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ES3037359T3 - Langerin+ cell targeting - Google Patents

Langerin+ cell targeting

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Publication number
ES3037359T3
ES3037359T3 ES19700520T ES19700520T ES3037359T3 ES 3037359 T3 ES3037359 T3 ES 3037359T3 ES 19700520 T ES19700520 T ES 19700520T ES 19700520 T ES19700520 T ES 19700520T ES 3037359 T3 ES3037359 T3 ES 3037359T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
cells
langerin
carrier
cell
group
Prior art date
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Active
Application number
ES19700520T
Other languages
English (en)
Inventor
Christoph Rademacher
Eike-Christian Wamhoff
Jessica Schulze
Robert Carsten Willi Wawrzinek
Oliver Seitz
Gunnar Bachem
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Humboldt Univ Zu Berlin
Humboldt Universitaet zu Berlin
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Original Assignee
Humboldt Univ Zu Berlin
Humboldt Universitaet zu Berlin
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Humboldt Univ Zu Berlin, Humboldt Universitaet zu Berlin, Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften filed Critical Humboldt Univ Zu Berlin
Application granted granted Critical
Publication of ES3037359T3 publication Critical patent/ES3037359T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

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Abstract

La presente invención se refiere al uso de un vehículo para la orientación molecular específica de células Langerin+, en donde el vehículo es capaz de unirse específicamente a una célula Langerin+, comprendiendo dicho vehículo (a) al menos un portador y (b) al menos un conjugado basado en una fracción sacárida para una administración de carga dirigida a una célula Langerin+, así como a composiciones farmacéuticas y usos que comprenden el vehículo inventivo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Focalización a celulas Langerina<+>
Campo de la invención
La presente invención se refiere al uso de un vehículo para la focalización molecular específica a las células Langerina<+>, en el que el vehículo es capaz de unirse específicamente a una célula Langerina<+>,comprendiendo dicho vehículo (a) al menos un portador y (b) al menos un conjugado basado en una fracción de sacárido para una entrega de carga dirigida a una célula Langerina<+>. La presente invención también se refiere a las composiciones farmacéuticas y de diagnóstico correspondientes, así como a los usos que comprenden el vehículo inventivo y los métodos que implican dicho vehículo.
Antecedentes de la invención
La piel es el tejido blando que recubre a los animales vertebrados. En los mamíferos, la piel es un órgano de los sistemas tegumentarios que comprende múltiples capas de tejido ectodérmico, incluida la epidermis, que proporciona impermeabilidad y funciona como barrera contra las infecciones; y la dermis, que es una capa pobre en células formada por fibroblastos que producen la matriz extracelular que contiene proteoglicanos y fibras entrelazadas de colágeno y elásticas; ambas capas están separadas por la membrana basal, una lámina de fibras, que controla el tráfico de células y moléculas entre la dermis y la epidermis y proporciona los factores necesarios para los procesos de remodelación o reparación. La piel, por tanto, interactúa con el mundo exterior y, por lo tanto, no sólo está expuesta al estrés físico, sino también a una ariedad de antígenos ambientales, como sustancias químicas, bacterias y agentes patógenos.
En consecuencia, el sistema inmunitario de la piel debe estar preparado para detectar y discernir entre antígenos diversos y debe ser capaz de inducir reacciones apropiadas, como respuestas inmunitarias tolerogénicas o protectoras. Para cumplir esta función, la piel contiene una población heterogénea de células dendríticas (CD) que representan reguladores claves de las respuestas inmunitarias. Las células dendríticas se definen generalmente como una población de células presentadoras de antígenos que coordinan la interacción entre la inmunidad innata y la adaptativa y son las únicas células capaces de inducir respuestas inmunitarias primarias. Por lo tanto, las CD son una diana interesante en las estrategias de inmunoterapia. Se han descrito varios tipos de CD en humanos y pueden clasificarse según su distribución tisular. Algunos de estos tipos de CD han sido reconocidos por su capacidad de presentar de forma cruzada antígenos exógenos asociados a tumores a través del CMH-I y de cebar de forma eficiente células T CD8<+>ingenuas. Las células dendríticas cutáneas desempeñan un papel fundamental en la protección del huésped contra los patógenos invasores pero también limitan los daños tisulares colaterales. Además, están asociadas a la ruptura de la tolerancia periférica que conduce a enfermedades inflamatorias crónicas inmunomediadas como la dermatitis alérgica de contacto y la psoriasis (Clausen y Stoitzner, 2015, Frontiers in Immunology, 6, Artículo 534).
Las CD pueden subdividirse en CD convencionales y CD plasmocitoides (pCD). La piel sana no contiene pCD o contiene muy pocas, que sólo entran en la piel inflamada para fomentar la cicatrización de heridas mediante interferones de tipo I o mediar en una reacción proinflamatoria que se desarrolla tras la estimulación TLR7, por ejemplo, durante la psoriasis. En estado estacionario, las CD convencionales que residen en la piel no suelen estar inactivas, sino que -como células inmaduras- sondean constantemente su entorno en busca de patógenos invasores y toman muestras continuamente de antígenos propios y ambientales. Tras su maduración, las CD migran a los ganglios linfáticos que drenan la piel y se desprenden de los queratinocitos circundantes. Durante su migración a las zonas de células T de los ganglios linfáticos locales, las células regulan al aumento la expresión superficial de complejos CMH/péptidos para el reconocimiento y la interacción con células T naive específicas de antígeno. Al encontrarse con células T potencialmente autorreactivas que han escapado a la tolerancia central o con células T que reconocen péptidos derivados de antígenos extraños inocuos, estas CD inducen la anergia de las células T o la tolerancia delecional de las células T (función tolerante).
Además, los frecuentes contactos entre células T y CD durante la exploración de las CD por parte de las células T en los órganos linfoides, es decir, en ausencia de antígenos afines, inducen un nivel de activación basal en las células T necesario para una rápida capacidad de respuesta ante posteriores encuentros con antígenos extraños durante la inflamación. La invasión patógena junto con las señales proinflamatorias suelen impulsar una maduración funcional completa de las células dendríticas de la piel. Más allá del programa de diferenciación homeostático, las células ahora también regulan al alza la expresión de moléculas coestimuladoras y, en particular, de citoquinas proinflamatorias. En conjunto, estas promueven la expansión clonal de las células T naïve específicas de antígeno e instruyen a las células T para que adquieran funciones efectoras apropiadas específicamente adaptadas para eliminar el patógeno invasor (función sensibilizadora). Así pues, las CD inmaduras de la periferia tienen una función centinela y son capaces de captar antígenos, procesarlos y asociarlos a péptidos-MHC. También tienen una función migratoria y se encargan del transporte del antígeno a los ganglios linfáticos. Allí, la interacción CD-célula T da lugar a complejos MHC I y II/péptido de alta superficie, que finalmente dan lugar a la instrucción Th1/Th2/Th17, o a la deleción y anergia de las células T o a la activación de los linfocitos T citotóxicos (CTL, células T asesinas).
Según informes actuales (Doebel et al., 2017, Trends Immunol, 38, 11, 817-828) los grupos de células dendríticas de la piel pueden subdividirse en varios subconjuntos de CD. Las células dendríticas pueden ser células de Langerhans (CL) epidérmicas y CD dérmicas. Las CD dérmicas constituyen los subtipos Langerina<+>y Langerin-, es decir, células que expresan la lectina de tipo C Langerina (también conocida como CD207) en su superficie, o no la expresan. Las CD dérmicas Langerina<+>se subdividen a su vez en grupos CD103<+>y CD103<−>(Yamazaki y Morita, 2013, Frontiers in Immunology, 4, Artículo 151) según la expresión de CD103, es decir, la integrina alfa E (ITGAE). Otra división en subconjuntos define las CD como poblaciones Langerina<+>CD11blow, Langerina<−>CD11b<−>, y Langerina<−>CD11b<+>(Yamazaki y Morita, 2013, Frontiers in Immunology, 4, Artículo 151).
Se sabe que la Langerina participa en el reconocimiento dependiente de Ca<2+>de glicanos asociados tanto a patógenos como a sí mismos, así como de oligosacáridos similares a la heparina (Munoz-Gracia et al., J. Am. Chem. Soc.2015, 137, 12, 4100-10). Además, la Langerina se une a glicanos, como los oligosacáridos glactosa-6-sulfatados, incluido el queratán sulfato (Tateno et al., Journal of Biological Chemistry, 2010, 283, 9, 6390-6400). Dado que la Langerina muestra un perfil de expresión muy restringido a subtipos específicos de CD, sobre todo en la piel, representa una diana atractiva para el desarrollo de vacunas o el establecimiento de inmunoterapias novedosas.
El documento WO 2005/092288 divulga liposomas derivados de hidratos de carbono para dirigir dominios celulares de reconocimiento de hidratos de carbono de lectinas CTL/CTLD, y la administración intracelular de compuestos terapéuticamente activos.
Flacher et al., 2010, Journal of Investigative Dermatology, 130, 755-762 divulga que las células de Langerhans epidérmicas capturan rápidamente y presentan antígenos de anticuerpos dirigidos a lectinas de tipo C depositados en la dermis.
La piel es, por tanto, un punto de entrada especialmente atractivo para las vacunas u otras inmunoterapias debido a las CD que expresan Langerina y que residen en la capa superior, lo que permite la aplicación local de una vacuna o fármaco con posibles respuestas sistémicas, y sin necesidad de utilizar agujas. Entre las estrategias que potencialmente pueden seguirse se incluyen el suministro de vacunas contra el cáncer, vacunas profilácticas contra infecciones víricas o bacterianas, inmunoterapias contra las alergias, el tratamiento de enfermedades autoinmunes como el lupus o el uso de enfoques regenerativos en el contexto de los trasplantes de piel.
Sin embargo, es difícil dirigirse específicamente a las CD de Langerina<+>ya que los sitios de unión a carbohidratos de las lectinas de tipo C están muy expuestos a los disolventes y son hidrófilos. En consecuencia, las interacciones con mono- y oligosacáridos se caracterizan típicamente por afinidades bajas en el rango milimolar. Además, el proceso de reconocimiento es altamente promiscuo, ya que las lectinas tipo C individuales se unen a varios mono- u oligosacáridos y viceversa. En este contexto, Aretz et al., 2014 señalan que el análisis in silico basado en la estructura de 21 estructuras de rayos X corroboró la clasificación de las lectinas de tipo C como dianas no drogables o desafiantes. Se identificaron exclusivamente bolsillos secundarios de unión a fármacos adyacentes al sitio de unión a carbohidratos para lectinas tipo C de relevancia terapéutica limitada (Aretz et al., 2014, Front Immunol, 5, Artículo 323). Por otro lado, existen enfoques exitosos que se basan en un método ex vivo en el que se han aislado células dendríticas progenitoras del paciente, se han diferenciado ex vivo y se han cargado posteriormente con partículas SPIO (Verdijk et al., 2006, Int. J. Cancer, 120, 978-984). Esta configuración, sin embargo, adolece de costos elevados y baja eficacia, debido, en particular, a la falta de migración celular desde el lugar de la inyección hasta el tejido diana y a la escasa diferenciación celular. Otros métodos alternativos se basan en el uso de anticuerpos. Por ejemplo, en Flacher et al., 2010, Journal of Investigative Dermatology, 130, 755-762 se describe la captura de la presentación de antígenos de anticuerpos dirigidos contra la Langerina en las células de Langerhans epidérmicas. Sin embargo, los anticuerpos no se disuelven per se del receptor tras la endocitosis, por lo que pueden limitar la capacidad de absorción de las células. Además, debido a la elevada afinidad del anticuerpo, también puede unirse a células con una expresión muy baja del receptor. De ahí la necesidad de un enfoque que permita dirigirse eficazmente a las células dendríticas Langerina<+>, en particular en la piel, y que además permita una entrada operativa y fiable además del posterior procesamiento de sustancias, por ejemplo antígenos, en la célula.
Objeto y resumen de la invención
La presente invención aborda estas necesidades y proporciona una composición farmacéutica que comprende un vehículo para la focalización molecular específica a las células Langerina<+>, en la que el vehículo es capaz de unirse específicamente a una célula Langerina<+>, comprendiendo dicho vehículo (a) al menos un portador y (b) al menos un conjugado de la fórmula general (I)
en la que
(i) R es seleccionado independientemente del grupo formado por
alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquilo C1-C8alquilo sustituido o no sustituido, arilo, arilo C1-C8alquilo, heteroarilo, heteroarilo C1-C8alquilo, biarilo y biarilo C1-C8alquilo, en el que los sustituyentes son seleccionados independientemente del grupo formado por -N(R<a>)(R<b>), -OR<a>, -SR<a>, -C(O)R<a>, -C(O)OR<a>, -C(O)N(R<a>)(R<b>), -N(R<a>)C(O)R<b>, -N(R<a>)S(O)2Rb, -OS(O)2R<a>, halógeno, -NO2, -CN, -NC, -N3, -NCO, -OCN, -NCS, -SCN, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y heteroarilo sustituido o no sustituido
donde R<a>y R<b>son seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, C1-8alquilo sustituido o no sustituido, C2-8alquenilo, C2-8alquinilo, C3-6cicloalquilo, aril-C1-5alquilo, heteroarilo-C1-5alquilo, arilo, heteroarilo;
(ii) R' es seleccionado independientemente del grupo formado por
-OR<a>, y -NHS(O)2R<a>,
en el que R<a>se define como anteriormente;
(iii) A-D-B-L es un grupo enlazador que une covalentemente el derivado de glucosa de fórmula (I) al portador o a una parte del mismo,
en el que dicho grupo enlazador A-D-B-L es un grupo formado por un espaciador A-D-B y un enlazador L que conecta el derivado de glucosa con el portador y en el que dicho enlazador L es un enlazador de la siguiente fórmula general (L-1)
en la que
U<1>es un grupo conectado a través de B con el espaciadorD, en el que U<1>es seleccionado del grupo formado por, -CH2-, -CH=CH-, o -C≡C-;
Z<1>es una fracción que une el enlazador al portador seleccionada del grupo formado por -O-, -S-, -N(R<d>)-, -C(R<d>)(R<e>)-, -R<d>C=CR<e>-, -C(O)-, -C(O)O-,-OC(O)-, -C(O)S-, -C(O)N(R<d>)-, -N(R<d>)C(O)-, -N(R<d>)C(O)N(R<e>)-, -N(R<d>)C(S)N(R<e>)-, -N(R<d>)C(O)O-, -OC(O)N(R<d>)-, -ciclohexeno-, -triazoles-, -NHS(O)2-, -S(O)2-, -OP(O)(H)O-, o -OP(O)(OH)O-;
donde R<d>y R<e>son seleccionados independientemente del grupo formado por hidrógeno, C1-32alquilo sustituido o no sustituido, C2-32alquenilo, C3-8cicloalquilo, arilo, C1-C8alquilo arilo, heteroarilo, C1-C8alquilo heteroarilo; y
d1 a d5 es cada uno un número entero de 0 a 50, d6 un número entero de 1 a 50. en el que el portador comprende o está asociado a una carga farmacéuticamente activa y, opcionalmente, a una sustancia portadora farmacéuticamente aceptable o a un adyuvante farmacéutico.
Los inventores descubrieron sorprendentemente que el vehículo descrito se une específicamente a las células Langerina<+>y transporta eficazmente la carga, es decir, sustancias de diferente tamaño y naturaleza, a una célula Langerina<+>, que a su vez puede presentar sustancias internalizadas, por ejemplo antígenos, en su superficie. La Langerina es especialmente adecuada para la captación de partículas mediada por el receptor en compartimentos endosómicos, lo que permite la respuesta inmunitaria de las células T CD8<+>adecuada para el cáncer y la terapia antiviral debido a la presentación cruzada de antígenos a través de moléculas MHC I en la superficie de las células diana. Un reto importante de la presente invención fue, de hecho, el desarrollo de una estructura de ligando que se una adecuadamente a la lectina de tipo C Langerina. De hecho, el direccionamiento del sitio de unión del marcador específico de las células de Langerhans, la Langerina, que es una proteína de unión a azúcares, ha fracasado hasta ahora debido sobre todo a la arquitectura compleja y a la baja accesibilidad de los compuestos similares a los fármacos, como se informó para las proteínas de unión a carbohidratos en general en Ernst y Magnani, 2009, Nat Rev Drug Disc, 8(8), 661-77. La elección correcta del bolsillo de unión y el mecanismo asociado para la liberación de la carga en el compartimento endosomal de las células fueron los factores esenciales del éxito. Los inventores descubrieron además que cuando la carga se libera bajo la influencia de la acidez y la concentración de calcio en la célula, el receptor puede introducir ventajosamente más partículas en la célula. El ligando de Langerina proporcionado actualmente, como parte del vehículo descrito anteriormente, surgió de un diseño racional del ligando para cumplir los criterios de durabilidad, escalabilidad, accesibilidad sintética, suficiente afinidad y especificidad por el receptor diana, así como suficiente hidrofilia para evitar interacciones no deseadas, como la agregación superficial, con el portador. Se utilizaron métodos asistidos por ordenador, así como métodos innovadores de diseño de fármacos basados en fragmentos para llegar a la estructura del ligando aquí descrita.
El uso del ligando ventajoso descrito anteriormente en un enfoque de liberación de carga en células Langerina<+>permite por primera vez el empleo de formas de dosificación transdérmica e intradérmica dirigidas, lo que aumenta significativamente el cumplimiento del paciente (debido a la aplicabilidad sin aguja) y al mismo tiempo permite vacunas más económicas. Al dirigirse específicamente a células dendríticas especializadas, ahora es posible iniciar una respuesta inmunitaria in vivo a la carga introducida, por ejemplo como vacunas terapéuticas o profilácticas, o reducir la respuesta inmunitaria, por ejemplo debido a la inducción de tolerancia periférica o central. Otra aplicación ventajosa es la modulación directa de una función desregulada de las células de Langerhans, como se manifiesta en algunas enfermedades autoinmunes y en la histocitosis de las células de Langerhans, es decir, un cambio canceroso en las células de Langerhans. Así pues, el hasta ahora problemático entorno de la piel, que suele estar formado por varios grupos de células que compiten entre sí y cuya complejidad ha reducido a menudo la eficacia de los enfoques de vacunación ya que, por ejemplo, los principios activos no han llegado a las células dendríticas previstas y pueden incluso haber producido efectos secundarios no deseados por su inclusión involuntaria en células inmunitarias, se convierte ahora en un área de actuación inmunológica y médica de primer orden y muy atractiva.
Además, debido al concepto versátil de carga-portador de la presente invención, que se implementa sobre la base del acoplamiento del innovador conjugado que contiene ligando y el portador, es factible la introducción de un grupo diverso de sustancias diferentes (cargas) en las células Langerina<+>. Así, no sólo pueden introducirse en la célula proteínas acopladas a anticuerpos, como se describe en la técnica anterior, sino también sustancias como ácidos nucleicos, por ejemplo ADN o ARN, elementos glicosilados, estimulantes, péptidos independientes o cualquier compuesto de bajo peso molecular. Esto permite aumentar enormemente la variabilidad en términos de modulación celular e inmunológica y de elicitación de respuestas inmunitarias. Además, es el único sistema que permite la administración simultánea de diferentes moléculas y, por tanto, puede modular diferentes brazos del sistema inmunitario adaptativo, es decir, anticuerpos y linfocitos T citotóxicos al mismo tiempo.
Además, el concepto de portador-carga de la presente invención conlleva una gran flexibilidad y adaptabilidad del vehículo (ligando-conjugado más portador) y de la carga. Esto se traduce en opciones de adaptación y optimización rápidas y rentables durante el desarrollo del producto. Otros sistemas, como los basados en anticuerpos, son menos flexibles y, debido a los largos plazos de desarrollo y producción, generan costos elevados. Así, la administración dirigida en combinación con la administración dérmica no sólo aumenta la eficacia y la seguridad al reducir la carga del fármaco, sino que también permite una mejor dosificación y evita la administración sistémica del fármaco. Además, el objeto de la presente invención permite ofrecer opciones de tratamiento sin inducir respuestas adversas de anticuerpos. También la coadministración de adyuvantes y antígenos como prevé la presente invención permite evitar la activación sistémica del sistema inmunitario. Además, la presente invención permite la combinación de diferentes cargas para la misma o para diferentes dianas, lo que puede amplificar la modulación de las respuestas inmunitarias a través de diferentes vías.
En una realización preferida de la presente invención, R es un fenilo sustituido o no sustituido.
En otra realización preferida, el fenilo está mono-, di- o trisustituido y los sustituyentes del fenilo son seleccionados independientemente del grupo formado por - NH2-OH, -OCH3, -C(O)CH3, C(O)NH2, -C(O)NHCH3, -CH2OH -NHC(O)CH3, -F, -Cl, -Br, -NO2, -CN, alquilo C1-C4, naftilo y fenilo.
En otra realización preferida, dicho conjugado es un conjugado de la siguiente fórmula (I-1) a (I-15):
En otra realización preferida, dicho al menos un portador es una partícula blanda es seleccionado del grupo que consiste en un liposoma, un niosoma, una micela, un sequessoma<TM>y un transferosoma y en el que el conjugado se une directamente mediante Z<1>a una parte de dicha partícula blanda, en la que dicha parte de la partícula blanda es un lípido, un lípido modificado, como un fosfolípido, 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DSPE), un lípido de membrana o una fosfatidilcolina modificada.
En una realización particularmente preferida, dicho conjugado de la presente invención, tal y como se ha definido anteriormente, se une a una parte de un portador de partículas blandas dando como resultado la siguiente fórmula (II):
donde n es un número entero de 0 a 150.
En una realización particularmente preferida, dicha carga se encuentra en el interior del portador y/o está unida al exterior del portador y/o está integrada en una estructura mono o bicapa del portador.
En otra realización, la composición farmacéutica comprende además un aditivo, para un suministro de carga dirigido a una célula Langerina<+>.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método in vitro para el suministro dirigido de carga a una célula Langerina<+>, que comprende el contacto del vehículo para el direccionamiento molecular específico de células Langerina<+>como se ha definido anteriormente, o la composición farmacéutica como se ha definido anteriormente con una célula dendrítica Langerina<+>.
En una realización preferida, dicha carga es seleccionado del grupo que consiste en una molécula pequeña, un péptido, una proteína, una sustancia citotóxica, un ácido nucleico, un pigmento, un colorante, un metal, un radionúclido, un virus, un virus modificado, un vector viral, un inoculante, un plásmido y/o un sistema multicomponente como un sistema para la edición genómica que comprenda diferentes componentes, preferentemente un sistema CRISPR/Cas; o es un compuesto farmacéuticamente activo o un compuesto inmunológicamente activo, preferentemente un inhibidor de la función celular, como un inhibidor de la apoptosis; o en el que dicha carga comprende, consiste esencialmente o consiste en (i) un antígeno o epítopo del cáncer o comprende un antígeno o epítopo del cáncer, (ii) un antígeno o epítopo de una enfermedad autoinmune o comprende un antígeno o epítopo de una enfermedad autoinmune, (iii) un antígeno bacteriano o comprende un antígeno o epítopo bacteriano, (iv) un antígeno vírico o comprende un antígeno o epítopo vírico, (v) un antígeno parasitario o comprende un antígeno o epítopo parasitario, o (vi) un alérgeno, o un epítopo de un alérgeno, o comprende un alérgeno o un epítopo de un alérgeno.
En una realización particularmente preferida, dicha composición farmacéutica es para uso en el tratamiento o prevención del cáncer, de una enfermedad autoinmune, de una infección bacteriana, de una infección vírica, de una infección parasitaria o de una enfermedad de injerto contra huésped, de una inflamación local o sistémica, de la alergia o para la hiposensibilización.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición de diagnóstico que comprende el vehículo tal como se ha definido anteriormente, que opcionalmente comprende además un aditivo, en el que el vehículo comprende o está asociado a una carga farmacéuticamente activa y opcionalmente a una sustancia portadora farmacéuticamente aceptable o a un adyuvante farmacéutico.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método de identificación de una dosis adecuada para una terapia dirigida a células dendríticas Langerina<+>de una enfermedad que comprende: (a) poner en contacto una población de células Langerina<+>con un compuesto capaz de ser introducido en las células, en el que dicho compuesto es una carga como se define en el presente documento, preferiblemente un colorante o pigmento, y en el que dicho compuesto se administra a dichas células con un vehículo como se define en el presente documento; (b) determinar el número de células que incorporaron dicho compuesto; (c) determinar una dosis adecuada del compuesto comparando el número de células con compuesto incorporado y la población de partida, preferiblemente tras un periodo de 1-3 días, opcionalmente correlacionando adicionalmente el número de células con compuesto incorporado o su estado con los resultados observados en la literatura.
En otro aspecto, la invención se refiere a un kit médico que comprende al menos un elemento seleccionado entre el vehículo definido anteriormente y/o la composición definida anteriormente, en el que el vehículo comprende o está asociado a una carga farmacéuticamente activa, y opcionalmente un prospecto con instrucciones.
En otro aspecto más, la invención se refiere a una vacuna que comprende el vehículo definido anteriormente, o la composición definida anteriormente, en la que el vehículo comprende o está asociado a una carga inoculante.
Breve descripción de los dibujos
LaFigura 1muestra la expresión estable de Langerina humana en la membrana plasmática de las células Hek293 se detectó mediante anticuerpos específicos CLR. La tinción con isotipo (gris) se aplicó como control negativo. Las intensidades de fluorescencia de la tinción de Langerina (gris oscuro) se compararon con la fluorescencia de fondo de las células de tipo silvestre (gris claro) y se trazaron en un histograma.
LaFigura 2muestra la expresión estable del receptor en la membrana plasmática de las células Raji, que se detectó mediante anticuerpos específicos CLR. Se aplicó tinción isotipo como control negativo. Las intensidades de fluorescencia se compararon con la fluorescencia de fondo de las células de tipo silvestre y se trazaron en un histograma.
LaFigura 3muestra la encapsulación y el suministro de FITC-BSA a las células que expresan Langerina. La fig.3 (A) muestra los resultados de los métodos de exclusión por tamaño y ultracentrifugación para eliminar el antígeno libre del antígeno encapsulado. La fluorescencia FITC-BSA se midió con un lector de placas. También muestra liposomas encapsulados con FITC-BSA que se utilizaron en un ensayo basado en células. Los liposomas se incubaron durante 2 h a 37 °C y los valores MFI de FITC y Alexa647 se midieron mediante citometría de flujo (Fig.3 (B). La Fig.3 (C) ilustra cómo se midió la calidad de los liposomas mediante DLS tras diferentes métodos de purificación. Se analizaron el tamaño y el potencial zeta (ZP). La Fig.3 (D) muestra liposomas encapsulados con FITC que se incubaron con células de Langerina<+>Hek293 durante 6h a 37°C. El núcleo se tiñó con DAPI y las células se analizaron por microscopía.
LaFigura 4muestra liposomas encapsulados con FITC-BSA que se purificaron por exclusión de tamaño o por ultracentrifugación. Los liposomas purificados se probaron posteriormente en un ensayo celular. Se incubaron liposomas 16 µM con células hLangerina<+>Raji durante 2 h a 37°C. Se analizó la tinción FITC de las células mediante citometría de flujo. Los valores MFI se corrigieron en función de la línea de base. LaFigura 5informa sobre la optimización de la encapsulación de proteínas con una proteína de prueba FITC-BSA. En la Fig.5 (A) se variaron la concentración inicial de FITC-BSA que se utilizó para rehidratar la película lipídica fina y en la Fig. 5 (B) la concentración inicial de liposomas de la película lipídica rehidratada para detectar las eficiencias de encapsulación optimizadas. En la Fig.5 (C) se ofrece un informe de calidad, que incluye el tamaño y el potencial zeta (ZP), que se analizaron mediante DLS. La eficacia de encapsulación se calculó tras la ultracentrifugación con un lector de placas. El antígeno FITC-BSA encapsulado (AG) se calculó por liposoma de 1 mM.
LaFigura 6muestra la internalización dependiente de la dosis y la velocidad cinética de los liposomas encapsulados con FITC-BSA. En la Fig.6 (A) se muestra la internalización dependiente de la dosis de los liposomas encapsulados con FITC-BSA. El colorante liposómico coformulado Alexa647 se comparó con la señal de fluoresceína del FITC-BSA. En la Fig. 6 (B) se muestra un estudio cinético de liposomas encapsulados con FITC-BSA. El colorante liposomal Alexa647 coformulado se comparó con la señal de fluoresceína de FITC-BSA.
LaFigura 7muestra la expresión y encapsulación de una proteína inmunoactiva EBNA y una proteína de control inmunoactiva PCNA. En la Fig. 7 (A) se muestra un cromatograma FPLC de las proteínas PCNA y EBNA purificadas con His-tag. En la Fig.7 (B) se representa un gel SDS-PAGE de las proteínas PCNA y EBNA purificadas, así como un control de carga, un control de flujo y un control de lavado. El tamaño de la proteína se determinó con una escalera de proteínas. En la Fig.7 (C) se proporcionan informes de calidad, incluidos el tamaño y el potencial zeta (ZP), de los liposomas formulados que se analizaron mediante DLS. La eficacia de encapsulación se calculó tras la ultracentrifugación con un lector de placas. El antígeno encapsulado (AG) se calculó por liposoma de 1 mM
LaFigura 8muestra el suministro de PCNA y EBNA a las CL a través de liposomas dirigidos a la Langerina. Los liposomas encapsulados con FITC-PCNA y -EBNA se incubaron con suspensiones de células epidérmicas a 37°C. Tras la incubación con liposomas, las células se tiñeron con marcadores de células de Langerhans, incluidos CD45, HLA-DR, CD1a y Langerina. Además, las células se tiñeron con un colorante de viabilidad eFluor 780 para determinar si estaban vivas o muertas (L/D). Las suspensiones de células epidérmicas se analizaron mediante citometría de flujo y las células de Langerhans se evaluaron mediante tinción con liposomas y FITC.
LaFigura 9muestra la especificidad liposomal del ligando blanco de Langerina humana hacia las células que expresan CLR. Fig. 9 (A) muestra que para la unión liposomal, se incubaron 16 µM de liposomas no funcionalizados y funcionalizados con células Raji de expresión estable a 4°C durante 1 h. Tras el lavado, las células se analizaron directamente por citometría de flujo. La unión liposomal se analizó con el colorante Alexa 647 coformulado. Se muestran los valores MFI de un experimento representativo y los valores se compararon con la señal de fondo mediante una prueba t (****p<0,0001, n=3). En la Fig. 9 (B) la unión liposomal a las células Langerina<+>y DC-SIGN<+>compitió con 10 mM de EDTA o 50 µg/ml de manano. Se trazaron los valores MFI de un ejemplo representativo (***p<0,001, ****p<0,0001, n=3, prueba t, uno de dos experimentos representativos) .
LaFigura 10muestra una imagen de microscopía de la internalización liposomal en células Hek293 con Langerina<+>. Se incubaron liposomas desnudos, dirigidos a la Langerina y conjugados con manosa con células Langerina<+>Hek293 a 37°C durante 2 h. El núcleo se tiñó con DAPI y la membrana celular con un colorante lipofílico DiO. Se tomó una pila en Z de las células Langerina<+>incubadas con liposomas dirigidos a Langerina que mostraban capas celulares de diferente altura focal.
LaFigura 11representa la cinética de unión e internalización de los liposomas diana de Langerina. En la Fig. 11 (A) se analizó la unión y en la Fig.11 (B) la internalización de los liposomas diana de Langerina tras varios periodos de incubación a 4°C o 37°C respectivamente. En la Fig.11 (C) se muestran varias concentraciones de liposomas diana de Langerina que se incubaron con células de Langerina<+>durante 24 h a 37°C.
LaFigura 12muestra la cinética de internalización liposomal medida por microscopía. Los liposomas dirigidos a la Langerina se incubaron durante diferentes puntos temporales con células hLangerina<+>y Hek293 de tipo silvestre. Se utilizaron voltajes PMT altos y bajos para Alexa647 con el fin de detectar eventos muy sensibles en los primeros puntos de incubación y fuertes señales de fluorescencia en los últimos puntos de incubación. LaFigura 13muestra la focalización en células Raji humanas que expresan Langerina con liposomas funcionalizados con GlcNTosil. Se varió la relación molar del ligando de focalización en los liposomas y se incubaron liposomas 16 µM durante 1 h a 4°C. Las células se analizaron con la misma estrategia de gating y las señales de fluorescencia de la hLangerina<+>y de las células Raji de tipo silvestre se trazaron con un ajuste lineal en GraphPad Prism.
LaFigura 14muestra la cinética de unión e internalización de los liposomas diana de Langerina que contienen diferentes proporciones molares de ligando. En la Fig. 14 (A) se analizó la unión y en la Fig. 14 (B) la internalización de los liposomas diana de Langerina tras varios periodos de incubación a 4°C o 37°C, respectivamente. La Fig. 14 (C) muestra que varias concentraciones de liposomas diana de Langerina se incubaron con células Langerina<+>durante 24 h a 37°C.
LaFigura 15muestra el encaminamiento de los liposomas hacia los compartimentos endosómicos. En la Fig. 15 (A) se incubaron células Hek293 humanas que expresan Langerina con liposomas dirigidos 16 µM durante 2 h a 37°C. Tras la incubación, las células se tiñeron inmunofluorescentemente con marcadores endosómicos, incluidos Rab5, Rab11, EEA1 y Lamp-1. A continuación, los anticuerpos primarios se marcaron con un anticuerpo secundario conjugado con Alexa488. El núcleo celular se tiñó con DAPI y las células se analizaron por microscopía. La Fig.15 (B) muestra la correlación entre la colocalización de los liposomas dirigidos y los diferentes compartimentos endosómicos expresada por los valores R de Pearson.
LaFigura 16muestra la internalización de los liposomas en los compartimentos endosómicos en momentos tempranos. Se transfectaron transitoriamente células COS-7 con YFP-Rab9. Se añadieron liposomas dirigidos y se incubaron durante diferentes periodos de tiempo a 37°C. Tras la incubación, se fijaron las células y se realizaron tinciones de inmunofluorescencia para EEA1 con un anticuerpo primario anti-EEA1 (conejo, clon C45B10) y Rab5 (conejo, clon C8B1) (Cell Signaling Technology) y para Rab9 con un anticuerpo primario anti-GFP. Para la tinción secundaria se utilizó un anticuerpo anti-conejo conjugado con Alexa488. Además, el núcleo celular se tiñó con DAPI.
LaFigura 17representa un estudio de citotoxicidad en función del tiempo de liposomas funcionalizados. En la Fig. 17 (A) se muestra de forma ejemplar la estrategia de gating para células no tratadas, tratadas con DMSO y tratadas con liposomas. Las células se incubaron durante 72 h a 37°C. Las células tratadas con DMSO se incubaron con DMSO al 50% durante 3 min después de la incubación de 72 h. Las células viables y muertas se distinguieron de los restos celulares en el gráfico FSC-A/SSC-A. Los dobletes se discriminaron en un trazado FSC-A/FSC-H. A continuación, se analizaron células individuales en un diagrama de disperción que mostraba la tinción con Annexin-V-FITC en el eje x y 7-AAD en el eje y para determinar los efectos apoptóticos tempranos y tardíos. Las células no tratadas se utilizaron como control negativo y las tratadas con DMSO representan el control positivo. En la Fig.17 (B) se analizó la frecuencia de progenitores (FoP) de varios puntos temporales de incubación para cada cuadrante y se trazó en una barra de columnas agrupadas. En la Fig.17 (C) se analizaron las MFI de A647 de los liposomas dirigidos y desnudos incubados con células Langerina<+>para detectar la internalización de los liposomas.
LaFigura 18muestra un estudio de citotoxicidad dependiente de la dosis de liposomas dirigidos a la Langerina. En la Fig.18 (A) se muestra de forma ejemplar la estrategia de gating para células no tratadas, tratadas con DMSO y tratadas con liposomas. Las células se incubaron durante 24 h a 37°C. Las células tratadas con DMSO se incubaron con DMSO al 50% durante 3 min después de la incubación de 24 h Las células viables y muertas se distinguieron de los restos celulares en el gráfico FSC-A/SSC-A. Los dobletes se discriminaron en un trazado FSC-A/FSC-H. A continuación, se analizaron células individuales en un gráfico de puntos que mostraba la tinción con Annexin-V-FITC en el eje x y 7-AAD en el eje y para determinar los efectos apoptóticos tempranos y tardíos. Las células no tratadas se utilizaron como control negativo y las tratadas con DMSO representan el control positivo. En la Fig.18 (B) se analizaron varias concentraciones de liposomas hasta 1 mM. Se determinó la frecuencia de progenitores (FoP) para cada cuadrante y se representó en una barra de columnas agrupadas. En la Fig.18 (C) se analizaron las MFI de A647 de liposomas dirigidos y desnudos incubados con células Langerina<+>para detectar la internalización de los liposomas.
LaFigura 19muestra la actividad liposomal frente a polimorfismos relevantes de la Langerina. En la Fig.19 (A) se probó la unión de liposomas desnudos y dirigidos a células Raji wt, células Raji que expresaban la Langerina humana wt<+>, el mutante N288D, el mutante K313I o el doble mutante N288D/ K313I. Se incubaron liposomas 16 µM durante 1h a 4°C. La unión se analizó mediante la MFI del colorante coformulado A647. Los datos se normalizaron con respecto a las células wt Langerina<+>(***p<0,001, ****p<0,0001, n=3, prueba t, uno de dos experimentos representativos ). Fig. 19 (B) Se analizó la expresión del receptor extracelular de las células que expresaban Raji con un anticuerpo anti-Langerina humana conjugado con PE (clon DCGM4). La IMF se normalizó con respecto a la expresión de Langerina wt (**p<0,01, ***p<0,001, n=3, prueba t, uno de dos experimentos representativos). Fig.19 (C) la unión liposomal relativa se trazó calculando el pliegue de la unión liposomal (A) a la tinción de anticuerpos (B) (***p<0,001, ****p<0,0001, n=3, prueba t; # Se excluyeron los datos de las células wt Raji, uno de dos experimentos representativos). Fig.19 (D) Además de la unión liposomal, se realizó un seguimiento de la internalización liposomal durante 24 h a 37 °C. Se trazó directamente la IMF del colorante A647 coformulado.
LaFigura 20muestra la cuantificación de la GFP cargada con ligando diana mediante MALDI-TOF.
LaFigura 21muestra la unión e internalización de proteínas conjugadas frente a liposomas encapsulados con FITC-BSA. En la Fig.21 (A) la unión y captación de la GFP funcionalizada a 4°C y 37°C se midió de forma dependiente de la dosis mediante citometría de flujo con células Raji y Langerina<+>Raji. En la Fig.21 (B) se incubaron GFP y liposomas durante varios puntos de tiempo con células Raji Langerina<+>. Aquí se utilizaron liposomas encapsulados con FITC-BSA para comparar la fluorescencia del FITC con la de la GFP. LaFigura 22muestra una competición de unión con manano. En la Fig. 22 (A) la unión de liposomas funcionalizados con ligando o GFP compitió con el manano. Los portadores del ligando se incubaron con células Raji Langerina<+>durante 4 h a 37°C. El manano se añadió directamente a 37°C para competir con la unión y la internalización o se añadió después del paso de incubación de 4 h (tras el lavado a 4°C) para eliminar los portadores unidos extracelularmente. (Un experimento representativo de tres, n=3). En la Fig.22 (B) se incubaron liposomas funcionalizados o GFP con células Raji Langerina<+>durante 30 min a 37°C. Tras el lavado, se añadió manano o DPBS (con Ca<2+>/Mg<2+>) durante diferentes periodos de tiempo. (Un experimento representativo de cuatro, n=3).
LaFigura 23muestra un análisis citrométrico de flujo de las microesferas de PMMA cargadas con ligando diana que muestra una unión específica a las células THP-1 humanas que expresan Langerina.
LaFigura 24muestra la focalización a las células de Langerhans primarias en suspensiones de células epidérmicas. En la Fig.24 (A) se prepararon suspensiones de células epidérmicas a partir de muestras de piel humana. Posteriormente, las células se incubaron con liposomas a una concentración de 16 µM durante 1 h a 37 °C. Como control, se añadió EDTA 10 mM al medio celular. Tras la incubación con liposomas, las células se tiñeron con marcadores de células de Langerhans, incluidos CD45, HLA-DR, CD1a y Langerina. Además, las células se tiñeron con un colorante de viabilidad eFluor 780 para determinar si estaban vivas o muertas (L/D). Las suspensiones de células epidérmicas se analizaron mediante citometría de flujo y las células de Langerhans se evaluaron mediante tinción con liposomas. Fig.24 (B): basándose en la estrategia de gating de (A) se analizó la IMF de los liposomas desnudos y dirigidos de diferentes subconjuntos celulares, incluidos CD45-; CD1a-, HLR-DR-; y CD1a<+>, HLR-DR<+>células expresantes. Fig. 24 (C): para analizar la internalización de los liposomas, se añadió EDTA después o durante el paso de incubación. El EDTA añadido después de la incubación elimina los liposomas unidos extracelularmente y, por tanto, refleja la internalización liposomal. Mientras que el EDTA añadido durante el paso de incubación impide la unión de los liposomas y sirve como control. Para evitar la internalización del receptor, las células se incubaron a 4°C. En la Fig.24 (D) las suspensiones de células epidérmicas se tiñeron con un anticuerpo anti-CD1a conjugado con FITC y se incubaron con liposomas dirigidos durante 1 h a 37°C. Las células se analizaron posteriormente mediante microscopía.
LaFigura 25muestra la especificidad liposomal para las células de Langerhans a través de un ligando dirigido a la Langerina. Se prepararon suspensiones de células cutáneas enteras a partir de muestras de piel humana. Posteriormente, las células cutáneas se incubaron con liposomas a una concentración de 16 µM durante 1 h a 37°C. Tras la incubación con liposomas, las células se tiñeron con marcadores de células de Langerhans, incluidos CD45, HLA-DR, CD1a y Langerina. Además, las células se tiñeron con un colorante de viabilidad eFluor 780 para determinar si estaban vivas o muertas (L/D) y con un anticuerpo CD14 para teñir monocitos y macrófagos. Las suspensiones celulares de piel entera se analizaron mediante citometría de flujo y se evaluaron varios subconjuntos celulares para la tinción de liposomas.
LaFigura 26representa esquemáticamente una molécula en la que la región de la cola (sección hidrófoba) del conjugado está incrustada en una estructura de bicapa lipídica, mientras que la región de la cabeza está situada fuera del portador y, por tanto, es capaz de interactuar con los receptores.
LaFigura 27muestra el diseño inspirado en la heparina de un ligando de focalización glicomimética para la Langerina humana. En la Fig.27 (A) se identificó el monosacárido GlcNS derivado de la heparina como un andamio favorable para el diseño de ligandos glicomiméticos. El diseño de análogos de GlcNS condujo al descubrimiento del ligando de focalización glicomimética15.15lleva un enlazador etilamino en la orientación β de C1 para su conjugación con la plataforma de liberación.20sirvió como molécula de referencia basada en el hombre a lo largo de este estudio. Fig.27 (B): Basándose en el modo de unión del GlcNAc (código PDB: 4N32), se planteó la hipótesis de que los pequeños sustituyentes aromáticos en C2 aumentan la afinidad mediante la formación de interacciones catión-π con K299 y K313 o interacciones π-π y H-π con F315 y P310. La superficie del receptor está contrastada según su lipofilia (lipofílico: gris oscuro, hidrofílico: gris claro). Fig.27 (C): Los experimentos de RMN filtrados con<19>F R2 revelaron un aumento de la afinidad de 42 veces para el ligando modelo16(Ki= 0,24±0,03 mM) respecto a la molécula de referencia21basada en Man (Ki= 10±1 mM). Además,16mostró una especificidad alentadora contra DC-SIGN (Ki,DC-SIGN= 15±3 mM). Fig. 27 (D): La afinidad de16por la Langerina se validó en experimentos de RMN<15>N HSQC analizando resonancias en el régimen de intercambio rápido (KD,rápido= 0,23±0,07 mM) y lento (KD,lento= 0,3±0,1 mM). LaFigura 28muestra el análisis del modo de unión para el ligando de focalización glicomimética. Fig.28 (A) y (B):Los experimentos de RMN HSQC<15>N revelaron el patrón de perturbación del desplazamiento químico (CSP) para16. Tras la valoración, se observaron resonancias de intercambio rápido como I250 y E285, así como resonancias de intercambio lento incluyendo Y251. Fig.28 (C): El mapeo de los CSP en la estructura de rayos X de la Langerina en complejo con GlcNAc (código PDB: 4N32) validó un modo de unión dependiente del Ca<2+>como indican los CSP observados para E285 y K299. En comparación con las valoraciones con21, Y251, I250 y T314 mostraron un aumento relativo de CSP, mientras que se observó una disminución para K313. En general, la mayoría de los residuos que mostraron un aumento de CSP pueden asociarse con N307 y F315, que no pudieron asignarse. Fig.28 (D): Los experimentos de RMN STD sirvieron para validar aún más la interacción formada entre16y Langerina. Los espectros de RMN STD se registraron a tiempos de saturación tsatde 0,4 s y están aumentados 8 veces. Los epítopos determinados a partir de las curvas de acumulación sugieren fuertes interacciones formadas por el sustituyente fenilo. Por el contrario, se observaron valores STD'0relativos bajos para el enlazador etilamino acetilado, coherentes con una orientación expuesta al disolvente. Fig. 28 (E):El 16se acopló al sitio de unión del carbohidrato para racionalizar las observaciones de los experimentos de<15>N HSQC y STD NMR. La pose de acoplamiento seleccionada predijo la formación de interacciones π-π entre el anillo fenilo y F315, así como la formación de un enlace de hidrógeno entre el grupo sulfonamida y N307. El enlazador muestra una elevada exposición a los disolventes. La superficie del receptor está contrastada según su lipofilia (lipofílico: gris oscuro, hidrofílico: gris claro).
LaFigura 29muestra la relación estructura-actividad y la especificidad de los compuestos seleccionados frente al DC-SIGN.
LaFigura 30muestra la determinación del Kipara los derivados de GlcNAc sulfatados. La determinación del Kipara los derivados de GlcNAc derivados de la heparina mediante RMN filtrada por<19>F R2reveló el impacto de los patrones de sulfatación en la afinidad del monosacárido. Los valores de Kiobtenidos se indican en laFigura 39.
LaFigura 31muestra la determinación de Kipara los análogos GlcNS1a5. Los experimentos de unión competitiva sirvieron para determinar las afinidades para la biblioteca de análogos de GlcNS. Los valores de Kiobtenidos se indican en laFigura 39.
LaFigura 32muestra la determinación del KDpara el análogo de Man21. Fig.32 (A) y (B): Los experimentos de RMN HSQC<15>N sirvieron para validar el valor Kiobtenido para2. Se resaltan (en gris) las resonancias asignadas detectadas en el espectro de referencia. Fig.32 (C): Las resonancias asignadas que mostraban un intercambio químico rápido y CSP mayores de 0,06 ppm se seleccionaron para la determinación de los valores de KD. El valor KDobtenido se muestra en laFigura 29.
LaFigura 33muestra la determinación del KDpara el análogo2de GlcNS. Fig.33 (A) y (B): Los experimentos de RMN HSQC<15>N sirvieron para validar el valor Kiobtenido para2. Se resaltan (en gris) las resonancias asignadas detectadas en el espectro de referencia Fig.33 (C): Las resonancias asignadas que mostraban un intercambio químico rápido y CSP mayores de 0,04 ppm se seleccionaron para la determinación de los valores de KD. Fig.33 (D): Además, un conjunto de residuos, incluidos K299 y T314, mostraron fenómenos de intercambio lento. Para estos residuos , se utilizaron las integrales Vfy Vbde las resonancias correspondientes al estado libre y al estado ligado de la Langerina para determinar los valores de KD. Los valores KDobtenidos figuran en laFigura 29.
LaFigura 34muestra el análisis del modo de unión<15>N HSQC NMR para los análogos GlcNS2,16y el análogo Man21. Fig.34 (A) a (C): El mapeo de los valores CSP en la estructura de rayos X de la Langerina (código PDB: 4N32 o 35PF) validó un modo de unión dependiente del Ca<2+>para2y16, como indican los CSP observados para E285 y K2999,10. Además, se observaron CSPs para los residuos N297, A300 y S302 también afectados por el reconocimiento de Man o21. Por el contrario, Y251 e I250 mostraron valores de CSP considerablemente mayores en comparación con21, mientras que se observó una disminución relativa para K313. Esta disminución estuvo acompañada de un aumento relativo para el T314 proximal. En particular, los residuos que muestran valores CSP considerablemente aumentados pueden asociarse predominantemente con F315 y N307, que no fueron asignados. Esto también es cierto para W252 y W306 que mostraron incrementos relativos menores. En consecuencia, el patrón CSP observado podría estar inducido por las interacciones formadas entre2o 16 y F315 en lugar de K313. De forma similar a Man y 21, también se observaron CSP en regiones remotas del pliegue del dominio similar a la lectina de tipo C, en particular para K257 y G259 en la región del bucle corto. Esto podría indicar una modulación de la red alostérica previamente descrita. Fig. 33 (D): Una comparación de las valoraciones con16y21reveló trayectorias CSP distintas para residuos asociados con el sitio de unión de carbohidratos, como E285 o W252, mientras que se conservaron las trayectorias de residuos situados en regiones remotas del pliegue similar a la lectina de tipo C, como K257.
LaFigura 35muestra las curvas de acumulación STD NMR para el análogo16de GlcNS. La ecuación 5 se ajustó a los valores STD para calcular los valores STD'0para la determinación del epítopo de unión de16. LaFigura 36muestra el mapeo de epítopos STD NMR para el análogo de Man21. Fig. 36 (A): Los experimentos de RMN STD sirvieron para investigar la interacción de21con la Langerina. Los espectros de RMN STD se registraron a tiempos de saturación tsatde 0,4 s y están aumentados 8 veces. Fig.36 (B): El epítopo de21se determinó a partir de curvas de acumulación y sugiere una orientación expuesta al disolvente para el enlazador etilamino acetilado (véase también laFigura 37).
LaFigura 37muestra las curvas de acumulación STD NMR para el análogo de Man21. La ecuación 5 se ajustó a los valores STD para calcular los valores STD'0para la determinación del epítopo de unión de21. LaFigura 38muestra el acoplamiento molecular para el análogo16de GlcNS. Fig. 38 (A): Se definió un modelo farmacóforo para guiar la colocación inicial de16en el sitio de unión a carbohidratos de la Langerina (código PDB: 4N32) y para restringir la orientación del andamiaje de Glc durante el refinamiento basado en el campo de fuerza de las poses de acoplamiento. Todas las características mostradas requieren un átomo de oxígeno dentro de las esferas indicadas. Fig.38 (B): Cuatro de las diez poses de acoplamiento generadas se asemejan a la conformación representada de16. La pose de acoplamiento seleccionada predijo la formación de interacciones π-π entre el anillo fenilo y F315, así como la formación de un enlace de hidrógeno entre el grupo sulfonamida y N307. El enlazador etilamino acetilado muestra una elevada exposición al disolvente. En consecuencia, esta postura de acoplamiento es coherente tanto con los experimentos de<15>N HSQC como con los de RMN STD. Fig. 38 (C): La conformación alternativa representada de16es representativa de tres de las diez poses de acoplamiento generadas. La pose de acoplamiento seleccionada predice la formación de una interacción catión-π entre el anillo fenilo y K313, así como la formación de un enlace de hidrógeno entre la sulfonamida y E293. El enlazador etilamino acetilado muestra una elevada exposición al disolvente. Sin embargo, esta postura de acoplamiento fue menos coherente con los resultados de la RMN HSQC<15>N, en particular la disminución relativa de los valores de CSP para el K313. El estudio de acoplamiento molecular proporcionó tres poses de acoplamiento únicas adicionales para16que se excluyeron debido a ángulos diedros desfavorables para el enlazador sulfonamida. La superficie del receptor está contrastada según su lipofilia (lipofílico: gris oscuro, hidrofílico: gris claro).
LaFigura 39muestra la relación estructura-actividad de una serie de ligandos diana, análogos de GlcN en la posición 2` y monosacáridos sulfatados.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES
Aunque la presente invención se describirá con respecto a realizaciones particulares, esta descripción no debe interpretarse en un sentido limitativo. A continuación se dan definiciones importantes para comprender la presente invención.
Tal como se utilizan en esta especificación y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares de "a" y "an" también incluyen los plurales respectivos, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.
En el contexto de la presente invención, los términos "aproximadamente" y "aproximadamente" denotan un intervalo de precisión que un especialista en la materia entenderá que sigue garantizando el efecto técnico de la característica en cuestión. El término indica típicamente una desviación del valor numérico indicado de ±20 %, preferiblemente ±15 %, más preferiblemente ±10 %, y aún más preferiblemente ±5 %.
Debe entenderse que el término "que comprende" no es limitativo. A efectos de la presente invención, el término "que comprende" o "que consiste esencialmente en" se considera una realización preferida del término "que comprende". Si en lo sucesivo se define que un grupo comprende al menos un cierto número de realizaciones, se entiende que esto abarca también un grupo que, preferentemente, consiste sólo en estas realizaciones.
