ES3039612T3 - Peptides for use as senotherapeutic agents - Google Patents

Abstract

Péptidos para su uso como agentes senoterapéuticos. La presente invención se refiere a agentes senoterapéuticos que comprenden diferentes péptidos para su uso en la prevención o el tratamiento de enfermedades asociadas al envejecimiento causadas por la persistencia y acumulación de células senescentes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Péptidos para su uso como agentes senoterapéuticos

Campo de la invención

La presente invención pertenece al campo médico. En particular, la presente invención se refiere a agentes senoterapéuticos que comprenden un péptido de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. En una realización preferida, la presente invención se refiere a la prevención o al tratamiento de la osteoartritis provocada por la persistencia y acumulación de células senescentes (SnC).

Estado de la técnica

La osteoartritis (OA) es la forma más común de artritis y se ha clasificado como una enfermedad asociada al envejecimiento [1, 2]. La OA es un trastorno degenerativo de las articulaciones caracterizado por la degeneración progresiva de las articulaciones sinoviales, lo que conduce a movilidad limitada y dolor [3]. Esta enfermedad es la principal causa de discapacidad con un impacto socioeconómico elevado, que afecta a un número creciente de la población envejecida [4, 5]. El daño del cartílago articular es el signo más típico de OA. Sin embargo, esta afección también afecta a toda la articulación, incluyendo el hueso, la membrana sinovial, los músculos, los tendones y los ligamentos. El cartílago articular de pacientes con OA muestra una acumulación de células desdiferenciadas y senescentes (SnC) junto con un aumento en la producción de citocinas proinflamatorias tales como IL-6 e IL-1 p y enzimas catabólicas que conducen a la degradación de la matriz extracelular (ECM) del cartílago y a la degradación articular. La prevalencia de la OA está en aumento a nivel mundial y la etiología aún se está estudiando, empezando las nuevas visiones sobre los mecanismos moleculares implicados en la progresión de OA a abrir nuevas posibilidades para restablecer la estabilidad fenotípica de condrocitos articulares y desarrollar nuevos enfoques con el fin de promover la reparación de cartílago y restablecer la función articular normal en pacientes con OA [6-8]. La acumulación de SnC ha estado implicada en la progresión de diferentes enfermedades relacionadas con la edad tales como osteoartritis (OA) [7, 9-12]. La senescencia celular consiste en un mecanismo de detención del ciclo celular a través de la activación sostenida de las rutas p16INK4A y/o p53-p21, que están implicadas en diferentes procesos biológicos tales como el desarrollo y la reparación de tejidos. Las células senescentes dejan de dividirse pero son células metabólicamente activas, secretando factores denominados fenotipo secretor asociado a senescencia (SASP), que incluyen citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento y proteasas [13]. Este secretoma es muy complejo y sus productos están asociados principalmente con la inflamación, reprogramación, desdiferenciación y proliferación de células circundantes junto con cambios en la síntesis y degradación de la matriz extracelular. La acumulación de SnC en una afección crónica afecta negativamente a la estructura y función tisulares. Ejemplos de enfermedades asociadas al envejecimiento, que se han asociado con la acumulación de SnC, son (lista no exhaustiva): obesidad, sarcopenia, enfermedad fibrótica, aterosclerosis, enfermedad cardiovascular, cáncer, OA, artritis, cataratas, osteoporosis, diabetes, enfermedad de Alzheimer, caída del cabello, hipertensión, enfermedad inflamatoria, demencia, enfermedad renal, atrofia muscular, enfermedad neurológica, enfermedad pulmonar, degeneración de discos vertebrales y alopecia. La incidencia de todas estas enfermedades aumenta exponencialmente con la edad [9].

Las SnC se acumulan con la edad y contribuyen al desarrollo de enfermedades asociadas con la edad. Como resultado, han surgido recientemente diferentes estrategias para dirigirse terapéuticamente a las SnC. El enfoque terapéutico que aprovecha los compuestos que se dirigen a las SnC (senoterapéuticos) se describe comúnmente como senoterapia. Los agentes senoterapéuticos comprenden agentes senolíticos (destruyen selectivamente las SnC) y agentes senomórficos/senostáticos (compuestos que modulan el SASP). Se ha notificado que la eliminación de SnC y/o el direccionamiento de las rutas implicadas en la producción y secreción de SASP alivian los síntomas o la evolución de algunas enfermedades relacionadas con la edad, incluyendo en la OA. Sin embargo, todavía existe una clara necesidad médica de agentes senoterapéuticos eficaces con capacidad regenerativa capaces de inducir selectivamente la muerte de las SnC y/o reducir su acumulación en tejido envejecido con el fin de restablecer la regeneración y la función normal del tejido.

Se ha notificado que la proteína transmembrana conexina 43 (Cx43) refuerza la senescencia y la desdiferenciación en condrocitos articulares de pacientes con OA y contribuye a la progresión de la enfermedad [6]. Sin embargo, Cx43 es una proteína de formación de canales compleja implicada en múltiples procesos biológicos. Las diferentes y diversas funciones de Cx43 están mediadas específicamente por pequeños dominios a lo largo de la secuencia de la proteína [14, 16-18]. En realidad, se han diseñado y probado varios compuestos que incluyen diferentes compuestos peptídicos para modular una función específica de la proteína sin afectar a otras funciones [15, 19, 20]. Están surgiendo inhibidores farmacológicos que se dirigen específicamente a determinadas actividades de Cx43, tales como péptidos terapéuticos, como fármacos prometedores para el tratamiento de diferentes trastornos tales como cáncer o neurodegeneración al dirigirse a interacciones proteína-proteína [15, 20, 21].

De hecho, las interacciones proteína-proteína de modulación dirigida mediante péptidos terapéuticos han representado una clase única y potente de compuestos farmacéuticos que está proporcionando medicamentos que salvan vidas desde la primera mitad del siglo XX. Ya se han aprobado más de 60 fármacos peptídicos dirigidos a diferentes dominios proteicos y más de 150 nuevos péptidos están en desarrollo clínico activo [22-24].

