käytettyihin sokerisiirappien valmistusprosesseihin. Menetelmän avulla säästetään entsyymin käyttökustannuksissa ja kyetään lisäämään CD:ien määrää tuotteessa. Menetelmän etuna on myös se, että entsyymiproteiini ei jää 5 tuotteeseen, joten ylimääräisiä puhdistusvaiheita ei tarvita. Erilaisten parametrien, kuten lämpötilan, immobilisaatioasteen, substraattiliuoksen ja siinä olevan etanolin konsentraation DE-luvun ja virtausnopeuden sopivalla säätelyllä voidaan ohjata muodostuvan tuotteen koostumusta. Lisäksi saadaan aikaan uudenlaisia tuotteita, joita ei kyetä 10 valmistamaan lisäämällä CD:jä jälkikäteen tärkkelys- tai maltoosisiirappeihin, sillä CGTaasi muuttaa samalla esiprosessoidun tärkkelyksen koostumusta tyypillisesti siten, että DP-lukua 10 suurempien polysakkaridien osuus vähenee ja toisaalta alle DP-luvun 10 olevien sokerien väliset konsentraatioerot tasaantuvat. Vaikutukset 15 tuotteen makeuteen ja pelkistävien sokerien määrään ovat vähäiset.

Taulukossa I on esitetty maltodekstriinin (DE 20) ja tärkkelyssiirapin (DE 30) koostumus natiivina ja reagoituaan immobilisoidun CGTaasin kanssa. Valmisteiden koostumukset määritettiin nestekromatografisesti. Menetelmällä kyetään mittaamaan alle DP-luvun 8 omaavien sokerien ja 20 CD:ien pitoisuudet. Tuotteeseen muodostuvat CD-määrät (1-10 %) ovat samaa luokkaa kuin elintarvikkeiden yhteydessä normaalisti käytetään (kirjassa Cyclodextrins and Their Inclusion Complexes (1982), J. Szejtli (toim.), Akad6miai Kiadö, Budapest, s. 236-255)·

Keksinnössä tarvittavaa CGTaasia tuotetaan kasvattamalla kyseistä 25 entsyymiä muodostavaa mikro-organismia, esimerkiksi tiettyjä Bacillus- tai Klebsiella -sukuisia bakteereja kasvuliuoksessa, joka sisältää hiili- ja typpilähteen, mineraaleja ja vitamiineja. Muodostuva CGTaasi otetaan talteen käyttäen tunnettuja menetelmiä, kuten kasvuliuoksen sentrifugointi tai suodatus. Näin taltioitu raakaentsyymi voidaan 30 puhdistaa ja konsentroida esimerkiksi ulossuolauksella, dialyysillä, adsorptiolla ja desorptiolla tärkkelykseen, geelisuodatuksella ja/tai ioninvaihtokromatografisesti tai affiniteettikromatografisesti.

Raakaentsyymi tai suositeltavimmin puhdistettu ja konsentroitu CGTaasi voidaan immobilisoida käyttäen olemassaolevia menetelmiä, kuten 35 sitomalla entsyymi kiinteään kantajaan, esimerkiksi kovalenttisesti, adsorptiolla tai ioninvaihtovoimin. Kiinteiksi kantajiksi soveltuvat 4 81116 erilaiset luonnossa esiintyvät tai synteettisesti valmistetut orgaaniset makromolekyylit, kuten selluloosa, agaroosi, polyakryyliamidi, polyetyleeniglykoli ja polystyreeni tai epäorgaaniset yhdisteet, kuten piimää ja lasi. Immobilisointi voidaan suorittaa olosuhteissa, joissa 5 CGTaasin efektiivinen aktiivisuus reaktion jälkeen säilyy, esimerkiksi pH-alueella 4-10 ja lämpötila-alueella < 90°C.

Menetelmässä voidaan käyttää alkuperältään erilaisia tärkkelysmateriaaleja esimerkiksi viljaperäisiä, kuten ohra- ja vehnätärkkelystä tai juuresperäisiä, kuten perunatärkkelystä. Tärkkelys 10 esiprosessoidaan esimerkiksi happohydrolyysillä ja/tai entsymaattisesti TAULUKKO I: Maltodekstriinin (DE 20) ja tärkkelyssiirapin (DE 30) koostumus natiivina ja reagoituaan immobilisoidun CGTaasin kanssa (*) 15 määritettynä nestekromatografisesti. MD 20* kuvaa esimerkin 4 ja TS 30* esimerkin 5 mukaisesti valmistetun sokeriliuoksen koostumusta, kun substraattiliuos ei sisällä etanolia.

