FI109204B - Immuunimäärityksiä ja monoklonaalisia vasta-aineita protrombiiniaktivaatiopeptideille ja niiden hajoamistuotteille - Google Patents

Description

109204

Immuunimäärityksiä ja xnonoklonaalisia vasta-aineita pro-trombiiniaktivaatiopeptideille ja niiden hajoamistuotteille 5 Keksinnön tausta Tämä keksintö koskee koagulaatioalaa ja erityisesti protrombiiniaktivaatiopeptidien F1.2 ja Fl.2.3 ja niiden hajoamistuotteiden des-R F.1.2, F2 ja des-R F2 ("antigeenien") epitooppeja vastaan muodostettuja monokonaalisia vasta-10 aineita, niiden käyttöä ja tällaisten monoklonaalisten vasta-aineiden fragmenttien käyttöä immuunimäärityksissä antigeenien detektoimiseksi ja diagnostisten välineistöjen komponentteina.

Tromboosi on vakava ja usein kuolemaan johtava säilö raus, jossa verihyytymät (trombit) häiritsevät veren normaalia virtausta verisuonissa tai sydämessä. Fibriini on proteiini, jota syntyy verta koaguloivan proteiinin, trom-biinin, vaikuttaessa fibrinogeeniin. Trombi on veren komponenteista, pääasiassa fibriinistä yhdessä punasolujen tai 20 aggregoituneiden verihiutaleiden kanssa, muodostunut kertymä verisuonen tai sydämen ontelon sisäpinnalla. Trombi sisältää liukenemattomia fibriinipolymeerejä, jotka hajoavat myöhemmin fibrinolyysin kautta. Trombit voivat haitata veren nor-*. maalia virtausta ja johtaa vakaviin ja usein kohtalokkaisiin » 25 seurauksiin.

• · ...# Yli 64 miljoonaa amerikkalaista vaivaavat sydän- *.**. verisuonisairaudet (CVD:t), häiriöt, joihin liittyy li- *· sääntynyt tromboosiriski. CVD:t, joiden piiriin kuuluvat sy- *· dänkohtaus, aivohalvaus, korkea verenpaine, arterioskleroosi * 30 ja reumaattiset ja synnynnäiset sydänviat, aiheuttavat yli 50 % kaikista kuolemantapauksista Yhdysvalloissa. Yli • · : 4,8 miljoonalla amerikkalaisella on ollut sydänkohtaus, an- gina pectoris tai molemmat. Arvioidaan, että vuonna 1989 esiintyy 1,5 miljoonaa uutta sydänkohtausta, joista 45 % ta-;;; 35 pahtuu alle 65-vuotiaille; yli 75 % tapauksista vaatii sai- raalahoitoa ja yli kolmasosa potilaista kuolee. Tällä 2 109204 t hetkellä on elossa lähes kaksi miljoonaa halvauspotilasta, ja vuodessa noin 500 000 ihmistä halvautuu. Viidesosa kaikista sydän-verisuonisairauksien aiheuttamista kuolemista tapahtuu alle 65 vuoden iässä. Sydän-verisuonisaiauksien 5 aiheuttamien vuosittaisten terveydenhoitomenojen odotet tiin olevan yli 83 miljardia dollaria vuonna 1988.

Myös muissa häiriöissä esiintyy kohonnutta tromboo-sitaipumusta. Niihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, syöpä, raskaus, ikääntyminen, vammat, eh-10 käisypillereiden käyttö, diabetes mellitus, maksa- ja munuaissairaudet ja liikalihavuus.

Potilaiden tromboosiriskin minimoiminen antikoagu-lanttihoidolla on yksi hoitoalue tällä kentällä. Annettaessa antikoagulanttia on välttämätöntä määrittää halutut 15 lääkepitoisuudet tehokkaan hoidon ylläpitämiseksi. Nykyi sin oraalisen antikoagulantin asianmukainen annostus määritetään seuraamalla potilaan protrombiiniaikaa ("PT"), joka pidetään noin 1,5- - 2,5-kertaisena normaalin plasman vastaavaan arvoon nähden. Suunnilleen oikea annos heparii-20 nihoidossa määritetään usein seuraamalla potilaan aktivoitua osittaista tromboplastiiniaikaan ("APTT"), joka pidetään yli 1,5-kertaisena vertailuarvoon nähden.

Veren koaguloituminen on hyvin monimutkainen pro-*. sessi, jota ei täysin vieläkään ymmärretä. Koagulaatiore-

25 aktiotien viimeinen vaihe johtaa fibriinin, trombin muo-dostumiseen tarvittavan komponentin, muodostumiseen. Fib-riinin muodostuminen vaatii protrombiinin aktivoitumisen * ja siihen liittyvän trombiinin muodostumisen. Kuvio IA

I t ( ’· “· esittää ptrotrombiinin aktivaatiota koagulaatioreaktiosar- V : 30 jassa, ja kuvio IB esittää protrombiiniaktivaatiotuotteita ja hajoamisen kautta syntyneitä muotoja. Tekijä Xa kataly- « · : soi protrombiiniaktivaatiota hyytymistekijän Va, kalsiumin ·”: ja stimuloituneiden verihiutaleiden läsnä ollessa, jolloin protrombiini katkeaa kahdesta kohdasta, Arg 271 - Thr 272 ;;; 35 ja Arg 320 - Ile 321 ja syntyy protrombiiniaktivaatiopep- i I 1 I · » < · I 3 109204 i i | tidifragmenttia FI. 2 ja trombiinia. Ensin mainittu katkea- I minen paljastaa F1.2:n karboksyylipään, jota ei ole läsnä I protrombiinissa ja joka sisältää F1.2:lle ainutlaatuisia epitooppeja. Trombiini voi hajottaa F1.2:n yhden katkaisun 5 kautta (Arg 155 - Ser 156), jolloin tuloksena on protrom-biinifragmentti F1 ja protrombiinifragmentti F2. M. J. Rabiet [J. Biol. Chem. 261 (1986) 13210 - 13215] on ehdottanut, että plasman hyytymisen yhteydessä muodostuu kohdassa Arg 284 - Thr 285 tapahtuvan katkeamisen kautta pro-10 trombiiniaktivaatiopeptidifrgmentti 1.2.3, peptidi, joka on 13 aminohapon verran pidempi kuin F1.2. Fl.2.3 on hy vin labiili ja voidaan detektoida vain proteaasi-inhibiit-toreiden läsnä ollessa.

Verenkierrossa plasman karboksipeptidaasi voi ha-15 jottaa edelleen F1.2:a tai F.2:a poistamalla karboksyyli- päästä viimeisen aminohapon, arginiinin ("R"), jolloin muodostuu hajoamistuotteet des-R F.1.2 tai des-R F2. Tämä i olettamus perustuu Chenowethin ja Teger-Nilssonin töihin [D. E. Chenoweth, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75 (1968) 20 3943 - 3947; A. C. Teger-Nilsson, Acta Chem. Scand. 22 (1968) 3171], jotka ovat osoittaneet verenkierrossa olevan karboksipeptidaasin tunnettujen substraattien, komplement-tikomponentin C5a ja fibrinopeptidi B:n, des-R-muodon. \ Karboksipeptidaasi poistaa ensisijaisesti päätearginiinin, 25 jos välittömästi sen edellä on glysiini tai alaniini [T.

• · .... J. McKay, Archives Biochem. Biophysics 197 (1979) • · 487 - 492]. Välittömästi ennen F1.2:n ja F2:n karboksiter- t · « ; 1 minaalisten sekvenssien päätearginiinia on glysiini, ja • · · '· molempien odotetaan olevan hyviä substraatteja karboksi- ' 30 peptidaasille ja siten pilkkoutuvan.

F1.2 koostuu 271 aminohaposta ja sen puoliintumis-aika verenkierrossa on noin 90 min [K. A. Bauer, J. Clin. ti· Invest. 76 (1985) 826 - 836]. Sen voidaan määritellä si- sältävän kaksi aluetta, F1 ja F2. Fl-alue sisältää erityi-’ 35 sen kalsiumia sitovan aminohapon, gamma-karboksiglutamii- ί 4 109204 i ! nihapon, joka on välttämätön, jotta FI, FI.2 ja protrom- biini omaksuisivat normaaleja, kalsiumista riippuvia kon-formaatioita, jotka ovat tarpeellisia normaalin fosfolipi-diensitomisaktiivisuuden kannalta.

5 Antigeenien syntyminen on osoitus trombiinin muo dostumisesta ja hyytymistekijän Xa aktiivisuudesta. Nykyisin tiedetään, että Fl.2-tasot ovat koholla kliinisissä tiloissa, joihin liittyy kasvanut tromboosiriski, ja laskevat antikoagulanttihoidon aikana [K. A. Bauer, Blood 70 10 (1987) 343 - 350]. Näiden pitoisuuksien mittaaminen on tärkeää potilaan hoidon kannalta.

Trombiinin ja antigeenien muodostumisen ei tarvitse liittyä fibriinin muodostumiseen, sillä trombiinilla on monia luonnollisia substraatteja ja inhibiittoreita. Trom-15 biinin aktivoitumisen lisääntyessä kasvaa kuitenkin myös trombiinin määrä ja fibriinin muodostumisen ja ehkä trombin muodostumisen mahdollisuus kasvaa. Kun sen sijaan tapahtuu vähemmän protrombiinin aktivoitumista, vähenee myös fibrinogeenin pilkkomiseen käytettävissä olevan trombiinin 20 määrä ja trombin muodostumisen mahdollisuus.

Nykyisin on olemassa monia testejä koaguloitumiseen liittyvien verenvuoto-ongelmien ennustamiseksi ja diagnosoimiseksi samoin kuin aktiivisen tromboosin diagnosointi -*. seksi. PT on esimerkiksi yksivaiheinen koagulaatiomääri- 25 tys, jolla testataan tekijät VII, X ja V, protrombiinin ja .... f ibrinogeenin sisältävän koagulaatiojärjestelmän osan yh- tenäisyyttä kokonaisuutena tarkasteltuna, ja se on käyttö- < · · ; *, kelpoinen annettaessa potilaalle oraalisia antikoagulant- *· “· teja. Kuten edellä kuvattiin, APTT on käyttökelpoinen seu- • * * *.' * 30 rattaessa hepariiniantikoagulanttihoitoa. Käytettävissä on myös radioimmuunimäärityksiä luontaisten ja epänormaalien protrombiinipitoisuuksien mittaamiseksi.

On olemassa muutamia immunologisia testejä, joilla

\# mitataan trombiiniaktiivisuuden tulosta, fibrinopeptidi A

35 ja liukoinen fibriini mukaan luettuina. Fibrinopeptidi A

! , I

i · > 5 109204 -pitoisuudet ovat koholla selvän tromboosin yhteydessä, mutta fibrinopeptidi A -pitoisuuden ja tromboosiriskin välinen korrelaatio on heikko. Käytettävissä on polyklo-naalisiin vasta-aineisiin perustuva iirnnuunimääritys trom-5 biini-antitrombiini III -kompleksin määrittämiseksi, jossa mitataan tärkeimmän fysiologisen inhibiittorinsa, anti-trombiini III:n, sitoman epäaktiivisen trombiinin pitoisuutta veressä.

Myöhemmin koagulaatioprosessissa tapahtuu muodostuit) neen trombin fibrinolyysi plasmiinin vaikutuksesta, ja se voidaan mitata muutamin immunologisin testein, kuten D-dimeerin, kaikkien hajoamistuotteiden ja fibriinin hajoamistuotteiden kautta.