Además, los términos "(i)", "(ii)", "(iii)" o "(a)", "(b)", "(c)", "(d)", o "primero", "segundo", "tercero" etc. y similares en la descripción o en las reivindicaciones, se utilizan para distinguir entre elementos similares y no necesariamente para describir un orden secuencial o cronológico. Debe entenderse que los términos así utilizados son intercambiables en circunstancias apropiadas y que las realizaciones de la invención aquí descritas son capaces de funcionar en otras secuencias que las aquí descritas o ilustradas. En caso de que los términos se refieran a pasos de un método o uso, no existe coherencia temporal o de intervalos de tiempo entre los pasos, es decir, los pasos pueden llevarse a cabo simultáneamente o puede haber intervalos de tiempo de segundos, minutos, horas, días, semanas, etc. entre dichos pasos, a menos que se indique lo contrario.
Debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, protocolos, reactivos, etc. particulares descritos en el presente documento, ya que éstos pueden variar. También debe entenderse que la terminología empleada en el presente documento tiene por objeto describir únicamente las realizaciones particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende persona con conocimientos ordinarios en la materia.
Como se ha expuesto anteriormente, la presente invención se refiere en un aspecto a una composición farmacéutica que comprende un vehículo para la focalización molecular específica a las células Langerina<+>, en el que el vehículo es capaz de unirse específicamente a una célula Langerina<+>, dicho vehículo comprende (a) al menos un portador y (b) al menos un conjugado de la fórmula general (I)
en la que
(i) R es seleccionado independientemente del grupo formado por
alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquilo C1-C8alquilo sustituido o no sustituido, arilo, arilo C1-C8alquilo, heteroarilo, heteroarilo C1-C8alquilo, biarilo y biarilo C1-C8alquilo,
en el que los sustituyentes son seleccionados independientementedel grupo formado por
-N(R<a>)(R<b>), -OR<a>, -SR<a>, -C(O)R<a>, -C(O)OR<a>, -C(O)N(R<a>)(R<b>), -N(R<a>)C(O)R<b>, -N(R<a>)S(O)2Rb,-OS(O)2R<a>, halógeno, -NO2, -CN, -NC, -N3, -NCO, -OCN, -NCS, -SCN, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y heteroarilo sustituido o no sustituido
donde R<a>y R<b>son seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, C1-8alquilo sustituido o no sustituido, C2-8alquenilo, C2-8alquinilo, C3-6cicloalquilo, aril-C1-5alquilo, heteroarilo-C1-5alquilo, arilo, heteroarilo;
(ii) R' es seleccionado independientemente del grupo formado por
-OR<a>, y -NHS(O)2R<a>,
donde R<a>se define como anteriormente;
(iii) A-D-B-L es un grupo enlazador que une covalentemente el derivado de glucosa de fórmula (I) al portador o a una parte del mismo,
en el que dicho grupo enlazador A-D-B-L es un grupo formado por un espaciador A-D-B y un enlazador L que conecta el derivado de glucosa con el portador y en el que dicho enlazador L es un enlazador de la siguiente fórmula general (L-1)
en la que
U<1>es un grupo conectado a través de B con el espaciador D, en el que U<1>es seleccionado del grupo formado por, -CH2-, -CH=CH-, o -C≡C-;
Z<1>es una fracción que une el enlazador al portador seleccionada del grupo formado por -O-, -S-, -N(R<d>)-, -C(R<d>)(R<e>)-, -R<d>C=CR<e>-, -C(O)-, -C(O)O-,-OC(O)-, -C(O)S-, -C(O)N(R<d>)-, -N(R<d>)C(O)-, -N(R<d>)C(O)N(R<e>)-, -N(R<d>)C(S)N(R<e>)-, -N(R<d>)C(O)O-, -OC(O)N(R<d>)-, -ciclohexeno-, -triazoles-, -NHS(O)2-, -S(O)2-, -OP(O)(H)O-, u -OP(O)(OH)O-;
donde R<d>y R<e>son seleccionados independientemente del grupo formado por hidrógeno, C1-32alquilo sustituido o no sustituido, C2-32alquenilo, C3-8cicloalquilo, arilo, C1-C8alquilo arilo, heteroarilo, C1-C8alquilo heteroarilo; y
d1 a d5 es cada uno un número entero de 0 a 50, d6 un número entero de 1 a 50.
en el que el portador comprende o está asociado a una carga farmacéuticamente activa y, opcionalmente, a una sustancia portadora farmacéuticamente aceptable o a un adyuvante farmacéutico.
El término "conjugado", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la combinación de un derivado de la glucosa, tal como se indica en la fórmula (I), que funciona como ligando para la Langerina, y un grupo enlazador de la forma A-D-B-L, en el que los elementos A, D y B se refieren o comprenden una funcionalidad espaciadora, como se detallará más adelante, y en el que el elemento L se refiere a un elemento enlazador, como también se explicará con más detalle en el presente documento.
En consecuencia, un "conjugado" de la presente invención es una parte de un "vehículo" que comprende el derivado de la glucosa de fórmula (I)-ligando, el grupo enlazador A-B-D-L y un portador, en el que dicho portador es capaz de llevar o transportar una carga.
El término "ligando", tal y como se utiliza aquí, se refiere a una molécula, péptido o proteína que se une a una proteína receptora, lo que altera la conformación química afectando a la orientación de su forma tridimensional. La unión se produce por fuerzas intermoleculares, como los enlaces iónicos, los enlaces de hidrógeno y las fuerzas de Van der Waals. El ligando tal como se incluye en el vehículo de la invención es un ligando para la Langerina también llamado "derivado de la glucosa", donde la "Langerina" es un receptor transmembrana homotrimérico de tipo II y un subtipo de receptores de lectina de tipo C localizado en las superficies de las células de Langerhans, que también puede denominarse "CD207". La secuencia de la Langerina tal como se utiliza en el presente documento está representada por la versión de tipo silvestre con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o codificada por el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2. La presente invención contempla además variantes homólogas de la misma, por ejemplo, variantes de secuencia de aminoácidos o de secuencia de nucleótidos que tengan una homología del 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o 99,5% con la secuencia de SEQ ID NO: 1 ó 2. También se contemplan las formas SNP naturales de la Langerina, por ejemplo, la forma SNP V278A (rs741326, base de datos NCBI SNP) con la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 3, codificada por el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 4. La Langerina que contiene el SNP V278A tiene una prevalencia del 49,9% y ha mostrado una unión a azúcares similar a la A278 (Ward et al., 2006. J Biol Chem, 281: 15450-6). Puede obtenerse más información de la base de datos SNP del NCBI o de una fuente bibliográfica adecuada, como Feinberg et al., 2013, J. Biol Chem.27, 288, 52, 36762-71. La presente invención contempla además variantes homólogas de la misma, por ejemplo, variantes de secuencia de aminoácidos o de secuencia de nucleótidos que tengan una homología del 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o 99,5% con la secuencia de SEQ ID NO: 3 o 4. También se contemplan variantes SNP adicionales como N288D (rs13383830, base de datos NCBI SNP) con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 5, codificada por el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 6; K313I (rs57302492, base de datos NCBI SNP) con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 7, codificada por el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8; y N288D/ K313I con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 9, codificada por el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 10. La presente invención contempla además variantes homólogas de la misma, por ejemplo, variantes de la secuencia de aminoácidos o de la secuencia de nucleótidos que tengan una homología del 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o 99,5% con la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NOs: 5 a 10. También se incluyen las variantes de Langerina optimizadas para el codón. Estas variantes pueden adaptarse al contexto de expresión previsto, por ejemplo, la optimización de codones puede proporcionarse para cepas bacterianas, por ejemplo, cepas de E. coli, para células de mamífero, etc., como sería conocido por la persona experta. En una realización específica, una secuencia optimizada de codones para la Langerina que contiene un sitio StreptagII y TEV en el C-terminal, que puede utilizarse para la expresión en E.coli, está representada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 29.
En realizaciones específicas, la "Langerina" también puede ser una molécula derivada de mamíferos no humanos, por ejemplo, ratones, monos, vacas, cerdos, etc. En una realización particular, la presente invención contempla el uso de una variante de Langerina de ratón con la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 13, codificada por el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 14. La presente invención contempla además variantes homólogas de la misma, por ejemplo, variantes de la secuencia de aminoácidos o de la secuencia de nucleótidos que tengan una homología del 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o 99,5% con la secuencia de SEQ ID NO: 13 o 14.
Por lo tanto, si se hace referencia a "Langerina<+>", se contempla la presencia de un receptor de Langerina tal y como se define en el presente documento. El término "célula de Langerina<+>", tal y como se utiliza aquí, hace referencia a una célula, preferiblemente una célula dendrítica (CD), por ejemplo una célula de Langerhans, que muestra en su superficie el CLR específico de Langerina. En ciertas realizaciones, la célula también puede ser una célula de un fondo diferente.
Se ha comprobado que las interacciones glicano-Langerina definidas anteriormente se limitan predominantemente a un único monosacárido y están dominadas por la coordinación del ion Ca<2+>por dos grupos hidroxilo vicinales y ecuatoriales. Estos grupos hidroxilo forman parte de una extensa red de enlaces de hidrógeno formada entre el monosacárido, el ion Ca<2+>y los residuos receptores, incluidos E285, E293, N297 y N307. Además, se ha descubierto que el grupo acetamido ecuatorial de la N-acetilglucosamina (GlcNAc) interactúa con el K299 a través de una molécula estructural de H2O y un débil contacto hidrofóbico del grupo metilo con el P310. Además, se han llevado a cabo análisis detallados de análogos de glucosamina-2-sulfato (GlcNS) mediante SAR, que indican que la introducción del anillo fenilo da lugar a las interacciones aromáticas con K299, P310 o F315 que resultan en afinidades aumentadas. Otros enfoques de diseño mostraron interacciones favorables, como se describe detalladamente en la sección Ejemplos, del presente documento. La introducción de un enlazador en C1 del andamiaje Glc mediante la formación de un betaglucósido logró ligandos diana potentes. Debido a estos resultados, el vehículo puede comprender una estructura GlcNS, que contenga una estructura enlazadora en la posición C1, varios sustituyentes del sulfato en la posición C2, grupos hidroxilo ecuatoriales en la posición C3 y C4, así como un grupo hidroxilo o, un ácido sulfónico o un ácido urónico en la posición C6 del GlcNS. También se contemplan otros grupos funcionales.
El término "focalización molecular específica", tal como se utiliza en el presente documento, comprende una interacción entre el ligando, tal como se define en el presente documento, que forma parte de un conjugado, tal como se define en el presente documento, y el receptor de Langerina presente en una célula Langerina<+>, tal como se define en el presente documento. En una realización preferida, la focalización molecular específica comprende una interacción entre el ligando tal como se ha definido anteriormente, que forma parte de un vehículo tal como se ha definido en el presente documento, y el receptor de Langerina presente en una célula Langerina<+>tal como se ha definido en el presente documento. En otra realización, la focalización molecular específica comprende una interacción entre dicho conjugado o vehículo y un receptor presente en una célula Langerina<+>.
El término "vehículo para la focalización molecularespecíficaa las células Langerina<+>", tal y como se utiliza aquí, se refiere por tanto a un vehículo capaz de una focalización molecularespecíficaa las células Langerina<+>.
Esta focalización específica, tal y como se ha mencionado anteriormente, es una unión específica del vehículo, tal y como se define en el presente documento, a una célula dendrítica, en particular a una célula dendrítica que exprese Langerina. La unión específica tiene lugar entre el vehículo, es decir, la parte ligando del vehículo y el receptor de Langerina en la superficie de la célula. En realizaciones específicas, esta unión muestra una especificidad que es al menos 2 veces superior a un control en un ensayo celular que comprende la introducción de liposomas en condiciones idénticas en células B Raji que presentan Langerina recombinante, células B Raji que presentan DC-SIGN recombinante (control 1) y células B Raji de tipo silvestre que no presentan receptor de lectina de tipo C (WT, control 2). En otras realizaciones más preferidas, la especificidad es 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 veces mayor que un control en un ensayo celular que comprende la introducción de liposomas en condiciones idénticas en células B Raji que presentan Langerina recombinante, células B Raji que presentan DC-SIGN recombinante (control 1) y células B Raji de tipo silvestre que no presentan receptor de lectina de tipo C (WT, control 2). En realizaciones particularmente preferidas, la especificidad es 16 veces superior a un control en un ensayo celular que comprende la introducción de liposomas en condiciones idénticas en células Raji B que presentan Langerina recombinante, células Raji B que presentan DC-SIGN recombinante (control 1) y células Raji B de tipo silvestre que no presentan receptor de lectina de tipo C (WT, control 2). El término "DC-SIGN" se refiere a otro receptor expresado por células dendríticas, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 o está codificado por el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 12. La presente invención contempla además variantes homólogas de la misma, por ejemplo, variantes de la secuencia de aminoácidos o de la secuencia de nucleótidos que tengan una homología del 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o 99,5% con la secuencia de SEQ ID NO: 11 o 12. También se incluyen las variantes de DC-SIGN con codón optimizado. Estas variantes pueden adaptarse al contexto de expresión previsto, por ejemplo, la optimización del codón puede proporcionarse para cepas bacterianas, por ejemplo, cepas de E. coli, para células de mamíferos, etc., como sería conocido por un especialista. En una realización específica, una secuencia optimizada de codones para DC-SIGN que contiene un sitio StreptagII y TEV en el C-terminal, que puede utilizarse para la expresión en E.coli, está representada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 52. En realizaciones específicas, el "DC-SIGN" también puede ser una molécula derivada de mamíferos no humanos, por ejemplo, ratones, monos, vacas, cerdos, etc.
El ensayo a realizar para determinar la especificidad antes mencionada comprende preferentemente los pasos mencionados en el ejemplo 10.
En el contexto de la presente invención, puede emplearse otra proteína relacionada con la Langerina, por ejemplo para un formato de ensayo como el descrito para DC-SIGN (véase más arriba). Un ejemplo preferido de tal proteína relacionada con la Langerina es la Dectina. Es particularmente preferido que la Dectina sea una variante de la Dectina de ratón, o mDectina. El término "mDectina" se refiere a un dominio de lectina de tipo C de la familia 7 miembro A, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 o está codificado por el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 16. La presente invención contempla además variantes homólogas de la misma, por ejemplo, variantes de la secuencia de aminoácidos o de la secuencia de nucleótidos que tengan una homología del 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o 99,5% con la secuencia de SEQ ID NO: 15 o 16. En las realizaciones específicas de , la "Dectina" también puede ser una molécula derivada de humanos, o de otros mamíferos no humanos, por ejemplo, monos, vacas, cerdos, etc.
El término "entrega de carga dirigida", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere al transporte de una carga, por ejemplo, tal y como se define en el presente documento, a una célula dirigida, por ejemplo, una célula Langerina<+>tal y como se define en el presente documento, preferiblemente una célula que muestre Langerina en su superficie. El transporte puede incluir la introducción de la carga en la célula, o puede incluir una descarga de la carga en las proximidades, por ejemplo en la superficie de la célula. La entrega de la carga puede implicar en cualquier caso una interacción del ligando tal como se define en el presente documento con su receptor afín, es decir, la Langerina tal como se menciona en el presente documento. La entrega de la carga puede depender y/o ajustarse en función del portador utilizado, en particular el portador tal como se define a continuación. Determinados portadores pueden requerir una introducción de la carga en la célula, mientras que otros portadores pueden utilizarse para descargar la carga en la superficie de la célula o en sus proximidades. El término "entrega" puede incluir un proceso de descarga de la carga, pero también puede incluir una unión del portador y la carga incluso después de que el ligando se haya unido a su diana, es decir, la Langerina. En ciertas realizaciones, la entrega puede incluir la liberación del portador en el compartimento endosómico temprano o en el compartimento endosómico tardío o en el lisosoma para el procesamiento posterior de la carga. Esta liberación puede, por ejemplo, desencadenarse por acidificación del compartimento endosomal, por enriquecimiento o agotamiento de cofactores de la interacción receptor/ligando como el Ca<2+>, digestión enzimática del receptor, del ligando-objetivo o del portador. También se contempla la liberación fotoinducida del fármaco, que puede producirse, por ejemplo, a partir de AuNPs-liposomas termosensibles utilizando un AuNPs-interruptor. En una realización alternativa, el suministro puede basarse en liposomas termosensibles o liposomas magnéticos termosensibles. Estos liposomas pueden, por ejemplo, diseñarse para combinar características de focalización magnética y liberación de control termo-sensible para la administración local de fármacos desencadenada por hipertermia. Pueden obtenerse más detalles, por ejemplo, en Dai et al., 2017, J Microencapsul.
34(4): 408-415 o de Kneidl et al., 2014, Int J Nanomedicine, 9: 4387-4398.
Tal y como se utiliza aquí, el término "alquilo" se refiere a un grupo hidrocarburo de cadena recta o ramificada. El hidrocarburo que tiene el número indicado de átomos de carbono (por ejemplo, "C1-C8" alquilo se refiere a un grupo alquilo que tiene de 1 a 8 átomos de carbono). Cuando no se indica el número de átomos de carbono, el grupo alquilo tiene de 1 a 100 átomos de carbono. Algunos ejemplos de grupos alquilo son el metilo, el etilo, el n-propilo, el isopropilo, el terc-butilo y el n-pentilo. Los grupos alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes. El término "alquenilo" se refiere a una cadena de hidrocarburos insaturados que puede ser una cadena recta o ramificada, que contiene de 2 a 100 átomos de carbono y al menos un doble enlace carbono-carbono. Los grupos alquenilo pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes.
El término "alquinilo" se refiere a una cadena de hidrocarburos insaturados que puede ser una cadena recta o ramificada, que contiene de 2 a 100 átomos de carbono y al menos un triple enlace carbono-carbono. Los grupos alquinilo pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes.
Un grupo "sustituido" se refiere a cualquier sustitución de cualquier patrón de ese grupo. Este grupo puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes, en los que los sustituyentes pueden ser del mismo tipo o de tipos diferentes. Los sustituyentes pueden seleccionarse del grupo que comprende -N(R<a>)(R<b>), -OR<a>, -SR<a>,-C(O)R<a>, -C(O)OR<a>, -C(O)N(R<a>)(R<b>), -N(R<a>)C(O)R<b>, -N(R<a>)S(O)2Rb,-OS(O)2R<a>, halógeno, -NO2, -CN, -NC, -N3, -NCO, -OCN, -NCS, -SCN, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y heteroarilo sustituido o no sustituido. Mientras que el término grupo "no sustituido" se refiere a un grupo que es un grupo hidrocarburo.
Tal y como se utiliza aquí, el término "halógeno", "hal" o "halo" significa F, CI, Br o I.
El término "arilalquilo", tal como se utiliza aquí, se refiere a una cadena de hidrocarburos saturados o insaturados que puede ser una cadena recta o ramificada, que contiene de 1 a 100 átomos de carbono y puede contener carbonocarbono de triple enlace y/o carbonos hibridizados sp2 de doble enlace. Los grupos arilo y/o alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes. Los carbonos sp2 o sp de un grupo alquenilo y un grupo alquinilo, respectivamente, pueden ser opcionalmente el punto de unión de los grupos alquenilo o alquinilo.
El término "cicloalquilo" se refiere a un sistema de anillos de hidrocarburos monocíclicos de 3-8 miembros o bicíclicos de 7-14 miembros o a un sistema de anillos más grande de más de 15 miembros con al menos un anillo saturado o con al menos un anillo no aromático, en el que el anillo no aromático puede tener cierto grado de insaturación. Los grupos cicloalquilo pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes. En una realización, 0, 1, 2, 3 o 4 átomos de cada anillo de un grupo cicloalquilo pueden estar sustituidos por un sustituyente. Algunos ejemplos representativos de grupo cicloalquilo son el ciclopropilo, el ciclopentilo, el ciclohexilo, el ciclobutilo, el cicloheptilo, el ciclopentenilo, el ciclopentadienilo, el ciclohexenilo, el ciclohexadienilo y similares.
El término "arilo" se refiere a un sistema de anillos aromáticos monocíclicos, bicíclicos o tricíclicos de hidrocarburos. Los grupos arilo pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes. En una realización, 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 átomos de cada anillo de un grupo arilo pueden estar sustituidos por un sustituyente. Algunos ejemplos de grupos arilo son el fenilo, el naftilo, el antracenilo, el fluorenilo, el indenilo, el azulenilo y similares.
El término "biarilo" se refiere a un sistema de anillos aromáticos que contiene una subestructura que es un ensamblaje de dos anillos aromáticos o grupos arilo, si están unidos por un enlace simple. Los grupos arilo pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes. Algunos ejemplos de grupos biarilo son el bifenilo, el binaftilo y similares.
El término "heteroarilo" se refiere a un sistema de anillos aromáticos monocíclicos, bicíclicos o tricíclicos que contienen al menos un heteroátomo con átomos de carbono (también denominados miembros del anillo) y miembros del anillo heteroátomos seleccionados independientemente entre N, O, P o S, y derivados por eliminación de un átomo de carbono de un átomo del anillo de un sistema de anillos padre. Algunos ejemplos de grupos heteroarilo son el furano, el tiofeno, el pirrol, el tiazol, el oxazol, la piridina, la pirazina y similares.
Los términos "alquilo cicloalquilo", "alquilo arilo", "alquilo biarilo" y "alquilo heteroarilo", tal y como se utilizan aquí, se refieren a una cadena de hidrocarburos saturada o insaturada que puede ser una cadena recta o ramificada, contener de 1 a 8 átomos de carbono y puede contener carbono-carbono de triple enlace y/o carbonos hibridizados sp2 de dobles enlaces unidos al cicloalquilo, arilo, biarilo o heteroarilo. Las diferentes estructuras cíclicas se definen como se ha indicado anteriormente. Los grupos cicloalquilo, arilo, biarilo o heteroarilo y/o alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes. Los carbonos sp2 o sp de un grupo alquenilo y de un grupo alquinilo, respectivamente, pueden ser opcionalmente el punto de unión de los grupos alquenilo o alquinilo.
En realizaciones preferidas, el residuo R es seleccionado independientemente del grupo formado por alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquilo C1-C8alquilo, arilo, arilo C1-C8alquilo, heteroarilo, heteroarilo C1-C8alquilo, biarilo y biarilo C1-C8alquilo. En otra realización, el residuo R es seleccionado independientemente del grupo formado por alquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo C1-C8alquilo, arilo, arilo C1-C8alquilo, heteroarilo, heteroarilo C1-C8alquilo, biarilo y biarilo C1-C8alquilo. En una realización más preferida, el residuo R es seleccionado independientemente del grupo que consiste en C1-C6alquilo sustituido o no sustituido, C3-C6cicloalquilo, C1-C3alquilo C3-C6cicloalquilo, C6-C14arilo, C1-C3alquilo C6-C14arilo, heteroarilo, C1-C3alquilo heteroarilo, biarilo y C1-C3alquilo biarilo. En una realización más preferida, el residuo R es seleccionado independientemente del grupo que consiste en ciclohexilo sustituido o no sustituido, fenilo, bencilo, bifenilo, piridilo u oxazolilo. En otra realización preferida, el residuo R es un fenilo sustituido o no sustituido.
Los sustituyentes del residuo R pueden ser cualquier sustituyente adecuado, que no dificulte la unión del ligando a la Langerina. Además, los sustituyentes pueden ser uno o más sustituyentes del mismo tipo o de tipos diferentes. Los sustituyentes de R pueden tener cualquier patrón de sustitución. En una realización, los sustituyentes del residuo R es seleccionado independientemente del grupo formado por -N(R<a>)(R<b>), -OR<a>, -SR<a>, -C(O)R<a>, -C(O)OR<a>, -C(O)N(R<a>)(R<b>), -N(R<a>)C(O)R<b>, -N(R<a>)S(O)2R<b>, -OS(O)2R<a>, halógeno, -NO2, -CN, -NC, -N3, -NCO, -OCN, -NCS, -SCN, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y heteroarilo sustituidos o no sustituidos. R<a>y R<b>pueden seleccionarse independientemente del grupo formado por hidrógeno, C1-8alquilo sustituido o no sustituido, C2-8alquenilo, C2-8alquinilo, C3-6cicloalquilo, aril-C1-5alquilo, heteroarilo-C1-5alquilo, arilo, heteroarilo. En una realización preferida, R<a>y R<b>pueden seleccionarse independientemente del grupo formado por hidrógeno, metilo y etilo.
Más preferentemente, los sustituyentes del residuo R son seleccionados independientemente del grupo formado por NH2, -OH, -OCH3, -C(O)CH3, -NHC(O)CH3, -F, -Cl, -Br, -NO2, -CN, C1-C4alquilo y fenilo, bifenilo y naftilo. En una realización preferida, el residuo R es un residuo de fenilo sustituido. Este residuo de fenilo puede estar sustituido con 5 sustituyentes. Más preferentemente, el residuo de fenilo puede estar mono-, di- o trisustituido. En una realización más preferida, el residuo R es un residuo de fenilo monosustituido, en el que los sustituyentes son seleccionados del grupo formado por -NH2, -OH, -OCH3, -C(O)CH3, C(O)NH2, -C(O)NHCH3, -CH2OH -NHC(O)CH3, -F, -Cl, -Br, -NO2, CN, alquilo C1-C4, naftilo y fenilo. En una realización preferida adicional, los sustituyentes están en posición para con el ligando. En otra realización preferida, los sustituyentes en posición para y los sustituyentes del fenilo son seleccionados independientemente del grupo formado por -NHC(O)CH3, -CN, -CH3, -F, -C(O)NH2, -NH2, -C(O)NHCH3, -CH2OH y fenilo. En otra realización preferida, los sustituyentes están en posición meta respecto al ligando.
En otra realización, R' puede seleccionarse independientemente del grupo que consiste en -OR<a>, y -NHS(O)2R<a>, en el que R<a>se define como arriba. En una realización preferida, R' puede seleccionarse del grupo formado por -OH, -OCH3,-OCH2CH3, o -NHS(O)2R<a>, en el que R<a>se define como arriba. En una realización más preferida, -OH o -NHS(O)2R<a>, en la que R<a>se define como arriba. En una realización más preferida, R' es -OH, -NHS(O)2CH3o N-tosilo. En la realización más preferida, R' es -OH.
En otra realización preferida, el conjugado antes mencionado es un conjugado de la siguiente fórmula (I-1) o (I-2):
En una realización aún más preferida, el conjugado antes mencionado es un conjugado de cualquiera de las siguientes fórmulas (I-3) a (I-15):
Las expresiones "grupo enlazador A-D-B-L", "A-D-B-L" o "grupo enlazador" se refieren a un grupo formado por un espaciador A-D-B y un enlazador L. El grupo une el ligando derivado de la glucosa con el portador. En una realización típica, en un extremo el enlazador L de la fórmula general (I), tal como se ha descrito anteriormente, está unido mediante un espaciador A-D-B a la estructura del ligando de Langerina, tal como se ha definido anteriormente, que comprende el derivado de la glucosa de la fórmula (I). El espaciador A-D-B está unido covalentemente a la posición C1 del mencionado derivado de la glucosa. También se prevé que el espaciador A-D-B esté unido covalentemente a la posición C6 del mencionado derivado de la glucosa.
En ciertas realizaciones, el grupo enlazador A-D-B-L entre el ligando y el portador es una cadena molecular. En una realización preferida, dicha cadena principal puede tener un número total de átomos de carbono, átomos de nitrógeno y átomos de oxígeno contenidos en la cadena principal de al menos 4, preferiblemente de entre 4 átomos y 600 átomos, más preferiblemente de entre 15 átomos y 400 átomos, y aún más preferiblemente de entre 25 átomos y 200 átomos, por ejemplo 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 y 200 átomos. En otra realización, la longitud de la cadena principal del enlazador puede ser de unos 0,4 nm a unos 400 nm, y más preferiblemente de entre 0,6 nm y 100 nm, por ejemplo, 0,6, 0,8, 1, 2, 4, 8, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100 nm. El tamaño o la longitud del enlazador pueden medirse mediante mediciones analíticas de centrifugación o mediciones SAXS, por ejemplo, como se describe en Fuji et al., ACS Symposium Series, 2017, 1271, "Control of Amphiphile Self-Assembling at the Molecular Level: Supra-Molecular Assemblies with Tuned Physicochemical Properties for Delivery Applications", capítulo 5, páginas 115-129. La longitud media de una cadena puede medirse mediante técnicas de medición adecuadas , por ejemplo, como se explica en Needham y Kim, 2000, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 18, 3-4, 183-195 o en Stepniwieski et al., 2011, Langmuir, 27(12), 7788-7798.
El término "enlazador L" o "L", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere además a un compuesto que puede utilizarse para enlazar el ligando de Langerina de la invención, tal como se define en el presente documento, y un portador, ya sea directa o indirectamente, por ejemplo, a través del espaciador A-D-B. El enlace proporcionado puede realizarse mediante cualquier conexión química adecuada, preferiblemente a través de enlaces covalentes. Según la presente invención, dicho enlazador L es un enlazador de la siguiente fórmula general (L-1)
en la que
U<1>es un grupo conectado a través de B con el espaciador D, en el que U<1>es seleccionado del grupo formado por, -CH2-, -CH=CH-, o -C≡C-;
Z<1>es una fracción que une el enlazador al portador seleccionada del grupo formado por -O-, -S-, -N(R<d>)-, -C(R<d>)(R<e>)-, -R<d>C=CR<e>-, -C(O)-, -C(O)O-,-OC(O)-, -C(O)S-, -C(O)N(R<d>)-, -N(R<d>)C(O)-, -N(R<d>)C(O)N(R<e>)-, -N(R<d>)C(S)N(R<e>)-, -N(R<d>)C(O)O-, -OC(O)N(R<d>)-, -ciclohexeno-, -triazoles-, -NHS(O)2-, -S(O)2-, -OP(O)(H)O-, o -OP(O)(OH)O-;
donde R<d>y R<e>son seleccionados independientemente del grupo formado por hidrógeno, C1-32alquilo sustituido o no sustituido, C2-32alquenilo, C3-8cicloalquilo, arilo, C1-C8alquilo arilo, heteroarilo, C1-C8alquilo heteroarilo; y d1 a d5 es cada uno un número entero de 0 a 50, d6 un número entero de 1 a 50.
El término "carbohidrato", tal y como se utiliza aquí, se refiere a cualquier carbohidrato natural o sintético. El término puede comprender además triosas, tetrosas, pentosas, hexosas y heptosas. Los hidratos de carbono pueden ser aldosas o cetosas. Los carbohidratos pueden estar en forma D o L. Los carbohidratos pueden comprender uno o más monosacáridos o disacáridos. El carbohidrato puede formar un oligosacárido que incluya de 3 a 9 monosacáridos. El hidrato de carbono también puede ser un polisacárido, que contiene más de 9 monosacáridos. El término "monosacárido" comprende, entre otros, la treosa, la ribulosa, la glucosa, la fructosa, la galactosa, la xilosa, la ribosa, la arabinosa y la manosa. Los monosacáridos contenidos en disacáridos, oligosacáridos y polisacáridos pueden estar unidos entre sí en cualquier configuración. El término "disacárido" comprende, entre otros, la sacarosa, la lactosa y la maltosa. El término "oligosacárido" comprende, entre otros, las maltodextrinas y las celodextrinas. El término "polisacárido" comprende, entre otros, el almidón, la celulosa y la quitina. Los hidratos de carbono naturales comprenden los monosacáridos naturales. Los carbohidratos sintéticos pueden comprender monosacáridos D- y L-, modificados, sintéticos, inusuales y derivados de monosacáridos. Un "derivado de monosacárido" también llamado "carbohidratos modificados" incluye monosacáridos que tienen sustituciones o modificaciones por unión covalente de un monosacárido padre, como, por ejemplo, por alquilación, acetilación, fosforilación y similares. También se incluyen dentro de la definición de "derivado de monosacáridos", por ejemplo, uno o más análogos de un monosacárido con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Los hidratos de carbono preferidos son la manosa, la glucosa, la fucosa o la xilosa. En ciertas realizaciones también pueden utilizarse inositoles.
El término "lípido", tal como se utiliza aquí, se refiere a cualquier lípido natural o sintético. En consecuencia, puede comprender ácidos grasos y sus derivados, incluidos tri-, di-, monoglicéridos, y fosfolípidos, glicerolípidos, glicerofosfolípidos, esfingolípidos, sacarolípidos, policétidos, lípidos esteroles y lípidos prenoles, incluido el DSPE (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DPPC (1,2-dipalmitoil-sn-gliceroil-3-fosfocolina), DPPE (1,2-dipalmitoil-sngliceroil-3-fosfoetanolamina), DMPC (1,2-dimiristoil-sn-gliceroil-3-fosfocolina), DSPC (1,2-distearoil-sn-gliceroil-3-fosfocolina), lípidos de membrana y fosfatidilcolina, así como versiones modificadas de los mismos. Los lípidos preferidos son DPPC (1,2-Dipalmitoyl-sn-glyceroyl-3-phosphocholine), DPPE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glyceroyl-3-phosphoethanolamine), DMPC (1,2-dimiristoil-sn-gliceroil-3-fosfocolina), DSPC (1,2-distearoil-sn-gliceroil-3-fosfocolina) o DSPE (1,2-distearoil-sn-gliceroil-3-fosfoetanolamina). El término "lípidos modificados" se refiere a un lípido que tiene una o más modificaciones. Una modificación de un lípido de este tipo puede comprender una acetilación, una glicosilación, una alquilación, una combinación con un quelante o una funcionalización adicional como la provisión de sensibilidad al pH, la adición de ácidos carbónicos, biotina, aminas, tioetanl, grupos azida, etc. Los lípidos pueden combinarse además con potenciadores de la flexibilidad, la elasticidad y/o la permeabilidad. El especialista conoce más detalles o puede obtenerlos de fuentes bibliográficas adecuadas, como Benson, 2017, Methods Mol. Biol., 1522: 107-117, Sala et al., 2018, Int J. Pharm. 535 Molecular Cell Biology, 201(1-2), 1-17 o Harayama y Riezman, Nature Reviews, 20188, 19, 281-296.
El término "péptido", tal y como se utiliza aquí, se refiere a cualquier tipo de secuencia de aminoácidos que comprenda más de 2 aminoácidos o derivados funcionales de los mismos. Además, el péptido puede combinarse con otras moléculas químicas o funcionalidades, o puede ser un péptido sintético. Los péptidos naturales suelen comprender aminoácidos naturales. Los péptidos sintéticos pueden comprender aminoácidos D- y L-, modificados, sintéticos o no naturales y derivados de aminoácidos. Los péptidos naturales comprenden aminoácidos naturales. Los péptidos sintéticos pueden comprender aminoácidos D- y L-, modificados, sintéticos, no naturales y derivados de aminoácidos. Un "derivado de aminoácido" incluye un aminoácido con sustituciones o modificaciones por unión covalente de un aminoácido padre, como, por ejemplo, por alquilación, glicosilación, acetilación, fosforilación y similares. También se incluyen en la definición de "derivado de aminoácido", por ejemplo, uno o varios análogos de un aminoácido con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Por "aminoácido natural" se entiende arginina, glutamina, fenilalanina, tirosina, triptófano, lisina, glicina, alanina, histidina, serina, prolina, ácido glutámico, ácido aspártico , treonina, cisteína, metionina, leucina, asparagina, isoleucina y valina, salvo que el contexto indique lo contrario. Un péptido preferido según la presente invención puede ser el ácido oligo-L-glutámico o la oligo-L-lisina. Otros péptidos preferidos pueden ser péptidos anfipáticos que se conectan a portadores lipídicos por inserción, por ejemplo, de la secuencia VLTTGLPALISWIKRKRQQ (SEQ ID NO: 81), con un enlazador corto N-terminal de di-L-glicina. Los péptidos pueden distinguirse de los polipéptidos. Un "polipéptido" puede, por ejemplo, tener una longitud de más de 20 a 50 aminoácidos. El término "proteína", tal y como se utiliza aquí, se refiere a una disposición de uno o más polipéptidos. En consecuencia, una proteína puede comprender o consistir en un polipéptido y, por tanto, por sinónimo de polipéptido. En otras realizaciones, una proteína puede comprender 2 o más polipéptidos que pueden estar organizados en unidades o subunidades de una estructura de orden superior en forma de proteína.
Otros ejemplos de polímeros naturales solubles en agua son la pectina, los derivados del quitosano, las gomas xantanas, los derivados del quitosano, el dextrano, los éteres de celulosa, el ácido hialurónico, la caseína, el carragenano, el almidón y los derivados del almidón y similares.
Como se describe con más detalle a continuación, el portador o el ligando pueden prepararse utilizando una sección de la unidad L del enlazador que tenga un sitio reactivo para unirse al ligando. Para sintetizar el conjugado, el enlazador puede proporcionarse como un ligando bifuncional o una unidad bifuncional. En consecuencia, la unidad L del enlazador puede tener un sitio reactivo, que posee un grupo nucleófilo que es reactivo con un grupo electrófilo presente en una unidad de ligando o en una unidad portadora. Alternativamente, la unidad ligando o una unidad portadora pueden tener en consecuencia un sitio reactivo, que tiene un grupo nucleofílico que es reactivo con un grupo electrófilo presente en la unidad enlazadora L. El grupo electrófilo de una unidad ligando o de una unidad portadora proporciona un sitio conveniente para la unión a una unidad enlazadora, o alternativamente, el grupo electrófilo de la unidad enlazadora L proporciona un sitio conveniente para la unión a una unidad ligando o a una unidad portadora. Los grupos electrófilos útiles en una unidad de ligando o enlazador incluyen, entre otros, los grupos carbonilo aldehído y cetona. El heteroátomo de un grupo nucleófilo de una unidad enlazadora puede reaccionar con un grupo electrófilo de un ligando y formar un enlace covalente con el ligando. Alternativamente, el heteroátomo de un grupo nucleófilo de una unidad de ligando puede reaccionar con un grupo electrófilo de un enlazador y formar un enlace covalente con el enlazador. Los grupos nucleófilos útiles en una unidad enlazadora o de ligando incluyen, entre otros, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida. En ciertas realizaciones, puede utilizarse un enlazador bifuncional, que lleva un grupo OH o que puede ser, por ejemplo, un nucleófilo general, y un grupo funcional adicional. El segundo grupo funcional puede ser cualquier nucleófilo portador de un grupo protector ortogonal o un grupo funcional compatible con las reacciones de glucosilación y los métodos de desprotección global. El elemento bifuncional puede reaccionar posteriormente con el centro anomérico del monosacárido a través del grupo OH. Posteriormente se desprotegen el monosacárido y el segundo grupo funcional. A continuación, el producto puede conjugarse con un lípido PEGilado correspondiente.
El término "espaciador", tal como se utiliza aquí, se refiere a cualquier estructura que conecte covalentemente el enlazador con el derivado-ligando de glucosa de la invención, tal como se ha definido anteriormente. En una realización preferida, dicho grupo espaciador A-D-B comprende D como espaciador conectado con A y B de la fórmula general (D-1)
A-(CH2)c-(CH2-O)c1-(CH2-CH2-O)c2-(CH2)c3-B (D-1),
en la que
D está conectado al enlazador L a través de B, en el que B es seleccionado del grupo formado por -O-, -S-, -C(R<c1>)(R<c2>)-, -S-S-, -N(R<c1>)-, -C(O)-, -C(R<c1>)=N-, -N=N-, -OC(O)-, -C(O)O-, -C(O)N(R<c1>)-, -N(R<c1>)C(O)-, -N(R<c1>)C(O)N(R<c2>)-, -N(R<c1>)C(S)N(R<c2>)-, -N(R<c1>)C(O)O-, - OC(O)N(R<c1>)-, -ciclohexeno- y -triazoles-; B también puede ser un enlace simple; preferentemente B es un enlace covalente, una amida o un grupo carbonilo;
donde R<c1>y R<c2>son seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquilo C1-C8alquilo, arilo, arilo C1-C8alquilo, heteroarilo y heteroarilo C1-C8alquilo; preferentemente R<c1>y R<c2>son seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y metilo;
D está conectado al derivado de la glucosa a través de A, en el que A es seleccionado del grupo formado por -O-, -CH2-, -S-, -NH-, -NHC(O)-, -OC(O)-, -ciclohexeno- y -triazoles-; A también puede ser un enlace simple; preferentemente A es un enlace covalente, una amida o un grupo carbonilo;
c es un número entero seleccionado entre 0 y 20, preferentemente c es 0, 1, 2 ó 3; c1 es un número entero seleccionado entre 0 y 20, preferentemente c1 es 0, 1, 2 ó 3; y c2 es un número entero seleccionado entre 0 y 20, preferentemente c2 es 0, 1, 2 ó 3; c3 es un número entero seleccionado entre 1 y 20, preferentemente c3 es 1, 2 ó 3; si A es -CH2- c3 es un número entero seleccionado entre 0 y 20. El grupo espaciador D puede ser un enlace simple, uno o más grupos metilenglicol, uno o más grupos etilenglicol o un hidrocarburo o una mezcla de los mismos. El espaciador es más preferentemente un grupo seleccionado de entre un enlace simple, -CH2-, -CH2-CH2-, o -CH2-CH2-O-. Por lo tanto, A y B pueden estar conectados mediante un enlace simple.
El término "portador", tal como se utiliza aquí, se refiere a cualquier estructura que pueda transportar una carga a una célula o grupo de células, en la que el portador comprende o está asociado a una carga farmacéuticamente activa. Por consiguiente, la carga puede estar asociada, es decir, unida al portador, o puede estar comprendida, abrazada o englobada por el portador. El portador puede, en realizaciones particularmente preferidas, ser también ventajosamente capaz de introducir -tras la interacción previa del ligando asociado, es decir, en el contexto del conjugado o vehículo antes definido, con la célula diana- la carga transportada en dicha célula. El portador puede, en determinadas realizaciones, comprender uno o varios tipos de carga. Estas cargas pueden estar conectadas al portador de manera idéntica o diferente. Por ejemplo, un tipo de carga puede estar unido al portador, por ejemplo en el exterior, y un tipo de carga diferente puede estar abrazado o englobado por el portador.
Según ciertas realizaciones de la presente invención, el portador puede estar unido o asociado al conjugado tal como se define en el presente documento en una proporción 1:1, es decir, un portador está unido a un conjugado. En otra realización, el portador puede estar unido a más de un conjugado. En una realización particular, el portador está unido a menos de 10 conjugados. En una realización más preferida, el portador puede estar unido a menos de 100 conjugados. En otra realización preferida, el portador puede estar unido a menos de 200 conjugados. En otras realizaciones, la proporción entre portador y conjugado puede ser variable, por ejemplo, ajustada a la forma del portador, la carga prevista, las intenciones secundarias de unión, etc. Por ejemplo, puede proporcionarse una proporción de 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100 o 1:200 o más, o cualquier proporción (valores enteros) entre las proporciones mencionadas entre el portador y el conjugado. En otras realizaciones alternativas, también puede proporcionarse una proporción de un conjugado con más de un portador. En consecuencia, puede proporcionarse una proporción de 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1 o más o cualquier proporción entre las proporciones mencionadas entre el portador y el conjugado.
En determinadas realizaciones, el portador puede ser una partícula blanda. El término "partícula blanda", tal como se utiliza aquí, se refiere a partículas elásticas, deformables y típicamente biodegradables o no biopersistentes. Ejemplos preferidos de partículas blandas son los liposomas, los niosomas, las micelas, los sequessomas<TM>y los transferosomas. Una partícula blanda como la definida anteriormente puede comprender o estar compuesta por diferentes tipos de constituyentes, por ejemplo lípidos. Una partícula blanda puede, por ejemplo, comprender uno o más tipos de fosfolípidos; además, una partícula blanda puede comprender un componente adicional que puede, por ejemplo, influir en la estabilidad, rigidez, capacidad de unión, capacidad de penetración para las células, capacidad de focalización secundaria, etc. Un ejemplo de componente es el colesterol, que normalmente reduce la fluidez de una estructura bicapa y aumenta la estabilidad de un liposoma. En una realización especialmente preferida, la partícula blanda es un liposoma. Es particularmente preferido que la partícula comprenda un 57% de DSPC, un 38% de colesterol y un 5% de DSPE-PEG.
Un "liposoma" es una vesícula esférica que tiene al menos una bicapa de lípidos, por ejemplo, como se ha definido anteriormente. Los liposomas pueden comprender fosfolípidos, por ejemplo fosfatidilcolina, o incluir otros lípidos como la fosfatidiletanolamina. El liposoma puede presentarse en forma de vesícula multilamelar (MLV), es decir, que comprende varias bicapas lipídicas en fase lamelar, como vesícula lamelar unilamelar pequeña (SUV), es decir, que comprende una bicapa lipídica, o como vesícula unilamelar grande (LUV). El liposoma suele tener un núcleo de solución acuosa rodeado por una membrana hidrófoba. En consecuencia, los compuestos hidrófobos disueltos en el núcleo no pueden atravesar la bicapa, a menos que dicha bicapa se abra, por ejemplo, mediante la introducción de un poro, o a menos que la bicapa se fusione con otra estructura de bicapa, por ejemplo, una membrana celular, y entregue así el contenido del liposoma al núcleo de la segunda bicapa, por ejemplo, la célula. A su vez, los compuestos hidrófobos suelen asociarse con la bicapa lipídica y pueden cargarse así en dicho compartimento del liposoma. Alternativamente, el liposoma puede entregarse a una célula mediante la provocación de un evento de endocitosis o fagocitosis. Los liposomas pueden tener diferentes tamaños, dependiendo en gran medida de la naturaleza del lípido, la estructura laminar y la presencia de factores adicionales en la bicapa lipídica, por ejemplo, el colesterol. Por ejemplo, el tamaño del liposoma puede oscilar entre unos pocos nanómetros y hasta 2000 nm. El tamaño de los liposomas puede medirse con cualquier ensayo adecuado conocido por el especialista, preferiblemente con dispersión dinámica de la luz (DLS).
En una realización particularmente preferida, el liposoma es un liposoma fosfolípido bicapa. La presente invención prevé que el tamaño de dicho liposoma fosfolípido bicapa sea de entre 10 y 500 nm. El tamaño del liposoma puede ser, por ejemplo, de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 150, 160, 180, 200, 220, 240, 250, 260, 280, 300, 350, 400, 450 o 500 nm. Preferiblemente, el tamaño está entre 30 y 250 nm, por ejemplo 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 150, 160, 180, 200, 220, 240 o 250 nm. También se prevén otros tamaños intermedios entre los mencionados.
Se comprobó que el tamaño preferido de aproximadamente 140 nm de los liposomas proporcionaba una estabilidad liposomal reproducible durante varios meses.
Los liposomas, incluido el liposoma bicapa de fosfolípidos, pueden contener uno o más componentes adicionales. Un ejemplo de estos componentes adicionales es el colesterol. En una realización preferida, el colesterol puede estar presente en el liposoma preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 20 a 50 mol %, por ejemplo, en una cantidad de aproximadamente 20 mol %, 25 mol %, 30 mol %, 35 mol %, 40 mol %, 45 mol % o 50 mol %, o cualquier valor adecuado entre los valores mencionados. Más preferiblemente, puede estar presente en una cantidad de alrededor del 40 %.
Además, los liposomas pueden estar compuestos preferentemente de fosfolípidos, más preferentemente de fosfatidilcolinas, pero también pueden incluir otros lípidos, como la fosfatidiletanolamina del huevo, siempre que sean compatibles con la estructura de la bicapa lipídica. Entre los ejemplos de fosfolípidos especialmente contemplados se incluyen el POPC (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina), el DPPG (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3[fosfo-rac-(1-glicerol), el DSPC (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina), el DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina), el DSPE (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DMPC (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DPPC (1,2-dipalmitoilsn-glicero-3-fosfocolina), DMPE (1,2-Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DPPE (1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DMPA•Na (1,2-Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfato (sal sódica)), DPPA•Na (1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfato (sal sódica)), DOPA•Na (1,2-Dioleoil-sn-glicero-3[Fosfo-rac-(1-glicerol) (sal sódica)) DMPG•Na (1,2-Dimiristoilsn-glicero-3[Fosfo-rac-(1-glicerol) (sal sódica)), DPPG•Na (1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3[Fosfo-rac-(1-glicerol) (sal sódica)), DMPS•Na (1,2-Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoserina (sal sódica)), DPPS•Na (1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoserina (sal sódica)), y DOPS•Na (1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfoserina (sal sódica)).
El término "niosoma", tal y como se utiliza aquí, se refiere a una vesícula basada en un tensioactivo no iónico. Típicamente, un niosoma está formado por un tensioactivo no iónico de la clase alquil o dialquil poliglicerol éter y colesterol con hidratación posterior en medio acuoso. Los niosomas son estructuralmente similares a los liposomas por tener una bicapa, pero son más estables debido a su composición. Se trata de vesículas unilamelares pequeñas (SUV, tamaño=0,025-0,05 μm), vesículas multilamelares (MLV, tamaño=>0,05 μm) y vesículas unilamelares grandes (LUV, tamaño=>0,10 μm). Algunos ejemplos de tensioactivos utilizados para la preparación de niosomas son el monoestearato de sorbitán (Span-60), el polioxietileno alquil éter y el Span 40 (C16 G2).
Una "micela", tal como se utiliza en el contexto de la presente invención, significa un agregado de moléculas tensioactivas, por ejemplo fosfolípidos, copolímeros en bloque o copolímeros tribloque, dispersas en un líquido. Una micela típica en solución acuosa forma un agregado con las regiones hidrófilas de la cabeza en contacto con el disolvente circundante, secuestrando las regiones hidrófobas de una cola en el centro de la micela. La micela tiene, por tanto, una estructura monocapa. Las micelas se forman por encima de la concentración micelar crítica y suelen tener un diámetro de entre 1 y 100 nm. Las micelas poliméricas suelen ser más estables y típicamente monodispersas con diámetros de entre 20 y 50 nm. Puede encontrar más detalles en fuentes bibliográficas adecuadas, como Soussan et al., 2009, Angew Chem Int Ed Engl.48(2), 274-88. Además de estas micelas de fase normal, existe otro grupo de micelas inversas de forma diferente en las que los grupos hidrófilos de cabeza se encuentran en el centro de la micela y las colas se extienden hacia fuera. La forma y el tamaño de una micela son función de la geometría molecular de sus moléculas de tensioactivo y de las condiciones de la solución, como la concentración de tensioactivo o polímero, la temperatura, el pH y la fuerza iónica. Algunos ejemplos de tensioactivos previstos son los tensioactivos catiónicos, como DeTAB, DTAB, TTAB o CTAB; los tensioactivos aniónicos, como SDS o SDC; los tensioactivos zwitteriónicos, como SB-14 o CHAPS; o los tensioactivos no iónicos, como NOG, Tween 20, Tween 80 o Triton X. Debido a su mayor estabilidad, las micelas poliméricas son una realización preferida de la presente invención. Según realizaciones particularmente preferidas, estas micelas poliméricas comprenden polímeros a base de carbohidratos y glicerol, polietilenoóxidos o biodegradables, que pueden utilizarse para la fracción hidrófila. La fracción hidrófoba puede estar compuesta preferentemente por polímeros biodegradables a base de lactato. En otra realización preferida se proporcionan micelas compuestas de copolímeros en bloque sensibles al pH. Tales micelas pueden generarse mediante la inclusión de grupos funcionales básicos o ácidos, que ventajosamente pueden cambiar la solubilidad de los polímeros y, por tanto, la estabilidad de las micelas a valores de pH variables.
El término "sequessomas"<TM>, tal como se utiliza aquí, se refiere a esferas ultradeformables e hidrófilas compuestas por moléculas de fosfolípidos y tensioactivos dispuestas como una bicapa. La inclusión de tensioactivos ablanda la membrana de la bicapa haciendo que las vesículas sequessome sean flexibles, pero también estables, lo que les permite atravesar la piel intactas y penetrar profundamente en el organismo sin necesidad de inyecciones ni potenciadores de la permeación cutánea. Puede encontrar más detalles, por ejemplo, en Benson, 2017, Methods Mol. Biol., 1522: 107-117, o Sala et al., 2018, Int J. Pharm.535 (1-2), 1-17.
El término "transferosoma", tal como se utiliza aquí, se refiere a un agregado portador compuesto por al menos un anfipato, que en disolventes acuosos se autoensambla en una bicapa lipídica que se cierra en una vesícula lipídica simple. Típicamente, el anfipato es fosfatidilcolina. Mediante la adición de al menos un componente suavizante de la bicapa, por ejemplo un tensioactivo biocompatible o un fármaco anfifilo, se puede aumentar la flexibilidad y permeabilidad de la bicapa lipídica. El transferosoma resultante está optimizado para la flexibilidad y la permeabilidad, por lo que puede adaptar su forma a las condiciones ambientales con facilidad y rapidez ajustando la concentración local de cada componente de la bicapa a la tensión local experimentada en la bicapa. El transferosoma se diferencia típicamente de las vesículas o liposomas más convencionales principalmente por su membrana artificial más blanda, más deformable y mejor ajustable. El transferosoma tiene además típicamente una mayor afinidad para ligar y retener agua. Sin querer atarse a la teoría, se supone que las vesículas ultradeformables y altamente hidrófilas, como los transferosomas, tienden a evitar la deshidratación, que puede implicar un proceso de transporte relacionado con la ósmosis directa. Ventajosamente, un transferosoma aplicado sobre una superficie biológica abierta, en particular la piel, tiende a penetrar su barrera y migrar hacia los estratos más profundos ricos en agua para asegurar una hidratación adecuada. La penetración de la barrera puede implicar una deformación reversible de la bicapa, pero no debe comprometer ni la integridad de la vesícula ni las propiedades de la barrera para que la afinidad y el gradiente de hidratación subyacentes permanezcan intactos. Puede encontrar más detalles, por ejemplo, en Benson, 2017, Methods Mol. Biol., 1522: 107-117, o Sala et al., 2018, Int J. Pharm.535 (1-2), 1-17.
