ES3039164T3

ES3039164T3 - Fecal microbiota composition, for use in reducing treatment-induced inflammation

Info

Publication number: ES3039164T3
Application number: ES19745077T
Authority: ES
Inventors: Emilie Plantamura; Cyrielle Gasc; Benoît Levast; Lilia Boucinha; Camus Corentin Le; Carole Schwintner; Hervé Affagard
Original assignee: Maat Pharma SA
Current assignee: Maat Pharma SA
Priority date: 2018-07-20
Filing date: 2019-07-19
Publication date: 2025-10-17
Anticipated expiration: 2039-07-19
Also published as: CN112399850A; IL279282A; US20250064865A1; US12076350B2; CA3102488C; JP2021530527A; IL279282B1; BR112021000975A2; DK3823650T3; PL3823650T3; IL279282B2; EP3597202A1; JP2024096153A; US20210299188A1; PT3823650T; AU2019304530B2; EP3823650A1; EP3823650B1; FI3823650T3; AU2019304530A1

Abstract

La invención se refiere al uso del trasplante de microbiota fecal para prevenir y/o reducir la inflamación sistémica e intestinal inducida por el tratamiento en un individuo que lo necesite. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composición de microbiota fecal, para el uso en la reducción de la inflamación inducida por tratamiento

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la terapia antineoplásica u otras terapias que necesitan tratamientos que provocan inflamación local o sistémica, y proporciona medios y composiciones para reducir la inflamación iatrogénica, de esta manera se reducen los eventos adversos.

Antecedentes y estado de la técnica

La leucemia mieloide aguda (AML) es un cáncer de la sangre relativamente raro pero potencialmente mortal. La AML se caracteriza por una proliferación anormal de células mieloides malignas poco diferenciadas, dentro de la médula ósea y la sangre periférica (Saultz y Garzon, 2016). La terapia estándar para la AML se basa en la quimioterapia convencional con o sin trasplante de células madre. Los pacientes idóneos primero se someten a una fase de inducción con quimioterapia intensiva. Si se logra la remisión completa, se realiza la terapia de consolidación para profundizar la respuesta y lograr una remisión duradera. Las terapias de inducción y consolidación estándar incluyen uno o varios ciclos de quimioterapia intensiva y/o trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) en dependencia de los perfiles de riesgo en el paciente (Dohner, Weisdorf y D, 2015). Las diferentes fases de tratamiento de la AML requieren estancias hospitalarias prolongadas en un entorno protegido y múltiples ciclos de tratamientos antibióticos debido al alto riesgo de complicaciones infecciosas con peligro para la vida (Mayer y otros, 2015).

Se ha demostrado que tales tratamientos alteran drásticamente la composición de la microbiota intestinal humana (Galloway-Pena y otros, 2016; Galloway-Peña y otros, 2017). La llamada disbiosis inducida se caracteriza por una reducción de la diversidad microbiana general, una interrupción de las bacterias beneficiosas que apoyan las defensas del huésped y un aumento de la dominancia de especies bacterianas normalmente subdominantes, que incluyen algunos patógenos y patobiontes y bacterias multirresistentes (MDR) (Jandhyala y otros, 2015; Montassier y otros, 2015). Por lo tanto, la quimioterapia y el tratamiento con antibióticos interrumpen la relación mutualista entre el huésped y los microorganismos y promueven condiciones patológicas que implican respuestas inmunitarias locales no controladas e inflamación potencialmente sistémica (Palm, Zoete y Flavell, 2015).

Estudios recientes demostraron que una alta diversidad microbiana intestinal se asocia con un mejor resultado clínico y menos complicaciones infecciosas en los pacientes (Galloway-Pena y otros, 2016; Galloway-Peña y otros, 2017; Malard y otros, 2018). Se observó una disminución significativa en la diversidad microbiana durante el transcurso de la quimioterapia de inducción en muestras de heces de pacientes con AML. Además, se conoce que la quimioterapia de inducción tiene consecuencias dramáticas en el epitelio gastrointestinal, lo que conduce a colitis con dolor abdominal intenso, diarrea, hematoquecia con evidencia de inflamación intestinal (Hogan y otros, 2002; Camera y otros, 2003). Se demostró que el estado inflamatorio sistémico de los pacientes con AML aumentó significativamente después de la quimioterapia de inducción, medida con dos marcadores séricos de inflamación: C-Reactive Protein (CRP) and ferritin levels (Khitam AW Ali, Alaa F Alwan, 2015). Las consecuencias intestinales de los tratamientos para la AML pueden interferir, por lo tanto, con la atención óptima del paciente: aumento de las complicaciones relacionadas con infecciones (por ejemplo, sepsis), mal estado nutricional, mayor duración de la hospitalización, interrupción o ciclos de consolidación retrasados debido a la toxicidad del tratamiento (Elting y otros, 2003).

Existe la necesidad de desarrollar soluciones terapéuticas para aliviar la inflamación intestinal que se ha inducido por el tratamiento antineoplásico en pacientes con AML.

El desarrollo de estrategias tales como la transferencia de microbiota fecal (FMT) para restablecer las diversas comunidades microbianas perdidas durante el tratamiento de la enfermedad, y en consecuencia para suprimir o disminuir las complicaciones relacionadas con el tratamiento en pacientes con AML, podría ofrecer posibilidades terapéuticas novedosas (Khanna, 2018; Malard y otros, 2018) Khanna 2017). El propósito del ensayo clínico prospectivo de un solo grupo informado en el Ejemplo 1 fue usar FMT autóloga (AFMT) en pacientes con AML tratados con quimioterapia e antibióticos intensivos para restablecer la diversidad de la microbiota intestinal y reducir los portadores de MDRB inducidos por el tratamiento. Sorprendentemente, los inventores también demostraron que la FMT en pacientes con AML conduce a una disminución de la inflamación, especialmente la inflamación intestinal local. Mohty y otros publicaron una descripción del protocolo clínico de este ensayo (denominado ODYSSEE). ["Prevention of Dysbiosis Complications with Autologous Fecal Microbiota Transplantation (auto-FMT) in Acute Myeloid Leukemia (AML) Patients Undergoing Intensive Treatment (ODYSSEE study): First Results of a Prospective Multicenter Trial", Blood, 7 de diciembre de 2017 eA17-12-07]. Ninguno de los métodos de preparación de muestras de microbiota fecal ni los resultados del ensayo se describieron en este documento.

Un número de publicaciones describe el uso de FMT en el tratamiento de la disbiosis intestinal inducida por quimioterapia. Por ejemplo, Wang y otros: "P038 Fecal Microbiota Transplant (Fmt) For Immunocheckpoint Inhibitor-Induced Colitis (ICI-C) in 50 Year Old Female with Bladder Cancer", Inflammatory Bowel Diseases, vol.24, núm. 51, 18 de enero de 2018 (2018-01-18), página S13, Le Bastard y otros: describe "Fecal microbiota transplantation reverses antibiotic and chemotherapy-induced gut dysbiosis in mice", Scientific Reports, vol. 8, núm. 1, 18 de abril de 201 8 (201 8-04-1 8), y Cui y otros: "Faecal microbiota transplantation protects against radiation-induced toxicity", EMBO Molecular medicine (en línea), vol. 9, núm. 4,27 de febrero de 2017 (2017 02-27), páginas 448-461.

El documento WO 2016/170285 A1 se refiere a un método para preparar una muestra de microbiota fecal de un sujeto donante.

En vista de la prevalencia continua del cáncer hoy en día, en particular la AML, existe la necesidad de proporcionar soluciones terapéuticas fiables, reproducibles y eficaces que sean complementarias a, o extiendan la eficacia de, o reduzcan los efectos secundarios de los tratamientos de AML existentes. Por supuesto, tales soluciones terapéuticas deben ser adecuadas para el uso en pacientes, en particular, en una población frágil, tal como aquellos que tienen cáncer.

Específicamente, existe la necesidad de proporcionar soluciones terapéuticas que cumplan con los requisitos farmacéuticos actuales, en términos de seguridad y eficacia. Existe la necesidad de que tales productos terapéuticos puedan producirse mediante el uso de procesos que cumplan con las Buenas Prácticas de Fabricación (GMP).

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a una composición de microbiota fecal para el uso en la reducción de una inflamación inducida por la terapia antineoplásica combinada con antibioterapia y/o trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) en pacientes con leucemia aguda, en donde la composición de microbiota fecal se ha obtenido mediante un proceso que comprende las etapas de:

(i) recolectar una muestra de heces y ponerla en condiciones anaerobias a lo máximo 5 minutos después de la recolección;

(ii) aún en condiciones anaerobias, mezclar la muestra con una solución salina acuosa que comprende al menos un crioprotector y/o un agente de carga; y

(iii) filtrar la muestra diluida,

en donde la proporción de los siguientes 15 géneros aumenta con relación al nivel antes de una transferencia de microbiota fecal (FMT): Blautia, Faecalibacterium, Alistipes, Eubacterium, Bifidobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus, Odoribacter, Roseburia, Holdemanella, Anaerostipes, Oscillibacter, Subdoligranulum y Butyrivibrio,

en donde la neopterina en un intestino, la CRP en suero y/o la ferritina en suero disminuyen, y en donde la composición de microbiota fecal administrada comprende los siguientes 15 géneros:Blautia, Faecalibacterium, Alistipes, Eubacterium, Bifidobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus, Odoribacter, Roseburia, Holdemanella, Anaerostipes, Oscillibacter, SubdoligranulumyButyrivibrio.

De acuerdo con una modalidad de la invención, la composición de microbiota fecal comprende microbiota de al menos dos, o al menos tres o al menos cuatro muestras de heces del mismo individuo.

De acuerdo con una modalidad de la invención, la composición de microbiota fecal comprende microbiota obtenida de al menos una muestra fecal del individuo que necesita un tratamiento para reducir la inflamación.

De acuerdo con una modalidad de la invención, la composición de microbiota fecal se usa para reducir una inflamación intestinal inducida por el tratamiento en un individuo que lo necesita.

De acuerdo con la invención, la composición de microbiota fecal se usa para reducir la inflamación inducida por una terapia antineoplásica, que incluye la quimioterapia, combinada con antibioterapia y/o trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) en pacientes con leucemia aguda.

