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ES3038380T3 - Methods and compositions for producing stem cell derived dopaminergic cells for use in treatment of neurodegenerative diseases - Google Patents

Methods and compositions for producing stem cell derived dopaminergic cells for use in treatment of neurodegenerative diseases

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ES3038380T3
ES3038380T3 ES16721481T ES16721481T ES3038380T3 ES 3038380 T3 ES3038380 T3 ES 3038380T3 ES 16721481 T ES16721481 T ES 16721481T ES 16721481 T ES16721481 T ES 16721481T ES 3038380 T3 ES3038380 T3 ES 3038380T3
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laminin
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Agnete Kirkeby
Malin Parmar
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Biolamina AB
Original Assignee
Biolamina AB
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Publication date
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Abstract

La presente divulgación se refiere a métodos para producir células dopaminérgicas y evaluar su funcionalidad. Cuando se cultivan células madre embrionarias humanas pluripotentes en placas recubiertas con laminina-111, laminina-121, laminina-521, laminina-421 o laminina-511 en un medio de cultivo celular que contiene un inhibidor de GSK3 y un inhibidor de TGF-β, así como la administración oportuna del factor de crecimiento de fibroblastos, se producen las células neuronales deseadas a tasas mucho mayores. También se describen kits de cultivo celular útiles para producir dichas células dopaminérgicas, así como métodos para usarlas en terapia con células madre. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCION
Métodos y composiciones para producir células dopaminérgicas derivadas de células madre para su uso en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas
Campo técnico
La presente invención se refiere a un método para producir células progenitoras del mesencéfalo ventral caudalizadas.
Antecedentes de la invención
Esta solicitud incorpora como referencia el material en el archivo de texto ASCII llamado “Seq_ListJ_CTI_200040USP3_ST25.txt”, que se creó el 10 de febrero de 2016 y tiene un tamaño de archivo de 8781 bytes.
La presente descripción se refiere a métodos para producir ciertas células dopaminérgicas deseadas a partir de células madre pluripotentes humanas (hESC) y para predecir su maduración fenotípica después del trasplante al cerebro en base a marcadores moleculares. Estas células dopaminérgicas pueden usarse entonces en terapias basadas en células madre, tales como para tratar enfermedades neurodegenerativas, que incluyen la enfermedad de Parkinson. También se describen kits para practicar los métodos. Muy generalmente, las células madre se cultivan en un sustrato de laminina-111 (u otras lamininas producidas recombinantemente) y se exponen a una variedad de medios de cultivo celular para producir las células dopaminérgicas con una eficiencia mucho mayor que la alcanzada anteriormente.
Las lamininas son una familia de glicoproteínas heterotriméricas que residen principalmente en la lámina basal.
Funcionan a través de interacciones de unión con receptores celulares vecinos en un lado y mediante la unión a otras moléculas de laminina u otras proteínas de matriz tales como colágenos, nidógenos o proteoglicanos.
Las moléculas de laminina también son moléculas de señalización importantes que pueden influir fuertemente en el comportamiento y la función celular. Las lamininas son importantes tanto para mantener el fenotipo celular/tejido, así como también para promover el crecimiento y la diferenciación celular en la reparación y el desarrollo de tejidos.
Las lamininas son proteínas grandes de múltiples dominios, con una organización estructural común. Una molécula de proteína de laminina comprende una subunidad de cadena a, una subunidad de cadena p y una subunidad de cadena y, todas unidas entre sí en un trímero a través de un dominio de hélice enrollada. Las doce cadenas de subunidades de laminina conocidas pueden formar al menos 15 tipos de laminina trimérica en tejidos nativos. Dentro de las estructuras de laminina trimérica hay dominios identificables que poseen actividad de unión hacia otras moléculas de laminina y lámina basal, y receptores unidos a membrana. La Figura 1 muestra las tres subunidades de cadena de laminina por separado. Por ejemplo, los dominios VI, IVb e IVa forman estructuras globulares, y los dominios V, IIIb e IlIa (que contienen elementos similares a EGF ricos en cisteína) forman estructuras en forma de varilla. Los dominios I y II de las tres cadenas participan en la formación de una estructura de hélice triple (el brazo largo).
Existen cinco cadenas alfa diferentes, tres cadenas beta y tres cadenas gamma que en tejidos humanos se han encontrado en al menos quince combinaciones diferentes. Estas moléculas se denominan laminina-1 a laminina-15 en base a su descubrimiento histórico, pero una nomenclatura alternativa describe las isoformas en base a su composición de cadenas, por ejemplo, laminina-111 (laminina-1) que contiene cadenas alfa-1, beta-1 y gamma-1. Se han identificado cuatro grupos familiares estructuralmente definidos de lamininas. El primer grupo de cinco moléculas de laminina identificadas comparte las cadenas p1 y<y>1, y varían por su composición de cadena a (cadena a1 a a5). El segundo grupo de cinco moléculas de laminina identificadas, que incluye laminina-521, todas comparten la cadena p2 y y1, y nuevamente varían por su composición de cadena a. El tercer grupo de moléculas de laminina identificadas tiene un miembro identificado, laminina-332, con una composición de cadena de a3p3Y2. El cuarto grupo de moléculas de laminina identificadas tiene un miembro identificado, laminina-213, con la cadena y3 recién identificada (a2p1Y3).
Las células madre embrionarias humanas (hES) son prometedoras para el desarrollo de la medicina regenerativa para una variedad de enfermedades, tales como lesiones de la médula espinal y cardíacas, diabetes tipo I y trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Parkinson. Una célula madre es una célula no diferenciada a partir de la cual se derivan subsecuentemente células especializadas. Las células madre embrionarias poseen una amplia capacidad de autorrenovación y pluripotencia con el potencial de diferenciarse en células de las tres capas germinales. Son útiles para fines terapéuticos y pueden proporcionar fuentes ilimitadas de células para terapias de reemplazo de tejidos, cribado de fármacos, genómica funcional y proteómica.
Se espera que las terapias y tratamientos basados en células madre para enfermedades neurodegenerativas lleguen pronto a ensayos clínicos. Sin embargo, un gran obstáculo permanece en la generación de progenitores de células madre pluripotentes humanas (hPS) de calidad de buenas prácticas de fabricación (GMP) que, tras el trasplante, madurarán y funcionarán en el cerebro adulto. Como las células se trasplantan como progenitores inmaduros y la maduración completa en neuronas funcionalmente integradas requiere 6 meses o másin vivo,las células trasplantadas no pueden evaluarse para determinar su funcionalidad antes del trasplante, y hay una falta de marcadores que predicen de manera confiable el rendimiento y la maduración de los progenitores inmaduros.
Como sustituto de los marcadores que predicen las propiedades funcionales, el campo se ha basado en la evaluación de los progenitores trasplantados mediante la expresión de genes y proteínas vinculados en el desarrollo a la generación de ciertos subtipos neuronales. Dado que no se sabe si estos marcadores son predictivos de la diferenciación terminal y la maduración funcional, los progenitores deben ser sometidos a una evaluación funcionalin vivopara controlar la variación de lote a lote y la eficacia terapéutica. Esto puede representar un obstáculo significativo para la generación de células para cohortes más grandes de pacientes y para el lanzamiento de un producto de células madre estandarizado a la clínica.
Para reducir los estudiosin vivonecesarios a realizar durante el proceso de desarrollo celular, será necesario identificar un conjunto validado de marcadores que puedan predecir el desempeñoin vivodel producto de células madre antes del trasplante. Ser capaz de predecir un el resultado del injertoin vivoen la etapa de progenitor también puede conducir a la producción de productos celulares estandarizados a partir de fuentes de entrada variables, tales como células derivadas de pacientes o bancos de células hPS con donantes con haplotipos HLA.
La enfermedad de Parkinson es una diana particularmente interesante para las terapias basadas en células madre debido a la degeneración relativamente focal de un tipo específico de neurona dopaminérgica mesencefálica (mesDA). Se ha obtenido la prueba de concepto de que la terapia de reemplazo celular para la enfermedad de Parkinson puede tener éxito en varios ensayos clínicos mediante el uso de células fetales. Los desarrollos recientes han dado como resultado una mejor comprensión de la ontogenia celular y del desarrollo de las neuronas mesDA de la placa del piso del mesencéfalo ventral, y este conocimiento se ha materializado en protocolos de diferenciación de investigación que dan como resultado la formación de progenitores del mesencéfalo ventral a partir de células hPS. Por el contrario, a los protocolos más antiguos, se ha demostrado que estas neuronas dopaminérgicas de origen mesencefálico ventral sobreviven, maduran y adquieren propiedades funcionales apropiadas en modelos animales de la enfermedad de Parkinson. Además, los injertos generados a partir de estos protocolos no dan como resultado el sobrecrecimiento celular o la formación de tumores, lo que los convierte en células candidatas adecuadas para las terapias de reemplazo de células madre.
Kirkeby y otros, "Generating regionalized neuronal cells from pluripotency, a step-by-step protocol", Vol. 6, DOI: 10.3389/fncel.2012.00064, 03 de enero de 2013 (2013-01-03), página 1-4, XP002763176 se refiere a un método para la diferenciación neuronal de células madre pluripotentes humanas que implica la inhibición dual de SMAD.
En una publicación adicional, Agnete Kirkeby y otros, "Generation of Regionally Specified Neural Progenitors and Functional Neurons from Human Embryonic Stem Cells under Defined Conditions", CELL REPORTS, Vol.
1, núm. 6, 01 de junio de 2012 (2012-06-01), páginas 703-714, XP055201858 se describe un método similar para obtener progenitores neuronales, que incluye la obtención de células dopaminérgicas para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.
Daisuke Doi y otros, "Isolation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Dopaminergic Progenitors by Cell Sorting for Successful Transplantation", STEM c ElL REPORTS, Vol. 2, núm. 3, 01 de marzo de 2014 (2014-03-01), páginas 337-350, XP055155184 describe el aislamiento de progenitores dopaminérgicos derivados de células madre pluripotentes inducidas por células basadas en Corin para el trasplante.
El documento WO 2008120218 se refiere a un método para inducir la diferenciación neuronal mediante el cultivo de células madre pluripotentes.
El documento WO 2015034012 describe un kit para producir un precursor neural de la producción de dopamina a partir de una célula madre pluripotente.
El documento WO 2011156331 se refiere a células madre embrionarias diferenciadas en células dopaminérgicas.
En los protocolos de diferenciación del mesencéfalo ventral actuales, los marcadores de la placa del piso mesencefálico LMX1A, FOXA2, OTX2 y CORIN se usan comúnmente para confirmar la identidad de mesDA de los progenitoresin vitroantes del injerto, pero un nuevo estudio ha revelado que estos y varios otros marcadores del mesencéfalo ventral usados comúnmente también se coexpresan en los progenitores diencefálicos del núcleo subtálamo. Por lo tanto, parecen ser marcadores subóptimos en protocolos para la generación de neuronas mesDA enriquecidas, ya que claramente no son específicos para el dominio mesDA. Para los propósitos de la medicina regenerativa y para modelar células neuronales humanas, existe el deseo de desarrollar métodos que permitan la derivación y el cultivo de células madre pluripotentes en condiciones químicamente definidas, libres de xeno y libres de patógenos, y para la diferenciación reproducible de estas células en células neuronales con capacidad regenerativa. Convenientemente, tales métodos deberían proporcionar grandes cantidades de tales células diferenciadas. Además, sería conveniente desarrollar métodos para predecir los resultados exitosos del injerto de progenitores trasplantados en un modelo animal. Breve descripción
La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjuntas.
La presente descripción proporciona métodos para producir ciertas células dopaminérgicas derivadas de células madre, así como también métodos para evaluar su funcionalidad después del trasplante. Estas células dopaminérgicas pueden usarse entonces en terapias basadas en células madre, tales como para tratar enfermedades neurodegenerativas, que incluyen la enfermedad de Parkinson. En aspectos adicionales, la presente descripción proporciona un kit para producir células dopaminérgicas a partir de células madre embrionarias.
La presente descripción también proporciona métodos para cultivar ciertas células madre deseadas en cultivos de monocapa que facilitan la homogeneidad celular, la extracción de las células madre de una placa de cultivo celular u otro soporte celular en suspensión de células individuales, y resembrar en placas las células madre en suspensión de células individuales para el pase y la expansión en diluciones significativas que permiten la expansión de cultivos de células madre y la producción a gran escala de tales células.
En algunos aspectos, la descripción describe la siembra en placas de células madre pluripotentes sobre un sustrato de laminina-111 o laminina-121, y el cultivo de las células mediante el uso de varios medios de cultivo celular diferentes para obtener células dopaminérgicas, particularmente células progenitoras dopaminérgicas caudalizadas. Las células pueden pasarse con EDTA antes de la siembra en placas.
En varias modalidades, pueden usarse hasta seis medios de cultivo celular diferentes. En otros, solo se necesitan usar tres o cuatro medios diferentes.
Las células madre pueden cultivarse en un medio primario que comprende medio N2 (N2M), un inhibidor de TGF-p, nogina, proteína sonic hedgehog y un inhibidor de GSK3. Puede añadirse un inhibidor ROCK al medio durante las primeras 24-72 horas
El medio primario puede entonces eliminarse y se añade un medio secundario, el medio secundario que comprende medio N2 y un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF). El FGF puede ser FGF8b. El medio secundario puede añadirse aproximadamente de 156 horas a aproximadamente 228 horas después de la siembra en placas.
Después, se puede eliminar el medio secundario y resembrar en placas las células madre. La resiembra en placas puede producirse aproximadamente de 252 horas a aproximadamente 276 horas después de la siembra en placas.
La resiembra en placas puede producirse mediante el uso de un medio terciario que comprende un medio B27, un inhibidor de ROCK, el FGF, un factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y ácido ascórbico.
Las células madre pueden cultivarse después en un medio cuaternario, el medio cuaternario que comprende un medio B27, el<f>G<f>, un factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y ácido ascórbico. Las células madre pueden cultivarse en el medio cuaternario hasta aproximadamente 372 horas a aproximadamente 396 horas después de la siembra en placas original (no la resiembra en placas). Dicho de otra manera, las células madre resembradas en placas se cultivan en el medio cuaternario durante un período de tiempo de aproximadamente 108 horas a aproximadamente 132 horas.
En algunas otras modalidades, el primer medio incluye un medio de inducción neural (NIM) o un medio N2, un inhibidor de ROCK, un inhibidor de TGFp, un inhibidor de GSK3 y, opcionalmente, una proteína sonic hedgehog y una proteína nogina.
De acuerdo con algunas modalidades, el segundo medio incluye (i) NIM o un medio de N2; un inhibidor de TGF-p, y un inhibidor de GSK3, y opcionalmente una proteína sonic hedgehog y una proteína nogina. El segundo medio no contiene el inhibidor de ROCK del primer medio. El segundo medio puede añadirse aproximadamente de 36 horas a aproximadamente 60 horas después de la siembra en placas.
De acuerdo con algunas otras modalidades, el tercer medio comprende un medio de proliferación neuronal (NPM) y un inhibidor de TGF-p; y opcionalmente el inhibidor de GSK3 y la proteína sonic hedgehog. El tercer medio puede añadirse aproximadamente de 84 horas a aproximadamente 108 horas después de la primera siembra en placas, y puede renovarse aproximadamente de 156 horas a aproximadamente 180 horas después de la primera siembra en placas. El tercer medio puede eliminarse después de aproximadamente 156 horas a aproximadamente 228 horas después de la primera siembra en placas.
En modalidades adicionales, el cuarto medio comprende (i) un medio de proliferación neuronal (NPM) o un medio N2; y (ii) un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF). El cuarto medio puede añadirse aproximadamente de 156 horas a aproximadamente 228 horas después de la primera siembra en placas. El cuarto medio puede eliminarse después de aproximadamente 36 horas a aproximadamente 108 horas de exposición, es decir, de aproximadamente 252 horas a aproximadamente 276 horas después de la siembra en placas original. Las células se resiembran en placas entonces en una segunda placa recubierta con laminina-111, laminina-121, laminina-521, laminina-421 o laminina-511.
