ES3039620T3

ES3039620T3 - Hypersensitive response elicitor-derived peptides and use thereof

Info

Publication number: ES3039620T3
Application number: ES17779572T
Authority: ES
Inventors: Zhongmin Wei; Gregory Zornetzer
Original assignee: Plant Health Care Inc
Current assignee: Plant Health Care Inc
Priority date: 2016-04-06
Filing date: 2017-03-31
Publication date: 2025-10-23
Anticipated expiration: 2037-03-31
Also published as: EP3439682B1; PL3439682T3; ZA201805811B; US20200407403A1; US11725027B2; US10793608B2; BR112018070141A2; WO2017176587A1; EP3439682A4; EP3439682A1; AR108086A1; CN108883148A; MX389549B; US20170291924A1; EP3439682C0

Abstract

Se describen péptidos inductores de respuesta hipersensible y péptidos inductores de respuesta no hipersensible que inducen respuestas activas en las plantas y que presentan una mejor solubilidad, estabilidad, resistencia a la degradación química o una combinación de estas propiedades. También se describe el uso de estos péptidos o polipéptidos de fusión, o de construcciones de ADN que los codifican, para modular la señalización bioquímica de las plantas, conferirles resistencia a enfermedades, mejorar el crecimiento vegetal, conferir tolerancia al estrés biótico, conferir tolerancia y resistencia al estrés abiótico, conferir resistencia a la desecación a esquejes de plantas ornamentales, conferir resistencia a enfermedades o a la desecación poscosecha a una fruta o verdura, o aumentar la longevidad de la maduración de frutas o verduras. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Péptidos derivados de inductor de respuesta de hipersensibilidad y uso de los mismos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevos péptidos inductores de respuesta de hipersensibilidad y a su uso para inducir respuestas activas en las plantas, incluyendo, sin limitación, la mejora del crecimiento, la resistencia a enfermedades, la resistencia a plagas o insectos y resistencia al estrés.

Antecedentes de la invención

La identificación y el aislamiento de las proteínas harpin surgieron de la investigación básica de la Universidad de Cornell, cuyo objetivo era comprender cómo las bacterias fitopatógenas interactúan con las plantas. Una primera línea de defensa es la respuesta de hipersensibilidad (HR), una muerte celular localizada en el sitio de la infección. La muerte celular crea una barrera física al movimiento del patógeno y, en algunas plantas, las células muertas pueden liberar compuestos tóxicos para el patógeno invasor. Las investigaciones habían indicado que las bacterias patógenas probablemente tenían un único factor responsable de desencadenar la HR. Un objetivo fundamental de la investigación de Cornell fue identificar una proteína bacteriana específica responsable de inducir la HR. Se sabía que la proteína diana estaba codificada por un grupo de genes bacterianos denominados grupo génico de Respuesta Hipersensible y Patogenicidad (hrp). Se diseccionó el grupo hrp en la bacteriaErwinia amylovora(Ea), que causa el fuego bacteriano en la pera y la manzana, y se identificó una sola proteína que provocaba fuego bacteriano en ciertas plantas. Esta proteína recibió el nombre de harpin (y, posteriormente, harpinEa) y el gen correspondiente se denominóhrpN.Este fue el primer ejemplo de una proteína y un gen de este tipo identificados en cualquier especie bacteriana.

Desde entonces, se han identificado diversas proteínas harpin en especies deErwinia, Pseudomonas, Ralstonia, XanthomonasyPantoea,sin limitación. Las proteínas harpin, si bien son diversas a nivel de la secuencia primaria de aminoácidos, comparten características bioquímicas y biofísicas comunes, así como funciones biológicas. Debido a sus propiedades únicas, en la literatura se considera que las proteínas harpin pertenecen a una sola clase de proteínas.

Tras su identificación y aislamiento, se descubrió que las harpin podían generar resistencia a enfermedades en las plantas y aumentar su crecimiento. Un hallazgo inicial importante fue que la aplicación de proteína harpin purificada hacía a la planta resistente a un ataque posterior de patógenos, incluso en zonas de la planta alejadas del sitio de inyección. Esto significaba que las proteínas harpin podían desencadenar una resistencia sistémica adquirida (SAR), un mecanismo de defensa de las plantas que proporciona resistencia a diversos patógenos virales, bacterianos y fúngicos.

En la protección de cultivos, existe una necesidad continua de composiciones que mejoren la salud de las plantas. Unas plantas más sanas son deseables, ya que resultan en mejores rendimientos y/o una mejor calidad de las plantas o cultivos. Además, las plantas más sanas resisten mejor el estrés biótico y abiótico. Una alta resistencia al estrés biótico permite a los agricultores reducir la cantidad de pesticidas aplicados y, en consecuencia, ralentizar el desarrollo de resistencias a los respectivos pesticidas.

Harpinap es una proteína de fusión derivada de varias harpin diferentes. Se ha demostrado que harpinap suprime la producción de huevos de nematodos, mejora el crecimiento, la calidad y el rendimiento de las plantas, y aumenta su vigor. Sus secuencias de aminoácidos y nucleótidos se describen en detalle en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos n.° 2010/0043095.

Hasta la fecha, la producción de harpin y harpinap y su uso en aplicaciones agrícolas y hortícolas se ha realizado como un sólido en polvo recubierto en almidón. Esto limita el uso y la versatilidad de las proteínas harpin, ya que las suspensiones líquidas de proteínas harpin en polvo en agua tienen una vida útil efectiva de solo 48-72 horas antes de que se produzca una degradación significativa y pérdida de actividad. Otro problema con las soluciones de harpin es la solubilidad y estabilidad de la proteína.

Sería deseable identificar péptidos harpin sintéticos y derivados que sean fácilmente solubles en solución acuosa, estables, resistentes a la degradación química y eficaces para iniciar una o más respuestas activas de las plantas, incluyendo, sin limitación, la respuesta vegetal hipersensible.

La presente invención tiene como objetivo superar estas y otras limitaciones de la técnica.

Resumen de la invención

Un primer aspecto de la invención se refiere a un péptido aislado que tiene una longitud de 12 a 50 aminoácidos, en longitud comprendiendo el péptido la secuencia de aminoácidos de

L-X-X-L-L-L-X-(F/L)-(I/L)-X-X-X-L (SEQ ID NO: 2)

donde

X en la posición 2 se selecciona entre Glu (E), Y-glutamato, Asp (D), e isoD;

X en la posición 3 es opcional y, cuando está presente es Gln (Q); y

cada X en las posiciones 7, 10, 11 y 12 se selecciona independientemente de Met (M), Ala (A), Glu (E), y yglutamato.

En una realización, X en la posición 3 está presente. En otra realización, X en la posición 3 no está presente. En otras realizaciones, el péptido aislado está libre de cisteína o de cisteína y metionina. En ciertas realizaciones, el péptido aislado incluye además una secuencia de aminoácidos hidrófila ubicada en el extremo terminal N o terminal C de la SEQ ID NO: 2.

El primer aspecto de la invención se relaciona además con un péptido aislado que tiene 12 a 50 aminoácidos de longitud y comprende la secuencia de aminoácidos de:

(Q/E)-(Q/E)-(L/I/V/F)-X-X-(L/I/V/F)-(L/I/V/F)-(L/I/V/F)-X-(L/I/V/F)-(L/I/V/F)-X-X-X-(L/I/V/F)-(D/G/Q/E)-(D/G/Q/E), (SEQ ID NO: 3),

donde

X en la posición 4 se selecciona entre Glu (E), Y-glutamato, Asp (D), e isoD;

X en la posición 5 es opcional y, cuando está presente es Gln (Q); y

cada X en las posiciones 9, 12, 13 y 14 se selecciona independientemente de Met (M), Ala (A), Glu (E), y yglutamato.

En una realización, X en la posición 5 está presente. En otra realización, X en la posición 5 no está presente. El primer aspecto de la invención se relaciona además con un péptido aislado que tiene 12 a 50 aminoácidos de longitud y comprende la secuencia de aminoácidos de:

(L/I/V/F)-X-X-(L/I/V/F)-(L/I/V/F)-(L/I/V/F)-X-(L/I/V/F)-(L/I/V/F)-X-X-X-(L/I/V/F)-(D/G/Q/E)-(D/G/Q/E), (SEQ ID NO: 4),

donde

X en la posición 2 se selecciona entre Glu (E), Y-glutamato, Asp (D), e isoD;

X en la posición 3 es opcional y, cuando está presente es Gln (Q); y

cada X en las posiciones 7, 10, 11 y 12 se selecciona independientemente entre Met (M), Ala (A), Glu (E), y<y>-glutamato.

En una realización, X en la posición 3 está presente. En otra realización, X en la posición 3 no está presente. El primer aspecto de la invención se relaciona además con un péptido aislado que tiene 12 a 50 aminoácidos de longitud y comprende la secuencia de aminoácidos de:

(Q/E)-(Q/E)-(L/I/V/F)-X-X-(L/I/V/F)-(L/I/V/F)-(L/I/V/F)-X-(L/I/V/F)-(L/I/V/F)-X-X-X-(L/I/V/F), (SEQ ID NO: 5), donde

X en la posición 4 se selecciona entre Glu (E), Y-glutamato, Asp (D), e isoD;

X en la posición 5 es opcional y, cuando está presente es Gln (Q); y

cada X en las posiciones 9, 12, 13 y 14 se selecciona independientemente entre Met (M), Ala (A), Glu (E), y yglutamato.

En una realización, X en la posición 5 está presente. En otra realización, X en la posición 5 no está presente. Un aspecto adicional de la invención se refiere a una proteína de fusión que comprende una pluralidad de secuencia de aminoácidos enlazadas entre sí en serie, comprendiendo cada una de la pluralidad de secuencia de aminoácidos el péptido de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición que incluye uno o más péptidos, de acuerdo con la invención, o una proteína de fusión, de acuerdo con de la invención, y un vehículo.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para conferir resistencia a enfermedades a las plantas. Este método incluye: aplicar una cantidad eficaz de un péptido aislado, de acuerdo con la invención, una proteína de fusión, de acuerdo con la invención, o una composición, de acuerdo con la invención, a una planta o semilla de planta, o al lugar donde la planta crece o se espera que crezca, donde dicha aplicación es eficaz para conferir resistencia a enfermedades.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para mejorar el crecimiento de las plantas. Este método incluye: aplicar una cantidad eficaz de un péptido aislado, de acuerdo con la invención, una proteína de fusión, de acuerdo con la invención, o una composición, de acuerdo con la invención, a una planta o semilla de la planta, o al lugar donde la planta crece o se espera que crezca, donde dicha aplicación es eficaz para mejorar el crecimiento de las plantas.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para aumentar la tolerancia y la resistencia de una planta a estresores bióticos. Este método incluye: aplicar una cantidad efectiva de un péptido aislado de acuerdo con la invención, una proteína de fusión de acuerdo con la invención o una composición de acuerdo con la invención a una planta o semilla de planta o al lugar donde la planta está creciendo o se espera que crezca, donde dicha aplicación es efectiva para aumentar la tolerancia y resistencia de la planta a factores de estrés biótico seleccionados del grupo que consiste en plagas tales como insectos, arácnidos, nematodos, malezas y combinaciones de los mismos.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para aumentar la tolerancia de una planta al estrés abiótico. Este método incluye: la aplicación de una cantidad eficaz de un péptido aislado de acuerdo con la invención, una proteína de fusión de acuerdo con la invención, o una composición de acuerdo con la invención a una planta o semilla de la planta, o al lugar donde la planta crece o se espera que crezca, donde dicha aplicación es eficaz para aumentar la tolerancia de la planta a factores de estrés abiótico seleccionados del grupo que consiste en estrés salino, estrés hídrico (incluyendo sequía e inundaciones), estrés por ozono, estrés por metales pesados, estrés por frío, estrés por calor, estrés nutricional (incluyendo deficiencia de fosfato, potasio y nitrógeno), y combinaciones de los mismos.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para modular la señalización bioquímica de la planta. Este método incluye: aplicar un cantidad eficaz de un péptido aislado de acuerdo con la invención, una proteína de fusión de acuerdo con la invención, o una composición de acuerdo con la invención, a una planta o al lugar donde crece la planta, donde dicha aplicación es eficaz para modular la señalización bioquímica de la planta.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una construcción de ADN que incluye una primera molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido, de acuerdo con la invención, o una proteína de fusión, de acuerdo con la invención; y una molécula de ácido nucleico con capacidad promotora acoplada operativamente a la primera molécula de ácido nucleico. Este aspecto de la invención también abarca un vector de expresión recombinante que contiene la construcción de ADN, una célula hospedadora recombinante que contiene la construcción de ADN, así como plantas transgénicas o semillas de plantas que incluyen una célula de planta recombinante de la invención (que contiene la construcción de ADN).

Al proporcionar péptidos que inducen HR y péptidos activos, pero no inductores de HR que presentan mayor solubilidad, estabilidad, resistencia a la degradación química o una combinación de estas propiedades, se ofrecerá a los agricultores mayor flexibilidad para preparar, manipular y suministrar a las plantas en sus campos o invernaderos cantidades efectivas de composiciones que contienen estos péptidos, tanto inductores de HR como no inductores de HR. Simplificar el proceso de aplicación para los agricultores resultará en un mayor cumplimiento y, por lo tanto, en mejores resultados con respecto a uno o más de resistencia a enfermedades, mejora del crecimiento, tolerancia y resistencia a estresores bióticos, tolerancia al estrés abiótico, resistencia a la desecación de esquejes de plantas ornamentales, resistencia a enfermedades postcosecha o resistencia a la desecación de frutas o verduras cosechadas de plantas, y/o una mayor longevidad de la maduración de frutas o verduras para frutas o verduras cosechadas de plantas. Estos y otros beneficios se describen en este documento, y la utilidad de estos péptidos se demuestra mediante los ejemplos adjuntos, donde se demostró resistencia al virus del mosaico del tabaco en tabaco, resistencia a nematodos en soja y tomate, y resistencia a la sequía en soja y maíz.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra una prueba de solubilidad y estabilidad del péptido P5 (SEQ ID NO: 8) en las siguientes soluciones tampón 50 mM: citrato, pH 7.2; EDDS, pH 7.3; imidazol, pH 7.5; EDTA, pH 8.0; fosfato de sodio, pH 8.0; y TES, pH 8.0. El péptido P5 mostró baja solubilidad por debajo de pH 7.0 y obtuvo sus mejores resultados en un tampón de EDTA a pH 8.0 (con un remanente de aproximadamente el 40 % después de 14 días).

La Figura 2 muestra una prueba de solubilidad y estabilidad del péptido P5-9 (SEQ ID NO: 15) en agua desionizada y las siguientes soluciones tampón 50 mM: citrato, pH 5.6; MES, pH 6.0; MOPS, pH 6.5; citrato, pH 7.2; EDDS, pH 7.3; imidazol, pH 7.5; EDTA, pH 8; fosfato de sodio, pH 8.0; y TES, pH 8.0. El péptido P5-9 mostró una mejor solubilidad a 500 |jg/ml, así como una mayor estabilidad en comparación con P5. Tanto en citrato a pH 7.2 como en fosfato a pH 8.0, el péptido P5-9 mostró una remanencia de alrededor del 80 % después de 45 días.

La Figura 3 muestra una prueba de solubilidad y estabilidad del péptido P5-21 (SEQ ID NO: 33) en las siguientes soluciones tampón 50 mM: citrato, pH 5.6; MES, pH 6.0;Mo PS,pH 6.5; citrato, pH 7.2;eDdS,pH 7.3; imidazol, pH 7.5; EDTA, pH 8; fosfato de sodio, pH 8.0; y TES, pH 8.0. El péptido P5-21 mostró una buena solubilidad a pH 5.6 y superior, así como una excelente estabilidad (>90 % después de 14 días) para todos los tampones con pH >7.0, excepto EDTA (alrededor del 80 %).

Descripción detallada de la invención

Un aspecto de la invención se refiere a nuevos péptidos que poseen la capacidad de inducir una respuesta de hipersensibilidad en las plantas o promover respuestas activas de las plantas (o ambas) que proporcionan uno o más de los siguientes atributos: resistencia a enfermedades, mejora del crecimiento, tolerancia y resistencia a estresores bióticos, y tolerancia al estrés abiótico. La inducción de estas respuestas de las plantas implica la modulación de la señalización bioquímica de las plantas.

Tal como se utiliza en el presente documento, los aminoácidos de origen natural se identifican mediante las abreviaturas convencionales de tres letras y/o de una letra, que corresponden al nombre trivial del aminoácido, de acuerdo con la siguiente lista: Alanina (Ala, A), Arginina (Arg, R), Asparagina (Asn, N), Ácido aspártico (Asp, D), Cisteína (Cys, C), Ácido glutámico (Glu, E), Glutamina (Gln, Q), Glicina (Gly, G), Histidina (His, H), Isoleucina (Ile, I), Leucina (Leu, L), Lisina (Lys,k),Metionina (Met, M), Fenilalanina (Phe, F), Prolina (Pro, P), Serina (Ser, S), Treonina (Thr, T), Triptófano (Trp, W), Tirosina (Tyr, Y) y Valina (Val, V). Las abreviaturas son aceptadas en la técnica de péptidos y recomendadas por la comisión IUPAC-IUB en la nomenclatura bioquímica. Las variaciones naturales de estos aminoácidos son bien conocidas e incluyen, sin limitación, el gamma-glutamato (g-Glu) y el isoaspartato (iso-Asp o isoD).

El término "aminoácido" incluye además análogos, derivados y congéneres de cualquier aminoácido específico mencionado en el presente documento, así como derivados de aminoácidos protegidos en el extremo terminal C o el extremo terminal N (por ejemplo, modificados con un grupo protector del extremo terminal N, el extremo terminal C o de cadena lateral, incluyendo, sin limitación, acetilación, formilación, metilación, amidación, esterificación, PEGilación y adición de lípidos. Los aminoácidos no naturales son bien conocidos y pueden introducirse en los péptidos de la presente invención mediante síntesis en fase sólida, como se describe a continuación. Además, el término "aminoácido" incluye tanto los aminoácidos D como los L. Por lo tanto, un aminoácido identificado en el presente documento por su nombre, símbolo de tres letras o de una letra, y que no se identifica específicamente con la configuración D o L, se entiende que asume cualquiera de las configuraciones D o L. En una realización, un péptido comprende todos los L-aminoácidos.

En ciertas realizaciones, los péptidos se identifican como “consisten en” una secuencia mencionada, en cuyo caso el péptido incluye únicamente la secuencia o secuencias de aminoácidos mencionadas sin aminoácidos extraños en sus extremos terminales N o C. En la medida en que una secuencia mencionada se presente en forma de secuencia consenso donde uno o más de los residuos X o Xaa indicados puedan ser cualquiera de uno o más aminoácidos, entonces múltiples secuencias peptídicas están comprendidas por un péptido que consiste en dicha secuencia mencionada.

En ciertas otras realizaciones, los péptidos se identifican como “consisten esencialmente en” una secuencia mencionada, en cuyo caso el péptido incluye la secuencia o secuencias de aminoácidos mencionadas, opcionalmente con uno o más aminoácidos extraños en sus extremos terminales N y/o C, cuyos aminoácidos extraños no alteran materialmente una o más de las siguientes propiedades: (i) la capacidad del péptido para inducir una respuesta de hipersensibilidad u otra respuesta activa en plantas, (ii) la solubilidad del péptido en agua o soluciones acuosas, (iii) la estabilidad del péptido disuelto en agua o solución acuosa a 50 °C durante un período de tiempo (por ejemplo, 3 semanas), y (iv) resistencia del péptido a la degradación química en presencia de una solución acuosa tamponada que incluye un agente biocida (por ejemplo, Proxel®GXL) a 50 °C durante un período de tiempo (por ejemplo, 3 semanas).

Brevemente, la estabilidad y resistencia a la degradación química de los péptidos se puede evaluar de la siguiente manera usando muestras de péptidos que tienen una pureza inicial de al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 82%, al menos aproximadamente 84%, al menos aproximadamente 86%, al menos aproximadamente 88%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 96%, o al menos aproximadamente 98%. Para la estabilidad en agua, el péptido se disuelve directamente en agua desionizada. Para pruebas de degradación química, el péptido se disuelve en una solución acuosa que contiene 50 mM de tampón de pH y 0.25% de Proxel GXL. Los tampones de pH ejemplares incluyen, sin limitación: (i) Citrato pH 5.6; (ii) MES pH 6.0; (iii) MOPS pH 6.5; (iv) imidazol pH 7.5; (v) Citrato pH 7.2; (vi) EDDS, pH 7.3; (vii) EDTA pH 8.0; (viii) fosfato de sodio pH 8.0; o (ix) TES pH 8.0. Los péptidos se disuelven primero en la solución acuosa a una concentración de 0.5 mg/ml. Las muestras se incuban a 50 °C para permitir una degradación acelerada. Se extrae una muestra inicial del péptido, se diluye 10x con agua y se analiza mediante HPLC de fase inversa. Brevemente, se inyectan

20 |jl de la muestra en el flujo de disolvente de un instrumento de HPLC y se analizan en una columna de HPLC

C18 (YMC ProPack C18, YMC, Japón, o C18 Stablebond, Agilent Technologies, EE. UU.) utilizando un gradiente de fosfato de trietilamina en agua/acetonitrilo o un gradiente de TFA al 0.1 % en agua/TFA al 0.1 %

en acetonitrilo para separar las diferentes especies de péptidos. Los péptidos eluyentes se monitorizan mediante absorbancia U<v>a 218 nm y se cuantifican de acuerdo con el área bajo el pico. El área bajo el pico

de la muestra inicial de péptido se considera el estándar para la cuantificación relativa en análisis posteriores.

