ES3038393T3 - Cleavable linker for peptide synthesis - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un nuevo componente básico para la síntesis de péptidos, que introduce un sitio de escisión que puede utilizarse para generar fragmentos escindibles posteriores a una secuencia de péptidos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Conector escindible para síntesis peptídica

La presente invención se refiere al campo técnico de síntesis peptídica. Más precisamente, la presente invención proporciona una nueva posibilidad para introducir conectores escindibles en péptidos sintetizados químicamente, creando de este modo nuevos conjugados peptídicos.

Técnica anterior

Los conectores escindibles, definidos como restos químicos que conectan dos funcionalidades a través de un enlace escindible, son herramientas importantes en la síntesis en fase sólida (SPS) y la biología química. Especialmente en la síntesis peptídica en fase sólida (SPPS), estos conectores pueden ayudar a resolver problemas relacionados con las propiedades fisicoquímicas, el manejo y la purificación de péptidos: a través de un conector escindible, los péptidos se pueden modificar con marcas funcionales (por ejemplo, restos potenciadores de solubilidad) y después de la escisión del conector se libera el péptido deseado, con o sin un residuo del conector. Los conectores escindibles se usan ampliamente en síntesis orgánica y síntesis en fase sólida (véase, por ejemplo, Lericheet al.,Bioorg. Med. Chem. 2012, 20, 571-582; Scottet al.,Eur. J. Org. Chem. 2006, 2251-2268). La escisión se puede realizar por medios químicos (nucleófilos, reactivos básicos, electrófilos, reactivos ácidos, reactivos reductores, reactivos oxidantes, catalizadores organometálicos y metálicos), por medios fotoquímicos o enzimáticos. En la síntesis peptídica, los conectores escindibles se usan principalmente para enlazar el péptido naciente a una resina que se puede separar por escisión después de completar la síntesis peptídica en fase sólida (véase, por ejemplo, Novabiochem Peptide Synthesis Catalogue, Merck; Jensenet al.(Ed.), Peptide Synthesis and Application, Methods in Molecular Biology, vol. 1047, Springer Protocols, Humana Press, Springer, New York, 2013).

Para la incorporación interna en una secuencia peptídica, también se han descrito unidades constituyentes de conector escindible. El ácido a,Y-diamino-p-hidroxibutanoico y las unidades constituyentes de conector a base de ácido Y-amino-a,p-dihidroxibutanoico para síntesis peptídica se han descrito por Amoreet al.,ChemBioChem 2013, 14, 123-131. Estos conectores se pueden escindir por medios oxidativos, es decir, usando peryodato de sodio. Desventajosa puede ser la oxidación de componentes sensibles a la oxidación dentro del péptido como residuos de cisteína o metionina.

Las unidades constituyentes de conector fotoescindible para síntesis peptídica que se han descrito por Kimet al.,Synlett 2013, 24, 733-736 son otro ejemplo. Las desventajas de la fotoirradiación pueden ser la escisión de conector incompleta y las reacciones secundarias que surgen de reacciones de radicales. Un conector escindible de forma cíclica para alcoholes basado en ácido [2-(aminometil)fenil]acético se ha descrito por Xiaoet al.,J. Comb. Chem. 1999, 1, 379-382. Este conector solo se ha aplicado para la síntesis y liberación de alcoholes usando un soporte sólido. No se ha descrito un derivado que se pueda usar para incorporación interna en síntesis peptídica. Se ha descrito la síntesis peptídica aplicando marcas de solubilización escindibles usando diferentes químicas y condiciones de escisión (véase, por ejemplo: Jacobsenet al.,JACS 2016, 138, 11777-11782; documento WO 2016047794).

Se ha descrito la síntesis peptídica aplicando marcas de purificación escindibles usando diferentes químicas y condiciones de escisión (véase, por ejemplo: Funakoshiet al.,Proceedings of the National Academy of Sciences 1991, 88, 6981-6985; Funakoshiet al.,J. Chromatogr. 1993, 638, 21-27; Canne,et al.Tetrahedron Letters 1997, 38, 3361-3364; Vizzavonaetal.,Tetrahedron Letters 2002, 43, 8693-8696; Haraet al.,Journal of Peptide Science, 2009, 15, 369-376; Aucagneet al.,Angewandte Chemie International Edition 2012, 51, 11320-11324; Reimannet al.,Angewandte Chemie International Edition 2015, 54, 306-310; Haraet al.,Journal of Peptide Science, 2016, 15, 379-382; patentes: Aucagneet al.,documento WO 2011058188, Zitterbartet al.,documento WO 2017129818 A1). En este enfoque, los conectores se unen normalmente en el último ciclo de SPPS al extremo N de la cadena peptídica en crecimiento para permitir la inmovilización selectiva del péptido de longitud completa deseado sobre un soporte sólido. Los productos secundarios se retiran lavando el soporte sólido y finalmente el péptido diana se libera por escisión del conector. Los conectores escindibles usados para la purificación no cromatográfica de péptidos normalmente requieren condiciones básicas fuertes. En estas condiciones, se pueden producir reacciones secundarias no deseadas, por ejemplo, racemización. Un problema importante de los conectores de eliminación de sulfonato usados con frecuencia son los electrófilos altamente reactivos, que se generan durante la reacción de escisión. Estos intermedios reaccionan rápidamente con los grupos de cadena lateral nucleófilos (por ejemplo, arginina, cisteína) y en consecuencia limitan la aplicación de los conectores escindibles basados en sulfonato. El ejemplo bastante raro de un conector de purificación escindible oxidativamente de Vizzavonaet al.(Tetrahedron Letters 2002, 43, 8693-8696) eluden los problemas mencionados anteriormente, pero lo más probable es que no son compatibles con péptidos que contienen metionina o cisteína.

