FI71167C - Foerfarande foer framstaellning av d-mandelsyrakarbamat - Google Patents

Description

1 71167

Menetelmä D - m a n t e l i h a p p o !< a r h n m a a t . i n v a l m i r> t. a m i a e k n i Förfarande för framställninq av D-mnndelsyrakarbamat

Keksinnön kohteena on menetelmä D-mantelihappokarba-maatin valmistamiseksi hydrolysoimalla seuraavan kaavan (I) mukaista yhdistettä:

R

Ί° 0 = ____2^C = 0

H

jossa kaavassa R on fenyyliryhmä.

5 Yleisen kaavan (1) mukaisilla yhdisteillä, toisin sanoen 5-substituoiduilla 2,4 oksatsolidiinidioneilla, voidaan suorittaa hydrolyysireaktio, joka avaa renkaan seuraavan kaavan mukaan: R 0 F f f n HC_ 0 HC-OC-NH2 Λ f · ί + Η,Ο η *

0 = c c = ο 2 r ο = C

Ν Ο Η Η (I). (II)

Hydrolysoimalla saatu yleisen kaavan (II) mukainen yhdiste on «C-hydroksihapon karbamyylijohdannainen, josta 10 ^-hydroksihappo voidaan saada suorittamalla yhdisteellä (II) toinen seuraavan kaavan mukainen hydrolyysi:

R

I R - CH - COOH + C0o + NH- HOOC - CH - 0C0NHo + Ho0 -> i 2 3

2 2 OH

(III) 2 71167

Lopullinen tuote (III) on <L -hydroksihappo.

Keksinnön kohteena on menetelmä D-mantelihappokarba-maatin valmistamiseksi, suoraan kaavan (1) mukaisen yhdisteen r a s e e m i s e n seoksen st.ereoselekt.iivi.aen e n t s y m a a 11. i s e n 5 hydrolysoimisen avulla.

Tässä yhteydessä on yllätyksellisesti todettu mahdolliseksi entsymaattisesti hydrolysoida 5-substitunituja DL -2,4-oksatso 1idiinidioneja siten, että tulokseksi saadaan ainoastaan D-karbamyyli-dC* -hydroksihappo, toisin s a n o e n 10 ainoastaan toinen mahdollisista optisista isomeereistä.

D-konfiquraation omaava vapaa öC-hydroksihappo voidaan saada optisesti aktiivisesta karbamyylijohdannaisosta yksinkertaisesti hydrolysoimalla. Kaavan (I) mukaisia yhdisteitä voidaan helposti valmistaa vastaavista ^- hydroksihapois-15 ta saattamalla ne reanoimaan karbamidin kanssa kuten Helqe

Aspelund on selittänyt julkaisussa Acta Acad. Aboensins Math, and Phys. 22 ( 7 ) 12 ( 1961 ) .

Raseeminen seos erotetaan stereo s el. ektiivisesti hydrolysoimalla oksatsolidiinirenqas entsyymien avulla, joita 20 voidaan helposti saada erilaisten mikro-orqanismien viljelyistä tai eläine 1 inten , esim. v a s i k a rima k s a n uutteista.

Tämän keksinnön tuloksena on on erittäin mielenkiintoinen, kaavan (IV) mukainen D-(-)-mantelihnppo,

-CH - C00H

OH (IV) 25 joka on tärkeä välituote puolisynteettisten antibioottien valmistuksessa.

Tätä välituotetta valmistetaan yleensä erottamalla r n -seeminen seos osiinsa siten, että muodostetaan diastereoiso-meerisuoloja optisesti aktiivisten luonnollisten emästen kuten 3 71167 brusiinin kanssa. Nämä menetelmät antavat joka tapauksessa teoreettisena maksimituotoksena 50 %, koska L-enantiomeeri on rasemisoitava ennen kuin se kierrätetään uudelleen.

Keksinnön mukaan voidaan D(-)mantelihapon karbamyyli-5 johdannainen edullisesti valmistaa stereoselektiivisesti entsymaattisesti hydrolysoimalla vastaava 5-fenyy1i-2,4-oksat-soiidiinidioni. Keksinnön mukaisen menetelmän eräs toinen huomattava etu on, että entsymaattinen reaktiosubstraatti ra-semisoituu spontaanisti hydrolyysiolosuhteissa niin, että 10 reaktion päättyessä D-mantelihapon karbamaatti saadaan stökio-metrisin määrin lähtöyhdisteestä.