Mikään edellä mainituista määrityksistä ei ole 15 osoittautunut tromboosia ennustavaksi.

Tällä hetkellä ei ole saatavissa yhtäkään hyvin herkkää monoklonaalisiin vasta-aineisiin perustuvaa testiä protrombiinin aktivaatioasteen mittaamiseksi. Tällainen testi olisi käyttökelpoinen sellaisten potilaiden identi-20 fioimiseksi, joilla on kohonnut tromboosiriski, antikoagu- lanttihoidossa olevien potilaiden hoidon parantamiseksi, sekundaaristen komplikaatioiden diagnosointikyvyn parantamiseksi, tromboosikuolevuuden alentamiseksi ja tromboosin yhteiskunalle aiheuttaman taloudellisen taakan vähentämi-*·,, 25 seksi.

Kirjallisuudessa on kuvattu tiettyjä testejä, joil-··. la on yritetty mitata protrombiinin aktivaatiota mittaa- maila F1.2. H. Lau [J. Biol. Chem. 254 (1979) 8751 - 8761] ‘ kuvaa radioimmuunitestiä protrombiinifragmenttien F2/F1.2 • « * *,,* 30 määrittämiseksi, jossa käytetään polyklonaalisia vasta- '·’ aineita F2:lle. Nämä polyklonaaliset vasta-aineet eivät erota protrombiinia ja pilkkoutumisen vapauttamia frag-’·, mentteja täydellisesti toisistaan, ellei niille toteuteta ‘>>t: lukuisia immuunipuhdistusvaiheita.

6 109204 ! EP-hakemusjulkaisussa O 303 983 ('983) kuvataan samankaltaista määritystä, jossa käytettiin F2:n/F1.2:n karboksyylipäätä vastaavia synteettisiä peptidejä eläinten immunisointiin polyklonaalisten antiseerumien saamiseksi 5 F2:lle/F1.2:lle. Myös nämä vasta-aineet vaativat immuuni-puhdistusta toimiakseen immuunimäärityksissä F1.2:n detek-toimiseksi.

'983:ssa kuvatussa immuunimäärityksessä päällystetään kiinteä faasi puhdistetulla polyklonaalisella vasta-10 aineella, joka sitoutuu F1.2:n karboksyylipäässä oleviin epitooppeihin ja lisätään sitten leimattua polyklonaalista antiprotrombiinia detektointivasta-aineeksi. Vaikka tällä määrityksellä pystytään detektoimaan F1.2, tässä määrityksessä esiintyy polyklonaalisten vasta-aineiden käytölle 15 luontaisia ongelmia, mukaan luettuina alentunut spesifisyys ja vaikeudet reagenssierien standardoinnissa. Katso H. Pelzer, Haemostasis Abst. 18 Supp. 2 (1988) nro 102.

Q. Shin tiivistelmässä Detection of Prothrombin Activation with Two-Site Enzyme Immunoassay for Fragment 20 Fl.2, Thromb. Hemost. 62 (1989) 165, tiiv. nro 493, kuva taan '983:ssa kuvattujen kaltaista immunogeenia ja määritystä. Polyklonaalista vasta-ainetta F1.2:n karboksyylipäätä jäljittelevälle synteettiselle peptidille käytetään kiinteällä faasilla olevana sitomisvasta-aineena ja lei-·. > 25 mattua monoklonaalista anti-F1.2:a käytetään todennäköi- simmin Fl-alueella tapahtuvaan detektointiin. Shin et ai.

• * mukaan ei tarvita polyklonaalisen sitomisvasta-aineen im- muuniaffiniteettipuhdistusta. Mainitun tiivistelmän perus- ; ‘ teella ei tiedetä, käytetäänkö muita puhdistusmenetelmiä.

* · · 30 Koska reagenssi on polyklonaalinen vasta-aine, sen saata-* vuutta rajoittaa luovuttajaeläimen elinikä eikä sitä voida valmistaa toistettavasta. Vaikka F1.2:n detektoivien ra- • · dio- ja entsyymi-immuunimääritysten käyttö on tarjonnut ·” : ratkaisuja ongelmiin, jotka koskevat antigeenien detek- • t » 35 tointia protrombiinin aktivaation mittaamiseksi, tromboot- » » » · » » · I < » · » · * * • · · 7 109204 tisten tilojen muodostumisen diagnosoimiseksi ja antikoa-gulanttihoidon vaikutusten seuraamiseksi, nykyisin saatavissa olevat testit ovat joko hankalia käyttää tai eivät ole niin herkkiä tai spesifisiä, kuin kliinikko tarvitsi-5 si. Yksi erityinen kaikille mainituille määrityksille luontainen epäkohta on polyklonaalisten vasta-aineiden käyttö sitomisvasta-aineina. Nämä polyklonaaliset vasta-aineet voisivat sitoa protrombiinia, Fl:ä ja mahdollisesti muita fragmentteja F1.2:n lisäksi, mikä heikentää testin 10 spesifisyyttä. Tarvitaan näiden antigeenien vastaisia mo-noklonaalisia vasta-aineita ja uutta immuunimääritystä, jossa hyödynnetään näitä hyvin spesifisiä ja herkkiä mono-klonaalisia vasta-aineita tai niiden fragmentteja.

Yhteenveto keksinnöstä 15 Tämä keksintö tarjoaa parannettuja menetelmiä pro- trombiiniaktivaatiopeptidien Fl.2 ja Fl.2.3 ja niiden ha-joamistuotemuotojen des-R F.l, F2 ja des-R F2 määrittämiseksi näytteestä. Patenttia haetaan erityisesti monoklo-naalisille vasta-aineille ja niiden fragmenteille, jotka 20 sitoutuvat spesifisesti kunkin antigeenin karboksyylipääs-sä olevan epitoopin kanssa. Patenttia haetaan myös näitä monoklonaalisia vasta-aineita sisältäville diagnostisille ! välineistöille antigeenien määrittämiseksi näytteestä.

I Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus ·. 25 Tämän keksinnön mukaiset vasta-aineet ovat monoklo- • · t>; naalisia vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä antigeenien • · ... karboksyylipäälle. Tarkemmin määriteltynä asianomaisen an- ;·1. tigeenin aminohapposekvenssiin perustuvaa synteettistä '· ”· peptidiä käytettiin hapteenina näiden monoklonaalisten • · · 30 vasta-aineiden synnyttämiseksi.

• tl ·.1 · Synteettinen peptidi on sekvenssiltään tunnettu ketju aminohappoja, jotka ovat liittyneet toisiinsa pepti-disidoksin, ja se voidaan valmistaa esimerkiksi kemialli-sin tai yhdistelmä-DNA-menetelmin. Sekvenssi voi olla sama 35 kuin jonkin määrätyn luonnonproteiinin sekvenssi. Pieniä 8 109204 synteettisiä peptidejä voidaan kytkeä sopiviin kantajapro-teiineihin niiden tekemiseksi immunogeenisiksi. Näitä kytkettyjä peptidejä käytettiin immunogeeneinä eläimissä mo-noklonaalisten vasta-aineiden synnyttämiseksi, jotka si-5 toutuvat antigeenien karboksiterminaalisiin epitooppeihin, joita nämä synteettiset peptidit edustavat.

Sekvenssit, joita käytettiin synteettisille peptideille tämän keksinnön yhteydessä, johdettiin protrom-biinin cDNA-sekvenssistä ja protrombiinin tunnetuista 10 pilkkoutumiskohdista. Tarkemmin määriteltynä käytettiin pilkkoutumisessa paljastuvien uusien terminaalisten kar-boksyyliryhmien sekvenssejä. Käyttämällä näitä sekvenssejä olemme kehittäneet ja valikoineet monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat vähäisessä määrin, jos ollenkaan, ris-15 tireaktiivisia protrombiinin kanssa.

Yksi immunogeenisessa konjugaatissa olevan synteettisen peptidin aminohapposekvenssi, joka saa aikaan mono-klonaalisten vasta-aineiden muodostumisen F1.2:n ja siksi F2:n karboksyylipäälle, sisältää vähintään jakson Ile-Glu-20 Gly-Arg-OH. Edullisin synteettinen peptidi sisältää sek venssin Ser-Asp-Arg-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg-OH. Karboksyyli-happomuodossa oleva karboksiterminaalinen arginiini on tämän nimenomaisen immunogeenin välttämätön komponentti.

Synteettinen peptidi, jota käytetään immunogeeninä 25 monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseksi F1.2.3:n » » karboksyylipäälle, sisältää vähintää aminohapposekvenssin > » .... Phe-Asn-Pro-Arg-OH. Edullisin sekvenssi on Tyr-Gln-Thr-

Phe-Phe-Asn-Pro-Arg-OH. Monoklonaalisten vasta-aineiden ; * tuottamiseksi hajoamisfragmenteille des-R F1.2 ja des-R F2 • '· 30 on edullinen sekvenssi Ser-Asp-Arg-Ala-Ile-Glu-Gly-OH.

’.* * Näitä peptidejä voidaan tuottaa käyttämällä ammat timiesten hyvin tuntemia menetelmiä. Orgaanisen kemian >,‘·· peptidisynteesimenetelmiin kuuluu aminohappojen kytkeminen : kondensaatioreaktiolla käyttämällä joko homogeenista faa- 35 siä tai kiinteää faasia. Yleisesti tunnettuihin menetel- I » · • · 9 109204 miin kondensaatioreaktioiden tekemiseksi kuuluvat karbodi-imidimenetelmä, atsidimenetelmä, seka-anhydridimenetelmä ja menetelmä, jossa käytetään aktivoituja estereitä, kuten kuvataan teoksessa The Peptides, Analysis, Synthesis, Bi-5 ology, voi. 1-3, toim. E. Gross, 1979, 1980, 1981. Kiin-teäfaasimenetelmää kuvaa Merrifield [J. Amer. Chem. Soc.

85 (1963) 2149]. Sopivia peptidejä voidaan myös ostaa sellaisten toimittajilta, kuten Cambridge Research Biochemi-cals, Cambridge, UK tai Multiple Peptide Systems, San Die-10 go, Kalifornia.

Kytkimme valitun synteettisen peptidin kantajamole-kyyliin immunogeenin aikaansaamiseksi. Mitä tahansa tehokasta kantajamolekyyliä voidaan käyttää. Sopiviin kanta jamolekyyleihin kuuluvat esimerkiksi ovalbumiini, poly-15 sakkaridi, tulivuorikotilon hemosyaniini ja transferriini. Edullisin kantaja tämän keksinnön yhteydessä käytettäväksi on ovalbumiini.

Kytkemismenetelmät ovat ammattimiesten tuntemia, ja niissä voidaan käyttää kemiallisia silloitusaineita tai 20 hapetusreaktioita, kuten kuvaa esimerkiksi K. Peter [Ann. Rev. Biochem. 46 (1977) 523 - 551], Valmistimme synteettisen peptidin ja kantajaproteiinin konjugaatteja käyttämäl-! lä silloitusaineena N-sukkinimidyyli-3-(2-pyridyylitio)- ! propionaattia (SPDP) ja J. Carlssonin perusmenetelmää 25 [Biochem. J. 173 (1978) 723 - 737].