En ciertas realizaciones de la presente invención, una parte de la partícula blanda, por ejemplo, una fracción o compuesto que interactúa, se une directamente mediante un enlace covalente o mediante
una fracción seleccionada del grupo formado por -O-, -S-, -N(R<d>)-, -C(R<d>)(R<e>)-, -R<d>C=CR<e>-, -C(O)-, -C(O)O-,-OC(O)-, -C(O)S-, -C(O)N(R<d>)-, -N(R<d>)C(O)-, -N(R<d>)C(O)N(R<e>)-, -N(R<d>)C(S)N(R<e>)-, -N(R<d>)C(O)O-, -OC(O)N(R<d>)-, -ciclohexeno-, -triazoles-, -NHS(O)2-, -S(O)2-, -OP(O)(H)O-, u -OP(O)(OH)O-;
en los que R<d>y R<e>son seleccionados independientemente del grupo formado por hidrógeno, C1-32alquilo sustituido o no sustituido, C2-32alquenilo, C3-8cicloalquilo, arilo, C1-C8alquilo arilo, heteroarilo, C1-C8alquilo heteroarilo,
por ejemplo, a través de Z<1,>tal como se ha definido anteriormente, al grupo enlazador A-D-B-L del conjugado tal como se ha definido anteriormente.
El término "una parte de la partícula blanda" se refiere a un constituyente típico de una partícula blanda, por ejemplo de un liposoma, como un lípido, un lípido modificado, un fosfolípido, 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DSPE), un lípido de membrana, o una fosfatidilcolina modificada, o colesterol, que está unido covalentemente al ligando de Langerina tal como se define aquí a través del grupo enlazador A-D-B-L. En determinadas realizaciones, el conjugado que comprende el ligando de Langerina y el grupo enlazador A-D-B-L puede comprender una región hidrófoba, que aquí se denomina también "región de cola", así como una región hidrófila, que también comprende el ligando de Langerina, también denominada "región de cabeza". En realizaciones específicas, la región de la cola del conjugado puede estar incrustada en una estructura de bicapa lipídica, mientras que la región de la cabeza se sitúa fuera del portador y, por tanto, es capaz de interactuar con los receptores. Un ejemplo de esta incrustación se representa esquemáticamente en la Fig.26, que muestra la región de cola del conjugado insertada en una estructura de bicapa lipídica, que pertenece a un portador de partículas blandas, por ejemplo un liposoma. La región de la cabeza del conjugado comprende, en realizaciones preferidas, un enlazador flexible entre el ligando y el lípido, permitiendo así una interacción con el receptor cognado. En realizaciones específicas, la longitud de este enlazador puede adaptarse para mantener una distancia mínima entre el ligando y la superficie de la partícula blanda, por ejemplo el liposoma. La presente invención también contempla la presencia de más de un conjugado en dicha bicapa lipídica o liposoma, como se ha mencionado anteriormente. La cantidad de conjugados y su distancia en la bicapa pueden ajustarse, por ejemplo, en correlación con la cantidad y la frecuencia de receptores afines en la superficie de una célula Langerina<+>. En una realización, el conjugado puede estar unido a una parte de la partícula blanda, por ejemplo una especie lipídica o colesterol, que forma parte de un liposoma, micela o estructura similar. En otra realización, los lípidos unidos a un conjugado y los lípidos que no están unidos a un conjugado tienen una proporción específica de aproximadamente 1:15, 1:20, 1:25, 1:50, 1:100, 1:150, 1:200, preferiblemente 1:20. En otras realizaciones específicas, el número de conjugados unidos a un lípido también puede determinarse como número de conjugados presentes por nm<2>del área de la bicapa lipídica. En realizaciones preferidas, este número debe adaptarse al tamaño del perímetro del liposoma. Por ejemplo, para un liposoma de un perímetro de 160 nm puede estar presente un número de aproximadamente 0,05 a 0,075 conjugados por nm<2>. En una realización muy específica, puede estar presente un número de aproximadamente 0,67 conjugados por nm<2>.
En una realización preferida, el conjugado se une a una parte de un portador de partículas blandas dando lugar a la siguiente fórmula (II-a)
(II-a)
donde p y q son cada uno independientemente números enteros entre 6 y 30; más preferiblemente p y q son cada uno independientemente números enteros entre 8 y 28, aún más preferiblemente p y q son cada uno independientemente 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 y 28; n es un número entero entre 0 y 150, preferiblemente un número entero entre 10 y 100 y más preferiblemente un número entero entre 20 y 75. En una realización más preferida, n es 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 75. En la realización más preferida, n es 45
En una realización más preferida, el conjugado se une a una parte de un portador de partículas blandas dando lugar a la siguiente fórmula (II):
en el que el número medio de unidades de etilenglicol n es un número entero de 0 a 150, preferentemente un número entero de aproximadamente 20 a 110 y más preferentemente un número entero de aproximadamente 40 a 70.
En una realización más preferida, n es aproximadamente 40, 50, 55, 60 o 70. En la realización más preferida, n es aproximadamente 59. En determinadas realizaciones se utiliza un enlazador PEG. Particularmente preferido es 3-(N-succinimidiloxiglutaril) aminopropil, polietilenglicol-carbamil distearoylfosfatidil-etanolamina.El enlazador PEG puede tener cualquier peso adecuado. Por ejemplo, el peso puede estar comprendido entre aproximadamente 1500 y 10000 Da, por ejemplo 1500, 2000, 2500, 3000, 3200, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 o 10 000 Da o cualquier valor intermedio entre los valores mencionados. También se contempla un rango de aproximadamente 2000 a 5000 Da. Es particularmente preferible utilizar un enlazador PEG que tenga un peso molecular de 2000 Da.
En otras realizaciones preferidas, el portador puede tener una estructura sólida, ser una nanopartícula, un péptido, una proteína, una toxina, un dendrímero, un fullereno o un nanotubo de carbono. El conjugado puede estar unido directamente mediante un enlace covalente al portador, o mediante
una fracción seleccionada del grupo formado por -O-, -S-, -N(R<d>)-, -C(R<d>)(R<e>)-, -R<d>C=CR<e>-, -C(O)-, -C(O)O-,-OC(O)-, -C(O)S-, -C(O)N(R<d>)-, -N(R<d>)C(O)-, -N(R<d>)C(O)N(R<e>)-, -N(R<d>)C(S)N(R<e>)-, -N(R<d>)C(O)O-, -OC(O)N(R<d>)-, -ciclohexeno-, -triazoles-, -NHS(O)2-, -S(O)2-, -OP(O)(H)O-, u -OP(O)(OH)O-;
en los que R<d>y R<e>son seleccionados independientemente del grupo formado por hidrógeno, C1-32alquilo sustituido o no sustituido, C2-32alquenilo, C3-8cicloalquilo, arilo, C1-C8alquilo arilo, heteroarilo, C1-C8alquilo heteroarilo
por ejemplo, a través de Z<1>, tal como se ha definido anteriormente, al portador. En otra realización, el conjugado puede unirse adicionalmente al portador a través de un elemento espaciador adicional.
El término "elemento espaciador", tal como se utiliza aquí, se refiere a cualquier grupo adecuado o a un polímero natural o sintético. Se prefiere especialmente que dicho polímero natural o sintético sea un polímero natural o sintético tal como se ha definido anteriormente
El término "nanopartícula", tal y como se utiliza aquí, se refiere a partículas de entre 1 y 1.000 nm, preferiblemente de entre 5 y 1.000 nm, de tamaño, normalmente con una capa interfacial circundante. Una nanopartícula se comporta esencialmente como una unidad completa en cuanto a su transporte y propiedades. En consecuencia, las partículas y, por tanto, sus superficies pueden tener una forma simétrica, globular, esencialmente globular o esférica, o ser de forma irregular o asimétrica. El tamaño de las partículas (y, por tanto, la dimensión de la superficie) puede variar. Se prefieren partículas y superficies de partículas en el rango de nanómetros hasta varios cientos de nanómetros. Son especialmente preferidas las nanopartículas de aproximadamente 1 a 700 nm. Particularmente preferidas son las nanopartículas que pueden tener un diámetro de unos 10 a 600 nm, por ejemplo 10 nm, 15 nm, 20 nm, 25 nm, 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 120 nm, 150 nm, 170 nm, 200 nm, 220 nm, 250 nm, 270 nm, 300 nm, 320 nm, 350 nm, 370 nm, 400 nm, 420 nm, 450 nm, 470 nm, 500 nm, 520 nm, 550 nm, 570 nm, 600 nm, 620 nm o cualquier valor intermedio. Aún más preferidas son las nanopartículas que tienen un diámetro de unos 500 nm. Las nanopartículas pueden estar constituidas por cualquier material adecuado conocido por el especialista en la materia, por ejemplo, pueden comprender o consistir o consistir esencialmente en material inorgánico u orgánico. Típicamente, pueden comprender o consistir o consistir esencialmente en metal o una aleación de metales, o un material orgánico, o comprender o consistir o consistir esencialmente en elementos carbohidratos, o una mezcla de los materiales antes mencionados. Otros ejemplos de materiales previstos son la agarosa, el poliestireno, el látex, el alcohol polivinílico, la sílice y los metales, aleaciones o materiales de composición ferromagnéticos. Otros ejemplos previstos de materiales en forma de nanopartículas son el oro, la plata, el silicio, el óxido de cerio, el hierro, el dióxido de titanio, el óxido de zinc, la arcilla, el óxido de aluminio, el óxido de cobre, los carburos metálicos, los nitruros metálicos, por ejemplo, el nitruro de aluminio o el nitruro de silicio, el aluminio o el cobre.
Normalmente, la carga iónica de la superficie o el recubrimiento de la superficie de las nanopartículas determina muchas de sus propiedades físicas y químicas, como la estabilidad, la solubilidad y la focalización. Para las aplicaciones biológicas previstas actualmente, se prevé que el recubrimiento proporcione una alta solubilidad acuosa y evite la agregación de las nanopartículas. En la superficie celular, los recubrimientos altamente cargados suelen favorecer la unión inespecífica, mientras que el polietilenglicol unido a grupos hidroxilo o metoxi terminales puede repeler las interacciones inespecíficas.
En ciertas realizaciones, la nanopartícula puede comprender una o más capas superficiales. Se prevé, por ejemplo, la presencia de una primera capa o estructura de concha. También se prevén estructuras multicapa o de malla. Dichas estructuras pueden comprender, por ejemplo, PEG, biotina y estreptavidina como componentes estructurales. La estructura de cáscara puede comprender un conjugado según la presente invención o, además, otras moléculas de afinidad, por ejemplo, anticuerpos, ligandos para una variedad de receptores, interactores proteicos, lectinas, etc. En otras realizaciones específicas, la multivalencia de la estreptavidina suele dar lugar a una malla de moléculas espaciadoras no afines en la superficie de la nanopartícula. Dicha estructura de malla alrededor de una molécula interactuante o diana, por ejemplo el conjugado según la presente invención, o una molécula de afinidad adicional como la mencionada anteriormente, la unión inespecífica de moléculas o entidades a la molécula interactuante o diana o la molécula de afinidad o a moléculas en sus proximidades puede reducirse, o abrogarse por completo o evitarse.
En otras realizaciones, la nanopartícula puede estar compuesta o tener una estructura biodegradable. El término "biodegradable", tal y como se utiliza aquí, significa que la nanopartícula puede desmontarse o desintegrarse mediante procesos naturales que tienen lugar en una célula o en el entorno de una célula, es decir, fuera de una célula. En consecuencia, las nanopartículas biodegradables pueden tener una biocompatibilidad mejorada y una buena capacidad de encapsulación de cargas como ácidos nucleicos, proteínas o fármacos de moléculas pequeñas. Las nanopartículas biodegradables pueden prepararse a partir de diversos materiales como proteínas, polisacáridos y polímeros biodegradables sintéticos. La selección del polímero base se basa en diversos diseños y criterios de aplicación final. Depende de muchos factores, como el tamaño de las nanopartículas deseadas, las propiedades de la carga (solubilidad acuosa, estabilidad, etc.) que se va a encapsular en el polímero, las características de la superficie y la funcionalidad, el grado de biodegradabilidad y biocompatibilidad, y el perfil de liberación de la carga del producto final. Dependiendo de la selección de los criterios deseados para la preparación de las nanopartículas, los métodos a utilizar para la producción de nanopartículas biogradables pueden incluir la dispersión de polímeros preformados, la polimerización de monómeros y el método de gelificación iónica para polímeros hidrófilos. Particularmente preferido es el empleo de ácido poli-láctico (PLA), poli -D- L-glicolida (PLG), poli-ε-caprolactona (PCL), poli-D- L-lactida-coglicolida (PLGA) y poli-cianoacrilato (PCA), quitosano, gelatina, Poli-alquil-ciano-acrilatos (PAC). La variante más preferida de las nanopartículas biodegradables son las nanopartículas de PLGA. Por ejemplo, la nanopartícula o las estructuras poliméricas presentes en la superficie de la nanopartícula pueden ser degradables por enzimas como lipasas, esterasas, alcalasas, hidroxilasas, dioxigenasas, etc.
En otras realizaciones específicas de la presente invención, el portador de nanopartículas puede estar asociado o proporcionar un agente penetrante celular. Dicho agente puede ser, por ejemplo, el péptido poliArg TAT, el péptido penetratina, un péptido de poliarginina o polinilisina, un péptido que comprenda secuencias catiónicas de localización nuclear singal , moléculas catiónicas unidas a andamiajes, por ejemplo, péptidos, oliogocarbamatos, loligomas u oligómeros de PNA. Pueden obtenerse más detalles de fuentes bibliográficas adecuadas, como Fillon et al., 2005 J. Am. Chem. Soc, 127, 11798-11803.
En realizaciones específicas, las nanopartículas pueden estar además unidas a moléculas biológicas que dirijan las nanopartículas a sitios específicos dentro del cuerpo, orgánulos específicos dentro de la célula, o para seguir específicamente el movimiento de moléculas individuales de proteína o ARN en células vivas. Dichas moléculas de afinidad pueden incluir, además de los conjugados aquí definidos, aptámeros o péptidos. Estas moléculas de afinidad suelen estar unidas covalentemente a la nanopartícula o a las capas de su superficie. Se prefiere que dichos conjugados o moléculas de afinidad estén presentes en un número controlado por nanopartícula. Las nanopartículas multivalentes, que comprenden más de un conjugado según la presente invención, portadoras de múltiples grupos diana, pueden agrupar receptores, lo que puede activar determinadas vías de señalización celular, y proporcionar un anclaje más fuerte. Las nanopartículas monovalentes, que portan un único grupo de unión o un único conjugado, tienden a evitar la agrupación. En realizaciones preferidas, se proporcionan nanopartículas multivalentes. La cantidad de conjugados por nanopartícula puede ajustarse al tamaño de la nanopartícula. Por ejemplo, en el contexto de la presente invención puede utilizarse una proporción de 2:100 o 5:100 conjugados por nanopartícula.
La unión entre el conjugado según la presente invención y la nanopartícula puede proporcionarse de cualquier forma adecuada. Por ejemplo, la unión puede conseguirse mediante atracciones intermoleculares entre la nanopartícula y la biomolécula, como enlaces covalentes, adsorción, como la quimisorción, e interacciones no covalentes. La unión puede ser, en ciertas realizaciones, una integración de los liposomas en una estructura bicapa, por ejemplo, de una célula. En otras realizaciones, la unión puede llevarse a cabo mediante un ligando unido covalentemente a una estructura receptora de una célula. También se contemplan nanopartículas que penetran en una célula o que se adsorben a una célula. Se prefiere especialmente utilizar una captación de liposomas a través de una vía endosomal. Sin querer estar atado por la teoría, se supone que los liposomas derivados se liberarán en el compartimento endosomal. La liberación de la propia carga de la bicapa del liposoma puede producirse posteriormente mediante lipasas que se supone destruyen el liposoma en el compartimento endosomal tardío o lisosomal. Se prefiere que la liberación de la carga se realice en los endosomas tempranos. Otros factores adicionales que pueden influir en la liberación de la carga son el pH, que puede, en determinadas realizaciones, ser influido o modificado para controlar dicha liberación de la carga. La presente invención prevé además una adaptación de la forma del endosoma a través de la concentración y/o la composición de la bicapa lipídica de los liposomas.
La nanopartícula prevista por la presente invención debe utilizarse como portadora para el transporte de carga. En consecuencia, la nanopartícula está unida a una o más moléculas de carga como las descritas en el presente documento, que suelen estar provistas en la superficie de la partícula. Estas moléculas de carga también pueden estar unidas a la nanopartícula de cualquier forma adecuada, por ejemplo, mediante atracción intermolecular, enlace covalente, adsorción, como la quimisorción, e interacciones no covalentes. La cantidad de carga por nanopartícula puede ajustarse en función del tamaño de la nanopartícula, su material, su forma y el tamaño y/o la forma de la carga. Típicamente, puede darse una proporción de 1 nanopartícula : 1-1000 entidades de carga.
En otras realizaciones, la nanopartícula puede proporcionarse como nanopartícula magnética, por ejemplo, como partícula superparamagnética. Por consiguiente, los materiales preferidos son metales, aleaciones o composiciones magnéticas o ferromagnéticas. Tales partículas pueden utilizarse especialmente en el contexto de las técnicas de obtención de imágenes por resonancia magnética. Se prefiere especialmente que la nanopartícula sea una nanopartícula de oro, plata o hierro.
Las nanopartículas pueden suministrarse como coloide o estar comprendidas dentro de un coloide. El término "coloide", tal como se utiliza aquí, se refiere a un sistema coloidal, en el que las partículas polimoleculares están dispersas en un medio, que tiene al menos una dimensión de entre 1nm y 1µm. Alternativamente, en los sistemas pueden encontrarse discontinuidades a distancias entre 1nm y 1µm. Típicamente, un coloide es una mezcla que tiene partículas sólidas, por ejemplo nanopartículas como las definidas aquí, dispersas en un medio líquido. El término se aplica típicamente si las partículas son mayores que las dimensiones atómicas pero lo suficientemente pequeñas como para mostrar un movimiento browniano, y el diámetro de las partículas suele oscilar entre nanómetros y micrómetros.
El término "portador peptídico" o "portador proteico", tal y como se utiliza aquí, se refiere a estructuras peptídicas o proteicas, tal y como se han definido anteriormente, que cumplen una función de portador. Como tal, el propio péptido o proteína puede estar conectado a una o más moléculas diferentes. Dicha conexión es, por ejemplo, una unión covalente a otra molécula a través de una cadena lateral de un aminoácido. Alternativamente, el péptido o la proteína pueden estar conectados a otros elementos a través de uniones no covalentes, por ejemplo, atracciones intermoleculares, quimisorción, atracciones electrostáticas, etc. En otras realizaciones específicas, el propio péptido o portador de proteína puede tener una o más funciones adicionales. Típicamente, el portador peptídico o proteico puede tener la función de un antígeno o tener una función vacunal, por ejemplo, representar una proteína expuesta o de superficie de un patógeno como una bacteria, un virus, un parásito eucariota o un antígeno o alérgeno del cáncer.
El término "portador de toxinas" o "toxina", tal y como se utiliza aquí en el contexto de los portadores, se refiere a un compuesto tóxico que proporciona al menos dos funcionalidades (a) envenenar, perturbar, matar o dañar un elemento biológico, por ejemplo, una célula o tejido y (b) transportar una carga, por ejemplo, tal y como se define aquí. Para funcionar como carga, la toxina puede estar unida, por ejemplo mediante unión covalente o no covalente, a dicha carga, por ejemplo un antígeno, una molécula pequeña, etc. La unión se optimiza para que el dominio que conduce a la funcionalidad de matar, dañar o envenenar no se vea impedido o influido negativamente. Ejemplos de toxinas a utilizar en el contexto de la presente invención son moléculas pequeñas, péptidos o proteínas. Estos compuestos pueden interactuar con macromoléculas biológicas como enzimas o receptores celulares. Las toxinas pueden variar mucho en cuanto a su toxicidad, desde una toxicidad generalmente menor, como la de una toxina de abeja, hasta una toxicidad grave en el caso de la toxina botulínica. Los portadores de toxinas preferidos según la presente invención son la toxina del cólera, la enterotoxina de E. coli, la toxina de la tos ferina, la toxina botulínica, la toxina C2 de Clostridium botulinum, la toxina iota de Clostridium perfringens o la estreptolisina O.
El portador puede ser además un dendrímero. El término "dendrímero", tal como se utiliza aquí, se refiere a moléculas ramificadas repetitivamente, que tienen una estructura arborescente. Los dendrímeros se caracterizan típicamente por su perfección estructural, y están formados por compuestos esféricos monodispersos y simétricos. Típicamente se considera que los dendrímeros tienen tres partes principales: un núcleo, una envoltura interior y una envoltura exterior. Un dendrímero puede, por ejemplo, estar diseñado para tener una funcionalidad diferente en cada una de estas porciones para controlar propiedades como la solubilidad, la estabilidad térmica y la fijación de compuestos para aplicaciones particulares. Los dendrímeros pueden estar compuestos por un esqueleto de polimetilmetacrilato (PMMA), poliestireno, poliacetileno, polifenileno, politiofeno, polifluoreno, poli(fenileno vinileno), poli(fenileno acetileno), polisiloxano, polioxanorborneno, oligospirocetal, poliglicerol o poli(etileno imina) (PEI), cuyo grupo metilo se sustituye por una estructura dendrónica. Se prefieren especialmente los dendrímeros de PMMA. Los polímeros resultantes pueden diferir en grosor y carga, así como en el peso, oscilando entre estructuras de bajo peso molecular y de alto peso molecular. Los dendrímeros pueden estar unidos o comprender un elemento de carga que se vaya a transportar. Por ejemplo, la carga puede estar unida mediante una unión covalente o no covalente a dicha carga, por ejemplo, un antígeno, una molécula pequeña, etc. La unión puede basarse en la formación de un éster, amida, triazol, amina o éter.
En otras realizaciones, el portador puede ser un fullereno. El término "fullereno", tal como se utiliza aquí, se refiere a una molécula de carbono en forma de esfera hueca, elipsoide o tubo o cualquier otra forma hueca adecuada. Un subtipo de fullerenos es el Buckminsterfullereno o buckyball, que se asemeja a un balón de fútbol y comprende anillos pentagonales y hexagonales. Los fullerenos pueden, en realizaciones específicas, comprender estructuras C69, C79, C76, C82, C84, C86, C88, C90, C92, C94, C96, C98 o C100. Otra alternativa, también contemplada por la presente invención, es un fullereno a base de boro, por ejemplo con una estructura B80. También se contemplan los heterofullerenos que comprenden, por ejemplo, heteroátomos en algunas posiciones, como átomos de boro, nitrógeno, oxígeno o fósforo. En otras realizaciones, los fullerenos pueden proporcionarse como fullerenos metálicos, por ejemplo como barras de grafito dopadas con metales u óxidos metálicos típicamente de la serie Sc, Y, La, lantánidos o elementos actínidos. También se contemplan los metallofullerenos templados con nitruro trimetálico, los clusterfullerenos o las trimetasferas que contienen un átomo central de nitrógeno (nitruro) unido a tres iones metálicos. En realizaciones típicas, los fullerenos pueden funcionalizarse o derivatizarse para aumentar la solubilidad de los fullerenos en medios orgánicos o acuosos, por ejemplo, mediante cicloproponación, polihidroxilación o cicloadición de yluros de azmetileno. En una realización específica, el fullereno puede ser deactivado con radicales libres, lo que permite eliminar las especies reactivas del oxígeno y convierte al fullereno en un antioxidante muy activo. En otra realización, el fullereno puede transportar cargas en una asociación no covalente. Una posibilidad es que la carga, por ejemplo una proteína, un anticuerpo, un ácido nucleico, etc. se asocie a la superficie del fullereno mediante interacciones supramoleculares, o interacciones hidrofóbicas, electrostáticas, etc. En el caso del transporte de carga de ácido nucleico, el portador puede ser preferiblemente un derivado de epóxido de n-tetra(piperazino) fullereno, o un fullereno C60 ciclopropanado, por ejemplo con grupos funcionales neutros, catiónicos o aniónicos. En otras realizaciones, pueden proporcionarse fullereno-inmunoconjugados en los que, por ejemplo, exista un enlace disulfuro entre el fullereno y, por ejemplo, un anticuerpo. En este contexto, se prefiere utilizar un derivado de fullereno malonodiserinolamida C60, que puede permitir la unión no covalente y espontánea entre el anticuerpo o la proteína y el fullereno. En otras realizaciones preferidas, los fullerenos pueden utilizarse en una configuración y derivatización que permita una agregación en estructuras similares a micelas, vesículas o liposomas basadas en fullerenos. Estas estructuras pueden englobar cualquier molécula de fármaco adecuada en su núcleo hidrófobo. En otro grupo de realizaciones, puede haber una unión covalente de las cargas al portador de fullereno. Esto puede proporcionarse típicamente con un elemento enlazador adicional entre el fullereno y la molécula de carga que está presente en la superficie del fullereno. Esto permite, entre otras cosas, retrasar la liberación de la carga. También se prevén glicofullerenos que pueden conectarse a otras entidades mediante la formación de enlaces triazol. El especialista conocerá más detalles o podrá obtenerlos de fuentes bibliográficas adecuadas como Bolskar, 2016, Encyclopedia of Nanotechnology, Springer, o Muñoz et al., 2016, Nature Chemistry, 8, 50-57.
En otras realizaciones, el portador puede tener la forma de un nanotubo de carbono. El término "nanotubo de carbono", tal y como se utiliza aquí, se refiere a alótropos de carbono con una nanoestructura cilíndrica. Estas moléculas cilíndricas de carbono suelen tener propiedades inusuales, que pueden utilizarse para actividades de transporte y entrega de carga. Los nanotubos de carbono muestran típicamente una resistencia y rigidez muy elevadas. Suelen construirse con una relación longitud-diámetro de hasta 132.000.000:1. Además, los nanotubos de carbono suelen tener una elevada conductividad térmica. Suelen tener una estructura larga y hueca con paredes formadas, por ejemplo, por láminas de carbono de un átomo de grosor, que suelen denominarse grafeno. Estas láminas suelen enrollarse en ángulos específicos y discretos, y la combinación del ángulo de enrollado y el radio puede decidir las propiedades de los nanotubos en cuanto a resistencia, rigidez, etc. Los nanotubos suelen clasificarse en nanotubos de pared simple (SWNT) y nanotubos de pared múltiple (MWNT), ambos contemplados en la presente invención. Los nanotubos pueden alinearse además en estructuras similares a cuerdas, que se supone que se mantienen unidas por fuerzas de van der Waals.
En general, se considera que los nanotubos de carbono pertenecen a la familia estructural de los fullerenos. En ciertas realizaciones de la presente invención, los nanotubos de carbono pueden modificarse como se ha descrito anteriormente en el contexto de los fullerenos. Se prefieren especialmente los enlaces entre nanotubos de carbono y ácidos nucleicos, proteínas y péptidos. También se prevén modificaciones mediante ácidos carboxílicos libres, que pueden conectarse a otras entidades mediante la formación de enlaces éster o amina.
En determinadas realizaciones, el portador tal y como se define en el presente documento puede utilizarse con o sin carga. En caso de que el portador se utilice sin carga, puede proporcionar por sí mismo una funcionalidad como la descrita en el presente documento. En otras realizaciones, el portador comprende o está asociado a una carga. La forma en que la carga se conecta al portador puede depender de la forma/naturaleza del portador, así como de la forma/naturaleza de la carga. En algunos casos puede preverse una unión covalente, mientras que en otros puede utilizarse una unión electrostática. En algunas otras realizaciones, la asociación puede basarse en una incrustación de los elementos de la carga en un liposoma o una estructura similar. Por ejemplo, la carga puede estar localizada dentro del portador y/o estar unida al exterior del portador y/o estar integrada en una estructura monocapa o bicapa del portador, por ejemplo un liposoma como se ha mencionado anteriormente.
El término "carga", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier sustancia, compuesto o elemento adecuado, que se encuentre en el interior del portador tal y como se ha definido anteriormente y/o esté unido o asociado al exterior, por ejemplo, a la superficie, del portador y/o esté integrado en una estructura monocapa o bicapa del portador, por ejemplo, en caso de que el portador sea una entidad que comprenda una membrana o bicapa como un liposoma y deba transportarse al interior de una célula, a un compartimento celular específico, por ejemplo, un endosoma, o a la superficie o los alrededores de una célula. Se prefiere que la carga se descargue en el interior de una célula. Se prefiere que la carga proporcione o medie un efecto beneficioso para la célula, el tejido que comprende la célula o el organismo que comprende la célula en un contexto médico. Ejemplos de tales efectos beneficiosos son la actividad/capacidad terapéutica, la actividad/capacidad diagnóstica, tras la administración a una célula o en su interior. Esto puede realizarse in vivo, pero también, en ciertas realizaciones, ex vivo, por ejemplo en un entorno in vitro, normalmente con la opción de reintroducirlo posteriormente en el organismo, por ejemplo mediante reimplantación de células. El término "actividad terapéutica" puede incluir el tratamiento, la mejora y/o la profilaxis/evitación de una enfermedad o afección médica. El término "actividad diagnóstica" puede incluir la visualización, detección, distinción y/o identificación de una condición patológica/médica y la atribución de la desviación a un cuadro clínico.
Preferiblemente, una "carga" se refiere, pero no se limita, a una molécula pequeña, un péptido, una proteína, una sustancia citotóxica, un ácido nucleico, un pigmento, un colorante, un metal, un radionucleido, un virus, un virus modificado, un vector viral, un inoculante, un plásmido y/o un sistema multicomponente.
Un "péptido" o una "proteína", tal como se utilizan en el presente documento en el contexto de la carga, es un péptido tal como se define en el presente documento o una proteína tal como se define en el presente documento. Se prefiere que dicho péptido o proteína cumpla una función para la célula a la que se transporta la carga, o para el organismo que comprende dicha célula. Dicha función puede ser una función terapéutica o de diagnóstico . El péptido o la proteína puede proceder de cualquier categoría adecuada. Por ejemplo, puede ser un elemento antigénico, un anticuerpo, una enzima, un alérgeno, una toxina, una entidad catalizadora, un receptor, etc. En realizaciones específicas, la proteína como parte de la carga según la presente invención puede seleccionarse del grupo que comprende: proteínas terapéuticas, proteínas suicidas, proteínas supresoras de tumores, factores de transcripción, inhibidores de quinasas, quinasas, proteínas reguladoras, proteínas apoptóticas, proteínas antiapoptóticas, antígenos microbianos, antígenos víricos, antígenos bacterianos, antígenos parasitarios, antígenos celulares, antígenos cancerígenos, factores de diferenciación, factores de inmortalización, toxinas proteicas/peptídicas, enzimas, hormonas peptídicas/proteicas, moléculas de adhesión peptídicas/proteicas, moléculas receptoras, inhibidores peptídicos o agentes antienvejecimiento peptídicos/proteicos.
El término "proteína terapéutica", tal como se utiliza aquí en el contexto de la carga, se refiere a cualquier proteína que tenga un efecto terapéutico en el cuerpo animal, en particular en el cuerpo humano, tal como lo conoce un especialista en la materia. Típicamente, el término se refiere a una enzima terapéutica. Ejemplos de tales enzimas son la alglucerasa, que puede utilizarse en el tratamiento de la deficiencia de glucocerebrosidasa lisosomal (enfermedad de Gaucher), la alfa-L-iduronidasa, que puede utilizarse en el tratamiento de la mucopolisacaridosis I o la adenosina deaminasa, que puede utilizarse en el tratamiento del síndrome de inmunodeficiencia combinada grave.
El término "proteína suicida", tal como se utiliza aquí en el contexto de la carga, se refiere a cualquier proteína, que conduce a la destrucción de una célula debido a la acción de la proteína, típicamente debido a una reacción enzimática en presencia de un sustrato correspondiente. Ejemplos de tales proteínas son las nucleósido quinasas, como la TK del VHS-1 o la desoxirribonucleósido quinasa multisustrato de Dm-dNK.
El término "proteína supresora de tumores", tal y como se utiliza aquí en el contexto de la carga, se refiere a cualquier proteína que proteja a una célula de un paso en el camino hacia el cáncer. Preferiblemente, el término se refiere a cualquier proteína de este tipo conocida por el especialista en la materia. Más preferentemente, el término se refiere a la proteína Rb, el supresor tumoral p53, APC y CD95.
El término "factor de transcripción", tal y como se utiliza aquí en el contexto de la carga, se refiere a cualquier proteína, que se une a partes específicas del ADN utilizando dominios de unión al ADN y forma parte del sistema que controla la transcripción de la información genética del ADN al ARN, tal y como conoce el especialista en la materia. Preferiblemente, el término se refiere a TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH y la proteína de unión a TATA (TBP). El término "inhibidores de la cinasa", tal como se utiliza aquí en el contexto de la carga, se refiere a cualquier proteína, que es un tipo de inhibidor enzimático que bloquea específicamente la acción de la proteína cinasa. Preferiblemente, el término se refiere a Erbitux (cetuximab), y herceptin. Por supuesto, la presente invención también contempla el uso de inhibidores de la proteína cinasa que no sean proteínas, que pueden ser, por ejemplo, pequeñas moléculas orgánicas, tal como se definen en el presente documento.
El término "cinasa", tal y como se utiliza aquí en el contexto de la carga, se refiere a cualquier proteína que transfiere grupos fosfato de moléculas donantes de alta energía, como el ATP, a moléculas diana específicas. Preferentemente, el término se refiere a la tirosina quinasa o MAP quinasa, MEK1 o MEK2.
El término "proteína apoptótica", tal y como se utiliza aquí en el contexto de la carga, se refiere a cualquier proteína que provoque la muerte celular programada en organismos multicelulares. Más preferentemente, el término se refiere a la proteína pro-apoptótica BAX, BID, BAK o BAD.
El término "proteína antiapoptótica", tal y como se utiliza aquí en el contexto de la carga, se refiere a cualquier proteína que impida la muerte celular programada en organismos multicelulares. Preferiblemente, el término se refiere a la proteína anti-apoptótica como BcI-XI, Bcl-2, y otros miembros de la familia Bcl-2.
Los términos "antígenos microbianos", "antígenos víricos", "antígenos bacterianos", "antígenos parasitarios" y "antígenos celulares" en el contexto de las moléculas de carga se refieren a inmunógenos, que son capaces de estimular una respuesta inmunitaria derivada de microbios, virus, bacterias, parásitos o células, respectivamente, en particular como se define a continuación.
Un "factor de diferenciación", tal como se utiliza aquí en el contexto de la carga, se refiere a cualquier factor, que funciona predominantemente en el desarrollo y conduce a la diferenciación de tejidos, grupos celulares de células específicas. Preferentemente, el término se refiere a factores de diferenciación del crecimiento (GDF) como GDF1, GDF2, GDF3, GDF5, GDF6, GDF8, GDF9, GDF10, GDF11 y GDF15.
El término "factores de inmortalización", tal como se utiliza aquí en el contexto de la carga, se refiere a cualquier factor que provoque la ausencia de un aumento sostenido de la tasa de mortalidad de una célula en función de la edad cronológica. Preferiblemente, el término se refiere a cualquier factor de este tipo conocido por el especialista en la materia. Más preferentemente, el término se refiere a la telomerasa o al antígeno T grande.
El término "hormona peptídica/proteica", tal como se utiliza aquí en el contexto de la carga, se refiere a cualquier compuesto que transporta como mensajero una señal de una célula (o grupo de células) a otra a través de la sangre. Más preferentemente, el término se refiere a la prostaglandina, la serotonina, la histamina, la bradiquinina, la calidina y las hormonas gastrointestinales, las hormonas liberadoras, las hormonas hipofisarias, la insulina, la vasopresina (ADH), el glucagón, la encefalina, la calcitonina, los corticosteroides, la hormona liberadora de corticotropina (CGRl), la sustancia P, la GRP, la MSH y los neuromediadores.
El término "molécula peptídica/proteínica de adhesión", tal como se utiliza aquí en el contexto de la carga, se refiere a péptidos o proteínas de la superficie celular implicados en la unión con otras células o con la matriz extracelular (MEC) en un proceso de adhesión celular. Preferiblemente el término se refiere a cualquier molécula de este tipo conocida por el especialista en la materia. Más preferentemente, el término se refiere a las CAM IgSF como NCAM, ICAM-1, VCAM-1, PECAM-1, L1, CHL1, MAG, integrinas o selectinas.
El término "moléculas-receptoras", tal y como se utiliza aquí en el contexto de la carga, se refiere a proteínas en la membrana celular o dentro del citoplasma o núcleo celular que se unen a un ligando y suelen transducir una señal. Preferentemente, el término se refiere a receptores metabotrópicos, receptores acoplados a proteínas G, receptores muscarínicos de acetilcolina, receptores de adenosina , adrenoceptores, receptores GABA, receptores de angiotensina, receptores cannabinoides, receptores de colecistoquinina, receptores de dopamina, receptores de glucagón, receptores metabotrópicos de glutamato, receptores de histamina, receptores olfativos, receptores opioides, receptores de quimioquinas, receptores sensores de calcio, receptores de somatostatina, receptores de serotonina o receptores de secretina.
El término "inhibidores peptídicos", tal como se utiliza aquí en el contexto de la carga, se refiere a los péptidos que tienen un efecto inhibidor sobre las funciones fisiológicas, preferentemente sobre la función de las proteínas, como las funciones enzimáticas.
El término "agente antienvejecimiento proteínico/péptido", tal como se utiliza aquí en el contexto de la carga, se refiere a cualquier compuesto que previene, ralentiza o invierte los efectos del envejecimiento. Preferiblemente, el término se refiere a la hormona del crecimiento humano (HGH).
El término "sustancia citotóxica", tal y como se utiliza aquí, se refiere en general a cualquier compuesto que sea tóxico para una célula viva, en particular para una célula de eucariotas superiores, más concretamente, para una célula de mamífero o humana. Como resultado de la acción de una sustancia citotóxica, la célula puede sufrir necrosis, la célula puede dejar de crecer actividad o la división, o la célula puede someterse a un programa de apoptosis. Normalmente, las células que sufren necrosis muestran una rápida hinchazón, pierden la integridad de la membrana, disminuyen su metabolismo y liberan contenido al medio ambiente. Por el contrario, la apoptosis se caracteriza por ciertos acontecimientos citológicos y moleculares que incluyen un cambio en el índice de refracción de la célula, la contracción del citoplasma, la condensación nuclear y la escisión del ADN en fragmentos de tamaño regular. La citotoxicidad puede medirse de acuerdo con ensayos adecuados, por ejemplo, midiendo la integridad de la membrana celular. La sustancia citotóxica puede ser, en caso de tratamiento contra el cáncer, un compuesto quimioterapéutico. Alternativamente, la sustancia citotóxica también puede ser un anticuerpo que transmita citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC), en la que las células son eliminadas por linfocitos que han sido unidos por un anticuerpo. Algunos ejemplos de linfocitos citotóxicos son las células T citotóxicas y las células asesinas naturales.
El término "compuesto quimioterapéutico", tal y como se utiliza aquí en el contexto de la carga, se refiere a compuestos de varias clases funcionales diferentes, que se emplean para el tratamiento terapéutico de células cancerosas. Los compuestos pueden ser, por ejemplo, agentes alquilantes, antraciclinas, disruptores del citoesqueleto (taxanos), epotilonas, inhibidores de la histona deacetilasa, inhibidores de la topoisomerasa I y II, inhibidores de la cinasa, análogos de nucleótidos o análogos de precursores, antibióticos peptídicos, agentes basados en platino, retinoides, alcaloides de vinca y derivados de los mismos. Un ejemplo aquí previsto de agente alquilante es la ciclofosfamida, que es un metabolito de la mostaza fosforamida que se forma en las células que contienen un bajo nivel de ALDH (aldehído deshidrogenasa), por ejemplo, en el hígado, el intestino o las células madre de la médula ósea. El metabolito suele entrecruzar el ADN en la posición N-7 de la guanina, lo que se supone que conduce a la apoptosis celular. Otro ejemplo es la mecloretamina, que típicamente entrecruza el ADN en la posición de guanina N-7 y evita así la duplicación celular, lo que conduce a la apoptosis celular. Otro ejemplo es el clorambucilo, que promueve la alquilación del ácido nucleico y entrecruza el ADN, lo que conduce a la detención del ciclo celular. Este compuesto puede ser detoxificado por la glutatión transferasa humana Pi (GST P1-1), a menudo sobreexpresada en el tejido canceroso. Otros ejemplos son las nitrosoureas, que son agentes lipofílicos alquilantes del ADN y, por tanto, pueden atravesar la barrera hematoencefálica. También se contempla el temozolomid que promueve la alquilación/metilación del ADN de la guanina en la posición O-6/ n-7. Puede utilizarse además como profármaco en forma de derivado de la imidazotetrazina. Una O-6-alquilguanina ADN alquiltransferasa codificada como O-6-metilguanina-ADN metiltransferasa puede prevenir el daño celular. Entre los ejemplos previstos de antraciclinas se incluyen la daunorrubicina, la doxorrubicina, la epirrubicina, la idarrubicina, la mitoxantrona, la pixantrona, la losoxantrona, la sabarrubicina (que es un análogo disacárido de la doxorrubicina) y la valrubicina (que es un análogo semisintético de la doxorrubicina). Estos compuestos funcionan típicamente como intercaladores del ADN e inhiben así, por ejemplo, la topoisomerasa II. Entre los ejemplos previstos de disruptores del citoesqueleto (taxanos) se incluyen el paclitaxel, el docetaxel, el abraxane y el taxotere. Estos compuestos se dirigen típicamente a la tubulina, en particular mediante la unión de la subunidad del heterodímero αβ-tubulina, lo que provoca defectos en el ensamblaje del huso mitótico, la segregación cromosómica y la división celular. Los ejemplos de epotilonas aquí contemplados incluyen las epotilonas A a F. Otros ejemplos son la ixabepilona, la patupilona y la utidelona. Estos compuestos provocan la interferencia de la tubulina. Tienen una mejor hidrosolubilidad que los compuestos similares al paclitaxel, lo que puede conducir a una mayor eficacia. Entre los ejemplos previstos de inhibidores de la histona deacetilasa se incluyen el vorinostat y la romidepsina. Estos compuestos se unen típicamente a sitios activos dependientes de zink y funcionan como quelantes de iones de zinc, lo que conduce a la acumulación de proteínas acetiladas, en particular histonas. Entre los ejemplos previstos de inhibidores de la topoisomerasa I se incluye el irinotecán. El irinotecán se une a la topoisomerasa I y forma un complejo ternario de ADN, que impide la religacion del ADN y causa daños en el ADN. Otros ejemplos incluyen el topotecán. Silatecan, cositecan, exatecan, lurtotecan, gimatecan, belotecan y rubitecan, que son derivados semisintéticos de la campotecina.Los ejemplos aquí previstos de inhibidores de la topoisomerasa II incluyen el etopósido, que forma un complejo ternario con el ADN y la enzima topoisomerasa II, impidiendo la religacion del ADN. También se contempla el tenipósido, que estabiliza los intermediarios topoisomerasa II-ADN e induce roturas de ADN de doble cadena. Otro ejemplo es el taflupósido. Entre los ejemplos previstos de inhibidores de la cinasa se incluye el bortezomib, que es un inhibidor del proteasoma, en el que su átomo de boro se une al sitio catalítico del proteasoma 26S. Otros ejemplos son el erlotinib y el gefitinib, que inhiben la tirosina cinasa EGFR uniéndose de forma reversible a un sitio de unión del ATP, y evitando así una cascada de señales. También se contempla el vemurafenib, que provoca la interrupción de la vía B-Raf/MEK/ERK si B-Raf tiene una mutación V600E. También se contempla el imatinib, que es un inhibidor de una serie de enzimas tirosina quinasa. Normalmente ocupa los sitios activos de las TK para disminuir la actividad de bcr-abl, por ejemplo en la leucemia mielógena crónica en la que se produce la fusión de abl con bcr. También está previsto el vismodegib, que es un antagonista ciclopamina-competitivo del receptor smoothened (SMO, una parte de la vía de señalización hedgehog). Puede utilizarse específicamente para el carcinoma basocelular. Entre los ejemplos previstos de análogos de nucleótidos o precursores se incluyen la azacitidina (que es un análogo del nucleósido citidina y causa hipometilación a bajas concentraciones y puede provocar citotoxicidad a altas concentraciones), la azatioprina (que inhibe la síntesis de purinas), la capecitabina, la citarabina (que combina la base citosina con el azúcar arabinosa y es un agente antimetabólico; actúa mediante la incorporación al ADN de la citosina desoxirribosa humana y suele inducir la muerte celular), doxifluridina (que es un metabolito de la capecitabina), fluorouracilo (que es un inhibidor de la timidilato sintasa que bloquea la síntesis de pirimidina-timidina), gemcitabina (que suele integrarse como citidina en la cadena de ADN, lo que provoca errores irreparables y la muerte celular) hidroxiurea (que es un inhibidor de la ribonucleótido reductasa al eliminar los radicales libres tirosilo y suele disminuir la producción de desoxirribonucleótidos), mercaptopurina (que inhibe la xantina oxidasa), metotrexato (que inhibe la síntesis de ADN, ARN, timidilatos y proteínas) y tioguanina (que es un análogo de la guanina y provoca la inhibición de la síntesis de nucleótidos de guanina). Los ejemplos aquí previstos de antibióticos peptídicos incluyen la bleomicina (que conduce a la inducción de roturas de la cadena de ADN) y la actinomicina (que se une al ADN en el complejo de iniciación de la transcripción y, por tanto, impide la elongación del ARN). Los ejemplos aquí previstos de agentes basados en el platino incluyen el carboplatino, el cisplatino (que interfiere en la replicación del ADN al unirse y entrecruzar el ADN) y el oxaliplatino (que interfiere en la replicación del ADN al unirse y entrecruzar el ADN). Los ejemplos de retinoides aquí contemplados incluyen la tretinoína (que se ha demostrado que fuerza la diferenciación celular de la leucemia promielocítica aguda y detiene la proliferación), la alitretinoína (que se supone que es un ligando endógeno del receptor X retinoide) y el bexaroteno (que activa los receptores X retinoides e induce la diferenciación celular y la apoptosis). Entre los alcaloides de la vinca y sus derivados se incluyen la vinblastina, la vincristina, la vindesina y la vinorelbina, que se supone que actúan como inhibidores de los microtúbulos.
La presente invención, en otra realización, prevé en particular el empleo de la alfa amantina y sus análogos o derivados como sustancia tóxica. Estos compuestos inhiben tapcialmente la ARN polimerasa II y III. En realizaciones específicas, la alfa amanitina o sus análogos o derivados pueden unirse a una proteína o péptido y transportarse en esta forma como carga a un destino deseado, es decir, una célula o tejido.
Según su modo de acción, las sustancias tóxicas anteriormente caracterizadas pueden emplearse para la administración intracelular o extracelular. Por consiguiente, pueden suministrarse en sistemas portadores que administren la carga intracelularmente, tal como se define en el presente documento, o que administren la carga extracelularmente, tal como se define en el presente documento.
El término "molécula pequeña", tal como se utiliza aquí en el contexto de la carga, se refiere a moléculas, por ejemplo moléculas orgánicas, que son terapéuticamente útiles y, preferentemente, incluyen fármacos u otros agentes biológica, terapéutica o diagnósticamente activos, que actúan para garantizar el correcto funcionamiento de una célula, o moléculas que pueden inducir, por ejemplo, la apoptosis o la lisis celular, cuando se desea la muerte de una célula, como una célula cancerosa o aberrante, o que inducen reacciones inmunológicas, o que marcan funcionalidades. La molécula pequeña tiene típicamente un peso molecular bajo, inferior a 900 Da. Típicamente, se supone que las moléculas pequeñas que tienen un peso molecular de unos 900 Da o menos son capaces de difundirse rápidamente a través de las membranas celulares. En consecuencia, las moléculas pequeñas pueden proporcionarse como cargas para ser administradas intracelular y/o extracelularmente. Una molécula pequeña puede, en ciertas realizaciones, tener solubilidades pobres en líquidos acuosos, como el suero y la solución salina acuosa. Así, los compuestos cuyas eficacias terapéuticas están limitadas por sus bajas solubilidades, pueden administrarse en dosis mayores según la presente invención, y pueden ser más eficaces sobre una base molar debido a los mayores niveles de captación por las células. Asimismo, los compuestos pueden ser eficaces ya en concentraciones bajas o muy bajas. Así, al dirigirse específicamente estos compuestos como cargas de acuerdo con la presente invención a células específicas, se evita una administración sistémica y bastante inespecífica y, por tanto, se permite reducir la cantidad total de compuesto a administrar. Ejemplos de pequeñas moléculas previstas para ser transportadas como cargas según la presente invención son, por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, agentes antivirales, agentes antiproliferativos, citostáticos, agentes inmunosupresores, antagonistas de los receptores de histamina, vitaminas, agentes analgésicos, agentes antineoplásicos, agentes antiinflamatorios, moléculas orgánicas terapéuticas, inhibidores, por ejemplo, inhibidores enzimáticos como los inhibidores de quinasas y similares. Algunos ejemplos de agentes antibacterianos son los aminoglucósidos, como la neomicina o la gentamicina, polimixina, cloranfenicol, bacitracina, framicetina, enrofloxacina, marbofloxacina, miconazol, sulfadiazina de plata, povidona yodada, clorhexidina y ácido acético. Entre los ejemplos de agentes antifúngicos contemplados se incluyen los antifúngicos polienicos (como la anfotericina B, la candicidina o la hamicina, etc.), los imidazoles (como el bifonazol, el butoconazol o el clotrimazol, etc.), los triazoles (como el albaconazol, el efinaconazol o el epoxiconazol, etc.), los tiazoles (como la abafungina), las alilaminas y las equinocandinas. Entre los ejemplos de agentes antivirales aquí contemplados se incluyen la amantadina, la rimantadina, el pleconaril, el aciclovier, la zidovudina, la lamivudina (que es un inhibidor de la transcripción inversa) y la rifampicina (que es un inhibidor del ensamblaje). Los ejemplos de citostáticos aquí previstos incluyen agentes alquilantes, por ejemplo, como los definidos anteriormente; antimetabolitos como el metotrexato, la azotioprina, la mercaptopurina o el fluorouracilo, como los definidos anteriormente. Entre los agentes inmunosupresores se incluyen glucocorticoides como prednisona, dexametasona, hidrocortisona; citostáticos; anticuerpos; fármacos que actúan sobre las inmunofilinas como ciclosporina, tacrolimus, sirolimus o everolimus; así como interferones, opioides, proteínas de unión a TNF alfa, micofenolato, fingolimod y miriocina. Ejemplos aquí previstos de antagonistas de los receptores de histamina son la cimetidina, la ranitidina, la famotidina y la zizatidina. Algunos ejemplos de agentes analgésicos son el paracetamol, la fenacetina, la aspirina, el ibuprofeno, el naproxeno y los opiáceos como la morfina. Algunos ejemplos de agentes antineoplásicos son los análogos de nucleósidos, los antifolatos, los inhibidores de la topoisomerasa I, las antraciclinas, las podofilotoxinas, los taxanos, los alcaloides de la vinca, los agentes alquilantes, los compuestos de platino, los inhibidores de la tirosina cinasa, los inhibidores de la mTOR, los retinoides, los agentes inmunomoduladores y los inhibidores de la histona deacetilasa, por ejemplo, los definidos anteriormente. Entre los ejemplos previstos de agentes antiinflamatorios se incluyen los anticuerpos antiinterleucina, las resolvinas, los glucocorticoides, los inhibidores de la proteasa, las estatinas, los inhibidores de la histona deacetilasa, los agonistas de la prostaglandina, los inhibidores de la fosfodiesterasa-4, los agonistas del receptor activador del proliferador de peroxisomas, los inhibidores del sistema del complemento, los anticoagulantes y los trombolíticos.