De acuerdo con una modalidad de la invención, la reducción de dicha inflamación se lleva a cabo mediante la realización de al menos un FMT 1 a 30 días después del final de la terapia antineoplásica. Preferentemente, pueden realizarse dos FMT en un intervalo de 1-7 días.

De acuerdo con la invención, la composición de microbiota fecal conduce a una disminución de neopterina en el intestino y/o una disminución de CRP y/o ferritina en suero del paciente a tratar.

De acuerdo con una modalidad de la invención, la administración de la composición de microbiota fecal conduce a un aumento de la proporción de bacterias beneficiosas y una disminución de la proporción de bacterias nocivas en el tubo gastrointestinal del individuo que se trata.

De acuerdo con una modalidad de la invención, la proporción de los siguientes 15 géneros aumenta con relación al nivel después del final de la terapia antineoplásica:Blautia, Faecalibacterium, Alistipes, Eubacterium, Bifidobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus, Odoribacter, Roseburia, Holdemanella, Anaerostipes, Oscillibacter, SubdoligranulumyButyrivibrio.

De acuerdo con la invención, la composición de microbiota fecal administrada comprende los siguientes 15 géneros:Blautia, Faecalibacterium, Alistipes, Eubacterium, Bifidobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus, Odoribacter, Roseburia, Holdemanella, Anaerostipes, Oscillibacter, SubdoligranulumyButyrivibrio.

De acuerdo con la invención, dicho individuo a tratar es un paciente con cáncer.

De acuerdo con la invención, dicho individuo a tratar tiene una enfermedad hematológica.

De acuerdo con la invención, dicho individuo a tratar tiene una leucemia aguda.

Leyendas de las figuras

Figura 1: Diagrama de flujo del estudio Odyssee

Figura 2: Evolución de los parámetros bioquímicos e inmunológicos para la población tratada de pacientes (n=25). (a) Nivel sistémico: IL-6, CRP y ferritina. (b) Nivel local: neopterina, IgA.

Figura 3: Evolución de los parámetros bioquímicos e inmunológicos para la población tratada (n=25) (a) sCD14 (b) TAS (c) TNFa.

Figura 4: Caracterización de la microbiota fecal en el diagnóstico de AML, antes y después de la administración de AFMT para la población según el protocolo (n=20). (a) Diversidad de especies. (b) Índice de Simpson a nivel de especie. (c) Índice de Bray Curtis a nivel de especie. (d) Número total de genes en la comunidad microbiana.

Figura 5: Proporción de bacterias beneficiosas (a) y nocivas (b) en la microbiota de los pacientes según el protocolo (n=20).

Figura 6: Abundancia relativa de 15 géneros generadores de butirato seleccionados (denominados "buticore"), específicamenteBlautia, Faecalibacterium, Alistipes, Eubacterium, Bifidobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus, Odoribacter, Roseburia, Holdemanella, Anaerostipes, Oscillibacter, SubdoligranulumyButyrivibrio,en pacientes en el estudio ODYSSEE después de cada una de las visitas al hospital, V1, V2, V3 y V4.

Figura 7: Curvas de supervivencia para pacientes tratados. (a) Curva de supervivencia general. (b) Curva de supervivencia libre de leucemia (LFS).

Figura 8: Diagrama de flujo del estudio OSIRIS.

Figura 9: Evolución de los parámetros bioquímicos e inmunológicos para pacientes de OSIRIS con seguimiento (n=42) (a) Zonulina. (b) Neopterina.

Descripción detallada de las modalidades preferidas

En el presente texto, se usan las siguientes definiciones generales:

Microbiota intestinal

La "microbiota intestinal" (anteriormente llamada flora intestinal o microflora) designa la población de microorganismos (bacterias, arqueas, hongos, virus) que viven en el intestino de cualquier organismo que pertenece al reino animal (humano, animal, insecto,etc.).Si bien cada individuo tiene una composición de microbiota única, de 60 a 80 especies bacterianas son compartidas por más del 50 % de una población humana muestreada en un total de 400-500 especies bacterianas/individuos diferentes.

La microbiota intestinal cumple funciones fisiológicas principales similares en todos los individuos y tiene un impacto directo en la salud del individuo:

• contribuye a la digestión de ciertos alimentos que el estómago y el intestino delgado no pueden digerir (principalmente fibras no digeribles);

• contribuye a la producción de algunas vitaminas (B y K);

• protege contra agresiones de otros microorganismos, manteniendo la integridad de la mucosa intestinal;

• desempeña un papel importante en el desarrollo de un sistema inmunitario adecuado;

• una microbiota intestinal saludable, diversa y equilibrada es clave para garantizar un funcionamiento intestinal adecuado.

Teniendo en cuenta el importante papel que desempeña la microbiota intestinal en el funcionamiento normal del cuerpo y las diferentes funciones que realiza, hoy en día se considera un "órgano". Sin embargo, es un órgano "adquirido", ya que la colonización del intestino por microorganismos comienza justo después del nacimiento y evoluciona permanentemente después de eso a lo largo de toda la vida y es el resultado de diferentes influencias ambientales (modo de parto, dieta, factores de estrés iatrogénicos...).

Si bien la composición general de la microbiota intestinal dominante es similar en la mayoría de las personas sanas (4 filos principales,es decir,Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria y Proteobacteria), la composición a nivel de especie es altamente personalizada y en gran medida determinada por el genoma, el entorno, la dieta y los antecedentes médicos de los individuos.

Disbiosis

Aunque puede adaptarse al cambio y tiene una alta capacidad de resiliencia, puede surgir una pérdida de equilibrio en la composición de la microbiota intestinal en algunas situaciones específicas. Esto se denomina "disbiosis", una desviación de lo que se considera una microbiota "sana" en términos de abundancia y diversidad de grupos bacterianos principales (es decir, un desequilibrio entre las bacterias potencialmente "nocivas" y "beneficiosas" en el intestino) que conduce a una interrupción de la relación simbiótica entre el huésped y su microbiota. La disbiosis puede estar relacionada con problemas de salud tales como trastornos funcionales del intestino, enfermedades inflamatorias intestinales, alergias, obesidad y diabetes. También puede ser la consecuencia de un tratamiento médico, tal como un tratamiento citotóxico (es decir, quimioterapia) o un tratamiento antibiótico y provocar eventos adversos tales como dolor abdominal y diarrea. La disbiosis inducida por el tratamiento también puede favorecer eventos adversos graves, tales como infecciones y sepsis.

Terapia antineoplásica

Por "terapia antineoplásica" se entiende en la presente descripción cualquier tipo de tratamiento usado para combatir el cáncer, tal como quimioterapia, terapias biológicas (que incluyen inmunoterapia), radioterapia y cirugía.

Quimioterapia antineoplásica

La "quimioterapia" se define en la presente descripción como el tratamiento del cáncer con uno o más "agentes quimioterapéuticos". Los agentes quimioterapéuticos son moléculas químicas que actúan al matar las células que se dividen rápidamente, una de las principales propiedades de la mayoría de las células cancerosas. Los agentes de quimioterapia incluyen:

- agentes alquilantes tales como mostazas de nitrógeno (mecloretamina, ciclofosfamida, melfalán, clorambucilo, ifosfamida, busulfán, etc.) nitrosoureas (N-nitroso-N-metilurea (MNU), carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), semustina (MeCCNU), etc.), tetrazinas (dacarbazina, mitozolomida, temozolomida, etc.), aziridinas (tiotepa, mitomicina, diazicuona (AZQ), etc.), y agentes alquilantes no clásicos (por ejemplo, procarbazina y hexametilmelamina);

- venenos del huso tales como mebendazol, colchicina;

- inhibidores mitóticos (que incluyen taxanos (paclitaxel (Taxol ®), docetaxel (Taxotere ®)) y alcaloides de vinca (por ejemplo: vincristina, vinblastina, vinorelvina, vindesina)),

- antibióticos citotóxicos/antitumorales: tales como antraciclinas (por ejemplo: doxorrubicina, daunorrubicina, adriamicina, idarrubicina, epirrubicina y mitoxantrona, valrubicina), estreptomyces (por ejemplo: actinomicina, bleomicina, mitomicina, aplicamicina)

- antimetabolitos (tales como análogos de pirimidina (por ejemplo: análogos de fluoropirimidinas, 5-fluorouracilo (5-FU), floxuridina (FUDR), arabinósido de citosina (Citarabina), gemcitabina (Gemzar ®), capecitabina; análogos de purina (por ejemplo: azatioprina, mercaptopurina, tioguanina, fludarabina, pentostatina, cladribina, capecitabina, clofarabina); análogos de ácido fólico (por ejemplo: metotrexato, ácido fólico, pemetrexed, aminopterina, raltitrexed, trimetoprim, pirimetamina),

- inhibidores de la topoisomerasa (por ejemplo: camptotecinas: irinotecán, topotecán, amsacrina, etopósido, etopósido fosfato, tenipósido);

- inhibidores de la metiltransferasa de ADN: 2'-desoxi-5-azacitidina (DAC), 5-azacitidina, 5-aza-2'-desoxicitidina, 1-[beta]-D-arabinofuranosil-5-azacitidina, dihidro-5-azacitidina;

- agentes de interrupción vascular, tales como derivados de ácido acético de flavona, ácido 5,6-dimetilxantenona-4-acético (DMXAA) y ácido flavono acético (FAA);

- otros fármacos quimioterapéuticos tales como aprepitant, bortezomib (Velcade ®, Millenium Pharmaceuticals), mesilato de imatinib (Gleevec ®), carmustina (BCNU), lomustina (CCNU), tamoxifeno, gefitinib, erlotinib, carboxiamidotriazol, efaproxiral, tirapazamina, xcitrina, timalfasina, vinflunina.