A intervalos regulares (por ejemplo, 1, 3, 7, 10 y 14 días), cada muestra de péptido se examina y analiza mediante HPLC como se describió anteriormente. Si es necesario observar la degradación (es decir, si el péptido presenta un alto grado de estabilidad química), este protocolo puede extenderse varias semanas para observar la degradación. La cuantificación de los análisis posteriores de péptidos se expresa como un porcentaje del resultado original de HPLC (día 0).

Un péptido al menos parcialmente soluble en agua o solución acuosa presenta una solubilidad superior a 0.1

mg/ml, preferiblemente de al menos aproximadamente 1.0 mg/ml, al menos aproximadamente 2.0 mg/ml, al menos aproximadamente 3.0 mg/ml o al menos aproximadamente 4.0 mg/ml. En ciertas realizaciones, el péptido presenta una alta solubilidad en agua o solución acuosa, con una solubilidad de al menos aproximadamente 5.0 mg/ml, al menos aproximadamente 10.0 mg/ml, al menos aproximadamente 15.0 mg/ml o al menos aproximadamente 20 mg/ml.

Un péptido estable en agua o solución acuosa presenta al menos aproximadamente el 66 %, al menos aproximadamente el 68 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 72 %, al menos aproximadamente el 74 %, al menos aproximadamente el 76 %, al menos aproximadamente el 78 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 82 %, al menos aproximadamente el 84 %, al menos aproximadamente el 86 %, al menos aproximadamente el 88 % o al menos aproximadamente el 90 % de la concentración original del péptido durante el periodo designado incubado a 50 °C. En ciertas realizaciones, el periodo designado es de 3 días, 7 días, 14 días, 21 días, 28 días, un mes, dos meses, tres meses o cuatro meses.

Un péptido resistente a la degradación química presenta al menos aproximadamente el 66 %, al menos aproximadamente el 68 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 72 %, al menos aproximadamente el 74 %, al menos aproximadamente el 76 %, al menos aproximadamente el 78 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 82 %, al menos aproximadamente el 84 %, al menos aproximadamente el 86 %, al menos aproximadamente el 88 % o al menos aproximadamente el 90 % de la concentración original del péptido durante el periodo designado incubado a 50 °C. En ciertas realizaciones, el periodo designado es de 3 días, 7 días, 14 días, 21 días, 28 días, un mes, dos meses, tres meses o cuatro meses.

La propiedad de un péptido de elicitar una respuesta de hipersensibilidad, o no, tras la infiltración o aplicación

del péptido a los tejidos vegetales se puede medir aplicando el péptido en forma de polvo seco o en forma de solución a una planta, en particular, aunque no exclusivamente, a una hoja. Las tasas de aplicación incluyen 1

500 |jg/ml para solución líquida y 0.0001-0.5 % (p/p) para aplicación en polvo. En los ejemplos adjuntos se describe un ejemplo de aplicación del péptido en forma de solución. Las plantas se consideran positivas para

HR ("HR+") si presentan una muerte celular macroscópica generalizada visible a simple vista, acompañada de marchitamiento y oscurecimiento del tejido afectado en un plazo de 48 horas. Las plantas se consideran negativas para HR ("HR-") si no presentan marchitamiento ni muerte tisular perceptibles a simple vista.

En ciertas realizaciones, la alteración sustancial de una o más propiedades se refiere a una variación inferior al 20 %, variación inferior al 15 %, variación inferior al 10 % o variación inferior al 5 % en una propiedad mencionada al comparar un péptido que posee uno o más aminoácidos extraños con un péptido idéntico que

carece de uno o más aminoácidos extraños. En ciertas realizaciones, el número de aminoácidos extraños en

los extremos terminales N o C es de hasta 20 aminoácidos en uno o ambos extremos, hasta 15 aminoácidos

en uno o ambos extremos, hasta 10 aminoácidos en uno o ambos extremos, hasta 7 aminoácidos en uno o

ambos extremos, hasta 5 aminoácidos en uno o ambos extremos, o hasta 3 aminoácidos en uno o ambos extremos. Además, en la medida en que una secuencia mencionada se presente como una secuencia consenso donde uno o más de los residuos X o Xaa indicados puedan ser cualquiera de uno o más aminoácidos, entonces múltiples secuencias peptídicas están abarcadas por el péptido que consiste esencialmente de dicha secuencia mencionada, sin considerar las variaciones adicionales de dichas secuencias que se producen por la presencia de aminoácidos extraños en sus extremos terminales N y/o C.

En diversas realizaciones de la invención, los péptidos divulgados pueden incluir una secuencia de aminoácidos hidrófila, por ejemplo, en el extremo terminal N o terminal C de una secuencia peptídica designada. La secuencia de aminoácidos hidrófila tiene al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos

8, al menos 9 o al menos 10 aminoácidos de longitud e incluye residuos de aminoácidos que contribuyen a una propiedad hidrófila de la secuencia de aminoácidos que está adyacente a la secuencia de aminoácidos del péptido designado (es decir, el péptido que induce una respuesta activa de la planta). Se han utilizado diferentes métodos en la técnica para calcular la hidrofobicidad/hidrofilicidad relativa de residuos de aminoácidos y proteínas (Kyte et al., “A Simple Method for Displaying the Hydropathic Character of a Protein”, J. Mol. Biol.

157: 105-32 (1982); Eisenberg D, “Three-dimensional Structure of Membrane and Surface Proteins”, Ann. Rev. Biochem. 53: 595-623 (1984); Rose et al., “Hydrogen Bonding, Hydrophobicity, Packing, and Protein Folding”, Annu. Rev. Biomol. Struct. 22: 381-415 (1993); Kauzmann, “Some Factors in the Interpretation of Protein Denaturation”, Adv. Protein Chem. 14: 1-63 (1959)). Cualquiera de estas escalas de hidrofobicidad puede utilizarse para la presente invención; sin embargo, la escala de hidrofobicidad de Kyte-Doolittle es quizás la más frecuentemente referenciada. Estas escalas de hidropatía proporcionan una clasificación de la hidrofobicidad relativa de los residuos de aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos que contribuyen a la hidrofilicidad incluyen Arg (R), Lys (K), Asp (D), Glu (E), Gln (Q), Asn (N) e His (H), así como, aunque en menor medida, Ser (S), Thr (T), Gly (G), Pro (P), Tyr (Y) y Trp (W). Por ejemplo, las secuencias de poliglutamato pueden utilizarse para mejorar la solubilidad de proteínas y otras moléculas farmacológicas (Lilie et al., Biological Chemistry 394(8): 995-1004 (2013); Li et al., Cancer Research 58: 2404-2409 (1998)).

El «índice de hidropatía» de una proteína o secuencia de aminoácidos es un número que representa sus propiedades hidrofílicas o hidrofóbicas promedio. Un índice de hidropatía negativo define la hidrofilicidad de la secuencia de aminoácidos de interés. El índice de hidropatía es directamente proporcional a la hidrofilicidad de la secuencia de aminoácidos de interés; por lo tanto, cuanto más negativo sea el índice, mayor será su hidrofilicidad. En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos hidrófilos añadida descrita anteriormente tiene un índice de hidropatía inferior a 0, -0.4, -0.9, -1.3, -1.6, -3.5, -3.9 o -4.5. En ciertas realizaciones, el péptido resultante tendrá un índice de hidropatía inferior a 0.7, 0.3, 0.2, 0.1 o 0.0, preferiblemente inferior a -0.1, -0.2, -0.3 o -0.4, más preferiblemente inferior a -0.5, -0.6, -0.7, -0.8, -0.9 o -1.0.

En los péptidos de la presente invención, los aminoácidos que contribuyen a un índice de hidropatía hidrofílica, ya sea para el péptido en su conjunto o para la secuencia de aminoácidos hidrofílica añadida, incluyen Arg (R), Lys (K), Asp (D), Glu (E), Gln (Q), Asn (N), His (H), Ser (S), Thr (T), Gly (G), Pro (P), Tyr (Y) y Trp (W). De estos, se prefieren Asp (D), Glu (E), Gln (Q), Asn (N) o sus variantes. Ejemplos de variantes incluyen g-glutamato para Glu y ácido isoaspártico (o isoD) para Asp.

Tal como se utiliza en este documento, en este y otros aspectos de la invención, el término "aminoácido hidrofóbico" se refiere a un aminoácido que contribuye a la hidrofobicidad del índice de hidropatía de una secuencia de aminoácidos designada. Los aminoácidos que contribuyen a un índice de hidropatía hidrofóbica, ya sea para el péptido en su conjunto o para una secuencia de aminoácidos específica del mismo, incluyen Ile (I), Val (V), Leu (L), Phe (F), Cys (C), Met (M) y Ala (A). En ciertas realizaciones, el término "aminoácido hidrofóbico" puede referirse a cualquiera de los siguientes: Ile (I), Val (V), Leu (L), Phe (F), Cys (C), Met (M) y Ala (A); o, alternativamente, a cualquiera de los siguientes: Ile (I), Val (V), Leu (L), Phe (F) y Ala (A). En otras realizaciones, el término "aminoácido hidrofóbico" puede referirse a uno de Ile (I), Val (V), Leu (L) y Phe (F).

Como se usa en el presente documento, el término "aminoácido no hidrofóbico" se refiere a un aminoácido hidrofílico (o no hidrofóbico) en una de las escalas de hidrofobicidad mencionadas anteriormente. Este término generalmente se refiere a los aminoácidos que contribuyen a un índice de hidropatía hidrofílica, ya sea para el péptido en su conjunto o para la secuencia de aminoácidos hidrofílica añadida.

En un aspecto de la invención, el péptido incluye la secuencia de aminoácidos de:

(i) L-X-X-L-L-L-X-(F/L)-(I/L)-X-X-X-L (SEQ ID NO: 2)

donde X en la posición 2 se selecciona de Glu (E), Y-glutamato, Asp (D), e isoD, X en posición 3 es opcional y, cuando está presente, es Gln (Q); y cada X en las posiciones 7,10,11 y 12 se selecciona independientemente de Met (M), Ala (A), Glu (E), y Y-glutamato.

En un aspecto relacionado de la invención, el péptido incluye la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 (mostrada arriba), donde el péptido está libre de cisteína o libre de cisteína y metionina; X en la posición 3 es opcional y, cuando está presente, es Gln (Q); y cada X en las posiciones 7, 10, 11 y 12 se selecciona independientemente de Met (M), Ala (A), Glu (E), y Y-glutamato.

De acuerdo con una realización, X en la posición 3 no está presente (es decir, el espacio entre el primer aminoácido hidrofóbico y el primer triplete de aminoácidos hidrofóbicos se reduce de dos a un residuo de aminoácido. En esta realización, se contempla que estos péptidos excluyan únicamente el aminoácido en la posición 3.

En una realización alternativa, X en la posición 3 está presente (es decir, el espacio entre los aminoácidos hidrofóbicos se mantiene en dos residuos de aminoácidos).

El péptido tiene una longitud de 12 a 50 aminoácidos.

X en las posición 2 se selecciona de Glu (E), Y-glutamato, Asp (D), e isoD y X en la posición 3 (cuando está presente) es Gln (Q).

X en las posiciones 7, 10, 11 y 12 se selecciona independiente de Ala (A), Met (M), Glu (E) y Y-glutamato.

En esta realización, el péptido aislado es estable al disolverse en agua; resistente a la degradación química en condiciones acuosas en presencia de un tampón de pH y un biocida, como se describió anteriormente; y/o tiene una solubilidad en una solución acuosa de al menos aproximadamente 1.0 mg/ml.

Un conjunto de péptidos, de acuerdo con el primer aspecto de la invención, tiene la secuencia de aminoácidos:

(Q/E)-(Q/E)-(L/I/V/F)-X-X-(L/I/V/F)-(L/I/V/F)-(L/I/V/F)-X-(L/I/V/F)-(L/I/V/F)-X-X-X-(L/I/V/F)-(D/G/Q/E)-(D/G/Q/E), (SEQ ID NO: 3), donde X en la posición 4 se selecciona de Glu (E), Y-glutamato, Asp (D), e isoD, X en la posición 5 es opcional y, cuando está presente, Gln (Q); y cada X en las posiciones 9, 12, 13 y 14 se selecciona independientemente de Met (M), Ala (A), Glu (E), y Y-glutamato. En una realización, X en la posición 5 está presente. En otra realización, X en la posición 5 no está presente.

X en la posición 4 se selecciona de Glu (E), Y-glutamato, Asp (D), e isoD y X en la posición 5 (cuando está presente) es Gln (Q).

X en las posiciones 9 y 12 a 14 se selecciona independiente de Ala (A), Met (M), Glu (E) y Y-glutamato.

En ciertas realizaciones, estos péptidos también reúnen las características estructurales que definen los péptidos de la SEQ ID NO: 1, en cuyo caso los residuos de metionina y cisteína no están presentes.

Otro conjunto de péptidos, de acuerdo con el primer aspecto de la invención, tiene la secuencia de aminoácidos de:

(L/I/V/F)-X-X-(L/I/V/F)-(L/I/V/F)-(L/I/V/F)-X-(L/I/V/F)-(L/I/V/F)-X-X-X-(L/I/V/F)-(D/G/Q/E)-(D/G/Q/E), (SEQ ID NO: 4), donde X en la posición 2 se selecciona de Glu (E), Y-glutamato, Asp (D), e isoD, X en la posición 3 es opcional y, cuando está presente es Gln (Q); y cada X en las posiciones 7, 10, 11 y 12 se selecciona independientemente de Met (M), Ala (A), Glu (E), y Y-glutamato. En una realización, X en la posición 3 está presente. En otra realización, X en la posición 3 no está presente.

X en la posición 2 se selecciona de Glu (E), Y-glutamato, Asp (D), e isoD y X en la posición 3 (cuando está presente) es Gln (Q).

Un conjunto adicional de péptidos, de acuerdo con el primer aspecto de la invención, tiene la secuencia de aminoácidos de:

(Q/E)-(Q/E)-(L/I/V/F)-X-X-(L/I/V/F)-(L/I/V/F)-(L/I/V/F)-X-(L/I/V/F)-(L/I/V/F)-X-X-X-(L/I/V/F), (SEQ ID NO: 5), donde X en la posición 4 se selecciona de Glu (E), Y-glutamato, Asp (D), e isoD, X en la posición 5 es opcional y, cuando está presente es Gln (Q); y cada X en las posiciones 9, 12, 13 y 14 se selecciona independientemente de Met (M), Ala (A), Glu (E), y Y-glutamato. En una realización, X en la posición 5 está presente. En otra realización, X en la posición 5 no está presente.

También se divulga un péptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de

J-X-X-J-J-J-X-J-J-X-X-X-J (SEQ ID NO: 6)

donde X en la posición 3 es opcional y, cuando está presente, es cualquier aminoácido; y cada X en las posiciones 2, 7, 10, 11 y 12 es cualquier aminoácido. De uno a tres de los residuos J en las posiciones 1, 4, 5, 6, 8, 9 y 13 son un aminoácido no hidrofóbico o A, y todos los demás residuos J son L, I, V o F, y el péptido induce una respuesta activa de la planta, pero no una respuesta de hipersensibilidad, al aplicarse al tejido de la planta. Estas respuestas activas de las plantas proporcionan uno o más de los siguientes atributos: señalización bioquímica modificada; crecimiento mejorado; resistencia a patógenos; y/o resistencia al estrés biótico o abiótico.

En las realizaciones descritas anteriormente, donde X en las posiciones 2, 3 (cuando esté presente), 7, 10, 11 y 12 de la SEQ ID NO: 6 puede ser cualquier aminoácido, en ciertas realizaciones estos residuos son hidrófilos. Como se describió anteriormente, estos aminoácidos hidrófilos incluyen Arg (R), Lys (K), Asp (D), Glu (E), Gln (Q), Asn (N), His (H), Ser (S), Thr (T), Gly (G), Pro (P), Tyr (Y) y Trp (W). De estos, se prefieren Asp (D), Glu (E), Gln (Q), Asn (N) o sus variantes. Las variantes ejemplares incluyen g-glutamato para Glu y ácido isoaspártico (o isoD) para Asp.

En ciertas realizaciones, X en las posiciones 2 y 3 (cuando está presente) se selecciona independientemente de Asp (D), Glu (E) y Gln (Q).

En ciertas realizaciones, X en las posiciones 7, 10, 11 y 12 se selecciona independientemente de Ala (A), Met (M), Gly (G), Ser (S) y Glu (E).

En la Tabla 1 y la Tabla 2 a continuación, se identifican péptidos ejemplares que cumplen con la estructura consenso de una o más de las SEQ ID NO: 1 a 6:

Tabla 1: Variantes peptídicas del péptido P5/P5A (SEQ ID NOS 8 y 9)

Nombre del Péptido Secuencia SEQ ID NO:

