ES3036522T3

ES3036522T3 - Single chain variable fragment cd3 binding proteins

Info

Publication number: ES3036522T3
Application number: ES17800304T
Authority: ES
Inventors: Robert B Dubridge; Pui Seto; Richard J Austin; Luke Evnin; Jeanmarie Guenot; Bryan D Lemon
Original assignee: Harpoon Therapeutics Inc
Current assignee: Harpoon Therapeutics Inc
Priority date: 2016-05-20
Filing date: 2017-05-19
Publication date: 2025-09-19
Anticipated expiration: 2037-05-19
Also published as: BR112018073761A2; EP3461261A1; JP2022064939A; CN109641046A; WO2017201493A1; US20170334997A1; DK3461261T3; SG11201810331YA; AU2017267793B2; EP3461261A4; EA201892693A1; MX2018014227A; CN116987189A; US10066016B2; SI3461261T1; AU2024202642A1; HRP20251020T1; MX2024004646A; CA3024683A1; PL3461261T3

Abstract

Se describen aquí proteínas de unión a CD3 de fragmento variable monocatenario con afinidades de unión mejoradas y perfiles de agregación robustos. También se describen proteínas de unión multiespecíficas que comprenden una proteína de unión a CD3 de fragmento variable monocatenario según la presente divulgación. Se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas de unión descritas aquí y métodos para usar dichas formulaciones. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla

Antecedentes de la invención

CD3 es un antígeno homodimérico o heterodimérico expresado en linfocitos T en asociación con el complejo de receptor de linfocitos T (TCR) y se requiere para la activación de linfocitos T. Los anticuerpos anti-CD3 tienen fines terapéuticos que implican la activación de linfocitos T. La presente divulgación proporciona proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla, incluyendo anticuerpos multiespecíficos que contienen las mismas. El documento WO2010/037837 describe anticuerpos biespecíficos de cadena sencilla con un dominio de unión para

CD3.

Sumario de la invención

La invención se define por las reivindicaciones adjuntas. Específicamente, la invención se refiere a proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla que comprenden la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID

NO:<8>o SEQ ID NO: 9, a polinucleótidos que codifican dichas proteínas, a vectores que comprenden dichos polinucleótidos, a células hospedadoras transformadas con dichos vectores. Otras proteínas, polinucleótidos, vectores o células hospedadoras divulgadas en el presente documento, incluyendo aquellos de acuerdo con SEQ ID NO: 1 a 7 y 10 a 105, no son de acuerdo con las reivindicaciones, pero son útiles para comprender la invención reivindicada.

Las referencias a los métodos de tratamiento en los párrafos siguientes de la presente descripción deben interpretarse como referencias a las sustancias, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

En una realización se divulga una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla, que comprende una región de cadena pesada variable (VH), una región de cadena ligera variable (VL) y un enlazador, en donde VH comprende regiones determinantes de complementariedad CDR1 de HC, CDR2 de HC y CDR3 de HC, en donde VL comprende regiones determinantes de complementariedad CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC, en donde (a) la secuencia de aminoácidos de CDR1 de HC es como se expone en GX<1>X<2>X<3>NX<4>YX<5>X<6>N (SEQ ID NO. 2), X<1>es fenilalanina o asparagina, X<2>es treonina, ácido glutámico o metionina, X<3>es fenilalanina o tirosina, X<4>es lisina, treonina, glicina, asparagina o ácido glutámico, X<5>es alanina o prolina, X<6>es metionina, leucina, valina o isoleucina;

(b) la secuencia de aminoácidos de CDR2 de HC es como se expone en RIRSX<7>X<8>NX<9>YX<10>TX<11>YX<12>DX<13>VK (SEQ ID

NO. 3), X<7>es lisina o glicina, X<8>es tirosina o serina, X<9>es asparagina o lisina, X<10>es alanina o ácido glutámico, X<11>es tirosina o ácido glutámico, X<12>es alanina o lisina, X<13>es serina, ácido glutámico, ácido aspártico, alanina o glutamina;

(c) la secuencia de aminoácidos de CDR3 de HC es como se expone en HX<14>NFX<15>X<16>SX<17>ISYWAX<18>(SEQ ID NO.