La presente invención se refiere a péptidos que pueden usarse como agentes senoterapéuticos para restablecer la regeneración para la prevención o el tratamiento de la OA provocada por la persistencia y acumulación de células desdiferenciadas y senescentes, en particular condrocitos senescentes y células desdiferenciadas en el cartílago articular y en las articulaciones sinoviales.

Se reconocen los siguientes documentos de la técnica anterior:

D1. Documento WO2017180896.

D2. Documento WO2013163423.

D3. E GANGOSOET AL.,“A cell-penetrating peptide based on the interaction between c-Src and connexin43 reverses glioma stem cell phenotype”, C<e>LL DEATH & DISEASE, (20140101), vol. 5, n.° 1, doi:10.1038/cddis.2013.560.

D4. Laura García Vicente, “Capacidad de internalización de péptidos penetrantes en células de glioma, neuronas y astrocitos”, (20160101), URL: https://gredos.usal.es/bitstream/handle/10366/135823/16TFG382_GARCiA%20VICENTE_L AURA.pdf?sequence=1&isAllowed=y

D5. MARTA VARELA-EIRÍNET AL.,“Targeting of chondrocyte plasticity via connexin43 modulation attenuates cellular senescence and fosters a pro-regenerative environment in osteoarthritis”, CELL DEATH & DISEASE, (20181201), vol. 9, n.° 12, doi:10.1038/s41419-018-1225-2.

Sin embargo, ninguno de los documentos citados de la técnica anterior da a conocer el uso de péptidos que consisten en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 como medicamento, en particular como estrategia eficaz y no tóxica para prevenir o tratar la osteoartritis.

Descripción de la invención

Breve descripción de la invención

La presente invención se refiere a agentes senoterapéuticos que comprenden los siguientes péptidos, y a su uso en la prevención o el tratamiento de la OA provocada por la persistencia y acumulación de células senescentes:

• SEQ ID NO: 1 (YSA1): M-GKSDPYHATSGALSPAKD-Cf

• SEQ ID NO: 2 (YTP1): M-GKSDPYHATTGPLSPAKD-Cf

En una realización preferida, los péptidos SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 se han seleccionado de una región de la proteína Cx43 que está comprendida entre los residuos 232 y 266.

En una realización preferida, los péptidos citados anteriormente pueden comprender una cola de 8 argininas en el dominio N-terminal para facilitar la internalización de los péptidos dentro de la célula, así como otra etiqueta tal como TAT u otras moléculas que facilitan su internalización.

Se somete a ensayo la OA como ejemplo ilustrativo de enfermedades asociadas al envejecimiento provocadas por la persistencia y acumulación de células senescentes. Tal como se explica a continuación, los péptidos de la invención pueden i) reducir la acumulación de células senescentes de condrocitos, por ejemplo, induciendo su muerte por medio de la apoptosis o inhibición del SASP y/o ii) desencadenar la rediferenciación de condrocitos una vez que se han desdiferenciado.

Tal como puede observarse en los resultados proporcionados por la presente invención:

• Los péptidos de la invención no muestran toxicidad (véase el Ejemplo 2.1 y la Figura 2).

• La presencia de la cola de arginina (8-Arg) mejora la internalización de los péptidos en las células (véase el Ejemplo 2.2 y la Figura 3).

• El tratamiento con los péptidos de la invención da lugar a una disminución en los niveles de Cx43 en condrocitos de pacientes con OA (Cx43 está significativamente aumentada en el cartílago articular de pacientes que padecen OA y conduce a senescencia y desdiferenciación) (véase el Ejemplo 2.3 y la Figura 4).

• Los péptidos de la invención disminuyen la comunicación intercelular a través de uniones comunicantes en condrocitos de OA (véase el Ejemplo 2.4 y la Figura 5).

• Los péptidos de la invención mejoran el fenotipo del condrocito de OA aumentando la expresión de componentes y biomarcadores de la matriz extracelular del cartílago articular; disminuyendo la pérdida de fenotipo implicada en la progresión de OA y reduciendo significativamente el número de células senescentes (véase el Ejemplo 2.5 y la Figura 6).

• El tratamiento con los péptidos de la invención mejora la composición y estructura de la matriz cartilaginosa secretada por los condrocitos en cultivos 3D en micromasas (véase el Ejemplo 2.6 y la Figura 7).

Por tanto, estos péptidos son útiles para el tratamiento de la OA u otras enfermedades asociadas al envejecimiento que progresan con la acumulación de células senescentes. La OA puede usarse en la presente invención como ejemplo ilustrativo para demostrar la idoneidad de los péptidos de la invención para i) reducir la acumulación de células senescentes, por ejemplo, induciendo su muerte por medio de apoptosis o inhibición del SASP y/o ii) desencadenar la rediferenciación de células una vez se han desdiferenciado. No obstante, esto significa que los péptidos de la invención podrían usarse para la prevención y el tratamiento no sólo de la OA, sino de cualquier otra enfermedad asociada al envejecimiento asociada con la persistencia y acumulación de células senescentes, por ejemplo (lista no exhaustiva): obesidad, enfermedad renal, sarcopenia, enfermedad fibrótica, aterosclerosis, enfermedad cardiovascular, cáncer, artritis, cataratas, osteoporosis, diabetes tipo 2 o enfermedad de Alzheimer. La incidencia de todas estas enfermedades aumenta exponencialmente con la edad [9].

Por tanto, la primera realización de la presente invención se refiere a un agente senoterapéutico que comprende al menos un péptido seleccionado de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. En una realización preferida, los péptidos comprenden una cola N-terminal con 8 argininas.

La segunda realización de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el agente senoterapéutico mencionado anteriormente y, opcionalmente, excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables. En una realización preferida, los péptidos o la composición farmacéutica se administran por vía oral o por medio de una inyección intraarticular, subcutánea, intravenosa o muscular.