tipo silvestre SAGSEQQLDQLLAMFIMMMLQQ7

P5SAGSEQQLDLLLMFIMMMLQQ 8

P5ASAGSEQQLDQLLLMFIMMMLQQ9

P5-2SAGSEQQLDLLLMFIAAALQQ 10

P5-3SAGSEQQLDLLLAFIAAALQQ 11

P5-4SAGSEQQLELLLAFIAAALQQ 12

P5-7SEEEEELDLLLAFIAAAL13

P5-8SEEEEELDLLLAFIAAALQQ14

P5-9LDLLLAFIAAALEE ASEE15

P5-10L D L L L A F IE E E L E EEE 16

P5-11SEEELDLLLAFIAAALEE17

P5-12S E E E L D L L L A FIE E E L E E18

P5-13SEEELDLLLAFIAAALDD19

P5-14SEEEEELDLLLAFIAAALGG 20

P5-1000SEEEEEEELDLLLAFIAAALAA 21

P5-1001SEEEEEELDLLLAFIAAALSS 22

P5-1002SAGSEQQLDLLLGFIGGGLQQ23

P5-1003SA G SEQ Q LD LLLSFISSSLQ Q24

P5-15SEEEEELDLLLAFIAAALQ25

P5-16SEEEEELDLLLAFIAAALS26

P5-17SEEEEELDLLLAFIAAALA27

P5-18SEEEEELDLLLAFIAAALE28

P5-19SE L E LLLA FIA A A LEEEEE 29

P5-22SEEELELLLA FIA A A LEEEE30

P5-1004SE L E L L LA FIA A A LEEEEE31

P5-1005SEEEEELDLLLALIAAALQQ32

P5-21SEEQLELLLAFIAAALQQEE33

P5-26SEEQLDLLLAFIAAALQEE34

P5-1006SE L E L L L A F IE E E L E E35

P5-20S E L E L L L E F IE E E L E E36

P5-1007S E L E L L L E F IE E E L E37

P5-1008S E L E L L L E L IE E E L E38

P5-48SEEQ LD LLLEFIEEELQ Q EE39

P5-1009SELD LLLA FID D D LEEEEE 40

P5-29SEEELDLLLMFIMMMLEE42

P5-31SEEEQLDLLLMFIMMMLEE43

P5-33SEEEQLDLLLMFIMMMLQEE44

P5-47SEEQLDLLLMFIMMMLQQEE45

P5-1010L E L L L E F IE E E L E46

P5-1011L E L L L E F IE E E L E E47

P5-1012S E L E L L L E F IE E E L48

Variante de P5A LDQLLLMFIMMMLQQ49

P5-23SEEEEELDQLLLAFIAAALQQ50

P5-24SEEEEELDQLLLAFIAAAL51

P5-25SEEEEQLDQLLLAFIAAALQQ52

P5-27SEEQLDQLLLAFIAAALQEE53

P5-28SEEQLDQLLLAFIAAALEE54

P5-30SEEELDQLLLMFIMMMLEE55

P5-32SEEEQLDQLLLMFIMMMLEE56P5-34 SEEEQLDQLLLMFIMMMLQEE 57 P5-46 SAEQLDQLLLMFIMMMLQQAE 58 Variante de P5 A M por A LD Q LLLAFIAAALQQ 59 Variante de P5 A M por E L D Q L L L E F IE E E L Q Q 60 Variante de P5A QLDQLLLMFIMMMLQQ 61 Vanante de P5 A M por A QLDQLLLAFIAAALQQ 62 Variante de P5 A M por E Q L D Q L L L E F IE E E L Q Q 63 Variante de P5 A QQLDQLLLMFIMMMLQQ 64 Variante de P5AM por A QQLDQLLLAFIAAALQQ 65 Variante de P5 A M por E Q Q L D Q L L L E F IE E E L Q Q 66 Variante de P5 A LDQLLLMFIMMML 67 Variante de P5AM por A L D Q L LLA FIA A A L 68 Variante de P5 A M por E L D Q L L L E F IE E E L 69 Variante de P5 A Q por E s a g s e e e l d q l l l m f i m m m l .e e 70 Variante de P5 Q por E SAGSEEELDLLLMFIMMMLEE 41 Mutante 8E de P5 P5-35 SAGSEQQEDLLLMFIMMMLQQ 71 Mutante 10E de P5 P5-36 SAGSEQQLDELLMFIMMMLQQ 72 Mutante 11E de P5 P5-37 SAGSEQQLDLELMFIMMMLQQ 73 Mutante 12E de P5 P5-38 SAGSEQQLDLLEMFIMMMLQQ 74 Mutante 13E de P5 P5-39 SAGSEQQLDLLLEFIMMMLQQ 75 Mutante 14E de P5 P5-40 SAGSEQQLDLLLMEIMMMLQQ 76 Mutante 15E de P5 P5-41 SAGSEQQLDLLLMFEMMMLQQ 77 Mutante 16E de P5 P5-42 SAGSEQQLDLLLMFIEMMLQQ 78 Mutante 17E de P5 P5-43 SAGSEQQLDLLLMFIMEMLQQ 79 Mutante 18E de P5 P5-44 SAGSEQQLDLLLMFIMMELQQ 80 Mutante 19E de P5 P5-45 SAGSEQQLDLLLMFIMMMEQQ 81 Mutante 9K de P5 SAGSEQQLKLLLMFIMMMLQQ 82 Mutante SS de P5 SAGSESSLDLLLMFIMMMLQQ 83 Mutante SS de P5 SAGSEQQLDLLLMFIMMMLSS 84 Mutante GG de P5 SAGSEGGLDLLLMFIMMMLQQ 85 Mutante GG de P5 SAGSEQQLDLLLMFIMMMLGG 86 Mutante sencillo 8V de P5 SAGSEQQVDLLLMFIMMMLQQ 87 Mutante sencillo 10V de P5 SAGSEQQLDVLLMFIMMMLQQ 88 Mutante sencillo 11V de P5 SAGSEQQLDLVLMFIMMMLQQ 89 Mutante sencillo 12V de P5 SAGSEQQLDLLVMFIMMMLQQ 90 Mutante sencillo 13V de P5 SAGSEQQLDLLLVFIMMMLQQ 91 Mutante sencillo 14V de P5 SAGSEQQLDLLLMVIMMMLQQ 92 Mutante sencillo 15V de P5 SAGSEQQLDLLLMFVMMMLQQ 93 Mutante sencillo 16V de P5 SAGSEQQLDLLLMFIVMMLQQ 94 Mutante sencillo 17V de P5 SAGSEQQLDLLLMFIMVMLQQ 95 Mutante sencillo 18V de P5 SAGSEQQLDLLLMFIMMVLQQ 96 Mutante sencillo 19V de P5 SAGSEQQLDLLLMFIMMMVQQ 97 Mutante sencillo 8E de P5 A, P5-53 SAGSEQQEDQLLLM FIMMMLQQ 98 Mutante sencillo 11E de P5 A, P5-54 SAGSEQQLDQELLMFIMMMLQQ 99 Mutante sencillo 12E de P5A SAGSEQQLDQLELMFIMMMLQQ 100 Mutante sencillo 13E de P5A SAGSEQQLDQLLEMEIMMMLQQ 101 Mutante sencillo 14E de P5 A SAGSEQQLDQLLLEFIMMMLQQ 102 Mutante sencillo 15E de P5A SAGSEQQLDQLLLMEIMMMLQQ 103 Mutante sencillo 16E de P5A SAGSEQQLDQLLLMFEMMMLQQ 104 Mutante sencillo 17E de P5 A SAGSEQQLDQLLLMFIEMMLQQ 105 Mutante sencillo 18E de P5 A SAGSEQQLDQLLLMFIMEMLQQ 106 Mutante sencillo 19E de P5 A SAGSEQQLDQLLLMFIMMELQQ 107M uta n te se n c illo 20E de P 5 ASAGSEQQLDQLLLMFIMMMEQQ108M uta n te se n c illo 9K de P5 ASAGSEQQLKQLLLMFIMMMLQQ109M uta n te se n c illo 10E de P5 ASAGSEQQLDELLLMFIMMMLQQ110M uta n te se n c illo 10S de P 5 ASAGSEQQLDSLLLMFIMMMLQQ111M uta n te se n c illo 10 A d e P5 ASAGSEQQLDALLLMFIMMMLQQ112M uta n te S S d e P5 ASAGSESSLDQLLLMFIMMMLQQ113M uta n te S S de P5 ASAGSEQQLDQLLLMFIMMMLSS114<M uta n te G G de P5 A>SAGSEGGLDQLLLMFIMMMLQQ115<M uta n te G G de P5 A>SAGSEQQLDQLLLMFIMMMLGG116M uta n te se n c illo 8V de P5 ASAGSEQQVDQLLLMFIMMMLQQ117M uta n te se n c illo 11V de P5 ASAGSEQQLDQVLLMFIMMMLQQ118M uta n te se n c illo 12V de P 5 ASAGSEQQLDQLVLMFIMMMLQQ119M uta n te se n c illo 13V de P5 ASAGSEQQLDQLLVMFIMMMLQQ120M uta n te se n c illo 14V de P5 ASAGSEQQLDQLLLVFIMMMLQQ121<M uta n te se n c illo 15V de P5 A>SAGSEQQLDQLLLMVIMMMLQQ122M uta n te se n c illo 16V de P5 ASAGSEQQLDQLLLMFVMMMLQQ123<M uta n te se n c illo 17V de P5 A>SAGSEQQLDQLLLMFIVMMLQQ124<M uta n te se n c illo 18V de P5 A>SAGSEQQLDQLLLMFIMVMLQQ125M uta n te se n c illo 19V de P5 ASAGSEQQLDQLLLMFIMMVLQQ126<M uta n te se n c illo 20 V de P5 A>SAGSEQQLDQLLLMFIMMMVQQ127 P5-1013SAGSEQQLDQLLLMFIMMML128 P5-1014QQLDQLLLMFIMMML129 P5-55SAGSEQ Q LD Q LLLA FIA A A LQ Q130 P5-1015SA G S E Q Q L D Q L L L E F IE E E L Q Q131 P5-1016QQLDLLLMFIMMMLQQ132 P5-1017LDLLLMFIMMMLQQ133 P5-1018SAGSEQQLDLLLMFIMMML134 P5-1019QQLDLLLMFIIMMML135 P5-1020LDLLLMFIMMML136 P5-1021S A G S E Q Q L D L L L E F IE E E L Q Q137S eq. e s c ln d lb le de e tiq u e taHHHHHHRQQLDLLLAFIAAALQQ138 P5-5Q LEL L L A FIA A A L Q Q139 P5-6SA G SEQ Q L D L L L A FIA A A L140 P5-49SA G SEQ Q ED LLLA FIA A A LQ Q510 P5-50SA G SEQ Q LD ELLA FIA A A LQ Q511 P5-51SA G SEQ Q ED ELLA FIA A A LQ Q512 P5-52SAGSEQQEDELLMFIMMMLQQ513 P5-56 SEEQEE L L L A F IA A A L Q QEE 514 P5-57 SEEQEE<E>L L A F IA A A L Q QEE 515 P5-58 SEEQEE E L L A F IA A A L Q QEE 516 P5-59, P5-RSAGSEQQLDLLLMFIMMMLQQR517 P5-60, P5-21-RS E E Q L E L L L A F IA A A L Q Q E E R518 P5-61SA G SE Q Q E D L L L A FIA L Q Q519 P5-62SA G SE Q Q L D E L L A FIA L Q Q520 P5-63S A G S E Q Q L D L L L E F IA L Q Q521 P5-64SA G SE Q Q LD LLLA EIA LQ Q522 P5-65S A G S E Q Q L D L L L A FIE A L Q Q523 P5-66SA G SEQ Q LD LLLA FIA EA LQ Q524 P5-67SA G SEQ Q LD LLLA FIEA A LQ Q525 P5-68SA G SEQ Q LD LLLA FIA A ELQ Q526 P5-69SAG SEQ Q LD LLLA EIA A A LQ Q527 P5-70SAGSEQQLDLLLE FIAAALQQ528P5-71 SAGSEQQEDLLLAFIAAALQQ 529 P5-72 SAGSEQQLDELLAFIAAALQQ 530 P5-73 SQAGSEQLDLLLMFIMMMLQQ 531 P5-74 AEQGSSQLDLLLMFIMMMLQQ 532 P5-75 NQGISEKQQLDLLLMFIMMMLQQ 533 P5-76 NQGISEKQQLDLLLAFIAAALQQ 534

NFGTPDSTVQNPQDASKPNQLDLLLMF 535 P5-77 IMMMLQQ

NFGTPDS TVQNPQDASKPNQLDLLLAF 536 P5-78 IAAALQQ

ITPDGQGGGQIGDNPQLDLLLMFIMMM 537 P5-79 LQQ

ITPDGQGGGQIGDNPQLDLLLAFIAAA 538 P5-80 LQQ

P5-87 5FFQLDLLLAFIAAALQQEE 539 P5-88 SFEQLELLLAFIAAALQEE 540 P5-89 SAGSEEELDLLLMFIMMMLQQ 541 P5-90 SAGSEQQLDLLLMFIMMMLEE 542 P5-91 SFFQQLDLLLMFIMMMLQQEE 543 P5-92 SFFFFQLDQLLLAFIAAALQQR 544 P5-1022 QLEQLLAFIAAALQQ 545 P5-1023 QLDLLLAFIAAALQQ 546

Los péptidos seleccionados en la Tabla 1 incluyen marcadores de solubilidad del extremo terminal N o C, indicados en cursiva, como SEEEEEEE, SEEEEEE, SEEEEE, SEEEE, SEEE, SEE, EE, EE y EEE. También se incluyen en este documento los péptidos que comprenden las secuencias mostradas en la Tabla 1, pero que carecen de estos marcadores de solubilidad específicos (o que tienen un marcador de solubilidad diferente).

Tabla 2: Variantes peptídicas del péptido P5/P5A (SEQ ID NOS: 8 y 9)

Variantes principales de P5/P5A/principales SEQ ID NO

LDLLLMFIMMML 136

LDQLLLMFIMMML 67

LDLLL(A/E)FIMMML 141

LDLLLMFI(A/E)MML 142

LDLLLMFIM(A/E)ML 143

LDLLLMFIMM(A/E)L 144

LDLLL (A/E) FI (A/E )MML 145

LDLLL (A/E) FIM (A/E)ML 146

LDLLL (A/E) FIMM (A/E) L 147

LDLLLMFI(A/E)(A/E)ML 148

LDLLLMFI(A/E)M(A/E)L 149

LDLLLMFIM(A/E)(A/E)L 150

LDLLLMFI(A/E)(A/E) (A/E) L 151

LDLLL(A/E)FIM(A/E)(A/E) L 152

LDLLL (A/E) FI (A/E) M (A/E) L 153

LDLLL(A/E)FI(A/E)(A/E)ML 154

LDLLL (A/E) FI (A/E) (A/E) (A/E) L 155

LDQLLL(A/E)FIMMML 156

05En ciertas realizaciones, el péptido incluye una o más mutaciones relativas a la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre correspondiente de SAGSEQQLDQLLAMFIMMMLQQ (SEQ ID NO: 7), que corresponde a los residuos de aminoácidos 33-54 de la proteína HreX deXanthomonas campestris pv. pelargonii(véase la patente de los Estados Unidos n.° 6,960,705). Estas una o más mutaciones incluyen, además del truncamiento de la proteína HreX de 114 aa de longitud completa en su extremo terminal N y extremo terminal C, una o más supresiones o sustituciones con respecto a la SEQ ID NO: 7. En ciertas realizaciones, la una o más mutaciones mejoran la solubilidad en solución acuosa, la estabilidad y/o la resistencia a la degradación química del péptido aislado con respecto a un polipéptido que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre correspondiente de la SEQ ID NO: 7. En esta realización, el péptido aislado es estable cuando se disuelve en agua; resistente a la degradación química en condiciones acuosas en presencia de un tampón de pH y un biocida, como se describió anteriormente; y/o tiene una solubilidad en una solución acuosa de al menos aproximadamente 1.0 mg/ml. En realizaciones alternativas, la una o más mutaciones alteran la secuencia de uno o más residuos hidrofóbicos y, por lo tanto, alteran la actividad del péptido. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los péptidos ya no inducirán una respuesta de hipersensibilidad, pero sí inducirán otras respuestas activas en la planta, incluidas las descritas en este documento.

Los péptidos aislados de la invención también pueden presentarse en forma de un péptido de fusión que incluye, además, una segunda secuencia de aminoácidos acoplada a los péptidos de la invención mediante un enlace peptídico. La segunda secuencia de aminoácidos puede ser un marcador de purificación, como polihistidina (His6-), una glutatión-S-transferasa (GST-) o una proteína de unión a maltosa (MBP-), que facilita la purificación, pero que puede eliminarse posteriormente, es decir, escindirse del péptido tras su recuperación. Se pueden introducir sitios de escisión específicos de la proteasa o sitios de escisión específicos de un producto químico (es decir, en una secuencia enlazadora escindible) entre el marcador de purificación y el péptido deseado. Los sitios de escisión específicos de la proteasa son bien conocidos en la literatura e incluyen, sin limitación, el sitio de escisión específico de la enteroquinasa (Asp)<4>-Lys (SEQ ID NO: 547), que se escinde después de la lisina; el sitio de escisión específico del factor Xa Ile-(Glu o Asp)-Gly-Arg (SEQ ID NO: 548), que se escinde después de la arginina; el sitio de escisión específico de la tripsina, que se escinde después de Lys y Arg; y el sitio de escisión específico de Genenase™ I Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr (SEQ ID NO: 549). Los productos químicos y sus sitios de escisión específicos incluyen, sin limitación, bromuro de cianógeno (CNBr), que se escinde en residuos de metionina (Met); BNPS-escatol, que se escinde en residuos de triptófano (Trp); ácido fórmico, que escinde en los enlaces peptídicos ácido aspártico-prolina (Asp-Pro); hidroxilamina, que escinde en los enlaces peptídicos asparagina-glicina (Asn-Gly); y ácido 2-nitro-5-tiocianobenzoico (NTCB), que escinde en los residuos de cisteína (Cys) (véase Crimmins et al., “Chemical Cleavage of Proteins in Solution”, Curr. Protocol. Protein Sci., Capítulo 11: Unidad 11.4 (2005)). Para utilizar uno de estos métodos de escisión, puede ser necesario eliminar los sitios de escisión no deseados de las secuencias peptídicas deseadas mediante mutación. Por ejemplo, P5-3 es una secuencia mutante derivada de P5 con los residuos de metionina mutados por alanina. Los péptidos que comprenden esta secuencia pueden producirse mediante la escisión, mediada por bromuro de cianógeno, de una secuencia repetida en tándem de P5-3 separada por residuos de metionina.

Los péptidos aislados de la invención también pueden presentarse en forma de un péptido de fusión que incluye múltiples secuencias peptídicas de la presente invención unidas entre sí por una secuencia enlazadora, que puede o no adoptar la forma de una secuencia de aminoácidos escindible del tipo descrito anteriormente. Dichas proteínas de fusión multiméricas pueden o no incluir marcadores de purificación. En una realización, cada secuencia monomérica puede incluir un marcador de purificación unido a un péptido de la invención mediante una primera secuencia peptídica escindible; y las diversas secuencias monoméricas pueden unirse a secuencias monoméricas adyacentes mediante una segunda secuencia peptídica escindible. En consecuencia, tras la expresión de la proteína de fusión multimérica, es decir, en una célula huésped, la proteína de fusión recuperada puede tratarse con una proteasa o una sustancia química eficaz para escindir la segunda secuencia peptídica escindible, liberando así las secuencias peptídicas monoméricas individuales que contienen marcadores de purificación. Tras la purificación por afinidad, las secuencias peptídicas monoméricas recuperadas pueden tratarse con una proteasa o una sustancia química eficaz para escindir la primera secuencia peptídica escindible y, por lo tanto, liberar el marcador de purificación del péptido de interés. Esta última puede purificarse aún más mediante filtración en gel y/o HPLC, como se describe más adelante.

De acuerdo con un enfoque, los péptidos de la presente invención pueden sintetizarse mediante operaciones estándar de síntesis de péptidos. Estas incluyen protocolos de síntesis de FMOC (9-fluorenilmetiloxicarbonilo) y tBoc (terc-butiloxicarbonilo), que pueden llevarse a cabo en instrumentos automatizados de síntesis de péptidos en fase sólida, incluyendo, sin limitación, los sintetizadores Applied Biosystems 431A, 433A y los sintetizadores de péptidos en fase sólida automatizados Peptide Technologies Symphony o Sonata a gran escala o CEM Liberty. También se contempla el uso de instrumentos alternativos de síntesis de péptidos. Los péptidos preparados mediante síntesis en fase sólida se recuperan en una forma sustancialmente pura.

Los péptidos de la presente invención también pueden prepararse mediante sistemas de expresión recombinantes, seguidos de la separación y purificación de los péptidos preparados de forma recombinante. Generalmente, esto implica la inserción de una molécula de ácido nucleico codificante en un sistema de expresión al que la molécula es heteróloga (es decir, no está presente normalmente). Se pueden insertar en el vector una o más moléculas de ácido nucleico deseadas que codifican un péptido de la invención. La molécula de ácido nucleico heteróloga se inserta en el sistema de expresión o vector en la orientación correcta (5A 3 ') y con el marco de lectura correcto respecto al promotor y a cualquier otra molécula reguladora 5' y 3'.

Las secuencias de nucleótidos representativas para la expresión en bacterias y plantas hospederas representativas se incluyen en la Tabla 3 a continuación:

Tabla 3

Péptido & Secuencia de Nucleótidos SEQ ID Hospedero Optimizado NO:

P5 enE. co liAGCGCAGGTAGCGAACAGCAGCTGGATCTGCTGCTGA 506

T GTTTAT TAT GATGAT GCTGCAGCAG

P5-21 enE. co liAGCGAAGAACAGCTGGAACTGCTGCTGGCATTTATTG 507

CAGCAGCACTGCAGCAGGAAGAA

P5 enZea m aysTCCGCCGGCTCCGAGCAGCAGCTGGACCTGCTGCTGA 508

TGT TCAT CAT GAT GATGCTGCAGCAG

P5-21 enZ ea m aysTCCGAGGAGCAGCTGGAGCTGCTGCTGGCCTTCATCG 509

CCGCCGCCCTGCAGCAGGAGGAG

Conociendo la secuencia de aminoácidos codificada que se lista en el presente documento y el organismo transgénico deseado, se pueden generar secuencias de ADN y ARN adicionales con codones optimizados con solo el uso de habilidades rutinarias.

La expresión (incluyendo la transcripción y la traducción) de un péptido o polipéptido de fusión de la invención por la construcción de ADN puede regularse con respecto al nivel de expresión, el o los tipos de tejido donde se expresa y/o la etapa de desarrollo de la expresión. Existen diversas secuencias reguladoras heterólogas (por ejemplo, promotores y potenciadores) para controlar la expresión de la construcción de ADN en plantas. Estas incluyen promotores constitutivos, inducibles y regulables, así como promotores y potenciadores que controlan la expresión de forma específica para cada tejido o tiempo. Los promotores constitutivos ejemplares incluyen el promotor E4 de frambuesa (patentes de los Estados Unidos n.° 5,783,393 y 5,783,394), el promotor de la nopalina sintasa (NOS) (Ebert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE. UU.) 84: 5745-5749 (1987)), el promotor de la octopina sintasa (OCS) (que se encuentra en plásmidos inductores de tumores deAgrobacterium tumefaciens),los promotores de caulimovirus, como el promotor 19S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) (Lawton et al., Plant Mol. Biol. 9: 315-324 (1987)) y el promotor 35S de CaMV (Odell et al., Nature 313: 810 812 (1985)), el promotor 35S del virus del mosaico de la escrofularia (patente de los Estados Unidos n.° 5,378,619), el promotor inducible por luz de la subunidad pequeña de la ribulosa-1,5-bis-fosfato carboxilasa (ssRUBISCO), el promotor Adh (Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE. UU.) 84: 6624-6628 (1987)), el promotor de la sacarosa sintasa (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.uU.)87: 4144-4148 (1990)), el promotor del complejo del gen R (Chandler et al., Plant Cell 1: 1175-1183 (1989)), el promotor del gen de la proteína de unión a la clorofila a/b, el promotor CsVMV (Verdaguer et al., Plant Mol Biol., 37: 1055-1067 (1998)) y el promotor de actina de melón (publicación PCT n.° WO00/56863). Entre los promotores específicos de tejido que se pueden citar a modo de ejemplo se incluyen los promotores E4 y E8 del tomate (Patente de los Estados Unidos n.° 5,859,330) y el promotor del gen 2AII del tomate (Van Haaren et al., Plant Mol Bio., 21: 625-640 (1993)).

