FI112601B - Menetelmä 5-fluoriurasiilia sisältävän farmaseuttisen yhdistelmän valmistamiseksi, jolla on parantunut stabiilisuus urasiilireduktaasia vastaan - Google Patents

Description

112601

Menetelmä 5-fluoriurasiilia sisältävän farmaseuttisen yhdistelmän valmistamiseksi, jolla on parantunut stabiilisuus urasiilireduktaasia vastaan 5 Esillä oleva keksintö koskee määrättyjen entsyymi - inaktivaattorikoostumusten valmistusta, jotka ovat käyttökelpoisia lääketieteessä, varsinkin syövän kemoterapiassa, erityisesti yhdistelmänä antimetaboliittisten, anti-neoplastisten lääkeaineiden, kuten 5-fluoriurasiilin (5-FU) 10 kanssa.

5-fluoriurasiilia on käytetty syövän kemoterapiassa vuodesta 1957. Kasvaimia, joihin tämä hoito tehoaa, ovat rintasyöpä, gastrointestinaaliset pahanlaatuiset kasvaimet ja pään ja niskan syöpämuodot; 5-fluoriurasiilia käytetään 15 myös säteilytyksen herkistysaineena. 5-fluoriurasiili me- taboloituu nopeasti maksassa (puoliintumisaika noin 8-20 minuuttia) entsyymin dihydropyrimidiinidehydrogenaasin (urasiilireduktaasin) vaikutuksesta. On raportoitu (Cancer Research 46, 1094, 1986), että 5-(2-bromivinyyli)urasiili 20 (BVU) on dihydrotymidiinidehydrogenaasin inhibiitti, joka sekä hidastaa 5-fluoriurasiilin metabolismia että parantaa '· sen tehoa kasvaimiin. On raportoitu, että 5-(2-bromivinyy- : li)-21-deoksiuridiini (joka metaboloituu in vivo BVU:ksi) parantaa 5-fluoriurasiilin ja 5-deoksi-5-fluoriuridiinin, 25 joka on 5 - fluoriurasiilin esilääkeaine (prodrug), tehoaa kasvaimiin [Biochemical Pharmacology 38; 2885 (1989)].

BVU on valitettavasti myrkyllinen ihmiselle.

Nyt on havaittu, että 5-etynyyliurasiili on urasiilireduktaasin inaktivaattori. Se lisää 5-fluoriurasii-30 Iin puoliintumisaikaa ja pitoisuutta plasmassa ja parantaa ; ' 5-fluoriurasiilin tehoa. Se vähentää myös 5 - fluori-ura- ; siilipitoisuuksien vaihteluja plasmassa, jotka ovat nor- • · maaleja eri henkilöiden välillä.

' On havaittu, että 5-etynyyliurasiili tai sen esi- 35 muoto on käyttökelpoinen urasiilireduktaasi-inhibiittorina 112601 2 lääketieteessä, erityisesti syövän kemoterapiassa. Urasii-lireduktaasi-inhibiittoria käytetään yhdessä 5-fluo-riurasiilin tai sen esimuodon kanssa. Lääke voi myös olla käyttökelpoinen 5-fluoriurasiilin myrkyllisyyden välttämi-5 seksi ja yhdessä 5-fluoriurasiilin tai sen esimuodon kanssa psoriaasin tai nivelreuman tai ihmisen papilloomavi-rusinfektioiden hoitamiseksi.

Keksinnön kohteena on menetelmä 5-fluoriurasiilia (5-FU) sisältävän farmaseuttisen yhdistelmän valmistami-10 seksi, jolla on parantunut stabiilisuus urasiilireduktaa-sia vastaan.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että 5-FU tai sen esimuoto yhdistetään urasiilireduk-taasi-aktivaattorin kanssa, joka on valittu 5-etynyyli-15 urasiilista (5-EU) tai sen esimuodoista, sopivassa kanta-j assa.

5-etynyyliurasiilijohdannaisten esimuodot ovat yhdisteitä, jotka voivat metaboloitua in vivo urasiilijoh-dannaisiksi. Sinänsä nämä esimuodot ovat tai eivät ole ak-20 tiivisia, mutta normaalisti niiden aktiivisuus on vähäinen. Tällaisia esimuotoja ovat nukleosidianalogit, joissa on nukleoemäs, joka vastaa 5-substituoituja urasiiliyhdis-teitä, esimerkkeinä nukleosidijohdannaiset, joissa on ri-; boosi-, 2'-deoksiriboosi-, 2',31-dideoksiriboosi-, arabi- I 25 noosi- tai muu pilkkoutuva sokeriosa, jossa lisäksi voi olla 2'- tai 31 -substituentti, kuten halogeeni, esim. :·. kloori tai fluori; alkoksi, amino tai tio. Tällaisten nuk leosidi j ohdannaisten spesifinen esimerkki on 2',3'-di-, , deoksi-5-etynyyli-3'-fluoriuridiini. Seuraavassa mainitut '30 5-FU:n esimuotojen analogiset yhdisteet ovat yleensä käyt-' tökelpoisia. Viittaukset tässä patenttihakemuksessa ura- : siilijohdannaisiin (tai urasiilireduktaasin inaktivaatto- ·;· * reihin) käsittävät myös näiden esimuodot.

