ES3039629T3 - Antibodies to cd40 - Google Patents

Abstract

Se proporcionan aquí anticuerpos agonistas, o sus porciones de unión a antígeno, que se unen al CD40 humano. Dichos anticuerpos comprenden opcionalmente regiones Fc con mayor especificidad para FcΥRIIb. La invención también proporciona métodos para el tratamiento del cáncer o infecciones crónicas mediante la administración de los anticuerpos de la invención a un sujeto que los necesite. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos contra CD40

Campo de la invención

La invención se refiere a anticuerpos que se unen específicamente a CD40 humano, y usos de anticuerpos anti-CD40 en el tratamiento del cáncer y de infecciones víricas crónicas.

Antecedentes de la invención

Investigaciones recientes han revelado que los cánceres humanos e infecciones crónicas pueden ser tratados con agentes que modulan la respuesta inmunitaria del paciente frente a las células malignas o infectadas. Véase, por ejemplo, Reck & Paz-Ares (2015)Semin. Oncol.42:402. Anticuerpos anti-CD40 agonistas, tales como CP-870893 y dacetuzumab (SGN-40) han sido sometidos a ensayo para tratar el cáncer basándose en la creencia de que pueden mejorar, por ejemplo, la respuesta inmunitaria. Véase, por ejemplo, Kirkwood et al. (2012)CA Cáncer J. Clin.62:309; Vanderheide & Glennie (2013)Clin. Cáncer Res.19: 1035. Experimentos recientes en ratones han revelado que anticuerpos anti-CD40 con especificidad mejorada para el receptor Fc inhibidor FcYRIIb tiene eficacia antitumoral incrementada. Véase, por ejemplo, el documento WO 2012/087928; Li & Ravetch (2011)Science333: 1030; Li & Ravetch (2012)Proc. Nat'l Acad. Sci USA109: 10966; Wilson et al. (2011)Cáncer Cell19: 101; White et al. (2011)J. Immunol.187: 1754.

El documento US-7338660B2 divulga anticuerpos y porciones de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a CD40 que funcionan como agonistas de CD40.

Existe la necesidad de anticuerpos anti-CD40 humano agonistas mejorados para el tratamiento del cáncer e infecciones crónicas en sujetos humanos. Tales anticuerpos pueden preferiblemente tener una especificidad mejorada para el receptor Fc inhibidor FcYRIIb en comparación con los receptores Fc de activación, y pueden exhibir actividad antitumoral y/o anti-infecciosa mejorada.

Breve descripción de la invención

En el presente documento se proporcionan anticuerpos aislados que se unen específicamente a CD40 humano (la secuencia madura de la SEQ ID NO: 1), opcionalmente anticuerpos monoclonales murinos humanizados, que opcionalmente tienen regiones Fc modificadas que mejoran la especificidad para unión al receptor FcYRIIb.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado, o porción de unión al antígeno del mismo, que se une específicamente a CD40 humano y comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena pesada comprende las secuencias CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y la cadena ligera comprende las secuencias CDRL1, CDRL2 y c Dr L3, en donde CDRH1, CDRH2 y CDr H3 comprenden los residuos 31-35, 50-66 y 99-108, respectivamente de SEQ ID NO:12 y CDRL1, CDRL2 y CDRL3 comprenden los residuos 24-39, 55-61 y 94-102, respectivamente, de SEQ ID NO: 9.

En ciertas realizaciones, la invención se refiere a anticuerpos anti-huCD40 o fragmentos de unión al antígeno de los mismos que compiten por la unión con, bloqueo cruzado, o se unen al mismo epítopo que, uno o más de los anticuerpos 12D6 (SEQ ID NO: 3 y 4), 5G7 (SEQ ID NO: 52 y 53), y 19G3 (SEQ ID NO: 58 y 59), que incluyen anticuerpos quiméricos, humanos o humanizados.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-CD40 humano de la presente invención, o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, se unen a un epítopo que comprende o que consiste en una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en WGCLLTa Vh PEPPTACr E (residuos 11 - 28 de SEQ ID NO: 1) (anticuerpo 12D6), y EPPTACREKQYLINS (residuos 21 - 35 de SEQ ID NO: 1) (anticuerpos 12D6, 5G7 y 19G3).

El anticuerpo de la presente invención comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena pesada comprende las secuencias CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y la cadena ligera comprende las secuencias CDRL1, CDRL2 y CDRL3 derivadas de al menos en parte de los mismos segmentos del gen de la región V de la línea germinal y segmentos del gen de la región J de ratón como anticuerpo anti-huCD40 12D6, como se describe en la Tabla 3. Específicamente, el anticuerpo comprende secuencias CDR derivadas de las mismas líneas germinales murinas que el anticuerpo 12D6 (secuencias CDR de cadena pesada derivadas al menos en parte de la línea germinal de la región V VFH-39_01 y línea germinal de la región J IGHJ4 murinas y secuencias CDR de cadena ligera derivadas al menos en parte de la línea germinal de la región V VK1-110_01 y línea germinal de la región J IGKJ1 murinas).

El anticuerpo de la presente invención comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena pesada comprende las secuencias CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y la cadena ligera comprende las secuencias CDRL1, CDRL2 y CDRL3 seleccionadas del grupo que consiste en: las CDR del anticuerpo 12D6-24 en donde CDRH1, CDRH2 y CDRH3 comprenden los residuos 31-35, 50-66 y 99-108, respectivamente, de SEQ ID NO: 12 y las CDRL1, CDRL2 and CDRL3 comprenden los residuos 24-39, 55-61 y 94-102, respectivamente, de SEQ ID NO: 9.

El anticuerpo comprende dominios variables de cadena pesada y dominios variables de cadena ligera específicos seleccionados del grupo que consiste en 12D6-24 (residuos 1-119 y 1-112 de SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO:9, respectivamente). Cualquiera de estos anticuerpos puede comprender además una región constante de cadena pesada que comprende la región Fc específica de FcYRIIb, dicha región constante de cadena pesada se selecciona del grupo que consiste en IgG1f (SEQ ID NO: 65), SE (SEQ ID NO: 66), SELF (SEQ ID NO: 67), P238D (SEQ ID NO: 68), V4 (SEQ ID NO: 69), V4 D270E (SEQ ID NO: 70), V7 (SEQ ID NO: 71), V8 (SEQ ID NO: 72), V9 (SEQ ID NO: 73), V9 D270E (SEQ ID NO: 74), V11 (SEQ ID NO: 75) y V12 (SEQ ID NO: 76). Cualquiera de estos anticuerpos puede comprender además la región constante kappa de cadena ligera de SEQ ID NO: 77.

En realizaciones específicas, el anticuerpo de la presente invención comprende un anticuerpo 12D6-24 humanizado que comprende una cadena ligera de SEQ ID NO: 9 y una cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en cualquiera de las SEQ ID NO: 13 - 22. Los anticuerpos específicos incluyen 12D6-24 SE (SEQ ID NO: 9 y 14), 12D6-24 SELF (SEQ ID NO: 9 y 15), 12D6-24 P238D (SEQ ID NO: 9 y 13), 12D6-24 V4 (SEQ ID NO: 9 y 16), 12D6-24 V4 D270E (SEQ ID NO: 9 y 17), 12D6-24 V8 (SEQ ID NO: 9 y 18), 12D6-24 V9 (SEQ ID NO: 9 y 19), 12D6-24 V9 D270E (SEQ ID NO: 9 y 20), 12D6-24 V11 (SEQ ID NO: 9 y 21), 12D6-24 V12 (SEQ ID NO: 9 y 22, donde las secuencias se proporcionan para las cadenas ligera y pesada, respectivamente.

En realizaciones adicionales, los anticuerpos anti-huCD40 de la presente invención comprenden cadenas pesada y ligera que comparten al menos un 80 %, 85 %, 90 % y 95 % de identidad de secuencia con las secuencias de las cadenas pesada y ligera de 12D6-24 SE (SEQ ID NO: 9 y 14), 12D6-24 SELF (SEQ ID NO: 9 y 15), 12D6-24 P238D (SEQ ID NO: 9 y 13), 12D6-24 V4 (SEQ ID NO: 9 y 16), 12D6-24 V4 D270E (SEQ ID NO: 9 y 17), 12D6-24 V8 (SEQ ID NO: 9 y 18), 12D6-24 V9 (SEQ ID NO: 9 y 19), 12D6-24 V9 D270E (SEQ ID NO: 9 y 20), 12D6-24 V11 (SEQ ID NO: 9 y 21), 12D6-24 V12 (SEQ ID NO: 9 y 22).

Incluso en otras realizaciones, los anticuerpos anti-huCD40 de la presente invención comprenden cadenas pesada y ligera que consisten esencialmente en las secuencias de las cadenas pesada y ligera de 12D6-24 SE (SEQ ID NO: 9 y 14), 12D6-24 SELF (SEQ ID NO: 9 y 15), 12D6-24 P238D (SEQ ID NO: 9 y 13), 12D6-24 V4 (SEQ ID NO: 9 y 16), 12D6-24 V4 D270E (SEQ ID NO: 9 y 17), 12D6-24 V8 (SEQ ID NO: 9 y 18), 12D6-24 V9 (SEQ ID NO: 9 y 19), 12D6-24 V9 D270E (SEQ ID NO: 9 y 20), 12D6-24 V11 (SEQ ID NO: 9 y 21), 12D6-24 V12 (SEQ ID NO: 9 y 22). En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-huCD40 de la presente invención que comprenden variantes de la secuencia de Fc V4 o V9 además comprenden la variante de secuencia D270E. Dichos anticuerpos incluyen una 12D6-24 V4 D270E (SEQ ID NO: 9 y 17), 12D6-24 V9 D270E (SEQ ID NO: 9 y 20) humanizadas, donde las secuencias se proporcionan para las cadenas ligera y pesada, respectivamente. En realizaciones alternativas, los anticuerpos anti-CD40 humano de la presente invención incluyen anticuerpos que comprenden cadenas pesada y ligera que consisten esencialmente en las secuencias de estas cadenas pesada y ligera, o comprenden cadenas pesada y ligera que comparten al menos 80%, 85%, 90% y 95% identidad de secuencia con estas secuencias. En algunas realizaciones, los anticuerpos antihuCD40 de la presente invención comprenden regiones Fc modificadas con mayor especificidad para unirse a FcYRIIb en contraposición a la unión para activar receptores que los anticuerpos con región Fc de origen natural. En ciertas realizaciones la relación A/I para el anticuerpo anti-huCD40 de la presente invención es menor de 5, y en realizaciones preferidas, menor de 1.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-huCD40 de la presente invención comprende una o más cadenas pesadas y una o más cadenas ligeras, tal como dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras.

La presente invención además proporciona ácidos nucleicos que codifican las regiones variables de cadena pesada y/o ligera, de los anticuerpos anti-CD40 de la presente invención, o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, vectores de expresión que comprenden las moléculas de ácido nucleico, células transformadas con los vectores de expresión, y métodos de producción de los anticuerpos, o porción de unión al antígeno de los mismos, expresando los anticuerpos, o porción de unión al antígeno de los mismos, de las células transformadas con los vectores de expresión y aislando el anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de la célula. La presente invención proporciona además células transformadas con (i) un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo o (ii) un vector de expresión que codifica un ácido nucleico que codifica la cadena pesada del anticuerpo y un vector de expresión diferente que comprende un ácido nucleico que codifica la cadena ligera del anticuerpo.

La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos anti-huCD40 de la presente invención, o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, y un vehículo.

La presente invención proporciona anticuerpos y composiciones farmacéuticas para usar en un método para mejorar una respuesta inmunitaria en un sujeto que comprende administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-huCD40 de la presente invención, o fragmento de unión al antígeno del mismo, al sujeto de modo que se mejora la respuesta inmunitaria en el sujeto. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene un tumor y se mejora la respuesta inmunitaria contra el tumor. En otra realización, el sujeto tiene una infección viral, por ejemplo, una infección crónica, y se mejora la respuesta inmunitaria antiviral.

La presente invención también proporciona anticuerpos y composiciones farmacéuticas para usar en un método para inhibir el crecimiento de tumores en un sujeto que comprende administrar al sujeto un anticuerpo anti-huCD40 de la presente invención, o fragmento de unión al antígeno del mismo, de modo que se inhibe el crecimiento del tumor.

La presente invención además proporciona anticuerpos y composiciones farmacéuticas para usar en un método para tratar cáncer, por ejemplo, por inmunoterapia, que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-huCD40 de la presente invención, o fragmento de unión al antígeno del mismo, por ejemplo, como una composición farmacéutica, tratando de este modo el cáncer. En ciertas realizaciones, el cáncer es cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer uterino/cervical, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer esofágico, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer de colon, cáncer de riñón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer de células germinales, cáncer de huesos, cáncer de hígado, cáncer de tiroides, cáncer de piel, neoplasma del sistema nervioso central, linfoma, leucemia, mieloma y sarcoma. En ciertas realizaciones, el cáncer es un cáncer metastásico, cáncer resistente, o cáncer recurrente.

La presente invención proporciona además anticuerpos y composiciones farmacéuticas para usar en un método para tratar una infección viral crónica.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos y composiciones farmacéuticas para usar en los métodos para modular la función inmunitaria y para usar en los métodos de tratamiento descritos en el presente documento comprenden administrar un anticuerpo anti-huCD40 de la presente invención en combinación con, o como un reactivo biespecífico con, uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, un anticuerpo anti-PD1, un anticuerpo anti-PD1-L1, un anticuerpo anti-LAG3, un anticuerpo anti-GITR, un anticuerpo anti-OX40, un anticuerpo anti-CD73, un anticuerpo anti-TIGIT, un anticuerpo anti-CD 137, un anticuerpo anti-CD27, un anticuerpo anti-CSF-1R, un anticuerpo anti-CTLA-4, un agonista TLR, o un agonista de molécula pequeña de IDO o TGFp. En realizaciones específicas, la terapia antihuCD40 se combina con terapia anti-PD1 y/o anti-PD-LI, por ejemplo, tratamiento con un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a PD1 humano o un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a PD-L1 humano.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la secuencia de dominio constante IgG1f humano (SEQ ID NO: 65) renumerada 118-446 para ilustrar mejor las variantes de secuencia Fc descritas en el presente documento (Tabla 4). Los residuos sometidos a variación están en negrita, y el aminoácido alterado se proporciona en negrita debajo del residuo. La sustitución D270E está subrayada. Un residuo lisina C terminal (K) ha sido eliminado en la Figura 1 y la SEQ ID NO: 65, así como también todas las otras secuencias de dominio constante de cadena pesada y cadena pesada descritas en el Listado de secuencias. Sin embargo, en otras realizaciones, especialmente construcciones de ácido nucleico que codifican las cadenas pesadas y los dominios constantes de cadena pesada de los anticuerpos anti-huCD40 de la presente invención, estas secuencias incluyen un residuo de lisina adicional en el C-terminal de la proteína o nucleótidos que codifican la lisina extra en el eXtremo 3' del ácido nucleico.

La Figura 2 es un diagrama de Venn que ilustra los grupos (“clases”) de epítopos en el CD40 humano unidos por los anticuerpos de la presente invención, así como también el bloqueo de la unión a CD40L. Los anticuerpos con óvalos o círculos solapados compiten para unirse a CD40 humano, y los anticuerpos que caen dentro del bloque de rectángulo CD40L se unen a CD40 humano.

Las Figuras 3A y 3B muestra la activación de células dendríticas, como se midió por secreción de IL-6, por anticuerpos anti-CD40 agonistas como una función de la secuencia Fc. Véase el Ejemplo 7. Se construyeron una serie de anticuerpos que comprenden un dominio variable del mAb 12D6-26 y varias regiones constantes de IgG1f humana, que incluyen variantes IgG1f, SE, SELF, P238D, V4, V8, V9 y V12. La Figura 3A presenta datos obtenidos usando células de un donador, y la Figura 3B presenta datos obtenidos usando células de un donador diferente. La Figura 4 muestra la activación de células, como se midió por CD54 de superficie celular, por anticuerpos anti-CD40 agonistas como una función de secuencia de dominio variable. Véase el Ejemplo 7. Se construyeron una serie de anticuerpos que comprenden una región constante de IgG1f-12 humana y dominios variables de mAbs anti-CD40 parentales (murinos) 12D6, 5G7, 8E8, 19G3 y 5F11. Los resultados se representan gráficamente como intensidad de fluorescencia media (MFI) como una función de concentración del anticuerpo.

La Figura 5 muestra el porcentaje de unión a F<cy>R por varios anticuerpos de la presente invención, que incluyen anticuerpos que tienen sustituciones D270. Véase el Ejemplo 8. Los nombres de anticuerpos que incluyen “-sup” representan sobrenadantes del anticuerpo que produce células, mientras que otros son anticuerpos purificados. Los datos son presentados como porcentajes de un valor de unión del receptor máximo para cada combinación del anticuerpo y receptor, como se midió en un sistema Octet de ForteBio. Véase, por ejemplo, el Ejemplo 3. Cada agrupamiento de tres barras representa, de izquierda a derecha, unión a hCD32a/FcYRIIa-H131 (10 uM) (barras rayadas), hCD32b/ FcYRIIa-R131 (10<j>M) (barras negras), y hCD32b/ FcYRIIb (1<j>M) (barras blancas).

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos aislados, particularmente anticuerpos monoclonales, por ejemplo, anticuerpos monoclonales humanizados o humanos, que específicamente se unen a CD40 humano (“huCD40”) y tienen actividad agonista. Los anticuerpos de la invención son como se definen en las reivindicaciones adjuntas. La divulgación técnica expuesta a continuación puede en algunos aspectos ir más allá del alcance de las reivindicaciones. Los elementos de la divulgación que no entran dentro del alcance de las reivindicaciones se proporcionan a título informativo. Cualquier referencia en la descripción a los métodos de tratamiento se refiere a los anticuerpos o composiciones farmacéuticas de la presente invención para usar en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia.

Se proporcionan secuencias para varios anticuerpos monoclonales anti-huCD40 murino humanizados. En ciertos ejemplos descritos en el presente documento, los anticuerpos son derivados de secuencias de la línea germinal de cadena pesada y ligera murina particular y/o comprenden características estructurales particulares tal como regiones CDR que comprenden secuencias de aminoácido particulares. En otros ejemplos descritos en el presente documento, los anticuerpos compiten por la unión a CD40 con, o se unen al mismo epítopo que, los anticuerpos anti-CD40 para los cuales se proporcionan secuencias en el presente documento. En algunas realizaciones, la secuencia de la región Fc de cadena pesada es modificada para mejorar específicamente la unión a FcYRIlb.

Además, se proporcionan en el presente documento métodos para elaborar tales anticuerpos, inmunoconjugados y moléculas biespecíficas que comprenden tales anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, y composiciones farmacéuticas formuladas para contener los anticuerpos o fragmentos. También se proporcionan en el presente documento métodos para usar los anticuerpos para mejorar la respuesta inmunitaria, solos o en combinación con otros agentes inmunoestimuladores (por ejemplo, anticuerpos) y/o terapias para el cáncer o anti-infectivas. En consecuencia, los anticuerpos anti-huCD40 descritos en el presente documento se pueden usar en un tratamiento en una amplia variedad de aplicaciones terapéuticas, que incluyen, por ejemplo, inhibir el crecimiento de tumor y tratar infecciones virales crónicas.

Definiciones

Con el fin de que la presente descripción pueda ser más fácilmente entendida, primero se definen ciertos términos. Se establecen definiciones adicionales a través de la descripción detallada.

CD40 se refiere al “miembro 5 de la superfamilia del receptor del TNF” (TNFRSF5). A menos que se indique de otra forma, o quede claro por el contexto, las referencias a<c>D40 en el presente documento se refieren a CD40 humano (“huCD40”), y los anticuerpos anti-CD40 se refieren a anticuerpos anti-CD40 humano. CD40 humano se describe adicionalmente en GENE ID NO: 958 y MIM (Herencia Mendeliana en el Hombre): 109535. La secuencia de CD40 humano (NP_001241.1), que incluye secuencias señal de 20 aminoácidos, se proporciona en la SEQ ID NO: 1.

CD40 interactúa con el ligando CD40 (CD40L), también referido como TNFSF5, gp39 y CD154. A menos que se indique de otra forma, o quede claro por el contexto, las referencias a CD40L en el presente documento se refieren a CD40L humano (“huCD40L”). CD40L humano se describe adicionalmente en GENE ID NO: 959 y MIM: 300386. La secuencia de CD40L humano (NP_000065.1) se proporciona en la SEQ ID NO: 2.

A menos que se indique de otra forma o quede claro por el contexto, el término “anticuerpo” como se usa en el presente documento pueden incluir anticuerpos completos y cualquiera de los fragmentos de unión al antígeno (es decir, “porciones de unión al antígeno”) o cadenas únicas del mismo. Un “anticuerpo” se refiere, en una realización, a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por uniones de disulfuro, o un fragmento de unión al antígeno del mismo. Cada cadena pesada está comprendida por una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento comoVH)y una región constante de cadena pesada. En ciertos anticuerpos IgG, IgD y IgA que son de origen natural, la región constante de cadena pesada está comprendida por tres dominios, CH1,<c>H2 y<c>H3. En ciertos anticuerpos de origen natural, cada cadena ligera está comprendida por una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como V<l>) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está comprendida por un dominio, CL. Las regionesVHyVLpueden ser además subdivididas en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés), intercaladas con regiones que son más conservadas, llamadas regiones marco (FR, por sus siglas en inglés). Cada Vh y Vl está compuesta de tres CDR y cuatro regiones marco (FR), dispuestas desde el amino terminal hasta el carboxi terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del hospedador, que incluyen varias células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema de complemento clásico.

Los anticuerpos se unen típicamente específicamente a su antígeno afín con alta afinidad, reflejados por una constante de disociación (KD) de l0 -7 a 10-11 M o menos. Cualquier Kd mayor de aproximadamente 10-6 M se considera en general que es unión no específica. Como se usa en el presente documento, un anticuerpo que se “une específicamente” a un antígeno se refiere a un anticuerpo que se une al antígeno y antígenos sustancialmente idénticos con alta afinidad, lo cual significa que tiene una K<d>de 10-7 M o menos, preferiblemente 10-8 M o menos, aún más preferiblemente 5 x 10-9 M o menos, y lo más preferiblemente entre 10-8 M y 10-10 M o menos, pero no se une con alta afinidad a antígenos no relacionados. Un antígeno es “sustancialmente idéntico” a un antígeno dado si presenta un alto grado de identidad de secuencia con el antígeno dado, por ejemplo, si presenta al menos 80 %, al menos 90 %, preferiblemente al menos 95 %, más preferiblemente al menos 97 %, o aún más preferiblemente al menos 99 % de identidad de secuencia con la secuencia del antígeno dado. A modo de ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a CD40 humano, también podría tener una reacción cruzada con CD40 de ciertas especies no primates (por ejemplo, mono macaco), pero podría no tener una reacción cruzada con CD40 de otras especies, o con un antígeno distinto de CD40.

A menos que se indique de otra forma, una inmunoglobulina puede ser de cualquiera de los isotipos comúnmente conocidos, que incluyen, pero no se limitan a IgA, IgA, IgG y IgM secretoras. El isotipo IgG se divide en subclases en ciertas especies: IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4 en humanos, e IgG1, IgG2a, IgG2b y IgG3 en ratones. Las inmunoglobulinas, por ejemplo, la IgG1 humana, existe en varios alotipos, los cuales difieren de entre sí en a lo sumo algunos aminoácidos. A menos que se indique de otra forma, los anticuerpos de la presente invención comprenden el dominio constante de IgG1f (SEQ ID NO: 65). A menos que se indique de otra forma, “anticuerpo” puede incluir, a modo de ejemplo, anticuerpos monoclonales y policlonales; anticuerpos quiméricos y humanizados; anticuerpos humanos y no humanos; anticuerpos completamente sintéticos; y anticuerpos de cadena única.

El término “porción de unión al antígeno” o “fragmento de unión al antígeno” de un anticuerpo, como se usa en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retiene la capacidad para unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, CD40 humano). Ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término “porción de unión al antígeno/fragmento” de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab - un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL,VH ,CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')<2>- un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominiosVHy CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominiosVLyVHde un brazo único de un anticuerpo, y (v) un fragmento dAb (Wardet al.,(1989)Nature341:544-546) que consiste en un dominioVH.Una región determinante de complementariedad aislada (CDR), o una combinación de dos o más CDR aisladas unidas por un enlazador sintético, puede comprender un dominio de unión al antígeno de un anticuerpo si es capaz de unirse al antígeno.

Las construcciones de anticuerpo de cadena única también están incluidas en la invención. Aunque los dos dominios del fragmento Fv,VLyVH ,son codificados por genes diferentes, pueden unirse, usando métodos recombinantes, por un enlazador sintético que les permite ser elaborados como una cadena de proteína única en la cual los pares de regionesVLyVHforman moléculas monovalentes conocidas como Fv de cadena única (scFv);véase, por ejemplo,Birdet al.,(1988)Science242:423-426; y Hustonet al.,(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:5879-5883). También se pretende que tales anticuerpos de cadena única estén abarcados dentro de la expresión “porción de unión al antígeno/fragmento” de un anticuerpo. Estos y otras construcciones potenciales se describen en Chan & Carter(2010)Nat. Rev. Immunol.10:301. Estos fragmentos de anticuerpo son obtenidos usando técnicas convencionales conocidas por aquellos expertos en la materia, y los fragmentos son seleccionados por su utilidad de la misma manera como anticuerpos intactos. Las porciones de unión al antígeno/fragmentos pueden ser producidas por técnicas de ADN recombinante, o por escisión enzimática o química de inmunoglobulinas intactas.

A menos que se indique de otra forma, la palabra “fragmento” cuando se usa con referencia a un anticuerpo, tal como en una reivindicación, se refiere a un fragmento de unión al antígeno del anticuerpo, de manera que el “anticuerpo o fragmento” tiene el mismo significado que “anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo”.

Un “anticuerpo bifuncional” o “biespecífico” es un anticuerpo artificial híbrido que tiene dos diferentes pares de cadena pesada/ligera, dando origen a dos sitios de unión al antígeno con especificidad para diferentes antígenos. Los anticuerpos biespecíficos pueden ser producidos por una variedad de métodos que incluyen fusión de hibridomas o unión de fragmentos Fab'. Véase, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann (1990)Clin. Exp. Immunol.79:315-321; Kostelnyet al.,(1992)J. Immunol.148, 1547-1553.

La expresión “anticuerpo monoclonal”, como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que presenta una especificidad de unión única y afinidad para un epítopo particular o una composición de anticuerpos en los cuales todos los anticuerpos presentan una especificidad de unión única y afinidad para un epítopo particular. Típicamente, tales anticuerpos monoclonales serán derivados de una célula única o ácido nucleico que codifica el anticuerpo, y serán propagados sin introducir intencionalmente algunas alteraciones de secuencia. En consecuencia, la expresión “anticuerpo monoclonal humano” se refiere a un anticuerpo monoclonal que tiene regiones constantes variables y opcionales derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En una realización, los anticuerpos monoclonales humanos se producen mediante un hibridoma, por ejemplo, se obtienen fusionando un linfocito B obtenido a partir de un animal no humano transcromosomal o transgénico (por ejemplo, un ratón transgénico que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera), a una célula inmortalizada.

La expresión “anticuerpo humano recombinante”, como se usa en el presente documento, incluye todos los anticuerpos humanos que son preparados, expresados, creados o aislados por medios recombinantes, tal como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosomal para genes de inmunoglobulina humana o un híbrido preparado a partir de estos, (b) anticuerpos aislados a partir de una célula hospedadora transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados a partir de una biblioteca de anticuerpo humano combinatoria, recombinante, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquiera de otros medios que implican corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes que comprenden regiones variables y constantes que utilizan secuencias de inmunoglobulina de líneas germinales humanas particulares son codificados por los genes de línea germinal, pero incluyen posteriores reordenaciones y mutaciones que ocurren, por ejemplo, durante la maduración del anticuerpo. Como se conoce en la técnica(véase, por ejemplo,Lonberg (2005)Nature Biotech.23(9):1117-1125), las regiones variables contienen el dominio de unión al antígeno, el cual es codificado por varios genes que se reordenan para formar un anticuerpo específico para un antígeno extraño. Además de la reordenación, la región variable puede ser, además, modificada por múltiples cambios de un único aminoácido (referida como mutación somática o hipermutación) para incrementar la afinidad del anticuerpo por el antígeno extraño. La región constante cambiará en respuesta a un antígeno (es decir, cambio de isotipo). Por lo tanto, las secuencias de ácido nucleico reordenadas y somáticamente mutadas que codifican los polipéptidos de inmunoglobulina de cadena pesada y cadena ligera en respuesta a un antígeno, pueden no ser idénticas a las secuencias de la línea germinal, pero preferiblemente serán sustancialmente idénticas o similares (es decir, tienen al menos un 80 % de identidad).

Un anticuerpo “humano” (HuMAb, por sus siglas en inglés) se refiere a un anticuerpo que tiene regiones variables en las cuales tanto las regiones marco como las CDR son derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también se deriva de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la presente invención pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis específica del sitio o aleatoriain vitroo por mutación somáticain vivo).Sin embargo, no se pretende que la expresión “anticuerpo humano”, como se usa en el presente documento, incluya anticuerpos en los cuales las secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otras especies de mamíferos, tales como un ratón, hayan sido injertadas sobre secuencias marco humanas. El término anticuerpos “humanos” y la expresión anticuerpos “completamente humanos” son usados de manera sinónima.

Un anticuerpo “humanizado” se refiere a un anticuerpo en el cual algunos, la mayoría o todos los aminoácidos fuera de los dominios CDR de un anticuerpo no humano, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, son reemplazados con aminoácidos correspondientes derivados de inmunoglobulinas humanas. En una realización de una forma humanizada de un anticuerpo, algunos, la mayoría o todos los aminoácidos fuera de los dominios CDR han sido reemplazados con aminoácidos de inmunoglobulinas humanas, mientras que algunos, la mayoría o todos los aminoácidos dentro de una o más regiones CDR están inalterados. Pequeñas adiciones, deleciones, inserciones, sustituciones o modificaciones de aminoácidos son permisibles siempre que no anulen la capacidad del anticuerpo para unirse a un antígeno particular. Un anticuerpo “humanizado” retiene una especificidad antigénica similar a aquella del anticuerpo original.

Un “anticuerpo quimérico” se refiere a un anticuerpo en el cual las regiones variables son derivadas de una especie y las regiones constantes son derivadas de otras especies, tales como un anticuerpo en el cual las regiones variables son derivadas de un anticuerpo de ratón y las regiones constantes son derivadas de un anticuerpo humano. Un anticuerpo “híbrido” se refiere a un anticuerpo que tiene cadenas pesada y ligera de diferentes tipos, tales como una cadena pesada de ratón (parental) y una cadena ligera humanizada, o vice versa.

Como se usa en el presente documento, “ isotipo” se refiere a una clase de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, e IgE) que es codificado por los genes de la región constante de cadena pesada.

“Alotipo” se refiere a variantes que son de origen natural dentro de un grupo de isotipo específico, en el cual las variantes difieren en uno o algunos aminoácidos.Véase, por ejemplo,Jefferiset al.,(2009)mAbs1:1.

Las expresiones “un anticuerpo que reconoce un antígeno” y “un anticuerpo específico para un antígeno” son usadas intercambiablemente en el presente documento con la expresión “un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno”.

Un “anticuerpo aislado”, como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente exento de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a CD40 está sustancialmente exento de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de CD40). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítopo de CD40 puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otras proteínas CD40 de diferentes especies.

“Funciones efectoras”, que derivan de la interacción de una región Fc de anticuerpo con ciertos receptores de Fc, incluyen, pero no se limitan necesariamente a la unión a C1q, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), unión al receptor Fc, funciones efectoras mediadas por FcyR tales como ADCC y fagocitosis mediada por células dependientes del anticuerpo (ADCP), y regulación negativa de un receptor de la superficie celular (por ejemplo, el receptor de linfocitos B; BCR). Tales funciones efectoras en general, requieren que la región Fc sea combinada con un dominio de unión al antígeno (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo).

Un “receptor Fc” o “FcR” es un receptor que se une a la región Fc de una inmunoglobulina. Los FcR que se unen a un anticuerpo IgG comprenden receptores de la familia FcYr, que incluyen variantes alélicas y formas alternativas de corte y empalme de estos receptores. La familia FcyR consiste en tres receptores de activación (FcyRI, FcyRIII, y FcyRIV en ratones; F<cy>RIA, F<cy>R<i>IA, y F<cy>RIIIA en humanos) y un inhibidor (FcYRIIb, o equivalentemente F<cy>RIIB). Varias propiedades de F<cy>R<s>humanos se resumen en la Tabla 1. La mayoría de los tipos de células efectoras innatas coexpresan uno o más FcyR de activación y el FcYRIIb inhibidor, mientras que las células citolíticas naturales (NK) expresan selectivamente un receptor Fc de activación (FcyRIII en ratones y FcyRIIIA en humanos), pero no el FcYRIIb inhibidor en ratones y humanos. La IgG1 humana se une a la mayoría de los receptores Fc humanos y es considerada equivalente a la IgG2a murina con respecto a los tipos de receptores Fc de activación que se unen a esta.