« ♦ M. Cianfriglian et ai. [Hybridoma 2(4) (1983) 451 - 457] kuvaama hiirissä toteutettava immunisaatiome-nettelyn muunnos tuotti relevantteja monoklonaalisia anti-'· antigeenivasta-aineita. Tämä muunnos oli välttämätön, kos- ‘‘ 30 ka viisi aiempaa fuusiointiyritystä, joissa käytettiin V · muita immunisaatio-ohjelmia, eivät johtaneet asianmukai siin immunogeenille spesifisiin monoklonaalisiin IgG-vas-; ta-aineisiin. Seerumi, jota saatiin immunisoiduista hii- ’ ristä, jotka eivät tuottaneet relevantteja monoklonaalisia 10 109204 vasta-aineita, sisälsi kuitenkin hyvin reaktiivisia ja spesifisiä polyklonaalisia vasta-aineita antigeeneille.

Hiiret immunisoitiin injektoimalla intraperitoneaa-lisesti (i.p.) konjugoitua synteettistä peptidiä täydelli-5 sessä Freundin adjuvantissa. Ensimmäisen immunisoinnin jälkeen hiirten annettiin levätä 21 vuorokautta ja annettiin sitten tehosteannos samaa immunogeenia epätäydellisessä Freundin adjuvantissa. Viimeiset tehosteannokset annettiin päivinä 25, 26 ja 27 sekä laskimonsisäisesti 10 (i.v.) että i.p. käyttämällä samaa immunogeenia PBS:ssä.

j Vaikka hiiret ovat edullinen väline, voidaan käyttää mui takin eläimiä, kuten rottia ja marsuja.

Immunisoidut hiiret lopetettiin päivänä 28 ja poistettiin pernasolut. Noudattamalla muunnosta [B. Butman et 15 ai., Appi. Env. Micro. 54 (1983) 1564 - 1569] Kohlerin ja Milsteinin [Nature 256 (1975) 495] menetelmästä solut fuusioitiin erittämättömän plasmasolulinjan kanssa (P3X63Ag8.563, ATCC-nro CRL 1580, Rockville, Md.) hybrido-mien tuottamiseksi ja jaettiin mikromaljoille, jotka si-20 sälsivät Iscoven muunnettua Dulbeccon alustaa ynnä hypo-ksantiinia, aminopteriiniä ja tymidiiniä (HAT), joko 20 % hevosen seerumia tai 5 % naudan sikiöseerumia, 1 % Nutri-domaa (Boehringer Mannheim) ja vatsaontelon yksitumaisia syöttösoluja. Supernatanteista tutkittiin antiantigeeni-25 vasta-aine epäsuoralla ELISA:11a (enzyme-linked immunoassay) ja kloonattiin valitut positiiviset hybridomaviljel-mät.

Hybridomien tutkiminen asianmukaisen vasta-aineen » · ; tuottamisen suhteen on tämän keksinnön olennainen vaihe.

’· 30 Esimerkiksi F1.2:n vastaisen raonoklonaalisen vasta-aineen * suhteen tehtävän tutkimisen yhteydessä tulisi vasta-aineen olla reagoimaton tai ainakin vain hyvin vähäisessä määrin ristireagoiva protrombiinin tai Fl:n kanssa. Sen tulee : myös tunnistaa luonnon F1.2:ssa ja F2:ssa oleva epitooppi n 109204 ; eikä pelkästään immunsointiin käytettyä synteettisestiä valmistettua peptidiä.

Seulontamääritykset osoittivat, että valituista positiivisista hybridomista peräisin olevilla 44 monoklo-5 naalisella vasta-aineella oli edellä kuvattu toivottu spesifisyys.

Kloonattiin kahdeksan hybridomaa ja kuutta valittua kloonia lisättiin vesivatsakasvaimina hiirissä käyttämällä tavanomaisia menetelmiä. Ammattimiehet tuntevat muita me-10 netelmiä monoklonaalisten vasta-aineiden lisäämiseksi, mukaan luettuna kasvatus bioreaktoreissa, kuten ontelokuitu-patruunoissa tai fermentoreissa. Vasta-aineet, joita lisätään käyttämällä näitä menetelmiä, vaativat myös karakterisointia. Vesivatsassa olevat monoklonaaliset vasta-ai-15 neet karakterisoitiin ELISAlla kuuden kloonatun hybridoman viljelmässä osoittaman spesifisyyden varmistamiseksi. Vasta-aineet puhdistettiin näistä vesivatsanesteistä käyttämällä Protein A -affiniteettikromatografiaa. Muitakin ammattimiesten tuntemia immuunipuhdistusmenetelmiä voidaan 20 käyttää.

Puhdistetut monoklonaaliset antiantigeenivasta-ai-neet karakterisoitiin isotyypin ja isoelektrisen pisteen suhteen. Monoklonaalisen vasta-aineen spesifisyyden määrittämiseksi tehtiin immuunikemialliset analyysit käyttä-25 mällä ELISAa. Kaikkien kuuden vasta-aineen havaittiin si- • · toutuvan spesifisesti seuraaviin antigeeneihin: F1.2, F2 ja PF2-0VA. PF2-0VA on F1.2:n karboksyylipäätä jäljittelevän synteettisen peptidin konjugaatti ovalbumiinin kanssa. Yhdelläkään vasta-aineella ei havaittu spesifistä sitoutu- 30 mistä seuraaviin antigeeneihin: trombiini, Fl, des-R-PF2- I » · ‘ OVA ja ovalbumiini. Des-R-PF2-0VA on ovalbumiinin konju gaatti des-R Fl.2:n karboksyylipäätä jäljittelevän syn-'· teettisen peptidin kanssa.

: Näitä monoklonaalisia antiantigeenivasta-aineita ja 35 niiden fragmentteja voidaan käyttää erilaisissa immuuni- > » 12 109204 I määrityksissä antigeenin detektoimiseksi. Yhdessä edulli sessa menetelmässä antigeenin määrittämiseksi käytetään vähintään yhtä monoklonaalista antiantigeenivasta-ainetta ja vähintään yhtä leimattua analysoitavaa ainetta, joka 5 voi olla leimattu vasta-aine tai leimattu peptidi, edullisesti antiantigeenivasta-aine ja edullisimmin polyklonaa-linen vasta-aine, kerrosimmuunimäärityksessä, jossa a) päällystetään kiinteä faasi monoklonaalisella antiantigeenivasta-aineella, 10 b) lisätään näyte päällystettyyn kiinteään faasiin ja inkuboidaan, c) pestään kiinteä faasi, d) lisätään leimattua antiantigeenivasta-ainetta ja inkuboidaan, 15 e) pestään kiinteä faasi, f) detektoidaan merkkiaineaktiivisuus ja g) katsotaan tulos.

Leimatulla vasta-aineella voi olla sitoutumisspesi-fisyys kiinteällä faasilla olevan vasta-aineen tai anti-20 geenin suhteen. Näyte on edullisesti plasma, mutta muitakin elimistön nesteitä, kuten seerumia, kokoverta, virtsaa, selkäydinnestettä ja nivelnestettä, voidaan käyttää. Pesuliuos on yleensä puskuroitu liuos, mutta se voi olla myös vesi tai sisältää muita komponenteja. Merkkiaine on \># 25 edullisesti piparjuuriperoksidaasi entsyymijärjestelmän ollessa kyseessä, mutta muitakin entsyymejä, kuten alkalista fosfataasia, glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasia, lusiferaasia ja beeta-galaktosidaasia, voidaan käyttää, kuten ammattimiehet tietävät. Esimerkkeihin muissa kuin • 30 entsyymijärjestelmissä käyttökelpoisista merkkiaineista ’ ' kuuluvat fluoresoivat merkkiaineet, kuten fluori-isotiosy- anaatti, rodamiini tai fluoreseiini, radioisotoopit radio--· immuunijärjestelmiä varten sekä hiukkaset.

: Muihin antigeenien in vitro -detektointiin tarkoi- 35 tettuihin menetelmiin, jotka mainitaan esimerkkeinä, mutta ! 13 109204 joita ei ole tarkoitettu rajoittaviksi, kuuluvat kompeti-tiiviset inhibitiomääritykset, yksivaiheiset määritykset ja agglutinaatiomääritykset.

Tämän keksinnön piiriin kuuluvat diagnostiset tes-5 tivälineistöt, jotka on tarkoitettu käytettäviksi määritettäessä antigeenejä näytteistä ja jotka sisältävät vähintään yhtä monoklonaalista antiantigeenivasta-ainetta, joka on suurin piirtein reagoimaton protrombiinin kanssa. Diagnostiset välineistöt voivat lisäksi sisältää puskuri-10 liuoksia, leimattuja polyklonaalisia tai monoklonaalisia antiantigeenivasta-aineita, antigeenejä tai peptidejä ja välineistön käyttämiseen tarvittavia mahdollisia lisätar-vikeita.

Seuraavissa esimerkeissä kuvataan monoklonaalisten 15 anti-Fl.2-vasta-aineiden tuotantoa ja käyttöä. Nämä esimerkit annetaan yksinomaan tämän keksinnön valaisemiseksi eikä niitä tule ymmärtää hakemuksen muuta osaa millään tavoin rajoittaviksi.

Esimerkki 1 20 Synteettisten peptidien valmistus

Immuunikonjugaattien valmistuksessa käytettyjen ja anti-Fl.2-vasta-aineiden tutkimiseen ja karakterisointiin tarkoitettujen synteettisten peptidien aminohapposekvenssit esitetään taulukossa 1.

♦ I » ♦ t * » * » ) » I * \ 1 I · 14 109204

Taulukko 1

Synteettisten peptidien sekvenssit** ja Fl.2:n ja protrombiinin osittaiset sekvenssit Peptidi Aminohappojen lkm. Sekvenssi* 5 _

PF2 10 (8+2) cgSDRAIEGR

desRPF2 9 (7+2) cgSDRAIEG

XPF 10 (8+) cgAIEGRTATS

PF2.14 14 (12+2) cgLDEDSDRAIEGR

10 PF2.K 8 SDRAIEGK

PF2.NH2 8 SDRAIEG R-amidi

PF2.8 8 SDRAIEGR

PF2.6 6 R A I E G R

PF2.5 5 A I E G R

15 PF2.4 4 I E G R

PF2.3 3 E G R

Luonnonproteiini

F1.2 271 ...LDEDSDRAIEGR

Protrom- 20 blini 530 ...LDEDSDRAIEGRTAT..

* Kaikissa synteettisissä peptideissä on vapaa karboksyy- liryhmä C-päässä lukuun ottamatta PF2.4nH2:a, jonka kar- boksyylipää on amidoitu (-CONH2). Neljän peptidin N-päässä 25 on aminohapot C ja G pelkästään konjugointia varten.

, ** Symbolit: A (alaniini), R (arginiini), D (asparagiini- » happo), C (kysteiini), E (glutamiinihappo), G (glysiini),

I (isoleusiini), L (leusiini), K (lysiini), S (seriini), T

» •( (treoniini) ’* 30 : > ' * Peptidit PF2, desPF2, XPF2 ja PF2.14 ostettiin Cam bridge Research Biochemicalsilta, Cambridge, UK; muut pep- » » . tidit ostettiin Multiple Peptide Systemsiltä, San Diego,

Kalifornia. Peptidin 0F2 sekvenssi Cys-Gly-Ser-Asp-Arg-35 Ala-Ile-Glu-Gly-Arg-OH perustuu F1.2:n karboksyylipään ( i » I f » t 1 I » is 109204 kahdeksaan viimeiseen aminohappoon -Ser-Asp-Arg-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg-OH ynnä kahteen lisäaminohappoon, kysteiiniin ja lysiinin, jotka ovat käyttökelpoisia konjugointitarkoituksiin. Myös peptidit desRPF2, Xpf2 ja PF2.14 sisältävät 5 jakson CG N-päässään konjugointia varten.