Puede usarse un quinto medio que comprende un medio B27; un factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF); ácido ascórbico (AA); un factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF); y un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF). El quinto medio puede renovarse aproximadamente de 324 horas a aproximadamente 348 horas después de la siembra en placas original. Después de aproximadamente 14 días a 16 días, es decir, de aproximadamente 336 horas a aproximadamente 384 horas, se obtienen las células progenitoras. Si se desea tiempo adicional, puede usarse un sexto medio de cultivo celular que comprende un medio B27; un factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF); ácido ascórbico (AA); un factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF), un agonista de AMPc (por ejemplo, dibutilil-AMPc) y un inhibidor de la gamma-secretasa (DAPT); y no contiene un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF).
También se describen en la presente descripción métodos para proporcionar células progenitoras dopaminérgicas caudalizadas con una alta probabilidad de un resultado de injerto exitoso, que comprenden: sembrar en placas células madre embrionarias sobre un primer sustrato recubierto con laminina-111, laminina-121, laminina-521, laminina-421 o laminina-511 para producir células progenitoras dopaminérgicas; identificar células progenitoras dopaminérgicas que expresan marcadores del mesencéfalo ventral caudal; y aislar las células progenitoras dopaminérgicas identificadas de las otras células progenitoras dopaminérgicas en el sustrato para obtener las células progenitoras dopaminérgicas caudalizadas con una alta probabilidad de un resultado de injerto exitoso.
Los métodos pueden comprender además injertar las células progenitoras dopaminérgicas caudalizadas en un cerebro de un mamífero. El mamífero puede ser un ser humano. Este injerto puede realizarse para el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa, tal como la enfermedad de Parkinson.
La etapa de identificación de progenitores del mesencéfalo ventral puede definirse por la coexpresión de OTX2, FOXA2 y LMX1A/B. La etapa de identificación de células progenitoras dopaminérgicas dentro del dominio del mesencéfalo ventral puede realizarse mediante la identificación de células que expresan altos niveles de EN1, SPRY1, WNT1, CNPY1, PAX8, ETV5, PAX5, FGF8, SP5 o TLE4. Más particularmente, la etapa de identificación de células dopaminérgicas puede realizarse mediante la identificación de células que expresan altos niveles de EN1, SPRY1, PAX8, CNPY1 y ETV5.
La etapa de identificación de células progenitoras dopaminérgicas dentro de cultivos de mesencéfalo ventral puede incluir además excluir células que expresan altos niveles de EPHA3, FEZF1, WNT7B, BARHL1, BARHL2, FOXG1, SIX3, HOXA2, GBX2 o Pa X6 y mediante la identificación de células que expresan solo niveles bajos a intermedios de CORIN y FOXP2.
La presente descripción también describe un kit para producir células dopaminérgicas in vitro. El kit incluye: una placa de cultivo celular con un recubrimiento de laminina-111, laminina-121, laminina-521, laminina-421 o laminina-511; un medio de cultivo celular; un inhibidor de GSK3; proteína sonic hedgehog; un inhibidor de ROCK; un inhibidor de TGF-p; un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF); un factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF); y ácido ascórbico (AA).
Estas y otras características no limitantes de la descripción se describen más particularmente más abajo. Breve descripción de las figuras
El archivo de patente o solicitud contiene al menos un dibujo ejecutado en color. La Oficina proporcionará copias de esta patente o publicación de solicitud de patente con dibujo(s) a color previa solicitud y pago de la tarifa necesaria.
Lo siguiente es una breve descripción de los dibujos, que se presentan con el propósito de ilustrar las modalidades ilustrativas descritas en la presente descripción y no con el propósito de limitar las mismas.
La Figura 1 muestra los motivos estructurales de cadenas de laminina alfa (a), beta (P), y gamma (y). Los dominios globulares N-terminal, interno y C-terminal se representan como óvalos blancos. Los dominios de formación de hélice enrollada (I y II) se muestran como rectángulos blancos. Las estructuras en forma de barra (dominios V, IIIb e Illa) se representan como rectángulos grises.
La Figura 2 es una representación gráfica de algunos métodos de la presente descripción, que identifican ingredientes específicos y cuándo se aplican a las células madre para lograr el efecto deseado. Este es un protocolo de diferenciación adecuado para GMP.
La Figura 3 es otra presentación gráfica de otros métodos de la presente descripción, en la que se usan medios de cultivo celular alternativos (NIM y NPM). El medio NDM en esta figura es equivalente a B27M
Las Figuras 4A-4G son un conjunto de imágenes y gráficos que ilustran que los lotes de hESC con patrón mesencefálico ventral dan resultados variables, que no se correlacionan con los marcadores mesDA comunes. Treinta y tres (33) grupos de ratas se sometieron a lesiones dopaminérgicas unilaterales con 6-OHDA se injertaron con 28 lotes diferentes de hESC con patrón VM. Todos los injertos se derivaron de células H9.
La Figura 4A es un conjunto de imágenes tomadas de animales seleccionados después de la maduración in vivo. Los cerebros se tiñeron para determinar el contenido de TH (tirosina hidroxilasa), lo que reveló resultados variados de los injertos. La Figura 4B es una cuantificación del rendimiento celular dopaminérgico (DA) en animales individuales en 33 lotes. El eje y es el número de células TH+ por 100 000 células trasplantadas y varía de 0 a 20 000 en intervalos de 4000, después de 30000 a 50000 en intervalos de 20000 en la parte superior. La Figura 4C es una cuantificación del volumen de injerto en animales individuales en 33 grupos de animales en base a inmunotinciones HuNu+. El eje y es el volumen del injerto en milímetros cúbicos por 100 000 células trasplantadas y va de 0 a 7 en intervalos de 1. La Figura 4D es una cuantificación de la densidad celular DA (es decir, número total de células TH+ por mm3 de volumen de injerto) en injertos de animales individuales en 33 grupos. El eje y va de 0 a 15 000 en intervalos de 3000. Para las Figuras 4B-4D, el contenido celular se normalizó a 100000 células injertadas, y las barras horizontales indican las medias para cada lote. La Figura 4E es un resumen esquemático del estudio del Ejemplo 6.
La Figura 4F es una representación gráfica de la expresión génica de FOXA2, LMX1A y CORIN en la población celular trasplantada el día 16 (día del trasplante) trazada frente al contenido medio de células TH+ (es decir, rendimiento de DA) en cada experimento de injerto. Para el gráfico de LMX1A, el eje y va de 0 a 6000 en intervalos de 2000, y el eje x va de 0 a 10000 en intervalos de 2500. Correlación de Spearman: R= 0,15, p= 0,50. Para el gráfico de FOXA2, el eje y va de 0 a 1500 en intervalos de 500, y el eje x va de 0 a 10000 en intervalos de 2500. Correlación de Spearman: R= -0,38, p= 0,08. Para el gráfico de CORIN, el eje y va de 0 a 15000 en intervalos de 5000, y el eje x va de 0 a 10000 en intervalos de 2500. Correlación de Spearman: R= -0,17, p= 0,37.
La Figura 4G es una representación gráfica de la expresión génica de TH, NURR1 y AADC en la población celular trasplantada el día 16 (día de trasplante) trazada frente al contenido medio de células TH+ (es decir, rendimiento de DA) en cada experimento de injerto. Los resultados del análisis de correlación de Spearman (células mesencefálicas ventrales solamente) se dan como R y valores de p en cada gráfico y las tendencias de la correlación se muestran mediante líneas de regresión lineal. Para el gráfico TH, el eje y va de 0 a 8000 en intervalos de 2000, y el eje x va de 0 a 8000 en intervalos de 2000. Correlación de Spearman: R= -0,18, p= 0,53. Para el gráfico de NURR1, el eje y va de 0 a 4000 en intervalos de 1000, y el eje x va de 0 a 8000 en intervalos de 2000. Correlación de Spearman: R= 0,11, p= 0,70. Para el gráfico de AADC, el eje y va de 0 a 600 en intervalos de 200, y el eje x va de 0 a 8000 en intervalos de 2000. Correlación de Spearman: R= 0,31, p= 0,28.
Las Figuras 5A-5I son un conjunto de imágenes y gráficos que indican que el análisis de secuenciación de ARN de células trasplantadas revela una correlación positiva entre el contenido TH+ del injerto y los marcadores del límite mesencéfalo-rinencéfalo (MHB). Todos los injertos se derivaron de células H9. La Figura 5A es una representación gráfica del rendimiento de DA dividido en grupos de DA-alto y DA-bajo a las 6 semanas y >16 semanas. Solo los experimentos con muestras de ARN relevantes del día 16 se categorizaron como altos o bajos. La función dopaminérgica de los injertos se evaluó en injertos con maduración a largo plazo (>16 semanas) a través de la rotación inducida por anfetamina (“-” indica falta de recuperación funcional, “+” indica recuperación funcional, ND indica no determinado). El eje y es el número de células TH+ por 100000 células injertadas y varía de 0 a 10 000 en intervalos de 5000. La Figura 5B es un gráfico de PCA de los resultados del análisis de secuenciación de ARN de muestras celulares del día 16 de un agrupamiento revelado de muestras de DA-bajo y DA-alto en el eje PC4. La Figura 5C es una lista de resultados del análisis de Deseq2 de datos de secuenciación de ARN de las muestras celulares DA-alto frente a DA-bajo (ver puntos de datos enmarcados en la Figura 5I más abajo). La lista muestra los 12 genes con mayor cambio en veces log2 (log2 FC) y con un valor de p de <0,001.
La Figura 5D es un gráfico de los niveles de ARNm de EN1 y la Figura 5E es un gráfico de los niveles de ARNm de PAX8, medidos tanto por qRT-PCR en lotes de células trasplantadas el día 16. Para el gráfico EN1, el eje y va de 0 a 15000 en intervalos de 5000, y el eje x va de 0 a 8000 en intervalos de 2000. Para el gráfico de PAX8, el eje y va de 0 a 150 en intervalos de 50, y el eje x va de 0 a 8000 en intervalos de 2000. Para ambas Figuras 5D-5E, el análisis de correlación de Spearman se da como R y valores de p en cada gráfico y las correlaciones se visualizan con líneas de regresión lineales.
La Figura 5F es un resumen gráfico del análisis de correlación de la secuenciación de ARN que muestra correlaciones positivas entre el contenido de TH+, el volumen de injerto y la densidad de TH+ y los niveles de ARN de los genes de MHB y los marcadores mesencefálicos ventrales comunes. La correlación positiva se define mediante el análisis de correlación de Spearman con p<0,05. Los genes verificados por qRT-PCR se muestran en negrita. La Figura 5G es una representación gráfica de un análisis de distancia de Spearman de los niveles de ARN en lotes de células, que muestra la regulación conjunta de los genes de MHB, mientras que FOXP2, FOXA2, LMX1B, CORIN, LMX1A y OTX2 están desacoplados o acoplados negativamente al grupo de genes de MHB. La Figura 5H muestra cinco imágenes representativas de neuronas TH+ de diferentes lotes celulares con alta expresión de marcadores predictivos que revelan la morfología madura de las células injertadas. Barra de escala: 50 |jm.
La Figura 5I es un análisis gráfico de marcadores predictivos después del análisis Deseq2 de datos de secuenciación de ARN de muestras celulares DA-alta y DA-baja. Los marcadores se trazaron en base al cambio en veces log2 en comparación con la media de recuentos normalizados. El recuadro de esta figura muestra los genes enumerados en la Figura 5C anterior.
Las Figuras 6A-6F son un conjunto de imágenes y gráficos que indican que los cultivos de hESC con patrón mesencefálico ventral contienen células de destinos STN diencefálicos. La Figura 6A es un conjunto de tres gráficos que muestran la correlación negativa entre los niveles de ARN de los marcadores diencéfalicos FEZF1, WNT7B y EPHA3 en células trasplantadas (día 16) y el contenido de TH+ en injertos. Para el gráfico de FEZF1, el eje y va de 0 a 8 en intervalos de 2, y el eje x va de 0 a 10000 en intervalos de 2500. R= -0,63, p= 0,015. Para el gráfico de WNT7B, el eje y va de 0 a 0,6 en intervalos de 0,2, y el eje x va de 0 a 10000 en intervalos de 2500. Correlación de Spearman: R= -0,54, p= 0,024. Para el gráfico EPHA3, el eje y va de 0 a 20 en intervalos de 5, y el eje x va de 0 a 10000 en intervalos de 2500. Correlación de Spearman: R= -0,63, p= 0,015.
La Figura 6B es un conjunto de imágenes de inmunotinciones de cultivos de hESC con patrón mesencefálico ventral (día 16) que revela la presencia de destinos de dominio STN (células BARHL1+/FOXA2+ y PITX2+/LMX1A/B+). La Figura 6C es una descripción esquemática de los dominios de expresión en la región STN del diencéfalo y en los dominios del mesencéfalo lateral. La Figura 6D es un conjunto de imágenes confocales de un injerto de 18 semanas de edad que muestra la presencia de células BARHL1+/PITX2+ y BARHL1+/PITX2-. La Figura 6E es un conjunto de imágenes ilustrativas del contenido celular de BARHL1+ en injertos derivados de lotes de células con niveles bajos (izquierda) o altos (derecha) de ARN de BARHL1 el día del trasplante.
La Figura 6F es un conjunto de representaciones gráficas que muestran correlaciones positivas entre los niveles de ARN de BARHL1 y BARHL2 en el momento del trasplante (qRT-PCR) y el número de células BARHL1+ en los injertos maduros. Para el gráfico de BARHL1, el eje y va de 0 a 1500 en intervalos de 500, y el eje x va de 0 a 15000 en intervalos de 5000. Correlación de Spearman: R= 0,89, p= 0,03. Para el gráfico de B<a>R<h>L2, el eje y va de 0 a 5000 en intervalos de 1000, y el eje x va de 0 a 15000 en intervalos de 5000. Correlación de Spearman: R= 0,89, p= 0,03. Para las Figuras 6A y 6F, los resultados del análisis de correlación de Spearman se dan como R y valores de p en cada gráfico, y las correlaciones se visualizan con líneas de regresión lineales.
La Figura 6G es un conjunto de ocho imágenes de inmunotinciones de cultivos de hESC con patrón mesencefálico ventral (día 42, similar a la Figura 6B), que muestra la diferenciación in vitro terminal de cultivos con destinos de STN.
Las Figuras 7A-7I son un conjunto de imágenes y gráficos que indican que el suministro cronometrado de FGF8 a hESC provoca que los destinos celulares cambien de progenitores mesencefálicos diencefálicos a caudales ventrales. Los estudiosin vitrousaron datos de ambas líneas H9 y RC17.
La Figura 7A es una representación gráfica de los niveles de ARNm de FOXG1, SIX3, GBX2 y HOXA2 después del análisis de qRT-PCR (día 10) después de diferenciar las hESC tratadas con FGF8b de los días 0 9. Para el gráfico de FOXG1, el eje y va de 0 a 800 en intervalos de 200. Para el gráfico de SIX3, el eje y va de 0 a 1000 en intervalos de 200. Para el gráfico de GBX2, el eje y va de 0 a 150 en intervalos de 50. Para el gráfico de HOXA2, el eje y va de 0 a 300 en intervalos de 100. Para los cuatro gráficos, el eje x indica la cantidad de FGF8b y es 0, 100 o 300 ng/ml.
La Figura 7B es un conjunto de cuatro imágenes de inmunotinción (día 16) que revelan parches de células PITX2+ y NKX2.1+ y parches de células LMX1- en cultivos tratados con FGF8b desde d0-9. La Figura 7C es un conjunto de nueve imágenes de inmunotinción que ilustran que el fenotipo mesencefálico ventral LMX1+/FOXA2+ se mantiene en cultivos tratados con FGF8b desde el día 7-16 o 9-16. La Figura 7D es un conjunto de seis imágenes de inmunotinción que ilustran que los cultivos del día 16 tratados con FGF8b desde el día 9-16 tienen niveles disminuidos de células BARHL1+ y FOXA2. La Figura 7E es un conjunto de seis imágenes de inmunotinción que ilustran que los cultivos del día 16 tratados con FGF8b desde el día 9-16 tienen niveles disminuidos de PITX2, pero niveles aumentados de células EN1. La Figura 7F es una cuantificación gráfica de las Figuras 7D-7E. El eje y va de 0 a 100 % en intervalos de 20. La Figura 7G es una representación gráfica de los niveles de ARNm en el día 16 de FOXA2, LMX1A, OTX2 y EN1 después del análisis de PCR. Los marcadores del eje y son, de abajo hacia arriba, 1, 4, 16, 64, 256 y 1024.