4), X<14>es glicina, alanina o treonina, X<15>es glicina o asparagina, X<16>es asparagina o ácido aspártico, X<17>es tirosina, histidina, prolina, glutamina, leucina o glicina, X<18>es tirosina o treonina; (d) la secuencia de aminoácidos de CDR1 de

LC es como se expone en X<19>X<20>X<21>X<22>GX<23>VX<24>X<25>GX<26>YPN (SEQ ID NO. 5), X<19>es glicina o alanina, X<20>es serina o ácido glutámico, X<21>es serina o tirosina, X<22>es treonina, fenilalanina, lisina o serina, X<23>es alanina o tirosina, X<24>es treonina o valina, X<25>es serina, ácido aspártico, lisina, histidina o valina, X<26>asparagina o tirosina; (e) la secuencia de aminoácidos de CDR2 de LC es como se expone en GX<27>X<28>X<29>X<30>X<31>P (SEQ ID NO.<6>), X<27>es treonina o isoleucina,

X<28>es lisina, ácido glutámico, tirosina, asparagina o serina, X<29>es fenilalanina, leucina, ácido glutámico, isoleucina, metionina o valina, X<30>es leucina, asparagina o glicina, X<31>es alanina o valina; y (f) la secuencia de aminoácidos de

CDR3 de LC es como se expone en X<32>LWYX<33>NX<34>WX<35>(SEQ ID NO. 7), X<32>es valina, treonina o alanina, X<33>es serina, ácido aspártico o alanina, X<34>es arginina o serina, X<35>es valina, isoleucina o alanina, en donde X<1>, X<2>, X<3>, X<4>,

X<5>, X<6>, X<7>, X<8>, X<9>, X<10>, X<11>, X<12>, X<13>, X<14>, X<15>, X<16>, X<17>, X<18>, X<19>, X<20>, X<21>, X<22>, X<23>, X<32>, X<33>, X<34>y X<35>no son simultáneamente fenilalanina, treonina, fenilalanina, lisina, alanina, metionina, lisina, tirosina, asparagina, alanina, tirosina, alanina, serina, glicina, glicina, asparagina, tirosina, tirosina, glicina, serina, serina, treonina, alanina, treonina, serina, asparagina, treonina, lisina, fenilalanina, leucina, alanina, valina, serina, arginina y valina respectivamente.

En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende la siguiente fórmula: f1-r1-f2-r2-f3-r3-f4-r4-f5-r5-f6-r6-f7, en donde, r1 es SEQ ID NO: 2; r2 es SEQ ID NO: 3; r3 es SEQ ID NO: 4;

r4 es SEQ ID NO:5; r5 es SEQ ID NO:6; y r6 es SEQ ID NO:7; y en donde fi, f<2>, f<3>, f<4>y f<5>son residuos de estructura seleccionados de modo que dicha proteína sea al menos un ochenta por ciento idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 22.

En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia de aminoácidos en donde r1 comprende SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 32,

SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 36, SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO.38, SEQ ID NO. 39 o

SEQ ID NO. 40. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia de aminoácidos en donde r2 comprende SEQ ID NO. 41, SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 43,

SEQ ID NO. 44, SEQ ID NO. 45, SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 47, SEQ ID NO. 48, SEQ ID NO. 49 o SEQ ID NO. 50.

En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia de aminoácidos en donde r3 comprende SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO. 53, SEQ ID NO. 54, SEQ ID NO. 55, SEQ ID NO. 56, SEQ ID NO. 57, SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 50 o SEQ ID NO. 60. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia de aminoácidos en donde r4 comprende SEQ ID NO. 61, SEQ ID NO. 62, SEQ ID NO. 63, SEQ ID NO. 64, SEQ ID NO.