Esimerkki II

Immuunikonjugaatin valmistus

Edellä esimerkissä I kuvattu PF2 ja ovalbumiini kytkettiin käyttämällä heterobifunktionaalista silloitus-10 ainetta, N-sukkinimidyyli-3-(2-pyridyylitio)propionaattia (SPDP).

| Kytkentämenettelyä varten valmistettiin SPDP:n eta- noliliuos ja määritettiin aktiivisen esterin pitoisuus käyttämällä Carlssonin menetelmää (katso edellä). Oval-15 burniini (laatu V; Sigma Chemical Co.) liuotettiin kytken-täpuskuriin, joka sisälsi 100 mmol/1 NaClra, 100 mmol/1 NaHP04:a, 0,02 % NaN3:a (pH 7,5), ja geelisuodatettiin sitten käyttämällä Sephadex G-25:ä™ (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc.), joka tasapainotettiin kytkentäpuskurissa.

20 Ovalbumiinia inkuboitiin 17-kertaisen mooliylimäärän kanssa SPDP:tä 30 min huoneenlämpötilassa ja geelisuodatettiin sitten edellä kuvatulla tavalla. Ovalbumiinin tiolaatioas-teen arvioitiin olevan 12,5 mol pyridyylisulfidiryhmiä/mol ·.. ovalbumiinia pelkistämällä tioloitu materiaali ditiotrei- ·”·· 25 tolilla ja seuraamalla aallonpituudella 343 nm pyridyyli- tionin vapautumista. PF2:n N-terminaali sen kysteiinin * t · : sulfhydryyliryhmä pelkistettiin inkuboimalla PF2:a pitoi- ! ; suutena 1 mmol/1 kytkentäpuskurissa, joka sisälsi *..* 50 mmol/1 ditiotreitolia, 10 min huoneenlämpötilassa.

• 30 PF2:lle tehtiin nopea geelisuodatus kytkentäpuskurissa tasapainotetulla Sephadex G-10:llä™ (Pharmacia LKB Bio-" technology, Inc.) ja inkuboitiin sitten huoneenlämpötilas- sa tioloidun ovalbumiinin kanssa PF2:n mooliylimäärän ol-lessa 1,25-kertainen ovalbumiinin pyridyylisulfidikohtiin .···. 35 nähden. Kytkentäreaktiota seurattiin spektrofotometrisesti , 109204 ! i pyridyylitiolin vapautumisen kautta; tällä tiolilla on ab-sorbanssimaksimi aallonpituudella 343 nm ja tunnettu eks-tinktiokerroin (8,08 ml/pmol). Kytkentä meni loppuun 10 minrssa, ja keskimääräinen kuormitus oli 8,9 mol 5 PF2:a/mol ovalbumiinia. PF2-OVA:ksi identifioitua konju-gaattia säilytettiin lämpötilassa -20 °C ennen käyttöään immunogeeninä.

Esimerkki III

Muiden peptidiä sisältävien konjugaattien valmistus 10 Valmistettiin ovalbumiinin konjugaatteja desRPF2:n ja XPF2:n kanssa ja piparjuuriperoksidaasin (HRP; Sigma Chemical Co.) konjugaatteja PF2.14:n kanssa käyttämällä SPDPrtä silloitusaineena edellä esimerkissä II kuvatulla tavalla. Pyridyylisulfidaatioreaktioiden tekemiseksi 15 SPDPrtä inkuboitiin 75 min huoneenlämpötilassa HRP:n kanssa moolisuhteessa 0,83:1 tai ovalbumiinin kanssa moolisuh-teessa 30:1. Keskimääräinen lopullinen kuormitus oli 10,2 mol des-RPF2:a/mol ovalbumiinia, 7,4 mol XPF2:a/mol ovalbumiinia ja 1,6 mol PF2.14:ää/HRP. Konjugaatteja säi-20 lytettiin lämpötilassa -20 °C, kunnes ne käytettiin vasta-aineiden seulonnassa ja karakterisoinnissa.

Esimerkki IV

Mbnoklonaalisten antipeptidivasta-aineiden seulon-·.. taan ja karakterisointiin tarkoitettujen proteii- ·;··· 2 5 nien valmistus ···. F1.2, F2 ja protrombiini täytyy puhdistaa huolelli- ; sesti homogeenisiksi, jotta eliminoidaan virheet antipep- ! tidivasta-vasta-aineiden etsimisessä viljelmänesteistä.

Protrombiini sisältää usein sellaisia epäpuhtauksia kuin ‘ 30 F1: ä ja F2:a, jotka voivat häiritä antipeptidivasta-ainei- den etsimistä ja tutkimista. Koska halutut vasta-aineet ei-vät saa tunnistaa protrombiinia, on tärkeää, että pro-: trombiini ei sisällä F1.2:a eikä F2:a.

» · I

Pienet epäpuhtauspitoisuudet poistettiin kaupalli- ‘1!! 35 sesti saatavissa olevasta protrombiinista (Enzyme Research • » · 17 109204

Inc. ) hepariini-Sepharose™-kolonnilla ((Pharmacia LKB Biotechnology, Inc.). Tämä tehtiin dialysoimalla 12 mg pro-trombiinia puskuriliuosta vastaan, joka sisälsi 20 mmol/1 Trisiä ja 50 mmol/1 NaClra (pH 7,5), yön yli lämpötilassa 5 4 °C ja johtamalla se sitten hitaasti samassa puskurissa tasapainotetunhepariini-Sepharose™-kolonnin (2,6 x 29 cm) läpi (Lau, katso edellä). Puhdistettu protrombiini antoi tulokseksi yhden vyöhykkeen elektroforeesissa pelkistetyllä ja pelkistämättömällä hopealla värjätyllä natriumdode-10 kyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelillä ("SDS-PAGE").

Epäpuhdasta Fl.2:a syntyi annettaessa katalyyttisten määrien puhdistettua tekijää Xa (Boehringer Mannheim) j reagoida puhdistetun protrombiinin (25 mg) kanssa Throm- stopin™ (5 pmol/l, NAPAP, N-alfa-(2-naftyylisulfonyyligly-15 syyli)-D-l-amidinofenyylialaniinipiperididi, American Diagnostica Inc.) ja CaCl2:n (100 mmol/1) läsnä ollessa. Reaktion etenemistä seurattiin SDS-PAGE:11a ja se keskeytettiin inhiboimalla tekijä Xa ja trombiini irreversii-! belisti GGACK:lla™ (dansyyli-L-glutamyyliglysyyli-L-argi- 20 niinikloorimetyyliketoni, Calbiochem Corp.) ja PPACK:lla™ (D-fenyylialanyyli-L-propyyli-L-arginiinikloorimetyylike-toni, Calbiochem Corp.), joiden molempien loppupitoisuus oli 50 pmol/l. Sekä Thromstop™ että korkea CaCl2-pitoisuus ovat välttämättömiä F1.2:n muodostamisen yhteydessä synty- 25 neen trombiinin estämiseksi inaktivoimasta protrombiinia ···. tai tuhoamasta F1.2:a. PPACK:ta™ ei voida käyttää Throm- ,·, : stopin™ korvaajana, sillä se inhiboi tekijää Xa halutun 1 *. trombiinin lisäksi.

• * *

Edellä muodostettu F1.2 puhdistettiin dialysoimalla > I · 30 sitä ensin puskuriliuosta (20 mmol/1 Trisiä, 50 mmol/1 NaCl:a, pH 7,4) vastaan yön yli lämpötilassa 4 °C ja se » · käsiteltiin sitten hepariini-Sepharose™-kolonnilla (2,6 x 29 cm) edellä kuvatuissa olosuhteissa protrombiinin puhdistamiseksi. F1.2:a sisältävä piikki indetifioitiin ··. 35 SDS-PAGE:11a ja laitettiin sitten HR 5/5 -FPLC-kolonnille 18 109204 (FPLC = fast protein liquid chromatography, nopea nestek-romatografia proteiineille) Mono-Q™ (Pharmacia LBK Biotechnology, Inc.), joka oli tasapainotettu puskuriliuoksessa. Puhdistettu F.1.2 eluoitui viimeisenä piikkinä 5 50 min kestäneessä NaCl-gradientissa (50 -» 500 mmol/1

NaCl:a, 20 mmol/1 Trisiä, pH 7,4). F1.2:n puhtausaste oli yli 95 % Coomassie-sinisellä värjätyn SDS-PAGE:n perusteella, ja sen näennäinen moolimassa oli 43 000 daltonia. Vähäiset epäpuhtaudet sisälsivät Fl:ä ja satunnaisesti 10 protrombiinia.

Epäpuhdasta Fl:a ja F2:a muodostettiin antamalla Oxyuraneous-myrkystä peräisin olevien yhden tai useamman proteaasin (noin 0,1 mg; Sigma Chemical Co.) pilkkoa pro-trombiini (noin 85 mg) Fl:ksi, F2:ksi ja trombiiniksi. 15 Reaktion etenemistä seurattiin tarkkailemalla trombiiniak- tiivisuuden kasvua trombiiniherkällä kromostraatilla. In-kubointi keskeytettiin 60 min;n kuluttua lisäämällä PPACK:ta™ ja GGACK:ta™, kumpaakin loppupitoisuudeksi 50 pmol/1. Sekä F1 että F2 puhdistettiin sitten Mono-Q™-20 kolonnilla edellä Fl.2:n puhdistuksen yhteydessä kuvatulla tavalla.

Esimerkki V

Immunisointiohjelma

BALB/c-hiiret immunisoitiin edellä esimerkissä II

25 kuvatulla PF2-0VA-immuunikonjugaatilla käyttämällä Cian- ···. friglian menettelyn muunnosta. Hiiret immunisoitiin päivä- : nä 1 intraperitoneaalisesti antamalla 50 pg immunogeenia . 1 täydellisessä Freundin adjuvantissa ja niiden annettiin • 1 » !..1 levätä 21 vuorokautta. Päivänä 22 hiirille annettiin te- » » · ’· ’ 30 hosteannos, 50 pg immuunikonjugaattia epätäydellisessä

Freundin adjuvantissa, ja viimeiset tehosteannokset annet-\ tiin päivinä 25, 26 ja 27 käyttämällä 5 pg immuunikonju- gaattia fosfaattipuskuroidussa fysiologisessa suolaliuok- sessa (PBS), jota annettiin sekä i.p. että i.v. Päivänä 28 » · » i9 109204 poistettiin perna ja eristettiin splenosyytit hybridoma-fuusiota varten.

Esimerkki VI Hybridomien valmistus 5 Immuunisplenosyytit fuusioitiin hiiren myeloomaso- luihin P3X63Ag8.653 käyttämällä Butmanin (edellä) muunnosta Kohlerin ja Milsteinin kuvaamasta menetelmästä. "Fuusio 97" -solut siirrostettiin Iscoven muunnettuun Dulbec-con alustaan, joka sisälsi 20 % hevosen seerumia ja 10 HAT:ia, ja "fuusio 98" -solut siirrostettiin Iscoven muunnettuun Dulbeccon alustaan, joka sisälsi 1 % Nutridomaa™ (Boehringer Mannheim), 5 % naudan sikiöseermia ja HAT:ia, hiiren vatsaonteloeritesoluja sisältävän syöttökerroksen päälle. Viljelmille annettiin uutta ravintoa 2-3 päivän 15 väliajoin korvaamalla 50 % kunkin viljelysyvennyksen alustasta tuoreella kasvualustalla.