En una realización preferida, la expresión de la construcción de ADN está controlada por secuencias reguladoras de genes cuya expresión está asociada con el desarrollo temprano de las semillas y/o embriones. De hecho, en una realización preferida, el promotor utilizado es un promotor mejorado por las semillas. Los ejemplos de dichos promotores incluyen las regiones reguladoras 5' de genes como la napina (Kridl et al., Seed Sci. Res. 1: 209: 219 (19), la globulina (Belanger y Kriz, Genet. 129: 863-872 (1991), GenBank acceso n.° L22295), la gamma zeína Z 27 (Lopes et al., Mol Gen Genet. 247: 603-613 (1995)), el promotor de oleosina L3 (patente de los Estados Unidos n.° 6,433,252), la faseolina (Bustos et al., Plant Cell 1(9): 839-853 (1989)), arcelina5 (publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos n.° 2003/0046727), un promotor 7S de soja, un promotor 7Sa (publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos n.° 2003/0093828), el promotor de conglicinina 7Sap de soja, un promotor 7Sa (Beachy et al., EMBO J. 4: 3047 (1985); Schuler et al., Nucleic Acid Res. 10(24): 8225-8244 (1982)), inhibidor de tripsina de soja (Riggs et al., Plant Cell 1(6): 609 621 (1989)), ACP (Baerson et al., Plant Mol. Biol., 22(2): 255-267 (1993)), estearoil-ACP desaturasa (Slocombe et al., Plant Physiol. 104(4): 167-176 (1994)), subunidad a' de la p-conglicinina de soja (Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 8560-8564 (1986)), Vicia faba USP (publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos n.° 2003/229918) y el promotor de oleosina L3 de Zea mays (Hong et al., Plant Mol. Biol., 34(3): 549-555 (1997)).

Las moléculas de ácido nucleico que codifican los péptidos de la presente invención pueden prepararse mediante síntesis en fase sólida utilizando, por ejemplo, el método de la fosforamidita y bloques de construcción de fosforamidita derivados de 2'-desoxinucleósidos protegidos. Para obtener el oligonucleótido deseado, los bloques de construcción se acoplan secuencialmente a la cadena de oligonucleótidos en crecimiento en el orden requerido por la secuencia del producto. Una vez completado el ensamblaje de la cadena, el producto se libera de la fase sólida a la solución, se desprotege, se recoge y, por lo general, se purifica mediante HPLC. Los límites de la síntesis en fase sólida son adecuados para la preparación de oligonucleótidos de hasta aproximadamente 200 nt de longitud, que codifican péptidos de aproximadamente 65 aminoácidos o menos. Los extremos del oligonucleótido sintetizado pueden diseñarse para incluir un sitio de escisión específico para una enzima de restricción que facilite la ligación del oligonucleótido sintetizado a un vector de expresión.

Para péptidos más largos, los oligonucleótidos pueden prepararse mediante síntesis en fase sólida y, posteriormente, las secuencias de oligonucleótidos sintéticos pueden ligarse mediante diversas técnicas. Las técnicas recombinantes para la fabricación de genes sintéticos completos se revisan, por ejemplo, en Hughes et al., “Capítulo Doce - Gene Synthesis: Methods and Applications”, Methods in Enzymology 498: 277-309 (2011).

Los oligonucleótidos sintéticos de la presente invención incluyen tanto ADN como ARN, en sus formas enantioméricas D y L, así como sus derivados (incluidos, sin limitación, polinucleótidos modificados con 2'-fluoro, 2'-amino, 2'O-metilo, 5'-yodo y 5'-bromo). Ácidos nucleicos que contienen nucleótidos modificados (Kubik et al., “ Isolation and Characterization of 2'fluoro-, 2' amino-, and 2'fluoro-amino-modified RNA Ligands or Human IFN-gamma that Inhibit Receptor Binding,” J. Immunol. 159 :259-267 (1997); Pagratis et al., “Potent 2'-amino, and 2'-fluoro-2'-deoxy-ribonucleotide RNA Inhibitors of Keratinocyte Growth Factor,” Nat. Biotechnol. 15: 68-73 (1997), y los ácidos L-nucleicos (algunas veces llamados Spiegelmers®), ácidos L nucleicos enantioméricos por naturales (Klussmann et al., “Mirror-image RNA that Binds D-adenosine,” Nat. Biotechnol.

14: 1112-1115 (1996) y Williams et al., “Bioactive and nuclease-resistant L-DNA Ligand of Vasopressin,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 11285-11290 (1997)), y se utilizan bases no naturales para mejorar la bioestabilidad. Además, la cadena principal de azúcar-fosfato puede sustituirse por una cadena principal peptídica, formando un ácido nucleico peptídico (PNA), se pueden utilizar otros azúcares, tanto naturales como artificiales (por ejemplo, azúcares 2'-desoxirribosa), o fosfotioato o fosfoditioato en lugar de enlaces fosfodiéster. También se contempla el uso de ácidos nucleicos bloqueados (LNA). Estas moléculas de ácido nucleico pueden utilizarse para múltiples propósitos, incluyendo su aplicación a plantas o semillas de plantas como oligonucleótidos desnudos o para la traducciónin vitrode oligonucleótidos codificantes para la producción de los péptidos de la presente invención.

Una vez seleccionado un vector de expresión adecuado, las secuencias de ácido nucleico deseadas se clonan en el vector mediante procedimientos de clonación estándar en la técnica, como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Laboratory, Cold Springs Harbor, NY (1989), o en la patente de los Estados Unidos n.° 4,237,224 de Cohen y Boyer. A continuación, el vector se introduce en un huésped adecuado.

Se pueden utilizar diversos sistemas huésped-vector para expresar de forma recombinante los péptidos de la presente invención. Fundamentalmente, el sistema vectorial debe ser compatible con el huésped utilizado. Los sistemas huésped-vector incluyen, sin limitación, los siguientes: bacterias transformadas con ADN de bacteriófagos, ADN plasmídico o ADN cósmido; microorganismos como levaduras que contienen vectores de levadura; sistemas celulares de mamíferos infectados con virus (por ejemplo, virus vaccinia, adenovirus, etc.); sistemas celulares de insectos infectados con virus (por ejemplo, baculovirus); y células de plantas infectadas con Agrobacterium. Los elementos de expresión de estos vectores varían en potencia y especificidad. Dependiendo del sistema huésped-vector utilizado, se puede utilizar cualquiera de los diversos elementos de transcripción y traducción adecuados para llevar a cabo este y otros aspectos de la presente invención.

Los péptidos purificados pueden obtenerse mediante diversos métodos. El péptido se produce preferiblemente en forma purificada (preferiblemente con una pureza de aproximadamente 80 % u 85 %, más preferiblemente con una pureza de aproximadamente 90 % o 95 %) mediante técnicas convencionales. Dependiendo de si la célula huésped recombinante secreta el péptido en un medio de cultivo (véase la patente de los Estados Unidos n.° 6,596,509 de Bauer et al.), el péptido puede aislarse y purificarse mediante centrifugación (para separar los componentes celulares del sobrenadante que contiene el péptido secretado), seguido de la precipitación secuencial del sobrenadante con sulfato de amonio. La fracción que contiene el péptido se somete a filtración en gel en una columna de dextrano o poliacrilamida de tamaño adecuado para separar los péptidos de otras proteínas. Si es necesario, la fracción peptídica puede purificarse aún más mediante HPLC.

Alternativamente, si el péptido de interés no se secreta, puede aislarse de las células recombinantes mediante esquemas estándar de aislamiento y purificación. Esto incluye la disrupción celular (por ejemplo, mediante sonicación, congelación, prensa francesa, etc.) y la posterior recuperación del péptido de los restos celulares.

La purificación puede lograrse mediante los procedimientos de centrifugación, precipitación y purificación descritos anteriormente. El uso de marcadores de purificación, descritos anteriormente, puede simplificar este proceso.

En ciertas realizaciones, no se requiere purificación. Si no se realiza la purificación, se pueden recuperar lisados libres de células tras la centrifugación para eliminar los restos celulares. El lisado libre de células resultante puede tratarse con calor durante el tiempo suficiente para desactivar cualquier proteasa nativa en la fracción recuperada, por ejemplo, 10 minutos a 100 °C. Si se desea, se pueden añadir uno o más agentes biocidas, inhibidores de proteasas y surfactantes no iónicos a dicha preparación libre de células (véase la solicitud de patente de los Estados Unidos n.° 20100043095 de Wei).

Una vez recuperados los péptidos de la presente invención, pueden utilizarse para preparar una composición que incluye un vehículo y uno o más aditivos seleccionados del grupo que consiste en un agente bactericida o biocida, un inhibidor de proteasas, un surfactante no iónico, un fertilizante, un herbicida, un insecticida, un fungicida, un nematicida, inóculos biológicos, fitorreguladores y mezclas de los mismos.

En ciertas realizaciones, las composiciones incluyen más de aproximadamente 1 nM del péptido, más de aproximadamente 10 nM del péptido, más de aproximadamente 20 nM del péptido, más de aproximadamente 30 nM del péptido, más de aproximadamente 40 nM del péptido, más de aproximadamente 50 nM del péptido, más de aproximadamente 60 nM del péptido, más de aproximadamente 70 nM del péptido, más de aproximadamente 80 nM del péptido, más de aproximadamente 90 nM del péptido, más de aproximadamente 100 nM del péptido, más de aproximadamente 150 nM del péptido, más de aproximadamente 200 nM del péptido o más de aproximadamente 250 nM del péptido. En ciertas realizaciones, las composiciones incluyen menos de aproximadamente 1 nM del péptido. Por ejemplo, ciertos péptidos pueden estar presentes en una concentración inferior a aproximadamente 2 ng/ml, inferior a aproximadamente 1.75 ng/ml, inferior a aproximadamente 1.5 ng/ml, inferior a aproximadamente 1.25 ng/ml, inferior a aproximadamente 1.0 ng/ml, inferior a aproximadamente 0.75 ng/ml, inferior a aproximadamente 0.5 ng/ml, inferior a aproximadamente 0.25 ng/ml o incluso inferior a aproximadamente 0.1 ng/ml.

Los vehículos adecuados incluyen agua, soluciones acuosas que contienen opcionalmente uno o más codisolventes, suspensiones y partículas portadoras sólidas. Entre los ejemplos de vehículos sólidos se incluyen tierras minerales como silicatos, geles de sílice, talco, caolines, caliza, tiza, bolo, loess, arcillas, dolomita, tierra de diatomeas, sulfato de calcio, sulfato de magnesio, óxido de magnesio, materiales sintéticos molidos y productos de origen vegetal, como harina de cereales, harina de corteza de árbol, harina de madera y harina de cáscara de nuez, polvos de celulosa, almidones y derivados del almidón, así como otros monosacáridos, disacáridos y polisacáridos.

Entre los fertilizantes adecuados se incluyen, sin limitación, sulfato de amonio, fosfato de amonio, nitrato de amonio, ureas y combinaciones de los mismos.

Los insecticidas adecuados incluyen, sin limitación, miembros de la clase de los neonicotinoides tales como imidicloprid, clotianidina y tiametoxam; miembros de la clase de los organofosfatos tales como clorpirifos y malatión; miembros de la clase de los piretroides tales como permetrina; otros insecticidas naturales tales como nicotina, nornicotina y piretrinas; miembros de la clase de los carbamatos tales como aldicarb, carbofurano y carbarilo; miembros de la clase de las lactonas macrocíclicas tales como varios productos de abamectina, avermectina e ivermectina; miembros de la clase de las diamidas tales como clorantraniliprol, ciantraniliprol y flubendiamida; inhibidores de la síntesis de quitina, particularmente aquellos de la clase de las benzoilureas tales como lufenurón y diflubenzurón; y cualquier combinación de los mismos, incluyendo combinaciones de dos o más, tres o más, o cuatro o más insecticidas. Se enumeran insecticidas adicionales en el Compendio de Nombres Comunes de Pesticidas, una base de datos operada por Alan Wood y disponible en formato electrónico en el sitio web alanwood.net.

Los fungicidas adecuados incluyen, sin limitación, miembros de la clase de las estrobilurinas, tales como azoxistrobina, piraclostrobina, trifloxistrobina, picoxistrobina y fluoxastrobina; miembros de la clase de los triazoles, como ipconazol, metconazol, tebuconazol, triticonazol, tetraconazol, difenoconazol, flutriafol, propiconazol y protioconazol; miembros de la clase de las succinato deshidrogenasas, tales como carboxina, fluxapiroxad, boscalida y sedaxano; miembros de la clase de las fenilamidas, tales como metalaxilo, mefenoxam, benalaxilo y oxadiyxlo; miembros de la clase de los fenilpirroles, tales como fludioxonilo; miembros de la clase de las ftalimidas, tales como el captan; miembros de la clase de los ditiocarbamatos, tales como mancozeb y tiram; miembros de la clase de los benzimidazoles, tales como el tiabendazol; y cualquier combinación de estos, incluyendo combinaciones de dos o más, tres o más, o cuatro o más fungicidas. Se listan fungicidas adicionales en el Compendio de Nombres Comunes de Pesticidas, una base de datos operada por Alan Wood y disponible en formato electrónico en el sitio web alanwood.net.

Los nematicidas adecuados incluyen, sin limitación, productos químicos de la clase de los carbamatos, tales como aldicarb, aldoxicarb, oxamilo, carbofurano y cleotocarb; y productos químicos de la clase de los organofosfatos, tales como tionazina, etoprofos, fenamifos, fensulfotiona, terbufos, isazofos y ebufos. Se listan otros nematicidas en el Compendio de Nombres Comunes de Pesticidas, una base de datos operada por Alan Wood y disponible en formato electrónico en el sitio web alanwood.net.

Entre los bactericidas adecuados se incluyen, sin limitación, los basados en diclorofeno y hemiformal de alcohol bencílico (Proxel® de ICI o Acticide® RS de Thor Chemie y Kathon® MK de Rohm & Haas) y derivados de isotiazolinona, tales como alquilisotiazolinonas y benzisotiazolinonas (Acticide® MBS de Thor Chemie; Proxel® GXL de ICI). Se listan otros bactericidas en el Compendio de Nombres Comunes de Pesticidas, una base de datos operada por Alan Wood y disponible en formato electrónico en el sitio web alanwood.net.

Los inóculos adecuados incluyen, sin limitación,Bradyrhizobium spp.,en particularBradyrhizobium japonicum(productos BASF Vault®),Bacillus subtilis, Bacillus firmus, Bacillus pumilis, Streptomyces lydicus, Trichoderma spp., Pasteuria spp.,otros cultivos de células rizóbicas (BASF Nodulator® y Rhizo-Flo®) y cualquier combinación de estos, incluyendo combinaciones de dos o más, tres o más, o cuatro o más inóculos. Los inóculos pueden ser recombinantes, como se describe más adelante, para facilitar la expresión y, opcionalmente, la secreción de un polipéptido de la invención. Alternativamente, estos inóculos pueden ser formas comerciales incapaces de expresar/secretar un polipéptido de la invención.

Los fitorreguladores son sustancias químicas, naturales o sintéticas, que estimulan o inhiben la señalización bioquímica de las plantas. Estos son generalmente, pero no exclusivamente, reconocidos por receptores en la superficie celular, lo que provoca una cascada de reacciones en la célula. Los fitorreguladores adecuados incluyen, sin limitación, etefón; etileno; ácido salicílico; ácido acetilsalicílico; ácido jasmónico; jasmonato de metilo; dihidrojasmonato de metilo; quitina; quitosano; ácido abscísico; cualquier compuesto o inhibidor de auxina, incluyendo, pero sin limitarse a, ácido (4-clorofenoxi)acético, ácido (2,4-diclorofenoxi)acético y ácido 2,3,5-triyodobenzoico; cualquier citoquinina, incluyendo, pero sin limitarse a, kinetina y zeatina; giberelinas; brasinolida; y cualquier combinación de estos, incluyendo combinaciones de dos o más, tres o más, o cuatro o más reguladores.

Otros aditivos adecuados incluyen agentes tampón, agentes humectantes, agentes de recubrimiento y agentes abrasivos. Estos materiales pueden utilizarse para facilitar la aplicación de las composiciones de acuerdo con la presente invención. Además, las composiciones pueden aplicarse a las semillas de plantas con otros materiales convencionales de formulación y tratamiento de semillas, como arcillas y polisacáridos. Las composiciones o sistemas para el tratamiento de semillas de plantas incluyen: uno o más de los péptidos de la presente invención, preferiblemente, aunque no exclusivamente, uno de los siguientes: P5, P5-8, P5-21, P5-25, P5-27, P5-35 o P5-46 (SEQ ID NOS: 8, 14, 33, 52, 53, 71 y 58, respectivamente), en combinación con uno o más insecticidas, nematicidas, fungicidas, otros inóculos u otros fitorreguladores, incluyendo combinaciones de múltiples insecticidas, o múltiples nematicidas, múltiples fungicidas, múltiples otros inóculos o múltiples fitorreguladores. Los insecticidas, nematicidas, fungicidas, inóculos y fitorreguladores adecuados para estos tratamientos combinados incluyen los identificados anteriormente. Estas composiciones se presentan en forma de una sola composición en el momento del tratamiento de semillas. Por el contrario, un sistema utilizado para el tratamiento de semillas puede implicar múltiples tratamientos; por ejemplo, una composición que contiene los péptidos se utiliza en un tratamiento y una composición que contiene uno o más insecticidas, nematicidas, fungicidas, fitorreguladores y/o bactericidas se utiliza en un tratamiento separado. En esta última modalidad, ambos tratamientos se realizan aproximadamente al mismo tiempo, es decir, antes de la siembra o aproximadamente en el momento de la siembra.

Un ejemplo de ello incluye uno o más péptidos de la presente invención, incluyendo (sin limitación) uno de los siguientes: P5, P5-8, P5-21, P5-25, P5-27, P5-35 o P5-46 (SEQ ID NOS: 8, 14, 33, 52, 53, 71 y 58 respectivamente), en combinación con Poncho™ (clotianidina) disponible en Bayer Crop Science, Poncho™ VOTiVO (clotianidina y nematicida biológico deBacillus firmus)disponible en Bayer Crop Science, y Gaucho™ (imidicloprid) disponible en Bayer Crop Science.

Otro ejemplo incluye uno o más de los péptidos de la presente invención, incluyendo (sin limitación) uno de P5, P5-8, P5-21, P5-25, P5-27, P5-35 o P5-46 (SEQ ID NOS: 8, 14, 33, 52, 53, 71 y 58 respectivamente), en combinación con Cruiser™ (tiametoxam) disponible en Syngenta, CruiserMaxx™ (tiametoxam, mefenoxam y fludioxinilo) disponible en Syngenta, Cruiser Extreme™ (tiametoxam, mefenoxam, fludioxinilo y azoxistrobina) disponible en Syngenta, Avicta™ (tiametoxam y abamectina) disponible en Syngenta, y Avicta™ Complete (tiametoxam, abamectina y Clariva Complete™ que contiene el inóculo biológico Pn1 de Pasteuria nishizawae, disponible en Syngenta, y Avicta Complete™ Corn (tiametoxam, mefenoxam, fludioxinilo, azoxistrobina, tiabendazol y abamectina), disponible en Syngenta.

Otro ejemplo incluye uno o más de los péptidos de la presente invención, incluyendo (sin limitación) uno de P5, P5-8, P5-21, P5-25, P5-27, P5-35, o P5-46 (SEQ ID NOS: 8, 14, 33, 52, 53, 71, y 58 respectivamente), en combinación con Vault Liquid plus Integral (inóculos de especies deBradyrhizobiumy cepa deBacillus subtilisMBI 600) disponibles de BASF, Vault NP (inóculo deBradyrhizobium japonicum)disponible en BASF, y Subtilex NG (inóculo biológico deBacillus subtilis)disponible en BASF.

Como alternativa al uso de péptidos o composiciones para aplicar los péptidos de la presente invención a las plantas, también se contempla el uso de microbios beneficiosos para administrar el péptido a la planta o a su semilla, o al lugar donde se planta la semilla en el suelo (y donde se cultiva la planta adulta). Por lo tanto, un aspecto adicional de la invención implica la modificación y aplicación de microbios beneficiosos para producir los péptidos de la presente invención. Los microbios beneficiosos realizan diversas actividades útiles, revisadas en Glick, “Plant Growth-Promoting Bacteria: Mechanisms and Applications”, Scientifica, ID de artículo 963401 (2012). Los microbios beneficiosos pueden proporcionar nutrición a una planta. Esta puede presentarse en forma de aminoácidos y otros compuestos nitrogenados mediante el proceso de fijación de nitrógeno. Los microbios beneficiosos también pueden liberar fosfato de depósitos minerales inaccesibles en el suelo y hacerlos accesibles. Por ejemplo, las bacterias pueden sintetizar sideróforos que se unen y solubilizan depósitos de hierro inaccesibles. Estos complejos hierro-sideróforo pueden ser absorbidos por las plantas. Los microbios pueden producir análogos de las hormonas de señalización vegetal que estimulan el crecimiento y reducen la señalización del estrés. Finalmente, los microbios benéficos pueden competir con los organismos patógenos extrayendo recursos como el hierro, así como sintetizando compuestos antibióticos. Los microbios benéficos pueden presentar otros comportamientos, no limitados a los mencionados anteriormente. Los organismos benéficos se clasifican en epífitos (que viven sobre o cerca de la superficie de los tejidos vegetales) o endófitos (que viven dentro de los tejidos vegetales).