Reaktion kaava on seuraava: A \ Ove 0 8 0-^-j H-- | H-j- ° - C - = o"\'C\ Γ°"

H H

L D D

D(-)-mantelihappo saadaan sitten D-mantelihappokarba-maatista hydrolysoimalla happamessa väliaineessa.

15 Entsymaattinen aktiviteetti, joka vaaditaan D ( - ) - m a n - telihappokarbamaatin valmistamiseksi on todettu sekä homogenisoidussa vasikanmaksassa että seuraavissa mikro-organismeissa: Pseudomonas, Achromobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium , Arthrobacter, Agrobacterium, Aerobacter, 20 Klebsiella, Serratia, Proteus, Bacillus, Micrococcus, Sareina, Protaminobacter, Streptomyces, Actinomyces, Candida, Rhodotorula, Pichia ja Paecilomyees.

Seuraavat mikro-organismit ovat osoittautuneet erikoisen sopiviksi : * 71167

Agrobacterium radiobacter NRRL B 11291 Bacillus brevis NRRL B 11080 Bacillus stearothermophilus NRRL B 11079 Pseudomonas sp CBS 145.75 5 Pseudomonas sp CBS 146.75 Pseudomonas sp ATCC 11299 Pseudomonas desmolytica NCIB8859 Pseudomonas fluorescens ATCC 11250 Pseudomonas putida ATCC 12633 10 Keksinnön mukaista menetelmää sovellettaessa viljel lään edellä mainittuja tyyppejä olevia mikro-organismeja aerobisissa olosuhteissa käyttämällä vi1jelyvä1 iaineita , jotka sisältävät typpi-, hiili-, fosfori- ja mineraalisuola-lähteitä, 20...80 °C:ssa 10...72 tuntia ja pH-arvon ollessa 15 6,0...8,0.

Hii1i1 ähteinä voidaan käyttää glukoosia, laktaattia, asetaattia, maissiuutelientä ja laktoosia.

Typpilähteinä voidaan käyttää hydrolysoitua lihaa, kaseiinia tai soijaa, ammoniumsuoloja, karbamidia, hydran-20 toiinia, jne.

Sopivan vi1je 1yvä1iaineen koostumus on esim. seuraava: lihapeptonia 5 kg 1 ihauutetta 5 kg glukoosia 5 kg 25 tislattua vettä 1000 ml pH 7,0. . .7,2.

Mantelihapon D(-)-karbamaatti voidaan valmistaa suoraan viljelyvällaineessa, joka sisältää vastaavaa DL-2,4-oksatsolidiinidionia, tai voidaan valmistaa suoraan käyttä-30 mä11ä mikrobimassaa jäännössoluina tai käyttää tästä tehtyjä uutteita. Keksinnön mukaiset entsymaattiset kompleksit uutetaan bakteerimassasta soveltamalla entsymologiassa tavanomaisia menetelmiä.

Tätä varten solut hajotetaan käyttämällä sopivia lait-35 teitä, esim. "French Pressure Cell Press",-, "Manton Gaulin Homogenizer"- tyyppisiä kojeita, pyöriviä hajoittimia, jne., 5 71167 tai käyttämällä ultraäänitekniikkaa.

5-substituoitu D L-2,4-oksatsoiidiinidioni voidaan hydrolysoida lisäämällä entsyymi reaktioseokseen seuraa-vina muotoina: tuoreina soluina, 1yo fi1 oituina soluina, 5 tolueenilla käsiteltyinä soluina, asetonijauheena tai raakoina tai puhdistettuina uutteina.

Eräs toinen tekninen ja taloudellinen parannus voidaan tehdä sitomalla entsyymit siten, että ne yhdistetään makromolekyylisi in yhdisteisiin muodostamalla kemiallisia si-10 doksia matriisin kanssa, tai ionisia sidoksia tai fysikaalisia sidoksia.

Seuraavat esimerkit kuvaavat muita menetelmiä keksinnön toteuttamiseksi.