5-fluoriurasiilin (5-FU) esimuodot ovat yhdistei-35 tä, jotka metaboloituvat in vivo 5-fluoriurasiiliksi, ja 112601 3 tällaisia ovat 5-fluoriuridiini, 5-fluori-2-deoksiuri-diini, 5 - fluori-2-deoksisytidiini, 5'-deoksi-41,51-fluoriuridiini, 5'-deoksi-5-fluoriuridiini, 1-(2-tetrahydro- furanyyli) -5-fluoriurasiili ja l-Ci-Cs-alkyylikarbamoyyli-5 5-fluoriurasiilijohdannaiset.

5-FU:ta tai sen esimuotoa ja 5-etynyyliurasiilia voidaan käyttää yhdistelmänä antamalla yhdistelmän komponentteja asianmukaiselle kohteelle joko samanaikaisesti esim. yhtenä farmaseuttisena formulaattina tai edullisem-10 min erikseen tai peräkkäin riittävän pitkänä ajanjaksona siten, että saavutetaan yhdistelmän haluttu terapeuttinen vaikutus. 5-etynyyliurasiili annetaan edullisesti ensin ja 5-FU tai sen esimuoto annetaan sitten edullisesti 15 minuutista neljään vuorokauteen, tavallisesti 1-15 tuntia, 15 erityisesti 1-2 tuntia, myöhemmin.

5-FU tai sen esimuoto ja 5-etynyyliurasiili voidaan antaa vastaavasti mitä tahansa sopivaa antotietä, esim. suun kautta, peräsuoleen, nenäonteloon, ulkoisesti (mm. poskeen ja kielen alle), emättimeen ja parenteraali-20 sesti (mm. ihon alle, lihakseen, laskimoon ja ihon sisään).

On huomattava, että edullinen antotie vaihtelee kohteen tilasta ja iästä, infektion luonteesta ja muista kliini-: sistä tekijöistä riippuen.

Tähän saakka ei ole ollut mahdollista antaa 5-FU:ta j 25 suun kautta, koska urasiilireduktaasi tuhoaa sen ruoansulatuskanavassa. Mutta nyt on havaittu, että jos 5-etynyy-liurasiili annetaan ennen 5-FU:n (tai sen esimuodon) antoa suun kautta, plasmassa ilmenee 5-FU:n suuri ja jatkuva pitoisuus merkkinä siitä, että tämä yhdiste ei ole tuhoutu-30 nut. Tämä on käsiteltävänä olevaan keksintöön liittyvä lisäetu. 5-FU annetaan edullisesti 15 minuutista neljään ; vuorokauteen, tavallisesti 1-15 tuntia, erityisesti 1-2 : tuntia, 5-etynyyliurasiilin annon jälkeen.

Annettaessa määrätty määrä 5-FU:ta on normaalia, 35 että 5-FU:n pitoisuus plasmassa vaihtelee suuresti. Tämä 4 1Ί 2601 voi johtua 5-FU:n eliminointinopeudesta, joka voi olla erilainen eri potilailla. Potilaiden välillä voi myös ilmetä päivittäisiä vaihteluja. On havaittu, että käsiteltävänä olevan keksinnön mukaisen 5-etynyyliurasiilin käyttö 5 vähentää selvästi tätä potilaskohtaista vaihtelua (ks. koe 3).

5-FU:n tai sen esimuodon sopiva annos on yleisesti ottaen alueella 0,1 - 1 000 mg per kilogramma kohteen kehonpainoa päivässä, edullisesti alueella 0,1 - 200 mg per kilogramma kehonpainoa päivässä. Annettaessa itse 5-FU:ta, 10 annos on edullisesti alueella 0,1 - 50 mg per kilogramma kehonpainoa päivässä, mutta voidaan antaa suurempia annoksia 5-FU:n esilääkeaineita. 5-FU:n tai sen esimuodon annos voidaan antaa annosyksikkömuodossa, joka sisältää 5-3 000 mg, edullisesti 20-1 000 mg vaikuttavaa aineosaa an-15 nosyksikköä kohti.

5-FU:lla suoritetut kokeet osoittavat, että on annettava annos, joka aikaansaa plasmassa vaikuttavan yhdisteen huippupitoisuuden noin 0,01 - noin 1,5 μg/ml.

5-etynyyliurasiili voidaan annostella alueella 20 0,01 - 50 mg per kilogramma per kohteen kehonpainoa päi vässä, erityisesti 0,01 - 10 mg/kg. Annos on edullisemmin ; alueella 0,01 - 0,4 mg per kilogramma kehonpainoa päivässä .·’·*; käytetystä johdannaisesta riippuen. Vaihtoehtoisena edul- lisena anto-ohjelmana on 0,5 - 10 mg/kg kerran viikossa.

2 5 Haluttu annos annetaan yhtenä, kahtena tai useampa- na osa-annoksena asianmukaisin välein päivän mittaan. Nämä osa-annokset voidaan antaa annosyksikkömuodossa, joka sisältää esim. 1 - 200 mg, edullisesti 2 - 100 mg, edullisemmin 2-50 mg, 5-etynyyliurasiili.

* ' 30 Urasiilireduktaasin inaktivaattoria (5-EU) ja 5-FU:ta '··>* käytetään tavallisesti asianmukaisessa suhteessa pienentä- ; mään olennaisesti kohteessa luonnostaan olevan urasiilire- ... : duktaasin pitoisuutta. Tämä suhde, joka perustuu urasiili reduktaasin inaktivaattorin (5-EU) ja 5-FU:n vastaaviin » *

I I

112601 5 painoihin, on yleensä alueella 1:0,01 - 1:100, edullisesti alueella 1:0,1 - 1:50 ja erityisesti alueella 1:1 - 1:10.