TABLA 1

Una “región Fc” (región cristalizable de fragmento) o “dominio Fc” o “Fc” se refiere a la región C-terminal de la cadena pesada de un anticuerpo que interviene en la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del hospedador, que incluye unión a receptores Fc localizados en varias células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) o al primer componente (C1q) del sistema de complemento clásico. De este modo, una región Fc comprende la región constante de un anticuerpo que excluye el primer dominio de inmunoglobulina de región constante (por ejemplo, CH1 o CL). En isotipos de anticuerpo IgG, IgA e IgD, la región Fc comprende dominios constantes C<h>2 y C<h>3 en cada una de las dos cadenas pesadas del anticuerpo; las regiones Fc de IgM e IgE comprenden tres dominios constantes de cadena pesada (dominios Ch 2-4) en cada cadena de polipéptido. Para IgG, la región Fc comprende dominios de inmunoglobulina Cy2 y Cy3 y la bisagra entre Cy1 y Cy2. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina podrían variar, la región Fc de cadena pesada IgG humana se define habitualmente como extensión desde un residuo de aminoácido en la posición C226 o P230 (o un aminoácido entre estos dos aminoácidos) hasta el carboxi terminal de la cadena pesada, en donde la numeración es de conformidad con el índice EU según Kabat. Kabatet al.,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health, Bethesda, MD;véase tambiénfiguras 3c-3f de la Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense N.° 2008/0248028. El dominio C<h>2 de la región Fc de IgG humana se extiende desde aproximadamente el aminoácido 231 hasta aproximadamente aproximadamente el aminoácido 340, mientras que el dominio Ch3 está posicionado en el lado C-terminal de un dominio Ch2 en una región Fc, es decir, se extiende desde aproximadamente el aminoácido 341 hasta aproximadamente el aminoácido 447 de una IgG (que incluye una lisina C terminal). Como se usa en el presente documento, la región Fc puede ser una secuencia Fc nativa, que incluye cualquier variante alotípica, o una variante de Fc (por ejemplo, una Fc que no es de origen natural). La Fc también puede referirse a esa región en aislamiento o en el contexto de un polipéptido de proteína que comprende Fc tal como una “proteína de unión que comprende una región Fc”, también referida como una “proteína de fusión Fc” (por ejemplo, un anticuerpo o inmunoadhesina).

Una “región Fc de secuencia nativa” o “secuencia Fc nativa” comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc de origen natural. Las regiones Fc humanas de secuencia nativa incluyen una región Fc de IgG1 humana de secuencia nativa; región Fc de IgG2 humana de secuencia nativa; región Fc de IgG3 humana de secuencia nativa; y región Fc de IgG4 humana de secuencia nativa, así como también variantes de la misma de origen natural. Las secuencias nativas Fc incluyen los diversos alotipos de las Fc. Véase, por ejemplo, Jefferiset al.,(2009)mAbs1:1.

El término “epítopo” o la expresión “determinante antigénico” se refiere a un sitio en un antígeno (por ejemplo, huCD40) al cual una inmunoglobulina o anticuerpo se une específicamente. Los epítopos dentro de los antígenos de proteína pueden formarse a partir de aminoácidos contiguos (habitualmente un epítopo lineal) o aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por plegamiento terciario de la proteína (habitualmente un epítopo conformacional). Los epítopos formados por aminoácidos contiguos son típicamente, pero no siempre, retenidos tras la exposición a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario típicamente se pierden durante el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo incluye típicamente al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos en una conformación espacial única.

El término “mapeo de epítopo” se refiere al proceso de identificación de las determinantes moleculares en el antígeno involucrado en el reconocimiento de anticuerpo-antígeno. Los métodos para determinar que epítopos están unidos por un anticuerpo dado son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, ensayos de inmunotransferencia e inmunoprecipitación, en donde los péptidos contiguos o solapantes de (por ejemplo, de CD40) son probados por reactividad con un anticuerpo dado (por ejemplo, anticuerpo anti-CD40); cristalografía de rayos-X; resonancia magnética nuclear de 2-dimensiones; despliegue de levadura (Véase Ejemplo 6); y HDX-MS(véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)) (véase Ejemplo 5).

El término “se une al mismo epítopo” con referencia a dos o más anticuerpos significa que los anticuerpos se unen al mismo segmento de residuos de aminoácido, como se determina por un método dado. Las técnicas para determinar si los anticuerpos se unen al “mismo epítopo en CD40” con los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen, por ejemplo, métodos de mapeo de anticuerpos, tales como, análisis de rayos-X de cristales de complejos de antígeno:anticuerpo, los cuales proporcionan resolución atómica del epítopo, y espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio (HDX-MS, por sus siglas en inglés). Otros métodos de seguimiento de la unión del anticuerpo a fragmentos de antígeno (por ejemplo, fragmentos proteolíticos) o a variaciones mutadas del antígeno donde la pérdida de unión debido a una modificación de un residuo de aminoácido dentro de la secuencia de antígeno es a menudo considerada una indicación de un componente de epítopo, tal como la mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham & Wells (1985)Science244: 1081) o presentación en levaduras de variantes de la secuencia objetivo mutante (véase Ejemplo 6). Además, también se pueden usar métodos combinatorios computacionales para mapeo de epítopos. Estos métodos dependen de la capacidad del anticuerpo de interés para aislar por afinidad péptidos cortos específicos a partir de bibliotecas combinatorias de presentación en fagos. Cabe esperar que los anticuerpos que tienen la misma secuencia o secuencias estrechamente relacionadasVHyVLo las mismas secuencias de c Dr , se unan al mismo epítopo.

Los anticuerpos que “compiten con otro anticuerpo para unirse a un objetivo” se refiere a anticuerpos que inhiben (parcialmente o completamente) la unión del otro anticuerpo al objetivo. Si dos anticuerpos compiten entre sí para unirse a un objetivo, es decir, si inhibe y en qué grado inhibe un anticuerpo la unión del otro anticuerpo a un objetivo, puede ser determinado usando experimentos de competición. En ciertas realizaciones, un anticuerpo compite con, e inhibe la unión de otro anticuerpo a un objetivo al menos en un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90% o 100%. El nivel de inhibición o competición puede ser diferente dependiendo de qué anticuerpo sea el “anticuerpo bloqueante” (es decir, el anticuerpo frío que es incubado primero con el objetivo). Los ensayos de competición pueden realizarse como se describe, por ejemplo, en Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harb. Protoc; 2006; doi: 10.1101/pdb.prot4277 o en Capítulo 11 de “Using Antibodies” por Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EE. UU. 1999. Los anticuerpos de competición se unen al mismo epítopo, un epítopo solapante de epítopos adyacentes (por ejemplo, como se evidencia por impedimento estérico).

Otros ensayos de unión competitiva incluyen: radioinmunoensayo (RIA) directo o indirecto en fase sólida, inmunoensayo enzimático (EIA) directo o indirecto en fase sólida, ensayo de competición de tipo sándwich (véase Stahliet al.,(1983)Methods in Enzymology9:242); EIA directo en fase sólida de biotina-avidina (véase Kirklandet al.,(1986)J. Immunol.137:3614); ensayo de marcaje directo en fase sólida, ensayo de marcaje directo en fase sólida de tipo sándwich (véase Harlow and Lane (1988)Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press);RIA directo en fase sólida usando un marcaje de I-125 (véase Morelet al.,(1988)Mol. Immunol.25(1):7); EIA directo en fase sólida de biotina-avidina (Cheungetal.,(1990)Virology176:546); y RIA de marcaje directo (Moldenhaueretal.,(1990)Scand. J. Immunol.32:77).

Como se usa en el presente documento, las expresiones “unión específica”, “unión selectiva”, “se une selectivamente”, y “se une específicamente”, se refieren a la unión de un anticuerpo a un epítopo en un antígeno predeterminado, pero no a otros antígenos. Típicamente, el anticuerpo (i) se une con una constante de disociación de equilibrio (K<d>) de aproximadamente menos de 10'7 M, tal como aproximadamente menos de 10'8 M, 10'9 M o 10'1° M o aún inferior cuando se determina mediante, por ejemplo, tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR, por sus siglas en inglés) en un instrumento de resonancia de plasmón superficial BIACORE®2000 usando el antígeno predeterminado, por ejemplo, CD40 humano recombinante, como el analito y el anticuerpo como el ligando, o el análisis Scatchard de unión del anticuerpo a células positivas al antígeno, y (ii) se une al antígeno predeterminado con una afinidad que es al menos dos veces mayor que su afinidad por unirse a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína) distinto del antígeno predeterminado o un antígeno estrechamente relacionado. En consecuencia, un anticuerpo que “se une específicamente a CD40 humano” se refiere a un anticuerpo que se une a CD40 humano unido a la célula o soluble con una K<d>de 10'7 M o menos, tal como aproximadamente menor de 10'8 M, 10'9 M o 10'10 M o aún inferior. Un anticuerpo que “reacciona de manera cruzada con CD40 de macaco” se refiere a un anticuerpo que se une a CD40 de macaco con una K<d>de 10'7 M o menos, tal como aproximadamente menos de 10'8 M, 10'9 M o 10'10 M o aún inferior.

El término “k<asoc>” o “k<a>”, como se usa en el presente documento, se refiere a la constante de velocidad de asociación de una interacción de antígeno-anticuerpo particular, mientras que el término “k<dis>” o “k<d>”, como se usa en el presente documento, se refiere a la constante de velocidad de disociación de una interacción de anticuerpo-antígeno particular. El término “K<d>”, como se usa en el presente documento, se refiere a la constante de disociación de equilibrio, la cual se obtiene a partir de la relación entre k<d>y k<a>(es decir, k<d>/k<a>) y se expresa como una concentración molar (M). Los valores K<d>para anticuerpos pueden ser determinados usando métodos bien establecidos en la técnica. Un método preferido para determinar la K<d>de un anticuerpo es el análisis de interferometría bicapa (BLI, por sus siglas en inglés), preferiblemente usando un dispositivo ForteBio Octet RED (véase Ejemplo 3), resonancia de plasmón superficial, preferiblemente usando un sistema biosensortal como un sistema de resonancia de plasmón superficial BIACORE<®>(véase Ejemplo 4), o citometría de flujo y análisis Scatchard.

El término “EC<50>” en el contexto de un ensayoin vitrooin vivousando un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo, se refiere a la concentración de un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo que induce una respuesta que es el 50 % de la respuesta máxima, es decir, la mitad entre la respuesta máxima y el valor de referencia.

La expresión “se une a CD40 inmovilizado” se refiere a la capacidad de un anticuerpo descrito en el presente documento para unirse a CD40, por ejemplo, expresado en la superficie de una célula o unido a un soporte sólido.

La expresión “reacciona de manera cruzada”, como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de un anticuerpo descrito en el presente documento para unirse a CD40 de diferentes especies. Por ejemplo, un anticuerpo descrito en el presente documento que se une a CD40 humano puede también unirse a CD40 de otras especies (por ejemplo, CD40 de macaco). Como se usa en el presente documento, la reactividad cruzada puede ser medida detectando una reactividad específica con un antígeno purificado en ensayos de unión (por ejemplo, SPR, ELISA) o que se une a, o de otro modo interactúa funcionalmente con, células que expresan fisiológicamente CD40. Los métodos para determinar la reactividad cruzada incluyen ensayos de unión convencional como se describe en el presente documento, por ejemplo, por análisis de resonancia de plasmón superficial BIACORE<®>(SPR) usando un instrumento BIACORE<®>2000 SPR (Biacore AB, Uppsala, Suecia), o técnicas de citometría de flujo.

La expresión “de origen natural” como se usa en el presente documento como se aplica a un objeto, se refiere al hecho de que el objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o polinucleótido que está presente en un organismo (incluyendo virus) que puede ser aislada de una fuente en la naturaleza y la cual no ha sido modificada intencionalmente por el hombre en el laboratorio, es de origen natural.

Un “polipéptido” se refiere a una cadena que comprende al menos dos residuos de aminoácido consecutivamente ligados, sin límite superior en la longitud de la cadena. Uno o más residuos de aminoácidos en la proteína pueden contener una modificación tal como, pero no limitado a, glicosilación, fosforilación o un enlace disulfuro. Una “proteína” puede comprender uno o más polipéptidos.

La expresión “molécula de ácido nucleico”, como se usa en el presente documento, se pretende que incluya moléculas de<a>D<n>y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser de una sola cadena o doble cadena, y puede ser ADNc.

También se proporcionan “modificaciones de secuencia conservadoras” con respecto a la secuencia de anticuerpo proporcionada en el presente documento, es decir, las modificaciones de la secuencia de aminoácidos y nucleótidos que no anulan la unión del anticuerpo codificado por la secuencia de nucleótidos o que contienen la secuencia de aminoácidos, al antígeno. Por ejemplo, las modificaciones pueden ser introducidas por técnicas convencionales conocidas en la técnica, tal como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por la PCR. Las modificaciones de secuencia conservadoras incluyen sustituciones de aminoácido conservadoras, en las cuales el residuo de aminoácido es reemplazado con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). De este modo, un residuo de aminoácido no esencial previsto en un anticuerpo anti-CD40 es preferiblemente reemplazado con otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral. Los métodos para identificar sustituciones conservadoras de aminoácidos y nucleótidos que no eliminan la unión del antígeno son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); y Burkset al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 94:412-417 (1997).

Como alternativa, en otra realización, las mutaciones pueden ser introducidas aleatoriamente junto con toda o parte de una secuencia codificante de anticuerpo anti-CD40, tal como por mutagénesis de saturación, y los anticuerpos anti-CD40 modificados resultantes pueden ser seleccionados en cuanto a su actividad de unión mejorada.

En los ácidos nucleicos, la expresión “homología sustancial” indica que dos ácidos nucleicos, o secuencias designadas de los mismos, cuando se alinean y comparan óptimamente, son idénticas, con inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas, en al menos aproximadamente un 80 % de los nucleótidos, habitualmente al menos aproximadamente 90 % hasta 95 %, y más preferiblemente al menos aproximadamente 98 % hasta 99,5 % de los nucleótidos. Como alternativa, existe homología sustancial cuando los segmentos hibriden en condiciones de hibridación selectivas, con el complemento de la cadena.

En los polipéptidos, la expresión “homología sustancial” indica que dos polipéptidos, o secuencias designadas de los mismos, cuando se alinean y comparan opcionalmente, son idénticas, con inserciones o deleciones de aminoácidos apropiadas, en al menos aproximadamente un 80 % de los aminoácidos, habitualmente al menos aproximadamente 90 % hasta 95 %, y más preferiblemente al menos aproximadamente 98% hasta 99,5 % de los aminoácidos.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias cuando las secuencias están óptimamente alineadas (es decir, % de homología = n.° de posiciones idénticas/n.° de posiciones totales x 100), con alineación óptima determinada teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, la cual debe ser introducida para una alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y determinación del porcentaje de identidad entre las dos secuencias puede ser realizada usando un algoritmo matemático, como se describe en los ejemplos no limitantes a continuación.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos puede ser determinada usando el programa GAP del paquete informático GCG, usando una matriz NWSgapdna.CMP y una ponderación por hueco de 40, 50, 60, 70, u 80 y una longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos también puede ser determinado usando el algoritmo de E. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4: 11-17 (1989)) el cual ha sido incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de ponderación por residuo PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede ser determinado usando el algoritmo Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) el cual ha sido incorporado en el programa GAP en el paquete informático GCG, usando ya sea una matriz Blossum62 o una matriz PAM250, y un ponderación por hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y una ponderación por longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6.

Las secuencias de proteínas y ácidos nucleicos descritas en el presente documento pueden, además, ser usadas como una “secuencia problema” para realizar una búsqueda en las bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Tales búsquedas pueden ser realizadas usando los programas BLAST yXBLAST (versión 2.0) de Altschulet al.,(1990)J. Mol. Biol.215:403-10. Las búsquedas de nucleótidos BLAST pueden ser realizadas con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento. Las búsquedas de proteínas por BLAST pueden ser realizadas con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener las secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteína descritas en el presente documento. Para obtener alineaciones con huecos con fines de comparación, se puede utilizar el Gapped BLAST como se describe en Altschulet al.,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402. Cuando se utilizan programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden usar los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST).

Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células completas, en un lisado celular, o en una forma sustancialmente pura o parcialmente purificada. Un ácido nucleico se “aísla” o “se vuelve sustancialmente puro” cuando se purifica de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos celulares (por ejemplo, las otras partes del cromosoma) o proteínas, por técnicas convencionales, que incluyen tratamiento alcalino/SDS, separación de bandas con CsCl, cromatografía de columna, electroforesis en gel de agarosa y otras bien conocidas en la técnica. Véase Ausubelet al.,ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987).

El término “vector”, como se usa en el presente documento, se pretende que se refiera a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual ha sido ligado. Un tipo de vector es un “plásmido”, el cual se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el cual, los segmentos de ADN adicionales pueden ser ligados. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde los segmentos de ADN adicionales pueden ser ligados en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedadora en la cual son introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamífero episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episomales), pueden ser integrados en el genoma de una célula hospedadora después de la introducción en la célula hospedadora, y de este modo replicarse junto con el genoma del hospedador. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales están operativamente ligados. Tales vectores son también referidos en el presente documento como “vectores de expresión recombinante” (o simplemente “vectores de expresión”). En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están a menudo en la forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, “plásmido” y “vector” se pueden usar intercambiablemente, ya que el plásmido es la forma más comúnmente usada de vector. Sin embargo, también están incluidas otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus defectuosos para replicación, adenovirus, y adenovirus asociados), los cuales tienen funciones equivalentes.

La expresión “célula hospedadora recombinante” (o simplemente “célula hospedadora”), como se usa en el presente documento, pretende referirse a una célula que comprende un ácido nucleico que no está naturalmente presente en la célula, y pude estar en una célula en la cual un vector de expresión recombinante ha sido introducido. Se debe entender que tales expresiones pretenden referirse no solamente a la célula objetivo particular, sino a la progenie de tal célula. Dado que ciertas modificaciones pueden ocurrir en generaciones posteriores debido ya sea a influencias ambientales o mutación, tal progenie no puede, en efecto, ser idéntica a la célula precursora, pero está todavía incluida dentro del alcance del término “célula hospedadora” como se usa en el presente documento.

Una “respuesta inmunitaria” se refiere a una respuesta biológica dentro de un vertebrado contra agentes extraños, los cuales protegen la respuesta del organismo contra estos agentes y enfermedades causadas por ellos. Una respuesta inmunitaria es mediada por la acción de una célula del sistema inmunitario (por ejemplo, un linfocito T, linfocito B, linfocito citolítico natural (NK), macrófago, eosinófilo, mastocito, células dendríticas o neutrófilo) y macromoléculas solubles producidas por cualquiera de estas células o el hígado (que incluye anticuerpos, citocinas, y complemento) que dan como resultado el direccionamiento selectivo, unión a, daño, destrucción de y/o eliminación del cuerpo del vertebrado de patógenos invasores, células o tejidos infectados con patógenos, células cancerosas u otras anormales, o, en casos de autoinmunidad o inflamación patológica, células o tejidos humanos normales. Una reacción inmunitaria incluye, por ejemplo, activación o inhibición de un linfocito T, por ejemplo, un linfocito T efector o un linfocito Th, tal como un linfocito T CD4+ o CD8+, o la inhibición o agotamiento de un linfocito T<reg>. “Linfocitos T efectores” (“T<ef>”) se refiere a linfocitos T (por ejemplo, linfocitos T CD4<+>y CD8<+>) con actividades citolíticas, así como también linfocitos T cooperadores (Th), los cuales secretan citocinas y activan y dirigen otras células inmunitarias, pero no incluyen linfocitos T reguladores (linfocitos T<reg>).

Como se usa en el presente documento, la expresión “respuesta mediada por linfocitos T” se refiere a una respuesta mediada por linfocitos T, que incluye linfocitos T efectores (por ejemplo, linfocitos CD8<+>) y linfocitos T cooperadores (por ejemplo, linfocitos CD4<+>). Las respuestas mediadas por linfocitos T incluyen, por ejemplo, proliferación y citotoxicidad de linfocitos T.

Como se usa en el presente documento, la expresión “respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL, por sus siglas en inglés” se refiere a una respuesta inmunitaria inducida por linfocitos T citotóxicos. Las respuestas CTL son mediadas principalmente por linfocitos T CD8<+>.

Un “inmunomodulador” o “inmunorregulador” se refiere a un agente, por ejemplo, un componente de la vía de señalización que puede estar involucrado en la modulación, regulación o modificación de una respuesta inmunitaria. “Modulación”, “regulación”, o “modificación” de una respuesta inmunitaria se refiere a cualquier alteración en una célula del sistema inmunitario o en la actividad de tal célula (por ejemplo, un linfocito T efector). Tal modulación incluye la estimulación o la supresión del sistema inmunitario lo cual se puede manifestar por un incremento o reducción en el número de varios tipos de células, un incremento o disminución en la actividad de estas células, o cualquiera de otros cambios los cuales pueden ocurrir dentro del sistema inmunitario. Ambos inmunomoduladores inhibidores y estimuladores han sido identificados, algunos de los cuales pueden tener una función mejorada en un microambiente tumoral. En realizaciones preferidas, el inmunomodulador está localizado en la superficie de un linfocito T. Un “objetivo inmunomodulador” u “objetivo inmunorregulador” es un inmunomodulador que es dirigido para unión por, y cuya actividad es alterada por la unión de, una sustancia, agente, porción, compuesto o molécula. Los objetivos inmunomoduladores incluyen, por ejemplo, receptores en la superficie de una célula (“receptores inmunomoduladores”) y ligandos de receptores (“ ligandos inmunomoduladores”).

“Inmunoterapia” se refiere al tratamiento de un sujeto que padece, o está en riesgo de contraer o sufrir una recurrencia de, una enfermedad por un método que comprende inducir, mejorar, suprimir o de otro modo modificar una respuesta inmunitaria.

“Terapia inmunoestimulante” o “terapia inmunoestimuladora” se refiere a una terapia que da como resultado un incremento (inducción o mejora) de una respuesta inmunitaria en un sujeto para, por ejemplo, tratar el cáncer.

“Potenciar una respuesta inmunitaria endógena” significa aumentar la efectividad o potencia de una respuesta inmunitaria existente en un sujeto. Este aumento de la efectividad y potencia se puede lograr, por ejemplo, superando los mecanismos que suprimen la respuesta inmunitaria endógena del hospedador o estimulando los mecanismos que mejoran la respuesta inmunitaria endógena del hospedador.

Como se usa en el presente documento, el término “unido” se refiere a la asociación de dos o más moléculas. El enlace puede ser covalente o no covalente. El enlace también puede ser genético (es decir, fusionado de forma recombinante). Tales enlaces se pueden lograr usando una amplia variedad de técnicas reconocidas en la técnica, tales como la conjugación química y producción de proteína recombinante.

Como se usa en el presente documento, “administrar” se refiere a la introducción física de una composición que comprende un agente terapéutico en un sujeto, usando cualquiera de los diversos métodos y sistemas de suministro conocidos por los expertos en la materia. Las vías de administración preferidas para anticuerpos descritos en el presente documento incluyen vías de administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, raquídea u otras vías de administración parenterales, por ejemplo, por inyección o infusión. La expresión “administración parenteral” como se usa en el presente documento significa modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, habitualmente por inyección, e incluye, sin limitación inyección e infusión, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intratecal, intralinfática, intralesional, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intrarraquídea, epidural e intraesternal, así como electroporaciónin vivo.Como alternativa, un anticuerpo descrito en el presente documento se puede administrar a través de una vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosal, por ejemplo, intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópica. La administración también se puede realizar, por ejemplo, una vez, una pluralidad de veces y/o durante uno o más períodos prolongados.

Como se usa en el presente documento, los términos “inhibe” o “bloquea” se usan indistintamente y abarcan la inhibición/bloqueo tanto parcial como completo en al menos aproximadamente un 50 %, por ejemplo, al menos aproximadamente 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 %.

Como se usa en el presente documento, “cáncer” se refiere a un amplio grupo de enfermedades caracterizadas por el crecimiento incontrolado de células anormales en el cuerpo. La división celular no regulada puede dar como resultado la formación de tumores malignos o células que invaden los tejidos cercanos y pueden hacer metástasis en partes distantes del cuerpo a través del sistema linfático o torrente sanguíneo.

Los términos “tratar”, “que trata” y “tratamiento”, como se usan en el presente documento, se refieren a cualquier tipo de intervención o proceso realizado en el sujeto, o administración de un agente activo al sujeto con el objetivo de revertir, aliviar, mejorar, inhibir, o ralentizar o prevenir la progresión, desarrollo, gravedad o recurrencia de un síntoma, complicación, afección o indicios bioquímicos asociados con una enfermedad. La profilaxis se refiere a la administración a un sujeto que no tiene una enfermedad, para prevenir que ocurra la enfermedad o minimizar sus efectos si lo hace.

Las expresiones “dosis eficaz” o “dosificación eficaz” se define como una cantidad suficiente para lograr o al menos parcialmente lograr un efecto deseado. Una “cantidad terapéuticamente eficaz” o “dosificación terapéuticamente eficaz” de un fármaco o agente terapéutico es cualquier cantidad del fármaco que, cuando se usa solo o en combinación con otro agente terapéutico, promueve la regresión de la enfermedad evidenciada por una disminución de la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento de la frecuencia y duración de los períodos libres de síntomas de la enfermedad, o una prevención del deterioro o discapacidad debido al padecimiento de la enfermedad. Una “cantidad profilácticamente eficaz” o una “dosis profilácticamente eficaz” de un fármaco es una cantidad del fármaco que, cuando se administra solo o en combinación con otro agente terapéutico a un sujeto con riesgo de desarrollar una enfermedad o de sufrir una recurrencia de la enfermedad, inhibe el desarrollo o recurrencia de la enfermedad. La capacidad de un agente terapéutico o profiláctico para promover la regresión de la enfermedad o inhibir el desarrollo o recurrencia de la enfermedad se puede evaluar usando una variedad de métodos conocidos por el profesional experto, tal como en sujetos humanos durante ensayos clínicos, en sistemas de modelos animales predictivos de eficacia en humanos, o sometiendo a ensayo la actividad del agente en ensayosin vitro.

A modo de ejemplo, un agente contra el cáncer es un fármaco que ralentiza la progresión del cáncer o promueve la regresión del cáncer en un sujeto. En realizaciones preferidas, una cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco promueve la regresión del cáncer hasta el punto de eliminar el cáncer. “Promover la regresión del cáncer” significa que la administración de una cantidad eficaz del fármaco, solo o en combinación con un agente antineoplásico, da como resultado una reducción del crecimiento o tamaño del tumor, necrosis del tumor, una disminución de la gravedad de al menos un síntoma de la enfermedad, un aumento de la frecuencia y duración de los períodos libres de síntomas de la enfermedad, una prevención del deterioro o discapacidad debido al padecimiento de la enfermedad, o de otro modo la mejora de los síntomas de la enfermedad en el paciente. La eficacia farmacológica se refiere a la capacidad del fármaco para promover la regresión del cáncer en el paciente. La seguridad fisiológica se refiere a un nivel de toxicidad aceptablemente bajo, u otros efectos fisiológicos adversos a nivel celular, de órganos y/u organismo (efectos adversos) que dan como resultado la administración del fármaco.

A modo de ejemplo para el tratamiento de tumores, una cantidad o dosificación terapéuticamente eficaz del fármaco inhibe preferiblemente el crecimiento celular o crecimiento tumoral en al menos aproximadamente un 20 %, más preferiblemente en al menos aproximadamente un 40 %, incluso más preferiblemente en al menos aproximadamente un 60 %, y aún más preferiblemente en al menos aproximadamente un 80 % con respecto a sujetos no tratados. En las realizaciones más preferidas, una cantidad o dosificación terapéuticamente eficaz del fármaco inhibe completamente el crecimiento celular o crecimiento tumoral, es decir, preferiblemente inhibe el crecimiento celular o crecimiento tumoral en un 100 %). La capacidad de un compuesto para inhibir el crecimiento tumoral se puede evaluar usando los ensayos descritos más adelante. La inhibición del crecimiento tumoral puede no ser inmediata después del tratamiento, y solo puede ocurrir después de un período de tiempo o después de una administración repetida. Como alternativa, esta propiedad de una composición se puede evaluar examinando la capacidad del compuesto para inhibir el crecimiento celular, tal inhibición se puede medirin vitropor ensayos conocidos por el experto en la materia. En otras realizaciones preferidas descritas en el presente documento, se puede observar la regresión tumoral y puede continuar durante un período de al menos aproximadamente 20 días, más preferiblemente al menos aproximadamente 40 días, o incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 60 días.

Terapia de “combinación”, como se usa en el presente documento, a menos que esté claro por el contexto, se entiende que abarca la administración de dos o más agentes terapéuticos de una manera coordinada, e incluye, pero no se limita a, dosificación concurrente. Específicamente, la terapia de combinación abarca tanto la coadministración (por ejemplo, administración de una coformulación o administración simultánea de composiciones terapéuticas separadas) como la administración en serie o secuencial, siempre que la administración de un agente terapéutico esté condicionada de algún modo a la administración de otro agente terapéutico. Por ejemplo, un agente terapéutico se puede administrar solo después que se ha administrado un agente terapéutico diferente y se le ha permitido actuar durante un período de tiempo prescrito. Véase, por ejemplo, Kohrt et al. (2011) Blood 117:2423.

Los términos “paciente” y “sujeto” se refieren a cualquier humano que recibe tratamiento ya sea profiláctico o terapéutico. Por ejemplo, los métodos y composiciones descritos en el presente documento se pueden usar para tratar un sujeto que tiene cáncer.

Diversos aspectos descritos en el presente documento se describen con detalle adicional en las siguientes subsecciones.

I. Anticuerpos Anti-CD40

La presente solicitud describe anticuerpos anti-huCD40 agonistas que tienen propiedades deseables para uso como agentes terapéuticos en el tratamiento de enfermedades tales como cánceres. Estas propiedades incluyen una o más de la capacidad de unirse a CD40 humano con alta afinidad, inmunogenicidad aceptablemente baja en sujetos humanos, la capacidad de unirse preferentemente a FcYRIIb, y la ausencia de exigencias de secuencia que podrían reducir la estabilidad química del anticuerpo.

Los anticuerpos anti-CD40 descritos en el presente documento por secuencia se unen a epítopos específicos en el CD40 humano, como se puede determinar, como se describe en los Ejemplos 5 y 6. Otros anticuerpos que se unen a los mismos epítopos o epítopos estrechamente relacionados probablemente compartirían estas propiedades deseables, y se pueden descubrir haciendo experimentos de competición.

Anticuerpos anti-huCD40 que compiten con los anticuerpos anti-huCD40 descritos en el presente documento

Los anticuerpos anti-huCD40 que compiten con los anticuerpos de la presente invención por la unión a huCD40 se pueden generar usando protocolos de inmunización similares a los descritos en el presente documento (Ejemplos 1 y 2). Los anticuerpos que compiten por la unión con los anticuerpos anti-huCD40 descritos en el presente documento por secuencia también se pueden generar inmunizando ratones u otro animal no humano con CD40 humano o una construcción que comprende el dominio extracelular del mismo (residuos 21-193 de la SEQ ID NO: 1), o inmunizando con un fragmento de CD40 humano que contiene el epítopo unido por los anticuerpos anti-huCD40 descritos en el presente documento. Los anticuerpos resultantes se pueden seleccionar por su capacidad de bloquear la unión de 12D6, 5F11, 8E8, 5G7 y/o 19G3 al CD40 humano por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, bloqueando la unión a la proteína de fusión del dominio extracelular de CD40 y un dominio Fc de inmunoglobulina en un ELISA, o bloqueando la capacidad de unión a las células que expresan huCD40 en su superficie, por ejemplo, por FACS. En diversas realizaciones, el anticuerpo de prueba se pone en contacto con la proteína de fusión CD40-Fc (o con células que expresan huCD40 en su superficie) antes, al mismo tiempo, o después de la adición de 12D6, 5F11, 8E8, 5G7 o 19G3. Por ejemplo, se pueden realizar experimentos de “preclasificación” (Ejemplo 4) para determinar si un anticuerpo de prueba cae en la misma “clase” que los anticuerpos descritos en el presente documento por secuencia, con anticuerpos descritos en el presente documento por secuencia como los anticuerpos de “referencia” y los anticuerpos que se analizan como los anticuerpos de “prueba”. Los anticuerpos que reducen la unión de los anticuerpos descritos en el presente documento por secuencia al CD40 humano (ya sea como una fusión de Fc o en una célula), particularmente a concentraciones aproximadamente estequiométricas, probablemente se unirán a los mismos epítopos, superpuestos, o adyacentes, y por lo tanto pueden compartir las propiedades funcionales deseables de 12D6, 5F11, 8E8, 5G7 o 19G3.

Por consiguiente, en el presente documento se proporcionan anticuerpos anti-huCD40 que inhiben la unión de anticuerpos anti-huCD40 descritos en el presente documento a huCD40 en células en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o en un 100 %, y/o cuya unión a huCD40 en las células se inhibe por anticuerpos anti-huCD40s descrito en el presente documento en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o en un 100 %, por ejemplo, como se mide por ELISA o FACS, tal como usando el ensayo descrito en el siguiente párrafo.

Un experimento de competición ilustrativo para determinar si un anticuerpo de prueba bloquea la unión de (es decir, “compite con”) un anticuerpo de referencia se puede realizar como sigue: las células que expresan CD40 se siembran a razón de 105 células por pocillo de muestra en una placa de 96 pocillos. La placa se pone en hielo seguido de la adición de anticuerpo de prueba no conjugado a concentraciones que varían de 0 a 50 pg/ml (titulación triple partiendo de una concentración más alta de 50 pg/ml). Se puede usar una IgG no relacionada como un control de isotipo para el primer anticuerpo y se añade a las mismas concentraciones (titulación triple partiendo de una concentración más alta de 50 |jg/ml). Una muestra preincubada con 50 jg/m l de anticuerpo de referencia no marcado se puede incluir como un control positivo para el bloqueo completo (100 % de inhibición) y una muestra sin anticuerpo en la incubación primaria se puede usar como un control negativo (sin competición; 0% de inhibición). Después de 30 minutos de incubación, se añade anticuerpo de referencia marcado, por ejemplo, biotinilado, a una concentración de 2 jg/m l por pocillo sin lavado. Las muestras se incuban durante otros 30 minutos en hielo. Los anticuerpos no unidos se eliminan lavando las células con tampón de FACS. El anticuerpo de referencia marcado unido a células se detecta con un agente que detecta el marcaje, por ejemplo, estreptavidina conjugada con PE (Invitrogen, n.° catálogo S21388) para detección de biotina. Las muestras se adquieren en un Citómetro de Flujo FACS Calibur (BD, San José) y se analizan con software Flowjo (Tree Star, Inc, Ashland, OR). Los resultados se pueden representar como % de inhibición.

