ES3039670T3

ES3039670T3 - Transgenic t cell and chimeric antigen receptor t cell compositions and related methods

Info

Publication number: ES3039670T3
Application number: ES22197444T
Authority: ES
Inventors: Michel Sadelain; Justin Eyquem; Jorge Mansilla-Soto
Original assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Current assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date: 2016-04-15
Filing date: 2017-04-14
Publication date: 2025-10-23
Anticipated expiration: 2037-04-14
Also published as: EP4180519A1; WO2017180989A3; SG11201808831TA; EP4180519B1; EP4628587A2; US20190119638A1; ES2933961T3; US11377637B2; US20220411753A1; AU2017250769B2; US12404316B2; PT3443075T; JP7058223B2; KR20220123325A; BR112018071199A2; WO2017180989A2; KR20180133496A; EP3443075A2; EP3443075B1; JP2019511236A

Abstract

La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una célula T para su uso en un método de tratamiento con terapia de receptor de antígeno quimérico (CAR) de un sujeto que tiene una enfermedad, en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica un CAR está integrada en un primer sitio dentro del genoma de la célula T de tal manera que el CAR es expresado por la célula T en la superficie de la célula T, en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico está bajo el control de un promotor endógeno de un gen del complejo del receptor de células T (TCR), y en donde la integración de la secuencia de ácido nucleico en el primer sitio previene la expresión de un complejo TCR funcional en la superficie de la célula. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Células T transgénicas y composiciones de células T de receptor de antígeno quimérico y métodos relacionados

1. Campo

La presente invención se refiere en general a la inmunoterapia y, más específicamente, a la inmunoterapia que utiliza células inmunitarias modificadas genéticamente, como las células T.

2. Antecedentes

Las inmunoterapias dirigidas se basan en el uso de células inmunitarias o moléculas que involucran a las células inmunitarias para tratar una variedad de enfermedades, incluido el cáncer, trastornos infecciosos y autoinmunitarios (Miller & Sadelain,Cáncer Cell.27(4):439-49 (2015); Sabatos-Peyton et al.,Curr. Opin. Immunol.22(5):609-615 (2010); McLeod & Anderton,Curr. Opin. Pharmacol.23:1-108 (2015)). Recientemente, la modificación genética de las células T para expresar receptores de antígenos quiméricos (CAR) que se dirigen a los antígenos tumorales ha permitido la erradicación exitosa de las células leucémicas en humanos. (Brentjens et al.,Sci. Transí. Med.

5(177):177ra38. doi: 10.1126/scitranslmed.3005930 (2013)). En el último enfoque, el ADN complementario (ADNc) que codifica el CAR se administra a las células T a través de retrovirus gamma o lentivirus competentes para la integración. Estos vectores virales recombinantes requieren una enzima integrasa viral, que cataliza la integración del ADN viral en el genoma humano de manera semialeatoria (Schroder et al.,Cell110(4):521-529 (2002); Wu et al.,Science300(5626): 1749-1751 (2003)). Un tercer enfoque hace uso de un mecanismo de transposición de ADN, cuyos componentes pueden ser suministrados a las células sin necesidad de partículas virales. En este caso, una transposasa de ADN lleva a cabo la integración del transposón de ADN (que contiene los genes de interés) en el genoma humano, también de forma semialeatoria (Yantet al., Mol. Cell. Biol.25(6):2085-2094 (2005)). Todos los métodos de administración de genes mencionados anteriormente producen una población de células T que muestra una expresión de CAR heterogénea debido a las diferentes ubicaciones genómicas del vector integrado. Esta "expresión variada" limita el número de células con una expresión de CAR que es óptima para la interacción con las células diana y para la fuerza de activación de las células T. Además, esta integración descontrolada del ADN puede dar lugar potencialmente a una mutagénesis por inserción, que puede activar un protooncogén o inactivar un gen supresor de tumores. Otra limitación de estos enfoques de modificación genética es que las células T aún expresan su receptor de antígeno, conocido como TCR, que aún puede participar en el reconocimiento de antígenos, activando así la célula T CAR. Este posible efecto secundario limita el uso de células T CAR autólogas en pacientes con trastornos autoinmunes, o el uso de células T CAR alogénicas en cualquier receptor, dos circunstancias en donde la célula T puede atacar los tejidos del receptor (causando autoinmunidad en primera instancia y el enfermedad de injerto versus huésped (GvHD) en este último).

La modificación genética de las células a través de la recombinación homóloga permite la integración precisa del ADN exógeno en sitios genómicos elegidos. (Cappechi et al.,Nat. Rev. Genet.6(6):507-512 (2005)). Tal administración dirigida se ha descrito recientemente donde un constructo CAR que contiene un promotor se dirigió al locus CCR5 en las células T primarias humanas, lo que permitió que las células T modificadas mataran las células tumoralesin vitro(Sather et al.,Sci. Transl. Med7(307):307ra156. doi: 10.1126/scitranslmed.aac5530 (2015)). Aunque interesante, los autores no demostraron si la expresión de CAR impulsada por el promotor MND se puede mantener constante en el locus CCR5 y, lo que es más importante, no demostraron que el nivel de expresión de CAR fuera óptimo para erradicar las células tumoralesin vivo. Además, la interrupción de CCR5 se ha relacionado con una mayor susceptibilidad a la infección por el virus del Nilo Occidental (Lim et al.,Trends Immunol.27(7):308-312 (2006)).

La inmunoterapia adoptiva que usa receptores de antígenos quiméricos (CAR) ha mostrado resultados clínicos notables en el tratamiento de la leucemia y es una de las nuevas estrategias más prometedoras para tratar el cáncer. Los protocolos clínicos actuales utilizan células T autólogas que se recolectan mediante aféresis y se modifican con vectores retrovirales para expresar de manera estable el CAR, que es responsable del reconocimiento de una molécula tumoral extracelular y de la activación de la célula T modificada. Este enfoque requiere la fabricación de células específicas para el paciente, lo que inevitablemente da como resultado una variabilidad de paciente a paciente en el producto celular final. La implementación generalizada de este enfoque requerirá aún más avances en la automatización y miniaturización de la fabricación de células para satisfacer la demanda de células T CAR. Además, los enfoques actuales utilizan vectores de integración aleatoria, incluidos gamma-retrovirales, lentivirales y transposones, que dan como resultado una integración semialeatoria y una expresión variable de CAR debido a la variedad de transgenes. Los efectos de posición pueden resultar en una función heterogénea de células T, silenciamiento de transgenes y, potencialmente, oncogénesis por inserción. Por lo tanto, la conjunción del origen de células autólogas y la integración de vectores aleatorios es propensa a generar productos celulares con potencia variable.

Diferentes nucleasas adaptadas, incluido el sistema CRISPR/Cas9, las nucleasas con dedos de zinc o las nucleasas efectoras TAL (TALEN), se han utilizado anteriormente para la interrupción de genes en una amplia gama de células humanas, incluidas las células T primarias. En algunos casos, estas nucleasas se han utilizado para generar las denominadas "células T universales" para la administración alogénica, al alterar el receptor de células T (TCR) o la expresión de HLA clase I, pero se utilizaron vectores virales o el transposón de la bella durmiente para administrar el<c>A<r>ADNc, todo lo cual da como resultado una integración transgénica semialeatoria y sus consecuencias posteriores.

Para abordar el impacto negativo que la expresión de TCR puede tener en la alorreactividad de las células T CAR, varios laboratorios han diseñado nucleasas adaptadas (nucleasa de dedo de zinc, nucleasa TALE y nucleasa CRISPR/Cas9) que se dirigen específicamente y escinden el extremo 5'. de la región constante de la cadena alfa o beta del TCR (Provasi et al,Nat. Med.18(5):807-815 (2012); Poirot et al.,Cáncer Res.75(18):3853-3864 (2015); Osborn et al.,Mol. Ther.24(3):570-581 (2016)). La escisión en cualquiera de los sitios da como resultado modificaciones del ADN incorporadas a través del mecanismo de reparación del ADN llamado unión de extremos no homólogos (NHEJ). La región mutada evita el empalme correcto entre los genes V(D)J reorganizados con su respectiva región constante, lo que impide el ensamblaje adecuado del complejo TCR en la superficie celular. Estas células TCR negativas, que fueron desactivadas por causar GVHD, luego se usaron para expresar CAR que se administraron con transposones o lentivirus (Torikai et al.,Blood119(24):5697-5705 (2012); Poirot et al.,Cáncer Res.

75(18):3853-3864 (2015)). Aunque estas células T CAR tienen la ventaja de no expresar un TCR que pueda causar GVHD, aún presentan los inconvenientes mencionados anteriormente debido a la integración semialeatoria del gen CAR (expresión variada, mutagénesis por inserción).

Los enfoques descritos anteriormente para modificar genéticamente una célula, como una célula T, incluyen el uso de promotores inducibles dentro de vectores virales (p. ej., promotor NFAT en un vector retroviral o constructos synNotch), o el uso de moléculas pequeñas que controlan la transcripción o la agregación de proteína (Ponomarev et al.,Neoplasia3(6):480-488 (2001); Zhang etal.,Mol. Ther.19(4): 751-759 (2011); Roybal et al.,Cell167(2):419-432, e16 (2016): Wu et al.,Science16;350(6258):aab4077 (2015); Juillerat et al.,Sci. report18950 (2016)). Estos enfoques son vulnerables a una serie de complicaciones y barreras, incluida la expresión variada de transgenes integrados aleatoriamente, la necesidad de infusión intravenosa de fármacos y las limitaciones farmacodinámicas de estos fármacos, y la inmunogenicidad de algunos de los componentes proteicos utilizados en algunos de estos enfoques (p. ej., factores de transcripción quiméricos, dominios proteicos inmunogénicos).

Los receptores de antígenos quiméricos (CAR) son receptores sintéticos que redirigen y reprograman las células T para mediar en el rechazo tumoral (Jensen et al.,Curr. Opin. Immunol.33:9-15 (2015)). Los CAR más exitosos utilizados hasta la fecha son aquellos dirigidos a CD19 (Brentjens et al.,Nat. Med.9:279-286 (2003)), que ofrecen la perspectiva de remisiones completas en pacientes con neoplasias malignas de células B quimiorrefractarias/recidivantes (Sadelain,J. Clin. Invest.125:3392-3400 (2015)). Los CAR generalmente se transducen en células T del paciente usando Y-retroviral (Sadelain et al.,Ninth International Immunology Congress, Budapest,88:34 (1992)) u otros vectores de integración aleatoria (Wang et al.,Mol. Ther. Oncolytics 3:16015(2016)), que puede resultar en expansión clonal, transformación oncogénica, expresión transgénica variada y silenciamiento transcripcional (Ellis,Hum. Gene. Ther.16:1241-1246 (2005)); Riviere et al.,Blood119:1107-1116 (2012); Von Kalle et al.,Hum. Gene Ther.25:475-481 (2014))). Los avances recientes en la edición del genoma permiten intervenciones eficientes específicas de secuencia en células humanas (Wright et al.,Cell164:29-44 (2016); Tsai et al.,Nat. Rev. Genet.17:300-312 (2016)), incluida la administración de genes dirigidos a los loci CCR5 y a Av S1 (Lombardo et al.,Nat. Methods8:861-869 (2011); Satheretal.,Sci. Transl. Med.7:307ra156 (2015)).

Por lo tanto, existe la necesidad de terapias para proporcionar un tratamiento mejorado usando inmunoterapia, como el tratamiento del cáncer u otras enfermedades. La presente invención satisface esta necesidad.

3. Sumario de la invención

En un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una célula T para uso en un método de tratamiento con terapia de receptor de antígeno quimérico (CAR) de un sujeto que padece una enfermedad, en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica un CAR se integra en un primer sitio dentro del genoma de la célula T de tal manera que el CAR es expresada por la célula T en el superficie de la célula T, en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico recombinante está bajo el control de un promotor endógeno de un gen complejo del receptor de la célula T (TCR), donde la integración de la secuencia de ácido nucleico recombinante en el primer sitio previene la expresión de un complejo TCR funcional en la superficie de la célula, en donde la enfermedad es una enfermedad infecciosa, y en donde el CAR se une a un antígeno del patógeno de la enfermedad infecciosa.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una célula T para usar en un método de tratamiento con terapia CAR de un sujeto que padece una enfermedad, en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica un CAR está integrada en un primer sitio dentro del genoma de la célula T de tal manera que el CAR es expresado por la célula T en la superficie de la célula T, en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico recombinante está bajo el control de un promotor endógeno de un gen del complejo TCR, en donde la integración de la secuencia de ácido nucleico recombinante en el primer sitio impide la expresión de un complejo TCR funcional en la superficie de la célula, en donde la enfermedad es una enfermedad autoinmunitaria, en donde el CAR se une a un antígeno de la enfermedad autoinmunitaria y en donde la célula T es una célula T reguladora.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una célula T para usar en un método de tratamiento con terapia CAR de un sujeto que padece una enfermedad, en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica un CAR está integrada en un primer sitio dentro del genoma de la célula T de tal manera que el CAR es expresado por la célula T en la superficie de la célula T, en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico recombinante está bajo el control de un promotor endógeno de un gen del complejo TCR, en donde la integración de la secuencia de ácido nucleico recombinante en el primer sitio impide la expresión de un complejo TCR funcional en la superficie de la célula, en donde la enfermedad es un cáncer seleccionado del grupo que consiste en un carcinoma, sarcoma, leucemia, linfoma, mieloma múltiple, melanoma, tumor cerebral, tumor de la médula espinal, tumor de células germinales, tumor neuroendocrino y tumor carcinoide, y en donde el CAR se une a un antígeno canceroso del cáncer.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una célula T para usar en un método para promover la tolerancia al trasplante con terapia CAR en un sujeto en riesgo de rechazo de trasplante, en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica un<c>A<r>está integrada en un primer sitio dentro del genoma de la célula T de tal manera que el CAR es expresado por la célula T en la superficie de la célula T, en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico recombinante está bajo el control de un promotor endógeno de un gen del complejo TCR, en donde la integración de la secuencia de ácido nucleico recombinante en el primer sitio impide la expresión de un complejo TCR funcional en la superficie de la célula, en donde el CAR se une a un antígeno de un tejido trasplantado en el sujeto y en donde la célula T es una célula T reguladora.

En lo sucesivo, las referencias a los métodos de tratamiento mediante terapia o cirugía en el contexto de la invención deben interpretarse como referencias a células, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en esos métodos.

En algunas realizaciones, el primer sitio está en un exón de un gen que codifica una proteína del complejo TCR.

En algunas realizaciones, el primer sitio está dentro del primer exón del gen que codifica la cadena alfa de TCR.

En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico recombinante sin promotor que codifica CAR se integra en dicho primer sitio de tal manera que CAR se expresa bajo el control del promotor endógeno de la cadena alfa del TCR, y donde la integración de la secuencia de ácido nucleico recombinante en dicho primer sitio previene la expresión de una cadena alfa TCR funcional.

En algunas realizaciones, la integración de la secuencia de ácido nucleico recombinante en el primer sitio evita la expresión de una proteína seleccionada del grupo que consiste en la cadena alfa de TCR, la cadena beta de TCR, la cadena gamma de CD3, la cadena delta de CD3, la cadena épsilon de CD3, y cadena zeta de CD3.

En algunas realizaciones, el promotor endógeno es un promotor de un gen que codifica una cadena alfa de TCR, una cadena beta de TCR, una cadena gamma de CD3, una cadena delta de CD3, una cadena épsilon de CD3 o una cadena zeta de CD3.

En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica el CAR se integra en dos sitios dentro del genoma de la célula T.

En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica el CAR se integra en una pluralidad de sitios dentro del genoma de la célula T, y de manera que la expresión de la secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica CAR en dicha pluralidad de sitios está bajo el control de diferentes promotores endógenos.

En algunas realizaciones, la célula T procede de un ser humano.

En otro aspecto, la invención proporciona una célula T como se describe en un aspecto anterior para tratar a un sujeto que tiene un cáncer, en donde el CAR se une a un antígeno canceroso seleccionado del grupo que consiste en mesotelina (MSLN), antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), antígeno de células madre de próstata (PCSA), anhidrasa carbónica IX (CAIX), antígeno carcinoembrionario (CEA), CD5, CD7, CD10, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD123, CD133, CD138, glicoproteína epitelial 2 (EGP 2), glicoproteína epitelial 40 (EGP-40), molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM), proteína de unión a folato (FBP), receptor de acetilcolina fetal (AChR), receptor de folato-a y p (FRa y p), gangliósido G2 (GD2), gangliósido G3 (GD3), receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER-2/ERB2), receptor del factor de crecimiento epidérmico vIII (EGFRvlII), ERB3, ERB4, transcriptasa inversa de telomerasa humana (hTERT), subunidad alfa-2 del receptor de interleucina-13 (IL-13Ra2), cadena ligera<k>, receptor de dominio de inserción de quinasa (KDR), Lewis A (CA19.9), Lewis Y (LeY), molécula de adhesión celular L1 (L1CAM), antígeno asociado a melanoma 1 (familia de antígenos de melanoma A1, MAGE-A1), mucina 16 (Muc-16), mucina 1 (Muc-1), ligandos NKG2D, antígeno de cáncer testicular NY-ESO-1, antígeno oncofetal (h5T4), glicoproteína 72 asociada a tumor (TAG-72), factor de crecimiento endotelial vascular R2 (VEGF-R2), proteína del tumor de Wilms (WT-1), receptor transmembrana de proteína tirosina quinasa tipo 1 (ROR1), B7-H3 (c D276), B7-H6 (Nkp30), proteoglicano-4 de sulfato de condroitina (CSPG4), molécula accesoria DNAX (DNAM-1), receptor 2 de efrina tipo A (EpHA2), proteína asociada a fibroblastos (FAP), Gp100/HLA-A2, glipicano 3 (GC3), HA-1H, HERK-V, IL-11Ra, proteína 1 de membrana latente (LMP1), molécula de adhesión celular neural (N-CAM/CD56) y receptor Trail (TRAIL R).

En otro aspecto, la invención proporciona una población aislada de células T, que comprende una pluralidad de la célula T de la invención.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la célula T de la invención, o la población aislada de células T de la invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la invención proporciona un métodoin vitropara generar una célula T que expresa un CAR y carece de un complejo funcional de TCR, que comprende introducir en una célula T:

(i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR, y

(ii) un sistema de recombinación homóloga adecuado para la integración dirigida de la secuencia de ácido nucleico en un sitio dentro del genoma de la célula T, siendo dicho sitio el primer exón del gen de la cadena alfa de TCR, de manera que la expresión de la secuencia de ácido nucleico esté bajo el control de un promotor endógeno de un gen complejo TCR, por lo que el sistema de recombinación homóloga integra la secuencia de ácido nucleico que codifica CAR en dicho sitio dentro del genoma de manera que la integración de la secuencia de ácido nucleico en dicho sitio evita la expresión de un complejo receptor de células T funcional en la superficie de la célula T, generando así una célula T que expresa CAR y carece de un complejo TCR funcional.

En algunas realizaciones, el método utiliza un vector que comprende un retrovirus gamma no integrante para introducir la una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR en la célula T.

En algunas realizaciones, el retrovirus gamma no integrante comprende una integrasa mutada.

En adelante, la referencia a un "transgén" en el contexto de la invención significa una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica un CAR.

De acuerdo con la invención, un transgén se integra en un primer sitio dentro del genoma de la célula T de manera que la expresión del transgén está bajo el control de un promotor endógeno de un gen del complejo TCR, en donde el transgén codifica un CAR. En ciertas realizaciones, el transgén se integra en un solo sitio dentro del genoma. En ciertas realizaciones, el transgén se integra en dos sitios dentro del genoma de la célula. En ciertas realizaciones, el primer sitio es un exón del gen del complejo TCR endógeno bajo el control del promotor del gen del complejo TCR endógeno. En una realización particular, el primer sitio está dentro del primer exón del gen del complejo TCR endógeno.

En una célula T, en donde el transgén está integrado en un primer sitio dentro del genoma de la célula T como se describe anteriormente, el promotor endógeno es constitutivo. En ciertas realizaciones, el promotor endógeno que es constitutivo se selecciona del grupo que consiste en promotor TCRa, promotor TCRb, promotor CD3d, promotor CD3g, promotor CD3e y promotor CD3z.

En ciertas realizaciones de una célula T en donde un transgén está integrado en un primer sitio dentro del genoma de la célula T como se describe anteriormente, el promotor endógeno está activo en un subconjunto de células T. En ciertas realizaciones, el promotor endógeno que es activo en un subconjunto de células T se selecciona del grupo que consiste en promotor TCRa, promotor TCRb, promotor CD3d, promotor CD3g, promotor CD3e y promotor CD3z. Promotores endógenos adicionales que pueden estar activos en un subconjunto de células T pueden ser promotor CD4, promotor CD8a, promotor CD8b, promotor de actina, promotor CD25, promotor IL2, promotor CD69, promotor GzmB, promotor T-bet, promotor IFNgamma, promotor TIM3, promotor IL4, promotor GATA3, promotor IL5, promotor IL13, promotor IL10, promotor IL17A, promotor IL6, promotor IL21, promotor IL23R, promotor FoxP3, promotor CTLA4, promotor CD25, promotor PD1, promotor CD45RO, promotor CCR7, promotor CD28, CD95 promotor, promotor CD28, promotor CD27, promotor CD127, promotor PD-1, promotor CD122, promotor CD132, promotor KLRG-1, promotor HLA-DR, promotor CD38, promotor CD69, promotor Ki-67, promotor CD11a, promotor CD58, CD99 promotor, promotor CD62L, promotor CD103, promotor CCR4, promotor CCR5, promotor CCR6, promotor CCR9, promotor CCR10, promotor CXCR3, promotor CXCR4, promotor CLA, promotor Granzyme A, promotor Granzyme B, promotor Perforin, promotor CD57, promotor CD161, IL-Promotor 18Ra, promotor c-Kit, o promotor CD130.

En ciertos ejemplos de una célula T en donde un transgén está integrado en un primer sitio dentro del genoma de la célula T como se describe anteriormente, el promotor endógeno es inducible.

En ciertos ejemplos, el promotor endógeno que es inducible es inducido por activación de la célula T. En ciertos ejemplos, el promotor endógeno que es inducible es inducido por la unión de un receptor de antígeno quimérico (CAR), un receptor coestimulador quimérico (CCR), receptor de células T (TCR), CD28, CD27 o 4-1BB expresado por la célula T a su respectivo asociado de unión. En ciertos ejemplos, el promotor se induce mediante la unión de un CAR, CCR o TCR expresado por la célula T a su respectivo asociado de unión. En ciertos ejemplos, el promotor inducido por la unión de un CAR, CCR o TCR expresado por la célula T a su respectivo asociado de unión se selecciona del grupo que consiste en el promotor del factor nuclear de células T activadas (NFAT), promotor de muerte programada 1 (PD-1), promotor de mucina-3 de inmunoglobulina de células T (TIM-3), promotor de antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA4), promotor de proteína de activación de linfocitos 3 (LAG-3), promotor del ligando inductor de apoptosis (TRAIL) relacionado con el factor de necrosis tumoral (TNF), promotor atenuador de linfocitos B y T (BTLA), promotor CD25, promotor CD69, promotor del ligando Fas (FasL), promotor TIGIT y promotor 2B4.

En ciertos ejemplos, el promotor endógeno que es inducible se induce mediante la unión de un ligando a un receptor inhibidor expresado por la célula T. En ciertos ejemplos donde el promotor se induce mediante la unión de un ligando a un receptor inhibidor expresado por la célula T, el receptor inhibidor se selecciona del grupo que consiste en PD-1, CTLA4, TRAIL, LAG-3, bTlA, TIM-3, Fas, TIGIT y 2B4. En ciertos ejemplos donde el promotor se induce mediante la unión de un ligando a un receptor inhibidor expresado por la célula T, el promotor se selecciona del grupo que consiste en el promotor CPT1a y el promotor ATGL.

En ciertos ejemplos, el promotor endógeno que es inducible se induce mediante la unión de una citoquina a un receptor de citoquina expresado por la célula T. En ciertos ejemplos en donde el promotor se induce mediante la unión de una citoquina a un receptor de citoquina expresado por la célula T, la citoquina se selecciona del grupo que consiste en interleucina 2 (IL2), interleucina 7 (IL7), interleucina 15 (IL15), e interleucina 21 (IL21). En ciertos ejemplos en donde el promotor se induce mediante la unión de una citoquina a un receptor de citoquina expresado por la célula T, la citoquina se selecciona del grupo que consiste en interleucina 10 (IL10) y factor de crecimiento transformante p (TGFP). En ciertos ejemplos en donde el promotor se induce mediante la unión de una citoquina a un receptor de citoquina expresado por la célula T, el promotor se selecciona del grupo que consiste en promotor T-bet, promotor Eomes, promotor GATA3 y promotor CD45RA.

En ciertos ejemplos, el promotor endógeno que es inducible se induce por contacto de la célula con un ácido nucleico. En ciertos ejemplos donde se induce un promotor por contacto de la célula con un ácido nucleico, el ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en ADN viral, ARN viral y microARN intracelular. En ciertos ejemplos, donde el promotor se induce por contacto con un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en ADN viral, ARN viral y microARN intracelular, el promotor se selecciona del grupo que consiste en interferón tipo I (IFN) alfa, Tipo I IFN beta, IRF3, IRF7, NFkB, AP-1, TNF-alfa, IL1 e IL6.

En ciertos ejemplos, el promotor endógeno que es inducible es inducido por contacto de la célula con un metabolito. En ciertos ejemplos, el metabolito se selecciona del grupo que consiste en piruvato, glutamina y beta-hidroxibutirato.

En ciertos ejemplos, el promotor endógeno que es inducible es inducido por un cambio metabólico en la célula o por el contacto de la célula con una sustancia que provoca un cambio metabólico en la célula. En ejemplos particulares, el promotor inducido por un cambio metabólico en la célula o el contacto de la célula con una sustancia que provoca un cambio metabólico en la célula es el promotor PKM2.

En ciertos ejemplos, el promotor endógeno que es inducible es inducido por una concentración particular de iones en la célula o el contacto de la célula con una concentración particular de iones. En ciertos ejemplos, el ion es potasio o calcio. En ciertos ejemplos, el promotor inducido por una concentración de iones particular en la célula o el contacto de la célula con una concentración de iones particular se selecciona del grupo que consiste en el promotor de IL2, el promotor de TNFalfa y el promotor de IFNgamma.

En ciertos ejemplos de una célula T en donde se integra un transgén en un primer sitio dentro del genoma de la célula T como se describió anteriormente, el transgén codifica una molécula seleccionada del grupo que consiste en un CAR, un CCR, una citoquina, un negativo dominante, un modulador del microambiente, un anticuerpo, un biosensor, un ligando de receptor quimérico (CRL), un ligando de receptor inmunitario quimérico (CIRL), un receptor soluble, un transportador de solutos, una enzima, una ribozima, un circuito genético, un modificador epigenético, un activador transcripcional, un represor transcripcional y ARN no codificante.

En ciertos ejemplos, el transgén codifica una citoquina. En un ejemplo, la citoquina es inmunoestimuladora. En ciertos ejemplos, la citoquina que es inmunoestimuladora se selecciona del grupo que consiste en IL2, IL12, IL15 e IL18. En otro ejemplo, la citoquina es inmunoinhibidora. En ciertos ejemplos, la citoquina que es inmunoinhibidora se selecciona del grupo que consiste en TGFBeta e IL10.

En ciertos ejemplos, el transgén codifica un anticuerpo. En ciertos ejemplos, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en una inmunoglobulina, un acoplador de células T bi-específico (BiTE), un diacuerpo, un redireccionamiento de doble afinidad (DART), un Fab, un F(ab'), un fragmento variable de cadena única (scFv) y un nanocuerpo.

Según la invención, el transgén codifica un CAR. En una realización particular, el CAR se une a un antígeno canceroso.

En ciertos ejemplos de una célula T en donde se integra un transgén en un primer sitio dentro del genoma de la célula T como se describe anteriormente, la célula T se sensibiliza a un antígeno diana.

En ciertos ejemplos de una célula T en donde un transgén está integrado en un primer sitio dentro del genoma de la célula T como se describe anteriormente, un transgén (en adelante "transgén informador") que codifica una molécula informadora está integrado dentro del genoma de la célula T tal que la expresión del transgén informador está bajo el control de un promotor, preferiblemente un promotor endógeno de la célula T.

En ciertas realizaciones de una célula T en donde se integra un transgén que codifica un CAR en un primer sitio dentro del genoma de la célula T como se describe anteriormente, la célula T se deriva de un ser humano. En ciertas realizaciones de una célula T derivada de un ser humano, la célula T es una célula T humana primaria, una célula T derivada de una célula madre hematopoyética CD34, una célula T derivada de una célula madre embrionaria o una célula T derivada de un célula madre pluripotente inducida.

En ciertas realizaciones de una célula T en donde se integra un transgén que codifica un CAR en un primer sitio dentro del genoma de la célula T como se describe anteriormente, el transgén se integra en el primer sitio mediante recombinación homóloga dirigida. En ciertas realizaciones, la recombinación homóloga dirigida se lleva a cabo mediante un método que comprende el uso de una nucleasa con dedos de zinc (ZFN), una nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción (TALEN), una proteína 9 (Cas9) asociada a repeticiones palindrómicas cortas agrupadas interespaciadas con regularidad (CRISPR), Cpf1, pirógeno, Aureus, Meganuclease o Mega-Tal.

En ciertas realizaciones de una célula T en donde un transgén que codifica un CAR se integra en un primer sitio dentro del genoma de la célula T como se describe anteriormente, el transgén se integra en una pluralidad de sitios dentro del genoma de la célula T, y de tal manera que la expresión del transgén en la pluralidad de sitios está bajo el control de diferentes promotores endógenos.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona una célula T en donde un primer transgén que codifica un CAR está integrado en un primer sitio dentro del genoma de la célula T de manera que la expresión del primer transgén está bajo el control de un primer promotor endógeno de un gen del complejo TCR, y en donde un segundo transgén se integra en un segundo sitio dentro del genoma de la célula T, de manera que la expresión del segundo transgén está bajo el control de un segundo promotor endógeno, en donde el primer y el segundo promotores endógenos son promotores diferentes, y en donde el primer transgén codifica un primer CAR, y el segundo transgén codifica una segunda proteína terapéutica o un segundo ácido nucleico terapéutico, preferiblemente donde el primer CAR es diferente de la segunda proteína terapéutica. En ciertas realizaciones, el segundo transgén codifica una segunda proteína terapéutica. En ciertas realizaciones, el segundo transgén codifica un segundo ácido nucleico terapéutico.

En ciertas realizaciones de una célula T en donde un primer transgén está integrado en un primer sitio dentro del genoma y un segundo transgén está integrado en un segundo sitio dentro del genoma de la célula, el primer promotor endógeno es un promotor endógeno de un gen del complejo TCR, y el segundo promotor endógeno es inducible. En ciertas realizaciones, el primer promotor se selecciona del grupo que consiste en promotor TCRa, promotor TCRb, promotor CD3d, promotor CD3g, promotor CD3e y promotor CD3z.

En ciertas realizaciones de una célula T en donde un primer transgén está integrado en un primer sitio dentro del genoma y un segundo transgén está integrado en un segundo sitio dentro del genoma de la célula, y en donde el primer promotor endógeno es un promotor endógeno de un gen del TCR complejo, y el segundo promotor endógeno es inducible, el primer promotor endógeno y/o el segundo promotor endógeno es activo en un subconjunto de células T. En ciertas realizaciones, el primer promotor endógeno se selecciona independientemente del grupo que consiste en promotor TCRa, promotor TCRb, promotor CD3d, promotor CD3g, promotor CD3e y promotor CD3z. En ciertas realizaciones, el segundo promotor endógeno se selecciona independientemente del grupo que consiste en promotor CD4, promotor CD8a, promotor CD8b, promotor TCRa, promotor TCRb, promotor CD3d, promotor CD3g, promotor CD3e, promotor CD3z, promotor actina, promotor CD25, IL2 promotor, promotor CD69, promotor GzmB, promotor T-bet, promotor IFNgamma, promotor TIM3, promotor IL4, promotor GATA3, promotor IL5, promotor IL13, promotor IL10, promotor IL17A, promotor IL6, promotor IL21, promotor IL23R, promotor FoxP3, CTLA4 promotor, promotor CD25, promotor PD1, promotor CD45RO, promotor CCR7, promotor Cd 28, promotor CD95, promotor CD28, promotor CD27, promotor CD127, promotor PD-1, promotor CD122, promotor CD132, promotor KLRG-1, promotor HLA-DR, Promotor CD38, promotor CD69, promotor Ki-67, promotor CD11a, promotor CD58, promotor CD99, promotor CD62L, promotor CD103, promotor CCR4, promotor CCR5, promotor CCR6, promotor CCR9, promotor C<c>R10, promotor CXCR3, promotor CXCR4, promotor CLA, pomotor de granzima A, promotor de granzima B, promotor de perforina, promotor CD57, promotor c D161, promotor IL-18Ra, promotor c-Kit y promotor CD130.

En ciertas realizaciones de una célula T en donde un primer transgén está integrado en un primer sitio dentro del genoma y un segundo transgén está integrado en un segundo sitio dentro del genoma de la célula, y en donde el primer promotor endógeno es un promotor endógeno de un gen del TCR complejo, y el segundo promotor endógeno es inducible, el promotor inducible es inducido por la activación de la célula T.

En ciertas realizaciones de una célula T en donde un primer transgén está integrado en un primer sitio dentro del genoma y un segundo transgén está integrado en un segundo sitio dentro del genoma de la célula, y en donde el primer promotor endógeno es un promotor endógeno de un gen del TCR complejo, y el segundo promotor endógeno es inducible, el promotor inducible es inducido por la unión de un receptor de antígeno quimérico (CAR), un receptor coestimulador quimérico (CCR), receptor de células T (TCR), CD28, CD27 y 4-1BB expresado por la célula T a su respectivo asociado de unión. En ciertas realizaciones, el promotor inducible se induce mediante la unión de un CAR, CCR o TCR expresado por la célula T a su respectivo asociado de unión. En ciertas realizaciones en donde el promotor inducible se induce mediante la unión de un CAR, CCR o TCR expresado por la célula T a su respectivo asociado de unión, el promotor inducible se selecciona del grupo que consiste en el promotor del factor nuclear de células T activadas (NFAT), promotor de muerte programada 1 (PD-1), promotor de mucina-3 de inmunoglobulina de células T (TIM-3), promotor de antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA4), promotor de proteína de activación de linfocitos 3 (LAG-3), promotor del ligando inductor de apoptosis (TRAIL) relacionado con el factor de necrosis tumoral (TNF), promotor del atenuador de linfocitos B y T (BTLA), promotor de CD25, promotor de CD69, promotor del ligando Fas (FasL), promotor TIGIT y promotor 2B4.

En ciertas realizaciones de una célula T en donde un primer transgén está integrado en un primer sitio dentro del genoma y un segundo transgén está integrado en un segundo sitio dentro del genoma de la célula, y en donde el primer promotor endógeno es un promotor endógeno de un gen del TCR complejo, y el segundo promotor endógeno es inducible, el promotor inducible se induce mediante la unión de un ligando a un receptor inhibidor expresado por la célula T. En ciertas realizaciones, el receptor inhibidor se selecciona del grupo que consiste en PD-1, CTLA4, TRAIL, LAG-3, BTLA, TIM-3, Fas, TIGIT y 2B4. En ciertas realizaciones, el promotor inducible se selecciona del grupo que consiste en el promotor CPT1a y el promotor ATGL.

En ciertas realizaciones de una célula T en donde un primer transgén está integrado en un primer sitio dentro del genoma y un segundo transgén está integrado en un segundo sitio dentro del genoma de la célula, y en donde el primer promotor endógeno es un promotor endógeno de un gen del TCR complejo, y el segundo promotor endógeno es inducible, el promotor inducible es inducido por la unión de una citoquina a un receptor de citoquina expresado por la célula T. En ciertas realizaciones, la citoquina se selecciona del grupo que consiste en interleucina 2 (IL2), interleucina 7 (IL7), interleucina 15 (IL15) e interleucina 21 (IL21). En ciertas realizaciones, la citoquina se selecciona del grupo que consiste en interleucina 10 (IL10) y factor de crecimiento transformante p (TGFp). En ciertas realizaciones, el promotor inducible se selecciona del grupo que consiste en el promotor T-bet, el promotor Eomes, el promotor GATA3 y el promotor CD45RA.

En ciertas realizaciones de una célula T en donde un primer transgén está integrado en un primer sitio dentro del genoma y un segundo transgén está integrado en un segundo sitio dentro del genoma de la célula, y en donde el primer promotor endógeno es un promotor endógeno de un gen del TCR complejo, y el segundo promotor endógeno es inducible, el promotor inducible es inducido por contacto de la célula con un ácido nucleico. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en ADN viral, ARN viral y microARN intracelular. En ciertas realizaciones en donde el promotor inducible se induce por contacto de la célula con ADN viral, ARN viral o microARN intracelular, el promotor inducible se selecciona del grupo que consiste en interferón (IFN) alfa de tipo I, IFN beta de tipo I, IRF3, IRF7, NFkB, AP-1, TNF-alfa, IL1 e IL6.

En ciertas realizaciones de una célula T en donde un primer transgén está integrado en un primer sitio dentro del genoma y un segundo transgén está integrado en un segundo sitio dentro del genoma de la célula, y en donde el primer promotor endógeno es un promotor endógeno de un gen del TCR complejo, y el segundo promotor endógeno es inducible, el promotor inducible es inducido por contacto de la célula con un metabolito. En ciertas realizaciones, el metabolito se selecciona del grupo que consiste en piruvato, glutamina y beta-hidroxibutirato.

En ciertas realizaciones de una célula T en donde un primer transgén está integrado en un primer sitio dentro del genoma y un segundo transgén está integrado en un segundo sitio dentro del genoma de la célula, y en donde el primer promotor endógeno es un promotor endógeno de un gen del TCR complejo, y el segundo promotor endógeno es inducible, el promotor inducible es inducido por un cambio metabólico en la célula o el contacto de la célula con una sustancia que provoca un cambio metabólico en la célula. En ciertas realizaciones, dicho promotor inducible es el promotor PKM2.

En ciertas realizaciones de una célula T en donde un primer transgén está integrado en un primer sitio dentro del genoma y un segundo transgén está integrado en un segundo sitio dentro del genoma de la célula, y en donde el primer promotor endógeno es un promotor endógeno de un gen del TCR complejo, y el segundo promotor endógeno es inducible, el promotor inducible es inducido por una concentración particular de iones en la célula o el contacto de la célula con una concentración particular de iones. En ciertas realizaciones, el ion es potasio o calcio. En ciertas realizaciones donde el promotor inducible es inducido por una concentración de iones particular en la célula o el contacto de la célula con una concentración de iones particular, el promotor inducible se selecciona del grupo que consiste en el promotor de IL2, el promotor de TNFalfa y el promotor de IFNgamma.

En ciertas realizaciones de una célula T en donde un primer transgén está integrado en un primer sitio dentro del genoma y un segundo transgén está integrado en un segundo sitio dentro del genoma de la célula, como se describió anteriormente, el primer transgén codifica un CAR y el segundo transgén codifica una molécula seleccionada del grupo que consiste en un CAR, un CCR, una citoquina, un negativo dominante, un modulador del microambiente, un anticuerpo, un biosensor, un ligando de receptor quimérico (CRL), un ligando de receptor inmunitario quimérico (CIRL), un receptor soluble, un soluto transportador, una enzima, una ribozima, un circuito genético, un modificador epigenético, un activador transcripcional, un represor transcripcional y ARN no codificante.

En ciertos ejemplos de una célula T en donde un primer transgén está integrado en un primer sitio dentro del genoma y un segundo transgén está integrado en un segundo sitio dentro del genoma de la célula, el primer transgén y/o el segundo transgén codifican una citoquina. En ciertos ejemplos en donde el primer y/o segundo transgén codifica una citoquina, la citoquina preferiblemente es inmunoestimuladora. En ciertos ejemplos donde la citoquina es inmunoestimuladora, la citoquina se selecciona del grupo que consiste en IL2, IL12, IL15 e IL18. En ciertos ejemplos en donde el primer transgén y/o el segundo transgén codifican una citoquina, la citoquina preferiblemente es inmunoinhibidora. En ciertos ejemplos donde la citoquina es inmunoinhibidora, la citoquina se selecciona del grupo que consiste en TGFBeta e IL10.

En ciertos ejemplos de una célula T en donde un primer transgén está integrado en un primer sitio dentro del genoma y un segundo transgén está integrado en un segundo sitio dentro del genoma de la célula, como se describió anteriormente, el primer transgén y/o el segundo transgén codifican un anticuerpo.En ciertos ejemplos, el anticuerpo es una inmunoglobulina, un acoplador de células T biespecífico (BiTE), un diacuerpo, un redireccionamiento de doble afinidad (DART), un Fab, un F(ab'), un fragmento variable de cadena única (scFv), y un nanocuerpo.

En ciertas realizaciones de una célula T en donde un primer transgén está integrado en un primer sitio dentro del genoma y un segundo transgén está integrado en un segundo sitio dentro del genoma de la célula, como se describió anteriormente, el primer transgén y el segundo transgén codifican un CAR. En una realización particular, el CAR se une a un antígeno canceroso.

En ciertas realizaciones de una célula T en donde un primer transgén se integra en un primer sitio dentro del genoma y un segundo transgén se integra en un segundo sitio dentro del genoma de la célula, como se describió anteriormente, la célula T se sensibiliza a un antígeno diana.

En ciertas realizaciones de una célula T en donde un primer transgén está integrado en un primer sitio dentro del genoma y un segundo transgén está integrado en un segundo sitio dentro del genoma de la célula, como se describe anteriormente, un transgén (en adelante "transgén informador") que codifica una molécula informadora se integra dentro del genoma de la célula T de manera que la expresión del transgén informador está bajo el control de un promotor, preferiblemente un promotor endógeno de la célula T.

En ciertas realizaciones de una célula T en donde un primer transgén se integra en un primer sitio dentro del genoma y un segundo transgén se integra en un segundo sitio dentro del genoma de la célula, como se describe anteriormente, la célula T se deriva de un ser humano. En ciertas realizaciones de una célula T derivada de un ser humano, la célula T es una célula T humana primaria, una célula T derivada de una célula madre hematopoyética CD34, una célula T derivada de una célula madre embrionaria o una célula T derivada de una célula madre pluripotente inducida.

En ciertas realizaciones de una célula T en donde un primer transgén está integrado en un primer sitio dentro del genoma y un segundo transgén está integrado en un segundo sitio dentro del genoma de la célula, como se describió anteriormente, el primer transgén y/o el segundo transgén se integrado en el primer sitio por recombinación homóloga dirigida. En ciertas realizaciones, la recombinación homóloga dirigida se lleva a cabo mediante un método que comprende el uso de una nucleasa con dedos de zinc (ZFN), una nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción (TALEN), una proteína 9 (Cas9) asociada a repeticiones palindrómicas cortas agrupadas interespaciadas con regularidad (CRISPR), Cpf1, pirógeno, Aureus, Meganuclease o Mega-Tal.

En ciertos ejemplos de una célula T en donde un primer transgén está integrado en un primer sitio dentro del genoma y un segundo transgén está integrado en un segundo sitio dentro del genoma de la célula, como se describió anteriormente, la primera proteína terapéutica o el primer ácido nucleico terapéutico es diferente de dicha segunda proteína terapéutica o segundo ácido nucleico terapéutico, respectivamente.

En ciertos ejemplos de una célula T en donde un primer transgén está integrado en un primer sitio dentro del genoma y un segundo transgén está integrado en un segundo sitio dentro del genoma de la célula, y en donde el primer promotor endógeno es constitutivo y el segundo promotor endógeno es inducible, el segundo promotor endógeno es inducido por la activación de la célula T.