Esimerkki VII Vasta-aineiden tutkiminen

Viljelmistä, joissa esiintyi hybridomakasvua HAT-20 alustassa, tutkittiin ELISAlla F1.2:n kanssa reagoivien monoklonaalisten vasta-aineiden tuotanto. Tätä varten | päällystettin Immulon II™ -mikromaljat (Dynatech, Va. ) käyttämällä puhdistettua F1.2:a (100 μΐ/syvennys, 5 pg/ml) PBS:ssä, pH 7,0, ja suojattiin sitten PBS-liuoksella, joka ;·«· 25 sisälsi 3 % Fish-gelatiinia (300 μΐ/syvennys). Sitten li- ··’. sättiin hybridomasupernatantteja (100 μΐ/syvennys) ja in- ,·,: kuboitiin 60 min lämpötilassa 37 °C, minkä jälkeen maljat « » pestiin viidesti deionisoidulla vedellä, joka sisälsi 0,5 % glyserolia ja 0,05 % Tween 20:ä™ /Rohn and Haas), ; i * ' * 30 sitoutumattomien vasta-aineiden poistamiseksi. Vasta-ai neen spesifinen sitoutuminen detektoitiin käyttämällä > » 60 min:n ajan 100 μΐ/syvennys HRP:hen kytkettyjä vuohen vasta-aineita hiiren immunoglobuliinille (IgG ynnä IgM), pestiin ja kehitettiin sitten käsittelemällä 30 min tetra-”, 35 metyylibentsldiinikromogeenisubstraatilla (100 μΐ/syven- < · · m 109204 nys). Reaktio keskeytettiin lisäämällä 100 μΐ/syvennys H2S04-liuosta (2 ekv/1) ja tulkittiin tulokset käyttämällä automaattista mikromaljoille tarkoitettua luentalaitetta aallonpituudella 450 nm. Positiiviset syvennykset levitet-5 tiin ja niistä testattiin uudelleen ELISAlla spesifisyys Fl.lrn, PF2-0VA:n, 0VA:a ja protrombiinin suhteen. Fuusion 97 tuloksena oli 13 F1.2-spesifistä hybridomaa 213:n joukosta ja fuusion 98 tuloksena 31 F.1-spesifistä hybridomaa 635:n joukosta. Supernatanttien isotyyppimääritys tejtiin 10 käyttämällä kaupallista kaksoisimmuunidiffuusiovälineis-töä. Valittiin yhdeensa 8 hybridomaa fusioista 97 ja 98 kloonattaviksi spesifisyystulosten ja IgG-isotyypin perusteella.

Esimerkki VII

15 Hybridomien kloonaus ja lisäys

Hybridomat kloonattiin tekemällä kaksi rajalaimen-nuskloonaussykliä vastaavaan aminopteriiniä sisältämättömään hybridomakasvatusalustaan, joka sisälsi 50 % L929-alustaa. Viimeksi mainittu valmistettiin kasvattamalla 20 hiiren L929-fibroblasteja, jotka saatiin ATCCrstä, yhte näisenä yksisolukerroksena Iscoven muunnetussa Dulbeccon alustassa, joka sisälsi 10 % naudan sikiöseerumia, 3-4 vuorokautta, minkä jälkeen alusta sentrifugoitiin ja steriloitiin suodattamalla. Kolmea stabiilia hybridomakloonia 25 kummastakin fuusiosta lisättiin vesivatsakasvaimina Pris- I · ··. tanellaR (Aldrich Chemical Co. ) esikäsitellyissä CD2 F1 . : -hiirissä (Balb/c x DBA F1 -hybridi) noudattaen tavanomai- ! siä ohjelmia.

Vesivatsanesteestä puhdistettiin kuusi monoklonaa- < > · 30 lista IgG-vasta-ainetta affiniteettikromatografialla käyt tämällä Protein A Sepharosea™.

> » * » i 21 109204

Esimerkki IX

Vesivatsanesteessä olevien monoklonaalisten vasta- aineiden karakterisointi

Vesivatsanesteissä olevien monoklonaalisten vasta-5 aineiden spesifisyys varmistettiin ELISAlla edellä esimerkissä VII kuvatulla tavalla käyttämällä Immulon II™ -mik-romaljojen pinnoilla seuraavia antigeenejä: F1.2, FI, F2, PF2-OVA, OVA, des-R-PF2-OVA ja protrombiini. Kaikilla kuudella monoklonaalisella oli samanlainen ELISA-reaktiivi-10 suuskäyttäytyminen testattujen kahdeksan antigeenin suhteen. Reaktiivisuus oli positiivinen F1.2:n, R2:n ja PF2-OVA:n suhteen. Fl:n, des-R-PF2-OVA:n, OVA:n, protrombiinin trombiinin suhteen reaktiivisuus oli negatiivinen.

| • » I · » » f »

I I

i » < i 22 1 0 9 2 0 4 I Ή «r — f* ^ — © m ηπβ ® m g h rs rs rs <r n w n» h n n n n ^ h n n 5 . *4 *« ·»« M4 — *4 +4 *4 — — *4 *4 ^Λ m4 — — m4 ,_a ^ '*""’ r* w ·» H fk N r< k· H ^ w ^ ^ ***»«« «v h-H eoo eee o o o o o o eoo o o o S ^ w (0 0) i O) € jj S r* φ m «-s rs r* hh^ wd © © h«« m* rs se

Ti y rs rs rs * t « ir -r ^ n n fN rs rs rs nnn W H Ή ** e«4 m4 — — *4 »4 H H *4 mS — *4 #4 H «4 «4

fl) 4JC ** " ·>» * Λ ^ m *m —> M.···· ·· H ·. N

g Q.^ooooeo©ooo©oöeoeeo i « m -h W dl X! μ (0 » m » «e r* e e e m *nir ro «0 in «-<»10 ^ n in in »mm m m m ιΛηη · »n η » » m __I jC «4 *4 *4 44 — »4 «4HN — *4 *4 H f4 »4 H »4 gg g^ φ§ gg gg gg 44 ^4 gg (0 03 o eee eee eee eee eeo eeo 0) 3 > s w < !u *Γ* δ r-* «r « © — r- ^ sp in in «» m m ^ rs m rs * r" i> fsi w rs rj β(Λ« ΙΛ ^ te «iAn Ψ4 %£ ** * rn ·* C ·(—) (a. 0· « ·-* m* ·* o* N N -4 ^ o» *4 N mm ^ H ^ »4

IfJ 1 ¢, « * % ^ M. M M N «k k« ·, t, I· N « M M a» q '_JJ e 00© ©o© ©g© ©e© ©o© eoo

2 * J

•H rö 'Cl M CU < (U >-l > c >0 m » r~ » m r- m n o M »w ·-, 10 o » ·“! jj I O m — » ^ o — in —< n \0 m m » m ** m m n u L, 1 «»cnic o w r» min» oeo » m » » o r* •3 ^4 N «*·*** ·» M· «· M «« <· ·»*«· M ·» «» <* ^ *· (0 CO u. im «m © rs γμ © rv rv © νν·4 —I © rs rs ©

Vl H *· <0 ,J|

X

ggt ^ r* o ^rw»/> ©<ro rs rs λ r» se r* S C-rsi^— — ^ CCP'n Μί(Ν ii«- hN4 v/3 ra rs r r* ie — r* o ^ C“ © n rs m ie in ie rs ec H fe. *·*«· ·* «·· ·* «·"»«* ·*>*·*» ···*·· MO··» j rs — O rs rs © n rs © rs rs — rs — o rs rs ©

(N H

O Ö Λ 0} m » » »00 » te e » » — «-, m m »no JC Ό mm» »»m «0 » m 10»» mmm mm» 3 *H m —~ "»'Vl *WX, Ί.Ί*"1. *^Ί"1 H 0) eee eeo eeo eee eeo eee

3 C

(β Ή H (0 n] in m >0 r» e m f- m»r~ «e m » mm» ·» m m 11 »"O «—*-10 mmm m»e m χ e mm» T" > m — cc »mr* emo m»m mc m emo (0 r* · H ^ · > »· ^ n *, ^ «»MW www flj b. mme mme m m wi m m «h m «4 o m m o

> I

·· e (d m

m to G

,: 4J -μ G c VI G ® G **t**t**t«ir »irvit,

,j i> (D QJ II, , > I III III III III

_J .f-i jj g eee eoe eee eee eee eee

ml (Η0)·Η HHH «Wwwl rl«HH «W«-lw< »4w«H W H H

2 0) Q) (Ö a > d h

0 -H

’ ’ ml Q

*: x a 9 F λ H Sh*4*4«M»4m4*4 S 8, 81 % 8. 8. fi.

d Λ Λ O' O O © U* ν' B -uyM m rs rs m m _, < w

. 0 a -H

: 0 : +· n

H

«Μ

H

,:, w

n . V V

01 ..«CCUmiNffio (A :fu se rs « · \d rs ! . +J · · s s ' mtiee-4<< (N m m «w w4 «_, βι h Ή 1 1 1 1 1 1 n. I^mmmcomie ;· ml tidceemr-m SSJervc-mee ς ε u. u. b. b. b. u.

23 109204 !

Esimerkki X

Puhdistettujen monoklonaalisten vasta-aineiden karakterisointi

Kuusi puhdistettua monoklonaalista anti-Fl. 2-vasta-5 ainetta karakterisoitiin fysikaalisten ominaisuuksien ja spesifisyyden suhteen.

a) Fysikaaliset ominaisuudet 1) Taulukossa 3 luetellaan monoklonaalisten vasta-aineiden fysikaaliset ominaisuudet, mukaan luettuina iso-10 tyyppi, isoelektriset pisteet (pl) ja mikromaljojen kyllästämiseen tarvittava määrä. Vasta-aineen isotyyppi määritettiin edellä esimerkissä VII kuvatulla tavalla. Isoelektriset pisteet määritettiin isoelektrisellä fokusoinnilla käyttämällä Phast-Gel Systemiä™ (Pharmacia LKB Bio-15 technology, Inc.). Vyöhykekuviot vastasivat monoklonaalisten, ei polyklonaalisten, vasta-aineiden läsnäoloa.

| • · t » » t < t I 1 I « • 1 * » t · i I • ! 1 # · « 24 109204 u < X > ι ι i iti ft- o p o, rt ,. u > I I I I I +

+J CL O

0) y e cn 3 \ ft- tn a. > I I I »il

3- X O

W

H g

<0 Ή « S

Ci—4 O I I

Φ m to <n I I I iii -Η Ό ** Φ ft- g 3 rt Ό Q, ft ** ö U -H «

O -L» (Olli III

CP U) M

•H 3 H

A) a (0

w I P Hill III

*0 CQ H

3 rt X

Π Ο ΓΟ Λ) 2 ΓΜ + + + + + + 3 ^ Cl Ö to 5 3 0 n 3 m t-c I I I ill (0 -2 3 I >

(Ö P fN

±J X II

“ (0 rH + + + + + + !A 0)+ ft.