La Figura 7H es un gráfico FACS de cultivos con patrón mesencefálico ventral tratados con FGF8b de control (día 16) que muestra porcentajes inalterados de progenitores FOXA2+. Para VM, los valores son 94,6 ± 2,7 % (media ± SEM). Para VM+FGF8, los valores son 95,4 ± 1,3 %. Para el control, los valores son 0,3 ± 0,2 %, n=3. La Figura 7I es un gráfico FACS de cultivos con patrón mesencefálico ventral tratados con FGF8b de control (día 16) que muestra porcentajes disminuidos de progenitores CORIN+. Para VM, los valores son 52,9 ± 4,5 %. Para VM+FGF8, los valores son 28,1 ± 1,8 %. Para el control, el valor es 0,0 %, n=3.
Las Figuras 8A-8K son un conjunto de imágenes y gráficos que indican que la diferenciación de hESC en una matriz de laminina compatible con GMP produce un alto rendimiento y pureza de los progenitores mesencefálicos ventrales. Se usaron células RC17. La Figura 8A es un conjunto de siete imágenes que ilustran la diferenciación neuronal de hESC en diferentes subtipos de laminina. La Figura 8B es un par de imágenes que muestran cómo el cultivo de hESC en LN-111 en medio de pluripotencia dio como resultado el desprendimiento y la formación de esferas, mientras que las células pluripotentes se unieron eficientemente a la matriz LN-521. La Figura 8C es un gráfico que compara el uso de sustratos recubiertos con LN-111 con sustratos recubiertos con LN-121, que muestra que el rendimiento de las células dopaminérgicas es aproximadamente igual en cualquiera de los sustratos. La Figura 8D es un conjunto de cuatro imágenes que ilustran que la siembra de hESC de baja densidad en matriz LN-111 en medio N2 suplementado dio como resultado cultivos neuralizados confluyentes después de 7 días de diferenciación. La Figura 8E es un gráfico de la regulación positiva de los niveles de ARNm de OCT4 y NANOG durante tres días de diferenciación en LN-111. El eje y va de 0,0 a 1,0 en intervalos de 0,2, y el eje x va de 0 a 3 en intervalos de 1.
La Figura 8F es un gráfico del rendimiento celular en diferentes combinaciones de medio básico (DMEM/F12+Neurobasal con suplemento de N2, suplemento de N2, suplemento de B27 y DMEM/F12+). El eje y es el recuento de células en millones el día 11 y va de 0 a 200 en intervalos de 50.
La Figura 8G es una comparación gráfica del rendimiento celular del protocolo basado en EB de grado de investigación con el rendimiento celular del protocolo LN-111 adaptado a GMP que se muestra en la Figura 2. El eje y es el recuento de células en millones y va de 0 a 500 en intervalos de 100. Las Figuras 8H-8K muestran que la maduración terminal (día 45) de los progenitores mesencefálicos ventrales generados por el protocolo GMP de la Figura 2 dio como resultado neuronas electrofisiológicamente activas. La Figura 8H es un gráfico que muestra la traza representativa de los potenciales de acción inducidos con inyecciones de corriente despolarizante. La Figura 8I es un gráfico que ilustra que algunas células mesencefálicas ventrales mostraron corrientes postsinápticas espontáneas indicativas de la integración sináptica en el plato. La Figura 8J es un ejemplo gráfico de la despolarización por rebote después de una breve despolarización de la membrana característica del fenotipo dopaminérgico. La Figura 8K es un recuadro que muestra la respectiva traza de Figura 8J en una escala ampliada.
Las Figuras 9A-9E son un conjunto de imágenes y gráficos que indican que la diferenciación de hESC a partir de un protocolo compatible con GMP produce lotes de células mesencefálicas ventrales con una expresión alta reproducible de marcadores predictivos del mesencéfalo ventral caudal. La Figura 9A es un conjunto de tres imágenes de inmunotinción tomadas de cultivos diferenciados de acuerdo con el protocolo GMP, que muestran una superposición muy alta de LMX1A/FOXA2. La Figura 9B es un conjunto de dos gráficos FACS de doble marcaje de OTX2/FOXA2 por citometría de flujo con media (%)±SEM de experimentos replicados (n=3). Para ambos gráficos, el eje y (OTX2-APC) es logarítmico, con el valor inferior que es 100, y continuando a través de 101, 102, 103, 104, 105, 106, y 107. El eje x (FOXA2-PE) también es logarítmico, siendo el valor más a la izquierda 100, y continuando a través de 102, 104, y 106.
La Figura 9C es una representación gráfica de los niveles de expresión génica en ESC humanas diferenciadas de acuerdo con el protocolo de cuerpos embrioides de grado de investigación o el protocolo LN-111 de grado GMP. Se incluyeron diferenciaciones hacia el cerebro anterior ventral (vFB) y el cerebro posterior ventral (vHB) como controles. Los valores se codifican por color y se normalizan a la muestra con mayor expresión para cada gen (= 1000). Las Figuras 9D-9E son 10 imágenes representativas de injertos adicionales de lotes que contienen altos niveles de marcadores de VM caudales. Las imágenes de la Figura 9D son células H9 injertadas, y la Figura 9E muestra células RC17, generadas ambas a través del protocolo de grado GMP.
La Figura 10 es una representación gráfica de la recuperación conductual en un modelo animal de la enfermedad de Parkinson. Las ratas sometidas a lesiones unilaterales de 6-OHDA se evaluaron para determinar las rotaciones inducidas por anfetamina antes y después del trasplante con células RC17 diferenciadas de acuerdo con el protocolo GMP de LN-111. Un grupo de animales (mesDA RC17, puntos verdes) se trasplantó con células diferenciadas en presencia de FGF8b desde el día 9-16 para producir células VM caudalizadas del dominio dopaminérgico mesencefálico (mesDA). Este grupo mostró recuperación funcional como lo demuestra la inversión y la sobrecompensación (en la semana 22) de las rotaciones inducidas por anfetamina. El otro grupo (STN RC17, puntos rojos) se trasplantó con células diferenciadas en ausencia de FGF8b para producir células VM rostrales del dominio STN. Por el contrario, al grupo mesDA, el grupo STN no mostró recuperación funcional de las rotaciones inducidas por anfetamina.
Descripción detallada
Una comprensión más completa de las composiciones y métodos descritos en la presente descripción puede obtenerse mediante referencia a los dibujos adjuntos. Estas figuras son meras representaciones esquemáticas basadas en la conveniencia y la facilidad de demostrar la presente descripción, y, por lo tanto, no pretenden definir o limitar el alcance de las modalidades ilustrativas.
Aunque se usan en la siguiente descripción términos específicos en aras de la claridad, estos términos pretenden referirse solo a la estructura particular de las modalidades seleccionadas para ilustración en los dibujos, y no pretenden definir o limitar el alcance de la descripción. En los dibujos acompañantes, los cuales ilustran una o más modalidades ilustrativas y la siguiente descripción más abajo, debe entenderse que las designaciones numéricas similares se refieren a componentes de función similar.
Las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto lo indique claramente de cualquier otra manera.
Como se usa en la descripción y en las reivindicaciones, el término "que comprende" puede incluir las modalidades "que consiste de" y "que consiste esencialmente de". Los términos “comprende(n),” “incluye(n),” “que tiene(n),” “tiene,” “puede,” “contiene(n),” y variantes de estos, como se usan en la presente, pretenden ser frases, términos o palabras de transición abiertas que requieren la presencia de los ingredientes/etapas nombrados y permiten la presencia de otros ingredientes/etapas. Sin embargo, tal descripción debe interpretarse como que también describes composiciones o procesos como "que consiste de" y "que consiste esencialmente de" los ingredientes/etapas enumerados, lo que permite la presencia de solo los ingredientes/etapas nombrados, junto con cualquier impureza que pudiera resultar de ellos, y excluye otros ingredientes/etapas.
Los valores numéricos en la descripción y las reivindicaciones de esta solicitud deben entenderse que incluyen valores numéricos que son iguales cuando se reducen al mismo número de cifras significativas y valores numéricos que difieren del valor indicado en menos del error experimental de la técnica de medición convencional del tipo descrito en la presente solicitud para determinar el valor.
Todos los intervalos descritos en la presente descripción son inclusivos del punto final enumerado y combinables independientemente (por ejemplo, el intervalo de “de 2 a 10” es inclusivo de los puntos finales, 2 y 10, y todos los valores intermedios).
El término “aproximadamente” puede usarse para incluir cualquier valor numérico que pueda variar sin cambiar la función básica de ese valor. Cuando se usa con un intervalo, “aproximadamente” también describe el intervalo definido por los valores absolutos de los dos puntos finales, por ejemplo, “aproximadamente 2 a aproximadamente 4” también describe el intervalo “de 2 a 4”. El término “aproximadamente” puede referirse a más o menos 10 % del número indicado.
Varias referencias bien conocidas que pueden ser relevantes para la presente descripción incluyen: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, y otros, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Gene Expression Technology (Methods in Enzymology, Vol. 185, editado por D. Goeddel, 1991. Academic Press, San Diego, Calif.), "Guide to Protein Purification" en Methods in Enzymology (M. P. Deutshcer, ed., (1990) Academic Press, Inc.); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, y otros, 1990. Academic Press, San Diego, California), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, Segunda Ed. (R. I. Freshney. 1987. Liss, Inc. Nueva York, N.Y.), Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. E. J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.), o el Ambion 1998 Catalog (Ambion, Austin, Tex.).
Como se usa en la presente, el término "laminina-521" se refiere a la proteína formada por la unión de cadenas a5, p2 y y1 juntas. El término debe interpretarse como que abarca tanto laminina-521 recombinante como laminina-521 heterotrimérica de fuentes de origen natural.
Como se usa en la presente, el término "laminina-111" se refiere a la proteína formada por la unión de cadenas a1, p1 y y1 juntas. El término debe interpretarse como que abarca tanto laminina-111 recombinante como laminina-111 heterotrimérica de fuentes de origen natural.
Como se usa en la presente, el término "laminina-121" se refiere a la proteína formada por la unión de cadenas a1, p2 y y1 juntas. El término debe interpretarse como que abarca tanto laminina-121 recombinante como laminina-121 heterotrimérica de fuentes de origen natural.
Como se usa en la presente, el término "laminina-421" se refiere a la proteína formada por la unión de cadenas a4, p2 y y1 juntas. El término debe interpretarse como que abarca tanto laminina-421 recombinante como laminina-421 heterotrimérica de fuentes de origen natural.
Como se usa en la presente, el término "laminina-511" se refiere a la proteína formada por la unión de cadenas a5, p1 y<y>1 juntas. El término debe interpretarse como que abarca tanto laminina-511 recombinante como laminina-511 heterotrimérica de fuentes de origen natural.
El término “intacta” se refiere a que la proteína está compuesta por todos los dominios de la cadena a, cadena p y cadena<y>, con las tres cadenas unidas entre sí para formar la estructura heterotrimérica. La proteína no está descompuesta en cadenas separadas, fragmentos o dominios funcionales. El término “cadena” se refiere a la totalidad de la cadena alfa, beta o gamma de la proteína laminina. El término “fragmento” se refiere a cualquier fragmento de proteína que contiene uno, dos o tres dominios funcionales que poseen actividad de unión a otra molécula o receptor. Sin embargo, una cadena no debe considerarse un fragmento porque cada cadena posee más de tres tales dominios. De manera similar, una proteína de laminina intacta no debe considerarse un fragmento. Ejemplos de dominios funcionales incluyen los dominios I, II, III, IV, V, VI y el dominio G.
Como se usa en la presente, el término “autorrenovación” se refiere a la capacidad de la célula madre para pasar por numerosos ciclos de división celular y permanecer indiferenciada (es decir, pluripotente). La pluripotencia en sí misma se refiere a la capacidad de la célula madre para diferenciarse en cualquier tipo de célula. El término “proliferación” se refiere a la capacidad de la célula madre para dividirse. Supervivencia se refiere a la capacidad de la célula madre para vivir, ya sea diferenciada o indiferenciada, y no requiere que la célula madre mantenga su capacidad de dividirse o de diferenciarse.
La abreviatura “DA” se refiere a dopamina. Generalmente, en la presente descripción se usa para referirse a células que pueden producir dopamina o a células que pueden dar lugar a células productoras de dopamina. La combinación del sustrato de laminina con el medio de cultivo celular de la presente descripción da como resultado un sistema de cultivo celular que proporciona células dopaminérgicas de grado clínico. Particularmente, el método describe más células dopaminérgicas
La presente descripción se refiere a métodos más eficientes de cultivo de células madre para obtener células neurales diferenciadas para terapias regenerativas. En particular, una laminina se usa como matriz/substrato para células madre pluripotentes, lo que da como resultado células más diferenciadas que los cultivos que contienen matrices alternativas. Solo puede usarse una laminina como matriz/substrato, o la matriz/substrato puede incluir lamininas específicas, que son laminina-111 (LN-111), LN-121, LN-521, LN-421 o LN-511. La laminina-111 normalmente se puede encontrar en los epitelios y las papilas dérmicas, las células endoteliales, el páncreas, los nervios periféricos y la placenta.
La presente descripción también se refiere a diferentes medios de cultivo celular que se usan para proporcionar nutrientes a las células, particularmente a las células madre. Con respecto a esto, las células madre típicamente requieren dos cosas para ser cultivadas: (1) un sustrato o recubrimiento que proporcione soporte estructural a la célula madre; y (2) un medio de cultivo celular que proporcione nutrición a la célula madre. El sustrato o recubrimiento (1) se coloca generalmente, por ejemplo, en una placa de Petri u otro tipo de contenedor. La aplicación de diferentes medios de cultivo celular en intervalos de tiempo apropiados en combinación con un sustrato de laminina-111 da como resultado un mayor número de células neuronales diferenciadas que producen dopamina (es decir, células dopaminérgicas).
Las células madre que pueden usarse con los métodos y materiales descritos en la presente descripción pueden ser células madre pluripotentes inducidas, células madre embrionarias, células madre adultas, células madre fetales, células madre amnióticas y, generalmente, cualquier célula madre pluripotente.
Los métodos pueden ser modificados para obtener células neuronales de muchos fenotipos diferentes. Estas células neuronales pueden usarse para terapias basadas en células madre, que incluyen su trasplante e injerto en el cerebro de un paciente mamífero para tratar diversas enfermedades neurodegenerativas. En ausencia de factores de patrón, se obtienen células neuronales con un destino telencefálico. El patrón de desarrollo rostrocaudal y dorsal-central de los progenitores neuronales puede controlarse mediante una adición dependiente de la dosis de factores de desarrollo. Estos métodos se describen con referencia a la Figura 2, que proporciona una línea de tiempo y una lista de los diversos ingredientes en los medios de cultivo celular descritos en la presente descripción. Como se ve aquí, las células madre pluripotentes se siembran en placas recubiertas con laminina-111 y se cultivan durante un período de 16 días. Los medios de cultivo pueden contener varias combinaciones de medio, factores de diferenciación y factores de patrón administrados a intervalos específicos durante un período de 16-25 días.
Inicialmente, se ilustran cuatro medios de cultivo celular diferentes, que se modifican mediante la adición de factores de diferenciación y/o factores de patrón para llegar a múltiples medios de cultivo celular diferentes. Esos cuatro medios se denominan en la presente descripción medio de inducción neural (NIM), medio N2 (N2M), medio de proliferación neural (NPM) y medio B27 (B27M).
El NIM, N2M, NPM y B27M se elaboran a partir de un conjunto de ingredientes comunes. Estos ingredientes comunes incluyen medio DMEM/F12, que está disponible comercialmente de Invitrogen (núms. de catálogo 10565 y 21331). DMEM/F12 generalmente contiene los siguientes ingredientes enumerados en la Tabla 1: Tabla 1.
Otro ingrediente común es el medio neurobasal, que está disponible comercialmente como medio neuro MACS de Miltenyi (núm. de catálogo 130-093-570) o de Life Technologies (núm. de catálogo 13712-01). El suplemento N2 está disponible comercialmente de Life Technologies (núm. de catálogo A13707-01) en una concentración de 100X. El suplemento B27 sin vitamina A puede obtenerse de Life Technologies (núm. de catálogo 12587-010) o como MACS NeuroBrew-21 de Miltenyi (núm. de catálogo 130-097-263).