5 -FU:ta tai sen esimuotoa ja 5-etynyyliurasiilia annetaan edullisesti farmaseuttisen formulaatin muodossa 5 joko yhtenä farmaseuttisena formulaattina, joka sisältää molemmat komponentit, tai erillisinä formulaatteina, joista jokainen sisältää yhdistelmän yhtä komponenttia. 5-ety-nyyliurasiili voimistaa 5-FU:ta, joten käytetään pienempiä annoksia 5-FU:ta.

10 Farmaseuttinen koostumus sisältää 5-etynyyliura siilia valinnaisesti yhdistelmänä 5-FU:n tai sen esimuodon ja vähintään yhden farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan tai täyteaineen kanssa.

Jokaisen kantajan on oltava "farmaseuttisesti hy-15 väksyttävä" siinä mielessä, että se sopii yhteen formulaatin muiden aineosien kanssa eikä vahingoita potilasta. Formulaatteihin kuuluvat sellaiset, jotka sopivat antoon suun kautta, peräsuoleen, nenäonteloon, ulkoisesesti (mm. poskeen ja kielen alle), emättimeen ja parenteraalisesti 20 (mm. ihon alle, lihakseen, laskimoon ja ihon sisään). For-mulaatit voivat sopivasti olla annosyksikkömuodossa ja ne • '.· voidaan valmistaa kaikkien farmasiassa tunnettujen mene- : * : telmien avulla. Tällaisiin menetelmiin kuuluu vaikuttavan aineosan sekoittaminen kantajaan, joka muodostuu yhdestä 2 5 tai useammasta lisäaineesta. Formulaatit voidaan yleisesti ;·/, ottaen valmistaa sekoittamalla vaikuttava aineosa tasai- sesti ja perusteellisesti nestemäisiin kantajiin tai hie- i » t nojakoisiin kiintokantajiin tai molempiin ja muovaamalla sitten tarvittaessa tuote.

’ ' 30 Käsiteltävänä olevan keksinnön suun kautta annet- tavat formulaatit voivat olla erillisinä yksikköinä, kuten ' ; kapseleina, annospusseina tai tabletteina, jotka sisältä- ., : vät ennalta määrätyn määrän vaikuttavaa aineosaa, jauheena ’ tai rakeina, liuoksena tai suspensiona vedellisessä tai 35 ei-vedellisessä nesteessä tai öljy-vedessä-neste-emulsiona 112601 6 tai vesi-öljyssä-neste-emulsiona. Vaikuttava aineosa voidaan myös antaa boluksena, lääkepuurona tai tahnana. Anto suun kautta on edullinen antotie.

Tabletti voidaan valmistaa puristamalla tai vala-5 maila valinnaisesti yhden tai useamman lisäaineen kera. Puristetabletit voidaan valmistaa puristamalla sopivassa koneessa vaikuttava aineosa vapaasti juoksevassa muodossa, kuten jauheena tai rakeina, valinnaisesti seoksena sideaineen (esim. povidonin, gelatiinin, hydroksipropyylimetyy-10 liselluloosan), liukastusaineen, tehottoman laimentimen, säilöntäaineen, hajotusaineen (esim. natriumtärkkelysgly-kolaatin, silloitetun povidonin, silloitetun natriumkar-boksimetyyliselluloosan) , pinta-aktiivisen aineen tai dis-pergointiaineen kanssa. Valetut tabletit voidaan valmistaa 15 valamalla sopivassa koneessa seos, joka muodostuu jauhetusta yhdisteestä ja sitä kostuttavasta tehottomasta nes-telaimentimesta. Tabletit voidaan valinnaisesti päällystää tai urittaa ja ne voidaan formuloida siten, että vaikuttava aineosa vapautuu niistä kontrolloidusti käyttämällä 20 esim. vaihtelevissa suhteissa hydroksipropyylimetyylisel-luloosaa halutun vapautumisprofiilin saamiseksi.

Formulaatteihin paikalliseen antoon suussa kuulu-; ‘ vat lääketabletit, jotka käsittävät vaikuttavan aineosan ; : maustetussa perusaineessa, jona on tavallisesti sakkaroosi ; 25 ja arabikumi tai tragantti, pastillit, jotka käsittävät , vaikuttavan aineosan tehottomassa perusaineessa, jona on esim. gelatiini ja glyseroli tai sakkaroosi ja arabikumi, ja suuvedet, jotka käsittävät vaikuttavan aineosan sopivassa nestekantajassa.

3 0 Formulaatit rektaaliantoon voivat olla peräpuikon muodossa sopivan perusaineen kera, jona voi olla esim.

; ; kaakaovoi tai jokin salisylaatti.

; Formulaatit vaginaaliantoon voivat olla pessaarien, tamponien, voiteiden, hyytelöiden, tahnojen, vaahtojen tai 35 suihkeiden muodossa, jotka vaikuttavan aineosan lisäksi 112601 7 sisältävät tekniikan tasolla asianmukaisiksi tunnettuja kantaj ia.