65, SEQ ID NO. 66, SEQ ID NO. 67, SEQ ID NO. 68, SEQ ID NO. 69, SEQ ID NO. 70, SEQ ID NO. 71, SEQ ID NO: 72 o SEQ ID NO: 73. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia de aminoácidos en donde r5 comprende SEQ ID NO. 74, SEQ ID NO. 75, SEQ ID NO. 76, SEQ ID NO. 77, SEQ ID NO. 78, SEQ ID NO. 79, SEQ ID NO. 80, SEQ ID NO. 81, SEQ ID NO. 82, SEQ ID NO. 83, SEQ ID NO. 84, SEQ ID NO. 85 o SEQ ID NO. 86. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia de aminoácidos en donde r6 comprende SEQ ID NO. 87, SEQ ID NO. 88, SEQ ID NO. 89, SEQ ID NO. 90, SEQ ID NO. 91, SEQ ID NO. 92 o SEQ ID NO. 93. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia de aminoácidos en donde r1 es SEQ ID NO. 39, r2 es SEQ ID NO. 49, r3 es SEQ ID NO. 51, r4 es SEQ ID NO. 61, r5 es SEQ ID NO. 86, y r6 es SEQ ID NO. 87. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia de aminoácidos en donde r1 es SEQ ID NO. 30, r2 es SEQ ID NO. 43, r4 es SEQ ID NO. 64, y r6 es SEQ ID NO. 89. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia de aminoácidos en donde r3 es SEQ ID NO. 55, r4 es SEQ ID NO. 67, r5 es SEQ ID NO. 77, y r6 es SEQ ID NO. 92. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia de aminoácidos en donde r1 es SEQ ID NO. 31, r2 es SEQ ID NO. 42, r3 es SEQ ID NO. 60, r4 es SEQ ID NO. 64, r5 es SEQ ID NO. 79, y r6 es SEQ ID NO. 91. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia de aminoácidos en donde r1 es SEQ ID NO. 35, r2 es SEQ ID NO. 46, r3 es SEQ ID NO. 56, r4 es SEQ ID NO. 68, y r5 es SEQ ID NO. 75. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia de aminoácidos en donde r1 es SEQ ID NO. 32, r2 es SEQ ID NO. 47, r3 es SEQ ID NO.

56, r4 es SEQ ID NO. 65, r5 es SEQ ID NO. 80, y r6 es SEQ ID NO. 87. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia de aminoácidos en donde r1 es SEQ ID NO. 29, r2 es SEQ ID NO. 44, r3 es SEQ ID NO. 52, r4 es SEQ ID NO. 73, y r5 es SEQ ID NO. 76. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia de aminoácidos en donde r1 es SEQ ID NO. 33, r2 es SEQ ID NO. 48, r3 es SEQ ID NO. 57, r4 es SEQ ID NO. 69, y r5 es SEQ ID NO. 74. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia de aminoácidos en donde r1 es SEQ ID NO. 38, r4 es SEQ ID NO. 62, y r5 es SEQ ID NO.

81. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia de aminoácidos en donde r1 es SEQ ID NO. 37, r3 es SEQ ID NO. 53, r4 es SEQ ID NO. 70, r5 es SEQ ID NO. 82, y r6 es SEQ ID NO. 88. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia de aminoácidos en donde r1 es SEQ ID NO. 34, r2 es SEQ ID NO. 47, r3 es SEQ ID NO. 56, r4 es SEQ ID NO. 68 y r5 es SEQ ID NO. 75. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia de aminoácidos en donde r1 es SEQ ID NO. 29, r3 es SEQ ID NO. 54, r4 es SEQ ID NO. 71 y r5 es SEQ ID NO. 83. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia de aminoácidos en donde r1 es SEQ ID NO. 33, r2 es SEQ ID NO. 41, r4 es SEQ ID NO. 63, r5 es SEQ ID NO. 84 y r6 es SEQ ID NO. 90. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia de aminoácidos en donde r1 es SEQ ID NO. 30, r2 es SEQ ID NO. 44, r3 es SEQ ID NO. 58, r4 es SEQ ID NO. 66 y r5 es SEQ ID NO.

85. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia de aminoácidos en donde r1 es SEQ ID NO. 40, r2 es SEQ ID NO. 45, r3 es SEQ ID NO. 56, r5 es SEQ ID NO. 78 y r6 es SEQ ID NO. 93. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia de aminoácidos en donde r1 es SEQ ID NO. 36, r2 es SEQ ID NO. 50, r3 es SEQ ID NO. 59, r4 es SEQ ID NO. 72 y r5 es SEQ ID NO. 75.

En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla CD3 tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 94 y SEQ ID NO. 95. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 8. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 9. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 14. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO.

19. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 94. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 10. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 11. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 12. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO.

13. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 15. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 16. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 17. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 18. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO.

20. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 21. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 25. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia de aminoácidos que comprende un enlazador, en donde dicho enlazador comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 1). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla se une a CD3 seleccionado de CD3 humano y CD3 de macaco cangrejero. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla se une a CD3 humano y a CD3 de macaco cangrejero con afinidad de unión comparable (Kd). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla se une a CD3 humano con una Kd humana (hKd) entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 200 nM y a CD3 de macaco cangrejero con una Kd de macaco cangrejero (cKd) entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 300 nM. En algunas realizaciones, la hKd y la cKd están entre aproximadamente 3 nM y aproximadamente 5 nM, de aproximadamente 6 nM a aproximadamente 10 nM, de aproximadamente 11 nM a aproximadamente 20 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente 40 nM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 70 nM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 125 nM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 145 nM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 170 nM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 210 nM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 260 nM a aproximadamente 300 nM.

En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla se une a CD3 humano con una Kd humana (hKd), se une a CD3 de macaco cangrejero con una Kd de macaco cangrejero (cKd), y la hKd y la cKd son aproximadamente las mismas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla se une a CD3 humano con una Kd humana (hKd), se une a CD3 de macaco cangrejero con una Kd de macaco cangrejero (cKd), y la hKd y la cKd son entre aproximadamente 1,5 veces y aproximadamente 2 veces más altas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla se une a CD3 humano con una Kd humana (hKd), se une a CD3 de macaco cangrejero con una Kd de macaco cangrejero (cKd), y la hKd y la cKd son entre aproximadamente 3 veces y aproximadamente 5 veces más altas que la afinidad de unión hacia c D3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO.22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla se une a CD3 humano con una Kd humana (hKd), se une a CD3 de macaco cangrejero con una Kd de macaco cangrejero (cKd), y la hKd y la cKd son entre aproximadamente 6 veces y aproximadamente 15 veces más altas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO.22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla se une a CD3 humano con una Kd humana (hKd), se une a CD3 de macaco cangrejero con una Kd de macaco cangrejero (cKd), y la hKd y la cKd son entre aproximadamente 20 veces y aproximadamente 50 veces más altas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO.22).

En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 8, y la hKd y cKd son aproximadamente las mismas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 8, y la hKd y la cKd están entre aproximadamente 3 nM y aproximadamente 5 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 9, y la hKd y la cKd son aproximadamente las mismas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 9, y la hKd y la cKd están entre aproximadamente 3 nM y aproximadamente 5 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 10, y la hKd y cKd son aproximadamente las mismas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 10, y la hKd y la cKd están entre aproximadamente 3 nM y aproximadamente 5 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 11, y en donde la hKd y cKd son aproximadamente las mismas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO.

22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 11, y la hKd y la cKd están entre aproximadamente 3 nM y aproximadamente 5 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 12, y hKd y cKd son entre aproximadamente 1,5 veces y aproximadamente 2 veces más altas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 12, y la hKd y la cKd están entre aproximadamente 6 nM y aproximadamente 10 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 13, y la hKd y la cKd son entre aproximadamente 1,5 veces y aproximadamente 2 veces más altas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 13, y la hKd y la cKd están entre aproximadamente 6 nM y aproximadamente 10 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 14, y la hKd y la cKd son de aproximadamente 3 veces a aproximadamente 5 veces más altas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 14, y la hKd y la cKd están entre aproximadamente 11 nM y 20 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 15, y la hKd y cKd son de aproximadamente 6 veces a aproximadamente 15 veces más altas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO.