Las bacterias beneficiosas adecuadas incluyen, sin limitación, Pseudomonas (por ejemplo, Pfluorescens, P aureofaciens,Pchlororaphis, P solanacearumyP syringae),Esfingomonas(porejemplo, S.phyllosphaerae, S. roseiflava, S. melonis, S. azotifigens y S. mali)(véase también Innerebner et al., “Protection ofArabidopsis thalianaAgainst Leaf-PathogenicPseudomonas syringaepor Sphingomonas Strains in a Controlled Model System”, Appl. Environ. Microbiol. 77: 3202-3210 (2011)), Bacilos(B. firmus, B. licheniformis, B. megaterium, B. mucilaginous, B. pumilus, B. subtilisyB. subtilis var. amyloliquefaciens),Estreptomices (por ejemplo, S.griseoviridisy S.lydicus),Rhizobium (por ejemplo,R. meliloti, R. trifolii, R. leguminosarum, R. phaseolin, R. lupineyR. japonicum),Frankia (por ejemplo, Falni)y Azospirillum (por ejemplo,A. brasilenseyA. lipoferum).

Otras bacterias beneficiosas incluyen, sin limitación,Agrobacterium radiobacter, Azotobacter chroococcum, Burkholderia cepacia, Delfitia acidovorans, Paenobacillus macerans, Pantoea agglomeransySerratia entomophilia.

En ciertas realizaciones, el microbio beneficioso puede ser una célula huésped fúngica filamentosa. En algunas realizaciones, la célula huésped puede ser una célula de una cepa con historial de uso para la producción de proteínas con estatus GRAS (Generalmente Reconocido como Seguro) por la FDA.

En algunas realizaciones, los microbios fúngicos beneficiosos pueden ser de una cepa deAspergillus niger,entre las que se incluyen ATCC 22342, ATCC 44733, ATCC 14331, ATCC 11490, NRRL 3112 y cepas derivadas de estas. En algunas realizaciones, los microbios fúngicos beneficiosos pueden ser cepas deTrichoderma(por ejemplo, Tharzianum, T viride, T koningi, T reeseiyT hamatum)que incluyen equivalentes funcionales de RL-P37 (Sheir-Neiss et al. (1984) Appl. Microbiol. Biotechnology 20:46-53). Otros microbios fúngicos beneficiosos útiles incluyen, sin limitación, NRRL 15709, ATCC 13631, ATCC 26921 (QM 9414), ATCC 32098, ATCC 32086 y ATCC 56765 (RUT-30). En algunas realizaciones, los microbios fúngicos beneficiosos pueden ser cepas de levaduras fúngicas no filamentosas, incluidas, sin limitación, cepas deRhodotorula(por ejemplo,R. graminisWP1 yR. mucilaginosa)(véase la patente de los Estados Unidos n.° 8,728,781 y Xin et al., “Characterization of Three Endophytic, Indole-3-Acetic Acid-Producing Yeast Occurring in Populus Trees”, Mycol. Res. 113: 973-980 (2009)).

Un experto en la materia puede crear sistemas de expresión de péptidos utilizando sistemas plasmídicos existentes. Una directriz importante es que la regulación de la expresión de péptidos debe estar bien controlada. Las altas concentraciones de péptidos detectadas por la planta probablemente desencadenarán una respuesta inmunitaria intensa con muerte celular generalizada, característica de la respuesta de hipersensibilidad. Por el contrario, niveles más bajos de expresión de péptidos deberían estimular la inmunidad y minimizar la muerte celular. Este efecto puede equilibrarse aún más mediante una cuidadosa selección de las secuencias de secreción. La expresión de péptidos enPseudomonas fluorescenspuede lograrse utilizando las cepas y herramientas de expresión descritas por Retallack et al., “Reliable protein production in aPseudomonas fluorescensexpression system”, Protein Expression and Purification 81: 157-65 (2012). La expresión de péptidos enBacillus subtilispuede lograrse mediante vectores que utilizan un sistema promotor de subtilisina (aprE). Esto puede aumentarse opcionalmente utilizando péptidos señal para dirigir la secreción del péptido fuera del microbio. Estas funciones se implementan en el manual "Sistema de Expresión de Proteínas Secretoras de Bacillus Subtilis", disponible en Clontech. La expresión de proteínas en Estreptomices se ha demostrado utilizando plásmidos, como describen Fernandez-Abalos et al., "Posttranslational processing of the xylanase Xys1L fromStreptomyces halstediiJM8 is carried out by secreted serine proteases", Microbiology 149: 1623-32 (2003). Un experto en la materia puede producir sistemas de expresión de péptidos adicionales.

Una vez criados los microbios modificados, por ejemplo, en un aparato de fermentación, los microbios modificados pueden recuperarse y luego administrarse en una composición seca, líquida o en suspensión. Para composiciones líquidas o suspensiones, los microbios pueden mezclarse en agua o en una solución tampón y aplicarse como tratamiento por aspersión a las plantas o al lugar donde se cultivan. Alternativamente, la solución puede utilizarse como tratamiento de semillas antes de sembrarlas. Para composiciones secas, los microbios pueden secarse con o sin partículas portadoras inertes, y la composición seca puede aplicarse a las semillas, al lugar donde se plantarán las semillas o donde se cultivarán las plantas, o directamente a las plantas.

Las unidades formadoras de colonias (c.f.u.) se utilizan para cuantificar los microbios. 1 c.f.u. de un microbio genera una sola colonia cuando se extiende sobre un agar nutritivo sólido compatible con el organismo y corresponde a una célula sana con capacidad de replicación. En una formulación en polvo seco, la concentración de microbios puede superar las 5 * 1010 cfu/gramo de material. Las concentraciones adecuadas para una formulación seca incluyen >1011, >5*1010, >1010, >109, >108, 107 o >106 cfu/gramo. Asimismo, los microbios pueden administrarse en suspensión líquida. Las concentraciones adecuadas para una formulación líquida incluyen >1010, >109, >108, >107, >106, >105 cfu/ml.

La presente invención se refiere además a métodos para conferir resistencia a enfermedades a las plantas, mejorar su crecimiento, controlar plagas, conferirles tolerancia al estrés biótico o abiótico y/o modular la señalización bioquímica de las plantas. De acuerdo con una realización, estos métodos implican la aplicación de una cantidad eficaz de un péptido aislado de la invención, o una composición de la invención, a una planta o semilla de la planta, o al lugar donde la planta crece o se espera que crezca. Como consecuencia de dicha aplicación, el péptido entra en contacto con las células de la planta o las semillas de la planta e induce en la planta o una planta en crecimiento, resistencia a enfermedades de la semilla de la planta, mejora del crecimiento, tolerancia al estrés biótico, tolerancia al estrés abiótico o alteración de la señalización bioquímica. De acuerdo con una realización alternativa, el péptido o la composición de la invención puede aplicarse a plantas de tal manera que las semillas recuperadas de dichas plantas puedan conferirles resistencia a enfermedades, mejorar su crecimiento, controlar plagas, conferirles tolerancia al estrés biótico o abiótico y/o modular la señalización bioquímica, para modular la maduración. De acuerdo con otra realización, estos métodos implican la aplicación de un inóculo recombinante a las semillas de la planta o a las plantas, o al lugar donde la planta crece o se espera que crezca. Como consecuencia de dicha aplicación, el inóculo recombinante expresa o secreta un péptido de la invención, el cual entra en contacto con las células de la planta o semillas de la planta e induce en la planta o en una planta en crecimiento, resistencia a las enfermedades de la semilla de la planta, mejora del crecimiento, tolerancia al estrés biótico, tolerancia al estrés abiótico o alteración de la señalización bioquímica.

En estas realizaciones, también es posible seleccionar plantas o semillas de la planta, o el lugar, en el que se aplica el péptido aislado o la composición de la invención. Por ejemplo, en campos con alto contenido de nematodos, las plantas o semillas de las plantas que se cultivarán en dichos campos, o los campos (el lugar), pueden tratarse selectivamente aplicando el péptido aislado o la composición, o el inóculo recombinante de la invención, como se describe en este documento; mientras que dicho tratamiento puede no ser necesario para plantas o semillas de plantas cultivadas en campos con bajo contenido de nematodos. De igual manera, en campos con riego reducido, las plantas o semillas de las plantas que se cultiven en dichos campos, o en los campos (el lugar), pueden tratarse selectivamente aplicando el péptido aislado, o la composición o el inóculo recombinante de la invención, como se describe en este documento; mientras que dicho tratamiento puede no ser necesario para plantas o semillas de plantas cultivadas en campos con riego adecuado. Asimismo, en campos propensos a inundaciones, las plantas o semillas de las plantas que se cultiven en dichos campos, o en los campos (el lugar), pueden tratarse selectivamente aplicando el péptido aislado, o la composición o el inóculo recombinante de la invención, como se describe en este documento; mientras que dicho tratamiento puede no ser necesario para plantas o semillas de plantas cultivadas en campos no propensos a inundaciones. Como otro ejemplo de dicha selección, en campos propensos a ataques de insectos en ciertas épocas de la temporada de cultivo, las plantas o semillas de las plantas que se cultiven en dichos campos, o en los campos (el lugar), pueden tratarse selectivamente aplicando el péptido aislado o la composición de la invención, como se describe en este documento; mientras que el mismo campo puede no tratarse en épocas ineficaces de la temporada de cultivo, o bien otros campos no propensos a dichos ataques pueden quedar sin tratamiento. Dichas etapas de selección pueden llevarse a cabo al practicar cada uno de los métodos de uso descritos en este documento, es decir, conferir resistencia a enfermedades a las plantas, mejorar el crecimiento de las plantas, controlar plagas (incluyendo insectos y nematodos), conferir tolerancia al estrés biótico o abiótico a las plantas y/o modular la señalización bioquímica de las plantas.

Como alternativa a la aplicación de un péptido aislado o una composición que lo contenga a plantas o semillas de las plantas para conferir resistencia a las enfermedades en las plantas, mejorar el crecimiento de las plantas, controlar insectos, conferir resistencia al estrés y/o modular la señalización bioquímica a las plantas o a las plantas cultivadas a partir de semillas, se pueden utilizar plantas transgénicas o semillas de plantas. Al utilizar plantas transgénicas, esto implica proporcionar una planta transgénica transformada con una molécula de ADN que codifica un péptido de la invención y cultivar la planta en condiciones eficaces para que dicha molécula de ADN confiera resistencia a enfermedades a las plantas, mejore el crecimiento de las plantas, controle insectos, confiera tolerancia al estrés biótico o abiótico y/o module la señalización bioquímica. Como alternativa, se puede obtener una semilla de planta transgénica transformada con una molécula de ADN que codifica un péptido de la invención y sembrarla en el suelo. A partir de la semilla sembrada, se propaga una planta en condiciones adecuadas para que la molécula de ADN exprese el péptido y, por lo tanto, confiera resistencia a enfermedades a la planta transgénica, mejore su crecimiento, controle insectos, confiera tolerancia al estrés biótico o abiótico y/o module la señalización bioquímica. Este enfoque transgénico puede usarse en combinación con el inóculo recombinante o la aplicación tópica del péptido o la composición aislada.

También se divulgan métodos para mejorar la resistencia a la desecación de esquejes de plantas ornamentales, la resistencia a enfermedades postcosecha o la resistencia a la desecación de frutas o verduras cosechadas de plantas, y/o una mayor longevidad de la maduración de frutas o verduras para frutas o verduras cosechadas de plantas. Estos métodos implican la aplicación de una cantidad eficaz de un péptido aislado de la presente invención o una composición de acuerdo con la presente invención a una planta o al lugar donde crece la planta. Como consecuencia de dicha aplicación, el péptido entra en contacto con las células de la planta o semilla de la planta e induce resistencia a la desecación de esquejes de plantas ornamentales, resistencia a enfermedades postcosecha o resistencia a la desecación de frutas o verduras cosechadas de plantas, y/o una mayor longevidad de la maduración de frutas o verduras para frutas o verduras cosechadas de plantas. Alternativamente, se puede aplicar una cantidad eficaz de un péptido aislado de la presente invención o una composición de acuerdo con la presente invención a una fruta o verdura cosechada. Como consecuencia de dicha aplicación, el péptido entra en contacto con las células de la fruta o verdura cosechada e induce resistencia a enfermedades postcosecha o resistencia a la desecación en las frutas o verduras tratadas, y/o mejora la longevidad de la maduración de las frutas o verduras tratadas.

Como alternativa a la aplicación de un péptido aislado o una composición que los contenga a plantas o semillas de plantas para inducir resistencia a la desecación en esquejes de plantas ornamentales, resistencia a enfermedades postcosecha o resistencia a la desecación en frutas o verduras cosechadas, o bien, mejora la longevidad de la maduración de las frutas o verduras para las frutas o verduras cosechadas, se pueden utilizar plantas o semillas de plantas transgénicas. Al utilizar plantas transgénicas, esto implica proporcionar una planta transgénica transformada con una molécula de ADN que codifica un péptido de la invención y cultivarla en condiciones eficaces para que dicha molécula de ADN induzca resistencia a la desecación en esquejes de plantas ornamentales, resistencia a enfermedades postcosecha o resistencia a la desecación en frutas o verduras cosechadas de las plantas transgénicas, y/o una mayor longevidad de la maduración de las frutas o verduras para las frutas o verduras cosechadas de las plantas transgénicas. Alternativamente, se puede proporcionar una semilla de planta transgénica transformada con una molécula de ADN que codifica un péptido de la invención y plantarla en el suelo. A continuación, se propaga una planta a partir de la semilla plantada en condiciones eficaces para que dicha molécula de ADN exprese el péptido y, por lo tanto, induzca resistencia a la desecación en esquejes de plantas ornamentales, resistencia a enfermedades postcosecha o resistencia a la desecación en frutas o verduras cosechadas de las plantas transgénicas, y/o una mayor longevidad de la maduración de las frutas o verduras para las frutas o verduras cosechadas de las plantas transgénicas.

En estas realizaciones, también es posible seleccionar plantas o semillas de plantas transgénicas para llevar a cabo la presente invención. Por ejemplo, en campos con alto contenido de nematodos, las plantas o semillas de las plantas transgénicas pueden cultivarse selectivamente en ellos; mientras que las plantas o semillas de las plantas no transgénicas pueden cultivarse en campos con bajo contenido de nematodos. De igual manera, en campos con riego reducido, las plantas o semillas de las plantas transgénicas pueden cultivarse selectivamente en ellos; mientras que las plantas o semillas de las plantas no transgénicas pueden cultivarse en campos con riego adecuado. Asimismo, en campos propensos a inundaciones, las plantas o semillas de las plantas transgénicas pueden cultivarse en ellos; mientras que las plantas o semillas de las plantas no transgénicas pueden cultivarse en campos no propensos a inundaciones. Como otro ejemplo de dicha selección, en campos propensos a ataques de insectos en ciertas épocas de la temporada de crecimiento, las plantas o semillas de las plantas transgénicas pueden cultivarse selectivamente en ellos; mientras que las plantas o semillas de las plantas no transgénicas pueden cultivarse en campos no propensos a dichos ataques de insectos. Dichas etapas de selección pueden llevarse a cabo al practicar cada uno de los métodos de uso descritos en este documento, es decir, impartir resistencia a las enfermedades a las plantas, mejorar el crecimiento de las plantas, efectuar el control de plagas (incluidos insectos y nematodos), impartir tolerancia al estrés biótico o abiótico a las plantas y/o modular la señalización bioquímica de las plantas.

También se divulgan métodos para mejorar la resistencia a la desecación de esquejes de plantas ornamentales, la resistencia a enfermedades postcosecha o la resistencia a la desecación de frutas o verduras cosechadas de plantas, y/o una mayor longevidad de la maduración de frutas o verduras para frutas o verduras cosechadas de plantas. Estos métodos implican la aplicación de una cantidad eficaz de un péptido aislado de la presente invención o una composición de acuerdo con la presente invención a una planta o al lugar donde crece la planta. Como consecuencia de dicha aplicación, el péptido entra en contacto con las células de la planta o semilla de la planta e induce resistencia a la desecación de esquejes de plantas ornamentales, resistencia a enfermedades postcosecha o resistencia a la desecación de frutas o verduras cosechadas de plantas, y/o una mayor longevidad de la maduración de frutas o verduras para frutas o verduras cosechadas de plantas. Alternativamente, se puede aplicar una cantidad eficaz de un péptido aislado de la presente invención o una composición de acuerdo con la presente invención a una fruta o verdura cosechada. Como consecuencia de dicha aplicación, el péptido entra en contacto con las células de la fruta o verdura cosechada e induce resistencia a enfermedades postcosecha o resistencia a la desecación en las frutas o verduras tratadas, y/o una mayor longevidad de la maduración de las frutas o verduras para las frutas o verduras tratadas.

En estas realizaciones, también es posible seleccionar plantas, esquejes, frutas, verduras o el lugar al que se aplica el péptido aislado o la composición de la invención. Por ejemplo, en el caso de esquejes o frutas o verduras cosechadas que se transportan a grandes distancias o se almacenan durante largos periodos, se pueden tratar selectivamente aplicando el péptido aislado o la composición de la invención como se describe en el presente documento; mientras que los esquejes o frutas o verduras cosechadas que se envían localmente y se destinan a un consumo sin largos periodos de almacenamiento se pueden excluir de dicho tratamiento.

Como alternativa a la aplicación de un péptido aislado o una composición que lo contenga a plantas o semillas para inducir resistencia a la desecación en esquejes de plantas ornamentales, resistencia a enfermedades postcosecha o resistencia a la desecación en frutas o verduras cosechadas de plantas, y/o una mayor longevidad de la maduración de frutas o verduras para frutas o verduras cosechadas de plantas, se pueden utilizar plantas o semillas de plantas transgénicas. Al utilizar plantas transgénicas, esto implica proporcionar una planta transgénica transformada con una molécula de ADN que codifica un péptido de la invención y cultivarla en condiciones eficaces para que dicha molécula de ADN induzca resistencia a la desecación en esquejes de plantas ornamentales, resistencia a enfermedades postcosecha o resistencia a la desecación en frutas o verduras cosechadas de plantas transgénicas, y/o una mayor longevidad de la maduración de frutas o verduras para frutas o verduras cosechadas de plantas transgénicas. Como alternativa, se puede proporcionar una semilla de planta transgénica transformada con una molécula de ADN que codifica un péptido de la invención y plantarla en el suelo. A continuación, se propaga una planta a partir de la semilla plantada en condiciones eficaces que permitan que la molécula de ADN exprese el péptido y, por lo tanto, induzca resistencia a la desecación en esquejes extraídos de plantas ornamentales, resistencia a enfermedades postcosecha o resistencia a la desecación en frutas o verduras cosechadas de plantas transgénicas, y/o una mayor longevidad de la maduración de frutas o verduras para frutas o verduras cosechadas de plantas transgénicas.

En estas realizaciones, también es posible seleccionar plantas o semillas de plantas transgénicas para llevar a cabo la presente invención. Por ejemplo, se pueden seleccionar plantas o semillas de plantas transgénicas para el cultivo cuando se sabe que los esquejes, frutas o verduras cosechadas se destinarán a ser transportados a grandes distancias o almacenados durante largos periodos después de la cosecha; mientras que se pueden seleccionar plantas o semillas de plantas no transgénicas para el cultivo cuando se sabe que los esquejes, frutas o verduras cosechadas se destinarán a ser transportados localmente y/o consumidos sin largos periodos de almacenamiento.

Las plantas adecuadas incluyen dicotiledóneas y monocotiledóneas, incluidas plantas agrícolas, silvícolas, ornamentales y hortícolas, ya sea en forma natural o modificada genéticamente. Los ejemplos de plantas incluyen, sin limitación, alfalfa, manzana, albaricoque, espárrago, aguacate, plátano, cebada, frijoles, haya (especie Fagus), begonia, abedul, mora, arándano, repollo, alcanfor, canola, zanahoria, planta de ricino, cereza, canela, cítricos, grano de cacao, café, maíz, algodón, pepino, calabaza, eucalipto, abeto, lino, remolacha forrajera, fucsia, ajo, geranio, uvas, cacahuete, cáñamo, lúpulo, baya de junio, juncea(Brassica júncea),yute, lenteja, lechuga, linaza, melón, mostaza, nectarina, roble, avena, palma aceitera, colza, aceituna, cebolla, pimentón, guisante, melocotón, pera, pelargonio, pimientos, petunia, pino (especiePinus),ciruela, álamo (especiePopulus),fruta de pepita, patata, colza, frambuesa, arroz, árbol del caucho, centeno, sorgo, soja, espinaca, abeto, chayote, fresa, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, té, teca, tabaco, tomate, triticale, césped, sandía, trigo y sauce (especieSalix), Arabidopsis thaliana,Saintpaulia, flor de pascua, crisantemo, clavel y zinnia.