La tercera realización de la presente invención se refiere a un péptido seleccionado de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 (o una composición farmacéutica que comprende dichos péptidos), para su uso como agente senoterapéutico, preferiblemente en la prevención o el tratamiento de la osteoartritis. En una realización preferida, la prevención o el tratamiento de la osteoartritis se logra reduciendo la acumulación de células senescentes de condrocitos. En una realización preferida, la prevención o el tratamiento de la osteoartritis se logra desencadenando la rediferenciación de condrocitos osteoartríticos una vez que se han desdiferenciado.

Para el fin de la presente invención, se proporcionan las siguientes definiciones:

• Según la presente invención, “senescencia celular” se refiere a un estado biológico natural en el que una célula detiene permanentemente la división celular. Las células senescentes se acumulan con la edad y secretan más de 100 moléculas biológicamente activas diferentes, incluyendo factores proinflamatorios, proteasas, factores profibróticos y factores de crecimiento que alteran el microentorno tisular. Este secretoma se denomina SASP. Además de sus efectos sobre la función tisular, SASP contiene factores que inducen senescencia, desdiferenciación y reprogramación en células vecinas, estableciendo una cascada de acontecimientos que culmina en la formación del tejido enfermo y/o envejecido funcionalmente que parece ser la base de la progresión de una variedad de enfermedades relacionadas con la edad. Por tanto, la eliminación de células senescentes y la modulación de SASP, abordan una causa fundamental de la progresión de enfermedades del envejecimiento.

• Según la presente invención, los “agentes senoterapéuticos con capacidad regenerativa” se diseñan para eliminar selectivamente las células senescentes y/o seleccionar como diana el SASP. Más específicamente, el agente senoterapéutico es una molécula que puede i) reducir la acumulación de células senescentes, por ejemplo, induciendo su muerte por medio de apoptosis o inhibición del SASP y ii) desencadenar la rediferenciación de las células una vez se han desdiferenciado. Tanto los niveles de senescencia reducidos como la potenciación de la rediferenciación restablecen la capacidad de los tejidos para restablecer la regeneración. El fin de los “agentes senoterapéuticos” es retrasar, prevenir, aliviar o revertir enfermedades relacionadas con la edad que están provocadas por la persistencia y acumulación de células senescentes, ya que la senescencia por medio de SASP también induce inflamación, reprogramación y desdiferenciación de células vecinas, siendo por tanto uno de los factores clave implicados en la degeneración tisular y la progresión de enfermedades asociadas al envejecimiento [25, 26].

• “Excipiente o portador farmacéuticamente aceptable” se refiere a un excipiente que puede incluirse opcionalmente en la composición de la invención y que no provoca efectos toxicológicos adversos significativos al paciente.

• Por “dosis o cantidad terapéuticamente eficaz” la presente invención se refiere a la situación en la que los péptidos o la composición se administran tal como se describió anteriormente, y se logra una respuesta terapéutica positiva en un sujeto que tiene una enfermedad asociada al envejecimiento. La cantidad exacta requerida variará de un sujeto a otro, dependiendo de la especie, la edad y el estado general del sujeto, la gravedad de la afección que está tratándose, el modo de administración, y similares. Una cantidad “eficaz” apropiada en cualquier caso individual puede determinarla un experto habitual en la técnica usando experimentación de rutina, basándose en la información proporcionada en el presente documento. Preferiblemente, una cantidad terapéuticamente eficaz restablece la función del nervio periférico.

• El término “que comprende” pretende incluir, pero no limitarse a, lo que siga a continuación de la expresión “que comprende”. Por tanto, el uso del término “que comprende” indica que los elementos enumerados se requieren o son obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden o no estar presentes.

• Por “que consiste en” se pretende incluir, y limitarse a, lo que siga a continuación de la expresión “que consiste en”. Por tanto, la expresión “que consiste en” indica que los elementos enumerados se requieren o son obligatorios, y que no pueden estar presentes otros elementos.

Descripción de las figuras

Figura 1. Diagrama representativo de las secuencias correspondientes a los péptidos sometidos a ensayo en la presente invención. (a) El péptido YSA1 se corresponde con los residuos 242-259 del dominio C-terminal (CTD) de Cx43, que incluye sitios de fosforilación de Src (Y247) y MAPK (S255). El péptido YTP1 incluye la misma secuencia, pero con dos mutaciones (S251T, A253P) que se encuentran en la secuencia de la proteína de seudogén de Cx43 (GJA1P). Se añadió una secuencia de penetración de 8 argininas al péptido YSA1 para facilitar su entrada en la célula (8Arg-YSA1). Posteriormente, se mutó YSA1 en el residuo Y247 (Src) con un residuo de 3-nitrotirosina para obtener el péptido YSA1-NO2. El péptido TUB1 se corresponde con los residuos 232-243 del dominio CTD de Cx43, que incluye sitios de unión de microtúbulos (K234-K243). Todos los péptidos se marcaron en su extremo A/-terminal con el fluoróforo TMR para permitir su detección mediante fluorescencia. (b) Diagrama topológico de Cx43 que muestra la región total de interés del residuo F232-D265.

Figura 2. Ensayo de viabilidad celular para estudiar la toxicidad. Se llevó a cabo un ensayo de viabilidad con MTT en condrocitos primarios de cartílago articular de pacientes con OA tratados con concentraciones crecientes del péptido 8Arg-YSA1 (1-10-60-600 |iM, con la secuencia de octaarginina y la TMR), durante 16 horas. Tal como se indica en la figura, las diferentes concentraciones estudiadas no afectaron a la viabilidad celular con respecto a las mismas células no tratadas (NT).