Típicamente, el mismo experimento luego se realiza a la inversa, es decir, el anticuerpo de prueba es el anticuerpo de referencia y el anticuerpo de referencia es el anticuerpo de prueba. En ciertas realizaciones, un anticuerpo bloquea al menos parcialmente (por ejemplo, al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% ) o completamente (100 %) la unión del otro anticuerpo al objetivo, por ejemplo, CD40 humano o fragmento del mismo, e independientemente de si la inhibición ocurre cuando uno o el otro anticuerpo es el anticuerpo de referencia. Un anticuerpo de referencia y un anticuerpo de prueba “bloquean de forma cruzada” la unión entre sí al objetivo cuando los anticuerpos compiten entre sí en ambas vías, es decir, en experimentos de competición en los cuales el anticuerpo de referencia se añade primero y en experimentos de competición en los cuales el anticuerpo de prueba se añade primero.

Se considera que los anticuerpos anti-huCD40 compiten con los anticuerpos anti-huCD40 descritos en el presente documento si inhiben la unión de 12D6, 5F11, 8E8, 5G7 y/o 19G3 al CD40 humano en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o en un 100 %, cuando están presentes a concentraciones aproximadamente iguales, por ejemplo en experimentos de competición como los descritos en el Ejemplo 4. A menos que se indique lo contrario, se considerará que un anticuerpo compite con un anticuerpo detectado del grupo que consiste en los anticuerpos anti-CD40 de la presente invención si reduce la unión del anticuerpo detectado al CD40 humano (SEQ ID NO: 1) en al menos un 20 % cuando se usa a una concentración molar aproximadamente igual a la del anticuerpo detectado, como se midió en los experimentos ELISA de competición, como se resume en los dos párrafos anteriores.

Anticuerpos anti-huCD40 que se unen al mismo epítopo

Los anticuerpos anti-huCD40 que se unen a los mismos o similares epítopos para los anticuerpos descritos en el presente documento se pueden generar usando protocolos de inmunización similares a los descritos en el presente documento (Ejemplos 1 y 2). Los anticuerpos resultantes se pueden detectar por una unión de alta afinidad al CD40 humano (Ejemplo 3). Los anticuerpos detectados luego se pueden estudiar en un ensayo de presentación en levaduras en el cual las variantes de secuencia de huCD40 se presentan en la superficie de células de levadura (Ejemplo 6), o por experimentos de intercambio de hidrógeno-deuterio (Ejemplo 5) para determinar el epítopo preciso unido por el anticuerpo.

Las determinaciones de epítopos se pueden realizar por cualquier método conocido en la técnica. En diversas realizaciones, se considera que los anticuerpos anti-huCD40 se unen al mismo epítopo que un mAb anti-huCD40 descrito en el presente documento si entran en contacto con uno o más de los mismos residuos dentro de al menos una región de huCD40; si entran en contacto con una mayoría de los residuos dentro de al menos una región de huCD40; si entran en contacto con una mayoría de los residuos dentro de cada región de huCD40; si entran en contacto con una mayoría de los contactos a lo largo de la longitud completa de huCD40; si entran en contacto dentro de todas las mismas regiones distintas de CD40 humano; si entran en contacto con todos los residuos en cualquier región del CD40 humano; o si entran en contacto con todos los mismos residuos en todas las mismas regiones. Las “regiones” epítopo son agrupamientos de residuos a lo largo de la secuencia primaria.

Las técnicas para determinar anticuerpos que se unen al “mismo epítopo en huCD40” con los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen análisis por rayos X de cristales de complejos de antígeno:anticuerpo, el cual proporciona la resolución atómica del epítopo. Otros métodos siguen la unión del anticuerpo a fragmentos de antígeno o variaciones mutadas del antígeno, cuando la pérdida de unión debida a una modificación de un residuo de aminoácido dentro de la secuencia del antígeno se considera a menudo una indicación de un componente del epítopo. Los métodos también se pueden basar en la capacidad de un anticuerpo de interés para aislar por afinidad péptidos cortos específicos (ya sea en forma tridimensional nativa o en forma desnaturalizada) de las bibliotecas combinatorias de péptidos de expresión en fagos o de una digestión con proteasa de la proteína objetivo. Los péptidos entonces se consideran como ejemplos para la definición del epítopo correspondiente al anticuerpo usado para seleccionar la biblioteca de péptidos. Para el mapeo de epítopos, también se han desarrollado algoritmos computacionales que se ha demostrado que mapean epítopos discontinuos conformacionales.

El epítopo o región que comprende el epítopo también se puede identificar mediante la selección por la unión a una serie de péptidos superpuestos que abarcan CD40. Como alternativa, el método de Jespers et al. (1994) Biotechnology 12:899 se puede usar para guiar la selección de anticuerpos que tienen el mismo epítopo y, por lo tanto, propiedades similares a los anticuerpos anti-CD40 descritos en el presente documento. Usando la expresión en fagos, primero la cadena pesada del anticuerpo anti-CD40 se combina con un repertorio de cadenas ligeras (preferiblemente humanas) para seleccionar un anticuerpo de unión a CD40, y luego la nueva cadena ligera se combina con un repertorio de cadenas pesadas (preferiblemente humanas) para detectar un anticuerpo de unión a CD40 (preferiblemente humano) que tiene el mismo epítopo o región de epítopo que un anticuerpo anti-huCD40 descrito en el presente documento. Como alternativa, las variantes de un anticuerpo descrito en el presente documento se pueden obtener por mutagénesis de ADNc que codifica las cadenas pesada y ligera del anticuerpo.

La mutagénesis de barrido de alanina, como se describe por Cunningham & Wells (1989) Science 244: 1081, o alguna otra forma de mutagénesis puntual de residuos de aminoácidos en CD40 (tal como el método de expresión en levaduras proporcionado en el Ejemplo 6) también se puede usar para determinar el epítopo funcional para un anticuerpo anti-CD40.

El epítopo o región de epítopo (una “región de epítopo” es una región que comprende el epítopo o está superpuesta con el epítopo) unido por un anticuerpo específico también se puede determinar evaluando la unión del anticuerpo a péptidos que comprenden fragmentos de CD40. Se puede sintetizar una serie de péptidos superpuestos que abarcan la secuencia de CD40 (por ejemplo, CD40 humano) y seleccionar por la unión, por ejemplo, en un ELISA directo, un ELISA competitivo (donde se evalúa la capacidad del péptido para evitar la unión de un anticuerpo a CD40 unido a un pocillo de una placa de microtitulación), o en un chip. Tales métodos de cribado de péptidos pueden no ser capaces de detectar algunos epítopos funcionales discontinuos, es decir, epítopos funcionales que implican residuos de aminoácidos que no son contiguos a lo largo de la secuencia primaria de la cadena de polipéptido de CD40.

También se puede identificar un epítopo por huella de proteína basada en MS, tal como espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio (HDX-MS) y oxidación fotoquímica rápida de proteínas (FPOP). La HDX-MS se puede realizar, por ejemplo, como se describe adicionalmente en Wei et al. (2014) Drug Discovery Today 19:95. Véase también el Ejemplo 5. La FPOP se puede realizar como se describe, por ejemplo, en Hambley & Gross (2005) J. American Soc. Mass Spectrometry 16:2057.

El epítopo unido por anticuerpos anti-CD40 también se puede determinar por métodos estructurales, tales como determinación de la estructura cristalina por rayos X (por ejemplo, documento WO 2005/044853), modelado molecular y espectroscopia de resonancia magnética nuclear (NMR), incluyendo la determinación de NMR de las velocidades de intercambio de H-D de hidrógenos de amida lábiles en CD40 cuando están libres y cuando están unidos en un complejo con un anticuerpo de interés (Zinn-Justin et al. (1992) Biochemistry 31: 11335; Zinn-Justin et al. (1993) Biochemistry 32: 6884).

Con respecto a la cristalografía de rayos X, la cristalización se puede realizar usando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, Giege et al. (1994) Acta Crystallogr. D50:339; McPherson (1990) Eur. J. Biochem.

189:1), incluyendo microlote (por ejemplo, Chayen (1997) Structure 5:1269), difusión de vapor de gota colgante (por ejemplo, McPherson (1976) J. Biol. Chem. 251:6300), siembra y diálisis. Es deseable usar una preparación de proteína que tenga una concentración de al menos aproximadamente 1 mg/ml y preferiblemente de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml. La cristalización puede lograrse mejor en una solución precipitante que contiene polietilenglicol 1000-20.000 (PEG; peso molecular promedio que varía de aproximadamente 1000 a aproximadamente 20.000 Da), preferiblemente de aproximadamente 5000 a aproximadamente 7000 Da, más preferiblemente de aproximadamente 6000 Da, con concentraciones que varían de aproximadamente 10% a aproximadamente 30% (p/v). También puede ser deseable incluir un agente estabilizante de proteínas, por ejemplo, glicerol a una concentración que varía de aproximadamente 0,5 % a aproximadamente 20 %. Una sal adecuada, tal como cloruro de sodio, cloruro de litio o citrato de sodio también puede ser deseable en la solución precipitante, preferiblemente en una concentración que varía de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 1000 mM. El precipitante preferiblemente se amortigua a un pH de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 5,0, preferiblemente aproximadamente 4,0. Los tampones específicos útiles en la solución precipitante pueden variar y son bien conocidos en la técnica (Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Third ed., (1994) Springer-Verlag, Nueva York). Los ejemplos de tampones útiles incluyen, pero no se limitan a, HEPES, Tris, MES y acetato. Los cristales pueden crecer a un amplio intervalo de temperaturas, incluyendo 2 °C, 4 °C, 8 °C y 26 °C.

Los cristales de anticuerpo:antígeno se pueden estudiar usando técnicas de difracción de rayos X bien conocidas y se pueden refinar usando un programa informático tal como X-PLOR (Yale University, 1992, distribuido por Molecular Simulations, Inc.; véase, por ejemplo, Blundell & Johnson (1985) Meth. Enzymol. 114 & 115, H.W. Wyckoff et al., eds., Academic Press; Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 2004/0014194), y BUSTER (Bricogne (1993) Acta Cryst. D49: 37-60; Bricogne (1997) Meth. Enzymol. 276A: 361-423, Carter & Sweet, eds. Roversi et al. (2000) Acta Cryst. D56:1313-1323).

A menos que se indique lo contrario, y con referencia a las reivindicaciones, el epítopo unido por un anticuerpo es el epítopo como se determina por los métodos de HDX-MS, sustancialmente como se describe en el Ejemplo 5.

Anticuerpos anti-CD40 que se unen con alta afinidad

En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-huCD40 de la presente invención se unen a huCD40 con alta afinidad, como los anticuerpos anti-huCD40 descritos en el presente documento, aumentando su probabilidad de ser agentes terapéuticos efectivos. En diversas realizaciones, los anticuerpos anti-huCD40 de la presente invención se unen a huCD40 con una Kd de menos de 10 nM, 5 nM, 2 nM, 1 nM, 300 pM o 100 pM. En otras realizaciones, los anticuerpos anti-huCD40 de la presente invención se unen a huCD40 con una Kd entre 2 nM y 100 pM. Los ensayos convencional para evaluar la capacidad de unión de los anticuerpos hacia huCD40 incluyen ELISA, RIA, transferencia Western, interferometría de biocapa (BLI) (ver Ejemplo 3) y análisis BIACORE® SPR (ver Ejemplo 4).

Variantes de secuencia de anticuerpo anti-CD40

Alguna variabilidad en las secuencias de anticuerpos descritas en el presente documento se puede tolerar y aún mantener las propiedades deseables del anticuerpo. Las regiones CDR se delinean usando el sistema Kabat (Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU, Publicación NIH N.° 91-3242). Por consiguiente, la presente invención proporciona adicionalmente anticuerpos anti-huCD40 que comprenden secuencias de CDR que son al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticas a las secuencias de CDR de los anticuerpos descritos en el presente documento (es decir, 12D6, 5F11, 8E8, 5G7 y 19G3 y derivados humanizados de los mismos). La presente invención también proporciona anticuerpos anti-huCD40 que comprenden secuencias de dominio variable de cadena pesada y/o ligera que son al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticas a las secuencias de dominio variable de cadena pesada y/o ligera de los anticuerpos descritos en el presente documento (es decir, 12D6, 5F11, 8E8, 5G7 y 19G3 y derivados humanizados de los mismos). Las secuencias de CDR de los anticuerpos de la invención son las especificadas en las reivindicaciones adjuntas.

Anticuerpos anti-CD40 que comparten las secuencias de CDR o derivados de las mismas líneas germinales murinas

Dado que la especificidad de unión al antígeno está determinada principalmente por las CDR, es probable que los anticuerpos que comparten las secuencias de CDR con los anticuerpos descritos en el presente documento (es decir, 12D6, 5F11, 8E8, 5G7 y 19G3) compartan sus propiedades deseables. Los anticuerpos anti-huCD40 de la presente invención comprenden regiones variables de cadena pesada y ligera derivadas de las mismas secuencias de la línea germinal de la región V y la región J murina que el anticuerpo 12D6. La presente divulgación proporciona además anticuerpos anti-huCD40 de la presente invención que comprenden regiones variables de cadena pesada y ligera derivadas de las mismas secuencias de la línea germinal de la región V y la región J murina que el anticuerpo 5F11, 8E8, 5G7 o 19G3. El anticuerpo 12D6 tiene una cadena pesada derivada de líneas germinales murinas VH1-39_01 e IGHJ4, y líneas germinales de cadena ligera VK1-110_01 e IGKJ1. El anticuerpo 5F11 tiene una cadena pesada derivada de líneas germinales murinas VH1-4_02 e IGHJ3, y líneas germinales de cadena ligera VK3-5_01 e IGKJ5. El anticuerpo 8E8 tiene una cadena pesada derivada de líneas germinales murinas VH1-80_01 e IGHJ2, y líneas germinales de cadena ligera VK1-110_01 e IGKJ2. El anticuerpo 5G7 tiene una cadena pesada derivada de líneas germinales murinas VH1-18_01 e IGHJ4, y líneas germinales de cadena ligera VK10-96_01 e IGKJ2. El anticuerpo 19G3 tiene una cadena pesada derivada de líneas germinales murinas VH5-9-4_01 e IGHJ3, y líneas germinales de cadena ligera VK1-117_01 e IGKJ2. Las secuencias de la línea germinal de la región D de cadena pesada (que forman parte de CDRH3) no se especifican, ya que a menudo son difíciles de asignar dada su alta variabilidad, y por lo tanto los anticuerpos de la presente invención pueden comprender cadenas pesadas derivadas de las líneas germinales de la región V y J citadas y cualquier línea germinal de la región D. Otros anticuerpos que se unen al CD40 humano y se derivan de algunas o todas estas secuencias de la línea germinal probablemente estén estrechamente relacionados en secuencia, particularmente los derivados de los mismos genes de la región V, y por lo tanto se esperaría que compartan las mismas propiedades deseables.

Como se usa en el presente documento, un anticuerpo murino comprende regiones variables de cadena pesada o ligera que se “derivan de” una secuencia de una línea germinal particular si las regiones variables del anticuerpo se obtienen de un sistema que usa genes de inmunoglobulina de línea germinal murina y la secuencia de anticuerpo está suficientemente relacionada con la línea germinal que es más probable que se derive de la línea germinal dada que de cualquier otra. Tales sistemas incluyen inmunizar un ratón con el antígeno de interés. La(s) secuencia(s) de inmunoglobulina de la línea germinal murina de las cuales se “deriva” la secuencia de un anticuerpo se pueden identificar comparando la secuencia de aminoácidos del anticuerpo con las secuencias de aminoácidos de las inmunoglobulinas de la línea germinal murina y seleccionando la secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal más próxima en secuencia (es decir, mayor % de identidad) a la secuencia del anticuerpo. Un anticuerpo murino que se “deriva de” una secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal particular puede contener diferencias de aminoácidos en comparación con la secuencia de la línea germinal debido a, por ejemplo, mutaciones somáticas de origen natural o introducción intencionada de mutación dirigida al sitio. Sin embargo, un anticuerpo murino seleccionado típicamente es al menos un 90 % idéntico en secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina de la línea germinal (por ejemplo, regiones V). En ciertos casos, un anticuerpo murino puede ser al menos un 95 %, o incluso al menos un 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico en secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal (por ejemplo, regiones V). Típicamente, un anticuerpo derivado de una secuencia de una línea germinal murina particular mostrará no más de una diferencia de 10 aminoácidos respecto a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal (por ejemplo, regiones V). En ciertos casos, el anticuerpo murino puede comprender una diferencia de no más de 5, o incluso no más de 4, 3, 2, o 1 aminoácidos respecto a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal (por ejemplo, regiones V).

II. Anticuerpos diseñados y modificados por ingeniería genética

Regiones VH y VL

También se proporcionan anticuerpos diseñados y modificados por ingeniería genética que se pueden preparar usando un anticuerpo que tiene una o más de las secuencias VH y/o VL descritas en el presente documento como material de partida para diseñar un anticuerpo modificado por ingeniería genética, anticuerpo modificado que puede tener propiedades alteradas respecto al anticuerpo de partida. Un anticuerpo puede diseñarse por ingeniería genética modificando uno o más residuos dentro de una o ambas regiones variables (es decir, V<h>y/o V<l>), por ejemplo, dentro de una o más regiones CDR y/o dentro de una o más regiones marco. Adicionalmente o como alternativa, un anticuerpo se puede diseñar por ingeniería genética modificando los residuos dentro de la(s) región(es) constantes, por ejemplo, para alterar la función(es) efectoras del anticuerpo.

Un tipo de diseño de región variable que se puede realizar es el injerto de CDR. Dicho injerto es de uso particular en la humanización de anticuerpos anti-CD40 no humanos que compiten por la unión con los anticuerpos anti-huCD40 descritos en el presente documento y/o se unen al mismo epítopo que los anticuerpos anti-huCD40 descritos en el presente documento. Los anticuerpos interactúan con antígenos objetivo predominantemente a través de residuos de aminoácidos que se ubican en las seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena pesada y ligera. Por esta razón, las secuencias de aminoácidos dentro de las c Dr son más diversas entre los anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Debido a que las secuencias de CDR son responsables de la mayoría de las interacciones de anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imiten las propiedades de anticuerpos de referencia específicos construyendo vectores de expresión que incluyen secuencias CDR del anticuerpo de referencia específico injertado en las secuencias marco procedente de un anticuerpo diferente con diferentes propiedades (véase, por ejemplo, Riechmann, L. et al. (1998)Nature332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 32:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033; Patente de Estados Unidos N.° 5,225, 539 de Winter, y Patentes de Estados Unidos Números 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 de Queen et al.).

Tales secuencias marco se pueden obtener de bases de datos públicas de ADN o referencias publicadas que incluyen secuencias de genes de anticuerpos de una línea germinal. Por ejemplo, las secuencias de ADN de la línea germinal para los genes de región variable de cadena pesada y ligera humana se pueden encontrar en la base de datos de secuencias de la línea germinal humana “VBase”, así como en Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. u U., Publicación NIH N.° 91-3242; Tomlinson, I.M., et al. (1992) “The Repertoire of Human Germline V<h>Sequences Reveals about Fifty Groups of V<h>Segments with Different Hypervariable Loops” J. Mol. Biol. 227: 776-798; y Cox, J. P.L. et al. (1994) “A Directory of Human Germ-line V<h>Segments Reveals a String Bias in their Usage” Eur. J. Immunol. 24: 827-836.

Las secuencias marco preferidas para uso en los anticuerpos descritos en el presente documento son aquellas que son estructuralmente similares a las secuencias marco usadas por los anticuerpos descritos en el presente documento. Las secuencias de CDR1, 2 y 3 de V<h>, y las secuencias de CDR1, 2 y 3 de V<l>, se pueden injertar en regiones marco que tienen la secuencia idéntica a la encontrada en el gen de inmunoglobulina de la línea germinal de la que se deriva la secuencia marco, o las secuencias de CDR se pueden injertar en regiones marco que contienen hasta 20 sustituciones de aminoácidos, preferiblemente conservadoras, en comparación con las secuencias de la línea germinal. Por ejemplo, se ha encontrado que en ciertos casos es ventajoso mutar los residuos dentro de las regiones marco para mantener o mejorar la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo (véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Números 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 de Queen et al.).

Los anticuerpos diseñados por ingeniera genética descritos en el presente documento incluyen aquellos en los cuales se han realizado modificaciones en residuos marco dentro de V<h>y/o V<l>, por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo. A menudo tales modificaciones de marco se hacen para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un procedimiento es “retromutar” uno o más residuos marco a la secuencia de la línea germinal correspondiente. Más específicamente, un anticuerpo que ha sufrido una mutación somática puede contener residuos marco que difieren de la secuencia de la línea germinal de la cual se deriva el anticuerpo. Tales residuos se pueden identificar comparando las secuencias marco del anticuerpo con las secuencias de la línea germinal de la cuales se deriva el anticuerpo. Para restablecer las secuencias de la región marco a su configuración de la línea germinal, las mutaciones somáticas se pueden “retromutar” a la secuencia de la línea germinal, por ejemplo, por mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por PCR. Tales anticuerpos “retromutados” también están destinados a ser abarcados.

Otro tipo de modificación en la región marco implica la mutación de uno o más residuos dentro de la región marco, o incluso dentro de una o más regiones CDR, para eliminar epítopos de linfocitos T para reducir así la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. Este procedimiento también se refiere como “desinmunización” y se describe más detalladamente en la Publicación de Patente de Estados Unidos N.° 2003/0153043 de Carr et al.

Otro tipo de modificación de la región variable es mutar los residuos de aminoácidos dentro de las regiones CDR para mejorar una o más propiedades de unión (por ejemplo, afinidad) del anticuerpo de interés. La mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por PCR se pueden realizar para introducir la(s) mutación(es) y el efecto en la unión del anticuerpo, u otras propiedades funcionales de interés. Preferiblemente se introducen modificaciones conservadoras. Las mutaciones pueden ser adiciones, deleciones, o preferiblemente sustituciones de aminoácidos. Además, típicamente no se alteran más de uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos dentro de una región CDR.

Los residuos de metionina en las CDR de los anticuerpos se pueden oxidar, dando como resultado una posible degradación química y la consiguiente reducción de la potencia del anticuerpo. Por consiguiente, también se proporcionan anticuerpos anti-CD40 que tienen uno o más residuos de metionina en las CDR de cadena pesada y/o ligera reemplazados con residuos de aminoácidos que no experimentan degradación oxidativa. De forma similar, los sitios de desamidación se pueden eliminar de los anticuerpos anti-CD40, particularmente en las CDR. Los sitios de glucosilación potenciales dentro del dominio de unión al antígeno se eliminan preferiblemente para prevenir que la glucosilación pueda interferir con la unión al antígeno. Véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N.° 5.714.350.

Unión al antígeno dirigida

En diversas realizaciones, el anticuerpo de la presente invención se modifica para bloquear selectivamente la unión al antígeno en tejidos y entornos donde la unión al antígeno sería perjudicial, pero permitiría la unión al antígeno cuando fuese ventajoso. En una realización, se genera una “máscara” de péptido bloqueante que se une específicamente a la superficie de unión al antígeno del anticuerpo e interfiere con la unión al antígeno, máscara que se une a cada uno de los brazos de unión del anticuerpo por un enlazador escindible con peptidasa. Véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos 8.518.404 de CytomX. Tales construcciones son útiles para el tratamiento de cánceres en los cuales los niveles de proteasa están muy aumentados en el microambiente tumoral en comparación con los tejidos no tumorales. La escisión selectiva del enlazador escindible en el microambiente tumoral permite la disociación del péptido de enmascaramiento/bloqueante, permitiendo la unión al antígeno selectivamente en el tumor, en lugar de en los tejidos periféricos en los cuales la unión al antígeno podría causar efectos secundarios no deseados.

Como alternativa, en una realización relacionada, se desarrolla un compuesto de unión bivalente (“ ligando de enmascaramiento”) que comprende dos dominios de unión al antígeno que se une a ambas superficies de unión al antígeno del anticuerpo (bivalente) e interfiere con la unión al antígeno, en la que las dos máscaras de dominios de unión se unen entre sí (pero no el anticuerpo) por un enlazador escindible, por ejemplo, escindible por una peptidasa. Véase, por ejemplo, Publicación de Solicitud de Patente Internacional N.° WO 2010/077643 de Tegopharm Corp. Los ligandos de enmascaramiento pueden comprender, o derivarse de, el antígeno al que se pretende unir el anticuerpo, o pueden generarse independientemente. Tales ligandos de enmascaramiento son útiles para el tratamiento de cánceres en los cuales los niveles de proteasa están muy aumentados en el microambiente tumoral en comparación con los tejidos no tumorales. La escisión selectiva del enlazador escindible en el microambiente tumoral permite la disociación de los dos dominios de unión entre sí, reduciendo la avidez por las superficies de unión al antígeno del anticuerpo. La disociación resultante del ligando de enmascaramiento del anticuerpo permite la unión al antígeno selectivamente en el tumor, en lugar de los tejidos periféricos en los cuales la unión al antígeno podría causar efectos secundarios no deseados.

Fc y Fc modificadas

Los anticuerpos de la presente invención pueden comprender los dominios variables de la invención combinados con dominios constantes que comprenden diferentes regiones Fc, seleccionadas en función de las actividades biológicas (si las hay) del anticuerpo para el uso pretendido. Salfeld (2007) Nat. Biotechnol. 25: 1369. Las IgG humanas, por ejemplo, se pueden clasificar en cuatro subclases, IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4, y cada una de estas comprende una región Fc que tiene un perfil único para unirse a uno o más de los receptores Fcy (que activan los receptores FcyRI (CD64), FcyRIIA, FcyRIIC (CD32a,c), FcyRIIIAy FcyRIIIB (CD16a,b) e inhiben el receptor FcyRIIB (CD32b), y para el primer componente del complemento (Clq). Las IgG1 e IgG3 humanas se unen a todos los receptores Fcy; IgG2 se une a FcyRIIAhi3i , y con menor afinidad a FcyRIIAr131 FcyRIIIAvi58; IgG4 se une a FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIC, y F<cy>RIILA<vi>58; y el receptor inhibidor F<cy>RIIB tiene una afinidad menor por IgGI, IgG2 e IgG3 que todos los demás receptores Fcy. Bruhns et al. (2009) Blood 113: 3716. Los estudios han mostrado que FcyRI no se une a IgG2, y FcyR i IIB no se une a IgG2 o IgG4. Id. En general, con respecto a la actividad de Ad Cc , IgGl > IgG3 > IgG4 > IgGl humana. Como consecuencia, por ejemplo, un dominio constante de IgGl, en lugar de una IgG2 o IgG4, se podría elegir para uso en un fármaco donde se desea ADCC; IgG3 se podría elegir si se activan linfocitos K que expresan F<cy>RIIIA, monocitos o macrófagos; e IgG4 se podría elegir si el anticuerpo se va a usar para desensibilizar a los pacientes con alergia. IgG4 también se puede seleccionar si se desea que el anticuerpo carezca de toda la función efectora.

Las regiones variables de anti-huCD40 descritas en el presente documento se pueden unir (por ejemplo, unidas o fusionadas covalentemente) a un Fc, por ejemplo, un Fc de IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4, que puede ser de cualquier alotipo o isoalotipo, por ejemplo, para IgGl: G lm , G lm l(a ), G1m2(x), G1m3(f), G1ml7(z); para IgG2: G2m, G2m23(n); para IgG3: G3m, G3m21(g1), G3m28(g5), G3m11(b0), G3m5(b1), G3m13(b3), G3m14(b4), G3m10(b5), G3m15(s), G3m16(t), G3m6(c3), G3m24(c5), G3m26(u), G3m27(v); Véase, por ejemplo, Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1). La selección del alotipo puede estar influenciada por los posibles problemas de inmunogenicidad, por ejemplo, para minimizar la formación de anticuerpos anti-fármaco.

En realizaciones preferidas, los anticuerpos anti-CD40 de la presente invención tienen un Fc que se une o tiene unión mejorada a FcYRIIb, que puede proporcionar un agonismo mejorado. Véase, por ejemplo, el documento WO 2012/087928; Li & Ravetch (2011) Science 333: 1030; Wilson et al. (2011) Cancer Cell 19:101; White et al. (2011) J. Immunol. 187:1754. Las regiones variables descritas en el presente documento se pueden unir a variantes de Fc que mejoran la afinidad por el receptor inhibidor FcYRIIb, por ejemplo, para mejorar la actividad adyuvante o de inducción de la apoptosis. Li & Ravetch (2012) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 109:10966; Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos 2014/0010812. Tales variantes pueden proporcionar un anticuerpo con actividades inmunomoduladoras relacionadas con células FcYRIIb+, incluyendo, por ejemplo, linfocitos B y monocitos. En una realización, las variantes de Fc proporcionan una afinidad selectivamente mejorada por FcYRIIb con respecto a uno o más receptores de activación. Dichas variantes también pueden presentar entrecruzamiento mediado por FcR mejorada, dando como resultado una eficacia terapéutica mejorada. Las modificaciones para alterar la unión a FcYRIIb incluyen una o más modificaciones en una posición seleccionada del grupo que consiste en 234, 235, 236, 237, 239, 266, 267, 268, 325, 326, 327, 328 y 332, de acuerdo con el Índice de UE. Las sustituciones ilustrativas para mejorar la afinidad de FcYRIIb incluyen, pero no se limitan a 234D, 234E, 234F, 234W, 235D, 235F, 235R, 235Y, 236D, 236N, 237D, 237N, 239D, 239E, 266M, 267D, 267E, 268D, 268E, 327D, 327E, 328F, 328W, 328Y, y 332E. Las sustituciones ilustrativas incluyen 235Y, 236D, 239D, 266M, 267E, 268D, 268E, 328F, 328W, y 328Y. Otras variantes de Fc para mejorarla unión a FcYRIIb incluyen 235Y-267E, 236D-267E, 239D-268D, 239D-267E, 267E-268D, 267E-268E y 267E-328<f>. Específicamente, las variantes S267E, G236D, S239D, L328F, e I332E, que incluyen la variante doble S267E-L328F, de IgG1 humana son de particular valor para mejorar específicamente la afinidad por el receptor inhibidor de FcYRIIb. Chu et al. (2008) Mol. Immunol. 45: 3926; Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos 2006/024298; documento WO 2012/087928. Se puede obtener una especificidad mejorada para FcYRIIb (a diferencia de FcYRIIaR13-i) añadiendo la sustitución P238D y otras mutaciones (Mimoto et al., 2013, Protein, Eng. Des. & Selection, 26: 589; documento WO 2012/1152410), así como V262E y V264E (Yu et al. (2013) J. Am. Chem. Soc.

135: 9723, y WO 2014/184545. Ver Tabla 4.

Prolongación de la semivida

En ciertas realizaciones, el anticuerpo se modifica para aumentar su semivida biológica. Son posibles varios procedimientos. Por ejemplo, esto se puede hacer aumentando la afinidad de unión de la región Fc por FcRn. En una realización, el anticuerpo se altera dentro de la región CH1 o CL para contener un receptor de rescate de unión al epítopo tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, como se describe en las Patentes de Estados Unidos Números 5.869.046 y 6.121.022 de Presta et al. Otras variantes de Fc ilustrativas que aumentan la unión a FcRn y/o mejoran las propiedades farmacocinéticas incluyen sustituciones en las posiciones 259, 308 y 434, incluyendo, por ejemplo, 2591, 308F, 428L, 428M, 434S, 434H, 434F, 434Y y 434M. Otras variantes que aumentan la unión de Fc a FcRn incluyen: 250E, 250Q, 428L, 428F, 250Q/428L (Hinton et al. (2004) J. Biol. Chem. 279(8): 6213 6216, Hinton et al. (2006) Journal of Immunology 176:346-356), 256A, 272A, 305A, 307A, 31 1A, 312A, 378Q, 380A, 382A, 434A (Shields et al. (2001) Journal of Biological Chemistry 276(9):6591-6604), 252F, 252Y, 252W, 254T, 256Q, 256E, 256D, 433R, 434F, 434Y, 252Y/254T/256E, 433K/434F/436H (Dall' Acqua et al. (2002) Journal of Immunology 169:5171-5180, Dall' Acqua et al. (2006) Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524). Véase la Patente de Estados Unidos N.° 8.367.805.

La modificación de ciertos residuos conservados en el Fc de IgG (1253, H310, Q311, H433, N434), tal como la variante N434A (Yeung et al. (2009) J. Immunol. 182: 7663), se ha propuesto como una forma de aumentar la afinidad de FcRn, lo que aumenta la semivida del anticuerpo en circulación. Véase el documento WO 98/023289. Se ha demostrado que la combinación de la variante de Fc que comprende M428L y N434S aumenta la unión a FcRn y aumenta la semivida en suero hasta cinco veces. Zalevsky et al. (2010) Nat. Biotechnol 28: 157. La combinación de la variante de Fc que comprende las modificaciones T307A, E380Ay N434A también prolonga la semivida de los anticuerpos IgG1. Petkova et al. (2006) Int. Immunol 18: 1759. Además, la combinación de las variantes de Fc que comprenden las variantes M252Y-M428L, M428L-N434H, M428L-N434F, M428L-N434Y, M428L-N434A, M428L-N434M y M428L-N434S también se ha demostrado que prolonga la semivida. Véase el documento WO 2009/086320.