En ciertas realizaciones de una célula T en donde un primer transgén está integrado en un primer sitio dentro del genoma y un segundo transgén está integrado en un segundo sitio dentro del genoma de la célula, y en donde el primer promotor endógeno es constitutivo y el segundo endógeno el promotor es inducible, el primer transgén codifica un CAR, y el primer promotor endógeno es un promotor del gen del complejo receptor de células T. En ciertas realizaciones, el promotor del gen del complejo del receptor de células T se selecciona del grupo que consiste en el promotor de la cadena alfa del receptor de células T, el promotor de la cadena beta del receptor de células T, el promotor de la cadena gamma de c D3, el promotor de la cadena delta de CD3, el promotor de la cadena épsilon de CD3 y el promotor de la cadena zeta de c D3. En una realización particular, el promotor es el promotor de la cadena alfa del receptor de células T.

En ciertas realizaciones de una célula T descrita anteriormente, excepto en la medida en que los ejemplos anteriores se refieren a un transgén que codifica una citoquina que es inmunoinhibidora, por ejemplo, TGFbeta o IL10, la célula T es una célula T inmunoestimuladora. En ciertas realizaciones donde la célula T es una célula T inmunoinhibidora, la célula T se selecciona del grupo que consiste en linfocitos T citotóxicos (CTL), subtipo CD4+, subtipo CD8+, células T de memoria central (TCM), células T de memoria madre (TSCM), célula T de memoria efectora, célula T efectora, célula Th1, célula Th2, célula Th9, célula Th17, célula Th22 y célula Tfh (ayudante folicular). En una realización específica, la célula T es CD4+. En una realización específica, la célula T es c D8+.

En ciertas realizaciones de una célula T descrita anteriormente, excepto en la medida en que los ejemplos anteriores se relacionan con un transgén que codifica una citoquina que es inmunoestimuladora, por ejemplo, la citoquina se selecciona del grupo que consiste en IL2, IL12, IL15 e IL18, la T es una célula T inmunoinhibidora. En una realización específica, la célula T es una célula T reguladora.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona una población aislada de células T, que comprende una pluralidad de células T de las realizaciones descritas anteriormente. En ciertas realizaciones, la población aislada de células T comprende las células T inmunoestimuladoras descritas anteriormente. En ciertas realizaciones, la población aislada de células T comprende las células T inmunoinhibidoras descritas anteriormente.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la célula T de las realizaciones descritas anteriormente; y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una población de células T, población que comprende una pluralidad de células T de las realizaciones descritas anteriormente; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la célula T de las realizaciones descritas anteriormente, en donde la célula T es la célula T inmunoestimuladora descrita anteriormente; y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, se proporciona en la presente memoria una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una población de células T, población que comprende una pluralidad de células T de las realizaciones descritas anteriormente, donde la célula T es la célula T inmunoestimuladora descrita anteriormente; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la célula T de las realizaciones descritas anteriormente, en donde la célula T es la célula inmunoinhibidora descrita anteriormente; y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, se proporciona en la presente memoria una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una población de células T, población que comprende una pluralidad de células T de las realizaciones descritas anteriormente, en donde la célula T es la célula T inmunoinhibidora descrita anteriormente; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, se proporciona en la presente memoria una célula T de las realizaciones anteriores para su uso en un método para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesite, en donde el método comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la célula T. En otro aspecto, también se proporciona en la presente memoria una población de células T de las realizaciones anteriores para su uso en un método para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesite, en donde el método comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la población de células T. En otro aspecto más, se proporciona en la presente memoria una composición farmacéutica de las realizaciones anteriores para uso en un método para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesite, en donde el método comprende administrar al sujeto la composición farmacéutica.

En ciertas realizaciones de los métodos descritos anteriormente, el sujeto es un ser humano y la célula T se deriva de un ser humano. En ciertas realizaciones de los métodos descritos anteriormente, la célula T es autóloga del sujeto. En ciertas realizaciones de los métodos descritos anteriormente, la célula T no es autóloga para el sujeto.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona una célula T o una población de células de las realizaciones anteriores para su uso en un método para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesite, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria estimulada, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de la célula T o población de células T, donde un transgén está integrado en un primer sitio dentro del genoma de la célula T de tal manera que la expresión del transgén está bajo el control de un promotor endógeno del gen del complejo TCR, en donde el transgén codifica una proteína CAR terapéutica. En el contexto de la invención, la célula o población celular se administra al sujeto como una composición farmacéutica.

En ciertas realizaciones, en los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesite, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria estimulada como se describe anteriormente, el transgén se integra en un solo sitio dentro del genoma. En ciertas realizaciones, el transgén se integra en dos sitios dentro del genoma de la célula. En ciertas realizaciones, el primer sitio es un exón del gen endógeno bajo el control del promotor del gen del complejo TCR endógeno. En una realización específica, el primer sitio está dentro del primer exón del gen del complejo TCR endógeno.

En los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesite, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria estimulada como se describe anteriormente, el promotor endógeno es un promotor endógeno del gen de un complejo TCR. En ciertas realizaciones, el promotor se selecciona del grupo que consiste en promotor TCRa, promotor TCRb, promotor CD3d, promotor CD3g, promotor CD3e y promotor CD3z.

En ciertas realizaciones, en los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesite, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria estimulada como se describe anteriormente, el promotor endógeno es activo en un subconjunto de células T. En ciertas realizaciones, el promotor endógeno que es activo en un subconjunto de células T se selecciona del grupo que consiste en promotor TCRa, promotor TCRb, promotor CD3d, promotor CD3g, promotor CD3e y promotor CD3z. En ciertos ejemplos donde el promotor endógeno es activo en un subconjunto de células T, el promotor endógeno se selecciona del grupo que consiste en promotor CD4, promotor CD8a, promotor CD8b, promotor actina, promotor CD25, promotor IL2, promotor CD69, promotor GzmB, Promotor T-bet, promotor IFNgamma, promotor TIM3, promotor IL4, promotor GATA3, promotor IL5, promotor IL13, promotor IL10, promotor IL17A, promotor IL6, promotor IL21, promotor IL23R, promotor FoxP3, promotor CTLA4, promotor CD25, promotor PD1, Promotor CD45Ro , promotor c Cr 7, promotor CD28, promotor CD95, promotor CD28, promotor CD27, promotor CD127, promotor PD-1, promotor CD122, promotor CD132, promotor KLRG-1, promotor HlA-DR, promotor CD38, promotor CD69, Ki- 67, promotor CD11a, promotor CD58, promotor CD99, promotor CD62L, promotor CD103, promotor CCR4, promotor CCR5, promotor CCR6, promotor CCR9, promotor CCR10, promotor CXCR3, promotor CXCR4, promotor CLA, promotor Granzima A, promotor Granzima B, promotor Perforina, promotor CD57, promotor CD161, promotor IL-18Ra, promotor c-Kit y promotor CD130.

En ciertos ejemplos de los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesite, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria estimulada como se ha descrito anteriormente, el promotor endógeno puede ser inducible.

En ciertos ejemplos de los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesite, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria estimulada y el promotor endógeno es inducible, como se describió anteriormente, el promotor endógeno se induce mediante la activación de la T célula. En ciertos ejemplos en donde el promotor endógeno se induce mediante la activación de la célula T, el promotor se induce mediante la unión de un receptor de antígeno quimérico (CAR), un receptor coestimulador quimérico (CCR), receptor de células T (TCR), CD28, CD27, o 4-1BB expresado por la célula T a su asociado de unión respectivo. En ciertos ejemplos, el promotor se induce mediante la unión de un CAR, CCR o TCR expresado por la célula T a su respectivo asociado de unión. En ciertos ejemplos en donde el promotor se induce mediante la unión de un CAR, CCR o TCR expresado por la célula T a su respectivo asociado de unión, el promotor se selecciona del grupo que consiste en el factor nuclear del promotor de células T activadas (NFAT), promotor de muerte programada 1 (PD-1), promotor de mucina-3 de inmunoglobulina de células T (TIM-3), promotor de antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA4), promotor de proteína de activación de linfocitos 3 (LAG-3), promotor del ligando inductor de apoptosis (TRAIL) relacionado con el factor de necrosis tumoral (TNF), promotor del atenuador de linfocitos B y T (BTLA), promotor de CD25, promotor de CD69, promotor del ligando Fas (FasL), promotor TIGIT y promotor 2B4.

En ciertos ejemplos de los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesite, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria estimulada y el promotor endógeno es inducible, como se describió anteriormente, el promotor se induce mediante la unión de un ligando a un receptor inhibitorio expresado por la célula T. En ciertos ejemplos, el receptor inhibidor se selecciona del grupo que consiste en PD-1, CTLA4, TRAIL, LAG-3, BTLA, TIM-3, Fas, TIGIT y 2B4. En ciertos ejemplos en donde el promotor se induce mediante la unión de un ligando a un receptor inhibidor expresado por la célula T, el promotor se selecciona del grupo que consiste en el promotor CPT1a y el promotor ATGL.

En ciertos ejemplos de los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesita, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria estimulada y el promotor endógeno es inducible, como se describió anteriormente, el promotor se induce mediante la unión de una citoquina a un receptor de citoquinas expresado por la célula T. En ciertos ejemplos, la citoquina se selecciona del grupo que consiste en interleucina 2 (IL2), interleucina 7 (IL7), interleucina 15 (IL15) e interleucina 21 (IL21). En ciertos ejemplos en donde el promotor se induce mediante la unión de una citoquina a un receptor de citoquina expresado por la célula T, el promotor se selecciona del grupo que consiste en promotor T-bet, promotor Eomes, promotor GATA3 y promotor CD45RA.

En ciertos ejemplos de los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesite, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria estimulada y el promotor endógeno es inducible, como se describió anteriormente, el promotor se induce por contacto de la célula con un ácido nucleico En ciertos ejemplos, el ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en ADN viral, ARN viral y microARN intracelular. En ciertos ejemplos en donde el promotor se induce por contacto de la célula con un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en ADN viral, ARN viral y microARN intracelular, el promotor se selecciona del grupo que consiste en interferón tipo I (IFN) alfa, IFN tipo I beta, IRF3, IRF7, NFkB, AP-1, TNF-alfa, IL1 e IL6.

En los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesite, en donde el sujeto necesita una respuesta inmune estimulada y el promotor endógeno es inducible, como se describió anteriormente, el promotor puede inducirse por contacto de la célula con un metabolito. En ciertos ejemplos, el metabolito se selecciona del grupo que consiste en piruvato, glutamina y beta-hidroxibutirato.

En ciertos ejemplos de los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesita, en donde el sujeto necesita una respuesta inmune estimulada y el promotor endógeno es inducible, como se describió anteriormente, el promotor es inducido por un cambio metabólico en la célula o contacto de la célula con una sustancia que provoca un cambio metabólico en la célula. En ejemplos específicos en donde el promotor es inducido por un cambio metabólico en la célula o el contacto de la célula con una sustancia que provoca un cambio metabólico en la célula, el promotor es el promotor PKM2.

En ciertos ejemplos de los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesite, en donde el sujeto necesita una respuesta inmune estimulada y el promotor endógeno es inducible, como se describió anteriormente, el promotor es inducido por una concentración particular de iones en la célula o el contacto de la célula con una concentración particular de iones. En ciertas realizaciones, el ion es potasio o calcio. En ciertos ejemplos, el promotor es inducido por una concentración de iones particular en la célula o el contacto de la célula con una concentración de iones particular, el promotor se selecciona del grupo que consiste en el promotor de IL2, el promotor de TNFalfa y el promotor de IFNgamma.

En ciertos ejemplos de los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesita, en donde el sujeto necesita una respuesta inmune estimulada, como se describió anteriormente, el transgén codifica una molécula seleccionada del grupo que consiste en un CAR, un CCR, una citoquina, un negativo dominante, un modulador del microambiente, un anticuerpo, un biosensor, un ligando de receptor quimérico (CRL), un ligando de receptor inmunitario quimérico (CIRL), un receptor soluble, un transportador de solutos, una enzima, una ribozima, un circuito genético, un modificador epigenético, un activador transcripcional, un represor transcripcional y ARN no codificante.

En ciertos ejemplos de los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesite, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria estimulada, como se ha descrito anteriormente, el transgén codifica una citoquina. En ciertos ejemplos, opcionalmente la citoquina es inmunoestimuladora. En ciertas realizaciones donde la citoquina es inmunoestimuladora, la citoquina se selecciona del grupo que consiste en IL2, IL12, IL15 e IL18.

En ciertos ejemplos de los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesite, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria estimulada, como se ha descrito anteriormente, el transgén codifica un anticuerpo. En ciertos ejemplos, opcionalmente el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en una inmunoglobulina, un acoplador de células T bi-específico (BiTE), un diacuerpo, un redireccionamiento de doble afinidad (DART), un Fab, un F(ab'), un fragmento variable de cadena única (scFv) y un nanocuerpo.

En ciertas realizaciones, en los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesite, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria estimulada, como se ha descrito anteriormente, el transgén codifica un CAR. En una realización específica, el CAR se une a un antígeno canceroso.

En ciertas realizaciones, en los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesite, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria estimulada, como se describe anteriormente, la célula T se sensibiliza a un antígeno diana.

En ciertas realizaciones, en los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesita, en donde el sujeto necesita una respuesta inmune estimulada, como se describió anteriormente, se integra un transgén (en adelante "transgén informador") que codifica una molécula informadora dentro del genoma de la célula T de manera que la expresión del transgén informador está bajo el control de un promotor. Preferiblemente, tal promotor es un promotor endógeno de la célula T.

En ciertas realizaciones, en los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesite, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria estimulada, como se describe anteriormente, la célula T se deriva de un ser humano. En ciertas realizaciones, la célula T es una célula T humana primaria, una célula T derivada de una célula madre hematopoyética CD34, una célula T derivada de una célula madre embrionaria o una célula T derivada de una célula madre pluripotente inducida.

En ciertas realizaciones, en los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesita, en donde el sujeto necesita una respuesta inmune estimulada, como se describió anteriormente, el transgén se integra en el primer sitio mediante recombinación homóloga dirigida. En ciertas realizaciones, la recombinación homóloga dirigida se lleva a cabo mediante un método que comprende el uso de una nucleasa con dedos de zinc (ZFN), una nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción (TALEN), una proteína 9 (Cas9) asociada a repeticiones palindrómicas cortas agrupadas interespaciadas con regularidad (CRISPR), Cpfl, pirógeno, Aureus, Meganuclease o Mega-Tal.

En ciertas realizaciones, en los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesita, en donde el sujeto necesita una respuesta inmune estimulada, como se describió anteriormente, el transgén se integra en una pluralidad de sitios dentro del genoma del de células T, y tal que la expresión del transgén en la pluralidad de sitios está bajo el control de diferentes promotores endógenos.

En ciertas realizaciones, en los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesita, en donde el sujeto necesita una respuesta inmune estimulada, como se describió anteriormente, la célula T es una célula T inmunoestimuladora. En ciertas realizaciones, la célula T se selecciona del grupo que consiste en linfocito T citotóxico (CTL), subtipo CD4+, subtipo CD8+, célula T de memoria central (TCM), célula T de memoria madre (TSCM), célula T de memoria efectora, célula T efectora, célula Th1, célula Th2, célula Th9, célula Th17, célula Th22 y célula Tfh (ayudante folicular). En una realización específica, la célula T es CD4+. En otra realización específica, la célula T es CD8+.

En ciertas realizaciones, en los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesite, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria estimulada, como se ha descrito anteriormente, el sujeto tiene cáncer. En una realización específica, el cáncer es leucemia.

En ciertas realizaciones, en los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesite, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria estimulada, como se ha descrito anteriormente, el sujeto tiene un tumor.

En ciertas realizaciones, en los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que la necesita, en donde el sujeto necesita una respuesta inmune estimulada, como se describió anteriormente, el sujeto es un ser humano y la célula T se deriva de un ser humano.

En ciertas realizaciones, en los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesita, en donde el sujeto necesita una respuesta inmune estimulada, como se describió anteriormente, la célula T es autóloga del sujeto. En ciertas realizaciones, en los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesita, en donde el sujeto necesita una respuesta inmune estimulada, como se describe anteriormente, la célula T no es autóloga para el sujeto.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona una célula T o una población de células T de las realizaciones anteriores para su uso en un método para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesite, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria inhibida, que comprende administrar al sujeto la composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la célula T o población de células T, en donde un transgén se integra en un primer sitio dentro del genoma de la célula T de tal manera que la expresión del transgén está bajo el control de un promotor endógeno del gen del TCR complejo, en donde el transgén codifica una proteína CAR terapéutica. En el contexto de la invención, la célula o población celular se administra como una composición farmacéutica.

En ciertas realizaciones, en los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesita, en donde el sujeto necesita una respuesta inmune inhibida, como se describió anteriormente, el transgén se integra en un solo sitio dentro del genoma. En ciertas realizaciones, el transgén se integra en dos sitios dentro del genoma de la célula. En ciertas realizaciones, el primer sitio es un exón del gen endógeno bajo el control del promotor endógeno. En una realización particular, el primer sitio está dentro del primer exón del gen endógeno.

En ciertas realizaciones de los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesita, en donde el sujeto necesita una respuesta inmune inhibida, como se describe anteriormente, el promotor endógeno es un promotor endógeno de un gen del complejo TCR. En ciertas realizaciones, el promotor se selecciona del grupo que consiste en promotor TCRa, promotor TCRb, promotor CD3d, promotor CD3g, promotor CD3e y promotor CD3z.

En ciertos ejemplos de los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesita, en donde el sujeto necesita una respuesta inmune inhibida, como se describió anteriormente, el promotor endógeno es activo en un subconjunto de células T. En ciertos ejemplos, el promotor endógeno que es activo en un subconjunto de células T se selecciona del grupo que consiste en promotor CD4, promotor CD8a, promotor CD8b, promotor TCRa, promotor TCRb, promotor CD3d, promotor CD3g, promotor CD3e, promotor CD3z, promotor de actina, promotor CD25, promotor IL2, promotor CD69, promotor GzmB, promotor T-bet, promotor IFNgamma, promotor TIM3, promotor IL4, promotor GATA3, promotor IL5, promotor IL13, promotor IL10, promotor IL17A, promotor IL6, promotor IL21, promotor IL23R, promotor FoxP3, promotor CTLA4, promotor CD25, promotor PD1, promotor CD45RO, promotor CCR7, promotor CD28, promotor CD95, promotor C<d>28, promotor CD27, promotor CD127, promotor PD-1, promotor CD122, promotor CD132, KLRG-1 promotor, promotor HLA-DR, promotor CD38, promotor CD69, promotor Ki-67, promotor CD11a, promotor CD58, promotor CD99, promotor CD62L, promotor CD103, promotor CCR4, promotor CCR5, promotor CCR6, promotor C<c>R9, promotor CCR10, promotor CXCR3, promotor CXCR4, Promotor C<l>A, promotor Granzima A, promotor Granzima B, promotor Perforina, promotor CD57, promotor CD161, promotor IL-18Ra, promotor c-Kit y promotor CD130.

En ciertos ejemplos de los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesita, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria inhibida, como se describió anteriormente, el promotor endógeno es inducible.

En ciertos ejemplos de los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesite, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria inhibida y el promotor endógeno es inducible, como se describió anteriormente, el promotor endógeno se induce mediante la activación de la T célula. En ciertos ejemplos en donde el promotor endógeno se induce mediante la activación de la célula T, el promotor se induce mediante la unión de un receptor de antígeno quimérico (CAR), un receptor coestimulador quimérico (CCR), receptor de células T (TCR), CD28, CD27, o 4-1BB expresado por la célula T a su asociado de unión respectivo. En ciertos ejemplos, el promotor se induce mediante la unión de un CAR, CCR o TCR expresado por la célula T a su respectivo asociado de unión. En ciertos ejemplos en donde el promotor se induce mediante la unión de un CAR, CCR o TCR expresado por la célula T a su respectivo asociado de unión, el promotor se selecciona del grupo que consiste en el factor nuclear del promotor de células T activadas (NFAT), promotor de muerte programada 1 (PD-1), promotor de mucina-3 de inmunoglobulina de células T (TIM-3), promotor de antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA4), promotor de proteína de activación de linfocitos 3 (LAG-3), promotor del ligando inductor de apoptosis (TRAIL) relacionado con el factor de necrosis tumoral (TNF), promotor del atenuador de linfocitos B y T (BTLA), promotor CD25, promotor CD69, promotor del ligando Fas (FasL), promotor TIGIT y promotor 2B4.

En ciertos ejemplos de los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesite, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria inhibida y el promotor endógeno es inducible, como se describió anteriormente, el promotor se induce mediante la unión de un ligando a un receptor inhibitorio expresado por la célula T. En ciertos ejemplos, el receptor inhibidor se selecciona del grupo que consiste en PD-1, CTLA4, TRAIL, LAG-3, BTLA, TIM-3, Fas, TIGIT y 2B4. En ciertos ejemplos en donde el promotor se induce mediante la unión de un ligando a un receptor inhibidor expresado por la célula T, el promotor se selecciona del grupo que consiste en el promotor CPT1a y el promotor ATGL.

En ciertos ejemplos de los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesite, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria inhibida y el promotor endógeno es inducible, como se describió anteriormente, el promotor se induce mediante la unión de una citoquina a un receptor de citoquinas expresado por la célula T. En ciertos ejemplos, la citoquina se selecciona del grupo que consiste en interleucina 10 (IL10) y factor de crecimiento transformante p (TGFp). En ciertos ejemplos en donde el promotor se induce mediante la unión de una citoquina a un receptor de citoquina expresado por la célula T, el promotor se selecciona del grupo que consiste en el promotor T-bet, el promotor Eomes, el promotor GATA3 y el promotor CD45RA.

En ciertos ejemplos de los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesite, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria inhibida y el promotor endógeno es inducible, como se describió anteriormente, el promotor se induce por contacto de la célula con un ácido nucleico En ciertos ejemplos, el ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en ADN viral, ARN viral y microARN intracelular. En ciertos ejemplos donde el promotor se induce por contacto de la célula con un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en ADN viral, ARN viral y microARN intracelular, el promotor se selecciona del grupo que consiste en interferón tipo I (IFN) alfa, IFN tipo I beta, IRF3, IRF7, NFkB, AP-1, TNF-alfa, IL1 e IL6.

En ciertos ejemplos de los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesite, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria inhibida y el promotor endógeno es inducible, como se describió anteriormente, el promotor se induce por contacto de la célula con un metabolito. En ciertos ejemplos, el metabolito se selecciona del grupo que consiste en piruvato, glutamina y beta-hidroxibutirato.

En ciertos ejemplos de los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesita, en donde el sujeto necesita una respuesta inmune inhibida y el promotor endógeno es inducible, como se describió anteriormente, el promotor es inducido por un cambio metabólico en la célula o contacto de la célula con una sustancia que provoca un cambio metabólico en la célula. En ciertos ejemplos en donde el promotor es inducido por un cambio metabólico en la célula o el contacto de la célula con una sustancia que provoca un cambio metabólico en la célula, el promotor es el promotor PKM2.

En ciertos ejemplos de los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesite, en donde el sujeto necesita una respuesta inmune inhibida y el promotor endógeno es inducible, como se describió anteriormente, el promotor es inducido por una concentración particular de iones en la célula o el contacto de la célula con una concentración particular de iones. En ciertos ejemplos, el ion es potasio o calcio. En ciertos ejemplos donde el promotor es inducido por una concentración particular de iones en la célula o el contacto de la célula con una concentración particular de iones, el promotor se selecciona del grupo que consiste en el promotor IL2, el promotor TNFalfa y el promotor IFNgamma.

En ciertos ejemplos de los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesita, en donde el sujeto necesita una respuesta inmune inhibida, como se describió anteriormente, el transgén codifica una molécula seleccionada del grupo que consiste en un CCR, una citoquina, un negativo dominante, un modulador del microambiente, un anticuerpo, un biosensor, un ligando de receptor quimérico (CRL), un ligando de receptor inmunitario quimérico (CIRL), un receptor soluble, un transportador de solutos, una enzima, una ribozima, un circuito genético, un modificador epigenético, un activador transcripcional, un represor transcripcional y ARN no codificante.

En ciertos ejemplos de los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesita, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria inhibida, como se describió anteriormente, el transgén codifica una citoquina. En ciertos ejemplos, opcionalmente la citoquina es inmunoinhibidora. En ciertos ejemplos, la citoquina que es inmunoinhibidora se selecciona del grupo que consiste en TGFBeta e IL10.

En ciertos ejemplos de los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesita, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria inhibida, como se describió anteriormente, el transgén codifica un anticuerpo. En ciertos ejemplos, opcionalmente el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en una inmunoglobulina, un acoplador de células T bi-específico (BiTE), un diacuerpo, un redireccionamiento de doble afinidad (DART), un Fab, un F(ab'), un fragmento variable de cadena única (scFv) y un nanocuerpo.

En ciertas realizaciones de la invención, en los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesita, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria inhibida, como se describió anteriormente, el transgén codifica un CAR. En una realización específica, el CAR se une a un antígeno canceroso.

En ciertas realizaciones, en los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesite, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria inhibida, como se describe anteriormente, la célula T se sensibiliza a un antígeno diana.

En ciertas realizaciones, en los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesita, en donde el sujeto necesita una respuesta inmune inhibida, como se describió anteriormente, se integra un transgén (en adelante "transgén informador") que codifica una molécula informadora dentro del genoma de la célula T de manera que la expresión del transgén informador está bajo el control de un promotor. Preferiblemente, el informador está bajo el control de un promotor endógeno de la célula T.

En ciertas realizaciones, en los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesite, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria inhibida, como se describe anteriormente, la célula T se deriva de un ser humano. En ciertas realizaciones, la célula T es una célula T humana primaria, una célula T derivada de una célula madre hematopoyética CD34, una célula T derivada de una célula madre embrionaria o una célula T derivada de una célula madre pluripotente inducida.

En ciertas realizaciones, en los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesita, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria inhibida, como se describió anteriormente, el transgén se integra en el primer sitio mediante recombinación homóloga dirigida. En ciertas realizaciones, la recombinación homóloga dirigida se lleva a cabo mediante un método que comprende el uso de una nucleasa con dedos de zinc (ZFN), una nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción (TALEN), una proteína 9 (Cas9) asociada a repeticiones palindrómicas cortas agrupadas interespaciadas con regularidad (CRISPR), Cpf1, pirógeno, Aureus, Meganuclease o Mega-Tal.

En ciertas realizaciones, en los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesite, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria inhibida, como se ha descrito anteriormente, el transgén se integra en una pluralidad de sitios dentro del genoma del T célula, y tal que la expresión del transgén en dicha pluralidad de sitios está bajo el control de diferentes promotores endógenos.

En ciertas realizaciones, en los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesita, en donde el sujeto necesita una respuesta inmune inhibida, como se describió anteriormente, la célula T es una célula T inmunoinhibidora. En una realización específica, la célula T inmunoinhibidora es una célula T reguladora.

En ciertas realizaciones, en los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que la necesita, en donde el sujeto necesita una respuesta inmune inhibida, como se describió anteriormente, el sujeto es un ser humano y la célula T se deriva de un ser humano.

En ciertas realizaciones, en los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesite, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria inhibida, como se ha descrito anteriormente, la célula es autóloga del sujeto. En ciertas realizaciones, en los métodos para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesite, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria inhibida, como se describe anteriormente, la célula no es autóloga del sujeto.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona un métodoin vitropara generar una célula T que expresa un transgén terapéutico, que comprende: introducir en una célula T: (i) un transgén y (ii) un sistema de recombinación homóloga adecuado para la integración dirigida del transgén en un sitio dentro del genoma de la célula T, siendo dicho sitio el primer exón del gen de la cadena alfa de TCR, donde el sistema de recombinación homóloga integra el transgén en el sitio dentro del genoma de la célula, y donde la expresión del transgén está bajo el control de un promotor endógeno de un gen del complejo TCR, donde el transgén codifica un CAR.

En ciertas realizaciones de los métodos para generar una célula T que expresa un transgén terapéutico, como se describe anteriormente, el promotor endógeno es un promotor endógeno de un gen del complejo TCR. En ciertas realizaciones, el promotor endógeno se selecciona del grupo que consiste en promotor TCRa, promotor TCRb, promotor CD3d, promotor CD3g, promotor CD3e y promotor CD3z.

En ciertas realizaciones de los métodos para generar una célula T que expresa un transgén terapéutico, como se describió anteriormente, el promotor endógeno está activo en un subconjunto de células T. En ciertas realizaciones, el promotor endógeno es activo en un subconjunto de células T se selecciona del grupo que consiste en promotor TCRa, promotor TCRb, promotor CD3d, promotor CD3g, promotor CD3e y promotor CD3z. En ciertos ejemplos donde el promotor endógeno es activo en un subconjunto de células T, el promotor endógeno se selecciona del grupo que consiste en promotor CD4, promotor CD8a, promotor CD8b, promotor actina, promotor CD25, promotor IL2, promotor CD69, promotor GzmB, Promotor T-bet, promotor IFNgamma, promotor TIM3, promotor IL4, promotor GATA3, promotor IL5, promotor IL13, promotor IL10, promotor IL17A, promotor IL6, promotor IL21, promotor IL23R, promotor FoxP3, promotor CTLA4, promotor CD25, promotor PD1, Promotor CD45RO, promotor CCR7, promotor CD28, promotor CD95, promotor CD28, promotor CD27, promotor CD127, promotor PD-1, promotor CD122, promotor CD132, promotor KLRG-1, promotor HlA-DR, promotor CD38, promotor CD69, Ki- 67, promotor CD11a, promotor CD58, promotor CD99, promotor CD62L, promotor CD103, promotor CCR4, promotor CC<r>5, promotor CCR6, promotor CCR9, promotor CCR10, promotor CXCR3, promotor CXCR4, promotor<c>L<a>, promotor Granzima A, promotor Granzima B, promotor Perforina, promotor CD57, promotor CD161, promotor IL-18Ra, promotor c-Kit y promotor CD130.

En ciertos ejemplos de los métodos para generar una célula T que expresa un transgén terapéutico, como se describe anteriormente, el promotor endógeno es inducible.

En ciertos ejemplos de los métodos para generar una célula T que expresa un transgén terapéutico y donde el promotor endógeno es inducible, como se describe anteriormente, el promotor endógeno se induce mediante la activación de la célula T.

En ciertos ejemplos de los métodos para generar una célula T que expresa un transgén terapéutico y donde el promotor endógeno es inducible, como se describió anteriormente, el promotor se induce mediante la unión de un receptor de antígeno quimérico (CAR), un receptor coestimulador quimérico (CCR), receptor de células T (TCR), CD28, CD27 y 4-1BB expresados por la célula T a su respectivo asociado de unión. En ciertos ejemplos, el promotor se induce mediante la unión de un CAR, CCR o TCR expresado por la célula T a su respectivo asociado de unión. En ciertos ejemplos en donde el promotor se induce mediante la unión de un CAR, CCR o TCR expresado por la célula T a su respectivo asociado de unión, el promotor se selecciona del grupo que consiste en el factor nuclear del promotor de células T activadas (NFAT), promotor de muerte programada 1 (PD-1), promotor de mucina-3 de inmunoglobulina de células T (TIM-3), promotor de antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA4), promotor de proteína de activación de linfocitos 3 (LAG-3), promotor del ligando inductor de apoptosis (TRAIL) relacionado con el factor de necrosis tumoral (TNF), promotor del atenuador de linfocitos B y T (BTLA), promotor de CD25, promotor de CD69, promotor del ligando Fas (FasL), promotor TIGIT y promotor 2B4.

En ciertos ejemplos de los métodos para generar una célula T que expresa un transgén terapéutico y donde el promotor endógeno es inducible, como se describe anteriormente, el promotor se induce mediante la unión de un ligando a un receptor inhibidor expresado por la célula T. En ciertos ejemplos, el receptor inhibidor se selecciona del grupo que consiste en PD-1,<c>T<l>A4, TRAIL, LAG-3, BTLA, TIM-3, Fas, TGIT y 2B4. En ciertos ejemplos en donde el promotor se induce mediante la unión de un ligando a un receptor inhibidor expresado por la célula T, el promotor se selecciona del grupo que consiste en el promotor CPT1a y el promotor ATGL.

En ciertos ejemplos de los métodos para generar una célula T que expresa un transgén terapéutico y donde el promotor endógeno es inducible, como se describe anteriormente, el promotor se induce mediante la unión de una citoquina a un receptor de citoquina expresado por la célula T. En ciertos ejemplos en donde el promotor se induce mediante la unión de una citoquina a un receptor de citoquina expresado por la célula T, la citoquina se selecciona del grupo que consiste en interleucina 2 (IL2), interleucina 7 (IL7), interleucina 15 (IL15), e interleucina 21 (IL21). En ciertos ejemplos en donde el promotor se induce mediante la unión de una citoquina a un receptor de citoquina expresado por la célula T, la citoquina se selecciona del grupo que consiste en interleucina 10 (IL10) y factor de crecimiento transformante p (TGFp). En ciertos ejemplos en donde el promotor se induce mediante la unión de una citoquina a un receptor de citoquina expresado por la célula T, el promotor se selecciona del grupo que consiste en promotor T-bet, promotor Eomes, promotor GATA3 y promotor CD45RA.

En ciertos ejemplos de los métodos para generar una célula T que expresa un transgén terapéutico y donde el promotor endógeno es inducible, como se describe anteriormente, el promotor se induce por contacto de la célula con un ácido nucleico. En ciertos ejemplos, el ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en ADN viral, ARN viral y microARN intracelular. En ciertos ejemplos en donde el promotor se induce por contacto de la célula con un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en ADN viral, ARN viral y microARN intracelular, el promotor se selecciona del grupo que consiste en interferón tipo I (IFN) alfa, IFN tipo I beta, IRF3, IRF7, NFkB, AP-1, TNF-alfa, IL1 e IL6.

En ciertos ejemplos de los métodos para generar una célula T que expresa un transgén terapéutico y donde el promotor endógeno es inducible, como se describe anteriormente, el promotor se induce por contacto de la célula con un metabolito. En ciertos ejemplos, el metabolito se selecciona del grupo que consiste en piruvato, glutamina y betahidroxibutirato.

En ciertos ejemplos de los métodos para generar una célula T que expresa un transgén terapéutico y donde el promotor endógeno es inducible, como se describió anteriormente, el promotor es inducido por un cambio metabólico en la célula o el contacto de la célula con una sustancia que provoca un cambio metabólico en la célula. En ciertos ejemplos en donde el promotor es inducido por un cambio metabólico en la célula o el contacto de la célula con una sustancia que provoca un cambio metabólico en la célula, el promotor es el promotor PKM2.

En ciertos ejemplos de los métodos para generar una célula T que expresa un transgén terapéutico y donde el promotor endógeno es inducible, como se describió anteriormente, el promotor es inducido por una concentración particular de iones en la célula o el contacto de la célula con una concentración particular de iones. En ciertos ejemplos, el ion es potasio o calcio. En ciertos ejemplos donde el promotor es inducido por una concentración particular de iones en la célula o el contacto de la célula con una concentración particular de iones, el promotor se selecciona del grupo que consiste en el promotor IL2, el promotor TNFalfa y el promotor IFNgamma.

En ciertos ejemplos de los métodos para generar una célula T que expresa un transgén terapéutico, como se describió anteriormente, el transgén codifica una molécula seleccionada del grupo que consiste en un CAR, un CCR, una citoquina, un negativo dominante, un modulador del microambiente, un anticuerpo, un biosensor, un ligando de receptor quimérico (CRL), un ligando de receptor inmunitario quimérico (CIRL), un receptor soluble, un transportador de solutos, una enzima, una ribozima, un circuito genético, un modificador epigenético, un activador transcripcional, un represor transcripcional y ARN no codificante.

En ciertos ejemplos de los métodos para generar una célula T que expresa un transgén terapéutico, como se describe anteriormente, el transgén codifica una citoquina. En ciertos ejemplos, opcionalmente la citoquina es inmunoestimuladora. En ciertos ejemplos, la citoquina inmunoestimuladora se selecciona del grupo que consiste en IL2, IL12, IL15 e IL18. En ciertas realizaciones, opcionalmente la citoquina es inmunoinhibidora. En ciertos ejemplos, la citoquina inmunoinhibidora se selecciona del grupo que consiste en TGFBeta e IL10.

En ciertos ejemplos de los métodos para generar una célula T que expresa un transgén terapéutico, como se describe anteriormente, el transgén codifica un anticuerpo. En ciertos ejemplos, opcionalmente el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en una inmunoglobulina, un acoplador de células T bi-específico (BiTE), un diacuerpo, un redireccionamiento de doble afinidad (DART), un Fab, un F(ab'), un fragmento variable de cadena única (scFv) y un nanocuerpo.

En el contexto de la invención, la célula T expresa un transgén terapéutico que codifica un CAR. En una realización específica, el CAR se une a un antígeno canceroso.

En ciertas realizaciones de los métodos para generar una célula T que expresa un CAR, como se describió anteriormente, la célula T se sensibiliza a un antígeno diana.

En ciertas realizaciones de los métodos para generar una célula T que expresa un CAR, como se describió anteriormente, un transgén (en adelante "transgén informador") que codifica una molécula informadora se integra dentro del genoma de la célula T de tal manera que la expresión del transgén informador es bajo el control de un promotor, preferiblemente un promotor endógeno de la célula T.

En ciertas realizaciones de los métodos para generar una célula T que expresa un CAR, como se describió anteriormente, la célula T se deriva de un ser humano. En ciertas realizaciones, la célula T es una célula T humana primaria, una célula T derivada de una célula madre hematopoyética CD34, una célula T derivada de una célula madre embrionaria o una célula T derivada de una célula madre pluripotente inducida.

En ciertas realizaciones de los métodos para generar una célula T que expresa un CAR, como se describió anteriormente, un transgén que codifica el CAR se integra en el primer sitio mediante recombinación homóloga dirigida. En ciertas realizaciones, la recombinación homóloga dirigida se lleva a cabo mediante un método que comprende el uso de una nucleasa con dedos de zinc (ZFN), una nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción (TALEN), proteína 9 (Cas9) asociada a repeticiones palindrómicas cortas agrupadas interespaciadas con regularidad (CRISPR), Cpfl, pirógeno, Aureus, Meganuclease o Mega-Tal.

En ciertas realizaciones de los métodos para generar una célula T que expresa un CAR, como se describió anteriormente, un transgén que codifica el CAR se integra en una pluralidad de sitios dentro del genoma de la célula T, y de tal manera que la expresión del transgén en dicha la pluralidad de sitios está bajo el control de diferentes promotores endógenos.

En ciertas realizaciones de los métodos para generar una célula T que expresa un CAR, como se describe anteriormente, un transgén que codifica el CAR que se introduce en la célula está contenido en un constructo de direccionamiento. En ciertas realizaciones, el constructo de direccionamiento comprende secuencias de ácido nucleico viral. En ciertas realizaciones, el constructo de direccionamiento se empaqueta en una partícula viral de virus adenoasociado (AVV) natural o recombinante. En una realización específica, la partícula de AAV comprende secuencias de AAV6. En ciertas realizaciones, el constructo de direccionamiento se empaqueta en un retrovirus gamma que no se integra.

En ciertas realizaciones de los métodos para generar una célula T que expresa un transgén terapéutico, como se describe anteriormente, el transgén en el constructo de direccionamiento no está operativamente unido a un promotor.

En ciertas realizaciones de los métodos para generar una célula T que expresa un transgén terapéutico, como se describe anteriormente, el método comprende además introducir un segundo transgén en la célula T. En ciertas realizaciones, el primer transgén está bajo el control de un promotor constitutivo endógeno y el segundo transgén está bajo el control de un promotor inducible endógeno. En el contexto de la invención, el primer transgén es un CAR. El promotor constitutivo endógeno es un promotor del receptor de células T, y el promotor se selecciona del grupo que consiste en el promotor de la cadena alfa del receptor de células T, el promotor de la cadena beta del receptor de células T, el promotor de la cadena gamma de CD3, el promotor de la cadena delta de CD3, el promotor de la cadena épsilon de CD3 y el promotor de la cadena zeta de CD3. En una realización específica, el promotor es el promotor de la cadena alfa del receptor de células T.

En otro aspecto, se divulga en la presente memoria un vector que comprende un retrovirus gamma que no se integra. En ciertas realizaciones, el retrovirus gamma que no se integra comprende una integrasa mutada. En ciertas realizaciones, la integrasa mutada está mutada en un motivo DDE. En ciertas realizaciones, la integrasa mutada tiene una mutación seleccionada del grupo que consiste en D124A, D124E, D124N, D124V, D183A, D183N, D124A y D183A, D124A y D183N, D124E y D183A, D124E y D183N, D124N y D183A, D124N y D183N, D124V y D183A, y D124V y D183N.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona una célula T en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) se integra en un primer sitio dentro del genoma de la célula de tal manera que la célula expresa CAR en la superficie de la célula, y en donde la integración del ácido nucleico que codifica CAR en el primer sitio evita la expresión de un complejo de receptor de células T (TCR) funcional en la superficie de la célula. En ciertas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica CAR se integra en un solo sitio dentro del genoma. En ciertas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica CAR se integra en dos sitios dentro del genoma de la célula. En ciertas realizaciones, el primer sitio es un exón del gen que codifica una proteína del complejo TCR.

En ciertas realizaciones de una célula T en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica CAR está integrada en un primer sitio dentro del genoma de la célula, como se describió anteriormente, la integración de la secuencia de ácido nucleico que codifica CAR en el primer sitio evita la expresión de un proteína seleccionada del grupo que consiste en la cadena alfa del receptor de células T, la cadena beta del receptor de células T, la cadena gamma de CD3, la cadena delta de CD3, la cadena épsilon de CD3 y la cadena zeta de CD3.

En ciertas realizaciones de una célula T en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica un CAR está integrada en un primer sitio dentro del genoma de la célula, como se describió anteriormente, la expresión de la secuencia de ácido nucleico integrada en la célula T está bajo el control de un promotor endógeno, que es un promotor del gen del complejo receptor de células T. En ciertas realizaciones, el promotor endógeno es un promotor de un gen que codifica una cadena alfa del receptor de células T, una cadena beta de un receptor de células T, una cadena gamma de CD3, una cadena delta de CD3, una cadena épsilon de CD3 o una cadena zeta de CD3.

En ciertas realizaciones de una célula T en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica un CAR se integra en un primer sitio dentro del genoma de la célula, como se describió anteriormente, el CAR se une a un antígeno canceroso.

En ciertas realizaciones de una célula T en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica un CAR se integra en un primer sitio dentro del genoma de la célula, como se describió anteriormente, la célula T se selecciona del grupo que consiste en linfocitos T citotóxicos (CTL), subtipo CD4+, subtipo CD8+, célula T de memoria central (TCM), célula T de memoria madre (TSCM), célula T de memoria efectora, célula T efectora, célula Th1, célula Th2, célula Th9, célula Th17, célula Th22, célula Tfh (ayudante folicular) y célula T reguladora.

En ciertas realizaciones de una célula T en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica un CAR está integrada en un primer sitio dentro del genoma de la célula, como se describe anteriormente, la célula T se deriva de un ser humano. En ciertas realizaciones, la célula T es una célula T humana primaria, una célula T derivada de una célula madre hematopoyética CD34, una célula T derivada de una célula madre embrionaria o una célula T derivada de una célula madre pluripotente inducida.