Formulaatteihin parenteraaliantoa varten kuuluvat vedelliset ja ei-vedelliset, isotoniset steriilit ruiske-5 liuokset, jotka voivat sisältää hapettumisen estoaineita, puskureita, bakteriostaatteja ja liuenneita aineita, jotka tekevät formulaatin isotoniseksi kohteen veren kanssa, ja vedelliset ja ei-vedelliset steriilit suspensiot, jotka voivat sisältää suspendointiaineita ja sakeutusaineita. 10 Formulaatit voivat olla yhtenä annoksena tai useana annoksena suljetuissa säiliöissä, esim. ampulleissa tai lääke-pulloissa ja ne voidaan säilyttää kylmäkuivatussa (lyofi-lisoidussa) tilassa, jolloin on tarpeen vain lisätä välittömästi ennen käyttöä steriiliä nestekantajaa, esim. ste-15 riiliä vettä. Improvisoidusti voidaan valmistaa ruiskeliu-oksia ja -suspensioita yllä kuvatunlaisista steriileistä jauheista, rakeista ja tableteista.

Nesteformulaatit, joihin on liuotettu 5-urasiili-johdannaista, puskuroidaan edullisesti pH-arvoon 7 - 11, 20 yleisesti ottaen 9,5 - 10,5. Edullisia annosyksikköformu-laatteja ovat sellaiset, jotka sisältävät päivässä tarvit-i tavan annoksen tai yksikön, päivässä tarvittavan, yllä ku- vatun osa-annoksen tai asianmukaisen osan siitä vaikutta-jv. vaa aineosaa.

25 5-etynyyliurasiili j ohdannainen, joita käytetään ;-t-( yhdistelmänä käsiteltävänä olevan keksinnön mukaisesti 5- fluoriurasiilin tai sen esimuodon kanssa, voidaan valmis- f i « ’ taa tavalliseen tapaan. Tämä yhdiste voidaan valmistaa esimerkiksi menetelmien avulla, jotka on kuvattu julkai-• ' 30 sussa J. Heterocycl. Chem. 19 (3) 463 - 464 (1982).

Yllä kuvatut esilääkeaineina käytettävät nukleosi-;dijohdannaiset voidaan myös valmistaa tavalliseen tapaan esim. menetelmien avulla, jotka on kuvattu EP-patenttijul-kaisussa nro 356 166 3'-fluori-21,3'-dideoksi-5-alkynyyli-35 uridiiniyhdisteiden, kuten 2',3'-dideoksi-5-etynyyli-3'- 112601 8 fluoriuridiinin, valmistamiseksi, ja EP-patenttijulkaisussa nro 272 065 5-alkynyyliurasiiliarabinosidien valmistamiseksi .

Esimerkki 1 (5-etynyyliurasiili (EU)) 5 (a) 5-(trimetyylisilyylietynyyli)urasiili

Liuoksesta, jossa oli 5-jodiurasiilia (8 g, 30 mmol) uudelleentislatussa trietyyliamiinissa (500 ml) ja kuivassa DMF.-ssä (10 ml) , poistettiin kaasut 15 minuutin aikana hapettomalla typellä. Sitten lisättiin bis(tri-10 fenyylifosfiini)palladium(II)kloridia (0,5 g), kupari(I)-jodidia (0,5 g) ja trimetyylisilyyliasetyleeniä (10 g, 102 mmol) ja seosta kuumennettiin sekoittaen 50 °C:ssa 24 tuntia. Jäähtynyt reaktioseos suodatettiin, suodos haihdutettiin kuiviin ja jäännös liuotettiin dikloorimetaaniin 15 (500 ml). Orgaaninen liuos pestiin dinatrium-EDTA:n 2-pro- senttisella vesiliuoksella (3 x 250 ml) , vedellä (3 x 200 ml), kuivattiin (Na2S04) ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöstä hierrettiin etanolissa ja saatiin otsikkoyhdisteen ensimmäinen saanto. Havaittiin, että reaktioseoksesta suo-20 dattamalla eristetty kiintoainekin sisälsi haluttua tuo tetta, joskin epäpuhtaammassa muodossa, ja siten sekin ; . työstettiin erillisenä panoksena ja saatiin toinen saanto, i 1H-NMR & (d6-DMSO) = 11,75 - 10,85 (2H, bs, NH) , 7,75 (1H, ; s, H-6) , 0,15 ppm (9H, m, SiCH3) .

- 25 (b) 5-etynyyliurasiili : Liuosta, jossa oli 5-(trimetyylisilyylietynyyli)- , urasiilia (5,3 g, 24,4 mmol) natriummetoksidin 0,2 M meta- noliliuoksessa (400 ml) , sekoitettiin huoneenlämpötilassa „ 3 tuntia ja neutraloitiin pH-arvoon 7 laimealla kloorive- * j * • ·’ 30 tyhapolla. Saostunut tuote eristettiin suodattamalla, pes- “* tiin metanolilla ja kuivattiin ja saatiin otsikkoyhdis- ; : teen ensimmäinen saanto. Suodokset ja pesunesteet yhdis- tettiin, haihdutettiin kuiviin ja jäännös kiteytettiin me-tanolista ja saatiin tuotteen toinen saanto. Yhdistämällä

' I

112601 9 molemmat saannot ja kiteyttämällä vielä uudelleen etanolista saatiin puhdas tuote.

Sp. = 260 °C (hajoaa) 1H-NMR & (ds-DMSO) = 11,6 - 10,8 (2H, bs, NH) , 7,8 (1H, s, 5 H-6), 4,03 ppm (1H, s, asetyleeninen H)

Mikroanalyysi C6H4N202 : Ile: laskettu: C 52,95, H 2,96, N 20,58; saatu: C 52,04, H 2,92, N 20,3.