Los dipéptidos de isoacilo son herramientas para potenciar la eficacia sintética en Fmoc SPPS (Y. Sohmaet al.,Chem. Commun. 2004, 124-125). Los dipéptidos de isoacilo consisten en un derivado de serina o treonina protegido con Boc en el que el grupo p-hidroxilo se acila por un aminoácido protegido con Fmoc. Después de la incorporación de una unidad constituyente de dipéptido de isoacilo dentro de la secuencia de un péptido, la estructura secundaria del péptido se cambia permitiendo una síntesis más eficaz. Además, después de la escisión y desprotección, la forma isoacilo del péptido se puede purificar por HPLC. A pH 7,4, tiene lugar la migración de acilo intramolecular O ^N para generar el péptido enlazado regularmente a amida. Aplicando estas unidades constituyentes de dipéptido de isoacilo no se puede realizar ninguna reacción de escisión.

Los conjugados oligonucleótido-péptido son una clase emergente para aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. Sin embargo, la síntesis de estos conjugados sigue siendo un gran desafío (véanse las revisiones de N. Venkatesanet al.,Chemical Reviews 2006, 106, 3712-3761 y K. Luet al.,Bioconjugate Chemistry 2010, 21, 187-202). Un enfoque directo sería ensamblar los conjugados oligonucleótido-péptido deseados en un soporte polimérico por medio de síntesis basada en fase sólida. Desafortunadamente, los procedimientos establecidos de síntesis peptídica y oligonucleotídica en fase sólida no son totalmente compatibles. La síntesis en fase sólida de péptidos requiere el uso de ácidos fuertes y previene de este modo la síntesis de conjugados oligonucleótido-péptido debido a la inestabilidad de los oligonucleótidos en condiciones ácidas. Esta es la razón por la que la síntesis por etapas de conjugados oligonucleótido-péptido normalmente avanza ensamblando en primer lugar el péptido, seguido de la síntesis oligonucleotídica en el mismo soporte sólido. Aunque esta estrategia se ha aplicado con éxito para la síntesis de conjugados oligonucleótido-péptido bastante simples, el procedimiento todavía carece del espectro completo de grupos protectores compatibles para abordar la química desafiante de las cadenas laterales de aminoácidos. En conclusión, no está disponible un procedimiento aplicable fiable y general para la síntesis basada en fase sólida por etapas de conjugados oligonucleótido-péptido. Por lo tanto, la síntesis de conjugados oligonucleótido-péptido normalmente avanza empleando una estrategia convergente. Aquí, el péptido y los fragmentos oligonucleotídicos se sintetizan por separado por el uso de unidades constituyentes rutinarias y protocolos de síntesis en fase sólida. Después de la purificación, los dos fragmentos se conjugan y el conjugado oligonucleótido-péptido deseado se aísla después de una etapa de purificación adicional. Los bajos rendimientos globales, el incremento en el gasto de tiempo y los altos costes son las principales desventajas de esta estrategia, que resultan de las numerosas etapas de purificación y procedimientos de liofilización intermedios mencionados anteriormente. Además, las etapas de purificación basadas en HPLC y la liofilización intermedia impiden la posibilidad de lograr una síntesis de alto rendimiento de conjugados oligonucleótido-péptido por medio de automatización. Estas desventajas se vuelven en particular problemáticas, si se necesita sintetizar un gran número de conjugados oligonucleótido-péptido, lo que se requiere, por ejemplo, para cribar un péptido de transfección adecuado en un oligonucleótido antisentido conocido. Un procedimiento perfecto combinaría la facilidad de la síntesis en fase sólida establecida y la conjugación postsintética mientras evita la necesidad de cualquier purificación basada en HPLC.

Sin embargo, todos los procedimientos divulgados anteriormente para aplicar conectores escindibles para síntesis peptídica tienen varias desventajas como incorporación o escisión ineficaz, condiciones de escisión duras y dañinas, síntesis de reactivos complejos o uso restringido.

Breve descripción de la invención

Por lo tanto, la presente invención proporciona una unidad constituyente que comprende la estructura

en la que 2 < n < 24, m = 2 o 3, A es Boc y B es Fmoc.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un compuesto que comprende la estructura

en la que 2 < n < 24, m = 2 o 3, X es un péptido o un soporte sólido e Y se selecciona de un grupo que consiste en PEG, polilisina, poliarginina, poli(ácido glutámico), poli(ácido aspártico), biotina, hidracina, aminooxi, acida, alquinilo, alquenilo, aldehído, cetona, pirroloalanina, carboxi y tiol.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento que comprende las etapas de sintetizar un péptido en un soporte sólido, comprendiendo dicho péptido un grupo amino terminal,

proporcionar una unidad constituyente como se divulga anteriormente, y

acoplar dicha unidad constituyente a dicho péptido

Dicho procedimiento puede comprender además las etapas

retirar el grupo protector B, y

acoplar al menos una unidad constituyente de aminoácido al grupo amino terminal

De forma alternativa, dicho procedimiento puede comprender además etapas

retirar el grupo protector B,

acoplar opcionalmente al menos una unidad constituyente de aminoácido al grupo amino terminal, y acoplar una marca o un grupo funcional al grupo amino terminal.

Dicho grupo funcional o marca se puede seleccionar de un grupo que consiste en PEG, polilisina, poliarginina, poli(ácido glutámico), poli(ácido aspártico), biotina, hidracina, aminooxi, acida, alquinilo, alquenilo, aldehído, pirroloalanina, carboxi y tiol.

Además, los procedimientos divulgados anteriormente pueden comprender además la etapa de

retirar el grupo protector A a un pH < 6, retirando también de este modo otros grupos protectores presentes en dicho péptido y escindiendo dicho péptido del soporte sólido, lo que se puede producir a un pH > 8.