En ciertas realizaciones de una célula T en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica CAR se integra en un primer sitio dentro del genoma de la célula, como se describió anteriormente, la secuencia de ácido nucleico que codifica CAR se integra en el primer sitio mediante recombinación homóloga dirigida. En ciertas realizaciones, la recombinación homóloga dirigida se lleva a cabo usando una nucleasa de dedo de zinc (ZFN), una nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción (TALEN), una proteína 9 (Cas9) asociada a repeticiones palindrómicas cortas agrupadas interespaciadas con regularidad (CRISPR), Cpf1, Meganuclease o Mega-Tal.

En ciertas realizaciones de una célula T en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica CAR está integrada en un primer sitio dentro del genoma de la célula, como se describió anteriormente, la secuencia de ácido nucleico que codifica CAR está integrada en una pluralidad de sitios dentro del genoma. de la célula, y de manera que la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica el CAR en dicha pluralidad de sitios está bajo el control de un promotor endógeno diferente.

En ciertas realizaciones de una célula T en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica un CAR está integrada en un primer sitio dentro del genoma de la célula, como se describió anteriormente, la secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR también está integrada en un segundo sitio dentro del genoma. de la célula de manera que el CAR es expresado por la célula en la superficie de la célula. En ciertas realizaciones, la integración del ácido nucleico que codifica CAR en el segundo sitio también reduce o previene la expresión de un complejo TCR funcional en la superficie de la célula, en donde el primer sitio y el segundo sitio están en genes diferentes.

En ciertas realizaciones de una célula T en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica un CAR se integra en un primer sitio dentro del genoma de la célula, como se describió anteriormente, una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un segundo CAR se integra en un segundo sitio dentro del genoma de la célula de modo que la célula exprese el segundo CAR en la superficie de la célula, y de modo que la expresión de la segunda secuencia de ácido nucleico esté bajo el control de un promotor endógeno en el segundo sitio, en donde el primer sitio y el segundo sitio están en diferentes genes.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona una célula T humana en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante sin promotor que codifica un CAR se integra en un sitio en el genoma de la célula, siendo el sitio el primer exón de la cadena alfa de TCR, de modo que el CAR se expresa bajo el control del promotor endógeno de la cadena alfa del TCR, para producir el CAR en la superficie de la célula, y en donde la integración del CAR en el sitio impide la expresión de una cadena alfa del TCR funcional. En ciertas realizaciones, el CAR se une a CD19.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona una población aislada de células T, que comprende una pluralidad de las células descritas anteriormente en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica un CAR está integrada en un primer sitio dentro del genoma de la célula, o una pluralidad de las célula descrita anteriormente que es una célula T humana en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante sin promotor que codifica un CAR está integrada en un sitio en el genoma de la célula.

En otro aspecto, se proporciona en la presente memoria una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la célula descrita anteriormente en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica un CAR está integrada en un primer sitio dentro del genoma de la célula, o la célula descrita anteriormente que es una célula T humana en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante sin promotor que codifica un CAR está integrada en un sitio en el genoma de la célula; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, se proporciona en la presente memoria una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una población de células T, población que comprende una pluralidad de las células descritas anteriormente en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica un CAR está integrada en un primer sitio dentro del genoma de la célula, o la célula descrita anteriormente que es una célula T humana en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante sin promotor que codifica un<c>A<r>está integrada en un sitio en el genoma de la célula; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona una célula T de las realizaciones anteriores para su uso en un método para tratar a un sujeto con terapia con CAR que lo necesite, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la célula T descrita anteriormente en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica un CAR está integrada en un primer sitio dentro del genoma de la célula, o la célula descrita anteriormente que es una célula T humana en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante sin promotor que codifica un CAR está integrada en un sitio del genoma de la célula.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona una composición farmacéutica de las realizaciones anteriores para su uso en un método para tratar a un sujeto con terapia con CAR en necesidad del mismo el método, que comprende administrar al sujeto la composición farmacéutica descrita anteriormente que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la célula descrita anteriormente en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica un CAR está integrada en un primer sitio dentro del genoma de la célula, o la célula descrita anteriormente que es una célula T humana en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante sin promotor que codifica un CAR está integrada en un sitio en el genoma de la célula.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona una población de células T de las realizaciones anteriores para su uso en un método para tratar a un sujeto con terapia con CAR en necesidad del mismo, el método, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la población de células T descrita anteriormente que comprende una pluralidad de la célula descrita anteriormente en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica un CAR está integrada en un primer sitio dentro del genoma de la célula, o una pluralidad de la célula descrita anteriormente que es una célula T humana en donde un ácido nucleico recombinante sin promotor la secuencia que codifica un CAR está integrada en un sitio en el genoma de la célula.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona una composición farmacéutica de las realizaciones anteriores para su uso en un método para tratar a un sujeto con terapia con CAR en necesidad del mismo, comprendiendo el método administrar al sujeto la composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una población de células T, que La población comprende una pluralidad de las células descritas anteriormente en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica un CAR está integrada en un primer sitio dentro del genoma de la célula, o la célula descrita anteriormente que es una célula T humana en donde un ácido nucleico recombinante sin promotor la secuencia que codifica un CAR está integrada en un sitio en el genoma de la célula.

En ciertas realizaciones, el sujeto que necesita terapia con CAR tiene cáncer y el CAR se une a un antígeno canceroso del cáncer. En una realización específica, el cánceres leucemia.

En ciertas realizaciones, el sujeto tiene un tumor.

En ciertas realizaciones, el sujeto es un ser humano y la célula se deriva de un ser humano.

En ciertas realizaciones, la célula es autóloga del sujeto. En ciertas realizaciones, la célula no es autóloga del sujeto.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona un métodoin vitropara generar una célula T que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR) y carece de un complejo funcional de receptor de células T (TCR), que comprende: introducir en una célula T: (i) un ácido nucleico secuencia de ácido que codifica CAR, y (ii) un sistema de recombinación homóloga adecuado para la integración dirigida de la secuencia de ácido nucleico en un sitio dentro del genoma de la célula, siendo dicho sitio el primer exón del gen de la cadena alfa del TCR, de manera que la expresión de la secuencia de ácido nucleico está bajo el control de un promotor endógeno de un gen del complejo TCR, mediante el cual el sistema de recombinación homóloga integra la secuencia de ácido nucleico que codifica CAR en el sitio dentro el genoma de la célula de manera que la integración de CAR en el sitio impide la expresión de un complejo receptor de células T funcional en la superficie de la célula, generando así una célula T que expresa CAR y carece de un complejo TCR funcional.

En ciertas realizaciones de un método para generar una célula T que expresa un CAR y carece de un complejo TCR funcional, como se describe anteriormente, la expresión del CAR está bajo el control de un promotor endógeno del gen del complejo del TCR. En ciertas realizaciones, el promotor endógeno es un promotor de un gen que codifica una cadena alfa del receptor de células T, una cadena beta de un receptor de células T, una cadena gamma de CD3, una cadena delta de CD3, una cadena épsilon de CD3 o una cadena zeta de CD3.

En ciertas realizaciones de un método para generar una célula T que expresa un CAR y carece de un complejo TCR funcional, como se describió anteriormente, el sistema de recombinación homóloga comprende una nucleasa de dedo de zinc (ZFN), una nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción (TALEN), o proteína 9 (Cas9) asociada a repeticiones palindrómicas cortas agrupadas interespaciadas con regularidad (CRISPR), Cpfl, Meganuclease o Mega-Tal.

En ciertas realizaciones de un método para generar una célula T que expresa un CAR y carece de un complejo TCR funcional, como se describe anteriormente, la secuencia de ácido nucleico que codifica el CAR que se introduce en la célula está contenida en un constructo de direccionamiento. En ciertas realizaciones, el constructo de direccionamiento comprende secuencias del virus 2 adenoasociado (AAV2). En ciertas realizaciones, el constructo de direccionamiento se empaqueta en una partícula viral de virus adenoasociado (AVV) natural o recombinante. En ciertas realizaciones, la partícula de AAV comprende secuencias de AAV6.

En ciertas realizaciones de un método para generar una célula T que expresa un CAR y carece de un complejo TCR funcional, como se describe anteriormente, las secuencias de ácido nucleico que codifican el CAR en el constructo de direccionamiento no están operativamente unidas a un promotor.

En ciertas realizaciones de un método para generar una célula T que expresa un CAR y carece de un complejo TCR funcional, como se describió anteriormente, el constructo de direccionamiento comprende en orden 5' a 3': una primera secuencia viral, un brazo de homología izquierdo, una secuencia de ácido nucleico que codifica un teschovirus porcino 2A autoescindible, la secuencia de ácido nucleico que codifica CAR, una secuencia de poliadenilación, un brazo de homología derecho y una segunda secuencia viral. En ciertas realizaciones, la primera o la segunda secuencia viral es de un virus adenoasociado (AAV). En ciertas realizaciones, el AAV es AAV2, AAV5 o AAV6.

En la presente memoria se describe una célula madre pluripotente inducida, en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) se integra en un primer sitio dentro del genoma de la célula, de modo que la célula expresa el CAR en la superficie de la célula, y en donde la integración del ácido nucleico que codifica CAR en el primer sitio reduce o previene la expresión de un complejo del receptor de células T (TCR) funcional en la superficie de la célula.

4. Descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-1E muestran el análisis de la integración dirigida de un CAR en el locus de la constante alfa de TCR (TRAC). La Figura 1A muestra un esquema de la integración dirigida inducida por nucleasas adaptadas (TALEN o CRISPR/Cas9) en el locus de la constante alfa TCR (TRAC). El constructo de direccionamiento (AAV6) contiene el gen CAR flanqueado por secuencias de homología (LHA y RHA). Una vez integrada, la expresión de CAR es impulsada por el promotor TCRa endógeno mientras que el locus TRAC se interrumpe. TRAV: Región variable TCR alfa. TRAJ: región de unión TCR alfa. 2A: la secuencia de teschovirus porcino 2A autoescindible. pA: secuencia PoliA de la hormona de crecimiento bovina. La Figura 1B muestra un gráfico de flujo TCR/CAR representativo 5 días después de la transfección de células T con ARNm de TRAC TALEN y la adición de AAV6 en la MOI (multiplicidad de infección) indicada. La Figura 1C muestra un gráfico de barras del porcentaje de interrupción de TCR (KO: inactivación) y la integración dirigida (KI: activación) según el MOI de AAV6. Los porcentajes se evaluaron mediante análisis FACS. La Figura 1D muestra la intensidad media de fluorescencia (MFI) de expresión de CAR promedio 5 días después de la vectorización de CAR (elección de un vector adaptado para expresar CAR, integración de la codificación de CAR en la célula) en células T (n = 6 a 8 experimentos independientes). La Figura 1E muestra el coeficiente de variación de las células T CAR+ que miden la dispersión en la expresión de CAR (relación entre la desviación estándar y la media). TRAC-P2A-1928z: integración dirigida en TRAC. SFG-1928z: integración semialeatoria utilizando el retrovirus SFG. ****P < 0,0001 (prueba T no pareada).

Las Figuras 2A-2E muestran el análisis de la integración dirigida de un CAR en el locus de constante alfa TCR (TRAC). La Figura 2A muestra el análisis de citometría de flujo que muestra la expresión de CAR y TCR. TRAC-P2A-1928z se generaron como en la Figura 1; Las células TCR generadas por TALEN se transdujeron con retrovirus SFG-1928z; y las células TCR+ se transdujeron con retrovirus SFG-1928z o SGF-P28z. La Figura 2B muestra los recuentos de células acumulados de las células T CAR indicadas tras la estimulación semanal con células diana CD19+. Las flechas indican puntos de tiempo de estimulación. La Figura 2C muestra la actividad citotóxica utilizando un ensayo de bioluminiscencia de 18 h, utilizando NALM6 que expresa luciferasa de luciérnaga (FFL) como células diana. Los datos son medias ± SD. Las Figuras 2D y 2E muestran ratones portadores de FFL-NALM6, que fueron tratados con 2 * 105 células T CAR. Carga tumoral mostrada como señal bioluminiscente cuantificada por animal cada semana durante un período de 40 días. La cuantificación es el recuento de fotones promedio de las adquisiciones ventrales y dorsales por animal en todos los puntos de tiempo dados, y se expresa como brillo. Cada línea representa un ratón. n = 7 ratones por grupo. La Figura inferior derecha es el análisis de Kaplan-Meier de supervivencia de ratones en la Figura 2D y 2E.

Las Figuras 3A-3J muestran que las células T TRAC- CAR superan a las células T CAR convencionales al prevenir el agotamientoin vivo.La Figura 3A muestra la integración del gen CAR dirigido por CRISPR/Cas9 en el locus TRAC. Parte superior, locus TRAC; medio, rAAV6 que contiene el casete CAR flanqueado por brazos de homología; abajo, editado locus TRAC. La Figura 3B muestra diagramas de flujo TCR/CAR representativos 4 días después del direccionamiento TRAC. Las Figuras 3C y 3D muestran la intensidad de fluorescencia media (MFI) de CAR (Figura 3C) y el coeficiente de varianza de MFI<c>A<r>(Figura 3D) de las células T CAR+ (n = 12 experimentos independientes, 6 donantes). La Figura 3E muestra el análisis de Kaplan-Meier de supervivencia de ratones. Las Figuras 3F-3J muestran que los ratones portadores de NALM-6 fueron tratados con 1*105 células T CAR (n = 7 por grupo; punto = un ratón) y sacrificados los días 10 y 17 después de la infusión; las células T CAR de médula ósea y las células NALM-6 se analizaron y contaron mediante FACS (TRAC-1928z, círculos; RV-1928z-TCR-, cuadrados;<r>V-1928<z>, triángulos). La Figura 3F muestra las células T CAR. La Figura 3G muestra células tumorales (GFP+CD19+). La Figura 3H muestra la proporción de células T con CAR a tumor. La Figura 3I muestra el porcentaje de memoria efectora (CD62L-CD45RA-) y efectora (CD62L-CD45RA+) en células T CAR en el día 17. La Figura 3J muestra el porcentaje de células T CAR que expresan marcadores de agotamiento; cuantificado por FACS en el día 17 (expresión del receptor inhibitorio mostrada desde los anillos interno a externo TIM3, LAG3 y PD1, respectivamente). * P<0,05, ** P<0,01, *** P<0,001, **** P < 0,0001 (prueba t de dos muestras de Welch (Figuras 3C y 3D); prueba de rango logarítmico de Mantel-Cox (Figura 3E); Mann-Whitney (Figuras 3F-3I)). Todos los datos son medias ± s.d. Véase también las Figuras 7-10.

Las Figuras 4A-4E muestran que las células T TRAC-CAR muestran señalización constitutiva reducida y diferenciación inducida por antígeno. La Figura 4A muestra el análisis FACS de marcadores de activación, memoria y agotamiento en células T (día 5 después de la infusión; representativa de 3 donantes; gráfico circular para la expresión de CD62L/D45RA (n = 3, 3 donantes). La Figura 4B muestra la expresión de CAR y fosforilación CD3Z ITAM (representativa de 3 donantes). RV-19Del, CAR específico de CD19 expresado retroviralmente que carece de dominios de señalización. La Figura 4C muestra fosfo-CD3Z MFI en la población CAR+ (n = 3, 3 donantes; ** P < 0,05 prueba de Mann-Whitney). La Figura 4D muestra la expresión de CD62L/CD45RA en células T CAR estimuladas 1, 2 o 4 veces. Los gráficos circulares muestran los fenotipos de las células T CAR+ (n = 3-5 en diferentes donantes) (A, CD45RA+ CD62L+; B, CD45RA- CD62L+; C, CD45RA- CD62L-; D, CD45RA+ CD62L-). La Figura 4E muestra el mapa de calor de la expresión de T-bet, EOMES y GATA3 en células T CAR recogidas como en la Figura 4D; el valor de aumento de veces de 1 representa a TRAC-1928z, 1 estimulación (n = 2, 2 donantes). Todos los datos son medias ± s.d. Véase también la Figura 12.

Las Figuras 5A-5G muestran que el prometor TRAC endógeno supera a otras combinaciones locus/promotorin vivo.

La Figura 5A muestra un esquema de la integración del promotor-CAR dirigido a CRISPR/Cas9 en el locus TRAC. Parte superior: locus TRAC; abajo: rAAV6 que contiene el casete promotor-CAR-poli A flanqueado por brazos de homología. La Figura 5B muestra un esquema de la integración CAR sin promotor dirigida a CRISPR/Cas9 en el locus B2M. Parte superior: locus B2M; abajo: rAAV6 que contiene un casete CAR sin promotor flanqueado por brazos de homología. La Figura 5C muestra diagramas de flujo B2M/CAR o TCR/CAR representativos 4 días después de la vectorización de células T. La Figura 5D muestra la intensidad de fluorescencia media (MFI) de CAR en el día 4 (n = 4-7 experimentos independientes; 4 donantes) (TRAC-LTR-1928z, B2M-1928z, TRAC-1928z y TRAC-EF1a-1928z, de izquierda a derecha, respectivamente). La Figura 5E muestra la expresión de CAR. Panel izquierdo: expresión de CAR (histograma representativo) en el día 4. Derecha: análisis FACS de marcadores de activación, memoria y agotamiento de células T CAR en el día 5 (representativo de 3 donantes). La Figura 5F muestra las células T CAR estimuladas en células diana CD19+ 0, 1, 2 o 4 veces. Los gráficos circulares muestran los fenotipos CD62L/CD45RA de las células T CAR+ (n= 3-5 experimentos independientes en diferentes donantes) (A, CD45RA+ CD62L+; B, CD45RA- CD62L+; C, CD45RA- CD62L-; D, CD45RA+ CD62L-). La Figura 5G muestra la carga tumoral (brillo promedio) de ratones portadores de NALM-6 tratados con 1 * 105 células T CAR (n = 6; línea = un ratón). La carga tumoral se cuantificó semanalmente durante un período de 50 días utilizando imágenes de bioluminiscencia (BLI). La cuantificación es el recuento de fotones promedio de adquisiciones ventrales y dorsales por animal en todos los puntos de tiempo dados. Cada línea representa un ratón. La Figura 5H muestra el análisis de Kaplan-Meier de la supervivencia de los ratones. (A): células T CAR TRAC-EF1a-1928z, (B): células T CAR B2M-1928z, (C): células T CAR TRAC-LTR-1928z, (D): células T CAR TRAC-1928z, células TRAC- 1928z etiquetado como se indica. ** P<0,01, *** P<0,001, ” “ P <0,0001 (prueba t de dos muestras de Welch para la Figura 5D); prueba de rango logarítmico de Mantel-Cox para la Figura 5G; prueba de Mann-Whitney para la Figura 5H). Todos los datos son medias ± SD. Véase también las Figuras 14 y 15.

Las Figuras 6A-6F muestran que el locus TRAC permite una regulación óptima de la expresión de CAR en la superficie celular. La Figura 6A muestra un histograma representativo de la expresión de CAR antes y después del cocultivo con células diana CD19+. La Figura 6B muestra la integración dirigida por CRISPR/Cas9 de un gen de fusión CAR-GFP en el locus TRAC. Figura 6C: Superior, expresión de LNGFR/CAR de las células T CAR bicistrónicas CAR-P2A-LNGFR antes y después del cocultivo con células diana CD19+. Inferior, expresión GFP/CAR de la fusión CAR-GFP dirigida al locus TRAC o integrada aleatoriamente con el vector RV (representativo de 3 experimentos independientes en 3 donantes). La Figura 6D muestra la expresión de CAR. Panel izquierdo: histograma representativo de la expresión CAR 5 días después de la vectorización. Panel derecho: MFI CAR relativo (1 = MFI a las 0 h) de células T CAR después de 1, 2 o 4 estimulaciones (indicadas por flechas; n = 3-7 experimentos independientes en diferentes donantes). La Figura 6E muestra los niveles relativos de CAR ARN (1 = nivel de TRAC ARN) 5 días después de la vectorización. La Figura 6F muestra un análisis de curso temporal de los niveles de CAR ARN (1 = nivel de ARN a las 0 h) en células T CAR estimuladas una vez en células diana CD19+ (n = 3 experimentos independientes en 3 donantes; células T CAR como en la Figura 6D, de arriba a abajo). Todos los datos son medias ± SD. * P<0,05,** P<0,01, *** P < 0,001 (prueba ANOVA F con corrección de Bonferroni (Figura 6D) y prueba de Mann-Whitney (Figura 6E)). Véase también la Figura 16. La línea inferior representa los niveles de CAR en la superficie (Figura 6D) o los niveles de de ARN de CAR (Figura 6F) en células T CAR TRAC-1928z.

Las Figuras 7A-7G muestran el gen CAR mediado por CRISPR/Cas9 dirigido al locus TRAC. Figura 7A, arriba, locus TRAC (SEQ ID NO:41) con el extremo 5' (gris) del primer exón TRAC, el TRAC ARNg (TGT...GAC, cadena inferior) y la secuencia PAM correspondiente (GGG, inmediatamente a la izquierda de TGT...GAC). Las dos flechas indican la rotura de doble cadena Cas9 predicha. Abajo, integración orientada a CRISPR/Cas9 en el locus TRAC. El constructo de direccionamiento (AAV) contiene un aceptor de empalme (SA), seguido de una secuencia codificante de P2A, el gen CAR 1928z y una secuencia poliA, flanqueada por secuencias homólogas al locus TRAC (LHA y RHA, brazo de homología izquierdo y derecho). Una vez integrado, el promotor endógeno TCRa impulsa la expresión de CAR, mientras que el locus TRAC está interrumpido. TRAV, región variable TCRa; TRAJ, región de unión TCRa; 2A, la secuencia de teschovirus porcino 2A autoescindible. pA: secuencia poliA de la hormona de crecimiento bovina. La Figura 7B muestra una línea de tiempo del direccionamiento de CAR hacia las células T primarias. La Figura 7C muestra diagramas de flujo TCR/CAR representativos 4 días después de la transfección de células T con ARNm Cas9 y TRAC ARNg y adición de AAV6 en la multiplicidad de infección indicada. La Figura 7D muestra el porcentaje de interrupción de TCR 4 días después de la transfección del ARNm de Cas9 y el ARNg de TRAC medido mediante análisis FACS de la expresión de TCR (n = 5). La Figura 7E muestra el porcentaje de activación dependiendo de la multiplicidad de infección de AAV6 medida por análisis FACS de la expresión de CAR (n = 4). La Figura 7F muestra el porcentaje de células T CAR+ en la población TCR negativa (n = 4). La Figura 7G muestra el porcentaje de TCR positivo (barra inferior) y TCR negativo (barra superior) en la población CAR+ analizada por FACS (n = 4).

Las Figuras 8A-8E muestran el mapeo del genoma completo de la integración AAV6 TRAC-1928z utilizando la tecnología TLA. La Figura 8A muestra una representación esquemática de la tecnología TLA (de Vree et al., Nat. Biotechnol. 32:1019-1025 (2014)). Para este estudio, se han utilizado dos conjuntos de cebadores dirigidos al CAR y al brazo de homología izquierdo. La Figura 8B muestra el gráfico de TCR/CAR FACS de células T CAR TRAC-1928z utilizadas para el análisis TLA. Las células T CAR se procesaron como en la Figura 7B y se expandieron durante 2 semanas. La Figura 8C muestra la cobertura de la secuencia TLA a través del genoma humano utilizando cebadores específicos de CAR 1928z (directo específico de CD28: 5' - ACAATGAGAAGAGCAATGGA-3' (SEQ ID NO: 39) y reverso específico de scFV: 5' - GAGATTGTCCTGGTTTCTGT-3' (SEQ ID NO: 40)). Los cromosomas se indican en el eje y, la posición cromosómica en el eje x. Las células T CAR codificadas por TRAC se produjeron como en la Figura 3 y se expandieron durante 10 días antes de procesarlas para su análisis. El conjunto de cebadores se usó en una amplificación de TLA individual. Los productos de PCR se purificaron y la biblioteca se preparó con protocolo Illumina NexteraXT™ y secuenciado en un secuenciador Illumina Miseq™. Las lecturas se mapearon utilizando BWA-SW, que es una herramienta de alineación de Smith-Waterman. Esto permite el mapeo parcial, que es óptimamente adecuado para identificar lecturas que abarcan interrupciones. Para el mapeo se usó la versión del genoma humano hg19. La Figura 8D muestra la cobertura de la secuencia TLA alineada en la secuencia AAV-TRAC-1928z (Secuencia objetivo flanqueada por ITR). Las barras verticales grises en la parte superior representan la cobertura en las posiciones mostradas. La cobertura mostró la integración de los ITR de AAV en fracción de lecturas. La comparación de cobertura entre la integración ITR y CAR en los extremos 5' y 3' del locus de los brazos de homología TRAC permiten la medición de la recombinación homóloga fiel e infiel que se muestra en la Figura 8E. La Figura 8E muestra los resultados finales del análisis TLA.

Las Figuras 9A-9C muestran actividad de citotoxicidadin vitroy respuesta de proliferación de Células T CAR TRAC. La Figura 9A muestra un análisis de citometría de flujo representativo que muestra la expresión de CAR y TCR. Las células T CAR TRAC-1928z se generaron como en la Figura 3B; las células T TCR generadas por CRISPR/Cas9 se transdujeron con el vector retroviral RV-1928z; las células TCR+ se transdujeron con RV-1928z o RV-P28z (CAR específico de PSMA). La purificación de células T negativas para TCR se realizó utilizando perlas magnéticas en la columna. La Figura 9B muestra la actividad citotóxica usando un ensayo de bioluminiscencia de 18 h, usando NALM-6 que expresa luciferasa de luciérnaga (FFL) como células diana (n = 3 experimentos independientes en 3 donantes sanos). La Figura 9C muestra recuentos de células acumulados representativos de células T CAR tras estimulación semanal con células diana CD19+. Las flechas indican puntos de tiempo de estimulación (n = 3 experimentos independientes en 3 donantes sanos).

Las Figuras 10A-10I muestran que las células T CAR TRAC- superan a las células T CAR convencionalesin vivo.La Figura 10A muestra que los ratones portadores de NALM-6 fueron tratados con 2 * 105 (izquierda), 1*105 (medio) o 5*104 (derecha) células T CAR. La carga tumoral se cuantificó semanalmente durante un período de 100 días usando BLI. La cuantificación es el recuento de fotones promedio de adquisiciones ventrales y dorsales por animal en todos los puntos de tiempo dados. Cada línea representa un ratón. Algunos grupos se agrupan de dos a tres experimentos independientes de diferentes donantes sanos, lo que representa n = 6-20 ratones por grupo. Inferior, análisis de Kaplan-Meier de supervivencia de ratones. Las Figuras 10B-10F muestran que los ratones portadores de NALM-6 fueron tratados con 1 * 105 células T CAR indicadas. A los 10 y 17 días después de la infusión de células T CAR, se sacrificaron 7 ratones por grupo y se recogieron células de la médula ósea. Las células T CAR y las células NALM-6 se analizaron y contaron con citometría de flujo. La Figura 10B muestra un análisis FACS representativo de células tumorales (CD19+GFP+) en la médula ósea el día 17. La Figura 10C muestra un análisis FACS representativo de los marcadores de agotamiento PD1 y TIM3 en células T con CAR de la médula ósea el día 17. La Figura 10D muestra un análisis FACS representativo de marcadores de agotamiento PD1 y LAG3 en células T CAR de médula ósea en el día 17. La Figura 10E muestra MFI CAR de las células CAR+ en la médula ósea (cada punto representa un ratón). La Figura 10F muestra el coeficiente de variación que mide la dispersión en la expresión CAR de la población CAR+ (relación entre la desviación estándar a la media; cada punto representa un ratón). La Figura 10G muestra que el diseño de CAR de RV-1928z permite la coexpresión de CAR y<l>N<g>FR del mismo promotor LTR mediante el uso de una secuencia P2A autoescindible. LTR, repetición terminal larga, SD, sitio donante de empalme; SA, sitio del aceptador de empalme; 2A, Secuencia autoescindible 2A de teschovirus porcino. La Figura 10H muestra gráficos de citometría de flujo representativos de células T transducidas con RV-1928z cultivadasin vitrooin vivo(extraído de la médula ósea) y marcado para detectar la expresión de CAR y LNGFR. La Figura 10I muestra una comparación entre MFI CAR en las células T RV-1928z y la carga tumoral (recuento de NALM-6) en la médula ósea.

Las Figuras 11A-11J muestran que las células T CAR TRAC-19BBz superan a las células T CAR de 19BBz convencionales al evitar el agotamientoin vivo.Las Figuras 11A y 11B muestran los resultados compilados a partir del MFI CAR promedio (Figura 11A) y el coeficiente de variación (Figura 11B) de las células T CAR+ obtenidas de tres transfecciones o transducciones independientes. Las células T utilizadas para estos tres experimentos se han aislado de la sangre de tres donantes sanos diferentes. Figura 11C: Izquierda, marcadores de activación, memoria y de agotamiento de células T CAR analizadas por citometría de flujo 5 días después de la transferencia génica. Derecha, los gráficos indican los fenotipos de las células T CAR+ medidas mediante análisis de citometría de flujo de la expresión de CD62L y CD45RA 5 días después de la vectorización de CAR; A: CD45RA+ CD62L+; B: CD45RA- CD62<l>+; C: CD45RA- CD62L-; D: CD45RA+ CD62L-. La Figura 11D muestra el MFI CAR relativo (1 = MFI a las 0 h) después de que las células T CAR se activaran 1, 2 o 4 veces en células diana CD19+ durante períodos de 48 h (n = 3 experimentos independientes, las flechas indican puntos de tiempo de estimulación) (TRAC -19bbz línea inferior, RV-19bbz línea superior). La Figura 11E muestra células T CAR estimuladas en células diana CD19+ 1, 2 o 4 veces en un período de 48 h que se analizaron mediante citometría de flujo. Los gráficos indican los fenotipos de las células T CAR+ medidas mediante análisis de citometría de flujo de la expresión de CD62L y CD45RA (proporción promedio de 3 experimentos independientes). La Figura 11F muestra que los ratones portadores de FFL-NALM-6 se trataron con 1 * 105 células T CAR. Carga tumoral mostrada como señal bioluminiscente cuantificada por animal cada semana durante un período de 21 días. n = 6 ratones por grupo. Las Figuras 11G-11J muestran que los ratones portadores de NALM-6 fueron tratados con 1 * 105 células T c A r . A los 10 y 17 días después de la infusión de células T CAR, se sacrificaron 7 ratones por grupo y se recogieron células de la médula ósea. Las células T CAR y las células NALM-6 se analizaron y contaron con citometría de flujo. Cada punto representa un ratón. La Figura 11G muestra el recuento de células T CAR en la médula (n = 7). La Figura 11H muestra el recuento de células tumorales (CD19+GFP+ NALM-6) en la médula ósea (n = 7). La Figura 11I muestra la relación efector/tumor en la médula ósea (n = 7). La Figura 11J muestra el análisis de marcadores de agotamiento de células T de médula ósea recogidas el día 17 y analizadas por citometría de flujo (expresión del receptor inhibidor mostrada desde los anillos interior a exterior TIM3, LAG3 y PD1, respectivamente). Representado como el porcentaje promedio de células que expresan los marcadores indicados (n = 7). * P<0,05, ** P<0,01, *** P < 0,001 (prueba de Mann-Whitney (Figuras 11Ay 11B) prueba ANOVA F (Figura 11D).

Las Figuras 12A-12D muestran que las células T CAR TRAC muestran señalización tónica reducida y diferenciación inducida por antígenoin vitro.La Figura 12A muestra un análisis FACS representativo de marcadores de diferenciación de células T 5 días después de la transferencia del gen CAR. La Figura 12B muestra un análisis FACS representativo de los marcadores de diferenciación de células T CAR después de 1, 2 o 4 estimulaciones en células diana CD19+. La Figura 12C muestra la expansión de las células T CAR cuando se estimulan 1, 2 o 4 veces en las células diana CD19+ durante un período de 48 h. No se encontró ninguna diferencia notable en la proliferación entre las tres condiciones de células T CAR 1928z. La Figura 12D muestra el porcentaje de células T CAR con expresión positiva de IFNy, TNFa o IL-2 después de la tinción intracelular al final del protocolo de la Figura 4D (n = 2 experimentos independientes en 2 donantes) (grupos de barras de izquierda a derecha TRAC- 1928z, RV1928z y RV-P28z, respectivamente).

Las Figuras 13A-13F muestran que las células T CAR TRAC muestran diferenciación inducida por antígenoin vitroretrasada en comparación con células T RV-CAR de baja o alta transducción. La Figura 13A muestra un histograma representativo de la expresión de CAR 5 días después de la transducción de diferentes volúmenes de sobrenadante retroviral en pl (representativo de 3 experimentos independientes; volumen total de transducción 2 ml). La Figura 13B muestra el porcentaje de células T c Ar en función del volumen de sobrenadante retroviral analizado por FACS 5 días después de la transducción (n = 3 donantes). La Figura 13C muestra la intensidad de fluorescencia media (MFI) de CAR de las células T en función del volumen de sobrenadante retroviral analizado por FACS 5 días después de la transducción (n = 3 donantes). La Figura 13D muestra el coeficiente de variación de CAR en función del volumen de sobrenadante retroviral analizado por FACS 5 días después de la transducción (n = 3 donantes). La Figura 13E muestra el MFI CAR promedio de las células T CAR 5 días después de la transducción (n = 3 donantes). Alto = 1000 pl y bajo = 30 pl. La Figura 13F muestra que las células T CAR estimuladas en células diana CD19+ 1, 2 o 4 veces en un período de 48 h se analizaron mediante citometría de flujo. Los gráficos indican los fenotipos de las células T positivas para CAR medidas mediante análisis de citometría de flujo de la expresión de CD62L y CD45RA (proporción promedio de 3 experimentos independientes) (A, CD45RA+ CD62L+; B, CD45RA- CD62L+; C, CD45RA- Cd 62L-; D, CD45RA+ CD62L-).

Figuras 14A-14F La expresión del gen CAR usando diferentes promotores en distintos loci influye en los niveles de señalización tónicain vitro.La Figura 14A muestra un diagrama de integración dirigida por CRISPR/Cas9 en el locus TRAC. El constructo de direccionamiento (AAV) contiene un aceptor de empalme (SA), seguido de una secuencia codificante de P2A, el gen CAR 1928z y una secuencia poliA, flanqueada por secuencias homólogas al locus TRAC (LHA y RHA: brazo de homología izquierdo y derecho). Una vez integrado, el promotor endógeno TCRa impulsa la expresión de CAR, mientras que el locus TRAC está interrumpido. TRAV: Región variable TCR alfa. TRAJ: región de unión alfa TCR 2A: la secuencia de teschovirus porcino 2A autoescindible. La Figura 14B muestra un diagrama de la integración del promotor dirigido por CRISPR/Cas9 en el locus TRAC. El constructo de direccionamiento (AAV) contiene la secuencia codificante de CAR 1928z en la orientación inversa, bajo el control de un promotor exógeno, la versión larga del promotor alfa del factor de elongación humano 1 (EF1a), la secuencia potenciadora del retrovirus gamma utilizado en la Figura 3 y 4 (Mo-MLV LTR aquí llamado LTR) o el promotor de la fosfoglicerato quinasa (PGK) y una secuencia poliA, flanqueada por secuencias homólogas al locus TRAC (LHA y RHA: brazo de homología izquierdo y derecho). TRAV: Región variable TCR alfa. TRAJ: región de unión TCR alfa. La Figura 14C muestra un esquema de integración dirigida inducida por CRISPR/Cas9 personalizada en el locus B<2>M. El constructo de direccionamiento (AAV) contiene el gen CAR flanqueado por secuencias de homología (LHA y RHA). Una vez integrada, el promotor endógeno B<2>M impulsa la expresión de CAR. La Figura 14D muestra un esquema de la integración del promotor dirigido por CRISPR/Cas9 en el locus B<2>M. El constructo de direccionamiento (AAV) contiene el gen CAR 1928z en la orientación inversa, bajo el control de un promotor exógeno, el promotor alfa del factor de elongación humano 1 (EF1a), el promotor de la fosfoglicerato quinasa (PGK) o una versión truncada de la PGK (PGK100) y una secuencia poliA, flanqueada por secuencias homólogas al locus B<2>M (LHA y RHA: brazo de homología izquierdo y derecho). La Figura 14E muestra la intensidad de fluorescencia media (MFI) de CAR promedio analizada por FACS 4 días después de la transducción (n= 3 a 7 experimentos independientes y 4 donantes diferentes). pA: secuencia poliA de la hormona de crecimiento bovina para todos los constructos de direccionamiento. La Figura 14F muestra el análisis de las células T CAR 5 días después de la vectorización. Panel izquierdo: histograma representativo de la expresión de CAR 5 días después de su vectorización en células T. Panel Medio: Marcadores de activación, memoria y agotamiento de células T CAR analizadas por citometría de flujo 5 días después de la vectorización de CAR. Panel derecho: los gráficos indican los fenotipos de las células T CAR positivas medidas mediante análisis de citometría de flujo de la expresión de CD62L y CD45RA 5 días después de la vectorización de CAR (A, CD45RA+ CD62L+; B, CD45RA- CD62L+; C, CD45RA-CD62L-; D, CD45RA+ CD62L-).

Las Figuras 15A-15G muestran que la expresión del gen CAR usando diferentes promotores en distintos loci influye en la diferenciación y el agotamiento inducidos por antígenoin vivo.La Figura 15A muestra un análisis FACS representativo de los marcadores de diferenciación de células T CAR después de 1, 2 o 4 estimulaciones en células diana CD19+. La Figura 15B muestra la expansión de células T CAR cuando se estimulan 1, 2 o 4 veces en células diana CD19+ durante un período de 48 h (grupos de puntos de izquierda a derecha TRAC-LTR-1928z, B2M-1928z, TRAC-1928z y TRAC-EF1a- 1928z, respectivamente). No se encontró ninguna diferencia aparente en la proliferación entre las cuatro condiciones de células T CAR 1928z. Las Figuras 15C-15E muestran que los ratones portadores de NALM-6 se trataron con 1 * 105 células T CAR. A los 10 y 17 días después de la infusión de células T CAR, se sacrificaron 7 ratones por grupo y se recolectaron células de médula ósea. Las células T CAR y las células NALM-6 se analizaron y contaron con citometría de flujo. Cada punto representa un ratón. La Figura 15F muestra el porcentaje de memoria efectora ('Eff mem', CD62L-CD45RA-) y efectora ('Eff', CD62L-CD45RA+) en las células T CAR de la médula ósea el día 17 (n = 7 ratones). La Figura 15G muestra el análisis de marcadores de agotamiento de células T de médula ósea recogidas el día 17 y analizadas por citometría de flujo. Representado como el porcentaje medio de células que expresan los marcadores indicados (n = 7 ratones) (expresión del receptor inhibidor mostrada desde los anillos interior a exterior TIM3, LAG3 y PD1, respectivamente).

Las Figuras 16A-16B muestran que la configuración del locus-promotor controla la expresión de la proteína CAR y la respuesta transcripcional tras la activación de las células T CAR. Figura 16A: Panel izquierdo: histograma representativo de la expresión de CAR 5 días después de su vectorización en células T. Panel derecho: MFI CAR relativo (1=MFI a las 0 h) después de que las células T CAR se activaran 1, 2 o 4 veces en las células diana CD19+ durante un período de 48 h. La Figura 16B muestra una comparación entre el nivel relativo de MFI CAR y CAR ARN antes de la estimulación (n=3 experimentos independientes en 3 donantes). La línea inferior representa los niveles superficiales del CAR en células T CAR TRAC-1928z.

La Figura 17 muestra perfiles de expresión génica asociados con la activación y formación de memoria de células T CD8+. Los genes sobrerregulados (Up) o subregulados (Down) en células OT-I expuestas a infección en relación con su expresión en células OT-I vírgenes se cuantificaron en varios puntos de tiempo durante la infección. Se muestran diez agrupaciones con la expresión más dinámica según el análisis de agrupación de K-medias, con un cambio en la expresión de más de 1,4 veces. Cada línea representa una sola sonda; los números en las esquinas inferiores derechas indican el número de sondas; gráficos anteriores, genes de interés en cada grupo (tomados de Best et al., Nature Immunol. 14:404-413 (2013)).

La Figura 18 muestra la secuencia de aminoácidos del virus de la leucemia murina (MLV) de Moloney de la integrasa de tipo salvaje (SEQ ID NO: 1) y mutantes D124A (SEQ ID NO: 2), D124E (SEQ ID NO: 3), D124N (SEQ ID NO: 4), D124V (SEQ ID NO: 5), D183A (SEQ ID NO: 6), D183N (SEQ ID NO: 7), D124A y D183A (SEQ ID NO: 8), D124A y D183N (SEQ ID NO: 9), D124E y D183A (SEQ ID NO: 10), D124E y D183N (SEQ ID NO: 11), D124N y D183A (SEQ ID NO: 12), D124N y D183N (SEQ ID NO: 13), D124V y D183A (SEQ ID NO: 14), y D124Vy D183N (SEQ ID NO: 15).

Donde se hace referencia en la descripción de los dibujos a color, los dibujos se han convertido a escala de grises.

5. Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere en general a la inmunoterapia y específicamente a las terapias celulares dirigidas basadas en la ingeniería genética de células T para expresar un CAR en las condiciones deseadas. En la presente memoria se describe un método para generar células T para inmunoterapia dirigiendo la integración de un transgén que codifica un CAR en el genoma de una célula T de modo que el transgén se coloque bajo el control de un promotor endógeno de un gen del complejo TCR. Se entenderá que la referencia a un transgén (en singular) como se describe aquí se aplica también a uno o más transgenes (en plural) a menos que el contexto indique lo contrario. En la presente memoria se describe una estrategia para la terapia con células T que utiliza la edición del genoma para colocar uno o varios transgenes terapéuticos bajo el control de uno o más promotores endógenos para proporcionar una expresión espaciotemporal controlada en las células T terapéuticas. En la presente memoria se describe una célula T que se diseñará para expresar un transgén terapéutico, o una variedad de transgenes terapéuticos, donde la expresión del transgén puede depender de la ubicación de la célula T (por ejemplo, la expresión de un transgén solo en la proximidad de un tumor), o en puntos de tiempo definidos (p. ej., antes o después de acoplarse a una célula tumoral) mediante el uso de promotores endógenos que proporcionan la expresión correspondiente. Por lo tanto, las células y los métodos de la invención pueden usarse para aumentar la eficacia y la seguridad de las células T terapéuticas.

La invención se refiere la colocación de un transgén terapéutico que codifica un CAR bajo el control de un promotor endógeno del gen del complejo TCR para lograr un perfil de expresión de transgén deseado en la célula T. Se selecciona un promotor endógeno para regular las características de expresión del transgén, por ejemplo, el momento de la expresión del transgén y/o el nivel de expresión del transgén. La regulación de la expresión del transgén colocándolo bajo el control de un promotor endógeno elimina la necesidad de administrar fármacos de molécula pequeña para inducir la expresión de un transgén, componentes inmunogénicos y vectores virales que codifican promotores internos y transgenes. Mediante la utilización de promotores endógenos, las células T se modifican para regular de forma autónoma la expresión de transgenes, de modo que la expresión transgénica, por ejemplo, donde y cuando se activa la expresión transgénica, se produce preferentemente en un programa definido que se basa en la respuesta endógena coordinada de la célula T para señales ambientales (p. ej., proximidad a un antígeno diana, citoquina y/o ligando coestimulador). Por lo tanto, la célula T puede diseñarse de manera que se use un promotor endógeno que responda a señales microambientales, dando como resultado una expresión del transgén espacial y temporalmente predecible gobernada por el promotor endógeno.

En un ejemplo específico, el transgén terapéutico codifica una proteína terapéutica. En otra realización específica, el transgén terapéutico codifica un ARN terapéutico.