Con respecto a la señalización bioquímica modificada, esto incluye tanto la mejora de ciertas vías bioquímicas vegetales como la disminución de otras vías bioquímicas vegetales. Las vías de señalización bioquímica que pueden modificarse de acuerdo con la presente invención incluyen la expresión génica y la producción de proteínas, la producción de metabolitos y la producción de moléculas de señalización/metabolitos secundarios. Ejemplos de vías de señalización bioquímica y sus modificaciones incluyen, sin limitación, la inducción de la producción de óxido nítrico, la producción de peróxido y otros metabolitos secundarios; agonista de la vía de señalización del etileno e inducción de la expresión génica sensible al etileno (véase Dong et al., Plant Phys.

136: 3628-3638 (2004); Li et al., Planta 239: 831-46 (2014); Chang et al., PLoS One 10,e0125498 (2015)); agonista de la vía de señalización del ácido salicílico e inducción de la expresión génica sensible al ácido salicílico (véase Dong et al., Plant J. 20: 207-215 (1999)); agonista de la vía del ácido abscísico e inducción de la expresión génica sensible al ácido abscísico (véase Dong et al., Planta 221: 313-327 (2005)); agonista de la vía de señalización de giberelina e inducción de la expresión génica sensible a giberelina (véase Li et al., Planta 239: 831-46 (2014)); antagonista de la señalización del ácido jasmónico e inhibición de la expresión de genes sensibles al ácido jasmónico (véase Dong et al., Plant Phys. 136: 3628-3638 (2004)); inducir la expresión de inhibidores de proteasa (véase Laluk y Mengiste, Plant J. 68: 480-494 (2011); Xia et al., Chin. Sci. Bull 56: 2351 2358 (2011)); inducir la producción de especies reactivas de oxígeno en tejidos vegetales; inducir la producción de péptidos antimicrobianos y relacionados con el sistema inmunitario, tales como, sin limitación, peroxidasa, superóxido dismutasa, quitinasa y p-1,3-glucanasa (Wang et al., J. Agric. Food Chem. 59: 12527-12533 (2011)); e inducir la expresión y producción del gen de expansina (véase Li et al., Planta 239: 831-46 (2014)).

Con respecto a la resistencia a enfermedades, si bien no se confiere inmunidad absoluta contra la infección, se reduce la gravedad de la enfermedad y se retrasa la aparición de síntomas. Se reducen el número y el tamaño de las lesiones, así como el grado de esporulación de los patógenos fúngicos. Este método para conferir resistencia a enfermedades tiene el potencial de tratar enfermedades previamente intratables, tratar sistémicamente enfermedades que podrían no tratarse por separado debido a su coste, y evitar el uso de agentes infecciosos o materiales perjudiciales para el medio ambiente.

El método para conferir resistencia a patógenos a las plantas, de acuerdo con la presente invención, es útil para conferir resistencia a una amplia variedad de patógenos, incluyendo virus, bacterias y hongos. Mediante el método de la presente invención se puede lograr resistencia, sin limitación, a los siguientes virus: virus del mosaico del tabaco y virus del mosaico del tomate. De acuerdo con la presente invención, también se puede conferir resistencia a las plantas, sin limitación, a las siguientes bacterias:Pseudomonasspp. patógenas,Erwiniaspp. patógenas,Xanthomonasspp. patógenas yRalstoniaspp. patógenas. Mediante el método de la presente invención, se pueden lograr plantas resistentes, sin limitación, a los siguientes hongos:Fusariumspp. yPhytophthoraspp.

Con respecto al uso de los péptidos o composiciones de la presente invención para mejorar el crecimiento de las plantas, se pueden lograr diversas formas de mejora o promoción del crecimiento de las plantas. Esto puede ocurrir desde el inicio del crecimiento de la planta a partir de las semillas o más tarde en su ciclo de vida. Por ejemplo, el crecimiento de las plantas de acuerdo con la presente invención abarca mayor rendimiento, mayor vigor de la planta, mayor vigor de las plántulas (es decir, después de la germinación), mayor peso de la planta, mayor biomasa, mayor número de flores por planta, mayor rendimiento de grano y/o fruto, mayor cantidad de semillas producidas, mayor porcentaje de semillas germinadas, mayor velocidad de germinación, mayor tamaño de la planta, menor altura de la planta (para trigo), mayor biomasa, más frutos y de mayor tamaño, coloración más temprana del fruto, maduración más temprana de brotes, frutos y plantas, más macollos o brotes laterales, hojas más grandes, senescencia foliar retardada, mayor crecimiento de los brotes, mayor crecimiento de las raíces, asignación alterada de raíz/brote, mayor contenido de proteínas, mayor contenido de aceite, mayor contenido de carbohidratos, mayor contenido de pigmentos, mayor contenido de clorofila, mayor fotosíntesis total, mayor eficiencia de la fotosíntesis, menor respiración (menor uso de O<2>), compensación por tratamientos que reducen el rendimiento, mayor durabilidad de los tallos (y resistencia al encamado de los tallos), mayor durabilidad de las raíces (y resistencia al encamado de las raíces), mejor crecimiento de las plantas en condiciones de poca luz y combinaciones de los mismos. Como resultado, la presente invención proporciona importantes beneficios económicos a los agricultores. Por ejemplo, la germinación y la maduración tempranas permiten cultivar en zonas donde, de otro modo, las temporadas de crecimiento cortas impedirían su crecimiento. Un mayor porcentaje de germinación de las semillas se traduce en una mejor densidad de cultivos y un uso más eficiente de las mismas. Un mayor rendimiento, mayor tamaño y una mayor producción de biomasa permiten una mayor generación de ingresos a partir de una parcela determinada.

Con respecto al uso de los péptidos o composiciones de la presente invención para controlar plagas (incluyendo, sin limitación, insectos y nematodos, que son factores de estrés bióticos), dicho control de plagas abarca evitar que las plagas entren en contacto con las plantas a las que se ha aplicado el péptido o la composición de la invención, evitar daños directos a las plantas por lesiones por alimentación, elicitar que las plagas se alejen de dichas plantas, eliminar las plagas próximas a dichas plantas, interferir con la alimentación de las larvas de insectos en dichas plantas, evitar que las plagas colonicen plantas hospedadoras, evitar que los insectos colonizadores liberen fitotoxinas, interferir con la deposición de huevos en las plantas hospedadoras, etc. La presente invención también previene daños posteriores por enfermedades a las plantas resultantes de la infección por plagas.

La presente invención es eficaz contra una amplia variedad de insectos (factores de estrés bióticos). El barrenador europeo del maíz es una plaga importante del maíz (maíz dentado y dulce), pero también se alimenta de más de 200 especies de plantas, incluyendo habas verdes, de cera y lima, soja comestible, pimientos, papa y tomate, además de muchas especies de malezas. Otras plagas de insectos que se alimentan de larvas y que dañan una amplia variedad de cultivos hortícolas incluyen: gusano cogollero de la remolacha, gusano bucleador de la col, gusano cogollero del maíz, gusano cogollero, polilla dorso de diamante, gusano de la raíz de la col, gusano de la cebolla, gusano de la semilla del maíz, gusano de pepinillos (gusano del melón), gusano del pimiento y oxiuros del tomate. En conjunto, este grupo de plagas de insectos representa el de mayor importancia económica para la producción hortícola a nivel mundial. La presente invención también es eficaz contra nematodos, otra clase de factores de estrés bióticos de importancia económica. El nematodo del quiste de la soja(Heterodera glycines)es una plaga importante de la soja. El nematodo reniforme(Rotylenchulus reniformis)es una plaga importante del algodón, ya que puede parasitar otras especies de cultivos, en particular la soja y el maíz. Entre las plagas adicionales de nematodos se incluyen los nematodos del nudo de la raíz del géneroMeloidogyne(particularmente en algodón, trigo y cebada), los nematodos del quiste de los cereales del géneroHeterodera(particularmente en soja, trigo y cebada), los nematodos de las lesiones radiculares del géneroPratylenchus,los nematodos de las agallas de las semillas del géneroAnguina(particularmente en trigo, cebada y centeno) y los nematodos del tallo del géneroDitylenchus.Otros estresores bióticos incluyen arácnidos, malezas y combinaciones de estos.

Con respecto al uso de los péptidos o composiciones de la presente invención para conferir resistencia al estrés abiótico a las plantas, dicho estrés abiótico abarca cualquier factor ambiental que tenga un efecto adverso en la fisiología y el desarrollo de las plantas. Ejemplos de dicho estrés ambiental incluyen el estrés climático (por ejemplo, sequía, inundaciones, heladas, bajas temperaturas, altas temperaturas, exceso e insuficiencia de luz), el estrés por contaminación atmosférica (por ejemplo, dióxido de carbono, monóxido de carbono, dióxido de azufre, NOx, hidrocarburos, ozono, radiación ultravioleta, lluvia ácida), el estrés químico (por ejemplo, insecticidas, fungicidas, herbicidas, metales pesados), el estrés nutricional (por ejemplo, exceso o defecto de fertilizantes, micronutrientes, macronutrientes, en particular potasio, derivados del nitrógeno y derivados del fósforo) y una mejor respuesta cicatrizante a las heridas. El uso de los péptidos de la presente invención confiere resistencia a las plantas contra dichas formas de estrés ambiental.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de los péptidos de la presente invención como protector en combinación con uno o más de los agentes activos (es decir, en una composición o en composiciones separadas) para el control de malezas acuáticas en un cuerpo de agua, como se describe en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos n.° 20150218099 de Mann.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de los péptidos de la presente invención como fortificante de plantas en una composición para su aplicación en plantas cultivadas en condiciones de riego reducido, cuya composición también incluye al menos un antioxidante y al menos un gestor de radiación, y opcionalmente al menos un regulador del crecimiento de las plantas, como se describe en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos n.° 20130116119 de Rees et al..

Los métodos de la presente invención que implican la aplicación del péptido o la composición pueden llevarse a cabo mediante diversos procedimientos cuando se trata la totalidad o parte de la planta, incluyendo hojas, tallos, raíces, propágulos (por ejemplo, esquejes), frutos, etc. Esto puede (aunque no necesariamente) implicar la infiltración del péptido en la planta. Los métodos de aplicación adecuados incluyen la atomización a alta o baja presión, la inyección y la abrasión foliar en las proximidades del lugar de la aplicación del péptido. Al tratar las semillas de plantas, de acuerdo con la realización de la presente invención, la proteína o polipéptido inductor de respuesta de hipersensibilidad puede aplicarse mediante atomización a baja o alta presión, recubrimiento, inmersión (por ejemplo, remojo) o inyección. Los expertos en la materia pueden considerar otros procedimientos de aplicación adecuados, siempre que puedan lograr el contacto del polipéptido o proteína inductor de respuesta de hipersensibilidad con las células de la planta o semilla de la planta. Una vez tratadas con los péptidos o composiciones de la presente invención, las semillas pueden plantarse en suelo natural o artificial y cultivarse mediante procedimientos convencionales para producir plantas. Tras la propagación de plantas a partir de semillas tratadas de acuerdo con la presente invención, las plantas pueden tratarse con una o más aplicaciones de los péptidos o composiciones de la invención para conferirles resistencia a enfermedades a las plantas, para mejorar el crecimiento de las plantas, para controlar los insectos en las plantas, para conferirles tolerancia al estrés biótico o abiótico, para mejorar la resistencia a la desecación de los esquejes removidos, para conferir resistencia a enfermedades postcosecha o resistencia a la desecación a las frutas o verduras cosechadas, y/o para aumentar la longevidad de la maduración de las frutas o verduras para las frutas o verduras cosechadas.

Cuando los péptidos se aplican en forma de microbios beneficiosos recombinantes, estos microbios pueden aplicarse en forma de una solución acuosa que comprende una suspensión de dichos microbios beneficiosos, que posteriormente se aplica a la planta mediante atomización, recubrimiento o inmersión, como se describió anteriormente. Al tratar las semillas de plantas, de acuerdo con la realización de la presente invención, los microbios pueden aplicarse mediante atomización a baja o alta presión, recubrimiento, inmersión (por ejemplo, remojo) o inyección. Los expertos en la materia pueden concebir otros procedimientos de aplicación adecuados, siempre que permitan el contacto de los microbios beneficiosos con las células de la planta o semilla. De acuerdo con la forma de aplicación de la presente invención, los microbios beneficiosos pueden aplicarse a plantas o semillas de plantas en forma seca. Por ejemplo, la aplicación en seco de microbios puede realizarse utilizando productos bacterianos o fúngicos como Kodiak® HB, disponible en Chemtura, y T-22™ HC, disponible en BioWorks. Una vez tratadas con los microbios de la presente invención, las semillas pueden plantarse en suelo natural o artificial y cultivarse mediante procedimientos convencionales para producir plantas. Tras la propagación de plantas a partir de semillas tratadas de acuerdo con la presente invención, las plantas pueden tratarse con una o más aplicaciones de los microbios de la invención o de los péptidos, proteínas de fusión o composiciones de la invención para conferir resistencia a enfermedades a las plantas, mejorar el crecimiento de las plantas, controlar insectos en las plantas, conferirles tolerancia al estrés biótico o abiótico, mejorar la resistencia a la desecación de los esquejes eliminados, conferir resistencia a enfermedades postcosecha o resistencia a la desecación a las frutas o verduras cosechadas, y/o aumentar la longevidad de la maduración de las frutas o verduras para las frutas o verduras cosechadas.

Los péptidos o composiciones de la invención pueden aplicarse a plantas o semillas de plantas de acuerdo con la presente invención, solos o en mezcla con otros materiales. Alternativamente, los péptidos o composiciones pueden aplicarse por separado a las plantas, aplicando otros materiales en diferentes momentos.

En la realización alternativa de la presente invención, que implica el uso de plantas y semillas transgénicas, no es necesario aplicar tópicamente un péptido de la invención a las plantas o semillas. En su lugar, se producen plantas transgénicas transformadas con una molécula de ADN que codifica un péptido de la invención de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. Un vector adecuado para la expresión en plantas (es decir, que contiene secuencias de control de la traducción y la transcripción operables en plantas) puede microinyectarse directamente en las células de plantas mediante micropipetas para transferir mecánicamente el ADN recombinante. Crossway, Mol. Gen. Genetics, 202: 179-85 (1985). El material genético también puede transferirse a la célula de planta utilizando polietilenglicol. Krens, et al., Nature, 296: 72-74 (1982).

Otro enfoque para transformar células de plantas con un gen que codifica el péptido de la invención es el bombardeo de partículas (también conocido como transformación biolística) de la célula huésped. Esto puede lograrse de varias maneras. La primera implica impulsar partículas inertes o biológicamente activas hacia las células. Esta técnica se divulga en las patentes de los Estados Unidos n.° 4,945,050, 5,036,006 y 5,100,792, todas de Sanford et al.. Generalmente, este procedimiento implica impulsar partículas inertes o biológicamente activas hacia las células en condiciones eficaces para penetrar la superficie externa de la célula y ser incorporadas a su interior. Cuando se utilizan partículas inertes, el vector puede introducirse en la célula recubriéndolas con el vector que contiene el ADN heterólogo. Como alternativa, la célula diana puede rodearse con el vector, de modo que este sea transportado al interior de la célula por la estela de la partícula. Las partículas biológicamente activas (por ejemplo, células bacterianas secas que contienen el vector y ADN heterólogo) también pueden introducirse en células de plantas.

Otro método de introducción es la fusión de protoplastos con otras entidades, ya sean minicélulas, células, lisosomas u otros cuerpos fusionables con superficie lipídica. Fraley, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 1859-63 (1982).

La molécula de ADN también puede introducirse en las células de plantas mediante electroporación. Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 5824 (1985). En esta técnica, los protoplastos de plantas se electroporan en presencia de plásmidos que contienen el casete de expresión. Impulsos eléctricos de alta intensidad de campo permeabilizan reversiblemente las biomembranas, lo que permite la introducción de los plásmidos. Los protoplastos de plantas electroporados reforman la pared celular, se dividen y se regeneran.

Otro método para introducir la molécula de ADN en células de plantas consiste en infectar una célula de planta conAgrobacterium tumefaciens o A. rhizogenespreviamente transformada con el gen. En condiciones adecuadas conocidas en la técnica, las células de plantas transformadas se cultivan para formar brotes o raíces y, posteriormente, se desarrollan hasta convertirse en plantas. Generalmente, este procedimiento implica inocular el tejido de la planta con una suspensión de bacterias e incubar el tejido durante 48 a 72 horas en un medio de regeneración sin antibióticos a 25-28 °C.Agrobacteriumes un género representativo de la familia de las gramnegativasRhizobiaceae.Sus especies son responsables de la agalla de la corona (A.tumefaciens)y la enfermedad de las raíces pilosas (A.rhizogenes).Las células de plantas en los tumores de agalla de la corona y las raíces pilosas son inducidas a producir derivados de aminoácidos conocidos como opinas, que son catabolizados únicamente por las bacterias. Los genes bacterianos responsables de la expresión de las opinas constituyen una fuente conveniente de elementos de control para los casetes de expresión quiméricos. Además, el análisis de la presencia de opinas puede utilizarse para identificar tejido transformado. Se pueden introducir secuencias genéticas heterólogas en células de plantas apropiadas mediante el plásmido Ti deA. tumefacienso el plásmido Ri deA. rhizogenes.El plásmido Ti o Ri se transmite a las células de plantas tras la infección por Agrobacterium y se integra de forma estable en el genoma de la planta. J. Schell, Science, 237: 1176-83 (1987).

Tras la transformación, las células de plantas transformadas deben regenerarse. La regeneración de plantas a partir de protoplastos cultivados se describe en Evans et al., Handbook of Plant Cell Cultures, Vol. 1 (MacMillan Publishing Co., New York, 1983); y Nasil I. R. (ed.), Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Acad. Press, Orlando, Vol. 1, 1984, y Vol. III (1986), que se incorporan al presente documento como referencia en su totalidad.

Se sabe que prácticamente todas las plantas pueden regenerarse a partir de células o tejidos cultivados. Los métodos de regeneración varían de acuerdo con la especie de plantas, pero generalmente se proporciona primero una suspensión de protoplastos transformados o una placa de Petri con explantes transformados. Se forma el tejido calloso y se pueden inducir brotes a partir del callo, que posteriormente enraízan. Alternativamente, se puede inducir la formación de embriones en el tejido calloso. Estos embriones germinan como embriones naturales para formar plantas. Los medios de cultivo generalmente contienen diversos aminoácidos y hormonas, como auxinas y citoquininas. También es ventajoso añadir ácido glutámico y prolina al medio, especialmente para especies como el maíz y la alfalfa. La regeneración eficiente dependerá del medio, del genotipo y de la historia del cultivo. Si se controlan estas tres variables, la regeneración suele ser reproducible y repetible.

Una vez que el casete de expresión se incorpora de forma estable en las plantas transgénicas, puede transferirse a otras plantas mediante cruzamiento sexual. Se puede utilizar cualquiera de las diversas técnicas de fitomejoramiento estándar, de acuerdo con la especie a cruzar.

Una vez producidas las plantas transgénicas de este tipo, las plantas pueden cultivarse de acuerdo con el procedimiento convencional con la presencia del gen que codifica el inductor de respuesta de hipersensibilidad que resulta en resistencia a enfermedades, mejor crecimiento de la planta, control de insectos en la planta, tolerancia al estrés abiótico o biótico, mayor resistencia a la desecación de los esquejes extraídos, resistencia a enfermedades postcosecha o resistencia a la desecación en las frutas o verduras cosechadas, y/o mayor longevidad de la maduración de las frutas o verduras para las frutas o verduras cosechadas.

Alternativamente, se recuperan semillas transgénicas de las plantas transgénicas. Estas semillas pueden plantarse en el suelo y cultivarse mediante procedimientos convencionales para producir plantas transgénicas. Las plantas transgénicas se propagan a partir de las semillas transgénicas plantadas en condiciones eficaces para conferir resistencia a las enfermedades a las plantas, mejorar el crecimiento de las plantas, controlar insectos, conferir tolerancia al estrés abiótico o biótico, mejorar la resistencia a la desecación de los esquejes extraídos, conferir resistencia a enfermedades postcosecha o resistencia a la desecación en las frutas o verduras cosechadas, y/o conferir una mayor longevidad de la maduración de las frutas o verduras para las frutas o verduras cosechadas.

Cuando se utilizan plantas y semillas transgénicas de plantas de acuerdo con la presente invención, también pueden tratarse con los mismos materiales que se utilizan para tratar las plantas y semillas a las que se aplica un péptido o una composición de la invención. Estos otros materiales, incluyendo los péptidos o la composición de la invención, pueden aplicarse a las plantas y semillas de plantas transgénicas mediante los procedimientos mencionados anteriormente, como atomización a alta o baja presión, inyección, recubrimiento e inmersión. De igual manera, tras la propagación de las plantas a partir de las semillas transgénicas, las plantas pueden tratarse con una o más aplicaciones de los péptidos o composiciones de la invención para conferir resistencia a enfermedades, mejorar el crecimiento, controlar insectos, tolerancia al estrés abiótico o biótico, resistencia a la desecación de los esquejes extraídos, resistencia a enfermedades postcosecha o resistencia a la desecación en frutas o verduras cosechadas, y/o una mayor longevidad de la maduración de las frutas o verduras para las frutas o verduras cosechadas.