En un modo de realización, la presente invención proporciona un procedimiento que comprende las etapas de a) sintetizar un péptido sobre un soporte sólido, comprendiendo dicho péptido un grupo amino terminal, b) proporcionar una unidad constituyente como se divulga anteriormente, y

c) acoplar dicha unidad constituyente a dicho péptido

d) retirar el grupo protector B,

e) acoplar opcionalmente al menos una unidad constituyente de aminoácido al grupo amino terminal, y f) acoplar una marca de solubilización o de inmovilización al grupo amino terminal,

y que comprende además las etapas

g) retirar el grupo protector A a un pH < 6, retirando también de este modo otros grupos protectores presentes en dicho péptido y escindiendo dicho péptido del soporte sólido

h) purificar dicho péptido, y

i) separar por escisión dicha marca de solubilización a un pH > 8, o

j) retirar el grupo protector A a un pH < 6, retirando también de este modo otros grupos protectores presentes en dicho péptido y escindiendo dicho péptido del soporte sólido

h) inmovilizar dicho péptido por medio de dicha marca de inmovilización en un soporte sólido

i) conjugar opcionalmente dicho péptido con una entidad química adicional, y

j) separar por escisión dicha marca de inmovilización a un pH > 8.

Dicha entidad química puede ser un compuesto que contiene ácido nucleico, oligonucleótido o nucleótido, preferentemente un nucleósido-hexafosfato.

Breve descripción de las figuras

Figura 1

Síntesis peptídica que comprende la introducción del conector 1 de acuerdo con el ejemplo 3

a) síntesis peptídica

b) solvatación en solución de NaHCO30,05 M (pH = 8,2), desencadenando ciclación

c) La CL-EM muestra la escisión de péptido AB en A y B con el tiempo

Figura 2

Síntesis de un péptido hidrófobo de acuerdo con el ejemplo 4

a) escisión de marca polilisina del péptido insoluble 12.

b) CL-EM de H-KKKKK1AhaGISFSIRFAIWIRFG-NH2 (10)

c) EM (ESI) de péptido insoluble 12

Figura 3

Purificación por afinidad de acuerdo con el ejemplo 5

a) mezcla de péptido bruto después de SPPS y escisión de resina

b) sobrenadante después de 30 min

c) sobrenadante después de incubación con NH<4>HCO<3>0,02 M (pH=8,8) durante 30 min

Figura 4

Esquema: síntesis rápida de conjugados nucleósido-péptido de acuerdo con el ejemplo 7

a) síntesis de péptidos y conjugados nucleósido-péptido por conjugación con soporte sólido y purificación no cromatográfica

Figura 5

Análisis HPLC de conjugados obtenidos en el ejemplo 7

Descripción detallada de la invención

Lista de definiciones y abreviaturas:

Fmoc: fluorenilmetiloxicarbonilo

Boc: ferc-butiloxicarbonilo

SPPS: síntesis peptídica en fase sólida

SPS: síntesis en fase sólida

TFA: ácido trifluoroacético

DBU: 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno

DMF: N,N-dimetilformamida

DAB: ácido diaminobutírico

EDC: N-(3-d¡met¡lam¡noprop¡l)-W-et¡lcarbod¡¡m¡da

DMAP: N,N-d¡met¡lp¡r¡d¡n-4-am¡na

HATU: hexafluorofosfato de 3-óx¡do de 1-[b¡s(d¡met¡lam¡no)met¡leno]-1H-1,2,3-tr¡azolo[4,5-b]p¡r¡d¡n¡o

DIPEA: N,N-d¡¡soprop¡let¡lam¡na

THPTA: tr¡s(3-h¡drox¡prop¡ltr¡azol¡lmet¡l)am¡na

Pra: proparg¡lgl¡c¡na

Aha: ac¡dohomoalan¡na

TIS: tr¡¡soprop¡ls¡lano

Definiciones:

Marca:en el contexto de la presente ¡nvendón, una marca es un resto quím¡co que altera las prop¡edades quím¡cas o fís¡cas de una molécula y/o hace que la molécula sea reconoc¡ble. Por ejemplo, una marca de pur¡f¡cac¡ón puede fac¡l¡tar la pur¡f¡cac¡ón de una molécula. Una marca puede ser una marca de ¡nmov¡l¡zac¡ón, es dec¡r, un resto quím¡co que se puede un¡r a un soporte sól¡do. Una marca tamb¡én puede ser una marca potenc¡adora de solub¡l¡dad, es dec¡r, un grupo quím¡co que, s¡ está presente, ¡ncrementa la solub¡l¡dad de una determ¡nada molécula.

Grupo funcional:los grupos func¡onales son grupos quím¡cos específ¡cos (restos) de átomos o enlaces dentro de moléculas que son responsables de las reacc¡ones quím¡cas característ¡cas de esas moléculas. Los grupos func¡onales son sust¡tuyentes o restos específ¡cos dentro de las moléculas que son responsables de las reacc¡ones quím¡cas característ¡cas de esas moléculas. El m¡smo grupo func¡onal exper¡mentará la(s) m¡sma(s) reacc¡ón/reacc¡ones quím¡ca(s) o s¡m¡lar(es), ¡ndepend¡entemente del tamaño de la molécula de la que forme parte. Esto perm¡te la pred¡cc¡ón s¡stemát¡ca de reacc¡ones quím¡cas y el comportam¡ento de compuestos quím¡cos y d¡seño de síntes¡s quím¡cas. Además, la react¡v¡dad de un grupo func¡onal se puede mod¡f¡car por otros grupos func¡onales cercanos. En síntes¡s orgán¡ca, la ¡nterconvers¡ón de grupos func¡onales es uno de los t¡pos bás¡cos de transformac¡ones. Los grupos func¡onales son grupos de uno o más átomos de prop¡edades quím¡cas d¡st¡nt¡vas s¡n ¡mportar a qué se unan. Los átomos de grupos func¡onales se enlazan entre sí y al resto de la molécula por enlaces covalentes. Para las un¡dades repet¡t¡vas de polímeros, los grupos func¡onales se unen a su núcleo apolar de átomos de carbono y por tanto añaden carácter quím¡co a las cadenas de carbono. Los grupos func¡onales tamb¡én se pueden cargar.