El término "ácido nucleico", tal como se utiliza aquí en el contexto de la carga, se refiere a cualquier ácido nucleico conocido por el especialista en la materia, por ejemplo, un polinucleótido como ADN, ARN, ADN monocatenario, ADNc o derivados de los mismos. Preferentemente, el término se refiere a oligonucleótidos y polinucleótidos formados por ADN y ARN, y análogos de los mismos, que tienen secuencias seleccionadas diseñadas para la hibridación con dianas complementarias, como secuencias antisentido para dianas monocatenarias o bicatenarias, o para expresar transcritos de ácidos nucleicos o proteínas codificadas por las secuencias. El ADN puede suministrarse en forma de, por ejemplo, ADN-A, ADN-B o ADN-Z. Los análogos incluyen análogos cargados y, preferiblemente, no cargados de la columna vertebral, como fosfonatos, metilfosfonatos, fosforamidatos, preferiblemente N-3' o N-5', tiofosfatos, polímeros no cargados basados en morfolinos, PNAs, o CNAs, HNAs, LNAs o ANAs. Tales moléculas pueden utilizarse en una variedad de regímenes terapéuticos, incluyendo, por ejemplo, la terapia de sustitución enzimática, la terapia génica o la terapia antisentido. El ARN puede estar en forma de, por ejemplo, ARN-p, es decir, ARN-piranosil o formas estructuralmente modificadas como el ARN de horquilla o un ARN de bucle de tallo. Además, el término se refiere al ARN antisentido. La proteína, el ARN o el ribosoma codificados por el ácido nucleico pueden, por ejemplo, estar infrarrepresentados, ser defectuosos o inexistentes en la célula y el ARN antisentido codificado por el ácido nucleico puede permitir la eliminación de una función no deseada de una molécula. El término "PNA" se refiere a un ácido nucleico peptídico, es decir, un polímero sintetizado artificialmente similar al ADN o al ARN, que se utiliza en la investigación biológica y los tratamientos médicos, pero que no se conoce que se produzca de forma natural. La columna vertebral del PNA se compone típicamente de unidades repetidas de N-(2-aminoetil)-glicina unidas por enlaces peptídicos. Las diversas bases de purina y pirimidina están unidas a la espina dorsal por enlaces de metileno carbonilo. Los PNA se representan generalmente como péptidos, con el N-terminal en la primera posición (izquierda) y el C-terminal a la derecha. El término "CNA" se refiere a un ácido nucleico aminociclohexiletano. Además, el término se refiere a un ácido nucleico de ciclopentano, es decir, una molécula de ácido nucleico que comprende, por ejemplo, 2'-desoxicarbaguanosina. El término "HNA" se refiere a los ácidos nucleicos de hexitol, es decir, análogos del ADN que se construyen a partir de nucleobases estándar y un esqueleto de 1,5-anhidrohexitol fosforilado. El término "LNA" se refiere a los ácidos nucleicos bloqueados. Típicamente, un ácido nucleico bloqueado es un nucleótido de ARN modificado y, por tanto, inaccesible. La fracción de ribosa de un nucleótido LNA puede modificarse con un puente adicional que conecta los carbonos 2' y 4'. Dicho puente bloquea la ribosa en una conformación estructural 3'-endo. La conformación de ribosa bloqueada mejora el apilamiento de bases y la preorganización de la columna vertebral.
Esto puede aumentar significativamente la estabilidad térmica, es decir, la temperatura de fusión del oligonucleótido. El término "ANA" se refiere a los ácidos nucleicos arabinoicos o sus derivados. Un derivado preferido de ANA en el contexto de la presente invención es un 2'-desoxi-2'-fluoro-beta-D-arabinonucleósido (2'F-ANA). En otra realización preferida, las moléculas de ácido nucleico pueden comprender una combinación de cualquiera de los siguientes: ADN monocatenario, ARN, PNA, CNA, HNA, LNA y ANA. En realizaciones específicas de la presente invención, el ácido nucleico, tal como se ha definido anteriormente, codifica para una proteína o péptido de interés, por ejemplo, una proteína terapéutica o una proteína inmunológicamente activa, o una proteína detectable en el diagnóstico, por ejemplo, una proteína bioluminiscente, es decir, una proteína o péptido que se pretende administrar a la célula diana, es decir, la célula Langerina<+>. Dichas proteínas pueden ser, en realizaciones preferidas, antígenos cancerígenos o proteínas tóxicas, etc., tal y como se definen a continuación. En consecuencia, el ácido nucleico proporciona elementos que permiten la expresión de las proteínas codificadas en un contexto celular, como un promotor, un terminador, ambos operativamente ligados al gen, o elementos que permiten una integración en el genoma de una célula, o elementos que permiten la presencia permanente o transitoria en el núcleo, por ejemplo como entidad extracromosómica. Por ejemplo, el ácido nucleico puede proporcionarse en forma de plásmido, tal como se define a continuación.
El término "pigmento", tal como se utiliza aquí en el contexto de la carga, se refiere a cualquier material que cambia el color de la luz reflejada o transmitida como resultado de la absorción selectiva de la longitud de onda. Este proceso físico difiere de la fluorescencia, la fosforescencia y otras formas de luminiscencia, en las que un material emite luz. Los pigmentos no suelen ser solubles en agua. En un ejemplo, el pigmento puede ser una sustancia inorgánica. Alternativamente, el pigmento también puede ser de naturaleza orgánica. Típicamente, el pigmento puede ser insoluble en líquidos acuosos. En determinadas realizaciones, el pigmento puede tener un tamaño superior a 1 µm. Ejemplos de pigmentos adecuados son los hemo o a base de porfirinas como la clorofila, la bilirrubina, la hemocianina, la hemoglobina, la mioglobina, los carotenoides, los hematocromos, los carotenos como el alfa y el beta caroteno, licopeno o rodopsina, xantofilas como la cantaxantina, la zeaxantina o la luteína, fitocromos, ficobiliproteínas, enolatos de polieno, melanina, urocromo, flavonoides.
El término "tinte", tal como se utiliza aquí en el contexto de la carga, se refiere a una sustancia coloreada que absorbe algunas longitudes de onda específicas de la luz visible, que se aplica típicamente en una solución acuosa. En un ejemplo típico, el colorante es una molécula pequeña insoluble en agua. Ejemplos de tintes adecuados son los tintes de acridina, los tintes de antraquinona, los tintes de arilmetano como los tintes de diarilmetano, los tintes de triarilmetano, los tintes azoicos, los tintes de diazonio, los tintes nitro basados en el grupo funcional nitro, los tintes nitrosos basados en el grupo funcional nitroso, tintes de ftalocianina, tintes de quinona-imina como los tintes de eurhodina o los tintes de safranina, indaminas, tintes de indofenol, tintes de oxazona, tintes de tiazina, tintes de tiazol, tintes de xanteno, tintes de fluoreno, tintes de pironina, tintes de fluorona o tintes de rodamina. Se prefieren especialmente la fluoresceína, la rodamina, la ficoeritrina, la fluorescamina y la rodopsina.
En ciertas realizaciones, la presente invención también prevé el empleo de otros compuestos que proporcionen color (por ejemplo, como carga que se transportará a una célula/en el interior de una célula), como compuestos quimioluminiscentes, por ejemplo, luminal, imidazol, proteínas bioluminiscentes, por ejemplo, luciferina, luciferasa, proteína verde fluorescente (GFP), mCherry, mOrange, TagBFP, Cerulean, Citrine, mTurquoise.p. ej. luciferina, luciferasa, proteína verde fluorescente (GFP), mCherry, mOrange, TagBFP, Cerulean, Citrine, mTurquoise, proteína roja fluorescente (RFP), proteína amarilla fluorescente (YFP) y derivados de las mismas como EGFP, ECFP, BFP, EBFP, EBFP2 o BFP. Otros compuestos que proporcionan color y que pueden utilizarse en el contexto de la presente invención son 6-FAM, HEX, TET, ROX, Cy2, Cy3, Cy5, Cy7, Texas Red o Rodamina, PerCP, Pacific Blue, APC, Alexa 405, 430, 488, 546, 559, 594, 633, 660, 674, 680, 700, Cascade Blue, TAMRA, Dabcyl, Black Hole Quencher, BHQ-1 o BHQ-2.
En ciertas realizaciones, el término también se extiende a los agentes de formación de imágenes. Ejemplos de tales agentes de formación de imágenes son los agentes de diagnóstico por imagen o de contraste. Se contemplan, por ejemplo, agentes infrarrojos cercanos y fotoacústicos, por ejemplo para aplicaciones in vivo.
El término "metal", tal como se utiliza aquí en el contexto de la carga, se refiere a cualquier metal conocido por el especialista en la materia. Preferentemente, el término se refiere a oro, platino, osmio, plata, hierro, metales lantánidos o metales actínidos. En otra realización, el término también se refiere a un metal radiactivo.
El término "radionucleido", tal como se utiliza aquí en el contexto de la carga, se refiere a un nucleido radiactivo o isótopo radiactivo, que como exceso de energía nuclear que lo hace inestable. Los radionucleidos pueden ser radionucleidos emisores alfa, radionucleidos emisores beta o radionucleidos emisores de electrones Auger. Algunos ejemplos de radionucleidos adecuados son 3H, 14C, 32P, 33P, 35S, 125I, 11C, 13N, 15O, 18F, 64Cu, 67Cu, 89Sr, 99Tc, 99mTc, 153Sm,123I, 125I, 129I, 131I, 77Br, 82Rb, 68Ga o 18F, 90Y, 177Lu, 166Ho, 186Re, 188Re, 149Pm, 199Au y 105Rh. Los radionucleidos pueden formularse además en composiciones adecuadas o unirse a moléculas o portadores adicionales.
El término "virus", tal como se utiliza aquí en el contexto de la carga, se refiere a cualquier tipo de virus conocido por el especialista en la materia. Preferiblemente, un virus se selecciona del grupo que consiste en adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes, virus simplex, lentivirus y retrovirus. El término, en realizaciones particularmente preferidas, se refiere a un virus capaz de provocar una respuesta inmunológica, por ejemplo en forma de vacuna.
El término "virus modificado", tal y como se utiliza aquí en el contexto de la carga, se refiere a una molécula de virus que ha sido alterada en comparación con un virus de tipo silvestre. Dicha modificación puede dar lugar preferentemente a una disminución de la vitalidad o influir en las capacidades de unión o interacción del virus, como sabrá el especialista en la materia. Un ejemplo típico de virus modificado es un virus atenuado como el que se suministra en una vacuna.
El término "vector viral", tal y como se utiliza aquí en el contexto de la carga, se refiere a elementos genéticos derivados de virus, modificados de tal manera que se minimice el riesgo de manipularlos. Preferiblemente, el término se refiere a cualquier elemento de este tipo conocido por el especialista en la materia. Normalmente, en los vectores virales se ha suprimido una parte del genoma viral crítica para la replicación viral . Preferiblemente, un virus de este tipo puede infectar eficazmente las células pero, una vez que se ha producido la infección, requiere un virus ayudante que aporte las proteínas que faltan para la producción de nuevos viriones. Además, los vectores virales suelen mostrar una baja toxicidad y son genéticamente estables y no reordenan sus genomas. Más preferentemente, el término se refiere a elementos genéticos virales de acuerdo con la definición anterior derivados de adenovirus, virus adenoasociados o retrovirus. En realizaciones particularmente preferidas, el vector viral es un vector viral para vacunas. Tales vectores se consideran generalmente seguros y muestran típicamente atenuación y eliminación de funcionalidades relevantes. Ejemplos adecuados de tales vectores virales son vaccinia, viruela aviar, virus del sarampión, adenovirus, ALVAC, MVA, poxvirus. Particularmente preferido es el MVA (Vaccinia Ankara modificada).
El término "inoculante", tal y como se utiliza aquí en el contexto de la carga, se refiere a un compuesto o composición que proporciona inmunidad adquirida frente a una enfermedad específica. El inoculante puede ser, por ejemplo, un agente parecido al elemento causante de la enfermedad pero atenuado o suministrado en forma muerta o no infecciosa. También pueden incluirse toxinas de microorganismos o partes de los mismos, elementos de superficie como proteínas o glicoproteínas o moléculas de azúcar que se presenten en la superficie de un elemento causante de enfermedad. Además, el inoculante puede comprender o ser un antígeno o un epítopo de un antígeno de un elemento causante de una enfermedad, como un antígeno del cáncer, tal como se define en el presente documento, un antígeno bacteriano, tal como se define en el presente documento, un antígeno vírico, tal como se define en el presente documento, un antígeno de una enfermedad autoinmune, tal como se define en el presente documento, o un alérgeno, tal como se define en el presente documento. El incoculante puede proporcionarse además en forma de proteína o péptido, o como ácido nucleico competente para la expresión, o como cualquier otro compuesto adecuado conocido por el especialista. También se contempla el uso de combinaciones adecuadas de más de un inoculante, la combinación de más de un tipo de inoculante, por ejemplo, una proteína y un ácido nucleico. El inoculante puede combinarse además con factores adicionales adecuados, por ejemplo en forma de adyuvantes o formulados con portadores adecuados.
El término "plásmido", tal como se utiliza aquí en el contexto de la carga, se refiere a cualquier molécula de ADN extracromosómica separada del ADN cromosómico y capaz de replicarse de forma autónoma. Preferiblemente, el término se refiere a cualquier molécula de este tipo conocida por el especialista en la materia. Más preferentemente, el término se refiere a una molécula de ADN capaz de replicarse de forma autónoma en células eucariotas y que codifica un polipéptido de interés, por ejemplo, una proteína terapéutica o una proteína inmunológicamente activa, o una proteína detectable con fines de diagnóstico, por ejemplo, una proteína bioluminiscente como la GFP o una proteína fluorescente similar, por ejemplo, como las mencionadas en el presente documento.
El "sistema multicomponente", tal como se utiliza aquí, puede referirse a cualquier sistema o kit de componentes que comprenda más de un componente. Dichos 2, 3, 4, 5 o más componentes pueden ser tipos de carga diferentes, como proteínas diferentes, ácidos nucleicos diferentes, etc., o mezclas de dichos tipos de carga diferentes, por ejemplo, una proteína y un ácido nucleico, etc. En otras realizaciones especialmente preferidas, el sistema comprende componentes que suelen funcionar juntos o que son necesarios para que un determinado método sea funcional o para lograr un determinado objetivo. Ejemplos de tales componentes son los necesarios para la edición genómica, incluyendo proteínas específicas como nucleasas, elementos de ARN, insertos de ADN u otros tipos de ácidos nucleicos. Tales enfoques de edición genómica pueden ser, por ejemplo, el sistema CRISPR/Cas, un sistema basado en TALEN, un sistema basado en nucleasas de dedos de zinc (ZFN), un sistema basado en meganucleasas, un sistema basado en recombinasas Cre o FLP y sitios lox r FRT.El sistema multicomponente puede, por ejemplo, proporcionarse en forma de componentes ya expresados o listos para usar. Alternativamente, el sistema puede proporcionarse en forma de componentes codificados, por ejemplo, proporcionados en un plásmido o transcrito, que requieren una maquinaria celular para expresarse y proporcionar así los elementos necesarios para su funcionamiento. La presente invención prevé específicamente el uso de un sistema basado en DRACO, es decir, un sistema basado en oligomerizadores de caspasas activados por ARN de doble cadena. Particularmente preferido es el uso del sistema CRISPR (Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas Regularmente Interespaciadas)/Cas. CRISPR/Cas puede utilizarse para reducir la expresión de genes específicos (o grupos o genes similares) o para editar secuencias genómicas. Esto se consigue normalmente mediante la expresión de ARN monocatenario además de un gen CRISPR o una nucleasa. La técnica se basa típicamente en la expresión de un gen CRISPR, como Cas9, u otros genes similares además de un ARN guía de secuencias (véase, por ejemplo, Cong et al.2013, Science, 339, 6121, 819-823). En consecuencia, la escisión de doble cadena puede dirigirse a secuencias específicas mediante la expresión de secuencias guía de ARN flanqueantes apropiadas, que pueden proporcionarse como un componente del sistema multicomponente, por ejemplo, junto con Cas9 o una funcionalidad similar. Alternativamente, el sistema CRISPR/Cas puede utilizarse para escindir el ARNm, reduciendo así la expresión. En una realización preferida, las secuencias guía de ARN y la expresión del gen CRISPR (por ejemplo, Cas9) pueden incluirse como parte de una construcción de expresión. En consecuencia, el sistema CRISPR/Cas puede incluir los ácidos nucleicos y los componentes enzimáticos necesarios para ser suministrados como carga.
El término "sistema basado en TALEN" se refiere al uso de TALEN, es decir, la nucleasa de efecto similar al activador de la transcripción, que es una enzima de restricción artificial, generada mediante la fusión del dominio de unión al ADN del efector TAL con un dominio de corte del ADN. Los efectores TAL son proteínas que suelen ser secretadas por bacterias Xanthomonas o especies relacionadas, o que derivan de ellas y han sido modificadas. El dominio de unión al ADN del efector TAL puede comprender una secuencia altamente conservada, por ejemplo, de unos 33-34 aminoácidos con la excepción de los aminoácidos 12 y 13 que son altamente variables (Diresiduo Variable Repetido o RVD) y que típicamente muestran una fuerte correlación con el reconocimiento específico de nucleótidos. El dominio de corte del ADN TALEN puede derivarse de nucleasas adecuadas. Por ejemplo, el dominio de corte del ADN de la endonucleasa FokI o de variantes de la endonucleasa FokI puede utilizarse para construir nucleasas híbridas. Los TALEN pueden suministrarse preferentemente como entidades separadas debido a las peculiaridades del dominio FokI, que funciona como un dímero. Los TALEN o los componentes de los TALEN pueden diseñarse o modificarse preferentemente para que se dirijan a cualquier secuencia de ADN deseada. Dicha ingeniería puede llevarse a cabo según metodologías adecuadas, por ejemplo, Zhang et al., Nature Biotechnology, 1-6 (2011), o Reyon et al., Nature Biotechnology, 30, 460-465 (2012). En consecuencia, el sistema basado en TALEN puede comprender los ácidos nucleicos necesarios, por ejemplo, como insertos genómicos o secuencias guía y componentes enzimáticos que se proporcionarán como carga.
El término "sistema basado en nucleasas de dedos de zinc (ZFN)", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a un sistema de enzimas de restricción artificiales, que se generan típicamente mediante la fusión de un dominio de unión al ADN de dedo de zinc con un dominio de clivaje del ADN. Preferiblemente, los dominios de dedo de cinc pueden diseñarse o modificarse para que se dirijan a cualquier secuencia de ADN deseada. Tales métodos de ingeniería serían conocidos por el especialista o pueden derivarse de fuentes bibliográficas adecuadas como Bae et al., 2003, Nat Biotechnol, 21, 275-80; Wright et al., 2006, Nature Protocols, 1, 1637-1652). Normalmente, el dominio de corte inespecífico de las endonucleasas de restricción de tipo IIs, por ejemplo de la FokI, puede utilizarse como dominio de corte en las ZFNs. Dado que este dominio de clivaje dimeriza para clivar el ADN, normalmente se requiere un par de ZFNs para dirigirse a sitios de ADN no palindrómico. Los ZFN previstos por la presente invención pueden comprender además una fusión de la escisión no específica con el C-terminal de cada dominio de dedo de cinc. Por ejemplo, para permitir que dos dominios de clivaje dimericen y cliven el ADN, se requieren típicamente dos ZFN individuales que se unan a hebras opuestas de ADN con los C-terminales proporcionados a una distancia específica. Debe entenderse que las secuencias enlazadoras entre el dominio de dedo de cinc y el dominio de clivaje pueden requerir que el extremo 5' de cada sitio de unión esté separado por unos 5 a 7 pb. La presente invención contempla cualquier forma o variante adecuada de ZNF, por ejemplo, fusiones FokI clásicas, o versión optimizada de la FokI, así como enzimas con interfaces de dimerización modificadas, funcionalidad de unión mejorada o variantes capaces de proporcionar especies heterodiméricas. En consecuencia, el sistema basado en la nucleasa de dedos de cinc (ZFN) puede comprender los ácidos nucleicos necesarios, por ejemplo como insertos genómicos o secuencias guía, y los componentes enzimáticos que se proporcionarán como carga.
El término "sistema basado en meganucleasas" se refiere a un sistema que utiliza endodesoxirribonucleasas, que suelen tener un sitio de reconocimiento en forma de secuencias de ADN de doble cadena de unos 12 a 40 nucleótidos. Las meganucleasas funcionan típicamente como tijeras moleculares de ADN, que ofrecen la posibilidad de eliminar o modificar secuencias de forma específica para cada secuencia. Algunos ejemplos de meganucleasas adecuadas son las endonucleasas de intrón y las endonucleasas de inteína. La secuencia de reconocimiento de una meganucleasa puede modificarse mediante ingeniería genética o proteínica para que se dirija a cualquier secuencia de ADN deseada. Para proporcionar una especificidad de secuencia, la especificidad de las meganucleasas existentes puede modificarse introduciendo una variación en la secuencia de aminoácidos, seguida de la selección de proteínas funcionales. Alternativamente, pueden fusionarse dominios proteicos de diferentes enzimas a las nucleasas, dando lugar a meganucleasas quiméricas. Tales meganucleasas quiméricas pueden tener, por ejemplo, un nuevo sitio de reconocimiento compuesto por un medio sitio de una meganucleasa y un medio sitio de una proteína. En otras realizaciones, pueden combinarse ambos enfoques, es decir, la modificación de la secuencia de unión de la meganucleasa y la fusión con un dominio proteico de una enzima diferente. Pueden obtenerse más detalles, en particular con respecto a las posibilidades de ingeniería de las meganucleasas, de fuentes bibliográficas adecuadas como Gao et al., 2010, The Plant Journal for Cell and Molecular Biology, 61, 176-87. En consecuencia, el sistema basado en meganucleasas puede incluir los ácidos nucleicos necesarios, por ejemplo como insertos genómicos o secuencias guía, y los componentes enzimáticos que se proporcionarán como carga.
El término "sistema Cre-lox", tal y como se utiliza aquí, se refiere a la combinación de la recombinasa Cre y sus respectivos sitios de reconocimiento (sitios lox). Alternativamente, el sistema puede estar compuesto por la recombinasa FLP y sus respectivos sitios de reconocimiento (sitios FRT). Proporcionando los sitios de reconocimiento de forma repetida directa se puede conseguir una deleción de secuencias entre las repeticiones. Del mismo modo, proporcionando otras orientaciones o más de dos sitios de reconocimiento puede hacerse posible otro patrón de reordenación, por ejemplo, una inversión de las secuencias. Puede encontrar más detalles en Ryder et al., 2004, Genetics, 167, 797-813 o Ito et al., 1997, Development, 771, 761-771.
Según la presente invención, la carga es un compuesto farmacéutica o inmunológicamente activo. El término "compuesto farmacéuticamente activo", tal y como se utiliza aquí, se refiere a cualquier sustancia, medicamento, fármaco, componente celular, tejido o ingrediente farmacéutico activo (API) adecuado y conocido por el especialista. Estos compuestos pueden comprender proteínas terapéuticas como las definidas anteriormente, radionucleidos como los definidos anteriormente, sustancias citotóxicas como las definidas anteriormente, pequeñas moléculas como las definidas anteriormente, inhibidores de péptidos o proteínas como los definidos anteriormente. En una realización particularmente preferida, el compuesto farmacéuticamente activo es un inhibidor de la función celular. El término "inhibidor de la función celular", tal como se utiliza aquí, se refiere a cualquier molécula orgánica, péptido o polipéptido que tenga un efecto inhibidor sobre las funciones fisiológicas, preferentemente sobre la función proteica como las funciones enzimáticas. La inhibición puede consistir, por ejemplo, en una disminución de la actividad de una enzima, en comparación con la actividad de la enzima en ausencia del inhibidor. En algunas realizaciones, el término "inhibir" significa, por tanto, una disminución de la actividad enzimática de al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90% o al menos un 95%. En otras realizaciones, "inhibir" significa una disminución de la actividad enzimática de aproximadamente un 5% a aproximadamente un 25%, de aproximadamente un 25% a aproximadamente un 50%, de aproximadamente un 50% a aproximadamente un 75%, o de aproximadamente un 75% a un 100%. También se contempla una disminución de la actividad enzimática de alrededor del 95% al 100%, por ejemplo, una disminución de la actividad del 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. Tales disminuciones pueden medirse utilizando cualquier método o ensayo adecuado conocido por el especialista sería reconocible por un especialista en la materia.
Ejemplos de tales inhibidores son los inhibidores de la proteasa, por ejemplo el ritonavir, el inhibidor de la proteasa del VIH tipranavir o el sildenafilo. Además, se prefieren especialmente los inhibidores de la apoptosis. Algunos ejemplos de inhibidores de la apoptosis son las proteínas de la familia Bcl-2, como Bcl-2, Bcl-XL o Bcl-w. Otros ejemplos incluyen el crmA (modificador de la respuesta a citotoxinas A), que puede utilizarse para inhibir las caspasas 1, 6 y 8. También se contempla el uso de IAP (inhibidores de las proteínas de la apoptosis), como Cp-IAP, Op-IAP, XIAP, cIAP1, C-IAP2, NAIP, Livin y Survivin.
El término "compuesto inmunológicamente activo", tal y como se utiliza aquí, se refiere a cualquier compuesto capaz de provocar una reacción inmunológica en el organismo. En otras realizaciones, puede ser alternativamente capaz de inmunomodular. También se contempla que el compuesto inmunológicamente activo sea un inductor de tolerancia inmunológica.
El término "compuesto capaz de provocar una reacción inmunológica en el organismo", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier sustancia o parte de una sustancia que sea reconocida por elementos del sistema inmunitario de un animal, preferiblemente un mamífero, y más preferiblemente del ser humano, y que provoque una activación del sistema inmunitario innato o del sistema inmunitario adaptativo.
Los componentes típicos del sistema inmunitario innato son el sistema del complemento o las células asesinas naturales. El sistema del complemento comprende una cascada de más de 20 proteínas capaces de destruir patógenos mediante anticuerpos. La respuesta se activa normalmente por la unión del complemento a anticuerpos que se han unido a patógenos o por la unión de las proteínas del complemento a carbohidratos de la superficie de elementos extraños, por ejemplo bacterias o virus. El sistema del complemento comprende además proteasas capaces de destruir elementos extraños como células, parásitos o parte de ellos (por ejemplo, huevos), bacterias o virus. Otra consecuencia de la activación del complemento es la producción de péptidos señal que atraen a otras células inmunitarias. Las células asesinas naturales (NK) son linfocitos que suelen destruir células huésped comprometidas, por ejemplo, células cancerosas o células infectadas por virus. Se supone que estas células no muestran autorreconocimiento por parte del sistema inmunitario y, por tanto, son atacables por las células NK. Tales células, por ejemplo las infectadas por virus, pueden mostrar un número reducido de células MHC I en su superficie, lo que aparentemente es detectado por las células NK. Las células NK pueden encontrarse en todos los compartimentos inmunitarios primarios y secundarios, así como en los tejidos de las mucosas. Además, pueden producir citocinas proinflamatorias como el interferón-gamma. Las células NK pueden, en realizaciones particularmente preferidas, activarse para destruir células cancerosas. Pueden utilizarse ventajosamente para comunicarse con otras células inmunitarias como las CD, las células NKT o las células T, lo que puede dar lugar a una respuesta inmunitaria adaptativa en el cáncer. Sin querer ceñirnos a la teoría, se cree que las células NK y las CD están en estrecha comunicación. La activación de las células NK mediada por las CD suele contribuir al desarrollo de una potente inmunidad innata, mientras que, a su vez, las células NK activadas proporcionan señales para la activación, maduración y producción de citocinas de las CD, promoviendo la inmunidad adaptativa. El suministro de exosomas derivados de las CD (Dex), o la activación de las CD puede dar lugar en particular a una activación de las células NK, permitiendo así destruir las células enfermas, en particular las cancerosas. El especialista conocerá más detalles o podrá obtenerlos de fuentes bibliográficas adecuadas, como Lion et al., 2012, The Oncologist, 17, 1256-1270. Típicamente, las células Langerina<+>suprimen la fusión de células NK. Según realizaciones específicas de la presente invención, la activación de las células Langerina<+>, por ejemplo mediante la entrega de cargas adecuadas a dichas células que permitan dicha activación, puede utilizarse para activar las células NK y/o contribuir a dicha activación.
El sistema inmunitario adaptativo, por otro lado, se basa principalmente en la actividad de leucocitos especializados, es decir, linfocitos, concretamente células B y células T. Las células B suelen participar en las respuestas inmunitarias humorales, mientras que las células T intervienen en las respuestas inmunitarias mediadas por células. Tanto las células B como las T están formadas por moléculas receptoras de células T (TCR) que reconocen dianas específicas que son procesadas y posteriormente presentadas en moléculas MHC, que pueden ser proporcionadas o expresadas por todas las células huésped. Las células T pueden diferenciarse en células T citotóxicas (CTL) también conocidas como células T CD8<+>o células T asesinas y células T auxiliares, así como células T reguladoras. Los antígenos del interior de una célula suelen estar unidos a moléculas CMH de clase I y son llevados a la superficie de la célula por la molécula CMH de clase I, donde pueden ser reconocidos por la célula T. Si el TCR es específico para ese antígeno, se une al complejo de la molécula MHC de clase I y el antígeno, y la célula T destruye la célula presentadora. Las moléculas MHC I se encuentran en la superficie de todas las células nucleadas. Las moléculas CMH de clase I suelen unirse a péptidos generados principalmente a partir de la degradación de proteínas citosólicas por el proteasoma. El complejo CMH I:péptido se inserta posteriormente a través del retículo endoplásmico en la membrana plasmática externa de la célula. El péptido epítopo se une en las partes extracelulares de la molécula del CMH de clase I. Así, se cree que la función del CMH de clase I es principalmente la de mostrar proteínas intracelulares a las células T citotóxicas (CTL). Además, el CMH de clase I también puede presentar péptidos generados a partir de proteínas exógenas a través de la presentación cruzada, que es la capacidad de ciertas células presentadoras de antígenos, por ejemplo las CD, de captar, procesar y presentar antígenos extracelulares con moléculas CMH de clase I a las células T citotóxicas CD8<+>. El cebado cruzado, resultado de este proceso, describe la estimulación de las células T CD8<+>citotóxicas ingenuas para convertirlas en células T CD8<+>citotóxicas activadas. Este proceso puede conducir a la inmunidad contra tumores y virus. La presentación cruzada también puede ser ventajosa para la inducción de la inmunidad citotóxica, por ejemplo, mediante la vacunación con antígenos proteicos, por ejemplo, la vacunación contra tumores como se describe en el presente documento. Las moléculas MHC I suelen unirse a péptidos de 8-10 aminoácidos de longitud.
Las células T auxiliares (también conocidas como células T CD4<+>) y las células T reguladoras (también conocidas como células Treg o células T supresoras), por otro lado, reconocen antígenos que están acoplados a moléculas CMH de clase II. Por lo general, las moléculas CMH II sólo se encuentran en las células presentadoras de antígenos (CPA), como las células dendríticas, los fagocitos mononucleares, las células epiteliales tímicas o las células B. La carga de las moléculas CMH de clase II suele producirse en compartimentos lisosomales. Por ejemplo, las proteínas extracelulares pueden ser endocitosadas, digeridas en los lisosomas y los fragmentos peptídicos epitópicos pueden unirse a las moléculas CMH II. Típicamente, las moléculas MHC II presentan antígenos de una longitud de entre unos 15 y 24 aminoácidos.
De acuerdo con la presente invención, cualquiera de las actividades descritas anteriormente puede ser provocada por un compuesto adecuado, por ejemplo, un antígeno o un epítopo. La longitud del antígeno, su presencia en el compartimento celular, etc., pueden modular la presentación en las moléculas MHC I o MHC II y, de este modo, modular también la activación de determinadas ramas del sistema inmunitario. Para el cáncer y la terapia vírica, se prefiere especialmente que se provoque una estrecha interacción del sistema inmunitario innato y adaptativo, por ejemplo, mediante la activación de las CD. Pueden obtenerse más detalles de fuentes bibliográficas adecuadas como Ortner et al., Oncoimmunology, 2017, 6, 2, e1260215; Watt et al., 2008, J Immunol., 181, 8, 5323-30 o Walzer et al., 2005, Blood, 106, 7, 2252-8.
El término "compuesto capaz de inmunomodular", tal y como se utiliza aquí, se refiere a cualquier sustancia o parte de una sustancia que transmite un ajuste regulador del sistema inmunitario . En consecuencia, las respuestas inmunitarias pueden inducirse, amplificarse, atenuarse o prevenirse en función de los objetivos terapéuticos. Así, la inmunomodulación puede ser, por ejemplo, una activación (por ejemplo, en forma de inmunoterapia de activación), se provoca o amplifica la respuesta inmunitaria, o puede ser una supresión (por ejemplo, en forma de inmunoterapia de supresión).
Entre los ejemplos de compuestos capaces de activar la inmunomodulación se incluyen factores estimulantes como el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), citocinas, interleucinas, quimiocinas, fármacos inmunomoduladores de imidas (IMiD), oligodesoxinucleótidos sintéticos de citosina fosfato-guanosina (CpG) o glucanos o una crema potenciadora de la inmunidad como el imiquimod. Ejemplos preferidos de interleucinas adecuadas son la IL-2, la IL-7 y la IL-12. Ejemplos preferidos de citoquinas ae interferones y G-CSF. Ejemplos preferidos de quimiocinas adecuadas son CCL3, CCL26 y CXCL7. Ejemplos preferidos de IMiD adecuados son la talidomida y sus análogos, como la lenalidomida, la pomalidomida y el apremilast.
Entre los ejemplos de compuestos capaces de suprimir la inmunomodulación se incluyen los fármacos inmunosupresores como los glucocorticoides, los citostáticos, los anticuerpos y los compuestos que actúan en las inmunofilinas. Ejemplos preferidos de glucocorticoides adecuados son la prednisona, la dexametasona y la hidrocortisona. Los glucocorticoides suelen suprimir la inmunidad mediada por células, por ejemplo, inhibiendo los genes que codifican las citocinas IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8 y TNF-alfa, por lo que una reducción de la producción de citocinas conlleva una disminución de la proliferación de células T. Los glucocorticoides también pueden suprimir la inmunidad humoral, por ejemplo, haciendo que las células B expresen menores cantidades de IL-2 y receptores de IL-2, lo que disminuye la expansión de clones de células B y la síntesis de anticuerpos. Ejemplos preferidos de citostáticos adecuados son los agentes alquilantes, como las mostazas nitrogenadas, por ejemplo, la ciclofosfamida, las nitrosoureas y los compuestos de platino. Otros ejemplos son los antimetabolitos como los análogos del ácido fólico, por ejemplo el metotrexato, los análogos de la purina, por ejemplo la azatiopina o la mercaptopurina, los análogos de la pirimidina como el fluorouracilo. En otro grupo de ejemplos adecuados se encuentran los antibióticos citotóxicos como la dactinomicina, la antraciclina, la mitomicina C, la bleomicina o la mitramicina. Los ejemplos preferidos de anticuerpos adecuados incluyen anticuerpos policlonales heterólogos, por ejemplo obtenidos a partir de suero de animales como caballos inmunizados con timocitos o linfocitos humanos. Entre los ejemplos de preparados de anticuerpos policlonales previstos por la presente invención se incluyen el atgam y la timoglobulina. También se contemplan los anticuerpos monoclonales contra CD25 y CD3. Ejemplos preferidos de compuestos adecuados que actúan sobre las inmunofilinas son la ciclosporina, el tacrolimus, el sirolimus y el everolimus. Otros compuestos con capacidad de inmunomodulación supresora son el fingolimod, la miriocina, el micofenolato, las moléculas de unión al TNF-alfa, como las variantes de penetración celular del infliximab, el etanercept o el adalimumab. Entre los ejemplos específicos especialmente previstos se incluyen la ciclosporina (que se une a la proteína ciclofilina citosólica de los linfocitos y, por tanto, inhibe la calcireurina), el tacrolimus (que es un inhibidor intracelular de la calcineurina), el sirolimus y el everolismus (que inhiben la producción de IL-2 a través de mTOR al unirse a la proteína 12 citosólica de unión a FK, bloqueando así la activación de los linfocitos T y B), fingolimod (que provoca la internalización de los receptores de esfingosina-1-fosfato y secuestra los linfocitos en los ganglios linfáticos), miriocina y micofenolato (que proporcionan una inhibición a-selectiva de la inosinmonofosfat-deshidrogenasa y conducen a la inhibición de la biosíntesis de guanosina, inhibiendo así la proliferación de los linfocitos B y T).
El término "inductor de tolerancia inmunológica", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a un compuesto capaz de inducir un estado de falta de respuesta del sistema inmunitario a sustancias o tejidos que normalmente tienen la capacidad de provocar una respuesta inmunitaria en un organismo. La tolerancia inmunológica puede ser tolerancia central o tolerancia periférica. Una tolerancia central se induce típicamente en el timo o la médula ósea, mientras que una tolerancia periférica se induce en los ganglios linfáticos. En el contexto de la presente invención, se prefiere la inducción de la tolerancia central. Se cree que la tolerancia periférica es responsable de la prevención de la reactividad excesiva del sistema inmunitario frente a diversas entidades ambientales como los alérgenos o los microbios intestinales. El mal funcionamiento del sistema de tolerancia suele conducir a enfermedades autoinmunes como el lupus eritematoso sistémico, la artritis reumatoide, la diabetes de tipo 1, el síndrome poliendocrino autoinmune de tipo 1 (APS-1), la inmunodisregulación, la polendocrinopatía o la enteropatía y se supone que contribuye al asma, la alergia y la enfermedad inflamatoria intestinal. El sistema de tolerancia también es fundamental para los trasplantes y los aloinjertos. Además, las reacciones de alergia e hipersensibilidad suelen considerarse reacciones erróneas o excesivas del sistema inmunitario, posiblemente debidas a mecanismos rotos o poco desarrollados de tolerancia periférica. Normalmente, las células Treg, TR1 y Th3 de las superficies mucosas suprimen las células auxiliares CD4 de tipo 2, los mastocitos y los eosinófilos, que median la respuesta alérgica. Los déficits de células Treg o su localización en la mucosa pueden desempeñar un papel en las reacciones alérgicas. Se supone que las células dendríticas (CD) desempeñan un papel importante en la tolerancia periférica. Las CD están ampliamente presentes en los tejidos periféricos no linfáticos, como la piel y los tejidos linfáticos, en una variedad de subconjuntos de diferentes linajes de diferenciación y niveles de madurez, en particular como células Langerina<+>. En estado estacionario, es decir, en estado no inflamatorio, la mayoría de las células dendríticas permanecen inmaduras, y ante una estimulación antigénica débil y una presentación de antígenos que puede proporcionar coestimulación, las células dendríticas inmaduras inducen típicamente la eliminación clonal y la inactivación de las células T ingenuas, al tiempo que inducen y amplifican diversas células T reguladoras con capacidad inmunosupresora. En consecuencia, se supone que las células dendríticas inmaduras desempeñan un papel en el mantenimiento de la homeostasis inmunológica a través de la inducción de la tolerancia inmunológica asociada a mecanismos reguladores que controlan la función de las células T. El empleo de citocinas, entre las que se incluyen al menos la IL-10 y el TGF-beta, puede dar lugar a CD tolerogénicas. Además, el desencadenamiento de la expresión superficial de CD80high, CD86high, CD40high y CD83low puede utilizarse para inducir la tolerancia. También se contempla el uso de un agente promotor de la producción de IL-10, como la dexametasona. En otra realización, la inducción de la inmunotolerancia puede lograrse mediante el uso de ácido 5-aminolevulínico (ALA) o derivados del mismo, así como el uso de citrato ferroso sódico (SFC). Pueden obtenerse más detalles de fuentes bibliográficas adecuadas, como el documento US 9399029. Se prefiere especialmente que el compuesto inductor de la inmunotolerancia se utilice en o para las células de Langerina<+>descritas en el presente documento, así como en el contexto de afecciones médicas que afecten a las células de Langerina<+>.
En otra realización preferida de la presente invención, la carga antes mencionada comprende, consiste esencialmente o está formada por (i) un antígeno o epítopo cancerígeno o comprende un antígeno o epítopo cancerígeno (ii) un antígeno o epítopo de enfermedad autoinmune o comprende un antígeno o epítopo de enfermedad autoinmune, (iii) un antígeno bacteriano o comprende un antígeno o epítopo bacteriano, (iv) un antígeno vírico o comprende un antígeno o epítopo vírico, (v) un antígeno parasitario o comprende un antígeno o epítopo parasitario, o (vi) un alérgeno, o un epítopo de un alérgeno, o comprende un alérgeno o un epítopo de un alérgeno.
El término "antígeno del cáncer", tal y como se utiliza aquí, se refiere a las sustancias antigénicas producidas en las células tumorales. Por lo tanto, el término también puede incluir típicamente los antígenos celulares mencionados anteriormente. Estas sustancias antigénicas también pueden denominarse alternativamente "antígenos tumorales". Estos antígenos suelen desencadenar respuestas inmunitarias en el huésped. Sin querer ceñirnos a la teoría, actualmente se cree que las proteínas normales de un organismo (es decir, las proteínas producidas por el propio huésped) no son antigénicas debido a la autotolerancia del sistema inmunológico, un concepto en el que los linfocitos autorreactivos se eliminan antes de convertirse en células totalmente inmunocompetentes. Otras proteínas que no están expuestas al sistema inmunitario pueden desencadenar una respuesta inmunitaria. Esto puede incluir proteínas que están secuestradas del sistema inmunitario, proteínas que se producen normalmente en cantidades muy pequeñas (pero que se producen, por ejemplo, en una cantidad mucho mayor en las células cancerosas), o proteínas que se producen típicamente sólo durante ciertas etapas del desarrollo de la célula/organismo, o proteínas cuya estructura o función está modificada debido a la presencia de una mutación. En consecuencia, los antígenos del cáncer pueden clasificarse en diferentes grupos, por ejemplo, como productos de oncogenes y genes supresores de tumores mutados, productos de otros genes mutados como (i) proteínas celulares sobreexpresadas o expresadas de forma aberrante, (ii) antígenos del cáncer producidos por virus oncogénicos, (iii) antígenos oncofetales, (iv) glicolípidos y glicoproteínas de la superficie celular alterados, y (v) antígenos de diferenciación específicos del tipo celular. En otras realizaciones específicas, el antígeno puede ser un antígeno específico de tumor, que es un antígeno que se produce por una mutación de un gen que codifica una proteína cuya producción anormal es la causa de un cáncer o tumor. Un ejemplo previsto en de tales antígenos tumorales específicos es una forma anormal de p53 o ras. Alternativamente, si una mutación no está relacionada con el desarrollo del tumor, pero conduce a la producción de una proteína anormal que está asociada a las células cancerosas, se considera como antígeno asociado al tumor (TAA). Asimismo, se prevé que este grupo de antígenos forme parte de la carga según la presente invención. El grupo de TAA se subdivide típicamente en el grupo de TAA compartidos y TAA únicos. Entre los TAA compartidos se encuentran antígenos que son compartidos por varias clases de cánceres, mientras que se cree que los TAA únicos son el resultado de mutaciones puntuales somáticas aleatorias incluidas por carcinógenos, constituyendo así neoantígenos únicos expresados por tumores individuales. La presencia de tales TAA únicos puede utilizarse ventajosamente para la preparación de cargas de antígenos específicos, por ejemplo en el formato de una vacuna, que se basen en una secuencia genómica personal obtenida mediante enfoques de secuenciación de próxima generación, proporcionando información sobre el mutanoma del paciente y ofreciendo potencialmente información sobre péptidos mutados únicos asociados al cáncer, que pueden utilizarse para la elicitación de células T antitumorales cuando se presentan como antígenos.
La presente invención contempla preferentemente el uso de uno o más de los siguientes antígenos cancerígenos: MAGE-A1, NY-ESO-1, SSX-2, Gp-100, Melan-A/Mart-1, Tirosinasa, PSA, Mamaglobina-A, URLC10, GAA, OFA, ciclina B1/WT-1/CEF, VEGFR1, VEGFR2, TTK, MUC1-KLH, HER2, VPH16 E7, VPH16/18, CEA, KOC1, SL-701, WT1, p53, survivina, telomerasa, GSK2302025A, MAGE-3.1, OVA BiP, CO16, DEPDC1, MPHOSPH1, ONT-10, GD2L y GD3L, TF, rsPSMA, MUC-2, PAP; KLH, STF-II, G17DT, ICT-107, LMP2A, NA17-A, NA17.A2, IMA901, hTERT, péptido 2 relacionado con la tirosinasa (TRP2), PANVAC, EBNA1/LMP2, TRICOM 5T4, MPHOSPH1 y DEPDC1. Además, la presente invención también se refiere a cualquier combinación de los antígenos antes mencionados, así como a derivados o versiones modificadas de los mismos o secuencias proteínicas/péptidas homólogas derivadas de los mismos. También se contempla el empleo de antígenos cancerígenos adicionales que puedan descubrirse y describirse en el futuro. También se contempla el empleo de cualquier otro antígeno adecuado conocido por el especialista. Se pueden obtener más detalles en Tagliamonte et al., 2014, Hum Vaccin Immunother, 10(11), 3332-3346. El término "epítopo del cáncer", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un epítopo específico de la clase MHC I o MHC II presente en un antígeno del cáncer, por ejemplo, tal como se define en el presente documento. El empleo de epítopos cancerígenos puede, en realizaciones específicas, combinarse con la caracterización adicional de los antecedentes alélicos HLA de un receptor.
Particularmente preferido es el empleo de los antígenos del cáncer NY-ESO-1, URLC10, G17DT, MART-1; NA17-A; gp100; hTERT, PAP, MPHOSPH1, DEPDC1, HPV16/18 o STF-II, o de epítopos presentes en estos antígenos.
El término "antígeno de enfermedad autoinmune", tal y como se utiliza aquí, se refiere a una sustancia antigénica que provoca respuestas inmunitarias inapropiadas que atacan a los tejidos propios o a componentes ambientales inocuos. Así pues, la enfermedad autoinmune es típicamente, en la mayoría de los casos, una afección derivada de respuestas inmunitarias anormales a una parte normal del cuerpo, pudiendo estar implicadas casi todas las partes del cuerpo. La enfermedad implica la aparición o presencia de un reservorio de células autorreactivas que se vuelven funcionales dentro del sistema inmunitario, es decir, en estos casos fallan los mecanismos de prevención de la creación de células T autorreactivas mediante un proceso de selección negativa dentro del timo cuando la célula T se está desarrollando hasta convertirse en una célula inmunitaria madura. La enfermedad implica la presencia de autoanticuerpos, así como de linfocitos autorreactivos, por ejemplo, células T autorreactivas. La enfermedad puede estar restringida a determinados órganos o afectar a un tejido concreto en diferentes lugares. El uso de antígenos de enfermedades autoinmunes en el contexto de la presente invención implica la inducción de tolerancia inmunológica contra dichos antígenos, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente. En realizaciones específicas de la presente invención pueden utilizarse células Langerina<+>migratorias inmaduras para la inducción de la tolerancia inmunitaria. En particular, una presentación como la mencionada anteriormente puede generar posteriormente un efecto de tolerancia inmunológica para dicho antígeno si no se activa la CD. Por consiguiente, la presente invención prevé que un tratamiento de un antígeno de una enfermedad autoinmune comprenda la entrega citosólica de un antígeno que conduzca a la posterior presentación del mismo a las células inmunitarias efectoras y la ausencia explícita de un componente que pueda conducir a una activación de las CD, como la activación mediante un adyuvante. Sin querer atarse a la teoría, se cree que la presentación de los antígenos a las CD, por ejemplo a través de una entrega citosólica, conducirá a una presentación de dicho antígeno basada en el CMH I. Dicha presentatin puede generar posteriormente un efecto de tolerancia inmunológica para dicho antígeno si no se activa la CD. Por consiguiente, la presente invención prevé que el tratamiento de un antígeno de una enfermedad autoinmune incluya la presentación citosólica de un antígeno y la ausencia explícita de un componente que pueda provocar la activación de las CD, como un adyuvante.
Entre las enfermedades autoinmunes para las que pueden proporcionarse antígenos en forma de cargas se incluyen, por ejemplo, el síndrome antifosfolípido (síndrome aPL), el pénfigo, la esclerosis múltiple (EM), la miastenia gravis, la enfermedad de Grave, el síndrome de Goodpasture, la angiitis microscópica, la granulomatosis con poliangeítos, las enfermedades reumáticas autoinmunes sistémicas (ERAS), la enfermedad mixta del tejido conectivo, Lupus eritematoso sistémico, Síndrome de Sjøgrens, Esclerosis sistémica/Síndrome de CREST, Polimiositis/Dermatomiositis, Enfermedades tiroideas autoinmunes, Enfermedad celíaca, Hepatitis autoinmune, Cirrosis biliar primaria, Enfermedades asociadas a ANCA, Síndrome antifosfolípido/Síndrome tromboembólico, Enfermedad anti-MBG, Diabetes mellitus, Anemia perniciosa o Enfermedad de Crohn. Los antígenos adecuados serían conocidos por el especialista o pueden derivarse de fuentes bibliográficas como Wang et al., Nucleic Acids Research, 2017, 45, D1, D769-D776. En realizaciones particulares, la presente invención prevé el uso de antígenos correspondientes como beta2-GP1 para el síndrome aPL, Dsg3 para el pénfigo, MBP, PLP y/o MOG-1 para la esclerosis múltiple, receptor de ACh para la miastenia gravis, receptor de TSH para la enfermedad de Grave, Colágeno tipo IV para el síndrome de Goodpasture, p-ANCA para la angiitis microscópica, c-ANCA para la granulomatosis con poliangitis, DFS70 o factor de crecimiento derivado del epitelio del cristalino/coactivador de la transcripción p75 (LEDGF/p75) para las enfermedades reumáticas autoinmunes sistémicas (ERAS), U1-snRNP 68/70, U1-snRNP A, U1-snRNP C o U-snRNP B/B' para la enfermedad mixta del tejido conectivo, Sm, RNP/Sm, SmD, SmD1, SmD2, SmD o fosofoproteína ribosómica P0 para el lupus eritematoso sistémico, Ro/SS-A, o La/SS-B para el síndrome de Sjøgrens, Proteína del centrómero B (CENP-B), Proteína del centrómero A (CENP-A), ADN Topoisomerasa I (Scl-70) para la Esclerosis Sistémica / Síndrome de CREST, Histidil-ARNt sintetasa (Jo-1), Treonil-ARNt sintetasa (PL-7), Alanil-ARNt sintetasa (PL-12), Glicil-ARNt sintetasa (EJ) o SRP54 para la Polimiositis / Dermatomiositis, peroxidasa tiroidea (TPO; sin. MSA), tiroglobulina Enfermedades tiroideas autoinmunes, transglutaminasa tisular (tTG; syn. TGase-2 o Gliadina para la enfermedad celíaca, citocromo p4502D6, formiminotransferasa ciclodeamidasa (FTCD) para la hepatitis autoinmune, M2, complejo de deshidrogenasa 2-oxoácido de cadena ramificada (BCOADC), OGDC-E2 o PDC-E2 para la cirrosis biliar primaria, mieloperoxidasa (MPO) o proteinasa 3 (PR3) para las enfermedades asociadas a ANCA, la beta2-glicoproteína 1 (beta2-GP1), antes conocida como apolipoproteína H (Apo H) para el síndrome antifosfolípido/síndrome tromboembólico, la membrana basal glomerular (MBG) para la enfermedad anti MBG, la glutamato descarboxilasa (GAD65) para la diabetes mellitus, el factor intrínseco para la anemia perniciosa o la glicoproteína 2 (GP2) para la enfermedad de Crohn. También se contemplan los epítopos de enfermedades autoinmunes presentes en un antígeno, preferentemente como los definidos anteriormente. El término "epítopo de enfermedad autoinmune", tal y como se utiliza aquí, se refiere a un epítopo específico de la clase MHC I o MHC II presente en un antígeno de enfermedad autoinmune, tal y como se ha definido anteriormente. El empleo de epítopos de enfermedades autoinmunes puede, en realizaciones específicas, combinarse con la caracterización adicional de los antecedentes alélicos HLA de un receptor.
El término "antígeno bacteriano", tal y como se utiliza aquí, se refiere a una sustancia antigénica producida o presentada por una bacteria. Los antígenos bacterianos pueden, por ejemplo, ser transportados por proteínas y polisacáridos, o lípidos. Pueden incluir cubiertas, cápsulas, paredes celulares, flagelos, fimbrias o toxinas de bacterias. Normalmente, estas sustancias se muestran en la superficie de las bacterias. En muchos casos, los hidratos de carbono en forma de polisacáridos capsulares y/o lipopolisacáridos son componentes principales en la superficie de las bacterias y, en consecuencia, pueden considerarse estructuras antigénicas. También se prevé que dichos polisacáridos y/o lipopolisacáridos sean imitados por péptidos o proteínas, que en consecuencia proporcionan el antígeno o epítopo pertinente. La presente invención contempla cualquier antígeno bacteriano adecuado conocido por el especialista. Se prefiere que el antígeno bacteriano o el epítopo bacteriano sea, comprenda o se derive del toxoide tetánico, el toxoide diftérico, un polisacárido de Neisseria meningitidis o Bordetella pertussis en forma acelular. Por ejemplo, el antígeno o epítopo bacteriano es un epítopo de células T derivado de un antígeno presente en CRM, toxoide tetánico, toxoide diftérico, complejo de membrana externa de Neisseria meningitidis o proteína D de Hemophilus influenzae. Pueden obtenerse más ejemplos y detalles de fuentes bibliográficas adecuadas como Detmer y Glenting, 2006, Microbial Cell Factories, 5, 23.