La presente invención se refiere a la inmunoterapia y específicamente a las terapias celulares dirigidas basadas en el reemplazo genético de un componente del complejo del receptor de células T (TCR) con secuencias que codifican un CAR que reprograma la especificidad y función de las células T. Como se describe a modo de ejemplo en la presente memoria, se utilizó la edición de genes para generar productos de células T histocompatibles con expresión estable y homogénea de CAR. Además, el enfoque de edición de genes da como resultado la interrupción del gen diana que codifica un componente del complejo TCR, lo que mejora la función de las células T CAR al reducir la reactividad del injerto contra el huésped que habría sido mediada por el complejo TCR. También se puede utilizar para enfermedades autoinmunes del paciente, generalmente no incluidas en el ensayo clínico. La inactivación de su t Cr se puede utilizar para mejorar la seguridad de estos pacientes.

En una realización específica, en la presente memoria se describe un métodoin vitropara la generación en una sola etapa de células T CAR universales mediante el direccionamiento de la integración de un casete del gen CAR, preferiblemente sin promotor, en un gen que codifica un polipéptido necesario para la expresión funcional de un complejo receptor de células T (TCR). El término "universal" indica que las células T no se limitan al uso autólogo, sino que también se pueden usar de forma no autóloga. En una realización, este enfoque puede aprovechar la expresión regulada de un componente del complejo TCR para impulsar la expresión de CAR en la célula. Además, la integración del casete CAR interrumpe la expresión de un polipéptido necesario para un complejo TCR funcional, por ejemplo, al impedir el ensamblaje adecuado del complejo TCR en la superficie celular, lo que da lugar a células TCR negativas. El método es adecuado con las plataformas de edición del genoma comúnmente utilizadas, tales como la nucleasa de dedo de zinc (ZFN), la nucleasa efectora similar al activador de la transcripción (TALEN) y la proteína 9 (Cas9) asociada a repeticiones palindrómicas cortas agrupadas interespaciadas con regularidad (CRISPR), Cpf1, Meganuclease o Mega-Tal, y da como resultado una recombinación homóloga en un sitio objetivo en el genoma de la célula. Como se describe en la presente memoria, se establecieron condiciones que producían hasta un 50 % de células T CAR universales, combinando la interrupción del gen diana y la inserción dirigida de CAR en una sola etapa. Los resultados descritos en la presente memoria muestran que los métodos que utilizan un promotor de TCR endógeno proporcionaron los beneficios de una integración única así como una expresión consistente y predecible. Además, el método proporcionó beneficios inesperados de mejora de la función y persistencia de las células T. Lo que es más importante, las células T que expresan el CAR del locus TCR exhibieron una mayor actividadin vitroein vivode lisis tumoral, mayor proliferación y persistencia que las células T CAR transducidas retroviralmente, al tiempo que elimina su potencial de enfermedad de injerto contra huésped. Además, esta nueva metodología abre la posibilidad de generar células T CAR autólogas para pacientes que padecen trastornos autoinmunes. Los métodos descritos en este documento, que combinan la escalabilidad de la fabricación universal de células T con la uniformidad y la seguridad de la integración del gen CAR dirigido, son útiles para la terapia con CAR y para el desarrollo de la terapia con CAR disponible en el mercado.

5.1 Células T

La invención proporciona una célula T, en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) se integra en un sitio dentro del genoma de la célula de tal manera que la célula expresa CAR en la superficie de la célula, y en donde la integración del ácido nucleico que codifica CAR en el sitio impide la expresión de un complejo de receptor de células T funcional (TCR) en la superficie de la célula. En una realización preferida, las células recombinantes se pueden usar para potenciar o proporcionar una respuesta inmunitaria contra un objetivo deseado. En otra realización, las células recombinantes pueden usarse para inhibir una respuesta inmunitaria indeseable. Preferiblemente, las células se derivan de un ser humano (son de origen humano antes de convertirse en recombinantes) (y las células derivadas de humanos son particularmente preferidas para la administración a un ser humano en los métodos de tratamiento).

La integración dirigida de un casete de expresión sin promotor en una unidad de transcripción cromosómica en células T, preferiblemente células T humanas, aprovecha un promotor endógeno para optimizar la expresión del transgén y mejorar la función de las células T manipuladas, donde el transgén es un CAR. Preferiblemente, modificando las células T de esta manera, se obtuvo una expresión estable y homogénea de CAR, y la función y persistencia de las células T se mejoraron en relación con los métodos anteriores para la terapia con CAR. Dependiendo del diseño del casete, el método se puede utilizar para interrumpir o no la expresión del gen endógeno. En el caso de que se interrumpa la expresión del gen endógeno, el gen endógeno es un gen no esencial, es decir, un gen que no es necesario para la viabilidad celular o la proliferación de la célula. En el contexto de la invención, el transgén terapéutico es un CAR y la integración de las secuencias de ácido nucleico que codifican CAR interrumpe la expresión de un gen endógeno que codifica una proteína requerida para un complejo receptor de células T funcional. Este enfoque se puede aplicar a cualquier gen, que tenga una expresión regulada estable, espacial y/o temporalmente. En una realización específica, el direccionamiento de un gen que se expresa a partir de un solo alelo, por ejemplo, genes específicos del cromosoma TCR alfa, TCR beta, Y o X, puede utilizarse para garantizar que solo se exprese una copia del transgén por célula. Cada célula T expresa un receptor de célula T único que resulta de la asociación de una cadena de TCR alfa recombinada y una cadena de TCR beta recombinada. El proceso de generación de la diversidad de TCR ocurre durante la linfopoyesis en el timo, donde se recombinan los genes alfa y beta de TCR (recombinación VJ y VDJ respectivamente), y solo se expresa un alelo de cada gen a través de un proceso llamado exclusión de alelos (Honey,Nat. Rev. Immunol.5, 95 doi:10.1038/nri1560 (2005)). En el caso de direcionar a una cadena alfa o beta de TCR recombinada, este proceso establece que solo se expresará una copia del CAR integrado. El otro alelo puede ser direccionado pero no daría como resultado la expresión de CAR.

Las células T de la invención son células inmunes del linaje linfoide. Las células T expresan el receptor de células T (TCR), la mayoría de las células expresan cadenas a y p y una población más pequeña expresa cadenas y y 6. Las células T útiles como células inmunitarias de la invención pueden ser CD4+ o CD8+ y pueden incluir, pero no se limitan a, células T auxiliares (CD4+), células T citotóxicas (también conocidas como linfocitos T citotóxicos, CTL; células T CD8+) y células T de memoria, incluidas las células T de memoria central (TCM), las células T de memoria madre (TSCM), las células T de memoria similares a las células madre (o células T de memoria similares a las células madre) y las células T de memoria efectoras, por ejemplo, células Ty T<emra>(CD45RA+), células T efectoras, células Th1, células Th2, células Th9, células Th17, células Th22, células Tfh (ayudantes foliculares), células T reguladoras, células T asesinas naturales, células T invariantes asociadas a la mucosa (MAIT) y células T<y>6 células. Los principales subtipos de células T incluyen T<n>(ingenuo), T<scm>(memoria de células madre), T<cm>(memoria central), T<tm>(Memoria de transición), T(Memoria efectora), y T<te>(Efector Terminal). En una realización, las células T de la invención son células inmunoestimuladoras, es decir, células que median una respuesta inmunitaria. Ejemplos de células T que son inmunoestimuladoras incluyen, pero no se limitan a, células T auxiliares (CD4+), células T citotóxicas (también conocidas como linfocitos T citotóxicos, CTL; células T CD8+) y células T de memoria, incluidas células T de memoria central (TCM), células T de memoria madre (TSCM), células T de memoria similares a las células madre (o células T de memoria similares a las células madre) y células T de memoria efectoras, por ejemplo, células Ty T<emra>(CD45RA+), células T efectoras, células Th1, células Th2, células Th9, células Thl7, células Th22, células Tfh (ayudantes foliculares), células T asesinas naturales, células T invariantes asociadas a la mucosa (MAIT) y células T Y8. En otra realización, las células T de la invención son células inmunoinhibidoras, es decir, células que inhiben una respuesta inmunitaria. Las células T de ejemplo que son inmunoinhibidoras incluyen células T reguladoras (células T reguladoras, Treg) y células T reguladoras foliculares (Tfh). Las células T pueden generarse opcionalmente a partir de células madre embrionarias o células madre pluripotentes inducidas (iPSC) (véase, por ejemplo, Themeli et al.,Nat. Biotechnol.31(10):928-933 (2013)). Opcionalmente, las células precursoras de las células T que se pueden utilizar, que expresan recombinantemente un CAR, son, a modo de ejemplo, células madre y/o progenitoras hematopoyéticas. Las células madre y/o progenitoras hematopoyéticas pueden derivarse de médula ósea, sangre de cordón umbilical, sangre periférica adulta después de la movilización de citoquinas y similares, mediante métodos conocidos en la técnica, y luego se modifican genéticamente para expresar recombinantemente un CAR. Las células precursoras particularmente útiles son aquellas que pueden diferenciarse en el linaje linfoide, por ejemplo, células madre hematopoyéticas o células progenitoras del linaje linfoide que pueden diferenciarse en células T. En otra realización, se puede utilizar una iPSC como célula para la expresión de un transgén. En una realización preferida, una iPSC se puede utilizar como una célula para la expresión de un CAR, en donde un ácido nucleico recombinante que codifica un CAR se integra en un sitio en el genoma de la célula de manera que el CAR se expresa en la superficie de la célula, y en donde la integración del ácido nucleico que codifica CAR en el sitio impide la expresión de un complejo receptor de células T funcional en la superficie de la célula. En otra realización, una célula T, preferiblemente una célula T CAR, como se describe en la presente memoria, puede usarse para producir una iPSC. Se entiende que las realizaciones descritas en la presente memoria relacionadas con una célula T se considerarán aplicables a una iPSC o a una célula madre, según lo permita el contexto. Se puede usar una iPSC para producir una célula T de la invención, y también se puede derivar una iPSC de la misma.

El tipo de célula T seleccionada para expresar un transgén tendrá en cuenta si se desea estimular una respuesta inmunitaria o inhibir una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, una célula T reguladora (CD4+ CD25high FoxpP3+) se usaría para tratar a un sujeto que necesita una respuesta inmune inhibida, tal como alguien que tiene una enfermedad autoinmune y, a modo de ejemplo, la célula T expresaría un transgén que codifica una citoquina inmuno- inhibidora, mientras que las céluls T CD4+ (excepto Treg)/CD8+ se utilizan para tratar a un sujeto que necesita una respuesta inmunitaria estimulada, por ejemplo, un sujeto que tiene cáncer y, a modo de ejemplo, la célula T expresaría una citoquina inmunoestimuladora.

Las células T se pueden aislar mediante métodos bien conocidos en la técnica, incluidos los métodos de aislamiento disponibles comercialmente (véase, por ejemplo, Rowland-Jones et al.,Lymphocytes: A Practical Approach,Oxford University Press, Nueva York (1999)). Las fuentes de las células T incluyen, pero no se limitan a, sangre periférica, sangre del cordón umbilical, médula ósea u otras fuentes de células hematopoyéticas. Pueden emplearse diversas técnicas para separar las células para aislarlas o enriquecerlas en las células inmunitarias deseadas, como las células T. Por ejemplo, se pueden utilizar métodos de selección negativa para eliminar células que no son las células inmunitarias deseadas. Además, se pueden usar métodos de selección positivos para aislar o enriquecer las células T deseadas, o se puede emplear una combinación de métodos de selección positivos y negativos. Los anticuerpos monoclonales (MAbs) son particularmente útiles para identificar marcadores asociados con linajes celulares particulares y/o etapas de diferenciación para selecciones tanto positivas como negativas. Si se va a aislar un tipo particular de célula T, se pueden usar varios marcadores de superficie celular o combinaciones de marcadores, incluidos, pero no limitados a, CD3, CD4, CD8, CD34 (para células madre y progenitoras hematopoyéticas) y similares, para separar las células, como es bien conocido en la técnica (véase Kearse,T Cell Protocols: Development and Activation,Humana Press, Totowa NJ (2000); De Libero,T Cell Protocols,Vol. 514 deMethods in Molecular Biology,Humana Press, Totowa NJ (2009)).

Los métodos para aislar y expandir las células T reguladoras son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Su et al.,Methods Mol. Biol.806:287-299 (2012); Bluestone et al.,Sci. Transl. Med.7(315) (doi: 10.1126/scitranslmed.aad4134)(2015); Miyara et al.,Nat. Rev. Rheumatol.10:543-551 (2014); Liu et al.,J. Exp. Med.

203:1701-1711 (2006); Seddiki et al.,J. Exp. Med.203:1693-1700 (2006); Ukena et al.,Exp. Hematol.39:1152-1160 (2011); Chen et al.,J. Immunol.183:4094-4102 (2009); Putnam et al.,Diabetes58:652-662 (2009); Putnam et al.,Am. J. Tranplant.13:3010-3020 (2013); Lee et al.,Cancer Res.71:2871-2881 (2011); MacDonald et al.,J Clin. Invest.

126:1413-1424 (2016)). También se ha descrito la generación de células T reguladoras (iTregs)in vitro(véase, por ejemplo, Lan et al.,J. Mol. Cell. Biol.4:22-28 (2012); Yamagiwa et al.,J. Immunol.166:7282-7289 (2001); Zheng et al.,J. Immunol.169:4183-4189 (2002)). Generalmente, las células T reguladoras de la invención son CD4+, por ejemplo, CD4+CD25+, y en particular c D4+CD127Io/'CD25+. Tales células T reguladoras expresan Foxp3 (forkhead box P3), que pertenece a la familia de factores de transcripción forkhead/winged-helix (Bluestone et al., J. Clin. Invest.

125:2250-2260 (2015); Riley et al.,Immunity30:656-665 (2009)). Una célula T reguladora que es una célula inmunoinhibidora de la invención también puede ser una célula T CD8+ reguladora (Guillonneau et al.,Curr. Opin. Organ Transplant.15:751-756 (2010)). Los métodos para aislar y expandir las células T reguladoras también están disponibles comercialmente (véase, por ejemplo,D Biosciences, San Jose, CA; STEMCELL Technologies Inc., Vancouver, Canada; eBioscience, San Diego, CA; Invitrogen, Carlsbad, CA). Una célula T inmunoinhibidora de la invención también puede ser una célula T reguladora folicular (T(FR)) (Sage et al.,Nat. Immunol.14:152-161 (2013)). En una realización particular, las células T reguladoras foliculares de la invención son CD4+CXCR5+ y expresan Foxp3 (Sage et al.,supra,2013).

Los procedimientos para la separación de células incluyen, pero no se limitan a, centrifugación en gradiente de densidad, acoplamiento a partículas que modifican la densidad celular, separación magnética con perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos, cromatografía de afinidad; agentes citotóxicos unidos o utilizados junto con un anticuerpo monoclonal (mAb), incluidos, pero no limitados a, complemento y citotoxinas, y cribado con un anticuerpo unido a una matriz sólida, por ejemplo, una placa o chip, elutriación, citometría de flujo, o cualquier otra técnica conveniente (véase, por ejemplo, Recktenwald et al.,Cell Separation Methods and Applications,Marcel Dekker, Inc., Nueva York (1998)).

Las células T pueden ser autólogas o no autólogas al sujeto al que se administran en los métodos de tratamiento en el contexto de la invención. Las células autólogas se aíslan del sujeto al que se van a administrar las células T manipuladas. En una realización preferida, las células autólogas se aíslan del sujeto al que se van a administrar las células manipuladas que expresan recombinantemente un CAR. Opcionalmente, las células se pueden obtener mediante leucoféresis, donde los leucocitos se eliminan selectivamente de la sangre extraída, se vuelven recombinantes y luego se vuelven a transfundir al donante. Alternativamente, pueden usarse células alogénicas de un donante no autólogo que no sea el sujeto. En el caso de un donante no autólogo, las células se tipifican y se emparejan con el antígeno leucocitario humano (HLA) para determinar un nivel apropiado de compatibilidad, como es bien conocido en la técnica. Tanto para las células autólogas como para las no autólogas, las células se pueden crioconservar opcionalmente hasta que estén listas para usarse para manipulación genética y/o administración a un sujeto usando métodos bien conocidos en la técnica.

Anteriormente se han descrito diversos métodos para aislar células T que se pueden usar para la expresión recombinante de un CAR, y se pueden usar, incluidos, pero no limitados a, el uso de linfocitos de donantes periféricos (Sadelain et al.,Nat. Rev. Cancer3:35-45 (2003); Morgan et al.,Science314:126-129 (2006), utilizando cultivos de linfocitos derivados de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en biopsias de tumores (Panelli et al.,J. Immunol.

164:495-504 (2000); Panelli et al.,J Immunol.164:4382-4392 (2000)), y usando selectivamente leucocitos de sangre periférica específicos de antígeno expandidosin vitroque emplean células presentadoras de antígeno artificiales (AAPC) o células dendríticas (Dupont et al.,Cancer Res.65:5417-5427 (2005)); Papanicolaou et al.,Blood102:2498-2505 (2003)). En el caso de utilizar células madre, las células pueden aislarse mediante métodos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Klug et al.,Hematopoietic Stem Cell Protocols,Humana Press, New Jersey (2002); Freshney et al.,Culture of Human Stem Cells,John Wiley & Sons (2007)).

En una realización específica, las células T aisladas se manipulan genéticamenteex-vivopara la expresión recombinante de un CAR. Las células pueden manipularse genéticamente para la expresión recombinante mediante métodos bien conocidos en la técnica.

Las células T pueden reconocer y pueden sensibilizarse a un antígeno diana que luego se manipulan genéticamente para la expresión recombinante de un transgén. Tales células T pueden, pero no necesitan, expresar un CAR que se une a un antígeno diana, dado que las células ya son específicas del antígeno diana, de modo que su respuesta inmunitaria (por ejemplo, citotoxicidad) es estimulada específicamente por dicho antígeno diana. Tales células T que reconocen y se sensibilizan a un antígeno diana pueden obtenerse mediante métodos conocidos, a modo de ejemplo, métodos de sensibilizaciónin vitroque utilizan células T ingenuas (véase, por ejemplo, Wolfl et al.,Nat. Protocols9:950-966 (2014)) o células progenitoras hematopoyéticas (véase van Lent et al.,J. Immunol.179:4959-4968 (2007)); u obtenidas de un sujeto que ha estado expuesto y está desarrollando una respuesta inmune contra el antígeno diana (es decir, células T sensibilizadasin vivo).Los métodos para aislar una célula T específica de antígeno de un sujeto son bien conocidos en la técnica. Dichos métodos incluyen, pero no se limitan a, un sistema de captura de citoquinas o un ensayo de secreción de citoquinas, que se basa en la secreción de citoquinas de células T estimuladas por antígenos que se pueden usar para identificar y aislar células específicas de antígenos y la expansión de célulasin vitro(véase Assenmacher et al.,Cytometric Cytokine Secretion Assay, in Analyzing T Cell Responses: How to Analyze Cellular Immune Responses Against Tumor Associated Antigens,Nagorsen et al., eds., Chapter 10, pp. 183-195, Springer, Paises Bajos (2005); Haney et al.,J. Immunol. Methods369:33-41 (2011); Bunos et al.,Vox SanguinisDOI: 10.1111/vox.12291 (2015); Montes et al.,Clin. Exp. Immunol.142:292-302 (2005); Adusumilli et al.,Sci Transl Med.

6:261ra151 (2014)). Tales citoquinas incluyen, pero no se limitan a, interferón-y y factor de necrosis tumoral-a. Los métodos para aislar una célula T reguladora específica de antígeno de un sujeto son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Noyan et al.,Eur. J. Immunol.44:2592-2602 (2014); Brusko et al.,PLoS One5(7) e11726 (doi: 10.1371) (2010); Bacher et al.,MucosalImmunol.7:916-928 (2014); Koenen et al.,J. Immunol.174:7573-7583 (2005)). Las células T específicas de antígeno pueden aislarse usando técnicas bien conocidas como las descritas anteriormente para aislar células T, que incluyen, pero no se limitan a, citometría de flujo, perlas magnéticas, cribado en una fase sólida, etc. Las técnicas de aislamiento de células T específicas de antígeno también están disponibles comercialmente, que pueden usarse o adaptarse para aplicaciones clínicas (véase, por ejemplo, Miltenyi Biotec, Cambridge, MA; Proimmune, Oxford, Reino Unido; y similares).

Las células T pueden someterse a condiciones que favorezcan el mantenimiento o la expansión de las células (véase Kearse,T Cell Protocols: Development and Activation,Humana Press, Totowa NJ (2000); De Libero,T Cell Protocols,Vol. 514of Methods in Molecular Biology,Humana Press, Totowa NJ (2009); Parente-Pereira et al.,J. Biol. Methods1(2) e7 (doi 10.14440/jbm.2014.30) (2014); Movassagh et al.,Hum. Gene Ther.11:1189-1200 (2000); Rettig et al.,Mol. Ther.8:29-41 (2003); Agarwal et al.,J. Virol.72:3720-3728 (1998); Pollok et al.,Hum. Gene Ther.10:2221-2236 (1999); Quinn et al.,Hum. Gene Ther.9:1457-1467 (1998); Su et al.,Methods Mol. Biol.806:287-299 (2012); Bluestone et al.,Sci. Transl. Med.7(315) (doi: 10.1126/scitranslmed.aad4134)(2015); Miyara et al.,Nat. Rev. Rheumatol.10:543-551 (2014); Liu et al.,J. Exp. Med.203:1701-1711 (2006); Seddiki et al.,J. Exp. Med.203:1693-1700 (2006); Ukena et al.,Exp. Hematol.39:1152-1160 (2011);Chen et al., J. Immunol.183:4094-4102 (2009); Putnam et al.,Diabetes58:652-662 (2009); Putnam et al.,Am. J. Tranplant.13:3010-3020 (2013); Lee et al.,Cancer Res.71:2871-2881 (2011); MacDonald et al.,J. Clin. Invest.126:1413-1424 (2016); véase también métodos disponibles comercialmente tales como Dynabeads™ productos activadores de células T humanas, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)). Las células se pueden expandir opcionalmente antes o después de Ingeniería genéticaex-vivo.La expansión de las células es particularmente útil para aumentar el número de células para la administración a un sujeto. Dichos métodos para la expansión de células inmunitarias como las células T son bien conocidos en la técnica (véase Kaiser et al.,Cancer Gene Therapy22:72-78 (2015); Wolfl et al.,Nat. Protocols9:950-966 (2014)). Además, las células se pueden crioconservar opcionalmente después del aislamiento y/o la ingeniería genética y/o la expansión de células modificadas genéticamente (véase Kaiser et al.,supra,2015)). Los métodos para cyroconservar células son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Freshney,Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques,4th ed., Wiley-Liss, Nueva York (2000); Harrison and Rae,General Techniques of Cell Culture,Cambridge University Press (1997)).

5.2 Métodos de integración dirigidos

Con respecto a la generación de células que expresan de forma recombinante un transgén bajo el control de un promotor endógeno de células T, el transgén se introduce en el genoma de la célula T. Con respecto a la generación de células que expresan recombinantemente un CAR, se introduce un ácido nucleico que codifica el CAR en la célula T. Tradicionalmente, dichos métodos han utilizado un vector de expresión adecuado, en cuyo caso las células T se transducen con un transgén, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un CAR. En la presente invención, un transgén se clona en un constructo de direccionamiento, que proporciona la integración dirigida del transgén en un sitio dentro del genoma. En el contexto de la invención, un ácido nucleico que codifica un CAR se clona en un constructo de direccionamiento, que proporciona la integración dirigida de la secuencia de ácido nucleico que codifica el CAR en un sitio que interrumpe la expresión de un gen que codifica una proteína necesaria para la expresión de un complejo TCR funcional en la célula. Por ejemplo, un transgén, por ejemplo, un polinucleótido que codifica un CAR, de la invención puede clonarse en un constructo de direccionamiento adecuado, o un vector adecuado tal como un vector retroviral, e introducirse en la célula T usando técnicas de biología molecular bien conocidas (véase Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999)).

Puede emplearse cualquier constructo de direccionamiento adecuado, adecuado para la expresión en una célula de la invención, particularmente una célula T humana. En una realización particular, el constructo de direccionamiento es compatible para su uso con un sistema de recombinación homóloga adecuado para la integración dirigida de la secuencia de ácido nucleico (transgén) en un sitio dentro del genoma de la célula. Los ejemplos de sistemas de recombinación homóloga son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, tecnologías que utilizan una nucleasa, por ejemplo, nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción (TALEN), nucleasas de dedos de zinc (ZFN), sistemas de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas interespaciadas con regularidad (CRISPR) tales como la proteína 9 asociada a CRISPR (Cas9) y Cpf1, y/o Meganucleasa o una Mega-Tal (fusión de un dominio Tal y una Meganucleasa) y similares, que proporcionan recombinación homóloga, por ejemplo, un sitio diana deseado dentro del genoma de la célula (véase Ejemplos; véase también Patente U.S. No. 8.697.359; publicación US 20140068797; Gaj et al.,Trends Biotechnol.31:397-405 (2013); Gersbach et al.,Nucl. Acids Res.39:7868-7878 (2011); Vasileva, et al.Cell Death Dis.6:e1831. (Jul 23 2015); Sontheimer,Hum. Gene Ther.26(7):413-424 (2015); Osborn et al.,Mol. Ther.24(3):570-581 (2016))). Tales métodos son bien conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente (ThermoFisher, Carlsbad, CA; GenScript, Piscataway, NJ; Clontech, Mountain View, CA). Otros sistemas basados en CRISPR incluyen pirógeno y Aureus. Tales métodos pueden usarse para llevar a cabo o promover la recombinación homóloga.

5.3 Vectores y constructos de direccionamiento

Un constructo de direccionamiento adecuado puede comprender cualquier secuencia de ácido nucleico que sea compatible con un sistema de recombinación homóloga empleado en la invención. En una realización, el constructo de direccionamiento comprende secuencias de virus adenoasociados (AAV). El constructo de direccionamiento puede tener secuencias de ácido nucleico de uno o más serotipos de AAV. Por ejemplo, el constructo de direccionamiento puede comprender secuencias de AAV2 u otras secuencias de serotipo tales como AAV5. Las secuencias de ácido nucleico de AAV que funcionan como parte de un constructo de direccionamiento pueden empaquetarse en varias cápsides o partículas de AAV naturales o recombinantes. En una realización particular, la partícula AAV es AAV6. En una realización particular, un constructo de direccionamiento basada en AAV2 se administra a la célula diana usando partículas virales de AAV6. En una realización particular, las secuencias de AAV son secuencias de AAV2, AAV5 o AAV6. En una realización particular, las secuencias de AAV son de AAV2. En otra realización particular, las secuencias de AAV son de AAV6. En otra realización particular, el constructo de direccionamiento comprende en orden 5' a 3': una primera secuencia viral, un brazo de homología izquierdo, una secuencia de ácido nucleico que codifica un teschovirus porcino autoescindible 2A, un transgén, una secuencia de poliadenilación, un brazo de homología derecho y una segunda secuencia viral. En una realización preferida, el constructo de direccionamiento comprende en el orden 5' a 3': una primera secuencia viral, un brazo de homología izquierdo, una secuencia de ácido nucleico que codifica un teschovirus porcino 2A autoescindible, una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR, una secuencia de poliadenilación, un brazo de homología derecho y una segunda secuencia viral. Otro constructo de direccionamiento adecuado puede comprender secuencias de un Lentivirus deficiente en integración (véase, por ejemplo, Wanisch et al., Mol. Ther. 17(8):1316-1332 (2009)). En una realización particular, la secuencia de ácido nucleico viral comprende secuencias de un Lentivirus deficiente en integración. Se entiende que puede utilizarse cualquier constructo de direccionamiento adecuado compatible con un sistema de recombinación homóloga empleado.

Las secuencias de vectores virales que se pueden incluir en un constructo diana incluyen, pero no se limitan a, vectores retrovirales, adenovirales, lentivirales y virales adenoasociados, virus vaccinia, vectores derivados del virus del papiloma bovino y vectores del virus del herpes, tales como el virus de Epstein-Barr. (véase, por ejemplo, Miller,Hum. Gene Ther.1(1):5-14 (1990); Friedman,Science244:1275-1281 (1989); Eglitis et al.,BioTechniques6:608-614 (1988); Tolstoshev et al.,CurrentOpin. Biotechnol.1:55-61 (1990); Sharp,Lancet337:1277-1278 (1991); Cornetta et al.,Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol.36:311-322 (1989); Anderson,Science226:401-409 (1984); Moen,Blood Cells17:407-416 (1991); Miller et al.,Biotechnology7:980-990 (1989); Le Gal La Salle et al.,Science259:988-990 (1993); and Johnson,Chest107:77S- 83S (1995); Rosenberg et al.,N. Engl. J. Med.323:370 (1990); Anderson et al., U.S. Pat. No. 5.399.346; Scholler et al.,Sci. Transl. Med.4:132-153 (2012; Parente-Pereira et al.,J. Biol. Methods1(2):e7 (1-9)(2014); Lamers et al.,Blood117(1):72-82 (2011); Reviere et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.USA 92:6733-6737 (1995); Wang et al.,Gene Therapy15:1454-1459 (2008)).

Los vectores particularmente útiles para generar un constructo diana que proporcione la vectorización transgénica para el direccionamiento mediado por recombinación homóloga incluyen, pero no se limitan a, el virus adenoasociado recombinante (rAAV), el lentivirus recombinante no integrador(rNILV), el retrovirus gamma no integrador recombinante (rNIgRV), ADN monocatenario (lineal o circular) y similares. Dichos vectores se pueden usar para introducir un transgén en una célula T de la invención creando un constructo diana, como se describe anteriormente.

En una realización, el vector es un retrovirus gamma no integrador recombinante (rNIgRV). En una realización, los rNIgRV se obtienen usando una integrasa de retrovirus gamma que está mutada en el motivo DDE, que suprime la actividad de la integrasa. Por lo tanto, un retrovirus gamma se convierte en un retrovirus gamma que no se integra mediante la inactivación de su integrasa (véanse el Ejemplo 4 y la Figura 18). En una realización particular, la integrasa comprende una mutación DDE seleccionada del grupo que consiste en D164A, D164E, D164N, D164V, D183A, D183N, D164A y D168A, D164A y D183N, D164N y D183A, D164N y D183N, D164V y D168A, D164V y D183N, D164V y D183A, y D164V y D183N. Tal vector rNIgRV es ventajoso ya que es más fácil y económico de producir que los vectores usados tradicionalmente.

Se entenderá fácilmente que se puede utilizar un vector rNIgRV para introducir cualquier ADN deseado en cualquier célula. Por lo tanto, se puede usar un rNIgRV para introducir cualquier tipo de ADN deseado en una célula de cualquier tipo en el que funcione el vector.

En los métodos que emplean un promotor endógeno para controlar la expresión de un transgén que está integrado dentro de un sitio en el genoma de una célula, el constructo de direccionamiento preferiblemente carece de promotor. En una realización preferida de los métodos de la presente invención que emplean un promotor endógeno para controlar la expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR que está integrado dentro de un sitio en el genoma de una célula, el constructo de direccionamiento preferiblemente no tiene promotor. Tal constructo permite la integración del transgén, como la secuencia de ácido nucleico que codifica un c Ar , en un sitio dentro del genoma de manera que la secuencia de ácido nucleico integrada (transgén) está bajo el control de un promotor endógeno de un gen del complejo TCR. En una realización particular, el promotor endógeno es un promotor de un gen que codifica una cadena alfa del receptor de células T, una cadena beta de un receptor de células T, una cadena gamma de CD3, una cadena delta de CD3, una cadena épsilon de CD3 o una cadena zeta de CD3. En una realización específica, las secuencias de ácido nucleico que codifican un CAR están integradas.

Un promotor endógeno puede controlar la expresión del transgén recombinante, como la secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR. Se entiende que se puede utilizar un vector que emplea un promotor adecuado para la expresión en una célula huésped particular, por ejemplo, un vector que incorpora un promotor endógeno tal como un promotor TCR. Tal vector podría proporcionar expresión de una manera similar a la proporcionada por un promotor endógeno, tal como un promotor de TCR. Dicho vector puede ser útil, por ejemplo, si el sitio de integración no permite la expresión eficiente de un transgén, o si la interrupción del gen endógeno controlado por el promotor endógeno sería perjudicial para la célula T o daría como resultado una disminución en su eficacia en la terapia con células T. Preferiblemente, dicho vector puede ser útil, por ejemplo, si el sitio de integración no proporciona una expresión eficaz de la secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR. El promotor puede ser un promotor inducible o un promotor constitutivo. La expresión de una secuencia de ácido nucleico bajo el control de un promotor endógeno o asociado a un vector se produce en condiciones adecuadas para que la célula exprese el ácido nucleico, por ejemplo, condiciones de crecimiento, o en presencia de un inductor con un promotor inducible, y similares. Tales condiciones son bien entendidas por los expertos en la técnica.

El constructo de direccionamiento puede diseñarse opcionalmente para incluir una secuencia de P2A directamente corriente arriba de las secuencias de ácido nucleico que codifican el transgén. En una realización preferida, el constructo de direccionamiento puede diseñarse opcionalmente para incluir una secuencia de P2A directamente cadena arriba de las secuencias de ácido nucleico que codifican un CAR. P2A es una secuencia peptídica autoescindible, que se puede utilizar para la expresión bicistrónica o multicistrónica de secuencias de proteínas (véase Szymczak et al.,Expert Opin. Biol. Therapy5(5):627-638 (2005)). Si se desea, el constructo de direccionamiento puede diseñarse opcionalmente para incluir un informador, por ejemplo, una proteína informadora que proporcione la identificación de las células transducidas. Las proteínas indicadoras de ejemplo incluyen, pero no se limitana a, proteínas fluorescentes, tales como mCherry, proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente azul, por ejemplo, EBFP, EBFP2, Azurite y mKalama1, proteína fluorescente cian, por ejemplo, ECFP, Cerulean y CyPet, y proteína fluorescente amarilla, por ejemplo, YFP, Citrine, Venus e YPet.

Preferiblemente, el constructo de direccionamiento comprende una secuencia de poliadenilación (poli A) 3' del transgén. En una realización preferida, el constructo de direccionamiento comprende una secuencia de poliadenilación (poli A) 3' de las secuencias de ácido nucleico que codifican un CAR.

Tal como se proporciona en la presente memoria, un ácido nucleico que codifica un CAR se integra en un sitio dentro del genoma de la célula de modo que el CAR pueda expresarse en la célula y producirse en la superficie celular. El sitio de integración impide la expresión de un complejo funcional de receptor de células T (TCR) en la superficie de la célula. De este modo, la célula puede convertirse en una célula negativa para TCR. Tal célula TCR negativa puede ser útil, por ejemplo, en el caso de utilizar células T no autólogas, para reducir la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) en el receptor. La generación de una célula TCR negativa también se puede usar para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad autoinmune con células autólogas, ya que la reacción autoinmune proporcionada por las propias células T del sujeto se puede reducir evitando la expresión de un complejo TCR funcional que se dirige a un autoantígeno.

El receptor de células T (TCR) es un heterodímero de las cadenas TCR-a y TCR-p. El complejo TCR está formado por TCR y CD3 gamma (y), CD3 delta (8), CD3 epsilon (e) y CD3 zeta (Z) (véase, por ejemplo, Call et al.,Cell111:967-979 (2002)). La interrupción o reducción de la expresión de uno o más de una cadena alfa del receptor de células T, una cadena beta de un receptor de células T, una cadena gamma de CD3, una cadena delta de CD3, una cadena épsilon de CD3 o una cadena zeta de CD3 se puede usar para reducir o prevenir la formación de un complejo funcional del receptor de células T (TCR). Al reducir o prevenir la formación de un complejo TCR funcional, la célula T ya no media una respuesta inmunitaria a través de su complejo TCR. En una realización, un ácido nucleico que codifica un CAR se integra en un sitio dentro del genoma que interrumpe la expresión de una cadena alfa del receptor de células T, cadena beta del receptor de células T, cadena gamma de CD3, cadena delta de CD3, cadena épsilon de CD3, o cadena zeta de CD3. Si bien la reducción de una de las proteínas del complejo TCR puede ser suficiente, se entiende que, si se desea, se puede reducir más de un componente del complejo TCR.

Se entiende que el sitio de integración en el genoma de la célula está dirigido a colocar el transgén bajo el control de un promotor endógeno. La integración puede ser, a modo de ejemplo pero sin limitación, integración en un exón, integración en un intrón o integración en el extremo 5' del gen. En una realización, la integración del transgén da como resultado la interrupción del gen endógeno en el sitio de integración. En una realización preferida, se entiende que el sitio de integración en el genoma de la célula está dirigido a interrumpir la expresión de un componente del complejo TCR, por ejemplo, cadena alfa del receptor de células T, cadena beta del receptor de células T, cadena gamma de CD3, cadena delta de CD3, cadena épsilon de CD3 o cadena zeta de CD3. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente una posición adecuada dentro de un gen que codifica una cadena alfa del receptor de células T, cadena beta de un receptor de células T, cadena gamma de CD3, cadena delta de CD3, cadena épsilon de CD3 o cadena zeta de CD3 para integrar un ácido nucleico que codifica CAR para reducir o interrumpir la expresión de la cadena alfa del receptor de células T, cadena beta del receptor de células T, cadena gamma de<c>D3, cadena delta de CD3, cadena épsilon de CD3 o cadena zeta de CD3. Tales métodos son bien conocidos en la técnica y pueden incluir, pero no se limitan a, integración en un exón, integración en un intrón, integración en el extremo 5' del gen y similares. Se entiende que cualquier intrón o exón del gen puede soportar el constructo de direccionamiento. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente un sitio adecuado para la integración dirigida de un transgén que, si se desea, interrumpirá la expresión de un gen endógeno bajo el control del promotor endógeno en el sitio de integración. En una realización particular, el sitio de integración está dentro del primer exón. Se entiende que, cuando se selecciona un sitio para la integración de un transgén, el sitio de integración ocurre en un gen no esencial, es decir, un gen que no es necesario para la viabilidad celular o proliferación de la célula, particularmente en el caso donde la expresión del gen endógeno será interrumpido. En una realización preferida, un experto en la técnica puede determinar fácilmente un sitio adecuado para la integración dirigida de una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR que interrumpirá la expresión de la proteína del complejo TCR, tal como la cadena alfa del receptor de células T, cadena beta del receptor de células T, cadena gamma de CD3, cadena delta de CD3, cadena épsilon de CD3 o cadena zeta de CD3, y/o colocar la secuencia de ácido nucleico que codifica CAR bajo el control del promotor endógeno del gen respectivo que codifica el componente del complejo TCR. En una realización, el sitio de integración está dentro del primer exón (véase Ejemplo). En una realización particular, el sitio de integración está dentro del primer exón de la cadena constante alfa de TCR (TRAC). En el contexto de la invención, un ácido nucleico que codifica un CAR se pone bajo el control de un promotor de un gen del complejo TCR endógeno.

Si se desea, el sitio de integración y el constructo de direccionamiento pueden diseñarse para proporcionar la integración de un transgén en marco con el gen endógeno, lo que da como resultado la expresión de una proteína de fusión del transgén y el gen endógeno (véase también US20130280222). En una realización preferida, el sitio de integración y el constructo de direccionamiento pueden diseñarse para proporcionar integración en marco con el gen endógeno, dando como resultado la expresión de una proteína de fusión de un CAR y la proteína del complejo TCR. Opcionalmente, tal constructo puede contener un P2A directamente en 5' del transgén, lo que permite la expresión del transgén en una ubicación deseada en la célula sin fusionarse con el producto génico del gen endógeno. Tal constructo proporciona la expresión tanto del transgén como del gen endógeno en el sitio de integración, y tal constructo se puede utilizar si la interrupción del gen endógeno es perjudicial para la célula T o resultaría en una disminución de su eficacia en terapia con células T. En una realización preferida, dicho constructo puede contener un P2A directamente en 5' de la secuencia de ácido nucleico que codifica CAR, lo que permite la expresión del CAR en la superficie de la célula sin fusionarse con la proteína del complejo TCR. Se entiende además que también se puede integrar otro gen en el genoma, tal como un gen que codifica un segundo CAR, o un interruptor de seguridad (p. ej., caspasa 9 inducible (iCasp9) o timidina quinasa del virus del herpes simple (HSVtk), véase Tey,Clin. Transí. Immunology3(6):e17), o una molécula inmunomoduladora, y similares. En una realización, la integración de genes iguales o diferentes (transgenes) se produce en genes diana diferentes, respectivamente. En un aspecto específico, se integran diferentes genes (transgenes) en los diferentes sitios de integración, respectivamente.

El sistema de recombinación homóloga se diseña usando métodos bien conocidos en la técnica para dirigirse a un sitio deseado dentro del genoma, por ejemplo, un sitio dentro del gen que codifica la cadena alfa del receptor de células T (Cromosoma 14, NC_000014.9 (22547506..22552132)), cadena beta del receptor de células T (Cromosoma 7, NC_000007.14 (142299011..142813287)), cadena gamma de CD3 (Cromosoma 11, NC_000011.10 (118344316..118353782)), cadena delta de CD3 (Cromosoma 11, NC_000011.10 (118339074..118342744)), cadena epsilon de CD3 (Cromosoma 11, NC_000011.10 (118304580..118316175)), o cadena zeta de CD3 (Cromosoma 1, NC_000001.11 (167430640..167518616)), como se conoce en la técnica (Los números de ubicación de los cromosomas corresponden al ensamblaje actual: GRCh38.p2).

Como se describe en la presente memoria, en una realización, el sitio de integración puede dirigirse a un gen que se expresa a partir de un solo alelo, por ejemplo, genes específicos del cromosoma TCR alfa, TCR beta, Y o X. En tal caso, puede ser suficiente integrar un transgén en un solo sitio dentro del genoma. En el contexto de la invención, en donde el transgén codifica un CAR, puede ser suficiente integrar un ácido nucleico que codifica un CAR en un solo sitio dentro del genoma. Esta estrategia se puede utilizar para garantizar que solo se exprese una copia del transgén por célula. Opcionalmente, en el caso de que un gen al que se dirige la integración esté presente en dos alelos, la recombinación homóloga dirigida puede ocurrir en ambos alelos. En tal caso, la integración dirigida puede ocurrir en un locus o en dos loci.

Pueden usarse ensayos para determinar la eficiencia de transducción de un transgén, preferiblemente que codifica un CAR, usando técnicas de biología molecular de rutina. La eficacia de la transferencia génica puede controlarse mediante análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para cuantificar la fracción de células T transducidas y/o mediante PCR cuantitativa. Utilizando un sistema de cocultivo bien establecido (Gade et al.,Cáncer Res.65:9080-9088 (2005)); Gong et al.,Neoplasia1:123-127 (1999); Latouche et al.,Nat. Biotechnol.18:405-409 (2000)) se puede determinar si los AAPC de fibroblastos que expresan antígeno canceroso (vs. controles) dirigen la liberación de citoquinas de las células T transducidas que expresan un ensayo de CAR (sobrenadante celular LUMINEX (Austin T<x>) para IL-2, IL-4, IL-10, IFN -<y>, TNF-a y GM-CSF), proliferación de células T (mediante marcaje con éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE)) y supervivencia de células T (mediante tinción con anexina V). Las células T que expresan un CAR pueden exponerse a estimulación repetida mediante células positivas al antígeno diana, y puede determinarse si la proliferación de células T y la respuesta de citoquinas siguen siendo similares o disminuyen con la estimulación repetida. En una realización preferida, las células T que expresan un CAR pueden exponerse a estimulación repetida por células diana positivas al antígeno canceroso, y puede determinarse si la proliferación de células T y la respuesta de citoquinas siguen siendo similares o disminuyen con la estimulación repetida. Los ensayos de citotoxicidad con múltiples relaciones E:T se pueden realizar utilizando ensayos de liberación de cromo.