Grupo protector:

El térm¡no "grupo protector" o su s¡nón¡mo "grupo de protecc¡ón" ¡nd¡ca el grupo que bloquea select¡vamente un s¡t¡o react¡vo en un compuesto mult¡func¡onal de modo que una reacc¡ón quím¡ca se puede llevar a cabo select¡vamente en otro s¡t¡o react¡vo desproteg¡do en el sent¡do convenc¡onalmente asoc¡ado con él en quím¡ca s¡ntét¡ca. Los grupos protectores se pueden ret¡rar en el punto aprop¡ado. Los grupos protectores son grupos protectores de am¡no, grupos protectores de carbox¡ o grupos protectores de h¡drox¡. Un grupo protector o grupo de protecc¡ón o grupo de bloqueo se ¡ntroduce en una molécula por mod¡f¡cac¡ón quím¡ca de un grupo func¡onal para obtener qu¡m¡oselect¡v¡dad en una reacc¡ón quím¡ca poster¡or. Se ¡ntroduce un grupo protector para bloquear o al menos reduc¡r la react¡v¡dad de grupos func¡onales. Una desprotecc¡ón es una etapa quím¡ca de ret¡rada de un grupo protector. Los grupos protectores pert¡nentes en el campo de la síntes¡s peptíd¡ca son grupos protectores láb¡les a bases y grupos protectores láb¡les a ác¡dos. Los grupos protectores láb¡les a bases se separan por esc¡s¡ón a un pH entre 7,5 y 12, pero preferentemente a un pH entre 8,0 y 10. Los grupos protectores láb¡les a ác¡dos se separan por esc¡s¡ón a un pH entre 6,5 y 3, pero preferentemente a un pH entre 6,0 y 5. Para la presente ¡nvenc¡ón, los grupos protectores de am¡no son de part¡cular ¡mportanc¡a. Los grupos protectores de am¡no son grupos dest¡nados a proteger un grupo am¡no e ¡ncluyen benc¡lo, benc¡lox¡carbon¡lo (carbobenc¡lox¡, CBZ), Fmoc (9-fluoren¡lmet¡lox¡carbon¡lo), p-metox¡benc¡lox¡carbon¡lo, p-n¡trobenc¡lox¡carbon¡lo, terc-butox¡carbon¡lo (BOC) y tr¡fluoroacet¡lo. Los ejemplos de estos grupos se encuentran en T. W. Greene y P. G. M. Wuts, "Protect¡ve Groups ¡n Organ¡c Synthes¡s", 2.a ed., John W¡ley & Sons, Inc., New York, N.Y., 1991, capítulo 5; E. Haslam, "Protect¡ve Groups ¡n Organ¡c Chem¡stry", J. G. W. McOm¡e, Ed., Plenum Press, New York, N.Y., 1973, capítulo 5, y T.W. Greene, "Protect¡ve Groups ¡n Organ¡c Synthes¡s", John W¡ley and Sons, New York, NY, 1981, capítulo 5.

Péptido:un pépt¡do es una cadena de un¡dades const¡tuyentes de am¡noác¡dos enlazados a través de enlaces am¡da con una long¡tud de 2 a 120 res¡duos.

Se han desarrollado conectores esc¡nd¡bles novedosos para síntes¡s peptíd¡ca. La esc¡s¡ón se produce en cond¡c¡ones bás¡cas suaves. Los conectores se basan en un núcleo de 4-am¡nobutanoato que exper¡menta lactamización intramolecular a pH >8 escindiendo el enlace éster liberando dos fragmentos, el alcohol N terminal y la lactama C terminal (esquema 1a). Como unidad constituyente protegida con Na-Fmoc-Nv-Boc (esquema 1b), este conector escindible de aminobutanoato se puede emplear en la síntesis peptídica en fase sólida. El conector de aminobutanoato1resultó ser estable durante la síntesis peptídica convencional y sorprendentemente durante una desprotección de Fmoc del aminoácido sucesivo sin ciclación a una dicetopiperacina de 6 miembros y se observó el correspondiente péptido de ruptura.

Esquema 1

a) Escisión cíclica del conector (n>1).

b) Fórmula general del conector escindible protegido (n >1).

Durante la síntesis peptídica en fase sólida, el grupo amino protegido con Nv-Boc no es reactivo y el conector de aminobutanoato permanece intacto. La escisión del péptido del soporte sólido y la desprotección de grupos protectores en condiciones ácidas da lugar a la retirada del grupo protector Nv-Boc del conector de aminobutanoato. Dado que el grupo amino se protona en las condiciones de escisión y desprotección ácidas, la reacción de lactamización se suprime totalmente y el conector de aminobutanoato permanece intacto. Por lo tanto, el péptido que contiene el conector de aminobutanoato intacto también se puede purificar en condiciones ácidas (es decir, eluyente de agua/acetonitrilo/ácido trifluoroacético). En condiciones básicas suaves, la escisión del conector de aminobutanoato avanza por medio de una reacción de ciclación intramolecular, liberando dos péptidos, uno como un N-alcohol y el otro como una lactama C terminal. El concepto general se muestra en el esquema 2 que muestra la síntesis peptídica en fase sólida con un conector de aminobutanoato (n>1) y la escisión final con liberación de dos fragmentos peptídicos.

Se ha descubierto que un conector escindible con n = 1 no es adecuado ya que se produjeron reacciones secundarias durante la síntesis peptídica en fase sólida (es decir, escisión de éster). Sin embargo, los conectores escindibles con n = 2 y n = 3 fueron compatibles con la síntesis peptídica en fase sólida y proporcionaron los péptidos que contienen conector deseados, que se pudieron escindir en condiciones alcalinas suaves. Por lo tanto, las unidades constituyentes mencionadas anteriormente se pueden usar para añadir una variedad de grupos funcionales al extremo N de un péptido que se puede retirar en una etapa de procedimiento posterior.

Una aplicación de añadir un grupo funcional escindible es introducir una marca hidrófila en el extremo N de un péptido hidrófobo para permitir la purificación (es decir, por HPLC) de dicho péptido hidrófobo. Después de la purificación, la marca de solubilización se puede separar por escisión en condiciones básicas suaves para liberar el péptido diana hidrófobo purificado.