Además, una combinación de la variante de Fc que comprende M252Y, S254T y T256E aumenta la semivida casi 4 veces. Dall'Acqua et al. (2006) J. Biol. Chem, 281: 23514. Se ha usado una modificación de IgG1 relacionada que proporciona una afinidad de FcRn aumentada, pero una dependencia del pH reducida (M252Y-S254T-T256E-H433K-N434F) para crear una construcción de IgG1 (“MST-HN Abdeg”) para uso como competidor para evitar la unión de otros anticuerpos a FcRn, lo que da como resultado un aumento del aclaramiento de ese otro anticuerpo, ya sea IgG endógena (por ejemplo, en un entorno autoinmunitario) u otro mAb exógeno (terapéutico). Vaccaro et al. (2005) Nat. Biotechnol 23: 1283; documento WO 2006/130834.

Otras modificaciones para aumentar la unión a FcRn se describen en Yeung et al. (2010) J. Immunol 182: 7663-771; 6,277,375; 6,821,505; documento WO 97/34631; y documento WO 2002/060919.

En ciertas realizaciones, los isotipos de IgG híbridos se pueden usar para aumentar la unión a FcRn y potencialmente aumentar la semivida. Por ejemplo, una variante híbrida de IgG1/IgG3 se puede construir sustituyendo las posiciones de IgG1 en la región CH2 y/o<c>H3 con los aminoácidos de IgG3 en las posiciones donde difieren los dos isotipos. Por lo tanto, se puede construir un anticuerpo IgG variante híbrido que comprende una o más sustituciones, por ejemplo, 274Q, 276K, 300F, 339T, 356E, 358M, 384S, 392N, 397M, 422I, 435R y 436F. En otras realizaciones descritas en el presente documento, una variante híbrida de IgG1/IgG2 se puede construir sustituyendo las posiciones de IgG2 en la región CH2 y/o CH3 con aminoácidos de IgG1 en posiciones donde difieren los dos isotipos. Por lo tanto, se puede construir un anticuerpo de IgG variante híbrido que comprende una o más sustituciones, por ejemplo, una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: 233E, 234L, 235L, -236G (que se refiere a una inserción de una glicina en la posición 236), y 327A. Véase la Patente de Estados Unidos N.° 8.629.113. Se ha generado un híbrido de secuencias de IgG1/IgG2/IgG4 que supuestamente aumenta la semivida en suero y mejora la expresión. Patente de Estados Unidos N.° 7.867.491 (número de secuencia 18 en el presente documento).

La semivida en suero de los anticuerpos de la presente invención también se puede aumentar por pegilación. Un anticuerpo puede pegilarse, por ejemplo, para aumentar la semivida biológica (por ejemplo, suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o fragmento del mismo, se hace reaccionar típicamente con un reactivo de polietilenglicol (PEG), tal como un éster reactivo o derivado de aldehído de PEG, en condiciones en las que uno o más grupos de PEG se unen al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Preferiblemente, la pegilación se realiza mediante una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactivo (o un polímero hidrosoluble reactivo análogo). Como se usa en el presente documento, el término “polietilenglicol” pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG que se han usado para derivatizar otras proteínas, tales como mono alcoxi(C1-C10) o ariloxipolietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En ciertas realizaciones, el anticuerpo a pegilar es un anticuerpo aglucosilado. Los métodos para pegilar proteínas son conocidos en la técnica y se pueden aplicar a los anticuerpos descritos en el presente documento. Véase, por ejemplo, el documento EP 0154316 de Nishimura et al. y el documento EP 0401384 de Ishikawa et al.

Como alternativa, en algunas circunstancias, puede ser deseable disminuir la semivida de un anticuerpo de la presente invención, en lugar de aumentarla. Las modificaciones tales como I253A (Hornick et al. (2000) J. Nucl. Med. 41: 355) y H435A/R, I253A o H310A (Kim et al. (2000) Eur. J. Immunol. 29: 2819) en Fc de IgG1 humana pueden disminuir la unión a FcRn, disminuyendo así la semivida (aumentando el aclaramiento) para uso en situaciones donde se prefiere el aclaramiento rápido, tal como en la adquisición de imágenes médicas. Véase también Kenanova et al. (2005) Cancer Res. 65: 622. Otros medios para mejorar el aclaramiento incluyen el formateo de los dominios de unión al antígeno de la presente invención como fragmentos de anticuerpos que carecen de la capacidad de unirse a FcRn, tales como los fragmentos Fab. Tal modificación puede reducir la semivida circulante de un anticuerpo de un par de semanas a una cuestión de horas. La PEGilación selectiva de fragmentos de anticuerpos se puede usar a continuación para ajustar (aumentar) la semivida de los fragmentos de anticuerpo si es necesario. Chapman et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17:780. Los fragmentos de anticuerpos también se pueden fusionar con la seroalbúmina humana, por ejemplo, en una construcción de proteína de fusión, para aumentar la semivida. Yeh et al. (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89: 1904. Como alternativa, un anticuerpo biespecífico se puede construir con un primer dominio de unión al antígeno de la presente invención y un segundo dominio de unión al antígeno que se une a la seroalbúmina humana (HSA). Véase Publicación de Solicitud de Patente Internacional WO 2009/127691 y referencias de patentes citadas en la misma. Como alternativa, se pueden añadir secuencias de polipéptidos especializadas a fragmentos de anticuerpo para aumentar la semivida, por ejemplo, secuencias de polipéptidos “XTEN”. Schellenberger et al. (2009) Nat. Biotechnol.

27: 1186; Publicación de Solicitud de Patente Internacional WO 2010/091122.

Variantes de Fc adicionales

Cuando se usa un dominio constante de IgG4, habitualmente es preferible incluir la sustitución S228P, que imita la secuencia de bisagra en IgG1 y por lo tanto estabiliza las moléculas de IgG4, por ejemplo, reduciendo el intercambio del brazo de Fab entre el anticuerpo terapéutico y la IgG4 endógena en el paciente tratado. Labrijn et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27: 767; Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164: 1925.

Un sitio de escisión de proteasa potencial en la bisagra de las construcciones de IgG1 se puede eliminar por modificaciones D221G y K222S, aumentando la estabilidad del anticuerpo. Documento WO 2014/043344.

Las afinidades y propiedades de unión de una variante de Fc para sus ligandos (receptores de Fc) se pueden determinar por una variedad de métodos de ensayoin vitro(ensayos bioquímicos o inmunológicos) conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitado a, métodos de equilibrio (por ejemplo, ensayo inmunoabsorbente unido a enzimas (ELISA) o radioinmunoensayo (RIA)), o cinética (por ejemplo, análisis BIACORE® SPR), y otros métodos tales como ensayos de unión indirecta, ensayos de inhibición competitiva, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), electroforesis en gel y cromatografía (por ejemplo, filtración en gel). Estos y otros métodos pueden usar un marcaje en uno o más de los componentes que se examinan y/o emplean una variedad de métodos de detección incluyendo, pero no limitado a, marcadores cromogénicos, fluorescentes, luminiscentes, o isotópicos. Se puede encontrar una descripción detallada de las afinidades y cinéticas de unión en Paul, W.E., ed., Fundamental Immunology, 4th ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999), que se centra en las interacciones anticuerpoinmunógeno.

En aún otras realizaciones, la glucosilación de un anticuerpo se modifica para aumentar o disminuir la función efectora. Por ejemplo, se puede elaborar un anticuerpo aglucosilado que carece de toda función efectora mutando el residuo de asparagina conservada en la posición 297 (por ejemplo, N297A), anulando así el complemento y la unión a FcyRI. Bolt et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23: 403. Véase también Tao & Morrison (1989) J. Immunol. 143: 2595 (usando N297Q en IgG1 para eliminar la glucosilación en la posición 297).

Aunque los anticuerpos aglucosilados generalmente carecen de la función efectora, se pueden introducir mutaciones para restaurar esa función. Los anticuerpos aglucosilados, por ejemplo, los que resultan de mutaciones N297A/C/D/o H o producidos en sistemas (por ejemplo E. coli) que no glucosilan proteínas, se pueden mutar adicionalmente para restaurar la unión a F<cy>R, por ejemplo, S298G y/o T299A/G/o H (documento WO 2009/079242), o E382V y<m>4281 (Jung et al. (2010) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 107:604).

La glucoingeniería también se puede usar para modificar las propiedades antiinflamatorias de una construcción de IgG cambiando el contenido de a2,6 sialilo de las cadenas de carbohidratos unidas a Asn297 de las regiones Fc, en donde una proporción aumentada de las formas a2,6 sialiladas da como resultado efectos antiinflamatorios mejorados. Véase Nimmerjahn et al. (2008) Ann. Rev. Immunol. 26: 513. Por el contrario, la reducción en la proporción de anticuerpos que tienen carbohidratos a2,6 sialilados puede ser útil en casos donde no se desean propiedades antiinflamatorias. Los métodos para modificar el contenido de a2,6 sialilación de anticuerpos, por ejemplo, por purificación selectiva de formas a2,6 sialiladas o por modificación enzimática, se proporcionan en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° 2008/0206246. En otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la región Fc se puede modificar para imitar el efecto de la a2,6 sialilación, por ejemplo, por inclusión de una modificación F241A. Documento WO 2013/095966.

III. Propiedades físicas del anticuerpo

Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden contener uno o más sitios de glucosilación en la región variable de la cadena ya sea ligera o pesada. Tales sitios de glucosilación pueden dar como resultado una inmunogenicidad aumentada del anticuerpo o una alteración de la pK del anticuerpo debido a la unión al antígeno alterada (Marshall et al. (1972) Ann. Rev. Biochem. 41: 673-702; Gala and Morrison (2004) J. Immunol. 172: 5489-94; Wallick et al. (1988) J. Exp. Med. 168: 1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12: 43R-56R; Parekh et al. (1985) Nature 316: 452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37: 697-706). Se sabe que la glucosilación ocurre en motivos que contienen una secuencia NXS/T. En algunos casos, se prefiere tener un anticuerpo anti-huCD40 que no contiene glucosilación de región variable. Esto se puede lograr seleccionando anticuerpos que no contienen el motivo de glucosilación en la región variable o mutando los residuos dentro de la región de glucosilación.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento no contienen sitios de isomerismo de asparagina. La desamidación de la asparagina puede ocurrir en las secuencias N-G o D-G y da como resultado la creación de un residuo de ácido isoaspártico que introduce un doblez en la cadena de polipéptido y disminuye su estabilidad (efecto de ácido isoaspártico).

Cada anticuerpo tendrá un punto isoeléctrico único (pI), que generalmente cae en el intervalo de pH entre 6 y 9.5. El pI de un anticuerpo IgG1 típicamente cae dentro del intervalo de pH de 7-9.5 y el pI de un anticuerpo IgG4 típicamente cae dentro del intervalo de pH de 6-8. Se especula que los anticuerpos con un pI fuera del intervalo normal pueden tener cierto despliegue e inestabilidad en condicionesin vivo.Por lo tanto, se prefiere tener un anticuerpo anti-CD40 que contenga un valor de pI que caiga dentro del intervalo normal. Esto se puede lograr ya sea seleccionando anticuerpos con un pI en el intervalo normal o mutando residuos de superficie cargados.

Cada anticuerpo tendrá una temperatura de fusión característica, con una temperatura de fusión mayor que indica mayor estabilidad generalin vivo(Krishnamurthy & Manning (2002) Curr. Pharm. Biotechnol. 3: 361-71). Generalmente, se prefiere que la T<mi>(la temperatura de despliegue inicial) sea mayor de 60 °C, preferiblemente mayor de 65 °C, incluso más preferiblemente mayor de 70 °C. El punto de fusión de un anticuerpo se puede medir usando calorimetría de barrido diferencial (Chen et al. (2003) Pharm Res 20: 1952-60, Ghirlando et al. (1999) Immunol Lett.

68: 47-52) o dicroísmo circular (Murray et al. (2002) J. Chromatogr. Sci. 40: 343-9). En una realización preferida, se seleccionan anticuerpos que no se degradan rápidamente. La degradación de un anticuerpo se puede medir usando electroforesis capilar (CE) y MALDI-MS (Alexander and Hughes (1995) Anal Chem. 67: 3626-32).

En otra realización preferida, se seleccionan anticuerpos que tienen efectos de agregación mínimos, que pueden conducir a la activación de una respuesta inmunitaria no deseada y/o propiedades farmacocinéticas alteradas o desfavorables. Generalmente, los anticuerpos son aceptables con agregación del 25 % o menos, preferiblemente 20 % o menos, incluso más preferiblemente 15% o menos, incluso más preferiblemente 10% o menos e incluso más preferiblemente 5 % o menos. La agregación se puede medir por varias técnicas, incluyendo columna de exclusión por tamaño (SEC), cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), y dispersión de la luz.

IV. Moléculas de ácido nucleico

Otro aspecto descrito en el presente documento se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos descritos en el presente documento. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células completas, en un lisado celular, o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico se “aísla” o “se vuelve sustancialmente puro” cuando se purifica de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos celulares (por ejemplo, otro ADN cromosómico, por ejemplo, el ADN cromosómico que se une al ADN aislado en la naturaleza) o proteínas, por técnicas convencionales, incluyendo tratamiento alcalino/SDS, bandas de CsCl, cromatografía en columna, enzimas de restricción, electroforesis en gel de agarosa y otras bien conocidas en la técnica. Véase, F. Ausubel, et al, ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Un ácido nucleico descrito en el presente documento puede ser, por ejemplo, ADN o ARN y puede contener o no secuencias intrónicas. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico es una molécula de ADNc.

Los ácidos nucleicos descritos en el presente documento se pueden obtener usando técnicas de biología molecular convencional. Para anticuerpos expresados por hibridomas (por ejemplo, hibridomas preparados de ratones transgénicos que portan genes de inmunoglobulina humana como se describe adicionalmente a continuación), se puede obtener ADNc que codifica las cadenas ligera y pesada del anticuerpo elaborado mediante el hibridoma por técnicas de clonación de ADNc o amplificación de PCR convencional. Para los anticuerpos obtenidos de una biblioteca de genes de inmunoglobulina (por ejemplo, usando técnicas de expresión en fagos), el ácido nucleico que codifica el anticuerpo se puede recuperar de la biblioteca.

Una vez que se obtienen fragmentos de ADN que codifican segmentos de VH y VL, estos fragmentos de ADN se pueden manipular adicionalmente por técnicas de ADN recombinante convencional, por ejemplo, para convertir los genes de región variable en genes de cadena de anticuerpo de longitud completa, en genes de fragmentos Fab o en un gen de scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica VL o VH se une operativamente a otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, tal como una región constante de anticuerpo o un enlazador flexible. La expresión “operativamente unido”, como se usa en este contexto, pretende significar que los dos fragmentos de ADN se unen de manera que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en el marco.

El ADN aislado que codifica la región de VH se puede convertir en un gen de cadena pesada de longitud completa uniendo operativamente el ADN que codifica la VH a otra molécula de ADN que codifica regiones constantes de cadena pesada (bisagra, CH1, CH2 y/o CH3). Las secuencias de genes de región constante de cadena pesada humana son conocidas en la técnica (Véase, por ejemplo, Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de Estados Unidos, Publicación NIH No. 91 3242) y los fragmentos de a Dn que abarcan estas regiones se pueden obtener por amplificación de PCR convencional. La región constante de cadena pesada puede ser una región constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, por ejemplo, una región de IgG1. Para un gen de cadena pesada del fragmento Fab, el ADN que codifica la VH se puede unir operativamente a otra molécula de ADN que codifica solo la región constante CH1 de cadena pesada.

El ADN aislado que codifica la región VL se puede convertir en un gen de cadena ligera de longitud completa (así como un gen de cadena ligera de Fab) uniendo operativamente el ADN que codifica la VL a otra molécula de ADN que codifica la región constante de cadena ligera, CL. Las secuencias de genes de región constante de cadena ligera humana son conocidas en la técnica (Véase, por ejemplo, Kabat, E.A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de Estados Unidos, Publicación NIH No. 91-3242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener por amplificación de PCR convencional. La región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda.

Para crear un gen de scFv, los fragmentos de ADN que codifican la VH y VL se unen operativamente a otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly4-Ser)3, de manera que las secuencias de VH y VL se pueden expresar como una proteína de cadena única contigua, con las regiones de VL y VH unidas por el enlazador flexible (Véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423 - 426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879 - 5883; McCafferty et al. (1990) Nature 348: 552 - 554).

V. Generación de Anticuerpos

Diversos anticuerpos de la presente invención, por ejemplo, los que compiten o se unen al mismo epítopo como los anticuerpos anti-CD40 humanos descritos en el presente documento, se pueden producir usando una variedad de técnicas conocidas, tal como la técnica de hibridación de células somáticas convencional descrita por Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975). Aunque se prefieren los procedimientos de hibridación de células somáticas, en principio, también se pueden emplear otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo, transformación viral u oncogénica de linfocitos B, técnica de expresión en fagos usando bibliotecas de genes de anticuerpos humanos.

El sistema animal preferido para preparar hibridomas es el sistema murino. La producción de hibridoma en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. Los protocolos y técnicas de inmunización para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para fusión son conocidos en la técnica. Las parejas de fusión (por ejemplo, células de mieloma murinas) y los procedimientos de fusión también son conocidos.

Los anticuerpos quiméricos o humanizados descritos en el presente documento se pueden preparar basándose en la secuencia de un anticuerpo monoclonal murino preparado como se ha descrito anteriormente. El ADN que codifica las inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera se puede obtener del hibridoma murino de interés y diseñado mediante ingeniería genética para contener secuencias de inmunoglobulina no murinas (por ejemplo, humanas) usando técnicas de biología molecular convencional. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimérico, las regiones variables murinas se pueden unir a regiones constantes humanas usando métodos conocidos en la técnica (Véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N.° 4.816.567 de Cabilly et al). Para crear un anticuerpo humanizado las regiones CDR murinas se pueden insertar en un marco humano usando métodos conocidos en la técnica (Véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N.° 5.225.539 de Winter, y Patentes de Estados Unidos Números 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 de Queen et al).

En una realización, los anticuerpos descritos en el presente documento son anticuerpos monoclonales humanos. Tales anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra CD40 humano se pueden generar usando ratones transgénicos o transcromosómicos que portan partes del sistema inmunitario humano en lugar del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones referidos en el presente documento como ratones HuMAb y ratones KM, respectivamente, y se refieren colectivamente en el presente documento como “ratones con Ig humana”.

El HuMAb mouse® (Medarex, Inc.) contiene un miniloci de gen de inmunoglobulina humana que codifica las secuencias de inmunoglobulina de cadena ligeraky cadena humana no reordenada (|j yy),junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci de cadena j ykendógena (Véase, por ejemplo, Lonberg, et al, (1994) Nature 368 (6474): 856 - 859). Por consiguiente, los ratones presentan expresión reducida de IgM okde ratón, y en respuesta a la inmunización, los transgenes de cadena pesada y ligera humanos introducidos experimentan cambio de clase y mutación somática para generar IgGK monoclonal humana de alta afinidad (Lonberg, N. et al. (1994).),supra,revisado en Lonberg, N. (1994) Handbookof Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, y Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Am. N.Y. Acad. Sci. 764: 536 - 546). La preparación y uso de ratones HuMab, y las modificaciones genómicas portadas por tales ratones, se describen adicionalmente en Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20: 6287 - 6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647 - 656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3720 - 3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4: 117 -123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821 - 830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152: 2912 - 2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579 - 591; y Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851. Véase adicionalmente, Patentes de Estados Unidos Números 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; y 5.770.429; todas de Lonberg and Kay; Patente de Estados Unidos N.° 5.545.807 de Surani et al; Publicaciones PCT Números WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas de Lonberg and Kay; y Publicación PCT No. WO 01/14424 de Korman et al.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos descritos en el presente documento se generan usando un ratón que porta secuencias de inmunoglobulina humana en transgenes y transcromosomas, tal como un ratón que porta un transgén de cadena pesada humana y un transcromosoma de cadena ligera humana. Tales ratones, referidos en el presente documento como “ratones KM”, se describen en detalle en la Publicación PCT WO 02/43478 de Ishida et al.

Aún adicionalmente, los sistemas de animales transgénicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana están disponibles en la técnica y se pueden usar para generar anticuerpos anti-huCD40 descritos en el presente documento. Por ejemplo, se puede usar un sistema transgénico alternativo referido como XENOMOUSE® (Abgenix, Inc.); tales ratones se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos números 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 y 6.162.963 de Kucherlapati et al.

Además, los sistemas de animales transcromosómicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana están disponibles en la técnica y se pueden usar para generar anticuerpos anti-CD40 descritos en el presente documento. Por ejemplo, se pueden usar ratones que portan tanto un transcromosoma de cadena pesada humana como un transcromosoma de cadena ligera humana, referidos como “ratones TC”; tales ratones se describen en Tomizuka et al (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 722-727. Además, las vacas que portan transcromosomas de cadena pesada y ligera humana se han descrito en la técnica (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20: 889 -894) y se pueden usar para generar anticuerpos anti-huCD40 descritos en el presente documento.

Los sistemas de ratón adicionales que se describen en la técnica para generar anticuerpos humanos, por ejemplo, anticuerpos anti-HuCD40 humanos, incluyen (i) el ratón VELOCIMMUNE® (Regeneron Pharmaceuticals, Inc.), en el cual las regiones variables de cadena pesada y ligera endógenas de ratón se han reemplazado, mediante recombinación homóloga, con regiones variables de cadena ligera y pesada humana, unidas operativamente a las regiones constantes endógenas de ratón, de tal modo que se generan anticuerpos quiméricos (V humano/C de ratón) en los ratones, y luego se convierten posteriormente en anticuerpos completamente humanos usando técnicas de ADN recombinante convencionales; y (ii) el ratón MEMO® (Merus Biopharmaceuticals, Inc.), en el cual el ratón contiene regiones variables no reordenadas humanas de cadena pesada pero una sola región variable de cadena ligera común humana reordenada. Los ratones, y el uso de los mismos para generar anticuerpos, se describen, por ejemplo, en los documentos WO 2009/15777, US 2010/0069614, WO 2011/072204, WO 2011/097603, WO 2011/163311, WO 2011/163314, WO 2012/148873, US 2012/0070861 y US 2012/0073004.

Los anticuerpos monoclonales humanos descritos en el presente documento también pueden ser preparados usando métodos de expresión en fagos para el cribado de bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana. Los métodos de expresión en fagos para aislar anticuerpos humanos se establecen en la técnica. Véase por ejemplo: Patentes de Estados Unidos números 5.223.409; 5.403.484; y 5.571.698 de Ladner et al. Patentes de Estados Unidos números 4.427.908 y 5.580.717 de Dower et al.; Patentes de Estados Unidos números 5.969.108 y 6.172.197 de McCafferty et al.; y las Patentes de Estados Unidos números 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 y 6.593.081 de Griffiths et al.

Los anticuerpos monoclonales humanos descritos en el presente documento también se pueden preparar usando ratones SCID en los que se han reconstituido células inmunitarias humanas de manera que se puede generar una respuesta de anticuerpos humanos tras la inmunización. Los ratones se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos números 5.476.996 y 5.698.767 de Wilson et al.

Inmunizaciones

Para generar anticuerpos completamente humanos contra CD40 humano, se pueden inmunizar ratones o ratones transcromosómicos o transgénicos que contienen genes de inmunoglobulina humana (por ejemplo, ratones HCo12, HCo7 o KM) con una preparación purificada o enriquecida del antígeno CD40 y/o células que expresan CD40, como se describe para otros antígenos, por ejemplo, por Lonberg et al. (1994)Nature368 (6474): 856-859; Fishwild et al. (1996)Nature Biotechnology14: 845-851 y el documento WO 98/24884. Como alternativa, los ratones pueden inmunizarse con ADN que codifica CD40 humano. Preferiblemente, los ratones tendrán 6-16 semanas de edad después de la primera infusión. Por ejemplo, se puede usar una preparación purificada o enriquecida (5-50 |jg) del antígeno CD40 humano recombinante para inmunizar a los ratones por vía intraperitoneal. En caso de que las inmunizaciones que usan una preparación purificada o enriquecida del antígeno CD40 no den como resultado anticuerpos, los ratones también se pueden inmunizar con células que expresan CD40, por ejemplo, una línea celular, para promover respuestas inmunitarias.

La experiencia acumulada con diversos antígenos ha demostrado que los ratones transgénicos HuMAb responden mejor cuando se inmunizan inicialmente por vía intraperitoneal (IP) o por vía subcutánea (SC) con antígeno en el adyuvante de Ribi, seguido en semanas alternas de inmunizaciones IP/SC (hasta un total de 10) con antígeno en el adyuvante de Ribi. La respuesta inmunitaria puede ser seguida a lo largo del protocolo de inmunización con muestras de plasma que se obtienen por sangrados retroorbitales. El plasma puede analizarse por ELISA y FACS (como se describe a continuación), y se pueden usar ratones con suficientes títulos de inmunoglobulina humana anti-CD40 para las fusiones. Los ratones pueden recibir refuerzo por vía intravenosa con antígeno 3 días antes del sacrificio y la extirpación del bazo y los ganglios linfáticos. Se espera que se necesiten realizar 2-3 fusiones por cada inmunización. Típicamente son inmunizados entre 6 y 24 ratones para cada antígeno. Por lo general, se usan las cepas HCo7, HCol2 y KM. Además, tanto el transgén HCo7 como el HCol2 pueden ser generados juntos en un único ratón que tiene dos transgenes de cadena pesada humana diferentes (HCo7/HCo12).

Generación de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales contra CD40

Para generar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales descritos en el presente documento, se pueden aislar esplenocitos y/o células de ganglios linfáticos de ratones inmunizados y fusionar con una línea celular inmortalizada apropiada, tal como una línea celular de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes se pueden seleccionar en función de la producción de anticuerpos específicos de antígeno. Por ejemplo, las suspensiones de células individuales de linfocitos esplénicos de ratones inmunizados se pueden fusionar con células de mieloma de ratón no secretoras de Sp2/0 (ATCC, CRL 1581) con PEG al 50 %. Las células se colocan en placas a razón de aproximadamente 2 x 105 en placa de microtitulación de fondo plano, seguido de una incubación de dos semanas en medio selectivo que contiene suero de clon fetal al 10 %, medio condicionado al 18 % “653”, origen 5 % (IGEN), L-glutamina 4 mM, piruvato sódico 1 mM, HEPES 5 mM, 2-mercaptoetanol 0,055 mM, penicilina 50 unidades/ml, estreptomicina 50 mg/ml, gentamicina 50 mg/ml y 1X HAT (Sigma). Después de aproximadamente dos semanas, las células pueden cultivarse en un medio en el que el HAT se reemplaza por HT. Los pocillos individuales pueden cribarse a continuación por ELISA para anticuerpos IgM e IgG monoclonales humanos. Una vez que se produce un crecimiento extenso del hibridoma, se puede observar el medio por lo general después de 10-14 días. Los hibridomas que secretan anticuerpos se pueden volver a colocar en placas, analizar de nuevo, y si todavía son positivos para IgG humana, los anticuerpos monoclonales se pueden subclonar al menos dos veces por dilución limitante. Los subclones estables pueden cultivarsein vitropara generar pequeñas cantidades de anticuerpo en el medio de cultivo tisular para la caracterización.

VI. Fabricación de anticuerpos

Generación de transfectomas que producen anticuerpos monoclonales contra CD40

Los anticuerpos de la presente divulgación, que incluyen anticuerpos específicos para los que se proporcionan secuencias y otros anticuerpos anti-CD40 relacionados, pueden producirse en un transfectoma de célula hospedadora usando, por ejemplo, una combinación de técnicas de ADN recombinante y métodos de transfección génica como es bien conocido en la técnica (Morrison, S. (1985)Science229: 1202).

Por ejemplo, para expresar anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos de los mismos, los ADN que codifican cadenas ligeras y pesadas parciales o completas pueden obtenerse por técnicas de biología molecular convencional (por ejemplo, amplificación por PCR o clonación de ADNc usando un hibridoma que expresa el anticuerpo de interés) y los ADN se pueden insertar en vectores de expresión de manera que los genes se unan operativamente a secuencias de control transcripcional y traduccional. En este contexto, la expresión “unido operativamente” pretende significar que un gen de anticuerpo es ligado en un vector de modo que las secuencias de control de transcripción y traducción dentro del vector cumplan su función prevista de regular la transcripción y traducción del gen de anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se eligen para que sean compatibles con la célula hospedadora de expresión usada. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo pueden insertarse en un vector diferente o ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes del anticuerpo se insertan en los vectores de expresión por métodos convencionales (por ejemplo, ligación de sitios de restricción complementarios en el fragmento del gen del anticuerpo y vector, o ligamiento del extremo romo si no están presentes sitios de restricción). Las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos descritos en el presente documento pueden usarse para crear genes de anticuerpo de longitud completa de cualquier isotipo de anticuerpo insertándolo en vectores de expresión que ya codifican regiones constantes de cadena pesada y constantes de cadena ligera del isotipo deseado de manera que el segmento Vh se une operativamente a los segmentos Ch dentro del vector y el segmento Vl se une operativamente al segmento Cl dentro del vector. Adicionalmente o como alternativa, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo de una célula hospedadora. El gen de la cadena del anticuerpo se puede clonar en el vector de manera que el péptido señal se una al marco en el extremo amino del gen de la cadena del anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína no inmunoglobulínica).

Además de los genes de la cadena del anticuerpo, los vectores de expresión recombinantes pueden llevar secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de la cadena del anticuerpo en una célula hospedadora. El término “secuencia reguladora” pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o traducción de los genes de la cadena del anticuerpo. Las secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel (Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Los expertos en la materia apreciarán que el diseño del vector de expresión, incluida la selección de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora a ser transformada, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para la expresión de células hospedadoras de mamíferos incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteína en células de mamíferos, tales promotores y/o potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV), virus 40 de los simios (SV40), adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardío principal del adenovirus (AdMLP) y polioma. Como alternativa, se pueden usar las secuencias reguladoras no virales, tales como el promotor de ubiquitina o promotor de p-globina. Aún más, los elementos reguladores compuestos de secuencias de diferentes fuentes, tales como el sistema promotor SRa, el cual contiene secuencias del promotor más temprano de SV40 y la repetición terminal larga del virus de la leucemia de linfocitos T humanos, tipo 1 (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472).

Además de los genes de la cadena del anticuerpo y las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes pueden llevar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células hospedadoras (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células hospedadoras en las que se ha introducido el vector (véanse, por ejemplo, la Patentes de los Estados Unidos números 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, todas de Axel et al). Por ejemplo, típicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula hospedadora en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para uso en células hospedadoras dhfr- con selección/amplificación en metotrexato) y el gen neo (para selección de G418).

Para la expresión de las cadenas ligera y pesada, los vectores de expresión que codifican las cadenas pesada y ligera se transfectan en una célula hospedadora mediante técnicas convencionales. Las diversas formas del término “transfección” pretenden abarcar una amplia variedad de técnicas usadas comúnmente para la introducción de ADN exógeno en una célula hospedadora procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato cálcico, transfección con DEAE-dextrano y similares. Aunque teóricamente es posible expresar los anticuerpos descritos en el presente documento en células hospedadoras procariotas o eucariotas, la expresión de anticuerpos en células eucariotas, y más preferiblemente células hospedadoras de mamífero, es la más preferida porque en tales células eucariotas, y en particular células de mamífero, es más probable que las células procariotas se ensamblen y secreten un anticuerpo inmunológicamente activo y adecuadamente plegado. Se ha descrito que la expresión procariota de genes de anticuerpos es ineficaz para la producción de altos rendimientos de anticuerpo activo (Boss, M. A. y Wood, C. R. (1985)Immunology Today6:12-13). Los anticuerpos de la presente invención también se pueden producir en cepas de la levaduraPichia pastorismodificadas por glucoingeniería. Li et al. (2006)Nat. Biotechnol.24: 210.

Las células hospedadoras de mamífero preferidas para expresar los anticuerpos recombinantes descritos en el presente documento incluyen ovario de hámster chino (células CHO) (que incluyen células de CHO dhfr-, descritas en Urlaub y Chasin (1980)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 77:4216-4220, usadas con un marcador seleccionable de DHFR, por ejemplo, como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 759:601-621), células de mieloma NSO, células COS y células SP2. En particular, para el uso con células de mieloma NSO, otro sistema de expresión preferido es el sistema de expresión del gen GS descrito en los documentos WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338.841. Cuando se introducen vectores de expresión recombinante que codifican genes de anticuerpos en células hospedadoras de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células hospedadoras durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospedadoras o, más preferiblemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que se cultivan las células hospedadoras. Los anticuerpos se pueden recuperar del medio de cultivo usando métodos convencionales de purificación de proteínas.

Los extremos N y C-terminales de las cadenas polipeptídicas de anticuerpos de la presente invención pueden diferir de la secuencia esperada debido a las modificaciones postraduccionales observadas comúnmente. Por ejemplo, los residuos de lisina C-terminales a menudo están ausentes de las cadenas pesadas de anticuerpos. Dick et al. (2008) Biotechnol. Bioeng. 100:1132. Los residuos de glutamina N-terminal, y en menor grado los residuos de glutamato, se convierten frecuentemente en residuos de piroglutamato en cadenas tanto ligeras como pesadas de anticuerpos terapéuticos. Dick et al. (2007)Biotechnol. Bioeng.97:544; Liu et al. (2011)J. Biol. Chem.286:11211.

Las secuencias de aminoácidos para diversos anticuerpos agonistas anti-huCD40 de la presente invención se proporcionan en el Listado de secuencias que se resume en la Tabla 8. Por las razones mencionadas anteriormente, la lisina C-terminal no está incluida en ninguna secuencia en el Listado de secuencias de cadenas pesadas o dominios constantes de cadenas pesadas. Sin embargo, en una realización alternativa, cada cadena pesada de los anticuerpos anti-huCD40 de la presente invención, y/o construcción genética que codifica los anticuerpos o las cadenas pesadas o ligeras de los mismos, incluye este residuo de lisina adicional en el extremo C-terminal de una o ambas cadenas pesadas.