MD 20 MD 20* TS 30 TS 30* 20 _ _ SOKERIEN MÄÄRÄ {%) glukoosi 5.2 4.1 3*9 6.9 maltoosi 4.7 5.8 10.4 9-2 25 maltotrioosi 4.8 6.1 11.4 8.9 maltotetraoosi 4.6 6.0 7·0 8.1 maltopentaoosi 4.3 5*3 10.2 7.0 maltoheksaoosi 3*8 4.2 14.4 5*5 maltoheptaoosi 3*2 3-7 3*2 3-7 30 alfa-CD - 0.8 - 0.4 beta-CD - 3.1 - 1.7 gamma-CD - 0.7 “ 0.3 siten, että muodostuvan nesteytetyn tärkkelyksen dekstroosiekvivalentti 35 on alueella 5“60.

Immobilisoidun CGTaasin kanssa reagoivan esiprosessoidun tärkkelyksen konsentraatio tulee olla alueella 5_1*0 %. Substraatti 5 81116 voidaan liuottaa joko veteen tai puskuriin, esimerkiksi 100 mM imidatsolipuskuriin pH 6.8, johon on lisätty 5 ®M CaCl2. Annettaessa substraatin reagoida ioninvaihtimiin adsorboidun CGTaasin kanssa ei puskureita tule yleensä käyttää. Reaktio voidaan suorittaa 20-70°C:ssa.

5 Lisäämällä substraattiliuokseen etanolia, kunnes sen pitoisuus on korkeintaan 50 tilavuus-#, CD:ien määrä tuotteessa nousee olennaisesti. Samalla eri CD-muotojen välinen tasapaino muuttuu. Kun etanolin määrä on riittävän suuri, on muodostuva tuote steriili, ollen näin vähemmän herkkä mikrobikontaminaatioille. Etanolin läsnäollessa tuotettuja CD: jä 10 sisältäviä tärkkelys- ja maltoosisiirappeja voidaan suoraan lisätä joihinkin tuotteisiin, esimerkiksi likööreihin. Keksinnön mukaisella menetelmällä saadaan uusi maltodekstriini-, tärkkelys- tai maltoosisiirappi, joka edullisesti sisältöä syklodekstriinejä 2.0-16 % ja lyhyitä malto-oligosokereita 30-60 %.

15 Keksinnön mukaiset koostumukset on selostettu tarkemmin seuraavissa taulukoissa II-VI.

6 81116 TAULUKKO II. Maltodekstriinin (DE 20; 100 g/i) ja tärkkelyssiirapin (DE 30; 100 g/1) koostumukset natiivina (1) ja reagoituaan Sepharose 4B geeliin immobilisoidun CGTaasin ilman etanolia (2) ja kun reaktioseokseen oli lisätty 15 t-% etanolia (3). Sokerien (alle DP-luvun 5 8) pitoisuudet määritettiin nestekromatografisesti (kts. esimerkit 4 ja 5).