5.4 Promotores de células T endógenas

Un transgén terapéutico puede expresarse en una célula T integrando el transgén en un sitio dentro del genoma de la célula T de manera que el transgén se coloque bajo el control de un promotor endógeno de la célula T. Al utilizar un promotor endógeno, las células T se modifican para expresar un transgén terapéutico o una variedad de transgenes terapéuticos bajo el control de diferentes promotores endógenos. Específicamente, la expresión del transgén puede depender del microambiente de la célula T. Por ejemplo, la expresión de un transgén terapéutico puede depender de la ubicación de la célula T (p. ej., la expresión de un transgén solo en la proximidad de un tumor) mediante el uso de un promotor endógeno que se induce cuando la célula T está en una ubicación particular. (p. ej., cuando la célula T se encuentra en la ubicación de un tumor y se activa al unirse al antígeno tumoral, induciendo así el promotor endógeno), o puede estar en puntos de tiempo definidos (p. ej., mediante el uso de un promotor endógeno que se induce en un punto de tiempo definido, por ejemplo, mediante la activación de la célula T al encontrar una célula tumoral). El promotor se selecciona basándose, por ejemplo, en qué tan pronto se activa o se inhibe después del encuentro de la célula T con un antígeno, qué tan fuerte se expresa y por cuánto tiempo. El promotor se selecciona para adaptarse a la farmacología del transgén cuya expresión regula (p. ej., algunos transgenes son más efectivos a niveles bajos, otros transgenes son más efectivos a niveles altos de expresión y similares). Se entenderá que la descripción en esta divulgación con respecto al uso de un promotor endógeno (singular) que controla la expresión de un transgén en una célula T se aplicará igualmente al uso de más de un promotor endógeno, cada uno de los cuales controla la expresión de un transgén (que puede ser igual o diferente de los otros transgenes), en la célula T, a menos que el contexto indique lo contrario. Un experto en la técnica puede seleccionar fácilmente los promotores endógenos apropiados para proporcionar la expresión y/o regulación deseada de uno o más transgenes para mejorar la eficacia de una célula T para su uso en la terapia con células T.

Los promotores de células T endógenos pueden ser constitutivos o inducibles. El promotor endógeno puede ser específico para un subconjunto de células T. En el caso de que se exprese más de un transgén en una célula T, los transgenes (que pueden ser diferentes entre sí) pueden colocarse bajo el control de una combinación de promotores constitutivos e inducibles, respectivamente, de los cuales uno o más pueden ser, por ejemplo, específico para un subconjunto de células T.

En una realización, se integran dos o más transgenes en el genoma de la célula T, de manera que la expresión de cada transgén está bajo el control de un promotor endógeno diferente de la célula T. En una realización específica, se integran así dos transgenes. En una realización particular, la expresión de cada uno de los dos transgenes está bajo el control de diferentes promotores endógenos que son constitutivos. En otra realización particular, la expresión de un primer transgén está bajo el control de un promotor endógeno constitutivo y la expresión de un segundo transgén está bajo el control de un promotor endógeno inducible. En otra realización particular, se integran tres transgenes en el genoma de la célula T, de manera que la expresión de cada transgén está bajo el control de un promotor endógeno diferente de la célula T, donde la expresión de un primer transgén está bajo el control de una endógena constitutiva. El promotor y la expresión de los transgenes segundo y tercero están bajo el control de dos promotores endógenos inducibles diferentes, respectivamente. Se entiende que, dependiendo del transgén a expresar en la célula T, se puede seleccionar un promotor para proporcionar un nivel de expresión apropiado, tiempo de expresión, expresión cuando la célula T está en un microambiente particular, etc. Por ejemplo, la expresión del transgén 1 está bajo el control de un promotor del gen del complejo TCR, la expresión del transgén 2 puede estar bajo el control de un promotor inducible que se activa poco después del contacto con un antígeno reconocido por la célula T y la expresión del transgén 3 puede ser bajo el control de un promotor inducible diferente que se activa en un momento posterior o en un nivel diferente al del transgén 2. En este ejemplo particular, el transgén 1 se expresa de forma constitutiva y los transgenes 2 y 3 están bajo el control de promotores inducibles con características distintas.

La ingeniería de células T de la invención para expresar un transgén a partir de un promotor endógeno de células T proporciona la regulación autónoma de la expresión del transgén por parte de la célula T. Por lo tanto, el microentorno de la célula T puede usarse para coordinar la expresión de múltiples transgenes para proporcionar una actividad optimizada de la célula T transgénica, particularmente cuando al menos un gen está bajo el control de un promotor inducible. Por ejemplo, la terapia con células T puede ir acompañada de la administración de una citoquina estimuladora de células T (véase Sadelain et al.,Cáncer Disc.3:388-398 (2013)). En una realización, las células T de la invención pueden modificarse para coexpresar un CAR y un segundo transgén, tal como una citoquina activadora de células T. Por ejemplo, un CAR puede colocarse bajo el control de un promotor del gen del complejo TCR, y un segundo transgén, como una citoquina activadora de células T (p. ej., interleucina 12 (IL12)) puede colocarse bajo el control de un promotor inducible tal activación del promotor inducible que controla el segundo transgén se produce cuando la célula T está cerca de un antígeno reconocido por CAR, como en un tumor, por ejemplo, cuando la célula T se acopla a un antígeno tumoral objetivo al unirse al CAR. En este ejemplo, tal constructo evita la necesidad de administración sistémica o localizada de una citoquina activadora de células T, que puede dar como resultado toxicidad. Además, en el caso de que la célula T se diseñe para expresar una citoquina de activación de células T bajo el control de un promotor inducible que puede regularse mediante la administración de un fármaco, tal constructo evita la necesidad de administrar el fármaco. En tal caso, en lugar de necesitar administrar un fármaco para inducir la expresión de un transgén, la regulación de la expresión del transgén está bajo el control de un promotor endógeno, que proporciona la expresión del transgén. En cambio, la propia célula T, al acoplarse con un antígeno diana, activa la expresión de una citoquina activadora de células T, lo que proporciona una expresión localizada de la citoquina y, por lo tanto, la regulación espacio-temporal de la expresión de los transgenes para optimizar la eficacia de las células T que van a ser utilizadas para la inmunoterapia.

Una célula T que expresa un CAR a veces puede exhibir toxicidades. Para reducir dicha toxicidad, un transgén que codifica un CAR puede, por lo tanto, colocarse bajo el control de un promotor inducible de modo que el promotor no se induzca y no se produzca la expresión del CAR, hasta que la célula T se acople con un objetivo reconocido por el CAR, tal como un tumor diana. Se puede diseñar una célula T para que tenga una mayor selectividad para un objetivo en particular. Por ejemplo, en algunos casos, un antígeno diana en un tumor puede no expresarse únicamente en el tumor. Por lo tanto, la orientación de una célula T al antígeno diana podría dar lugar a una respuesta inmunitaria contra células o tejidos no diana que expresan el mismo antígeno. En consecuencia, una célula T puede diseñarse para que reconozca dos antígenos en un tumor diana, lo que proporciona una mayor selectividad para el tumor diana. Por ejemplo, la célula T puede diseñarse para expresar dos<c>A<r>específicos para dos antígenos tumorales diferentes. En este caso, la unión selectiva de la célula T a una diana que contiene dos antígenos diana se puede acoplar con un tercer transgén bajo el control de un promotor endógeno inducible, como una citoquina que activa la célula T como se describió anteriormente, estimulando así la activación de la célula T. con la citoquina solo tras el compromiso selectivo con el objetivo. Una persona experta en la técnica entenderá fácilmente que la selección de transgenes terapéuticos adecuados para expresarse bajo el control de promotores de células T endógenos adecuados, ya sea constitutivos, específicos para un subtipo de células T, inducibles o una combinación de los mismos, puede usarse para generar expresión autónomamente regulada de transgenes para proporcionar una terapia con células T más eficaz. En una realización, en lugar de utilizar un CAR totalmente competente dirigido a un antígeno, es necesario acoplar dos CAR subóptimos dirigidos a dos antígenos diferentes para una respuesta antitumoral completa. Si los tejidos sanos expresan uno u otro antígeno, el tejido sano no participará completamente en una respuesta de células T CAR. Si el tumor expresa los dos antígenos, desencadenará una actividad completa de células T CAR.

Se pueden usar opcionalmente tanto promotores constitutivos como inducibles, ya que una célula T se puede diseñar para responder específicamente a una señal molecular particular para producir nuevas moléculas terapéuticas en un lugar y tiempo elegidos. Por ejemplo, un transgén que codifica un receptor de superficie celular específico de antígeno puede expresarse a partir de un promotor constitutivo y solo emitirá señales tras la interacción con ese antígeno en particular. Entonces, esta interacción induce la activación de un promotor específico que controla la expresión de una molécula terapéutica. El beneficio terapéutico de esta célula T modificada depende de la función de los promotores tanto constitutivos como inducibles. En una realización particular, un CAR puede estar bajo el control de un promotor constitutivo (por ejemplo, TRAC, CD3...). Otros transgenes terapéuticos (anticuerpos monoclonales (inhibidores de puntos de control y similares) o citoquinas (p. ej., IL12, IL18 y similares) pueden estar bajo el control del promotor activado por la participación de CAR (p. ej., IL2, IFNg, CD69...). En tal caso, el transgén se expresaría tras la activación de CAR y se expresaría específicamente en el tumor.

Pueden expresarse tres transgenes o más. Por ejemplo, el transgén 1 puede ser constitutivo, el transgén 2 puede aparecer poco después del contacto con el antígeno y el transgén 3 puede aparecer más tarde o en un nivel diferente al del transgén 2. En este ejemplo, la expresión del transgén 1 está bajo el control de un promotor constitutivo endógeno, la expresión del transgén<2>comienza poco después del contacto con el antígeno en virtud de que está controlada por un promotor endógeno inducido por la participación del antígeno, y la expresión del transgén 3 comienza más tarde o a un nivel diferente que el transgén<2>en virtud de que está controlada por un promotor endógeno inducido más tarde o que proporciona un nivel de expresión diferente al del transgén 2 regulador del promotor endógeno. En este ejemplo, el transgén 1 es constitutivo y los transgenes 2 y 3 son inducibles (cada uno con características cinéticas distintas). En una realización particular, el transgén 1 codifica un CAR específico para el antígeno A, por ejemplo, en células tumorales, donde el transgén<1>se expresa constitutivamente. Después de unirse al antígeno A, se expresa el transgén 2, que codifica otro CAR específico para el antígeno B (p. ej., también se expresa en células tumorales o en otras células dentro del microambiente tumoral). El transgén 3 puede ser, por ejemplo, un tercer CAR; este tercer CAR puede reconocer el antígeno C, por ejemplo, también en las células tumorales u otras células dentro del microambiente tumoral. Este ejemplo es una forma de "direccionamiento combinatorio" que usa la expresión temporal/secuencial de diferentes CAR por la misma célula T. En otra realización particular, el transgén 1 codifica un CAR (o TCR) específico para el antígeno A; el transgén B codifica una citoquina y el transgén 3 codifica otra citoquina o un ligando coestimulador o un scFv, por ejemplo, reconociendo un antígeno en las mismas células (p. ej., células tumorales) que expresan el antígeno A o células en el mismo microambiente. Este es un ejemplo de activación génica secuencial diseñada para aumentar la potencia y la seguridad de las células T al limitar la expresión génica a un microambiente como el microambiente tumoral. Por lo tanto, un experto en la técnica puede seleccionar un promotor de células T endógeno para colocar un transgén deseado para proporcionar las características de expresión deseadas del transgén.

Se entiende además que ciertos transgenes (p. ej., transgenes inmunoestimuladores, aquellos que cuando se expresan proporcionan un efecto inmunoestimulador) son deseables para expresarse en una célula T que es inmunoestimuladora, mientras que otros transgenes (p. ej., transgenes inmunoestimuladores, aquellos que cuando se expresan proporcionan un efecto inmunoestimulador) son deseables expresarse en una célula T que es inmunoinhibidora. Se entiende que un experto en la técnica puede determinar fácilmente transgenes adecuados para expresar en una célula T dependiendo de si se desea estimular o inhibir una respuesta inmunitaria. En un ejemplo, un transgén inmunoestimulador se expresa en una célula T inmunoestimuladora para estimular una respuesta inmunitaria en el sujeto al que se administra la célula T, y un transgén inmunoinhibidor se expresa en una célula T inmunoinhibidora para inhibir una respuesta inmunitaria en el sujeto a que se administra la célula T.

Promotores Constitutivos. Un transgén terapéutico puede integrarse en un sitio dentro del genoma de una célula T de manera que la expresión del transgén se coloque bajo el control de un promotor endógeno que sea constitutivo. Los promotores constitutivos se pueden usar para expresar un transgén como CAR o CCR para activar la respuesta inmunitaria. También puede usarse un promotor constitutivo para inhibir una respuesta inmunitaria si controla la expresión de un dominio intracelular CAR inhibidor (iCAR) que contiene PD1 y/o cTLA4, y similares.

En el contexto de la invención, el promotor es un promotor de TCR, es decir, un promotor de una proteína del gen del complejo receptor de células T (TCR) (véanse Ejemplos). En una realización particular, el promotor endógeno es un promotor de un gen que codifica una cadena alfa del receptor de células T, cadena beta de un receptor de células T, cadena gamma de CD3, cadena delta de CD3, cadena épsilon de CD3 o cadena zeta de CD3.

Un promotor constitutivo puede ser un promotor tal como un promotor CD4, un promotor CD<8>a, un promotor CD<8>b, un promotor TCRa, un promotor TCRb, un promotor CD3d, un promotor CD3g, un promotor CD3e y un promotor CD3z o similar (véase también la Tabla 1, promotores indicados como constitutivos).

T l 1. Pr m r n i iv in i l m l in r rr n i n .

continuación

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Promotores específicos del subconjunto de células T. Un transgén terapéutico puede integrarse en un sitio dentro del genoma de una célula T de manera que la expresión del transgén se coloque bajo el control de un promotor endógeno que esté activo en un subconjunto de células T. Se entiende que dichos promotores que están activos en un subconjunto de células T están inactivos o tienen baja actividad en otras células T. Ejemplos de promotores que son activos en un subconjunto de células T incluyen, pero no se limitan a, promotores tales como promotor CD4, promotor CD<8>a, promotor CD<8>b, promotor TCRa, promotor TCRb, promotor CD3d, promotor CD3g, promotor CD3e, promotor CD3z, promotor actina, promotor CD25, promotor IL2, promotor CD69, promotor GzmB, promotor T-bet, promotor IFNgamma, promotor TIM3, promotor IL4, promotor GATA3, promotor IL5, promotor IL13, promotor IL10, promotor IL17A, promotor IL<6>, promotor IL21, promotor IL23R, promotor FoxP3, promotor CTLA4, promotor CD25, promotor PD1, promotor CD45RO, promotor CCR7, promotor CD28, promotor CD95, promotor CD28, promotor CD27, promotor CD127, promotor PD-1, promotor CD122, promotor CD132, promotor KlRg -1, promotor HlA-DR, promotor CD38, promotor CD69, promotor Ki-67, promotor CD11a, promotor CD58, promotor CD99, promotor CD62L, promotor CD103, promotor CCR4, promotor CCR5, promotor CCR<6>, promotor CCR9, promotor CCR10, promotor CXCR3, promotor CXCR4, promotor CLA, promotor de granzima A, promotor de granzima B, promotor de perforina, promotor CD57, promotor CD161, promotor IL-18Ra, promotor c-Kit y promotor CD130 (véanse las Tablas 1 y 2).

En la Tabla 2, los niveles de expresión se comparan con las células T ingenuas en los diferentes subconjuntos de diferenciación de células T, según lo informado por Mahnke et al.,Eur. J. Immunol.43(11):2797-809. doi: 10.1002/eji.201343751 (2013). Después de la activación por un TCR o un CAR, las células T se diferencian y genes específicos se activan o reprimen. El inductor es la activación inicial por un TCR o CAR, pero la señalización también continúa las coestimulaciones que impactarán en la diferenciación de la célula T (véase también Mahnke et al.,Eur. J. Immunol.43(11):2797-809. doi: 10.1002/eji.201343751 (2013)).

Tabla 2. Promotores específicos de ejemplo para subconjuntos de células T (véase Mahnke et al.,Eur. J. Immunol.

4 11 :27 7- . i: 1 .1 2 i.2 1 4 7 1 2 1 .

37

continuación

En general, no suele haber un solo inductor para un solo promotor, sino vías de señalización que se involucran y bucles de activación/represión que conducen a la activación del promotor. Estas vías de señalización son activadas por múltiples inductores y dan como resultado el compromiso de las células T con un subconjunto o un fenotipo. Sin embargo, ciertos patrones de expresión de genes son muy específicos para subconjuntos y fenotipos; y su promotor puede estar dirigido, p. ej., T-bet e INFgamma en Th1; GATA3, IL4 e IL10 en Th2; IL<6>en Th17; FoxP3 en Treg. Por lo tanto, se puede seleccionar un promotor endógeno para la integración de un transgén para proporcionar la expresión del transgén en un subtipo de células T particular.

Promotores inducibles. Un transgén terapéutico puede integrarse en un sitio dentro del genoma de una célula T de manera que la expresión del transgén se coloque bajo el control de un promotor endógeno que sea inducible. Un promotor inducible es aquel que responde a un inductor que propaga una señal al núcleo, lo que resulta en la activación del promotor inducible (véase, por ejemplo, la Tabla<1>). En general, el inductor es un asociado de unión de una molécula expresada por la célula T. Por ejemplo, en el caso de un receptor, el asociados de unión puede ser su ligando afín, o en el caso de un CAR, CCR o TCR, el asociado de unión puede ser un antígeno diana.

El promotor inducible endógeno se puede inducir mediante la activación de la célula T. El promotor inducible endógeno se puede inducir mediante la unión de un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor coestimulador quimérico

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(CCR) expresado por la célula T a su asociado de unión respectivo, por ejemplo, tras la interacción con su antígeno correspondiente. Se proporciona una descripción más detallada de CAR y CCR en la sección a continuación que describe los transgenes terapéuticos. En resumen, tanto los CAR como los CCR contienen dominios de señalización intracelular. En el caso de un CAR, el dominio de señalización intracelular activa una célula T y, opcionalmente, contiene un dominio coestimulador (en el caso de los CAR de segunda y tercera generación) (véase Sadelain et al.,Cáncer Discov.3(4):388-398 (2013)). En el caso de un CCR, contiene una señal coestimuladora pero no tiene una señal de activación de células T (Sadelain et al.,supra,2013). La unión de un antígeno correspondiente a un CAR o CCR da como resultado la activación del dominio de señalización de células T y/o el dominio coestimulador. La activación de estos dominios de señalización da como resultado la propagación de una señal al núcleo y la activación de ciertos promotores endógenos en la célula T. Los dominios de señalización intracelular de CAR o CCR incluyen, pero no se limitan a, los dominios intracelulares de CD28, 4-1BB, CD27, ICOS, CD3z y similares, así como otros dominios de señalización intracelular descritos en la presente memoria. La señalización también puede ocurrir con versiones mutadas (por ejemplo, ITAM mutados), truncadas o fusionadas de estos dominios.

En otro ejemplo, el promotor inducible endógeno se induce mediante la unión del receptor de células T (TCR), CD28, CD27, 4-1BB y similares, expresado por la célula T a su respectivo asociado de unión. Estas moléculas contienen dominios de señalización intracelular. Tras la activación, el dominio de señalización da como resultado la propagación de una señal al núcleo y la activación de ciertos promotores endógenos en la célula T. En otro ejemplo, el promotor inducible endógeno se induce mediante la unión de un iCAR (CAR con dominio intracelular inhibidor tal como PD1, CTLA4) o CAR truncado (sin dominio intracelular). En un ejemplo, el iCAR funciona como un "descanso" para la activación de las células T al encontrar el objetivo a través de la señalización de los dominios intracelulares CTLA4 o PD1. Por lo tanto, los promotores que están regulados por PD1 o CTLA4 se pueden usar para expresar un transgén tras el encuentro de iCAR con el antígeno. El transgén podría ser, por ejemplo, una molécula inmunosupresora para controlar aún más la activación de las células T.

Se cree que los CAR truncados permitirían dirigir la célula T a una ubicación específica donde se expresa su objetivo. También se cree que el contacto creado entre las células T CAR y las células diana eventualmente regularía los promotores que, por lo tanto, pueden ser el objetivo de la expresión transgénica.

En un ejemplo, el promotor que es inducido por un CAR, CCR o TCR se selecciona del grupo que consiste en promotor del factor nuclear de células T activadas (NFAT), promotor PD-1, promotor TIM-3, promotor CTLA4, promotor LAG3, Promotor TRAIL, promotor BTLA, promotor CD25, promotor CD69, promotor FasL, promotor TIGIT y promotor 2B4. En una realización particular, CAR y TCR pueden regular los promotores que están en la ruta de señal de la fosforilación de CD3 ITAM y regulados por factores de transcripción dependientes de Ca2+ (p.ej., genes regulados por NFAT, NFkB, AP1 o CREb tal como IL2). Tales promotores dan como resultado una mayor expresión tras la señalización de la ruta. Para CAR y CCR, los genes regulados por el encuentro con el antígeno dependen de los dominios de los que CAR y CCR, respectivamente, están compuestos, p.ej., un dominio coestimulador CD28 induce promotores activados por la ruta PI3K, mientras que la activación del dominio coestimulador 41BB induce promotores activado por la ruta TRAF. La regulación oportuna de los promotores, en respuesta, por ejemplo, a la activación de TCR/CD28 (así como los CAR compuestos por CD28 y CD3zeta), se puede utilizar para regular el tiempo de expresión de un transgén (véase la Figura 17; Best et al.,Nat. Immunol.14:404-413 (2013)). Por ejemplo, tras la activación y formación de la memoria de las células T CD<8>+, los promotores en el grupo 1 (12-24 horas) incluyen, por ejemplo, el promotor CTLA4, el promotor IFNgamma, el promotor Gzmb, el promotor IL2ra, el promotor IL2 y similares; los promotores en el grupo 2 (12-48 horas) incluyen, por ejemplo, el promotor CD69 y el promotor Pkm2, y similares; y los promotores en el grupo 3 (de 24 horas a días) incluyen, por ejemplo, el promotor Id<2>, el promotor KLRg<1>, el promotor Cxcr3, el promotor Cxcr3r1, el promotor Itgam y similares (véase también la Figura 17 para promotores de ejemplo adicionales y Best et al.,supra,2013). Un promotor inducible de ejemplo es el promotor 4-1BB. Otro promotor inducible de ejemplo es HIF1alfa, implicado en la respuesta metabólica a la hipoxia.

En otro ejemplo, el promotor inducible endógeno se induce mediante la unión de un ligando a un receptor inhibidor expresado en la célula T. Los receptores inhibidores de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, los receptores de muerte programada 1 (PD-1), antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4), atenuador de linfocitos B y T (BTLA), mucina-3 de inmunoglobulina de células T (TIM-3), proteína de activación de linfocitos 3 (LAG-3), ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TNF) (TRAIL, receptores 1 y 2), Fas, inmunorreceptor de células T con dominios Ig e ITIM (TIGIT) y 2B4 (CD244). Los ligandos correspondientes para estos receptores inhibidores incluyen, por ejemplo, p D-L1 (para PD-1); PD-L2 (para PD-1); CD80, CD<86>(para CTLA-4); MEVH (para BTLA); galectina-9, HMGB1 (para TIM-3); MHC II (para LAG-3); TRAIL (para el receptor 1 de TRAIL y el receptor 2 de TRAL); Ligando Fas (FasL) (para Fas), y similares (véase Chen et al.,Nat. Rev. Immunol.13(4):227-242 (2013); Tollefson et al.,J. Virol.75:8875-8887 (2001)); Waring et al.,Immunol. Cell Biol.77:312-317 (1999)).

En un ejemplo particular, el promotor que se induce mediante la unión de un ligando a un receptor inhibidor se selecciona del grupo que consiste en el promotor CPT1a y el promotor ATGL.

En otro ejemplo, el promotor inducible endógeno se induce mediante la unión de una citoquina a un receptor de citoquina expresado por la célula T. En una realización, la citoquina es una citoquina inmunoestimuladora seleccionada del grupo que consiste en interleucina 2 (IL2), interleucina 7 (IL7), interleucina 15 (IL15) e interleucina 21 (IL21). En

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otro ejemplo, la citoquina es una citoquina inmunoinhibidora, tal como la interleucina 10 (IL10), el factor de crecimiento transformante p (TGFp); IL4, IL9 o linfopoyetina estromal tímica (TSLP).

En un ejemplo particular, el promotor es inducido por una citoquina seleccionada del grupo que consiste en el promotor T-bet, el promotor Eomes, el promotor GATA3 y el promotor CD45RA.

En otro ejemplo, el promotor inducible endógeno se induce por contacto de una célula con un ácido nucleico. En una realización particular, el ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en ADN viral, ARN viral y microARN intracelular. Los promotores de ejemplo que son inducidos por el contacto de la célula con un ácido nucleico incluyen, pero no se limitan a, promotores de los interferones de tipo I (IFN) (alfa y beta), factores de transcripción IRF3 e |RF7, factores de transcripción NFkB y AP-1, citoquinas proinflamatorias (TNF-alfa, IL1, IL<6>), y similares.

En otro ejemplo, el promotor inducible endógeno es inducido por un metabolito. En una realización particular, el metabolito se selecciona del grupo que consiste en piruvato, glutamina, beta-hidroxibutirato, lactato y serina. Estos metabolitos se generan o absorben durante la activación de las células T, lo que se traduce en un cambio metabólico en la célula T. Ejemplos de promotores que son inducidos por un metabolito son los de: c-Myc, HIF-lalpha, ERRalpha, CD98, SLC1A5, Psatl, Phgdh, psph, Mthfd2, Mthfdl, Mat2a, Mtrr, Mtr, Shmtl, Shmt2 (véase Wang et al.,Immunity35:871-882 (2011); Chang et al.,Nat. Immunol.17: 364-368 (2016); Ma et al.,Cell Metab.25:345-357 (2017)).

En otro ejemplo, el promotor inducible endógeno es inducido por un cambio metabólico. Esto se refiere al estado metabólico de las células. Por ejemplo, cuando las células T ingenuas dependen de la fosforilación oxidativa para generar energía, y cuando se activan y se diferencian en células T efectoras, cambian a la glucólisis para generar energía. La hipoxia y el pH bajo también inducen cambios metabólicos (Chang et al.,Nat. Immunol17:364-368 (2016); McNamee et al.,Immunol. Res.55: 58-70 (2013)).

En un ejemplo particular, el promotor inducido por un cambio metabólico es el promotor PKM2. El promotor PKM2 es el mismo que el de PKM1. PKM2 se genera a través de empalmes alternativos cuando las células pasan de la fosforilación oxidativa a la glucólisis.

En otro ejemplo, el promotor inducible endógeno es inducido por un ion, tal como una concentración de ion particular. En un ejemplo, el ion es potasio o calcio. Los ejemplos de promotores inducidos por un ión incluyen, pero no se limitan a, los promotores de IL2, TNFalfa e IFNgamma, que se activan de manera dependiente de NFA<t>. La NFAT se activa por el aumento de los niveles de calcio intracelular.

5.5 Transgenes terapéuticos

Un transgén terapéutico se puede expresar en una célula T integrando el transgén en un sitio dentro del genoma de la célula T de manera que la expresión del transgén esté bajo el control de un promotor endógeno de la célula T. Un transgén terapéutico es una secuencia de nucleótidos (p.ej., ADN o una forma modificada del mismo) que codifica una proteína terapéutica o un ácido nucleico terapéutico. La proteína terapéutica o el ácido nucleico terapéutico cuando se expresa por la célula T tiene uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno humano o veterinario. El ácido nucleico terapéutico es preferiblemente un ARN terapéutico. La proteína terapéutica puede ser un péptido o polipéptido.

Los transgenes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, aquellos que codifican un CAR, receptor coestimulador quimérico (CCR),<t>R<c>, citoquina, dominante negativo, modulador de microambiente, anticuerpo, biosensor, ligando de receptor quimérico (CRL), ligandos de receptor inmunitario quimérico (CIRL), receptor soluble, enzima, ribozima, circuito genético, informador, modificador epigenético, activador o represor transcripcional, ARN no codificante, o similares. De acuerdo con la invención, el transgén codifica un CAR.

Se entiende que un transgen puede codificar, por ejemplo, un ADNc, un gen, miARN o ARNlnc, o similares. Además, el transgén puede ser un mensaje policistrónico, es decir, una matriz de ADNc o una matriz de miARN. Un ejemplo de transgén policistrónico son las cadenas de TCR. Los mensajes policistrónicos se pueden diseñar en las células T para expresar múltiples transgenes bajo el control del mismo promotor endógeno. Por lo tanto, golpeando 3 transgenes bicistrónicos en 3 loci seleccionados, se podrían expresar<6>productos génicos en una célula T manipulada. Por lo tanto, se pueden expresar varios transgenes en una célula T (1, 2, 3, 4, 5,<6>y así sucesivamente, según se desee), cada uno bajo el control de promotores endógenos separados, o con algunos transgenes (es decir, transgenes policistrónicos) bajo el control del mismo promotor endógeno. Los transgenes múltiples pueden colocarse de forma independiente bajo el control de un promotor constitutivo o inducible. Por lo tanto, se puede usar una combinación de promotores constitutivos y/o inducibles en una célula T para expresar múltiples transgenes en la misma célula.

En una realización específica, el transgén es policistrónico, p.ej., bicistrónico. En una realización específica, el transgén es policistrónico y codifica más de una proteína terapéutica o ARN terapéutico, donde la expresión de ambos está bajo el control del mismo promotor endógeno de la célula T. En una realización específica, el transgén es bicistrónico y codifica dos proteínas terapéuticas (por ejemplo, scFv), donde la expresión de los scFv está bajo el control del mismo promotor endógeno de la célula T.

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En un ejemplo, el transgén terapéutico codifica un TCR. En el caso de un transgén que está codificado en más de una cadena polipeptídica, el transgén puede expresarse a partir de más de un polinucleótido, es decir, los dos ácidos nucleicos codificantes (p. ej., ADNc) se coexpresan en una célula T. En consecuencia, cuando se desea expresar una proteína de múltiples subunidades, las diferentes subunidades polipeptídicas pueden expresarse a partir de diferentes transgenes, es decir, las dos secuencias de nucleótidos codificantes (p. ej., secuencias de ADNc) se coexpresan en una célula T a partir de diferentes transgenes regulados por diferentes promotores de células T endógenas. En un ejemplo, se expresan las cadenas a y b de un TCR.

Receptores de antígenos quiméricos (CARs). Un receptor de antígeno quimérico (CAR) es un producto codificado por un transgén terapéutico de la invención. El CAR que se expresa de forma recombinante por una célula de la invención tiene un dominio de unión a antígeno que se une a un antígeno. El antígeno está asociado con una enfermedad o trastorno presente en el sujeto o que se desea prevenir en el sujeto al que se administra la célula T.

En realizaciones específicas, el CAR puede ser un CAR de "primera generación", "segunda generación" o "tercera generación" (véase, por ejemplo, Sadelain et al.,Cáncer Discov.3(4):388-398 (2013); Jensen et al.,Immunol. Rev.

257:127-133 (2014); Sharpe et al.,Dis. Model Mech.8(4):337-350 (2015); Brentjens et al.,Clin. Cáncer Res.13:5426-5435 (2007); Gade et al.,Cáncer Res.65:9080-9088 (2005); Maher et al.,Nat. Biotechnol.20:70-75 (2002); Kershaw et al.,J. Immunol.173:2143-2150 (2004); Sadelain et al.,Curr. Opin. Immunol.(2009); Hollyman et al.,J. Immunother.

32:169-180 (2009)).

Los CAR de "primera generación" generalmente se componen de un dominio de unión a antígeno extracelular, por ejemplo, un fragmento variable de cadena única (scFv), fusionado con un dominio transmembrana, que se fusiona con un dominio citoplásmico/intracelular de la cadena del receptor de células T. Los CAR de "primera generación" suelen tener el dominio intracelular de la cadena CD3Z, que es el principal transmisor de señales de los receptores de células T endógenos (TCR) (véase el ejemplo de CAR de primera generación en la Figura 1A). Los CAR de "primera generación" pueden proporcionar de novo reconocimiento de antígenos y causa la activación de células T CD4+ y CD<8>+ a través de su dominio de señalización de cadena CD3Z en una sola molécula de fusión, independientemente de la presentación de antígeno mediada por HLA. Los CAR de "segunda generación" para uso en la invención comprenden un dominio de unión a antígeno fusionado con un dominio de señalización intracelular capaz de activar las células T y un dominio coestimulador diseñado para aumentar la potencia y la persistencia de las células T (Sadelain et al.,Cancer Discov.3:388-398 (2013)). Por lo tanto, el diseño de CAR puede combinar el reconocimiento de antígenos con la transducción de señales, dos funciones que son fisiológicamente realizadas por dos complejos separados, el heterodímero TCR y el complejo CD3. Los CAR de "segunda generación" incluyen un dominio intracelular de varias moléculas coestimuladoras, por ejemplo, CD28, 4-1BB, ICOS, OX40 y similares, en la cola citoplasmática del CAR para proporcionar señales adicionales a la célula (véase ejemplo CAR de segunda generación en la Figura 1A). Los CAR de "segunda generación" proporcionan coestimulación, por ejemplo, mediante dominios CD28 o 4-1BB, y activación, por ejemplo, mediante un dominio de señalización CD3Z. Los estudios preclínicos han indicado que los CAR de "segunda generación" pueden mejorar la actividad antitumoral de las células T. Por ejemplo, la sólida eficacia de las células T modificadas con CAR de "segunda generación" se demostró en ensayos clínicos dirigidos a la molécula CD19 en pacientes con leucemia linfoblástica crónica (CLL) y leucemia linfoblástica aguda (ALL) (Dávila et al.,Oncoimmunol.1(9): 1577-1583 (2012)). Los CAR de "tercera generación" proporcionan coestimulación múltiple, por ejemplo, al comprender dominios tanto de CD28 como de 4-1BB, y activación, por ejemplo, al comprender un dominio de activación CD3Z.

En las realizaciones, los CAR generalmente comprenden un dominio de unión a antígeno extracelular, un dominio transmembrana y un dominio intracelular, como se describió anteriormente, donde el dominio de unión a antígeno extracelular se une a un antígeno de interés, como un antígeno de cáncer o un antígeno de un patógeno infeccioso., o de un trastorno autoinmune, o de un tejido trasplantado. En una realización particular no limitante, el dominio de unión a antígeno extracelular es un scFv.

Como se describe en la presente memoria, los métodos implican la administración de células que han sido diseñadas para expresar un CAR. El dominio de unión a antígeno extracelular de un CAR generalmente se deriva de un anticuerpo monoclonal (mAb) o de receptores o sus ligandos.

El diseño de los CAR es bien conocido en la técnica (véanse, por ejemplo, las reseñas de Sadelain et al.,Cancer Discov.3(4):388-398 (2013); Jensen et al.,Immunol. Rev.257:127-133 (2014); Sharpe et al.,Dis. Model Mech.

8(4):337-350 (2015), y las referencias citadas en el mismo). Se puede generar un CAR dirigido a un antígeno deseado utilizando métodos bien conocidos para diseñar un CAR, incluidos los que se describen en la presente memoria. Un CAR, ya sea un CAR de primera, segunda o tercera generación, se puede diseñar fácilmente mediante la fusión de una actividad de unión a un antígeno diana, por ejemplo, una actividad de unión a un antígeno del cáncer, como un anticuerpo scFv dirigido al antígeno, a un dominio de señalización de células inmunitarias, tal como un dominio citoplásmico/intracelular del receptor de células T. Como se describió anteriormente, el CAR generalmente tiene la estructura de un receptor de superficie celular, con actividad de unión a antígeno, como un scFv, como al menos una parte del dominio extracelular, fusionado con un dominio transmembrana, que se fusiona con un dominio intracelular. que tiene actividad de señalización celular en una célula T. El CAR puede incluir moléculas coestimuladoras, como se describe en este documento. Un experto en la técnica puede seleccionar fácilmente los dominios transmembrana

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apropiados, como se describe en la presente memoria y son conocidos en la técnica, y los dominios intracelulares para proporcionar la capacidad de señalización deseada en la célula T.

Un CAR para uso en la presente invención comprende un dominio extracelular que incluye un dominio de unión a antígeno que se une a un antígeno. En una realización específica, el dominio de unión a antígeno se une a un antígeno en la célula o tejido canceroso diana. Dicho dominio de unión a antígeno generalmente se deriva de un anticuerpo. En una realización, el dominio de unión a antígeno puede ser un scFv o un Fab, o cualquierfragmento de unión a antígeno adecuado de un anticuerpo (véase Sadelain et al.,Cáncer Discov.3:38-398 (2013)). En la técnica se conocen muchos anticuerpos o dominios de unión a antígenos derivados de anticuerpos que se unen a un antígeno, tal como un antígeno del cáncer. Alternativamente, dichos anticuerpos o dominios de unión a antígeno se pueden producir mediante métodos de rutina. Los métodos para generar un anticuerpo son bien conocidos en la técnica, incluidos los métodos para producir un anticuerpo monoclonal o seleccionar una biblioteca para obtener un polipéptido de unión a antígeno, incluyendo la selección de una biblioteca de Fab humanos (Winter and Harris,Immunol. Today14:243-246 (1993); Ward et al.,Nature341:544-546 (1989); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Hilyard et al.,Protein Engineering: A practical approach(IRL Press 1992); Borrabeck,Antibody Engineering,2nd ed. (Oxford University Press 1995); Huse et al.,Science246:1275-1281 (1989)). Para CAR, el dominio de unión a antígeno derivado de un anticuerpo puede ser humano, humanizado, quimérico, injertado con CDR y similares, según se desee. Por ejemplo, si un anticuerpo monoclonal de ratón es un anticuerpo fuente para generar el dominio de unión al antígeno de un CAR, dicho anticuerpo puede humanizarse injertando CDR del anticuerpo de ratón en una estructura humana (véase Borrabeck,supra,1995), que puede ser beneficioso para administrar el CAR a un sujeto humano. En una realización preferida, el dominio de unión al antígeno es un scFv. La generación de scFvs es bien conocida en la técnica (véase, por ejemplo, Huston, et al.,Proc. Nat. Acad. Sci. USA85:5879-5883 (1988); Ahmad et al.,Clin. Dev. Immunol.2012: ID980250 (2012); Patentes U.S. Nos. 5.091.513, 5.132.405 y 4.956.778; y Publicaciones de patentes U.S. Nos. 20050196754 y 20050196754)).

Con respecto a la obtención de una actividad de unión a antígeno, un experto en la técnica puede obtener fácilmente una actividad de unión a antígeno adecuada, como un anticuerpo, usando cualquiera de los métodos bien conocidos para generar y seleccionar un anticuerpo que se une a un antígeno deseado, como descrito en este documento, incluida la generación de un scFv que se une a un antígeno, que es particularmente útil en un CAR. Además, varios anticuerpos antigénicos, en particular anticuerpos monoclonales, como antígenos de cáncer u otros antígenos, están disponibles comercialmente y también pueden usarse como fuente para una actividad de unión a antígeno, como un scFv, para generar un CAR.

Como alternativa al uso de un dominio de unión a antígeno derivado de un anticuerpo, un dominio extracelular CAR puede comprender un ligando o un dominio de unión a ligando extracelular de un receptor (véase Sadelain et al.,Cancer Discov.3:388-398 (2013); Sharpe et al.,Dis. Model Mech.8:337-350 (2015)). En este caso, el ligando o el dominio de unión a ligando extracelular de un receptor proporciona al CAR la capacidad de dirigir la célula que expresa el CAR al receptor o ligando correspondiente. En una realización específica, el ligando o el dominio de unión al ligando extracelular se selecciona de manera que la célula que expresa CAR se dirija a una célula cancerosa o tumor (véase Sadelain et al.,Cancer Discov.3:388-398 (2013); Sharpe et al.,Dis. Model Mech.8:337-350 (2015), y las referencias citadas en el mismo). En una realización de la invención, el ligando o el dominio de unión a ligando extracelular se selecciona para unirse a un antígeno que es el receptor o ligando correspondiente (véase Sadelain et al.,Cancer Discov.3:388-398 (2013)).

Para un CAR dirigido a un antígeno diana, el dominio de unión al antígeno del CAR se selecciona para unirse al antígeno diana (un antígeno expresado en una célula objetivo). Dicho antígeno diana puede expresarse únicamente en una célula diana, o el antígeno diana puede sobreexpresarse en una célula diana en relación con células o tejidos no diana. El antígeno diana al que se unirá el CAR se elige para proporcionar la orientación de la célula que expresa el CAR sobre células o tejidos no diana. En una realización preferida, para un CAR dirigido a un antígeno canceroso, el dominio de unión al antígeno del CAR se selecciona para unirse a un antígeno expresado en una célula cancerosa. Dicho antígeno canceroso puede expresarse únicamente en una célula cancerosa, o el antígeno canceroso puede sobreexpresarse en una célula cancerosa en relación con células o tejidos no cancerosos. El antígeno del cáncer que se unirá al CAR se elige para proporcionar la dirección de la célula que expresa el CAR sobre células o tejidos no cancerosos. En una realización de los métodos en el contexto de la invención para tratar un cáncer, se diseña una célula T para tratar a un paciente con cáncer expresando en la célula un CAR que se une a un antígeno de cáncer adecuado del cáncer del paciente, como se describe en este documento. De manera similar, cuando se usa un CAR para atacar un antígeno de un patógeno de una enfermedad infecciosa, un trastorno autoinmune o un tejido trasplantado, el antígeno puede expresarse de forma única en el objetivo o en el sitio objetivo, o sobreexpresado en relación con tejidos no diana o sitios no diana.

El antígeno del cáncer puede ser un antígeno tumoral. Puede elegirse cualquier antígeno de cáncer adecuado basándose en el tipo de cáncer que presenta un sujeto (paciente de cáncer) a tratar. Se entiende que el antígeno canceroso seleccionado se expresa de tal manera que el antígeno canceroso es accesible para unirse al CAR. Generalmente, el antígeno canceroso al que se dirige una célula que expresa un CAR se expresa en la superficie celular de una célula cancerosa. Sin embargo, se entiende que cualquier antígeno canceroso que sea accesible para unirse a un CAR es adecuado para dirigir la célula que expresa CAR a la célula cancerosa. Los antígenos de cáncer

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de ejemplo y los cánceres de ejemplo se proporcionan a continuación en la Tabla 3.

Tabla 3. Antí enos cancerosos diana dianas cancerosas corres ondientes.

43

continuación

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Los antígenos de cáncer adecuados incluyen, pero no se limitan a, mesotelina (MSLN), antígeno prostético específico de membrana (PSMA), antígeno prostético de células madre (PCSA), anhidrasa carbónica Ix (CAIX), antígeno carcinoembrionario (CEA), CD5, CD7, CD10, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD123, CD133, CD138, glicoproteína2 epitelial (EGP 2), glicoproteína epitelial-40 (EGP-40), molécula de adhesión de célula epitelial (EpCAM), proteína de unión a folato (FBP), receptor de acetilcolina fetal (AChR), receptor de folato-a y p (FRa y p), gangliósido G2 (GD2), gangliósido G3 (GD3), receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER-2/ERB2), receptor del factor de crecimiento epidérmico vIII (EGFRvIlI), ERB3, ERB4, transcriptasa inversa de telomerasa humana (hTERT), subunidad alfa-2 del receptor de interleucina-13 (IL-13Ra2), cadena ligera k, receptor de dominio de inserción de quinasa (KDR), Lewis A (CA19.9), Lewis Y (LeY), molécula de adhesión celular L1 (L1CAM), antígeno asociado a melanoma 1 (familia de antígenos de melanoma A1, MAGE-A1), mucina 16 (Muc-16), mucina 1 (Muc-1), ligandos NKG2D, antígeno de cáncer testicular NY-ESO-1, antígeno oncofetal (h5T4), glicoproteína 72 asociada a tumor (TAG-72), factor de crecimiento endotelial vascular R2 (VEGF-R2), proteína del tumor de Wilms (WT-1), receptor transmembrana de proteína tirosina quinasa tipo 1 (ROR1), B7-H3 (CD276), B7-H<6>(Nkp30), proteoglicano-4 de sulfato de condroitina (CSPG4), Molécula accesoria DNAX (d Na M-1), receptor 2 de efrina tipo A (EpHA<2>), proteína asociada a fibroblastos (FAP), Gp<10 0>/HLA-A<2>, glipicano 3 (GC3),<h>A-<1>H, HERK-V, IL-11Ra, Proteína 1 de membrana latente (LMP1), molécula de adhesión celular neural (N-CAM/CD56) y receptor Trail (TRAIL R). Se entiende que estos u otros antígenos del cáncer pueden utilizarse para el direccionamiento mediante CAR antígeno canceroso.