VII. Ensayos

Los anticuerpos descritos en el presente documento se pueden analizar para determinar la unión a CD40, por ejemplo, mediante ELISA convencional. Brevemente, las placas de microtitulación se recubren con CD40 purificado a 1-2 pg/ml en PBS, y luego se bloquean con seroalbúmina bovina al 5 % en PBS. Se añaden diluciones de anticuerpo (por ejemplo, diluciones de plasma de ratones inmunizados con CD40) a cada pocillo y se incuban durante 1-2 horas a 37 °C. Las placas se lavan con PBS/Tween y luego se incuban con reactivo secundario (por ejemplo, para anticuerpos humanos, o anticuerpos que de otra forma tienen una región constante de cadena pesada humana, un reactivo policlonal específico de Fc de cabra anti-IgG humana) conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) durante 1 hora a 37 °C. Después del lavado, las placas se desarrollan con sustrato ABTS (Moss Inc, producto: ABTS-1000) y se analizan en un espectrofotómetro a DO 415-495. Los sueros de ratones inmunizados se analizan adicionalmente por citometría de flujo para detectar la unión a una línea celular que expresa CD40 humano, pero no a una línea celular de control que no expresa CD40. Brevemente, la unión de anticuerpos anti-CD40 se evalúa incubando células CHO que expresan CD40 con el anticuerpo anti-CD40 a una dilución 1:20. Las células se lavan y la unión se detecta con un Ab anti-IgG humana marcado con PE. Los análisis de citometría de flujo se realizan usando una citometría de flujo FACScan (Becton Dickinson, San José, CA). Preferiblemente, los ratones que desarrollan los títulos más altos se usarán para las fusiones. Se pueden realizar experimentos análogos usando anticuerpos de detección anti-ratón si se van a detectar anticuerpos anti-huCD40 de ratón.

Se puede usar un ELISA como se describió anteriormente para detectar anticuerpos y, por lo tanto, hibridomas que producen anticuerpos que muestran reactividad positiva con el inmunógeno CD40. Los hibridomas que producen anticuerpos que se unen, preferiblemente con alta afinidad, a CD40 pueden después subclonarse y caracterizarse adicionalmente. Un clon de cada hibridoma, que retiene la reactividad de las células progenitoras (por ELISA), puede elegirse entonces para crear un banco de células y para la purificación de anticuerpos.

Para purificar anticuerpos anti-CD40, los hibridomas seleccionados se pueden cultivar en matraces rotativos de dos litros para la purificación de anticuerpos monoclonales. Los sobrenadantes se pueden filtrar y concentrar antes de la cromatografía de afinidad con proteína A-sefarosa (Pharmacia, Piscataway, NJ). La IgG eluida puede controlarse por electroforesis en gel y cromatografía líquida de alta resolución para garantizar la pureza. La solución tampón puede intercambiarse en PBS, y la concentración se puede determinar a DO280 usando un coeficiente de extinción 1,43. Los anticuerpos monoclonales se pueden distribuir en alícuotas y almacenar a -80 °C.

Para determinar si los anticuerpos monoclonales anti-CD40 seleccionados se unen a epítopos únicos, cada anticuerpo puede biotinilarse usando reactivos comercializados (Pierce, Rockford, IL). La unión del MAb biotinilado se puede detectar con una sonda marcada con estreptavidina. Los estudios de competición que usan anticuerpos monoclonales no marcados y anticuerpos monoclonales biotinilados pueden realizarse usando placas de ELISA recubiertas con CD40 como se describió anteriormente.

Para determinar el isotipo de anticuerpos purificados, se pueden realizar ensayos ELISA de isotipo usando reactivos específicos de anticuerpos de un isotipo particular. Por ejemplo, para determinar el isotipo de un anticuerpo monoclonal humano, se pueden recubrir pocillos de placas de microtitulación con 1 pg/ml de anti-inmunoglobulina humana durante la noche a 4 °C. Después del bloqueo con BSA al 1 %, las placas se hacen reaccionar con 1 pg/ml o menos de anticuerpos monoclonales de prueba o controles de isotipo purificado, a temperatura ambiente durante una o dos horas. Los pocillos pueden hacerse reaccionar con sondas conjugadas con fosfatasa alcalina específicas de IgM humana o IgG1 humana. Las placas se desarrollan y analizan como se ha descrito anteriormente.

Para probar la unión de anticuerpos monoclonales a células vivas que expresan CD40, se puede usar citometría de flujo. Brevemente, las líneas celulares que expresan CD40 unido a la membrana (cultivadas en condiciones de crecimiento convencional) se mezclan con diversas concentraciones de anticuerpos monoclonales en PBS que contiene BSA al 0,1 % a 4 °C durante 1 hora. Después del lavado, las células se hacen reaccionar con anticuerpo anti-IgG marcado con ficoeritrina (PE) en las mismas condiciones que la tinción del anticuerpo primario. Las muestras se pueden analizar con un instrumento FACScan que usa propiedades de luz y dispersión lateral para bloquear en células individuales y se determina la unión de los anticuerpos marcados. Se puede usar un ensayo alternativo usando microscopía de fluorescencia (además de o en lugar de) el ensayo de citometría de flujo. Las células pueden ser teñidas exactamente como se describió anteriormente y son examinadas por microscopía de fluorescencia. Este método permite la visualización de células individuales, pero pueden haber disminuido la sensibilidad dependiendo de la densidad del antígeno.

Los anticuerpos anti-huCD40 se pueden analizar adicionalmente para determinar su reactividad con el antígeno CD40 mediante transferencia Western. Brevemente, los extractos celulares de las células que expresan CD40 pueden ser preparados y sometidos a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio. Después de la electroforesis, los antígenos separados se transferirán a membranas de nitrocelulosa, se bloquearán con suero de ratón al 20 % y se probarán con los anticuerpos monoclonales que se van a analizar. La unión de IgG se puede detectar usando pastillas de sustrato de fosfatasa alcalina para anti-IgG y desarrollar con pastillas de sustrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO).

Los métodos para analizar la afinidad de unión, reactividad cruzada y cinética de unión de diversos anticuerpos anti-CD40 incluyen ensayos convencionales conocidos en la técnica, por ejemplo, análisis de interferometría de biocapa (BLI) y análisis de resonancia de plasmón superficial (SPR) BIACORE® usando un instrumento BIACORE® 2000 SpR (Biacore AB, Uppsala, Suecia).

El anticuerpo se une específicamente a la región extracelular de CD40 humano. Un anticuerpo puede unirse específicamente a un dominio particular (por ejemplo, un dominio funcional) dentro del dominio extracelular de CD40. En ciertas realizaciones, el anticuerpo se une específicamente a la región extracelular de CD40 humano y a la región extracelular de CD40 de macaco. Preferiblemente, un anticuerpo se une a CD40 humano con alta afinidad.

VIII. Moléculas biespecíficas

Los anticuerpos descritos en el presente documento se pueden usar para formar moléculas biespecíficas. Un anticuerpo anti-CD40, o fragmentos de unión al antígeno del mismo, puede ser derivatizados o unidos a otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando para un receptor) para generar una molécula biespecífica que se une al menos a dos sitios de unión diferentes o moléculas objetivo. El anticuerpo descrito en el presente documento puede, de hecho, derivatizarse o unirse a más de una molécula funcional diferente para generar moléculas multiespecíficas que se unen a más de dos sitios de unión y/o moléculas objetivo diferentes; tales moléculas multiespecíficas también se pretende que estén incluidas por la expresión “molécula biespecífica” como se usa en el presente documento. Para crear una molécula biespecífica descrita en el presente documento, un anticuerpo descrito en el presente documento puede unirse funcionalmente (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente, u otro) a una o más moléculas de unión, tales como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o mimético de unión, de modo que se obtenga una molécula bioespecífica.

Por consiguiente, se proporcionan en el presente documento moléculas biespecíficas que comprenden al menos una primera especificidad de unión para CD40 y una segunda especificidad de unión para un segundo epítopo objetivo. En una realización descrita en el presente documento en la que la molécula biespecífica es multiespecífica, la molécula puede incluir además una tercera especificidad de unión.

En una realización, las moléculas biespecíficas descritas en el presente documento comprenden como especificidad de unión al menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo del mismo, que incluye, por ejemplo, un Fab, Fab', F(ab')2, Fv o un Fv monocatenario. El anticuerpo también puede ser un dímero de cadena ligera o de cadena pesada, o cualquier fragmento mínimo del mismo tal como un Fv o una construcción monocatenaria como se describe en Ladner et al. Patente de los Estados Unidos N.° 4.946.778.

Aunque se prefieren los anticuerpos monoclonales humanos, otros anticuerpos que se pueden emplear en las moléculas biespecíficas descritas en el presente documento son anticuerpos monoclonales murinos, quiméricos y humanizados.

Las moléculas biespecíficas descritas en el presente documento se pueden preparar conjugando las especificidades de unión constituyentes usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, cada especificidad de unión de la molécula biespecífica puede generarse por separado y luego conjugarse entre sí. Cuando las especificidades de unión son proteínas o péptidos, se puede usar una variedad de agentes de acoplamiento o entrecruzamiento para la conjugación covalente. Los ejemplos de agentes de entrecruzamiento incluyen proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilendimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), y 4-(N-maleimidometil) ciclohaxano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC) (véase, por ejemplo, Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985)Proc. Natl. Acad. Sci.<u>SA 82:8648). Otros métodos incluyen aquellos descritos en Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118 132; Brennan et al. (1985)Science229:81-83), y Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Los agentes de conjugación preferidos son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles en Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

Cuando las especificidades de unión son anticuerpos, los mismos pueden ser conjugados mediante unión por sulfhidrilo de las regiones de bisagra del extremo C-terminal de las dos cadenas pesadas. En una realización particularmente preferida, la región de bisagra se modifica para que contenga un número impar de residuos de sulfhidrilo, preferiblemente uno, antes de la conjugación.

Como alternativa, ambas especificidades de unión pueden ser codificadas en el mismo vector y expresarse y ensamblarse en la misma célula hospedadora. Este método es particularmente útil cuando la molécula biespecífica es una proteína de fusión mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')<2>o ligando x Fab. Una molécula biespecífica descrita en el presente documento puede ser una molécula monocatenaria que comprende un anticuerpo monocatenario y un determinante de unión, o una molécula biespecífica monocatenaria que comprende dos determinantes de unión. Las moléculas biespecíficas pueden comprender al menos dos moléculas monocatenarias. Los métodos para preparar moléculas biespecíficas se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos números 5.260.203; 5.455.030; 4.881.175; 5.132.405; 5.091.513; 5.476.786; 5.013.653; 5.258.498; y 5.482.858.

La unión de las moléculas biespecíficas a sus objetivos específicos puede confirmarse usando métodos reconocidos en la técnica, tales como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), análisis FACS, bioensayo (por ejemplo, inhibición del crecimiento) o ensayo de transferencia Western. Cada uno de estos ensayos generalmente detecta la presencia de complejos de proteína-anticuerpo de interés particular empleando un reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) específico para el complejo de interés.

IX. Composiciones

Se proporcionan adicionalmente composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas, que contienen uno o más anticuerpos anti- CD40, o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, como se describe en el presente documento, formulados junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones pueden incluir uno o una combinación de (por ejemplo, dos o más diferentes) anticuerpos, o inmunoconjugados o moléculas biespecíficas descritas en el presente documento. Por ejemplo, una composición farmacéutica descrita en el presente documento puede comprender una combinación de anticuerpos (o inmunoconjugados o biespecíficos) que se unen a diferentes epítopos en el antígeno objetivo o que tienen actividades complementarias.

En ciertas realizaciones, una composición comprende un anticuerpo anti-CD40 a una concentración de al menos 1 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, o a 1-300 mg/ml o 100-300 mg/ml.

Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento también pueden ser administradas en terapia de combinación, es decir, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir un anticuerpo anti-CD40 descrito en el presente documento, combinado con al menos uno de otro agente estimulante (por ejemplo, de activación) de linfocitos T y/o anticanceroso. Ejemplos de agentes terapéuticos que pueden ser usados en terapia de combinación son descritos en mayor detalle más adelante en la sección sobre usos de los anticuerpos descritos en el presente documento.

En algunas realizaciones, las composiciones terapéuticas descritas en el presente documento pueden incluir otros compuestos, fármacos, y/o agentes usados para el tratamiento de cáncer. Tales compuestos, fármacos, y/o agentes pueden incluir, por ejemplo, fármacos de quimioterapia, fármacos de molécula pequeña o anticuerpos que estimulan la respuesta inmunitaria a un cáncer dado. En algunos casos, las composiciones terapéuticas pueden incluir, por ejemplo, uno o más de un anticuerpo anti-CTLA-4, un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-PD-L1, un anticuerpo anti-TIGIT, un anticuerpo anti-OX40 (también conocido como CD 134, TNFRSF4, ACT35 y/o TXGP1L), un anticuerpo anti-LAG-3, un anticuerpo anti-CD73, un anticuerpo anti-CD37, un anticuerpo anti-CD27, un anticuerpo anti-CSF-1R, un agonista de TLR, o un antagonista de molécula pequeña de IDO o TGFp.

Como se usa en el presente documento, “vehículo farmacéuticamente aceptable” incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes retardantes de la absorción e isotónicos, y similares que son fisiológicamente compatibles. Preferiblemente, el vehículo es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, raquídea o epidérmica (por ejemplo, por inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo, es decir, anticuerpo, inmunoconjugado, o molécula biespecífica, puede ser recubierto con un material para proteger el compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.

Los compuestos farmacéuticos descritos en el presente documento pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una “sal farmacéuticamente aceptable” se refiere a una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto precursor y no provoca efectos toxicológicos indeseados (véase, por ejemplo, Berge, S.M.,et al.,(1977)J. Pharm. Sci.66: 1-19). Ejemplos de tales sales incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de base. Las sales de adición de ácido incluyen aquellas derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso y similares, así como también de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos mono y dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos y similares. Las sales de adición de base incluyen aquellas derivadas de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio, y similares, así como también de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y similares.

Una composición farmacéutica descrita en el presente documento también puede incluir un anti-oxidante farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes hidrosolubles, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como ascorbil palmitato, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol, y similares; y (3) agentes quelantes de metal, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminatetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, y similares.

Ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden ser empleados en las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos.

Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos puede garantizarse tanto por procedimientos de esterilizaciónsupra,como por la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol sórbico, y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio, y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede conseguirse mediante la inclusión de agentes que retardan la absorción tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce en la técnica. Excepto en el caso de que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento. Los compuestos activos suplementarios también pueden ser incorporados en las composiciones.

Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede ser formulada como una solución, microemulsión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para la alta concentración de fármaco. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos.

Las soluciones inyectables estériles pueden ser preparadas incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes citados anteriormente, como se requiera, seguido de esterilización por microfiltración. En general, las dispersiones son preparadas incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos a partir de aquellos citados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado en vacío y secado por congelación (liofilización) que proporciona un polvo del principio activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución del mismo previamente esterilizada por filtración.

La cantidad de principio activo que puede ser combinada con un material vehículo para producir una forma farmacéutica única variará dependiendo del sujeto que será tratado, y el modo particular de administración. La cantidad de principio activo que puede ser combinada con un material vehículo para producir una forma farmacéutica única en general, será tal cantidad de la composición que produce un efecto terapéutico. En general, de un cien por ciento, esta cantidad variará desde aproximadamente 0.01 por ciento hasta aproximadamente noventa y nueve por ciento de principio activo, preferiblemente desde aproximadamente 0,1 por ciento hasta aproximadamente 70 por ciento, muy preferiblemente desde aproximadamente 1 por ciento hasta aproximadamente 30 por ciento de principio activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los regímenes de dosificación son ajustados para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un bolo único, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo, o la dosis puede ser proporcionalmente reducida o incrementada como se indica por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en una forma farmacéutica unitaria para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma farmacéutica unitaria como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos que serán tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas farmacéuticas unitarias descritas en el presente documento viene dictada por, y es directamente dependiente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se va a lograr, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de elaboración de compuestos, tal como un compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos.

Para la administración del anticuerpo, la dosificación varía desde aproximadamente 0,0001 hasta 100 mg/kg, y más habitualmente desde 0,01 hasta 5 mg/kg, del peso corporal del hospedador. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg. Un régimen de tratamiento ilustrativo implica la administración una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses o una vez cada tres a seis meses.

En algunos métodos, dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión son administrados simultáneamente, en tal caso la dosificación de cada anticuerpo administrado cae dentro del intervalo indicado. Un anticuerpo terapéutico es habitualmente administrado en ocasiones múltiples. Los intervalos entre dosificaciones únicas pueden ser, por ejemplo, semanalmente, mensualmente, cada teres meses o anualmente. Los intervalos también pueden ser irregulares como se indica mediante la medición de las concentraciones sanguíneas de anticuerpo dirigido al antígeno objetivo en el paciente. En algunos métodos, la dosificación se ajusta para lograr una concentración plasmática de anticuerpo de aproximadamente 1-1000 pg/ml y en algunos métodos aproximadamente 25-300 pg/ml.

Un anticuerpo puede ser administrado como una formulación de liberación sostenida, en tal caso se requiere administración menos frecuente. La dosificación y frecuencia varían dependiendo de la semivida del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran la semivida más larga, seguida por anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, y anticuerpos no humanos. La dosificación y frecuencia de administración puede variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, una dosificación relativamente baja es administrada a intervalos relativamente no frecuentes durante un periodo de tiempo largo. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento durante el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, a veces se requiere una dosificación relativamente alta a intervalos relativamente cortos hasta que el progreso de la enfermedad se reduce o termina, y preferiblemente hasta que el paciente muestra alivio completo o parcial de los síntomas de la enfermedad. Posteriormente, se puede administrar opcionalmente al paciente un régimen profiláctico, aunque en muchas indicaciones de inmunooncología el tratamiento continuado no es necesario.

Los niveles reales de dosificación de los principios activos en las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se pueden variar para obtener una cantidad del principio activo que es eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente composición, y modo de administración particular, sin sertóxico para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares descritas en el presente documento empleadas, o el éster, sal o amida del mismo, la vía de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se está utilizando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historial médico previo del paciente a tratar, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.

Una “dosificación terapéuticamente eficaz” de un anticuerpo anti-CD40 descrito en el presente documento preferiblemente tiene como resultado una disminución de la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un incremento en la frecuencia y duración de los periodos libres de síntomas de la enfermedad, o una prevención del deterioro o incapacidad debido al padecimiento de la enfermedad. En el contexto del cáncer, una dosis terapéuticamente eficaz previene preferiblemente el deterioro adicional de síntomas físicos asociados con el cáncer. Los síntomas de cáncer son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, características inusuales en un lunar, un cambio en la apariencia de un lunar, que incluyen asimetría, bordes, color y/o diámetro, un área de piel recientemente pigmentada, un lunar anormal, área oscurecida bajo la uña, bultos en el pecho, cambios en el pezón, quistes de mama, dolor de mama, muerte, pérdida de peso, debilidad, fatiga excesiva, dificultad para comer, pérdida del apetito, tos crónica, empeoramiento de la disnea, tos con sangre, sangre en la orina, sangre en las heces, náuseas, vómitos, metástasis del hígado, metástasis del pulmón, metástasis de hueso, plenitud abdominal, hinchazón, fluido en la cavidad peritoneal, sangrado vaginal, estreñimiento, distensión abdominal, perforación de colon, peritonitis aguda (infección, fiebre, dolor), dolor, vómito con sangre, sudoración intensa, fiebre, presión arterial alta, anemia, diarrea, ictericia, mareos, escalofríos, espasmos musculares, metástasis de colon, metástasis de pulmón, metástasis de vejiga, metástasis de hígado, metástasis ósea, metástasis de riñón, y metástasis pancreática, dificultar para tragar, y similares. La eficacia terapéutica puede ser observable inmediatamente después de la primera administración de un mAb anti-huCD40 agonista de la presente invención, o puede ser solamente observada después de un periodo de tiempo y/o una serie de dosis. Tal eficacia retardada puede solamente ser observada después de varios meses de tratamiento, hasta 6, 9 o 12 meses. Es fundamental no decidir prematuramente que un mAb anti-huCD40 agonista de la presente invención carece de eficacia terapéuticamente en vista de la eficacia retardada presentada por algunos agentes de inmunooncología.

Una dosis terapéuticamente eficaz puede prevenir o retardar el comienzo de cáncer, tal como se puede desear cuando están presentes signos tempranos o preliminares de la enfermedad. Las pruebas de laboratorio utilizadas en el diagnóstico del cáncer incluyen bioquímica (que incluyen la medición de niveles de CD40 o CD40L soluble) (Hocket al.(2006)Cáncer106:2148; Chung & Lim (2014)J. Trans. Med.12: 102), hematología, serología y radiología. Por consiguiente, cualquier ensayo clínico o bioquímico que analice cualquiera de los anteriores puede ser usado para determinar si un tratamiento particular es una dosis terapéuticamente eficaz para tratar el cáncer. Un experto en la materia podría ser capaz de determinar tales cantidades basándose en tales factores como el tamaño del sujeto, la gravedad de los síntomas objetivo, y la composición o vía particular de administración seleccionada.

Una composición descrita en el presente documento puede ser administrada mediante una o más vías de administración usando una o más de una variedad de métodos conocidos en la técnica. Como se apreciará por el experto en la materia, la vía y/o modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Las vías preferidas de administración para anticuerpos descritos en el presente documento incluyen intravenosa, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, subcutánea, raquídea u otras vías parenterales de administración, por ejemplo, por inyección o infusión. La expresión “administración parenteral” como se usa en el presente documento significa modos de administración distintos la administración tópica y entérica, habitualmente por inyección, e incluye, sin limitación, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intrarraquídea, epidural e infusión e inyección intraesternal.

Como alternativa, un anticuerpo descrito en el presente documento, puede ser administrado mediante una vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosal, por ejemplo, por vía intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópica.

Los compuestos activos pueden ser preparados con vehículos que protegerán el compuesto contra la rápida liberación, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes, parches transdérmicos, y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biocompatibles, biodegradables, tales como etilen vinil acetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados o son generalmente conocidos por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo,Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Las composiciones terapéuticas pueden ser administradas con productos sanitarios conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una realización preferida, una composición terapéutica descrita en el presente documento puede ser administrada con un dispositivo de inyección hipodérmico sin aguja, tal como los dispositivos descritos en las Patentes Estadounidenses Números 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; o 4.596.556. Ejemplos de implantes bien conocidos y módulos para uso con anticuerpos anti-huCD40 descritos en el presente documento incluyen: Patente Estadounidense N.° 4.487.603, la cual describe una bomba de micro-infusión implantable para dispensar medicación a una velocidad controlada; Patente Estadounidense N.° 4.486.194, la cual describe un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; Patente Estadounidense No. 4.447.233, la cual describe una bomba de infusión de medicación para suministro de un medicamento a una velocidad de infusión precisa; Patente Estadounidense N.° 4.447.224, la cual describe un aparato de infusión implantable de flujo variable para suministro continuo de fármaco; Patente Estadounidense N.° 4.439. 196, la cual describe un sistema de administración de fármaco osmótico que tiene compartimientos de cámara múltiple; y Patente Estadounidense No.

4.475.196, la cual describe un sistema de administración osmótica de fármaco que tiene compartimentos multicámara y la Patente Estadounidense N.° 4.475.196, que divulga un sistema de administración osmótica de fármaco. Muchos otros de tales implantes, sistemas de suministro, y módulos se conocen por aquellos expertos en la materia.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-huCD40 descritos en el presente documento pueden ser formulados para asegurar la distribución apropiadain vivo.Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrófilos. Para asegurar que los compuestos terapéuticos descritos en el presente documento cruzan la BBB (si se desea), pueden ser formulados, por ejemplo, en liposomas. Para métodos de fabricación de liposomas,véase, por ejemplo,Patentes Estadounidenses 4.522.811; 5.374.548; y 5.399.331. Los liposomas pueden comprender una o más porciones que son selectivamente transportadas en células u órganos específicos, de este modo se mejora el suministro de fármaco objetivo(véase, por ejemplo,V.V. Ranade (1989)J. Clin. Pharmacol.29:685). Los restos objetivo ilustrativos incluyen folato o biotina (véase, por ejemplo, Patente Estadounidense 5.416.016 por Lowet al.);manósidos (Umezawaet al.,(1988)Biochem. Biophys. Res. Commun.153:1038); anticuerpos (P.G. Bloemanet al.,(1995)FEBS Lett.357:140; M. Owaiset al.,(1995)Antimicrob. Agents Chemother.39:180); receptor de proteína tensioactivo A (Briscoeet al.,(1995)Am. J. Physiol.1233:134); pl20 (Schreieret al.,(1994)J. Biol. Chem.

269:9090); véase también K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994)FEBS Lett.346: 123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994;Immunomethods4:273.

X. Usos y Métodos

Cualquier referencia en la descripción a los métodos de tratamiento se refieren a los anticuerpos o composiciones farmacéuticas de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia. Los anticuerpos, composiciones de anticuerpo y métodos descritos en el presente documento tienen numerosas utilidadesin vitroein vivoque implican, por ejemplo, mejora de la respuesta inmunitaria antagonizando la señalización de CD40. En una realización preferida, los anticuerpos descritos en el presente documento son anticuerpos humanos o humanizados. Por ejemplo, los anticuerpos anti-huCD40 descritos en el presente documento pueden ser administrados a células en cultivo,in vitrooex vivo,o a sujetos humanos, por ejemplo,in vivo,para mejorar la inmunidad en una variedad de enfermedades. Por consiguiente, se proporcionan en el presente documento anticuerpos o composiciones farmacéuticas de la presente invención para usar en métodos para modificar una respuesta inmunitaria en un sujeto que comprende, administrar al sujeto un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, descrito en el presente documento de manera que la respuesta inmunitaria en el sujeto mejore, se estimule o se regule positivamente.

Los sujetos preferidos incluyen pacientes humanos en los que sería deseable la mejora de una respuesta inmunitaria. Los anticuerpos o composiciones farmacéuticas son especialmente adecuados para uso en métodos para tratar pacientes humanos que tienen un trastorno que puede ser tratado aumentando una respuesta inmunitaria (por ejemplo, la respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T). En una realización particular, los anticuerpos o composiciones farmacéuticas para uso en métodos de tratamiento son particularmente adecuados para el tratamiento del cáncerin vivo.Para lograr la mejora de inmunidad específica del antígeno, los anticuerpos anti-huCD40 descritos en el presente documento pueden ser administrados junto con un antígeno de interés o el antígeno puede ya estar presente en el sujeto a tratar (por ejemplo, un sujeto que porta el virus o porta el tumor). Cuando los anticuerpos contra CD40 son administrados junto con otro agente, los dos pueden ser administrados separadamente o simultáneamente.

También están abarcados métodos para detectar la presencia de antígeno CD40 humano en una muestra, o medir la cantidad de antígeno CD40 humano, que comprenden poner en contacto la muestra, y una muestra de control, con un anticuerpo monoclonal humano, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une específicamente a CD40 humano, en condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo o fragmento del mismo y el CD40 humano. A continuación, se detecta la formación de un complejo, en donde una diferencia en la formación de complejo entre la muestra comparada con la muestra de control es indicativa de la presencia de antígeno CD40 humano en la muestra. Sin embargo, los anticuerpos anti-CD40 descritos en el presente documento pueden ser usados para purificar CD40 humanos mediante purificación por inmunoafinidad.

Dada la capacidad de los anticuerpos anti-huCD40 descritos en el presente documento para mejorar la coestimulación de respuestas de linfocitos T, por ejemplo, respuestas de linfocitos T específicas del antígeno, se proporcionan en el presente documento métodos de usoin vitroein vivode los anticuerpos descritos en el presente documento para estimular, mejorar o regular positivamente las respuestas de linfocitos T específicas del antígeno, por ejemplo, respuestas de linfocitos T antitumorales. Las respuestas de linfocitos T CD4+ y CD8+ pueden ser mejoradas usando anticuerpos anti-CD40. Los linfocitos T pueden ser linfocitos Tef, por ejemplo, linfocitos Tef CD4+, linfocitos Tef CD8+, linfocitos T cooperadores (Th) y linfocitos T citotóxicos T (Tc).

Además, están abarcados anticuerpos o composiciones farmacéuticas para uso en métodos para mejorar una respuesta inmunitaria (por ejemplo, una respuesta de linfocitos T específica del antígeno) en un sujeto que comprenden administrar un anticuerpo anti-huCD40 descrito en el presente documento al sujeto de manera que se mejora una respuesta inmunitaria (por ejemplo, una respuesta de linfocitos T específica del antígeno) en el sujeto. En una realización preferida, el sujeto es un sujeto que porta un tumor y se mejora una respuesta inmunitaria contra el tumor. Un tumor puede ser un tumor sólido o un tumor líquido, por ejemplo, una neoplasia hematológica. En ciertas realizaciones, un tumor es un tumor inmunogénico. En ciertas realizaciones, un tumor es no inmunogénico. En ciertas realizaciones, un tumor es PD-L1 positivo. En ciertas realizaciones un tumor es PD-L1 negativo. Un sujeto también puede ser un sujeto que porta el virus y se mejora una respuesta inmunitaria contra el virus.

Se proporcionan, además, anticuerpos o composiciones farmacéuticas para uso en métodos para inhibir el crecimiento de células tumorales en un sujeto que comprenden, administrar al sujeto un anticuerpo anti-huCD40 descrito en el presente documento de manera que se inhiba el crecimiento del tumor en el sujeto. También se proporcionan anticuerpos o composiciones farmacéuticas para uso en métodos para tratar una infección viral crónica en un sujeto que comprenden, administrar al sujeto un anticuerpo anti-huCD40 descrito en el presente documento de manera que se trate la infección viral crónica en el sujeto.

En ciertas realizaciones, se administra a un sujeto un anticuerpo anti-huCD40 como una terapia adyuvante. Los tratamientos de sujetos que tienen cáncer con un anticuerpo anti-huCD40 pueden conducir a una respuesta duradera a largo plazo respecto al tratamiento de referencia actual; la supervivencia a largo plazo de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 10 o más años, la supervivencia sin recurrencia de al menos 1,2, 3, 4, 5, o 10 o más años. En ciertas realizaciones, el tratamiento de un sujeto que tiene cáncer con un anticuerpo anti-huCD40 previene la recurrencia de cáncer o retarda la recurrencia de cáncer mediante, por ejemplo, en 1,2, 3, 4, 5, o 10 o más años. Un tratamiento anti-CD40 puede ser usado como una línea de tratamiento primaria o secundaria.

Estos y otros métodos descritos en el presente documento se analizan más detalladamente a continuación.

Cáncer

Se proporcionan en el presente documento anticuerpos o composiciones farmacéuticas para usar en métodos para tratar un sujeto que tiene cáncer, que comprenden administrar al sujeto un anticuerpo anti-huCD40 descrito en el presente documento, de manera que el sujeto es tratado, por ejemplo, de manera que el crecimiento de tumores cancerosos se inhibe o reduce y/o se impide su recurrencia. Un anticuerpo anti-huCD40 puede ser usado solo para inhibir el crecimiento de tumores cancerosos. Como alternativa, un anticuerpo anti-huCD40 puede ser usado junto con otro agente, por ejemplo, otros agentes inmunogénicos, tratamientos convencionales para el cáncer, u otros anticuerpos, como se describe a continuación. La combinación con un inhibidor de PD-1, tal como un anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1, también se proporciona.Véase, por ejemplo,Ellmarket al.,(2015)Oncolmmunology4:7 el011484.

Por consiguiente, se proporcionan en el presente documento anticuerpos o composiciones farmacéuticas para usar en métodos para tratar el cáncer, por ejemplo, inhibiendo el crecimiento de células tumorales, en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-huCD40 descrito en el presente documento, por ejemplo, una forma humanizada de 12D6, 5F11, 8E8, 5G7 o 19G3, o fragmento de unión al antígeno del mismo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-huCD40 humanizado (tal como cualquiera de los anticuerpos anti-huCD40 humanizados descritos en el presente documento), un anticuerpo anti-huCD40 quimérico humano, o un anticuerpo anti-huCD40 no humano humanizado, por ejemplo, un anticuerpo anti-huCD40 humano, quimérico o humanizado que compite por la unión con, o se une al mismo epítopo que, al menos uno de los anticuerpos anti-huCD40 específicamente descritos en el presente documento.