El término "antígeno viral", tal y como se utiliza aquí, se refiere a sustancias antigénicas producidas por virus. El antígeno vírico es típicamente una proteína o un elemento peptídico, que suele estar codificado por el genoma del virus. Puede presentarse en la superficie del virus, por ejemplo como una cubierta o envoltura o parte de ella, o ser una parte integral del núcleo del virus o de otras estructuras virales, que pueden, por ejemplo, ser presentadas por las células tras la desintegración viral en el interior de una célula. Los ejemplos de antígenos virales incluyen elementos estructurales virales como una proteína de la cápside, una proteína de la matriz, una proteína de la envoltura, etc., así como proteínas no estructurales como holinas, proteínas de movimiento, proteínas NS, por ejemplo NS2, NSP1, etc., o actividades enzimáticas codificadas por virus como integrasa, transcriptasa inversa, neuraminidasa, esterasa, etc.
Los antígenos preferidos son los derivados del virus de la hepatitis A (virus entero inactivado por calor), de la hepatitis B y del virus del papiloma humano (VPH). Especialmente preferido es el antígeno de superficie de HepB. También se contempla el uso de epítopos virales. El término "epítopo viral", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a un epítopo específico de la clase MHC I o MHC II presente en un antígeno viral tal y como se define en el presente documento. El empleo de epítopos virales puede, en realizaciones específicas, combinarse con la caracterización adicional de los antecedentes alélicos HLA de un receptor. Puede obtenerse más información en recursos de Internet adecuados, como https://www.who.int/immunization/diseases/en/ (última consulta: 4 de diciembre de 2018).
El término "antígeno parasitario", tal como se utiliza aquí, se refiere a sustancias antigénicas producidas por parásitos o presentadas en ellos. El término "parásito" se refiere a parásitos de mamíferos, preferentemente parásitos de humanos. Los parásitos pertenecen típicamente a los protozoos o metazoos. Los principales grupos parasitarios son los protozoos parásitos y los helmintos parásitos. Los protozoos son eucariotas unicelulares. Los protozoos parásitos suelen dividirse en cuatro grupos en función de sus medios de locomoción y modo de reproducción: flagelados, amebas, esporozoos y ciliados. Dentro del grupo de los flagelados hay flagelados intestinales y genitourinarios como Giardia y Trichomonas, así como flagelados sanguíneos y tisulares como Trypanosoma y Leishmania. Ejemplos de amebas son Entamoeba, Naegleria y Acanthamoeba. El grupo de los Esporozoos suele tener un ciclo vital complejo con fases de reproducción sexual y asexual alternadas e incluye Cryptosporidium, Cyclospora y Toxoplasma y los parásitos de la malaria, es decir, las especies de Plasmodium. Estos esporozoos son parásitos típicamente intracelulares. Los ciliados son protozoos complejos que portan cilios. Un ejemplo de este grupo es el Balantidium coli, un ciliado intestinal de humanos y cerdos. Los helmintos parásitos suelen pertenecer a los grupos de los nematodos y los platelmintos. Ejemplos de platelmintos son los trematodos, como la Fasciola hepatica, o los cestodos, como la Taenia. También se contemplan los parásitos Schistosoma o Filarial, como Wuchereria bancrofti u Onchocerca volvulus. La presente invención contempla antígenos de cualquiera de los parásitos mencionados o de cualquier otro parásito adecuado conocido por el especialista. En realizaciones específicas, el antígeno puede estar presente en determinadas formas del ciclo vital, por ejemplo, en los huevos. Se prefiere especialmente el empleo de antígenos de la malaria, por ejemplo, estructuras proteicas mostradas por Plasmodium durante una de sus formas de ciclo vital, como el antígeno protector rico en cisteína (CyRPA), que es un componente crucial de un complejo ternario, que incluye la proteína homóloga 5 de unión a reticulocitos (RH5) y la proteína que interactúa con la RH5 (Ripr). El término "epítopo parasitario", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a un epítopo específico de la clase MHC I o MHC II presente en un antígeno parasitario tal y como se define en el presente documento. El empleo de epítopos parasitarios puede, en realizaciones específicas, combinarse con la caracterización adicional de los antecedentes alélicos HLA de un receptor. Puede obtenerse más información de fuentes bibliográficas adecuadas como Tarleton, 2005, Cellular Microbiology, 7, 10, 1379-1386 o Higashi, 1988, Ann Rev Public Health, 9, 483-501.
El término "alérgeno", tal y como se utiliza aquí, se refiere a sustancias antigénicas capaces de estimular una reacción de hipersensibilidad de tipo I en individuos atópicos a través de respuestas de inmunoglobulina E (IgE). Por consiguiente, el alérgeno es un tipo de antígeno que produce una respuesta inmunitaria anormalmente vigorosa en la que el sistema inmunitario defiende al organismo contra una amenaza percibida que, de otro modo, sería inofensiva para el cuerpo. En el contexto de la presente invención, se entiende principalmente que el alérgeno comprende una proteína o un péptido. Los alérgenos pueden encontrarse en diversas fuentes, como las excreciones de los ácaros del polvo, el polen o la caspa de las mascotas. También pueden encontrarse en alimentos como los cacahuetes, los frutos secos, el marisco o el crustáceo. encontrar una lista de proteínas alergénicas en la SDAP (base de datos estructural de proteínas alergénicas), que puede consultar en http://fermi.utmb.edu. Todos los alérgenos mencionados en dicha base de datos están contemplados en la presente invención. También se contempla cualquier otro alérgeno conocido por el especialista. El término "epítopo de un alérgeno", tal y como se utiliza aquí, se refiere a un epítopo específico de la clase MHC I o MHC II presente en un alérgeno tal y como se ha definido anteriormente. El empleo de epítopos de un alérgeno puede, en realizaciones específicas, combinarse con la caracterización adicional de los antecedentes alélicos HLA de un receptor. El especialista conocerá más información o podrá obtenerla de fuentes bibliográficas adecuadas, como el "Opinion of the Scientific Panel on Dietetic Products, Nutrition and Allergies on a request from the Commission relating to the evaluation of allergenic foods for labelling purposes", publicado en The EFSA Journal, 2004, 32, 1-197.
En otra realización de la presente invención, el vehículo puede tener un tamaño medio de aproximadamente 1 a 2000 nm, preferentemente de aproximadamente 1 a 1000 nm. El "tamaño del vehículo", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a la combinación del conjugado, tal y como se define en el presente documento, y un portador vacío o sin carga, tal y como se define en el presente documento, o a la combinación del conjugado, tal y como se define en el presente documento, y un portador que incluya o esté asociado a una carga, tal y como se define en el presente documento. El tamaño del vehículo depende en gran medida de la naturaleza y la forma del portador, por ejemplo, un liposoma o una nanopartícula o una proteína, etc. Por lo tanto, puede estar en el rango de 1 nm a 100 nm, o en el rango de aproximadamente 100 nm a 250 nm, o en el rango de 250 nm a 1000 nm, o en el rango de 1000 a 2000 nm. El tamaño del vehículo se adapta ventajosamente al uso previsto para el vehículo, y/o a la forma y naturaleza del portador incluido en el vehículo. Por ejemplo, el vehículo puede utilizarse en un rango de tamaño nanométrico, lo que permite una captación eficaz por una variedad de tipos celulares y una acumulación selectiva del fármaco en los lugares diana. El especialista puede conocer más información a este respecto o puede obtenerse de fuentes bibliográficas adecuadas como Desai et al., 1997, Pharm Res.14,1568-73 o Panyam y Labhasetwar, 2003, Adv Drug Del Rev. 55:329-347. En otras realizaciones se prevé que el tamaño de los vehículos se adapte a la dimensión del torrente sanguíneo. En consecuencia, el vehículo puede tener un tamaño inferior a 5 μm, lo que permite evitar la formación de agregados y reducir el riesgo de desarrollar embolias. El tamaño del vehículo puede, en una realización preferida, medirse preferentemente en una solución acuosa.
En consecuencia, puede medirse la longitud media del vehículo mediante la técnica de dispersión dinámica de la luz (DLS). La técnica DLS es un método físico utilizado para determinar el perfil de distribución del tamaño de pequeñas partículas en suspensión o de polímeros en solución. En el ámbito de la DLS, las fluctuaciones temporales suelen analizarse mediante la función de autocorrelación de intensidad o de fotones. En el análisis en el dominio temporal, la función de autocorrelación (ACF) suele decaer a partir del tiempo de retardo cero, y una dinámica más rápida debida a partículas más pequeñas conduce a una descorrelación más rápida de la traza de intensidad dispersa. Se ha demostrado que la ACF de intensidad es la transformación de Fourier del espectro de potencia, por lo que las mediciones DLS pueden realizarse igualmente bien en el dominio espectral. El especialista conocerá más detalles o podrá obtenerlos de fuentes bibliográficas adecuadas, como Stetefeld et al., 2016, Biophysical Reviews, 8, 4, 409-427.
En una realización preferida, dicha composición comprende además un aditivo. El término "aditivo", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier sustancia o compuesto que facilite (i) la interacción entre el ligando y la célula diana, tal y como se define en el presente documento, (ii) la entrega de la carga en o a la célula diana, tal y como se define en el presente documento, (iii) estabilice el vehículo durante su conservación, almacenamiento y/o uso o (iv) ayude a promover los pasos posteriores asociados con la inducción de actividades en la célula diana, por ejemplo, el escape endosomal o la translocación nuclear del vehículo o la carga y, más concretamente, el procesamiento y la presentación del antígeno en las células Langerina<+>.
Entre los ejemplos de aditivos adecuados previstos se incluyen los iones divalentes. Los iones divalentes preferidos son Ca<2+>o Zn<2+.>Se sabe que la Langerina es una lectina dependiente de iones divalentes, en particular una lectina dependiente de Ca<2+>, en la que la presencia del ion divalente influye en la interacción entre el ligando y su receptor Langerina cognado. Se supone además que la presencia de quelantes como EDTA o EGTA conducirá a una pérdida o función de Langerin, como puede, por ejemplo, deducirse de Valladeau, 2000, Immunity, 12(1), 71-81. En consecuencia, la presente invención prevé particularmente que ningún quelante como el EDTA esté presente en la composición de la invención. En realizaciones específicas, la concentración de iones de calcio, es decir Ca<2+>, puede estar en el intervalo de 4µM a 1mM, por ejemplo de 4-40 µM, de 40 a 500µM, de 500µM a 1 mM o cualquier valor intermedio entre los valores mencionados. En otras realizaciones específicas, la concentración de iones de zinc, es decir, Zn<2+>puede estar en el intervalo de 4µM a 1mM, por ejemplo, de 4-40 µM, de 40 a 500µM, de 500µM a 1 mM o cualquier valor intermedio entre los valores mencionados. En realizaciones específicas, el uso de aditivos puede ajustarse al lugar de aplicación de la composición de la presente invención. En consecuencia, el uso de iones Ca<2+>puede contemplarse únicamente en emplazamientos en los que no se dé una provisión natural de Ca<2+>. Sin querer atarse a la teoría, se cree que la concentración de Ca<2+>en la epidermis humana es de aproximadamente 1-2 mM, lo que se supone que satura todas las Langerinas y las hace funcionales. Es especialmente preferible utilizar un aditivo como el descrito anteriormente en pacientes o situaciones en los que la concentración de Ca<2+>se desvíe del estado típico descrito anteriormente.
Otro ejemplo de aditivo adecuado es un adyuvante. El término "adyuvante", tal como se utiliza en el contexto de la composición definida anteriormente, se refiere en general a un agente inmunológico que modifica el efecto de otros agentes, en particular, el efecto del vehículo que contiene la carga o asociado a la carga como se ha mencionado anteriormente, más concretamente de las entidades de carga como se ha mencionado anteriormente. El adyuvante puede tener, por ejemplo, un efecto potenciador con respecto a las cargas que provocan inmunidad. Los adyuvantes pueden tener además efectos selectivos a medida para las CD o las células Langerina<+>. Es especialmente preferible que se utilice un adyuvante que induzca la maduración de las CD y/o la emigración de las CD de la piel a los ganglios linfáticos, lo que normalmente conduce a una activación de las células T. Ejemplos de adyuvantes preferidos incluyen compuestos inmunológicamente activos como hidróxido de aluminio, aceite de parafina, MF59, AS03, MPL, QS21, AS04, AS01, AS02, IC31, CpG-Oligonucleótidos, ISCOMATRIX o virosomas, Freund-Adjuvans incompletos, KLH o BCG.
Otro ejemplo de aditivo adecuado es un factor que promueva la unión del ligando del vehículo a la Langerina. Dicho factor promotor puede ser, por ejemplo, un activador alostérico de la función proteica, por ejemplo, una molécula pequeña como las descritas en Aretz et al., 2018, Am. Chem. Soc., 140, 44, 14915-14925, o un anticuerpo o un aptámero. El factor promotor también puede ser un metal que permita una unión más estrecha de la unión del carbohidrato.
En realizaciones preferidas, una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se proporciona en forma de líquido. Puede tratarse, por ejemplo, de una solución líquida, una emulsión o una suspensión. En otras realizaciones, la composición puede comprender un disolvente como H2O, una solución acuosa de sacarosa, un tampón, por ejemplo una solución salina tamponada con fosfato, un tampón tricina o un tampón HEPES. También se contempla la combinación de los sistemas acuosos y aditivos antes mencionados, por ejemplo, cualquiera de ellos y dimetilsulfóxido (DMSO). El DMSO puede utilizarse en cualquier cantidad o concentración adecuada hasta aproximadamente un 15 % vol, por ejemplo, en una concentración de aproximadamente 5 % vol, 7 % vol, 8 % vol, 9 % vol, 10 % vol, 12 % vol o 15 % vol. También tensioactivos como Tween o TritonX pueden actuar como aditivos y pueden utilizarse en el contexto de la presente invención.
En otra realización preferida, la composición farmacéutica según la presente invención comprende el vehículo como se ha definido anteriormente, es decir, incluyendo la carga, en cualquier cantidad adecuada. La cantidad puede ajustarse en función de la forma o el tipo de portador, por ejemplo liposoma, nanopartícula, proteína, etc. Además, la cantidad de vehículo puede ajustarse de acuerdo con el número de receptores que deban unirse, así como con la ubicación de una célula diana; por ejemplo, la piel u otros tejidos pueden requerir diferentes cantidades de vehículo. Se prefiere que el vehículo se proporcione en una cantidad de aproximadamente 0,5 a 30 mol%, más preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 1 a 10 mol%, aún más preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 4 a 6 mol%, más preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 4,75 a 5 mol%. En una realización típica, los valores aproximadamente mencionados se aplican a los liposomas, por ejemplo, como se define en . En otros portadores alternativos, la cantidad puede variar y adaptarse según cálculos adecuados conocidos por el especialista.
En otras realizaciones específicas, la composición farmacéutica según la presente invención comprende el vehículo tal como se ha definido anteriormente, es decir, incluyendo la carga, en cualquier densidad adecuada. La densidad puede ajustarse de acuerdo con la forma o el tipo de portador, por ejemplo, liposoma, nanopartícula, proteína, etc. Además, la densidad del vehículo puede ajustarse de acuerdo con el número de receptores que deban unirse, así como con la ubicación de una célula diana; por ejemplo, la piel u otros tejidos pueden requerir una densidad diferente del vehículo. Se prefiere que el vehículo se proporcione en una densidad de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,08 vehículos por nm<2>, más preferiblemente en una densidad de aproximadamente 0,065 vehículos por nm<2>, por ejemplo, aproximadamente 0,067 vehículos por nm<2>para un portador de un diámetro de aproximadamente 160 nm. También se prevén otros valores de densidad adecuados, que pueden determinarse en función del tamaño o el diámetro del portador, por ejemplo, el liposoma. Se prevé además que la densidad se ajuste de forma que la distancia entre dos vehículos sea de aproximadamente 4,4 nm. Según una realización específica, el cálculo de las densidades adecuadas de los vehículos puede basarse en un valor de concentración de lípidos de unos 26 µM y una concentración media de liposomas de unos 75µM. Estos valores pueden variar y/o adaptarse en función del tipo de liposoma, el tamaño, el diámetro o el tipo de portador, la forma y el tamaño del vehículo, etc. Pueden obtenerse más detalles sobre el cálculo y la adaptación de la densidad de vehículos en un portadorsegún la presente invención de fuentes bibliográficas adecuadas como Güven et al., 2009, Journal of Liposome Research, 19, 2, 148-154 o Methods of Enzymology, Vol. 391, 2005, Liposomes, Part E, Chapter 13, Use of Liposomes to deliver Bactericides to bacterial biofilms, p.21.
Según la presente invención, la composición farmacéutica comprende el vehículo tal como se ha definido anteriormente, en el que el portador comprende o está asociado a una carga farmacéuticamente activa, por ejemplo, tal como se ha definido anteriormente. Es particularmente preferible que dicha composición farmacéutica comprenda un vehículo como el definido anteriormente, en el que el portador comprenda o esté asociado a una carga seleccionada entre cualquiera de las siguientes: una molécula pequeña , un péptido, una proteína, una sustancia citotóxica, un ácido nucleico, un metal, un radionúclido, un virus, un virus modificado, un vector viral, un inoculante, un plásmido, un sistema multicomponente, un compuesto farmacéuticamente activo como un inhibidor de la función celular, p. ej. un inhibidor de la apoptosis, un compuesto inmunológicamente activo que incluya un compuesto capaz de provocar una reacción inmunológica en el organismo, un inmunomodulador y un inductor de la tolerancia inmunológica, o un antígeno o epítopo del cáncer o un compuesto que comprenda un antígeno o epítopo del cáncer, un antígeno o epítopo de una enfermedad autoinmune o un compuesto que comprenda un antígeno o epítopo de una enfermedad autoinmune, un antígeno bacteriano o un compuesto que comprenda un antígeno o epítopo bacteriano, un antígeno vírico o un compuesto que comprenda un antígeno o epítopo vírico, un antígeno parasitario o un compuesto que comprenda un antígeno o epítopo parasitario, o un alérgeno, o un epítopo de un alérgeno, o un compuesto que comprenda un alérgeno o un epítopo de un alérgeno. También se contemplan uno o más ingredientes o componentes necesarios para un enfoque terapéutico génico o de edición molecular como, por ejemplo, los componentes CRISPR/Cas o TALEN descritos en el presente documento. Se prefiere además que todos los elementos mencionados correspondan a los definidos aquí en el contexto de la carga, incluidos ejemplos adicionales de los elementos mencionados. También se prevén combinaciones de las cargas mencionadas, por ejemplo, una proteína y un ácido nucleico, o un virus o vector viral y una proteína, o una molécula pequeña y un ácido nucleico o proteína, etc. Particularmente preferidas son las combinaciones de adyuvantes y antígenos, por ejemplo, como los definidos anteriormente, o complejos ARN-proteína, etc., por ejemplo, para enfoques terapéuticos génicos o de edición molecular como los definidos aquí.
Opcionalmente, es decir, en ciertas realizaciones, la composición farmacéutica definida anteriormente comprende un portador farmacéuticamente aceptable o un adyuvante farmacéutico. El término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales, y más particularmente en humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente, excipiente o vehículo farmacéutico con el que se administra la carga o terapéutica. Dicho portador es farmacéuticamente aceptable, es decir, no es tóxico para el receptor a la dosis y concentración empleadas. Es preferiblemente isotónico, hipotónico o débilmente hipertónico y tiene una fuerza iónica relativamente baja, como la que proporciona una solución de sacarosa. Dichos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, como el agua y los aceites, incluidos los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, como el aceite de cacahuete, de soja, mineral, de sésamo y similares. También pueden emplearse como portadores líquidos soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol. Entre los excipientes farmacéuticos adecuados se encuentran el almidón, la glucosa, la sacarosa, la gelatina, la malta, el arroz, la harina, la tiza, el gel de sílice, el estearato de sodio, el monoestearato de glicerol, el talco, el ion sódico, la leche desnatada en polvo, el glicerol, el propilenglicol, el agua, el etanol y similares. La composición, si se desea, puede contener también pequeñas cantidades de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes amortiguadores del pH. Estas composiciones pueden adoptar la forma, por ejemplo, de soluciones, suspensiones, emulsiones, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. Algunos ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se describen, por ejemplo, en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E.W. Martin. Otros ejemplos de sustancias que pueden servir como portadores farmacéuticos son los azúcares, como la glucosa y la sacarosa; los almidones, como el almidón de maíz y el almidón de patata; la celulosa y sus derivados, como la carboximetilcelulosa sódica, la etilcelulosa y los acetatos de celulosa; el traganto en polvo; la malta; la gelatina; el talco; los ácidos esteárico; el estearato de magnesio; el sulfato cálcico; el carbonato cálcico; aceites vegetales, como los de cacahuete, semilla de algodón, sésamo, oliva, maíz y teobroma; polioles como el propilenglicol, la glicerina, el sorbitol, el manitol y el polietilenglicol; agar; ácidos algínicos; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; extractos de arándano rojo y solución amortiguadora de fosfatos; leche desnatada en polvo; así como otras sustancias compatibles no tóxicas utilizadas en formulaciones farmacéuticas como la vitamina C, el estrógeno y la equinácea, por ejemplo. También pueden estar presentes agentes humectantes y lubricantes como el lauril sulfato sódico, así como colorantes, aromatizantes, lubricantes, excipientes, agentes de comprimidos, estabilizantes, antioxidantes y conservantes. En ciertas realizaciones, los ingredientes de la composición farmacéutica pueden administrarse en forma encapsulada, por ejemplo, como encapsulado de celulosa, en gelatina, con poliamidas, matrices de cera o con ciclodextrinas encapsuladas.
Por lo general, los ingredientes pueden suministrarse por separado o mezclados en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como polvo seco liofilizado o concentrado sin agua en un recipiente herméticamente cerrado, como una ampolla o sobre que indique la cantidad de agente activo.
En una realización específica, la composición farmacéutica se formula de acuerdo con procedimientos rutinarios como una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa a seres humanos. Típicamente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. En caso necesario, la composición puede incluir también un agente solubilizante y un anestésico local, como la lignocaína, para aliviar el dolor en el lugar de la inyección. Cuando la composición vaya a administrarse por infusión, puede dispensarse con un frasco de infusión que contenga agua estéril de calidad farmacéutica o solución salina. Cuando la composición se administre por inyección, puede suministrarse una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina para que los ingredientes puedan mezclarse antes de la administración.
El término "adyuvante farmacéutico", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a ingredientes adicionales como la cloroquina, compuestos polares próticos, como el propilenglicol, el polietilenglicol, el glicerol, el EtOH, la 1-metil L-2-pirrolidona o sus derivados, o compuestos polares apróticos como dimetilsulfóxido (DMSO), dietilsulfóxido, di-n-propilsulfóxido, dimetilsulfona, sulfolano, dimetilformamida, dimetilacetamida, tetrametilurea, acetonitrilo o sus derivados. El adyuvante farmacéutico puede ser además uno o varios de los siguientes: un tensioactivo, un agente humectante, un agente dispersante, un agente de suspensión, un tampón, un estabilizador o un agente isotónico. Además, un adyuvante puede promover la unión del vehículo/ligando a la Langerina. La presente invención también contempla cualquier adyuvante farmacéutico adecuado conocido por el especialista. Los compuestos mencionados se añaden en condiciones que respetan las limitaciones de pH.
La composición farmacéutica de la presente invención también puede comprender un conservante. Los conservantes según ciertas composiciones de la invención incluyen, sin limitación: butilparabeno; etilparabeno; imidazolidinilurea; metilparabeno; O-fenilfenol; propilparabeno; cuaternio-14; cuaternio-15; deshidroacetato sódico; piritiona de zinc; y similares. Los conservantes se utilizan en cantidades eficaces para prevenir o retardar el crecimiento microbiano. Generalmente, los conservantes se utilizan en cantidades de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 1% en peso de la composición total, siendo preferibles de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 0,8% y de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 0,5% los más preferidos.
La composición de la presente invención puede administrarse a un sujeto o paciente. Los términos "sujeto" o "paciente" se refieren a un mamífero. El término "mamífero", tal como se utiliza en el presente documento, tiene el mismo significado que el comúnmente entendido por una persona con conocimientos ordinarios en la materia. Los mamíferos preferidos son primates, vacas, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, conejos, ratas, ratones y similares. En realizaciones particularmente preferidas, el sujeto es un ser humano.
Por "administrado" se entiende la administración de una dosis terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica mencionada por cualquier vía adecuada. Por "cantidad terapéuticamente eficaz" se entiende una dosis que produce los efectos para los que se administra en un paciente. La dosis exacta dependerá de la finalidad del tratamiento, y será determinable por un especialista en la materia mediante técnicas conocidas. Como se conoce en la técnica y se describe en el presente documento, puede ser necesario realizar ajustes en función de la administración sistémica frente a la localizada, la edad, el peso corporal, el estado general de salud, el sexo, la dieta, el momento de la administración, la interacción con el fármaco y la gravedad de la afección, y los especialistas en la materia podrán determinarlo con experimentación rutinaria. Se prefiere que la administración sea localizada, más preferiblemente, que la administración sea tópica, en particular sobre o a través de la piel.
La composición farmacéutica puede utilizarse tanto en terapia humana como veterinaria, preferentemente en terapia humana. Los vehículos descritos en el presente documento asociados a cargas que tengan la actividad terapéutica deseada pueden administrarse en un portador fisiológicamente aceptable a un paciente, tal como se describe en el presente documento. Dependiendo de la forma de administración, estos elementos pueden formularse de diversas maneras, como se expone a continuación. La concentración de los vehículos descritos en el presente documento que se asocian con cargas que tienen la actividad terapéutica deseada en la formulación puede variar de aproximadamente 0,00001-100 % en peso. Por ejemplo, la formulación puede proporcionar el vehículo en una cantidad de aproximadamente 0,5 a 30 mol%, más preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 1 a 10 mol%, aún más preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 4 a 6 mol%, más preferiblemente en una cantidad de aproximadamente 4,75 a 5 mol%. En una realización típica, los valores aproximadamente mencionados se aplican a los liposomas, por ejemplo, tal como se definen en el presente documento. En otros portadores alternativos, la cantidad puede variar y adaptarse según cálculos adecuados conocidos por el especialista.
También se contemplan formulaciones que comprenden el vehículo en una densidad adecuada. Por consiguiente, en otras realizaciones específicas, la composición farmacéutica según la presente invención puede comprender el vehículo como se ha definido anteriormente, es decir, incluyendo la carga, en cualquier densidad adecuada, que puede ajustarse de acuerdo con la forma o el tipo de portador, por ejemplo, liposoma, nanopartícula, proteína, etc. Además, la densidad del vehículo puede ajustarse en función al número de receptores que deban unirse, así como de la ubicación de una célula diana; por ejemplo, la piel u otros tejidos pueden requerir una densidad diferente del vehículo. Se prefiere que el vehículo se proporcione en una densidad de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,08 vehículos por nm<2>, más preferiblemente en una densidad de aproximadamente 0,065 vehículos por nm<2>, por ejemplo, aproximadamente 0,067 vehículos por nm<2>para un portador de un diámetro de aproximadamente 160 nm. También se prevén otros valores de densidad adecuados, que pueden determinarse en función del tamaño o el diámetro del portador, por ejemplo, el liposoma. Se prevé además que la densidad se ajuste de forma que la distancia entre dos vehículos sea de aproximadamente 4,4 nm. Según una realización específica, el cálculo de las densidades adecuadas de los vehículos puede basarse en un valor de concentración de lípidos de unos 26 µM y una concentración media de liposomas de unos 75 µM. Estos valores pueden variar y/o adaptarse en función del tipo de liposoma, el tamaño, el diámetro o el tipo de portador, la forma y el tamaño del vehículo, etc. Pueden obtenerse más detalles sobre el cálculo y la adaptación de la densidad de vehículos en un portador según la presente invención a partir de fuentes bibliográficas adecuadas, como Methods of Enzymology, Vol. 391, 2005, Liposomes, Part E, Chapter 13, Use of Liposomes to deliver Bactericides to bacterial biofilms, p.21.
La concentración de los compuestos de una composición farmacéutica según la presente invención puede ajustarse además al régimen de dosificación previsto, a la duración de uso prevista, a la cantidad y proporción exactas de todos los ingredientes de la composición y a otros factores y parámetros conocidos por el especialista en la materia.
Los vehículos aquí descritos que se asocian con cargas que tienen la actividad terapéutica deseada según la presente invención pueden administrarse solos o en combinación con otros tratamientos. Se prevén tratamientos combinados para la inmunoterapia del cáncer, por ejemplo mediante la administración conjunta de inhibidores del punto de control como los anticuerpos anti-CTLA-4 y anti-PD1, para la quimioterapia, por ejemplo mediante la administración conjunta de agentes alquilantes o inhibidores de la ADN y ARN polimerasa, para la terapia antivírica, por ejemplo mediante la administración conjunta de inhibidores de la entrada, de la proteasa o de la ADN y ARN polimerasa y para la terapia de enfermedades autoinmunes, por ejemplo mediante la administración conjunta de glucocorticoides o inhibidores de la inmunofilina.
La administración de la composición farmacéutica puede realizarse de diversas maneras. La administración puede ser, por ejemplo, oral, intravenosa, tópica, corneal, nasal, subcutánea, intradérmica o transdérmica. En otras realizaciones, la administración es para la vacunación, o para la administración a través de los folículos pilosos. Además, las vías alternativas de administración incluyen, sin limitación, la administración ocular o intratumoral o mediante inyección intraesternal.
En otras realizaciones, la administración puede llevarse a cabo con un dispositivo médico específico, por ejemplo, una aguja, una pistola de vacunación, un esparadrapo/adhesivo o un inhalador, como se explicará en detalle más adelante. La presente invención se centra en los enfoques de vacunación. El término "vacunación" en general se refiere a la administración de material antigénico (por ejemplo, como una vacuna) para estimular el sistema inmunológico de un individuo. En consecuencia, la composición farmacéutica aquí definida puede administrarse como una vacuna. Una vacuna puede ser (i) una vacuna inactivada, (ii) una vacuna atenuada, (iii) una vacuna de subunidades o (iv) una vacuna de ADN. El término "vacuna inactivada" se refiere a una vacuna o composición que comprende partículas infectantes que fueron cultivadas y posteriormente muertas o destruidas, preferentemente mediante calor o formaldehído. Tales partículas infectantes, por ejemplo los virus, normalmente no pueden replicarse, pero ciertas proteínas, por ejemplo las proteínas de la cápside, están lo suficientemente intactas como para ser reconocidas por el sistema inmunitario y evocar una respuesta. El término "vacuna atenuada" se refiere a una vacuna o composición que comprende partículas infectantes vivas con una virulencia baja. Normalmente, las partículas infectantes vivas atenuadas pueden reproducirse, pero muy lentamente. Estas vacunas pueden producirse por cualquier método adecuado conocido por el especialista, normalmente mediante cultivos de tejidos infectantes que seleccionarán cepas menos virulentas, o mediante mutagénesis o deleciones dirigidas en genes necesarios para la virulencia. El término "vacuna de subunidad" se refiere a una vacuna o composición que comprende un antígeno, que se proporciona al sistema inmunitario sin la introducción de partículas infectantes, enteras o no. Una vacuna de subunidad puede producirse por cualquier método adecuado conocido por el especialista en la materia. Típicamente, la producción puede implicar el aislamiento de una proteína o porción de proteína específica o de estructuras de azúcar y su administración como vacuna o composición vacunal. La estrategia de subunidades puede utilizarse además para la presentación de antígenos cancerígenos adecuados. El término "vacuna de ADN" se refiere a las composiciones de ADN creadas a partir del ADN de un agente infeccioso o que codifican los componentes estructurales correspondientes, que normalmente se inserta en células, por ejemplo humanas o animales, y se expresa en ellas. En consecuencia, la vacuna de ADN puede codificar cualquier antígeno o epítopo tal y como se ha definido anteriormente. Las vacunas de la presente invención pueden administrarse a un sujeto o individuo por cualquier método adecuado, preferentemente mediante inyección utilizando una jeringa convencional o una pistola génica o gen de vacunación, como el sistema de administración génica Accell®. Se prefiere especialmente la administración de ADN en células de la epidermis, ya que este modo de administración proporciona acceso a las células linfoides asociadas a la piel y permite una presencia transitoria de ADN en el receptor. Tanto los ácidos nucleicos como las proteínas/péptidos pueden inyectarse por vía subcutánea, epidérmica, intradérmica, intramucosa como la nasal, rectal y vaginal, intraperitoneal, intravenosa, oral o intramuscular. Otros modos de administración incluyen la administración oral y pulmonar, supositorios, inyección sin aguja, aplicaciones transcutáneas y transdérmicas. Si se emplean sólidos como agentes auxiliares para la formulación de la vacuna, se administra, por ejemplo, un adsorbato o una mezcla en suspensión del ingrediente de la vacuna con el agente auxiliar. En realizaciones especiales, la vacuna se administra como solución, o vacuna líquida, respectivamente, en un disolvente acuoso. Se prefiere que la administración sea epidérmica, intradérmica o intramucosa.
En una realización especialmente preferida, la administración se realiza a través de los folículos pilosos. El método se basa en la constatación de que la unidad pilosebácea (formada por el folículo piloso y la glándula sebácea) puede desempeñar un papel en el transporte pasivo de fármacos a la piel. Para alcanzar la epidermis y salir de la piel a la circulación, la composición farmacéutica debe penetrar además en las capas de queratinocitos que rodean el tallo piloso. Mediante el uso de partículas como las nanopartículas de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), la composición farmacéutica puede mantenerse en los folículos pilosos, lo que permite la perfusión del fármaco en la piel. También puede utilizarse un efecto depot. Opcionalmente, puede emplearse el adyuvante bis-(3',5')-monofosfato de adenosina dimérico cíclico.
Otras vías de administración previstas son la iontoforesis, las microagujas, el láser y los inyectores a chorro.
Las microagujas suelen considerarse parte de un parche transdérmico, que se coloca sobre la piel para administrar la composición farmacéutica o una parte de ella a la piel y a través de ella. Las microagujas son típicamente más pequeñas que un cabello humano, compuestas de metales, Si o polímeros biodegradables. Normalmente, las microagujas se suministran en forma de matriz. Ventajosamente, el uso de las microagujas es prácticamente indoloro. Una realización preferida del método de las microagujas es el nanoparche.
El término "nanoparche" utilizado aquí se refiere a un conjunto de miles de microproyecciones recubiertas de vacunas que perforan las capas externas de la piel cuando se aplican con un dispositivo aplicador. Las puntas de las microproyecciones de Nanopatch suelen estar recubiertas con un material vacunal que incluye la composición según la presente invención y liberan este material directamente a las grandes cantidades de células inmunitarias que se encuentran inmediatamente debajo de la superficie de la piel. El elemento central de esta tecnología es la propia matriz de Nanopatch, que suele consistir en un cuadrado de 1 cm2 de silicio con ~20.000 microproyecciones en su superficie. La matriz de nanoparches penetra a través de la capa protectora externa de la piel (estrato córneo) y dirige el material activador del sistema inmunitario a las capas ricas en células inmunitarias situadas justo debajo de la capa más externa de la piel utilizando las microproyecciones con un espaciado y una longitud optimizados.
Otra vía de administración preferida es la vía tópica. La administración tópica de la composición farmacéutica de la presente invención es útil cuando el tratamiento deseado afecta a zonas u órganos fácilmente accesibles mediante administración tópica. Para una aplicación tópica, por ejemplo sobre la piel o las mucosas, la composición farmacéutica se formula preferentemente en forma de parche de hidrogel, líquido, crema, pomada, pasta, gel, loción, cinta, película, sublingual, bucal, comprimido, aerosol o supositorio.
El término "parche de hidrogel", tal como se utiliza aquí, se refiere a los parches que están compuestos por una tela no tejida transpirable con una capa de un hidrogel de adherencia avanzada que suele estar protegido por una cubierta de película transparente. El hidrogel es una red de cadenas poliméricas insolubles en agua, que a veces se encuentra como un gel coloidal en el que el agua es el medio de dispersión. Los hidrogeles son polímeros superabsorbentes, naturales o sintéticos, que poseen un grado de flexibilidad similar al del tejido natural, debido a su importante contenido en agua. Según ciertas realizaciones, el hidrogel comprende la composición según la presente invención en una cantidad adecuada.
Una pasta adecuada comprende los vehículos aquí descritos asociados a cargas que tienen la actividad terapéutica deseada según la presente invención suspendidas en un portador. Tales portadores incluyen, entre otros, el petróleo, la parafina blanca blanda, la vaselina amarilla y el glicerol.
La composición farmacéutica también puede formularse con una pomada adecuada que comprenda los componentes activos suspendidos o disueltos en un portador. Tales portadores incluyen, pero no se limitan a, uno o más de glicerol, aceite mineral, aceite líquido, petróleo líquido, petróleo blanco, vaselina amarilla, propilenglicol, alcoholes, triglicéridos, ésteres de ácidos grasos como el éster cetílico, compuesto de polioxietileno y polioxipropileno, ceras como la cera blanca y la cera de abeja amarilla, alcoholes de ácidos grasos como el alcohol cetílico, el alcohol estearílico y el alcohol cetílico-estearílico, ácidos grasos como el ácido esteárico, el estearato de cetilo, lanolina, hidróxido de magnesio, caolín y agua.
Alternativamente, la composición farmacéutica también puede formularse con una loción o crema adecuada que comprenda los componentes activos suspendidos o disueltos en un portador. Dichos portadores incluyen, entre otros, uno o varios aceites minerales como la parafina, aceites vegetales como el aceite de ricino, el aceite de semillas de ricino y el aceite de ricino hidrogenado, monoestearato de sorbitán, polisorbato, ésteres de ácidos grasos como el éster cetílico, cera, alcoholes de ácidos grasos como el alcohol cetílico, el alcohol estearílico, el 2-octildodecanol, el alcohol bencílico, alcoholes, triglicéridos y agua.
La composición farmacéutica también puede formularse como una cinta o adhesivo para aplicación transdérmica. La cinta se adhiere típicamente a la piel como un parche y comprende los componentes activos típicamente en un formato de liberación retardada. Se prevé que el adhesivo sea un adhesivo sensible a la presión en el que pueden haberse introducido en la formulación transdérmica potenciadores de la permeación, a saber, tensioactivos, ácidos grasos, terpenos y disolventes. El adhesivo sensible a la presión suele comenzar como un líquido muy viscoso y pegajoso y permanece en la misma forma durante todo su ciclo de vida de aplicación. Como alternativa, pueden emplearse adhesivos sensibles a la presión a base de caucho, que se compone de caucho natural o sintético, además de aceites, resinas y antioxidantes como agente adhesivo y estabilizador. También se contempla el adhesivo sensible a la presión a base de acrílico, que se prepara a partir de ésteres de acrilato, ácido metacrílico, acrilamida, metacrilamida, N-alcoxialquil o N-alquil-acrilamidas sin o con adición de agente adherente, o el adhesivo sensible a la presión a base de silicona, que se prepara principalmente a partir de goma y resina . La resina es un producto resultante de la reacción de hidrosol silícico o polisilícico con trimetilclorosilano.
La "administración sublingual" se refiere a la vía de administración farmacológica por la que las sustancias se difunden en la sangre a través de los tejidos situados bajo la lengua. Cuando la sustancia entra en contacto con la mucosa situada bajo la lengua, se absorbe. Dado que el tejido conjuntivo bajo el epitelio contiene una profusión de capilares, la sustancia se difunde entonces en ellos y entra en la circulación venosa. Las formas típicas de administración sublingual son los comprimidos sublinguales, las tiras sublinguales, las gotas sublinguales, el aerosol sublingual, las pastillas, etc.
De forma similar a la administración sublingual, la administración bucal se refiere a una vía de administración tópica por la que los fármacos mantenidos o aplicados en la zona bucal (en la mejilla) se difunden a través de la mucosa oral y entran directamente en el torrente sanguíneo o son captados por las células presentadoras de antígeno positivas a la Langerina que residen en el tejido. Se cree que la administración bucal proporciona una mejor biodisponibilidad y un inicio de acción más rápido en comparación con la administración oral porque el medicamento no pasa por el aparato digestivo y evita así el metabolismo de primer paso. Los enfoques modernos para la administración bucal previstos para la presente invención incluyen materiales compuestos como las películas mucoadhesivas a base de nanofibras. Estos materiales suelen constar de una capa mucoadhesiva, una capa de reserva para permitir la liberación controlada del portador. Se prefiere que los materiales incluyan nanopartículas a base de lípidos y una capa protectora posterior. Además, se prevé el uso de potenciadores de la permeabilidad, como tensioactivos, ácidos grasos y aminoácidos catiónicos y aniónicos, que pueden aumentar ventajosamente la biodisponibilidad bucal. Pueden obtenerse más detalles de fuentes bibliográficas adecuadas, como Morales et al., 2017, Curr Opin Pharmacol, 36, 22-28.
Alternativamente, la composición farmacéutica también puede formularse con un gel adecuado que comprenda los componentes activos suspendidos o disueltos en un portador. Dichos portadores incluyen, entre otros, uno o varios de los siguientes: agua, glicerol, propilenglicol, parafina líquida, polietileno, aceites grasos, derivados de la celulosa, bentonita y dióxido de silicio coloidal.
Los preparados según la invención pueden comprender, en general, otros auxiliares que se utilizan habitualmente en dichos preparados, por ejemplo, conservantes, perfumes, antiespumantes, colorantes, pigmentos, espesantes, sustancias tensioactivas, emulsionantes, emolientes, agentes de acabado, grasas, aceites, ceras u otros constituyentes habituales, de una formulación cosmética o dermatológica, como alcoholes, polioles, polímeros, estabilizadores de espuma, promotores de solubilidad, electrolitos, ácidos orgánicos, disolventes orgánicos o derivados de silicona.
La composición farmacéutica según la invención puede comprender emolientes. Los emolientes pueden utilizarse en cantidades que sean eficaces para prevenir o aliviar la sequedad. Entre los emolientes útiles se incluyen, sin limitación aceites y ceras de hidrocarburos; aceites de silicona; ésteres de triglicéridos; ésteres de acetoglicéridos; glicéridos etoxilados; ésteres alquílicos; ésteres alquenílicos; ácidos grasos; alcoholes grasos; éteres de alcoholes grasos; éteres; lanolina y derivados; alcoholes polihídricos (polioles) y derivados poliéteres; ésteres de alcoholes polihídricos (polioles); ésteres de ceras; derivados de la cera de abeja; ceras vegetales; fosfolípidos; esteroles; y amidas.
Así, por ejemplo, los emolientes típicos incluyen el aceite mineral, especialmente los aceites minerales que tienen una viscosidad en el rango de 50 a 500 SUS, el aceite de lanolina, el aceite de visón, el aceite de coco, la manteca de cacao, el aceite de oliva, el aceite de almendras, el aceite de nuez de macadamia, extracto de aloa, aceite de jojoba, aceite de cártamo, aceite de maíz, lanolina líquida, aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuete, aceite de purcelina, perhidroescualeno (escualeno), aceite de ricino, polibuteno, alcoholes minerales inodoros, aceite de almendras dulces, aceite de aguacate, aceite de calófilo, aceite de ricino, acetato de vitamina E, aceite de oliva, alcoholes minerales, alcohol cetearílico (mezcla de alcoholes grasos compuesta predominantemente por alcoholes cetílico y estearílico), alcohol linolénico, alcohol oleílico, octil dodecanol, aceite de gérmenes de cereales como el aceite de germen de trigo octanoato de cetearilo (éster de alcohol cetearílico y ácido 2-etilhexanoico), palmitato de cetilo, adipato de diisopropilo, palmitato de isopropilo, palmitato de octilo, miristato de isopropilo, miristato de butilo, estearato de glicerilo, estearato de hexadecilo, estearato de isacetilo, estearato de octilo , estearato de octilhidroxi, estearato de propilenglicol, estearato de butilo, oleato de decilo, oleato de glicerilo, acetilglicéridos, los octanoatos y benzoatos de alcoholes (C12-C15), los octanoatos y decanoatos de alcoholes y polialcoholes como los de glicol y glicerol, y los oleatos de alcoholes y polialcoholes como los de adipato de isopropilo, laurato de hexilo, dodecanoato de octilo, copoliol dimeticona, dimeticonol, lanolina, alcohol de lanolina, cera de lanolina, lanolina hidrogenada, lanolina hidroxilada, lanolina acetilada, vaselina, lanolato de isopropilo, miristato de cetilo, miristato de glicerilo, miristato de miristilo, lactato de miristilo, alcohol cetílico, alcohol isostearílico, alcohol estearílico y lanolato de isacetilo, y similares.
Además, la composición farmacéutica según la invención también puede comprender emulsionantes. Los emulsionantes (es decir, los agentes emulsionantes) se utilizan preferentemente en cantidades eficaces para proporcionar una mezcla uniforme de los ingredientes de la composición. Entre los emulgentes útiles se incluyen (i) aniónicos como jabones de ácidos grasos, por ejemplo, estearato de potasio, estearato de sodio, estearato de amonio y estearato de trietanolamina; monoésteres de ácidos grasos de poliol que contienen jabones de ácidos grasos, por ejemplo, monoestearato de glicerilo que contengan sal de potasio o de sodio; ésteres sulfúricos (sales de sodio), por ejemplo, lauril 5 sulfato de sodio y sulfato de cetilo y poliol monoésteres de ácidos grasos que contengan ésteres sulfúricos, por ejemplo, monoestearato de glicerilo que contienen laurilsulfato de sodio; (ii) cloruros catiónicos como el N(estearoil colamino formilmetil) piridio; el N-soya-N-etil morfosulfato de alquilo; el cloruro de alquil dimetil bencil amonio; el cloruro de diisobutilfenoxiteoxietil dimetil bencil amonio; y el cloruro de cetil piridio; y (iii) no iónicos como los éteres polioxietilénicos de alcoholes grasos, por ejemplo, monoestearato; alcohol laurílico polioxietilénico; éteres de alcoholes grasos polioxipropilénicos, por ejemplo, alcohol oleílico propoxilado; ésteres de ácidos grasos polioxietilénicos, por ejemplo, estearato de polioxietileno; ésteres de ácidos grasos sorbitánicos polioxietilénicos, por ejemplo, monoestearato de sorbitán polioxietilénico; ésteres de ácidos grasos sorbitánicos, por ejemplo, sorbitán; ésteres de ácidos grasos de polioxietilenglicol, por ejemplo, monoestearato de polioxietilenglicol; y ésteres de ácidos grasos de polioles, por ejemplo, monoestearato de glicerilo y monoestearato de propilenglicol; y derivados etoxilados de lanolina, por ejemplo, lanolinas etoxiladas, alcoholes de lanolina etoxilados y colesterol etoxilado.
La composición farmacéutica según la invención también puede incluir un tensioactivo. Los tensioactivos adecuados pueden incluir, por ejemplo, aquellos tensioactivos generalmente agrupados como agentes limpiadores, agentes emulsionantes, potenciadores de la espuma, hidrotropos, agentes solubilizantes, agentes de suspensión y no tensioactivos (facilitan la dispersión de sólidos en líquidos).
Los tensioactivos suelen clasificarse en anfóteros, aniónicos, catiónicos y no iónicos. Los tensioactivos anfóteros incluyen los acilaminoácidos y derivados y los N-alquilaminoácidos. Los tensioactivos aniónicos incluyen: acilaminoácidos y sales, como, acilglutamatos, acilpéptidos, acilsarcosinatos y aciltauratos; ácidos carboxílicos y sales, como, ácidos alcanoicos, ácidos carboxílicos ésteres y ácidos carboxílicos éteres; ácidos sulfónicos y sales, como, isetionatos de acilo, alquilaril sulfonatos, alquil sulfonatos y sulfosuccinatos; ésteres de ácido sulfúrico, como, alquil éter sulfatos y alquil sulfatos. Los tensioactivos catiónicos incluyen: alquilaminas, alquilimidazolinas, aminas etoxiladas y cuaternarios (como, sales de alquilbencilmetilamonio, alquilbetainas, sales de amonio heterocíclico y sales de tetraalquilamonio). Y los tensioactivos no iónicos incluyen alcoholes, como los alcoholes primarios que contienen de 8 a 18 átomos de carbono; alcanolamidas, como las amidas derivadas de las alcanolaminas y las amidas etoxiladas; óxidos de amina; ésteres como los ácidos carboxílicos etoxilados, los glicéridos etoxilados, los ésteres de glicol y derivados, los monoglicéridos, los ésteres poliglicerílicos, los ésteres y éteres de alcoholes polihídricos, los ésteres de sorbitán/sorbitol y los triésteres del ácido fosfórico; y éteres como los alcoholes etoxilados, la lanolina etoxilada, los polisiloxanos etoxilados y los éteres de polioxietileno propoxilados.
En caso de suministro de la composición farmacéutica en forma de película, ésta puede comprender un formador de película. Los formadores de película adecuados que se utilizan de acuerdo con la invención mantienen la composición lisa y uniforme e incluyen, sin limitación: copolímero de acrilamida/acrilato de sodio; copolímero de acrilatos de amonio; Bálsamo de Perú; goma de celulosa; copolímero de etileno/anhídrido maleico; hidroxietilcelulosa; hidroxipropilcelulosa; poliacrilamida; polietileno; alcohol polivinílico; copolímero de pvm/MA (polivinilmetiléter/anhídrido maleico); PVP (polivinilpirrolidona); copolímero de anhídrido maleico como PA-18 disponible en Gulf Science and Technology; copolímero de PVP/hexadeceno como Ganex V-216 disponible en GAF Corporation; copolímero de acrilolacrilato; y similares.
Generalmente, los formadores de película pueden utilizarse en cantidades de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 10% en peso de la composición total, siendo preferibles de aproximadamente 1% a aproximadamente 8% y más preferibles de aproximadamente 0,1 DEG/O a aproximadamente 5%. También pueden utilizarse humectantes en cantidades eficaces, entre ellos: fructosa; glucosa; ácido glulámico; glicerina; miel; maltitol; metilglucet-10; metilglucet-20; propilenglicol; lactato sódico; sacarosa; y similares.
En otra realización de la presente invención, la composición farmacéutica puede administrarse por inhalación. En consecuencia, los preparados farmacéuticos pueden presentarse en forma de pulverizador, por ejemplo, un pulverizador de bomba o un aerosol. Típicamente, los aerosoles según la presente invención comprenden el medicamento o la composición farmacéutica, uno o más propelentes clorofluorocarbonados y un tensioactivo o un disolvente, como el etanol. Por ejemplo, pueden utilizarse propelentes para aerosoles como el propelente 11 y/o el propelente 114 y/o el propelente 12. Otros propulsores adecuados para los aerosoles según la invención son el propano, el butano, el pentano y otros. Otros propulsores que pueden utilizarse y que se considera que tienen efectos mínimos de agotamiento de la capa de ozono en comparación con los clorofluorocarburos convencionales son los fluorocarburos y los clorofluorocarburos que contienen hidrógeno. En el documento EP 0372777, por ejemplo, se describen otros aerosoles para formulaciones de aerosoles medicinales. Normalmente, pueden añadirse a las formulaciones uno o varios adyuvantes, como alcoholes, alcanos, dimetiléter, tensioactivos (incluidos tensioactivos fluorados y no fluorados, ácidos carboxílicos, polietoxilatos, etc.) y propelentes clorofluorocarbonados convencionales en pequeñas cantidades.
Se prefiere además el uso de 1,1,1,2-tetrafluoroetano en combinación tanto con un cosolvente que tenga mayor polaridad que el 1,1,1,2-tetrafluoroetano (por ejemplo, un alcohol o un alcano inferior) como con un tensioactivo para conseguir una formulación estable de un polvo de composición farmacéutica. Además, los tensioactivos pueden utilizarse como componentes importantes de las formulaciones en aerosol, con el fin de reducir la agregación de la composición farmacéutica y lubricar, por ejemplo, las válvulas de un aparato de dispersión, si se emplean según otra realización preferida de la presente invención, garantizando así una reproducibilidad constante del accionamiento de la válvula y la precisión de la dosis dispensada. Típicamente, la composición farmacéutica según la presente invención puede recubrirse previamente con tensioactivo antes de su dispersión en 1,1,1,2-tetrafluoroetano.
En otra realización preferida de la presente invención, una formulación farmacéutica en aerosol puede dispersarse con cualquier aparato adecuado conocido por el especialista en la materia, preferentemente a través de un inhalador dosificador (MDI), un nebulizador, un Rotahaler o un aparato autohalador.
La administración oral puede realizarse mediante la complejación de la composición aquí definida con un portador capaz de resistir la degradación por enzimas digestivas en el intestino de un animal. Ejemplos de tales portadores incluyen cápsulas o comprimidos de plástico, como los conocidos en la técnica.
Un supositorio adecuado puede comprender la composición aquí definida junto con dióxido de silicio coloidal, y una base oleaginosa que incluya triglicéridos.
Opcionalmente, pueden emplearse ensayos, por ejemplo, derivados de fuentes bibliográficas conocidas y cualificadas, para ayudar a identificar las proporciones y/o rangos de dosificación óptimos para los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la presente invención. La dosis precisa y la proporción entre los ingredientes de la composición farmacéutica definida anteriormente que se emplearán en la formulación dependerán también de la vía de administración y del tipo exacto de enfermedad o trastorno, y deberán decidirse según el criterio del profesional y las circunstancias de cada paciente. Las dosis eficaces o las proporciones de los ingredientes pueden extrapolarse a partir de curvas dosis-respuesta derivadas de sistemas de ensayo in vitro o de modelos (animales).