Como se describió anteriormente, un CAR también contiene un dominio de señalización que funciona en la célula T que expresa el CAR. Tal dominio de señalización puede ser, por ejemplo, derivado de CDZ o Fc del receptor y (véase Sadelain et al.,Cancer Discov.3:288-298 (2013). En general, el dominio de señalización inducirá funciones de persistencia, tráfico y/o efectoras en las células T transducidas, o células precursoras de las mismas (Sharpe et al., Dis.Model Mech.8:337-350 (2015); Finney et al.,J. Immunol.161:2791-2797 (1998)); Krause et al.,J. Exp. Med.

188:619-626 (1998)). En el caso del receptor CDZ o Fc<y>, el dominio de señalización corresponde al dominio intracelular de los respectivos polipéptidos, o a un fragmento del dominio intracelular que es suficiente para la señalización. Los dominios de señalización de ejemplo se describen a continuación con más detalle.

Los polipéptidos de ejemplo se describen en la presente memoria con referencia a los números de GenBank, números de Gl y/o SEQ ID NOS. Se entiende que un experto en la técnica puede identificar fácilmente secuencias homólogas por referencia a fuentes de secuencias, incluidas, pero no limitadas a, GenBank (ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) y EMBL (embl.org/).

CD3Z. En una realización no limitante, un CAR puede comprender un dominio de señalización derivado de un polipéptido CD3Z, por ejemplo, un dominio de señalización derivado del dominio intracelular de CD3Z, que puede

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activar o estimular una célula T. CD3Z comprende 3 motivos de activación basados en tirosina del receptor inmunológico (ITAM) y transmite una señal de activación a la célula, por ejemplo, una célula del linaje linfoide como una célula T, después de que se une el antígeno. Un polipéptido CD3Z puede tener una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia que tiene GenBank No. NP_932170 (GI:37595565; véase más abajo), o fragmentos de la misma. En una realización, el polipéptido CD3Z tiene una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 52 a 164 de la secuencia del polipéptido CD3Z proporcionada a continuación, o un fragmento de la misma que es suficiente para la actividad de señalización. Véase GenBank NP_932170 para referencia a dominios dentro de CD3Z, por ejemplo, péptido señal, aminoácidos 1 a 21; dominio extracelular, aminoácidos 22 a 30; dominio transmembrana, aminoácidos 31 a 51; dominio intracelular, aminoácidos 52 a 164. Se entiende que una "molécula de ácido nucleico CD3Z" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido CD3Z.

1 MKWKALFTAA ILQAQLPITE AQSFGLLDPK LCYLLDGILF IYGVILTALF LRVKFSRSAD

61 APAYQQGQNQ LYNELNLGRR EEYDVLDKRR GRDPEMGGKP QRRKNPQEGL YNELQKDKMA

121 EAYSEIGMKG ERRRGKGHDG LYQGLSTATK DTYDALHMQA LPPR (NP_93217Q; SEQ ID

NO;16)

En ciertas realizaciones no limitantes, un dominio intracelular de un CAR puede comprender además al menos un dominio de señalización coestimulador. Dicho dominio de señalización coestimulador puede proporcionar una mayor activación de una célula T. Un dominio de señalización coestimulador puede derivarse de un polipéptido CD28, un polipéptido 4-1BB, un polipéptido OX40, un polipéptido ICOS, un polipéptido DAP10, un polipéptido 2B4 y similares. Los CAR que comprenden un dominio intracelular que comprende una región de señalización coestimuladora que comprende 4-1BB, ICOS o DAP-10 se han descrito previamente (véase U.S. 7.446.190, que también describe secuencias representativas para 4-1BB, ICOS y DAP-10). En algunas realizaciones, el dominio intracelular de un CAR puede comprender una región de señalización coestimuladora que comprende dos moléculas coestimuladoras, como CD28 y 4-1BB (véase Sadelain et al.,Cáncer Discov.3(4):388-398 (2013)), o CD28 y OX40, u otras combinaciones de ligandos coestimuladores, como se describe en la presente memoria.

CD28. La agrupación de diferenciación 28 (CD28) es una proteína expresada en las células T que proporciona señales coestimuladoras para la activación y supervivencia de las células T. CD28 es el receptor de las proteínas CD80 (B7.1) y CD<86>(B7.2). En una realización, un CAR puede comprender un dominio de señalización coestimulador derivado de CD28. Por ejemplo, como se describe en la presente memoria, un CAR puede incluir al menos una parte de un dominio intracelular/citoplasmático de CD28, por ejemplo, un dominio intracelular/citoplasmático que puede funcionar como un dominio de señalización coestimulador (véase Figura 1B). Un polipéptido CD28 puede tener una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia que tiene GenBank No. P10747 o NP_006130 (GI:5453611), como se proporciona a continuación, o fragmentos de la misma. Si se desea, las secuencias de CD28 adicionales al dominio intracelular pueden incluirse en un CAR en el contexto de la invención. Por ejemplo, un CAR puede comprender la transmembrana de un polipéptido CD28. En una realización, un CAR puede tener una secuencia de aminoácidos que comprende el dominio intracelular de CD28 correspondiente a los aminoácidos 180 a 220 de CD28, o un fragmento del mismo. En otra realización, un CAR puede tener una secuencia de aminoácidos que comprende el dominio transmembrana de CD28 correspondiente a los aminoácidos 153 a 179, o un fragmento del mismo. Véase GenBank NP_006130 para referencia a dominios dentro de CD28, por ejemplo, péptido señal, aminoácidos 1 a 18; dominio extracelular, aminoácidos 19 a 152; dominio transmembrana, aminoácidos 153 a 179; dominio intracelular, aminoácidos 180 a 220. Se entiende que las secuencias de CD28 que son más cortas o más largas que un dominio delineado específico pueden incluirse en un CAR, si se desea. Se entiende que una "molécula de ácido nucleico de CD28" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido de CD28.

1 MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC KYSYNLFSREFRASLHKGLD

61 SAVEVCWYG NYSQQLQVYSKTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIYFCKIEVMYPP

121 PYLDNEKSNG TIIHVKGKHLCPSPLFPGPS KPFWVLVWG GVLACYSLLVTVAF1IFWVR

181 SKRSRLLHSD YMNMTPRRPGPTRKHYQPYA PPRDFAAYRS(NP_006130; SEQ ID NO:17)

4-1BB. 4-1BB, también denominado miembro 9 de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral, puede actuar como un ligando del factor de necrosis tumoral (TNF) y tener actividad estimuladora. En una realización, un CAR puede comprender un dominio de señalización coestimulador derivado de 4-1BB. Un polipéptido 4-1BB puede tener una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia que tiene GenBank No. P41273 o NP_001552 (GI:5730095) o fragmentos de la misma. En una realización, un CAR puede tener un dominio coestimulador que comprende el dominio intracelular de 4-1BB correspondiente a los aminoácidos 214 a 255, o un fragmento del mismo. En otra realización, un CAR puede tener un dominio transmembrana de 4-1BB correspondiente a los aminoácidos 187 a 213, o un fragmento del mismo. Véase GenBank NP_001552 para referencia a dominios dentro de 4-1BB, por ejemplo, péptido señal, aminoácidos 1 a 17; dominio extracelular, aminoácidos 18 a 186; dominio transmembrana, aminoácidos

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187 a 213; dominio intracelular, aminoácidos 214 a 255. Se entiende que las secuencias de 4-1BB que son más cortas o más largas que un dominio delineado específico pueden incluirse en un CAR, si se desea. También se entiende que una "molécula de ácido nucleico 4-1BB" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido 4-1BB.

1 MGNSCYNIVA TLLLVLNFERTRSLQDPCSN CPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQR

61 TCDICRQCKG VFRTRKECSSTSNAECDCTP GFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDC

121 CFGTFNDQKRGICRPWTNCS LDGKSVLVNGTKERDWCGP SPADLSPGAS SVTPPAPARE

181 PGHSPQIISF FLALTSTALLFLLFFLTLRF SWKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDG

241 CSCRFPEEEEGGCEL (NP 001552; SEQ ID NO:18)

OX40. OX40, también conocido como precursor del miembro 4 de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral o CD134, es un miembro de la superfamilia de receptores TNFR. En una realización, un CAR puede comprender un dominio de señalización coestimulador derivado de OX40. Un polipéptido OX40 puede tener una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia que tiene GenBank No. P43489 o NP_003318 (GI:4507579), proporcionada a continuación, o fragmentos de la misma. En una realización, un CAR puede tener un dominio coestimulador que comprende el dominio intracelular de OX40 correspondiente a los aminoácidos 236 a 277, o un fragmento del mismo. En otra realización, un CAR puede tener una secuencia de aminoácidos que comprende el dominio transmembrana de OX40 correspondiente a los aminoácidos 215 a 235 de OX40, o un fragmento del mismo. Véase GenBank NP_003318 para referencia a dominios dentro de OX40, por ejemplo, péptido señal, aminoácidos 1 a 28; dominio extracelular, aminoácidos 29 a 214; dominio transmembrana, aminoácidos 215 a 235; dominio intracelular, aminoácidos 236 a 277. Se entiende que las secuencias de OX40 que son más cortas o más largas que un dominio delineado específico pueden incluirse en un CAR, si se desea. También se entiende que una "molécula de ácido nucleico OX40" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido OX40.

1 MCVGARRLGR GPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSND RCCHECRPGN GMVSRCSRSQ

61 NTVCRPCGPG FYNDWSSKPCKPCTWCNLR SGSERKQLCT ATQDTVCRCR AGTQPLDSYK

121 PGVDCAPCPP GHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASN SSDAICEDRD PPATQPQETQ

181 GPPARPITVQ PTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILG LGLVLGLLGP LAILLALYLL

241 RRDQRLPPDA HKPPGGGSFR TPIQEEQADA HSTLAKI (NP 003318; SEQ ID NO:19)

ICOS. El precursor del coestimulador de células T inducible (ICOS), también conocido como CD278, es una molécula coestimuladora de la superfamilia CD28 que se expresa en las células T activadas. En una realización, un CAR puede comprender un dominio de señalización coestimulador derivado de ICOS. Un polipéptido ICOS puede tener una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia que tiene GenBank No. NP_036224 (GI: 15029518), proporcionada a continuación, o fragmentos de la misma. En una realización, un CAR puede tener un dominio coestimulador que comprende el dominio intracelular de ICOS correspondiente a los aminoácidos 162 a 199 de ICOS. En otra realización, un CAR puede tener una secuencia de aminoácidos que comprende el dominio transmembrana de ICOS correspondiente a los aminoácidos 141 a 161 de ICOS, o un fragmento del mismo. Véase GenBank NP_036224 para referencia a dominios dentro de ICOS, por ejemplo, péptido señal, aminoácidos 1 a 20; dominio extracelular, aminoácidos 21 a 140; dominio transmembrana, aminoácidos 141 a 161; dominio intracelular, aminoácidos 162 a 199. Se entiende que las secuencias de ICOS que son más cortas o más largas que un dominio delineado específico pueden incluirse en un CAR, si se desea. También se entiende que una "molécula de ácido nucleico de ICOS" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido de ICOS.

1 MKSGLWYFFLFCLRIKVLTG EINGSANYEMFIFHNGGVQI LCKYPDIVQQFKMQLLKGGQ

61 ILCDLTKTKGSGNTVSIKSL KFCHSQLSNNSVSFFLYNLD HSHANYYFCNLSIFDPPPFK

121 VTLTGGYLHIYESQLCCQLK FWLPIGCAAFVWCILGCIL ICWLTKKKYSSSVHDPNGEY

181 MFMRAVNTAKKSRLTDVTL (NP 036224; SEQ ID NO:20)

DAP10. DAP10, también conocido como transductor de señales de células hematopoyéticas, es una subunidad de señalización que se asocia con una gran familia de receptores en células hematopoyéticas. En una realización, un CAR puede comprender un dominio coestimulador derivado de DAP10. Un polipéptido DAP10 puede tener una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia que tiene GenBank No. NP_055081.1 (GI: 15826850), proporcionada a continuación, o fragmentos de la misma. En una realización, un CAR puede tener un dominio coestimulador que comprende el dominio intracelular de DAP10 correspondiente a los aminoácidos 70 a 93, o un fragmento del mismo. En otra realización, un CAR puede tener un dominio transmembrana de DAP10 correspondiente

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a los aminoácidos 49 a 69, o un fragmento del mismo. Véase GenBank NP_055081.1 para referencia a dominios dentro de DAP10, por ejemplo, péptido señal, aminoácidos 1 a 19; dominio extracelular, aminoácidos 20 a 48; dominio transmembrana, aminoácidos 49 a 69; dominio intracelular, aminoácidos 70 a 93. Se entiende que las secuencias de DAP10 que son más cortas o más largas que un dominio delineado específico pueden incluirse en un CAR, si se desea. También se entiende que una "molécula de ácido nucleico de DAP10" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido de DAP10.

1 MIHLGHILFL LLLPVAAAQT TPGERSSLPA FYPGTSGSCS GCGSLSLPLL AGLVAADAVA

61 SLLIVGAVFL CARPRRSPAQ EDGKVYINMP GRG (NP_055081.1; SEQ ID NO:21)

El dominio extracelular de un CAR se puede fusionar con un líder o un péptido señal que dirige la proteína naciente hacia el retículo endoplásmico y la posterior translocación a la superficie celular. Se entiende que, una vez que un polipéptido que contiene un péptido señal se expresa en la superficie celular, el péptido señal generalmente se ha eliminado proteolíticamente durante el procesamiento del polipéptido en el retículo endoplásmico y la translocación a la superficie celular. Por lo tanto, un polipéptido como un CAR generalmente se expresa en la superficie celular como una proteína madura que carece del péptido señal, mientras que la forma precursora del polipéptido incluye el péptido señal. Un péptido señal o líder puede ser esencial si un CAR va a ser glicosilado y/o anclado en la membrana celular. La secuencia señal o líder es una secuencia peptídica generalmente presente en el terminal N de las proteínas recién sintetizadas que dirige su entrada en la ruta secretora. El péptido señal se une covalentemente al terminal N del dominio de unión a antígeno extracelular de un CAR como una proteína de fusión. Cualquier péptido señal adecuado, como se conoce bien en la técnica, se puede aplicar a un CAR para proporcionar expresión en la superficie celular en una célula T (véase Gierasch Biochem. 28:923-930 (1989); von Heijne,J. Mol. Biol.184 (1): 99-105 (1985)). Los péptidos señal particularmente útiles pueden derivarse de proteínas de la superficie celular expresadas naturalmente en la célula T de las mismas, incluyendo cualquiera de los péptidos señal de los polipéptidos descritos en la presente memoria. Por lo tanto, se puede utilizar cualquier péptido señal adecuado para dirigir un CAR para que se exprese en la superficie celular de una célula T.

En ciertas realizaciones no limitantes, un dominio de unión a antígeno extracelular de un CAR puede comprender una secuencia conectora o un conector peptídico que conecta la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera del dominio de unión a antígeno extracelular. En ciertas realizaciones no limitativas, un CAR también puede comprender una región o secuencia espaciadora que une los dominios del CAR entre sí. Por ejemplo, se puede incluir un espaciador entre un péptido señal y un dominio de unión a antígeno, entre el dominio de unión a antígeno y el dominio transmembrana, entre el dominio transmembrana y el dominio intracelular y/o entre dominios dentro del dominio intracelular, por ejemplo, entre un dominio estimulador y un dominio coestimulador. La región espaciadora puede ser lo suficientemente flexible para permitir interacciones de varios dominios con otros polipéptidos, por ejemplo, para permitir que el dominio de unión al antígeno tenga flexibilidad en la orientación para facilitar el reconocimiento del antígeno. La región espaciadora puede ser, por ejemplo, la región bisagra de una IgG, la región CH<2>CH<3>(constante) de una inmunoglobulina, y/o porciones de CD3 (grupo de diferenciación 3) o alguna otra secuencia adecuada como espaciadora.

El dominio transmembrana de un CAR generalmente comprende una hélice alfa hidrófoba que se extiende por al menos una parte de la membrana. Diferentes dominios transmembrana dan como resultado diferente estabilidad del receptor. Después del reconocimiento del antígeno, los receptores se agrupan y se transmite una señal a la célula. En una realización, el dominio transmembrana de un CAR puede derivar de otro polipéptido que se expresa naturalmente en la célula T. En una realización, un CAR puede tener un dominio transmembrana derivado de CD<8>, CD28, CD3Z, CD4, 4-1BB, OX40, ICOS, CTLA-4, PD-1, LAG-3, 2B4, BTLA u otros polipéptidos expresados en la célula T que tienen un dominio transmembrana, incluyendo otros como se describe en la presente memoria o que son bien conocidos en la técnica. Opcionalmente, el dominio transmembrana puede derivar de un polipéptido que no se expresa de forma natural en la célula T, siempre que el dominio transmembrana pueda funcionar transduciendo la señal del antígeno unido al CAR a los dominios de señalización y/o coestimuladores intracelulares. Se entiende que la porción del polipéptido que comprende un dominio transmembrana del polipéptido puede incluir secuencias adicionales del polipéptido, por ejemplo, secuencias adicionales adyacentes en el extremo N-terminal o C-terminal del dominio transmembrana, u otras regiones del polipéptido, según se desee.

CD<8>. La agrupación de diferenciación<8>(CD<8>) es una glicoproteína transmembrana que sirve como co-receptor para el receptor de células T (TCR). CD<8>se une a una molécula del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) y es específico para la proteína MHC de clase I. En una realización, un CAR puede comprender un dominio transmembrana derivado de CD<8>. Un polipéptido CD<8>puede tener una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia que tiene GenBank No. NP_001139345.1 (GI:225007536), como se proporciona a continuación, o fragmentos de la misma. En una realización, un CAR puede tener una secuencia de aminoácidos que comprende el dominio transmembrana de CD<8>correspondiente a los aminoácidos 183 a 203, o fragmentos de los mismos. Véase GenBank NP_001139345.1 para referencia a dominios dentro de CD<8>, por ejemplo, péptido señal, aminoácidos 1 a 21; dominio extracelular, aminoácidos 22 a 182; aminoácidos del dominio transmembrana, 183 a 203; dominio intracelular, aminoácidos 204 a

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235. Se entiende que se puede incluir en un CAR, si se desea, una secuencia adicional de CD<8>más allá del dominio transmembrana de los aminoácidos 183 a 203. Se entiende además que las secuencias de CD<8>que son más cortas o más largas que un dominio dilineado específico pueden incluirse en un CAR, si se desea. También se entiende que una "molécula de ácido nucleico CD<8>" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido CD<8>.

1 MALPVTALLL PLALLLHAARPSQFRVSPLD RTWNLGETVELKCQVLLSMP TSGCSWLFQP

61 RGAAASPTFL LYLSQNKPKAAEGLDTQRFS GKRLGDTFVLTLSDFRRENE GYYFCSALSN

121 SIMYFSHFVP VFLPAKPTTTPAPRPPTPAP TIASQPLSLRPEACRPAAGG AVHTRGLDFA

181 CDIYIWAPLA GTCGVLLLSLVITLYCNHRN RRRVCKCPRPWKSGDKPSL SARYV

(NP_001139345.1; SEQ ID NO;22)

CD4. La agrupación de diferenciación 4 (CD4), también conocido como glicoproteína de superficie de células T CD4, es una glicoproteína que se encuentra en la superficie de las células inmunitarias, tal como las células T auxiliares, los monocitos, los macrófagos y las células dendríticas. En una realización, un CAR puede comprender un dominio transmembrana derivado de c D4. CD4 existe en varias isoformas. Se entiende que se puede seleccionar cualquier isoforma para lograr una función deseada. Los ejemplos de isoformas incluyen la isoforma 1 (NP_000607.1, GI:10835167), la isoforma 2 (NP_001181943.1, GI:303522479), la isoforma 3 (NP_001181944.1, GI:303522485 o NP_001181945.1, GI:303522491 o NP_001181946.1, GI:303522569), y similares. A continuación se proporciona una secuencia de isoforma de ejemplo, la isoforma 1. En una realización, un CAR puede tener una secuencia de aminoácidos que comprende el dominio transmembrana de CD4 correspondiente a los aminoácidos 397 a 418, o fragmentos de los mismos. Véase GenBank NP_000607.1 para referencia a dominios dentro de CD4, por ejemplo, péptido señal, aminoácidos 1 a 25; dominio extracelular, aminoácidos 26 a 396; aminoácidos del dominio transmembrana, 397 a 418; dominio intracelular, aminoácidos 419 a 458. Se entiende que se puede incluir en un CAR, si se desea, una secuencia adicional de CD4 más allá del dominio transmembrana de los aminoácidos 397 a 418. Se entiende además que las secuencias de CD4 que son más cortas o más largas que un dominio dilineado específico pueden incluirse en un CAR, si se desea. También se entiende que una "molécula de ácido nucleico de CD4" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido de CD4.

1 MNRGVPFRHL LLVLQLALLP AATQGKKWL GKKGDTVELT CTASQKKSIQ FHWKNSNQIK

61 ILGNQGSFLT KGPSKLNDRA DSRRSLWDQG NFPLIIKNLK 1EDSDTYICE VEDQKEEVQL

121 LVFGLTANSD THLLQGQSLT LTLESPPGSS PSVQCRSPRG KNIQGGKTLS VSQLELQDSG

181 TWTCTVLQNQ KKVEFKIDIV VLAFQKASSI VYKKEGEQVE FSFPLAFTVE KLTGSGELWW

241 QAERASSSKS WITFDLKNKE VSVKRVTQDP KLQMGKKLPL HLTLPQALPQ YAGSGNLTLA

301 LEAKTGKLHQ EVNLWMRAT QLQKWLTCEV WGPTSPKLML SLKLENKEAK VSKREKAVWV

361 LNPEAGMWQC LLSDSGQVLL ESNIKVLPTW STPVQPMALI VLGGVAGLLL FIGLGIFFCV

421 RCRHRRRQAE RMSQIKRLLS EKKTCQCPHR FQKTCSPI (NP_000607.1; SEQ ID NO;23)

Se entiende que los dominios de los polipéptidos descritos en la presente memoria se pueden usar en un CAR de antígeno del cáncer, como útiles para proporcionar una función deseada, como un péptido señal, un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana, un dominio de señalización intracelular y/o un dominio coestimulador. Por ejemplo, se puede seleccionar un dominio como un péptido señal, un dominio transmembrana, un dominio de señalización intracelular u otro dominio, según se desee, para proporcionar una función particular a un CAR en el contexto de la invención. Las posibles funciones deseables pueden incluir, pero no se limitan a, proporcionar un péptido señal y/o un dominio transmembrana.

Receptores coestimuladores quiméricos (CCRs). Un receptor coestimulador quimérico (CCR) es un producto de ejemplo codificado por un transgén terapéutico. Los receptores coestimuladores quiméricos (CCRs) son receptores quiméricos que, de forma similar a un CAR, comprenden un dominio extracelular de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un dominio de señalización intracelular (Sadelain et al.,Cáncer Discov.3(4):388-398 (2013)). Los CCR no tienen un dominio de activación de células T, pero comprenden un dominio coestimulador, como uno de los dominios coestimuladores descritos anteriormente para un CAR, por ejemplo, CD28, 4-1BB, OX40, ICOS, DAP10, 2B4, CD70, o similar. Los CCR se pueden usar junto con un receptor de células T o un CAR para mejorar la reactividad de las células T contra las células T que expresan antígenos duales (Sadelain et al.,supra,2013). Los CCR también se pueden usar para mejorar la orientación selectiva del tumor (Sadelain et al.,supra,2013). Un CCR es un receptor coestimulador específico de antígeno, que imita los efectos 4-1BB, OX40, ICOS o CD70 (según el dominio coestimulador del CCR) al unirse a su asociado de unión, es decir, un antígeno diana.

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Ejemplos de ligandos coestimuladores (CL) útiles como producto que puede ser codificado por un transgén terapéutico incluyen, pero no se limitan a, ligandos coestimuladores 4-1BBL; OX40L; ICOSL; CD70, y similares. Los receptores coestimuladores quiméricos (CCR) de ejemplo que pueden ser codificados por un transgén terapéutico incluyen, per no se limitan a, un receptor coestimulador específico de antígeno, que imita los efectos de 4-1BB, OX40, ICOS o c D70 al unirse a un antígeno diana.

Citoquinas. Una citoquina es un producto de ejemplo codificado por un transgén terapéutico. Las citoquinas que son particularmente útiles cuando están codificadas por un transgén terapéutico incluyen aquellas que estimulan o mantienen la activación de una célula T de la invención. Los ejemplos de citoquinas útiles como producto codificado por un transgén terapéutico para estimular una respuesta inmune incluyen, pero no se limitan a, IL2, IL12, IL15, IL18 y similares. Los ejemplos de citoquinas útiles como producto codificado por un transgén terapéutico para inhibir una respuesta inmune incluyen, pero no se limitan a, TGFBeta, IL10 y similares.

Negativos dominantes. Un negativo dominante es un producto de ejemplo de codificado por un transgén terapéutico. Los negativos dominantes que son particularmente útiles cuando están codificados por un transgén terapéutico incluyen aquellos que estimulan o mantienen la activación de una célula T de la invención. Ejemplos de negativos dominantes incluyen, pero no se limitan a, un receptor de antígeno quimérico inhibidor (iCAR), un receptor de citoquina soluble secretable (p. ej., para TGFBeta, IL10), un receptor inhibidor de células T soluble secretable (p. ej., derivado de PD1, CTLA4, LAG3 o TIM-3) y similares. Los receptores de antígenos quiméricos inhibidores son receptores de superficie celular compuestos por un dominio scFV extracelular (se une a una molécula de superficie celular en la célula diana) fusionado con un dominio de señalización intracelular derivado de receptores de células T inhibidores (como PD1, CTL4). Las células T diseñadas se inhiben tras la interacción con una célula diana.

Moduladores del Microambiente. Los moduladores del microambiente son productos de ejemplo codificados por transgenes terapéuticos. Un modulador de microambiente se refiere a una molécula que modula la actividad de las células en la vecindad de la célula T terapéutica modificada. Los moduladores del microambiente que son particularmente útiles cuando están codificados por un transgén terapéutico incluyen aquellos que estimulan o mantienen la activación de una célula T de la invención. Los moduladores de microambiente de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, heparanasa, Mediador de entrada del virus del herpes (HVEM), también denominado TNFRSF14, y similares.

Anticuerpos. Un anticuerpo es un producto de ejemplo codificado por un transgén terapéutico. Los ejemplos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo contra un ligando inhibidor de células T, comoD1L, CD80, CD<8 6>, Galectin-9, ligando Fas y similares.

El anticuerpo se puede expresar como una inmunoglobulina, por ejemplo, una IgG, o como un acoplador de células T biespecífico (BiTE), un diacuerpo, un anticuerpo de redireccionamiento de doble afinidad (DART), un Fab, un F(ab'), un fragmento variable de cadena única (scFv), un nanocuerpo, un anticuerpo biespecífico o similar (véase, por ejemplo, Harlow and Lane,Antibodies: A Laboratory Manual,Laboratorio Cold Spring Harbor (1988)); Chames et al.,Br. J. Pharmacol.157:220-233(2009); Rader,Blood,117:4403-4404 (2011)).

Biosensores. Un biosensor es un producto de ejemplo codificado por un transgén terapéutico. Un biosensor es una molécula biológica (proteína, ADN o ARN) que, tras la unión del ligando, envía una señal a la célula para producir un efecto específico. El biosensor puede ser, por ejemplo, un biosensor de proteína, ADN, ARN, microARN, metabolito, ion o similar. Los biosensores de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, receptor tipo toll (TLR), que es un biosensor para ADN, ARN, toxina y un biosensor para un ion, por ejemplo, Calmodulina sensible al calcio (CaM) - péptido de unión a calmodulina. La expresión de TLR específicos permite que la célula T diseñada responda a la presencia de moléculas diana (como ARN, toxina) en el citoplasma, desencadenando así una determinada señal que la célula puede utilizar para activar la expresión de una molécula terapéutica. Se aplica una estrategia similar a la proteína de unión CaM-calmodulina (que detecta el calcio intracelular). Estos biosensores pueden actuar como intermediarios durante la producción de una molécula terapéutica, y lo hacen solo cuando se requiere que tengan tal efecto. Por ejemplo, el biosensor se puede usar para detectar un estado de la célula y luego activar la expresión de otro transgén. En una realización particular, o ejemplo, se puede usar un biosensor que detecta específicamente una secuencia de ARN de VIH específica. Al unirse, el biosensor sufre un cambio de conformación que provoca la liberación de un represor de transcripción quimérico que luego se traslada al núcleo e inhibe específicamente la transcripción del genoma del VIH.

Ligandos de receptores quiméricos (CRLs). Un ligando de receptor quimérico (CRL) es un producto de ejemplo codificado por un transgén terapéutico. Un CRL es un ligando de la superficie celular que es reconocido por un receptor de células diana (como un receptor de citoquinas) y que, tras la interacción con su receptor específico, desencadenará una respuesta de células T. Un CRL contiene un dominio intracelular que iniciará una respuesta de células T tras la interacción con su receptor específico en la célula diana.

Ligandos de receptores inmunitarios quiméricos (CIRLs). Un receptor inmunitario quimérico (CIRL) es un producto de ejemplo codificado por un transgén terapéutico. Un CIRL es un ligando de la superficie celular que es reconocido por un receptor de células inmunitarias (como un TCR o inmunoglobulina) y que, tras la interacción con su receptor específico, desencadenará una respuesta de células T. Un CIRL contiene un dominio intracelular que iniciará una respuesta de células T tras la interacción con su receptor específico en la célula diana.

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Receptores Solubles. Un receptor soluble es un producto de ejemplo codificado por un transgén terapéutico. Dichos receptores solubles pueden ser intracelulares o extracelulares. Los ejemplos de receptores solubles incluyen, pero no se limitan a, IL4R, IL10R, PD1, CTL4, TIM-3, LAG3 y similares. Dichos receptores solubles generalmente tienen un efecto estimulador sobre una respuesta inmune.

Transportadores de solutos. Un transportador de solutos es un producto de ejemplo codificado por un transgén terapéutico. Los transportadores de soluto de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, un transportador de glucosa, tal como Glut1 o Glut3. Se sabe que las células T efectoras requieren una mayor captación de glucosa para generar energía. Las células T diseñadas que expresan transportadores de glucosa pueden beneficiarse de un mayor número de transportadores de glucosa cuando las células T se encuentran en un entorno competitivo donde las células tumorales (generalmente en mayor número) consumen glucosa.

Enzimas. Una enzima es un producto de ejemplo codificado por un transgén terapéutico. Una enzima terapéutica de ejemplo incluye, pero no se limita a, PKM2. La isoenzima muscular piruvato quinasa 2 (PKM2) es una enzima que se necesita en las células que se dividen, como las células T efectoras, con una alta tasa de glucólisis y una alta demanda de precursores biosintéticos. La sobreexpresión de PKM2 ayuda a aumentar los precursores biosintéticos, mejorando así la proliferación de células T manipuladas.

Ribozimas. Una ribozima es un producto de ejemplo codificado por un transgén terapéutico. Una ribozima de ejemplo que es el producto de un transgén terapéutico incluye, pero no se limita a, una ribozima específica de un patógeno o específica de un virus que escinde el genoma de un patógeno o un virus, respectivamente. En el caso de un patógeno viral, la ribozima puede inhibir tanto la transcripción inversa del ARN del virus durante la entrada del virus como el empaquetamiento del genoma del ARN del virus durante el ensamblaje del virus. Es fácilmente evidente que las ribozimas para diversos patógenos, incluidos los genomas virales dirigidos, pueden expresarse como el producto de un transgén terapéutico. En un ejemplo específico, el transgén codifica una ribozima específica del VIH que escinde el genoma del ARN del VIH, inhibiendo así la transcripción inversa del ARN del virus durante la entrada del virus y el empaquetamiento del genoma del ARN del virus durante el ensamblaje del virus.

Circuitos Genéticos. Un circuito genético es un producto de ejemplo codificado por un transgén terapéutico. Un circuito genético es un conjunto de unidades de expresión génica que están conectadas funcionalmente.

Un ejemplo de un circuito genético es una unidad de transcripción constitutiva que expresa un factor de transcripción sintético (TF) específico del ligando de la superficie celular donde, al unirse al ligando, la fracción TF se libera y se transloca al núcleo. Luego, el TF se une a su secuencia de ADN afín en la segunda unidad de transcripción (inducible por definición), lo que activa la expresión de un receptor soluble específico del ligando inhibidor que se secreta en el microambiente para atrapar dicho ligando inhibidor. En otro ejemplo, una unidad de transcripción constitutiva que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR) que, tras el reconocimiento de la célula diana, induce la expresión de un supresortumoral secretable (como el soIHEVM específico del linfoma) a través de un elemento sensible a NFAT; en una realización de este tipo, el CAR está codificado por un primer transgén bajo el control de un promotor endógeno constitutivo, cuyo CAR, tras el reconocimiento de la célula diana, induce la expresión de un supresortumoral secretable (como el soIHEVM específico del linfoma) a partir de un transgén bajo el control de un promotor endógeno inducible sensible a NFAT. En un ejemplo, un TF sintético se expresa a partir de una unidad de transcripción (un solo transgén integrado en una ubicación); el receptor soluble se expresa a partir de una segunda unidad de transcripción (un solo casete de expresión transgénica, integrado en la misma ubicación o en una diferente) y esa expresión se produce cuando el TF se une a esta segunda unidad de transcripción.

En un ejemplo particular de un circuito genético, una célula T que expresa CAR contiene un circuito genético compuesto por unidades de transcripción dependientes de HIF1a y dependientes de TALE-VP64. Cuando la célula T CAR se encuentra en un microambiente tumoral con bajos niveles de oxígeno, el factor de transcripción HIF1alfa se activa en las células T, se une a la unidad de transcripción dependiente de HIF1a e induce la expresión de un factor de transcripción quimérico TALE-VP64, que luego se une a la unidad de transcripción dependiente de TALE-VP64 y estimula la expresión de scFv secretables que se dirigen a una molécula inhibidora en el microambiente como PD1L o CD80. A partir de esta segunda unidad de transcripción, también se expresa un HIF1a recombinante que dará como resultado una retroalimentación positiva a la primera unidad de transcripción. En el ejemplo específico anterior, la expresión de un primer transgén está bajo el control de un promotor inducible endógeno inducido por el factor de transcripción HIF1 alfa, la expresión de un segundo transgén está bajo el control de un promotor inducible endógeno inducido por TALE-VP64 y el primer transgén codifica TALE-VP64, y el segundo transgén codifica el scFv secretable. Opcionalmente, la expresión de un tercer transgén, cuyo tercer transgén codifica HIF1a, está bajo el control de un promotor inducible endógeno diferente que también es inducido por TALE-VP64. En un ejemplo, un factor de transcripción puede impulsar la expresión de uno o múltiples productos génicos, ocurriendo este último en el caso de un mensaje policistrónico. Ejemplos de unidades de transcripción bicistrónicas: las cadenas alfa y beta para ensamblar un TCR; dos scFv en tándem, y similares. En un ejemplo, una sola unidad de transcripción sensible a TALE-VP64 contendrá tanto el scFv como el HIF1a; este es un constructo bicistrónico: dos genes se expresarán a partir de un solo promotor.

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En otro ejemplo particular, una unidad de transcripción constitutiva que expresa una proteína de fusión scFV-NFAT específica de CD19 de la superficie celular que, al unirse a las células B, se libera a la fracción NFAT, se transloca al núcleo y se une a su secuencia de ADN afín en la segunda unidad de transcripción, a partir de la cual se expresa un ligando de receptor inmunitario quimérico. Este segundo gen codifica una proteína de fusión compuesta por un antígeno extracelular (que es reconocido por un receptor de inmunoglobulina específico en la célula B diana) y dominios de señalización intracelular que activan la célula T manipulada, lo que provoca la muerte de la célula B diana. Por lo tanto, en este ejemplo particular, la expresión de un primer transgén está bajo el control de un promotor constitutivo endógeno, cuyo primer transgén codifica la proteína de fusión scFv-NFAT específica de CD19 de la superficie celular, y la expresión de un segundo transgén está bajo el control de un promotor inducible endógeno que se induce mediante la unión de la proteína de fusión scFv-NFAT específica de<c>D19 de la superficie celular a las células B, y el segundo transgén codifica una proteína de fusión que comprende (i) un antígeno extracelular (que es reconocido por un receptor de inmunoglobulina en la célula B objetivo), y (ii) al menos un dominio de señalización intracelular que activa la célula T diseñada, lo que resulta en la muerte de la célula B objetivo (por ejemplo, debido a la actividad citolítica de la célula T activada)

Modificadores epigenéticos. Un modificador epigenético es un producto de ejemplo codificado por un transgén terapéutico. Un modificador epigenético es una proteína/enzima que cataliza modificaciones específicas de la cromatina, ya sea las proteínas histonas o el ADN, en una ubicación genómica particular. Estas modificaciones dan como resultado cambios específicos de la expresión génica, ya sea activación o represión. Ejemplos de modificadores epigenéticos incluyen, pero no se limitan a, dominio de unión de ADN específico de secuencia programable quimérico fusionado con dominio de acetiltransferasa p300 (una histona H3 acetilasa), que activa la expresión del gen diana; y el dominio de unión de ADN específico de secuencia programable quimérico fusionado con el dominio represor KRAB (una proteína que recluta complejos formadores de heterocromatina), que reprime la expresión del gen diana.

Activadores o represores transcripcionales. Un activador o represor transcripcional (factor de transcripción) es un producto de ejemplo codificado por un transgén terapéutico. El activador o represor transcripcional puede ser natural o quimérico. En algunos casos, un activador de un gen puede ser un represor de otro gen, o viceversa. Los factores de transcripción de ejemplo que pueden expresarse mediante un transgén terapéutico incluyen, pero no se limitan a, Foxp3, NFAT, HIF-1alfa y similares.

Entre los ejemplos de activadores transcripcionales quiméricos se incluyen, pero no se limitan a, proteínas de fusión compuestas por un dominio de unión al ADN (como TAL, dedo de zinc, CRISPR/cas9 desactivado) y un dominio de transactivación (tal como VP16, VP64, p65, Rta o combinaciones de ellos), que puede diseñarse para activar específicamente uno o más genes. Así, en un ejemplo específico, un transgén terapéutico codifica una proteína de fusión que comprende un dominio de unión al ADN y un dominio de transactivación.

Los represores transcripcionales quiméricos de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, proteínas de fusión compuestas por un dominio de unión al ADN (como TAL, dedo de zinc, CRISPR/Cas9 desactivado) y un dominio represor (tal como KRAB), que puede diseñarse para reprimir específicamente uno o más genes. Así, en un ejemplo específico, un transgén terapéutico codifica una proteína de fusión que comprende un dominio de unión al ADN y un dominio represor.

ARN no codificante. El ARN no codificante es un producto de ejemplo codificado por un transgén terapéutico. Los ejemplos de ARN no codificantes (microARN o ARN de interferencia corta) incluyen aquellos que se dirigen a ARN mensajeros de genes de receptores inhibidores tales como PD1, TIM-3, LAG3, CTLA-4 y similares. Por lo tanto, en un ejemplo, un transgén terapéutico codifica un ARN no codificante como un microARN (miARN), ARN de interferencia corta (ARNip), ARN antisentido, etc. En un ejemplo en donde se desea la estimulación de la actividad de la célula T manipulada, el ARN no codificante puede dirigirse, por ejemplo, a ARN mensajeros de genes de receptores inhibidores de diana tales como ARN mensajeros de PD1, TIM-3, LAG3, CTLA-4 o similares.

En el caso de que se desee estimular una respuesta inmunitaria, se selecciona preferentemente un transgén terapéutico para que codifique un producto que estimule una respuesta inmunitaria. Dicho producto que estimula una respuesta inmunitaria puede ser, pero no se limita a, IL12, IL15, IL18 o dominios funcionales derivados de cualquiera de estos factores. En el caso de que se desee inhibir un inhibidor de una respuesta inmunitaria, se selecciona un transgén terapéutico preferiblemente para codificar un producto que inhiba un inhibidor de una respuesta inmunitaria. Dicho producto que inhibe un inhibidor de una respuesta inmunitaria puede ser, entre otros, un anticuerpo específico de un ligando (p. ej., PD1L, CD80, CD<86>o galectina-9) que se une a un receptor inhibidor de células T (por ejemplo, PD1, CTLA4, La G3 o TIM3); un receptor soluble que se une a un factor tal como TGFbeta, TNFalfa, IL1, Il4, IL<6>o IL10, evitando así la activación del receptor de la superficie celular del factor; un antígeno o un derivado funcional del mismo que se une a un receptor inmunitario autoinmune específico en una célula B o T para inducir tolerancia inmunológica o muerte celular, etc. En un ejemplo, se sabe que los ligandos PD1L, CD80, CD<8 6>, galectina-9 inhiben actividad de las células T al unirse a receptores específicos en las células T. Los anticuerpos terapéuticos se unen a los ligandos, no a los receptores inhibidores de células T; el anticuerpo bloqueará la interacción entre el ligando y su receptor inhibidor de células T correspondiente. Por lo tanto, estos ligandos no inhibirán las células T diseñadas que secretan estos anticuerpos. En un ejemplo, TGFbeta es una citoquina que también inhibe la actividad de las células T. Un receptor soluble terapéutico específico para esta citoquina bloqueará su actividad evitando su unión al receptor expresado en las células T. Por lo tanto, las células T diseñadas que secretan un receptor soluble de TGFbeta no

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serán inhibidas por esta citoquina.

En otro ejemplo, la célula T puede expresar opcionalmente un transgén que produce un informador. Un informadores un transgén de ejemplo que se puede coexpresar en una célula T con un transgén terapéutico. Un ejemplo de un transgén de este tipo es el receptor de EGF truncado (EGFRt), que permite tanto la detección como la eliminación (es decir, puede funcionar como un interruptor de suicidio celular), si es necesario, de la célula T terapéutica. Hay anticuerpos específicos (p. ej., cetuximab) que reconocen a este informador y desencadenan la muerte de células diana mediada por anticuerposin vivo(véase la patente U.S. No. 8.802.374)). Por lo tanto, en un ejemplo específico, la célula T manipulada (en donde la expresión de un transgén terapéutico está bajo el control de un promotor endógeno) comprende además un transgén informador, siendo el transgén informador un transgén que codifica una proteína marcadora detectable (preferiblemente de superficie celular), en donde la expresión del transgén informador está bajo el control de un promotor endógeno de la célula T (p. ej., cualquiera de los promotores endógenos descritos anteriormente en la presente memoria). En un ejemplo específico, el transgén informador no codifica IL4 ni una forma de IL4 unida a la membrana. En otro ejemplo específico, el transgén informador codifica un interruptor de suicidio celular. En una realización específica, el interruptor de suicidio celular es EGFRt; en tal ejemplo, después de la administración de la célula T modificada al sujeto con fines terapéuticos, al sujeto se le puede administrar un anticuerpo que reconoce EGFRt y desencadena la muerte celular de la célula T modificada, para detener la actividad de la célula T cuando se desee después del tratamiento.