Figura 3. La presencia de la cola de octaarginina (8-Arg) mejora la internalización de la secuencia del péptido YSA1. Se trataron condrocitos a una confluencia del 70-80 % durante 16 horas con los péptidos marcados con TMR para visualización a nivel celular a una concentración de 150 |iM (YSA1, YTP1 e YSA1-NO2). La presencia de la cola de 8-Arg aumenta la penetrancia del péptido permitiendo la reducción de la concentración eficaz hasta 30 veces (5 |iM), tanto en el caso del péptido 8Arg-YSA1 como de 8Arg-TUB1. Las imágenes indican que YSA1 y TUB1 se sitúan principalmente en el nivel citoplásmico.

Figura 4. Disminución en los niveles de Cx43 en condrocitos de pacientes con OA tratados con los péptidos YSA1, YTP1 y TUB1. Los pacientes con OA tienen niveles significativamente elevados de Cx43 en el cartílago articular, lo que activa la desdiferenciación celular por medio de EMT mediante la activación de Twist-1 y la senescencia celular mediada por p53/p16. La disminución en los niveles y la actividad de Cx43 activa la rediferenciación del condrocito y disminuye la acumulación de células senescentes, restableciendo el fenotipo del condrocito adulto y la capacidad de regeneración tisular. (a) Se detectó una disminución en la positividad para Cx43 en los condrocitos de OA mediante estudios de inmunofluorescencia para la detección de Cx43, especialmente en la membrana, o en el margen de las células, cuando las células se trataron con 200 |iM de YSA1 o YTP1, y en comparación con células sin tratar (UT) (a) o con 5 |iM del péptido 8-Arg-YSA1. (b) Los resultados obtenidos se confirmaron mediante inmunotransferencia de tipo Western usando a-tubulina como control de carga. (c) El tratamiento con YSA1 150 |iM durante 16 horas redujo significativamente los niveles de Cx43 en condrocitos de OA, en comparación con las mismas células sin tratar (UT). (d) Se trataron condrocitos aislados de donantes con osteoartritis durante 16 horas con el péptido YTP1 (150 |iM) y se analizaron los niveles de Cx43 mediante inmunotransferencia de tipo Western, usando a-tubulina como control de carga. Como con el péptido YSA1, el tratamiento con el péptido YTP1 redujo los niveles de Cx43 en condrocitos de OA, en comparación con las mismas células sin tratar (UT). (e) Se trataron condrocitos aislados de donantes con OA durante 16 horas con el péptido 8Arg-YSA1 (5 |iM) y se analizaron los niveles de Cx43 mediante inmunotransferencia de tipo Western, usando a-tubulina como control de carga. (f) La nitración del residuo Y247 del péptido YSA1 evitó la disminución de Cx43 cuando los condrocitos se tratan con este péptido modificado (YSA1-NO2), lo que indica la importancia de esta tirosina para la actividad del péptido YSA1 y su posible aplicación para el tratamiento de la OA. (g) Se trataron condrocitos aislados de donantes con OA durante 16 horas con el péptido TUB1 (5 |iM) y se analizaron los niveles de Cx43 mediante inmunotransferencia de tipo Western, usando la intensidad de la tinción Ponceau como control de carga. Como con los péptidos anteriores, el tratamiento con el péptido TUB1 redujo los niveles de Cx43 en condrocitos de OA, en comparación con las mismas células sin tratar (UT). (h) Las imágenes de inmunofluorescencia confirman que el péptido nitrado YSA1-NO2 puede atravesar la membrana celular, pero no disminuye los niveles de Cx43 (inmunofluorescencia).

Figura 5. Los péptidos YSA1 y YTP1 disminuyen la comunicación intercelular a través de uniones comunicantes (UC) formadas por Cx43 en condrocitos de OA. (a) Ensayo Scrape Loading / Dye Transfer (carga por raspado / transferencia de colorante) (SL / DT) en el que se estudia la transferencia de fluoróforo Lucifer Yellow (LY) entre condrocitos en contacto a través de UC. Los condrocitos de OA tratados con el péptido YSA1 (150 |iM) durante 16 horas mostraron una disminución en el acoplamiento celular en comparación con las células sin tratar (UT). (b) La presencia de 8-Arg disminuyó el acoplamiento celular mediado por este péptido a concentraciones inferiores (5 |iM, 16 h). (c) El tratamiento con YTP1 disminuyó el acoplamiento celular a través de UC cuando las células se trataron con YTP1 150 |iM durante 16 horas.

Figura 6. Los péptidos de esta invención mejoran el fenotipo de condrocitos de OA disminuyendo la senescencia implicada en la progresión de OA y aumentando la expresión de las proteínas de la matriz extracelular del cartílago. Los condrocitos de OA muestran niveles aumentados de Cx43 asociados con EMT y senescencia mediante Twist-1 y p53/p21/p16, respectivamente. Además, la acumulación de células senescentes está implicada en la progresión de OA. (a) El tratamiento con el péptido 8Arg-YSA1 (5 |iM) durante 16 horas condujo a la expresión reducida de Twist-1, un factor de la transcripción que activa la desdiferenciación celular por medio de EMT, y los factores de activación de senescencia p16 y p21. Los niveles de ARN de Twist-1, p16 y p21 se normalizaron con respecto a los niveles de HPRT1 y se compararon con OAC sin tratar (condrocitos de osteoartritis) (UT). (b) Las SnC comparten características comunes que se usan ampliamente para detectar y/o dirigirse a este tipo de células. Dentro de los biomarcadores compartidos comúnmente, las SnC muestran actividad de p-galactosidasa lisosomal ácida mejorada (SA-p-Gal), expresión aumentada de los inhibidores de cinasa dependientes de ciclina p21CIP y p16INK4A, y secreción mejorada de factores proinflamatorios y de remodelación tisular dentro del SASP. El análisis de la expresión génica de OAC tratados con 8Arg-YSA1 (5 |iM) durante 16 horas confirmó la regulación por disminución de factores de SASP incluyendo citocinas proinflamatorias (IL-1 p, IL-6, COX-2) y enzimas que degradan la matriz tales como metaloproteasa-3 (MMP-3) y expresión aumentada de marcadores de la ECM de cartílago, tales como agrecano (ACAN). Los niveles de ARN se normalizaron con respecto a los niveles de HPRT1 y se compararon con condrocitos de OA sin tratar (UT). (c) El tratamiento de OAC durante 7 días con el péptido 8Arg-YSA1 (5 |iM) redujo significativamente el número de células senescentes detectadas por tinción con p-galactosidasa. (d) El tratamiento con el péptido 8Arg-TUB1 (5 |iM) durante 16 horas también conduce a la expresión reducida de Twist-1 y los factores de activación de senescencia p16 y p21 en OAC. (e) Además, los OAC tratados con 8Arg-TUB1 (5 |iM) durante 16 horas condujeron a la expresión disminuida de los factores de SASP IL-1 p, IL-6, COX-2 y MMP-3. (f) El tratamiento de OAC durante 7 días con el péptido 8Arg-TUB1 (5 |iM) redujo significativamente el número de células senescentes detectadas por tinción con p-galactosidasa.