!3 > (N J5 m 1 φ } H §

Oh o 3 I in to M 1 τί1 h •S ·Η < o JC j! p in o in

p1 T1 fi ‘H M m O CO H

pJ/HOJCLE OOO + + CO

—1 2 p I v. ... ooo

^fTjtflCQD) OOO

p 3rta OOO

to β S i in H 0) μ s W1h s u c \ >H φ o t7> _j p x c i-i p ·· ·— o o vo

. M1Hrt OO OrOtN

* P > C OrH (N(Ni-l

, . ffl I Ο Φ CO

' 1 3 CQ I Ό C rt o» jc a.

• Λ 0 ft- :«0 ,»1 1 y ε a- c

• · i-H

λ o • e m ;·. o 5 ' 11 S c m • c φ rt CO) » o ω Λ 2

* · fl) Λ: >- tn m r- «+ Ό (N

* 1 w>,pnj mmm mmm * -1-¾ C ω E ‘ ...

. . C :«J -H OOO OOO

* . 3 Φ iH P

, I JJ > r—I ro , 1 · T\ >i n « •μ cn x > 0)

P

. w VO CO CO O O

* 1 "H vo vo vo r- r-1 *! »rt

• y III I l CO

|C

• Γ3 O'#1· m vo λ I 3 H ... . .

I ψ 0- vO VO vO vO vO

>

» 1H

ίΐ· Οι o- I · x >1 u

1 1 1 P MMM M rH (N

• o ooo ooo • tfl Φ Ol Q cn oi cn

! 1 1 H M H M MMM

t Γ- CO

«Τ' (J\ V 1 ft- ft- * 1 sc a * · ort»-irt oomo * -Η Ο1» Μ Μ νΗΓ^ΟΟΜ *, 1 1 CQ to I I I (0111 t rt3vocoov3cMmm • 0 3 3 s » · 2 ft- ft- 25 109204 ii) Mikromaljan kyllästämiseen tarvittavan vasta-ainemäärän määrittämiseksi inkuboitiin 100 μΐ liuosta, joka sisälsi 5 pg/ml - 90 pg/ml vasta-ainetta puskuriliuoksessa, joka sisälsi 150 mmol/1 NaClra, 20 mmol/1 Trisiä ja 5 5 mmol/1 CaCl2:a (pH 7,4), Griener™-mikromaljojen kanssa (Organon Teknika, Inc.) huoneenlämpötilassa 18 tuntia. Syvennykset pestiin kolmesti käyttämällä 300 μΐ/syvennys liuosta, joka sisälsi 150 mmol/1 NaCl:a ja 0,05 % tween-20 :ä™, ja suojattiin sitten käsittelemällä 200 pl:lla liu-10 osta, joka sisälsi 150 mmol/1 NaCl:a, 20 mmol/1 Trisiä, 5 mmol/1 CaCl2:a ja 5 % rasvatonta kuivamaitoa (pH 8,2), tunnin ajan lämpötilassa 37 °C ja pestiin sitten kuten edellä. Inkuboitiin HRP-leimattua vuohen antihiiri-immuno-globuliinia (Boehringer Mannheim) kunkin syvennyksen kans-15 sa tunnin ajan lämpötilassa 37 °C. Syvennykset pestiin kuten edellä ja mitattiin HRP-aktiivisuus aallonpituudella j 450 nm käyttämällä tetrametyylibentsidiiniä/vetyperoksidia indikaattorina, rikkihappoa keskeytysliuoksena ja 10 min:n värinkehitysaikaa. Monoklonaalisen vasta-aineen pitoisuus, 20 jolla HRP-aktiivisuus ei enää kohonnut, katsottiin syvennyksen kyllästyksen vaatimaksi pitoisuudeksi. Näiden kuuden monoklonaalisen vasta-aineen yhteydessä syvennyksen kyllästyminen tapahtui vasta-ainemäärillä, jotka ovat yhtäpitäviä monoklonaalisten vasta-aineiden yhteydessä ta-·. 25 vallisesti raportoitujen arvojen kanssa.

ttft; iii) Spesifisyys. Taulukossa 3 esitetään yhteenveto • · ... puhdistettujen anti-Fl. 2-vasta-aineiden spesifisyydestä

Fl:2:n, Fl:n, F2:n, protrombiinin, trombiinin, ovalbumii-

• I

Ί ni-PF2-immuunikonjugaatin, ovalbumiinin konjugaatin '· ’· 30 desRPF2:n, XPF2:n ja yhden ei-sukulaispeptidin (PCPr) kan- ·.· * ssa sekä pyridyylidisulfidoidun ovalbumiinin suhteen.

Näitä tutkmuksia varten Griener™-mikromaljät pääl-: ·.: lystettiin antigeenillä (1 pg trombiinia; F1.2:a, Fl:ä, F2:a, protrombiinia, ovalbumiini-PcPr:ää ja pyridyylisul-35 fidoitua ovalbumiinia 100 ng kutakin, ovalbumiinin kon- t i i » » 26 109204 jugaattia PF2:n, desRPF2:n ja XPF2:n kanssa 10 ng kutakin) liuoksessa, joka sisälsi 150 mmol/1 NaCl:a, 20 mmol/1 Tri-siä ja 5 mmol/1 CaCl2:a (pH 8,2), 18 tuntia huoneenlämpötilassa. Sitten maljat pestiin ja suojattiin edellä ku-5 vatulla tavalla. Monoklonaalista vasta-ainetta (100 μΐ liuosta, joka sisälsi 50 pg/ml - 70 pg/ml vasta-ainetta puskuriliuoksessa, joka sisälsi 150 mmol/1 NaCl:a, 20 mmol/1 Trisiä, 5 mmol/1 CaCl2:a ja 0,02 % Tween-20:ä™, pH 7,4) in-kuboitiin päällystettyjen levyjen kanssa 1 tunti lämpöti-10 lassa 37 °C. Kukin malja pestiin kuten edellä ja sitoutunut j vasta-aine detektoitiin käyttämällä HRP-leimattua vuohen anti-hiiri-IgG:tä (H+L) edellä kuvatulla tavalla. Kunkin vasta-aineen titteri oli maljaan sidotun ovalbumiini-PF2-konjugaatin kanssa määritetyn isotermin keskipiste (katso 15 kuvio 3). Vasta-aine määriteltiin reaktiiviseksi, kun aal-i lonpituudella 450 nm mitattu absorbanssi oli enemmän kuin kolminkertainen taustan absorbanssiin nähden käytettäessä 5 pg/1 vasta-ainetta.

Kukin kuudesta monoklonaalisesta vasta-aineesta 20 tunnisti F1.2:n ja F2:n 5-10H:ta lukuun ottamatta eikä tunnistanut Fl:ä, protrombiinia (II), trombiinia (Ha) , pyri-dyylisulfidoitua ovalbumiinia (pyr-OVA) eikä ovalbumiinin konjugaatteja des-R-PF2:n, XPF2:n ja PCPrrn kanssa. Monk-·_ lonaalisella vasta-aineella 5-10H oli korkeampi tausta kuin 25 viidellä muulla monoklonaalisella vasta-aineella, todennäköisesti epäspesifisten vuorovaikutusten vuoksi. Käytettä-*··* essä vielä tiukempaa reaktiivisuusmääritelmää (A450 korke- ampi kuin tausta käytettäessä 50 pg/ml vasta-ainetta) vas- » t ta-aineet 6-9A, 8-11H, 9-1A, 2-7C ja 5-3B eivät vieläkään : .* 30 tunnistaneet Fl:ä, protrombiinia, trombiinia eivätkä yhtä kään testatuista ovalbumiinikonjugaateista.

:’.j iv) Vasta-aineista tutkittiin myös kyky sitoa F1.2 .’··. liuoksesta kerros-ELISA-testausmuodossa. Valmistettiin vas- ta-aineella päällystetyt Gnener -maljat ja suojattiin 27 109204 ne edellä maljankyllästystutkimuksen yhteydessä kuvatulla tavalla; käytettiin vasta-ainepitoisuuksia, joiden tiedettiin kyllästävän maljan. Erilaisia F1.2-pitoisuuksia (0,023 - 23 nmol/1) liuoksessa, joka sisälsi 150 mmol/1 5 NaClra, 20 mmol/1 Trisiä ja 5 mmol/1 CaCl2:a (pH 7,5), in-kuboitiin maljan syvennyksissä 1 tunti lämpötilassa 37 °C ja poistettiin sitten sitoutumaton Fl.2 edellä kuvatulla tavalla. HRP-leimattuja polyklonaalisia vasta-aineita pro-trombiinin kalsiumista riippuvalle vastineelle (katso esi-10 merkki XI) inkuboitiin maljan kanssa 1 tunti lämpötilassa 37 °C, minkä jälkeen malja pestiin. HRP-aktiivisuus määritettiin edellä kuvatulla tavalla.

Kuvio 4 esittää monoklonaalisten vasta-aineiden F1.2-sitomisisotermejä. Kukin vasta-aine pystyi sitomaan 15 liuosfaasissa olevaa F1.2:a ja olisi ollut käyttökelpoinen F1.2-kerros-ELISA:n kehittämiseen. Vasta-aineet 5-10H ja 5-3B olivat muita parempia alimman F1.2-pitoisuuden detek-toinnin suhteen. 5-10H:n epäspesifisten sitoutumisominai-suuksien vuoksi valittiin 5-3B vasta-aineeksi F1.2-ELISAn 20 kehittämiseen ja talletettiin se the American Type Culture Collectioniin, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852, USA, 2. marraskuuta 1989 numerolla ATCC HB10921.

v) Tehtiin lisää spesifisyystutkimuksia monoklonaa-lisen vasta-aineen 5-3B epitooppivaatimusten määrittämi-·. 25 seksi paremmin. Käytettiin kompetitiivista ELISA-mallia, i<>; jossa käytettiin mikromaljoja, jotka oli päällystetty ... edellä kuvatulla tavalla käyttämällä 5-3B-kyllästyspitoi- suutta. HRP-leimattua PF2.14:ää (50 μΐ, 10 nmol/1 konju-*j gaattia) inkuboitiin 75 min lämpötilassa 37 °C yhtä suuren ’· '· 30 tilavuuden kanssa erilaisia puhdistetun F1.2:n tai syn- ·.1 1 teettisen peptidin pitoisuuksia 150 mmol/1 NaClra, 20 mmol/1 Trisiä, 5 mmol/1 CaCl2:a ja 0,05 % Tween-20™:ä : ·.: sisältävän puskuriliuoksen (pH 7,2) läsnä ollessa. Syven- nykset pestiin neljästi 300 pl:lla puskuriliuosta, joka 35 sisälsi 150 mmol/1 NaCl:a, 20 mmol/1 Trisiä ja 0,05 % ' i i I • # t · » * 28 109204

Tween-20™:ä (pH 7,2). HRP-aktiivisuus määritettiin edellä yksityiskohtaisesti kuvatulla tavalla, ja se heijasti HRP-; PF2.14-sitoutumisastetta (B). Kilpailevan antigeenin pois sa ollessa havaittiin maksimisitoutuminen (B0). Suhde B/Bc 5 heijasti HRP:n ja PF2.14:n välistä prosentuaalista sitoutumista .