Esimerkki 2 (5-etynyyliurasiili) 10 a) 2,4-dimetoksi-5-jodipyrimidiini

Kuivaan yhden litran pyörökolviin panostettiin 5-jodiurasiilia (50 g, 0,21 mol), fosforioksikloridia (300 ml) ja N,N-dietyylianiliinia (6 tippaa). Heterogeenia seosta kuumennettiin 120 °C:ssa öljyhauteessa typpisuojas-15 sa 24 tuntia. Fosforioksikloridi poistettiin tislaamalla (samalla tislautui hieman tuotetta). Reaktioliuos kaadettiin sitten hitaasti ja varovasti jäihin (1 litra) ja kiinteälle natriumbikarbonaatille pitäen sisälämpötila -20 °C:ssa tai sen alapuolella. (Tämä tapahtui jäähdyttä-20 mällä kuivajää/asetonihauteessa.) Lisäyksen päätyttyä re-aktioseoksen pH säädettiin arvoon 7 lisäämällä kiinteää ; · natriumbikarbonaattia. Seos uutettiin metyleenikloridilla : ja orgaaniset jakeet kuivattiin valuttamalla ne faasin- erotuspaperin läpi. 2,4-dikloori-5-j odipyrimidiinin epä-. 25 puhdas liuos lisättiin välittömästi tiputtaen liuokseen, ; , jossa oli MeOH:ta (400 ml) ja natriummetoksidia (28,8 g,

I I

0,553 mol). Tämän lisäyksen kesto oli 1 tunti. Reaktio-seosta sekoitettiin sitten huoneenlämpötilassa yli yön.

, Liuos neutraloitiin C02:lla (kaasuna), uutettiin metyleeni- • 30 kloridilla, kuivattiin vedettömän Na2S04:n päällä, suoda- tettiin ja haihdutettiin. Epäpuhdas tuote adsorboitiin silikageeliin (100 g) ja panostettiin 400 g.-n silikageeli-pikakromatografointipylvääseen. Pylvästä eluoitiin heksaa-nien ja etyyliasetaatin seoksella tilavuussuhteessa 90:10.

112601 10

Asianmukaiset jakeet yhdistettiin ja haihdutettiin ja saatiin otsikkoyhdiste valkoisena kiintoaineena.

Saanto 26,7 g (48 %) 200 MHz NMR CDC13 & = 3,97 (s, 3H) , 4,02 (s, 3H) , 8,43 (s, 5 1H) .

b) 2,4-dimetoksi-5-(b-trimetyylisilyyli)etynyylipy-rimidiini

Yhden litran kuivaan, typpisuojassa olevaan pyörö-kolviin panostettiin vaiheen a) tuotetta (26,7 g, 0,10 10 mol), kuivaa metyleenikloridia (Aldrich, 150 ml) , kuivaa Et3N:ää (vastatislattu KOH-pellettien päältä, 250 ml). Systeemiin imettiin tyhjö ja huuhdeltiin useita kertoja ty-pellä Firestone-venttiilin kautta. Lisättiin ruiskulla trimetyylisilyyliasetyleeniä (21,2 ml, 0,15 mol, Aldrich). 15 Tämän jälkeen lisättiin bis(trifenyylifosfiini)palladiumin) kloridia (Aldrich, 5,84 g, 8,32 mmol) ja kupari(I)kloridia (Aldrich, 4,76 g, 25 mmol). Seosta kuumennettiin 60 °C:ssa öljyhauteessa 2 tuntia, jäähdytettiin ja suodatettiin Celiten läpi. Suodos haihdutettiin vakuumissa. 20 Jäännös laimennettiin tolueenilla (100 ml) ja tolueeni poistettiin sitten vakuumissa. Jäännös otettiin metyleeni-kloridiin (200 ml) , suodatettiin ja suodos uutettiin ety-j leenidiamiinitetraetikkahapon dinatriumsuoladihydraatin F \ 5-prosenttisella vesiliuoksella (3 x 100 ml, Aldrich), ve- ____: 25 dellä (1 x 100 ml) . Orgaaninen kerros kuivattiin valutta- maila faasinerotuspaperin läpi ja haihdutettiin vakuumis-\,1 sa. Tuote puhdistettiin laitteessa Waters Prep 500 eluoi- ' den heksaanien ja etyyliasetaatin seoksella tilavuussuh teessa 95:5. Epäpuhdas tuote adsorboitiin 100 g:aan sili-' 30 kageeliä ja panostettiin 400 g:n silikageelipikakromato- ·,,,· grafointipylvääseen. Pylväs eluoitiin heksaanien ja etyy- liasetaatin seoksella tilavuussuhteessa 97,5:2,5. Asian-,: mukaiset jakeet yhdistettiin ja haihdutettiin.

Saanto 16,94 g (73 %).

112601 11 1,2 g:n näyte muodostunutta yhdistettä sidottiin 6 g:aan silikageeliä ja panostettiin 50 g:n pikakromato-grafointipylvääseen. Pylväs eluoitiin heksaanien ja etyyliasetaatin seoksella tilavuussuhteessa 95:5. Asian-5 mukaiset jakeet yhdistettiin, haihdutettiin, stripattiin CH2Cl2:lla (2 x 30 ml) ia kuivattiin vakuumissa ja saatiin 1,000 g otsikkoyhdistettä, sp. 72,5 - 73 °C, kirjallisuudesta saatu sp. 73 - 74 °C, J. Heterocyclic Chem. 19, 363 (1987).