Terapias biológicas antineoplásicas

Las "terapias biológicas" antineoplásicas implican el uso de organismos vivos, sustancias derivadas de organismos vivos, o versiones producidas en laboratorio de tales sustancias para tratar el cáncer, al dirigirse ya sea a las células cancerosas directamente, o al estimular el sistema inmunitario del cuerpo para actuar contra las células cancerosas ("inmunoterapia"). Las terapias biológicas incluyen anticuerpos monoclonales (Mab), que incluyen los dirigidos a la superficie de células cancerosas (por ejemplo, rituximab y alemtuzumab); anticuerpos dirigidos a un punto de regulación inmunitario, tales como Mab anti-CTLA4 (por ejemplo, ipilimumab), Mab anti-PD1, Mab anti-PD-L1 (tales como atezolizumab o durvalumab), Mab anti-PD-L2, Mab anti-Tim3, Mab anti-ICOS, etc.; dirigidos a factores de crecimiento (por ejemplo: bevacizumab, cetuximab, panitumumab y trastuzumab); inmunoconjugados (por ejemplo: 90Y-ibritumomab tiuxetán, 131I-tositumomab y adotrastuzumab emtansina). Otras terapias biológicas incluyen citocinas (que incluyen interferones tales como IFNa; interleucinas tales como IL-2, IL-11, G-CSM, GM-CSF), vacunas terapéuticas (por ejemplo: Sipuleucel-T (Provenge®)), el bacilo bacteriano Calmette-Guérin, virus citotóxicos para células cancerosas, terapia génica y transferencia adoptiva de células T.

Inmunoterapia antineoplásica

"Inmunoterapia" en la presente descripción designa cualquier terapia que actúa a través de la modulación del sistema inmunitario del paciente, mediante el uso de terapias biológicas como se describió anteriormente o cualquier otro agente.

Cáncer, tratamiento, etc.

Como se usa en la presente, "cáncer" significa todos los tipos de cánceres. En particular, los cánceres pueden ser cánceres sólidos o no sólidos. Los ejemplos no limitantes de cánceres son carcinomas o adenocarcinomas tales como de mama, próstata, ovario, pulmón, páncreas o colon, sarcomas, linfomas, mielomas, melanomas, leucemias, cánceres de células germinales y blastomas.

Otras definiciones se especificarán más abajo, cuando sea necesario.

Como se describe en la parte experimental más abajo, los inventores demostraron que los pacientes con AML que recibieron un trasplante de microbiota fecal (FMT) después de una quimioterapia de inducción combinada con antibióticos no solo se beneficiaron de la restablecimiento de su diversidad de microbiota intestinal y la reducción de portadores de MDRB inducidos por el tratamiento, sino que también tuvieron una disminución de la inflamación, tanto a nivel intestinal sistémico como local. Este resultado inesperado es de gran importancia, ya que varios eventos adversos de los tratamientos antineoplásicos están relacionados con la inflamación.

Por lo tanto, de acuerdo con un primer aspecto, la presente invención se refiere a una composición de microbiota fecal para el uso en la reducción de una inflamación inducida por la terapia antineoplásica combinada con antibioterapia y/o trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) en pacientes con leucemia aguda.

En el presente texto, el individuo que necesita FMT para reducir una inflamación inducida por tratamiento es un individuo humano o un animal no humano.

En el presente texto, una "composición de microbiota fecal" designa una composición que comprende materia fecal con bacterias fecales vivas, especialmente una composición adecuada para el trasplante de microbiota fecal (FMT). De acuerdo con una modalidad particular, la composición de microbiota fecal comprende la microbiota completa presente en una muestra fecal o una combinación de dicha microbiota, obtenida de diferentes muestras.

Los inventores han demostrado que la FMT reduce la inflamación sistémica inducida por el tratamiento o iatrogénica, como lo demuestra una disminución en el nivel de CRP y/o el nivel de ferritina. Esta reducción es muy beneficiosa para los pacientes, ya que se conoce que la inflamación sistémica es una causa o factor de riesgo de algunos eventos adversos graves (por ejemplo, sepsis) vinculados a tratamientos fuertes tales como tratamientos antineoplásicos. De manera consistente, los inventores no observaron ninguna sepsis en los pacientes con AML dentro de al menos 40 días después de recibir un FMT de acuerdo con la invención. La presente invención se refiere, por lo tanto, más específicamente al uso de una composición de microbiota fecal para reducir la inflamación inducida por tratamiento sistémico y las complicaciones asociadas, tales como la sepsis.

Los inventores también demostraron que la FMT reduce la inflamación intestinal local, como lo demuestra una disminución en el nivel de neopterina fecal. De acuerdo con una modalidad particular, la composición de microbiota fecal se usa por lo tanto para reducir la inflamación intestinal y los síntomas gastrointestinales asociados tales como colitis y diarrea, por ejemplo.

De acuerdo con la invención, la composición de microbiota fecal usada para reducir la inflamación inducida por la terapia antineoplásica combinada con antibioterapia y/o trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) en pacientes con leucemia aguda se ha obtenido mediante un proceso que comprende las etapas de:

(iii) filtrar la muestra diluida, por ejemplo, alrededor de 265 |jm.

De acuerdo con una modalidad preferida, la solución acuosa usada en la etapa (ii) comprende maltodextrina y/o trehalosa de manera que la concentración final (p/vol) de maltodextrina está en el intervalo de 5 %-15 % y/o la concentración final (p/vol) de trehalosa está en el intervalo de 5 %-15 %.

Pueden añadirse etapas opcionales adicionales al proceso anterior, tales como:

(ia) controlar la muestra de heces, por ejemplo:

- realizar una prueba microbiológica en la muestra, para evitar la administración de patobiontes y/o bacterias multirresistentes (MDRB) al individuo;

- evaluar visualmente la ausencia de orina y sangre en el material de partida;

- aplicar la escala de heces de Bristol al material de partida;

- evaluar visualmente la homogeneidad y el color del producto, y comprobar la viabilidad de las bacterias presentes en la muestra (mediante cultivo fecal).

(iv) combinar varios productos de la etapa (iii): mezclar dos o más de dichos productos y homogeneizar la mezcla;

(va) congelar el producto de la etapa (iii) o (iv) a -80 °C; después del descongelamiento, este inóculo líquido será adecuado para la administración por enema;

(vb) liofilizar el producto de la etapa (iii) o (iv) mediante el uso de materiales y protocolos de liofilización habituales. El liofilizado de inóculo es adecuado después para la administración por enema en una solución líquida, o por vía oral, en cápsulas gastrorresistentes.

(vc) colocar el material liofilizado de la etapa (vb) en cápsulas apropiadas para la administración oral. (vi) comprobar la viabilidad y diversidad de las bacterias en el producto obtenido en las etapas (iii), (iv), (va), (vb) o (vc), y/o la ausencia de patobiontes y MDRB en dicho producto.

La composición de microbiota fecal usada de acuerdo con la presente invención puede comprender microbiota de un único donante o de varios donantes. Por ejemplo, varias muestras diluidas y filtradas pueden mezclarse en la etapa (iv) del proceso descrito anteriormente. El experto en la técnica elegirá, en dependencia de la situación, si es preferible que el paciente reciba un FMT de un único donante (por ejemplo, del propio paciente o de un familiar del paciente) o un FMT de múltiples donantes.

De acuerdo con una modalidad particular, la composición de microbiota fecal comprende microbiota obtenida de una muestra fecal del individuo que necesita un tratamiento para reducir la inflamación. Esta modalidad abarca FMT autóloga (AFMT) (es decir, la composición se elabora a partir de materia fecal de este individuo solamente), así como también FMT de múltiples donantes si la microbiota del individuo se combina con la microbiota de al menos otro individuo adicional.

Cuando se realiza FMT autóloga en el marco de la presente invención, es preferible recoger las heces del paciente antes del comienzo del tratamiento que inducirá inflamación y/o disbiosis, como se ilustra en el Ejemplo 1 más abajo.

De acuerdo con otra modalidad particular, la composición de microbiota fecal comprende al menos 90 % de los géneros presentes en la(s) muestra(s) usada(s). En particular, en el caso de AFMT, la composición de microbiota fecal comprende al menos 90 % de los géneros presentes en la muestra del individuo recogida antes del tratamiento inductor de la inflamación.

Los tratamientos antineoplásicos normalmente inducen inflamación sistémica y/o local, que puede ser la causa de incomodidad y, a veces, de eventos adversos graves (que a su vez pueden dar como resultado la interrupción del tratamiento). La presente invención se refiere, por lo tanto, a una composición de microbiota fecal como la descrita anteriormente, para el uso en la reducción de una inflamación inducida por la terapia antineoplásica combinada con antibioterapia y/o trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) en pacientes con leucemia aguda.

Cuando se realiza la invención, la composición de microbiota fecal puede administrarse para el trasplante de microbiota fecal (FMT) antes, durante y/o después de la terapia antineoplásica, por ejemplo antes, durante y/o después de una quimioterapia de primera línea, por ejemplo antes, durante y/o después de una quimioterapia de inducción (tal como una quimioterapia "7+3" con citarabina y un antibiótico de antraciclina o daunorrubicina).

Pueden imaginarse varios regímenes de administración en el marco de la presente invención. De acuerdo con una modalidad particular, ilustrada en el Ejemplo 1 más abajo, al menos un FMT se realiza de 1 a 30 días después del final de una terapia antineoplásica, más específicamente de 20 a 30 días después del final de una quimioterapia de inducción (que corresponde, para estos pacientes, al final de la antibioterapia).

De acuerdo con otra modalidad particular, también ilustrada en el Ejemplo 1 más abajo, se realizan al menos dos FMT en un intervalo de 1 a 7 días.

La presente invención también se refiere al uso de una composición de microbiota fecal como se describió anteriormente, para reducir una inflamación inducida por tratamiento en un individuo que recibe un tratamiento antineoplásico, en donde la composición de microbiota fecal se administra cada día, por ejemplo en cápsulas orales, en el diagnóstico del cáncer, antes, durante y/o después de dicho tratamiento antineoplásico. De acuerdo con una modalidad particular, la captación diaria de cápsulas orales que comprenden la composición de microbiota fecal se inicia al comienzo de la quimioterapia de inducción y se continúa durante al menos 3 a 6 meses.

Como ya se mencionó, los inventores demostraron que la FMT conduce a una reducción de la inflamación intestinal iatrogénica en los pacientes tratados, lo que se evidencia por una disminución del nivel de neopterina en las heces recogidas. De acuerdo con una modalidad particular de la presente invención, la FMT con una composición de microbiota fecal como se describió anteriormente conduce a una disminución de neopterina en el intestino, que puede medirse en muestras de heces del individuo tratado. Más particularmente, el nivel de neopterina disminuye en al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 % o al menos 40 %.