Los medios NIM, N2M, NPM y B27M se preparan mediante la mezcla de partes en volumen de estos ingredientes comunes con otros aditivos.
El medio de inducción neuronal (NIM) se forma a partir de 1 parte en volumen (pbv) de una mezcla 50:50 de DMEM/F12: Neurobasal; 1 parte de suplemento N2 1X (1:100); y 1 parte de suplemento B27 1X (1:50); con adición de L-glutamina 2 mM y opcionalmente penicilina/estreptavidina al 0,2 % si es necesario.
El medio N2 (N2M) se forma a partir de 1 parte en volumen (pbv) de una mezcla 50:50 de DMEM/F12: Neurobasal; y 1 parte de suplemento N2 1X; con adición de L-glutamina 2 mM y opcionalmente penicilina/estreptavidina al 0,2 % si es necesario. En comparación con el NIM, el N2M no contiene en absoluto el suplemento B27.
El medio de proliferación neuronal (NPM) se forma a partir de 1 parte de la mezcla 50:50 de DMEM/F12: Neurobasal; 1 parte de suplemento N20,5X (1:200); y opcionalmente 1 parte de suplemento B270,5X (1:100); con adición de L-glutamina 2 mM y opcionalmente penicilina/estreptavidina al 0,2 % si es necesario. Los suplementos N2 y B27 están más diluidos en el NPM en comparación con el NIM y el B27M. Cuando está presente el B27, esto puede denominarse NPM-B.
El medio B27 (B27M) se forma a partir de 1 parte de medio Neurobasal; y 1 parte de suplemento B27 1X (1:50); con adición de L-glutamina 2 mM y opcionalmente penicilina/estreptavidina al 0,2 % si es necesario. El B27M no contiene suplemento N2 en absoluto.
Los factores de diferenciación usados en la presente descripción incluyen un inhibidor de TGFp; nogina humana recombinante; un factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF); ácido ascórbico (AA); un factor neurotrófico derivado de línea celular glial (GDNF); un monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) tal como monofosfato de dibutil-cíclico adenosina (db-AMPc); y un inhibidor de gamma-secretasa tal como DAPT. En modalidades particulares, el inhibidor de TGFp es SB431542 (CAS# 301836-41-9). La nogina puede obtenerse de R&D Systems (núm. de catálogo 6057-GMP) o Miltenyi (núm. de catálogo 130-103-456). BDNF (núm. de catálogo 130-096-286) y GDNF (núm. de catálogo 130-098-449) pueden obtenerse de Miltenyi.
Los factores de modelado usados en la presente descripción incluyen un inhibidor de GSK3, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y proteína de erizo sonoro. En modalidades particulares, el inhibidor de GSK3 es CHIR99021 (CAS# 252917-06-9). En otras modalidades particulares, el factor de crecimiento de fibroblastos es FGF8b. En aún otras modalidades, la proteína sonic hedgehog particular es SHH-C24II.
En modalidades particulares, un inhibidor de ROCK puede usarse para ciertas porciones de los métodos. El inhibidor de ROCK puede ser Y27632 (CAS# 129830-38-2). También puede usarse la proteína nogina y una gamma-secretasa, tal como DAPT.
A continuación, antes de la diferenciación, las células pueden mantenerse en Cellstart o laminina-521 en medio StemPro o iPSBrew (número de catálogo 130-104-368). Las células también pueden pasarse con EDTA de 4 a 6 días antes del inicio de la diferenciación. Se deben usar células madre pluripotentes sanas.
Con referencia ahora a la Figura 2 y la Figura 3, el protocolo de diferenciación comienza el día 0 y continúa durante 16 días. Después de 16 días, las células pueden prepararse para el trasplante. En el día 0, las células madre pluripotentes se siembran en placas sobre un sustrato de laminina-111, LN-121, LN-521, LN-421 y/o LN-511. El sustrato puede consistir completamente de laminina-111, completamente de LN-121, o ser una combinación de lN-111 y LN-121, o una combinación de las otras lamininas nombradas también. El sustrato también puede incluir otros factores basales. En modalidades particulares, la(s) laminina(s) consiste(n) de laminina(s) intacta(s), es decir, que contiene(n) la totalidad de las tres cadenas. También se contempla que el sustrato pudiera consistir en fragmentos de la(s) laminina(s) especificada(s) en otras modalidades particulares. Las células madre pueden sembrarse en placas a una densidad de aproximadamente 10000 células por cm2
En la presente descripción se contemplan al menos dos protocolos / métodos diferentes para diferenciar las células madre en el sustrato recubierto de laminina durante este período de 16-25 días. Un protocolo se ilustra en la Figura 2, y el otro protocolo se ilustra en la Figura 3.
En el protocolo de la Figura 2, se aplican cuatro medios de cultivo celular diferentes a las células madre. La composición de esos cuatro medios de cultivo celular se describe ahora. Estos medios de cultivo celular se denominan en la presente descripción medio de cultivo celular primario, medio de cultivo celular secundario, medio de cultivo celular terciario y medio de cultivo celular cuaternario.
El medio de cultivo celular primario comprende el N2M, un inhibidor de TGF-p; y un inhibidor de GSK3. No está presente ningún suplemento B27. En modalidades particulares, el medio de cultivo celular primario consiste en estos ingredientes enumerados. El inhibidor de TGF-p está presente en una concentración de aproximadamente 5 |jM a aproximadamente 15 |jM, y en particular aproximadamente 10 |jM. En modalidades específicas, el inhibidor de TGF-p es SB431542. El inhibidor de GSK3 está presente en una concentración de aproximadamente 0,2<ji>M o mayor. En modalidades específicas, el inhibidor de GSK3 es CHIR99021. En algunas modalidades, el medio de cultivo celular primario comprende además una proteína sonic hedgehog (SHH), tal como SHH-C24II. Cuando está presente, la proteína SHH está presente en una cantidad de al menos 50 ng/ml, que incluye aproximadamente 100 ng/ml a aproximadamente 400 ng/ml, y en particular aproximadamente 200 ng/ml. La nogina también puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 150 ng/ml, y en particular aproximadamente 100 ng/ml. La nogina también actúa como un inhibidor de TGF-p. En modalidades particulares adicionales, el medio de cultivo celular primario consiste en estos ingredientes enumerados (que incluyen el SHH y la nogina). Un inhibidor de ROCK está presente en el medio durante las primeras 24 horas a 72 horas después de la siembra en placas. En modalidades específicas, el inhibidor de ROCK es Y-27632. El inhibidor de ROCK está presente en una concentración de aproximadamente 5<ji>M a aproximadamente 15<ji>M, y en particular aproximadamente 10<ji>M.
51 se desea, el medio de cultivo celular primario que contiene el inhibidor de ROCK (“primario-A”) puede considerarse un medio diferente del medio de cultivo celular primario que no contiene el inhibidor de ROCK (“primario-B”).
El medio de cultivo celular secundario comprende el N2M y un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF). En modalidades particulares, el medio de cultivo celular secundario consiste en estos ingredientes enumerados. No está presente ningún suplemento B27. El FGF está presente en una cantidad de aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 150 ng/ml, y en particular aproximadamente 100 ng/ml. En modalidades particulares, el factor de crecimiento de fibroblastos es FGF8b.
El medio de cultivo celular terciario comprende el B27M, un inhibidor de ROCK, un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), un factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y ácido ascórbico (AA), y opcionalmente un factor neurotrófico derivado de una línea celular glial (GDNF). Tenga en cuenta que B27 está presente en este medio, pero N2 no está presente. En modalidades particulares, el medio de cultivo celular terciario consiste en estos ingredientes enumerados. El FGF está presente en una cantidad de aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 150 ng/ml, y en particular aproximadamente 100 ng/ml. En modalidades particulares, el factor de crecimiento de fibroblastos es FGF8b. El BDNF está presente en una cantidad de aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 30 ng/ml, y en particular aproximadamente 20 ng/ml. El AA está presente en una concentración de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 0,5 mM, y en particular aproximadamente 0,2 mM. El inhibidor de ROCK está presente en una concentración de aproximadamente 5 jiM a aproximadamente 15 jiM, y en particular aproximadamente 10 jiM. El GDNF puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 2 ng/ml a aproximadamente 20 ng/ml, y en particular aproximadamente 10 ng/ml, pero generalmente se excluye.
El medio de cultivo celular cuaternario comprende el B27M, un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), un factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y ácido ascórbico (AA), y opcionalmente un factor neurotrófico derivado de una línea celular glial (GDNF). Tenga en cuenta que B27 está presente en este medio, pero N2 no está presente. En modalidades particulares, el medio de cultivo celular cuaternario consiste en estos ingredientes enumerados. El FGF está presente en una cantidad de aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 150 ng/ml, y en particular aproximadamente 100 ng/ml. En modalidades particulares, el factor de crecimiento de fibroblastos es FGF8b. El BDNF está presente en una cantidad de aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 30 ng/ml, y en particular aproximadamente 20 ng/ml. El AA está presente en una concentración de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 0,5 mM, y en particular aproximadamente 0,2 mM. El GDNF puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 2 ng/ml a aproximadamente 20 ng/ml, y en particular aproximadamente 10 ng/ml, pero generalmente se excluye. El medio de cultivo celular cuaternario es generalmente idéntico al medio de cultivo celular terciario, pero no contiene el inhibidor de ROCK.
A continuación, se describe el protocolo de diferenciación de la Figura 2. Las células madre pueden sembrarse en placas a una densidad de aproximadamente 10000 células por cm2 Después de que las células madre se siembran en placas originalmente en el sustrato recubierto de laminina (como se describió anteriormente), el medio de cultivo celular primario se aplica durante un período de aproximadamente 156 horas a aproximadamente 228 horas (es decir, aproximadamente 7 días a aproximadamente 9 días). El cultivo celular primario puede renovarse periódicamente. Después, se retira el medio de cultivo celular primario y se añade el medio de cultivo celular secundario al sustrato.
Con respecto a esto, el medio de cultivo celular secundario contiene FGF, y diferentes cantidades de FGF y tiempos de adición del FGF (es decir, 7-9 días) pueden controlar el patrón rostro-caudal de las células resultantes. Después, el medio de cultivo celular secundario se retira aproximadamente de 252 horas a aproximadamente 276 horas después de la siembra original (es decir, aproximadamente 11 días). Dicho de otra manera, las células se exponen al medio de cultivo celular secundario durante un período de aproximadamente 36 horas a aproximadamente 60 horas (es decir, de aproximadamente 2 a 4 días).
A continuación, las células se resiembran en placas mediante disociación a células individuales y se exponen al medio de cultivo celular terciario que contiene el inhibidor de ROCK. La densidad celular en la resiembra en placas puede ser de aproximadamente 0,5 millones de células por cm2 a aproximadamente 1 millón de células por cm2. Se contempla que el medio de cultivo celular terciario se use solo durante un corto período de tiempo, es decir, aproximadamente 48 horas o menos, durante la resiembra en placas. A continuación, las células se exponen al medio de cultivo celular cuaternario hasta aproximadamente entre 324 a a aproximadamente 396 horas (es decir, aproximadamente 14-16 días) después de la siembra en placas original. Dicho de otra manera, las células se exponen al medio de cultivo celular cuaternario durante un período de aproximadamente 108 horas a aproximadamente 132 horas (es decir, aproximadamente 5 días). Después de aproximadamente 14-16 días, la densidad celular puede ser tan alta como aproximadamente 1,78 millones de células por cm2. Después de aproximadamente 16 días a aproximadamente 25 días, las células neuronales están listas para la criopreservación o el trasplante. La identidad de las células deseadas puede verificarse mediante la expresión de los marcadores deseados, como se describe más detalladamente en la presente descripción.
Con referencia ahora a la Figura 3, se aplican seis medios de cultivo celular diferentes a las células madre y al sustrato recubierto con laminina durante este período de 25 días. La composición de esos seis medios de cultivo celular se describe ahora.
El primer medio de cultivo celular comprende el NIM o el N2M; un inhibidor de ROCK; un inhibidor de TGFp; y un inhibidor de GSK3. En modalidades particulares, el primer medio de cultivo celular consiste en estos ingredientes enumerados. Los diversos aditivos pueden ser cualquier combinación de los aditivos específicos descritos anteriormente. El inhibidor de ROCK está presente en una concentración de aproximadamente 5 |jM a aproximadamente 15<j>M, y en particular aproximadamente 10<j>M. El inhibidor de TGFp está presente en una concentración de aproximadamente 5 j M a aproximadamente 15 j M, y en particular aproximadamente 10 j M. El inhibidor de GSK3 está presente en una concentración de aproximadamente 0,2<j>M o mayor. Como se explicará más adelante en la presente descripción, la cantidad / concentración del inhibidor de GSK3 afectará el tipo de célula neural que se obtiene. En algunas modalidades, el primer medio de cultivo celular comprende además una proteína sonic hedgehog (SHH). Cuando está presente, la proteína SHH está presente en una cantidad de al menos 50 ng/ml, que incluye aproximadamente 100 ng/ml a aproximadamente 300 ng/ml, y en particular aproximadamente 200 ng/ml. La nogina también puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 150 ng/ml, y en particular aproximadamente 100 ng/ml. La nogina también actúa como un inhibidor de TGFp. En modalidades particulares adicionales, el primer medio de cultivo celular consiste en estos ingredientes enumerados (que incluyen el SHH y la nogina).
El segundo medio de cultivo celular comprende el NIM o el N2M; un inhibidor de TGFp; y un inhibidor de GSK3; pero no contiene el inhibidor de ROCK que estaba presente en el primer medio de cultivo celular. En modalidades particulares, el segundo medio de cultivo celular consiste en estos ingredientes enumerados. Las cantidades de estos aditivos son como se describió anteriormente. En algunas modalidades, el segundo medio de cultivo celular comprende además una proteína sonic hedgehog (SHH). Cuando está presente, la proteína SHH está presente en una cantidad de al menos 50 ng/ml, que incluye aproximadamente 100 ng/ml a aproximadamente 300 ng/ml, y en particular aproximadamente 200 ng/ml. La nogina también puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 100 ng/ml a aproximadamente 300 ng/ml en este segundo medio de cultivo celular, y en particular aproximadamente 200 ng/ml. En modalidades particulares, el segundo medio de cultivo celular consiste en estos ingredientes enumerados (incluyendo el SHH y la nogina).
El tercer medio de cultivo celular comprende (i) el NPM o el N2M; y (ii) un inhibidor de TGFp. El inhibidor de TGFp está presente en una concentración de aproximadamente 5 j M a aproximadamente 15 j M, y en particular aproximadamente 10 j M. La nogina también puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 150 ng/ml, y en particular aproximadamente 100 ng/ml. En algunas modalidades, el tercer medio de cultivo celular comprende además un inhibidor de GSK3 y proteína SHH. Cuando está presente, el inhibidor de GSK3 está presente en una concentración de aproximadamente 0,2 |<j>M o mayor. Cuando está presente, la proteína SHH está presente en una cantidad de al menos 50 ng/ml, que incluye aproximadamente 100 ng/ml a aproximadamente 300 ng/ml, y en particular aproximadamente 200 ng/ml. En modalidades particulares, el tercer medio de cultivo celular consiste del NPM o N2M, el inhibidor de TGFp, el inhibidor de<g>S<k>3 y la proteína SHH.
El cuarto medio de cultivo celular comprende (i) el NPM o el N2M; y (ii) un FGF. El FGF está presente en una cantidad de aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 150 ng/ml, y en particular aproximadamente 100 ng/ml.
El quinto medio de cultivo celular comprende el B27M; un factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF); ácido ascórbico (AA); un factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF); y un FGF. En modalidades particulares, el quinto medio de cultivo celular consiste en estos ingredientes enumerados. El BDNF está presente en una cantidad de aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 30 ng/ml, y en particular aproximadamente 20 ng/ml. El AA está presente en una concentración de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 0,5 mM, y en particular aproximadamente 0,2 mM. El GDNF está presente en una cantidad de aproximadamente 2 ng/ml a aproximadamente 20 ng/ml, y en particular aproximadamente 10 ng/ml. El FGF está presente en una cantidad de aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 150 ng/ml, y en particular aproximadamente 100 ng/ml.