Dichas plantas transgénicas también pueden tratarse con agentes convencionales de tratamiento de plantas, por ejemplo, agentes bactericidas o biocidas, inhibidores de proteasas, surfactantes no iónicos, fertilizantes, herbicidas, insecticidas, fungicidas, nematicidas, inóculos biológicos, fitorreguladores y mezclas de los mismos, como se describió anteriormente.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar realizaciones de la presente invención, pero no pretenden limitar su alcance.

Ejemplo 1- Determinación de una secuencia mínima inductora de HR

La secuencia mínima inductora derivada se desarrolló a partir de la secuencia del gen hrex deXanthomonas campestris pv. pelargonii.Se sintetizaron varias secuencias truncadas y mutadas y se analizaron para determinar la inducción de la respuesta de hipersensibilidad (resultados en la Tabla 4). La HR en tabaco se analizó como se describe en Wei, Science 257: 85-88 (1992). En resumen, los péptidos se disolvieron a una concentración de 500 pg/ml en solución acuosa. Se realizaron cuatro diluciones seriadas con el mismo volumen de agua, obteniendo muestras de péptidos en soluciones de péptidos de 500, 250, 125, 62.5 y 31.25 pg/ml. Se utilizaron plantas xanthi de la variedad cultivadaNicotiana tabacumde 5 a 7 semanas de edad (prefloración). Se pincharon ligeramente las hojas con un palillo en un panel central de la hoja. Posteriormente, se infundieron soluciones de péptidos mediante una jeringa sin aguja en la lesión, llenando el panel. Cada muestra de péptido se infundió en una hoja de dos plantas diferentes. Se observaron las hojas y se evaluaron durante las 48 horas siguientes para detectar marchitamiento y oscurecimiento, lesiones típicas de la muerte celular programada. Estos estudios tuvieron tres objetivos principales: (1) determinar la secuencia mínima suficiente para elicitar HR; (2) aumentar la estabilidad de la solución de los péptidos; (3) realizar mutaciones disruptivas para verificar los residuos más importantes para elicitar HR; (4) realizar mutaciones conservadoras para identificar el grado de especificidad para aminoácidos particulares.

La secuencia de tipo silvestre deXanthomonas campestris pv. pelargoniicontiene varios residuos de metionina, propensos a la oxidación. Los péptidos mutantes (P5-2 y P5-3) presentan mutaciones de Met por Ala, pero estas mutaciones no afectan la elicitación de HR, lo que sugiere que los residuos de metionina son indispensables para la activación de HR.

Con base en las secuencias de P5 y P5a (SEQ ID NOS: 8 y 9), se introdujeron mutaciones únicas disruptivas o conservadoras en residuos específicos dentro de la secuencia. En el caso de los residuos de leucina, estos se mutaron a ácido glutámico (disruptivo debido a la introducción de una carga negativa) o valina (conservador).

Las secuencias intermedias, dependiendo de la identidad del aminoácido en cuestión, se mutaron para tener una carga negativa (ácido aspártico o ácido glutámico), tener una cadena lateral hidrofóbica (valina), una cadena lateral mínima (alanina) o una cadena lateral polar pequeña (serina). Estos péptidos mutantes se probaron para la elicitación de la respuesta de hipersensibilidad. Se seleccionan mutaciones adicionales con base en los resultados iniciales de HR. Para aquellos aminoácidos que fueron importantes para la elicitación de HR, se seleccionaron mutaciones más conservadoras para determinar la especificidad de las interacciones. Los residuos de leucina se mutaron a isoleucina, valina, fenilalanina o tirosina, siendo estos 2 últimos residuos menos conservativos. Como se indicó anteriormente, se analizó la elicitación de HR en estos mutantes.

Tabla 4

Nombre del SecuenciaSEQIDNO: HR:péptido

P5SAGSEQQLDLLLMFIMMMLQQ8 P5aSAGSEQQLDQLLLMFIMMMLQQ9 P5-2SAGSEQQLDLLLMFIAAALQQ10 P5-3SAGSEQQLDLLLAFIAAALQQ11 P5-4SAGSEQQLELLLAFIAAALQQ12 P5-5QLELLLAFIAAALQQ139 P5-6SAGSEQQLDLLLAFIAAAL140-P5-7SEEEEELDLLLAFIAAAL13-P5-8SEEEEELDLLLAFIAAALQQ14Débil-*-P5-9LDLLLAFIAAALEEEEEEE15-P5-10LDLLLAFIEEELEEEE16-P5-11SEEELDLLLAFIAAALEE17-P5-12SEEELDLLLAFIEEELEE18-P5-13SEEELDLLLAFIAAALDD19-P5-14SEEEEELDLLLAFIAAALGG20Débil-*-P5-15SEEEEELDLLLAFIAAALQ25-P5-16SEEEEELDLLLAFIAAALS26-P5-17SEEEEELDLLLAFIAAALA27-P5-18SEEEEELDLLLAFIAAALE28-P5-19SELELLLAFIAAALEEEEE29 P5-20SEL E L L L E FIE E E L E E36-P5-21SEEQLELLLAFIAAALQQEE33 P5-22SEEELELLLAFIAAALEEEE30 P5-23SEEEEELDQLLLAFIAAALQQ50Débil-*-P5-24SEEEEELDQLLLAFIAAAL51-P5-25SEEEEQLDQLLLAFIAAALQQ52-P5-26SEEQLDLLLAFIAAALQEE34 P5-27SEEQLDQLLLAFIAAALQEE53-P5-28SEEQLDQLLLAFIAAALEE54Débil-*-P5-29SEEELDLLLMFIMMMLEE42 P5-30SEEELDQLLLMFIMMMLEE55+P5-31SEEEQLDLLLMFIMMMLEE43+P5-32SEEEQLDQLLLMFIMMMLEE56<+>P5-33SEEEQLDLLLMFIMMMLQEE44<+>P5-34SEEEQLDQLLLMFIMMMLQEE57<+>P5-35SAGSEQQEDLLLMFIMMMLQQ71Débil-*-P5-36SAGSEQQLDELLMFIMMMLQQ72<+>P5-37SAGSEQQLDLELMFIMMMLQQ73-P5-38SAGSEQQLDLLEMFIMMMLQQ74-P5-39SAGSEQQLDLLLEFIMMMLQQ75Fuerte-*-P5-40SAGSEQQLDLLLMEIMMMLQQ76 Fuerte+ P5-41SAGSEQQLDLLLMFEMMMLQQ77-P5-42SAGSEQQLDLLLMFIEMMLQQ78 Débil+ P5-43SAGSEQQLDLLLMFIMEMLQQ79 Fuerte+ P5-44SAGSEQQLDLLLMFIMMELQQ80 Déb¡l+ P5-45SAGSEQQLDLLLMFIMMMEQQ81-P5-46SEEQLDQLLLMFIMMMLQQEE58<+>P5-47SEEQLDLLLMFIMMMLQQEE45<+>P5-48SEEQ LD LLLEFIEEELQ Q EE39-P5-49SAGSEQQEDLLLAFIAAALQQ510-P5-50SAGSEQQLDELLAFIAAALQQ511 Débil+ P5-51SAGSEQQEDELLAFIAAALQQ512-P5-52SAGSEQQEDELLMFIMMMLQQ513-P5-53SAGSEQQEDQLLLMFIMMMLQQ98-P5-54SAGSEQQLDQELLMFIMMMLQQ99-P5-55SAGSEQQLDQLLLAFIAAALQQ130-P5-56SEEQEELLLAFIAAALQQEE514-P5-57SEEQLEELLAFIAAALQQEE515<+>P5-58SEEQEEELLAFIAAALQQEE516-P5-61SAGSEQQEDLLLAFIALQQ519-P5-62SAGSEQQLDELLAFIALQQ520-P5-63SAGSEQQLDLLLEFIALQQ521-P5-64SAGSEQQLDLLLAEIALQQ522-P5-65SAGSEQQLDLLLAFIEALQQ523-P5-66SAGSEQQLDLLLAFIAEALQQ524 Déb¡l+ P5-67SAGSEQQLDLLLAFIEAALQQ525-P5-68SAGSEQQLDLLLAFIAAELQQ526-P5-69SAGSEQQLDLLLAEIAAALQQ527-P5-70SAGSEQQLDLLLEFIAAALQQ528-P5-71SAGSEQQEDLLLAFIAAALQQ529-P5-72SAGSEQQLDELLAFIAAALQQ530-P5-73SQAGSEQLDLLLMFIMMMLQQ531<+>P5-74AEQGSSQLDLLLMFIMMMLQQ532<+>P5-75NQGISEKQQLDLLLMFIMMMLQQ533 Fuerte+ P5-76NQGISEKQQLDLLLAFIAAALQQ534 Débil+ P5-77NFGTPDSTVQNPQDASKPNQLDLLLMFIMMMLQQ535 Débil+ P5-78NFGTPDSTVQNPQDASKPNQLDLLLAFIAAALQQ536 Débil+ P5-79ITPDGQGGGQIGDNPQLDLLLMFIMMMLQQ537 Fuerte+ P5-80ITPDGQGGGQIGDNPQLDLLLAFIAAALQQ538 Débil+ P5-87SEEQLDLLLAFIAAALQQEE539-P5-88SEEQLELLLAFIAAALQEE540<+>

Ejemplo 2- Pruebas de estabilidad de péptidos variantes

Se evaluaron los péptidos para uno o más de solubilidad, estabilidad frente a la degradación química, efecto de los agentes de carga en la estabilidad de la solución, protección contra la oxidación y estudios de estabilidad de la solución.

Se evaluó la estabilidad frente a la degradación química en diversos tampones de pH mediante la creación de soluciones de AI al 0.2 % de péptido puro sintetizado químicamente en agua desionizada, 0.25 % peso/volumen de Proxel® GXL (biocida) y 50 milimolar (mM) de nueve tampones (por separado) de la siguiente manera: citrato, pH 5.6, MES pH 6.0, MOPS pH 6.5, citrato pH 7.2, EDDS pH 7.3, imidazol pH 7.5, EDTApH 8, fosfato pH 8 y TES pH 8. Las soluciones se observaron mediante HPLC para detectar evidencia de degradación (% de pérdida de la señal del péptido con el tiempo, en relación con la muestra del tiempo 0) durante un período de semanas a temperatura elevada (50 °C). Se observó la precipitación de P5 y P5-5 en varias muestras, en particular en aquellas con pH < 7. Otros péptidos, en particular el P5-9 y el P5-21, permanecieron en solución. Esto se correlaciona con los valores más bajos de hidrofobicidad del<p>5-9.

El péptido P5 mostró baja solubilidad a pH inferior a 7.0, lo que distorsionó los resultados experimentales (no mostrado). Para las soluciones tampón con pH superior a 7.0, se observó una estabilidad generalmente baja, con los mejores resultados en un tampón de EDTAa pH 8.0 (aproximadamente 40 % restante después de 14 días) (Figura 1).

P5-9 contiene una secuencia de glutamato en el extremo terminal C para mejorar la solubilidad y mutaciones de residuos de metionina para aumentar la resistencia a la oxidación. Este péptido mostró una mejor solubilidad a 500 |jg/ml, así como una mejor estabilidad en comparación con P5 (Figura 2). El citrato a pH 7.2 y el fosfato a pH 8.0 mostraron una remanencia superior al 80 % después de 14 días. Cabe destacar que, después de 45 días, el 81 % del péptido original permaneció en la muestra de citrato a pH 7.2 y el 79 % en la de fosfato a pH 8.0.

P5-21 es una secuencia mínima necesaria para la elicitación de HR, que contiene secuencias que mejoran la solubilidad del extremo terminal N y terminal C y metionina para mutaciones de alanina. Presentó buena solubilidad a pH 5.6 y superior, así como excelente estabilidad (>90%) para todos los tampones con pH >7.0, excepto EDTA (alrededor del 80%). Los resultados se muestran en la Figura 3.

Se analizó la estabilidad a temperatura ambiente durante 48 horas de muestras de los materiales P5, P5-21 y P5-25, a granel con maltodextrina y tampón fosfato (pH 8.0) o tampón citrato (pH 7.2). No se observó degradación significativa (pérdida superior al 5%).

Se realizaron estudios de estabilidad de la solución mediante la creación de soluciones de AI al 0.09% de péptido puro sintetizado químicamente en agua desionizada, 50 mM de tampón de pH, 0.25% de Proxel GXL y 0-50% de isopropanol. Las soluciones de péptidos se analizaron mediante HPLC para determinar el % de pérdida de la señal peptídica a lo largo del tiempo durante la incubación a 50 °C, con respecto a la muestra de tiempo 0. Se analizaron los péptidos hasta que la concentración restante de péptido disminuyó al 80 % de la original (20 % de degradación). Los resultados se resumen en la Tabla 5 a continuación.

Tabla 5: Estabilidad de la formulación de las variantes de P5

IPA: isopropanol, DTPA: ácido dietilentriaminopentaacético

Ejemplo 3- Inducción de resistencia al virus del mosaico del tabaco

Se analizaron péptidos para determinar la inducción de resistencia al virus del mosaico del tabaco (TMV) en tabaco. Brevemente, se seleccionaron tres plantas de tabaco de 6-8 semanas de edad por grupo (muestras y controles). Se cubrió la hoja más inferior de la planta y se roció con una solución de agua (control sin tratar UTC), péptido o Proact (control positivo). Se aplicó el rociado hasta que las hojas estuvieron completamente humedecidas, indicado mediante el goteo de líquido desde las hojas. Posteriormente, se dejaron secar las plantas y se retiró la cubierta foliar.

Tres días después del tratamiento, la hoja previamente cubierta y una hoja del lado opuesto de la planta se espolvorearon ligeramente con tierra de diatomeas y se aplicaron 20 pl de una solución de 1.7 pg/ml de virus del mosaico del tabaco purificado. La solución de TMV se extendió sobre la superficie foliar frotando suavemente la solución y la tierra de diatomeas a través de la superficie de las hojas. Dos minutos después de la inoculación, se enjuagó la tierra de diatomeas con agua. Tres días después de la inoculación del TMV, se evaluaron las hojas de acuerdo con el número de lesiones observadas por el TMV. También se evaluaron los signos de respuesta de hipersensibilidad, incluyendo amarillamiento y marchitamiento de las hojas afectadas.

La eficacia descrita en la Tabla 6 se refiere al porcentaje de disminución de las lesiones por TMV en plantas tratadas frente a las UTC. Una reducción de TMV en hojas cubiertas indica una respuesta inmunitaria sistémica en la planta, mientras que una reducción en hojas descubiertas indica una respuesta local. Los asteriscos indican que el valor P obtenido mediante una prueba T fue <0.05.

Tabla 6: Resumen de la resistencia al TMV

Ejemplo 4- Inducción de resistencia a nematodos en plantas de soja

Se evaluó la eficacia del tratamiento con péptidos para inhibir el crecimiento de nematodos del quiste de la soja (SCN) en soja. La soja se sembró en una mezcla 1:1 de arena/turba en un invernadero (temperatura mantenida a 28 °C), con 10 plantas por grupo de tratamiento. 14 días después de la siembra, las plantas se rociaron con una solución de péptido de 2.0 pg/ml o una solución de control sin péptido. 4,000 huevos de SCN recién cosechados se añadieron a las plantas 48 horas después de la aplicación del péptido. 30 días después de la introducción del patógeno, las plantas se cosecharon y los quistes se recolectaron y contaron con un elutriador.

En dos ensayos separados, la aplicación de P5 (SEQ ID NO: 8) a razón de 2.0 pg/ml provocó una reducción significativa en las poblaciones de SCN. En el ensayo # 1 , la población de control contenía un promedio de 133.5 quistes por planta, en comparación con un promedio de 69.7 quistes por planta en el grupo de tratamiento de P5 (P = 0.004). En el ensayo # 2, la población de control contenía un promedio de 104.9 quistes por planta, en comparación con un promedio de 54.5 quistes por planta en el grupo de tratamiento de P5 (P = 0.019). Estos resultados sugieren que los péptidos de la presente invención activan fuertemente las defensas de las plantas de soja contra la infiltración de nematodos.

Se realizarán experimentos adicionales para examinar la eficacia del tratamiento con péptidos en la supresión del crecimiento de nematodos del quiste de la soja utilizando uno o más de los otros péptidos de las Tablas 1 y 2, incluyendo, sin limitación, P5-21 y P5-25. Véase el Ejemplo 8 a continuación.

Ejemplo 5- Resistencia a la sequía en maíz

Se evaluó la eficacia del tratamiento con péptidos para reducir el estrés por sequía en maíz y soja. Se llenaron macetas de 3.5 pulgadas con tierra Sunshine #1 (SunGro Horticultura), fertilizada con una mezcla 20-10-20. La tierra se remojó y se drenó durante la noche. Se sembraron semillas (de maíz o soja, inspeccionadas manualmente para asegurar un tamaño uniforme) a 1 pulgada de profundidad para su germinación. Las plantas se cultivaron en un invernadero con 16 horas de luz al día a > 70 °F y 8 horas de oscuridad por noche a >65 °F. Antes de la sequía, las plantas recibieron abundante riego.

Cuando las plantas alcanzaron la etapa V1, las plantas se cosecharon para lograr una altura uniforme (se eliminaron las plantas anormalmente grandes y pequeñas). Posteriormente, las plantas se asignaron aleatoriamente a los grupos de control (atomización sin péptido) o de tratamiento (atomización con péptido) y se midieron sus alturas. El péptido se preparó en una solución de 0.2 pg/ml o 2 pg/ml en agua destilada 0.01 % de Tween-20, y se aplicó como una fina niebla con una botella atomizadora hasta que la solución goteó de las hojas. Tras el secado de las soluciones peptídicas, las plantas se distribuyeron aleatoriamente de nuevo en un diseño de bloques completamente al azar. Tras el tratamiento con péptidos, se inició el estrés por sequía. Esto se logró manteniendo el nivel de agua entre el 25 %- 50 % de la capacidad máxima de agua (la capacidad se determinó como el peso de la maceta llena con tierra saturada menos el peso de la maceta llena antes de añadir agua).

La fase de prueba de sequía finalizó tras 2-3 semanas. En ese momento, se midió de nuevo la altura de la planta y se calculó la tasa de crecimiento como la diferencia entre esta y la altura registrada previamente. Se cosecharon y pesaron las partes aéreas de las plantas. Dicha parte también se secó en un horno a 70 °C durante 72 horas y se obtuvo el peso seco. Todos los cálculos se compararon con plantas de control emparejadas sin tratamiento.

El procedimiento de prueba de sequía se llevó a cabo en maíz utilizando un tratamiento de P5 (SEQ ID NO: 8). El tratamiento con 2.0 pg/ml de péptido provocó un aumento del 3.09 % en la tasa de crecimiento, un aumento del 10.04 % en el peso seco (P < 0.05) y un aumento del 4.01 % en el peso fresco.

Como se muestra en la Tabla 7, la adición de péptidos provocó un fenotipo de resistencia a la sequía.

Tabla 7: Resumen de resistencia a la sequía

*: P <0.1, **: P <0.05

Los resultados experimentales para P5-21 y P5-25 no fueron estadísticamente significativos. Un resultado notable es el de P5-35. Si bien este resultado representa un fenotipo negativo bajo tratamiento, demuestra que el péptido posee cierta bioactividad. Se ha demostrado previamente con otras proteínas harpin que la aplicación excesiva puede producir una respuesta negativa. Experimentos futuros podrían demostrar que la aplicación de concentraciones más bajas de este péptido puede causar una respuesta biológica positiva. Véase el Ejemplo 10 a continuación.

Ejemplo 6- Resistencia al nematodo del nudo de la raíz (RKN) en tomate

Se trasplantaron plántulas de tomate 'Rutgers' a tierra arenosa pasteurizada en macetas de arcilla de 5 pulgadas. Las plantas se rociaron con una solución de péptido hasta que las hojas se saturaron inmediatamente después del trasplante. 2 días después del trasplante, se inocularon las plantas con huevos del nematodo del nudo de la raíz(Meloidogyne incógnita)(5000 huevos por maceta). Las plantas se mantuvieron en invernadero durante aproximadamente 60 días después de la inoculación, lo que corresponde a 2 ciclos de vida del nematodo. Se realizaron dos aplicaciones adicionales por aspersión a los 21 y 42 días después del trasplante.

Para estos ensayos, los tratamientos de control incluyeron un control positivo estándar comercial (Vydate); un control sin tratar, inoculado con RKN; y un control sin tratar y sin inocular. Al final de cada ensayo, se tomaron las siguientes medidas: clasificación de agallas radiculares (basada en el % de raíces con agallas, 1 - mínimo: <5% de raíces con agallas, 2 - leve:5-25%de raíces con agallas, 3 - moderada: 26-50% de raíces con agallas; 4 - alta: más del 50% de raíces con agallas) y recuento del número de huevos de RKN por gramo de raíz.

Con el tratamiento por aspersión con P5 a razón de 46.7 pg/ml, se observó una reducción significativa de las agallas radiculares (4 en plantas no tratadas frente a 2-3 en plantas tratadas). Asimismo, se observó una reducción en el recuento de huevos: un promedio de 165,600 en plantas no tratadas frente a 52,000 en plantas tratadas, una disminución del 69 %, p = 0.02.