Figura 7. YSA1 y TUB1 mejoran la composición y estructura de la matriz extracelular de condrocitos cultivados como micromasas. Los condrocitos aislados de donantes con OA se cultivaron como micromasas 3D durante 14 días en medio de crecimiento normal o en medio condrogénico (CM) solo o complementado con 5 |iM de los péptidos 8Arg-YSA1 o 8Arg-TUB1. La tinción con hematoxilina-eosina mostró que las micromasas tratadas con estos péptidos conducen a una mejor estructura de la ECM. Además, la tinción con azul de toluidina mostró una deposición aumentada de proteoglicanos en la ECM de micromasas tratadas con los péptidos 8Arg-YSA1 u 8Arg-TUB1, tal como se detecta mediante la coloración violeta aumentada.

Descripción detallada de la invención

Ejemplo 1. Materiales y métodos.

Ejemplo 1.1. Cultivo primario.

Se obtuvieron los cultivos primarios de condrocitos de cartílago articular de la cadera y rodilla de pacientes con OA y de individuos sanos en elComplexo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela(CHUS-XXIS) bajo consentimiento informado y aprobado por el Comité de Ética Institucional, dentro de la colección privada de muestras biológicas del grupo (C.0003333, 2012/094 y 2015/029). Con la ayuda de un bisturí, se separó el cartílago del hueso y se dividió en pequeños fragmentos de 1 mm. Entonces se digirieron los fragmentos de manera enzimática con tripsina durante 10 min a 37 °C con agitación, seguido por digestión con colagenasa IV a 37 °C con agitación durante 16 horas. Posteriormente, la muestra se hizo pasar a través de un filtro de 100 |iM y se sembraron las células en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Lonza) complementado con suero bovino fetal al 10 % (SFB, Gibco, Thermo Scientific) y penicilina (100 U / ml) / estreptomicina (100 |ig / ml) al 1% (Gibco, Thermo Scientific) y se mantuvo en cultivo en un incubador a 37 °C, 5% de CO<2>y saturación de humedad.

Ejemplo 1.2. Síntesis de péptidos.

Se sintetizaron los péptidos sometidos a prueba en el Centro Singular de Investigación en Química Biolóxica e Materiais Moleculares (CIQUS) y Centro de Investigacións Científicas Avanzadas (CICA). La secuencia del péptido YSA1 se corresponde con parte del dominio C-terminal de Cx43 y contiene un sitio de fosforilación de la Src cinasa (Y247) y otro sito de fosforilación (S255) de la proteína cinasa activada por mitógeno (Mitogen-Activated Protein Kinase, MAPK). Se sintetizó un nuevo péptido de secuencia similar a YSA1 pero mutado en dos posiciones y se denominó YTP1 (Figura 1, YSA1 mutado). Ambos péptidos contienen una secuencia de 8 argininas en el extremo N-terminal (8Arg) y una molécula fluorescente para estudiar su localización subcelular (tetrametilrodamina, TMR). Finalmente, YSA1-NO2 contiene un residuo de 3-nitrotirosina en la misma posición que el residuo de tirosina fosforilado por Src (Y247), para estudiar el efecto de la nitración de tirosina sobre el péptido YSA1 (véase la Figura 1). Se sintetizaron péptidos siguiendo los protocolos de síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) Fmoc convencionales. Después de completar la síntesis de las secuencias peptídicas, sus extremos N-terminales se desprotegieron mediante el tratamiento con 4-metilpiperidina al 20 % en N,N-dimetilformamida (DMF). Entonces, el fluoróforo se unió al extremo N-terminal de los péptidos mediante el tratamiento de las resinas desprotegidas con éster succinimidílico de 6-carboxitetrametilrodamina en presencia de N,N-diisopropiletilamina (DIEA) y DMF. Una vez se acopló el fluoróforo a los péptidos, estos se escindieron de la resina y se purificaron los residuos correspondientes mediante HPLC de fase inversa, y se liofilizaron las fracciones identificadas como productos deseados.

En una realización preferida, los péptidos pueden comprender un fluoróforo como tetrametilrodamina (TAMRA) unido a ácido aminohexanoico (Ahx), o un fluoróforo como tetrametilrodamina (TAMRA) unido a una cola de 8 argininas y también al ácido aminohexanoico (Ahx).

Ejemplo 1.3. Ensayo de viabilidad celular con MTT.

Se sembró un número inicial de células (5.000-10.000) en una placa de cultivo de 96 pocillos, y se trató con diferentes concentraciones de los péptidos. Después del tratamiento, se retiró el medio de cada pocillo y se añadieron 10 |il del reactivo MTT a 100 |il de medio nuevo, y se incubó a 37 °C durante 4 horas. Para solubilizar los cristales de formazán del reactivo MTT, se incubó con DMSO a temperatura ambiente y con agitación durante 30 minutos. Se midió la absorbancia a 570 nm en un lector de placas (Nanoquant Infinite M200, TECAN).