El sexto medio de cultivo celular puede usarse para la maduración neuronal; y comprende el B27M; un BDNF; ácido ascórbico (AA); un GDNF; db-AMPc; y una gamma-secretasa. En modalidades particulares, el sexto medio de cultivo celular consiste de estos ingredientes enumerados. El BDNF está presente en una cantidad de aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 30 ng/ml, y en particular aproximadamente 20 ng/ml. El AA está presente en una concentración de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 0,5 mM, y en particular aproximadamente 0,2 mM. El GDNF está presente en una cantidad de aproximadamente 2 ng/ml a aproximadamente 20 ng/ml, y en particular aproximadamente 10 ng/ml. El db-AMPc está presente en una concentración de aproximadamente 200 j M a aproximadamente 800 mM, y en particular aproximadamente 500 j M. La gamma-secretasa está presente en una concentración de aproximadamente 0,1 j M a aproximadamente 5<j>M, y en particular aproximadamente 1<j>M.
Después de que las células madre se siembran en placas originalmente en el sustrato recubierto de laminina, el primer medio de cultivo celular se aplica durante un período de aproximadamente 36 horas a aproximadamente 60 horas, y en particular durante aproximadamente 48 horas (es decir, 2 días). Después, se retira el primer medio de cultivo celular y se añade el segundo medio de cultivo celular al sustrato. El segundo medio de cultivo celular se retira aproximadamente de 84 horas a aproximadamente 108 horas después de la siembra en placas original (es decir, aproximadamente el día 4) y se reemplaza con el tercer medio de cultivo celular. El tercer medio de cultivo celular puede renovarse aproximadamente de 156 horas a aproximadamente 180 horas después de la siembra en placas original. Después, el tercer medio de cultivo celular se retira aproximadamente de 156 horas a aproximadamente 228 horas después de la siembra en placas original (es decir, aproximadamente 7-9 días después de la siembra en placas original).
Con respecto a esto, el patrón rostro-caudal de las células resultantes puede controlarse mediante la adición dependiente de la dosis del inhibidor de GSK3 durante este período inicial mediante el uso de los primeros a terceros medios de cultivo celular. En algunas modalidades, se usan de 0,2 j M a 0,4 j M del inhibidor de GSK3 en estos medios de cultivo celular para destinos diencefálicos. En otras modalidades, puede usarse de 0,6<j>M a 0,8 j M del inhibidor de GSK3 para destinos mesencefálicos. En aún otras modalidades, puede usarse de 1<j>M a 2<j>M del inhibidor de GSK3 para destinos romencefálicos anteriores. En aún modalidades adicionales, pueden usarse más de 4 j M del inhibidor de GSK3 para destinos romencefálicos posteriores.
De manera similar, el patrón dorso-ventral de los progenitores neurales puede controlarse mediante la adición dependiente de la dosis de la proteína SHH. En algunas modalidades, si no se añade proteína SHH al cultivo, las células se enriquecerán para destinos de placa alar. En otras modalidades, se puede añadir aproximadamente de 50 ng/ml a a aproximadamente 150 ng/ml de la proteína SHH para enriquecer destinos de la placa basal. En aún otras modalidades, se pueden añadir más de 200 ng/ml de proteína SHH para enriquecer los destinos de la placa basal. Para enriquecer los destinos de la placa del techo, no debe estar presente ningún inhibidor de TGFp o nogina en el tercer medio de cultivo celular (aplicado aproximadamente el día 4). Esto permite la activación de la proteína morfogenética ósea (BMP).
En algunas modalidades, la purmorfamina y la proteína SHH pueden añadirse al segundo y tercer medio de cultivo celular para obtener una ventralización más potente. La purmorfamina debe estar presente en una concentración de aproximadamente 0,1 j M a aproximadamente 1 j M, y en particular aproximadamente 0,5 mM.
Continuando, el tercer medio de cultivo celular se sustituye por el cuarto medio de cultivo celular después de aproximadamente 156 horas a aproximadamente 228 horas después de la siembra en placas original. Como se analizó anteriormente, la cantidad y el momento del FGF en el cuarto medio de cultivo celular pueden controlar el patrón rostral-caudal de las células progenitoras. Después, el cuarto medio de cultivo celular se retira aproximadamente de 252 horas a aproximadamente 276 horas después de la siembra en placas original (es decir, aproximadamente 11 días después de la siembra en placas original). En este momento, las células pueden resembrarse en placas sobre un segundo sustrato recubierto de laminina, y se aplica el quinto medio de cultivo celular. Las células se cultivan en el quinto medio de cultivo celular hasta aproximadamente entre 324 a a aproximadamente 396 horas después de la siembra en placas original (es decir, aproximadamente el día 14-16). El quinto medio de cultivo celular también puede renovarse aproximadamente de 324 horas a aproximadamente 348 horas después de la siembra en placas original.
Después de aproximadamente 14-16 días, la identidad de las células de estos procesos mediante el uso de los primeros a los quintos medios de cultivo celular puede verificarse mediante la expresión de marcadores regionales que incluyen FOXG1, OTX2, LMX1A, fOxA2 y HOXA2. Después de aproximadamente 16 días a aproximadamente 25 días, las células neuronales están listas para la criopreservación o el trasplante. Si las células se usan para estudios a largo plazo que necesitan fenotipos neuronales maduros, pueden cultivarse en el sexto medio de cultivo celular. Las células neuronales resultantes se obtienen en una gran cantidad.
Los medios de cultivo celular de la Figura 2 y la Figura 3 pueden compararse entre sí. El medio de cultivo celular primario de la Figura 2 es similar al segundo medio de cultivo celular de la Figura 3. El medio de cultivo celular secundario de Figura 2 es similar al cuarto medio de cultivo celular de Figura 3. El medio de cultivo celular cuaternario de la Figura 2 (B27M) es similar al quinto medio de cultivo celular de la Figura 3 (NDM). Los siguientes ejemplos tienen como propósito ilustrar adicionalmente la presente descripción. Los ejemplos son simplemente ilustrativos y no pretenden limitar los dispositivos fabricados de acuerdo con la descripción a los materiales, condiciones o parámetro del proceso expuestos en ellos.
Ejemplos
Recubrimiento de placas con laminina-111
Antes de iniciar la diferenciación, se recubrió aproximadamente 1 |jg/cm2 de laminina-111 en PBS y Ca2+/Mg2+ (volumen total 300 jl) sobre una placa de 24 pocillos. Para unos pocos pocillos, se mezclaron laminina-111 y PBS directamente en los pocillos. La placa se agitó para asegurar un recubrimiento homogéneo. Después, la placa se cubrió con parafilm y se dejó a 4 °C durante aproximadamente 1 a aproximadamente 7 días antes de su uso.
Dilución de CHIR99021
Se preparó una solución madre de CHIR99021 10 mM en DMSO. La solución madre se distribuyó en alícuotas (5-10 j l por vial) y se almacenó a -20 °C. Las alícuotas se pueden descongelar hasta tres veces antes de desecharlas.
Para su uso en el cultivo, CHIR99021 se diluyó 1:100 en N2M para producir una solución de 100 jM antes de añadirla al medio de cultivo celular.
Ejemplo 1
Materiales y métodos
El medio de inducción neural (NIM), Y-27632 (10 jM), SB431542 (10 jM) y nogina (100 ng/ml) se combinaron para crear un medio de diferenciación. Se necesitaban aproximadamente 250 j l de medio por cm2 de diferenciación. Para el patrón de destinos mesencefálicos ventrales, se añadió CHIR99021 de 0,6 a 1,0 jM y Shh-C24II de 200 ng/ml al medio.
Las colonias parecían pluripotentes y cualquier colonia diferenciada se retiró del cultivo antes de iniciar la diferenciación. El medio iPSBrew de StemMACS se aspiró y las células se lavaron una vez en PBS. Se añadió EDTA (0,5 mM) a las células y las células se incubaron a temperatura ambiente durante aproximadamente 7 minutos. La placa se balanceó ocasionalmente para asegurar que las células estuvieran sumergidas en EDTA. Se prepararon 10 ml de medio de lavado (DMEM/F12 con albúmina al 0,1 % u otro medio similar al medio de crecimiento) en un tubo de 15 ml. Se retiró el EDTA y se transfirió 1 ml de medio de lavado a la placa.
Las colonias se pipetearon inmediatamente fuera del plato con una pipeta y se trituraron para producir tamaños homogéneos mientras se evitaba la disociación en células individuales. Después, las colonias se transfirieron al tubo de 15 ml con el medio de lavado. La suspensión celular se mezcló y se transfirió 1 ml de suspensión a un tubo de 1,5 ml para el recuento. El tubo se giró a 400 x g durante 5 minutos.
Se aspiró el medio del tubo de 1,5 ml y las células se resuspendieron en 100 j l de accutasa. Las células se dejaron en una incubadora durante 7 minutos para producir una suspensión de células individuales. Se añadieron 900 j l de medio de lavado al tubo de 1,5 ml y las células se disociaron con la pipeta. Después, se contó el número de células para estimar el total de células en suspensión. Se requirió aproximadamente 10000 células/cm2 para iniciar la diferenciación y se transfirieron de la suspensión a un nuevo tubo antes de centrifugarlas a 400 x g durante 5 minutos.
Se aspiró el medio de lavado y se resuspendió en un medio de diferenciación mixto de NIM, Y-27632 (10|jM), SB431542 (10<j>M), nogina (100 ng/ml), CHIR99021 (0,7<j>M) y SHH-C24II (200 ng/ml) para obtener una suspensión celular de 50 000 células/ml. La laminina-111 se aspiró de la placa recubierta y la suspensión celular se sembró sobre la placa recubierta con 10 000 células/m2 (aproximadamente 250 j l de medio por cm2). La placa se agitó y se agitó bien para producir una siembra en placas de células homogénea.
Después de aproximadamente 48 horas (día 2), el medio se cambió a un nuevo medio de inducción neural (NIM) con SB431542 (10 j M) y nogina (100 ng/ml). Para el patrón a destinos mesencefálicos ventrales, se añadieron 0,6 a 1,0 j M de CHIR99021 y 200 ng/ml de SHH-C24II al medio. Se usó el mismo volumen de medio de diferenciación que el volumen usado para iniciar la diferenciación.
Después de aproximadamente 48 horas (es decir, aproximadamente 96 horas desde la siembra en placas, día 4), el medio se cambió a medio de proliferación neural (NPM) con SB431542 (10 j M) y nogina (100 ng/ml). Para el patrón a destinos mesencefálicos ventrales, se añadieron 0,6 a 1,0<j>M de CHIR99021 y 200 ng/ml de Shh-C24lI al medio. Se añadió aproximadamente 350 j l de medio por cm2.
Después de aproximadamente 72 horas (es decir, aproximadamente 168 horas desde la siembra en placas, día 7), el medio se renovó con NPM que contiene SB431542 (10 j M) y nogina (100 ng/ml). Para el patrón a destinos mesencefálicos ventrales, se añadieron 0,6 a 1,0 j M de CHIR99021 y 200 ng/ml de Shh-C24II al medio. Se añadió aproximadamente 350 j l de medio por cm2.
Después de aproximadamente 48 horas (es decir, aproximadamente 216 horas desde la siembra en placas, día 9), el medio se cambió a NPM con factor de crecimiento de fibroblastos (FGF8b) (100 ng/ml). Se añadió aproximadamente 500 j l de medio por cm2.
Después de aproximadamente 48 horas (es decir, aproximadamente 264 horas desde la siembra en placas, día 11), las células se sembraron en placas en una nueva placa de 12 pocillos recubierta con laminina-111. Las células se lavaron dos veces con PBS y se agitaron en la placa para eliminar todas las células muertas y flotantes. Se añadieron aproximadamente 300 j l de accutasa a cada pocillo. Las células se dejaron en la incubadora durante 10 minutos y se agitaron ocasionalmente para asegurar que las células estuvieran sumergidas en accutasa.
Se preparó un tubo de 15 ml con 10 ml de NPM. Después de 10 minutos, las células se disociaron con una pipeta de 1 ml para obtener una suspensión de células individuales y se transfirieron al tubo de 15 ml que contenía NPM. Las células se centrifugaron a 400 x g durante 5 minutos. Después, se aspiró el medio y el sedimento celular se transfirió y resuspendió en 1 ml de NPM en un tubo de 1,5 ml. Se retiraron 10 j l de suspensión celular para el recuento. La suspensión se diluyó 1:10 - 1:50. Mientras se contaban, las células se centrifugaron a 400 x g durante 5 minutos.
El medio se aspiró y las células se resuspendieron a una densidad de 1,7 millones de células/ml en medio B27 (B27M), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) (20 ng/ml), ácido ascórbico (AA) (0,2 mM), factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF) (10 ng/ml) y FGF8b (100 ng/ml). La laminina-111 se aspiró de las placas recubiertas y las células se sembraron sobre la placa a una densidad de 800 000 células/cm2. La placa se agitó y se agitó bien para producir una siembra homogénea de las células antes de la incubación. Después de 72 horas (es decir, aproximadamente 336 horas después de la siembra en placas, día 14), el medio sobre las células se refrescó con B27M, BDNF (20 ng/ml), AA (0,2 mM), GDNF (10 ng/ml) y FGF8b (100 ng/ml). Se añadió aproximadamente 500 j l de medio por cm2.
Después de 48 horas (es decir, aproximadamente 384 horas después de la siembra en placas, día 16), las células estaban listas para la criopreservación y/o el trasplante.
Validación del fenotipo de células progenitoras
Las placas paralelas de células se mantuvieron en B27M con BDNF, ácido ascórbico y FGF8b hasta el día 14 (es decir, 336 horas después de la siembra en placas) y después se cosecharon para el análisis de ARN o se fijaron para la inmunocitoquímica. En el día 14, las identidades regionales de las células se identificaron claramente mediante la expresión de marcadores regionales tales como FOXG1, OTX2, LMX1A, FOXA2 y HOXA2.
Ejemplo 2
Materiales y métodos
Los mismos materiales y el protocolo descritos en el Ejemplo 1 se usan para placas de 24 pocilios con las siguientes alteraciones:
Las placas se recubrieron con laminina-111 (1 |jg/cm2) en PBS y Ca2+/Mg2+ (700 |jl/cm2). Para sembrar la suspensión celular sobre las placas recubiertas de laminina-111, se requirió aproximadamente 250 j l por cm2 (500 jl/pocillo). Para iniciar la diferenciación, se necesitaron un total de 120000 células para 6 pocillos de una placa de 24 pocillos.
En las marcas de 96 horas y 168 horas después de la siembra en placas, se añadieron aproximadamente 600 j l de medio a cada pocillo. A las 216 horas después de la siembra en placas, se añadieron aproximadamente 700 j l de medio a cada pocillo.
Algunas líneas celulares requirieron la adición de 10 jM de Y-27632 al medio para sobrevivir a la resiembra en placas. Durante la resiembra en placas, se añadieron aproximadamente 150 j l de accutasa a cada pocillo. En la marca de 336 horas, se añadieron aproximadamente 700 j l de medio por pocillo.
Ejemplo 3
Preparación de células para el trasplante (Día 16-25)
Se usan los mismos materiales y protocolo descritos en los Ejemplos 1 y 2.
Las células se mantuvieron en B27M, BAG (BDNF+AA+GDNF) y FGF8b hasta el día del trasplante sin más manipulaciones. El medio se refrescó cada 2-3 días. Las células fueron más adecuadas para el trasplante el día 16, pero podrían trasplantarse hasta el día 26. Las células para trasplante no recibieron DAPT ni db-AMPc en el medio, ya que esto provocaría una maduración neuronal prematura y un aumento de la muerte celular tras la disociación.
Ejemplo 4
Maduración neuronal terminal a largo plazo
Se usan los mismos materiales y protocolo descritos en los Ejemplos 1 y 2.
Las células para estudios a largo plazo del fenotipo neuronal maduro se resembraron en placas entre los días 16 y 25 para evitar densidades demasiado altas de cultivos y el desprendimiento de células. Las células se mantuvieron en B27M y BAG (sin db-AMPc y DAPT) hasta el día de la resiembra en placas. La resiembra en placas se realizó mediante el uso del mismo procedimiento que en el día 11 (es decir, 264 horas después de la primera siembra en placas), y las células se mantuvieron en B27M, BDNF (20 ng/ml), GDNF (10 ng/ml), ácido ascórbico (0,2 mM), db-AMPc (500 jM ) y DAPT (1 jM ) después de la resiembra en placas.