El procedimiento también se puede aplicar para una síntesis mejorada de conjugados oligonucleótido-péptido. Esto es de particular interés, si el péptido contiene muchos residuos hidrófobos. Por ejemplo, en primer lugar se puede sintetizar el péptido hidrófobo, que contiene un sitio de conjugación para la unión del oligonucleótido, tal como acidohomoalanina. A continuación, se acopla el conector de aminobutanoato escindible, seguido de la introducción de una secuencia de marca de solubilización. Después de la escisión y desprotección, el péptido se puede purificar por HPLC y finalmente conjugarse con un oligonucleótido funcionalizado con un sitio de conjugación. Dicho sitio de conjugación, por ejemplo, puede ser un grupo alquino. Después de esto, el conjugado se puede purificar y la marca de solubilización se puede separar por escisión en condiciones alcalinas suaves.

Otra aplicación es la introducción de una marca de purificación que se puede introducir en el extremo N de un péptido. La biotina es un ejemplo destacado de dicha marca de purificación. En primer lugar, el péptido se sintetiza por medio de SPPS que incluye una etapa de adición de caperuza después de cada acoplamiento. Después de esto, el conector escindible se acopla al extremo N del péptido y finalmente la biotina se acopla en el conector escindible. Después de la escisión y desprotección en condiciones ácidas, el péptido marcado con biotina se puede unir a microesferas recubiertas con estreptavidina, que son preferentemente microesferas magnéticas. Los subproductos no biotinilados de SPPS (es decir, secuencias de fallo, deleciones) se pueden retirar por lavado. Después de esto, el péptido purificado se puede liberar de las microesferas de estreptavidina escindiendo el conector en tratamiento alcalino suave.

Los procedimientos contemporáneos para la síntesis convergente de conjugados oligonucleótido-péptido requieren múltiples etapas de purificación. Por lo tanto, el cribado de numerosos conjugados oligonucleótido-péptido es un esfuerzo que consume tiempo y dinero. El procedimiento de la invención permite la síntesis rápida de conjugados de (oligo)nucleótido-péptido. El procedimiento de la invención que usa la unidad constituyente de conector escindible de la invención evita la necesidad de tediosas etapas de purificación por HPLC por la combinación de unidades de reactividad quimioselectivas y marcas de purificación escindibles y que permite la escisión suave de la molécula de interés. Este enfoque de purificación no cromatográfica permite la síntesis paralela de numerosos conjugados con buen rendimiento y pureza.

Como se mostrará en los ejemplos, el conector escindible de la invención es fácil de sintetizar, permite la incorporación eficaz en péptidos y la escisión suave en condiciones ligeramente alcalinas, no destructoras.

Ejemplos

Ejemplo 1: síntesis de conector 1 (m=2; n=3)

Síntesis del compuesto 2:

4-hidroxibutanoato de alilo

A una solución de Y-butirolactona (5,00 g, 58,1 mmol) en DMF (17 ml) se le añadieron H<2>O (13,6 g, 13,6 ml, 755 mmol) y DBU (8,85 g, 8,67 ml, 58,1 mmol). Después de 1 h de agitación a TA, se añadió bromuro de alilo (10,5 g, 7,53 ml, 87,2 mmol) a la solución. Se desactivó la reacción después de 1 h por adición de solución ac. sat. de NH4Cl (30 ml) y se extrajo la fase acuosa con acetato de etilo (3 x 100 ml). Se secaron las capas orgánicas combinadas sobre Na2SO4 y se retiró el disolvente bajo presión reducida. La cromatografía en columna sobre SiO<2>(n-hexano/acetato de etilo = 1:1) dio el producto deseado (5,90 g, 40,9 mmol, 71 %) como un aceite incoloro.Rf (n-hexano/acetato de etilo = 1:1) = 0,33 (KMnO4)

RMN de1H(400 MHz, CDCla): 5 = 6,06 - 5,86 (m, 1H), 5,42 - 5,04 (m, 2H), 4,59 (td,J= 1,4, 5,7 Hz, 1H), 4,35 (t,J= 7,0 Hz, 1H), 4,25 - 4,06 (m, 1H), 3,73 - 3,67 (m, 1H), 2,55 - 2,41 (m, 2H), 2,34 - 2,16 (m, 1H), 1,99 - 1,83 (m, 1H), 1,62 (s, 1H).

Síntesis del compuesto 3:

2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-4-((ferc-butoxicarbonil)amino)butanoato de 4-(aliloxi)-4-oxobutilo

Se disolvieron Fmoc-Dab(Boc)-OH disponible comercialmente (1,00 g, 2,27 mmol) y el compuesto2(360 mg, 2,50 mmol) en CH<2>Cl<2>(7,5 ml) y se enfrió hasta 0 °C. Se añadieron EDC-HCl (479 mg, 2,50 mmol) y DMAP (28 mg, 0,227 mmol) a la solución. Después de 1 h agitando a TA se añadió solución sat. ac. de NaCl (25 ml) a la mezcla de reacción que a continuación se extrajo con CH<2>O<2>(3 x 50 ml). Se secaron las capas orgánicas combinadas sobre Na2SO4 y se retiró el disolvente bajo presión reducida dando el producto deseado (1,27 g, 2,24 mmol, 99 %) como una resina incolora.

Rf (n-hexano/acetato de etilo = 1:1) = 0,63

RMN de1H(400 MHz, CDCla): 5 = 7,80 - 7,72 (m, 2H), 7,64 - 7,56 (m, 2H), 7,44 - 7,36 (m, 2H), 7,35 - 7,28 (m, 2H), 5,95 - 5,84 (m, 1H), 5,68 - 5,57 (m, 1H), 5,34 - 5,20 (m, 2H), 5,10 - 4,98 (m, 1H), 4,61 - 4,55 (m, 2H), 4,46 - 4,32 (m, 3H), 4,26 - 4,15 (m, 3H), 3,47 - 3,30 (m, 1H), 3,02 - 2,93 (m, J=5,3, 5,3, 8,3, 14,0 Hz, 1H), 2,46 - 2,37 (m, 2H), 2,12 - 1,94 (m, 3H), 1,82 - 1,72 (m, 1H), 1,51-1,35 (m, 9H).