Ejemplo 1.4. Visualización de la internalización de péptidos.

Se trataron cultivos primarios de condrocitos a una confluencia del 70-80 % con el péptido correspondiente. Después de 16 horas, la localización subcelular de los péptidos marcados con TMR se visualizóin vivoen un microscopio de fluorescencia invertido (Inverted Research Microscope Eclipse Ti, Nikon).

Ejemplo 1.5. Inmunofluorescencia.

Se trataron cultivos primarios de condrocitos a una confluencia del 70-80 % con péptidos miméticos de Cx43, y se fijaron con paraformaldehído al 2-4 % (PFA, Sigma-Aldrich) en solución salina tamponada con fosfato (PBS, MP Biomedicals) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se eliminó el PFA y se incubaron las células en glicina 0,1 M (Sigma-Aldrich) durante 10 minutos para eliminar la autofluorescencia del PFA, y las membranas celulares se permeabilizaron con Tritón X-100 al 0,2 % (Sigma-Aldrich) en PBS durante 10 minutos. Se bloquearon los sitios de unión no específica con albúmina sérica bovina al 1 % (BSA, Sigma-Aldrich) en PBS con Tween-20 (PBS-T, Sigma-Aldrich), durante 30 minutos. Posteriormente, las células se incubaron con el anticuerpo primario anti-Cx43 (C6219, Sigma-Aldrich) durante 1 hora, a temperatura ambiente y se lavaron con PBS durante 10 minutos para retirar el exceso de anticuerpo. Se incubó con el anticuerpo secundario marcado con FITC (anticuerpo anti-F2765 de conejo, Thermo Fisher) durante 1 hora a temperatura ambiente, en la oscuridad. Se retiró el exceso de anticuerpo y se tiñeron los núcleos con 4',6-diamino-2-fenilindol (DAPI, Sigma-Aldrich) durante 4 minutos. Finalmente, se montaron las preparaciones con una gota de medio de montaje acuoso Glycergel (Dako) y se visualizaron en un microscopio de fluorescencia Olympus BX61 usando una cámara digital DP71 (Olympus).

Ejemplo 1.6. Inmunotransferencia de tipo Western.

El sedimento celular aislado de pacientes con OA y tratado o no con los péptidos se lisó mecánica y químicamente usando una aguja de calibre 29 (BD Medical) en presencia de un tampón de lisis frío (Tris HCl 50 mM pH 7,5; EDTA 50 mM pH 8,<n>P-40 al 0,5 %, Tritón X-100 al 1 %, NaCl 150 mM). Una vez se obtuvieron los extractos celulares, se diluyeron en tampón de carga (SDS al 10 %, Tris HCl 200 mM pH 6,8, glicerol al 50 %, azul de bromofenol al 0,1 %, P-mercaptoetanol al 10 %). Se separaron cantidades iguales de los extractos celulares en un gel de acrilamida / bisacrilamida (Acr / Bis) al 10 % con SDS. Las proteínas se transfirieron posteriormente a una membrana de poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF, Merck) en un aparato Trans-Blot® SD Semi-Dry Transfer Cell (Bio-Rad). Se verificó que la transferencia era correcta mediante la tinción de la membrana con ATX Ponceau S (Sigma-Aldrich). Para bloquear la posible unión no específica con la membrana, se realizó la incubación de 1 hora a temperatura ambiente con una disolución de leche al 5 % en un tampón TTBS (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 al 0,05 %).

La membrana se incubó con el anticuerpo primario a 4 °C con agitación durante 16 horas. Se retiró el exceso de anticuerpo con lavados sucesivos con TTBS y luego se incubó con el anticuerpo secundario a temperatura ambiente con agitación durante 1 hora. Se retiró el exceso de anticuerpo y se reveló la señal con el kit comercial de sustrato de inmunotransferencia de tipo Western Pierce™ ECL (Thermo Fisher Scientific) en una cámara de revelado Amersham Imager 600 (GE Healthcare). Los anticuerpos primarios usados fueron anticuerpo anti-Cx43 (C6219, Sigma-Aldrich) y anticuerpo anti-a-tubulina (T9026 Sigma-Aldrich). Los anticuerpos secundarios usados fueron un anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo (A6154 Sigma-Aldrich) y un anticuerpo de oveja anti-IgG de ratón (NA-931 Sigma-Aldrich), respectivamente.

Ejemplo 1.7. Ensayo Scrape Loading / Dye Transfer (carga por raspado / transferencia de colorante) (SL / DT).

Se sembraron las células en placas de cultivo hasta aproximadamente un 90 % de confluencia. Después de tratar las células con los péptidos, se retiró el medio y se lavó dos veces con PBS. Se añadió el compuesto fluorescente Lucifer Yellow (LY, Cell Projects Ltd© Kent) al 0,4 % en PBS y se realizaron dos cortes, uno con un bisturí y el otro con una aguja sobre la monocapa celular. Se incubaron las células durante 5-7 minutos a 37 °C para permitir la transferencia del LY entre células en contacto no dañadas, tras lo cual se retiró el LY y se lavaron las células con PBS. Se fijaron las células con formaldehído al 4 % durante 10 minutos. Se realizó la visualización en un microscopio de fluorescencia invertido (Inverted Research Microscope Eclipse Ti, Nikon).

Ejemplo 1.8. Análisis de la expresión génica (qPCR).