Se debe evitar la resiembra en placas en puntos de tiempo posteriores debido al estrés en las células neuronales maduras. En las etapas tardías de la diferenciación, las neuronas pueden comenzar a desprenderse de la placa. Esto puede atenuarse mediante la adición de laminina y fibronectina (FN) al medio de cultivo celular. Los fenotipos dopaminérgicos maduros solo comienzan a aparecer a partir del día 45 y en adelante.
Ejemplo 5
Durante los últimos 6 años, más de 500 ratas se trasplantaron intracerebralmente con 31 lotes diferentes de progenitores mesDA derivados de células hES en varios sitios de investigación distintos. Un resumen del plan del experimento de injerto se refleja en las Tablas 2-3 más abajo. Para el sitio del injerto: Str. = cuerpo estriado, SN = sustancia negra. Para la cepa huésped de rata, SD = Sprague-Dawley, LH = Lister-hooded, At = Crl:NIH-Foxn1rnu atímico. Para la inmunosupresión, Ciclo = inyecciones intraperitoneales diarias de ciclosporina (10 mg/kg), comenzando el día antes del trasplante.
Tabla 2.
Tabla 3.
# Lote Prom. Vol. / Prom. TH+ / Incluido en Incluido en la Incluido en la 100000 Vol. (mm3) DeSeq2+PCA Figura 7D y 7E Figura 6G (mm3)
En todos los experimentos, el esquema de los cuales se ilustra en la Figura 4E, las hESC se diferenciaron durante 16 díasin vitro,y varios lotes diferentes de hESC con patrón mesencefálico ventral se injertaron en ratas sometidas a lesiones dopaminérgicas unilaterales con 6-OHDA. La Figura 4A es un conjunto de fotografías de los injertos después de que las células maduraron in vivo, y los cerebros se tiñeron con TH. Aunque todos los lotes de células con patrón de mesencéfalo ventral se evaluaron rutinariamente para una alta expresión de los marcadores de mesencéfalo ventral LMX1A, FOXA2 y OTX2 antes de la gratificación, el resultadoin vivocon respecto al tamaño del injerto y el número de neuronas dopaminérgicas varió entre los experimentos.
Para determinar el nivel de variabilidad de lote a lote de estos experimentos, se cuantificó el número total de neuronas TH+ de cada animal por cada 100 000 células injertadas (rendimiento de DA), que se ilustra gráficamente en la Figura 4B, y el tamaño del injerto se basó en el volumen de células HuNu+ (mm3) después de la inmunotinción. La representación gráfica del volumen de injerto se observa en la Figura 4C. Para todas las cuantificaciones, los valores se reportaron por cada 100000 células injertadas. Esto permitió la estimación de las densidades de DA (TH+/mm3) para todos los injertos, que se representan en la Figura 4D. Estas evaluaciones cuantitativas revelaron una variabilidad interexperimental considerable.
Para determinar qué grado de marcas progenitoras de mesDA usadas comúnmentein vitropredicen el contenido TH+ en injertos después de la maduraciónin vivo,se recogieron muestras de ARN de cada lote de células individuales enumerado anteriormente (todas que contenían altos niveles de células que coexpresan FOXA2/LMX1A) el día del trasplante y se analizaron. Las muestras de ARN de las mismas células resembradas en placas se analizaron además después de una maduraciónin vitro.
La Figura 4F es un conjunto de gráficos que indican el contenido medio de células TH+ en cada experimento de injerto trazado frente a la expresión génica de FOXA2, LMX1A y CORIN en la población celular trasplantada el día 16 (es decir, el día del trasplante). De manera similar, la Figura 4G es también un conjunto de gráficos que representan la población de células trasplantadas el día 16, pero los gráficos indican la expresión génica de TH, NURR1 y AADC. Los resultados de una correlación de Spearman (solo células del mesencéfalo ventral) se muestran como R y valores de p en cada gráfico, y las tendencias de correlación se representan mediante líneas de regresión lineal.
Se descubrió que la expresión de los marcadores mesDA usados comúnmente FOXA2, LMX1A y CORIN era necesaria para la diferenciación dopaminérgica de los injertos. Sin embargo, los niveles de expresión de FOXA2 y LMX1A en el momento del trasplante no se correlacionaron significativamente con el rendimiento de DA en los injertos, lo que sugiere que dentro de las células coexpresoras de FOXA2/LMX1A, se necesitan marcadores adicionales para predecir el resultadoin vivo.
Las Figuras 4F y 4G representan una evaluación de si la maduraciónin vitroprolongada de los progenitores en neuronas reflejó su maduraciónin vivocorrespondiente en los injertos. En experimentos adicionales donde las células usadas para el injerto se habían sometido a diferenciación terminalin vitrodurante 39-45 días (en lugar de solo 16 días), se encontró que los niveles de expresión de los marcadores DA TH, NURR1 y AADC no mostraron ninguna correlación estadísticamente significativa con el rendimiento de DA después del trasplante.
Ejemplo 6
Para permitir una búsqueda imparcial de posibles marcadores que correlacionen positivamente con el rendimiento de DA después del trasplante (es decir, un resultado exitoso del injerto), se realizó un perfil global de expresión génica de muestras celulares recolectadas el día del trasplante mediante el uso de secuenciación de ARN.
Para un análisis imparcial de la expresión génica, los experimentos de injerto se dividieron en grupos de DA-alta y DA-baja en base al número total de células TH+ en los injertos. Una comparación gráfica del contenido de TH+ entre lotes se muestra en la Figura 5A. La función dopaminérgica de los injertos se evaluó en injertos con maduración a largo plazo (es decir, más de 16 semanas) mediante rotación inducida por anfetamina o imágenes PET. Un símbolo “-” indica una falta de recuperación funcional, un símbolo “+” indica recuperación funcional y “ND” indica “no determinado”.
Es importante destacar que todos los injertos a largo plazo con falta de recuperación funcional se ubicaron en el grupo DA baja, mientras que el grupo DA alta contenía células con potencial terapéutico capaces de mediar la recuperación funcional.
Para ver si los lotes de células DA-alta y DA-baja podrían identificarse mediante perfiles de expresión génica distintos, se realizó un análisis de componentes principales (PCA) no sesgado en todas las muestras de secuenciación de ARN seleccionadas del día 16. Como se muestra en la Figura 5B, se observó que un agrupamiento de las muestras DA-alta tenía un eje PC1 positivo, que contenía genes tales como FGF8, PAX5, EN2 y CNPY1, todos los cuales se ha demostrado que son importantes para la formación del límite mesencéfalo-telencéfalo (MHB).
Como claramente hubo perfiles de expresión distintos entre los dos grupos, se realizó un análisis de Deseq2 para identificar todos los genes expresados diferencialmente entre las muestras de DA-alta y DA-baja. La Figura 5I es un análisis gráfico de marcadores predictivos después del análisis Deseq2 de datos de secuenciación de ARN de muestras celulares DA-alta y DA-baja. Los marcadores se trazaron en base al cambio en veces log2 en comparación con la media de recuentos normalizados. A partir de los 12 genes mejor clasificados que aparecen en este análisis, nuevamente se encontró una alta representación de genes expresados en el mesencéfalo caudal ventral y las regiones MHB que se asocian positivamente con el rendimiento de DAin vivo,es decir, PAX5, FGF8, SPRY1, EN1, EN2, SP5, ETV4, CNPY1, TLE4 y ETV5. Estos perfiles de expresión se reflejan en la Figura 5C. Estos 12 genes son aquellos con el cambio en veces más alto y con un valor de p de <0,001.
Para evaluar el valor predictivo de estos marcadores seleccionados, se realizó un análisis de correlación de Spearman directo entre los resultados del injerto (es decir, contenido de TH+) y los niveles de expresión de ARN de genes seleccionados de los análisis de PCA y Deseq2. Las Figuras 5D-5E muestran específicamente los resultados del análisis de correlación de Spearman para EN1 y PAX8. Los resultados del análisis de correlación de Spearman se dieron como R y valores de p, y las correlaciones se visualizaron con líneas de regresión lineales. Para validar el conjunto de datos de secuenciación de ARN, se evaluó un subconjunto de correlaciones génicas mediante el uso de qRT-PCR, que incluye 4 experimentos de injerto adicionales, que se representan como Figura 5E específicamente.
En la Figura 5F se muestra un resumen del análisis de correlación de secuenciación de ARN entre el contenido de TH+, el volumen del injerto y la densidad de DA y los niveles de ARN de los genes MHB y los marcadores comunes del mesencéfalo ventral. El esquema solo muestra correlaciones positivas definidas por el análisis de correlación de Spearman con p < 0,05. Los genes verificados por qRT-PCR se muestran en negrita.
Estas correlaciones se compararon con las correlaciones de marcadores comúnmente usados del mesencéfalo ventral (es decir, LMX1A, LMX1B, FOXA2, FOXP2, CORIN y OTX2).
Los análisis mostraron que la mayoría de los marcadores de mesencéfalo caudal ventral identificados por DeSeq2 mostraron una correlación positiva con el tamaño del injerto y el contenido total de TH de los injertos, como se muestra en la Figura 5G. La Figura 5G en particular es una representación gráfica de un análisis de distancia de Spearman de los niveles de ARN en lotes de células, que muestra la corregulación de los genes de MHB. Los marcadores EN1, SPRY1, WNT1, ETV5 y CNPY1 se correlacionaron positivamente con la densidad de DA (TH+/mm3). Estos se contrastaron con los marcadores del mesencéfalo ventral más amplios y más ampliamente expresados FOXA2, LMX1A, CORIN, FOXP1 y FOXP2, que mediante varios análisis mostraron correlaciones negativas tanto con el tamaño del injerto como con el rendimiento total de DA, lo que indica que pueden desacoplarse o acoplarse negativamente al grupo de genes del MHB. LMX1A y OTX2 mostraron correlaciones positivas solo con la densidad de DA, pero no con el rendimiento de DA de los injertos. Para investigar si los genes identificados en el análisis de secuenciación de ARN formaron parte de una red génica regulada conjuntamente, se realizó un análisis de correlación de Spearman de los valores de expresión para cada gen candidato hacia otros en 29 lotes de células con patrón de mesencéfalo ventral. Como se observa en la Figura 5G, todos los genes MHB asociados con rendimiento de DA alta mostraron un patrón de corregulación. En particular, los marcadores MHB SPRY1 y ETV4/5 y los marcadores del mesencéfalo caudal ventral EN1 y CNpYI se agruparon en el análisis, lo que sugiere una fuerte corregulación entre los genes. Sin embargo, LMX1A y OTX2 mostraron poca o ninguna co-regulación positiva con estos genes. CORIN, LMX1B, FOXA2 y FOXP2 se correlacionaron negativamente con varios de los genes caudales, lo que indica que estos marcadores usados comúnmente no se asocian específicamente con un fenotipo de mesencéfalo ventral caudal y que pueden expresarse en niveles más altos en los dominios más rostrales del mesencéfalo ventral. Otros marcadores del mesencéfalo ventral reportados como involucrados en la neurogénesis mesDA, específicamente MSX1, SOX6 y PBX1, no mostraron correlaciones con la densidad de DA de los injertos cuando se analizaron en progenitores con patrón de mesencéfalo ventral en el día 16. La Figura 5H es un conjunto de cinco imágenes representativas de neuronas TH+ de diferentes lotes celulares con alta expresión de marcadores predictivos, que revela la morfología madura de las células injertadas.
Ejemplo 7
Mediante el uso de los valores de expresión de secuenciación de ARN, se encontró una fuerte correlación negativa entre los marcadores diencefálicos FEZF1, WNT7B y EPHA3 y el rendimiento de DA en injertos el día 16, como se muestra en Figura 6A. Esta correlación condujo a una investigación de si algunos lotes de hESC con patrón de mesencéfalo ventral que contenían progenitores STN BARHL1 y PITX2+ se derivaban del dominio LMX1A+/FOXA2+ anterior.
Tanto BARHL1+ como PITX2+ se detectaron en los lotes de células diferenciadas el día 16. La Figura 6B es un conjunto de imágenes después de la inmunotinción de cultivos de células hES con patrón de mesencéfalo ventral al día 16, que revelan la presencia de destinos de dominio STN (es decir, células BARHL1+/FOXA2+ y PITX2+/LMX1+). La Figura 6C es resumen esquemático de los dominios de expresión de PITX2 y BARHL1 en la región diencefálica STN y en los dominios de cerebro medio lateral. La Figura 6G muestra los cultivos celulares de Figura 6B el día 42 de diferenciación.
Como se representa en las Figuras 6B-6C, las células BARHL1+ podrían haber sido FOXA2+ o FOXA2-, lo que indica la presencia de células de la placa del piso diencefálica así como también poblaciones celulares laterales en los lotes de progenitores diferenciados. Se descubrió además que las neuronas FOXA2+/BARHL1+/MAP2+ y las células PITX2+/LMX1A/B+ estaban presentes en los cultivos de células hES terminalmente diferenciadas, lo que indica la diferenciación de estos progenitores en destinos de STN.
La Figura 6D es un conjunto de imágenes que siguen la obtención de imágenes confocales de injertos de 18 semanas de edad. En animales injertados con células con patrón de mesencéfalo ventral, se detectó la presencia variable de células BARHL1+, y estas células habrían sido PITX2+ (que indica destinos de STN diencefálico ventral) o PITX2- (que indica otros destinos de STN lateral). Imágenes de ejemplo de contenido celular BARHL1+ en injertos derivados de lotes de células con niveles bajos o altos de ARN de BARHL1 el día del trasplante se muestra en la Figura 6E.
Para investigar si estos marcadores podrían usarse para predecir la cantidad de células contaminantes lateral y rostro-ventral dopaminérgicas en los injertos, las cantidades de células BARHL1+ se cuantificaron en varios de los experimentos de injerto. El análisis de correlación mostró que la densidad de células BARHL1+ en los injertos se correlacionaron positivamente con los niveles de expresión de BARHL1 y BARHL2in vitroen los lotes de células diferenciadas el día del transplante, como se muestra en las Figuras 6D y 6F. Los resultados del análisis de correlación de Spearman se dan como R y valores de p en cada gráfico, y las correlaciones se visualizan con líneas de regresión lineal.
Estos resultados implicaron que BARHL1 y BARHL2 en cultivos progenitores podrían usarse como marcadores para identificar y cuantificar varias poblaciones contaminantes que ocurren comúnmente en hESC con patrón de mesencéfalo ventral tantoin vitrocomoin vivo.
Ejemplo 8
Dado el resultado variable de los progenitores de células hES con patrón en el mesencéfalo ventral, se investigó a continuación si el patrón en el protocolo de diferenciación podría optimizarse hacia el dominio dopaminérgico caudal del mesencéfalo ventral (porque los marcadores de este dominio se correlacionaban con un alto rendimiento de DAin vivo).Las células ubicadas en el mesencéfalo ventral caudal están cerca del MHB, y estudios en modelos de ratón y pollo han demostrado que el desarrollo de los progenitores de mesDA en esta región depende de la actividad de FGF8, un factor de crecimiento que se secreta desde el MHB. Además, se encontró que la alta expresión de FGF8 se correlaciona con el grupo DA-alto en los análisis de expresión génica como se ve en la Figura 5C anterior.
La Figura 7A es un conjunto de gráficos creados siguiendo un análisis de qRT-PCR en el día 10 de hESC en diferenciación tratados con FGF8b exógeno durante el patrón del mesencéfalo ventral desde los días 0-9. El análisis muestra la inducción de marcadores de prosencéfalo y rombencéfalo en cultivos diencefálicos ventrales (CHIR = 0,4|jM) o mesencefálicos ventrales (CHIR = 0,8|jM).