Los inventores también demostraron que la FMT conduce a una reducción de la inflamación sistémica iatrogénica en los pacientes tratados, lo que se evidencia por una disminución de los niveles de CRP y/o ferritina en el suero de los pacientes. De acuerdo con la presente invención, la FMT con una composición de microbiota fecal como la descrita anteriormente conduce a una disminución de la CRP y/o la ferritina en el suero del individuo tratado. Más particularmente, de acuerdo con una modalidad particular, el nivel sérico de CRP disminuye en al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 % o al menos 40 %, y/o el nivel sérico de ferritina disminuye en al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 % o al menos 40 %.

Otro aspecto de la presente invención es el uso de una composición de microbiota fecal como se describió anteriormente, para reducir una inflamación inducida por tratamiento en un individuo, en donde la FMT con dicha composición de microbiota fecal conduce a un aumento de la proporción de bacterias beneficiosas y una disminución de la proporción de bacterias nocivas en el tubo gastrointestinal.

En el contexto de la presente invención, las "bacterias beneficiosas" incluyen bacterias pertenecientes a las familias Lachnospiraceae, Ruminococcaceae, Bifidobacteriaceae, Streptococcaceae, Akkermansiaceae, Lactobacillaceae, Eubacteriaceae, Erysipelotrichaceae, Eggerthellaceae, Clostridiaceae, Prevotellaceae, Oscillospiraceae, Rikenellaceae y Odoribacteraceae, y las "bacterias nocivas" incluyen bacterias pertenecientes a las familias Bacteroidaceae y Enterococcaceae. De acuerdo con la invención, una composición de microbiota fecal se considera que conduce a un aumento de la proporción de bacterias beneficiosas y una disminución de la proporción de bacterias nocivas en el tubo gastrointestinal si, entre 2 días y 3 semanas después de la FMT con dicha composición, la suma de abundancias de las bacterias beneficiosas enumeradas anteriormente es superior a la medida justo antes de la FMT y la suma de abundancias de las bacterias nocivas enumeradas anteriormente es inferior a la medida justo antes de la FMT.

Los datos del solicitante (ver los ejemplos más abajo) confirman que la presente invención es particularmente útil para prevenir y/o reducir la inflamación inducida por tratamiento en pacientes que padecen de cáncer.

También se describe una composición de microbiota fecal para prevenir y/o reducir la inflamación inducida por tratamiento en pacientes que padecen una enfermedad hematológica, tal como una leucemia aguda (por ejemplo, leucemia mieloide aguda - AML), citopenia autoinmunitaria y aplasia de la médula ósea idiopática.

Además, los datos del solicitante en los ejemplos más abajo revelan el potencial de la microbioterapia en combinación con otros tratamientos contra enfermedades de la sangre, especialmente las malignas.

Específicamente, el tratamiento con el producto de FMT se asocia con un estado inflamatorio disminuido en pacientes (Ejemplo 1) en contraste con los pacientes que no se tratan con FMT (Ejemplo 2). La inflamación y el síndrome inflamatorio están relacionados con el aumento de comorbilidades y la puntuación negativa de los pacientes. De hecho, los marcadores inflamatorios en sangre tales como CRP y ferritina sérica tienen valor predictivo para la incidencia de infección sistémica en pacientes que se sometieron a HSCT (Hong y otros, 2015). Curiosamente, la CRP antes del tratamiento (es decir, antes del acondicionamiento con HSCT) es un predictor de los resultados del alo-HSCT: los niveles más altos de CRP se correlacionan con una toxicidad infecciosa de grado 3 a 4, toxicidad hepática, mayor estancia hospitalaria en HCT, más aGVHD, mayor mortalidad sin recaída y supervivencia global inferior (Artz y otros, 2008). Por lo tanto, de acuerdo con una modalidad de la invención, la FMT repetida durante el cuidado del paciente con leucemia durante los ciclos de quimioterapia reduce el estado inflamatorio y los niveles de CRP, lo que evita así las toxicidades por alo-HSCT y la morbilidad/mortalidad asociada (en aquellos pacientes que son candidatos para alo-HSCT). Además, el impacto positivo sobre la inflamación intestinal local tiene un efecto beneficioso sobre la calidad de vida del paciente, por ejemplo, con la reducción de trastornos gastrointestinales, tales como dolor abdominal y/o diarrea.

Por el contrario, los datos del inventor en el Ejemplo 2 muestran el impacto nocivo de un tratamiento de antibioterapia a largo plazo, demostrado en el protocolo OSIRIS con 96 AE relacionados con el sistema gastrointestinal informados en pacientes que se siguieron. Estos pacientes no recibieron FMT. Tal resultado destaca la necesidad de un tratamiento combinado para reducir la inflamación relacionada con el intestino y las complicaciones relacionadas.

Recientemente se ha demostrado que la microbiota intestinal puede modular la respuesta a la terapia antineoplásica (quimioterapia, radioterapia e inmunoterapia) y la susceptibilidad a los efectos secundarios tóxicos (Roy y Trinchieri, 2017; Routy y otros, 2018). Por lo tanto, se sugiere el restablecimiento de la microbiota intestinal con un aumento de la diversidad para mejorar la eficacia y reducir la toxicidad (Alexander y otros, 2017). Además, se ha demostrado que la alta diversidad de la microbiota intestinal desempeña un papel clave en la supervivencia general después del alo-HSCT y en el resultado del paciente con GvHD (Taur y otros, 2014). En conjunto, estos argumentos demuestran el impacto beneficioso de una microbiota "sana" y diversa en los resultados de los pacientes con cáncer y, especialmente, en las neoplasias malignas hematológicas y respaldan firmemente la justificación para usar la microbioterapia como terapia adyuvante durante toda la atención al paciente.

Las proporciones de bacterias beneficiosas y nocivas en la microbiota de los pacientes de ODYSSEE se modificaron claramente después de IC, con una disminución significativa de las bacterias beneficiosas y un aumento de las nocivas, respectivamente, que se correlaciona con el aumento de los marcadores inflamatorios evaluados en sangre y heces. De hecho, entre las bacterias beneficiosas, los inventores han encontrado un grupo específico de 15 géneros bacterianos excepcionalmente beneficiosos:Blautia, Faecalibacterium, Alistipes, Eubacterium, Bifidobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus, Odoribacter, Roseburia, Holdemanella, Anaerostipes, Oscillibacter, SubdoligranulumyButyrivibrio.Los inventores han nombrado a este conjunto de géneros "buticore".

Como se describe en el Ejemplo 1, los inventores han correlacionado la presencia de los 15 géneros anteriores con una disminución de la inflamación intestinal como lo demuestran los niveles de los marcadores de inflamación (fecales y plasmáticos) neopterina y CRP plasmática en los pacientes. Por lo tanto, la presencia de estos 15 géneros en una muestra fecal que se administrará en FMT es conveniente para maximizar la capacidad antiinflamatoria de dicha muestra.

Por lo tanto, la invención incluye la administración de muestras de microbiota fecal en las que están presentes algunos o todos los últimos 15 géneros beneficiosos.

Entre las bacterias nocivas, se identificaron algunas familias que comprenden bacterias proinflamatorias tales comoEscherichiaoKlebsiella.Algunas de estas bacterias proinflamatorias pueden ser multirresistentes a fármacos, tales comoEnterococcus(Steck y otros, 2011; Strickertsson y otros, 2013), lo que refuerza la razón para reducir el transporte de estos microbios en los pacientes. Cabe destacar que el 32 % de los pacientes en el protocolo OSIRIS presentaron una adquisición fecal de bacterias multirresistentes después de su ciclo antibiótico (datos no mostrados). El restablecimiento de la diversidad y de la relación de bacterias beneficiosas / nocivas después de la FMT se asocia con una reducción de la inflamación local y sistémica en el estudio ODYSSEE, lo que destaca el posible efecto antiinflamatorio beneficioso de la FMT en el huésped.

Por lo tanto, de acuerdo con la invención, la administración de la composición de microbiota fecal a un paciente aumenta la abundancia relativa de los 15 géneros mencionados anteriormente y/o de acuerdo con una modalidad de la invención una disminución en la abundancia de las bacterias proinflamatorias nocivas.

En particular, de acuerdo con la invención, la composición de microbiota fecal comprendeBlautia, Faecalibacterium, Alistipes, Eubacterium, Bifidobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus, Odoribacter, Roseburia, Holdemanella. Anaerostipes, Oscillibacter, SubdoligranulumyButyrivibrio.

Generalmente, y como se mostró anteriormente, desde un punto de vista terapéutico, la presencia de estos 15 géneros en la composición de microbiota fecal es ventajosa en el tratamiento de la inflamación intestinal, especialmente la asociada con la disbiosis intestinal.

Proporcionar a los pacientes con cáncer una composición de microbiota fecal generalmente puede regular la inflamación intestinal y potenciar mejor otros tratamientos antineoplásicos.

El producto de FMT descrito en la presente descripción ofrece una amplia gama de actividades que crean un circuito interactivo específico y positivo entre la microbiota intestinal, el metabolismo intestinal, el epitelio intestinal y la circulación sistémica. Por lo tanto, este ciclo positivo es una etapa crucial en el proceso inmunitario para combatir las células cancerosas, especialmente las células cancerosas de la sangre, tales como los mieloblastos presentes en pacientes con AML.

Generalmente, las consecuencias inducidas por la disbiosis, tales como infecciones y síntomas gastrointestinales tales como colitis, diarrea, dolor abdominal, distensión se reducen mediante la administración de la composición de microbiota fecal. Preferentemente, la composición de microbiota fecal que se administrará al paciente contiene algunos, o con mayor preferencia, todos los géneros bacterianos productores de butirato mencionados anteriormente. De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, la composición de microbiota fecal que se administrará al paciente proviene de al menos una, o al menos dos, o al menos tres o al menos cuatro muestras fecales del mismo paciente. Por ejemplo, de acuerdo con una modalidad de la invención, la muestra de FMT se prepara de acuerdo con las etapas:

(iii) filtrar la muestra diluida, por ejemplo, alrededor de 265 pm.