MD 20 TS 30 SOKERI (g/1) _ ___ 10 12 3 12 3 glukoosi 5*2 4.1 4.6 3*9 6.9 6.9 maltoosi 4.7 5-8 6.2 10.4 9-2 10.0 maltotrioosi 4.8 6.1 6.0 11.4 8.9 9*1 15 maltotetraoosi 4.6 6.0 5*5 7*0 8.1 7-7 maltopentaoosi 4.3 5·3 4.7 10.2 7*0 6.4 maltoheksaoosi 3*8 4.2 4.4 14.4 5-5 4.9 maltoheptaoosi 3*2 3·7 3·2 3·2 3·7 3·! alfa-CD 0.0 0.8 0.2 0.0 0.4 0.1 20 beta-CD 0.0 3-1 9-5 0.0 1.7 4.9 gamma-CD 0.0 0.7 1.0 0.0 0.3 0.3 7 81116 TAULUKKO III. Maltodekstriinin (DE 20; 100 g/1) ja tärkkelyssiirapin (DE 30; 100 g/1) koostumukset natiivina (1) ja reagoituaan Serdolit AW-14 geeliin immobilisoidun CGTaasin kanssa ilman etanolia (2) ja kun reaktioseokseen oli lisätty 15 t-% etanolia (3) · Sokerien (alle DP-luvun 5 8) pitoisuudet määritettiin nestekromatografisesti (kts. esimerkki 7)· MD 20 TS 30 SOKERI (g/1) _ _ 12 3 12 3 10____ glukoosi 5*2 4.3 4.7 3*9 6.2 5.8 maltoosi 4.7 5*6 5*8 10.4 10.4 10.0 maltotrioosi 4.8 5·7 5·6 11.4 10.0 9-4 maltotetraoosi 4.6 5*3 5*1 7-0 9.2 7.8 15 maltopentaoosi 4.3 4.9 4.5 10.2 8.4 8.1 maltoheksaoosi 3·8 3·8 3·7 14.4 6.6 7-0 maltoheptaoosi 3·2 3·0 2.8 3-2 4.1 3-9 alfa-CD 0.0 0.2 0.1 0.0 0.2 0.0 beta-CD 0.0 2.3 3-3 0.0 1.6 2.2 20 gamma-CD 0.0 0.6 0.4 0.0 0.4 0.2 e 81116 TAULUKKO IV: Maltodekstriinin (DE 20) konsentraation vaikutus muodostuvan syklodekstriinituotteen koostumukseen. Substraattiliuoksen annettiin reagoida Sepharose 4B geeliin immobilisoidun CGTaasin kanssa (esimerkki 2). Virtausnopeus 60 ml/h, 25°C, reaktiopylvään halkaisijan 5 suhde korkeuteen 1:6.5· Sokerien (alle DP-luvun 8) pitoisuudet määritettiin nestekromatografisesti.

SOKERI md 20 (%) {% totaalisokeri- _ 10 pitoisuudesta) 5 10 15 glukoosi 4.6 4.6 4.7 maltoosi 6.6 6.9 6.9 maltotrioosi 6.6 7·1 7-3 15 maltotetraoosi 6.4 6.9 7-4 maltopentaoosi 5·6 5·9 6.8 maltoheksaoosi 5·0 5·5 6.1 maltoheptaoosi 3*4 4.1 4.5 alfa-CD 2.0 0.7 0.7 20 beta-CD 4.2 2.9 2.5 gamma-CD 1.2 0.6 0.3 i 9 81116 TAULUKKO V: Syklodekstriinisiirapin koostumus annettaessa maltodekstriinin (DE 20; 50 g/1) reagoida Sepharose 4B geeliin immobilisoidun CGTaasin (esimerkki 2) kanssa lämpötila-alueella 25-70°C. Reaktiopylvään halkaisijan suhde korkeuteen 1:6.5, virtausnopeus 60 5 ml/h. Sokerien (alle DP-luvun 8) pitoisuudet määritettiin nestekromatografisesti.

LÄMPÖTILA (°C) SOKERI (g/1) _ 10 25 40 50 60 70 glukoosi 2.5 2.3 2.2 2.3 4.1

maltoosi 3.3 3.1 3.0 3-1 M

maltotrioosi 3*3 3*1 3-1 3.1 4.3 15 maltotetraoosi 3-5 3*5 2.9 2.9 4.2 maltopentaoosi 3*1 3*0 3.0 2.8 4.0 maltoheksaoosi 2.6 2.3 2.1 2.1 3*6 maltoheptaoosi 1.8 1.2 1.4 1.5 2.9 alfa-CD 0.4 0.6 0.8 0.8 0.2 20 beta-CD 3.1 3.2 3.1 3.3 2.6 gamma-CD 0.6 0.7 0.7 0.7 0.6 10 81116 TAULUKKO VI: Etanolikonsentraation vaikutus maltodekstriinistä (MD 20; 100 g/1) muodostuvan syklodekstriinisiirapin koostumukseen.

Substraattiliuoksen annettiin reagoida Sepharose 4B geeliin immobilisoidun CGTaasin kanssa (esimerkki 2). Virtausnopeus 60 ml/h, 5 25°C, reaktiopylväön halkaisijan suhde korkeuteen 1:6.5· Sokerien (alle DP-luvun 8) pitoisuudet määritettiin nestekromatografisesti.