10 c) 5-(b-trimetyylisilyyli)etynyyliurasiili

Kuivaan, typpisuojassa olevaan kolmikaulapyörökol-viin panostettiin 2,4-dimetoksi-5-(b-trimetyylisilyyli)-etynyylipyrimidiiniä (6,5 g, 27,5 mmol), kuivaa asetonit-riiliä (120 ml, Aldrich), natriumjodidia (kuivattu lämpö-15 kaapissa vakuumissa 80 °C:ssa 18 tuntia, 12,4 g, 82,7 mmol) ja klooritrimetyylisilaania (10,5 ml, 82,7 mmol, vastatislattua). Seosta kuumennettiin palautuslämpötilassa 3 tuntia ja haihdutettiin sitten vakuumissa. Jäännöstä digeroitiin liuoksessa, jossa oli metanolia (40 ml) ja 20 vettä (20 ml) ja tuote eristettiin suodattamalla ja saatiin 1,48 g (26 %) . Tuote liuotettiin kloroformiin ja : .. liuos adsorboitiin silikageeliin (7 g) , joka panostettiin ; sitten 35 g:n silikageelipikakromatografointipylvääseen.

·’ Eluoimalla kloroformin ja metanolin seoksella tilavuussuh- ,, 25 teessä 95:5 ja sitten kloroformin ja metanolin seoksella tilavuussuhteessa 90:10 ja haihduttamalla tuotetta sisäl-tävät jakeet saatiin 1,23 g otsikkotuotetta valkoisena kiintoaineena.

d) 5-etynyyliurasiili : 30 Liuosta, jossa oli 5-(b-trimetyylisilyyli)etynyyli- *·..* urasiilia (3,85 g, 18,4 mmol) ja metanolia (370 ml), käsi- teltiin toisella liuoksella, jossa oli natriumhydroksidia (2,3 g, 57,5 mmol) ja vettä (18 ml). Seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 2 tuntia ja haihdutettiin sitten va-’ 35 kuumissa. Jäännös suspendoitiin veteen (35 ml) ja pH sää- 112601 12 dettiin arvoon 5 käyttäen 0,1 N HCl:ää. Kiintoaines liukeni ja muodostui toinen sakka pH-arvossa 5. Tuote eristettiin suodattamalla, pestiin vedellä ja kuivattiin vakuu-missa ja saatiin 2,3 g (92 %) 5-etynyyliurasiilia vaalean 5 beigen värisenä jauheena.

Mikroanalyysi C6H4N2O2 : Ile : laskettu: C 52,95, H 2,96, N 20,58, saatu: C 52,79, H 3,02, N 20,44.

Esimerkki 3 10 Tablettiformulaatteja

Seuraavat formulaatit 3A, 3B ja 3C valmistettiin märkärakeistamalla aineosat (lukuun ottamatta magnesium-stearaattia) povidoniliuoksessa, jonka jälkeen rakeet kuivattiin, lisättiin magnesiumstearaatti ja puristettiin 15 tableteiksi.

Formulaatti 3A mg/tabletti mg/tabletti

Vaikuttava aineosa 5 2

Laktoosi B.P. 205 75 20 Povidoni B.P. 15 10

Natriumtärkkelysglykolaatti 20 10 : Magnesiumstearaatti 3 3 250 100

Formulaatti 3B mg/tabletti mg/tabletti 25 Vaikuttava aineosa 5 2 ;Vi Laktoosi B.P. 155 ‘ ; Avicel PH 101 50 25 ' Ί

Povidoni B.P. 15 10

Natriumtärkkelysglykolaatti 20 10 30 Magnesiumstearaatti 5 3 ; 250 50 112601 13

Formulaatti 3C mg/tabletti

Vaikuttava aineosa 5

Laktoosi B.P. 205 Tärkkelys 50 5 Povidoni B.P. 6

Magnesiumstearaatti 4 270

Seuraava formulaatti 3D valmistettiin puristamalla 10 suoraan sekoitetut aineosat. Käytetty laktoosi oli suora-puristustyyppiä.

Formulaatti 3D mg/tabletti

Vaikuttava aineosa 5 15 Laktoosi 155

Avicel PH 101 100 260

Seuraava formulaatti 3E on kestovaikutteinen tab-20 letti ja se valmistetaan märkärakeistamalla aineosat (lukuun ottamatta magnesiumstearaattia) povidoniliuoksessa, jonka jälkeen rakeet kuivataan, lisätään magnesiumstearaatti ja puristetaan tableteiksi.

·’ 25 Formulaatti 3E mg/tabletti , Vaikuttava aineosa 5

Hydroksipropyylimetyyli-selluloosa 110 (Methocel K4M Premium) 30 Laktoosi B.P. 50

Povidoni B.P. 28

Magnesiumstearaatti 7 ; 200 ' 3 5 112601 14

Esimerkki 4 Kapseliformulaattej a

Seuraavat formulaatit 4A ja 4B valmistettiin sekoittamalla puristamattomat aineosat ja täyttämällä kaksi-5 osainen kovagelatiinikapseli seoksella.