Se descubrió que la adición de FGF8b al medio de diferenciación junto con SHH y GSK3i para activar la señalización WNT canónica durante la fase temprana de la inducción y el patrón neural (días 0-9) indujo una regulación positiva significativa de los marcadores del prosencéfalo fOx g 1 y SIX3 en cultivos con patrón de diencéfalo y de los marcadores del rombencéfalo HOXA2 y GBX2 en cultivos con patrón mesencefálico. Esto indicó que el patrón temprano con FGF8b provocó la contaminación de cultivos con varios destinos de progenitores del mesencéfalo no ventral. La Figura 7B es un conjunto de imágenes después de la inmunotinción en el día 16, que revela parches de células PITX2+ y NKX2.1 y parches de células LMX1A- en cultivos tratados con FGF8b desde los días 0-9.
Por el contrario, se mantuvo el fenotipo FOXA2+/LMX1A+, como se muestra en la Figura 7C, si se añadió FGF8b a las células después de que se completó el patrón inicial hacia el mesencéfalo ventral (del día 7-16 o 9-16).
Las Figuras 7D-7F corresponden a cultivos del día 16 tratados con FGF8b. La adición de 100 ng/ml de FGF8b provocó la caudalización de los progenitores del mesencéfalo ventral cuando los cultivos se trataron con FGF8b desde el día 9-16. Como se muestra en las imágenes de inmunotinción de la Figura 7D-7E, cuyos resultados se cuantificaron en la Figura 7F, los niveles de BARHL1+ y PITX2+ se redujeron ambos. Sin embargo, mientras que los cultivos de mesencéfalo ventral de control estaban completamente carentes de expresión de EN1, progenitores EN1+ y ARNm de EN1 fueron abundantes en cultivos tratados con FGF8b desde el día 9-16. La Figura 7E es un conjunto de imágenes que muestran la inmunotinción de EN1, mientras que la Figura 7G representa gráficamente los niveles de ARNm de FOXA2, LMX1A, OTX2 y EN1 después del análisis de qRT-PCR.
En resumen, el tratamiento con FGF8b desde el día 9-16 provocó además una disminución significativa en el porcentaje de progenitores de STN BARHL1+/FOXA2+ y PITX2+, lo que se ilustra en las Figuras 7D-7F. Esta disminución indicó que la adición tardía de FGF8b a los cultivos desplazó los destinos de los progenitores del mesencéfalo ventral anterior y los destinos de STN hacia los destinos de progenitores mesDA del mesencéfalo ventral caudal.
El análisis de citometría de flujo, mostrado como gráficos FACS en las Figuras 7H-7I, mostró que, aunque la adición de FGF8b del día 9-16 no afectó el porcentaje de progenitores FOXA2+, hubo una disminución del 47 % en el número de progenitores CORIN+. Esto estuvo de acuerdo con las correlaciones negativas encontradas para CORIN en los análisis de secuenciación de ARN asociados con las Figuras 5F-5G e indica que la expresión de CORIN tanto a nivel de proteína como de ARNm se asocia más fuertemente con un destino mesencefálico/diencefálico rostral ventral que con un destino de progenitor mesDA caudal.
Ejemplo de referencia 9
Para desarrollar un protocolo de diferenciación compatible con GMP para un rendimiento alto y reproducible de progenitores de mesencéfalo ventral de mesDA caudilizados que daría como resultado un buen resultado del injerto, se usó una línea celular de hES derivada de GMP completa RC17 de células de Roslin (hPS Creg #RCe021-A). Los protocolos de diferenciación del mesencéfalo ventral de grado de investigación previo han implementado etapas de formación del cuerpo embrionario (CE) o cultivo en Matrigel, los cuales plantean problemas en la adaptación de GMP debido a dificultades en la reproducibilidad y el contenido de componentes derivados de animales no definidos, respectivamente.
Se probaron siete subtipos de laminina de longitud completa diferentes, y se encontró que cuatro de ellos (LN-111, LN-421, LN-511 y LN-521) admitieron eficientemente la diferenciación adherente de progenitores del mesencéfalo ventral desde el día 0-11 del protocolo. Esto se ilustra en la Figura 8A, que es un conjunto de imágenes que revelan la mejor unión y rendimiento de células neuronales en los siete subtipos de laminina probados. Con relación a un rendimiento estándar del 100 %, LN-111 produjo 170 %, LN-421 produjo 294 %, LN-511 produjo 223 % y LN-521 produjo 208 %. Las células RC17 se diferenciaron de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción, pero en placas recubiertas con laminina-121 en lugar de laminina-111. La Figura 8C compara los rendimientos, y los rendimientos son aproximadamente iguales entre sí, es decir, LN-121 funciona aproximadamente tan bien como LN-111 como sustrato.
Por el contrario, a LN-511 y LN-521, que apoyan eficientemente el crecimiento de hPSCs, se encontró que cuando hESCs no diferenciadas se sembraron en placas en LN-111 en medio de pluripotencia (iPS Brew), las células formaron esferas después de 4 días de cultivo, que se desprendieron fácilmente de la placa de cultivo, como se muestra en las imágenes de la Figura 8B. Cuando se sembró en placas el mismo número de células en LN-111 en medio B27, los cultivos permanecieron adheridos y crecieron hasta la confluencia después de 7 días de diferenciación mientras mostraban una rápida regulación negativa de los marcadores de pluripotencia. La Figura 8D es un conjunto de imágenes tomadas en los días 0, 2, 4 y 7, que muestran que la siembra de hESC de baja densidad en la matriz LN-111 en medio B27 dio como resultado cultivos neuralizados confluyentes, mientras que la Figura 8E es una ilustración gráfica de los niveles de ARNm de los marcadores de pluripotencia que disminuyen durante tres días de diferenciación. Esto indicó que LN-111 apoyaba selectivamente el crecimiento de células neuronales, pero no de células madre pluripotentes, lo que concuerda con su amplia expresión en el cerebro en desarrollo.
A continuación, se probaron diferentes combinaciones de medio basal compatible con GMP con el objetivo de optimizar el rendimiento total y la pureza de los progenitores del mesencéfalo ventral. Se descubrió que la diferenciación en un medio basal de NeuroBasal DMEM/F12 con suplemento N2, pero sin suplemento B27 desde el día 0-11 produjo el mayor rendimiento de células el día 11. La Figura 8F es una representación gráfica del rendimiento celular en los diferentes medios.
Para garantizar la caudalización precisa de los progenitores del mesencéfalo ventral, se añadieron 100 ng/ml de FGF8b a las células desde el día 9-16 de diferenciación. Para una compatibilidad GMP completa, todos los factores de crecimiento y productos químicos del protocolo se conmutaron por los enumerados en la Tabla 4 más abajo.
Tabla 4.
Como se ilustra en la Figura 2, el protocolo compatible con GMP consistió en sembrar en placas a 1 x 106 hESC en un sustrato que contiene LN-111, que después se cultivaron con medio N2, SB431542, nogina, Shh-C24II y CHIR 99021 en los días 0-9. Después, se eliminó el primer cultivo y las células sembradas en placas se expusieron a medio N2 y FGF8b en los días 9-11, lo que dio como resultado progenitores. Las células progenitoras se resembraron en placas en tres placas separadas a 0,8 x 106/cm2 con un inhibidor de ROCK (Y-27632). En los días 11-16, se eliminó el Y-27632 y cada placa se cultivó en B27, FGF8b, BDNF y ácido ascórbico para dar como resultado células que cubren un área de aproximadamente 1,78±0,13 x 106/cm3. Este rendimiento final fue más de 40 veces mayor que el rendimiento obtenido con el protocolo de diferenciación de grado de investigación basado en EB original.
En base a estos números, se extrapoló que podrían producirse más de 380 millones de células progenitoras trasplantables en 16 días cuando se comenzaba con 1 millón de hESC no diferenciadas. La Figura 8G es una ilustración gráfica de las células contadas del protocolo basado en EB en comparación con las células contadas del protocolo GMP/LN-111.
Después de diferenciar terminalmente estos progenitoresin vitro,se realizó la electrofisiología de fijación en parche en hESC diferenciadas a un destino de mesencéfalo ventral en el día 45 después de la diferenciación. Las células cultivadas en portaobjetos se sumergieron en una solución de Krebs de flujo continuo (NaCl 119 mM, KCl 2,5 mM, MgSO<4>1,3 mM, CaCl 2,5 mlVh, glucosa 25 mM y NaHCO<3>26 mM) se gasificó con 95 % de O<2>- 5 % de CO<2>a 28 °C. Las grabaciones se realizaron con un amplificador Multiclamp 700B (Molecular Devices), mediante el uso de pipetas de vidrio de borosilicato (3-7 MOhm) llenas con gluconato de potasio 122,5 mM, KCl 12,5 mM, EGTA 0,2 mM, Hepes 10 mM, MgATP 2 mM, Na<3>GTP 0,3 mM y NaCl 8 mM ajustado a pH 7,3 con KOH. Los datos se adquirieron con pClamp 10.2 (Molecular Devices); la corriente se filtró a 0,1 kHz y se digitalizó a 2 kHz. Se seleccionaron células con morfología neuronal con cuerpo celular redondo para la fijación en parche de célula completa. Los potenciales de membrana en reposo se monitorearon inmediatamente después de la ruptura en modo de pinza de corriente. Después, las células se mantuvieron a un potencial de membrana de -60 mV a -80 mV, y se inyectaron corrientes de 500 ms de -20 pA a 90 pA con incrementos de 10 pA para inducir potenciales de acción. Para las despolarizaciones de rebote, las células se inyectaron con un tren de pequeñas corrientes de 20 pA para inducir potenciales de acción. Se registraron corrientes postsinápticas espontáneas en potenciales de membrana en reposo mediante el uso de la misma solución interna.
Se verificó que las células dieron origen a neuronas que evocaron potenciales de acción al ser evaluadas mediante electrofisiología de fijación en parche (11/11). En la fracción madura de neuronas (potencial de membrana en reposo < -40 mV), 4 de 7 células mostraron además potenciales de acción de rebote después de una breve despolarización, lo que es característico de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfaloin vitro.La Figura 8H es representativa del trazo de potenciales de acción inducidos con inyecciones de corriente despolarizante. La Figura 8I es un gráfico que ilustra que algunas células del mesencéfalo ventral mostraron corrientes postsinápticas espontáneas indicativas de la integración sináptica en el plato. La Figura 8J es un ejemplo de despolarización de rebote después de una breve despolarización de la membrana característica de un fenotipo dopaminérgico. La Figura 8K es un recorte de la Figura 8J que muestra una traza respectiva en una escala ampliada.
Ejemplo de referencia 10
Para validar que el nuevo protocolo de la Figura 3 dio lugar a poblaciones puras de progenitores del mesencéfalo ventral, los cultivos se tiñeron para FOXA2 y LMX1A/B, y se encontró una alta colocalización de las dos proteínas. La Figura 9A es un conjunto de fotografías después de la inmunotinción de los progenitores, que ilustra que los cultivos diferenciados mostraron una superposición muy alta de LMX1A/FOXA2. La Figura 9B es un conjunto de gráficos que siguen el análisis de citometría de flujo, que indica que los cultivos contenían en promedio 95 % de progenitores OTX2<+>/FOXA2<+>el día 16 de la diferenciación.
Para monitorear las variaciones de lote a lote predictivas de resultadoin vivo,se diseñó un panel de qRT-PCR que implementa los nuevos marcadores predictivos clave (EN1, SPRY1, PAX8, CNPY1 y ETV5). Las células madre embrionarias humanas se diferenciaron de acuerdo con el protocolo GMP del Ejemplo 10, y después se evaluaron el día 16 de diferenciación para determinar el patrón de mesencéfalo rostro-caudal ventral correcto, así como también los marcadores para monitorear la presencia de cualquier población celular de prosencéfalo (FOXG1), de rombencéfalo (HOXA2) o lateral (PAX6) contaminante. Las especificidades de todos los cebadores usados en el panel se verificaron en muestras de tejido fetal humano subdisecado enumeradas en la Tabla 5 más abajo.
Tabla 5.
Para evaluar la reproducibilidad y precisión del nuevo protocolo GMP en comparación con el protocolo de grado de investigación, se analizaron 34 lotes de grado de investigación y 43 lotes de mesencefálicos ventrales mediante el uso del panel qRT-PCR diseñado.
La Figura 9C es una imagen de comparación de hESC diferenciadas de acuerdo con los dos protocolos. Las hESC se evaluaron para determinar la expresión de ARN el día 16 de diferenciación. Se incluyeron diferenciaciones hacia el cerebro anterior ventral (vFB) y el cerebro posterior ventral (vHB) como controles. Los valores se codificaron por colores y se normalizaron según la muestra con la mayor expresión genética para cada gen.
Si bien todos los lotes de células tenían una expresión muy robusta de OTX1, OTX2, LMX1A, LMX1B y FOXA2, hubo una variación considerable en la expresión de los marcadores del mesencéfalo caudal ventral PAX8, EN1, SPRY1 y ETV5 entre los lotes generados con el protocolo de investigación. Los lotes de células de grado de investigación generalmente tendieron a caer en dos categorías: (i) lotes de células con altos niveles de EN1, PAX8, ETV5, SPRY1 y HOXA2; o (ii) lotes de células con bajos niveles de EN1, PAX8, ETV5, SPRY1 y HOXA2, mientras que solo muy pocos lotes contenían altos niveles de marcadores del mesencéfalo caudal ventral (EN1, PAX8, EtV5, SPRY1) en ausencia de expresión de HOXA2.
Estos patrones de expresión indicaron que la presencia de células del cerebelo posterior (HOXA2+) fue necesario para la inducción de una identidad mesencefálica caudal ventral completa en los cultivos generados por el protocolo de investigación, ya que la ausencia de células del cerebelo produjo cultivos con una identidad mesencefálica ventral predominantemente rostral. Por el contrario, la implementación del nuevo protocolo de GMP produjo lotes de células que eran más homogéneas y que no contenían altos niveles de contaminación con HOXA2.
La adición de FGF8b al protocolo GMP (día 9-16) provocó una expresión inducida robusta de alto nivel de marcadores del mesencéfalo ventral caudal (EN1, PAX8, ETV5 y SPRY1), que habían demostrado ser predictivos del rendimiento de DA concomitantemente con una reducción en la expresión de marcadores correlacionados negativamente con un alto rendimiento de DA (CORIN y FOXP2). Esta caudalización tuvo lugar en ausencia de contaminación por HOXA2. Al evaluar los injertos de dos líneas celulares clínicamente relevantes (H9 y RC17) diferenciadas de acuerdo con el protocolo GMP del Ejemplo 10, se encontró que ambas líneas generaron injertos ricos en neuronas con un alto número de células que expresaban TH. La Figura 9D (H9) y la Figura 9E (RC17) son imágenes representativas de injertos de lotes que contienen altos niveles de marcadores mesencefálicos caudales ventrales. Estas células inervaron densamente el estriado del huésped (ver las marcadas con D” y E”) y expresaron marcadores de mesDA maduros. El protocolo había disminuido la contaminación del cerebelo y había aumentado la expresión de marcadores del mesencéfalo caudal ventral, que eran predictivos de un buen resultado del injerto.
Ejemplo de referencia 11
Para determinar si el protocolo GMP produjo células con actividad dopaminérgicain vivoy si los fenotipos VM anterior frente a caudal fueron realmente predictivos de la eficaciain vivo,las células se evaluaron mediante el trasplante a un modelo animal de la enfermedad de Parkinson. Dos grupos de ratas sometidas a lesiones unilaterales de 6-OHDA se evaluaron para determinar las rotaciones inducidas por anfetamina antes y después del trasplante intranigral con células RC17 con patrón VM diferenciadas de acuerdo con el protocolo GMP de LN-111 (protocolo en la Figura 2). Un grupo de animales (mesDA RC17) recibió células diferenciadas en presencia de FGF8b desde el día 9-16 para producir progenitores mesDA de VM caudal que expresaban altos niveles de marcadores predictivos EN1, CNPY1, SPRY1, ETV5 y PAX8 como se muestra en la Figura 9C. Como se muestra en la Figura 10, este grupo de animales exhibió una recuperación funcional evidenciada por la reversión y sobrecompensación (en la semana 22) de las rotaciones inducidas por anfetamina. Una disminución en las rotaciones es equivalente a la recuperación del comportamiento, ya que las lesiones provocan la rotación en las ratas. Si el injerto es funcional, el comportamiento rotacional se suprime. Por el contrario, los animales que recibieron células diferenciadas en ausencia de FGF8b para producir células VM rostrales del dominio de STN (grupo STN RC17) no mostraron recuperación funcional de las rotaciones inducidas por anfetamina. Estas células con patrón STN expresaron altos niveles de marcadores de VM generales pero bajos niveles de marcadores de VM caudales predictivos, lo que valida de esta manera el poder de los marcadores de VM caudales para predecir el resultadoin vivoen modelos animales de la enfermedad de Parkinson.