Sekä Fl.2 että PF2.14 kilpailivat tehokkaasti HRP-PF2.14:n kanssa (kuvio 5), mikä osoittaa kompetitiivisen määritysmuodon järkevyyden käytettäessä leimattua peptidiä 10 ja varmistaa 5-3B:n kyvyn tunnistaa sekä luonnonproteiini että synteettinen peptidi. Vertailun vuoksi mainittakoon, etteivät des-RPF2 ja PF2.NH2 kumpikaan kilpailleet HRP-PF2.14:n kanssa ja PF2.K kilpaili vain suurena pitoisuutena (kuvio 6). Nämä tulokset viittaavat siihen, että jotta 15 5-3B tunnistaisi epitoopin, ei riitä, että läsnä on minkä tahansa vapaan karboksyyliryhmän sisältävä C-terminaalisen aminohappo tai vapaata karboksyyliryhmää sisältämätön C-terminaalinen arginiini, ja että C-terminaalisen positiivisesti varautuneen, vapaan karboksyyliryhmän sisältävän 20 aminohapon (ts. lysiinin) läsnäolo on tärkeää muttei riittävää. Optimaalinen tunnistus tapahtuu, kun läsnä on vapaan karboksyyliryhmän sisältävä C-terminaalinen arginiini.

Eri pituisten peptidien suhteelliset kyvyt kilpail-·. 25 la HRP-PF2.14:n kanssa osoittivat, että kriittinen epitoo- pin koko 5-3B:n toimesta tapahtuvan tunnistuksen kannalta ... on 6-8 aminohappoa (kuvio 7).

. Esimerkki XI

’· ’· Vasta-aineiden protrombiinin kalsiumista riippuval- » 1 ♦ '1 ” 30 le vastineelle · Vasta-aineet valmistettiin ja puhdistettiin muuten N. M. Tain [J. Biol. Chem. 255 (1980) 2790] kuvaamalla ta-; valla, mutta immunogeenit olivat ihmisen protrombiini ja ihmisen protrombiinifragmentti Fl eikä naudan protrombii-35 ni. Nämä vasta-aineet tunnistavat Fl:n protrombiinin ja » 29 109204 ! F1.2:n luonnollisessa kalsiumista riippuvassa konformaati-ossaan.

Esimerkki Xll HRP-leimattujen vasta-aineiden valmistus protrombiinin 5 kalsiumista riipuvalle vastineelle

Protrombiinin kalsiumista riippuvan vastineen vastaisia vasta-aineita kytkettiin HRP:hen käyttämällä SPDP:tä silloitusaineena ja Carlssonin menetelmää (katso edellä). Erona tämän esimerkin ja esimerkin I välillä on, 10 että sekä vasta-aine että HRP tioloitiin ensin reaktiolla SPDP:n kanssa. Yhtä HRP-moolia kohden tuotiin suunnilleen yksi pyridyylidisulfidaattikohta. Tioloitu HRP pelkistettiin käyttämällä ditiotreitolia kytkentäpuskurissa (pH 4,5) ja geelisuodatettiin Sephadex G-25:llä™, joka oli ta-15 sapainotettu kytkentäpuskurilla (pH 7,5), ja annettiin sitten reagoida tioloidun vasta-aineen kanssa pH:n ollessa

7,5 45 - 60 min huoneenlämpötilassa. Inkuboinnin yhteydessä moolisuhteet valittiin siten, että saatiin konjugaatte-ja, joissa kuormitus oli 2-5 mol HRP:tä/mol vasta-ainet-I 20 ta. 7,5-%:isessa homogeenisessa geelissä tehty SDS-PAGE

varmisti, että läsnä oli konjugaattia, joka moolimassa oli yli 150 000 daltonia.

Esimerkki XlII

Fl.2-kerros-ELISA

·. 25 F1.2-ELISA on kaksivaiheinen kerrosimmuunimääritys ' ihmisen Fl.2:a varten, jossa käytetään sitojana monoklo- • · naalista vasta-ainetta 5-3B, joka on spesifinen F1.2:n karboksyylipäälle.

Määrityksessä käytetty mikromalja valmistettiin in- I · . 30 kuboimalla 0,4 pg 5-3B:tä (puskuriliuoksessa, joka sisäl- . · tää 150 mmol/1 NaClra ja 20 mmol/1 Trisiä, pH 7,2) syven nystä kohden 18 tuntia huoneenlämpötilassa. Tämä vasta-ai-·,: nemäärä kyllästi syvennyksen näissä immobilisaatio-olosuh- teissä. Kustakin syvennyksestä imettiin pois sisältö ja 35 lisättiin sitten 150 μΐ suojausliuosta (1 % ovalbumiinia, 1 > 3o 109204 i i 2,5 % sakkaroosia, 150 mmol/1 NaClra, 20 mmol/1 Trisiä ja 0,05 % Tween-20:ä™, pH 7,2). Kun oli inkuboitu 1 tunti huoneenlämpötilassa, syvennyksen sisältö imettiin taas pois. Maljan annettiin kuivua yön yli huoneenlämpötilassa 5 ja se säilytettiin sitten kuivausainepakkauksen sisältävässä Mylar-kalvopusissa lämpötilassa 4 °C.

Määrityksessä käytetyt kalibrointi- ja vertailuaineet valmistettiin lisäämällä puhdistettua F1.2:a ihmisen plasmaan, josta oli poistettu F1.2. Ennen poistamista sit-10 raattikäsitelty normaali plasma sekoitettiin tilavuussuhteessa 9:1 puskuroidun plasmanstabilointiliuoksen kanssa. Poisto tehtiin kahdesti plasman BaS04-adsorptiokäsittelyllä (0,22 g BaS04/ml plasmaa). Tällä menettelyllä poistettiin gamma-karboksiglutamiinihapporyhmiä sisältävät proteiinit, 15 mukaan luettuina protrombiini ja F1.2. Puhdistettua F1.2:a lisättiin adsorptiokäsiteltyyn plasmaan siten, että saatiin kalibrointiliuokset, jotka sisälsivät 0, 0,25, 1,0, 3,0, 6,0 ja 10 nmol/1 F1.2:a, ja vertailuliuokset, jotka sisälsivät 0,5 ja 7,0 nmol/1 F1.2:a. Kalibrointi- ja ver-20 tailuliuokset kylmäkuivattiin 1,0 ml:n annoksina, ja ne vaativat sekoittamista puskuroituun liuokseen ennen käyttöä. Tässä määrityksessä käytetyn kalsiumista riippuvan protrombiinin vastineen vastaisen HRP-leimatun vasta-aineen valmistusta on kuvattu edellä esimerkissä XII. Tämä 25 vasta-aine kylmäkuivattiin kaniinin seerumiin perustuvassa matriksissa, ja se vaati sekoittamista proteiiniphjäiseen puskuroituun liuokseen ennen käyttöään määrityksessä de-tektointivasta-aineena.

Yksi tähän määritykseen soveltuva näyte oli hepa-30 riinikäsitelty plasma, joka sisälsi vähintään normaalin : antitrombiini III -pitoisuuden (30 %). Ennen määritystä plasma sekoitettiin tilavuussuhteessa 9:1 määrityksen : herkkyyden parantamiseen käytetyn puskuroidun näytteenkä- .··. sittelyreagenssin kanssa. Plasmanäytteille, jotka sisältä- • 35 vät enemmän kuin 10 nmol/1 F1.2:a, voidaan tehdä määritys > 3i 109204 laimentamalla tarpeen mukaan O nmol/1 F1.2:a sisältävällä kalibrointiliuoksella, niin että mittaus voidaan tehdä määrityksen toiminta-alueella 0-10 nmol/1 F.2:a, kuten on nähtävissä taulukosta 4.

5

Taulukko 4 F1.2-ELISA: Näytteen ja kalibrointiliuoksen vastaavuus

Fl.2 (nmol/1)

Kohta A Kohta B

10 Laimennus- laimen- laimen- laimen- laimen-suhde nettu tamaton* nettu tamaton* Näyte 1** 1/2 >10 NA 9,68 19,4 1/4 5,28 21,1 4,87 19,5 15 1/8 2,68 21,4 2,39 19,1 1/16 1,40 22,4 1,37 21,9 1/32 0,69 22,1 0,67 21,4 keskiarvo (SD): 21,7 (0,6) 20,3 (1,3) Näyte 2 20 1/2 8,19 16,4 7,69 15,4 1/4 3,94 15,8 3,78 15,1 1/8 2,00 16,0 1,98 15,8 1/16 1,01 16,2 1,12 17,9 1/32 0,52 16,6 0,62 19,8 25 keskiarvo (SD): 16,2 (0,3) 16,8 (2,0) ...j * Laskettu jakamalla laimennetun näytteen F1.2-pitoisuus asianomaisella laimennussuhteella ** Näytteet 1 ja 2 valmistettiin lisäämällä F1.2:a 2 nor-' ! 30 maalin luovuttajan nepariinikäsiteltyyn plasmaan.

' ’ Plasmanäytettä, kalibrointiliuosta (0-10 nmol/1

Fl.2:a) tai vertailuliuosta (pitoisuudet I ja II) inkuboi-,·· tiin 60 min huoneenlämpötilassa päällystetyn mikromaljan ,,,·’ 35 syvennyksen kanssa. Sitoutumattomat proteiinit protrombii- ni mukaan luettuna poistettiin pesemällä. Pesu tehtiin • · » I t „ 109204 | 32 f i imemällä pois syvennyksen sisältö, täyttämällä syvennys puskuroidulla pesuliuoksella (300 μΐ) ja imemällä syvennys tyhjäksi; täyttö ja imeminen toistettiin neljä kertaa. Toisessa vaiheessa sitoutuneeseen F1.2:een liitettiin pro-5 trombiinin kalsiumista riippuvan vastineen vastaisia HRP-leimattuja vasta-aineita inkuboimalla 60 min huoneenlämpötilassa. Toinen pesu poisti sitoutumattoman HRP-leimatun vasta-aineen. Sitoutunut HRP-aktiivisuus määritettiin käyttämällä indikaattorijärjestelmänä tetrametyylibentsi-10 diinin (TMB) ja vetyperoksidin seosta suhteessa 1:1 (värin kehitys 10 min) ja keskeytysreagenssina rikkihappoliuosta (2 ekv/1). Aallonpituudella 450 nm mitattu absorbanssi oli verrannollinen F1.2-pitoisuuteen (kuvio 8). Näytettä, ka-librointiliuosta, vertailuliuosta, detektointivasta-ainet-15 ta, TMB:n ja vetyperoksidin seosta ja rikkihappoa käytettiin kaikkia 100 μΐ/syvennys.

Esimerkki XIV

F1.2-ELISAN analyyttinen suorituskyky Määrityksen herkkyys (ts. pienin F1.2-pitoisuus, 20 joka on erotettavissa 0 nmol/1 F1.2:a sisältävästä kalib-rointiliuoksesta) on 0,05 nmol/1 F1.2:a. Tämä arvon määrittämiseksi tehtiin useita toistomäärityksiä 0 nmol/1 F1.2:a sisältävästä kalibrointiliuoksesta ja määritettiin F1.2-pitoisuus, joka vastaa keskimääräistä absorbanssia ·_ 25 aallopituudella 450 nm ynnä kahta standardipoikkeamaa, ekstrapoloimalla kalibrointikäyrältä.