Formulaatti 4A mg/kapseli

Vaikuttava aineosa 10

Laktoosi B.P. 250 10 Natriumtärkkelysglykolaatti 25

Magnesiumstearaatti 5 290

Formulaatti 4B mg/kapseli

Vaikuttava aineosa 5 15 Esigelatinoitu tärkkelys NF15 245 250

Formulaatti 4C mg/kapseli

Vaikuttava aineosa 10

Macrogol 4000 B.P. 340 20 350

Macrogol 4000 B.P. sulatettiin ja vaikuttava aineosa dispergoitiin siihen. Kaksiosainen kovagelatiinikapse-jli täytettiin sitten perusteellisesti sekoitetulla sulal- V la· ;·· 2 5 Esimerkki 5

Ruiskeformulaatti

Vaikuttava aineosa 10 mg - » *

Steriili, pyrogeenitön pyrofosfaatti-puskuri (pH 10) q.s. ad 10 ml 30 Vaikuttava aineosa liuotettiin fosfaattipuskurin ' pääosaan (35 - 40 °C) , tilavuus säädettiin sitten oikeak- ; ; si, ja suodatettiin steriilin mikrohuokossuodattimen läpi ; 10 ml:n ruskeaan lasilääkepulloon (tyyppi 1) ja suljettiin steriilillä tulpalla ja kapselilla.

3 5 1R 112601 1 b

Esimerkki 6

Peräpuikkoformulaatti mg/peräpuikko

Vaikuttava aineosa, 63 μτη* 10 5 Kovarasva B.P. (Witepsol H15,

Dynamit Noble 1) 1 790 1 800 * Vaikuttavaa aineosaa käytetään jauheena, jossa vähintään 90 % hiukkasista ovat 63 μτη tai pienempiä.

10

Viidesosa Witepsol H15:stä sulatettiin höyryvai-palla varustetussa kattilassa maksimilämpötilassa 45 °C. Vaikuttava aineosa seulottiin 200 μπΐ:η seulan läpi ja lisättiin sekoittaen sulaan perusaineeseen käyttäen leik-15 kuupäällä varustettua Silverson-sekoitinta, kunnes saatiin tasalaatuinen dispersio. Pitäen seoksen lämpötila 45 °C:ssa suspensioon lisättiin loput Witepsol H15:stä ja sekoitettiin homogeeliksi seokseksi. Suspensio kaadettiin kokonaisuudessaan 250 μιτηη ruostumatonta terästä olevan 2 0 seulan läpi ja annettiin jäähtyä noin 4 0 °C: seen jatkuvasti sekoittaen. Sopiviin muovimuotteihin kaadettiin 1,80 g lämpötilassa 38 - 40 °C olevaa seosta. Peräpuikot saivat jäähtyä huoneenlämpötilaan.

: ‘ : Suoritettiin joitakin kokeita keksinnön mukaisten • · 25 5-substituoitujen urasiilien tehokkuuden määrittämiseksi.

V. Koe 1

Urasiilireduktaasin inaktivoitumisen määrittäminen

Urasiilireduktaasia (1 mikromoolinen) (dihydropyri-midiinidehydrogenaasi EC 1.3.1.2), joka oli puhdistettu 30 naudan maksasta, ja 100 mikromoolinen inaktivaattori ja 5 mM ditiotreitolia (entsyymireduktantti) inkuboitiin 37 °C:ssa 30 minuuttia 0,05 M tris-HCl:ssä pH:ssa 8,0.

‘ Entsyymi ja inaktivaattori laimennettiin satakertaisesti määrityspuskuriin, joka sisälsi 200 mikromoolista 35 NADPH:ta, 200 mikromoolista tymiiniä ja 1 mM ditiotreito- 112601 16 lia tris-HCl:ssä pH:ssa 8,0. Entsyymin nopeus määritettiin spektrofotometrisesti. Nämä nopeudet on korjattu siten, että niissä on otettu huomioon NADPH-oksidaasiaktiivisuus, joka oli alle 10 % NADPHrn tymiinistä riippuvaisesta ha-5 pettumisnopeudesta. Entsyymin prosentuaalinen inaktivoitu-minen oli yhtä kuin 100 % miinus jäljelle jääneen entsyymiaktiivisuuden prosenttiarvo. Ilman inhibiittiä inkuboitu entsyymi oli näissä olosuhteissa stabiili. Sulkeissa olevat arvot ovat entsyymin inaktivoitumisen suhteellisia 10 ensimmäisen kertaluvun nopeusvakioita määritettyinä samanlaisissa kokeissa, joissa osamääräinen aktiivisuus mitattiin ajan funktiona inkuboitaessa 50 mikromoolia inakti-vaattoria ja entsyymiä.

Tulokset ilmenevät alla: 15

Yhdiste Inakt ivo itvraiinen % 5-etynyyliurasiili 100 (100) 5-syaaniurasiilia 100 (14) 5-propynyyliurasiili 100 (8) 20 5-bromietynyyliurasiili 100 (8) 5-(1-kloorivinyyli)urasiili 100 (5) : *· 5-jodiurasiili 100 (4) ' : 5-heks-l-ynyyliurasiilia 90 • : 5-vinyyliurasiilia,b 86 • 25 5-trifluorimetyyliurasiili 75 5-bromiurasiili 75 a Inhibitio oli käänteinen, koska tällä johdannaisella käsitellyn entsyymin aktiivisuus palautui hitaasti sata-30 kertaisen laimentamisen jälkeen määritysseoksessa ·· ' b Nämä nukleoemäkset syntyivät in situ käsiteltäessä vas- : ’ : taavia nukleosideja määrällä 40 yksikköä/ml tymidiinifos- ; j forylaasia 35 mM kaliumfosfaatissa 20 minuuttia ennen li säämistä urasiilireduktaasiin. Lähtöyhdistenukleosidit 35 eivät olleet inaktivaattoreita.