EM(ESI): hallado 567,3 [M H]+, 467,3 [M H - Boc]+, calculado 567,3 [M H]+

Síntesis de conector1:

Ácido 4-((2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-4-((ferc-butoxicarbonil)amino)butanoil)oxi)butanoico

A una solución de 2-(((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-4-((ferc-butoxicarbonil)amino)butanoato de 4-(aliloxi)-4-oxobutilo3(4,5 g, 7,94 mmol) en CH<2>Cl<2>/acetato de etilo 2:1 (75 ml) se le añadieron tetraquis(trifenilfosfina)paladio(0) (275 mg, 0,238 mmol), trifenilfosfina (104 mg, 0,395 mmol) y 2-etilhexanoato de sodio (1,97 g, 11,9 mmol). Se agitó la reacción a TA durante 3 horas. A continuación, se añadió HCl 1 M (50 ml). Se extrajo la mezcla de reacción con CH<2>O<2>(3 x 150 ml). Se secaron las capas orgánicas combinadas sobre Na2SO4y se retiró el disolvente bajo presión reducida. La cromatografía en columna sobre SiO<2>(acetato de etilo metanol al 1 %) dio el producto deseado1como un sólido incoloro.

Rf (acetato de etilo) = 0,38

RMN de1H(400 MHz, CDCla): 5 = 7,79 - 7,73 (m, 2H), 7,64 - 7,55 (m, 2H), 7,44 - 7,37 (m, 2H), 7,35 - 7,28 (m, 2H), 5,70 - 5,54 (m, 1H), 5,18 - 5,02 (m, 1H), 4,47 - 4,33 (m, 3H), 4,28 - 4,16 (m, 3H), 3,43 - 3,32 (m, 1H), 3,04 - 2,94 (m, 1H), 2,55 - 2,25 (m, 3H), 2,15 - 1,98 (m, 3H), 1,48 - 1,38 (m, 9H).

EM(ESI): hallado 527,3 [M H]+, 427,2 [M H - Boc]+, calculado 527,2 [M H]+

Ejemplo 2: Síntesis de conector 4 (m=2; n=2)

Esquema 4 4

2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-4-((ferc-butoxicarbonil)amino)butanoato de 3-(benciloxi)-3-oxopropilo

Se disolvieron Fmoc-Dab(Boc)-OH (2,5 g, 5,68 mmol) y 3-hidroxipropanoato de bencilo (1,12 g, 6,25 mmol) disponibles comercialmente en CH<2>Cl<2>(20 ml) y se enfrió hasta 0 °C. A esta solución se le añadieron EDC-HCl (1,20 g, 6,25 mmol) y DMAP (70,0 mg, 0,568 mmol). Después de 1 h, se añadió solución sat. ac. de NaCl (25 ml), se separó la fase orgánica y se extrajo la fase acuosa con CH<2>O<2>(3 x 50 ml). Se secaron las capas orgánicas combinadas sobre Na2SO4 y se retiró el disolvente bajo presión reducida. La cromatografía en columna sobre SiO<2>(n-hexano/EtOAc 6:4) dio el producto deseado (2,84 g, 4,71 mmol, 83 %) como una resina incolora.

RMN de 1H(400 MHz, CDCla) 5 = 7,78 - 7,74 (m, 2H), 7,65 - 7,58 (m, 2H), 7,35 (s, 9H), 5,77 - 5,66 (m, 1H), 5,17 -5,14 (m, 2H), 5,13 - 5,04 (m, 1H), 4,54 - 4,46 (m, 1H), 4,45 - 4,30 (m, 4H), 4,26 - 4,20 (m, 1H), 3,91 - 3,87 (m, 1H), 3,46 - 3,33 (m, 1H), 2,97 - 2,88 (m, 1H), 2,77 - 2,70 (m, 2H), 2,05 - 2,03 (m, 1H), 2,01 - 1,92 (m, 1H), 1,79 - 1,70 (m, 1H), 1,47 - 1,42 (m, 9H).

Síntesis del compuesto4:

ácido 3-((2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-4-((ferc-butoxicarbonil)amino)butanoil)oxi)propanoico

Se disolvió el compuesto4(2,8 g, 4,65 mmol) en MeOH (50 ml). Se añadió paladio sobre carbono (Pd/C al 10 %, 742 mg, 0,69 mmol) a la solución y se burbujeó H<2>en la mezcla de reacción. Después de 1 h, se diluyó la reacción con CH<2>O<2>y se filtró a través de un tapón de sílice. Se retiró el disolvente bajo presión reducida dando el producto deseado (0,6 g, 1,17 mmol, 25 %) como un sólido incoloro.

EM(ESI): 513,0 [M H], calculado 513,2 [M H]+.

Ejemplo 3: síntesis peptídica aplicando el conector 1:

Se sintetizó un péptido con la secuencia H-KATSG -(conector 1)- GLF-NH<2>(7) (SEQ. ID. NO: 1) por síntesis peptídica en fase sólida y se purificó por HPLC preparativa. El conector1fue estable durante la síntesis peptídica y, sorprendentemente también durante la desprotección de Fmoc con piperidina del aminoácido sucesivo (Gly en la posición 5). No se observó ciclación a una dicetopiperacina de 6 miembros y el correspondiente péptido de ruptura (figura 1 a). A continuación, se disolvió el péptido purificado (AB en la figura 1 b) en solución de NaHCO30,05 M (pH = 8,2), lo que desencadenó la reacción de ciclación intramolecular liberando los dos fragmentos8y9(A y B, figura 1b), identificados por CL-EM (figura 1c).