Por lo tanto, el paciente puede recibir una composición de microbiota derivada de al menos dos inoculados fecales combinados (es decir, productos de la etapa (iii)). Por ejemplo, el paciente puede donar una o más muestras de heces en uno o dos o tres días consecutivos antes de que tenga lugar la terapia antineoplásica. Estas muestras de heces se usan para preparar inóculos (producto de la etapa iii) que después se combinan (etapa (iv) anterior) y después se administran como uno o dos (o más) productos de FMT homogéneos después de la terapia antineoplásica (por ejemplo, quimioterapia o inmunoterapia). Si se prevén una o más administraciones adicionales de terapia antineoplásica, las siguientes muestras de heces pueden recogerse una vez que la microbiota intestinal se haya restablecido suficientemente en el individuo, generalmente de aproximadamente una semana (o menos si la microbiota se ha restablecido antes) después del tratamiento FMT anterior. Por lo tanto, el procedimiento puede repetirse tantas veces como sea necesario, y siempre que se lleven a cabo terapias antineoplásicas.

De acuerdo con ciertas modalidades de la invención, las muestras de heces pueden recogerse de donantes sanos (que no son el paciente). En este caso se lleva a cabo un FMT alogénico en lugar de un FMT autólogo. En este caso, los donantes se analizan para que las muestras de donantes sean adecuadas para el uso en el tratamiento de un paciente, por ejemplo, que las muestras estén libres de bacterias o virus patógenos. En el caso de FMT alogénico, los inóculos fecales (es decir, productos de la etapa (iii), de diferentes donantes, pueden combinarse como se describió anteriormente. Por lo tanto, pueden usarse muestras de FMT alogénicos de uno o dos, o tres o cuatro o más donantes. Preferentemente se usan al menos cuatro donantes, si se usa un producto alogénico combinado.

La diversidad bacteriana de los productos trasplantados es lo más alta posible y existe una homogeneidad entre las diferentes dosis de productos (homogeneidad intralote) trasplantadas a la misma persona. También existe homogeneidad entre los diferentes lotes producidos (homogeneidad entre lotes). La viabilidad de las bacterias también se conserva. El mantenimiento de una alta diversidad de la microbiota intestinal, como se demuestra mediante la administración de las composiciones de microbiota fecal descritas en la presente descripción tiene los efectos beneficiosos descritos anteriormente.

Los inventores han señalado que, en un estudio clínico separado (ULYSSE, datos no mostrados), la composición de la microbiota intestinal de 12 pacientes que padecen de AML y que no recibieron ningún FMT, se ve afectada negativamente después de la primera ronda de una quimioterapia, y permanece alterada negativamente después, con una riqueza de especies microbianas baja y con una composición microbiana muy diferente de la de su microbiota inicial (similitud de Bray Curtis baja).

Los datos de ULYSSE, que pueden verse como una especie de grupo negativo del estudio ODYSSEE (pero en una cohorte diferente), demuestran que el efecto antiinflamatorio observado en el Ejemplo 1 se debe directamente a la administración del producto de FMT, como se describió anteriormente.

Otras características de la invención también se harán evidentes en el transcurso de la descripción que sigue de los ensayos biológicos que se han realizado en el marco de la invención y que le proporcionan el soporte experimental requerido, sin limitar su alcance.

Ejemplos

Ejemplo 1: Restablecimiento de la diversidad de la microbiota intestinal en pacientes con leucemia mieloide aguda (AML) que se someten a quimioterapia intensiva con transferencia de microbiota fecal (FMT) autóloga: resultados del estudio Odyssée

Pacientes y métodos

Pacientes y diseño del estudio

Un total de 62 pacientes de entre 24 y 69 años con un diagnóstico de AMLde novose seleccionaron de 7 centros médicos franceses entre junio de 2016 y julio de 2017, y se siguieron hasta junio de 2018 (identificador de ClinicalTrials NCT02928523). Los pacientes con leucemia promielocítica aguda y/o que padecen de otras enfermedades graves, que incluyen trastornos digestivos (enfermedad inflamatoria intestinal, colitis grave...), o que recibieron antibioterapia hasta 4 días antes de la inclusión en el estudio, se excluyeron de este ensayo (Tabla 1). Se evaluó la seguridad bacteriológica en las heces fecales recogidas inmediatamente después de la inclusión y la detección de bacterias MDR, patógenos bacterianos,Clostridium diffiále,parásitos, norovirus y/o rotavirus condujeron a la exclusión de los pacientes. Por último, la cohorte de tratamiento comprendió 25 pacientes que cumplían todos los criterios de inclusión (Tabla 2).

T l 1: l i n i n r l i

Tabla 2: Motivos del fallo en la selección n=37

Inmediatamente después de la inclusión de los pacientes y antes del inicio de la quimioterapia de inducción (IC) y cualquier antibioterapia, se recogieron heces fecales y sangre (Visita V1, día 0) (ver el diagrama de flujo del estudio en la Figura 1). Se realizaron análisis bacteriológicos, bioquímicos y metagenómicos en muestras de heces fecales, y se realizaron análisis inmunológicos y bioquímicos en muestras de plasma. Las heces fecales se fabricaron y almacenaron como productos de AFMT en una plataforma de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) para el tratamiento futuro de los pacientes. Los pacientes se hospitalizaron después para el comienzo de la IC y se monitorearon clínica y biológicamente de acuerdo con los procedimientos estándar de los departamentos hematológicos. Después de la recuperación hematopoyética, las heces fecales y la sangre se recogieron dentro de 2 días antes de la suspensión del antibiótico para análisis bioquímicos, bacteriológicos, metagenómicos e inmunológicos (Visita V2). El AFMT se realizó 24 horas después de la suspensión de los antibióticos (al final de la IC y antes del inicio de la quimioterapia de consolidación), después del enema rectal la noche anterior y/o 1 hora antes del procedimiento. Los pacientes recibieron 2 inóculos de 150 ml que contenían 30 g de heces fecales con un día de diferencia mediante el uso de una sonda rectal introducida en su recto y se monitorearon durante todo el tiempo del proceso de trasplante y hasta el alta hospitalaria. Antes del inicio de la quimioterapia de consolidación, se recogieron heces fecales y sangre para los mismos análisis que antes (Visita V3), y al final de la hospitalización, se recogió una última muestra de heces fecales (Visita V4). La calidad de vida de los pacientes se evaluó en cada visita (V1 a V4), mediante el uso de un cuestionario EQ-5D-5L que evalúa la movilidad, el autocuidado, las actividades habituales, el dolor/incomodidad, la ansiedad y la depresión. Por último, después de 6 meses (Visita V5) y 1 año (Visita V6), se informaron la información clínica y la evaluación de la seguridad.

Entre los 25 pacientes tratados, 4 pacientes recibieron AFMT después de la primera quimioterapia de consolidación y no antes debido al estado del paciente (la AFMT no fue factible debido a la colitis o hemorroides) y se observó una desviación del protocolo en un paciente: por lo tanto, 20 pacientes se consideraron según el protocolo. Todas las Figuras y Tablas presentarán los datos obtenidos de estos pacientes excepto cuando se especifique de otra forma.

Producción de inóculos de AFMT

Las heces fecales se recogieron en el momento del ingreso del paciente, antes del comienzo de la IC. Las heces fecales se procesaron dentro de las 72 h con un diluyente crioprotector como se describe en los documentos WO 2016/170285 (A1) y WO 2017/103550 (A1) en un dispositivo patentado (similar al descrito en el documento WO 2016/170290 (A1)) bajo condiciones de GMP, se filtraron, se acondicionaron y se almacenaron congeladas a -80 °C hasta el trasplante. Más precisamente, una primera comprobación visual garantizó la ausencia de orina y sangre, y la evaluación de la textura en base a la escala de heces de Bristol. Después, las heces fecales se pesaron para adaptar la cantidad de diluyente crioprotector a usar. Después se añadió diluyente en el dispositivo, y un suave mezclado de ambos garantizó la homogeneización de la suspensión. La suspensión se filtra al mismo tiempo que el mezclado la hace pasar a través del tamiz. Todas estas etapas se realizan en el dispositivo herméticamente cerrado, lo que garantiza que no haya aire en contacto con la microbiota. Después, la suspensión se recoge a través del puerto inferior del dispositivo y se acondiciona a través de sistemas cerrados y tubos en una bolsa de plástico resistente al frío, que muestra varias conexiones, para permitir la entrada y salida del producto por vías separadas. Las muestras se recogen al final de esta etapa para usarlas como QC. El producto se almacena por último a -80 °C. Las pruebas microbiológicas (realizadas en las heces frescas de acuerdo con las pautas de la Agencia de Salud) y la evaluación de la viabilidad mediante citometría de flujo se realizan por último antes del lanzamiento del producto.

En paralelo, se realizó un análisis microbiológico riguroso (ver sección de análisis microbiológicos y Tabla 3) y se permitió la liberación del producto medicinal en investigación (IMP) después de un período de cuarentena.

Análisis microbiológicos

Detección de C.diffiále, Salmonellasp.,Shigellasp. y bacterias MDR(Staphylococcus aureusresistente a la meticilina, enterococos resistentes a vancomicina y resistentes a los glicopéptidos, bacterias productoras de beta-lactamasa de espectro ampliado (ESBL) y bacterias productoras de carbapenemasa) se realizó en muestras de heces fecales recogidas durante las tres primeras visitas mediante el uso de PCR y cultivo en medios de aislamiento específicos, respectivamente. Los parásitos, virus y bacterias patógenas se analizaron en las muestras de heces fecales recogidas durante la primera visita para comprobar la seguridad de las heces fecales para el uso de AFMT. Los parásitos se detectaron mediante el uso de PCR (Microsporidia,Dientamoeba fragilis)o microscopía(Strongyloides stercoralis, Cyclosporasp.,Isosporasp.,Entamoeba histolytica, Giardia intestinalis, Cryptosporidiumsp.,Blastocystis hominis)después de la concentración de las heces fecales. Los norovirus y los rotavirus se identificaron mediante PCR e inmunocromatografía respectivamente, y las bacterias patógenas se detectaron mediante el uso de PCR (Campylobacter) y cultivo(Listeriasp.,Vibriosp.,Yersiniasp.).