5.6. Métodos de tratamiento

Las referencias a los métodos de tratamiento mediante terapia o cirugía en el contexto de la invención deben interpretarse como referencias a células, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en dichos métodos. La invención también se refiere a métodos para tratar a un sujeto con terapia de células T, cuando el sujeto la necesite. En realizaciones en donde la terapia con células T es para promover una respuesta inmunitaria (es decir, tratar a un sujeto que necesita una respuesta inmunitaria estimulada), a modo de ejemplo, el sujeto que se está tratando puede tener cáncer o una enfermedad infecciosa, y la administración de las células T recombinantes de la invención son para tratar el cáncer o la enfermedad infecciosa, respectivamente. Las células T pueden dirigirse al cáncer o enfermedad infecciosa en virtud de la expresión recombinante de un asociado de unión (por ejemplo, un CAR o anticuerpo o receptor) (que puede estar codificado por el transgén terapéutico) a un antígeno diana asociado con el cáncer o enfermedad infecciosa, o en virtud de estar sensibilizado a un antígeno diana asociado con el cáncer o enfermedad infecciosa. En una realización específica que usa células T sensibilizadas, las células T se sensibilizan a un antígeno del cáncer o enfermedad infecciosa, respectivamente. En una realización preferida, la invención también se refiere a métodos para tratar a un sujeto con terapia con CAR, en donde el sujeto necesita tal terapia. En realizaciones en donde la terapia con CAR es para promover una respuesta inmunitaria, a modo de ejemplo, el sujeto que se está tratando puede tener cáncer o una enfermedad infecciosa, la administración de las células T recombinantes de la invención es para tratar el cáncer o la enfermedad infecciosa, y el CAR se une a un antígeno del patógeno del cáncer o de la enfermedad infecciosa, respectivamente. En tales realizaciones, la célula T puede ser CD<8>+, CD4+, una TSCM, una TCM, célula T de memoria efectora, célula T efectora, célula Th1, célula Th2, célula Th9, célula Th17, célula Th22, célula Tfh (auxiliar folicular), u otra célula T como se describe en la presente memoria.

En realizaciones en donde la terapia con células T es para suprimir una respuesta inmunitaria (es decir, tratar a un sujeto que necesita una respuesta inmunitaria inhibida), a modo de ejemplo, el sujeto que se está tratando puede tener una enfermedad autoinmune o corre el riesgo de rechazo del trasplante, y la administración de las células T recombinantes de la invención es para tratar la enfermedad autoinmune o para promover la tolerancia al trasplante, respectivamente. Como otro ejemplo, en donde la terapia con células T es para suprimir una respuesta inmunitaria, el sujeto que se está tratando puede estar en riesgo o tener una enfermedad de injerto contra huésped, y la administración de las células T recombinantes (utilizadas de forma intercambiable en la presente memoria con "modificadas por ingeniería") de la invención es para prevenir o reducir la enfermedad de injerto contra huésped. Las células T pueden dirigirse a la enfermedad, trasplante o injerto autoinmune en virtud de la expresión recombinante de un asociado de unión (es decir, un CAR) (que puede estar codificado por el transgén terapéutico) a un antígeno diana asociado con la enfermedad autoinmune (p. ej., el autoantígeno), trasplante o injerto, o en virtud de estar sensibilizado a un antígeno diana asociado con la enfermedad autoinmune, trasplante o injerto. En una realización específica que usa células T sensibilizadas, las células T se sensibilizan a un antígeno en el sitio de la reacción autoinmune o las células trasplantadas o el injerto (o las células derivadas de las mismas), respectivamente. En dichas realizaciones, la célula T puede ser una célula T reguladora (Treg). En realizaciones preferidas en donde la terapia con CAR es para suprimir una respuesta inmunitaria, a modo de ejemplo, el sujeto que se está tratando puede tener una enfermedad autoinmune o está en riesgo de rechazo del trasplante, la administración de las células T recombinantes de la invención es para tratar la enfermedad autoinmune o para promover la tolerancia al trasplante, y el CAR se une a un antígeno en el sitio de la reacción autoinmune o las células trasplantadas, respectivamente. Como otro ejemplo, el sujeto que se está tratando puede tener o estar en riesgo de enfermedad de injerto contra huésped (GVHD), la administración de las células T recombinantes de la invención es para tratar o prevenir o reducir el riesgo de GVHD, y el CAR se une a un antígeno asociado con la GVHD. En dichas realizaciones, la célula T puede ser una célula T reguladora (Treg). Dichos trastornos autoinmunitarios incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, enfermedad celiaca, anemia perniciosa, vitíligo, esclerodermia, psoriasis, enfermedad inflamatoria intestinal,

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enfermedad de Hashimoto, enfermedad de Addison, enfermedad de Graves, artritis reactiva, síndrome de Sjogren. y diabetes tipo 1. Los trasplantes pueden ser trasplantes de órganos o tejidos, p. ej., trasplantes de pulmón, riñón, corazón, intestino, hígado y páncreas, etc. El tratamiento o prevención de la GVHD puede ser posterior a un trasplante de células madre hematopoyéticas del sujeto.

En una realización, el sujeto tiene cáncer. En tal realización, la terapia con células T se dirige al cáncer. De acuerdo con la invención, la célula T expresa un CAR. (Por tanto, eltransgén terapéutico codifica un CAR). En una realización preferida, CAR se une a un antígeno canceroso. El antígeno del cáncer se elige para dirigirse a un cáncer del sujeto.

En una realización específica, las células se administran como una población de células que expresan un transgén. La invención se refiere a varios usos de las células T que expresan un CAR (donde el transgén codifica un CAR). En una realización específica, las células se administran como una población de células que expresan un CAR. Opcionalmente, las células a administrar pueden purificarse o enriquecerse con las células de la invención.

En una realización, las células T de la invención se utilizan para tratar el cáncer. De acuerdo con la invención, las células T expresan un CAR. Por tanto, el transgén codifica un CAR. En una realización, el CAR es un CAR específico del antígeno del cáncer.

Se entiende que un método para tratar el cáncer puede incluir cualquier efecto que mejore un signo o síntoma asociado con el cáncer. Dichos signos o síntomas incluyen, pero no se limitan a, la reducción de la cantidad de células leucémicas, la reducción de la carga tumoral, incluida la inhibición del crecimiento de un tumor, la desaceleración de la tasa de crecimiento de un tumor, la reducción del tamaño de un tumor, la reducción de la cantidad de tumores, eliminando un tumor, todo lo cual puede medirse usando técnicas rutinarias de formación de imágenes de tumores bien conocidas en la técnica. Otros signos o síntomas asociados con el cáncer incluyen, pero no se limitan a, fatiga, dolor, pérdida de peso y otros signos o síntomas asociados con varios tipos de cáncer. Por tanto, la administración de las células de la invención puede reducir el número de células tumorales, reducir el tamaño del tumor y/o erradicar el tumor en el sujeto. El tumor puede ser un cáncer de la sangre o un tumor sólido. Los métodos de la invención también pueden proporcionar una supervivencia aumentada o prolongada de un sujeto que tiene cáncer. Además, los métodos de la invención pueden proporcionar una respuesta inmunitaria aumentada en el sujeto, por ejemplo, una respuesta inmunitaria aumentada contra el cáncer.

En la invención, las células T se administran a un sujeto que necesita terapia con células T, por ejemplo, un sujeto que necesita tratamiento, por ejemplo, tratamiento de cáncer, una enfermedad infecciosa, un trastorno autoinmune, rechazo de trasplantes, y similares, como se describe en la presente memoria. En una realización preferida de los métodos de la invención, las células T se administran a un sujeto que necesita terapia con CAR, por ejemplo, un sujeto que necesita tratamiento, por ejemplo, tratamiento de cáncer, una enfermedad infecciosa, un trastorno autoinmune, rechazo de trasplante, y similares como se describe en este documento. El sujeto puede ser un mamífero, en particular un ser humano. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano. Una composición farmacéutica que comprende una célula de la invención se administra a un sujeto para provocar una respuesta inmunitaria, con el objetivo de paliar el estado del sujeto. La mejora clínica comprende la disminución del riesgo o la tasa de progresión o la reducción de las consecuencias patológicas del trastorno que se está tratando con terapia con células T, por ejemplo, cáncer. En una realización preferida, la mejora clínica comprende la disminución del riesgo o la tasa de progresión o la reducción de las consecuencias patológicas del trastorno que se está tratando con la terapia con CAR, por ejemplo, el cáncer.

El sujeto puede tener una forma avanzada de enfermedad, en cuyo caso el objetivo del tratamiento puede incluir la mitigación o reversión de la progresión de la enfermedad y/o la mejora de los efectos secundarios. Los sujetos pueden tener antecedentes de la afección, por la cual ya han sido tratados, en cuyo caso el objetivo terapéutico puede ser disminuir o retrasar el riesgo de recurrencia. En el caso del tratamiento del cáncer, las neoplasias malignas refractarias o recurrentes pueden tratarse usando las células de la invención. Opcionalmente, se puede administrar una célula de la invención para el tratamiento profiláctico para prevenir la aparición de una enfermedad o condición en un sujeto sospechoso de tener una predisposición a una enfermedad o condición, por ejemplo, en base a antecedentes familiares y/o pruebas genéticas.

Las células de la invención se administran a un sujeto, tal como un sujeto humano, que necesita terapia con células T, por ejemplo, tratamiento de cáncer, una enfermedad infecciosa, una enfermedad autoinmune, rechazo de trasplantes y similares. En una realización preferida, las células de la invención se administran a un sujeto, como un sujeto humano, que necesita terapia con CAR, por ejemplo, tratamiento de cáncer, una enfermedad infecciosa, una enfermedad autoinmune, rechazo de trasplantes y similares. En el caso del cáncer, el cáncer puede involucrar un tumor sólido o un cáncer de la sangre que no involucre un tumor sólido. Los cánceres a tratar usando las células de la invención comprenden cánceres típicamente sensibles a la inmunoterapia. Tipos de ejemplo de cánceres incluyen, pero no se limitan a, carcinomas, sarcoma, leucemia, linfoma, mieloma múltiple, melanoma, tumores cerebrales y de la médula espinal, tumores de células germinales, tumores neuroendocrinos, tumores carcinoides y similares. El cáncer puede ser un tumor sólido o un cáncer de sangre que no forma un tumor sólido. En el caso de un tumor sólido, el tumor puede ser un tumor primario o un tumor metastásico.

Ejemplos de otras neoplasias o cánceres que pueden tratarse usando los métodos de la invención incluyen cáncer de

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huesos, cáncer intestinal, cáncer de hígado, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma (melanoma maligno cutáneo o intraocular), cáncer renal (por ejemplo, carcinoma de células claras), cáncer de garganta, cáncer de próstata (por ejemplo, adenocarcinoma de próstata refractario a hormonas), cánceres de la sangre (por ejemplo, leucemias, linfomas y mielomas), cáncer de útero, cáncer de recto, cáncer de la región anal, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de estómago, cáncer testicular, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma de endometrio, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de vagina, carcinoma de vulva, leucemias (por ejemplo, leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mieloblástica aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia mielomonocítica aguda, leucemia monocítica aguda, eritroleucemia aguda, leucemia crónica, leucemia mielocítica crónica, leucemia mielocítica crónica, leucemia linfocítica crónica), policitemia vera, linfoma (enfermedad de Hodgkin, enfermedad no Hodgkin, macroglobulinemia de Waldenstrom), cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de uretra, cáncer de pene, tumores sólidos de la infancia, linfoma linfocítico, cáncer de riñón o de uréter, carcinoma de pelvis renal, neoplasia del sistema nervioso central (CNS), linfoma primario del CNS, angiogénesis tumoral, tumor del eje espinal, glioma del tronco encefálico, adenoma hipofisario, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, linfoma de células T, cánceres inducidos por el medio ambiente, incluidos los inducidos por asbesto, enfermedad de cadenas pesadas y tumores sólidos como sarcomas y carcinomas, por ejemplo, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, hepatoma, carcinoma de vías biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino, cáncer de útero, cáncer testicular, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodenroglioma, schwannoma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, enfermedad pleural maligna, mesotelioma, cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas), cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cáncer de mama (por ejemplo, cáncer de mama metastásico, cáncer de mama metastásico triple negativo), cáncer de colon, tumor pleural, glioblastoma, cáncer de esófago, cáncer gástrico y sarcoma sinovial. Los tumores sólidos pueden ser tumores primarios o tumores en estado metastásico.

En una realización específica, las células que expresan recombinantemente un transgén que se administran al sujeto comprenden tanto celulas T CD4+ como CD<8>+, con el objetivo de generar respuestas de linfocitos T auxiliares y citotóxicos (CTL) en el sujeto. En una realización preferida en donde el transgén codifica un CAR, las células que expresan de forma recombinante un CAR que se administran al sujeto comprenden tanto células T CD4+ y CD<8>+, con el objetivo de generar respuestas de linfocitos T auxiliares y citotóxicos (CTL) en el sujeto.

En una realización, la invención proporciona un método para tratar a un sujeto con terapia con células T que lo necesita, en donde el sujeto necesita una respuesta inmunitaria inhibida, que comprende administrar células T de la invención que son células inmunoinhibidoras. En una realización, el sujeto tiene una enfermedad autoinmune. En una realización particular en el caso de que la célula T exprese un CAR (codificado por el transgén), el CAR se une a un antígeno autoinmune del trastorno autoinmune. Los trastornos autoinmunitarios incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, enfermedad celiaca, anemia perniciosa, vitíligo, esclerodermia, psoriasis, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Hashimoto, enfermedad de Addison, enfermedad de Graves, artritis reactiva, síndrome de Sjogren, y diabetes tipo 1.

En otra realización, el sujeto que necesita tratamiento con una célula inmunoinhibidora tiene un trasplante de órgano. En tal método, las células T de la invención que son inmunoinhibidoras se administran al sujeto para mejorar la tolerancia inmunológica para el órgano trasplantado. De acuerdo con la invención, la célula T expresa un CAR (codificado por el transgén), y el CAR se une a un antígeno del órgano trasplantado. Los trasplantes pueden ser trasplantes de pulmón, riñón, corazón, intestino, hígado y páncreas, etc.

En otra realización, el sujeto que necesita tratamiento con una célula inmunoinhibidora necesita reducir o prevenir la GVHD, por ejemplo, cuando el sujeto ha tenido un trasplante de células madre hematopoyéticas. En dicho método, las células T de la invención que son inmunoinhibidoras se administran al sujeto para potenciar la tolerancia inmunitaria mediante el trasplante de células madre o células derivadas del mismo de antígenos del sujeto. De acuerdo con la invención, la célula T expresa un CAR (codificado por el transgén), y el CAR se une a un antígeno de las células trasplantadas.

Para el tratamiento, la cantidad administrada es una cantidad efectiva para producir el efecto deseado. Una cantidad eficaz o una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad suficiente para proporcionar un resultado clínico beneficioso o deseado tras el tratamiento. Se puede proporcionar una cantidad eficaz en una sola administración o en una serie de administraciones (una o más dosis). Se puede proporcionar una cantidad eficaz en un bolo o mediante perfusión continua. En términos de tratamiento, una cantidad eficaz es una cantidad que es suficiente para paliar, mejorar, estabilizar, revertir o retardar la progresión de la enfermedad, o reducir de otro modo las consecuencias patológicas de la enfermedad. La cantidad efectiva puede ser determinada por el médico para un sujeto particular. Por lo general, se tienen en cuenta varios factores al determinar una dosis adecuada para lograr una cantidad efectiva.

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Estos factores incluyen la edad, el sexo y el peso del sujeto, la afección que se está tratando, la gravedad de la afección y la forma y concentración efectiva de las células de la invención que se administran.

Las células de la invención generalmente se administran como una dosis basada en células por kilogramo (células/kg) de peso corporal. Generalmente, las dosis celulares están en el rango de aproximadamente 10<4>a aproximadamente

<1 0 10>células/kg de peso corporal, por ejemplo, aproximadamente<1 0 5>a aproximadamente<1 0>9, aproximadamente<1 0 5>a aproximadamente<1 0>8, aproximadamente<10 5>a aproximadamente<10>7, o aproximadamente<10 5>a<1 0>6, dependiendo del modo y lugar de administración. En general, en el caso de la administración sistémica, se utiliza una dosis mayor que en la administración regional, donde las células T de la invención se administran en la región, un órgano o un tumor. Los rangos de dosis de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, 1*10<4>a 1*108, 2*10<4>a 1*108, 3*10<4>a 1*108, 4*10<4>a 1*108, 5*10<4>a 1*108, ®*104, a 1*108, 7*10<4>a 1*108, 8*10<4>a 1*108, 9*10<4>a 1*108, 1*10<5>a 1*108, por ejemplo, 1*105 a 5*107, 1*105 a 4*107, 1*105 a 3*107, 1*105 a 2*107, 1*105 a 1*107, 1*105 a 9*10®, 1*105 a 8*10®,

1*105 a 7*10®, 1*105 a ®*10®, 1*105 a 5*10®, 1*105 a 4*10®, 1*105 a 3*10®, 1*105 a 2*10®, 2*105 a 7*10®, 2*105 a 6x10®, 2*10<5>a 5*10®, 2*10<5>a 4*10®, 3*10<5>a 3*10®, y similares. Tales rangos de dosis pueden ser particularmente útiles para la administración regional. En una realización particular, las células se proporcionan en una dosis de 1x10<5>a 5*10®, en particular 1*10<5>a 3*10® o 3*10<5>a 3*10® células/kg para administración regional, por ejemplo, administración intrapleural. Los rangos de dosis de ejemplo también pueden incluir, pero no se limitan a, 5*10<5>a 1*108, por ejemplo, ®*10<5>a 1*108, 7*10<5>a 1*108, 8*10<5>a 1*108, 9*10<5>a 1*108, 1*10® a 1*108, 1*10® a 9*107,

1*10® a 8*107, 1*10® a 7*107, 1*10® a ®*107, 1*10® a 5*107, 1*10® a 4*107, 1*10® a 3*107, y similares. Tales dosis pueden ser particularmente útiles para la administración sistémica. En una realización particular, las células se proporcionan en una dosis de 1x10® a 3*10<7>células/kg para administración sistémica. Las dosis de células de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, una dosis de 1*104, 2*104, 3*104, 4*104, 5*104, ®*104, 7*104, 8*104, 9*104, 1*10 2*105, 3*105, 4*105, 5*105, ®*105, 7*105, 8*105, 9*105, 1*10®, 2*10®, 3*10®, 4*10®, 5*10®, ®*10®, 7*10®, 8*10®, 9*10®, 1*107, 2*107, 3*107, 4*107, 5*107, ®*107, 7*107, 8*107, 9*107, 1*108, 2*108, 3*108, 4*108, 5*108, ®*108, 7*108, 8*108, 9*108, 1*10<9>y así sucesivamente en el rango de aproximadamente 10<4>a aproximadamente 1010.

Además, la dosis también se puede ajustar para tener en cuenta si se administra una dosis única o si se administran

dosis múltiples. La determinación precisa de lo que se consideraría una dosis efectiva puede basarse en factores individuales de cada sujeto, incluidos su tamaño, edad, sexo, peso y condición del sujeto en particular, como se describe anteriormente. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente las dosis basándose en la descripción del presente documento y el conocimiento en la técnica.

Las células de la invención se pueden administrar mediante cualquier método conocido en la técnica, incluidos, pero no limitados a, administración pleural, administración intravenosa, administración subcutánea, administración intraganglionar, administración intratumoral, administración intratecal, administración intrapleural, administración intraperitoneal, administración intracraneal, y administración directa al timo. En una realización, las células de la invención pueden administrarse regionalmente a un órgano, tumor o sitio de una enfermedad autoinmune o sitio de una enfermedad infecciosa utilizando métodos bien conocidos, que incluyen, pero no se limitan a, bomba hepática o aórtica; perfusión de extremidades, pulmones o hígado; en la vena porta; a través de una derivación venosa; en una cavidad o en una vena que está cerca de un tumor, y similares. En otra realización, las células de la invención pueden administrarse sistémicamente. En aún otra realización, las células se administran regionalmente en el sitio de una terapia deseada, por ejemplo, en el sitio de un tumor. En el caso de un tumor, las células también pueden administrarse por vía intratumoral, por ejemplo, mediante inyección directa de las células en el sitio de un tumor y/o en la vasculatura del tumor. Un experto en la técnica puede seleccionar un modo de administración adecuado basándose en el tipo de tejido diana o región diana y/o la ubicación de un tejido diana o región diana a tratar. Las células se pueden introducir por inyección o catéter. Opcionalmente, los agentes de expansión y/o diferenciación pueden administrarse al sujeto antes, durante o después de la administración de células para aumentar la producción de células de la invención in vivo.

La proliferación de las células de la invención generalmente se realiza ex-vivo, antes de la administración a un sujeto, y puede ser deseable in vivo después de la administración a un sujeto (véase Kaiser et al.,Cáncer Gene Therapy22:72-78 (2015)). La proliferación celular debe ir acompañada de supervivencia celular para permitir la expansión y persistencia celular, tal como con las células T. Por lo tanto, las células T pueden proliferar ex-vivo o in vivo, según se desee.

Los métodos de la invención pueden comprender además terapia adyuvante en combinación con antes, durante o después del tratamiento con las células de la invención. Por lo tanto, los métodos de terapia celular de la invención se pueden usar con otros tratamientos y/o terapias estándar que sean compatibles con la administración de las células de la invención.

5.7. Composiciones farmacéuticas

La invención proporciona adicionalmente composiciones farmacéuticas que comprenden las células de la invención.

La composición farmacéutica comprende una cantidad eficaz de una célula de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las células de la invención y las composiciones que comprenden las células pueden proporcionarse convenientemente en preparaciones líquidas estériles, por ejemplo, típicamente soluciones acuosas isotónicas con suspensiones celulares, u opcionalmente como emulsiones, dispersiones o similares, que típicamente se regulan a un pH seleccionado. Las composiciones pueden comprender vehículos, por ejemplo, agua, solución salina, solución salina reguñada con fosfato y similares, adecuados para la integridad y viabilidad de las células y para

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la administración de una composición celular.

Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando células de la invención en una cantidad adecuada del disolvente apropiado con diversas cantidades de los demás ingredientes, según se desee. Dichas composiciones pueden incluir un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa, dextrosa o similares, que son adecuados para uso con una composición celular y para administrar a un sujeto tal como un ser humano. Los reguladores adecuados para proporcionar una composición celular son bien conocidos en la técnica. Cualquier vehículo, diluyente o aditivo utilizado es compatible con la preservación de la integridad y viabilidad de las células de la invención.

Las composiciones serán generalmente isotónicas, es decir, tendrán la misma presión osmótica que la sangre y el fluido lagrimal. La isotonicidad deseada de las composiciones celulares de la invención se puede lograr usando cloruro de sodio u otros agentes farmacéuticamente aceptables tales como dextrosa, ácido bórico, tartrato de sodio u otros solutos inorgánicos u orgánicos. Se prefiere el cloruro de sodio particularmente para reguadores que contienen iones de sodio. Un regulador particularmente útil es la solución salina, por ejemplo, solución salina normal. Los expertos en la técnica reconocerán que los componentes de las composiciones deben seleccionarse para que sean químicamente inertes y no afecten a la viabilidad o eficacia de las células de la invención y sean compatibles para la administración a un sujeto, tal como un ser humano. El experto en la técnica puede determinar fácilmente la cantidad de células y aditivos, vehículos y/o portadores opcionales en las composiciones que se van a administrar en los métodos de la invención.

Las células de la invención se pueden administrar en cualquier vehículo fisiológicamente aceptable. Las dosis adecuadas para la administración se describen en este documento. Una población celular que comprende células de la invención puede comprender una población purificada de células. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente el porcentaje de células en una población celular usando varios métodos bien conocidos, como se describe en este documento. Los rangos de pureza en las poblaciones celulares que comprenden células genéticamente modificadas de la invención pueden ser de aproximadamente 25% a aproximadamente 50%, de aproximadamente 30% a aproximadamente 50%, de aproximadamente 30% a aproximadamente 40%, de aproximadamente 40% a 50%, de aproximadamente 50% a aproximadamente 55%, de aproximadamente 55% a aproximadamente 60%, de aproximadamente 65% a aproximadamente 70%, de aproximadamente 70% a aproximadamente 75%, de aproximadamente 75% a aproximadamente 80%, de aproximadamente 80% a aproximadamente 85%; de aproximadamente 85% a aproximadamente 90%, de aproximadamente 90% a aproximadamente 95%, o de aproximadamente 95 a aproximadamente 100%. Se entiende que dicha población puede generarse de manera eficiente con los métodos de la invención, como se describe en la presente memoria, u opcionalmente enriquecerse para las células modificadas genéticamente que expresan un transgén, como se describe en la presente memoria. De acuerdo con la invención, el transgén codifica un CAR, y se entiende que tal población puede generarse eficientemente con los métodos de la invención, como se divulga en este documento, u opcionalmente enriquecerse para las células modificadas genéticamente que expresan un CAR, como se describe en este documento. Los expertos en la técnica pueden ajustar fácilmente las dosis; por ejemplo, una disminución de la pureza puede requerir un aumento de la dosificación.

Puede usarse un kit para la preparación de células de la invención. El kit puede comprender en uno o más contenedores: uno o más vectores para generar una célula T manipulada genéticamente que contiene un transgén integrado dentro de su genoma de manera que la expresión del transgén está bajo el control de un promotor endógeno de la célula T. De acuerdo con la invención, el transgén es un CAR, y el kit puede comprender uno o más vectores para generar una célula T manipulada genéticamente que exprese un CAR. En un ejemplo particular, el kit comprende en un recipiente un retrovirus gamma recombinante no integrante, como se describe en la presente memoria. El kit también puede contener un sistema de recombinación homóloga adecuado, como una nucleasa de dedo de zinc (ZFN), una nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción (TALEN), una proteína 9 (Cas9) asociada a repeticiones palindrómicas cortas agrupadas interespaciadas con regularidad (CRISPR), Cpf1, Meganuclease o Mega-Tal, preferiblemente en un recipiente separado. Los kits se pueden usar para generar células T manipuladas genéticamente a partir de células autólogas derivadas de un sujeto o de células no autólogas para administrar a un sujeto compatible. En otro ejemplo, los kits pueden comprender células de la invención para administración autóloga o no autóloga a un sujeto. En ejemplos específicos, el kit comprende las células T de la invención en uno o más contenedores.

En otro ejemplo, un kit puede comprender un retrovirus gamma recombinante que no se integra, como se describe en la presente memoria. En ejemplos específicos, el kit comprende el retrovirus gamma no integrante en uno o más contenedores.

5.8. Aspecto alternativo relacionado con los transgenes informadores

En un aspecto específico alternativo, una célula T tiene integrado en su genoma un transgén informador (opcionalmente en lugar de un transgén terapéutico), en donde la expresión del transgén informador está bajo el control de un promotor endógeno, que puede ser cualquiera de los promotores descritos aquí arriba. El transgén informador es un transgén que codifica una proteína marcadora detectable (preferiblemente de la superficie celular).

En otro ejemplo específico, el transgén informador codifica un interruptor de suicidio celular. En un ejemplo específico, el interruptor de suicidio celular es un receptor de EGF truncado (EGFRt), que permite tanto la detección como la eliminación, si es necesario, de la célula T terapéutica. Hay anticuerpos específicos (p. ej., cetuximab) que reconocen

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a este informador y desencadenan la muerte de células diana mediada por anticuerposin vivo(véase Patent U.S. No.

8.802.374). Así, por ejemplo, el transgén que codifica el EGFRt puede estar bajo el control de un promotor constitutivo o inducible endógeno, y después de la administración de la célula T manipulada al sujeto con fines terapéuticos, al sujeto se le puede administrar un anticuerpo que reconoce el EGFRt y desencadena la muerte celular de la célula T diseñada, para cerrar la actividad de la célula T cuando se desee después del tratamiento.

6. Ejemplos

6.1 Ejemplo 1: Generación en una sola etapade células T CAR universales.

A continuación se describe una estrategia para la generación en una sola etapa de células T CAR universales.

El método implica una estrategia de edición del genoma dos en uno para generar células T CAR universales con el CAR bajo el control del promotor TCR alfa. Para ello, se interrumpió la expresión de TCR direccionado un CAR al gen de la cadena constante alfa de TCR y se usó el promotor endógeno para expresar el CAR. Se diseñaron nucleasas adaptadas (TALEN y CRISPR/cas9) direccionadas al primer exón del gen TRAC, y se usó un vector AAV para promover la integración del CAR en marco con el gen TRAC mediante reparación homóloga dirigida (HDR).

Nucleasas adaptadas: TALEN y un ARNg fueron diseñados para direccionarse al primer exón en el gen TRAC. La secuencia direccionada se encuentra corriente arriba del dominio transmembrana del TCR alfa. Este dominio es necesario para el ensamblaje de TCR alfa y beta y para el direccionamiento a la superficie celular. La unión de extremos no homólogos (NHEJ) o la integración del CAR por HDR en este locus interrumpe de manera eficiente el complejo TCR.

Secuencia de TRAC-ARNg:

C*A*G*GGUUCUG GAUAUCUGUG UUUUAGAGCU AGAAAUAGCA

AGUUAAAAUA AGGCUAGUCC GUUAUCAACU UGAAAAAGUG GCACCGAGUC

GGUGCU*U*U*U (SEQ ID NO:24)

*2'-O-metil 3' fosforotioato

Secuencia objetivo de TALEN (espaciador subrayado):

TTGTCCCACAGATATCC AGAACCCTGACCCTG

CCGTGTACCAGCTGAGA (SEQ ID N 0 25)

ARN mensajero: Los plásmidos que codifican TALEN fueron sintetizados por Transposagen y linealizados con AgeI. El ARNm de TALEN se transcribió y poliadenilóin vitroutilizando el kit mMessage mMachine T7 Ultra (Life Technologies; Carlsbad, CA). El ARN se purificó con columnas RNeasy (Qiagen; Valencia, CA) y se cuantificó utilizando la máquina Nanodrop. La calidad del ARN se verificó en un gel de agarosa MOPS/formaldehído desnaturalizante. Los ARN guía modificados (ARNg) y el ARNm de Cas9 fueron sintetizados por TriLink Biotechnologies. Los ARNg se reconstituyeron a 1 ug/ul en rgulador T de citoporación (Harvard Apparatus; Holliston, MA).

AAV: Para direccionamiento de TRAC (véase Figura 1A), basado en una columna vertebral pAAV-GFP (Cellbiolabs; San Diego, CA), el pAAV-TRAC-P2A-1928z fue diseñado y clonado conteniendo 1,9kb de TRAC genómico (amplificado por PCR) que flanquea las secuencias de direccionamiento de TALEN y ARNg, un péptido P2A autoescindible en marco con el primer exón de TRAC, seguido por el CAR 1928z utilizado en ensayos clínicos (Brentjens et al.,Sci. Transí. Med.5(177):177ra38. doi: 10.1126/scitranslmed.3005930 (2013)). En resumen, el CAR comprende un fragmento variable de cadena única 19scFV, específico para el CD19 humano precedido por un péptido líder CD<8>a y seguido por regiones intracelulares transmembrana-bisagra CD28 y un dominio intracelular CD3Z. El casete termina con la señal poliA de la hormona de crecimiento bovina (BGHpA).

Células: Se obtuvieron capas leucocitarias de donantes voluntarios sanos del New York Blood Center. Las células mononucleares de sangre periférica se aislaron mediante centrifugación en gradiente de densidad y los linfocitos T se purificaron luego usando el kit de aislamiento de células T Pan (Miltenyi Biotech; San Diego, CA). Las células se activaron con Dynabeads (1:1 perlas:Célula) Activador T Humano CD3/CD28 (ThermoFisher; Carlsbad CA) en medio X-vivo 15 (Lonza; Basilea, Suiza) complementado con suero humano (Gemini Bioproducts; West Sacramento, CA).) con 200 U/ml de IL-2 (Miltenyi Biotech) a una densidad de 10<6>células/ml. El medio se cambió cada 2 días y las células se volvieron a sembrar a<1 0 6>células/ml.

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Direccionamiento genético: Después de una activación de 48 h, las perlas de CD3/CD28 se retiraron magnéticamente y las células se cultivaron en ausencia de perlas durante 12-16 horas. Los linfocitos T se transfectaron mediante electrotransferencia de ARN TALEN o Cas9/ARNg utilizando un sistema AgilePulse MAX (Harvard Apparatus). En resumen, las células se lavaron en medio de citoporación T (Harvard Apparatus). Luego, las células se sedimentaron, se resuspendieron en medio de citoporación T a 3o * 10<6>células/ml. Se mezclaron 3*10® células con la dosis indicada de cada ARNm que codifica las nucleasas adaptadas en una cubeta de 0,2 cm. La electroporación consistió en dos pulsos de 0,1 ms a 600 V seguidos de cuatro pulsos de 0,2 ms a 100 V. Después de la electroporación, las células se diluyeron en medio de cultivo y se incubaron a 37 °C, CO<2>al 5 %. Se añadió AAV al cultivo de 2 a 4 horas después de la electroporación, seguido de una incubación continua a 30 °C durante 20 horas adicionales. El donante de AAV se añadió a la MOI indicada (1e5 a 1e6 MOI). Posteriormente, las células editadas se cultivaron en condiciones estándar (37 °C y se expandieron en medio de cultivo de células T, se reabastecieron según fuera necesario para mantener una densidad de ~1e6 células/ml cada 2 o 3 días).

Estas condiciones son altamente reproducibles entre los donantes y dieron como resultado hasta un 50 % de células T TCR-/CAR+ en una sola etapa tanto con TALEN como con CRISpR.

Para obtener células T negativas para TCR, las células T positivas para TCR se extrajeron del cultivo usando microperlas magnéticas PE-anti-TCRab y anti-PE y columnas LS (Miltenyi Biotech).

Constructos de vectores retrovirales y producción retroviral: Plásmidos que codifican el vector retroviral<y>SFG (Riviére et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA92(15):6733-6737 (1995)) se prepararon usando técnicas estándar de biología molecular. La síntesis de SFG-1928z y SFG-P28z se ha descrito previamente (Brentjens et al.,Nat Med.9(3):279-286 (2003), Brentjens et al., 2007Clin. Cáncer Res.13(18 Pt 1):5426-5435 (2007); Maher et al.,Nat. Biotechnol.20(1):70-5 (2002)). Se usaron sobrenadantes retrovirales pseudotipados de VSV-G derivados de fibroblastos gpg29 transducidos (H29) para construir líneas celulares productoras de retrovirales estables como se describió previamente (Gong et al.,Neoplasia1:123-127 (1999)).

Transducción retroviral: Las células T se transdujeron en dos días consecutivos mediante centrifugación en placas unidas al vector oncoretroviral recubiertas con retronectina (Takara; Mountain View, CA).

Ensayos de citotoxicidad: La citotoxicidad de las células T transducidas con CAR se determinó mediante un ensayo estándar basado en luciferasa. En resumen, NALM<6>que expresa luciferasa-GFP de luciérnaga sirvió como células diana. Las células efectoras (E) y diana tumorales (T) se cocultivaron por triplicado en la relación E/T indicada utilizando placas de 96 pocillos de paredes negras con 1*10<5>células diana en un volumen total de 100 pl/pocillo en medio NALM<6>. Las células diana solas se colocaron en placas a la misma densidad celular para determinar la expresión máxima de luciferasa (unidades relativas de luz; RLUmáx). 18 h más tarde, se añadieron directamente a cada pocillo 100 pl de sustrato de luciferasa (Bright-Glo, Promega; Madison, WI). La luz emitida se detectó en un lector de placas de luminiscencia o en el sistema de imágenes Xenogen IVIS (Xenogen; Alameda, CA) y se cuantificó utilizando el software Living Image (Xenogen). La lisis se determinó como [1 - (RLUmuestra)/(RLUmáx)] * 100.

Modelo de tumor sistémico de ratón: El modelo de ratón utilizado fue un ratón NOD.Cg-PrkdescidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) de<8>a 12 semanas de edad (Jackson Laboratory; Bar Harbor, ME), según un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de MSKCC. Los ratones fueron inoculados con 0,5 * 10® células FFLuc-GFP NALM<6>mediante inyección en la vena de la cola, seguida de 2 * 10<5>células T CAR inyectadas cuatro días después. NALM<6>produce cargas tumorales muy uniformes y no se excluyó a ningún ratón antes del tratamiento. No se utilizó ningún método de cegamiento. Las imágenes de bioluminiscencia utilizaron el sistema de imágenes Xenogen IVIS (Xenogen) con el software Living Image (Xenogen) para la adquisición de conjuntos de datos de imágenes. La carga tumoral se evaluó como se describió anteriormente (Gade et al., Cancer Res. 65(19):9080-9088 (2005)).

La Figura 1A muestra un esquema de la integración específica inducida por nucleasas adaptadas (TALEN o CRISPR/Cas9) en el locus de la constante alfa de TCR (TRAC). El constructo de direccionamiento (AAV<6>) contiene el gen CAR flanqueado por secuencias de homología (brazo homólogo izquierdo, LHA y brazo homólogo derecho, RHA). Una vez que la expresión CAR integrada es impulsada por el promotor endógeno TCRa mientras que el locus TRAC está interrumpido (TRAV: región variable de TCR alfa; TRAJ: región de unión de TCR alfa; 2A: la secuencia de teschovirus porcino 2A autoescindible; pA: secuencia PoliA de la hormona de crecimiento bovina). La Figura 1B muestra un gráfico de flujo TCR/CAR representativo 5 días después de la transfección de células T con ARNm TRAC TALEN y adición de AAV<6>en el MOI indicado. Como se muestra en la Figura 1B, la expresión de CAR aumentó y la expresión de TCR disminuyó al aumentar la MOI de AAV. La Figura 1C muestra un gráfico de barras del porcentaje de interrupción de TCR (KO: inactivación) y la integración dirigida (KI: activación) según el MOI de AAV<6>. Los porcentajes se evaluaron mediante análisis FACS. La Figura 1D muestra la intensidad media de fluorescencia (MFI) de expresión de CAR promedio 5 días después de la vectorización de CAR en células T (n =<6>a<8>experimentos independientes). Los resultados muestran que la integración dirigida de CAR en el locus TRAC dio como resultado una población homogénea de células T con niveles de expresión similares de CAR. La Figura 1E muestra el coeficiente de variación de las células T CAR+ que miden la dispersión en la expresión de CAR (relación entre la desviación estándar y la media). TRAC-P2A-1928z: integración dirigida en TRAC. SFG-1928z: integración semialeatoria utilizando el retrovirus SFG. ****p < 0,0001 (prueba T no pareada). Estos resultados muestran que la integración

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dirigida de CAR en el locusTRACdio como resultado una población homogénea de células T con expresión similar.

La Figura 2A muestra el análisis de citometría de flujo que muestra la expresión de CAR y TCR. TRAC-P2A-1928z se generaron como en la Figura 1. Las células TCR- generadas por TALEN se transdujeron con retrovirus SFG-1928z. Las células TCR+ se transdujeron con retrovirus SFG-1928z o SGF-P28z. La Figura 2B muestra los recuentos celulares acumulados de las células T CAR indicadas tras la estimulación semanal con células diana CD19+, lo que muestra que las células que expresan 1928z exhibieron proliferaciónin vitro.La Figura 2C muestra la actividad citotóxica utilizando un ensayo de bioluminiscencia de 18 h, utilizando NALM<6>que expresa luciferasa de luciérnaga (FFL) como células diana. Las células que expresan 1928z exhibieron actividad citotóxica. Las Figuras 2D y 2E muestran que los ratones portadores de FFL-NALM<6>fueron tratados con 2 * 10<5>células T CAR. La carga tumoral se muestra como señal bioluminiscente cuantificada por animal cada semana durante un período de 40 días. La cuantificación es el recuento de fotones promedio de las adquisiciones ventrales y dorsales por animal en todos los puntos de tiempo dados, y se expresa como brillo. Cada línea en la Figura 2E representa un ratón, n = 7 ratones por grupo. La figura inferior derecha es el análisis de Kaplan-Meier de supervivencia de ratones en las Figuras 2D y 2<e>. Estos resultados demuestran que la integración direccionada de un CAR en TRAC dio como resultado una supervivencia significativamente más prolongada que con la integración semialeatoria usando el retrovirus SFG.

En conjunto, estos resultados muestran que, a una dosis equivalente de células T CAR inyectadas, las células con CAR dirigidas al locus TRAC son mucho más potentes que las células transducidas retroviralmente con CAR.

Como se describió anteriormente, se desarrolló una estrategia para la generación en una sola etapa de células T CAR universales al mediante direccionamiento de la integración de un casete del gen CAR sin promotor en el primer exón de la cadena constante de TCR alfa (TRAC). Esto da como resultado la expresión de CAR bajo el control del promotor de TCR alfa endógeno con la alteración concomitante de la expresión del gen de TCR alfa. Como se requieren todos los componentes del complejo TCR para su localización en la membrana citoplasmática, la interrupción del TCR alfa da lugar a células TCR negativas. Este enfoque es adecuado con las plataformas de edición del genoma comúnmente utilizadas (por ejemplo, TALEN, CRISPR/Cas9, ZFN) y da como resultado una recombinación homóloga en el sitio de diana de TRAC usando una plantilla de donante AAV en células T. Se comparó la eficacia de TALEN y CRISPR/Cas9 para promover la recombinación homóloga utilizando la plantilla de donante AAV<6>en células T. Se establecieron condiciones que producían hasta un 50 % de células T CAR universales que combinaban la interrupción del gen diana y la inserción direccionada de CAR en una sola etapa. La integración dirigida del transgén CAR se confirmó molecularmente, lo que da como resultado una expresión CAR altamente homogénea y estable en células T de sangre periférica humana. Estas células T exhibieron la misma actividadin vitrode lisis tumoral y proliferación que las células T CAR transducidas retroviralmente, lo que respalda su utilidad en la actividad antitumoralin vivo.El promotor endógeno TCR alfa proporcionó beneficios inesperados. El método proporcionó una expresión de CAR altamente homogénea y estable en células T de sangre periférica humana y también mejoró la persistencia de las células T. Lo que es más importante, estas células T exhibieron una mayor actividadin vitroein vivode lisis tumoral, proliferación y persistencia que las células T CAR transducidas retroviralmente, mientras que su potencial de enfermedad de injerto contra huésped se eliminó al reducir o prevenir la expresión de un complejo receptor de células T funcional en la superficie de la célula. El proceso descrito en este documento, que combina la escalabilidad de la fabricación universal de células T con la uniformidad y la seguridad de la integración específica del gen CAR, es útil para el desarrollo de terapia con CAR lista para uso que se puede ampliar y proporcionar fácilmente a los pacientes, según sea necesario.

6.2 Ejemplo 2: El direcionamiento de un CAR al locus TRAC con CRISPR/Cas9 potencia el rechazo de tumores.

Este ejemplo muestra que se llevó a cabo la expresión por parte de una célula T de un CAR codificado por un transgén, en donde la expresión del transgén estaba bajo el control de un promotor endógeno de células T, específicamente el promotor de la cadena a del receptor de células T humanas (TRAC). A continuación se describen experimentos que muestran que el direccionamiento de un CAR específico de CD19 al locus de la cadena a del receptor de células T humanas (TRAC) no solo da como resultado una expresión uniforme de CAR en células T de sangre periférica humana, sino que también mejora la potencia de las células T, con células editadas que superan ampliamente a las células T CAR generadas convencionalmente en un modelo de ratón de leucemia linfoblástica aguda. Se demuestra además que el direccionamiento del CAR al locus TRAC evita la señalización tónica de CAR y establece la internalización y la reexpresión efectivas de CAR después de una exposición única o repetida al antígeno, lo que retrasa la diferenciación y el agotamiento de las células T efectoras. Estos hallazgos descubren facetas de la inmunobiología de CAR y subrayan el gran potencial de la edición del genoma CRISPR/Cas9 para avanzar en las inmunoterapias.