Típicamente, el médico tratante y los factores clínicos pueden determinar el régimen de dosificación. Como es bien sabido en las artes médicas, las dosis para cualquier paciente dependen de muchos factores, como el tamaño del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto concreto que se va a administrar, el sexo, el momento y la vía de administración, el estado general de salud y otros fármacos que se administren simultáneamente. Una dosis típica puede estar, por ejemplo, en el rango de 0,001 a 1000 mg; sin embargo, también se prevén dosis por debajo o por encima de este rango ejemplar, especialmente teniendo en cuenta los factores antes mencionados.
En una realización preferida, la composición farmacéutica tal como se define en el presente documento es para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad o condición patológica.
Una "enfermedad" o "afección patológica", tal y como se utiliza aquí, es cualquier afección que se beneficiaría de un tratamiento con una composición farmacéutica tal y como se ha definido anteriormente, en particular con un vehículo en el que el portador comprende o está asociado a una carga, preferiblemente una carga tal y como se ha definido anteriormente.
Los términos "tratar" o "tratamiento", a menos que el contexto indique lo contrario, se refieren al tratamiento terapéutico y/o a las medidas profilácticas para prevenir el brote o la recaída de una enfermedad o condición patológica, en los que el objetivo es inhibir o ralentizar (disminuir) una condición fisiológica no deseada. A efectos de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, entre otros, el alivio de los síntomas, la disminución de la extensión de la enfermedad, la estabilización (es decir, el no empeoramiento) del estado de la enfermedad, el retraso o la ralentización de la progresión de la enfermedad, la mejora o paliación del estado de la enfermedad y la remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Entre los que necesitan tratamiento se incluyen tanto los que ya padecen la enfermedad o trastorno como los propensos a padecerla. El tratamiento puede además, en realizaciones específicas, implicar una única administración de una composición farmacéutica como la definida anteriormente, o administraciones múltiples. El esquema de administración correspondiente puede ajustarse al sexo o al peso del paciente, a la enfermedad, a la composición farmacéutica que vaya a utilizarse, al estado de salud general del paciente, etc. Por ejemplo, el esquema de administración puede contemplar una administración cada 12 h, 24 h, 28 h, 72 h, 96 h, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada 3 semanas, una vez al mes, etc. También se contemplan pausas o descansos entre las fases de administración. Por supuesto, estos regímenes pueden ser ajustados o modificados por el médico en función de la reacción del paciente al tratamiento y/o de la evolución de la enfermedad o del estado patológico.
En una realización particularmente preferida de la presente invención, la composición farmacéutica tal como se define en el presente documento es para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer. El término "cáncer", tal como se utiliza aquí, se refiere a un proceso patológico que tiene como resultado la formación y el crecimiento de una neoplasia cancerosa o maligna, es decir, un tejido anormal que crece por proliferación celular, a menudo más rápidamente de lo normal y que continúa creciendo después de que cesen los estímulos que iniciaron el nuevo crecimiento. Las neoplasias malignas suelen mostrar una falta parcial o total de organización estructural y de coordinación funcional con el tejido normal y la mayoría invaden los tejidos circundantes, hacen metástasis en varios lugares y es probable que reaparezcan tras el intento de extirpación y que causen la muerte del paciente a menos que se traten adecuadamente. Por lo tanto, también incluye la existencia y el desarrollo de metástasis. Tal y como se utiliza aquí, el término "neoplasia" se emplea para describir todos los estados de enfermedad cancerosos y abarca o engloba el proceso patológico asociado a los tumores malignos hematógenos, ascíticos y sólidos. Entre los cánceres representativos se incluyen, por ejemplo, los de estómago, colon, recto, hígado, páncreas, pulmón, mama, cuello uterino, cuerpo uterino, ovario, próstata, incluido el cáncer de próstata metastásico, testículos, vejiga, renal, cerebro/SNC, cabeza y cuello, garganta, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, mieloma múltiple, leucemia, cáncer de piel melanoma, cáncer de piel no melanoma, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielógena aguda, sarcoma de Ewing, cáncer de pulmón de células pequeñas, coriocarcinoma, rabdomiosarcoma, tumor de Wilms, neuroblastoma, leucemia de células pilosas, boca/faringe, esófago, laringe, cáncer de riñón y linfoma También se contemplan otras formas de cáncer conocidas por el especialista o derivadas de fuentes bibliográficas adecuadas como Pavlopoulou et al., 2015, Oncol Rep., 33, 1, 3-18.
El cáncer puede ser, en ciertas realizaciones, un cáncer refractario. Se puede suponer que un cáncer está presente de forma residual si un sujeto ha sido sometido a una intervención quirúrgica como tratamiento contra el cáncer. También se contemplan formas de cáncer metastásico, por ejemplo, de las formas de cáncer antes mencionadas.
Las formas de cáncer antes mencionadas pueden tratarse preferiblemente utilizando antígenos asociados al tumor o antígenos o epítopos del cáncer, tal y como se ha descrito anteriormente, que se proporcionan a las CD de Langerina<+>en forma de cargas, tal y como se ha descrito anteriormente. Estos antígenos o epítopos de los mismos son posteriormente procesados y presentados por las células Langerina<+>a otras células inmunitarias y activan estas células inmunitarias dando lugar a una respuesta inmunitaria, por ejemplo mediante CTL o anticuerpos contra entidades, por ejemplo células, que muestran dicho antígeno o epítopo. La activación de estas células inmunitarias, a su vez, depende de la maduración y activación de las CD de Langerina<+>, lo que puede lograrse mediante la coadministración de adyuvantes adecuados. Ejemplos no limitantes de tales adyuvantes son los agonistas TLR o de los receptores similares al Rig-I (RLR).
También se prevé que se proporcionen diferentes antígenos y/o diferentes epítopos, por ejemplo, derivados de diferentes formas de cáncer, o derivados de diferentes proteínas o glicoproteínas, que pueden estar presentes en la misma célula cancerosa o en el mismo tumor. Estos antígenos o epítopos pueden, por ejemplo, proporcionarse en una proteína de fusión multiantígeno o una proteína multiepítopo (por ejemplo, que comprenda 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más epítopos), o como unidades de antígeno/epítopo individuales que se empaquetan juntas en una carga. Por ejemplo, pueden mezclarse diferentes antígenos y formularse posteriormente en un portador, por ejemplo un liposoma, tal como se define en el presente documento. También se prefiere el uso de diferentes formas moleculares del antígeno/epítopos tumorales dentro de la carga. Por ejemplo, puede proporcionarse como proteína/péptido, o como ácido nucleico.
En una realización adicional, particularmente preferida, el término "cáncer" también se refiere a la histiocitosis de células de Langerhans (HCL), es decir, un cambio canceroso en las células de Langerhans. La histiocitosis de células de Langerhans es una enfermedad rara que implica la proliferación clonal de células de Langerhans. Clínicamente, sus manifestaciones van desde lesiones óseas aisladas hasta la enfermedad multisistémica . La histiocitosis de células de Langerhans forma parte de un grupo de síndromes clínicos denominados histiocitosis, que se caracterizan por una proliferación anormal de histiocitos (es decir, células dendríticas y macrófagos activados). Esta forma de cáncer está relacionada con la leucemia y los linfomas. La enfermedad se manifiesta típicamente en las células Langerina<+>, es decir, células que expresan Langerina en su superficie. Sin querer ceñirnos a la teoría, se cree que la ERK hiperactiva puede impulsar la patogénesis de la HCL. Se cree además que BRAF-V600E está implicado en la HCL de alto riesgo debido a su presencia en las células hematopoyéticas de la médula ósea. Esto puede explicarse, por ejemplo, por un modelo erróneo de CD mieloide de la patogénesis de la HCL en el que el estado de diferenciación celular en el que surge la activación patológica de ERK determina el alcance clínico de la HCL. Otros factores que pueden contribuir a aspectos de la patogénesis son los infiltrados inflamatorios. Por tanto, se supone que la HCL es una neoplasia mieloproliferativa o una neoplasia mieloide inflamatoria. La HCL puede tratarse preferentemente utilizando sustancias citotóxicas, moléculas pequeñas, radionúclidos o proteínas, por ejemplo, anticuerpos adecuados como los anticuerpos contra marcadores de superficie o proteínas presentes en la superficie celular, más concretamente anticuerpos anti-Langerina y/o sistemas multicomponentes como los descritos anteriormente, que se proporcionan a las células Langerina<+>en forma de cargas como las descritas anteriormente. Los anticuerpos adecuados para su uso en el contexto del tratamiento de la HCL incluyen, por ejemplo, anticuerpos contra BRAF V600E basados en el hallazgo de que BRAF V600E. También se contemplan anticuerpos contra otras mutaciones en el contexto de la HCL conocidas por el especialista.
En otra realización particularmente preferida de la presente invención, la composición farmacéutica tal como se define en el presente documento es para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad autoinmune. El término "enfermedad autoinmune", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a respuestas inmunitarias inapropiadas que atacan a tejidos propios o a componentes ambientales inocuos, tal y como se definen en el presente documento. Entre los ejemplos de enfermedades autoinmunes que contempla la presente invención y que pueden tratarse con la composición farmacéutica descrita se incluyen el síndrome antifosfolípido (síndrome aPL), el pénfigo, la esclerosis múltiple (EM), la miastenia gravis, la enfermedad de Grave, el síndrome de Goodpasture, la angiitis microscópica, la granulomatosis con poliangeítos, Enfermedades reumáticas autoinmunes sistémicas (ERAS), Enfermedad mixta del tejido conectivo, Lupus eritematoso sistémico, Síndrome de Sjøgrens, Esclerosis sistémica/Síndrome de CREST, Polimiositis/Dermatomiositis, Enfermedades tiroideas autoinmunes, Enfermedad celíaca, Hepatitis Autoinmune, Cirrosis Biliar Primaria, Enfermedades Asociadas a ANCA, Síndrome Antifosfolípido/Síndrome Tromboembólico, Enfermedad Anti-MBG, Diabetes Mellitus, Anemia Perniciosa, Vitíligo y Enfermedad de Crohn. El tratamiento de las enfermedades autoinmunes descrito anteriormente se basa en el uso de antígenos de enfermedades autoinmunes o epítopos de enfermedades autoinmunes descritos anteriormente, que se suministran a las CD de Langerina<+>en forma de cargas como se ha descrito anteriormente. En particular, se sabe que las CD de Langerina<+>inducen la expansión de las células T reguladoras y la eliminación antígeno-específica de los CTL, es decir, una tolerancia antígeno-específica, en ausencia de señales coestimuladoras, es decir, sin la administración conjunta de adyuvantes. En el contexto de este esquema de tratamiento, los antígenos de la enfermedad autoinmune o los epítopos de la enfermedad autoinmune descritos anteriormente se suministran, por tanto, preferiblemente sin la administración conjunta de ningún adyuvante. Se prefiere además que cualquier señal coestimuladora que conduzca a una activación de las CD de Langerina<+>se inhiba por cualquier medio adecuado conocido por el especialista.
En otra realización particularmente preferida de la presente invención, la composición farmacéutica tal como se ha definido anteriormente es para su uso en el tratamiento o la prevención de una infección bacteriana. El término "infección bacteriana" se refiere a la infección de un paciente, en particular de un ser humano, con una bacteria patógena o una bacteria cuya presencia en el organismo no es deseada, por ejemplo, una parte de un consorcio bacteriano o bioflora. Los ejemplos preferidos incluyen infecciones bacterianas intracelulares, por ejemplo, transmitidas por bacterias como Chlamydophila, Ehrlichia, Rickettsia, Salmonella, Neisseria, Brucella, Mycobacterium, Nocardia, Listeria, Francisella, Legionella o Yersinia. Otros ejemplos de bacterias patógenas, cuya infección está previsto tratar con la composición farmacéutica según la presente invención incluyen bacterias del género Bacillus, Bartonella, Bordetella, Borrelia, Campylobacter, Chlamydia, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus, Escherichia, Haemophilus, Helicobacter, Leptospira, Mycoplasma, Pseudomonas, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Treponema, Ureaplasma yVibrio. En realizaciones específicas, la infección bacteriana a tratar puede ser una infección por una o más de las siguientes especies: Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bartonella henselae, Bartonella quintana, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii, Borrelia afzelii, Borrelia recurrentis, Brucella abortus, Brucella canis, Brucella melitensis, Brucella suis, Campylobacter jejuni, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila psittaci, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, Leptospira interrogans, Leptospira santarosai, Leptospira weilii, Leptospira noguchii, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium ulcerans, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa, Rickettsia rickettsii, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Treponema pallidum, Ureaplasma urealyticum, Vibrio cholerae, Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica y Yersinia pseudotuberculosis. Particularmente preferido es el tratamiento de infecciones por Neisseria meningitides, Corynebacterium diphtheria, Bordetella pertussis o Clostridium tetani.
En el contexto de una infección bacteriana, el término "tratar" incluye alguno o todos los siguientes: inhibir el crecimiento de bacterias, la multiplicación o replicación del patógeno que causa la enfermedad infecciosa y mejorar uno o más síntomas de una enfermedad infecciosa. Las infecciones por bacterias antes mencionadas pueden tratarse preferiblemente utilizando antígenos bacterianos o epítopos bacterianos como los descritos en el presente documento, o que sean conocidos por la persona experta, por ejemplo, a partir de fuentes bibliográficas adecuadas como Detmer y Glenting, 2006, Microbial Cell Factories, 5, 23, que se proporcionan a los CD de Langerina<+>en forma de cargas como las descritas en el presente documento. Estos antígenos o epítopos de los mismos son posteriormente procesados y presentados por las células de Langerina<+>a otras células inmunitarias y activan estas células inmunitarias dando lugar a una respuesta inmunitaria, por ejemplo mediante CTL o anticuerpos contra entidades, por ejemplo bacterias o partes de las mismas, que muestren dicho antígeno o epítopo. También se prevé que se proporcionen diferentes antígenos y/o diferentes epítopos, por ejemplo derivados de diferentes bacterias, o derivados de diferentes proteínas o glicoproteínas, que pueden estar presentes en la misma bacteria. Estos antígenos o epítopos pueden, por ejemplo, proporcionarse en una proteína de fusión multiantígeno o en una proteína multiepítopo (por ejemplo, que comprenda 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más epítopos), o como unidades individuales de antígeno/epítopo que se empaquetan juntas en una carga. También se prefiere el uso de diferentes formas moleculares del antígeno/epítopo bacteriano dentro de la carga. Por ejemplo, puede proporcionarse como proteína/péptido, como oligosacárido o como ácido nucleico. Se prefiere además que los antígenos/epítopos bacterianos, si se proporcionan varios, se proporcionen en combianción o como mezclas de antígenos/epítopos, por ejemplo, cuando se forma o genera un liposoma.
En otra realización particularmente preferida de la presente invención, la composición farmacéutica tal como se define en el presente documento es para su uso en el tratamiento o la prevención de una infección vírica. El término "infección vírica", tal como se utiliza aquí, se refiere a una infección y/o enfermedad causada por un virus patógeno o una partícula vírica infecciosa (virión). Ejemplos de virus o viriones patógenos, cuya infección se prevé tratar con la composición farmacéutica según la presente invención incluyen virus de los grupos: Adenoviridae, Picornaviridae, Herpesviridae, Hepadnaviridae, Flaviviridae, Retroviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Papillomaviridae, Rhabdoviridae, Togaviridae. En realizaciones específicas, la infección vírica a tratar puede ser una infección por uno o más de los siguientes tipos de virus: Adenovirus, Coxsackievirus, virus de Epstein-Barr, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus del herpes simple tipo 1, virus del herpes simple tipo 2, citomegalovirus, herpesvirus humano tipo 8, VIH, virus de la gripe, virus del sarampión, virus de las paperas, virus del papiloma humano, virus de la parainfluenza, poliovirus, virus de la rabia, virus respiratorio sincitial, virus de la rubéola, virus de la varicela zoster. Se prefiere especialmente el tratamiento de las infecciones por el virus del papiloma humano, el virus de la hepatitis A y el virus de la hepatitis B.
En el contexto de una infección vírica, el término "tratar" incluye alguno o todos los siguientes: inhibir el crecimiento de virus, la multiplicación o replicación del patógeno que causa la enfermedad infecciosa y mejorar uno o más síntomas de una enfermedad infecciosa. Las infecciones por virus o viriones mencionadas anteriormente pueden tratarse preferiblemente utilizando antígenos virales o epítopos virales como los descritos en el presente documento, o que sean conocidos por la persona experta, por ejemplo, de fuentes bibliográficas adecuadas como Ansari et al., 2010, Nucleic Acids Res, 38, D847-D853 o de recursos de Internet como https://www.who.int/immunization/diseases/en/ (última visita el 4 de diciembre de 2018), que se proporcionan a las CD de Langerina<+>en forma de cargas como las descritas en el presente documento. Estos antígenos o epítopos de los mismos son posteriormente procesados y presentados por las células Langerina<+>a otras células inmunitarias y activan estas células inmunitarias dando lugar a una respuesta inmunitaria, por ejemplo mediante CTL o anticuerpos contra entidades, por ejemplo virus o partes de los mismos, que muestren dicho antígeno o epítopo. También se prevé que se proporcionen diferentes antígenos y/o diferentes epítopos, por ejemplo derivados de diferentes virus, o derivados de diferentes proteínas o glicoproteínas, que pueden estar presentes en o sobre el mismo virus. Estos antígenos o epítopos pueden, por ejemplo, proporcionarse en una proteína de fusión multiantígeno o una proteína multiepítopo (por ejemplo, que comprenda 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más epítopos), o como unidades de antígeno/epítopo individuales que se empaquetan juntas en una carga. Por ejemplo, pueden mezclarse diferentes antígenos y formularse posteriormente en un portador, por ejemplo, un liposoma tal como se define en el presente documento. También se prefiere el uso de diferentes formas moleculares del antígeno/epítopos del virus dentro de la carga. Por ejemplo, puede proporcionarse como proteína/péptido, como oligosacárido o como ácido nucleico.
En otra realización particularmente preferida de la presente invención, la composición farmacéutica tal como se define en el presente documento es para su uso en el tratamiento o la prevención de una infección parasitaria. El término "infección parasitaria" se refiere a la infección de un paciente, en particular de un ser humano, con un parásito. Dicha infección puede, pero no necesariamente, dar lugar a una enfermedad parasitaria o parasitosis, es decir, una enfermedad infecciosa causada o transmitida por un parásito. Así pues, la presente invención no sólo contempla el tratamiento de enfermedades parasitarias per se, sino también el tratamiento de infecciones por parásitos que pueden no dar lugar a una enfermedad. Dicha infección puede seguir considerándose problemática para la salud del paciente, por ejemplo, debido al uso de recursos energéticos o alimentarios por parte del parásito, a la fatiga o a problemas psíquicos debidos, por ejemplo, al conocimiento de estar infectado. Además, desde una perspectiva epidemiológica, el tratamiento de tales infecciones es ventajoso, ya que así puede evitarse una mayor disimulación. El parásito cuya infección debe tratarse es, como se ha descrito anteriormente, un parásito de los mamíferos, en particular de los seres humanos. El parásito pertenece típicamente al grupo de los protozoos o metazoos. Ejemplos de parásitos, cuya infección se prevé tratar con la composición farmacéutica según la presente invención incluyen flagelados, amebas, esporozoos y ciliados, así como platelmintos. En realizaciones específicas, la infección parasitaria a tratar puede ser una infección por uno o más de los siguientes géneros o especies: Giardia, Trichomonas, Trypanosoma, Leishmania, Entamoeba, Naegleria, Acanthamoeba, Cryptosporidium, Cyclospora, Toxoplasma, Plasmodium, Balantidium coli, Fasciola hepatica, Taenia, Schistosoma, Wuchereria bancrofti y Onchocerca volvulus. Se prefiere especialmente el tratamiento de las infecciones por Plasmodium.
En el contexto de una infección vírica, el término "tratar" incluye alguno o todos los siguientes: inhibir el crecimiento de parásitos, la multiplicación o replicación del patógeno que causa la enfermedad infecciosa y mejorar uno o más síntomas de la infección parasitaria. Las infecciones por parásitos antes mencionadas pueden tratarse preferentemente utilizando antígenos parasitarios o epítopos parasitarios como los descritos en el presente documento, o que sean conocidos por el especialista, por ejemplo, a partir de fuentes bibliográficas adecuadas como Ansari et al, 2010, Nucleic Acids Res, 38, D847-D853, Tarleton, 2005, Cellular Microbiology, 7, 10, 1379-1386 o Higashi, 1988, Ann Rev Public Health, 9, 483-501, que se proporcionan a las CD de Langerina<+>en forma de cargas como se describe en el presente documento. Estos antígenos o epítopos de los mismos son posteriormente procesados y presentados por las células Langerina<+>a otras células inmunitarias y activan estas células inmunitarias dando lugar a una respuesta inmunitaria, por ejemplo mediante CTL o anticuerpos contra entidades, por ejemplo virus o partes de los mismos, que muestren dicho antígeno o epítopo. También se prevé que se proporcionen diferentes antígenos y/o diferentes epítopos, por ejemplo derivados de diferentes parásitos, o derivados de diferentes proteínas o glicoproteínas, que pueden estar presentes en o sobre el mismo parásito. Estos antígenos o epítopos pueden, por ejemplo, proporcionarse en una proteína de fusión multiantígeno o una proteína multiepítopo (por ejemplo, que comprenda 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más epítopos), o como unidades antígeno/epítopo individuales que se empaquetan juntas en una carga. Por ejemplo, pueden mezclarse diferentes antígenos y formularse posteriormente en un portador, por ejemplo, un liposoma tal como se define en el presente documento. También se prefiere el uso de diferentes formas moleculares del antígeno/epítopos del parásito dentro de la carga. Por ejemplo, puede proporcionarse como proteína/péptido, como oligosacárido o como ácido nucleico.
En otra realización particularmente preferida de la presente invención, la composición farmacéutica tal como se define en el presente documento es para su uso en el tratamiento o la prevención o de una enfermedad de injerto contra huésped. El término "enfermedad injerto contra huésped", tal y como se utiliza aquí, se refiere a una complicación médica tras la recepción de tejido trasplantado de una persona genéticamente diferente. La enfermedad injerto contra huésped se asocia típicamente a los trasplantes de células madre, como los que se producen con los trasplantes de médula ósea. La enfermedad injerto contra huésped también puede aplicarse a otras formas de tejidos trasplantados, como los trasplantes de órganos sólidos. Sin querer ceñirnos a la teoría, se supone que la enfermedad está causada por el hecho de que los glóbulos blancos del sistema inmunológico del donante que permanecen dentro del tejido donado (el injerto) reconocen al receptor (el huésped) como extraño (no propio). Los glóbulos blancos presentes dentro del tejido trasplantado atacan entonces normalmente a las células del organismo del receptor, lo que provoca la enfermedad injerto contra huésped. La enfermedad injerto contra huésped es diferente de un rechazo de trasplante, que se produce cuando el sistema inmunológico del receptor del trasplante rechaza el tejido trasplantado; la enfermedad injerto contra huésped, en cambio, se produce cuando los glóbulos blancos del sistema inmunológico del donante rechazan al receptor. La enfermedad injerto contra huésped también puede producirse tras una transfusión de sangre si los productos sanguíneos utilizados no han sido irradiados o tratados con un sistema aprobado de reducción de patógenos. La presente invención prevé que el huésped del tejido donado (el injerto) esté provisto de un antígeno MHC comprendido en el tejido donado, por ejemplo, un antígeno del injerto o del donante del tejido. Este antígeno puede proporcionarse ventajosamente a las células CDs de Langerina<+>vía como carga en un portador adecuado tal y como se define en el presente documento. Este paso puede ser seguido suele ir seguido de una expansión y activación de células T reguladoras específicas del CMH, lo que conduce a una supresión antígenoespecífica de los CTL, es decir, a una tolerancia antígeno-específica en ausencia de señales coestimuladoras, por ejemplo, sin la administración conjunta de adyuvantes. En el contexto de este esquema de tratamiento, los antígenos o epítopos de enfermedades autoinmunes descritos anteriormente se suministran preferentemente sin la administración conjunta de ningún adyuvante. Se prefiere además que cualquier señal coestimuladora que conduzca a una activación de las células CD de Langerina<+>se inhiba por cualquier medio adecuado conocido por el especialista. Pueden obtenerse más detalles de fuentes bibliográficas adecuadas, como Sela et al., 2011, J. Exp. Med., 208, 12, 2489-2496.
En otra realización, la presente invención prevé además que se inhiba la reacción inmunológica del donante del tejido donado (el injerto), por ejemplo ex vivo. En consecuencia, la presente invención se refiere, por ejemplo, al uso de trasplantes de piel en los que las CL del injerto donante se matan específicamente ex vivo. Se pueden obtener más detalles, por ejemplo, en Zell et al., 2008, Journal of Investigative Dermatology, 128, 8, 1874, Obhrai et al., 2008, Journal of Investigative Dermatology, 128, 8, 1950-1955; Molinero et al., 2007, American Journal of Transplantation, 8, 1; Adhikary et al., 2018, Transplantation, 102, S235 o Yamano et al., 2011, Blood, 117, 2640-2648.
En una realización adicional y particularmente preferida de la presente invención, la composición farmacéutica tal como se define en el presente documento es para su uso en el tratamiento o la prevención de la inflamación local o sistémica. El término "inflamación", tal como se utiliza aquí, se refiere a la respuesta biológica compleja de los tejidos corporales a estímulos perjudiciales o dañinos, como patógenos, células dañadas o irritantes. La inflamación es una respuesta protectora en la que intervienen células inmunitarias, vasos sanguíneos y mediadores moleculares. La función de la inflamación es eliminar la causa inicial de la lesión celular, eliminar las células necróticas y los tejidos dañados por el insulto original y el proceso inflamatorio, e iniciar la reparación de los tejidos. La inflamación es una respuesta genérica, por lo que se considera un mecanismo de la inmunidad innata. El proceso de inflamación lo inician las células inmunitarias residentes ya presentes en el tejido implicado, en particular los macrófagos residentes, las células dendríticas , los histiocitos (células de Langerhans), las células de Kupffer y los mastocitos. Estas células poseen receptores de superficie conocidos como receptores de reconocimiento de patrones (PRR), que reconocen dos subclases de moléculas: los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) y los patrones moleculares asociados a daños (DAMP). Los PAMP son compuestos que se asocian a diversos patógenos, pero que se distinguen de las moléculas del huésped. Los DAMP son compuestos que se asocian a lesiones y daños celulares relacionados con el huésped. Al inicio de una infección, una quemadura u otras lesiones, estas células sufren una activación (uno de los PRR reconoce un PAMP o un DAMP) y liberan mediadores inflamatorios responsables de los signos clínicos de la inflamación. La vasodilatación y el consiguiente aumento del flujo sanguíneo provocan el enrojecimiento y el aumento del calor. El aumento de la permeabilidad de los vasos sanguíneos provoca una exudación de proteínas plasmáticas y líquido en el tejido, que se manifiesta como hinchazón. Algunos de los mediadores liberados, como la bradicinina, aumentan la sensibilidad al dolor. Las moléculas mediadoras también alteran los vasos sanguíneos para permitir la migración de leucocitos, principalmente neutrófilos y macrófagos, fuera de los vasos sanguíneos hacia el tejido. Los neutrófilos migran a lo largo de un gradiente quimiotáctico creado por las células locales para llegar al lugar de la lesión. La pérdida de función es probablemente el resultado de un reflejo neurológico en respuesta al dolor.
Cuando la inflamación desborda al huésped, es decir, se convierte en una "inflamación sistémica", se da un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica. Cuando se debe a una infección, el síndrome se considera sepsis. En caso de infección generalizada pueden producirse vasodilatación y disfunción orgánica que pueden conducir a un shock séptico y a la muerte. Por el contrario, una "inflamación local" se limita al lugar o la región tisular del primer estímulo nocivo, lesión o daño. Sin querer ceñirnos a la teoría, actualmente se cree que las células de Langerhans modulan las células T reguladoras, que a su vez pueden apagar las respuestas inflamatorias, por ejemplo, como se describe en Sharabi et al., 2018, Nature Reviews Drug Discovery, 17, 823-844. Se asume además el hecho de que las células de Langerhans pueden inducir una respuesta antiinflamatoria a través de las Treg, como se desprende de recursos bibliográficos adecuados como Stary et al., 2011, J Immunol, 186,1, 103-112. El enfoque de tratamiento previsto implica el suministro de compuestos adecuados, como glucocorticosteroids, que pueden estar comprendidos en un portador tal como se define en el presente documento, a las células Langerina<+>a través del vehículo de la presente invención. En consecuencia, puede iniciarse una respuesta antiinflamatoria. Puede obtenerse más información en Bartneck et al., 2014, Nanomedicine, 10, 6, 1209-20.
En otra realización particularmente preferida de la presente invención, la composición farmacéutica tal como se define en el presente documento es para su uso en el tratamiento o la prevención de la alergia. El término "alergia", tal como se utiliza aquí, se refiere a una condición patológica causada por la hipersensibilidad del sistema inmunológico a un estímulo del entorno que normalmente, es decir, en un sujeto sano, causa poco o ningún problema. La alergia es, por tanto, una afección en la que el paciente produce una respuesta inmunitaria anormalmente vigorosa en la que el sistema inmunitario defiende al organismo contra una amenaza percibida que, de otro modo, sería inofensiva para el cuerpo. Se supone que el mecanismo subyacente implica a los anticuerpos de inmunoglobulina E (IgE), que se unen a un alérgeno, por ejemplo, como se ha definido anteriormente, y a un receptor en los mastocitos o basófilos, donde desencadena la liberación de sustancias químicas inflamatorias como la histamina.
En otra realización particularmente preferida de la presente invención, la composición farmacéutica tal como se define en el presente documento es para su uso en hiposensibilización. El término "hiposensibilización", que también se conoce como desensibilización o hiposensibilización, es una inmunoterapia con alérgenos en forma de tratamiento médico para algunos tipos de alergias que se basa en la administración de dosis crecientes de alérgenos para conducir las respuestas inmunitarias desde la producción de IgE hacia la inducción de respuestas de células T reguladoras, promoviendo así la tolerancia específica al alérgeno. La presente invención puede utilizarse para inducir directamente respuestas de células T reguladoras con mayor eficacia mediante la administración selectiva de alérgenos a las CD de Langerina<+>, concretamente a las células de Langerhans, en ausencia de adyuvantes.
La presente invención contempla además el tratamiento de cualquier otra enfermedad o afección médica que esté directa o indirectamente relacionada con la expresión de Langerina en la superficie de las células, en particular las CD. En particular, la carga, que puede estar comprendida en el portador definido anteriormente o asociada a él , puede ser un compuesto farmacéutico o inmunológico activo, que sea, por ejemplo, capaz de provocar una reacción inmunológica en el organismo, que funcione como inmunomodulador, como inductor de la tolerancia inmunológica o como inhibidor de la función celular, como un inhibidor de la apoptosis. Además, el compuesto farmacéutico o inmunológico activo que se administra a una célula Langerina<+>puede, tras dicha administración, permitir una activación o supresión específica del sistema inmunitario, preferiblemente a través de vías típicas de las CD. Esta activación o modulación del sistema inmunitario puede ser útil para el tratamiento o la prevención in vivo de una enfermedad. En consecuencia, la enfermedad a tratar puede no estar desarrollada o existir ya en el sujeto a tratar.
En otro aspecto, la invención se refiere a una composición diagnóstica que comprende el vehículo tal como se ha definido anteriormente o la composición tal como se ha definido anteriormente, en la que el vehículo comprende o está asociado a una carga diagnósticamente adecuada. El término "carga diagnósticamente adecuada", tal como se utiliza aquí, se refiere a entidades de carga seleccionadas entre cualquiera de las siguientes: una molécula pequeña, un péptido, una proteína, un ácido nucleico, un metal, un radionúclido, una toxina, un colorante y un pigmento. Se prefiere que todos los elementos mencionados correspondan a los definidos anteriormente en el contexto de la carga, incluidos ejemplos adicionales de los elementos mencionados. Se prefieren especialmente los colorantes, que pueden utilizarse para dirigir y visualizar las células Langerina<+>en diferentes contextos, por ejemplo, la piel o el tejido linfático. También se contemplan combinaciones de los cargamentos mencionados, por ejemplo, una proteína y un ácido nucleico, o una proteína y un colorante, o una molécula pequeña y un colorante, etc. En otras realizaciones preferidas, el portador mencionado puede comprender o estar asociado a una carga adecuada desde el punto de vista del diagnóstico, por ejemplo un colorante, y al mismo tiempo a una carga adecuada desde el punto de vista terapéutico, por ejemplo una molécula pequeña, etc., tal como se define en el presente documento. En consecuencia, la presencia de la carga adecuada para el diagnóstico puede utilizarse para detectar y/o contar la administración de la carga adecuada para el tratamiento. La composición de diagnóstico puede comprender además un portador farmacéuticamente aceptable, tal como se define en el presente documento en el contexto de las composiciones farmacéuticas, o un adyuvante farmacéutico, tal como se define en el presente documento en el contexto de las composiciones farmacéuticas.
En realizaciones específicas, la composición diagnóstica aquí definida puede utilizarse para diagnosticar directamente enfermedades relacionadas con las células de Langerhans, por ejemplo la histocitosis de CL, en las que la composición diagnóstica puede comprender un marcador/biomarcador específico de la enfermedad o comprender un componente adecuado que permita detectar la histocitosis de CL.
En otras realizaciones, la composición diagnóstica aquí descrita puede utilizarse para usos pronósticos y/o predictivos. Por ejemplo, la composición diagnóstica puede utilizarse para evaluar los cambios en el nivel de activación de las células de Langerhans y/o los niveles de presentación cruzada de antígenos o alérgenos específicos de la enfermedad, por ejemplo, antes, durante o después de un tratamiento, preferiblemente directamente después de un tratamiento. Dichos usos contemplan especialmente las composiciones diagnósticas que comprenden marcadores etiquetados de señales de activación, como marcadores de nivel de ARN, péptidos o proteínas. Estos marcadores pueden administrarse o coadministrarse, junto con otros componentes como los compuestos farmacéuticamente activos definidos en el presente documento, a la célula diana, es decir, una célula Langerina<+>a través del vehículo y el portador definidos en el presente documento.
Por lo tanto, un marcador etiquetado para señales de activación (a nivel de ARN, péptido/proteína) podría ser codiluido utilizando el sistemaEn una realización preferida, la composición diagnóstica como se define anteriormente es para uso en la detección o monitorización de un enfoque de tratamiento y/o la eficacia de dicho enfoque de tratamiento basado en una composición farmacéutica como se define aquí contra el cáncer, una enfermedad autoinmune, una infección bacteriana, una infección viral, o una enfermedad de injerto contra huésped inflamación local o sistémica o alergia.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método de identificación de una dosis adecuada para una terapia dirigida a células dendríticas Langerina<+>de una enfermedad que comprende: (a) poner en contacto una población de células de Langerina<+>con un compuesto susceptible de ser introducido en las células, en el que dicho compuesto es una carga como se define en el presente documento, preferentemente un colorante o pigmento, y en el que dicho compuesto se administra a dichas células con un vehículo como se define en el presente documento; (b) determinar el número de células que incorporaron dicho compuesto; (c) determinar una dosis adecuada del compuesto comparando el número de células que incorporaron el compuesto y la población de partida. El término "terapia dirigida a células dendríticas", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere al uso de una composición farmacéutica tal como se describe en el presente documento. Preferiblemente, el término se refiere a formas de terapia o usos de composiciones farmacéuticas que implican una interacción de un vehículo como se define en el presente documento, que comprende más preferiblemente una carga como se define en el presente documento, a través de un ligando como parte del conjugado como se define en el presente documento y el receptor Langerina cognado. En consecuencia, la enfermedad puede ser cualquiera de las mencionadas anteriormente, por ejemplo, cáncer, o una infección bacteriana, vírica, parasitaria, alergia, etc. El paso "poner en contacto una población de células de Langerina<+>con un compuesto" significa que dicho compuesto se pone en contacto o se acerca a dicha célula o se suministra a dicha célula, preferiblemente a través del vehículo definido anteriormente. Las células proceden de un cultivo celular in vitro o son células ex vivo obtenidas de la piel de un paciente. Se prefiere especialmente que el número de células que se utilicen esté determinado o sea conocido. En consecuencia, estas células pueden suministrarse en un entorno confinado, por ejemplo, una cámara de reacción, etc. El compuesto es un "compuesto capaz de ser introducido en las células", lo que significa que el compuesto puede ser internalizado por las células Langerina<+>, por ejemplo por endocitosis. Este enfoque puede comprender, por ejemplo, una etapa in vitro, en la que se tiñen las CL o se realiza un análisis citométrico de flujo. La introducción del compuesto puede realizarse preferentemente mediante endocitosis de las células Langerina<+>.
Por ejemplo, en una realización específica, el enfoque puede aplicarse como enfoque in vitro, en el que las células Langerina<+>pueden etiquetarse con una composición según la presente invención, por ejemplo, que comprenda un colorante. Se prevé además el empleo de citometría de flujo para separar las células etiquetadas de las no etiquetadas. También se prevé la aplicación como enfoque in vivo o como enfoque combinado in vitro/ex vivo. El compuesto puede ser, en determinadas realizaciones, una carga como la definida anteriormente, preferiblemente un colorante o pigmento, más preferiblemente es Alexa Fluor 647.
El paso de "determinar el número de células que han incorporado dicho compuesto", tal como se utiliza en el paso b) del método, se refiere a cualquier proceso de análisis adecuado, que permita diferenciar las células que han incorporado el compuesto de las que no lo han hecho. Preferiblemente, este proceso es un proceso de detección por fluorescencia, que identifica las células que han incorporado un colorante o pigmento de las que no lo han hecho. Más preferiblemente se trata de un proceso basado en el uso de Alexa Fluor 647. En consecuencia, el número de células que han incorporado el compuesto frente a las células que no lo han hecho puede determinarse contando las células que muestran, por ejemplo, una señal o mancha de fluorescencia y deduciendo el número del número de células originalmente proporcionadas, es decir, el número global de células utilizadas en el ensayo, con lo que se obtiene el número de células no fluorescentes o no teñidas. Por último, la dosis de un compuesto, o de cualquier compuesto similar o comparable por analogía, puede determinarse correlacionando la cantidad de compuesto utilizada con el número o porcentaje de células con compuestos incorporados. En consecuencia, al aumentar la cantidad de compuesto administrado a las células, puede incrementarse el porcentaje de células con incorporación de compuestos. En otras realizaciones, también pueden modificarse parámetros alternativos como, por ejemplo, la presencia de aditivos, la formulación del compuesto, la presencia de iones divalentes, etc. Así pues, una "dosis adecuada" puede ser, según ciertas realizaciones, un porcentaje del 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o más del 90% de células que muestren una incorporación del compuesto, por ejemplo mediante fluorescencia de acuerdo con los pasos descritos anteriormente. Además, el método puede realizarse como se describe en los Ejemplos, por ejemplo en el Ejemplo 10. Puede obtenerse más información de fuentes bibliográficas adecuadas, como Boyd y Jackson, 2015, Cell Host & Microbe, 17, 301-307.
En una realización preferida, la comparación de células con compuestos incorporados frente a compuestos no incorporados puede realizarse tras un periodo de 1 a 3 días, por ejemplo, tras 24 h, 30 h, 36 h, 40 h, 48 h, 55 h, 60 h, 65 h o 72 h.
En otra realización, el número de células con compuesto incorporado puede compararse con los resultados observados en la bibliografía o con los resultados derivados de una base de datos o de un repositorio de Internet. Por ejemplo, el porcentaje de incorporación, la dosis adecuada calculada, etc. del compuesto pueden, por ejemplo, compararse con los datos de otros compuestos en el mismo ensayo o en un ensayo similar de una base de datos. En ciertas realizaciones, la base de datos puede ser una base de datos desarrollada con información de diferentes enfoques/diferentes compuestos según la presente invención. También puede utilizarse para dicha base de datos información procedente de otros proyectos ajenos a la presente invención.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit médico que comprende al menos un elemento seleccionado entre el vehículo tal como se ha definido anteriormente y/o la composición tal como se ha definido anteriormente, en el que el vehículo comprende o está asociado a una carga farmacéuticamente activa. El kit puede incluir opcionalmente un prospecto con instrucciones. El término "kit médico" incluye cualquier composición farmacéutica como la definida anteriormente, un dispositivo médico, una terapéutica como la mencionada anteriormente, etc. En otras realizaciones específicas, el kit médico también puede ser un kit vacunal, de diagnóstico, pronóstico o predictivo que comprenda ingredientes adecuados para la realización de una vacunación, para la realización de un diagnóstico de una enfermedad asociada a la Langerina, por ejemplo, como se define en el presente documento, o la determinación pronóstica o predictiva de un e estado de salud con respecto a dicha enfermedad. En otras realizaciones, un kit médico puede comprender cualquier dispositivo médico en un envase. El término "dispositivo médico" comprende una jeringuilla, una aguja, por ejemplo, una aguja de jeringuilla, una pistola de vacunación, un esparadrapo o un inhalador, preferiblemente como se ha definido anteriormente. El vehículo de la invención o una composición del mismo pueden, por ejemplo, administrarse a través de un dispositivo médico. Además, el vehículo o una composición del mismo pueden almacenarse en el dispositivo médico. El término "prospecto" o "prospecto con instrucciones" se utiliza para referirse a las instrucciones incluidas habitualmente en los envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre la indicación o indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones y/o advertencias relativas al uso de dichos productos terapéuticos. El prospecto con instrucciones puede formar parte de un kit médico.
En otro aspecto más, la presente invención se refiere a una vacuna que comprende el vehículo tal como se ha definido anteriormente, o la composición tal como se ha definido anteriormente, en la que el vehículo comprende o está asociado a una carga inoculante, por ejemplo, tal como se ha definido anteriormente.
El término "vacuna" debe considerarse como una composición que incluye, en realizaciones preferidas, el vehículo o la composición definida anteriormente, que es adecuada para una vacunación de un sujeto. La composición de una vacuna se ha descrito anteriormente en el contexto de las composiciones farmacéuticas. Es particularmente preferible que la vacuna comprenda un adyuvante, en particular un adyuvante inmunológico como se ha descrito anteriormente. La vacuna puede, por ejemplo, comprender una cantidad terapéuticamente eficaz del vehículo que comprende una carga como se ha definido anteriormente. Por ejemplo, la vacuna puede, en una realización preferida, comprender proteínas y/o ácidos nucleicos como elementos inmunogénicos.
El término "vacunación" se refiere a la provocación de una respuesta inmunitaria contra un tumor a través de un antígeno cancerígeno, una infección bacteriana a través de un antígeno bacteriano, una infección vírica a través de un antígeno vírico, una infección parasitaria a través de un antígeno parasitario como se ha definido anteriormente, en un sujeto que comprende la administración a dicho sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz del vehículo que comprende una carga como se ha definido anteriormente. Preferentemente, el portador del vehículo de la invención comprende una carga que es o comprende un antígeno o epítopo canceroso como se ha definido anteriormente, un antígeno o epítopo bacteriano como se ha definido anteriormente, un antígeno o epítopo vírico como se ha definido anteriormente, un antígeno o epítopo parasitario, como se ha definido anteriormente. También se contempla la vacunación con entidades descritas en el contexto de la enfermedad injerto contra huésped, tal como se ha definido anteriormente. La presente invención, en particular, prevé el uso de portadores liposómicos o nanopartículas, tal como se definen en el presente documento, con fines de vacunación. Se prefiere además que el portador liposomal o nanopartícula comprenda un antígeno peptídico o proteico como se describe en el presente documento. En consecuencia, el péptido o antígeno proteico puede estar comprendido o encapsulado en dicho portador liposomal o nanopartícula, tal como se describe en el presente documento. La administración de dicho portador es preferiblemente una inyección intradérmica como se describe en el presente documento o una administración transcutánea como se describe en el presente documento, preferiblemente una administración mediante parches de microagujas.
En las realizaciones preferidas, la vacuna puede utilizarse para tratar o prevenir el cáncer, una enfermedad autoinmune, una infección bacteriana, una infección vírica, una infección parasitaria o una enfermedad de injerto contra huésped.
La inmunización puede realizarse según cualquier esquema o calendario conocido por el especialista, por ejemplo, derivable de www.who.int/immunization/documents/en/ (última visita el 4 de diciembre de 2018) o fuentes de información similares. El esquema puede comprender, por ejemplo, varias dosis de la composición vacunal que comprende el vehículo o la composición definida anteriormente. En una realización de la invención, se administra al menos 1 dosis de la composición vacunal al sujeto. En otra realización, la vacunación consiste en 1 dosis de la composición vacunal. En otra realización, un sujeto recibe una vacunación inicial de 2 dosis, pero no recibe más administraciones de la composición vacunal, o recibe una nueva administración tras un periodo de tiempo predefinido de al menos 1 mes, o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc. años. El intervalo entre la administración de varias, por ejemplo dos o más, dosis de la vacuna puede variar además entre 1 semana y aproximadamente un año o más, o entre 1 mes y un año, o entre 1 y 3 meses.
La administración de la vacuna puede realizarse según cualquier esquema de administración adecuado y por cualquier vía adecuada, por ejemplo, subcutánea, transdérmica, intradérmica, intramuscular, oral, vía córnea o nasal, intravenosa, tópica o a través de los folículos pilosos, etc. Se prefiere especialmente la vía transdérmica, intradérmica o subcutánea, por ejemplo como inyección intradérmica. La aplicación se realiza preferentemente con agujas, microagujas, nanoparches, parches de hidrogel, pistolas de vacunación, etc., como se ha descrito anteriormente. El término "cantidad eficaz" incluye una cantidad efectiva, a las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado deseado. Una cantidad eficaz de compuesto puede variar en función de factores como el estado de la enfermedad, la edad y el peso del sujeto, y la capacidad del compuesto para provocar una respuesta deseada en el sujeto. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Una cantidad eficaz es también aquella en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial (por ejemplo, efectos secundarios) del compuesto inhibidor es superado por los efectos terapéuticamente beneficiosos.
El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a aquella cantidad del compuesto que se administra suficiente para prevenir el desarrollo o aliviar en cierta medida uno o varios de los síntomas de la afección o trastorno que se está tratando.
Una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto (es decir, una dosis eficaz) puede determinarse teniendo en cuenta el peso corporal del paciente y otros factores conocidos por el especialista. La cantidad terapéuticamente eficaz puede definirse además como concentración, por ejemplo, en el intervalo pM o µM. La persona experta apreciará que ciertos factores pueden influir en la dosis necesaria para tratar eficazmente a un sujeto, incluidos, entre otros, la gravedad de la enfermedad o trastorno, los tratamientos anteriores, el estado general de salud y/o la edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto puede incluir un único tratamiento o, preferiblemente, puede incluir una serie de tratamientos. En un ejemplo, se trata a un sujeto con un compuesto una o varias veces al día durante un periodo de entre 1 y 50 semanas, o cualquier otro periodo de tiempo adecuado. En otro ejemplo, un sujeto puede ser tratado diariamente durante dos o más años en el marco de una afección o enfermedad crónica. También se apreciará que la dosis eficaz de un compuesto utilizado para el tratamiento puede aumentar o disminuir a lo largo de un tratamiento concreto.
La administración del vehículo, composición, composición farmacéutica o vacuna puede ser en combinación con un agente quimioterapéutico en particular si el tratamiento de contra el cáncer. Algunos ejemplos adecuados son los inhibidores del punto de control o las células T CAR. El agente quimioterapéutico puede ser preferiblemente cualquier sustancia citotóxica como las mencionadas anteriormente. El tratamiento con un agente quimioterapéutico se realiza preferiblemente de otra forma que la interacción descrita actualmente con las CD, es decir, no a través de la célula Langerina<+>. Por ejemplo, el agente quimioterapéutico puede administrarse de forma sistémica, o intravenosa, etc. En consecuencia, el agente quimioterapéutico puede apoyar un enfoque de vacunación contra el cáncer mediante la destrucción quimioterapéutica de las células cancerosas. Por ejemplo, un enfoque basado en una combinación con un agente quimioterapéutico puede basarse en una quimioterapia sistémica capaz de modular los fenotipos inmunitarios de las células tumorales residuales, por ejemplo, después de que la masa tumoral se haya reducido de forma óptima con cirugía. Otro enfoque puede basarse en la potenciación de la presentación de antígenos tumorales mediante la regulación al alza de la expresión de los propios antígenos tumorales o de las moléculas MHC de clase I a las que se unen los antígenos. Además, la quimioterapia puede utilizarse para regular al alza las moléculas coestimuladoras (por ejemplo, B7-1) o a la baja las moléculas coinhibidoras (por ejemplo, PD-L1/B7-H1 o B7-H4) expresadas en la superficie de las células tumorales, lo que conduce a una potenciación de la fuerza de la actividad de las células T efectoras. En otra realización, la quimioterapia puede utilizarse para hacer que las células tumorales sean más sensibles a la lisis mediada por células T a través de mecanismos dependientes de fas, perforina o granzima B.
En el contexto de la hiposensibilización, la presente invención prevé que se proporcione al paciente alérgico un alérgeno antigénico. Este alérgeno puede proporcionarse ventajosamente a la célula Langerina<+>a través de una carga en un portador adecuado, tal como se define en el presente documento. Se prefiere especialmente que el alérgeno antigénico se proporcione en más de una dosis. El número de dosis y/o la concentración de alérgeno pueden aumentarse a lo largo del periodo de tratamiento. Este paso de suministro, que puede repetirse una o varias veces, suele ir seguido de una expansión y activación de las células T reguladoras específicas del alérgeno antigénico, lo que conduce a una eliminación de los CTL específica del alérgeno, es decir, a una tolerancia específica del alérgeno en ausencia de señales coestimuladoras, por ejemplo, sin la administración conjunta de adyuvantes. En el contexto de este esquema de tratamiento, los alérgenos, tal y como se han descrito anteriormente, se suministran preferentemente sin la administración conjunta de ningún adyuvante. Se prefiere además que cualquier señal coestimuladora que conduzca a una activación de las células Langerina<+>se inhiba por cualquier medio adecuado conocido por el especialista. Pueden obtenerse más detalles de fuentes bibliográficas adecuadas, como Sela et al., 2011, J. Exp. Med., 208, 12, 2489-2496.
La invención se describe con más detalle en los siguientes ejemplos, que no pretenden limitar el alcance de la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1
Células Hek293 que expresan Langerina
La línea celular de riñón embrionario humano Hek293 se mantuvo en medio DMEM con GlutaMax suplementado con un 10% de FCS (Biochrom) y 100 U/ml de penicilina-estreptomicina. Las células se cultivaron hasta una confluencia del 70% y se subcultivaron con tripsina cada 2-3 días. A menos que se indique lo contrario, todos los medios y suplementos se adquirieron en Thermo Fisher Scientific. Las células se cultivaron en condiciones controladas a 37°C y 5% de CO2. Las células se controlaron con un microscopio óptico (IT405PH, VWR) y se cultivaron en placas de Petri (Corning). Las células se subcultivaron con la enzima proteolítica tripsina en combinación con EDTA al 0,25%. En el subcultivo rutinario, todas las células se centrifugaron a 500 g durante 3 min (Heraeus Megafuge 8R, Thermo Fisher Scientific). Se aspiró el sobrenadante y las células se resuspendieron en medio de crecimiento fresco. Como control de calidad, se analizaron con frecuencia las células libres de contaminación por micoplasma utilizando un kit de detección de micoplasmas MycoAlert® (Lonza). No se detectó ninguna contaminación. Las células se contaron con un contador celular automático (Eve, Montreal Biotech). Para criopreservar las células, se contaron las células vitales, se centrifugaron, se aspiraron y se resuspendieron en medio de congelación compuesto por un 90% de medio de crecimiento y un 10% de DMSO (grado de cultivo celular, Euro Clone). A continuación, se transfirieron a un recipiente para crioviales lleno de isopropanol (Mr. Frosty, Nalgene). El recipiente se almacenó a -80°C durante al menos 24 h y, para un almacenamiento prolongado, los viales se conservaron en nitrógeno líquido.
El clon ORF de ADNc de la Langerina humana se adquirió en sinobiological, El gen se clonó a partir de un vector TA pcDNA5/FRT/V5-His-TOPO (life technologies) en un vector de expresión RP172 (K. J. Koymans et al., Staphylococcal Superantigen-Like Protein 1 and 5 (SSL1 & SSL5) Limit Neutrophil Chemotaxis and Migration through MMP-Inhibition. International journal of molecular sciences 17, 2016) mediante ensamblaje Gibson, según las instrucciones del fabricante. Brevemente, los fragmentos de genes se amplificaron con un saliente del vector de destino mediante PCR utilizando una ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion (NEB). Para la reacción de PCR se preparó una mezcla maestra consistente en 10 µl de tampón Phusion HF (NEB), 5 µl de dNTPs 2 mM (Carl Roth), 0,5 µl de polimerasa Phusion (NEB) y 29 µl de H2O por reacción. A cada reacción se añadieron 0,5 µl de cebador 50 µM y 2,5 µl de vectores molde de aproximadamente 10 ng/ml. El vector de destino se linealizó mediante PCR (Mastercycler nexus gradient, Eppendorf). Aquí se añadieron 0,6 µl de DMSO (NEB). Se comprobó la calidad de los productos de la PCR mediante electroforesis en gel de agarosa y se midió la concentración de ADN con un nanodrop (nanofotómetro Implen).