ETANOLI {t-%) SOKERI _ 10 (g/1) 5 10 15 glukoosi 4.2 4.6 4.8 maltoosi 6.2 6.3 6.3 maltotrioosi 6.4 7·7 6.1 15 maltotetraoosi 6.2 6.1 6.1 maltopentaoosi 5*2 5*5 5*8 maltoheksaoosi 4.3 4.6 4.6 maltoheptaoosi 3*1 2.9 2.8 alfa-CD 0.0 0.0 0.0 20 beta-CD 5.2 8.0 10.7 gamma-CD 0.6 0.9 1.2 CD:jä sisältävät tärkkelys- ja maltoosisiirappiliuokset voidaan 25 konsentroida tai kuivata käyttäen tunnettuja menetelmiä. Saatua siirappia tai jauhetta voidaan käyttää erilaisissa elintarvike-, makeis-ja juomateollisuuden tuotteissa.

Esimerkki 1.

30 Bacillus circulans var. alkalophilus -kanta (ATCC 21783) siirrostettiin Horikoshi II-alustaan (Horikoshi K. (1971). Agric. Biol. Chem., 25· 1783~1791) ja kasvatettiin 37°C, ravistelussa ja ilmastuksen alaisena 3 vrk. Kasvuliuos sentrifugoitiin ja supernatantin aktiivisuudeksi mitattiin 28 U/ml maltotrioosi-metyylioranssi il 81116 menetelmällä (Mäkelä M.J. ja Korpela T.K. (1988), J. Biochem. Biophys. Methods., I5, 307-318).

CGTaasi puhdistettiin affiniteettikromatografisesti (unkarilainen patenttijulkaisu no. 175. 584) ja entsyymiliuos konsentroitiin Amicon-5 laitteistolla (membraanikalvo PM 10). CGTaasi-konsentraatin aktiivisuudeksi mitattiin 19400 U/ml spesifisen aktiivisuuden ollessa 1205 U/mg.

Esimerkki 2.

10 4 g CNBr-aktivoitua Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals,

Upsala, Ruotsi) geeliä pestiin 10'3 M HCl:lla (1000 ml). Pesty kantaja-aine sekoitettiin 0.1 M NaHC03-puskuriin (18 ml) pH 8.3. joka sisälsi 0.5 M NaCl. Suspensioon lisättiin 2 ml esimerkin 1 mukaisesti valmistettua CGTaasi-konsentraattia (32.2 mg etnsyymiä). Reaktion 15 annettiin edetä 2 tuntia huoneenlämmössä seosta samalla ravistellen.

Näin saatu immobilisoitu entsyymi suodatettiin ja pestiin perättäin kolmasti riittävällä määrällä 0.1 M asetaattipuskuria pH 4.0, joka sisälsi vastaavasti 0.5 M NaCl sekä 0.1 M tris-HCl-puskuria pH 8.0, joka sisälsi vastaavasti 0.5 M NaCl. Lopuksi immobilisoitu CGTaasi 20 huuhdottiin puhtaaksi vedellä.

Määrittämällä suodoksen ja pesuvesien proteiinipitoisuudet saatiin agaroosiin sitoutuneen CGTaasin määräksi 31-8 mg, joten sitoutumisaste oli 99 %.

25 Esimerkki 3.

5 g Serdolit AW-14 anioninvaihdinta (Serva, Heidelberg, Saksan Liittotasavalta; raekoko 0.05-0.1 mm) pestiin vuorotellen 1 M HClrlla ja 1 M NH40H:lla kolme kertaa. Regeneroitu ioninvaihdin huuhdottiin 200 mM tris-asetaatti -puskurilla pH 8.3 ja tasapainotettiin lopuksi 30 10 mM tris-asetaatti -puskurilla pH 8.3* 5 ml tasapainotettua adsorbenttia ja 4?.5 ml 10 mM tris-asetaatti -puskuria pH 8.3 sekoitettiin keskenään ja suspensioon lisättiin 2.5 ml esimerkin 1 mukaisesti valmistettua CGTaasi-konsentraattia (40.2 mg entsyymiä). Reaktioseos siirrettiin ravistelijaan, huoneenlämpöön 12 81116 vuorokaudeksi. Reaktion jälkeen immobilisoitu entsyymi suodatettiin ja pestiin riittävällä määrällä vettä.