I » Määritys on spesifinen F1.2-pitoisuuden ollessa vä-hintään 0,23 nmol/1, kun läsnä on 1,5 pmol/l protrombii- * » ’ϊ nia. F1.2-saanto puskuripohjäisestä järjestelmästä, joka ’’! 30 sisälsi 1,5 pmol/l puhdistettua protrombiinia, ja heparii- : · nikäsitellystä plasmasta, joka sisälsi noin 1,5 pmol/l protrombiinia, oli keskimäärin 92 % ja vastaavasti 98 %, : kuten nähdään taulukosta 5.

33 109204

Taulukko 5 FI.2-saanto protrombiinin läsnä ollessa

Tutkittu Fl.2-alue Saanto (%)

Matriksi (nmol/1) Keskiarvo SD N

5 Puskuri + 1,5 pmol/l pro- trombiinia 0,23-23 92 13 3

Normaali plasma 0,5-10 98 13 3 10 Ristireaktiivisuus protrombiinin tai muiden plasma- j pohjaisten proteiinien kanssa olisi johtanut yli 100 %:n saantoihin. Määrityksessä ei lisäksi havaittu huomattavaa triglyresidin, hemoglobiinin tai bilirubiinin aiheuttamaa häirintää (taulukko 6).

15

Taulukko 6 F1.2-ELISAN spesifisyys

Analysoitava aine Pitoisuus F1.2-saanto (%)

Protrombiini 1,5 pmol/l 98 20 Triglyseridi 500 mg/dl 103

Hemoglobiini 100 mg/dl 111

Bilirubiini 20 mg/dl 97

Mitattu epätarkkuus on vertailukelpoinen muiden 25 kerros-ELISA-määritysten kanssa [J. A. Hoek, Clin. Chem.

34 (1988) 2058 - 2062]. Kahdesta kohdasta määritetyt vari-aatiokertoimet olivat alle 9 % määrityksen sisäisen epä-tarkkuuden ollessa kyseessä ja alle 11 % määritysten väli-,* sen epätarkkuuden ollessa kyseessä kummallakin vertailu- ·,· 30 liuoksen pitoisuudella I ja II, kuten nähdään taulukosta ;·. 7.

» ) 34 109204

Taulukko 7 F1.2-ELISAN toistettavuus FI.2 (nmol/1)

Keskiarvo SD N CV-%

5 Määrityksen sisäinen pitoisuus I

kohta A 0,487 0,012 20 2,5 kohta B 0,587 0,054 20 9,2

pitoisuus II

10 kohta A 6,49 0,44 20 6,8 kohta B 6,56 0,42 20 6,4

Määrityksen välinen pitoisuus I

kohta A 0,498 0,043 20 8,6 15 kohta B 0,485 0,053 13 10,6

pitoisuus II

kohta A 6,97 0,53 20 7,6 kohta B 6,92 0,56 12 8,1

20 Esimerkki XV

F1.2-ELISAn kliininen suorituskyky

Mitattiin käyttämällä edellä olevan esimerkin XIII

mukaista ELISA-määritystä F1.2-pitoisuuksia terveistä henkilöistä, potilaista, joilla oli tromboosi tai tila, 25 johon liittyy tromboosiriski, ja antikoagulanttihoidossa olevista potilaista. Terveiden alle 45-vuotiaiden ihmisten keskimääräinen F1.2-pitoisuus oli 1,5 ± 0,6 nmol/1 (±SD; n = 30), joka sopii yhteen radioimmuunimäärityksellä mi- *,· tattujen arvojen kanssa [K. Bauer, Blood 70 (1987) j 30 343 - 350]. Kohonneen F1.2-tason (>2,7 nmol/1) esiintymis- . ·, tiheys oli 38 % (15/39 potilasta) tromboosialttiustiloissa * * ja 100 % (16/16 potilasta) todetuissa tromboositiloissa.

, kuten taulukossa 8 esitetään. F1.2-pitoisuudet olivat yli i » 20 nmol/1 kahdessa sirppisoluanemiatapauksessa ja yhdessä 35 myrkytystromboositapauksessa.

> » » » i 35 109204

Taulukko 8 FI.2 potilaissa, joilla on tromboosi ja tiloja, joihin liittyy tromboosiriski 5 Kohonneen Fl.2*-tason esiintymistiheys (potilaiden lkm, joilla F1.2 > 2,7 Kliininen tila nmol/l/potilaiden lkm.)

Tromboosi

Halvaus 1/1 10 DIC 2/2

Sydäninfarkti 8/8

Laskimotromboosi 5/5

Yhteensä 16/6 (100 %)

Tromboosiriski 15 Syövät 3/6 SLE tai LUPUS-antikoagulantti 2/5

Epästabiili angina pectoris 3/6

Sirppisolusairaus 5/13 PHN 0/1 20 Ääreisverisuonisairaus 1/2

Diabetes Mellitus 1/6

Yhteensä 15/39 (38 %) * Referenssialue (CI 95 %) F1.2:lle: 0,3 - 2,7 nmol/1 (30 25 tervettä luovuttajaa, iät 18 - 45 vuotta; normaalijakautuma: keskiarvo ± 2SD = 1,5 ± 1,2 nmol/1 i * · F1.2-pitoisuudet olivat alentuneita (alle 0,3 nmmol/1) viidellä potilaala, jotka olivat pitkäaikai- I * ; 30 sessa kumadiinihoidossa (taulukko 9).

* » ; » • » » » i * » I 36 1 0 9 2 0 4 j

Taulukko 9 FI.2 oraalisessa antikoagulanttihoidossa olevissa potilaissa

Kliininen tila 5 (kaikki kumadiini- F1.2 lääkityksellä) (nmol/1) Komentti

Maksasyöpä 0,21 pitkäaikainen Rx SLE 0,21 pitkäaikainen Rx SLE 0,25 pitkäaikainen Rx 10 Hiippäläpän siirymä 0,13 pitkäaikainen Rx

Synnynnäinen sydänvika 1,03 vain 5 päivän Rx

Lopus-antikoagulantti 0,19 myös Org 10172

Yksi potilas, jolla F1.2-taso oli normaali, oli ol-15 lut tässä hoidossa vain 5 päivää. Potilailla, jotka saivat hepariinia kestoinfuusiona (taulukko 10) äkillisen sydän-kuoleman/sydäninfarktin (4 potilasta) tai epästabiilin angina pectoriksen (3 potilasta) hoitamiseksi, Fl.2-tasot laskivat kaikilla potilailla lukuun ottamatta potilasta, i | 20 jota oli kohdannut äkillinen sydänkuolema ja jonka kliini sen tilan parantamista vaikeutti nopeasti etenevä hajape-säkkeinen suonensisäinen koaguloituminen.

< » · » » * » t t 1 *

r i « i I

» I I · 37 109204

Taulukko 10 FI.2 hepariinihoidossa olevissa potilaissa

Potilaan kliininen Hoitopäi- Fl.2 (nmol/1) 5 tila (jatkuva vien lkm. seuraavina päivinä

hepariini-infuusio) päivänä A päivä A päivä B päivä C

Äkillinen sydänkuolema* 2 4,7 4,4 4,5

Sydäninfarkti 1 14,2 4,4 nd

Sydäninfarkti 3 5,8 2,0 nd 10 Sydäninfarkti 6** 9,2 2,2 0,8 MI/epästabiili angina pectoris tuntematon 3,3 1,8 nd

Epästabiili angina pectoris 4 7,1 4,4 nd 15 Epästabiili angina pectoris 4 >10 5,4 1,4 * Kliinisen tilan kulkuun vaikutti nopeasti etenevä haja-pesäkkeinen suonensisäinen koaguloituminen 20 ** Toistuvaa rintakipua 2 päivää ennen ensimmäistä F1.2- näytettä. nd = ei tehty Nämä tulokset osoittavat, että kuvatulla F1.2-25 ELISAlla mitatut F1.2-pitoisuudet voivat olla käyttökelpoisia yksilön tromboosiriskin arvioinnissa ja antikoagu-. lanttihoidon tehon seuraamisessa.

> · t » » ·

» I

I i » * » * f * > · ‘ I t

Claims (11)

1. 33 109204
2. 1. Oktapeptidin, jolla on aminohapposekvenssi Ser-Asp-Arg-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg-OH, käyttö vasta-aineiden 5 tuottoon, jotka vasta-aineet sitoutuvat spesifisesti epi-tooppiin protrombiiniaktivaatiopeptidin F1.2 karboksipääs-sä ja eivät reagoi protrombiinin kanssa.
3. 2. Monoklonaalinen vasta-aine tai sen fragmentti, I tunnettu siitä, että mainittu monoklonaalinen vasta- 1. aine on saatavissa käyttämällä patenttivaatimuksen 1 mu kaista oktapeptidiä antigeeninä ja että mainittu monoklonaalinen vasta-aine tai sen fragmentti sitoutuu spesifisesti protrombiiniaktivaatiopeptidin F1.2 karboksipäähän eikä protrombiiniin.
4. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että se on peräisin hybri-domasta, jonka tunnuksena on ATCC-nro HB10291.
5. 4. Hybridoma, tunnettu siitä, että sen tunnuksena on ATCC-nro HB10291, joka hybridoma tuottaa pa- 20 tenttivaatimuksen 3 mukaista monoklonaalista vasta-ai-I netta.
6. 5. Menetelmä näytteessä olevan protrombiiniaktivaatiopeptidin Fl. 2 määrittämiseksi, tunnettu siitä, että ! t - 25 a) päällystetään kiinteä faasi patenttivaatimuksen ·' : 2 tai 3 mukaisella monoklonaalisella vasta-aineella, ,/ b) lisätään näyte kiinteään faasiin ja inkuboi- ’.j daan, ’1,· c) pestään kiinteä faasi, » 30 d) lisätään leimattua vasta-ainetta ja inkuboi- daan, e) pestään kiinteä faasi, » f) detektoidaan merkkiaine ja g) katsotaan tulos, • i 1 » t i » • t I » * » < I > » > « · I 39 109204 | jolloin mainitulla leimatulla vasta-aineella on sitoutu-mis spesifisyys kiinteällä faasilla olevan vasta-aineen tai antigeenin suhteen.
7. 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että mainittu leimattu vasta-aine on polyklonaalinen vasta-aine.
8. 7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu näyte on seerumi, plasma, kokoveri, virtsa, selkäydinneste tai nivelneste.
9. 8. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu merkkiaine on pipar-juuriperoksidaasi, glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasi, al-kalinen fosfataasi, beeta-galaktosidaasi, fluori-isotio-syanaatti, rodamiini, fluoreseiini,lusiferaasti tai ra-dioisotooppi.
10. 9. Menetelmä näytteessä olevien protrombiiniak-tivaatiopeptidien F1.2 määrittämiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää immuunimäärityksen, jossa käytetään patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukaista monoklonaalis-. 20 ta vasta-ainetta sitomisvasta-aineena, ja immuunimääritys on kompetitiiviseen inhibitioon perustuva immuunimääritys, yksivaiheinen immuunimääritys tai agglutinaatioimmuunimää-ritys. : *.j 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että mainittuun immuunimääritykseen sisältyy leimattu analysoitava aine ja tällainen leimattu analysoitava aine on leimattu vasta-aine tai leimattu pep- : tidi. < * ·
11. 11. Diagnostinen välineistö näytteessä olevien 30 protrombiiniaktivaatiopeptidien F1.2 määrittämiseksi, /j’ tunnettu siitä, että näyte sisältää vähintään yhtä pa- tenttivaatimuksen 2 tai 3 mukaista monoklonaalista vasta-ainetta. 109204