Después de los tratamientos con los péptidos, las células se tripsinizaron y los sedimentos se lisaron en reactivo TRI (MRC), siguiendo las instrucciones del fabricante hasta obtener un sedimento de ARN. Posteriormente, se realizó un tratamiento con 1 U/|il de ADNasas para eliminar ADN contaminante. La calidad y cantidad de ARN aislado se cuantificó en un espectrofotómetro Nanodrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific). Para la retrotranscripción del ARN y la obtención del ADN complementario, se usaron 1 |ig de ARN y el kit comercial Superscript® VILOTM Master Mix (invitrogen) en un termociclador Veriti (Applied Biosystems) con el siguiente programa: una desnaturalización de 10 minutos a 65 °C, seguida por 10 minutos a 25 °C, una incubación de 60 minutos a 42 °C y 5 minutos a 85 °C. El ADN complementario se diluyó en agua libre de proteasas, ADNasas y ARNasas (Sigma-Aldrich). Finalmente, se llevó a cabo PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) usando la mezcla maestra PowerUp™ SYBR® Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific) en el instrumento LightCycler® 480 (Roche, Applied Science) con el siguiente programa: incubación de 10 minutos a 95 °C, seguida por amplificación de 30-40 ciclos desde 10 hasta 95 °C, desde 30 hasta 60 °C y desde 12 hasta 72 °C. Se usóHPRT-1como gen de mantenimiento, y los niveles de expresión génica se analizaron con respecto a las células de control sin tratamiento. Los cebadores usados fueron los siguientes:

Tabla 1

Ejemplo 1.9. Diferenciación condrogénica.

Se cultivaron condrocitos primarios aislados de donantes con osteoartritis como micromasas tridimensionales. Para esto, se sembraron 500.000 células en tubos de poliestireno y se centrifugaron a 1500 rpm durante 10 minutos, formando un sedimento celular. Entonces, se reemplazó el medio por el correspondiente tratamiento: control sin tratar (DMEM con FBS al 10 %), o medio condrogénico solo o complementado con 8Arg-YSA1 u 8Arg-TUB1 5 |iM. Se cambió el medio cada 2-3 días, y después de 14 días, se congelaron las micromasas en Tissue-Tek® O.C.T. (Sakura Finetek).

Ejemplo 1.10. Detección de la actividad de B-galactosidasa asociada a senescencia (SA-B-Gal).

Para la detección de actividad de p-galactosidasa asociada a senescencia, se ha usado el kit de tinción histoquímico de células de senescencia (Sigma-Aldrich). Se aclararon las células con PBS atemperado y se fijaron durante 7 minutos a temperatura ambiente con un tampón compuesto por paraformaldehído al 2 % y glutaraldehído al 0,2 %. Después de tres lavados con PBS, se incubaron las células 16 h a 37 °C sin CO<2>en una disolución de tinción que contenía X-gal, que se escinde mediante la enzima p-galactosidasa produciendo un producto insoluble de color azul intenso.

Ejemplo 2. Resultados.

Ejemplo 2.1. Ensayo de viabilidad celular para estudiar la toxicidad.

Tal como se explica en la Figura 2, se llevó a cabo un ensayo de viabilidad con MTT en condrocitos primarios de cartílago articular de pacientes con OA tratados con concentraciones crecientes del péptido 8Arg-YSA1 (1-10-60-600 |iM, con la secuencia de arginina y la TMR), durante 16 horas.

Las diferentes concentraciones estudiadas no afectaron a la viabilidad celular con respecto a las mismas células sin tratar (UT).

Ejemplo 2.2. La presencia de la cola de octaarginina (8-Arg) mejora la internalización de la secuencia del péptido YSA1.

Se trataron condrocitos a una confluencia del 70-80 % durante 16 horas con los péptidos marcados con TMR para visualización a nivel celular a una concentración de 150 |iM (YSA1, YTP1 e YSA1-NO2) (véase la Figura 3). La presencia de la cola de 8-Arg aumenta la penetrancia, dándose así la posibilidad de reducir las concentraciones del péptido hasta 30 veces (5 |iM) tanto en el caso del péptido 8Arg-YSA1 como de 8Arg-TUB1. Las imágenes representadas en la Figura 3 indican que YSA1 y TUB1 se ubican principalmente a nivel citoplásmico.

Ejemplo 2.3. Disminución en los niveles de Cx43 en condrocitos de pacientes con OA tratados con los péptidos YSA1, YTP1 y TUB1.

Los pacientes con OA tienen niveles significativamente elevados de Cx43 en el cartílago articular lo que activa la desdiferenciación celular por medio de EMT mediante la activación de Twist-1 y la senescencia celular mediada por p53/p16.

Tal como se muestra en la Figura 4, los péptidos YSA1, YTP1 y TUB1 pudieron disminuir los niveles y la actividad de Cx43. Al seleccionar Cx43 como diana, estos péptidos activan la rediferenciación del condrocito y disminuyen la acumulación de células senescentes, restableciendo el fenotipo de condrocitos adultos y la capacidad de regeneración tisular.

Tal como se muestra en la Figura 4, se detectó una disminución en la positividad para Cx43 en los condrocitos de OA, especialmente en la membrana, o en el margen de las células (actividad de formación de canales, UC), cuando se trataron con 200 |iM de YSA1 o YTP1, contra las células sin tratar (UT) (Figura 4a) o con 5 |iM del péptido 8Arg-YSA1 (Figura 4b). Los resultados obtenidos se confirmaron mediante inmunotransferencia de tipo Western usando a-tubulina como control de carga. Además, el tratamiento con YSA1 150 |iM durante 16 horas redujo significativamente los niveles de Cx43 en condrocitos de OA, en comparación con las mismas células sin tratar (UT) (Figura 4c). Por otro lado, se trataron condrocitos aislados de donantes con osteoartritis durante 16 horas con el péptido YTP1 (150 |iM) y se analizaron los niveles de Cx43 mediante inmunotransferencia de tipo Western, usando a-tubulina como control de carga (Figura 4d). Como con el péptido YSA1, el tratamiento con el péptido YTP1 redujo los niveles de Cx43 en condrocitos de OA, en comparación con las mismas células sin tratar (UT). Además, se trataron condrocitos aislados de donantes con osteoartritis durante 16 horas con el péptido 8Arg-YSA1 (5 |iM) y se analizaron los niveles de Cx43 mediante inmunotransferencia de tipo Western, usando a-tubulina como control de carga (Figura 4e). La nitración del residuo Y247 del péptido YSA1 evitó la disminución de Cx43 cuando los condrocitos se tratan con este péptido modificado (YSA1-NO2) lo que indica la importancia de esta tirosina para la actividad del péptido YSA1 y su posible aplicación para el tratamiento de la OA (Figura 4f). Se trataron condrocitos aislados de donantes con osteoartritis durante 16 horas con el péptido 8Arg-TUB1 (5 |iM) y se analizaron los niveles de Cx43 mediante inmunotransferencia de tipo Western, usando la intensidad de la tinción Ponceau como control de carga. Como con los péptidos anteriores, el tratamiento con el péptido 8Arg-TUB1 redujo los niveles de Cx43 en condrocitos de OA, en comparación con las mismas células sin tratar (UT) (Figura 4g). Las imágenes de inmunofluorescencia (Figura 4h) confirman que el péptido nitrado YSA1-NO2 puede atravesar la membrana celular, pero no disminuye los niveles de Cx43 (inmunofluorescencia).