112601 17 5-etynyyliurasiilin (EU) tehokkuutta tutkittiin seuraavissa kokeissa 2 - 4 ja kuvioissa kuvatulla tavalla, jolloin kuvio 1 esittää urasiilin ja tymiinin kohonneita pitoisuuksia neljä tuntia sen jälkeen kun rotille oli an-5 nettu suun kautta vaihtelevia annoksia EU:ta, ja kuvio 2 esittää 5-fluoriurasiilin (5-FU) kasvaneita pitoi suuksia plasmassa EU:n vaikutuksesta. Hiirille annettiin 5-FU:ta joko suun kautta (po.) tai interperitoneaalisesti (ip.). 5-etynyyliurasiili (EU) annettiin määränä 2 mg/kg ip. 90 10 minuuttia ennen 5-FU:n antoa.

Koe 2

Urasiilireduktaasin inaktivoituminen (in vivo)

Hiirien, rottien, koirien ja apinoiden, joille oli annettu pieniä määriä 5-etynyyliurasiilia (EU), plasmassa 15 ilmeni nopeasti suuresti kasvaneita urasiili- ja tymiini-pitoisuuksia. Maksimivaikutus ilmeni annolla noin 0,1 mg/ kg po rotilla, 0,5-1 mg/kg se. hiirillä ja suunnilleen 1 mg/kg laskimoon (iv.) koirilla ja merkitsi todennäköisesti urasiilireduktaasin täydellistä inaktivoitumista. 20 Plasman urasiilipitoisuus kohosi näillä annoksilla hiiressä, koirassa ja rotassa arvosta noin 3 μΜ arvoon noin 50 - : 60 μΜ. Urasiilipitoisuus plasmassa laski normaalitasolle 24 tunnin aikana (puoliintumisaika = 10 tuntia) . Kuvio 1 esittää urasiilin ja tymiinin kohonneita pitoisuuksia ro- ,25 tan plasmassa 4 tunnin aikana erilaisten 5-etynyyliurasii- I »

Hannosten jälkeen suun kautta urasiilireduktaasin inakti-voitumisen johdosta. ED50-arvo oli 0,01 mg/kg.

Koe 3

Vaikutus FU-pitoisuuteen plasmassa > » * • ·' 30 Hiirissä ja rotissa, jotka oli esilääkitty 5-ety- nyyliurasiililla (EU) ja joille oli sitten annettu FU:ta, ilmeni jatkuvasti korkeampia FU-pitoisuuksia plasmassa : kuin hiirissä, joita ei oltu esilääkitty (kuvio 2) . Lisäk si tavanomainen vaihtelevuus plasman FU-pitoisuudessa ro- f t : ‘ 35 tissa, joille oli annettu suun kautta FU:ta määränä 50 112601 18 mg/kg, eliminoitui esilääkittäessä EU:lla. Plasman FU:n konsentraatio-aikakäyrien AUC-arvot olivat 41, 126 ja 68 (keskiarvo = 78 ± 55 %) verrattuna arvoihin 417, 446 ja 426 (keskiarvo 430 ± 3 %) esilääkitsemättömissä ja vas-5 taavasti EU:11a esilääkityissä rotissa.

Koe 4 5-fluoriurasiilin (5-FU) kasvaimen vastaisen vaikutuksen voimistuminen hiirissä 5-etynyyliurasiilin (EU) vaikutuksesta 10 Paksunsuolen 38-kasvain istutettiin hiiriin päivänä 0. Hiiriä (8 ryhmää kohti) lääkittiin 5-FU:11a päivinä 1 - 9 taulukosta 2 ilmenevillä annoksilla. EU:ta annettiin ip. määränä 2 mg/kg 30 minuuttia ennen mahdollista 5-FU-antoa. Taulukko 2. Hiirien määrä prosentteina, joissa ei ollut 15 kasvaimia 17. päivänä

Annos 5-FU:ta FU ip. plus EU FU ip. FU po. plus EU FU po. (mg/kg) 0,25 0 0,5 25 0 20 1 12,5 25 2 37,5 37,5a | '·· 3 100 4 loo 10 0 0 ; ·; 25 15 12,5 12,5 : V. 20 12,5 12,5 25 - 12,5 30 87,5a 12,5 30 a Näissä ryhmissä tapahtui yksi kasvaimeen liittymätön kuolema

Claims (9)

112601

1. Menetelmä 5-fluoriurasiilia (5-FU) sisältävän farmaseuttisen yhdistelmän valmistamiseksi, jolla on pa-5 rantunut stabiilisuus urasiilireduktaasia vastaan, tunnettu siitä, että 5-FU tai sen esimuoto yhdistetään urasiilireduktaasi-aktivaattorin kanssa, joka on valittu 5-etynyyliurasiilista (5-EU) tai sen esimuodoista, sopivassa kantajassa. io 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 5-FU:n suhde 5-EU:hun on alueella 1:10 - 50:1.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu suhde on alueella 15 1:1 - 10:1.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään 1 - 200 mg

5-EU:ta yhtä annosyksikkömuotoa kohti.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että käytetään 2 - 50 mg 5-EU:ta : '* yhtä annosyksikkömuotoa kohti.

6. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen : menetelmä, tunnettu siitä, että yhdistelmä sovi- * t » * tetaan oraalisesti annettavaksi.

7. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen : ’ · menetelmä, tunnettu siitä, että yhdistelmä sovi tetaan tabletin, kapselin tai annospussin muotoon. : 8. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään 5 mg 30 tai 10 mg 5-EU:ta yhtä annosyksikkömuotoa kohti.

9. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään 5 - ' ., 3000 mg 5-FU:ta tai sen esimuotoa yhtä annosyksikkömuotoa kohti. 112601