Métodos.Guía-ARN: Se diseñó un ARN guía (ARNg) para direccionar el primer exón de la cadena constante del gen TCRa (TRAC). La secuencia direccionada se encuentra corriente arriba del dominio transmembrana del TCR alfa. Este dominio es necesario para el ensamblaje alfa y beta de TCR y para el direccionamiento a la superficie celular. Tanto la unión de extremos no homólogos (NHEJ) como la integración de CAR por HDR en este locus interrumpirían eficientemente el complejo TCR.

Para el B2M, se diseñaron tanto un ARNg como un TALEN (nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción) direccionados al primer exón del gen B2M, y se obtuvo una mayor eficiencia de corte con el TALEN. Se usó el mismo protocolo, se obtuvo una citotoxicidad y una especificidad similares para ambos métodos, y las células

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T CAR obtenidas no fueron discernibles en términos de actividad y proliferación. Por razones de fabricación el B2M TALEN se utilizó principalmente en este estudio.

Secuencia de TRAC-ARNg:

C*A*G*GGUUCUG GAUAUCUGUG UUUUAGAGCU AGAAAUAGCA

AGUUAAAAUA AGGCUAGUCC GUUAUCAACU UGAAAAAGUG GCACCGAGUC

GGUGCU*U*U*U (SEQ ID NO:26)

Secuencia de B2M-ARNg:

G*G*C*CACGGAG CGAGACAUCU UUUUAGAGCU AGAAAUAGCA AGUUAAAAUA AGGCUAGUCC GUUAUCAACU UGAAAAAGUG GCACCGAGUC

GGUGCU*U*U*U (SEQ ID NO:27)

*2'-O-metil 3' fosforotioato

Secuencia de direccionamiento de B2M-TALEN:

TTAGCTGTGCTCGCGC (TACTCTCTCTTTCTG) GCCTGGAGGCTATCCA

(SEQ ID NO.28).<Efector j a l izquierdo (espaciador) Efector TAL derecho.>

ARN mensajero: Los ARN guía modificados (ARNg) y el ARNm de Cas9 fueron sintetizados por TriLink Biotechnologies (San Diego, CA). Los ARN guía se reconstituyeron a 1 pg/pL en regulador T de citoporación (Harvard Apparatus; Holliston, MA).

AAV: Basado en una columna vertebral pAAV-GFP (Cell Biolabs; San Diego, CA), el pAAV-TRAC-1928z fue diseñado y clonado conteniendo 1,9kb de TRAC genómico (amplificado por PCR) que flanquea las secuencias de direccionamiento de ARNg, un péptido P2A autoescindible en marco con el primer exón de TRAC seguido por el 1928z CAR utilizado en ensayos clínicos (Brentjens et al., Sci. Trans. Med. 5:177ra138 (2013)). En resumen, el CAR comprende un fragmento variable de cadena única 19scFV específico para el CD19 humano precedido por un péptido líder CD<8>a y seguido por regiones intracelulares transmembrana-bisagra CD28 y un dominio intracelular CD3Z. El ADNc de<c>A<r>es seguido por la señal poliA de la hormona de crecimiento bovina (bGHpA). Al direccionar el locus de B2M, se siguió una estrategia similar, excepto que no se requirió la secuencia P2Aya que la secuencia 1928z-pA se colocó en marco en el ATG del gen B2M. Cuando se utilizan promotores exógenos (EF1a, LTR, PGK o PGK100), el casete promotor-1928z-pA se colocó en orientación inversa al mismo TRAC o puntos de entrada de B2M.

Células: Se obtuvieron capas leucocitarias de donantes voluntarios sanos del New York Blood Center. Las células mononucleares de sangre periférica se aislaron mediante centrifugación en gradiente de densidad, y luego los linfocitos T se purificaron usando el kit de aislamiento de células T Pan (Miltenyi Biotech; San Diego, CA). Las células se activaron con Dynabeads (1:1 perlas:célula) Activador T Humano CD3/CD28 (ThermoFisher; Carlsbad, CA) en medio X-vivo 15 (Lonza; Basilea, Suiza) complementado con suero humano al 5 % (Gemini Bioproducts; West Sacramento, CA) con 200 U/ml de IL-2 (Miltenyi Biotech) a una densidad de 10<6>células/ml. El medio se cambió cada<2>días y las células se volvieron a sembrar a<1 0 6>células/ml.

Direccionamiento genético: 48 horas después de iniciar la activación de las células T, las perlas CD3/CD28 se retiraron magnéticamente y las células T se transfectaron mediante electrotransferencia de ARNm Cas9 y ARNg utilizando un sistema AgilePulse MAX (Harvard Apparatus). Se mezclaron 3*10® células con 5 pg de Cas9 y 5 pg de ARNg en una cubeta de 0,2 cm. Después de la electroporación, las células se diluyeron en medio de cultivo y se incubaron a 37 °C/5 % CO<2>. El vector donante AAV<6>recombinante (fabricado por SignaGen; Gaithersburg, MD) se añadió al cultivo de 2 a 4 horas después de la electroporación, a la MOI indicada (rango de 1 * 10<5>a 1*106). Posteriormente, las células editadas se cultivaron utilizando condiciones estándar (37 °C y se expandieron en medio de crecimiento de células T, se repusieron según fuera necesario para mantener una densidad de ~1*10<6>células/ml cada 2 o 3 días).

Para células T negativas para TCR, las células T positivas para TCR se extrajeron del cultivo usando microperlas magnéticas de biotina-anti-TCRap y antibiotina y columnas LS (Miltenyi Biotech). Para obtener detalles sobre los constructos de direccionamiento y estrategias, véase las Figuras 7 y 14.

Constructos de vectores retrovirales, producción y transducción retrovirales: los plásmidos que codifican el vector SFG

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Y-retroviral (RV) (Riviére et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA92:6733-6737 (1995)) se prepararon como se describió anteriormente (Brentjens et al.,Nat. Med.9, 279-286, (2003); Maher et al.,Nat. Biotechnol.20:70-75 (2002)). Se usaron sobrenadantes retrovirales pseudotipados de VSV-G derivados de fibroblastos gpg29 transducidos (H29) para construir líneas celulares productoras de retrovirales estables como se describió previamente (Gong et al., Cancer patient T cells genetically targeted to prostate-specific membrane antigen specifically lyse prostate cancer cells and release cytokines in response to prostate-specific membrane antigen.Neoplasia1:123-127 (1999)). Las células T se transdujeron por centrifugación en placas recubiertas con retronectina (Takara).

Líneas celulares: NALM<- 6>y NIH/3T3 se obtuvieron de ATCC y se probaron regularmente para detectar contaminación por micoplasma utilizando el kit de detección de micoplasma MycoAlert (Lonza). Las células NALM<- 6>se transdujeron para expresar luciferasa-GFP de luciérnaga y las células NIH/3T3 se transdujeron para expresar CD19 humano (Brentjens et al.,Nat. Med.9, 279-286, (2003); Zhao et al.,Cancer Cell28:415-428 (2015)).

Ensayos de citotoxicidad: La citotoxicidad de las células T transducidas con CAR se determinó mediante un ensayo estándar basado en luciferasa. En resumen, NALM<- 6>que expresa luciferasa-GFP de luciérnaga sirvió como células diana. Las células efectoras (E) y diana tumorales (T) se cocultivaron por triplicado en la relación E/T indicada utilizando placas de 96 pocillos de paredes negras con 1*10<5>células diana en un volumen total de 100 pl/pocillo en medio NALM-<6>. Las células diana solas se colocaron en placas a la misma densidad celular para determinar la expresión máxima de luciferasa (unidades relativas de luz; RLUmáx). 18 h más tarde, se añadieron directamente a cada pocillo 100 pl de sustrato de luciferasa (Bright-Glo, Promega; Madison, WI). La luz emitida se detectó en un lector de placas de luminiscencia o en el sistema de imágenes Xenogen IVIS (Xenogen; Alameda, CA) y se cuantificó utilizando el software Living Image (Xenogen). La lisis se determinó como [1 - (RLUmuestra)/(RLUmáx)] * 100.

Ensayos de estimulación y proliferación de antígenos: NIH/3T3 que expresan CD19 humano se utilizaron como células presentadoras de antígenos artificiales (Brentjens et al.,Nat. Med.9, 279-286, (2003)). Para estimulaciones semanales, se sembraron 3 x 105 AAPC CD19+ irradiadas en placas de 24 pocillos 12 horas antes de la adición de 5 x 10<5>células T CAR en X-vivo 15 suero humano 50U IL-2/mL. Cada 2 días se contaron las células y se añadió medio hasta alcanzar una concentración de 1*10<6>células T/mL. Para estimulaciones proximales repetidas (Figura<6>D), las células se transfirieron a un nuevo pocillo sembrado con 3T3-CD19 después de 24 h (2 estimulaciones) o cada 12 h (4 estimulaciones). Para cada condición, las células T se contaron y analizaron mediante FACS para CAR, expresión de marcadores fenotípicos y de agotamiento cada<1 2>horas.

Anticuerpos y tinción intracelular: CAR se marcó con un Fab anti-ratón de cabra (Jackson ImmunoResearch, 115-606 003; West Grove, PA). Para el fenotipado de células T, se usaron los siguientes anticuerpos: ratón antihumano BUV-395CD4 (563552), APC-cy7-CD8 (557834), BV-421-CD62L (563862), BV-510-CD279 (PD1, 563076) de BD biosciences (San José, CA); APC-CD25 antihumano de ratón (17-0259-42), FITC-CD45RA (11-0458-42), PerCP-eFluor710<c>D223 (LAG-3, 46-2239-42) de eBiosciences (Carslbad, CA), y<c>D366 antihumano de ratón FITC (TIM-3, 345032) de Biolegend (San Diego, CA). Para la tinción intracelular, las células T se fijaron y permeabilizaron utilizando el kit BD Cytofix/Cytoperm Plus (BD Biosciences) según la recomendación del fabricante. Para la tinción extracelular se utilizaron anti-CD<8>-FITC (clon HIT<8>a, ebiosciencce) y anti-CD4-BUV-395 (clon SK3, BD Horizon; BD Biosciences). Para la tinción intracelular se utilizaron anti TNF-Alexa Fluor 700 (clon MAb11, BD pharmingen; BD Biosciences), anti-IL2-BV421 (clon 5344.111, BD Horizon) y anti-IFNg-BV510 (clon B27, BD Horizon).

Modelo de tumor sistémico de ratón: Se utilizaron ratones macho NOD/SCID/IL-2Ry-null (NSG) de<8>a 12 semanas de edad (Jackson Laboratory), bajo un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del MSKCC. Los ratones fueron inoculados con 0,5 * 10<6>Células FFLuc-GFP NALM<- 6>mediante inyección en la vena de la cola, seguida de 2 * 105, 1*10<5>o 5*104, células T CAR inyectadas cuatro días después. NALM<- 6>produce cargas tumorales muy uniformes y no se excluyó a ningún ratón antes del tratamiento. No se utilizaron métodos de aleatorización o cegamiento. Las imágenes de bioluminiscencia utilizaron el sistema de imágenes Xenogen IVIS (Xenogen) con el software Living Image (Xenogen) para la adquisición de conjuntos de datos de imágenes. La carga tumoral se evaluó como se describió previamente (Gade et al.,Cancer Res.65:9080-9088 (2005))).

Extracción de ARN y PCR cuantitativa en tiempo real: El ARN total se extrajo de las células T utilizando el kit RNeasy (QIAGEN; Hilden, Alemania) combinado con QIAshredder (QIAGEN), siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración y la calidad del ARN se evaluaron mediante espectroscopia UV utilizando el espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Fisher Scientific; Carslbad, CA). Se usaron de 100 a 200 ng de ARN total para preparar ADNc usando SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen; Carlsbad, CA), con una relación de volumen de 1:1 de hexámeros aleatorios y oligo dT. Las reacciones de síntesis de ADNc completadas se trataron con 2U de RNasa H durante 20 min a 37 °C. La PCR cuantitativa se realizó con ABsolute Blue qPCR SYBR Green Low ROX Mix (Thermo Fisher Scientific) y los siguientes conjuntos de cebadores: Ribosomal 18S: 5'-aacccgttgaaccccatt directo (SEQ ID NO: 29), 5'-ccatccaatcggtagtagcg inverso (SEQ ID NO: 30); 1928z: 5'-cgtgcagtctaaagacttgg directo (SEQ ID NO: 31), 5'-ataggggacttggacaaagg inverso (SEQ ID NO: 32); T-bet: 5'-gaaacccagttcattgccgt directo (SEQ ID NO: 33), 5'-ccccaaggaattgacagttg inverso (Se Q ID NO: 34); EOMES: 5'-actggttcccactggatgag directo (SEQ ID NO: 35), 5'-ccacgccatcctctgtaact inverso (SEQ ID NO: 36); GATA3: 5' - cacaaccacactctggagga directo (SEQ ID NO:37), 5'-ggtttctggtctggatgcct inverso (SEQ ID NO:38). Los ensayos de PCR se realizaron en el QuantStudio™ 7 Flex System (Thermo Fisher Scientific) y los valores de Ct se obtuvieron con el software QuantStudio Real-Time PCR. Los cambios

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relativos en la expresión génica se analizaron con el método 2ññCt. Los niveles de expresión de ARN se normalizaron al porcentaje de células T CAR+ para cada grupo de células T analizadas.

Estadísticas: Todos los datos experimentales se presentan como media ± sem. No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra. Los grupos se compararon mediante la prueba t de dos muestras de Welch para datos paramétricos (tamaño de muestra > 10) o la prueba de Mann-Whitney para datos no paramétricos (tamaño de muestra < 10). Se utilizó la corrección de Welch, ya que las varianzas no eran iguales. Para la comparación de MFI CAR y el nivel de ARN tras la estimulación con CAR, se usaron pruebas ANOVA F. El análisis estadístico se realizó en el software GraphPad Prism 7 (GraphPad Software; La Jolla, CA).

Para interrumpir el locus TRAC y colocar el CAR 1928z (Brentjens et al.,Sci. Transí. Med.5, 177ra138 (2013)) bajo su control transcripcional (TRAC-CAR), se diseñó un ARN guía direccionado al extremo 5' del primer exón de TRAC y una matriz de reparación de vector de virus adenoasociado (AAV) que codifica un péptido P2A autoescindible seguido del ADNc de CAR (Figura 3A y Figura 7A). La electroporación de células T de ARNm Cas9 y ARNg produjo una alta frecuencia de inactivación (KO) (~ 70%, Figura 3B y Figura 7D) sin muerte celular limitada. La activación (KI) fue proporcional a la dosificación de AAV, superando el 40% a una multiplicidad de infección (MOI) de 106 (Figura 3B y Figuras 7C y 7E). Este direccionamiento eficiente, informado aquí por primera vez en el locus TRAC, es comparable a los niveles alcanzados en las células T en los loci AAVS1, CCR5 o CD40L (Sather et al.,.Sci. Transí. Med.

7:307ra156 (2015); Wang et al.,Nucleic Acids Res.44:e30 (2016); Hubbard et al.,Blood127:2513-2522 (2016)). Aproximadamente el 95 % de las células CAR+ eran negativas para el receptor de células T (TCR) (Figura 7G), lo que validaba la estrategia de eliminación de TCR 2 en 1 y de activación de CAR. El 5% observado de células CAR+/TCR+ es consistente con la frecuencia típica de células T que expresan dual-TCRa (Corthay et al.,J. Autoimmun.16:423-429 (2001)). La especificidad de direccionamiento se confirmó mapeando la integración del vector AAV en todo el genoma (de Vree et al.,Nat. Biotechnol.32:1019-1025 (2014)), que confirmó la alta selectividad para la integración de TRAC y la ausencia de puntos críticos fuera del objetivo (Figura<8>). Estos resultados demuestran la alta eficiencia y precisión del direccionamiento de genes que ofrece CRISPR/Cas9 y nuestra capacidad para generar reproduciblemente hasta 50*106 de células T TRAC-CAR. Se encontró una expresión homogénea y consistente de TRAC-CAR en múltiples donantes, en contraste con CAR codificado retroviralmente (RV-CAR), que mostró una expresión variada con una expresión media dos veces mayor (Figuras 3C y 3D).

Los estudios funcionalesin vitrono revelaron diferencias notables entre 1928z codificado por TRAC e integrado aleatoriamente, en términos de citotoxicidad o proliferación de células T en respuesta a la estimulación semanal con células presentadoras de antígeno CD19+ (Brentjens et al.,Nat. Med.9:279-286 (2003)) (Figuras 9A y 9C). Estos experimentos incluyeron un grupo de control donde las células T alteradas por TCR que expresaban CAR transducido retroviralmente (RV-CAR-TCR-) respondieron de manera similar a las células T RV-CAR TCR+ (Figura 9A).In vivo,sin embargo, en el modelo de ratón NALM<- 6>de leucemia linfoblástica aguda pre-B que utiliza la "prueba de estrés CAR", en las que la dosificación de células T CAR se reduce gradualmente para revelar los límites funcionales de diferentes poblaciones de células T (Brentjens et al.,Nat. Med.9:279-286 (2003); Zhao et al.,Cancer Cell28:415-428 (2015)), las células T TRAC-CAR, R<v>-<c>A<r>y RV-CAR-TCR diferían notablemente en su actividad antitumoral. Las células T TRAC-CAR indujeron respuestas mucho mayores y prolongaron notablemente la mediana de supervivencia en cada dosis de células T (Figura 3E y Figura 10A). La interrupción de TCR no tuvo un efecto perceptible sobre la potencia de las células T RV-CAR. Estudios de médula ósea en ratones inyectados con 1*10<5>células T CAR mostraron una acumulación similar de células T en el sitio del tumor después de 10 días (Figura 3F). Sin embargo, solo las células T TRAC-CAR lograron el control del tumor (Figuras 3G y 3H). Para el día 17, las células T TRAC-CAR superaron en número a las células T RV-CAR, ya que estas últimas disminuyeron en relación con el día 10, a pesar de la presencia continua de células tumorales CD19+ (Figura 3F-3G y Figura 10B). Además, los grupos de células T con CAR diferían en su grado de diferenciación y agotamiento de células T, como se refleja en la proporción de células efectoras terminales (CD45RA+CD62L-) y la acumulación de PD1, LAG3 y TIM3 coexpresados (Blackburn et al.,Nat. Immunol.10:29-37 (2009)), respectivamente. Por lo tanto, las células T CAR convencionales mostraron hasta un 50 % de expresión positiva de los marcadores de agotamiento en el día 17, en contraste con menos del 2 % de las células T TRAC-CAR, que también retuvieron una mayor composición de memoria efectora (Figuras 3I-3J y Figuras 10C-10D). La diferenciación terminal y la adquisición de este fenotipo de agotamiento es consistente con una actividad antitumoral disminuida (Gattinoni et al.,Nat. Med.17:1290-1297 (2011)). Curiosamente, la expresión de CAR en las células T de la médula ósea fue similar a los niveles previos a la infusión para las células T TRAC-CAR, pero disminuyó en ambos grupos de RV-CAR (Figura 10E). Es importante destacar que la expresión en la superficie celular del informador LNGFR mutante (Gallardo et al.,Gene Ther.4:1115-1119 (1997)) (coexpresado a través de un elemento 2A autoescindible) no disminuyó, descartando el silenciamiento del vector como la explicación de la disminución de la expresión de CAR (Figuras 10G-10H). El nivel de expresión de CAR medido en células T RV-CAR se correlacionó negativamente con la carga tumoral (Figura 10I), lo que sugiere que CAR en la superficie celular estaba subregulado en proporción al antígeno tumoral. Por lo tanto, estos hallazgosin vivono solo demostraron la actividad antitumoral superior de las células T TRAC-CAR, sino que también forjaron un vínculo entre el control del tumor, la diferenciación y el agotamiento de las células T y los niveles de expresión de CAR. Estos mismos patrones se observaron con otro CAR, 19BBz, que utiliza el dominio citoplásmico 4-1Bcomo su fracción coestimuladora (Figura 11).

Para analizar más a fondo el impacto de los niveles de expresión de CAR en la función de las células T, primero examinamos el fenotipo de las células T cuando se cultivaron en ausencia o presencia de antígeno (Figura 4). Cinco

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días después de la transducción, las células T RV-CAR ya mostraban evidencia de activación, agotamiento y diferenciación (Figura 4A y Figura 12A), resultados similares a los obtenidos con un CAR22 administrado retroviralmente descrito anteriormente. Por el contrario, las células T TRAC-CAR mantuvieron un fenotipo análogo al de las células T no transducidas (Figura 4A), compuesto principalmente por células ingenuas y de memoria central (células CD62L+), un fenotipo asociado con una mayor actividad antitumoralin vivo(Gattinoni et al., Nat. Med.

17:1290-1297 (2011); Sommermeyer et al., Leukemia 30:492-500 (2016)). Consistente con la señalización de activación constitutiva, encontramos que los RV-CAR, pero no los TRAC-CAR, tenían motivos de activación detirosina de base inmune fosforilados (Long et al., Nat. Med. 21:581-590 (2015)) (Figuras 4B y 4C). Se observaron diferencias adicionales tras la exposición al antígeno. En contraste con las células T TRAC-CAR, las células T RV-CAR estimuladas 1, 2 o 4 veces en un período de 48 horas se diferencian en células T efectoras, identificadas en base al fenotipo (pérdida de CD62L), secreción de citoquinas (incremento de IFNy, IL2 y TNFa) y expresión de factores de transcripción maestros (aumento de T-bet, EOMES y GATA3) (Figuras 4D-4E y Figuras 12B-12D). Estos resultados indicaron que la eficacia mejorada de las células T TRAC-CAR está relacionada con su nivel de expresión de CAR al reducir la señalización tónica y retrasar la diferenciación de las células T tras la estimulación.

Para controlar la expresión de CAR, primero se intentó variar el número de copias del vector retroviral. La eficiencia de transferencia de genes reducida solo afectó modestamente el nivel de expresión de CAR (Figura 13). Curiosamente, incluso cuando la expresión media de RV-CAR coincidía con la de TRAC-CAR, la primera aún mostraba una diferenciación acelerada en múltiples estimulaciones, lo que sugiere que la regulación dinámica de la expresión de CAR, y no solo la expresión de referencia, promueve características funcionales distintas.

Para definir aún más la importancia de los niveles de expresión de CAR, se generaron células T que expresaban CAR de diferentes loci genómicos y promotores. Para examinar la contribución específica del locus TRAC y su promotor, se diseñaron otros siete constructos direccionados al CAR 1928z al TRAC o al locus p2-microglobulina (B2M) (gen relacionado con MHC-I que se sabe que se expresa en todas las células T), usando promotores endógenos o exógenos (Figuras 5A-5B y Figuras 14A-14E). Las células T CAR diseñadas se diseñaron con éxito en ambos loci, logrando una expresión de c Ar homogénea con niveles medios que van desde siete veces más bajos (B2M-PGK100) a más del doble (TRAC-EF1a) del promotor endógeno TRAC-CAR (Figuras 5C-5E y Figura 14).

Todas las combinaciones que otorgaron una mayor expresión de CAR que TRAC-CAR mostraron la firma de señalización tónica, en marcado contraste con aquellas que proporcionaron una expresión más baja, en consonancia con un estudio anterior que vincula el nivel de expresión con la señalización independiente de antígenos (Frigault et al.,Cáncer Immunol Res.3:356-367 (2015)) (Figura 5E y Figura 14F). Se seleccionaron tres de estos para un análisis en profundidad: TRAC-EF1a de alta expresión y B2M-CAR y TRAC-LTR (potenciador-promotor de RV) de baja expresión, comparando su potenciain vitroein vivocontra TRAC-CAR.In vitro,después de estimulaciones antigénicas repetidas, las células T CAR TRAC-EF1a adquirieron rápidamente perfiles efectores, mientras que las células T B2M y TRAC-CAR conservaron un fenotipo de memoria central (Figura 5F y Figura 15A). Curiosamente, aunque TRAC-LTR dirigió una expresión de CAR de referencia más baja que RV-CAR y evitó la señalización tónica, lTr todavía promovió desde dentro del locus TRAC el mismo patrón de diferenciación que RV-CAR. En el modelo de prueba de estrés NALM-<6>, ninguna de las combinaciones de 3 locus-promotor mostró la misma eficacia antitumoral que TRAC-CAR (Figuras 5G-5H). 10 y 17 días después de la infusión de 1*10<5>células T CAR, el número de células T CAR acumuladas en la médula ósea fue similar o superior al de las células T TRAC-CAR; sin embargo, solo las células T TRAC-CAR podrían controlar eficazmente la progresión del tumor (Figuras 15C-15E). Aunque las células T B2M-CAR parecían conservar una relación efector/efector-memoria similar a las células T TRAC-CAR, también adquirieron una firma de agotamiento preponderante (Figuras 15F-15G), lo que sugiere que la diferenciación retrasada puede ser independiente del agotamiento. Juntos, estos resultados subrayaron el efecto del direcionamiento de CAR y sugirieron una regulación adicional de la expresión de CAR que se extiende más allá del control transcripcional de referencia.

La expresión de CAR se analizó de cerca tras el encuentro con el antígeno. Con este fin, se mezclaron células T CAR con células presentadoras de antígeno CD19+ y se examinó la expresión de CAR en la superficie celular a intervalos de tiempo regulares (Figura<6>A). La expresión de CAR disminuyó a las pocas horas de la exposición a CD19 tanto en células T CAR integradas aleatoriamente como direccionadas, acompañada de una caída más profunda y un retraso de recuperación más largo cuando el nivel inicial era más bajo. El retorno posterior a la expresión de referencia distinguió más notablemente las diferentes poblaciones de células T.

Para estudiar mejor el mecanismo detrás de la caída en la expresión de la superficie celular de CAR, diseñamos una proteína de fusión CAR-GFP para analizar la expresión de CAR tanto en la superficie celular como intracelular, y compararla con las células que expresan un CAR con un informador LNGFR cotraducido pero escindido (Figuras<6>B-<6>C). Observamos que la expresión de CAR se subreguló independientemente de LNGFR, lo que sugiere una internalización física en lugar de un proceso transcripcional. La co-reducción de la señal de CAR y GFP después del encuentro con el antígeno indicó que la internalización de CAR fue seguida por su degradación. La aparición de la degradación de CAR después de la exposición al antígeno sugirió que sería necesaria la síntesis de CAR de novo a partir del ARNm de CAR para restaurar de manera precisa y oportuna la expresión de CAR y respaldar la función eficaz de las células T. Un análisis cuidadoso de la expresión de la superficie de las células CAR después de la estimulación repetida con antígeno (Figura<6>D y Figura 16A) identificó dos patrones principales en la fase de recuperación (12-48 horas después de la exposición al antígeno). En las células T TRAC-EF1a, TRAC-LTR y RV-

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CAR, la expresión de la superficie de las células CAR aumentó después de cada estimulación, de dos a cuatro veces por encima de la línea base dentro de las 24 horas. Tanto en las células T TRAC- como en las B2M-CAR, la expresión de CAR disminuyó con estimulaciones repetidas y permaneció por debajo de la línea de base después de 48 horas (Figura<6>D). El análisis de ARNm en estado estacionario mostró una correlación lineal entre el nivel de proteína de la superficie celular (Figura<6>E y Figura 16B) y la respuesta transcripcional a la activación de las células T CAR (Figura<6>F), lo que apunta al papel esencial de la fuerza y regulación del promotor para permitir una reposición óptima posterior a la estimulación de la expresión de CAR en la superficie celular.

Esta subregulación de la proteína CAR/ARN y la subsiguiente reexpresión recuerda a la regulación del TCR tras la estimulación de las células T humanas. (Schrum et al.,Immunol Rev.196:7-24, (2003)) y recirculación de TCR inducida por antígeno en células T de ratón (Liu et al.,Immunity13, 665-675, (2000); Call et al.,Annu. Rev. Immunol.23, 101 125, (2005); Allison et al.,Elife.5, (2016)). De manera similar, se ha informado diferenciación acelerada y agotamiento en el contexto de activación excesiva y continua del TCR (Schietingeret al.,Trends Immunol.35, 51-60, (2014); Wherry et al.,Nat. Rev. Immunol.15, 486-499, (2015)). En conjunto, estos hallazgos convergentes respaldan la conclusión de que TRAC tiene un papel en el control de la expresión de CAR de dos maneras críticas. Una es promover la expresión de línea base óptima, que impidió la señalización tónica en ausencia de antígeno y permitió la internalización efectiva de CAR en contactos únicos o múltiples con antígeno. El otro es dirigir una respuesta transcripcional equilibrada que resulte en una recuperación cinéticamente óptima de la expresión de CAR de línea base después del acoplamiento con el antígeno. A diferencia de las células T con una mayor expresión de CAR, el perfil TRAC-CAR se correlacionó con una menor diferenciación y agotamiento de las células T, lo que resultó en una mejor erradicación del tumor. Nuestros estudios, que compararon CAR integrados aleatoriamente versus CAR direccionados a dos loci en<8>configuraciones transcripcionales diferentes, ilustran la exquisita sensibilidad de la regulación de CAR. Por lo tanto, aunque el promotor B2M endógeno respondió de manera similar a TRAC tras la estimulación con CAR, B2M-CAR no se desempeñó tan bien como TRAC-CARin vivo,lo que indica que el nivel de expresión basal más bajo que ofreció es insuficiente para una actividad CAR efectiva. TRAC-LTR también proporcionó una expresión de línea base comparable a la de TRAC, pero su rápido rebote después de la activación se asoció con un rendimiento deficiente de las células T y una diferenciación acelerada. Por lo tanto, concluimos que tanto los niveles de expresión de CAR basales como los dinámicos contribuyen a mantener la función de las células T.

En resumen, los resultados demuestran que direccionar una secuencia codificadora de CAR al locus TCR, colocándola bajo el control de elementos reguladores endógenos, reduce la señalización tónica, evita la diferenciación y el agotamiento acelerados de las células T y aumenta la potencia terapéutica de las células T diseñadas. Las mediciones cinéticas de la internalización y degradación de CAR inducida por antígeno revelaron una recuperación diferencial de CAR en la superficie celular según los elementos potenciadores/promotores que impulsan la expresión de CAR. Estos hallazgos demuestran que la estricta regulación transcripcional de la expresión de CAR es fundamental para la erradicación eficaz del tumor. El direccionamiento de c A r a un locus TCR puede proporcionar así una célula T terapéutica más segura (al minimizar los riesgos de oncogénesis por inserción y autoinmunidad y alorreactividad inducidas por TCR), un producto de células T mejor definido (al producir una expresión constante de CAR y evitar la variación del efecto de posición y variación del número de copias del vector) y una célula T más potente (al reducir la señalización constitutiva y retrasar el agotamiento de las células T). Finalmente, los resultados demuestran la relevancia de estudiar la inmunobiología de CAR y el gran potencial de la edición del genoma para avanzar en las terapias de células T.

6.3 Ejemplo 3. Expresión de transgenes terapéuticos bajo el control de promotores endógenos.

En un ejemplo, se integra un receptor de antígeno quimérico terapéutico (CAR) en el locus TRAC (bajo el control de elementos promotores/potenciadores endógenos); una unidad de transcripción sensible a NFAT está integrada en el locus de la constante de la cadena beta del receptor de células T (TRBC), a partir del cual se expresan dos scFv terapéuticos específicos de PD1L y CTLA4. Con esta configuración, las células T diseñadas se activan a través del CAR, lo que conduce a la activación de NFAT seguida de la expresión de los scFv terapéuticos. Alternativamente, estos transgenes pueden integrarse en el locus CD69 sensible a NFAT. En una realización particular, un factor de transcripción del ligando de superficie celular quimérico es CD19-NFAT. Por consiguiente, en una realización, el CAR está codificado por un primer transgén, y el scFv de PD1L y el scFV de CTLA4 están codificados por un segundo transgén que es bicistrónico, en donde la expresión del segundo transgén está bajo el control del promotor TRBC endógeno que es inducida por NFAT. En una realización alternativa, los scFv de PD1L y CTLA4 se expresan a partir de transgenes separados (es decir, transgenes segundo y tercero). En una realización específica, los scFv de PD1L y CTLA4 se expresan a partir de un solo transgén policistrónico. Tal constructo puede incluir opcionalmente una secuencia escindible, tal como una secuencia P2A, para proporcionar la expresión de los scFv de PD1L y CTLA4 como moléculas separadas.

En otro ejemplo, un gen de fusión del factor de transcripción (TF; intracelular) de ligando de superficie celular quimérico (extracelular) se integra en el locus TRAC (bajo el control de elementos promotores/potenciadores endógenos) que interactúa específicamente con la molécula CD19 en las células B; una unidad de transcripción sensible a TF integrada en el locus TRBC, a partir de la cual se expresa un ligando de receptor inmunitario quimérico terapéutico (CIRL). Este diseño permite que las células T diseñadas respondan a la interacción con las células B liberando el TF, que luego activa la expresión de CIRL, que interactúa con un receptor de inmunoglobulina (IgR) autoinmune de células B

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específico. La última interacción señala/activa una respuesta de células T citotóxicas que conduce a la muerte de células B autoinmunes. En una realización, un gen de fusión del factor de transcripción (TF; intracelular) de ligando de superficie celular quimérico (extracelular) está codificado por un primer transgén. En una realización, el CIRL está codificado por un segundo transgén.

En otro ejemplo, una secuencia de ADN que codifica una ribozima específica de VIH se integra en el locus CD4; una unidad de transcripción sensible al interferón integrada en el locus CCR5 que expresa un scFv intracelular que interactúa con la proteína Rev del VIH. Esta célula T terapéutica inhibirá la replicación del VIH tres veces: escindiendo el genoma del VIH a través de la ribozima, previniendo la infección por el VIH al eliminar la expresión de CCR5 e inhibiendo el empaquetamiento del VIH al bloquear la actividad Rev del VIH. En una realización, un primer transgén codifica una ribozima específica de VIH. En una realización, un scFv intracelular está codificado por un segundo transgén, por ejemplo, un scFv que interactúa con la proteína rev del VIH.

6.4 Ejemplo 4. Generación de Gamma-retrovirus no integrantes

El gamma- retrovirus recombinante no integrador(o de integración deficiente) (rNIgRV o IDgRV) es un vector retroviral que contiene una proteína integrasa mutante, que no puede catalizar la integración del ADN viral en el genoma de la célula huésped. Para hacer este vector retroviral mutante, se usa un ADN plasmídico que codifica una proteína integrasa mutante (con las mutaciones indicadas anteriormente) en combinación con los ADN plasmídicos que codifican la envoltura y codifican el genoma retroviral. Estos tres plásmidos se transfectan en células de mamíferos productores y el vector viral mutante recombinante se libera en el medio, que luego se recolecta y se usa para transducir células T de sangre periférica humana.

Como se muestra en la Figura 18, las integrasas mutantes se generaron mediante la mutación de aminoácidos en el motivo DDE (véase Andrake and Skalka (2015). Integrasa retroviral: antes y ahora. Ann. Rev. Virol. 2:241-264. Las posiciones de los aminoácidos DDE son: D124, D183, E 219 (numeración de residuos basada en el número de acceso de GenBank NP_955592 (NP_955592.1). Los mutantes generados fueron D124A, D124E, D124N, D124V, D183A, D183N, D124A y D183A, D124A y D183N, D124E y D183A, D124E y D183N, D124N y D183A, D124N y D183N, D124V y D183A, y D124V y D183N. Los mutantes se generaron utilizando técnicas estándar de biología molecular. Un plásmido que contiene las secuencias Gag-Pol del virus de la leucemia murina de Moloney (MLV) se modificaron utilizando técnicas moleculares estándar. Los mutantes se generaron reemplazando la región de la secuencia de ADN que contenía el motivo DDE con una nueva secuencia de ADN donde se mutaron los codones específicos para generar cada mutante específico. Los plásmidos resultantes se usaron para producir NIgRV.

Aprovechando su naturaleza transitoria dentro de las células diana, los rNIgRV se pueden utilizar para diferentes aplicaciones. Por ejemplo, para expresar transitoriamente genes que mantienen un determinado fenotipo celular, como las células T de memoria; expresar transitoriamente nucleasas quiméricas o componentes CRISPR/Cas para interrumpir secuencias de ADN específicas; para administrar ADN exógeno flanqueado con secuencias de ADN homólogas a ubicaciones genómicas específicas, permitiendo así la integración de la secuencia de ADN flanqueada en el genoma de la célula T mediante recombinación homóloga; para administrar e integrar el ADN retroviral transgénico en rupturas de ADN específicas de una manera dependiente de NHEJ independiente de integrasa.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una célula T para su uso en un método para tratar con terapia con receptor de antígeno quimérico (CAR) a un sujeto que padece una enfermedad, en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) está integrada en un primer sitio dentro del genoma de la célula T de tal manera que el CAR es expresado por la célula T en la superficie de la célula T, en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico recombinante está bajo el control de un promotor endógeno de un gen complejo del receptor de células T (TCR), y en donde la integración de la secuencia de ácido nucleico recombinante en el primer sitio evita la expresión de un complejo TCR funcional en la superficie de la célula, en donde,

(i) la enfermedad es una enfermedad infecciosa, y en donde el CAR se une a un antígeno del patógeno de la enfermedad infecciosa;

(ii) la enfermedad es una enfermedad autoinmunitaria, en donde el CAR se une a un antígeno de la enfermedad autoinmunitaria, y en donde la célula T es una célula T reguladora; o

(iii) la enfermedad es un cáncer seleccionado del grupo que consiste en un carcinoma, sarcoma, leucemia, linfoma, mieloma múltiple, melanoma, tumor cerebral, tumor de la médula espinal, tumor de las células germinales, tumor neuroendocrino y tumor carcinoide, y en donde el CAR se une a un antígeno canceroso del cáncer.

2. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una célula T para su uso en un método para promover la tolerancia al trasplante con terapia con receptor de antígeno quimérico (CAR) en un sujeto con riesgo de rechazo del trasplante, en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) está integrada en un primer sitio dentro del genoma de la célula T de tal manera que el CAR es expresado por la célula T en la superficie de la célula T, en donde la expresión de la secuencia de ácido nucleico recombinante está bajo el control de un promotor endógeno de un gen del complejo del receptor de células T (TCR), en donde la integración de la secuencia de ácido nucleico recombinante en el primer sitio evita la expresión de un complejo TCR funcional en la superficie de la célula, en donde el CAR se une a un antígeno de un tejido trasplantado en el sujeto y en donde la célula T es una célula T reguladora.

3. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 1o 2, en donde el primer sitio está en un exón de un gen que codifica una proteína del complejo TCR.

4. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 1 o 2, en donde el primer sitio está dentro del primer exón del gen que codifica la cadena alfa del TCR.

5. La composición farmacéutica para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde una secuencia de ácido nucleico recombinante sin promotor que codifica el CAR se integra en dicho primer sitio, de tal manera que el CAR se expresa bajo el control del promotor endógeno de la cadena alfa del TCR, y en donde la integración de la secuencia de ácido nucleico recombinante en dicho primer sitio evita la expresión de una cadena alfa de TCR funcional.

6. La composición farmacéutica para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1a 3, en donde la integración de la secuencia de ácido nucleico recombinante en el primer sitio evita la expresión de una proteína seleccionada del grupo que consiste en la cadena alfa de TCR, cadena beta de TCR, cadena gamma de CD3, cadena delta de CD3, cadena épsilon de CD3 y cadena zeta de CD3.

7. La composición farmacéutica para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el promotor endógeno es un promotor de un gen que codifica una cadena alfa de TCR, cadena beta de TCR, cadena gamma de CD3, cadena delta de CD3, cadena épsilon de CD3 o cadena zeta de CD3.

8. La composición farmacéutica para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica el CAR está integrada en dos sitios dentro del genoma de la célula T.

9. La composición farmacéutica para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica el CAR está integrada en una pluralidad de sitios dentro del genoma de la célula T, y de tal manera que la expresión de la secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica el CAR en dicha pluralidad de sitios está bajo el control de diferentes promotores endógenos.

10. La composición farmacéutica para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la célula T procede de un ser humano.

11. Una célula T como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1(iii) y 3 a 10, en donde el CAR se une a un antígeno canceroso seleccionado del grupo que consiste en mesotelina (MSLN), antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), antígeno de células madre de próstata (PCSA), anhidrasa carbónica IX (CAIX), antígeno carcinoembrionario (CEA), CD5, CD7, CD10, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD123, CD133, CD138, glicoproteína epitelial 2 (EGP 2), glicoproteína epitelial 40 (EGP-40), molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM), proteína de unión a folato (FBP), receptor de acetilcolina fetal (AChR),

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receptor de folato-a y p (FRa y p), gangliósido G2 (GD2), gangliósido G3 (GD3), receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER-2/ERB2), receptor del factor de crecimiento epidérmico vIII (EGFRvIII), ERB3, ERB4, transcriptasa inversa de telomerasa humana (hTERT), subunidad alfa-2 del receptor de interleucina-13 (IL-13Ra2), cadena ligera k, receptor de dominio de inserción de quinasa (KDR), Lewis A (CA19.9), Lewis Y (LeY), molécula de adhesión celular L1 (L1CAM), antígeno asociado a melanoma 1 (familia de antígenos de melanoma A1, MAGE-A1), mucina 16 (Muc-16), mucina 1 (Muc-1), ligandos NKG2D, antígeno de cáncer testicular NY-ESO-1, antígeno oncofetal (h5T4), glicoproteína 72 asociada a tumor (TAG-72), factor de crecimiento endotelial vascular R2 (VEGF-R2), proteína del tumor de Wilms (WT-1), receptor transmembrana de proteína tirosina quinasa tipo 1 (ROR1), B7-H3 (CD276), B7-H6 (Nkp30), proteoglicano-4 de sulfato de condroitina (CSPG4), molécula accesoria DNAX (<d>N<a>M-1), receptor 2 de efrina tipo A (EpHA2), proteína asociada a fibroblastos (FAP), Gp100/HLA-A2, glipicano 3 (Gp C3), hA-1H, HERK-V, IL-11Ra, proteína 1 de membrana latente (LMP1), molécula de adhesión celular neural (N-CAM/CD56) y receptor Trail (TRAIL R).

12. Una población aislada de células T, que comprende una pluralidad de la célula T de la reivindicación 11.

13. Una composición farmacéutica que comprende la célula T de la reivindicación 11, o la población aislada de células T de la reivindicación 12, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Un métodoin vitropara generar una célula T que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR) y carece de un complejo funcional de receptor de células T (TCR), que comprende introducir en una célula T:

(i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR, y

(ii) un sistema de recombinación homóloga adecuado para la integración direccionada de la secuencia de ácido nucleico en un sitio dentro del genoma de la célula T, siendo dicho sitio el primer exón del gen de la cadena alfa de TCR, de tal manera que la expresión de la secuencia de ácido nucleico está bajo el control de un promotor endógeno de un gen complejo de TCR, por lo que el sistema de recombinación homóloga integra la secuencia de ácido nucleico que codifica el CAR en dicho sitio dentro del genoma de tal manera que la integración de la secuencia de ácido nucleico en dicho sitio evita la expresión de un complejo receptor de células T funcional en la superficie de la célula T, generando así una célula T que expresa el CAR y carece de un complejo TCR funcional.

15. El método de la reivindicación 14, en donde el método comprende el uso de un vector que comprende un retrovirus gamma no integrante para introducir la secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR en la célula T.

16. El método de la reivindicación 15, en donde el retrovirus gamma no integrante comprende una integrasa mutada.

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