Discusión
La evaluación preclínica de las células y su desempeño in vivo es pertinente porque para los trastornos del sistema nervioso central, el trasplante se realiza con células progenitoras inmaduras que experimentan diferenciación terminal y maduración después del trasplantein vivo. Los progenitores trasplantados solo se vuelven funcionales después de varios mesesin vivo. Esto complica la evaluación del potencial terapéutico de las células antes del injerto. Por lo tanto, es conveniente poder predecir la maduraciónin vivode células injertadas basadas en las característicasin vitrode los progenitores antes del injerto.
Se encontró que la diferenciaciónin vitroen neuronas TH+ no se correlaciona con la formación de neuronas TH+in vivo.También se descubrió que, aunque FOXA2, LMX1A y CORIN, que se usan comúnmente para identificar progenitores de mesDA durante el desarrollo y en cultivos de células madre, son necesarios para la diferenciación de dopamina después del trasplante, no son suficientes para predecir el rendimiento o la funcionalidad de las célulasin vivo. Esto resalta la necesidad de validar marcadores que puedan predecir la maduración funcional de la célula in vivo, en lugar de depender únicamente de los marcadores expresados en los progenitores diferenciadores de una línea celular específica.
Cuando se aplicó un enfoque imparcial para identificar marcadores predictivos de un resultado de injerto exitoso, se encontró que los marcadores expresados por las células del mesencéfalo cercanas al MHB (es decir, EN1, ETV5, CNPY1, PAX8 y SPRY1) se correlacionaron con un resultado de injerto exitoso, mientras que los marcadores expresados en el dominio diencéfalo, tales como EPHA3, mostraron una correlación negativa con el resultado del injerto. Estos hallazgos están en línea con un estudio reciente en el modelo de ratón que muestra una relación notablemente estrecha entre las líneas neuronales de mesDA y STN. Mientras que muchos factores de transcripción clave, que incluyen LMX1A, LMX1B, CORIN, FOXA1, FoXA2, FOXP1, FOXP2, MSX1, NURR1 y PBX1, se comparten por ambos linajes, solo el linaje mesDA se identifica por la expresión de EN1 y CNPY1, que están restringidos a la parte caudal del mesencéfalo ventral.
En base al análisis de estos marcadores, se confirmó que los cultivos con patrón mesencefálico ventral contenían progenitores tanto de STN como de mesDA y que su proporción relativa en cada lote probablemente contribuyó a la variación observada, pero previamente inexplicada, en los resultadosin vivocuando los progenitores definidos solo por la alta coexpresión de LMX1A, FOXA2 y OTX2 se trasplantaron.
El ajuste fino del patrón para enriquecer los progenitores dopaminérgicos se logró mediante el suministro exógeno cronometrado de FGF8b en la etapa de progenitor de diferenciación. Esto, así como también una serie de ajustes, permitieron la generación de un protocolo de diferenciación GMP completo para la producción de progenitores de mesDA. La clave de este protocolo GMP es el uso de LN-111, un componente de la matriz extracelular fisiológicamente relevante que normalmente se expresa en el cerebro en desarrollo y que se descubrió que apoya la unión de progenitores neuronales diferenciadores, pero no de células madre pluripotentes.
A partir del análisis cerebral post mortem de pacientes con enfermedad de Parkinson trasplantados con tejido mesencefálico ventral fetal humano, se determinó que los injertos que contienen aproximadamente 100 000 neuronas TH+ trasplantadas están asociados con un beneficio clínico significativo en los pacientes. Mediante el uso del protocolo GMP a base de laminina, el número de progenitores de mesDA obtenidos por hESC al inicio de la diferenciación aumentó en gran medida en comparación con el protocolo de grado de investigación, y dio como resultado resultados de injerto que coincidieron con las mejores diferenciaciones del protocolo de grado de investigación. Dada un rendimiento promedio de aproximadamente 5000 a 6000 neuronas DA maduras por 100 000 progenitores trasplantados de lotes celulares ricos en los marcadores predictivos, la producción manual de células para varios cientos de pacientes puede ser alcanzable incluso en pequeños laboratorios GMP sin la necesidad de sistemas de cultivo automatizados. El protocolo presentado aquí omite muchos de los problemas de producción a gran escala asociados con otras terapias con células madre que ingresan a una clínica.
Además, la eficaciain vivodel protocolo GMP, así como también los poderes predictivos de los nuevos marcadores identificados enumerados anteriormente se verificaron en el Ejemplo 11 y la Figura 10. Una disminución en las rotaciones se consideró equivalente a una recuperación del comportamiento, ya que las lesiones dopaminérgicas de 6-OHDA hicieron que los animales rotaran. Un injerto se consideró funcional si abolió el comportamiento rotacional hasta o por debajo del valor inicial de 0.
El perfil genético global de un gran número de lotes celulares que se han trasplantado a un modelo de rata permitió el establecimiento de un panel de marcadores para predecir con mucha más precisión un resultado de injerto exitoso en la etapa progenitorain vitro.La capacidad de predecir mejor el resultado del injerto acelerará la progresión de las células madre hacia el uso clínico y puede usarse para la comparabilidad de lote a lote, así como también para comparar las células injertadas en diferentes ensayos clínicos. A largo plazo, una mejor predicción de la maduración in vivo y de las propiedades funcionales de las células ya en el nivel progenitor facilitará el uso de células autólogas o compatibles individualmente para el trasplante.
Se apreciará que variantes de las características y funciones descritas anteriormente y otras, o alternativas de estas, pueden combinarse en muchos otros sistemas o aplicaciones diferentes. Los expertos en la técnica pueden hacer subsecuentemente varias alternativas, modificaciones, variaciones o mejoras no previstas o imprevistas en la presente descripción que también se pretende que se abarquen por las reivindicaciones siguientes.

Claims (2)

REIVINDICACIONES
1. Un método para inducir la producción de células progenitoras del mesencéfalo ventral caudalizadas, que comprende:
sembrar en placas células madre embrionarias sobre un sustrato que contiene laminina-111, en donde dichas células madre se cultivan en medios de cultivo celular para producir dichas células progenitoras del mesencéfalo ventral caudalizado, en donde dichas células progenitoras del mesencéfalo ventral caudalizado expresan altos niveles de EN1, SPRY1, WNT1, CNPY1, PAX8, ETV5, PAX5, FGF8, SP5 o TLE4,
en donde las células madre se cultivan en un medio primario que comprende medio N2, un inhibidor de TGF-p, nogina, proteína sonic hedgehog, y un inhibidor de GSK3, y que no contiene suplemento B27,
en donde el medio primario se retira y se añade un medio secundario, el medio secundario que comprende medio N2 y un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), y que no contiene suplemento B27, en donde el FGF es FGF8b,
en donde el sustrato consiste de laminina intacta o fragmentos de la laminina, en donde el medio secundario se añade de 156 horas a 228 horas después de la siembra en placas,
en donde se retira el medio secundario y las células madre se resiembran en placas,
en donde la resiembra en placas se produce de 252 horas a 276 horas después de la resiembra en placas,
en donde la resiembra en placas se produce mediante el uso de un medio terciario que comprende un medio B27, un inhibidor de ROCK, el FGF, un factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y ácido ascórbico, y/o en donde las células madre se cultivan después en un medio cuaternario, el medio cuaternario que comprende un medio B27, el FGF, un factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y ácido ascórbico.
2. El método de la reivindicación 1, en donde las células madre se cultivan en el medio cuaternario hasta 324 horas a 396 horas después de la siembra en placas, o en donde las células madre se cultivan en el medio cuaternario durante un período de tiempo de 108 horas a 132 horas.
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Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010096496A2 (en) 2009-02-17 2010-08-26 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods of neural conversion of human embryonic stem cells
CN110684734A (zh) 2011-11-04 2020-01-14 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 用于植入的中脑多巴胺（da）神经元
CA2910394A1 (en) 2013-04-26 2014-10-30 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Cortical interneurons and other neuronal cells produced by the directed differentiation of pluripotent and multipotent cells
US20190018000A1 (en) 2016-01-12 2019-01-17 Cedars-Sinai Medical Center A method of non destructive monitoring of biological processes in microfluidic tissue culture systems
AU2017213795A1 (en) 2016-02-01 2018-08-16 Cedars-Sinai Medical Center Systems and methods for growth of intestinal cells in microfluidic devices
US11913022B2 (en) 2017-01-25 2024-02-27 Cedars-Sinai Medical Center In vitro induction of mammary-like differentiation from human pluripotent stem cells
US11767513B2 (en) 2017-03-14 2023-09-26 Cedars-Sinai Medical Center Neuromuscular junction
WO2018176001A2 (en) 2017-03-24 2018-09-27 Cedars-Sinai Medical Center Methods and compositions for production of fallopian tube epithelium
EP4235175A3 (en) * 2017-05-05 2023-10-11 National University of Singapore Methods for culturing human keratinocytes
EP3655774B1 (en) * 2017-07-17 2024-09-25 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG A method for single cell protein expression profiling of floorplate mesencephalic dopaminergic progenitor cells
WO2019066059A1 (ja) 2017-09-29 2019-04-04 国立大学法人東京医科歯科大学 臓器オルガノイド及びその製造方法
CN108265025A (zh) * 2017-12-28 2018-07-10 安徽中盛溯源生物科技有限公司 一种人类诱导多能干细胞的重编程培养基
EP3768823B1 (en) 2018-03-23 2025-12-31 Cedars-Sinai Medical Center METHODS FOR USING CELLS FROM PANCREATIC ISLETS
EP3775161A4 (en) 2018-04-06 2022-04-06 Cedars-Sinai Medical Center NEURODEGENERATIVE DISEASE MODELS DERIVED FROM HUMAN PLURIPOTENTIC STEM CELLS ON A MICROFLUIDIC CHIP
US11981918B2 (en) 2018-04-06 2024-05-14 Cedars-Sinai Medical Center Differentiation technique to generate dopaminergic neurons from induced pluripotent stem cells
KR102201417B1 (ko) * 2018-05-02 2021-01-11 (주) 에스바이오메딕스 도파민 신경세포의 분리방법 및 이를 이용하여 분리된 도파민 신경세포를 포함하는 파킨슨병 치료용 약제학적 조성물
TWI675678B (zh) * 2018-08-23 2019-11-01 國為生醫科技股份有限公司 亞丁基苯酞於多巴胺神經前驅細胞移植治療的應用
CN114606188A (zh) * 2019-03-06 2022-06-10 安徽中盛溯源生物科技有限公司 一种中脑多巴胺能神经前体细胞的制备方法及其应用
WO2020201488A1 (en) * 2019-04-04 2020-10-08 Hackethal Johannes A novel human-material-based platform technology for tissue engineering
JP2022538503A (ja) * 2019-07-05 2022-09-02 ノヴォ ノルディスク アー／エス ヒト多能性幹細胞由来の神経幹細胞株の生成
CA3145700A1 (en) 2019-07-25 2021-01-28 Jeanne F. Loring Methods of identifying dopaminergic neurons and progenitor cells
MX2022002532A (es) * 2019-08-29 2022-06-16 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Métodos para generar y aislar neuronas de dopamina del mesencéfalo.
EP3792346B1 (en) * 2019-09-13 2023-07-26 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG Method for the generation of a cell composition of ventral midbrain dopaminergic progenitor cells
EP4073235A4 (en) * 2019-12-09 2024-02-14 Wisconsin Alumni Research Foundation IN VITRO MULTIPLICATION OF DOPAMINERGIC SUBTYPE NEURAL PROGENITORS DERIVED FROM PLURIPOTENT STEM CELLS
WO2021175768A1 (en) 2020-03-02 2021-09-10 Novo Nordisk A/S Use of pluripotent markers to detect contaminating residual undifferentiated pluripotent stem cells
BR112022019060A2 (pt) 2020-03-25 2022-11-29 Sana Biotechnology Inc Células neurais hipoimunogênicas para o tratamento de distúrbios e condições neurológicas
WO2021216622A1 (en) 2020-04-21 2021-10-28 Aspen Neuroscience, Inc. Gene editing of gba1 in stem cells and method of use of cells differentiated therefrom
US20230165909A1 (en) 2020-04-21 2023-06-01 Aspen Neuroscience, Inc. Gene editing of lrrk2 in stem cells and method of use of cells differentiated therefrom
CA3183958A1 (en) * 2020-06-26 2021-12-30 Minerva Biotechnologies Corporation Methods for deriving dopaminergic neurons from pluripotent stem cells
CN114292814A (zh) * 2020-09-22 2022-04-08 上海跃赛生物科技有限公司 一种多能干细胞分化为中脑黒质多巴胺能神经细胞的方法
EP4263809A1 (en) 2020-12-21 2023-10-25 Aarhus Universitet Dopaminergic neuron progenitor cells or cell derivatives thereof obtained from lineage restricted pluripotent stem cells
CN112725278B (zh) * 2021-01-19 2022-09-02 上海爱萨尔生物科技有限公司 诱导多功能干细胞分化为多巴胺能祖细胞的培养液及分化方法
KR20230161494A (ko) 2021-03-30 2023-11-27 트레일헤드 바이오시스템즈 인크. 희소돌기아교세포 전구 세포를 생성하기 위한 방법 및 조성물
JP2024526842A (ja) * 2021-07-19 2024-07-19 トレイルヘッド バイオシステムズ インコーポレイテッド ヒト中脳神経前駆細胞を作製するための方法および組成物
US20250082686A1 (en) 2021-07-21 2025-03-13 Aspen Neuroscience, Inc. Aav-based modulation of gba1 and related compositions and uses thereof
US20230081881A1 (en) 2021-07-21 2023-03-16 Aspen Neuroscience, Inc. Transposon-based modulation of gba1 and related compositions and uses thereof
WO2023118050A1 (en) 2021-12-21 2023-06-29 Novo Nordisk A/S Use of novel markers to detect pluripotent stem cells
US20250076286A1 (en) * 2022-01-13 2025-03-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Generation of neural organizer organoids and midline assembloids from human pluripotent stem cells
CN119384700A (zh) 2022-04-15 2025-01-28 艾斯本神经科学公司 细胞分化状态的分类方法和分化细胞的相关组合物
GB202214291D0 (en) * 2022-09-29 2022-11-16 Rinri Therapeutics Ltd Laminin culture protocol
CN120283046A (zh) * 2022-12-02 2025-07-08 安徽中盛溯源生物科技有限公司 用于成熟中脑多巴胺能祖细胞的培养基、包被基质和方法
CN120283045A (zh) 2022-12-02 2025-07-08 安徽中盛溯源生物科技有限公司 用于扩增中脑多巴胺能祖细胞的培养基、包被基质和方法
WO2024182311A2 (en) * 2023-02-27 2024-09-06 Ryne Biotechnology Inc. Combinations for treatment of parkinson's disease and other primary and secondary parkinsonian disorders

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003296316A1 (en) * 2002-12-09 2004-06-30 The Mclean Hospital Corporation Dopaminergic neurons differentiated from embryonic cells for treating neurodegenerative diseases
US8597947B2 (en) * 2004-12-29 2013-12-03 Hadasit Medical Research Services & Development Limited Undifferentiated stem cell culture systems
WO2011156331A2 (en) 2010-06-08 2011-12-15 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Human neural progenitor derived dopaminergic progenitors and neurons
US8691574B2 (en) * 2010-06-15 2014-04-08 Cellular Dynamics International, Inc. Generation of induced pluripotent stem cells from small volumes of peripheral blood
EP3042951B1 (en) * 2013-09-05 2019-02-20 Kyoto University New method for inducing dopamine-producing neural precursor cells
WO2015143342A1 (en) * 2014-03-21 2015-09-24 Cellular Dynamics International, Inc. Production of midbrain dopaminergic neurons and methods for the use thereof
HUE058258T2 (hu) * 2015-06-01 2022-07-28 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Középagyi dopamin (mda) neuronok in vitro differenciálódásának eljárásai

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