Análisis bioquímicos e inmunológicos

Se realizaron análisis bioquímicos e inmunológicos en las diferentes muestras de sangre y heces fecales recogidas durante las tres primeras visitas. La neopterina y la IgA secretada (slgA) se midieron a partir de sobrenadantes de heces fecales mediante el uso de los kits de ELISA de neopterina (IBL International) y ELISA de IgA secretada humana (EUROBIO) respectivamente. El estado antioxidante total (TAS) se midió a partir del plasma mediante el uso del kit Hitachi 912 (RANDOX Laboratories), la CRP y la ferritina se midieron a partir de muestras de plasma/suero en los diferentes centros médicos de acuerdo con sus propios procedimientos internos. Los marcadores inmunológicos se midieron a partir de muestras de plasma: IL6 y TNFa (kit de panel de perlas magnéticas de citocinas/quimiocinas humanas (EMD Millipore)); CD14 soluble (sCD14) (kit de ELISA de CD14 Quantikine (R&D System).

Aislamiento de ADN y secuenciación metagenómica

El ADN genómico se extrajo de las muestras de heces fecales recogidas durante las primeras cuatro visitas mediante el uso del kit NucleoSpin Soil (Macherey Nagel). Se construyó una biblioteca de secuenciación para cada muestra de ADN mediante el uso del kit TruSeq (Illumina) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después, las bibliotecas se secuenciaron en 2 corridas de HiSeq2500 (Illumina) de extremos pareados (2 x 125 pb).

Análisis bioinformáticos

Después del filtrado de calidad mediante el uso de Trimmomatic (Bolger, Lohse y Usadel, 2014), la descontaminación de la secuencia huésped se realizó mediante el uso de Bowtie2 (Langmead, Ben y Salzberg, 2013) . Por lo tanto, se obtuvieron entre 936060 y 37212 124 pares de lecturas (media: 34811 750 pares de lecturas) de las diferentes muestras. Para una comparación justa, el número de secuencias de cada muestra se normalizó aleatoriamente a la misma profundidad de secuenciación, es decir, 1500 000 secuencias de extremos pareados por muestra. Después, se realizó un perfil taxonómico con Kraken v.0.10.5-beta (Wood 2014) y la base de datos genómica RefSeq (versión de junio de 2015, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/). La medición de los índices de diversidad a y p medianos se realizó en el software estadístico R después de 10 submuestreos (R Core Team 2015, versión 3.4.4, http://www.R-project.org) mediante el uso de paquetes vegan y phyloseq. La proporción de bacterias beneficiosas se definió como la suma de abundancias relativas (basadas en el perfil taxonómico de la microbiota) de familias microbianas beneficiosas: Lachnospiraceae, Ruminococcaceae, Bifidobacteriaceae, Streptococcaceae, Akkermansiaceae, Lactobacillaceae, Eubacteriaceae, Erysipelotrichaceae, Eggerthellaceae, Clostridiaceae, Prevotellaceae y Oscillospiraceae. De manera similar, la proporción de bacterias nocivas se definió como la suma de abundancias de las familias Bacteroidaceae y Enterococcaceae.

Los análisis de resistencia a antibióticos y basados en genes se realizaron a través del mapeo de genes con Bowtie 2 mediante el uso del Catálogo de genes integrados (IGC) (Li y otros, 2014) y MEGARes (https://megares.meglab.org/) respectivamente.

Análisis estadísticos

Las relaciones de V3/V1 y V2/V1 de los siguientes parámetros se han comparado gracias a una prueba t pareada bilateral:

- Índices de riqueza para especies y genes

- Índice de Simpson para especies

La prueba pareada de Wilcoxon se aplicó a los siguientes parámetros:

- Número de copias de resistencia a antibióticos

- Bacterias beneficiosas-nocivas (%)

- Índice de Bray-Curtis

- CRP, ferritina, neopterina, IL-6, sCD14, IgA, TNFa, TAS

Resultados

Características del paciente

Un total de 62 pacientes con AML se seleccionaron en nuestro estudio en 7 centros diferentes, 25 se trataron con AFMT y 20 se consideraron como la población según el protocolo sobre la que se han realizado los siguientes análisis. Las características iniciales de los pacientes tratados y según el protocolo se enumeran en la Tabla 4. Hubo más hombres que mujeres en la población de pacientes según el protocolo (relación, 3:1) y la edad media fue de 50 años. La mayoría de los pacientes (80 % de los pacientes tratados y de los pacientes según el protocolo) se consideraron con riesgo intermedio de AML, mientras que 3 y 2 pacientes de la población tratada eran de los grupos de riesgo favorable y desfavorable, respectivamente. Todos los pacientes recibieron quimioterapia de inducción intensiva (régimen clásico "3+7" o equivalente).

Resultados de seguridad

El tiempo medio de retención del producto de AFMT fue más largo de lo esperado (189,50 min y 173,33 min para el primer y segundo AFMT respectivamente en lugar de los 120 min recomendados) lo que demuestra la viabilidad del procedimiento de enema y la ausencia de incomodidad para los pacientes.

Durante el tratamiento con AFMT, no se observaron cambios nocivos en los signos vitales de los pacientes tratados (frecuencia cardiaca, presión arterial). Después, durante las primeras 24 h después de AFMT, se informaron 5 eventos adversos (AE) en 4 pacientes tratados (16 %). (Tabla 5).

No se informaron eventos adversos graves (SAE) durante este período en la población tratada.

=

Después de las primeras 24 h después del AFMT y hasta el final del período de seguimiento de 1 año, se informaron 415 Ae en 24 de los 25 pacientes tratados (96 %) (Tabla 6). Entre ellos, 2 se relacionaron con el procedimiento de enema y 1 con el producto de AFMT. Los otros AE estaban correspondían a los perfiles de pacientes con leucemia. Los AE más comunes fueron trastornos del sistema sanguíneo y linfático (n=58; 14 %), trastornos gastrointestinales (n=78; 19 %), trastornos generales y condiciones del sitio de administración (n=39; 9 %) e infecciones e infestaciones (n=88; 21 %). La mayoría de los AE ocurrieron entre la inclusión y el AFMT (V1-V2) (tasa de incidencia del 27,06 %) y entre la visita V3 y la visita V4 (tasa de incidencia del 15,07 %) (Figura S2 complementaria). Además, se han informado 30 eventos adversos graves (SAE) en 15 pacientes (15 %) (Tabla 7), la mayoría de ellos son infecciones e infestaciones (n=13; 43 %). En cuanto a los AE, la mayoría de los SAE ocurrieron entre la inclusión y el AFMT (V1-V2) (tasa de incidencia del 1,57 %) y entre la visita V3 y la visita V4 (tasa de incidencia del 0,90 %). Ninguno de estos SAE ocurrió durante el primer mes después del AFMT, y solo uno se declaró posiblemente relacionado con el tratamiento de AFMT por el investigador del sitio. El paciente exhibió hipertermia y síntomas gastrointestinales 93 días después del segundo AFMT y se le diagnosticó sepsis porEscherichia coli.El antecedente médico del sujeto incluyó colonización porE. colimultirresistente a fármacos en las heces después de la hospitalización para la quimioterapia de consolidación, es decir 22 días después del segundo AFMT. Después de la antibioterapia, el paciente se recuperó completamente. Esta bacteria multirresistente a fármacos no se detectó en las heces recogidas al comienzo de la quimioterapia de consolidación. Este SAE ocurrió 3 meses después de AFMT, lo que plantea la pregunta de su vínculo con el tratamiento administrado.

Tabla 6: EA des dos (n=25).

Tabla 7: SAE l rim r 24 h r AFMT r n i n ratados (n=25).

Se informaron cuatro muertes entre los 25 pacientes tratados (16 %) (mismos resultados en la población según el protocolo: 4 muertes entre 20 pacientes (20 %)) (Tabla 8). El tiempo medio hasta la muerte desde el segundo AFMT fue de 182,5 días (intervalo: 113-225 días). Un paciente murió de fallo multiorgánico 34 días después de HSCT (143 días después de AFMT). Otro paciente experimentó un fallo multiorgánico en un contexto de infecciones durante la aplasia posterior al aloinjerto (113 días después de AFMT). Se informó un ataque al corazón después de un embolismo pulmonar, posiblemente relacionado con antecedentes médicos de fibrilación auricular crónica e hipertensión arterial. La muerte ocurrió 225 días después de AFMT. La cuarta muerte (222 días después de AFMT) se debió a GvHD gastrointestinal resistente de grado IV, agravada por la septicemia aKlebsiella pneumoniaeyStenotrophomonas maltophiliaproductoras de ESBL, la presencia deEnterobacter cloacaemultirresistente en la orina, reactivación del citomegalovirus, viremia por virus del herpes humano 6 y un contexto de encefalitis aguda. El investigador del sitio y el Comité de Monitoreo de Datos y Seguridad (DMSB) consideraron que todas las muertes no estaban relacionadas con el tratamiento con AFMT

Tabla ^(n=25).

La calidad de vida de pacientes según el protocolo se evaluó a lo largo del estudio clínico. Los datos obtenidos mostraron que los resultados del cuestionario después de AFMT (V3) fueron similares o tendieron a mejorar en comparación con los de V2 antes de AFMT (especialmente los parámetros de autocuidado, actividades habituales y ansiedad y depresión), lo que destaca la ausencia de impacto negativo de AFMT en la salud general de los pacientes (Tabla 9). De manera similar, no se observó una variación significativa del BMI a lo largo del estudio para los pacientes tratados, pero el peso medio tendió a aumentar entre V2 y V3 (26,89 a 27,26), lo que sugiere la ausencia de problemas digestivos en los pacientes tratados.