En particular, para la generación de clones de Langerina, clones de variantes de Langerina y clones de mLangerina, así como para la generación de clones de DC-SIGN y mDectina se utilizaron las siguientes secuencias de cebadores y condiciones de PCR:
Por último, los productos de PCR se ensamblaron mediante Gibson Assembly. Volúmenes iguales (2-10 µl) de ADN que contenían 0,02-0,5 pmoles de fragmentos de ADN con un exceso de 2-3 de inserto y la mezcla maestra de ensamblaje Gibson se incubaron a 50 °C durante 20 min. La mezcla maestra contenía exonucleasas T5, ADN polimerasas Phusion y ADN ligasas Taq para crear salientes de ADN monocatenario, incorporar nucleótidos en los huecos de ADN y para recocer fragmentos de ADN complementarios. Tras el ensamblaje Gibson, se añadió 1 µl de DpnI (NEB) para digerir el vector de clonación dado. A continuación, la reacción de PCR digerida (1 µl) se transformó en 10 µl de E.colis 5-alfa competente (NEB) mediante transformación por choque térmico a 42 °C durante 30 s. Tras 2-3 min en hielo, se añadieron 200 µl de medio SOC (medio SOB con 20 mM de glucosa, Carl Roth) a los viales de reacción y se incubaron durante 1 h a 37°C. Las células de E.coli se sembraron en placas de agar LB (Luria/Miller, Carl Roth) que contenían 100 µg/ml de ampicilina (Panreac AppliChem) y se incubaron a 37°C durante toda la noche. Para aislar el ADN, se utilizó un kit MiniPrep siguiendo las instrucciones del fabricante (GeneJET Plasmid Miniprep Kit, Thermo Fisher Scientific). Se midió la concentración de ADN con un nanodrop y se secuenció el ADN plasmídico.
El lentivirus utilizado para la transducción de las líneas celulares se produjo en células 293T utilizando un reactivo de transfección por lipopolíplex (LT) Mirus LT1 (Sopachem). Mediante este sistema se introdujo en las células 293T el vector RP172 (BIC-PGK-Zeo-T2a-mAmetrina; EF1A) que contiene la secuencia de Langerina y una mezcla de empaquetamiento que contiene los tres plásmidos necesarios (pVSV-G, pMDL y pRSV). Tras la transfección con el sistema LT, las células 293T produjeron virus durante 3-4 días que se cosecharon y congelaron a -80ºC para matar las células 293T restantes. A continuación, se utilizó este sobrenadante para transducir Langerin/RP172 en las diferentes líneas celulares.
Los sobrenadantes que contenían lentivirus se mezclaron con células Raji y se centrifugaron suavemente en medio completo con polibreno (Santa Cruz Biotechnology) a 33ºC. El vector RP172 (BIC-PGK-Zeo-T2a-mAmetrina; EF1A) incluye un casete de resistencia a Zeocin y una proteína fluorescente mAmetrina derivada de GFP. La transducción de 50000 células Raji se facilitó por centrifugación a 1000*g durante aproximadamente 90 min a 33 °C. Al cabo de 2-3 días, las células (parcialmente) infectadas se expusieron a la presión de Zeocin (Life technologies) para seleccionar las células que contenían RP172. Las células transducidas se seleccionaron con un medio de selección que contenía 300 µg/ml de Zeocin (Life Technologies) durante dos semanas. La presencia de RP172 se evaluó mediante la expresión de mAmetrina medida por FACS (BD FACS canto II). La comprobación inicial de mAmetrina (realizada antes de la selección) es crucial, ya que el porcentaje de células infectadas mide el título lentiviral. En todas las transducciones, aspiramos a un porcentaje inicial de mAmetrina del 5-10%.
Los receptores expresados recombinantemente se detectaron con anticuerpos específicos CLR. Para la tinción con anticuerpos, se incubaron 50000 células con 25 µl de medio que contenía una dilución 1:100 de PE anti-ratón/humano CD207 (4C7, Biolegend) para teñir Langerina murina, PE anti-humano CD209 (9E9A8, Biolegend) para teñir DC-SIGN, PE anti-ratón Dectina-1 (bg1fpj, eBioscience) para teñir las células mDectina-1 o PE anti-ratón/IgG2a (RMG2a-62, Biolegend) o PE anti-ratón normal/IgG1 (sc-2866, Santa CruzBiotechnology) para la tinción de isotipo. Para teñir la expresión de la superficie celular de las células humanas que expresan Langerina, se incubaron 50000 células con una dilución 1:5 de anticuerpo conjugado CD207-PE (DCGM4, Beckman Coulter). Tras la incubación a 4°C durante 30 min, se lavaron las células y se analizó la tinción con PE mediante citometría de flujo con un láser 488 con un filtro 574/26 (Attune Nxt, life technologies). LaFigura 1muestra los resultados.
Ejemplo 2
Células Raji que expresan CLR
La línea celular Raji humana de origen hematopoyético se cultivó en medio RPMI base que contenía un 10% de FCS, 100 U/ml de penicilina-estreptomicina y GlutaMax. Las células se mantuvieron entre 0,5-3 Mio células/ml por adición o sustitución del medio de crecimiento completo y se cultivaron, mantuvieron, monitorizaron y almacenaron en las mismas condiciones que las mencionadas para Hek293 (véase más arriba). Los clones de ORF de ADNc de DC-SIGN y Dectina-1 de ratón también se transfirieron de un vector TA pcDNA5/FRT/V5-His-TOPO (life technologies) a un vector RP172 (Koymans et al., 2016, Int. J. Mol. Sci., 17, 7, 1072) para su expresión estable en células Raji mediante transducción. La clonación se realizó mediante el ensamblaje de Gibson, siguiendo las instrucciones del fabricante (véase más arriba). Se midió la concentración de ADN con un nanodrop y se secuenció el ADN plasmídico. La transducción de Langerina humana, DC-SIGN y Dectina-1 de ratón en líneas celulares Raji se llevó a cabo como se describe para las células Hek293 (véase elEjemplo 1). Los receptores expresados recombinantemente se detectaron con anticuerpos específicos CLR y se midieron mediante citometría de flujo (véase elEjemplo 1y laFigura 2). En conjunto, estos resultados experimentales describen las líneas celulares recombinantes utilizadas aquí.
Ejemplo 3
Síntesis del ligando diana
El clorhidrato de glucoseamina (46,4 mmol, 10 g) se disolvió en una solución acuosa de NaOH (1M, 47 mL) a 0°C. Se añadió p-anisaldehído (47 mmol, 5,7 mL) gota a gota en 5 min y la reacción se dejó agitar a 0°C durante 2 h, durante las cuales la solución se solidificó. La suspensión cristalina se filtró por succión, se lavó con H2O y pequeñas cantidades de Et2O y se secó al vacío a 45°C para obtener 1 como sólido incoloro en un 97% de rendimiento (45,34 mmol, 13,48 g).
1 (40,3 mmol, 11,98 g) se disolvió en piridina (71 mL) bajo Ar y se enfrió a 0°C. Se añadió anhidrita acética (36 mL) bajo agitación, se retiró el baño de enfriamiento y se dejó que la mezcla se calentara a temperatura ambiente bajo agitación durante toda la noche. La mezcla se vertió en agua helada (240 mL). El precipitado resultante se filtró por succión, se lavó con agua (350 mL) y se secó en alto vacío para obtener 2 como sólido incoloro en un 87% de rendimiento (35,15 mmol, 16,36 g).
2 (35,15 mmol, 16,36 g) se agitó fuertemente en acetona hirviendo en un vaso de precipitados (70 mL de ebullición). Se añadieron rápidamente 7,03 mL (35 mmol) de HCl acuoso (5 M). La masa que solidificó inmediatamente se dejó enfriar a temperatura ambiente, posteriormente se filtró por succión, se lavó con Et2O frío y se secó al vacío. El sólido resultante (35,15 mmol, 11,67 g) se suspendió en 180 mL de piridina y se enfrió a 0°C bajo agitación intensa. Se añadió a la mezcla de una vez 2,2,2-cloroformato de tricloroetilo (76 mmol, 10,4 mL) y se dejó agitando durante 3 horas. Se añadieron 30 mL de metanol para apagar el exceso de Troc-Cl y la mezcla se concentró posteriormente al vacío. Se añadieron 250 mL de DCM, se filtró el precipitado resultante y el filtrado se concentró al vacío. El residuo se redisolvió en poco DCM y se purificó mediante cromatografía líquida para obtener 3 como sólido incoloro en un 87% de rendimiento (30,61 mmol, 16 g).
3 (13,32 mmol, 6,96 g) y etanotiol (18,64 mmol, 1,38 mL) se disolvieron en 35 mL de DCM anhidro bajo atmósfera de Ar y se enfriaron a 0°C. Se añadió BF3•Et20 (18,64 mmol, 2,36 mL) durante 5 min y la reacción se agitó durante 40 min a 0°C, después a temperatura ambiente durante 4 horas. La reacción se apagó añadiendo 1,1 mL de NEt3 y la mezcla se concentró al vacío. La purificación mediante cromatografía líquida obtuvo 4 como un sólido blanco en un 83% de rendimiento (11,05 mmol, 5,8 g).
Una suspensión de 4 (2,48 mmol, 1,30 g) y bencil-2-hidroxietilcarbamato (3,96 mmol, 790 mg) en 60 mL de DCM anhidro se agitó durante 45 min en atmósfera de Ar. Se añadió tetrafluoroborato de dimetil(metiltio)sulfonio (4,95 mmol, 1 g) y la reacción se dejó agitando toda la noche a temperatura ambiente. El disolvente se eliminó al vacío y el residuo se purificó por cromatografía de líquidos para obtener 5 como un sólido blanco en un 68% de rendimiento (1,67 mmol, 1,1 g).
Se agitó durante 4 h una suspensión de 5 (0,76 mmol, 500 mg) y zinc recién activado (6,46 g, 99 mmol) en 27 mL de ácido acético. La mezcla de reacción se filtró sobre celita y se secó al vacío durante una noche. A continuación, el sólido resultante se disolvió en piridina (12 mL) y se añadió gota a gota cloruro de p-toluenosulfonilo (1,52 mmol, 290 mg; disuelto en 12 mL de piridina). La mezcla de reacción se dejó agitar durante toda la noche. Después se eliminó el disolvente in vacuo y el residuo se purificó por cromatografía líquida para obtener 6 como polvo blanco en un 43% de rendimiento (209 mg, 0,33 mmol).
A una solución de 6 (0,30 mmol, 190 mg) en metanol anhidro (8 mL) se añadió una solución de metanolato sódico (c=0,5 mM.149 mmol 2,98 mL) bajo atmósfera de Ar y se dejó agitar durante 2 horas. El disolvente se eliminó al vacío. El polvo blanco resultante se volvió a disolver en metanol anhidro (30 mL), se añadieron 30 mg de paladio sobre carbón (10%) y la mezcla de reacción se dejó agitar bajo atmósfera de hidrógeno durante toda la noche. El catalizador se filtró a través de Celite y se lavó con metanol. Se eliminaron los disolventes y el residuo se purificó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa para obtener 7 como un sólido blanco en un 71% de rendimiento (0,21 mmol, 80 mg).
Ejemplo 4
Conjugación de lípidos
Los ligandos y colorantes se acoplaron al PEG-DSPE mediante conjugación NHS. El éster NHS Alexa Fluor 647 (A647, life technologies) se conjugó con la amina primaria del NH2-PEG-DSPE (PEG MW 2000, Sunbright) mediante acoplamiento amida. El lípido (1,024 mg) disuelto en 500 µl de DMSO se agitó en un matraz en forma de pera, y se añadió gota a gota al lípido 1 mg de colorante (1,5 equiv.) disuelto en 500 µl de DMSO. La reacción se agitó durante toda la noche en la oscuridad a temperatura ambiente. El DMSO se liofilizó (Alpha 2-4 LDplus, CHRIST) y el producto de la reacción se disolvió en 2-3 ml de tampón que contenía bicarbonato sódico 0,1 M (Sigma-Aldrich) a pH8,4. El colorante no conjugado se eliminó mediante diálisis con un casete Slide-A-Lyzer (7MWCO, 0,5-3 ml, Thermo Fisher Scientific) primero contra 500 ml de tampón durante varias horas con dos veces de intercambio de tampón así como una incubación durante la noche y después tres veces más dializado contra agua con al menos 1 h de diálisis bajo agitación permanente. El agua se eliminó por liofilización y el producto final se disolvió en DMSO a una concentración de 8 mg/ml. El ligando glicomimético de Langerina, la manosa, así como los polímeros de manosa, contenían una amina primaria terminal y se acoplaron a NHS-PEG-DSPE (PEG MW 2000, NOF Europe) mediante acoplamiento de amida de forma idéntica a la descrita para la conjugación de A647, salvo que se disolvieron 2 mg de ligandos en 900 µl de tampón y 0,125 equivalentes de lípidos en 100 µl de DMF. Los lípidos se añadieron gota a gota en un matraz en forma de pera y la DMF se eliminó al vacío (Heidolph). El producto final se disolvió en DMSO-d6 (Euriso-Top) y la eficacia de conjugación se determinó mediante espectroscopia de RMN de 1H-protón con 265 barridos (400 MHz, Variant).
Ejemplo 5
Formulación liposomas
Los liposomas dirigidos y desnudos PEGilados se prepararon mediante el método de extrusión de película de hidratación (Chen et al., 2010, Blood, 115, 23, 4778-4786). A menos que se indique lo contrario, los liposomas contenían DSPE : colesterol : ligando-PEG-DSPE/PEG-DSPE : colorante-PEG-DSPE en una proporción molar de 57 : 38 : 4,75 : 0,25. Si los liposomas contenían menos de 4,75 mol% de lípidos conjugados con ligando, se rellenaron con PEG-DSPE para obtener siempre una proporción molar total de 5% de lípidos PEGilados. Los lípidos PEGilados se disolvieron en DMSO a una concentración de 8 mg/ml y se almacenaron a -20°C para su conservación a largo plazo. El DSPE (NOF Europe) y el colesterol (Sigma-Aldrich) se prepararon siempre frescos y se disolvieron en cloroformo a una concentración de 20 mg/ml y 10 mg/ml, respectivamente. Los lípidos pEGilados se añadieron a un tubo de vidrio y el DMSO se liofilizó. A continuación, se añadieron DSPE y colesterol y se eliminó el cloroformo en vaccuo durante la noche. La película lipídica seca se hidrató con DPBS (sin calcio ni magnesio; life technologies) a una concentración de 1,6 mM si no se indicaba lo contrario. La solución que contenía lípidos se agitó primero en vórtex y luego se sonicó (Ultrabath 1510, Branson) durante 3 segundos con tres repeticiones y un breve intervalo de tiempo entre ellas. Este paso se repitió hasta obtener una suspensión homogénea. Los liposomas unilamelares grandes se produjeron por extrusión de poros (extrusora, Avanti Polar Lipids) con 30 golpes primero con una membrana de policarbonato de 200 nm y después de 100 nm (Avanti Polar Lipids). La concentración de liposomas se refiere a la concentración total de lípidos.
Ejemplo 6
Caracterización de los liposomas
Para caracterizar los liposomas preparados siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 4 en lo que respecta al tamaño y la estabilidad de las partículas, se realizaron mediciones de dispersión dinámica de la luz (Malvern Instruments Zetasizer) en soluciones diluidas de liposomas (32 μM en agua pura). Los liposomas que presentaban potenciales Zeta de entre -35 mV y -15 mV, así como tamaños medios de partícula de entre 100 y 200 nm (diagrama de % de intensidad) e índices de polidispersidad de hasta 0,3 se consideraron viables para su uso posterior.
Ejemplo 7
Carga y purificación de liposomas
Se idearon varias proteínas como carga para la carga liposomal. A continuación se presenta la expresión recombinante de estas proteínas y se describe su carga en liposomas.
Se disolvieron 2 mg de albúmina de suero bovino (BSA) (PAA) en 1 ml de tampón HBSS (life technologies) y se transfirieron a un matraz en forma de pera de 5 ml con septo y barra agitadora. Se disolvió isotiocianato de fluoresceína (Thermo Fisher Scientific) en DMSO (1 mg/ml) y se añadieron 200 µl lentamente en pasos de 5 µl a la BSA. El matraz se cubrió con papel de aluminio y se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente. La reacción se apagó añadiendo una concentración final de 50 mM de etanolamina (Sigma-Aldrich) y se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente. La fluoresceína no conjugada se eliminó mediante diálisis con un casete Slide-A-Lyzer (7MWCO, 0,5-3 ml, Thermo Fisher Scientific) contra tampón HBS (25 mM HEPES, Carl Roth; 150 mM NaCl, Panreac AppliChem; pH 7,5). El tampón se intercambió dos veces tras 1 h de agitación y tras otra incubación durante la noche. La concentración de proteína de las proteínas conjugadas con FITC se midió con absorbancia a 280 nm y la eficacia de conjugación se determinó a 495 nm con un nanodrop (Nanofotómetro Implen). Las muestras de proteínas se almacenaron a 4°C. Los liposomas se cargaron con FITC-BSA mediante la hidratación del lípido de película fina con DPBS que contenía el FITC-BSA. Las concentraciones de FITC-BSA oscilaron entre 1 mg/ml y 20 mg/ml. Tras la sonicación y la extrusión de los poros, los liposomas se purificaron por ultracentrifugación o exclusión por tamaño. Para eliminar las proteínas libres por ultracentrifugación, se transfirió la suspensión liposomal a un tubo de ultracentrifugación (Thinwall, Ultra-Clear™, 4 mL, Beckman coulter). El tubo se llenó con DPBS para evitar la implosión. Los liposomas se ultracentrifugaron a 55000 rpm durante 1 h a 4 °C con un rotor SW 60 Ti (Beckman coulter) en una ultracentrífuga (Optima L-80 XP Ultracentrifuge, Beckman Coulter). Se eliminó el sobrenadante y el precipitado se resuspendió en DPBS. La ultracentrifugación se repitió dos veces. La purificación por exclusión de tamaño se realizó con 20 ml de medio de filtración en gel sepharose CL (CL-4B, reticulado, Sigma-Aldrich) que se empaquetó en una columna de cromatografía (Econo-columna, 1,5x30cm, BioRad). La columna se equilibró con DPBS antes de cargar en ella la solución de liposomas. Se recogieron fracciones de 1,5 ml hasta que eluyeron los liposomas y el FITC-BSA libre (10-15 fracciones). Tras el fraccionamiento, la columna se regeneró con tampón de regeneración que contenía NaCl 0,5 M en NaOH 0,1 M, se equilibró con DPBS hasta que el pH fue neutro y la siguiente solución liposomal se separó por exclusión de tamaño. Las eficiencias de encapsulación se analizaron con un lector de placas (SpectraMax M5, Molecular Devices) y se calcularon a partir de curvas estándar. La concentración de liposomas se midió mediante liposomas decorados con Alexa 647 (ex.640, em.670) y la concentración de FITC-BSA mediante (ex.485, em.525). Las eficiencias de encapsulación se calcularon por 1 mM de concentración total de lípidos.
Ejemplo 8
Caracterización de liposomas
La dispersidad y la estabilidad liposomales se determinaron como se ha descrito anteriormente (véanse losEjemplos 4a6)
Se utilizó FITC-BSA para mostrar los métodos de encapsulación y purificación de una proteína. Se midió la concentración total de proteína FITC-BSA tras la ultracentrifugación. A continuación, los liposomas purificados se probaron en un ensayo basado en células. Los liposomas encapsulados con FITC-BSA se incubaron con células Langerina<+>Raji durante 2 h a 37 °C para inducir su internalización. La fluorescencia A647 y FITC de células individuales se midió simultáneamente mediante citometría de flujo (véase laFigura 3). Como se demostró anteriormente, para los liposomas dirigidos con o sin FITC-BSA encapsulado se detectó una señal de fluorescencia de Alexa647, pero lo que es más importante, sólo para los liposomas encapsulados con FITC-BSA se detectó una señal de FITC. El FITC-BSA aumentó significativamente en las células diana con liposomas encapsulados, mientras que los liposomas desnudos encapsulados con FITC-BSA no mostraron ninguna señal de FITC. La integridad liposomal de los liposomas ultracentrifugados se analizó mediante DLS (véase laFigura 3 (C)). El tamaño y el potencial zeta fueron similares a los de los liposomas no tratados (véanse elEjemplo 6y laFigura 5 (C)) o a los de los liposomas purificados por exclusión por tamaño, lo que indica el mantenimiento de la integridad estructural. A continuación, los liposomas encapsulados con FITC-BSA se incubaron con células Langerina<+>Hek293 durante 6 h a 37 °C, y las células se analizaron posteriormente por microscopía tras teñir el núcleo (véase laFigura 3 (D)). El FITC-BSA se co-localizó altamente con el colorante liposomal co-formulado A647 indicando compartimentos endosomales similares después de 6h.
Para descartar que las elevadas fuerzas centrípetas durante la ultracentrifugación, los liposomas liberaran su carga en el sobrenadante dando lugar a una menor eficacia de encapsulación, se compararon los liposomas purificados por exclusión por tamaño y por ultracentrifugación en un ensayo basado en células (véase laFigura 4). La señal FITC-BSA de esta última fue aún mayor en comparación con los liposomas purificados por exclusión por tamaño, lo que concluye que las fuerzas centrípetas no tuvieron ningún impacto en la integridad de los liposomas y que se asemeja al método de purificación más eficaz. En consecuencia, todos los liposomas posteriores se purificaron por ultracentrifugación si no se indicaba lo contrario.
Para analizar el impacto de la concentración inicial de FITC-BSA en la eficacia de la encapsulación, se varió la concentración de proteína de 20 mg/ml a 1 mg/ml, y se probaron los liposomas encapsulados en un ensayo basado en células (véase laFigura 5 (A)). La señal de fluorescencia se normalizó con respecto al colorante coformulado A647. La señal de fluorescencia más alta se detectó con 20 mg/ml de liposomas formulados con FITC-BSA. Sin embargo, la señal de fluorescencia no se correlacionó con la concentración inicial de proteína utilizada para formular los liposomas. Este resultado indica que entre 1 mg/ml y 20 mg/ml la eficacia de encapsulación se situó en un rango similar e independiente de la concentración inicial de proteína.
Además, se varió la concentración inicial de liposomas. Se compararon 10 mM de liposomas rehidratados con 1 mM en un ensayo basado en células (véase laFigura 5). Los liposomas se rehidrataron con 20 mg/ml de FITC-BSA. La fluorescencia FITC de las células incubadas con liposomas encapsulados con FITC-BSA fue muy similar en los liposomas formulados con 10 mM y 1 mM, lo que indica que las diferentes concentraciones liposomales no tuvieron ningún impacto en la eficacia de la encapsulación. Todos los liposomas se analizaron mediante DLS para determinar su tamaño y potencial zeta (véase laFigura 5 (C)). ¡Además, la eficacia de encapsulación de FITC-BSA se analizó con un lector de placas tras la ultracentrifugación y se calculó para liposomas 1 mM (¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.Figura 5 (B)). También en este caso, las eficiencias de encapsulación de todos los liposomas formulados se situaron en un intervalo similar entre 17 µg y 95 µg por liposoma 1 mM y no mostraron ninguna tendencia de mejora de las eficiencias de encapsulación.
A continuación, se incubaron liposomas encapsulados en función de la dosis y se realizó un estudio cinético para detectar diferencias entre la carga FITC-BSA encapsulada y el vehículo de administración etiquetado con A647 (véase laFigura 6). Las proteínas encapsuladas marcadas con FITC se midieron con un láser de 488 nm y un filtro de 574/26 nm (Attune Nxt, life technologies). Estos estudios validaron los resultados de lasFiguras 14 (B)y14 (C)mostrando de nuevo que con liposomas de 16 µM la internalización no se saturaba después de 24 h y que la internalización liposomal de concentraciones más altas se saturaba por encima de 250 µM de liposomas. Sin embargo, lo que es más importante, la carga encapsulada con FITC-BSA y los liposomas marcados con A647 mostraron tasas de internalización dependientes de la dosis casi idénticas y una cinética de internalización altamente correlacionada, lo que indica que la carga y el vehículo de entrega entran en vías de procesamiento similares, como ya se observó por microscopía en laFigura 3 (D).
A continuación, se utilizaron estos métodos de encapsulación optimizados para formular liposomas que contuvieran la proteína EBNA1 inmunoactiva. Se seleccionó el EBNA (antígeno nuclear de Epstein-Barr) como péptido modelo. Se trata de un péptido inmunoactivo corto del virus de Epstein Barr (VEB) que tiene una prevalencia de más del 90% en la población adulta (véase Cohen, 2000, N Engl J Med, 343, 7, 481-492). Además, un péptido de mantenimiento de la casa PCNA (antígeno nuclear de células proliferantes) está asociado con la progresión del cáncer y se cree que promueve la evasión inmunológica (Rosental et al., 2011, J Immunol, 187, 11, 5693-5702). Además, el péptido de mantenimiento PCNA (antígeno nuclear de células proliferantes) está asociado a la progresión del cáncer y se cree que promueve la evasión inmunológica.Por lo tanto, este péptido se utilizó como control negativo.
Ejemplo 9
Expresión de proteínas bacterianas y purificación de EBNA1 y PNCA
Se utilizaron células E. coli EBNA1 BL21 y PCNA BL21 LC (véase Barwell et al., 1995, J Biol Chem, 270, 35, 20556-20559). Las proteínas se fusionaron con una etiqueta His y un sitio de reconocimiento de trombina. Para la expresión de las proteínas, las células se cultivaron en 50 ml de medio LB (Luria/Miller, Carl Roth) con 200 µg/ml de Ampicilina en un matraz Erlenmeyer de 250 ml durante toda la noche a 37 °C y 300 rpm (MaxQ 4000, Thermo Fisher Scientific). Al día siguiente, el precultivo se centrifugó a 3000 g durante 12 min (Multifuge X3R Heraus, Thermo Scientific Fisher). El precipitado se resuspendió en medio LB fresco. Para la inoculación de 500 ml de medio suplementado con 200 µg/ml de Ampicilina, se añadieron 20 ml de precultivo a un matraz Erlenmeyer de 2000 ml y se agitó a 300 rpm a 37°C. El cultivo se incubó hasta alcanzar un valor de densidad óptica (DO a 600 nm) de aproximadamente 0,8 para inducir la expresión proteica con 1 mM de IPTG durante toda la noche a 30°C. Al día siguiente, se centrifugaron 500 ml de suspensiones celulares bacterianas a 4000 g durante 15 min. Se descartó el sobrenadante y el precipitado se resuspendió en PBS, se transfirió a un tubo de 50 ml, se centrifugó de nuevo y el precipitado final de E. coli se congeló a -80°C o se utilizó directamente para la purificación de proteínas mediante cromatografía de afinidad con una columna His-tag (HisTrap HP, 1 x 1 ml; GE Healthcare).
Para purificar la proteína expresada recombinante, las células E.coli se lisaron con 5 ml de tampón de lisis (50 mM Na2PO4, Carl Roth; 300mM NaCl, Panreac AppliChem; 10 mM imidazol, Carl Roth; pH 8) por 1 g de precipitado de E.coli. Se añadió 1 mg de lisozima (Fluka) por 1 ml de lisado y las células se incubaron a 4 °C durante 30 min. Después, las células se sometieron a tres sonicaciones de 20 segundos al 30% de amplitud y 10 segundos de desconexión entre ellas (Bransen, sonificador digital). El lisado se centrifugó a 10000 g durante 15 min y el sobrenadante, que contenía la proteína sobreexpresada, se filtró con un filtro de membrana de 0,45 µm (Corning) para eliminar los restos celulares.
Las proteínas expresadas recombinantemente se purificaron mediante cromatografía de afinidad his-tag utilizando una cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC, MWD2.1L Azura, Knauer) La FPLC se equilibró con tampón de unión (en la línea A: 50 mM Na2PO4, 300mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8), tampón de lavado (en la línea B: 50 mM Na2PO4, 300mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8), agua destilada (en la línea C) y tampón de elución (en la línea D: 50 mM Na2PO4, 300mM NaCl, 250 mM imidazol, pH 8). El sobrenadante filtrado que contenía la proteína sobreexpresada se inyectó en la FPLC. El sobrenadante se cargó en la columna his-trap con tampón de unión a un caudal de 1 ml/min y una presión máxima de 1 bar durante 20 min. La concentración de proteína se midió a 280 nm con un detector UV. La columna cargada se lavó durante 20 min con tampón de lavado antes de eluir la proteína aplicando un gradiente de tampón de lavado a tampón de elución durante 10 min. Se recogieron fracciones de 1 ml en pequeños tubos de reacción. Durante 5 min adicionales, se aplicó un 100% de tampón de elución para eluir toda la proteína atrapada. La columna se equilibró con tampón de unión antes de iniciar la siguiente serie. Se recogieron las fracciones con proteínas marcadas con his y se combinaron para dializar las proteínas (diálisis CelluTrans, Cral Roth) con tampón HBS (25 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5) que contenía 2 mM CaCl2. La calidad de las proteínas se comprobó mediante gel SDS-PAGE y la concentración de proteínas se midió mediante nanodrop (nanofotómetro Implen).
Los péptidos se sobreexpresaron en E.coli y los resultados se muestran en laFigura 7. Tras la lisis celular, los péptidos fusionados con His se purificaron mediante una columna de afinidad His-tag (véase laFigura 7 (A)). A continuación se aplicó SDS-PAGE para determinar la calidad del péptido (véase laFigura 7 (B)). Las fracciones de carga, de paso y de lavado se utilizaron para seguir la purificación del péptido. A continuación, los péptidos de PCNA y EBNA se marcaron con FITC y se encapsularon en liposomas.
Las proteínas se cargaron como se describe en la sección de "Carga y purificación de liposomas", excepto que las proteínas EBNA conjugadas con FITC se digirieron con un volumen diez veces mayor de tripsina, se purificaron por exclusión de tamaño y se concentraron con ultracentrifugación. Todos los demás pasos se realizaron de acuerdo con el protocolo
Los liposomas se analizaron mediante DLS y las eficiencias de encapsulación se detectaron con un lector de placas de fluorescencia (véase laFigura 7 (C)). El tamaño, el potencial zeta y las eficiencias de encapsulación estaban en el rango típico de las formulaciones liposomales anteriores (véase laFigura 5 (C)).
A continuación, se administraron antígenos FITC-PCNA y FITC-EBNA a los LC. Los liposomas encapsulados con antígenos dirigidos a los LC tiñeron el 56,9% y el 84,1% de los LC con FITC-PCNA y FITC-EBNA, respectivamente, mientras que los liposomas desnudos no mostraron ningún aumento de la fluorescencia FITC. Esto demuestra la entrega específica de antígenos a través de liposomas encapsulados.
En conjunto, las proteínas encapsuladas en liposomas pueden entregarse específicamente a las células Langerinpositivas.
Ejemplo 10
Ensayo de unión e internalización de liposomas celulares
La especificidad de los liposomas se investigó expresando varios CLR con patrones de unión superpuestos en líneas celulares modelo y analizando la unión a liposomas. Se sembraron 50000 células Raji en 100 µl de medio de crecimiento completo que contenía 16 µM de liposomas. Para medir la unión liposomal, la placa se incubó a 4 °C, mientras que la internalización del receptor se indujo con la incubación a 37 °C. Tras la incubación, las células se centrifugaron a 500 g durante 3 min y se desechó el sobrenadante. Las células se resuspendieron en 100 µl de medio de cultivo helado y se analizaron detectando el colorante Alexa647 coformulado mediante citometría de flujo con un láser de 633 nm y un filtro de 570/20 nm (BD FACSCanto II, BD Biosciences) o un láser de 654 nm con un filtro de 670/14 nm (Attune Nxt, life technologies).
Como se presenta en laFigura 9, se probó la unión liposomal de liposomas desnudos, GlcNTosyl y conjugados con manosa hacia células wt, Langerina<+>, Langerina de ratón<+>(mLangerina<+>), DC-SIGN<+>y Dectina-1 de ratón<+>(mDectin-1<+>). La unión liposomal se detectó tras la incubación con células que expresaban CLR a 4°C. Las señales de fluorescencia de los lípidos A647 coformulados mostraron una unión significativa de los liposomas funcionalizados con GlcNTosyl a las células Langerina<+>Raji. La señal de fluorescencia se multiplicó por 46 y fue específica de las células Langerina<+>. Los liposomas funcionalizados con manosa no fueron capaces de unirse a las células Langerina<+>, pero se unieron significativamente a las células DC-SIGN<+>con un aumento de la fluorescencia de 12 veces. La unión liposomal de varias preparaciones de liposomas con GlcNTosyl funcionalizado mostró una unión consistente a las células Langerina<+>. La unión liposomal se caracterizó aún más utilizando laminarina, manano y EDTA como competidores. El ligando natural manano que se une al sitio de unión primario de Langerina y DC-SIGN abolió completamente la unión liposomal a ambos CLR. El EDTA inhibió parcialmente la unión de los liposomas funcionalizados con GlcNTosil e impidió por completo la unión liposomal de los liposomas conjugados con manosa (véase laFigura 9 (B)). Por lo tanto, los liposomas basados en glicomiméticos inspirados en la heparina mostraron una unión específica al sitio de unión primario de la Langerina humana de forma dependiente del calcio.
Ejemplo 11
Internalización de liposomas funcionalizados con ligando de Langerina inspirado en la heparina
Hasta ahora, se había detectado la unión específica de los liposomas dirigidos a la Langerina a las células que la expresan. Sin embargo, para la administración de agentes inmunomoduladores, es necesario que los liposomas se internalicen en las células; por ello, se realizaron estudios de microscopía con liposomas no funcionalizados y funcionalizados. La microscopía de barrido láser (LSM) en combinación con proteínas fluorescentes o fluoróforos sintéticos permite detectar la co-localización de partículas y orgánulos celulares. Las células se cultivaron en cubreobjetos (Carl Roth) en placas de 24 pocillos de cultivo (Corning). Antes de la siembra celular, los cubreobjetos se recubrieron con poli-L-lisina (Sigma Aldrich) mediante incubación durante una noche. Tras lavar los cubreobjetos con DPBS, se sembraron 200.000 células Hek293 en peso o con Langerina<+>en 500 µl de medio de cultivo. La placa de 24 pocillos se incubó durante toda la noche a 37°C y 5% de CO2. Al día siguiente, se añadieron liposomas 16 µM durante 1 h a 37°C a menos que se indicara lo contrario. Tras la incubación con liposomas, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% (Roti-Histofix, Carl Roth) durante 10 min, y la membrana celular se tiñó con 10 µM de DiO (Thermo Fisher Scientific) durante 15 min. Para teñir el núcleo, las células se permeabilizaron primero con saponina al 0,1% (Sigma Aldrich) durante 10 min y posteriormente se tiñeron con 1 µg/ml de DAPI (Sigma Aldrich) durante 5 min. Para el almacenamiento a largo plazo, los cubreobjetos se fijaron en portaobjetos de microscopio (Carl Roth) utilizando una solución de montaje (Carl Roth). Los portaobjetos se analizaron mediante microscopía (microscopio confocal de lámina de luz DLS-DMi8, Leica). La internalización de los liposomas dirigidos a la Langerina se detectó mediante el barrido de diferentes capas del foco celular (véase laFigura 10). Aunque los liposomas se localizaron principalmente en las regiones superiores, las capas celulares central e inferior mostraron también señales de fluorescencia A647 que afirmaban la internalización liposomal.
A continuación, se estudiaron con más detalle las interacciones receptor-ligando mediante cinéticas de unión e internalización de liposomas funcionalizados con Langerina. La cinética de unión reveló que la adhesión de los liposomas a las células Langerina<+>se saturaba al cabo de 4 h (véase laFigura 11 (A)). En cambio, la cinética de internalización se llevó a cabo a 37°C hasta las 24 h (véase laFigura 11 (B)). Incluso tras 24 h de incubación, la señal de fluorescencia del A647 no estaba saturada, lo que implicaba una elevada captación de los liposomas dirigidos a la Langerina. Sin embargo, la internalización liposomal se limitó al aplicar concentraciones más elevadas (véase laFigura 11 (C))¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.
Las concentraciones aplicadas en estudios anteriores (16 µM) se indican con una flecha negra en laFigura 11 (C). La saturación se alcanzó con concentraciones superiores a 250 µM. Los estudios de unión, captación y concentración no fueron directamente comparables porque la potencia del láser se adaptó para cada medición. En todos los experimentos no se observó unión a las células Raji wt (líneas negras continuas).
Para visualizar y verificar las altas tasas de captación de liposomas, se realizaron estudios de microcopia. Los liposomas dirigidos se incubaron con células Hek293 Langerina<+>durante varios puntos de tiempo hasta 48 h (véase laFigura 12). Tras 30 min, ya se observó la internalización liposomal.
Después de 24 h, los liposomas se acumularon tan fuertemente que la señal A647 estaba completamente sobresaturada. Por lo tanto, se redujeron los voltajes PMT visibles en el panel derecho. Las células Wt Hek293 no mostraron ninguna señal de fluorescencia detectable de los lípidos A647, incluso a altos PMT, después de 48 h. En conjunto, se demostró que la unión específica y la captación de los liposomas dirigidos a las líneas celulares que expresan Langerina dependen de la dosis y del tiempo.
Ejemplo 12
Administración dirigida a líneas celulares modelo: densidad mol% del ligando
Se detectó una dependencia de la señal de fluorescencia con respecto a la relación molar del ligando, lo que demuestra una relación entre la concentración del ligando diana y la eficacia de unión a las células Langerina<+>(véase laFigura 13)
Las formulaciones liposomales con diferentes proporciones molares también se incubaron en función de la dosis y el tiempo (véase laFigura 14)
Ejemplo 13
Enrutamiento liposomal y administración de antígenos mediante liposomas dirigidos a la Langerina
El destino de la presentación del antígeno en MHCI o MHCII depende en gran medida de las vías de procesamiento intracelular. Por ello, se analizó la ruta de los liposomas con marcadores endosómicos. La localización de los liposomas se estudió mediante microscopía tras 2 h de incubación de los liposomas con inmunotinción contra Rab5, Rab7, Rab11, EEA1 y Lamp-1 (véase laFigura 15). En laFigura 15 (A)la co-localización es visible fusionando ambos canales con intensidad gris media en un único tono gris brillante. La mayoría de las señales de fluorescencia superpuestas que surgen de proximidades cercanas o idénticas de liposomas se detectaron con el marcador endosomal/lisosomal tardío Lamp-1.
Se detectó una menor co-localización en comparación con Lamp-1 para los marcadores endosomales tempranos EEA1 y Rab5, así como con el marcador de reciclaje Rab11. En conclusión, tras 2 h de incubación con liposomas, la mayoría de los vehículos diana de la Langerina se localizaron en endosomas tardíos y lisosomas. Sin embargo, los liposomas se co-localizaron con los marcadores endosómicos tempranos EEA1 y Rab5 en los puntos temporales más tempranos de 2 min y 20 min (véase laFigura 16).
En conjunto, estos datos demuestran que los liposomas dirigidos son captados por las líneas celulares Langerina positivas y siguen un recorrido intracelular en el compartimento endosomal que comienza en el endosoma temprano (2-20 min), para pasar después al compartimento endosomal tardío y al lisosomal (60-120 min).
Ejemplo 14
Citotoxicidad in vitro de liposomas dirigidos a la Langerina inspirados en la heparina
Los liposomas están formados principalmente por fosfolípidos y colesterol. Estos compuestos naturales y biocompatibles han revelado que los liposomas son muy seguros en los ensayos clínicos (Immordino et al., 2006, Int J Nanomedicine 1, 3, 297-315). No obstante, periodos de incubación más largos y concentraciones elevadas de liposomas funcionalizados pueden provocar efectos citotóxicos. Para descartar la toxicidad inducida por el colorante fluorescente y el ligando glicomimético de Langerina se realizaron ensayos de toxicidad. Para analizar los efectos citotóxicos inducidos por los liposomas, se tiñeron las células con Annexin-V y 7-AAD. Para analizar la apoptosis temprana y tardía, se incubaron 10000 células con varias concentraciones de liposomas en 50 µl durante 24 h o se incubaron liposomas 16 µM durante varios puntos de tiempo a 37 °C y 5% de CO2. Como control positivo, las células se trataron durante 3 min con DMSO al 50%. Como controles negativos se aplicaron células no tratadas. Las células se lavaron y se resuspendieron en 25 µl de tampón (10 mM HEPES, 140 mM NaCl y 2,5 mM CaCl2, pH7,4) que contenía Annexin-V-FITC diluido 1:100 (Adipogen). Las células se incubaron durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Tras el lavado, las células se resuspendieron en 100 µl de tampón que contenía 1 µl de solución 7-AAD (Biolegend) y se incubaron durante 5-10 min en la oscuridad a temperatura ambiente. Las células se midieron directamente sin más pasos de lavado mediante citometría de flujo. Annexin-V y 7-AAD se excitaron con el láser 488, Alexa 647 con el láser 654. Annexin-V se detectó con un filtro 530/30, 7-AAD con un filtro 695/40 y Alexa647 con un filtro 670/14 (Attune Nxt, life technologies). Se compensaron los solapamientos espectrales. Los liposomas dirigidos a la Langerina se incubaron con células durante periodos de tiempo prolongados de hasta 72 h, y posteriormente se analizó la toxicidad celular (véase laFigura 17).
Los efectos apoptóticos tempranos se detectaron con la tinción de Annexin-V que se une a la fosfatidilserina translocada, mientras que las células apoptóticas tardías se tiñeron con 7-AAD un intercalador fluorescente impermeable a las células que se asocia al ADN y sufre un desplazamiento espectral. Sin embargo, el 7-AAD es permeable a la membrana en las células muertas. Los restos celulares se omitieron al gating células vivas y muertas en el gráfico FSC-A/SSC-A. Tras la discriminación de dobletes, se analizaron células individuales para la tinción con Annexin-V-FITC y 7-AAD en un histograma bivariante dividiendo el gráfico en cuatro cuadrantes. Las células no tratadas, tratadas con DMSO y tratadas con liposomas se presentaron de forma ejemplar en laFigura 17 (A). Siguiendo la misma estrategia de gating, se analizó la frecuencia de progenitores (FoP) de los cuatro cuadrantes a partir de muestras incubadas en distintos periodos de tiempo. Los FoP de las células doblemente negativas (células vivas), de las células Annexin-V<+>(células apoptóticas tempranas) y de las células 7-AAD así como doblemente positivas (células apoptóticas tardías) se visualizaron en un gráfico de columnas agrupadas (véase laFigura 17 (B)). Las células no tratadas, que representaban el control negativo, mostraron más de un 90% de células viables. Por otro lado, las células tratadas con DMSO (50% de DMSO durante 3 min) sirvieron como control positivo revelando un 98% de células muertas. Así pues, las muestras de control representan un ensayo funcional. Incluso los periodos de tiempo prolongados, hasta 72 h, no mostraron ningún indicio de efectos citotóxicos inducidos por los liposomas. Además, se realizó un seguimiento de la internalización liposomal analizando la fluorescencia del lípido A647 coformulado (véase laFigura 17 (C)). De forma similar a los resultados anteriores, no se detectó ninguna saturación de la internalización liposomal después de las 24 h (compárese con laFigura 14). Sin embargo, la internalización liposomal se saturó después de 48 h a 72 h. Cabe destacar que se plataron 10000 células en sólo 50 µl de medio de crecimiento.
De forma similar al estudio cinético, se realizó un estudio de toxicidad dependiente de la dosis (véase laFigura 18). La estrategia y las muestras de control fueron idénticas a las del estudio de toxicidad anterior (véase laFigura 17). Aquí, se incubaron concentraciones de liposomas entre 1 µM y 1 mM durante 24 h. Tras la incubación, se analizó la toxicidad mediante tinción con Annexin-V y 7-AAD, como se ha mencionado antes. Incluso a la concentración más alta de 1 mM, los liposomas no mostraron efectos tóxicos para las células Langerina<+>(véase laFigura 18 (B)). Como antes, la internalización liposomal se detectó con los lípidos A647 coformulados. La captación se saturó con concentraciones superiores a 250 µM, como se había demostrado antes (véanse laFigura 18 (C)y laFigura 14 (C)). En conjunto, los liposomas dirigidos no mostraron toxicidad alguna durante un periodo de tiempo prolongado, ni indujeron la muerte celular cuando se aplicaron a concentraciones muy elevadas durante 24 horas.
Ejemplo 15
Administración dirigida a líneas celulares modelo: SNPs
Mutagénesis
Las mutaciones N288D y K313I se introdujeron en el ADN de tipo silvestre (wt) de la Langerina humana mediante mutagénesis in vitro dirigida al sitio. Para la mutagénesis dirigida al sitio, se utilizó un kit de mutagénesis disponible en el mercado (QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit, Agilent). Todos los pasos se siguieron de acuerdo con el fabricante. Brevemente, los cebadores para la PCR mutacional dirigida al sitio se diseñaron con la herramienta en línea QuickChange Primer Design (Agilent). Se preparó una mezcla maestra y se transfirieron 48 µl a un tubo de reacción PCR para cada reacción mutacional. Se añadieron 1 µl de cebador directo 10 µM y 1 µl de cebador inverso 10 µM por reacción mutacional (véase también elEjemplo 1). La mezcla de reacción se transfirió a un termociclador y se aplicó un programa de PCR según las directrices del fabricante. Tras la reacción de PCR, se añadió 1 µl de Dpn I durante 1 h a 37 °C para digerir las cadenas parentales de ADN metilado y hemimetilado. A continuación, las reacciones de PCR digeridas se transformaron, cultivaron y cosecharon en células E.coli 5-alfa competentes (NEB). Las células se asentaron en placas de agar con L-ampicilina y, al día siguiente, se recogieron de dos a tres colonias bacterianas por clon y se cultivaron para aislar el plásmido (kit de minipreparación de plásmidos GeneJET, Thermo Fisher Scientific). Se midió la concentración de ADN con un nanodrop (Nanofotómetro Implen) y se secuenció el ADN plasmídico. Para introducir la segunda mutación, se repitió la mutagénesis con un plásmido mutado.
Evaluación de la unión liposomal a polimorfismos nucleotídicos relevantes de la Langerina humana
Se determinó el efecto de los residuos polimórficos sobre la actividad de unión e internalización liposomal en células humanas que expresan Langerina. Se introdujeron polimorfismos de nucleótido único (SNP) relevantes en el ADNc wt de la Langerina. La Langerina wt a la que se hace referencia en este texto contiene el polimorfismo V278A y está presente en la población humana en un 49,9% (rs741326, base de datos SNP del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI)). Como la Langerina tiene varias variaciones SNP, se centró la atención en el polimorfismo más importante para este estudio, un polimorfismo doble N288D/ K313I que mostró afinidades de unión mejoradas para los glicanos con residuos terminales GlcNAc y afinidades reducidas para los glicanos 6SO4-Gal presentados en estudios anteriores (J Biol Chem, 288, 52, 36762-36771). El mutante N288D/ K313I tiene una heterocigosidad del 13,5% (rs13383830 y rs57302492, respectivamente, base de datos NCBI SNP). El doble polimorfismo N288D y K313I se da siempre junto en la población humana.
El mutante simple N288D y el mutante doble se fusionaron a una etiqueta bandera en el extremo N-terminal de la Langerina. En primer lugar, se probó la unión liposomal de liposomas dirigidos y desnudos a la Langerina wt<+>y se comparó con los mutantes de Langerina N288D, K313I y el doble mutante N288D/ K313I (véase laFigura 19 (A)). La unión de los liposomas dirigidos a la mutante K313I se situó en un rango similar al de la Langerina wt. La N288D y el doble mutante N288D/ K313I mostraron una unión liposomal significativamente mayor. Llama la atención la correlación entre el aumento de los valores de unión de los mutantes que también contienen una etiqueta flag. Dado que la unión liposomal está directamente relacionada con la expresión de Langerina en la superficie celular, se detectó la expresión del receptor extracelular con un anticuerpo anti-Langerina humana. Se detectó una tinción con anticuerpos análoga a la observada para la unión de liposomas dirigidos (véase laFigura 19 (B)). Los valores de IFM normalizados del mutante K313I fueron comparables a los de la Langerina wt, mientras que los valores de IFM del mutante N288D y del mutante N288D/ K313I aumentaron significativamente. La única diferencia con respecto a la unión liposomal fue que la tinción con anticuerpos reveló una mayor expresión del mutante N288D en comparación con el doble mutante. En consecuencia, las distintas expresiones de los receptores afectaron al cambio de pliegues de la tinción del liposoma con respecto al anticuerpo (véase laFigura 19 (C)). El mutante N288D y el mutante doble mostraron una fuerza de unión significativamente mayor a los liposomas diana en relación con la expresión del receptor. Pero sólo el mutante doble presentaba un cambio de pliegue superior al doble que la Langerina wt, lo que indica una afinidad mejorada con el ligando diana. En segundo lugar, se estudió el efecto de los mutantes en el resultado de la internalización liposomal. Para ello, se incubaron liposomas durante diferentes periodos de tiempo en combinación con los mutantes a 37°C para inducir la internalización del receptor. En contraste con la unión liposomal, se detectaron los valores MFI más altos para el mutante K313I y para la Langerina wt tras 24 h de internalización del receptor. Antes del punto temporal de las 6 h, la Langerina wt y el mutante K313I mostraron tasas de internalización inferiores similares a los resultados de la unión liposomal. Sin embargo, el efecto de los mutantes fue insignificante con respecto a la Langerina wt. En consecuencia, el polimorfismo natural N288D/K313I de la Langerina no tuvo ningún impacto en la ingestión de liposomas.
Ejemplo 16
Entrega dirigida de proteínas modificadas directamente a líneas celulares modelo
Preparación del constructo reactivo ligando liker para reaccionar con los grupos amino de las proteínas
El compuesto 7 (0,87 mg, 2,3 μmol) se disolvió en 300 μL de DMSO y 43 μL de piridina en presencia de 17,4 uL de trimetilamina bajo atmósfera inerte. Se añadieron 8,63 mg (22 μmol) de bis(4-nitrofenil) adipato (disuelto en 193 μL de DMSO) y se dejó agitar la solución durante 3 horas. Posteriormente se eliminó el disolvente por liofilización. El residuo se lavó con tolueno y el disolvente se eliminó al vacío para obtener el compuesto 8.
Preparación de la proteína fluorescente verde (GFP) modificada con ligando
La proteína de fluorescencia verde (GFP) se utilizó como modelo para la modificación directa de proteínas por ligandos. La secuencia de aminoácidos de la GFP fue MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPV PWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAE VKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKI RHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEF VTAAGITLGMDELYKA(SEQ ID NO: 82)
Se añadió una solución de 1 mg de GFP en 175 μL de PBS (pH 8) a 1,45 mg (2,31 μmol) del compuesto reactivo 8 (véase más arriba, Ejemplo 16) y se dejó agitar durante 23 horas a temperatura ambiente. La mezcla se diluyó con PBS (pH 7,4) hasta 2,5 mL y se centrifugó. El sobrenadante se dializó dos veces durante 12 horas con PBS (pH 7,4) a 4 °C y la solución se concentró posteriormente hasta obtener 1,06 mg/mL de proteína modificada.
Caracterización de la proteína verde fluorescente (GFP) modificada con ligando
Para estimar el número total de ligandos en la GFP modificada, obtenida siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 17, se realizaron mediciones de Desorción/Ionización Láser Asistida por Matriz (Bruker MALDI-TOF Autoflex speed) utilizando una matriz de 2,5-dihidroxiacetofenona. La comparación del peso molecular medio de la GFP prístina y de la GFP modificada con ligando dio una media de unos 7 restos de ligando por molécula de proteínaEntrega dirigida a líneas celulares modelo: Captación de cargas proteínicas
A continuación, se probó la GFP funcionalizada en un ensayo de unión e internalización celular. Tanto la GFP funcionalizada con GlcNTosil como la GFP no conjugada se incubaron con células Raji WT o hLangerina<+>a 4°C y a 37°C durante 1 h o 2 h, respectivamente (véase laFigura 21). La GFP dirigida se unió específicamente a las células que expresaban Langerina y se saturó a concentraciones superiores a 1 µg/ml (véase laFigura 21 (A)). La GFP no conjugada y la GFP dirigida incubadas con células WT Raji no mostraron un aumento de las señales de fluorescencia. Además, la GFP dirigida incubada a 37°C mostró también un aumento de la fluorescencia en las células Langerina<+>. La fluorescencia de la GFP se elevó ligeramente en comparación con el ensayo de unión y también se saturó por encima de 1 µg/ml.
Sin embargo, a diferencia de la internalización liposomal, la captación de GFP apenas fue visible, lo que indica una tasa de internalización deficiente o una degradación rápida (véase laFigura 21 (B)).