Ejemplo 4: síntesis de péptido hidrófobo:

H-AhaGISFSIRFAIWIRFG-NH<2>(AHA = acidohomoalanina) (SEQ. ID. NO: 2) es un péptido extremadamente hidrófobo, que es insoluble en agua, lo que hace que el manejo y la purificación porHPLcdespués de la síntesis sean prácticamente imposibles. Para potenciar la solubilidad de este péptido, se preparó una variante en la que se sintetizó una marca de polilisina N terminal escindible después de la secuencia peptídica y se incorporó el conector escindible1: H-KKKKK-(conector 1)AhaGISFSIRFAIWIRFG-NH2 (10)(SEQ. ID. NO: 3). La síntesis y purificación de este péptido modificado avanzó sin problemas de acuerdo con el ejemplo 3 (figura 2b). Se disolvió el péptido puro10en una solución acuosa de NaHCO30,05 M y se agitó durante 2 h a TA (figura 2a). La reacción de escisión liberó los dos péptidos11y12: aunque la marca de polilisina11es soluble en agua, el péptido12precipitó en las condiciones de reacción y se pudo aislar fácilmente con alta pureza por centrifugación.

Figura 2b): CL-EM de H-KKKKK(conector 1)-AhaGISFSIRFAIWIRFG-NH2 (10),EM(ESI): 545,4 [M+5H]5+,

681,6 [M+4H]4+, 908,3 [M+3H]3+, 1362,0 [M+2H]2+.

Figura 2c): EM (ESI) de péptido insoluble12 (EM(ESI): 661,5 [M+3H]3+, 991,3 [M+2H]2+, 1322,0 [3M 2H]2+,

1983,1[M+H]+).

Ejemplo 5: purificación por afinidad por medio de interacción biotina / estreptavidina

La introducción de marcadores de afinidad N terminales en combinación con un procedimiento de síntesis peptídica que aplica adición de caperuza después de cada etapa de acoplamiento permite la purificación por afinidad de productos de longitud completa. Se captura el péptido de longitud completa en microesferas magnéticas recubiertas con estreptavidina, se retiran subproductos (secuencias más cortas) por filtración y se libera el péptido de longitud completa puro.

Después de la SPPS del péptido diana, en primer lugar el conector1y a continuación Fmoc-Glu(biotinil-PEG)-OH se acoplaron al extremo N del péptido. Esto dio como resultado H-GluBiotinilPEG-1-IIKKSTALL-NH2 (13) (Se Q.ID. NO: 4). Como la secuencia peptídica contiene varios aminoácidos estéricamente exigentes, se obtuvo una mezcla compleja de péptido de longitud completa y fragmentos más cortos acetilados después de la escisión de la resina. Se disolvió el producto bruto en un tampón fosfato a pH = 6,2 y se incubó durante 30 minutos con microesferas magnéticas recubiertas con estreptavidina. Se analizó el sobrenadante por CL-EM, lo que indica la retirada completa del péptido biotinilado de la mezcla. Se retiró la solución tampón que contenía subproducto y se lavaron las microesferas varias veces con tampón fosfato (pH = 6,2). Después, se añadió un tampón de escisión volátil (NH<4>HCO<3>, 0,02 M, pH = 8,8) a las microesferas y, después de 30 min de incubación, se liberó el péptido deseado14de las microesferas.

Ac-Péptido Lavado

Subproductos

Esquema 5

Los resultados se muestran en la figura 3. La figura 3a muestra la mezcla de péptido bruto obtenida después de SPPS y escisión de la resina. La figura 3b muestra el sobrenadante después de 30 min de incubación de la mezcla de péptido bruto en microesferas magnéticas recubiertas con estreptavidina en tampón fosfato a pH = 6,2. La marca de biotina N terminal que contiene el péptido13se captura completamente por estreptavidina. c) Después de separar por lavado los subproductos peptídicos acetilados e incubar las microesferas con estreptavidina magnéticas con NH<4>HCO<3>a pH 8,8 durante 30 min para liberar el péptido deseado HO(CH2)3CO-IIKKSTALL-NH2 (14)(SEQ. ID. NO: 4)

Ejemplo 6: síntesis de conjugados ADN-péptido empleando marca de solubilización escindible en el péptido

Se sintetizó un péptido con la secuencia H-PEG10(conector 1)Aha AFDYLAQYHGG-NH<2>(15)(SEQ ID NO: 5) por SPPS (Aha = acidohomoalanina). La conjugación con el ácido nucleico modificado con hexinilo se realizó por química "clic". Se mezcló una solución del péptido modificado con acido15(4 mM en DMSO/fBuOH 3:1, 50 |jl) con una solución de 5'-hexinil-dT20-3' (0,55 mM en H<2>O, 180 j l) que se sintetizó de acuerdo con el enfoque de fosforamidita en fase sólida estándar. Se mezclaron CuBr (100 mM en DMSO/fBuOH 3:1, 10 j l) y THPTA (100 mM en H<2>O, 20 j l) por separado y se añadió el complejo preformado a la solución de oligonucleótido-péptido. Después de 1 h agitando a 37 °C, se completó la reacción de "clic". Se obtuvo la escisión del conector PEG de solubilización añadiendo NaHCO3(0,1 M en H<2>O, 3 ml). La diálisis de esta solución (membrana de diálisis MWCO 1000) dio el producto deseado16.

5'-hex-T20-3':EM(ESI): hallado 1544,3 [M - 4H]4-, calculado 1544,5 [M - 4H]4

Péptido X - 5' - hex-T20-3':EM(ESI): hallado 1647,7 [M - 5H]5-, calculado 1648,0 [M - 5H]5

Producto16: péptido X - 5' - hex-T20-3'(despegilado):EM(ESI): hallado 1525,6 [M - 5H]-5, calculado 1525,9 [M -5H]-5.

Ejemplo 7: síntesis rápida de péptidos y conjugados nucleósido-péptido por conjugación con soporte sólido y purificación no cromatográfica usando un conector de inmovilización escindible

El esquema de reacción divulgado en este ejemplo se ilustra en la fig. 4 y comprende dos vías alternativas A y B.

Se sintetizó el péptido

AAAEAAAEAAAEAAAEEEEE<(SEQ ID NO:>6)<en una resina de amida Rink usando Fmoc-SPPS>automatizada. A continuación, se acoplaron por etapas Fmoc-Pra-OH (N-alfa-(9-fluorenilmetiloxicarbonil)-L-propargilglicina), conector escindible protegido con Fmoc1, Fmoc-O2Oc-OH (ácido 8-(9-fluorenilmetiloxicarbonil-amino)-3,6-dioxaoctanoico) y ácido tri-Boc-hidracinoacético al péptido unido a resina por medio de SPPS, proporcionando el péptido deseado17.