Esimerkki 1 15 Valmistettiin vi1je 1y1iemi, jonka koostumus oli seu ra a v a: lihapeptonia 5 kq lihauutetta 3 kg glukoosia 5 kg 20 tislattua vettä 1000 ml.

pH säädettiin arvoon 7,2 soodan avulla, ja väliaine jaettiin 500 ml:n pulloihin 100 ml:n suuruisina erinä. Pullot steriloitiin 30 minuuttia 110 ° C:ssa, minkä jälkeen ne ympättiin Pseudomonas CBS 145.75 kannan viljelmällä, joka 25 sisälsi samaa väliainetta, jossa oli 2 % agaria (Difco) ja inkuboitiin 24 tuntia 30 0 C:ssa 220 kierr/min nopeudella sekoittaen.

1 ml tätä esiviljelmää (D.0. kohdassa 550 nm = 0,250, laimennus 1:10) pantiin viiteen 500 ml:n pulloon, 30 joissa oli 100 ml samaa väliainetta, ja viljelmää inkuboitiin 30 ° C:ssa sekoittaen 200 kierr/min nopeudella 24 tuntia (D.0. kohdassa 550 nm = 0,450, laimennus 1:10).

Tämän jälkeen solut koottiin, pestiin fysiologisessa liuoksessa ja suspendoitiin lopuksi 100 mlraan 0,1 M pyro-35 fosfaattipuskuria, jonka pH-arvo = 8,7, ja jossa oli 2 g 6 71167 DL - 5-fenyy1i-2,4-oksatso 1idiinidionia , 50 0 C:ssa.

Inkuboitiin 70 tuntia näissä olosuhteissa, minkä jälkeen hydrolysoituminen D-mantelihappokarbanaatiksi oli sujunut loppuun, kuten todettiin polarnetrisesti analysoimalla 5 reaktioseosta.

Karbamaatti eristettiin reaktioseoksesta sen jälkeen, kun solumassa oli erotettu sentrifugoima 11 a , minkä jälkeen jäähdytettiin, ja pH säädettiin arvoon 2,5 konsentroidun suolahapon avulla. Täten saatu sakka suodatettiin, p e s -10 tiin kylmällä vedellä ja kuivattiin alipaineessa. Saatiin 1,8 g karbamaattia, jonka identiteetti todistettiin IR- ja NMR-spektrien alkuaineanalyysin avulla.

Täten saadun karbamaatin alkoholi1iuoksen ominainen optinen kiertokyky £«cj 2δ oli -141°. Sulamispiste oli 15 169 0 C (hajosi ) .

1,4 g karbamaattia suspendoitiin 100 ml:aan vettä, minkä jälkeen keitettiin palautustislausta soveltaen 4 tun-'/ tia. Täten saatu vesiliuos tehtiin happameksi ja uutettiin sitten etyylieetterillä, ja orgaaninen faasi konsentroitiin 20 alipaineessa kuiviin. Täten saatiin 1,10 g raakaa manteli-happoa, jonka ΓΛ.7ζδ oli -120 ° (optinen tuotos 76 %) .

Vedestä kiteytettynä oli raakatuotteen sulamispiste — 130 °C ja sen optinen kiertämisvoima £*CJ2i oli -154,5 ke dessä, verrattuna sulamispisteeseen 113 °C ja optiseen kier-25 tämisvoimaan -15(?, kuten kirjallisuudessa on seli tetty D(-)-mantelihapolle.

Esimerkki 2

Lisättiin 1 g homogenoidun vasikanmaksan asetonijau-hetta liuokseen, jossa oli 500 mg DL-5-fenyy1i-2,4-oksatso-30 lidiinidionia 50 mlrssa 0,1 M pyrofosfaasipuskuria, jonka pH-arvo = 8,5.

Täten saatua reaktioseosta inkuboitiin 30 °C:ssa 40 tuntia, minkä jälkeen D-mante 1ihappokarbamaa11i otettiin talteen esimerkissä 1 selitetyllä tavalla. Täten saatiin 35 380 mg raakaa karbamaattia, jonka ominainen optinen kierto- kyky oli fcCj2& -136° etanolissa.