Mittaamalla suodoksen ja pesuliuoksen proteiinipitoisuudet saatiin immobilisoidun CGTaasin määräksi 24.7 mg, joten entsyymin sitoutumisaste 5 oli 61 %.

Esimerkki 4.

Esimerkin 2 mukaisesti valmistettu immobilisoitu CGTaasi pakattiin pylvääseen, jonka halkaisijan suhde korkeuteen oli 1:6.5· 10 Maltodekstriini (DE 20; Suomen Sokeri, Jokioisten tehtaat) liuotettiin veteen (100 g/1) ja liuosta (substraattiliuos) eluoitiin huoneenlämmössä pylvään läpi virtausnopeudella 60 ml/h.

Pylvään läpi menneen liuoksen koostumus määritettiin nestekromatografisesti (Zsadon B., Otta K.H., Tudos F. ja Szejtli J. 15 (1979). J· Chromatogr., 172. 490-492) ja CD:ien kokonaismääräksi eluutioliuoksessa mitattiin 4.6 g/1 (alfa-CD: 0.8 g/1, beta-CD: 3·! g/1 ja gamma-CD: 0.7 g/1)· Käyttämällä substraattiliuosta, jossa maltodekstriini (DE 20; 100 g/1) lisättiin 15 v/v % etanoli- vesiliuokseen, mitattiin samoissa reaktio-olosuhteissa eluutioliuoksessa 20 olevien CD:ien kokonaismääräksi 10.7 g/1 (alfa-CD: 0.2 g/1, beta-CD: 9*5 g/1 ja gamma-CD: 1.0 g/1).

Esimerkki 5·

Esimerkin 2 mukaisesti valmistettu immobilisoitu CGTaasi pakattiin 25 pylvääseen, jonka halkaisijan suhde korkeuteen oli 1:6.5. Pylvään läpi eluoitiin huoneenlämmössä tärkkelyssiirapin (100 g/1; DE 30; Suomen Sokeri, Jokioisten tehtaat) vesiliuosta virtausnopeudella 60 ml/h.

Eluutioliuoksen koostumus määritettiin kuten esimerkissä 4 ja CD:ien kokonaismääräksi mitattiin 2.4 g/1 (alfa-CD: 0.4 g/1, beta-CD» 30 1.7 g/1 ja gamma-CD: 0.3 g/1). Käyttämällä substraattiliuosta, jossa tärkkelyssiirappi (DE 30; 100 g/1) lisättiin 15 v/v % etanoli- vesiliuokseen, mitattiin samoissa reaktio-olosuhteissa eluutioliuoksessa olevien CD:ien kokonaismääräksi 5.3 g/1 (alfa-CD: 0.1 g/1, beta-CD: 4.9 g/1 ja gamma-CD: 0-3 g/1)· 13 81116

Esimerkki 6.

1 ml esimerkin 1 mukaisesti valmistettua CGTaasi-konsentraattia (16.1 mg entsyymiä) immobilisoitiin 3*2 g CNBr-aktivoitua Sepharose 4B geeliä vastaavasti kuin esimerkissä 2. Entsyymin sitoutumisasteeksi 5 mitattiin 99*5 %·

Immobilisoitu CGTaasi pakattiin pylvääseen, jonka halkaisijan suhde korkeuteen oli 1:13· Pylvään läpi eluoitiin substraattiliuosta, joka koostui maltodekstriinistä (200 g/1; DE 20; Suomen Sokeri, Jokioisten tehtaat) liuotettuna etanolin 10 v/v % vesiliuokseen, virtausnopeudella 10 10 ml/h, lämpötilassa 40°C.

Eluutioliuoksen koostumus määritettiin kuten esimerkissä 4 ja CD:ien kokonaismääräksi mitattiin 6.6 g/1 (alfa-CD: 0.4 g/1, beta-CD: 5.0 g/1 ja gamma-CD: 1.2 g/1).