Se escindió el péptido de la resina con una mezcla de TFA/TIS/H<2>O (95/2,5/2,5). Después de 2 h, se concentró la solución y se añadió a una solución de éter frío. Se separó el péptido precipitado del sobrenadante, se disolvió en una mezcla de H<2>O/ACN (1/1) y se liofilizó. Se disolvió el material bruto en una mezcla de un tampón acuoso de NaOAc/AcOH 0,25 M (pH 4,2) y acetonitrilo (20 % vol). Se añadió cianoborohidruro de sodio y se transfirió la solución a una resina de aldehído-agarosa. Se agitó la suspensión a temperatura ambiente y se supervisó el progreso de la reacción de inmovilización por HPLC (véase la fig. 5 A, B). Después de la inmovilización (~1 h), se lavó la resina con un tampón acuoso de NaOAc/AcOH 0,25 M (pH 4,2), una mezcla de H<2>O/ACN (2/1) y agua. Se llevó a reacción el péptido que contiene propargilglicina unido a resina18con la hexafosfato-timidina modificada con acida (Fulleret al.PNAS 2016, 113 (19), p. 5233-4238) en presencia de CuSO4, THPTA, ascorbato y aminoguanidina en una mezcla de un tampón acuoso de NaH2PO40,2 M (pH 6,5) que contiene DMSO al 20 % vol (véase la figura 4, vía A). Se agitó la suspensión a 37 °C durante 16 h. Se lavó la resina con un tampón acuoso de NaHPO40,2 M (pH 6,5) y una mezcla de H<2>O/ACN (2/1). El conjugado nucleósido-péptido deseado20se liberó con buena pureza por tratamiento de la resina con un tampón acuoso de Na2HPO4 0,2 M (pH 8,5) durante 16 h a temperatura ambiente.

(H0(CH2)3C0NH-Pra(N3(CH2)ii0(P02)6dT) WWWWEAAAEAAAEAAAEAAAEAAAEAAAEAAAEAAAEAAA- EAAAEAAAEAAAEEEEE -NH2:

EM(ESI): hallado 1101,3 [M - 6H]6-, calculado 1101,2 [M - 6H]6-; hallado 944,0 [M - 7H]7-, calculado 943,8 [M - 7H]7

De forma alternativa, el péptido unido a resina18también se podría liberar en condiciones básicas suaves (tampón de Na2HPO40,2 M, pH 8,5, TA, 16 h) de la resina de agarosa (véase la figura 4, vía B) incluso antes de la etapa de conjugación de nucleósido. En estas condiciones, se aisló el péptido no modificado19

<HO(CH2)3CONH-Pra>WWWWEAAAEAAAEAAAEAAAEAAAEAAAEAAAEAAAEAAA-EAAAEAAAEAAAEEEEE-NH<2>con<alta pureza.>

Se supervisó la generación de producto por análisis de HPLC. La fig. 5 muestra el análisis de HPLC del producto SPPS bruto (5A), el sobrenadante después de la inmovilización (5B), el péptido purificado19(5D) generado de acuerdo con la vía B y el conjugado nucleósido-péptido20(5C).

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES 1. Una unidad constituyente que comprende la estructura

   en la que A es Boc y B es Fmoc.
2. 2. Un compuesto que comprende la estructura

   en la que 2 < n < 24, m = 2 o 3, X es un péptido, o un soporte sólido e Y se selecciona de un grupo que consiste en PEG, polilisina, poliarginina, poli(ácido glutámico), poli(ácido aspártico), biotina, hidracina, aminooxi, acida, alquinilo, alquenilo, aldehido, pirroloalanina, carboxi y tiol.
3. 3. Un procedimiento que comprende las etapas de a) sintetizar un péptido sobre un soporte sólido, comprendiendo dicho péptido un grupo amino terminal, b) proporcionar una unidad constituyente de acuerdo con la reivindicación 1, c) acoplar dicha unidad constituyente a dicho péptido.
4. 4. El procedimiento de la reivindicación 3, que comprende además las etapas de d) retirar el grupo protector B, y e) acoplar al menos una unidad constituyente de aminoácido al grupo amino terminal.
5. 5. El procedimiento de la reivindicación 3, que comprende además las etapas de d) retirar el grupo protector B, e) acoplar opcionalmente al menos una unidad constituyente de aminoácido al grupo amino terminal, y f) acoplar una marca o un grupo funcional al grupo amino terminal.
6. 6. El procedimiento de las reivindicaciones 3-5, que comprende además la etapa de g) retirar el grupo protector A a un pH < 6, retirando también de este modo otros grupos protectores presentes en dicho péptido y escindiendo dicho péptido del soporte sólido.
7. 7. El procedimiento de la reivindicación 6, que comprende además la etapa de d) escindir el péptido generado a un pH > 8.
8. 8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que dicha marca o grupo funcional es una marca de solubilización, que comprende además las etapas de g) retirar el grupo protector A a un pH < 6, retirando también de este modo otros grupos protectores presentes en dicho péptido y escindiendo dicho péptido del soporte sólido h) purificar dicho péptido, y i) separar por escisión dicha marca de solubilización a un pH > 8.
9. 9. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que dicha marca o grupo funcional es una marca de inmovilización, que comprende además las etapas de g) retirar el grupo protector A a un pH < 6, retirando también de este modo otros grupos protectores presentes en dicho péptido y escindiendo dicho péptido del soporte sólido h) inmovilizar dicho péptido por medio de dicha marca de inmovilización en un soporte sólido, i) conjugar opcionalmente dicho péptido con una entidad química adicional, j) separar por escisión dicha marca de inmovilización a un pH > 8.
10. 10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicha entidad química es un ácido nucleico, oligonucleótido o nucleótido, que es preferentemente un nucleósido-hexafosfato.