Los cánceres cuyo crecimiento puede ser inhibido usando los anticuerpos de la invención incluyen cánceres típicamente sensibles a inmunoterapia. Ejemplos no limitantes de cánceres para tratamiento incluyen carcinoma de células escamosas, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón escamoso no microcítico (NSCLC, por sus siglas en inglés), no NSCLC, glioma, cáncer gastrointestinal, cáncer renal (por ejemplo, carcinoma de células claras), cáncer de ovario, cáncer hepático, cáncer colorrectal, cáncer endometrial, cáncer de riñón (por ejemplo, carcinoma de células renales (RCC)), cáncer de próstata (por ejemplo, adenocarcinoma de próstata resistente a hormonas), cáncer de tiroides, neuroblastoma, cáncer pancreático, glioblastoma (glioblastoma multiforme), cáncer cervical, cáncer de estómago, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, carcinoma de colon, y cáncer (o carcinoma) de cabeza y cuello, cáncer gástrico, tumor de células germinales, sarcoma pediátrico, linfoma nasal de linfocitos T citolíticos, melanoma (por ejemplo, melanoma maligno metastásico, tal como melanoma maligno intraocular o cutáneo), cáncer de hueso, cáncer de piel, cáncer uterino, cáncer de la región anal, cáncer testicular, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma de endometrio, carcinoma del cerviz, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer del sistema endócrino, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de uretra, cáncer de pene, tumores sólidos de la infancia, cáncer de uréter, carcinoma de la pelvis renal, neoplasma del sistema nervioso central (CNS, por sus siglas en inglés), linfoma del CNS primario, angiogénesis del tumor, tumor del eje espinal, glioma del tronco encefálico, adenoma hipofisario, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, linfoma de linfocitos T, cánceres inducidos ambientalmente que incluyen aquellos inducidos por asbestos, cánceres relacionados con virus (por ejemplo, tumor relacionado con el virus del papiloma humano (HPV, por sus siglas en inglés), y neoplasias hematológicas derivadas de cualquiera de los dos linajes de células sanguíneas principales, es decir, la línea de células mieloides (la cual produce granulocitos, eritrocitos, trombocitos, macrófagos y mastocitos) o línea de células linfoides (la cual produce linfocitos B, T, NK y células plasmáticas), tales como todos los tipos de leucemias, linfomas, y mielomas, por ejemplo, leucemias aguda, crónica, linfocítica y/o mielógena, tal como leucemia aguda (ALL, por sus siglas en inglés), leucemia mielógena aguda (AML, por sus siglas en inglés), leucemia linfocítica crónica (CLL, por sus siglas en inglés), y leucemia mielógena crónica (CML, por sus siglas en inglés), AML no diferenciada (M0), leucemia mielobástica (M1), leucemia mieloblástica (M2; con maduración celular), leucemia promielocítica (variante M3 o M3 [M3V]), leucemia mielomonocítica (variante M4 o M4 con eosinofilia [M4E]), leucemia monocítica (M5), eritroleucemia (M6), leucemia megacarioblástica (M7), sarcoma granulocítico aislado, y cloroma; linfomas, tales como linfoma de Hodgkin (HL, por sus siglas en inglés), linfoma no Hodgkin (NHL, por sus siglas en inglés), linfomas de linfocitos B, linfomas de linfocitos T, linfoma linfoplasmacitoide, linfoma de linfocitos B monocitoide, linfoma del tejido linfoide asociado a la mucosa (MALT, por sus siglas en inglés), linfoma de células grandes anaplásicas (por ejemplo, Ki 1+), linfoma/leucemia de linfocitos T de adulto, linfoma de células del manto, linfoma angioinmunoblástico de linfocitos T, linfoma angiocéntrico, linfoma intestinal de linfocitos T, linfoma mediastínico primario de linfocitos B, linfoma linfoblástico de precursores de linfocitos T, linfoblástico de linfocitos T; y leucemia/linfoma (T-Lbly/T-ALL), linfoma de linfocitos T periféricos, linfoma linfoblástico, trastorno linfoproliferativo postrasplante, linfoma histiocítico verdadero, linfoma primario del sistema nervioso central, linfoma de efusión primaria, linfoma linfoblástico (LBL, por sus siglas en inglés), tumores hematopoyéticos del linaje linfoide, leucemia linfoblástica aguda, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de Burkitt, linfoma folicular, linfoma histiocítico difuso (DHL), linfoma inmunfoblástico de células grandes, linfoma linfoblástico de precursores de linfocitos T, linfoma cutáneo de linfocitos T (CTLC, por sus siglas en inglés) (también llamado micosis fungoides o síndrome de Sezary), y linfoma linfoplasmacitoide (LPL, por sus siglas en inglés) con macroglobulinemia de Waldenstrom; mielomas, tales como mieloma de IgG, mieloma de cadena ligera, mieloma no secretor, mieloma latente (también llamado mieloma indolente), plasmocitoma solitario, y mielomas múltiples, leucemia linfocítica crónica (CLL, por sus siglas en inglés), linfoma de células pilosas; tumores hematopoyéticos del linaje mieloide, tumores de origen mesenquimal, que incluyen fibrosarcoma y rabdomiosarcoma; seminoma, teratocarcinoma, tumores del sistema nervioso central y periférico, que incluyen astrocitoma, schwannomas; tumores de origen mesenquimal que incluyen fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, y osteosarcoma; y otros tumores, que incluyen melanoma, xerodermia pigmentosa, queratocarcinoma, seminoma, cáncer folicular tiroideo y teratocarcinoma, tumores hematopoyéticos del linaje linfoide, por ejemplo, tumores de linfocitos T y linfocitos B, que incluyen pero no se limitan a trastornos de linfocitos T tales como leucemia prolinfocítica de linfocitos T (T-PLL, por sus siglas en inglés), que incluyen del tipo de células cerebriformes y células pequeñas; leucemia de linfocitos grandes granulares (LGL, por sus siglas en inglés) preferiblemente del tipo de linfocitos T; linfoma hepatoesplénico NHL de linfocitos T a/d; linfoma de linfocitos T periféricos/postímicos (subtipos pleomórfico e inmunoblástico); linfoma angiocéntrico de linfocitos T; cáncer de cabeza o cuello, cáncer renal, cáncer rectal, cáncer de la glándula tiroides; linfoma mieloide agudo, así como cualquiera de las combinaciones de tales cánceres. Los métodos descritos en el presente documento también pueden ser usados para el tratamiento de cánceres metastásicos, cánceres resistentes (por ejemplo, cánceres resistentes a inmunoterapia previa, por ejemplo, con un anticuerpo bloqueante de PD-L1 o<c>T<l>A-4), y cánceres recurrentes.

No obstante lo anterior, los anticuerpos anti-huCD40 agonistas de la presente invención no tienen aplicación en el tratamiento de neoplasias hematológicas con expresión de CD40, la cual podría exacerbarse por el tratamiento con un agonista de CD40. Se sabe que ciertos cánceres expresan CD40 y, por tanto, están sujetos a tal exacerbación que son categóricamente excluidos. En otras realizaciones, las muestras específicas del tumor son probadas para determinar la expresión de CD40 y son excluidas de la terapia con los anticuerpos anti-huCD40 agonistas de la presente invención basándose en los resultados de las pruebas.

Un anticuerpo anti-huCD40 puede ser administrado como una monoterapia, o como la única terapia inmunoestimuladora, o puede ser combinado con un agente inmunogénico en una estrategia de vacuna para el cáncer, tal como células cancerosas, antígenos de tumor purificados (que incluyen proteínas recombinantes, péptidos y moléculas de carbohidrato), células, y células transfectadas con genes que codifican citocinas inmunitarias estimulantes (Heet al.,(2004)J. Immunol.173:4919-28). Ejemplos no limitantes de vacunas contra tumores que pueden ser usadas incluyen péptidos de antígenos de melanoma, tales como péptidos de gp100, antígenos MAGe , Trp-2, MARTI y/o tisorinasa, o células tumorales transfectadas para expresar la citocina GM-Cs F. Muchas estrategias experimentales para vacunación contra tumores han sido contempladas (véase Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C, 2000, ASCO Educational Book Spring: 300 302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730 738; véase también Restifo, N. y Sznol, M., Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043 en DeVitaet al.,(eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology, Quinta Edición). En una de estas estrategias, se prepara una vacuna usando células tumorales autólogas o alogénicas. Estas vacunas celulares han demostrado ser muy eficaces cuando las células tumorales son transducidas para expresar GM-CSF. El GM-CSF ha demostrado ser un activador potente de la presentación de antígeno para la vacunación contra un tumor. Dranoffet al.,(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3539-43.

El estudio de la expresión génica y de los patrones de expresión génica a gran escala en varios tumores ha conducido a la definición de los así llamados antígenos específicos del tumor. Rosenberg, S A (1999)Immunity10:281-7. En muchos casos, estos antígenos específicos del tumor son antígenos diferenciados expresados en los tumores y en la célula a partir de la cual se origina el tumor, por ejemplo, antígenos de melanocitos gp100, antígenos MAGE, y Trp-2. Más importante aún, se ha podido demostrar que muchos de estos antígenos son los objetivos de linfocitos T específicos del tumor encontrados en el hospedador. Los agonistas de CD40 pueden ser usados junto con una colección de proteínas recombinantes y/o péptidos expresados en un tumor con el fin de generar una respuesta inmunitaria frente a estas proteínas. Estas proteínas son normalmente consideradas por el sistema inmunitario como autoantígenos y son por lo tanto tolerantes a ellas. El antígeno tumoral puede incluir la proteína telomerasa, la cual es requerida para la síntesis de los telómeros de los cromosomas y la cual se expresa en más del 85 % de los cánceres humanos y en solamente un número limitado de tejidos somáticos (Kimet al.,(1994)Science266: 2011-2013). El antígeno tumoral también puede ser un “neoantígeno” expresado en células de cáncer debido a las mutaciones somáticas que alteran la secuencia de la proteína o crean proteínas de fusión entre dos secuencias no relacionadas (es decir, bcr-abl en el cromosoma Philadelphia), o idiotipo de tumores de linfocitos B.

Otras vacunas tumorales pueden incluir las proteínas de los virus implicados en cánceres humanos tales como el virus del papiloma humano (HpV, por sus siglas en inglés), el virus de la hepatitis (HBV y HCV, por sus siglas en inglés) y el virus del sarcoma del herpes de Kaposi (KHSV, por sus silgas en inglés). Otra forma de antígeno específico del tumor que puede ser usada junto con la inhibición de CD40 son las proteínas de choque térmico purificadas (HSP) aisladas a partir del propio tejido del tumor. Estas proteínas de choque térmico contienen fragmentos de proteínas de las células tumorales y estas HSP son altamente eficientes en la administración a células presentadoras de antígeno para estimular la inmunidad tumoral (Suot & Srivastava (1995)Science269: 1585-1588; Tamuraet al.,(1991)Science278: 117-120).

Las células dendríticas (DC, por sus siglas en inglés) son potentes células presentadoras de antígeno que pueden ser usadas para estimular respuestas específicas del antígeno. Las DC pueden ser producidasex vivoy cargadas con varios antígenos de péptidos y proteínas, así como también extractos de células tumorales (Nestleetal.,(1998)Nature Medicine4:328-332). Las DC también pueden ser transducidas por medios genéticos para expresar también estos antígenos tumorales. Las DC también han sido fusionadas directamente con células tumorales con el propósito de inmunización (Kugleretal.,(2000)Nature Medicine6:332-336). Como un método de vacunación, la inmunización con DC puede ser eficazmente combinada con el agonismo de CD40 para activar (desatar) respuestas antitumorales más potentes.

El agonismo de CD40 también puede ser combinado con tratamientos para el cáncer convencionales (por ejemplo, cirugía, radiación, y quimioterapia). El agonismo de CD40 puede ser eficazmente combinado con regímenes quimioterapéuticos. En estos casos, puede ser posible reducir la dosis del reactivo quimioterapéutico administrado (Mokyret al.,(1998) Cancer Research 58: 5301-5304). Un ejemplo de tal combinación es un anticuerpo anti-huCD40 en combinación con dacarbazina para el tratamiento del melanoma. Otro ejemplo de tal combinación es un anticuerpo anti-huCD40 en combinación con interleucina-2 (IL-2) para el tratamiento del melanoma. El razonamiento científico que justifica el uso combinado de agonistas de CD40 y quimioterapia es que la muerte celular, la cual es una consecuencia de la acción citotóxica de muchos compuestos quimioterapéuticos, debería producir un aumento de los niveles de antígeno tumoral en la vía de presentación del antígeno. Otras terapias de combinación que pueden producir sinergia con el agonismo de CD40 a través de la muerte celular son la radiación, la cirugía, y la deprivación hormonal. Cada uno de estos protocolos crea una fuente de antígeno tumoral en el hospedador. Los inhibidores de la angiogénesis también pueden ser combinados con agonistas de CD40. La inhibición de la angiogénesis conduce a la muerte de las células tumorales que pueden alimentar el antígeno tumoral en las vías de presentación del antígeno hospedador.

Los anticuerpos anti-huCD40 descritos en el presente documento también pueden ser usados en combinación con anticuerpos biespecíficos que dirigen las células efectoras que expresan el receptor Fca o F<cy>a células tumorales (véase, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses números 5.922.845 y 5,837,243). Los anticuerpos biespecíficos pueden ser usados para dirigir dos antígenos diferentes. Por ejemplo, se han usado anticuerpos biespecíficos receptor anti-Fc/antígeno antitumoral (por ejemplo, Her-2/neu) para dirigir macrófagos a sitios del tumor. Este direccionamiento puede activar más eficazmente las respuestas específicas del tumor. El brazo efector constituido por los linfocitos T en estas respuestas podría aumentarse por el agonismo de CD40. Como alternativa, el antígeno puede ser administrado directamente a las DCs por el uso de anticuerpos biespecíficos que se unen al antígeno tumoral y a un marcador de la superficie celular específico de células dendríticas.

Los tumores evaden la vigilancia inmunitaria del hospedador mediante una gran variedad de mecanismos. Muchos de estos mecanismos pueden ser superados por la inactivación de proteínas inmunosupresoras expresadas por los tumores. Estas incluyen entre otros TGF-p (Kehrletal.,(1986)J. Exp. Med.163:1037-1050), IL-10 (Howard & O'Garra (1992)Immunology Today13:198-200), y el ligando Fas (Hahneet al.,(1996)Science274: 1363-1365). Los anticuerpos contra cada una de estas entidades pueden ser usados en combinación con anticuerpos anti-huCD40 para contrarrestar los efectos del agente inmunosupresor y favorecer las respuestas inmunitarias tumorales por el hospedador.

Los anticuerpos anti-CD40 son capaces de sustituir eficazmente la actividad cooperadora de los linfocitos T. Ridgeet al.,(1998)Nature393:474-478. La activación de anticuerpos contra moléculas coestimuladoras de linfocitos T tales como CTLA-4 (por ejemplo, Patente Estadounidense N.° 5.811.097), OX-40 (Weinberget al.,(2000) Immunol.

164:2160-2169), CD137/4-1BB (Meleroetal.,(1997) Nature Medicine 3:682-685 (1997), e ICOS (Hutloffetal.,(1999) Nature 397: 262-266) puede también proporcionar niveles incrementados de activación de linfocitos T. Los inhibidores de PD1 o PD-L1 también pueden ser usados junto con anticuerpos anti-huCD40.

Existen también varios protocolos de tratamiento experimental que implican al activaciónex vivoy la expansión de linfocitos T específicos del antígeno y la transferencia adoptiva de estas células en receptores con el fin de estimular el tumor contra los linfocitos T específicos del antígeno (Greenberg & Riddell (1999)Science285: 546-51). Estos métodos también pueden ser usados para activar las respuestas de linfocitos T a agentes infecciosos tales como el CMV. La activaciónex vivoen la presencia de anticuerpos anti-CD40 puede incrementar la frecuencia y actividad de los linfocitos T transferidos adoptivamente.

Infecciones Virales Crónicas

En otro aspecto, la invención descrita en el presente documento proporciona anticuerpos o composiciones farmacéuticas para uso en un método para tratar una enfermedad infecciosa en un sujeto que comprende administrar al sujeto un anticuerpo anti-huCD40, o fragmento de unión al antígeno del mismo, de manera que el sujeto es tratado de la enfermedad infecciosa.

Similar a esta aplicación a tumores como se ha analizado anteriormente, el agonismo de CD40 mediado por el anticuerpo puede ser usado solo, o como un adyuvante, en combinación con vacunas, para mejorar las respuestas inmunitarias a patógenos, toxinas, y autoantígenos. Ejemplos de patógenos para los cuales el procedimiento terapéutico puede ser particularmente útil, incluyen patógenos para los cuales existe actualmente una vacuna no eficaz, o patógenos para los cuales las vacunas convencionales no son completamente eficaces. Estas incluyen, pero no se limitan al VIH, hepatitis (A, B y C), gripe, herpes,Giardia,malaria,Leishmania, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa.El agonismo de CD40 es particularmente útil contra infecciones establecidas por agentes tales como el VIH que presentan antígenos alterados durante el transcurso de las infecciones. Estos nuevos epítopos son reconocidos como extraños en el momento de la administración del anticuerpo anti-CD40 humano, provocando de este modo una fuerte respuesta de linfocitos T.

Algunos ejemplos de virus patógenos que causan infecciones tratables por los métodos descritos en el presente documento incluyen VIH, hepatitis (A, B, o C), virus del herpes (por ejemplo, virus VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II, y CMV, Epstein Barr), adenovirus, virus de la gripe, flavivirus, ecovirus, rinovirus, virus coxsackie, coronavirus, virus sincitial respiratorio, virus de las paperas, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubéola, parvovirus, virus vaccinia, virus HTLV, virus del dengue, virus del papiloma, virus del molusco, virus de la polio, virus de la rabia, virus JC y virus de la encefalitis arboviral.

Algunos ejemplos de bacterias patógenas que causan infecciones tratables por los métodos descritos en el presente documento incluyenChlamydia, bacterias Rickettsia,micobacterias, estafilococos, estreptococos, pneumonococos, meningococos y gonococos,Klebsiella, Proteus, Serratia, Pseudomonas, Legionella,difteria,Salmonella, Bacilli,cólera, tétanos, botulismo, ántrax, peste,leptospirosis,y bacteria de la enfermedad de Lyme.

Algunos ejemplos de hongos patógenos que causan infecciones tratables por los métodos descritos en el presente documento incluyenCandida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis,etc.),Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger,etc.), génerosMucorales (mucor, absidia, rhizopus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitiseHistoplasma capsulatum.

Algunos ejemplos de parásitos patógenos que causan infecciones tratables por los métodos descritos en el presente documento incluyenEntamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoebasp.,Giardia lambia, Cryptosporidiumsp.,Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondii, Nippostrongylus brasiliensis.

En todos los métodos anteriores, el agonismo de CD40 también puede ser combinado con otras formas de inmunoterapia tales como tratamiento de citocinas (por ejemplo, interferones, GM-CSF, G-CSF, IL-2), o terapia con anticuerpos biespecíficos, que proporciona una presentación mejorada de antígenos tumorales. Véase, por ejemplo, Holliger (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:6444-6448; Poljak (1994) Structure 2:1121-1123.

Adyuvantes de vacunas

Los anticuerpos anti-huCD40 descritos en el presente documento pueden ser usados para mejorar las respuestas inmunitarias específicas del antígeno por coadministración de un anticuerpo anti-huCD40 con un antígeno de interés, por ejemplo, una vacuna. Por consiguiente, se proporcionan en el presente documento anticuerpos o composiciones farmacéuticas para usar en métodos para mejorar una respuesta inmunitaria a un antígeno en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto: (i) el antígeno; y (ii) un anticuerpo anti-huCD40, o fragmento de unión al antígeno del mismo, de manera que se mejore una respuesta inmunitaria al antígeno en el sujeto. El antígeno puede ser, por ejemplo, un antígeno tumoral, un antígeno viral, un antígeno bacteriano o un antígeno de un patógeno. Ejemplos no limitantes de tales antígenos incluyen aquellos descritos en las secciones anteriores, tales como los antígenos tumorales (o vacunas tumorales) descritos anteriormente, o antígenos de virus, bacterias u otros patógenos descritos anteriormente.

Las vías adecuadas para administrar las composiciones de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos monoclonales humanos, moléculas biespecíficas y multiespecíficas e inmunoconjugados) descritas en el presente documentoin vivoein vitroson bien conocidas en la técnica y pueden ser seleccionadas por aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, las composiciones de anticuerpo pueden ser administradas por inyección (por ejemplo, intravenosa o subcutánea). Las dosificaciones adecuadas de las moléculas usadas dependerán de la edad y peso del sujeto y la concentración y/o formulación de la composición de anticuerpo.

Como se describe previamente, los anticuerpos anti-huCD40 descritos en el presente documento pueden ser coadministrados con uno o más de otros agentes terapéuticos, por ejemplo, un agente citotóxico, un agente radiotóxico, o un agente inmunosupresor. El anticuerpo se puede unir al agente (como un inmunocomplejo) o puede ser administrado por separado del agente. En el último caso (administración separada), el anticuerpo puede ser administrado antes, después o concurrentemente con el agente o puede ser coadministrado con otras terapias conocidas, por ejemplo, una terapia anticancerosa, por ejemplo, radiación. Tales agentes terapéuticos incluyen, entre otros, agentes antineoplásicos tales como doxorrubicina (adriamicina), cisplatino, sulfato de bleomicina, carmustina, clorambucilo, dacarbazina, ciclofosfamida e hidroxiurea, los cuales por sí mismos, son solamente efectivos a niveles que son tóxicos o subtóxicos para un paciente. El cisplatino es administrado por vía intravenosa como una dosis de 100 mg/ml una vez cada cuatro semanas y la adriamicina es administrada por vía intravenosa como una dosis de 60 75 mg/ml una vez cada 21 días. La coadministración de anticuerpos anti-CD40, o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, descritos en el presente documento con agentes quimioterapéuticos proporciona dos agentes anticancerosos que actúan mediante mecanismos diferentes que tienen un efecto citotóxico en las células tumorales humanas. Tal coadministración puede resolver problemas debido al desarrollo de resistencia a fármacos o a un cambio en la antigenicidad de las células tumorales que podrían proporcionarlas no reactivas con el anticuerpo.

También dentro del alcance descrito en el presente documento están kits que comprenden las composiciones de anticuerpo descritas en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas biespecíficas o multiespecíficas, o inmunoconjugados) e instrucciones de uso. El kit puede contener además, al menos un reactivo adicional, o uno o más anticuerpos humanos adicionales descritos en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo humano que tiene una actividad complementaria que se une a un epítopo en el antígeno CD40 distinto del primer anticuerpo humano). Los kits incluyen típicamente unas instrucciones de uso que indican el uso previsto del contenido del kit. La expresión instrucciones de uso incluye cualquier material escrito o grabado, suministrado con o dentro del kit, o que de otro modo acompaña al kit.

Terapias de combinación

Además de las terapias de combinación proporcionadas anteriormente, los anticuerpos anti-CD40 descritos en el presente documento, también pueden ser usados en la terapia de combinación, por ejemplo, para tratar el cáncer, como se describe a continuación.

La presente invención proporciona anticuerpos o composiciones farmacéuticas para usar en métodos de terapia de combinación en los cuales un anticuerpo anti-huCD40 es coadministrado con uno o más agentes adicionales, por ejemplo, anticuerpos que son efectivos en estimular respuestas inmunitarias para de este modo, mejorar, estimular o regular positivamente aún más las respuestas inmunitarias en un sujeto.

En general, un anticuerpo anti-huCD40 descrito en el presente documento puede ser combinado con (i) un agonista de otro receptor coestimulador y/o (ii) un antagonista de una señal inhibidora en linfocitos T, cualquiera de los cuales da como resultado la amplificación de las respuestas de linfocitos T específicas del antígeno (reguladores de puntos de control inmunitarios). Muchas de las moléculas estimuladoras y coinhibidoras son miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas (IgSF), y los anticuerpos anti-CD40 descritos en el presente documento pueden ser administrados con un agente que dirige un miembro de la familia de las IgSF para incrementar una respuesta inmunitaria. Una familia importante de ligandos unidos a la membrana que se unen a receptores coestimuladores o coinhibidores es la familia B7, la cual incluye B7-1, B7-2, B7-H1 (PD-L1), B7-DC (PD-L2), B7-H2 (ICOS-L), B7-H3, B7-H4, B7-H5 (VISTA), y B7-H6. Otra familia de ligandos unidos a la membrana que se une a receptores coestimuladores o coinhibidores es la familia TNF de moléculas que se unen a miembros de la familia del receptor de TNF afin, los cuales incluyen CD40 y CD40L, OX-40, OX-40L, CD70, CD27L, CD30, CD30L, 4-1BBL, CD137/4-1BB, TRAIL/Apo2-L, TRAILR1/DR4, TRAILR2/DR5, TRAILR3, TRAILR4, OPG, RANK, RANKL, TWEAKR/Fn 14, TWEAK, BAFFR, EDAR, XEDAR, TACI, APRIL, BCMA, LTpR, LIGHT, DcR3, HVEM, VEGI/TL1A, TRAMP/DR3, EDAR, EDA1, XEDAR, EDA2, TNFR1, linfotoxina a/TNFp, TNFR2, TNFa, LTpR, linfotoxina a ip2, FAS, FASL, RELT, DR6, TROY, NGFR(véase, por ejemplo,Tansey (2009) Drug Discovery Today 00:1).

En otro aspecto, los anticuerpos anti-huCD40 pueden ser usados en combinación con antagonistas de citocinas que inhiben la activación de linfocitos T (por ejemplo, IL-6, IL-10, TGF-p, VEGF); u otras “citocinas inmunosupresoras” o citocinas que estimulan la activación de linfocitos T, para estimular una respuesta inmunitaria, por ejemplo, para tratar enfermedades proliferativas, tales como el cáncer.

En un aspecto, las respuestas de linfocitos T pueden ser estimuladas por una combinación de los mAbs anti-huCD40 de la presente invención y uno o más de (i) un antagonista de una proteína que inhibe la activación de linfocitos T (por ejemplo, inhibidores de los puntos de control inmunitarios) tales como CTlA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, TEVI-3, Galectina 9, CEACAM-1, BTLA, CD69, galectina-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, 2B4, CD48, GARP, PD1H, LAIR1, TEVI-1, y TIM-4, y (ii) un agonista de una proteína que estimula la activación de linfocitos T tal como B7-1, B7-2, CD28, 4-1BB (CD137), 4-1BBL, ICOS, ICOS-L, OX40, OX40L, GITR, GITRL, CD70, CD27, CD40, DR3 y CD28H.

Agentes ilustrativos que modulan una de las proteínas anteriores y pueden ser combinados con anticuerpos antihuCD40 agonistas, por ejemplo, aquellos descritos en el presente documento para tratar el cáncer, incluyen: YERVOY®/ipilimumab o tremelimumab (a CTLA-4), galiximab (a B7.1), BMS-936558 (contra PD-1), pidilizumab/CT-011 (contra PD-1), KEYTRUDA®/pembrolizumab/MK-3475 (contra PD-1), AMP224 (contra B7-DC/PD-L2), BMS-936559 (contra B7-H1), MPDL3280A (contra B7-H1), MEDI-570 (contra ICOS), AMG557 (contra B7H2), MGA271 (contra B7H3-WO 11/109400), IMP321 (contra LAG-3), urelumab/BMS-663513 y PF-05082566 (contra CD137/4-1BB), varlilumab/CDX-1127 (contra CD27), MEDI-6383 y MEDI-6469 (contra OX40), RG-7888 (contra OX40L-WO 06/029879), atacicept (contra TACI), muromonab-CD3 (contra CD3), ipilumumab (contra CTLA-4).

Otras moléculas que pueden ser combinadas con anticuerpos anti-huCD40 agonistas para el tratamiento de cáncer incluyen antagonistas de receptores inhibidores en linfocitos citolíticos naturales o agonistas de receptores de activación en linfocitos citolíticos naturales. Por ejemplo, los anticuerpos anti-huCD40 agonistas pueden ser combinados con antagonistas de KIR (por ejemplo, lirilumab).

Aún otros agentes para terapias de combinación incluyen agentes que inhiben o agotan los macrófagos o monocitos, que incluyen, pero no se limitan a antagonistas de CSF-R1 tales como anticuerpos antagonistas de CSF-1R que incluyen RG7155 (documentos WO 11/70024, WO 11/107553, WO 11/131407, WO 13/87699, WO 13/119716, WO 13/132044) o FPA-008 (WO 11/140249; WO 13/169264; WO 14/036357).

En general, los anticuerpos anti-huCD40 agonistas descritos en el presente documento pueden ser usados junto con uno o más agentes agonistas que ligan receptores coestimuladores positivos, agentes bloqueantes que atenúan la señalización a través de receptores inhibidores, y uno o más agentes que incrementan sistémicamente la frecuencia de linfocitos T antitumorales, agentes que evitan distintas vías supresoras inmunitarias dentro del microambiente tumoral (por ejemplo, bloquean el acoplamiento del receptor inhibidor (por ejemplo, interacciones PD-L1/PD-1), agotan 0 inhiben los Tregs (por ejemplo, usando un anticuerpo monoclonal anti-CD25 (por ejemplo, daclizumab) o por agotamiento de perlas anti-CD25ex vivo),inhiben enzimas metabólicas tales como IDO, o invierten/evitan el agotamiento o anergia de linfocitos T) y agentes que desencadenan la activación inmunitaria innata y/o inflamación en sitios del tumor.

Se proporcionan en el presente documento anticuerpos o composiciones farmacéuticas para usar en métodos para estimular una respuesta inmunitaria en un sujeto que comprenden administrar al sujeto un agonista de CD40, por ejemplo, un anticuerpo, y uno o más anticuerpos inmunoestimuladores adicionales, tales como un antagonista de PD-1, por ejemplo, anticuerpo antagonista, un antagonista de PD-L1, por ejemplo, anticuerpo antagonista, un antagonista de CTLA-4, por ejemplo, anticuerpo antagonista y/o un antagonista de LAG3, por ejemplo, un anticuerpo antagonista, de manera que se estimule una respuesta inmunitaria en el sujeto, por ejemplo, para inhibir el crecimiento del tumor o para estimular una respuesta antiviral. En una realización, se administra al sujeto un anticuerpo anti-huCD40 agonista y un anticuerpo anti-PD-1 antagonista. En una realización, se administra al sujeto un anticuerpo anti-huCD40 agonista y un anticuerpo anti-PD-L1 antagonista. En una realización, se administra al sujeto un anticuerpo anti-huCD40 agonista y un anticuerpo anti-CTLA-4 antagonista. En una realización, al menos un anticuerpo inmunoestimulador adicional (por ejemplo, un anti-PD-1 antagonista, un anti-PD-L1 antagonista, un anti-CTLA-4 antagonista y/o un anticuerpo anti-LAG3 antagonista) es un anticuerpo humano. Como alternativa, al menos un anticuerpo inmunoestimulador adicional puede ser, por ejemplo, un anticuerpo quimérico o humanizado (por ejemplo, preparado a partir de un anticuerpo anti-PD-1, anti-PD-L1, anti-CTLA-4 y/o anti-LAG3 de ratón).

Se proporcionan en el presente documento anticuerpos o composiciones farmacéuticas como se define en las reivindicaciones adjuntas para usar en métodos para tratar una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, cáncer), que comprenden administrar un anticuerpo anti-huCD40 agonista y un anticuerpo PD-1 antagonista a un sujeto. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-huCD40 agonista es administrado a una dosis subterapéutica, el anticuerpo anti-PD-1 es administrado a una dosis subterapéutica, o ambos son administrados a una dosis subterapéutica, en donde la designación subterapéutica es con referencia a la monoterapia con el agente en cuestión. También se proporcionan en el presente documento anticuerpos o composiciones farmacéuticas para usar en métodos para alterar un acontecimientos adverso asociado con el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa con un agente inmunoestimulador, que comprenden administrar un anticuerpo anti-huCD40 agonista y una dosis subterapéutica de un anticuerpo anti-PD-1 a un sujeto. En ciertas realizaciones, el sujeto es humano. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 es un anticuerpo monoclonal de secuencia humana y el anticuerpo anti-huCD40 agonista es un anticuerpo monoclonal humanizado, tal como un anticuerpo que comprende las CDR o regiones variables de los anticuerpos descritos en el presente documento.

Los antagonistas de PD-1 adecuados para uso en los métodos descritos en el presente documento, incluyen, sin limitación, ligandos, anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales y anticuerpos biespecíficos), y agentes multivalentes. En una realización, el antagonista de PD-1 es una proteína de fusión, por ejemplo, una proteína de fusión Fc, tal como AMP-244. En una realización, el antagonista de PD-1 es un anticuerpo anti-PD-1 o anti-PD-L1.

Un anticuerpo anti-PD-1 ilustrativo es OPDIVO®/nivolumab (BMS-936558) o un anticuerpo que comprende las CDR o regiones variables de uno de los anticuerpos 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 7D3, 5F4 y 4A11 descritos en el documento WO 2006/121168. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-PD-1 es MK-3475 (KEYTRUDA®/pembrolizumab/anteriormente lambrolizumab) descrito en el documento WO 2012/145493; AMP-514/MEDI-0680 descrito en el documento WO 2012/145493; y CT-011 (pidilizumab; previamente CT-AcTicuerpo o BAT;véase, por ejemplo,Rosenblattet al.,(2011)J. Immunotherapy34:409). Anticuerpos anti-PD-1 conocidos adicionales y otros inhibidores de PD-1 incluyen aquellos descritos en los documentos WO 2009/014708, WO 03/099196, WO 2009/114335, WO 2011/066389, WO 2011/161699, WO 2012/145493, Patentes Estadounidenses números 7.635.757 y 8.217.149, y Publicación de Patente Estadounidense N.° 2009/0317368. Cualquiera de los anticuerpos anti-PD-1 descritos en el documento WO 2013/173223 también puede ser usado. Un anticuerpo anti-PD-1 que compita por la unión con, y/o se una al mismo epítopo en PD-1 que uno de estos anticuerpos también puede ser usado en tratamientos de combinación.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 se une a la PD-1 humana con una K<d>de 5 x 10'8 M o menos, se une a la PD-1 humana con una Kd de 1 x 10'8 M o menos, se une a la PD-1 humana con una Kd de 5 x 10'9 M o menos, o se une a la PD-1 humana con una Kd de entre 1 x 10'8M y 1 x 10'1° M o menos.

Se proporcionan en el presente documento anticuerpos o composiciones farmacéuticas para usar en métodos para tratar una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, cáncer), que comprenden administrar un anticuerpo antihuCD40 agonista y un anticuerpo anti-PD-L1 antagonista a un sujeto. En ciertas realizaciones, el anticuerpo antihuCD40 agonista es administrado a una dosis subterapéutica, el anticuerpo anti-PD-L1 es administrado a una dosis subterapéutica, o ambos son administrados a una dosis subterapéutica. Se proporcionan en el presente documento métodos para alterar un acontecimiento adverso asociado con el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa con un agente inmunoestimulador, que comprenden administrar un anticuerpo anti-huCD40 agonista y una dosis subterapéutica de anticuerpo anti-PD-L1 a un sujeto. En ciertas realizaciones, el sujeto es humano. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-L1 es un anticuerpo monoclonal de secuencia humana y el anticuerpo antihuCD40 agonista es un anticuerpo monoclonal humanizado, tal como un anticuerpo que comprende las CDR o regiones variables de los anticuerpos descritos en el presente documento.