Ejemplo 7- Resistencia a la sequía en soja

Se evaluó la eficacia del tratamiento con péptidos para reducir el estrés por sequía en soja. Se llenaron macetas de 3.5 pulgadas con tierra Sunshine #1 (SunGro Horticulture), fertilizada con una mezcla 20-10-20. La tierra se remojó y se drenó durante la noche. Las semillas (soja, inspeccionadas manualmente para asegurar un tamaño uniforme) se plantaron a media pulgada de profundidad para su germinación. Las plantas se cultivaron en un invernadero con 16 horas de luz al día a > 70 °F y 8 horas de oscuridad por noche a > 65 °F. Antes de la sequía, las plantas recibieron abundante riego.

Cuando las plantas alcanzaron la etapa de crecimiento con la primera expansión trifoliar, se cosecharon para lograr una altura uniforme (se eliminaron las plantas anormalmente grandes y pequeñas). Posteriormente, las plantas se asignaron aleatoriamente a grupos de control (atomización sin péptido) o de tratamiento (atomización con péptido) y se midió su altura. El péptido se preparó en una solución de 0.2 pg/ml o 2 pg/ml en agua destilada 0.04 % de Tween-20, y se aplicó como una fina niebla con una botella atomizadora hasta que la solución goteó de las hojas. Tras el secado de las soluciones peptídicas, las plantas se distribuyeron aleatoriamente de nuevo en un diseño de bloques completamente al azar. El estrés cíclico por sequía se inició después del tratamiento con péptidos. Las plantas se sometieron a al menos tres ciclos de sequía de estrés hídrico (3-5 días sin riego y 1 día de riego con saturación de agua) antes de la cosecha.

La fase de prueba de sequía finalizó después de 2-3 semanas. En ese momento, se midió de nuevo la altura de la planta y se calculó la tasa de crecimiento como la diferencia entre esta y la altura registrada previamente. Se cosecharon las partes aéreas de las plantas y se pesaron para obtener el peso fresco. La parte aérea también se secó en un horno a 70 °C durante 72 horas para obtener el peso seco. Todos los cálculos se compararon con plantas de control emparejadas sin tratamiento.

Los resultados se muestran en la Tabla 8 a continuación. Los asteriscos indican la significancia estadística de acuerdo con el valor P (*: P < 0.1 y **: P < 0.05).

Tabla 8: Resumen de la resistencia a la sequía

Ejemplo 8- Comparación de péptidos con agentes químicos contra nematodos en soja

Se evaluó la eficacia de los péptidos en soja (variedad Sheyenne) y se comparó con los productos químicos contra nematodos actuales. Brevemente, se recubrieron semillas de soja comercialmente con péptidos a dosis de 10, 30 o 90 pg por semilla o con nematicidas químicos Avicta Complete, Clariva Complete, Poncho/Votivo o Velum total. Se sembraron 3 semillas de soja en una mezcla de tierra vegetal y arena (pasteurizada) en una maceta de 10 cm de diámetro y se inocularon con 1500 huevos por maceta al momento de la siembra. Se utilizaron 10 macetas replicadas por condición experimental. Después de que las plantas emergieron del suelo, se trasladaron a razón de una planta por maceta. Las plantas se cosecharon aproximadamente 45 días después de la siembra. Se tomaron las siguientes medidas: (1) Peso de los brotes frescos y las raíces; (2) Estado de las raíces, calificado de 0-10 para la presencia de enfermedades; (3) Quistes de nematodos por planta; (4) Huevos de nematodos por planta; y opcionalmente (5) Nematodos macho. Se calcularon los siguientes valores: huevos por gramo de raíz, quistes por gramo de raíz y huevos por quiste.

P5 (SEQID: 8) no mostró una reducción significativa de quistes ni huevos, pero sí causó una reducción de ~ 30 % en el número de nematodos machos. Sin embargo, los tratamientos químicos causaron una mayor reducción de nematodos machos.

P5-21 (SEQID: 33) causó una reducción de quistes por gramo de raíz: 91%con 10 |jg, 80%con 30 |jg y 86%con 90 jg . Estos resultados fueron numéricamente mayores que los resultados de Clariva Complete (76 %) y Avicta Complete (78 %). Los resultados fueron estadísticamente significativamente mayores que los de Poncho/Votivo (58 %). También se observó una reducción significativa de huevos por gramo de raíz: 93 % para un tratamiento con 10 jg , 74 % para un tratamiento con 30 jg y 92 % para un tratamiento con 90 jg . Estos resultados fueron numéricamente superiores a los de Clariva Complete (75 %) y Avicta Complete (72 %) para todas las dosis analizadas. Los resultados de P5-21 a 10 jg y 90 jg fueron estadísticamente significativamente mayores que los de Poncho/Votivo (49 %).

P5-25 (SEQID: 52) también provocó una fuerte reducción de quistes por gramo de raíz: 92 % con 10 jg , 82 % con 30 jg y 91 % con 90 jg . Estos resultados fueron numéricamente superiores a los resultados de Clariva Complete (76 %) y Avicta Complete (78 %). Los resultados con 10 jg y 90 jg fueron estadísticamente significativamente superiores a los de Poncho/Votivo (58 %). Asimismo, se observó una reducción significativa en la cantidad de huevos por gramo de raíz: 94 % con 10 jg , 85 % con 30 jg y 93 % con 90 jg . Estos resultados fueron numéricamente mejores que los de Clariva Complete (75 %) y Avicta Complete (72 %). Los resultados también fueron estadísticamente significativamente mayores que los de Poncho/Votivo (49 %).

Ejemplo 9- Estimulación de las secreciones radiculares contra nematodos en soja mediante P5

Semillas de soja recubiertas con P5 (SEQ ID NO: 8) o un tratamiento simulado se humedecieron y germinaron en papel de estraza durante 48 horas. A continuación, las plántulas se colocaron en un vaso de precipitados con 3 ml de agua destilada por plántula durante 24 horas. Se recogió el exudado líquido y se añadió 1 ml a cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Se añadieron 300 huevos del nematodo del quiste de la soja,Heterodera glycines,a una malla de microtamiz de plástico y se colocaron en cada uno de los 24 pocillos. Tras 3 días de incubación, se contabilizó el número de nematodos eclosionados en el fondo del pocillo. En los pocillos de exudado con tratamiento simulado, los recuentos revelaron un promedio de 40 nematodos eclosionados. En los pocillos de exudado tratados con p5, se contabilizó un promedio de 30 nematodos eclosionados. Esta diferencia fue estadísticamente significativa (P<0.05).

Ejemplo 10- Rendimiento del maíz en condiciones de sequía en el campo

Se evaluó la eficacia del péptido P5 (SEQ ID: 8) para reducir el estrés por sequía en condiciones de campo. En resumen, se seleccionó un sitio en Hughson, Ca , donde la pluviosidad es mínima y se requiere riego para el cultivo. Semillas de maíz híbrido 639STX (Heine Seed Company) se recubrieron con P5 a razón de 12, 35 o 105 jg de péptido por semilla o con un tratamiento simulado. El campo de siembra se dividió en parcelas de 3 surcos (con un espaciamiento de 30”) x parcelas de 25 pies. Se sembró maíz a una tasa de 32,000 semillas viables por acre (6.5 pulgadas de separación entre semillas en surcos de 30 pulgadas). Se sembraron cuatro surcos de borde (10 pies) a ambos lados del ensayo para mitigar los efectos ambientales. Cada grupo de tratamiento se replicó 4 veces y se alineó en un diseño de bloques completos en forma aleatoria.

El riego se gestionó de la siguiente manera: Inicialmente, se regó el sitio para asegurar una buena densidad de plantas y un crecimiento temprano. Se iniciaron dos períodos de sequía. El primero comenzó en la etapa de crecimiento V-3 de la planta y finalizó cuando se observó el enrollamiento de las hojas. El segundo período de sequía comenzó con la emergencia de la espiga y finalizó al final de la liberación de polen. Durante ambos períodos de sequía, se monitoreó el marchitamiento de las plantas para evitar que alcanzaran un punto de marchitamiento permanente.

El tratamiento con P5 resultó en un aumento de 20.2 bushels por acre (Bu/Ac) para el tratamiento de 12 jg/semilla, un aumento de 11.4 Bu/Ac para el tratamiento de 35 jg/semilla y un aumento de 19.7 Bu/Ac para una tasa de tratamiento de 105 jg/semilla. Estos resultados se compararon con un rendimiento promedio de 123.6 Bu/Ac para el control sin tratamiento. Los cultivadores también observaron un aumento en las métricas asociadas con el tamaño de la mazorca de maíz. El número de hileras por mazorca de maíz aumentó de 12.3 (UTC) a 12.7 para 12 jg/semilla, se mantuvo sin cambios para 35 jg/semilla y aumentó a 13.1 para 105 jg/semilla. La masa de las mazorcas de maíz también aumentó de 90.1 gramos por mazorca (UTC) a 104.8 g para 12 jg/semilla, 98.4 g para 35 jg/semilla y 104.5 g para 105 jg/semilla. El número de granos por hilera fue de 25.9 para UTC. Este aumentó a 28.6 para 12 jg/semilla, disminuyó ligeramente a 25.3 para 35 jg/semilla y aumentó a 28.9 para 105 jg/semilla. Estos resultados indican un potente efecto en la conservación del agua en el maíz.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un péptido aislado que tiene 12 a 50 aminoácidos de longitud, comprendiendo el péptido la secuencia de aminoácidos de

(i) L-X-X-L-L-L-X-(F/L)-(I/L)-X-X-X-L (SEQ ID NO: 2)

donde

X en la posición 2 se selecciona de Glu (E), y-glutamato, Asp (D), e isoD;

X en la posición 3 es opcional y, cuando está presente, es Gln (Q); y

cada X en las posiciones 7, 10, 11 y 12 es independientemente seleccionado de Met (M), Ala (A), Glu (E) y yglutamato; o

(ii) (Q/E)-(Q/E)-(L/I/V/F)-X-X-(L/I/V/F)-(L/I/V/F)-(L/I/V/F)-X-(L/I/V/F)-(L/I/V/F)-X-X-X-(L/I/V/F)-(D/G/Q/E)-(D/G/Q/E), (SEQ ID NO: 3),

donde

X en la posición 4 se selecciona de Glu (E), y-glutamato, Asp (D), e isoD;

X en la posición 5 es opcional y, cuando está presente es Gln (Q), y

cada X en las posiciones 9, 12, 13, y 14 es independientemente seleccionado de Met (M), Ala (A), Glu (E), y yglutamato o

(iii) (L/I/V/F)-X-X-(L/I/V/F)-(L/I/V/F)-(L/I/V/F)-X-(L/I/V/F)-(L/I/V/F)-X-X-X-(L/I/V/F)-(D/G/Q/E)-(D/G/Q/E), (SEQ ID NO: 4),

donde

X en la posición 2 se selecciona entre Glu (E), Y-glutamato, Asp (D), e isoD;

X en la posición 3 es opcional y, cuando está presente es Gln (Q); y

cada X en las posiciones 7, 10, 11 y 12 se selecciona independientemente entre Met (M), Ala (A), Glu (E), y yglutamato; o

(iv) (Q/E)-(Q/E)-(L/I/V/F)-X-X-(L/I/V/F)-(L/I/V/F)-(L/I/V/F)-X-(L/I/V/F)-(L/I/V/F)-X-X-X-(L/I/V/F), (SEQ ID NO: 5), donde

X en la posición 4 se selecciona entre Glu (E), Y-glutamato, Asp (D), e isoD;

X en la posición 5 es opcional y, cuando está presente es Gln (Q); y

cada X en las posiciones 9, 12, 13 y 14 se selecciona independientemente entre Met (M), Ala (A), Glu (E), y<y>-glutamato;

donde el péptido induce una respuesta activa de la planta cuando se aplica al tejido de la planta y, opcionalmente, induce una respuesta de hipersensibilidad.

2. El péptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, donde el péptido está libre de cisteína y metionina.

3. El péptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además una secuencia de aminoácido hidrofílico en su extremo terminal N o extremo terminal C del mismo.

4. El péptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, donde el péptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4

donde

X en la posición 2 se selecciona de Glu (E), y-glutamato, Asp (D), e isoD;

X en la posición 3 es opcional y, cuando está presente es Q; y

cada X en las posiciones 7, 10, 11, y 12 es independientemente seleccionado de M, A, E, y y-glutamato.

5. El péptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, donde el péptido aislado tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 o 5 y X en la posición 5 está presente, y es Q.

6. El péptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, donde el péptido aislado tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 o 5 y X en la posición 4 se selecciona del grupo que consiste en D y E.

7. El péptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, donde el péptido aislado tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 o 5 y X en la posición 9 se selecciona del grupo que consiste en A, M, y E o cada X en las posiciones 12, 13, y 14 es independientemente seleccionado del grupo que consiste en A, M, y E.

8. El péptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, donde el péptido aislado tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 o 5 y X en la posición 10 es F o L, o X en la posición 11 es I o L.

9. El péptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, donde el péptido comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 8-14, 20, 29, 30, 33, 34, 42-45, 50, 52-58, 75, 78-80, 139, 140, 518, 524, 531-538, o 540.

10. El péptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, donde el péptido aislado tiene un índice de hidropatía promedio de Kyte-Doolittle de menos de 0.7

11. El péptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, donde el péptido aislado, cuando se disuelve en agua o solución acuosa a 50 °C durante 7 días, tiene una estabilidad de al menos 66 %.

12. El péptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, donde el péptido aislado tiene una solubilidad de al menos 5.0 mg/ml en agua o solución acuosa.

13. El péptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, donde el péptido induce una respuesta activa de la planta, pero no induce una respuesta de hipersensibilidad, cuando se aplica al tejido de la planta, y donde el péptido comprende la secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NOS: 13, 52, 53 y 140.

14. El péptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, donde el péptido induce una respuesta de hipersensibilidad cuando se aplica al tejido de la planta, y donde el péptido comprende la secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NOS: 8-12, 14, 20, 29, 30, 33, 34, 42-45, 50, 54-58, 75, 78-80, 139, 518, 524, 531-538, y 540.

15. El péptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, donde X en la posición 3 de la SEQ ID NO: 2 o 4 está presente, y es Q, donde X en la posición 2 de la SEQ ID NO: 2 o 4 se selecciona del grupo que consiste en D e isoD, donde X en la posición 7 de la SEQ ID NO: 2 o 4 se selecciona del grupo que consiste en A, M, o E, o donde cada X en las posiciones 10, 11 o 12 de la SEQ ID NO: 2 o 4 se selecciona independientemente del grupo que consiste en M, A, y E.

16. El péptido aislado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 15, donde el péptido tiene una pureza de al menos el 90 %.

17. El péptido aislado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 15, donde el péptido es un polipéptido de fusión que comprende una segunda secuencia de aminoácidos acoplada mediante un enlace peptídico a la secuencia de aminoácidos, donde la segunda secuencia de aminoácidos incluye opcionalmente un marcador de purificación o una secuencia de aminoácidos hidrofílica en el extremo terminal N o terminal C, o el polipéptido de fusión comprende opcionalmente una primera secuencia de aminoácidos para dicho péptido enlazado a una segunda secuencia de aminoácidos para dicho péptido.

18. El péptido aislado de acuerdo con la reivindicación de 17, donde la segunda secuencia de aminoácidos comprende un marcador de purificación que incluye además una secuencia enlazadora escindible entre el marcador de purificación y la secuencia de aminoácidos.

19. Un polipéptido de fusión que comprende una pluralidad de secuencias de aminoácidos unidas en serie, comprendiendo cada una de la pluralidad de secuencias de aminoácidos el péptido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1a 15.

20. Una composición que comprende uno o más péptidos de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 18 o un polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 19, y un portador.

21. La composición de acuerdo con la reivindicación 20, que comprende además un aditivo seleccionado del grupo que consiste en fertilizante, herbicida, insecticida, fungicida, nematicida, un agente bactericida, un inóculo biológico, un fitorregulador y mezclas de los mismos.

22. La composición de acuerdo con la reivindicación 20, donde el vehículo es un vehículo acuoso que opcionalmente comprende además uno o más de un agente biocida, un inhibidor de proteasa, un tensioactivo no iónico, o una combinación de los mismos, o el vehículo es un vehículo sólido en forma particulada, preferiblemente un polvo seco.

23. Un método para impartir resistencia a las plantas a una enfermedad, mejorar el crecimiento de las plantas, o aumentar la tolerancia de las planta al estrés biótico o abiótico, que comprende:

aplicar una cantidad eficaz de un péptido aislado, de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 18, un polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 19, o una composición de acuerdo con una de las reivindicaciones 20 a 22 a una planta o semilla de una planta o al lugar donde la planta crece o se espera que crezca, donde dicha aplicación es eficaz para impartir resistencia a la enfermedad, mejorar el crecimiento de la planta, o aumentar la tolerancia al estrés biótico o abiótico, donde el estrés biótico se selecciona del grupo que consiste en insectos, arácnidos, nemátodos, malezas, y combinaciones de los mismos, o donde el estrés abiótico se selecciona del grupo que consiste en estrés salino, estrés hídrico, estrés por ozono, estrés por metales pesados, estrés por frío, estrés térmico, estrés nutricional y combinaciones de los mismos.

24. El método de acuerdo con la reivindicación 23, donde el método es un método para impartir resistencia a enfermedades a las plantas y la enfermedad es una enfermedad viral, una enfermedad bacteriana, o una enfermedad fúngica.

25. El método de acuerdo a la reivindicación 23 coma donde el método es un método para mejorar el crecimiento de las plantas y el crecimiento mejorado comprende mejorar el vigor de la planta, aumentar el peso de la planta, aumentar la biomasa, aumentar el número de flores por planta, mayor rendimiento de granos y/o frutos, más macollos o brotes laterales, hojas más grandes, mayor crecimiento de los brotes, mayor contenido de proteínas, mayor contenido de aceite, mayor contenido de almidón, mayor contenido de pigmentos, mayor contenido de clorofila y combinaciones de los mismos.

26. El método de acuerdo con la reivindicación 23, donde dicha aplicación se lleva a cabo con una planta.

27. El método de acuerdo con la reivindicación 23, donde dicha aplicación se lleva a cabo con una semilla de una planta, dicho método comprende además plantar la semilla tratada con el péptido o la composición en un suelo natural o artificial, y propagar una planta de la semilla plantada en el suelo.

28. El método de acuerdo con la reivindicación 23, donde dicha aplicación se lleva a cabo en el lugar donde la planta crece o se espera que crezca.

29. El método de acuerdo con la reivindicación 23, donde la planta se selecciona entre plantas agrícolas, silvícolas, ornamentales y hortícolas, cada una en su forma natural o modificada genéticamente.

30. El método de acuerdo con la reivindicación 23, donde la planta que se va a tratar se selecciona del grupo que consiste en alfalfa, manzana, albaricoque, espárrago, aguacate, plátano, cebada, frijoles, haya (especie Fagus), begonia, abedul, mora, arándano, repollo, alcanfor, canola, zanahoria, planta de ricino, cereza, canela, cítricos, grano de cacao, café, maíz, algodón, pepino, calabaza, eucalipto, abeto, lino, remolacha forrajera, fucsia, ajo, geranio, uvas, cacahuete, cáñamo, lúpulo, baya de junio, juncea(Brassica júncea),yute, lenteja, lechuga, linaza, melón, mostaza, nectarina, roble, avena, palma aceitera, colza, aceituna, cebolla, pimentón, guisante, melocotón, pera, pelargonio, pimientos, petunia, pino (especiePinus),ciruela, álamo (especiePopulus),fruta de pepita, patata, colza, frambuesa, arroz, árbol del caucho, centeno, sorgo, soja, espinaca, abeto, chayote, fresa, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, té, teca, tabaco, tomate, triticale, césped, sandía, trigo y sauce (especieSalix).

31. Un método para modular la señalización bioquímica de la planta que comprende: aplicar una cantidad eficaz de un péptido aislado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 18, un polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 19, o una composición de acuerdo con una de las reivindicaciones 20 a 22 a una planta o semilla de una planta o al lugar donde la planta crece o se espera que crezca, donde dicha aplicación es efectiva para modular la señalización bioquímica de la planta.

32. Una construcción de ADN que comprende una primera molécula de ácido nucleico que codifica un péptido de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 18 o un polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 19, y una molécula de ácido nucleico efectiva para promover operativamente acoplada a la primera molécula de ácido nucleico.

33. Un vector de expresión recombinante o una célula huésped recombinante que comprende la construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 32.

34. La célula huésped recombinante de acuerdo con la reivindicación 33 coma donde la célula huésped recombinante es (i) un protoplasto de una planta, (ii) una bacteria, donde la bacteria es opcionalmente un miembro seleccionado del grupo que consiste en Pseudomonas, Esfingomonas, Bacilos, Estreptomices, Rhizobium, Frankia y Azospirillum, o (iii) un hongo, donde el hongo es opcionalmente un miembro del género seleccionado del grupo que consiste en Rhodotorula, Aspergillus, y Trichoderma.

35. Una planta transgénica o semilla de una planta transgénica que comprende una célula huésped recombinante de acuerdo con la reivindicación 33 o la construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 32.