Mediante microscopía de fluorescencia, se investigaron la GFP funcionalizada y la GFP no conjugada tras su incubación con células COS-7 con Langerina<+>(véase laFigura 16¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.). Las células incubadas con GFP funcionalizada mostraron un aumento de las señales de fluorescencia, mientras que la GFP no conjugada no se unió a las células Langerina<+>. Tras sólo 5 min de incubación a 37°C, la GFP funcionalizada se redistribuyó y, tras 60 min, parecía localizarse en compartimentos endosómicos. La distinta tinción de la membrana celular en el punto temporal 0 min quedó completamente abolida en el punto temporal 60 min, lo que sugiere la internalización de la GFP. Además, los estudios de unión y competencia con manano demostraron que la GFP funcionalizada mostraba afinidades de unión aumentadas (véase laFigura 22 (A)). Fue necesario aplicar concentraciones de manano de hasta 500 µg/ml para competir con la unión de la GFP funcionalizada con GlcNTosil, mientras que, por el contrario, 50 µg/ml de manano fueron suficientes para competir con los liposomas funcionalizados. Para diferenciar la unión de la internalización, se añadió manano tras el paso de incubación de 4 h a 4°C (véase laFigura 22 (A)). Ni los liposomas ni la GFP pudieron competir, lo que indica de nuevo que ambos portadores están internalizados. Sin embargo, cuando se añadió manano durante un tiempo de incubación más largo a 37°C, la fluorescencia de la GFP disminuyó fuertemente en comparación con los liposomas (véase laFigura 22 (B)). La reducción de la señal también fue visible cuando se incubó con DPBS, pero la adición de manano potenció el efecto. En resumen, la GFP funcionalizada y conjugada con aproximadamente siete ligandos mostró una mayor afinidad de unión en comparación con los liposomas conjugados con ligandos. Sin embargo, la internalización de la GFP se vio drásticamente perjudicada en comparación con los liposomas decorados con GlcNTosil.
Ejemplo 17
Administración selectiva de nanopartículas alternativas
Preparación de perlas de PMMA modificadas con ligando
Se disolvieron 0,01 mL de perlas de poli(metacrilato de metilo) carboxilado (solución madre al 0,5%, diámetro 130 nm, PolyAn) en 200 μL de tampón de activación (MES 50 mM pH=5 0,001% de tween). Se añadieron 12 μL de una solución acuosa 1,5 M de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida y 12 μL de una solución 0,3 M de N-hidroxisuccinimida y se agitaron enérgicamente durante 1 hora. Posteriormente se lavaron las microesferas tres veces con tampón de acoplamiento (HBS, pH=7, 5 mM Ca<2+>). Se añadieron 2 μL de una solución acuosa de ligando diana 10 mM y se dejaron agitar durante toda la noche a temperatura ambiente. Las microesferas modificadas se lavaron dos veces con etanolamina (1 M en tampón de acoplamiento, pH=8 0,02% de tween) y, a continuación, se lavaron y almacenaron en tampón HBS (pH=7, 5 mM Ca<2+>, 0,02% de Tween) a 4°C.
Interacción de perlas de PMMA modificadas con ligando con células THP-1
Se añadieron diferentes dosis (5, 10, 20 μL) de una solución de microesferas de PMMA modificadas con ligando (c= 2,5 x 10<7>microesferas/mL (preparación descrita en el Ejemplo 18) a suspensiones de células THP-1 de 50 µL (el recuento de células fue de 2 x 10<6>células/ml). Tras 45 min de incubación en hielo y exclusión de la luz, se centrifugaron las mezclas, se fijaron con 120 µL de una solución acuosa de paraformaldehído (4%) y finalmente se volvieron a suspender en 150 µL de medio. La interacción perlas-células se analizó mediante citometría de flujo con clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para células THP1 que detectan la fluorescencia roja de las perlas.
Ejemplo 18
Administración dirigida a células de Langerhans primarias
Administración liposomal en suspensiones de células epidérmicas
Las células primarias son un modelo excelente antes de trasladar los estudios in vivo. Se extrajeron muestras de piel de donantes sanos de la grasa subcutánea con un bisturí. Las suspensiones de células epidérmicas se incubaron en medio RPMI1640 (Lonza) suplementado con 1,5 U/ml de dispasaII (Roche) y 0,1% de tripsina (Sigma-Aldrich) durante toda la noche a 4°C. Por otro lado, las suspensiones de células de piel entera se obtuvieron mediante incubación en medio RPMI1640 suplementado con un 10% de FCS (Pan-Biotech) y 1 mg/ml de colagenasaIV (Worthington Biochemical Corporation) durante toda la noche a 37°C. La epidermis pelada o la piel entera se filtraron a través de un colador celular de 100 µm (Thermo Fisher Scientific) para obtener suspensiones de células individuales. Las suspensiones celulares se incubaron con liposomas 16 µM en tampón HBSS (Mg<2+>y Ca<2+>; Biochrom GmbH) que contenía un 1 % de BSA (Serva Electrophoresis GmbH) durante 1 h a 37 °C. Para el estudio cinético se incubaron los liposomas durante varios periodos de tiempo a 37 °C o 4 °C. Como control, se añadió EDTA 10 mM (Lonza). Antes de analizar las células por citometría de flujo (FACS Canto II, BD Biosciences), se tiñeron con un colorante de viabilidad eFluor® 780 (eBioscience) y anticuerpos conjugados con fluorocromos (CD1a, clon: HI149; CD14, clon: HCD14; HLA-DR, clon: L243; CD45, clon: HI30 - Biolegend; Langerina, clon: MB22-9F5 - Miltenyi Biotec; anticuerpos de control coincidentes con el isotipo) durante 15 min a 4°C. Para la microscopía confocal, las suspensiones de células epidérmicas se tiñeron con el anticuerpo CD1a conjugado con FITC (clon: HI149; Biolegend) durante 15 min a 4°C. Tras 1 h de incubación liposomal a 37°C, las células se analizaron mediante microscopía (Zeiss AxioObserver Z1).
Para la utilización de células primarias, se prepararon suspensiones de células epidérmicas a partir de muestras de piel humana y se analizó la unión de los liposomas a las células de Langerhans mediante citometría de flujo (véase laFigura 24 (A)). Las células de Langerhans se identificaron mediante la expresión de CD45<+>, HLA-DR<+>y CD1a<+>. Además, un colorante de viabilidad (eFluor 780) discrimina las células muertas (L/D). Las células hematopoyéticas CD45<+>viables contenían un 94% de células de Langerhans HLA-DR<+>, CD1a<+>.
Más del 97% de las células de Langerhans epidérmicas fueron Langerina positivas y se tiñeron con el colorante coformulado A647 presente en los liposomas. La unión liposomal a las células de Langerhans fue específica para los liposomas decorados con el ligando y la unión liposomal dependiente de Ca<2+>compitió con 10 mM de EDTA. Estos resultados confirman una interacción específica ligando-receptor en el sitio de unión primario del CRD de la Langerina. Además, la tinción liposomal fue específica para las CL, ya que las células CD45<->y CD45-, HLR-DR<->no fueron capaces de unirse a los liposomas dirigidos a la Langerina (véase laFigura 24 (B)). Además, el hecho de que el EDTA impida la unión de los liposomas lo convierte en una herramienta ideal para analizar la internalización de los liposomas mediante la adición de EDTA después del paso de incubación para eliminar los liposomas unidos extracelularmente (véase laFigura 24 (C)). La adición de EDTA tras el paso de incubación no fue capaz de inhibir la señal de fluorescencia, lo que sugiere que los liposomas fueron internalizados, mientras que la adición directamente al medio inhibió por completo la unión liposomal así como la captación. Además, los liposomas se incubaron a 4°C para evitar la internalización incluso cuando los liposomas se unen al receptor de la superficie celular. Este paso abolió por completo la señal de fluorescencia que confirmaba la internalización de los liposomas en las CL. La internalización de los liposomas se verificó además mediante microscopía (véase laFigura 24 (C)). Aquí, los anticuerpos CD1a conjugados con FITC tiñeron las células de Langerhans en suspensiones de células epidérmicas. Los liposomas dirigidos se detectaron exclusivamente en las células de Langerhans marcadas con FITC.
Administración liposomal en suspensiones de células de piel entera
Se sabe que las CL son las únicas células presentadoras de antígenos profesionales de la epidermis. Para demostrar la especificidad liposomal hacia las CL frente a otras líneas de células dendríticas, se prepararon suspensiones de células cutáneas enteras a partir de muestras de piel humana y se analizaron mediante citometría de flujo para detectar la tinción liposomal (véase laFigura 25). La fluorescencia A647 de los subconjuntos de células distintas de Langerhans se trazó en función de la SSC-W, mientras que la tinción liposomal de las CL se trazó en función de la expresión extracelular de Langerina. En primer lugar, el 18% de las células CD45<+>, HLR-DR<+>, no autofluorescentes (AF) se identificaron como LC viables CD1ahigh, el 40% de las células contenían expresión CD1a intermedia (CD1ainter) y el 27% de las células eran CD1a-, en las que el 8% eran CD14<+>, un marcador de monocitos y macrófagos. En la población viable de CL con CD1a alto, más del 96% de las células mostraron expresión de Langerina y el 89,9% de las CL incorporaron liposomas dirigidos. Las células CD1ainter contenían un 8,3% de células Langerina<+>y un 4,9% de células se tiñeron positivamente con el colorante liposomal. La gran mayoría de la tinción liposomal se correlacionó con la expresión de Langerina, lo que indica que los liposomas dirigidos se unieron específicamente a la Langerina. Los subconjuntos de células distintas de Langerhans (incluidas las células CD45-; las células CD45<+>, HLA-DR-; las células CD45<+>, HLA-DR<+>, AF<+>; las células CD45<+>, HLA-DR<+>, CD14<+>; y las células CD45<+>, HLA-DR<+>, CD1a-) no fueron capaces de unirse a los liposomas. Sin embargo, los monocitos y macrófagos CD45<+>, HLA-DR<+>, CD14<+>nombrados mostraron una unión inespecífica a los liposomas desnudos y dirigidos con menos del 3%. Pero, en general, los liposomas desnudos no unieron ni a las CL ni a los subconjuntos celulares distintos de CL. Estos resultados confirman nuestros estudios anteriores en los que empleamos líneas celulares modelo que expresan Langerina. En consecuencia, los liposomas dirigidos son internalizados específicamente por las células que expresan Langerina de forma dependiente del Ca<2+>al unirse al sitio de unión primario del CRD de la Langerina.
En resumen, los liposomas dirigidos se administran específicamente a las células Langerin-positivas en suspensiones de células epidérmicas y de piel entera.
Ejemplo 19
Caracterización biofísica de los ligandos de Langerina humana
Expresión y purificación del receptor
Observaciones generales.Los genes con codones optimizados para la expresión de Langerina y DC-SIGN en E. coli se adquirieron a GenScript y Life Technologies, respectivamente. Todos los medios de crecimiento o productos químicos utilizados para la expresión y purificación de los receptores se adquirieron a Carl Roth si no se indica lo contrario.
La secuencia genética optimizada en codones para la Langerina que contiene un sitio StreptagII y TEV en el C-terminal para su expresión en E. coli se presenta por SEQ ID NO: 29. Para la expresión en E. coli de dicha secuencia se utilizaron las siguientes secuencias de cebadores:
La secuencia genética optimizada en codones para DC-SIGN que contiene un sitio StreptagII y TEV en el C-terminal para la expresión en E.coli se presenta por SEQ ID NO: 52. Para la expresión en E. coli de dicha secuencia se utilizaron las siguientes secuencias de cebadores:
Dominio extracelular de la Langerina.La expresión y purificación se llevaron a cabo como se publicó anteriormente (Wamhoff, E.C. et al. (19)F Nmr-Guided Design of Glycomimetic Langerin Ligands. ACS Chem Biol, 11, 2407-13 (2016)). Brevemente, el dominio extracelular (ECD) trimérico de la Langerina se expresó de forma insoluble en E. coli BL21* (DE3) (Invitrogen). Tras la lisis celular enzimática, se cosecharon los cuerpos de inclusión y posteriormente se solubilizaron. La muestra se centrifugó y el ECD de Langerina se volvió a plegar durante la noche mediante dilución rápida. A continuación, la muestra se dializó durante la noche, se centrifugó y se purificó mediante cromatografía de afinidad manano-agarosa (Sigma Aldrich). Para los experimentos de RMN filtrada con<19>F R2y de ensayo de lectina ligada a enzimas lipídicas (Lipid-ELLA), se cambió el tampón a 25 mM Tris con 150 mM NaCl y 5 mM CaCl2a pH 7,8 utilizando columnas de desalinización por exclusión de tamaño de 7 kDa (Thermo Scientific). Para los experimentos de RMN STD, las muestras de ECD de Langerina se dializaron cinco veces durante al menos 8 h contra H2O. Posteriormente, el H2O se eliminó mediante liofilización y el residuo se almacenó a -80° C. Antes de los experimentos de RMN STD, se disolvió el ECD de Langerina en 25 mM Tris-d11(Eurisotope) con 100% D2O, 150 mM NaCl y 5 mM CaCl2a pH 7. La concentración de ECD de Langerina se determinó mediante espectroscopia UV (A280, 0,1%= 2,45). La pureza y la monodispersidad de las muestras de ECD de Langerina se analizaron mediante SDS PAGE y DLS.
Langerina y el dominio de reconocimiento de carbohidratos DC-SIGN.La expresión y purificación se llevaron a cabo como se publicó previamente. Brevemente, la Langerina monomérica marcada con<15>N y los dominios de reconocimiento de carbohidratos (CRD) DC-SIGN se expresaron insolubles enE. coliBL21* (DE3) (Invitrogen). Tras la lisis celular enzimática, se cosecharon los cuerpos de inclusión y posteriormente se solubilizaron. La muestra se centrifugó y los CRD de Langerina y DC-SIGN se volvieron a plegar durante la noche mediante dilución rápida. A continuación, la muestra se dializó durante la noche, se centrifugó y se purificó mediante cromatografía de afinidad StrepTactin (Iba). Tras un paso adicional de diálisis durante la noche, se centrifugó la muestra y se cambió el tampón a 25 mM de HEPES con 150 mM de NaCl a pH 7,0 utilizando columnas de desalinización por exclusión de tamaño de 7 kDa (Thermo Scientific) para realizar experimentos de RMN de<19>F R2-filtrado y<15>N HSQC. La concentración de Langerina y DC-SIGN CRDs se determinó mediante espectroscopia UV (A280, 0,1%= 3,19 y A280, 0,1%= 2,98). La pureza y la monodispersidad de las muestras de Langerina y DC-SIGN CRD se analizaron mediante SDS PAGE y DLS.
RMN filtrada por 19F R2
Observaciones generales.Los experimentos de RMN19F R2-filtrado se realizaron en un espectrómetro PremiumCompact de 600 MHz (Agilent). Los espectros se procesaron en MestReNova y el análisis de datos se realizó con OriginPro (Mestrelab Research. Mestrenova.11.0.2. (2016); OriginLab. Originpro.9.1. (2015)). Los experimentos con el ECD Langerina se realizaron a una concentración del receptor de 50 μM en 25 mM Tris con 10% D2O, 150 mM NaCl y 5 mM CaCl2a pH 7,8 y 25° C. Los experimentos con el ECD DC-SIGN se realizaron a una concentración del receptor de 50 μM en 25 mM HEPES con 10% D2O, 150 mM NaCl y 5 mM CaCl2a pH 7,0 y 25° C. El TFA sirvió como referencia interna a una concentración de 50 μM. Las velocidades de relajación aparente R2,obspara el ligando reportero se determinaron utilizando la secuencia de pulsos CPMG como se publicó anteriormente (Wamhoff, E.C. et al.<19>F Nmr-Guided Design of Glycomimetic Langerin Ligands. ACS Chem Biol, 11, 2407-13 (2016): Carr, H.Y. & Purcell, E.M. Efectos de la difusión en la precesión libre en experimentos de resonancia magnética nuclear. Phys Rev, 94, 630-638 (1954); Meiboom, S. & Gill, D. Modified Spin-Echo Method for Measuring Nuclear Relaxation Times. Rev Sci Instrum 29, 688-691 (1958)).
Desarrollo del ensayo para DC-SIGN.El ensayo de desplazamiento reportero por RMN<19>F R2-filtrado para DC-SIGN se desarrolló siguiendo el procedimiento publicado previamente para la Langerina (Wamhoff, E.C. et al.<19>F Nmr-Guided Design of Glycomimetic Langerin Ligands. ACS Chem Biol 11, 2407-13 (2016)). Brevemente, se determinaron el valor KDy la velocidad de relajación en estado ligado R2,ba cinco concentraciones [L]Tdel ligando informador24en tres experimentos de valoración independientes. Las muestras se prepararon mediante dilución en serie. La adición de 10 mM de EDTA sirvió para validar la Ca<2+>-dependencia de la interacción entre DC-SIGN y el ligando informador. Para garantizar la validez de las ecuaciones para la determinación de KDy KI, se estimó la contribución de intercambio químico R2,exmediante experimentos de dispersión de relajación por<19>F RMN a una concentración de ligando informador de 0,1 mM en presencia del receptor.
Determinación de Ki.Los valores de Kise determinaron como se publicó anteriormente para la Langerina (Wamhoff, E.C. et al.<19>F NMR-Guided Design of Glycomimetic Langerin Ligands. ACS Chem Biol 11, 2407-13 (2016)). Brevemente, se realizaron experimentos de valoración a una concentración de 0,1 mM del ligando informador24a cinco concentraciones de competidor [I]T. Las muestras se prepararon mediante dilución en serie. Para los ácidos GlcNS, GlcNAc-6-OS y GlcNS-6-OS se controlaron los valores de pH y se ajustaron a 7,8 si era necesario.
15N HSQC RMN
Observaciones generales.Los experimentos de RMN HSQC<15>N se realizaron en un espectrómetro Ascend de 700 MHz (Bruker) (Bodenhausen, G. & Ruben, D.J. Natural Abundance Nitrogen-<15>NMR by Enhanced Heteronuclear Spectroscopy.Chem Phys Lett69, 185-189 (1980)). Los espectros se procesaron en NMRPipe (Delaglio, F. et al. Nmrpipe: A Multidimensional Spectral Processing System Based on Unix Pipes. J Biomol NMR 6, 277-93 (1995)). El análisis de los datos se realizó con CCPN Analysis, MatLab y OriginPro (OriginLab. Originpro.9.1. (2015); Vranken, W.F. et al. The Ccpn Data Model for NMR Spectroscopy: Development of a Software Pipeline. Proteins, 59, 687-96 (2005); MathWorks. Matlab.9.0. Natick, U.S.A. (2016)). Los experimentos con el CRD de Langerina se realizaron a una concentración del receptor de 100 μM en 25 mM de HEPES con 10% de D2O, 150 mM de NaCl y 5 mM de CaCl2a pH 7,8 y 25° C. ElDSS-d6sirvió como referencia interna a una concentración de 100 μM. Los espectros se referenciaron mediante la referencia interna del espectrómetro. Los espectros se adquirieron con 128 incrementos y 32 barridos por incremento para muestras de 150 μL en tubos de muestra de 3 mm. El retardo de relajación d1se fijó en 1,4 s y el tiempo de adquisición tacqen 100 ms. Se utilizó la secuencia de pulsos Watergate W5 para la supresión de disolventes (Liu, M. et al. Improved Watergate Pulse Sequences for Solvent Suppression in NMR Spectroscopy. J Magn Reson 132, 125-129 (1998)). La asignación de resonancia utilizada para el CRD de Langerina se ha publicado anteriormente (Hanske, J. et al. Intradomain Allosteric Network Modulates Calcium Affinity of the C-Type Lectin Receptor Langerin. J Am Chem Soc, 138, 12176-86 (2016)).
Determinación de KD.Los valores de KDse determinaron en experimentos de valoración a seis concentraciones de ligando [L]T. Las muestras se prepararon mediante dilución en serie. Las perturbaciones del desplazamiento químico CSP para las resonancias CRD de Langerina en el régimen de intercambio rápido o rápido a intermedio observadas al valorar con el ligando se calcularon mediante la ecuación 1 (Williamson, M.P. Using Chemical Shift Perturbation to Characterise Ligand Binding. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc 73, 1-16 (2013)).
Ecuación 1
Anteriormente se determinó una desviación estándar σ de 0,02 ppm para la medición de los desplazamientos químicos en experimentos de RMN HSQC<15>N con el CRD de Langerina (Hanske, J. et al. Intradomain Allosteric Network Modulates Calcium Affinity of the C-Type Lectin Receptor Langerin. J Am Chem Soc, 138, 12176-86 (2016)). En consecuencia, solo se seleccionaron las resonancias asignadas que mostraban valores de CSP superiores a un umbral de 2σ a la concentración más alta de ligando para la determinación de los valores de KDmediante la ecuación 2 en un ajuste global de dos parámetros (Williamson, M.P. Using Chemical Shift Perturbation to Characterise Ligand Binding. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc, 73, 1-16 (2013)). Los errores estándar se derivaron directamente de los procedimientos de ajuste. Además, las resonancias que mostraron un ensanchamiento de línea Δv0,5superior a 10 Hz tras la valoración en la dimensión<1>H o en la<15>N no se tuvieron en cuenta para la determinación de los valores de KD. CSPmaxrepresenta el valor CSP observado en el momento de la saturación del sitio de unión.
con
Ecuación 2
Para las resonancias que se suponía estaban en el régimen de intercambio lento en la valoración, los valores de KDse derivaron de las integrales Vby Vfcorrespondientes al estado ligado y libre del CRD de Langerina, respectivamente. Los valores V sirvieron para calcular la fracción ligada del receptor pbmediante la ecuación 3. Las integrales V se normalizaron mediante la integral V del K347N-terminaly sirvieron para calcular la fracción ligada del receptor pbmediante la ecuación 3. Para estos cálculos, sólo se consideraron las resonancias para las que se podía asignar el estado ligado. Los puntos de datos seleccionados que mostraban una SNR baja o problemas con la corrección de la línea de base se trataron como valores atípicos y no se tuvieron en cuenta para la determinación de los valores de pb. A continuación, un ajuste de un parámetro de la ecuación 3 a los valores medios de pbsirvió para determinar los valores de KD.
con
Ecuación 3
Análisis del modo de unión. Basándose en la asignación de resonancia, los valores de CSP observados en las concentraciones máximas de ligando [L]Tse mapearon en la estructura de rayos X del CRD de Langerina (código PDB: 4N32) utilizando la caja de herramientas bioinformáticas de Matlab mediante la sustitución de los valores del factor B (Feinberg, H. et al. Common Polymorphisms in Human Langerin Change Specificity for Glycan Ligands. J Biol Chem, 288, 36762-71 (2013); MathWorks. Bioinformatics Toolbox.4.7. Natick, U.S.A. (2016)). Los patrones CSP obtenidos se visualizaron en MOE utilizando la cadena B del CRD de Langerina en complejo con GlcNAc (ChemicalComputingGroup. Molecular Operating Enviroment. 2016.08. Montreal, Canada (2016)). La calidad del modelo se mantuvo utilizando Structure Preparation de MOE seguido de la simulación de los estados de protonación y la red de enlaces de hidrógeno del complejo con Protonate 3D de MOE. Las superficies del receptor se visualizaron en la representación Connolly (Connolly, M.L. The Molecular Surface Package. J Mol Graph, 11, 139-41 (1993)).STD NMR
Observaciones generales.Los experimentos de RMN STD se realizaron en un espectrómetro PremiumCompact de 600 MHz (Agilent) (Mayer, M. & Meyer, B. Characterization of Ligand Binding by Saturation Transfer Difference NMR Spectroscopy. Angew Chem Int Ed, 38, 1784-1788 (1999)). Los espectros se procesaron en MestReNova y el análisis de datos se realizó con OriginPro (Mestrelab Research. Mestrenova.11.0.2. (2016): OriginLab. Originpro.9.1. (2015)). Los experimentos con el ECD de Langerina se realizaron a una concentración de receptor de 50 µM en Tris-d1125 mM (Eurisotope) con 100% D2O, 150 mM NaCl y 5 mM CaCl2 a pH 7,8 y 25° C. Los experimentos se repitieron en ausencia de receptor para excluir los efectos de ETS debidos a la saturación directa de los ligandos. El H2O residual o laTSP-d6a 0,1 mM sirvieron como referencia interna. Los espectros se registraron en tubos de muestra de 5 mm con volúmenes de muestra de 500 μL. La saturación se implementó mediante un tren de pulsos Gauss de 50 ms a tiempos de saturación variables tsat. La frecuencia de irradiación en resonancia νsatse fijó en 0,0 ppm y la frecuencia de irradiación fuera de resonancia νrefse fijó en 80,0 ppm. El tiempo de adquisición tacqse fijó en 2,0 s y se utilizó la secuencia de pulsos DPFGSE para la supresión de disolventes (Hwang, T.L. & Shaka, A.J. Water Suppression That Works - Excitation Sculpting Using Arbitrary Wave-Forms and Pulsed-Field Gradients. J Magn Reson, 112, 275-279 (1995)). Las resonancias del receptor se suprimieron utilizando un filtro T1,rhoa un tiempo de relajación τ de 35 ms.
Mapeo del epítopo.Se determinó el epítopo de unión para16a una concentración de 500 µM. Para cada espectro se registraron 512 barridos. El retardo de relajación d1se fijó en 6 s y los espectros se registraron a 5 tiempos de saturación diferentes tsatque variaban de 0,25 a 6,00 s. La ecuación 4 sirvió para derivar el efecto STD de cada resonancia analizada a partir de los espectros correspondientes de dentro y fuera de resonancia (Mayer, M. & Meyer, B. Group Epitope Mapping by Saturation Transfer Difference NMR to Identify Segments of a Ligand in Direct Contact with a Protein Receptor. J Am Chem Soc, 123, 6108-17 (2001)). I0representa la integral de una resonancia en el espectro fuera de resonancia e Isatrepresenta la integral de una resonancia en el espectro en resonancia.
Ecuación 4
La velocidad de saturación aparente ksat y el efecto STD máximo STDmaxse obtuvieron a partir de la ecuación 5 en un ajuste de dos parámetros (Angulo, J. & Nieto, P.M. Std-Nmr: Application to Transient Interactions between Biomolecules-a Quantitative Approach. Eur Biophys J, 40, 1357-69 (2011)). Los errores estándar se derivaron directamente de los procedimientos de ajuste. Estos parámetros se utilizaron para calcular la pendiente inicial de las curvas de acumulación STD'0mediante la ecuación 6. Los valores STD'0se normalizaron y mapearon en la estructura del ligando correspondiente. Sólo se consideraron para la cartografía del epítopo las resonancias para las que se aisló al menos parte de un multiplete.
Ecuación 5
Ecuación 6
Modelización molecular
Observaciones generales.Los procedimientos de modelización molecular se realizaron en MOE (ChemicalComputingGroup. Molecular Operating Enviroment. 2016.08. Montreal, Canada (2016)). Se señalan las desviaciones respecto a las opciones y parámetros por defecto. Se seleccionó el campo de fuerza AMBER10:EHT para el refinamiento de las poses de acoplamiento y la red de enlaces de hidrógeno, mientras que se utilizó el campo de fuerza MMFF94x para la generación de conformadores (Case, D.A., Darden, T. A., Cheatham, T. E., Simmerling, C. L., Wang, J., Duke, R. E., Luo, R., Crowley, M., R. C. Walker, Zhang, W., Merz, K. M., B. Wang, Hayik, S., Roitberg, A., Seabra, G., K. F. Wong, Paesani, F., Vanicek, J., X. Wu, Brozell, S. R., Steinbrecher, T., Gohlke, H., Yang, L., Tan, C., Mongan, J., Hornak, V., Cui, G., Mathews, D. H., Seetin, M. G., Sagui, C., Babin, V. y P.A. Kollman. Ambar.10. San Francisco, U.S.A. (2008); Gerber, P.R. & Muller, K. Mab, a Generally Applicable Molecular Force Field for Structure Modelling in Medicinal Chemistry. J Comput Aided Mol Des, 9, 251-68 (1995); Halgren, T.A. Merck Molecular Force Field. I. Basis, Form, Scope, Parameterization, and Performance of Mmff94. J Comput Chem, 17, 490-519 (1996)). Las superficies receptoras se visualizaron en representación Connolly (Connolly, M.L. The Molecular Surface Package. J Mol Graph, 11, 139-41 (1993)).
Desarrollo del modelo farmacóforo y preparación del complejo de Langerina.Se realizó una alineación estructural de los sitios de unión de carbohidratos de la Langerina en complejo con GlcNAc (códigos PDB: 4N32) (Feinberg, H. et al. Common Polymorphisms in Human Langerin Change Specificity for Glycan Ligands. J Biol Chem, 288, 36762-71 (2013)). A partir de esta visualización, se definió un modelo farmacóforo con características para O3, O4 y O5 del andamiaje Glc. La restricción espacial de los O3 y O4 se definió mediante una esfera con un radio r de 0,5 Å, mientras que la posición del O5 se restringió mediante una esfera con un radio r de 1,0 Å. La cadena B del CRD de Langerina en complejo con GlcNAc sirvió de base estructural para el estudio de acoplamiento molecular realizado. Además, se modeló e incluyó en el estudio una conformación alternativa para K313 observada para el complejo de Langerina con Gal-6-OS (Feinberg, H. et al. Structural Basis for Langerin Recognition of Diverse Pathogen and Mammalian Glycans through a Single Binding Site. J Mol Biol, 405, 1027-39 (2011)). La calidad general del modelo y la geometría de la proteína se evaluaron y mantuvieron mediante la preparación de estructuras de MOE. A continuación, se simularon los estados de protonación y la red de enlaces de hidrógeno del complejo con Protonate 3D de MOE, seguido de la eliminación de todas las moléculas de disolvente.
Acoplamiento molecular.Las conformaciones para16se generaron utilizando la Importación de conformaciones de MOE. Se utilizó un método de colocación basado en farmacóforos para generar poses de acoplamiento que puntuamos mediante la función London ΔG. Las posturas con mayor puntuación se refinaron utilizando simulaciones de mecánica molecular, se volvieron a puntuar mediante la función GBIV/WSA ΔG, se filtraron utilizando el modelo farmacóforo y se escribieron en la base de datos de salida (Corbeil, C.R., Williams, C.I. & Labute, P. Variability in Docking Success Rates Due to Dataset Preparation. J Comput Aided Mol Des, 26, 775-86 (2012)). La flexibilidad conformacional del sitio de unión del carbohidrato se tuvo en cuenta introduciendo enlaces derivados del factor B a los átomos de la cadena lateral. Las posturas de acoplamiento refinadas se clasificaron según su puntuación GBIV/WSA ΔG y se evaluaron visualmente en el contexto de los experimentos de RMN<15>N HSQC y STD realizados.
Ejemplo 20
Los monosacáridos derivados de la heparina representan andamiajes favorables para el diseño de ligandos glucomiméticos
Aparte de su función como receptor de reconocimiento de patógenos, la Langerina interactúa con autoantígenos como los glucosaminoglicanos, incluida la heparina (Munoz-Garcia, J.C. et al. Langerin-Heparin Interaction: Two Binding Sites for Small and Large Ligands as Revealed by a Combination of NMR Spectroscopy and Cross-Linking Mapping Experiments. J Am Chem Soc, 137, 4100-10 (2015); Hanske, J. et al. Calcium-Independent Activation of an Allosteric Network in Langerin by Heparin Oligosaccharides. ChemBioChem, aceptado (2017); Zhao, J. et al. Kinetic and Structural Studies of Interactions between Glycosaminoglycans and Langerin. Biochemistry (2016)). Estos polisacáridos lineales de están compuestos por unidades repetitivas de disacáridos formadas por galactosa o ácidos urónicos y N-acetilglucosamina (GlcNAc) sulfatada diferencialmente. Impulsados por el aumento de 10 veces la afinidad (KD= 0,49±0,05 mM) sobre los disacáridos de manosa (Man) (KD= ca.4 mM) notificado recientemente para un trisacárido derivado de la heparina, se emplearon experimentos de RMN filtrados con<19>F R2observados por ligando para determinar los valores de Kipara un conjunto de derivados de GlcNAc sulfatados diferencialmente (véase laFigura 27 A) (Holla, A. & Skerra, A. Comparative Analysis Reveals Selective Recognition of Glycans by the Dendritic Cell Receptors DC-Sign and Langerin. Protein Eng Des Sel, 24, 659-69 (2011); Muñoz-García, J.C. et al. Langerin-Heparin Interaction: Two Binding Sites for Small and Large Ligands as Revealed by a Combination of NMR Spectroscopy and Cross-Linking Mapping Experiments. J Am Chem Soc, 137, 4100-10 (2015); Wamhoff, E.C. et al. (19)F NMR-Guided Design of Glycomimetic Langerin Ligands. ACS Chem Biol, 11, 2407-13 (2016)). Curiosamente, las afinidades de la glucosamina-2-sulfato (GlcNS) (Ki= 1,4±0,2 mM), la N-acetilglucosamina-6-sulfato (GlcNAc-6-OS) (KiI= 0,6±0,1 mM) y la glucosamina-2-sulfato-6-sulfato (GlcNS-6-OS) (Ki= 0,28±0.06 mM) fueron comparables o superiores a los observados para los oligosacáridos derivados de la heparina y otros monosacáridos, incluidos Glc (Ki= 21±4 mM), GlcNAc (Ki= 4,1±0,7 mM) y Man (Ki= 4,5±0,5 mM) (véanse laFigura 30y laFigura 39) (Hanske, J. et al. Calcium-Independent Activation of an Allosteric Network in Langerin by Heparin Oligosaccharides. ChemBioChem, 2017).
El GlcNS-6-OS, que representa el monosacárido más potente identificado, mostró una relación estructura-actividad (SAR) aditiva para la sulfatación en C2 y C6. Este aumento de la afinidad se basa en la formación de puentes salinos con K299 y K313, como se demostró previamente mediante cristalografía de rayos X (Porkolab, V. et al. Rational-Differential Design of Highly Specific Glycomimetic Ligands: Targeting DC-Sign and Excluding Langerin Recognition. ACS Chem Biol (2018)). GlcNS-6-OS mostró una orientación alterada del andamio Glc en comparación con el complejo Langerina-GlcNAc (Figura 27 (B)(Feinberg, H. et al. Common Polymorphisms in Human Langerin Change Specificity for Glycan Ligands. J Biol Chem, 288, 36762-71 (2013)). Por otra parte, el aumento de afinidad observado sobre el Glc para el GlcNAc es el resultado de un enlace de hidrógeno mediado por H2O con K299. Es importante destacar que cualquiera de estas interacciones podría aprovecharse para el diseño de ligandos glicomiméticos mediante la sustitución bioisostérica de los grupos sulfato con un enlazador sulfonamida. En concreto, la síntesis de análogos de GlcNS representa un enfoque factible de cultivo de fragmentos para explorar el sitio de unión del carbohidrato en busca de interacciones favorables (véase laFigura 27 (A)). Estas características convierten a los derivados sulfatados de GlcNAc en andamiajes favorables para el diseño de ligandos glicomiméticos de Langerina.
Ejemplo 21
Pequeños sustituyentes aromáticos de sulfonamida convierten a los glicomiméticos en potentes ligandos diana para la Langerina y proporcionan especificidad contra DC-SIGN
Asumiendo la conservación de la orientación del andamiaje Glc observada para el GlcNAc, se planteó la hipótesis de que los pequeños sustituyentes aromáticos en C2 aumentarían la afinidad mediante la formación de interacciones catión-π con K299 y K313 o interacciones π-π y H-π con F315 y P310, respectivamente (véase laFigura 27 (B)). En consecuencia, se preparó un panel de análogos de GlcNS1a5con anillos de fenilo diferencialmente sustituidos y se procedió a la determinación de los valores de Ki(véase laFigura 39). Se observaron afinidades aumentadas sobre el GlcNAc para todos los análogos, con un aumento de afinidad de 13 veces para el2(Ki= 0,32±0,05 mM), el miembro más potente del panel (véansela Figura 29, laFigura 31y laFigura 39). El análogo lleva un grupo metilo en posición para del anillo fenilo que no contribuye sustancialmente al aumento de afinidad, como ejemplifica el valor de KIobtenido para1(KiI= 0,37±0,04 mM).
A pesar de su escasa complejidad, el2muestra una afinidad superior a la de los glicanos aplicados anteriormente como ligandos diana para subconjuntos de CD distintos de los LC (Fehres, C.M. et al. Cross-Presentation through Langerin and Dc-Sign Targeting Requires Different Formulations of Glycan-Modified Antigens. J Control Release, 203, 67-76 (2015)). Aquí se demostró que el antígeno del grupo sanguíneo Le<X>(KD,DC-SIGN= aprox. 1 mM) promueve la internalización dependiente de DC-SIGN de liposomas por CD dérmicas aisladas para activar células Tin vitro (Pederson, K., Mitchell, D.A. & Prestegard, J.H. Structural Characterization of the Dc-Sign-Lex Complex. Biochemistry,53, 5700-5709 (2014)). Alentados por estos informes el2avanzó hacia aplicaciones de administración dirigida mediante la introducción de un enlazador etilamino en la orientación β del C1 del andamio Glc para producir el ligando dirigido15(véase laFigura 27 (A)).
Tras la acetilación del grupo amino, se obtuvo el ligando modelo16(Figura 27 (A)). La determinación del valor Kipara16(Ki= 0,24±0,03 mM) reveló una afinidad 42 veces mayor que la molécula de referencia21basada en el hombre (Ki= 10±1 mM) (Figura 27 (A)y27 (C)yFigura 29). Para validar estas afinidades y ampliar el conocimiento del proceso de reconocimiento, se realizaron experimentos ortogonales de RMN HSQC observada por proteína<15>N (Figura 27 (D)y28 (A),Figura 29yFigura 32). En particular, una fracción considerable de las resonancias que mostraban perturbaciones del desplazamiento químico (CSP) al añadir16también mostraban un ensanchamiento de la línea Δν0,5de más de 10 Hz, indicativo de fenómenos de intercambio intermedio. En consecuencia, estas resonancias no se tuvieron en cuenta para la determinación de KD. Simultáneamente, se observaron fenómenos de intercambio lento para un conjunto de resonancias correspondientes a Y251, I253, N297 y K299 (Figura 27 (A)). El análisis de los picos de intercambio rápido y lento reveló afinidades comparables a los valores de Kiobtenidos para16(KD,rápido= 0,23±0,07 mM, KD,lento= 0,3±0,1 mM), así como para21(KD= 12±1 mM) (Figura 27 (D),Figura 29,Figura 32). Asimismo, la afinidad de2se validó mediante RMN<15>N HSQC (KD,rápida= 0,46±0,04 mM, KD,lenta= 0,5±0,2 mM) (Figura 29yFigura 33).
A continuación, se exploró la especificidad del ligando diana16(véase laFigura 27A)frente a DC-SIGN, ya que dicha afinidad fuera de diana implicaría una menor eficacia del enfoque y la posible inducción de efectos adversos. Para ello, se transfirió a DC-SIGN el ensayo de desplazamiento del reportero de RMN<19>F R2filtrado ().16(Ki,DC-SIGN= 15±3 mM) mostró un Kiconsiderablemente disminuido para DC-SIGN en comparación con la Langerina, lo que corresponde a una especificidad 63 veces mayor (Figura 27 (C)yFigura 29). Al mismo tiempo,21mostró una especificidad 3,7 veces mayor para DC-SIGN que para la Langerina (Ki,DC-SIGN= 2,7±0,3 mM). Una comparación con de las afinidades determinadas para2(Ki(I,DC-SIGN)= 17±1 mM) y Man (Ki,DC-SIGN= 3,0±0,3 mM) reveló que el reconocimiento diferencial de α- y β-glicósidos por estos CLR contribuye a la especificidad (Figura 29).
Ejemplo 22
Análisis del modo de unión derivado de los conocimientos de RMN y modelización molecular: La formación de interacciones π-π y enlaces de hidrógeno por los sustituyentes aromáticos de sulfonamida median un aumento de la afinidad por la Langerina
Para investigar el modo de unión del ligando modelo16(véase laFigura 27A), se combinaron experimentos de RMN<15>N HSQC y STD con estudios de acoplamiento molecular (Figura 28 (A) a 28 (E)). Aquí, la orientación del enlazador era de especial interés para evaluar la compatibilidad del modo de unión con la presentación del ligando diana15en liposomas.
La titulación de16(véase laFigura 27 (A)) indujo CSPs para E285 y K299 proporcionando más pruebas de un modo de unión canónico Ca<2+>-dependiente del andamio Glc del glicomimético (Figura 28 (B)y28 (C)). Estos experimentos de RMN observados en la proteína revelaron además fuertes CSP para los residuos próximos a F315 y N307. Notablemente, ambos residuos no pudieron asignarse, probablemente debido a su asociación con el bucle largo flexible (Hanske, J. et al. Intradomain Allosteric Network Modulates Calcium Affinity of the C-Type Lectin Receptor Langerin. J Am Chem Soc138, 12176-86 (2016). Este efecto va acompañado de una disminución de la CSP para K313 en comparación con las titulaciones con el análogo de Man21de laFigura 27 (A)(Figuras 32y34). Ambas observaciones se conservan en las valoraciones con2de laFigura 27 (A)e indican una orientación del anillo fenilo hacia F315 o K299 en lugar de K313 o P310 (Figuras 33y34). Curiosamente, se indujeron CSP adicionales para residuos alejados de la unión del carbohidrato, lo que sugiere la modulación de una red alostérica implicada en la regulación del reconocimiento del Ca<2+>por la Langerina.
Para complementar los experimentos de RMN observados en la proteína e investigar la orientación del enlazador etilamino acetilado, se realizó un mapeo de epítopos de RMN STD con16y21 (véase laFigura 27 (A)). El epítopo de unión de16estaba dominado por efectos STD uniformemente altos para el anillo fenilo y, por tanto, apoya un modelo en el que se forman interacciones secundarias favorables entre este sustituyente y la superficie de la Langerina (Figura 28 (D)yFigura 35). Por el contrario, el enlazador etilamino acetilado mostró efectos STD uniformemente bajos, lo que indica una orientación expuesta al disolvente y valida la estrategia de conjugación desarrollada para los análogos de GlcNS. De forma similar, el enlazador etilamino de21recibió efectos STD disminuidos en comparación con el andamio Man (Figuras 36y37).
Por último, se realizó un acoplamiento molecular utilizando la estructura de rayos X del complejo de Langerina con GlcNAc (véanse laFigura 28 (E)y laFigura 38) (Feinberg, H. et al. Common Polymorphisms in Human Langerin Change Specificity for Glycan Ligands. J Biol Chem,288, 36762-71 (2013)). Las poses de acoplamiento generadas se evaluaron en el contexto de los experimentos de RMN y se seleccionaron poses representativas para visualizar la formación de posibles interacciones secundarias. En efecto, la orientación del anillo fenilo hacia F315 dio lugar a la formación de interacciones π-π. Esta orientación también coincidió con la formación de un débil enlace de hidrógeno entre el enlazador sulfonamida y N307. Ambas interacciones explican los pronunciados valores de CSP observados para los residuos que se asocian con F315 y N307, incluidos I250, Y251, N297 y K299. Además, el anillo fenilo recibió elevados efectos ETS, lo que indica la formación de una interacción secundaria y una elevada proximidad a la superficie de la Langerina. Por el contrario, el enlazador etilamino acetilado mostró una elevada exposición al disolvente y ninguna interacción secundaria conservada para la mayoría de las poses de acoplamiento. Esta observación concordaba con los bajos efectos STD y validaba así la estrategia de conjugación desarrollada para los análogos de GlcNS. En general, se propone un modo de unión para16que muestra una orientación conservada del andamiaje de Glc, coherente tanto con los experimentos de ETS como con los de RMN HSQC<15>N. El aumento de afinidad puede racionalizarse mediante la formación de interacciones π-π entre el sustituyente fenilo y F315, así como un enlace de hidrógeno entre el enlazador sulfonamida y N297.
Ejemplo 23
Aplicación de un ensayo de lectina ligada a enzimas (ELLA) basado en placas lipídicas
Los análogos monosacáridos15o20(véase laFigura 27 (A)) se utilizaron para sintetizar los glicolípidos22y23, respectivamente (véase laFigura 27 (E)).Su afinidad por la Langerina se evaluó en un ensayo de lectina ligada a enzimas (ELLA) basado en placas. Mientras que se pudo demostrar una interacción dosis-dependiente para la22, no se detectó ninguna interacción para la inmovilización de la23. Esto valida el aumento de afinidad determinado del ligando modelo16(véase laFigura 27 (A)) sobre la molécula de referencia 21 basada en el hombre. A continuación se prepararon liposomas dirigidos marcados con Alexa Fluor (AF) 647 con un diámetro d de 160±60 nm que fueron estables durante varios meses cuando se almacenaron a 4°C en PBS. Se emplearon experimentos de RMN<1>H para sondear la accesibilidad del ligando diana15en la superficie de los liposomas. En ellos se observaron dos estados para las resonancias correspondientes a H1' y H2' del anillo fenilo. Ambos estados mostraron anchos de línea ν0,5inferiores a 30 Hz, lo que sugiere una flexibilidad residual debida a la presentación del ligando diana en un enlazador de polietilenglicol extendido. El estado alternativo corresponde potencialmente a ligandos diana orientados hacia el lumen de los liposomas. En resumen, es probable que15se presente favorablemente en la superficie de los liposomas para permitir interacciones con la Langerina, lo que valida aún más la estrategia de conjugación desarrollada.

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES 1. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo para la focalización molecular específica a células Langerina<+>, en el que el vehículo es capaz de unirse específicamente a una célula Langerina<+>, dicho vehículo comprende (a) al menos un portador y (b) al menos un conjugado de la fórmula general (I)
    donde (i) R es seleccionado independientemente del grupo formado por alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquilo C1-C8alquilo, arilo, arilo C1-C8alquilo, heteroarilo, heteroarilo C1-C8alquilo, biarilo y biarilo C1-C8alquilo sustituido o no sustituido, en el que los sustituyentes son seleccionados independientemente del grupo formado por -N(R<a>)(R<b>) , -OR<a>, -SR<a>, -C(O)R<a>, -C(O)OR<a>, -C(O)N(R<a>) (R<b>) , -N(R<a>) C(O)R<b>, -N(R<a>) S(O)2Rb ,-OS(O)2R<a>, halógeno, -NO2, -CN, -NC, -N3, -NCO, -OCN, -NCS, -SCN, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo y heteroarilo sustituido o no sustituido, donde R<a>y R<b>son seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, C1-8alquilo sustituido o no sustituido, C2-8alquenilo, C2-8alquinilo, C3-6cicloalquilo, aril-C1-5alquilo, heteroarilo-C1-5alquilo, arilo, heteroarilo; (ii) R' es seleccionado independientemente del grupo formado por -OR<a>, y -NHS(O)2R<a>, donde R<a>se define como anteriormente; (iii) A-D-B-L es un grupo enlazador que une covalentemente el derivado de glucosa de fórmula (I) al portador o a una parte del mismo, en el que dicho grupo enlazador A-D-B-L es un grupo formado por un espaciador A-D-B y un enlazador L que conecta el derivado de glucosa con el portador y en el que dicho enlazador L es un enlazador de la siguiente fórmula general (L-1)
    donde U<1>es un grupo conectado a través de B con el espaciador D, en el que U<1>se selecciona del grupo formado por, -CH2 -, -CH=CH-, o -C≡C-; Z<1>es una fracción que une el enlazador al portador seleccionada del grupo formado por -O-, -S-, -N(R<d>) -, -C(R<d>) (R<e>) -, -R<d>C= CR<e>-, -C(O)-, -C(O)O-,-OC(O)-, -C(O)S-, -C(O)N(R<d>)-, -N(R<d>)C(O)-, -N(R<d>) C(O)N(R<e>) -, -N(R<d>) C(S)N(R<e>) -, -N(R<d>) C(O)O-, -OC(O)N(R<d>) -, -ciclohexeno-, -triazoles-, -NHS(O)2 -, -S(O)2 -, -OP(O)(H)O-, u -OP(O)(OH)O-; donde R<d>y R<e>se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, C1-32alquilo sustituido o no sustituido, C2-32alquenilo, C3-8cicloalquilo, arilo, C1-C8alquilo arilo, heteroarilo, C1-C8alquilo heteroarilo; y d1 a d5 es cada uno un número entero de 0 a 50, d6 un número entero de 1 a 50 en el que el portador comprende o está asociado a una carga farmacéuticamente activa y opcionalmente a una sustancia portadora farmacéuticamente aceptable o a un adyuvante farmacéutico.
  2. 2. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que R es un fenilo sustituido o no sustituido.
  3. 3. La composición farmacéutica según la reivindicación 2, en la que el fenilo está mono-, di- o trisustituido y los sustituyentes del fenilo se seleccionan independientemente del grupo que consiste en - NH2, -OH, -OCH3, -C(O)CH3, C(O)NH2, -C(O)NHCH3, -CH2OH -NHC(O)CH3, -F, -Cl, -Br, -NO2, -CN, C1-C4alquilo, naftilo y fenilo.
  4. 4. La composición farmacéutica según la reivindicación 3, en la que dicho conjugado es un conjugado de la siguiente fórmula (I-1) a (I-15):
  5. 5. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho al menos un portador es una partícula blanda seleccionada del grupo que consiste en un liposoma, un niosoma, una micela, un sequessome<TM>y un transferosoma y en la que el conjugado está unido directamente mediante Z<1>a una parte de la partícula blanda, en la que dicha parte de la partícula blanda es un lípido, un lípido modificado como un fosfolípido, 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DSPE), un lípido de membrana o una fosfatidilcolina modificada.
  6. 6. La composición farmacéutica según la reivindicación 5, en la que el conjugado está unido a una parte de un portador de partículas blandas que da lugar a la siguiente estructura (II):
    donde n es un número entero comprendido entre 0 y 150.
  7. 7. La composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha carga está situada dentro del portador y/o está unida al exterior del portador y/o está integrada en una estructura monocapa o bicapa del portador.
  8. 8. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 comprende además un aditivo, para un suministro de carga dirigido a una célula Langerina<+>.
  9. 9. Un método in vitro para el suministro dirigido de carga a una célula Langerina<+>, que comprende poner en contacto el vehículo para el direccionamiento molecular específico de células Langerina<+>como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o la composición farmacéutica como se define en la reivindicación 8 con una célula dendrítica Langerina<+>.
  10. 10. La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o el método según la reivindicación 9, en el que dicha carga se selecciona del grupo que consiste en una molécula pequeña, un péptido, una proteína, una sustancia citotóxica, un ácido nucleico, un pigmento, un colorante, un metal, un radionúclido, un virus, un virus modificado, un vector viral, un inoculante, un plásmido y/o un sistema multicomponente, tal como un sistema para la edición genómica que comprende diferentes componentes, preferentemente un sistema CRISPR/Cas; o bien es un compuesto farmacéuticamente activo o un compuesto inmunológicamente activo, preferentemente un inhibidor de la función celular, como un inhibidor de la apoptosis; o en el que dicha carga comprende, consiste esencialmente o consiste en (i) un antígeno o epítopo del cáncer o comprende un antígeno o epítopo del cáncer, (ii) un antígeno o epítopo de una enfermedad autoinmune o comprende un antígeno o epítopo de una enfermedad autoinmune (iii) un antígeno bacteriano o comprende un antígeno o epítopo bacteriano, (iv) un antígeno vírico o comprende un antígeno o epítopo vírico, (v) un antígeno parasitario o comprende un antígeno o epítopo parasitario, o (vi) un alérgeno, o un epítopo de un alérgeno, o comprende un alérgeno o un epítopo de un alérgeno.
  11. 11. La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o 10, para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer, de una enfermedad autoinmune, de una infección bacteriana, de una infección vírica, de una infección parasitaria o de una enfermedad de injerto contra huésped, de una inflamación local o sistémica, de la alergia, o para la hiposensibilización.
  12. 12. Una composición de diagnóstico que comprende el vehículo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o 10, que comprende preferentemente además un aditivo, en el que el portador comprende o está asociado a una carga farmacéuticamente activa y opcionalmente una sustancia portadora farmacéuticamente aceptable o un adyuvante farmacéutico.
  13. 13. Un método para identificar una dosis adecuada para una terapia dirigida a células dendríticas Langerina<+>de una enfermedad que comprende: (a) poner en contacto una población de células de Langerina<+>con un compuesto capaz de introducirse en las células, en el que dicho compuesto es una carga como se define en la reivindicación 10, preferentemente un colorante o pigmento, y en el que dicho compuesto se administra a dichas células con un vehículo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o 10; (b) determinar el número de células que incorporaron dicho compuesto; (c) determinar una dosis adecuada del compuesto comparando el número de células con compuesto incorporado y la población de partida, preferiblemente después de un periodo de 1-3 días, opcionalmente correlacionando adicionalmente el número de células con compuesto incorporado o su estado con los resultados observados en la literatura.
  14. 14. Un kit médico que comprende al menos un elemento seleccionado entre el vehículo definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o 10 y/o la composición definida en la reivindicación 8 o 10, en el que el portador comprende o está asociado a una carga farmacéuticamente activa y opcionalmente un prospecto con instrucciones.
  15. 15. Una vacuna que comprende el vehículo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o 10, o la composición como se define en la reivindicación 8 o 10, en la que el portador comprende o está asociado a una carga inoculante.
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