La seguridad de AFMT se evaluó mediante la medición de parámetros inflamatorios tanto a nivel local en el intestino como sistémico en el plasma durante las 3 primeras visitas. En un enfoque sistémico, medimos proteínas inflamatorias y citocinas en plasma tales como proteína C-reactiva (PCR), ferritina, IL-6, TNFa y sCD14 (Figuras 2 y 3). Observamos un aumento significativo de CRP en V2 (V1: 11,80 ± 18,25 mg/l; V2: 24,40 ± 23,92 mg/l; p = 0,o4) y un regreso al valor de referencia en V3 (V3: 10,16 ± 22,07 mg/l; V2 frente a V3: p= 0,02). Los niveles de ferritina siguieron las mismas variaciones con un aumento en V2 y un regreso al valor de referencia en V3. Se observaron tendencias adicionales con la cuantificación de otros parámetros inflamatorios que mostraron un aumento significativo de IL-6, TNFa y sCD14 después del tratamiento con AFMT (Figura 3). También medimos el estado antioxidante total (TAS) en plasma como un marcador de estrés oxidativo que puede inducirse por alteraciones de la microbiota intestinal. Estudios anteriores han informado que el estrés oxidativo está estrechamente relacionado con la aparición y el desarrollo de cánceres (Wu y otros, 2017) y también está asociado con la disbiosis intestinal. El estrés oxidativo que se produce durante la inflamación es un factor que amplifica la disbiosis al disminuir fuertemente la diversidad microbiana en el intestino y al promover el crecimiento de taxones bacterianos específicos (Weiss y Hennet, 2017). Observamos una disminución de los niveles de TAS entre V1 y V2 (V1: 1,33 ± 0,09 mmol/l; V2: 1,31 ± 0,19 mmol/l) y un aumento significativo después de AFMT (V3: 1,59 ± 0,58 mmol/l; p=0,006) que podría asociarse con la restablecimiento de la microbiota intestinal.

La inmunidad local y la inflamación en el intestino se evaluaron mediante la medición de neopterina fecal e IgA secretada. La neopterina se produce y libera de macrófagos activados estimulados con varios inductores tales como IFNy, TNFa y componentes bacterianos (Nancey y otros, 2013) y refleja el grado de respuesta inmunitaria mediada por células y, de esta manera, los niveles de inflamación intestinal. Observamos un aumento significativo de los niveles medios de neopterina fecal después de IC (V1: 2,79 ± 4,02 ng/g de heces fecales frente a V2: 32,70 ± 40,15 ng/g de heces fecales; p=0,0006) lo que destaca el estado inflamatorio intestinal esperado de los pacientes después de la IC y la antibioterapia. Los niveles disminuyeron significativamente y regresaron al valor de referencia después de AFMT (V3: 5,41 ± 7,42 ng/g de heces fecales; p =0,001). Estas variaciones están en línea con las variaciones de CRP. Como reflejo de la inmunidad local, la IgA secretada también se midió en heces fecales y se observaron tendencias similares (V1: 1,95 ± 2,05 mg/g de heces fecales; V2: 2,75 ± 1,81 mg/g de heces fecales; V3: 2,39 ± 2,15 mg/g de heces fecales). En conjunto, estos datos señalan claramente la ausencia de cualquier reacción inflamatoria perjudicial, tanto local como sistemáticamente después de AFMT.

Evolución de la composición de la microbiota intestinal

Después se examinó el impacto de la IC y el tratamiento posterior con AFMT sobre la riqueza y diversidad filogenética de la microbiota fecal en pacientes según el protocolo. Los inventores demostraron que IC induce un cambio drástico en las comunidades microbianas, con una disminución estadísticamente significativa de los índices de diversidad a entre V1 y V2 a nivel de especie: 39,3 % de reducción estimada en la riqueza media (de 960,45 a 589,71 especies; p<0,001) (Figura 4a) y 42,3 % de reducción estimada en el índice de Simpson medio (de 0,85 a 0,50; p<0,001) (Figura 4b y Figura 5). Después del tratamiento con AFMT, la riqueza de especies (957,70 especies; p<0,001) y el índice de Simpson (0,86; p<0,001) volvieron a su nivel inicial sin diferencia estadística entre los valores en V1 y V3. Por lo tanto, la microbiota intestinal en V3 después de AFMT se reconstruye a más del 90 % en la población según el protocolo en base a la riqueza y el índice de Simpson a nivel de especie (p<0,001). Esta modificación de las comunidades microbianas también se observa con las medidas de p-diversidad (Figura 4c y Figura 5). De hecho, el índice de disimilitud de Bray-Curtis (BC) demuestra la inducción de una disbiosis microbiana después de IC (BC V1-V2 media: 0,76) y la restablecimiento de comunidades microbianas después del tratamiento AFMT cuya composición es más cercana a la de las comunidades iniciales a nivel de especies (BC V1-V3 media: 0,40). (Figura 5).

Después se midió la proporción de bacterias beneficiosas y nocivas en la microbiota de los pacientes según el protocolo entre V1 y V3 (Figuras 5a y 5b). La proporción de bacterias beneficiosas se redujo significativamente entre V1 y V2 (V1 media: 5,54 %; V2: 2,43 %; p<0,01) y después se aumentó para regresar a su nivel inicial en V3 después de AFMT (V3 media: 6,82 %). Por el contrario, la proporción de bacterias nocivas aumentó significativamente en V2 (media V1: 10,95 %; V2: 32,29 %; p<0,5) y disminuyó para regresar a su estado inicial en V3 después de AFMT (media V3: 10,65 %).

Para evaluar la riqueza funcional de la microbiota intestinal durante el transcurso del tratamiento, se evaluó el número total de genes en la microbiota intestinal de pacientes según el protocolo mediante el mapeo de lecturas contra la base de datos de IGC. Los resultados demuestran que el número medio de genes se reduce significativamente en un 78 % (531 500,20 a 21 361,50 genes totales; p<0,001) después de IC y aumenta significativamente después de AFMT (424 374,15 genes) de manera que se recupera más del 70 % de la riqueza génica inicial para la población según el protocolo (p=0,025) (Figura 4d, Figura 5).

Determinación de una lista refinada de productores de ácido butírico, asociados con la disminución de la inflamación en base a los datos clínicos:

En base a una lista de 34 géneros productores de butirato elaborada a partir de la bibliografía, los inventores realizaron una prueba de correlación entre el nivel de cada género y neopterina fecal (marcador de inflamación) en pacientes del ensayo ODYSSEE para determinar una lista refinada de productores de butirato (llamada buticore). Las correlaciones de Spearman y las pruebas de correlación de Spearman se calcularon con R (prueba de correlación de la función del paquete de estadísticas). No se aplicó corrección de pruebas múltiples para estos análisis.

Resultados:

Se determinó una lista de 15 géneros productores de butirato que están significativamente correlacionados con neopterina fecal y tienen una abundancia relativa estimada >0,1 % en el estudio ODYSSEE. Esta lista está compuesta por los génerosBlautia, Faecalibacterium, Alistipes, Eubacterium, Bifidobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus, Odoribacter, Roseburia, Holdemanella, Anaerostipes, Oscillibacter, SubdoligranulumyButyrivibriogenera (ver la Tabla 10).

Tabla 10. Quince géneros productores de butirato en base al análisis de correlación y filtrado de abundancia relativa.

En el ensayo ODYSSEE, los 15 géneros productores de butirato se correlacionan negativamente con la neopterina fecal y plasmática y la CRP. La abundancia relativa disminuye en V2 después de la quimioterapia y la iC, y se restablece al valor de referencia en V3 después del tratamiento con aFMT. Para la mayoría de los pacientes, la mayoría de los 15 géneros están presentes en V1 (valor de referencia), la mayoría de los géneros se eliminan en V2 y se restablecen debido al FMT en V3, que muestra un buticore similar al medido en V1 (Figura 6).

Descolonización de MDRB

La presencia deC. difficiley MDRB en heces fecales de pacientes se evaluó entre V1 y V3 mediante el análisis de genes de resistencia en el conjunto de datos metagenómicos.

Las lecturas de secuenciación totales se mapearon en la base de datos de genes de resistencia a antibióticos MEGARes. Se observó que los IC y los tratamientos antibióticos asociados indujeron un aumento significativo en el número medio de lecturas mapeadas contra genes de resistencia a antibióticos en V2 (167546 a 371 465 lecturas, p<0,01) para los pacientes según el protocolo. Después, se observó una reducción significativa del 43 % del número medio de lecturas mapeadas en V3 después de AFMT (211 127 lecturas, p<0,001).

Resultados clínicos

Los resultados clínicos se resumen en la Tabla 2. El tiempo medio de seguimiento para los pacientes fallecidos fue de 7,13 meses (intervalo, 4,8-8,5 meses). A los 6 meses, la tasa de supervivencia general (OS) fue del 88 % (3 muertes) (Figura 8). Entre los pacientes tratados, 21 (84 %) lograron la remisión completa en base a la respuesta hematológica y 1 (4 %) logró la remisión parcial. La tasa de OS a 1 año fue del 84%(4 muertes) para la población tratada (Figura 8). Un total de 17 pacientes (68 %) seguían en remisión completa a los 12 meses y 1 paciente (4 %) estaba en remisión parcial. Además, se observó una progresión de la leucemia en 3 (12 %) de los pacientes tratados a un año.

Ejemplo 2: Resultados del estudio clínico de Osiris que muestran que la disbiosis iatrogénica y la inflamación que no se normalizan en ausencia de FMT

Pacientes y métodos

Pacientes y diseño del estudio

Un total de 62 pacientes con sospecha de infección ósea y articular (BJI) se seleccionaron de 5 centros médicos franceses entre enero de 2017 y septiembre de 2017 y se siguieron hasta marzo de 2018 (identificador de ensayos clínicos NCT03011502). Los pacientes se clasificaron en 3 categorías como sigue: nativos (n=27, media de edad=56), osteosíntesis (n=13, media de edad=52) y prótesis (n=22, media de edad=66) BJI.

T l 11: l i n i n r l i IRI

Inmediatamente después de la inclusión de los pacientes y antes del inicio de la antibioterapia, se recogieron heces fecales y sangre (Visita V1, día 0) (ver el diagrama de flujo del estudio en la Figura 8). Se realizaron análisis bacteriológicos, bioquímicos y metagenómicos en muestras de heces fecales, y se realizaron análisis bioquímicos en muestras de plasma. Después de completar la antibioterapia, se recogieron heces fecales y sangre para análisis bioquímicos, bacteriológicos y metagenómicos (Visita V3). Dos semanas después de la suspensión de la antibioterapia, se recogieron heces fecales y sangre para los mismos análisis que antes (Visita V4). La calidad de vida de los pacientes se evaluó en cada visita (V1 a V4), mediante el uso de un cuestionario EQ-5D-5L (que evalúa la movilidad, el autocuidado, las actividades habituales, el dolor/incomodidad, la ansiedad y la depresión). Por último, después de 6 meses de la inclusión (Visita V5), se informaron la información clínica y la evaluación de la seguridad.