15 Esimerkki 7.

Esimerkin 3 mukaisesti valmistettu immobilisoitu CGTaasi pakattiin pylvääseen, jonka halkaisijan suhde korkeuteen oli 1:6.5· Pylvään läpi eluoitiin huoneenlämmössä maltodekstriinin (100 g/1; DE 20; Suomen Sokeri, Jokioisten tehtaat) vesiliuosta virtausnopeudella 10 ml/h.

20 Eluutioliuoksen koostumus määritettiin kuten esimerkissä 4 ja CD:ien kokonaismääräksi mitattiin 2.5 g/1 (alfa-CD: 0.2 g/1, beta-CD: 1.7 g/1 ja gamma-CD: 0.6 g/1). Käyttämällä substraattiliuosta, jossa maltodekstriini (DE 20; 100 g/1) liuotettiin 15 v/v % etanoli- vesiliuokseen mitattiin vastaavissa reaktio-olosuhteissa CD:ien 25 kokonaismääräksi 3*7 g/1 (alfa-CD: 0 g/1, beta-CD: 3*3 g/1 ja gamma-CD: 0.4 g/1).

Vaihtamalla substraattiliuokseksi tärkkelyssiirapin (100 g/1; DE 30; Suomen Sokeri, Jokioisten tehtaat) vesiliuos mitattiin vastaavissa reaktio-olosuhteissa CD:ien kokonaismääräksi eluutioliuoksessa 2.2 g/1 30 (alfa-CD: 0.2 g/1, beta-CD: 1.6 g/1 ja gamma-CD: 0.4 g/1). Liuottamalla tärkkelyssiirappi (DE 30; 100 g/1) etanolin 15 v/v % vesiliuokseen ja käyttämällä saatua liuosta substraattiliuoksena, mitattiin vastaavissa reaktio-olosuhteissa CD:ien kokonaismääräksi eluutioliuoksessa 2.4 g/1 (alfa-CD: 0 g/1, beta-CD: 2.2 g/1 ja gamma-CD: 0.2 g/1).

Claims (3)

1. Menetelmä syklodekstriinejä (alfa-, beta- ja/tai gammamuotoja) sisältävien siirappien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että 5-40 paino-?! esiprosessoidun tärkkelyksen, jonka dekstroosiekvivalentti 5 on alueella 5~60 liuotettuna, joko veteen, puskuriin tai näiden korkeintaan 50 tilavuus-?! etanoliliuokseen annetaan reagoida immobilisoidun syklomaltodekstriiniglukanotransferaasin (E.C. 2.4.1.19) kanssa, jolloin saadaan maltodekstriini-, tärkkelys- tai maltoosisiirappi, joka sisältää edullisesti syklodekstriinejä 2.0-16 % 10 ja lyhyitä malto-oligosokereita 30-60 ?!.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuottamalla lähtöaine joko veteen tai puskuriin saadaan maltodekstriini-, tärkkelys- tai maltoosisiirappi, joka sisältää 15 edullisesti glukoosia 4.1-8.2 ?!, maltoosia 5.6-10.4 %, maltotrioosia 5.7_10.0 ?!, maltotetraoosia 5·3“9·2 ?!, maltopentaoosia 4.9-8.4 ?!, maltoheksaoosia 3.7-7-2 ?!, maltoheptaoosia 2.9-4.5 ?!. alfa- syklodekstriiniä 0.4-2.0 ?!, beta-syklodektriiniä 1.6-6.6 ?! ja gamma-syklodekstriiniä 0·3“1·4 ?!. 20

3· Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuottamalla lähtöaine joko veden tai puskurin korkeintaan 50 tilavuus-?! etanoliliuokseen saadaan maltodekstriini-, tärkkelys- tai maltoosisiirappi, joka sisältää edullisesti glukoosia 4.2-6.9 ?!, 25 maltoosia 5-3-10.0 ?!, maltotrioosia 5-6-9-4 ?!, maltotetraoosia 5-1“ 7-8 ?!, maltopentaoosia 4.5-8.1 ?!, maltoheksaoosia 2.8-4.6 ?!, maltoheptaoosia 2.8-3,9 X. alfa-syklodekstriiniä 0.0-0.2 ?!, beta-syklodektriiniä 2.2- 10.7 % ja gamma-syklodekstriiniä 0.2-1.2 ?!. is 81116