Ejemplo 2.4. Los péptidos YSA1 y YTP1 alteran la comunicación intercelular a través de uniones comunicantes (UC) en condrocitos de OA.

Se realizó un ensayo Scrape Loading / Dye Transfer (carga por raspado / transferencia de colorante) en el que se estudió la transferencia del fluoróforo Lucifer Yellow (LY) entre condrocitos en contacto a través de UC. Los condrocitos de OA tratados con el péptido YSA1 (150 |iM) durante 16 horas mostraron una disminución en el acoplamiento celular en comparación con células sin tratar (UT) (Figura 5a). La presencia de 8-Arg hizo posible disminuir el acoplamiento celular de manera más eficaz a menores concentraciones (8Arg-YSA1 5 |iM, 16 horas) (Figura 5b). El tratamiento con YTP1 disminuyó el acoplamiento celular a través de UC cuando las células se trataron con 150 |iM durante 16 horas (Figura 5c).

Ejemplo 2.5. Los péptidos en estudio mejoran el fenotipo del condrocito de OA disminuyendo la senescencia implicada en la progresión de OA y aumentando la expresión de los componentes de la matriz extracelular del cartílago articular.

Los condrocitos de OA muestran niveles aumentados de Cx43 que conducen a EMT y senescencia por medio de Twist-1 y p53/p21/p16, respectivamente. Además, la acumulación de células senescentes está implicada en la progresión de la OA. El tratamiento con el péptido 8Arg-YSA1 (5 |iM) durante 16 horas conduce a la expresión reducida de Twist-1, un factor de la transcripción que activa la desdiferenciación celular por medio de EMT, y los factores de activación de senescencia p16 y p212 (Figura 6a). Los niveles de ARN de Twist-1, p16 y p21 se normalizaron con respecto a los niveles de HPRT1 y se compararon con OAC sin tratar (UT). El análisis de la expresión génica de OAC tratados con 8Arg-YSA1 (5 |iM) durante 16 horas confirmó la regulación por disminución de factores de SASP incluyendo citocinas proinflamatorias (IL-1 p, IL-6, COX-2) y enzimas que degradan la matriz tales como metaloproteasa-3 (MMP-3) y expresión aumentada de marcadores de la ECM de cartílago, tales como agrecano (ACAN). Los niveles de ARN se normalizaron con respecto a los niveles de HPRT1 y se compararon con OAC sin tratar (UT) (Figura 6b). El tratamiento de OAC durante 7 días con el péptido 8Arg-YSA1 (5 |iM) redujo significativamente el número de células senescentes detectado por la tinción con p-galactosidasa (Figura 6c). El tratamiento con el péptido 8Arg-TUB1 (5 pM) durante 16 horas también conduce a la expresión reducida de Twist-1 y los factores de activación de senescencia p16 y p21 en OAC (Figura 6d). Además, los OAC tratados con 8Arg-TUB1 (5 |iM) durante 16 horas conducen a la expresión disminuida de los factores de SASP IL-1 p, IL-6, COX-2 y MMP-3 (Figura 6e). El tratamiento de OAC durante 7 días con el péptido 8Arg-TUB1 (5 |iM) redujo significativamente el número de células senescentes detectado por la tinción con p-galactosidasa (Figura 6f).

Ejemplo 2.6. El tratamiento con los péptidos 8Arg-YSA1 y 8Arg-TUB1 mejora la composición y estructura de la matriz extracelular de condrocitos cultivados como micromasas.

Se cultivaron condrocitos aislados de donantes con OA como micromasas 3D durante 14 días en medio de crecimiento normal o en medio condrogénico (CM) solo o complementado con 5 |iM de péptidos 8Arg-YSA1 o 8Arg-TUB1. La tinción con hematoxilina-eosina mostró que las micromasas tratadas con estos péptidos conducen a una mejor estructura de la ECM. Además, la tinción con azul de toluidina mostró una deposición aumentada de proteoglicanos en la ECM de micromasas tratadas con los péptidos 8Arg-YSA1 u 8Arg-TUB1, tal como se detecta mediante la coloración violeta aumentada (véase la Figura 7).

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Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Péptido que consiste en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

2. Composición farmacéutica que comprende el péptido según la reivindicación 1 y, opcionalmente, excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables.

3. Péptido que consiste en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 para su uso como agente terapéutico.

4. Péptido que consiste en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 para su uso, según la reivindicación 3, en la prevención o el tratamiento de la osteoartritis.

5. Péptido que consiste en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 y que comprende además una cola N-terminal de 8 argininas, para su uso según las reivindicaciones 3 ó 4.

6. Péptido para su uso, según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que el péptido se administra por vía oral o por medio de una inyección intraarticular, subcutánea, intravenosa o muscular.