En una realización, el anticuerpo anti-PD-L1 es BMS-936559 (referido como 12A4 en el documento WO 2007/005874 y en la Patente Estadounidense N.° 7,943,743), MSB0010718C (WO 2013/79174), o un anticuerpo que comprende las CDR o regiones variables de 3G10, 12A4, 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7 y 13G4, que se describen en la Publicación de PCT WO 07/005874 y la Patente Estadounidense N.° 7.943.743. En cierta realización, un anticuerpo anti-PD-L1 es MEDI4736 (también conocido como Anti-B7-Hl) o MPDL3280A (también conocido como RG7446). Cualquiera de los anticuerpos anti-PD-L1 descritos en los documentos WO 2013/173223, WO 2011/066389, WO 2012/145493, Patentes Estadounidenses números 7.635.757 y 8.217. 149 y Publicación Estadounidense N.° 2009/145493 también puede ser usado. Los anticuerpos anti-PD-L1 que compiten con y/o se unen al mimo epítopo que cualquiera de estos anticuerpos también puede ser usado en tratamientos de combinación.

En aún una realización adicional, el anticuerpo anti-huCD40 agonista de la presente invención se combina con un antagonista de la señalización de PD-1/PD-L1, tal como un antagonista de PD-1 o un antagonista de PD-L1, en combinación con un tercer agente inmunoterapéutico. En una realización, el tercer agente inmunoterapéutico es un antagonista de GITR o un antagonista de OX-40, tal como los anticuerpos anti-GITR o anti-OX40 descritos en el presente documento.

En otro aspecto, el agente de inmuno-oncología es un agonista de GITR, tal como un anticuerpo GITR agonista. Los anticuerpos GITR adecuados incluyen, por ejemplo, BMS-986153, BMS-986156, TRX-518 (documentos WO 06/105021, WO 09/009116) y MK-4166 (documento WO 11/028683).

En otro aspecto, el agente de inmunooncología es un antagonista de IDO. Antagonistas de IDO adecuados incluyen, por ejemplo, INCB-024360 (documentos WO 2006/122150, WO 07/75598, WO 08/36653, WO 08/36642), indoximod, o NLG-919 (WO 09/73620, WO 09/1156652, WO 11/56652, WO 12/142237).

Se proporcionan en el presente documento anticuerpos o composiciones farmacéuticas para usar en métodos para tratar una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, cáncer), que comprenden administrar un anticuerpo antihuCD40 agonista descrito en el presente documento y un anticuerpo CTLA-4 antagonista a un sujeto. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-huCD40 agonista es administrado a una dosis subterapéutica, el anticuerpo anti-CTLA-4 es administrado a una dosis subterapéutica, o ambos son administrados a una dosis subterapéutica, en donde la designación subterapéutica es con referencia a la monoterapia con el agente en cuestión. Se proporcionan en el presente documento métodos para alterar un acontecimiento adverso asociado con el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa con un agente inmunoestimulador, que comprenden administrar un anticuerpo anti-huCD40 agonista y una dosis subterapéutica de anticuerpo anti-CTLA-4 a un sujeto. En ciertas realizaciones, el sujeto es humano. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-CTLA-4 es un anticuerpo seleccionado a partir del grupo que consiste en: YERVOY® (ipilimumab o anticuerpo 10D1, descrito en la Publicación de PCT WO 01/14424), tremelimumab (anteriormente ticilimumab, CP-675,206), y los anticuerpos anti-CTLA-4 descritos en las siguientes publicaciones: WO 98/42752; WO 00/37504; Patente Estadounidense N.° 6,207,156; Hurwitzet al.,(1998)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 95(17): 10067-10071; Camachoet al.,(2004)J. Clin. Oncology22(145): Resumen N.° 2505 (anticuerpo CP-675206); y Mokyret al.,(1998)Cancer Res.58:5301-5304. Cualquiera de los anticuerpos anti-CTLA-4 descritos en el documento WO 2013/173223 también pueden ser usados.

Se proporcionan en el presente documento anticuerpos o composiciones farmacéuticas para usar en métodos para métodos para tratar una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, cáncer), que comprenden administrar un anticuerpo anti-huCD40 agonista y un anticuerpo anti-LAG-3 a un sujeto. En realizaciones adicionales, el anticuerpo anti-huCD40 agonista es administrado a una dosis subterapéutica, el anticuerpo anti-LAG-3 es administrado a una dosis subterapéutica, o ambos son administrados a una dosis subterapéutica. Se proporcionan en el presente documento métodos para alterar un acontecimiento adverso asociado con el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa con un agente inmunoestimulador, que comprenden administrar un anticuerpo anti-huCD40 agonista y una dosis subterapéutica de anti-LAG-3 anticuerpo a un sujeto. En ciertas realizaciones, el sujeto es humano. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-LAG-3 es un anticuerpo monoclonal de secuencia humana y el anticuerpo antihuCD40 agonista es un anticuerpo monoclonal humanizado, tal como un anticuerpo que comprende las CDR o regiones variables de los anticuerpos descritos en el presente documento. Ejemplos de anticuerpos anti-LAG3 incluyen anticuerpos que comprenden las CDR o regiones variables de los anticuerpos 25F7, 26H10, 25E3, 8B7, 11F2 o 17E5, los cuales son descritos en la Publicación de Patente Estadounidense N.° US 2011/0150892 y WO 2014/008218. En una realización, un anticuerpo anti-LAG-3 es BMS-986016. Otros anticuerpos anti-LAG-3 reconocidos en la técnica que pueden ser usados incluyen IMP731 descrito en el documento US 2011/007023. El FMP-321 también puede ser usado. Los anticuerpos anti-LAG-3 que compiten con y/o se unen al mismo epítopo que cualquiera de estos anticuerpos también pueden ser usados en tratamientos de combinación.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-LAG-3 se une a LAG-3 humana con una Kd de 5 x 10'8 M o menos, se une a LAG-3 humana con una Kd de 1 x 10'8 M o menos, se une a LAG-3 humana con una Kd de 5 x 10'9 M o menos, o se une a LAG-3 humana con una K<d>de entre 1 x 10'8 M y 1 x 10'1° M o menos.

La administración de anticuerpos anti-huCD40 agonistas descritos en el presente documento y antagonistas, por ejemplo, anticuerpos antagonistas, de uno o más segundos antígenos objetivo tales como LAG-3 y/o CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 pueden mejorar la respuesta inmunitaria a células cancerosas en el paciente. Los cánceres cuyo crecimiento puede ser inhibido usando los anticuerpos de la presente descripción incluyen cánceres típicamente sensibles a inmunoterapia. Ejemplos representativos de cánceres para tratamiento con la terapia de combinación de la presente descripción incluyen aquellos cánceres específicamente citados anteriormente en la descripción de la monoterapia con anticuerpos anti-huCD40 agonistas.

En ciertas realizaciones, la combinación de anticuerpos terapéuticos descritos en el presente documento puede ser administrada concurrentemente como una composición única en un vehículo farmacéuticamente aceptable, o concurrentemente como composiciones separadas con cada anticuerpo en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización, la combinación de anticuerpos terapéuticos puede ser administrada secuencialmente. Por ejemplo, un anticuerpo anti-CTLA-4 y un anticuerpo anti-huCD40 agonista pueden ser administrados secuencialmente, de manera que el anticuerpo anti-CTLA-4 es administrado primero y el anticuerpo anti-huCD40 agonista segundo, o el anticuerpo anti-huCD40 agonista es administrado primero y el anticuerpo anti-CTLA-4 segundo. Adicionalmente o como alternativa, un anticuerpo anti-PD-1 y un anticuerpo anti-huCD40 agonista pueden ser administrados secuencialmente, de manera que el anticuerpo anti-PD-1 es administrado primero y el anticuerpo anti-huCD40 agonista segundo, o el anticuerpo anti-huCD40 agonista es administrado primero y el anticuerpo anti-PD-1 segundo. Adicionalmente o como alternativa, un anticuerpo anti-PD-L1 y un anticuerpo anti-huCD40 agonista pueden ser administrados secuencialmente, de manera que un anticuerpo anti-PD-L1 es administrado primero y el anticuerpo antihuCD40 agonista segundo, o el anticuerpo anti-huCD40 agonista es administrado primero y el anticuerpo anti-PD-L1 segundo. Adicionalmente o como alternativa, un anticuerpo anti-LAG-3 y un anticuerpo anti-huCD40 agonista pueden ser administrados secuencialmente, de manera que el anticuerpo anti-LAG-3 es administrado primero y el anticuerpo anti-huCD40 agonista segundo, o el anticuerpo anti-huCD40 agonista es administrado primero y el anticuerpo anti-LAG-3 segundo.

Además, si más de una dosis de la terapia de combinación es administrada secuencialmente, el orden de la administración secuencial puede ser invertido o mantenido en el mismo orden en cada punto temporal de administración, las administraciones secuenciales pueden ser combinadas con administraciones concurrentes o cualquier combinación de las mismas. Por ejemplo, la primera administración de una combinación de anticuerpo anti-CTLA-4 y anticuerpo anti-huCD40 agonista puede ser concurrente, la segunda administración puede ser secuencial con el primer anticuerpo anti-CTLA-4 y el segundo anticuerpo anti-huCD40 agonista, y la tercera administración puede ser secuencial con el primer anticuerpo anti-huCD40 agonista y el segundo anticuerpo anti-CTLA-4, etc. Adicionalmente o como alternativa, la primera administración de una combinación de anticuerpo anti-PD-1 y anticuerpo anti-huCD40 agonista puede ser concurrente, la segunda administración puede ser secuencial con el primer anticuerpo anti-PD-1 y el segundo anticuerpo anti-huCD40 agonista, y la tercera administración puede ser secuencial con el primer anticuerpo anti-huCD40 agonista y el segundo anticuerpo anti-PD-1, etc. Adicionalmente o como alternativa, la primera administración de una combinación de anticuerpo anti-PD-L1 y anticuerpo anti-huCD40 agonista puede ser concurrente, la segunda administración puede ser secuencial con el primer anticuerpo anti-PD-L1 y el segundo anticuerpo anti-huCD40 agonista, y la tercera administración puede ser secuencial con el primer anticuerpo antihuCD40 agonista y el segundo anticuerpo anti-PD-L1, etc. Adicionalmente o como alternativa, la primera administración de una combinación de anticuerpo anti-LAG-3 y anticuerpo anti-huCD40 agonista puede ser concurrente, la segunda administración puede ser secuencial con el primer anticuerpo anti-LAG-3 y el segundo anticuerpo anti-huCD40 agonista, y la tercera administración puede ser secuencial con el primer anticuerpo antihuCD40 agonista y el segundo anticuerpo anti-LAG-3, etc. Otro esquema de dosificación representativo puede implicar una primera administración que es secuencial con el primer anti-huCD40 agonista y segundo anticuerpo anti-CTLA-4 (y/o anticuerpo anti-PD-1 y/o anticuerpo anti-PD-L1 y/o anticuerpo anti-LAG-3), y las administraciones posteriores pueden ser concurrentes.

Opcionalmente, un anti-huCD40 agonista como agente inmunoterapéutico único, o la combinación de un anticuerpo anti-huCD40 agonista y uno o más anticuerpos inmunoterapéuticos adicionales (por ejemplo, anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y/o anti-LAG-3) puede además combinarse con un agente inmunogénico, tal como células cancerosas, antígenos tumorales purificados (que incluyen proteínas recombinantes, péptidos, y moléculas de carbohidratos), células y células transfectadas con genes que codifican citocinas inmunitarias estimulantes (Heet al.,(2004)J. Immunol.173:4919-28). Ejemplos no limitantes de vacunas tumorales que pueden ser usadas incluyen péptidos de antígenos de melanoma, tales como péptidos de gp100, antígenos MAGe , Trp-2, MART1 y/o tirocinasa, o células tumorales transfectadas para expresar la citocina GM-CSF (descrita adicionamente más abajo). Un agonista de CD40 y uno o más anticuerpos adicionales (por ejemplo, bloqueo de CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 y/o LAG-3) también puede ser además combinado con tratamientos para cáncer convencionales. Por ejemplo, un agonista de CD40 y uno o más anticuerpos adicionales (por ejemplo, de bloqueo de CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 y/o LAG-3) pueden ser eficazmente combinados con regímenes quimioterapéuticos. En estos casos, es posible reducir la dosis de otro reactivo quimioterapéutico administrado con la combinación de la presente descripción (Mokyret al.,(1998)Cáncer Research58:5301-5304). Un ejemplo de tal combinación es una combinación de anticuerpo anti-CD40 agonista con o sin y un anticuerpo adicional, tal como anticuerpos anti-CTLA-4 y/o anticuerpos anti-PD-1 y/o anticuerpos anti-PD-L1 y/o anticuerpos anti-LAG-3) además en combinación con dacarbazina para el tratamiento del melanoma. Otro ejemplo es una combinación de anticuerpo anti-huCD40 agonista con o sin y anticuerpos anti-CTLA-4 y/o anticuerpos anti-PD-1 y/o anticuerpos anti-PD-L1 y/o anticuerpos LAG-3 además en combinación con interleucina-2 (IL-2) para el tratamiento del melanoma. El razonamiento científico que justifica el uso combinado del agonismo de CD40 y el bloqueo de CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 y/o LAG-3 con quimioterapia es que la muerte celular, que es una consecuencia de la acción citotóxica de la mayoría de los compuestos quimioterapéuticos, debería dar lugar a un aumento de los niveles de antígeno tumoral en la vía de presentación del antígeno. Otras terapias de combinación que pueden dar como resultado una sinergia con un agonismo de CD40 combinado con o sin y bloqueo de CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 y/o LAG-3 mediante la muerte celular incluyen radiación, cirugía, o deprivación hormonal. Cada uno de estos protocolos crea una fuente de antígeno tumoral en el hospedador. Los inhibidores de la angiogénesis también pueden ser combinados con un agonismo de CD40 combinado y bloqueo de CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 y/o LAG-3. La inhibición de la angiogénesis conduce a la muerte celular tumoral, la cual puede ser una fuente de antígeno tumoral alimentado en las vías de presentación del antígeno.

Un anticuerpo anti-huCD40 agonista como agente inmunoterapéutico único, o una combinación de agonista de CD40 y anticuerpos de bloqueo de CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 y/o LAG-3, también pueden ser usados en combinación con anticuerpos biespecíficos que dirigen a las células efectoras que expresan el receptor Fca o Fcy a las células tumorales. Véase, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses números 5.922.845 y 5.837.243. Los anticuerpos biespecíficos pueden ser usados para dirigir dos antígenos diferentes. El brazo efector constituido por los linfocitos T en estas respuestas podría aumentarse por el uso combinado de un agonismo de CD40 y/o bloqueo de CTLA-4 y/o PD- 1 y/o PD-L1 y/o LAG-3.

En otro ejemplo, un anticuerpo anti-CD40 agonista como agente inmunoterapéutico único o una combinación de un anticuerpo anti-CD40 y un agente inmunoestimulante adicional, por ejemplo, anticuerpo anti-CTLA-4 y/o anticuerpo anti-PD-1 y/o anticuerpo anti-PD-L1 y/o agente contra LAG-3, por ejemplo, anticuerpo, puede ser usado junto con un anticuerpo anti-neoplásico tal como RITUXAN® (rituximab), HERc EpTIN® (trastuzumab), BEXXAR® (tositumomab), ZEVALIN® (ibritumomab), CAMPATH®(alemtuzumab), LYMPHOCIDE® (eprtuzumab), AVASTIN® (bevacizumab), y TARCEVA® (erlotinib), y similares. A modo de ejemplo y sin pretender quedar limitado a teoría alguna, el tratamiento con un anticuerpo anticanceroso o un anticuerpo anticanceroso conjugado con una toxina puede conducir a la muerte de células cancerosas (por ejemplo, células tumorales) lo cual podría mejorar una respuesta inmunitaria mediada por el agente inmunoestimulante, por ejemplo, agente CD40, TIGIT, CTLA-4, PD-1, PD-L1 o LAG-3, por ejemplo, anticuerpo. En una realización ilustrativa, los anticuerpos o composiciones farmacéuticas para usar en un método para tratar una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, un tumor canceroso) pueden incluir un agente anticanceroso, por ejemplo, anticuerpo, en combinación con un anticuerpo anti-huCD40 agonista y opcionalmente un agente inmunoestimulante adicional, por ejemplo, agente anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y/o anti-LAG-3, por ejemplo, anticuerpo, concurrentemente o secuencialmente o cualquier combinación de los mismos, los cuales pueden potenciar una respuesta inmunitaria antitumoral por el hospedador.

Se proporcionan en el presente documento anticuerpos o composiciones farmacéuticas para usar en métodos para alterar un acontecimiento adverso asociado con el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa (por ejemplo, cáncer) con un agente inmunoestimulador, que comprenden administrar un anticuerpo anti-huCD40 agonista con o sin y una dosis subterapéutica de un agente anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-L1 y/o anti-LAG-3, por ejemplo, anticuerpo, a un sujeto. Por ejemplo, los métodos descritos en el presente documento proporcionan un método para reducir la incidencia de colitis o diarrea inducida por un anticuerpo terapéutico inmunoestimulador administrando un esteroide no absorbible al paciente. Como se usa en el presente documento, un “esteroide no absorbible” es un glucocorticoide que presenta un extenso metabolismo de primer paso de manera que, después del metabolismo en el hígado, la biodisponibilidad del esteroide es baja, es decir, menos de aproximadamente el 20 %. En una realización descrita en el presente documento, el esteroide no absorbible es budesonida. La budesonida es un glucocorticosteroide de acción local, que sufre un extenso metabolismo, principalmente por el hígado, después de la administración oral. ENTOCORT EC® (Astra-Zeneca) es una formulación oral de budesonida dependiente del tiempo y pH desarrollada para optimizar el suministro de fármaco al íleo y a través del colon. El ENTOCORT EC® está aprobado en los Estados Unidos para el tratamiento de la enfermedad de Crohn leve a moderada que afecta al íleo y/o colon ascendente. La dosificación oral usual de ENTOCORT EC® para el tratamiento de la enfermedad de Crohn es 6 a 9 mg/día. El ENTOCORT EC® es liberado en el intestino antes de ser absorbido y retenido en la mucosa intestinal. Una vez que pasa a través del tejido objetivo de la mucosa intestinal, el ENTOCORT EC® sufre un extenso metabolismo por el sistema del citocromo P450 en el hígado a metabolitos con actividad glucocorticoide insignificante. Por lo tanto, la biodisponibilidad es baja (aproximadamente 10 %). La baja biodisponibilidad de la budesonida da como resultado una relación terapéutica mejorada comparada con otros glucocorticoides con un metabolismo de primer paso menos extenso. La budesonida provoca efectos adversos, que incluyen menos supresión hipotalámica-hipofisaria, que los corticosteroides de acción sistémica. Sin embargo, la administración crónica de ENTOCORT EC® puede provocar efectos glucocorticoides sistémicos tales como hipercorticismo y supresión suprarrenal. Véase PDR 58a ed. 2004; 608 610.

En todavía realizaciones adicionales, un agonista de CD40 con o sin bloqueo de CTLA-4 y/o PD-1 y/o PD-L1 y/o LAG-3 (es decir, anticuerpos terapéuticos inmunoestimuladores contra CD40 y opcionalmente anticuerpos anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-LI y/o anti-LAG-3) junto con un esteroide no absorbible pueden ser además combinados con un salicilato. Los salicilatos incluyen agentes 5-ASA tales como, por ejemplo: sulfasalazina (AZULFIDINE®, Pharmacia & Upjohn); olsalazina (DIPEn Tu M®, Pharmacia & Upjohn); balsalazida (COLAZAL®, Salix Pharmaceuticals, Inc.); y mesalamina (ASACOL®, Procter & Gamble Pharmaceuticals; PENTASA®, Shire US; CANASA®, Axcan Scandipharm, Inc.; ROWASA®, Solvay).

De acuerdo con los métodos descritos en el presente documento, un salicilato administrado en combinación con un anticuerpo anti-huCD40 agonista con o sin anticuerpos anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-LI y/o LAG-3 y un esteroide no absorbible pueden incluir cualquier administración secuencial o solapante del salicilato y el esteroide no absorbible con el propósito de disminuir la incidencia de colitis inducida por los anticuerpos inmunoestimuladores. De este modo, por ejemplo, métodos para reducir la incidencia de colitis inducida por los anticuerpos inmunoestimuladores descritos en el presente documento abarcan administrar un salicilato y un esteroide no absorbible concurrentemente o secuencialmente (por ejemplo, un salicilato se administra 6 horas después de un esteroide no absorbible), o cualquier combinación de los mismos. Además, un salicilato y un esteroide no absorbible pueden ser administrados por la misma vía (por ejemplo, ambos son administrados por vía oral) o por diferentes vías (por ejemplo, un salicilato es administrado por vía oral y un esteroide no absorbible es administrado por vía rectal), los cuales difieren por la(s) vía(s) usada(s) para administrar los anticuerpos anti-huCD40 y anti-CTLA-4 y/o anti-PD-1 y/o anti-PD-LI y/o anti-LAG-3.

Los anticuerpos anti-huCD40 agonistas y terapias de combinación de anticuerpo descritos en el presente documento pueden también ser usados junto con otras terapias bien conocidas que son seleccionadas por su utilidad particular contra la indicación que será tratada (por ejemplo, cáncer). Las combinaciones de anticuerpos anti-huCD40 agonistas descritos en el presente documento pueden ser usadas secuencialmente con agente(s) farmacéuticamente aceptable(s) conocidos.

Por ejemplo, los anticuerpos anti-huCD40 agonistas y terapias de combinación de anticuerpos descritos en el presente documento pueden ser usados en combinación (por ejemplo, simultáneamente o separadamente) con un tratamiento adicional, tal como irradiación, quimioterapia (por ejemplo, usando camptotecina (CPT-11), 5-fluorouracilo (5-FU), cisplatino, doxorrubicina, irinotecán, paclitaxel, gemcitabina, cisplatino, paclitaxel, carboplatino-paclitaxel (Taxol), doxorrubicina, 5-fu, o camptotecina apo21/TRAIL (un 6X combo)), uno o más inhibidores del proteasoma (por ejemplo, bortezomib o MG132), uno o más inhibidores de Bcl-2 (por ejemplo, BH3I-2' (inhibidor bcl-x1), inhibidor de indoleamina dioxigensa-1 (IDO1) (por ejemplo, INCB24360), AT-101 (derivado de R-(-)-gossipol), ABT-263 (molécula pequeña), GX-15-070 (obatoclax), o antagonistas de MCL-1 (proteína 1 de diferenciación de células de leucemia mieloide)), iAP (inhibidor de la proteína de apoptosis) (por ejemplo, smac7, smac4, mimético smac de molécula pequeña, péptidos smac sintéticos (véase Fuldaet al., Nat Med2002;8:808-15), ISIS23722 (LY2181308), o AEG-35156 (g EM-640)), inhibidores de HDAC (histona deacetilasa), anticuerpos anti-CD20 (por ejemplo, rituximab), inhibidores de la angiogénesis (por ejemplo, bevacizumab), agentes anti-angiogénicos dirigidos a VEGF y VEGFR (por ejemplo, AVASTIN®), triterpenoides sintéticos (véase Hyeret al., Cáncer Research2005; 65:4799-808), moduladores de c-FLIP (proteína inhibidora de FLICE celular) (por ejemplo, ligandos naturales y sintéticos de PPARy (receptor<y>activado por el proliferador de peroxisomas), 5809354 o 5569100), inhibidores de cinasa (por ejemplo, sorafenib), trastuzumab, cetuximab, temsirolimus, inhibidores de mTOR tales como rapamicina y temsirolimus, bortezomib, inhibidores de JAK2, inhibidores de HSP90, inhibidores de PI3K-AKT, lenalildomida, inhibidores de GSK3P, inhibidores de IAP y/o fármacos genotóxicos.

Los anticuerpos anti-huCD40 agonistas y terapias de combinación de anticuerpos descritos en el presente documento, pueden además ser usados en combinación con uno o más agentes citotóxicos antiproliferativos. Las clases de compuestos que pueden ser usados como agentes citotóxicos antiproliferativos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes:

Agentes alquilantes (que incluyen, sin limitación, mostazas de nitrógeno, derivados de etilenimina, alquil sulfonatos, nitrosoureas y triazenos): mostaza de uracilo, clormetina, ciclofosfamida (CYTOXAN™), fosfamida, melfalán, clorambucilo, pipobromano, trietilenmelamina, trietilenetiofosforamina, busulfán, carmustina, comustina, estreptozocina, dacarbazina, y temozolomida.

Antimetabolitos (que incluyen, sin limitación, antagonistas del ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inhibidores de adenosina desaminasa): metotrexato, 5-fluorouracilo, floxuridina, citarabina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, fosfato de fludarabina, pentostatina, y gemcitabina.

Agentes antiproliferativos adecuados para combinación con anticuerpos anti-huCD40 agonistas son, sin limitación, taxanos, paclitaxel (el paclitaxel está comercializado como TAXOL™), docetaxel, discodermolida (DDM), dictiostatina (DCT), pelorusida A, epotilonas, epotilona A, epotilona B, epotilona C, epotilona D, epotilona E, epotilona F, furanoepotilona D, desoxiepotilona B1, [17]-deshidrodesoxi epotilona B, [18]deshidrodesoxi epotilonas B, C12,13-ciclopropil-epotilona A, epotilona A en puente con C6-C8, trans-9,10-deshidroepotilona D, cis-9,10-deshidroepotilona D, 16-desmetilepotilona B, epotilona B10, discoderomolida, patupilona (EPO-906), KOS-862, KOS-1584, ZK-EPO, ABJ-789, XAA296A (discodermolida), TZT-1027 (soblidotina),<i>L<x>-651 (clorhidrato de tasidotina), halicondrina B, mesilato de eribulina (E-7389), hemiasterlina (HTI-286), E-7974, criptoficinas, LY-355703, inmunoconjugados maitansinoides (DM-1), MKC-1, ABT-751, T1-38067, T-900607, SB-715992 (ispinesib), SB-743921, MK-0731, STA-5312, eleuterobina, 17beta-acetoxi-2-etoxi-6-oxo-B-homo-estra-1,3,5(10)-trien-3-ol, ciclostreptina, isolaulimalida, laulimalida, 4-epi-7-deshidroxi-14,16-didesmetil-(+)-discodermolidas, y criptotilona 1, además de otros agentes estabilizantes de la microtubulina conocidos en latécnica.

En casos donde es deseable obtener células aberrantemente proliferativas quiescentes junto con o previo al tratamiento con anticuerpos anti-huCD40 agonistas descritos en el presente documento, también se pueden administrar al paciente hormonas y esteroides (que incluyen análogos sintéticos), tales como 17a-etinilestradiol, dietilstilbestrol, testosterona, prednisona, fluoximesterona, propionato de drostanolona, testolactona, megestrolacetato, metilprednisolona, metil-testosterona, prednisolona, triamcinolona, clorotrianiseno, hidroxiprogesterona, aminoglutetimida, estramustina, acetato de medroxiprogesteronao, leuprolida, flutamida, toremifeno, ZOLADEX™. Cuando se emplean los métodos o composiciones descritos en el presente documento, si se desea, también se pueden administrar en un centro médico otros agentes usados en la modulación del crecimiento del tumor o metástasis, tal como antimiméticos.

Los métodos para la administración segura y eficaz de agentes terapéuticos se conocen por aquellos expertos en la materia. Además, su administración se describe en la bibliografía convencional. Por ejemplo, la administración de muchos de los agentes quimioterapéuticos se describe en Physicians’ Desk Reference (PDR), por ejemplo, edición 1996 (Medical Economics Company, Montvale, N.J. 07645-1742, EE. UU.).

El(los) agente(s) quimioterapéutico(s) y/o radioterapia pueden ser administrados de acuerdo con protocolos terapéuticos bien conocidos en la técnica. Se apreciará por aquellos expertos en la materia que la administración del(los) agente(s) quimioterapéuticos y/o radioterapia puede variarse dependiendo de la enfermedad a tratar y los efectos conocidos del(los) agente(s) quimioterapéuticos y/o radioterapia en tal enfermedad. También, de acuerdo con el conocimiento del especialista experto, los protocolosterapéuticos (por ejemplo, cantidades de dosificaciónytiempos de administración) pueden variarse en vista de los efectos observados de los agentes terapéuticos administrados en el paciente, y en vista de las respuestas observadas de la enfermedad a los agentes terapéuticos administrados.

XI. Caracterización de anticuerpos anti-CD40 agonistas específicos de la presente invención

La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas. Los anticuerpos anti-CD40 agonistas de la presente invención se obtuvieron como se describe en el Ejemplo 1. Los dominios variables y regiones de secuencia CDR de anticuerpos ilustrativos de la presente invención se proporcionan en el Listado de secuencias, y son resumidos en la Tabla 2. La numeración de la región CDR y dominio variable son los mismos para todos los anticuerpos derivados del mismo clon original, es decir, las variantes humanizadas proporcionadas en el presente documento no incluyen algunas inserciones o deleciones.

TABLA 2

La divulgación también proporciona anticuerpos anti-huCD40 relacionados con aquellos descritos en el presente documento por secuencia siendo derivada a partir de las mismas secuencias de la línea germinal murina, específicamente los segmentos del gen de la región V y J. Las secuencias de la línea germinal murina para cada uno de los anticuerpos descritos en el presente documento se proporcionan en la Tabla 3.

______________________________TABLA 3______________________________

Secuencias de la línea germinal de ratón para mAbs anti~huCD40

La divulgación proporciona, además, anticuerpos anti-huCD40 humanizados derivados a partir de los anticuerpos parentales murinos descritos en el presente documento por recolocación de secuencias marco murinas con secuencias marco humanas, con o sin mutaciones adicionales (“retromutaciones”) para restaurar la afinidad del antígeno (CD40 humano) que podrían de otro modo perderse en la humanización o para eliminar exigencias de secuencia. Véase Ejemplo 3.

La invención también proporciona construcciones de anticuerpo que comprenden las secuencias de dominio variable novedosas descritas en el presente documentoydominios constantes con regiones Fc modificadas quetienen afinidad mejorada para FcyRIIb comparado con su afinidad por otros receptores Fc, es decir, receptores de activación. Se espera que tales anticuerpos anti-huCD40 agonistas con especificidad de FcyRIIb mejorada presenten superior eficacia en el tratamiento del cáncer y de las infecciones crónicas. Li & Ravetch (2011) Science 333: 1030; Whiteet al.,(2011)J. immunoi.187: 1754. Sin pretender quedar limitado a teoría alguna, tales mAbs anti-CD40 agonistas específicos de FcyRIIb pueden presentar efectos adyuvantes incrementando la maduración de células dendríticas promoviendo la expansión y activación de linfocitos T CD8+ citotóxicos, conduciendo a una respuesta antitumoral mejorada. Id. Sin pretender quedar limitado a teoría alguna, la mejora de la señal mediada por FcR de los anticuerpos anti-CD40 agonistas debido a un aumento del agrupamiento de receptores, o “entrecruzamiento”, de la presente invención puede ser un contribuyente importante a la eficacia terapéutica. El entrecruzamiento de anticuerpos anti-CD40 agonistas por acoplamiento de FcR por la porción Fc del anticuerpo puede incrementar la intensidad de la señal y de este modo mejorar la activación de las células.

La afinidad de unión relativa de anticuerpos para la activación (A) contra receptores Fc inhibidores (I) puede ser expresada como la relación “A/I”, y es típicamente una función de la estructura de la región Fc de un anticuerpo IgG. Véase el documento WO 2012/087928. Los anticuerpos que tienen especificidad mejorada para la unión al receptor FcyRIIb inhibidor tienen relaciones A/I menores. Los anticuerpos preferidos para los anticuerpos anti-huCD40 agonistas de la presente invención tienen, por ejemplo, relaciones A/I de menos de 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,3, 0,1, 0,05, 0,03 o 0,01.

Los dominios constantes de la IgG1 humana que comprenden mutaciones para mejorar la especificidad de FcyRIIb también se proporcionan en el Listado de secuencias, y se resumen en la Tabla 4 e ilustran en la Figura 1. Las variantes de secuencia son definidas con referencia a la secuencia de dominio constante de la IgG1f humana proporcionada en la SEQ ID NO: 65. Las posiciones con respecto a la nomenclatura (numeración) de mutaciones en la región Fc son de conformidad con el índice EU como en Kabatet al.,(1981)Sequences ofProteins ofimmunological interest,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.), el cual facilita la comparación de secuencias Fc en posiciones equivalentes en los anticuerpos con diferentes longitudes de dominio variable. Véase también Edelmanet al.,(1969)Proc. Nat’i Acad. Sci. USA63:78; documento WO 2012/130831 (usando el mismo sistema de numeración). No coincide la numeración de secuencia en el Listado de secuencias. La Figura 1 proporciona una representación gráfica de las variantes de secuencia Fc de la Tabla 4, a partir de las cuales un experto en la materia podría fácilmente reconocer las posiciones correspondientes en las secuencias de anticuerpo descritas en el presente documento. Lasvariantes SEySELF se describen en Chuetal.,(2008)Mol. Immunol.45:3926. Lasvariantes P238D, V4, V7, V8, V9, V11 y V12 se describen en Mimotoet al.,(2013)Protein Engineering Design & Selection26:589 (por ejemplo, en la tabla 1 del presente documento).

TABLA 4

Las variantes de secuencia Fc adicionales con afinidad mejorada por FcYRIIb se describen en Yuetal.,(2013)J. Am. Chem. Soc.135:9723 (y documento WO 2014/184545), que incluyen V262E y V264E, por ejemplo, para uso en combinación con S267E y L328F.

Las variantes adicionales con mutaciones D270E se produjeron para reducir la isomerización D270 que ocurre en las variantes de secuencia Fc V4 y V9, las cuales de otro modo presentan velocidades de isomerización mejorada en estudios de degradación acelerada sugiriendo ~12-16% de isomerización después de dos años a 4 °C en PBS, comparado con ~5-7 % para otras variantes. Véase Tabla 5 (proporciona datos de un único experimento pero experimentos duplicados mostraron valores comparables). La sustitución de ácido aspártico en la posición 270 con ácido glutámico eliminando la posibilidad de tal isomerización de DG, dando como resultado anticuerpos que son químicamente más estables y preparaciones de anticuerpo que son más homogéneas. Otras sustituciones D270 de V9, tales como D270A, D270Q,<d>270S y D270T, eliminan eficazmente la unión a receptores FcYRIIa y FcYRIIb (la K<d>fue mayor de 5pM). Aunque la mutación D270E reduce la unión al receptor FcYRIIb en un orden de magnitud, la variante V9-D270E mantuvo una desviación favorable en afinidad por el receptor FcYRIIb comparado con FcYRIIa, y una afinidad absoluta aceptable por FcYRIIb.VéaseEjemplo 8.