Análisis microbiológicos

Detección deC. difficile, Salmonellasp.,Shigellasp. y bacterias MDR(Staphylococcus aureusresistente a meticilina,enterococos resistentes a vancomicina y resistentes a los glicopéptidos, bacterias productoras de beta-lactamasa de espectro ampliado (ESBL) y bacterias productoras de carbapenemasa) se realizó en muestras de heces fecales recogidas durante las cinco visitas mediante el uso de PCR y cultivo en medios de aislamiento específicos, respectivamente.

Análisis bioquímicos

Se realizaron análisis bioquímicos en muestras de heces fecales recogidas durante las visitas V1, V3 y V4. La neopterina y la IgA secretada (slgA) se midieron a partir de sobrenadantes de heces fecales mediante el uso de los kits de ELISA de neopterina (IBL International) y ELISA de IgA secretada humana (EUROBIO) respectivamente. La CRP se midió a partir de muestras de plasma en los diferentes centros médicos de acuerdo con sus propios procedimientos internos.

Aislamiento de ADN y secuenciación metagenómica

Análisis bioinformáticos

Después del filtrado de calidad mediante el uso de Trimmomatic (Bolger, Lohse y Usadel, 2014), la descontaminación de la secuencia huésped se realizó mediante el uso de Bowtie2 (Langmead, Ben y Salzberg, 2013). Para una comparación justa, el número de secuencias de cada muestra se normalizó aleatoriamente a la misma profundidad de secuenciación, es decir, 1500 000 secuencias de extremos pareados por muestra. Después, se realizó un perfil taxonómico con Kraken v.0.10.5-beta (Wood 2014) y la base de datos genómica RefSeq (versión de junio de 2015, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/). La medición de los índices de diversidad a y p medianos se realizó en el software estadístico R después de 10 submuestreos (R Core Team 2015, versión 3.4.4, http://www.R-project.org) mediante el uso de paquetes vegan y phyloseq. Los análisis de resistencia a antibióticos y basados en genes se realizaron a través del mapeo de genes con Bowtie 2 mediante el uso del Catálogo de genes integrados (IGC) (Li y otros, 2014) y MEGARes (https://megares.meglab.org/) respectivamente.

Análisis estadísticos

Pruebas t pareadas

Resultados

Características del paciente

En nuestro estudio se seleccionaron un total de 62 pacientes con BJI en 5 centros diferentes, 42 se consideraron como la población de intención de tratar sobre la que se realizaron algunos análisis. Las características iniciales de los pacientes totales y por protocolo se enumeran en la Tabla 12. Hubo más hombres que mujeres en los pacientes según el protocolo (relación, 2:1) y la edad media fue de 59 años.

Tabla 12: Características demo ráficas clínicas iniciales BMI: Índice de masa corporal

Después se evaluó la inmunidad local y la inflamación en el intestino, mediante la medición de zonulina fecal, calprotectina, neopterina e IgA secretada. Observamos un aumento significativo de los niveles medios de neopterina fecal después de la terapia con antibióticos (V1: 97,7 ng/g de heces fecales frente a 504 ng/g de heces fecales después del tratamiento; p<0,001) lo que destaca el estado inflamatorio intestinal esperado de los pacientes después de la antibioterapia. Los niveles no regresaron al valor de referencia dos semanas después del final de la antibioterapia (285,4 ng/g de heces fecales; p =0,02). Estas variaciones están en línea con las concentraciones de zonulina.

En conjunto, estos datos señalan claramente la presencia de una reacción inflamatoria perjudicial, localmente, después de la antibioterapia. Cabe destacar que casi el 70 % de los pacientes del protocolo OSIRIS, sin tratamiento con FMT, padecieron síntomas gastrointestinales. 9 de ellos, de 42 pacientes con seguimiento, presentaron síntomas de diarrea grave.

Evolución de la composición de la microbiota intestinal

El índice de disimilitud de Bray-Curtis (BC) medido a nivel de especie (datos no mostrados) demuestra la inducción de una disbiosis microbiana después del tratamiento antimicrobiano (BC V1-V3 media: 0,321) y la ausencia de restablecimiento de la comunidad microbiana inicial después de dos semanas (BC V1-V4 media: 0,367).

En el estudio OSIRIS, la abundancia relativa de los 15 géneros productores de butirato analizados anteriormente también se correlaciona negativamente con la neopterina fecal y la abundancia relativa de butirato disminuye después del tratamiento antimicrobiano.

Ejemplo 3: El perfil bacteriano de la muestra de heces usada para producir la composición de microbiota fecal se mantiene en el producto final

Los inóculos producidos como se describe en el documento WO 2016/170285 A1 en un dispositivo patentado (similar al descrito en el documento WO 2016/170290 A1) permiten la excelente conservación de todas las familias y géneros de bacterias pertenecientes a la microbiota humana recogidas. Además, el proceso cerrado evita la contaminación por otras bacterias ambientales.

Se analizaron cuatro heces frescas y cultivos producidos de acuerdo con el proceso descrito anteriormente mediante el uso de análisis de ADNr 16S. Todas las muestras se almacenaron a - 80 °C y el ADN se extrajo mediante el uso del Kit NucleoSpin® Soil (Macherey Nagel). Las bibliotecas de ADNr de 16S se realizaron con el kit de mezcla MyTag HS (Bioline) mediante el uso de cebadores dirigidos a la región V3-V4. Se realizó la secuenciación para obtener 80 000-90 000 pares de lecturas (160 000-180 000 lecturas) por biblioteca. La secuenciación de las bibliotecas de ADNr de 16S se realizó mediante el uso de un secuenciador MiSeq V3 2x300 pb (Illumina).

La microbiota se ha analizado en todos los niveles taxonómicos, y los resultados para las principales familias y géneros se presentan en la Tabla 13 y la Tabla 14.

Estos análisis demuestran que el proceso permite la conservación de todas las bacterias presentes en las heces originales con abundancias relativas cercanas; normalmente, más del 90 % de los géneros observados en las heces iniciales se mantienen en el producto congelado.

Además, los inóculos producidos con el proceso descrito se usaron para inocular ratones axénicos. La microbiota fresca usada para preparar las muestras congeladas también se inoculó a ratones axénicos. Los datos presentados en el documento WO 2016/170285 (A1) muestran que se encontró una excelente consistencia entre los géneros observados en ratones inoculados con heces frescas y ratones inoculados con heces procesadas. Más particularmente, el géneroFacelibacterium,conocido por ser muy sensible a las condiciones aeróbicas, sí colonizó el intestino de los ratones al mismo nivel para ambos grupos, mientras que en un grupo de control inoculado con microbiota procesada con NaCl,Faecalibacteriumno logró colonizar. Por el contrario, el géneroBacteroidescreció en el grupo de NaCl donde se encontró a un nivel similar en ratones inoculados con heces frescas y procesadas. La conclusión fue que el proceso descrito en el documento WO 2016/170285 (A1) permitió una excelente recuperación de los géneros principales presentes en la muestra de heces recogida.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición de microbiota fecal para el uso en la reducción de una inflamación inducida por la terapia antineoplásica combinada con antibioterapia y/o trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) en un paciente con leucemia aguda, en donde la composición de microbiota fecal se ha obtenido mediante un proceso que comprende las etapas de:

(iii) filtrar la muestra diluida,

en donde la proporción de los siguientes 15 géneros aumenta con relación al nivel antes de una transferencia de microbiota fecal (FMT):Blautia, Faecalibacterium, Alistipes, Eubacterium, Bifidobacterium, Ruminococcus, Clostridium, Coprococcus, Odoribacter, Roseburia, Holdemanella, Anaerostipes, Oscillibacter, SubdoligranulumyButyrivibrio,

2. La composición de microbiota fecal para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde, en la etapa (ii) la solución salina acuosa comprende al menos un crioprotector y un agente de carga.

3. La composición de microbiota fecal para el uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la composición de microbiota fecal comprende microbiota de una o varias muestras de heces del paciente.

4. La composición de microbiota fecal para el uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la composición de microbiota fecal comprende al menos 90 % de las especies presentes en al menos una muestra del paciente.

5. La composición de microbiota fecal para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para el uso en la reducción de una inflamación intestinal inducida por tratamiento inducida por la terapia antineoplásica combinada con antibioterapia y/o trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) en un paciente con leucemia aguda.

6. La composición de microbiota fecal para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde se realiza al menos una transferencia de microbiota fecal (FMT) de 1 a 30 días después del final de la terapia antineoplásica.

7. La composición de microbiota fecal para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde se realizan dos FMT en un intervalo de 1-7 días.

8. La composición de microbiota fecal para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la FMT con dicha composición de microbiota fecal conduce a un aumento de la proporción de bacterias beneficiosas y una disminución de la proporción de bacterias nocivas en el tubo gastrointestinal.

9. La composición de microbiota fecal para el uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde las bacterias beneficiosas incluyen bacterias pertenecientes a las familias Lachnospiraceae, Ruminococcaceae, Bifidobacteriaceae, Streptococcaceae, Akkermansiaceae, Lactobacillaceae, Eubacteriaceae, Erysipelotrichaceae, Eggerthellaceae, Clostridiaceae, Prevotellaceae, Oscillospiraceae, Rikenellaceae y Odoribacteraceae.

10. La composición de microbiota fecal para el uso de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, en donde las bacterias nocivas incluyen bacterias pertenecientes a las familias Bacteroidaceae y Enterococcaceae.

11. La composición de microbiota fecal para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la proporción deFaecalibacteriumaumenta y la proporción deBacteroidesdisminuye con relación al nivel antes de una transferencia de microbiota fecal (FMT).

12. La composición de microbiota fecal para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde una transferencia de microbiota fecal (FMT) conduce a una disminución de neopterina en al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 % o al menos 40 %.

13. La composición de microbiota fecal para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde una transferencia de microbiota fecal (FMT) conduce a una disminución del nivel sérico de CRP en al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 % o al menos 40 %.

14. La composición de microbiota fecal para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde una transferencia de microbiota fecal (FMT) conduce a una disminución del nivel sérico de ferritina en al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 % o al menos 40 %.