TABLA 5

Se midió la actividad agonista de varios anticuerpos anti-CD40 de la presente invención. Véase Ejemplo 7, y Figuras 3A, 3B y 4. Se observó que la actividad agonista dependía tanto de las secuencias de dominio variable (número de clon de mAb), las cuales determinan la unión al antígeno (CD40 humano), y la secuencia de la región Fc, la cual determina la unión al receptor Fc (FcYRIIb).

La presente descripción es además ilustrada por los siguientes ejemplos.

Ejemplos

EJEMPLO 1

Generación de anticuerpos monoclonales de ratón contra CD40 humano

Se generaron anticuerpos anti-CD40 humano murinos usando ratones Bablb/c de tipo silvestre (Charles Rivers Labs) que expresan los genes de anticuerpo de ratón, como sigue.

Antígeno

Se usó una proteína recombinante soluble huCD40-muFc como el antígeno para inmunizaciones. La proteína de fusión soluble tiene un PM de 91,6 kD y está compuesta por la porción extracelular de huCD40 unida a una Fc IgG2b de ratón en su extremo C-terminal. Esta proteína de fusión se denomina en el presente documento “proteína de fusión huCD40-muFc”. La proteína de fusión se generó por métodos de ADN recombinante convencionales y se expresó en células CHO transfectadas, las cuales secretaron la proteína de fusión soluble en el sobrenadante de cultivo. Las células CHO hospedadoras usadas para transfección se obtuvieron de Invitrogen (N.° Cat 11619-012). La proteína de fusión soluble secretada se purificó para uso como inmunógeno.

Inmunización de ratones

Para generar anticuerpos monoclonales de ratón contra CD40 humano, se inmunizaron ratones Balb/c con proteínas de fusión huCD40-muFc purificadas. Los ratones tenían aproximadamente 2-4 meses de edad después de la primera infusión del antígeno. La preparación del antígeno huCD40-muFc recombinante purificado (10 |jg purificado a partir de células de mamífero transfectadas que expresan la proteína de fusión) se usó para inmunizar los ratones usando dos protocolos de inmunización (Ay B). El protocolo A, consistía en cuatro inmunizaciones semanales en la almohadilla plantar (FP) y el protocolo B en siete inmunizaciones semanales subcutáneas (SC)/intraperitoneales (IP)/corvejón. En ambos casos, el inmunógeno se mezcló 1:1 con adyuvante RIBI (Sigma N.° Cat M6536).

Todos los ratones se sangraron una semana después de las cuatro inmunizaciones para evaluar los títulos específicos del antígeno. Los sangrados finales también se obtuvieron a partir de cada ratón en el momento del sacrificio. Las respuestas inmunitarias se controlaron mediante sangrados retroorbitales. Los plasmas se cribaron mediante ELISA usando la proteína recombinante usada para inmunizaciones. Los ratones del protocolo A recibieron dos refuerzos finales por vía intravenosa (IV) y en las almohadillas plantares (FP) con antígeno soluble en los días -2 y -3 antes de la infusión. Los ratones del protocolo B recibieron dos refuerzos finales por vía intravenosa, así como también IP y en el corvejón con el antígeno soluble en los días -2 y -3 antes de la infusión.

Los cuatro ratones del protocolo A (ID 291763, 291764, 291765, 291766) se sacrificaron. Las células del bazo y ganglios linfáticos se extrajeron y se mezclaron para fusión (fusiones 3582 y 3583). Solamente dos ratones del protocolo B (ID 294286 y 294288) se sacrificaron. Los ganglios linfáticos y del bazo de cada ratón se mezclaron y fusionaron (fusiones 3716 y 3717).

Generación de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales contra CD40 humano

Los esplenocitos de ratón y los ganglios linfáticos aislados de ratones Balb/c de título alto se fusionaron con una pareja de fusión de mieloma de ratón usando el instrumento Hybrimune de electrofusión basado en campo eléctrico y una cámara grande de fusión de 0,9 ml (BTX Harvard Apparatus, Inc., Holliston, MA). Las suspensiones celulares individuales de linfocitos a partir de ratones inmunizados se fusionaron con un número igual de células de mieloma de ratón no secretante P3X63 Ag8.6.53 (ATCC CRL 1580). Las células resultantes se se sembraron en placa a razón de 2,0 x 104 células/pocillo en placas de microtitulación de fondo plano en ClonaCell-HY Medium E selectivo (N.° Catálogo 03805; STEMCELL Technologies Inc., Vancouver BC, Canadá) con adición de aminopterina para seleccionar hibridomas. Después de aproximadamente 7 días, el medio de cultivo se reemplazó con Medio E (sin aminopterina).

Después de 10 a 12 días, las pocillos individuales se analizaron para determinar la presencia de anticuerpos anti-IgG de ratón/cadena ligera kappa de ratón usando un ensayo HTRF homogéneo. En este ensayo, los sobrenadantes de las placas de fusión de 96 pocillos se mezclaron con IgG anti-ratón de cabra marcado habitualmente con terbio-criptato (específico de F<cy>) (Cisbio US Inc. Bedford, MA) y anti-Fab'2 de IgG de ratón de cabra marcado con AlexaFluor 647 (Jackson ImmunoResearch; N.° Catálogo 109-605-098). La incubación fue der 1 hora. Las placas se leyeron a continuación en un lector Rubystar. Las células de hibridoma de pocillos positivos para anticuerpos anti-IgG de ratón/cadena ligera kappa de ratón se seleccionaron a continuación o bien por FACS usando células CHO transfectadas con CD40 humano y células CHO no transfectadas como control (fusiones 3582/3583) o por ELISA usando proteína recombinante seguido de FACS en células B Daudi y linfocitos T Jurkat como control negativo (fusiones 3716/3717). Las líneas parentales positivas por FACS se transfirieron a placas de 24 pocillos. Unos pocos días después, los sobrenadantes celulares de pocillos individuales fueron seleccionados de nuevopor FACS para confirmar la especificidad de IgG por CD40 humano.

Un panel de hibridomas específicos del antígeno se clonó por dilución serial y se seleccionó de nuevo por FACS usando o bien transfectantes CHO o células Daudi. Diecinueve anticuerpos de fusiones 3582/3583 y veinte anticuerpos de fusiones 3716/3717 se purificaron y probaron para determinar la actividad funcional. A partir de este panel de anticuerpos, se seleccionaron cinco agonistas fuertes para una segunda subclonación. Estos cinco anticuerpos denominados 1802.3582.19G3.F10.E1, 1802.3583.5G7.F12.G3, 1802.3583.8E8.C10.G2, 1802.3716.12D6.B1.E3, y 1802.3717.5F11.A11.E7 fueron secuenciados y analizados adicionalmente.

EJEMPLO 2

Generación de anticuerpos anti-huCD40 completamente humanos

Los anticuerpos monoclonales anti-huCD40 completamente humanos que se unen al mismo epítopo y bloquean de manera cruzada la unión de los anticuerpos anti-CD40 humanizados descritos en el presente documento pueden utilizarse en los métodos de la presente invención. Tales anticuerpos pueden ser generados usando ratones transgénicos que expresan genes de anticuerpo humano, como sigue.

Antígeno

Una proteína recombinante soluble huCD40 se usó como el antígeno para inmunización. La proteína de fusión soluble está compuesta por la porción extracelular de huCD40 unida a una Fc IgG2a de ratón en su extremo C-terminal. Esta proteína de fusión se denomina en el presente documento “proteína de fusión huCD40-muFc”. La proteína de fusión es generada por métodos de ADN recombinante convencional y expresada en células CHO transfectadas, las cuales secretan la proteína de fusión soluble en el sobrenadante del cultivo. Las células hospedadoras CHO usadas para transfección se obtienen de Invitrogen (N.° Cat.11619-012). La proteína de fusión soluble secretada es purificada para uso como inmunógeno. La secuencia de CD40 humano de longitud completa que incluye la secuencia señal se proporciona en la SEQ ID NO: 1.

Ratones transgénicos

Los anticuerpos monoclonales completamente humanos contra CD40 humano son preparados usando ratones con el genotipo<c>M<d>++;JKD++;KC<o>5(9272)+<a>;SC20+ (posteriormente llamados ratones KM®). Las designaciones de transgenes individuales están en paréntesis, seguido por los números de línea para transgenes aleatoriamente integrados. Los símbolos + y indican homocigotos o hemicigotos; sin embargo, debido a que los ratones son rutinariamente seleccionados usando un ensayo basado en PCR que no permite distinguir entre heterocigosidad y homocigosidad para los transgenes Ig humanos aleatoriamente integrados, una designación puede ser proporcionada a ratones que son realmente homocigotos para estos elementos. En esta cepa, el gen endógeno de la cadena ligera kappa de ratón ha sido alterado homocigotamente como se describe en Chenet al.,(1993)EMBO J.

12:811-820 y el gen endógeno de la cadena pesada de ratón ha sido alterado homocigotamente como se describe en el ejemplo 1 del documento WO 2001/09187. Además, esta cepa de ratón porta un transen de cadena ligera kappa humana, KCo5, como se describe en Fishwildet al.,(1996)Nature Biotechnology14:845-851, un cromosoma artificial de levadura (YAC) que porta muchos de los locus de la cadena ligera kappa humana, como se describe en el documento WO 2000/026373.

Inmunización de ratones

Para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos contra CD40 humano, los ratones KM® se inmunizaron con proteína de fusión huCD40-muFc purificada. Los esquemas de inmunización general se describen en Lonberget al.,(1994)Nature368(6474):856-859; Fishwild, D.et al.,(1996)Nature Biotechnology14:845-851 y el documento WO 98/24884. Los ratones tienen aproximadamente 4 meses de edad después de la primera infusión del antígeno. Se usó la preparación de antígeno huCD40-muFc recombinante purificado (10 |jg purificado de células de mamífero transfectadas que expresan la proteína de fusión) o células 300-19 transfectadas con CD40 humano, para inmunizara los ratones por vía intraperitoneal y subcutánea. Los inmunógenos son mezclados 1:1 con adyuvante RIBI (N.° Cat. Sigma M6536).

Los ratones son inmunizados cinco veces a intervalos de 5-7 días. La primera y segunda inmunizaciones se realizaron con la proteína recombinante. La tercera inmunización es con las células, la cuarta inmunización con la proteína y la quinta inmunización con las células. Los ratones son sangrados una semana después de las últimas inmunizaciones para evaluar los títulos específicos del antígeno. La respuesta inmunitaria se controla mediante sangrados retroorbitales. El plasma es seleccionado por análisis FACS usando las células 300-19 transfectadas, y los ratones con títulos más altos para IgG anti-CD40 humano son usados para infusiones. Los ratones recibieron un refuerzo final por inyección intravenosa (IV) e intraperitoneal (IP) de antígeno soluble dos días y las células transfectadas tres días antes del sacrificio y extirpación del bazo.

Generación de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales contra CD40 humano

Esplenocitos de ratón aislados de ratones KM® de título alto y una pareja de fusión de mieloma de ratón son fusionados con una electrofusión basada en campo eléctrico usando un electroporador de fusión celular de cámara grande Cyto Pulse (Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD). Las suspensiones de células individuales de linfocitos esplénicos de ratones inmunizados son fusionadas con un número igual de células de mieloma de ratón no secretante P3X63 Ag8.6.53 (ATCC CRL 1580) (número de fusión: 2541). Las células resultantes se siembran en placas a razón de 2,0 x 104 células/pocillo en placas de microtitulación de fondo plano en medio DMEM selectivo con alto contenido de glucosa (Cellgro n.° 10-013-CM) y suero de bovino fetal al 10 % (Hyclone n.° SH30071.03), y suplementadas con betamercaptoetanol (1000X, Gibco n.° 21985-023), HEPES 7 mM (Cellgro 25-060-Cl), L-glutamina 2 mM adicional (Cellgro 25-005-Cl), HAT (50X, Sigma n.° H-0262), factor de clonación de hibridoma al 5% (BioVeris n.° 210001), medio acondicionado P388DI al 10% (ATCC n.° CRL TIB-63) y penicilina-estreptomicina (100x, Cellgro n.° 30-002-0). Después de aproximadamente 7 días, algo del medio que contiene HAT es reemplazado con medio que contiene HT (Cellgro n.° 25-047-CI).

Después de 10 a 12 días, las pocillos individuales se analizaron para determinar la presencia de anticuerpos contra IgG humana/cadena ligera kappa humana usando un ensayo HTR<f>homogéneo. En este ensayo, los sobrenadantes de las placas de fusión de 96 pocillos se mezclaron con anti-IgG humana de cabra marcada con europio-criptato (específica del fragmento Fc), anti-cadena ligera kappa humana de cabra biotinilada (Betil n.° A80-115B), estreptavidina-XLent y se incubó durante1 hora. Las placas se leen a continuación en un lector RUBYstar.

Las células de hibridoma de pocillos positivos para anticuerpos anti-IgG humana/cadena ligera kappa o anti-IgG humana/cadena ligera lambda son analizadas a continuación por FACS usando células 300-19 transfectadas con CD40 humano y células 300-19 no transfectadas como control. Las líneas parentales positivas FACS son transferidas a placas de 24 pocillos. Unos días después, los sobrenadantes celulares de pocillos individuales son analizados de nuevo por FACS para confirmar la especificidad de IgG por el CD40 humano.

Los hibridomas son clonados por dilución serial y analizados de nuevo por FACS.

EJEMPLO 3

Humanización de anticuerpos anti-huCD40

Anticuerpos parentales (murinos) de la presente invención se humanizaron para un uso potencial como agentes terapéuticos humanos. La secuencia de la región de la línea germinal humana de mayor emparejamiento se seleccionó para cada dominio variable de ratón, y estas regiones marco humanas se usaron para reemplazar regiones marco murinas en las versiones “ injerto de CDR” de los anticuerpos. Las sustituciones de aminoácidos adicionales, tales como retromutaciones marco, se elaboraron a continuación según necesidad para restaurar la afinidad de unión del anticuerpo humanizado. Se hicieron sustituciones de aminoácidos adicionales para eliminar las exigencias de secuencia. Las relaciones de secuencia entre las varias formas de los anticuerpos de la presente invención se proporcionan en la Tabla 6. La unión de varios anticuerpos anti-huCD40 agonistas a CD40 humano soluble se determinó por análisis de interferometría de biocapa (BLI) usando un instrumento de análisis de interacción sin marcaje Fortebio Octet RED (Rapid system-Extended Detection). Todos los estudios se realizaron en NaxPO4 10 mM, NaCl 130 mM, tensioactivo p20 al 0,05 % (pH 7,1) a 25 °C. Brevemente, los sobrenadantes de anticuerpo anti-huCD40 (diluidos a 10 pg/ml o capturados no diluidos si la concentración de sobrenadante es menos de 10 pg/ml) se capturaron en biosensores recubiertos con proteína A (Pall Fortebio n.° 18-5010) usando un tiempo de carga de 90 s y velocidad de agitación de 1000 rpm. Los sobrenadantes fueron analizados primero para determinar la unión al monómero de CD40 humano recombinante (monómero de huCD40) 1 pM usando tiempos de 180 s de asociación y disociación, a 1000 rpm, con dos etapas de acondicionamiento de 15 s usando glicina 10 mM, pH 1,5 entre los ciclos de unión. Todos los sobrenadantes que demostraron una señal de unión en el experimento de monómero huCD40 1 pM se probaron para determinar la unión a siete concentraciones diferentes de monómero de huCD40 en una serie de dilución de tres veces, donde la concentración más alta fue 10 pM de monómero huCD40 o monómero de huCD40 1 pm dependiendo de la intensidad de la señal de unión en el experimento de selección de 1 pm. Los resultados para los anticuerpos seleccionados y variantes de secuencia de los mismos se muestran en la Tabla 6. Los anticuerpos que no son de acuerdo con la invención de la Tabla 6 se presentan solamente a modo ilustrativo y están consecuentemente marcados con “ ilustrativo”.

TABLA 6

continuación

= para prop stos e comparac n, e parenta present una d e , n en ugar e , nM) cuando se analizó en el mismo ensayo en paralelo con el anticuerpo 5F11-45._____________

Para los anticuerpos humanizados, las columnas Vh y Vl proporcionan las líneas germinales de dominio variable humano en las cuales se basan las regiones marco. “Injerto de CDR” se refiere a dominios variables que comprenden CDR parentales no modificadas (ratón) injertadas directamente sobre las secuencias marco humanas mencionadas. La numeración de residuos para todas las variantes de secuencia en la Tabla 6 es de conformidad con Kabat, y de este modo las posiciones de los cambios de secuencia en la Tabla 6 no coinciden con la numeración del residuo de las secuencias de anticuerpo en el Listado de secuencias. Se usa subrayado para indicar las modificaciones de secuencia que están destinadas a corregir las potenciales exigencias de secuencia correcta, es decir, residuos que son sometidos a modificación química y degradación potencial, que dan lugar a una heterogeneidad del producto. Otras modificaciones de secuencia están destinadas a restaurar la afinidad, típicamente una retromutación marco (revertiendo desde la secuencia marco de la línea germinal humana hasta el residuo marco murino original). La modificación M69L en la cadena pesada de anticuerpo 5G7 es tanto una retromutación marco como una corrección de exigencia.

EJEMPLO 4

Experimentos de preclasificación de epítopos de anticuerpos anti-CD40

Se pueden llevar a cabo experimentos de preclasificación de epítopos para determinar qué anticuerpos anti-CD40 humanos compiten con otros por su unión a huCD40, y de este modo se unen a epítopos similares. La competición por pares entre anticuerpos anti-huCD40 se determina como sigue, en el cual un anticuerpo de referencia se une a la superficie de un chip sensor, un anticuerpo de prueba es preincubado con una construcción de polipéptido huCD40 en una mezcla, y la mezcla preincubada se derrama sobre el chip sensor para determinar con qué grado el anticuerpo de prueba interfiere con la unión de la construcción de polipéptido huCD40 al anticuerpo de referencia sobre la superficie del chip. Tales experimentos de competición pueden ser realizados usando un instrumento BIACORE® SPR. Brevemente, un anticuerpo anti-huCD40 de referencia es inmovilizado sobre una superficie de chip CM5 de Sensor Chip (Series S, GE Healthcare N.° CAT BR-1005-30), celda de flujo 2, celda de flujo 3 y celda de flujo 4 (5000 RU), y la celda de flujo 1 es usada como un control negativo. Un anticuerpo de prueba se diluye a 120 pg/ml (2X) de concentración de partida. Se realizó una serie de diluciones del anticuerpo de prueba diluyendo una concentración 1:3 de anticuerpo con tampón para siete concentraciones diferentes y una muestra de control (con 0 pg/ml) para obtener una curva de titulación. Cada serie de concentración de anticuerpo se dividió en dos mitades. En la primera mitad de la serie de concentración, se agregó antígeno CD40 humano 40 nM (2X) (por ejemplo, huCD40/Fc) para hacer la serie de concentración final (60 pg/ml-0.0 pg/ml) y 20 nM de concentración final de antígeno en cada pocillo. En la segunda mitad de la serie de concentración, en lugar del antígeno, se agregó tampón para tener el anticuerpo diluido a la misma concentración, y esta mitad se trató como el blanco. Los complejos de los anticuerpos anti-CD40 de prueba y huCD40/Fc son incubados durante 2 horas. Se inyectan 40 pl de complejos sobre la superficie recubierta de anticuerpo de referencia a 30 pl/min. Se usó un instrumento de resonancia de plasmón superficial BIACORE® T200 y el tampón de análisis es HBE-EP, GE Healthcare N.° CAT BR-1001-88, se filtró, se desgasificó, HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCI 0,15, EDTA 3 mM, tensioactivo P200,005%. La superficie se regeneró con NaOh 25 mM (código de orden: BR-1003-58, GE Healthcare) a 100 |jl/m¡n durante 5 segundos. Los datos se analizaron usando Microsoft Excel donde la concentración de los anticuerpos de prueba se representó gráficamente frente a la unidad de respuesta correspondiente para obtener curvas de titulación.

Los resultados de cada uno de los experimentos de preclasificación de epítopos para los anticuerpos anti-CD40 de la presente invención son proporcionados en la Figura 2. Los anticuerpos 5F11 y 8E8 bloquean la unión al ligando (CD40L). Los cinco anticuerpos anti-CD40 de la presente invención se incluyen en tres grupos de epítopos 12D6/5G7/19G3, 5F11/5G7/19G3, y 8E8.

EJEMPLO 5

Mapeo de epítopos por HDX

Los epítopos para los anticuerpos anti-huCD40 12D6, 5G7, 19G3 y 5F11 de la presente invención se determinaron mediante espectrometría de masas por intercambio de hidrógeno/deuterio (HDX-MS). La HDX-MS analiza la conformación de la proteína y la dinámica conformacional en solución controlando la velocidad y grado de intercambio de deuterio de los átomos de hidrógeno de amida de la cadena principal. Huang & Chen (2014)Anal. Bioanalytical Chem.406:6541; Weietal.,(2014)Drug Disc. Today19:95. El nivel de H<d>X depende de la accesibilidad del disolvente a los átomos de hidrógeno de amida de la cadena principal y los enlaces de hidrógeno de la proteína. El incremento de masa de la proteína tras la HDX puede ser medido de manera precisa por MS. Cuando esta técnica se combina con la digestión enzimática, las características estructurales a nivel de péptido pueden ser resueltas, permitiendo la diferenciación de los péptidos expuestos a la superficie de aquellos plegados hacia adentro, o de aquellos secuestrados en la interfaz de un complejo de proteína-proteína. Típicamente, se realizan experimentos de marcaje con deuterio y posterior inactivación, seguidos de digestión enzimática, separación de péptidos, y análisis de MS.

Antes de los experimentos de mapeo de epítopos, se llevaron a cabo experimentos no deuterados para generar una lista de péptidos comunes para el monómero de CD40 humano recombinante (10 jM), y complejos proteicos de CD40 con mAbs 12D6, 5G7, 19G3, y 5F11 (relación molar 1:1). En el experimento de HDX-MS, se diluyó 5 j l de cada muestra (CD40 o CD40 con mAbs 12D6, 5G7, 19G3, y 5F11 respectivamente) en 55 j l de tampón D2O (tampón fosfato 10 mM, D2O, pH 7,0) para iniciar las reacciones de marcaje. Las reacciones se llevaron a cabo durante diferentes periodos de tiempo: 20 s, 1 min, 10 min y 240 min. Al final de cada periodo de reacción de marcaje, la reacción se inactivó agregando tampón de inactivación (tampón fosfato 100 mM con GdnCl 4 M y TCEP 0,4 M, pH 2,5, 1:1, v/v) y se inyectaron 50 j l de muestra inactivada en el sistema Waters HDX-MS para análisis. Los niveles de absorción de deuterio de péptidos pépticos comunes se midieron en la ausencia/presencia de mAbs anti-CD40. La cobertura de secuencia obtenida fue 82 %.

Los epítopos de HDX para mAbs anti-CD40 12D6, 5G7, 19G3, y 5F11 son proporcionados en la Tabla 7. El anticuerpo 12D6 protege dos péptidos, uno de los cuales (residuos 11-28) incluye una porción de la secuencia señal y de este modo no es probable que sea fisiológicamente relevanteper se,pero indica que 12D6 hace contactos en la región 21 28 que no hacen los mAbs 5G7 y 19G3.

TABLA 7

EJEMPLO 6

Mapeo de epítopos por presentación en levaduras

Los epítopos para anticuerpos anti-huCD40 quiméricos o humanizados seleccionados de la presente invención son determinados mediante presentación de variantes de la región extracelular de huC40 mutagenizadas aleatoriamente en levadura, y clasificando esta levadura en función de la falta de unión a anticuerpos particulares. Las células de levadura seleccionadas que no se unen son amplificadas y sometidas a rondas adicionales de selección en función de su incapacidad para unirse a formas humanizadas o quiméricas particulares de los anticuerpos de la presente invención. Véase, por ejemplo, Chaoet al.,(2004)J. Mol. Biol.342:539. Las secuencias para variantes de huCD40 son determinadas para la levadura resultante y analizadas en cuanto a los efectos de cada residuo en la unión del anticuerpo. El epítopo de unión para los anticuerpos de la presente invención se determinó como los loci dentro de la secuencia de huCD40 donde las mutaciones de un único aminoácido alteran la unión a los anticuerpos anti-huCD40 de la presente invención.

Brevemente, la PCR propensa a errores se usó para clonar el ADN que codifica CD40 humano en construcciones que permiten la expresión de las variantes de huCD40 como las porciones amino-terminales de proteínas de fusión que comprenden además una etiqueta c-myc y proteína de la pared celular de levadura Aga1p. Tales construcciones, cuando se expresan en levadura(Saccharomyces cerevisiae),presentan los polipéptidos huCD40 variantes sobre la superficie de las células de levadura, anclados a la superficie celular por el polipéptido Aga1 p. La etiqueta c-myc puede opcionalmente usarse como un control positivo para la presentación de proteínas de fusión huCD40 en una célula de levadura dada. Las células de levadura son clasificadas por FACS, y aquellas que se expresan como proteínas de fusión huCD40 apropiadamente plegadas (como se determina por la unión de un anticuerpo anti-huCD40 de ratón de control detectado por un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón de cabra marcado con aloficocianina (APC), pero no se unen a los anticuerpos de la presente invención (como se determina por detección con una anti-IgG humana de cabra marcada con ficoeritrina (PE) como anticuerpo secundario), son combinadas, amplificadas, y usadas en rondas de selección posteriores. La secuencia huCD40 se determinó para construcciones de levadura que permanecen después de varias rondas de selección. Se realizaron experimentos de control sin selección de anticuerpo anti-huCD40 para confirmar una buena cobertura mutante en cada posición a lo largo de la secuencia huCD40, y proporcionan un valor de referencia para normalizar los resultados obtenidos con las bibliotecas seleccionadas.

EJEMPLO 7

Actividad agonista de anticuerpos anti-CD40

El efecto de la variación de la secuencia Fc en la actividad agonista de anticuerpos anti-CD40 seleccionados de la presente invención se evaluó midiendo la activación de células dendríticas (DC) inmaduras. Se realizaron experimentos con construcciones 12D6-24 de mAb anti-CD40 que tienen secuencias humanas de IgG1f (control), SE, SELF, P238D, V4, V8 y V12 Fc. Se aislaron monocitos humanos (CD14+) a partir de donantes normales sanos usando adherencia plástica o microperlas CD14 humanas (Miltenyi Biotec). Se cultivaron monocitos con 100 ng/ml de GM-CSF (Miltenyi Biotec) y 100 ng/ml de IL-4 (Miltenyi Biotec). La mitad del medio se eliminó y se repuso el día 2 y el día 5. Las células dendríticas inmaduras se recogieron el día 6-7. Las DC de dos donantes se incubaron con la concentración indicada de anticuerpos durante la noche a 37 °C. Los sobrenadantes de cultivo celular se recogieron y se sometieron a ensayo para producción de IL-6 humana (Cisbio). Véase Figuras 3Ay 3B.

Los anticuerpos IgG1f humanos de control no inducen secreción de IL-6 cuando se usan hasta 100 nM, y la variante P238D se induce solamente débilmente. Por el contrario, las variantes SE, SELF, V9 y V12 todas mejoran drásticamente la secreción de IL-6, presentando V8 y V4 efectos intermedios. Estos resultados se corresponden aproximadamente con la afinidad de unión por FcYRIIb, y confirman que el uso de la variante de secuencia Fc apropiada puede dar como resultado anticuerpos anti-CD40 con actividad agonista mejorada.

Además, las diferencias en actividad agonista entre anticuerpos que tienen regiones variables 8E8, 5G7, 12D6, 19G3 y 5F11 se evaluarán en experimentos usando construcciones de mAb anti-CD40 quiméricos que tienen un dominio constante de IgG1f V12 humana común. La activación se midió en células dendríticas inmadurasin vitro(aisladas como se describe en el párrafo precedente) sembrando células en una placa de 96 pocillos, agregando anticuerpos como se indica, e incubando durante la noche a 37 °C. A continuación, las células se recogieron y se tiñeron con un anticuerpo anti-CD54 fluorescente, el cual se detectó por clasificación de células activada por fluorescencia (FACS). Véase Figura 4.

El anticuerpo IgG1f humano de control no provocó ninguna regulación positiva significativa de CD54, mientras 12D6 provocó una drástica regulación positiva de CD54. Los anticuerpos l9G3 y 8G8 fueron algo menos efectivos que 12D6, y los anticuerpos 5G7 y 5F11 fueron similares entre sí y presentaron estimulación relativamente baja. Los resultados de activación no se correlacionan necesariamente con la afinidad de unión por CD40, puesto que el anticuerpo 5F11 tiene casi la afinidad de unión más alta y aún así es un agonista débil, mientras que el anticuerpo 19G3 es lo contrario. Independientemente de la razón de las diferencias, estos resultados confirman que el uso de la secuencia de dominio de unión al antígeno apropiada es importante para obtener anticuerpos anti-CD40 con actividad agonista mejorada.

EJEMPLO 8

Corrección de la isomerización de DG

Los anticuerpos de la presente invención que tienen secuencias variantes Fc V4 y V9 presentan niveles inaceptables de isomerización de DG en la posición D270. Tal isomerización es indeseable debido a que conduce a heterogeneidad del producto y potencialmente a una eficacia reducida. Para reducir tal isomerización, el residuo de ácido aspártico en la posición 270 de Fc V4 se cambió a ácido glutámico (D270E), y la posición 270 de Fc V9 se cambió a alanina, ácido glutámico, glutamina, serina y treonina (D270A, D270E, D270Q, D270S, D270T). Los sobrenadantes se obtuvieron a partir de células que expresan estos anticuerpos y se sometieron a ensayo para determinar la unión a hCD32/FcYRII. Los anticuerpos purificados seleccionados sin mutaciones en la posición 270 se usaron como controles. Estos experimentos se realizaron en anticuerpos con dominios variables de mAbs 12D6-24 y 5F11-45. Los anticuerpos se proporcionan en la Figura 5.

Para ambas variantes de Fc V4 y V9, la sustitución D270E conduce a una disminución modesta en la unión al receptor. Otras variantes Fc V9 probadas (D270A, D270Q, D270S, D270T) conducen a una mayor disminución en la unión al receptor. Los resultados fueron independientes de si el anticuerpo era 12D6 o 5F11. En todos los casos, la unión relativa (orden de clasificación) a los tres receptores probados (FcYRIIa-H131, FcYRIIa-R131, y FcYRIIb) permanecieron similares, con una unión aproximadamente equivalente a FcYRIIa-R131 y FcYRIIb, y una unión significantemente más débil a FcYRIIa-H131.

Para ambas variantes V4 y V9, la sustitución D270E retiene una afinidad por F<cy>R aceptablemente alta, y mantiene la especificidad por FcYRIIb que se desea para mejorar la actividad agonista de los anticuerpos anti-CD40 de la presente invención.

TABLA 8

continuación

(continuación)

El Listado de secuencias proporciona las secuencias de las cadenas pesada y ligera maduras (es decir, secuencias que no incluyen péptidos señal). Una secuencia señal para producción de los anticuerpos de la presente invención, por ejemplo, en células humanas, se proporciona en la SEQ ID NO: 78.

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo aislado, o una porción de unión al antígeno del mismo, que se une específicamente a CD40 humano y comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde la cadena pesada comprende las secuencias CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y la cadena ligera comprende las secuencias CDRL1,<c>D<r>L2 y CDRL3, en donde CDRH1, CDRH2 y CDRH3 comprenden los residuos 31-35, 50-66 y 99-108, respectivamente, de SEQ ID NO: 12 y CDRL1, CDRL2 y CDRL3 comprenden los residuos 24-39, 55-61 y 94-102, respectivamente, de SEQ ID NO: 9.
2. 2. El anticuerpo de la reivindicación 1 que comprende secuencias de dominio variable de cadenas pesada y ligera que comprenden los residuos 1-119 y 1-112 de SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 9, respectivamente.
3. 3. Un ácido nucleico que codifica las regiones variables de cadenas pesada y ligera del anticuerpo, o de la porción de unión al antígeno del mismo, de las reivindicaciones 1 o 2.
4. 4. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3.
5. 5. Una célula transformada con (i) un vector de expresión de la reivindicación 4 o (ii) un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica la cadena pesada del anticuerpo de las reivindicaciones 1 o 2 y un vector de expresión diferente que comprende un ácido nucleico que codifica la cadena ligera del anticuerpo de las reivindicaciones 1 o 2.
6. 6. Un método para preparar un anticuerpo anti-CD40 humano, o una porción de unión al antígeno del mismo, que comprende: a) expresar el anticuerpo, o la porción de unión al antígeno del mismo, en la célula de la reivindicación 5; y b) aislar el anticuerpo, o la porción de unión al antígeno del mismo, de la célula.
7. 7. Una composición farmacéutica que comprende: a) el anticuerpo, o la porción de unión al antígeno del mismo, de las reivindicaciones 1 o 2; y b) un vehículo.
8. 8. La composición farmacéutica de la reivindicación 7 para usar en un método para tratar el cáncer.
9. 9. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 8, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en: cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer uterino/cervical, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer esofágico, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer de colon, cáncer de riñón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer de células germinales, cáncer de huesos, cáncer de hígado, cáncer de tiroides, cáncer de piel, neoplasma del sistema nervioso central, linfoma, leucemia, mieloma y sarcoma.
10. 10. La composición de la reivindicación 7 para uso en un método para tratar una infección viral crónica.

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