15, y la hKd y la cKd están entre aproximadamente 25 nM y aproximadamente 40 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 16, y la hKd y la cKd son de aproximadamente 3 veces a aproximadamente 5 veces más altas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO.

22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 16, y la hKd y la cKd están entre aproximadamente 11 nM y aproximadamente 20 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 17, y la hKd y cKd son de aproximadamente 6 veces a aproximadamente 15 veces más altas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 17, y la hKd y la cKd están entre aproximadamente 40 nM y aproximadamente 60 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO.

18, y la hKd y cKd son de aproximadamente 3 veces a aproximadamente 5 veces más altas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 18, y la hKd y la cKd están entre aproximadamente 11 nM y 20 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 19, y la hKd y cKd son de aproximadamente 6 veces a aproximadamente 15 veces más altas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 19, y la hKd y la cKd están entre aproximadamente 40 nM y 60 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 20, y la hKd y la cKd son de aproximadamente 3 veces a aproximadamente 5 veces más altas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 20, y la hKd y la cKd están entre aproximadamente 11 nM y aproximadamente 20 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 21, y la hKd y la cKd son de aproximadamente 20 veces a aproximadamente 50 veces más altas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID No .22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 21, y la hKd y la cKd están entre aproximadamente 125 nM y aproximadamente 140 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 94, y en donde la hKd y la cKd son de aproximadamente 20 veces a aproximadamente 50 veces más altas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 94, y la hKd y la cKd están entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 120 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 95, y la hKd y la cKd son de aproximadamente 20 veces a aproximadamente 50 veces más altas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 95, y la hKd y la cKd están entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 120 nM.

En el presente documento, en otra realización, se proporciona una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla que comprende la secuencia expuesta como SEQ ID NO. 22 (anti-CD3 de tn) en donde uno o más residuos de aminoácidos seleccionados de las posiciones de aminoácidos 27, 28, 29, 31, 33, 34, 54, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 102, 105, 106, 108, 114, 163, 164, 165, 166, 168, 170, 171, 173, 193, 194, 195, 196, 197, 231, 235, 237 y 239 están sustituidos, en donde la posición de aminoácido 27 se sustituye por asparagina, la posición de aminoácido 28 está sustituida por ácido glutámico o metionina, la posición de aminoácido 29 está sustituida por tirosina, la posición de aminoácido 31 está sustituida por asparagina, glicina, ácido glutámico o treonina, la posición de aminoácido 33 está sustituida por prolina, la posición de aminoácido 34 está sustituida por valina, leucina o isoleucina, la posición de aminoácido 54 está sustituida por glicina, la posición de aminoácido 55 está sustituida por serina, la posición de aminoácido 57 está sustituida por lisina, la posición de aminoácido 59 está sustituida por ácido glutámico, la posición de aminoácido 61 está sustituida por ácido glutámico, la posición de aminoácido 63 está sustituida por lisina, la posición de aminoácido 65 está sustituida por ácido aspártico, ácido glutámico, alanina o glutamina, la posición de aminoácido 102 está sustituida por alanina o treonina, la posición de aminoácido 105 está sustituida por asparagina, la posición de aminoácido 106 está sustituida por ácido aspártico, la posición de aminoácido 108 está sustituida por histidina, prolina, glutamina, glicina o leucina, la posición de aminoácido 114 está sustituida por treonina, la posición de aminoácido 163 está sustituida por alanina, la posición de aminoácido 164 está sustituida por ácido glutámico, la posición de aminoácido 165 está sustituida por tirosina, la posición de aminoácido 166 está sustituida por fenilalanina, lisina o serina, la posición de aminoácido 168 está sustituida por tirosina, la posición de aminoácido 170 está sustituida por valina, la posición de aminoácido 171 está sustituida por ácido aspártico, lisina, valina o histidina, la posición de aminoácido 173 está sustituida por tirosina, la posición de aminoácido 193 está sustituida por isoleucina, la posición de aminoácido 194 está sustituida por ácido glutámico, tirosina, asparagina o serina, la posición de aminoácido 195 está sustituida por leucina, ácido glutámico, isoleucina, metionina o valina, la posición de aminoácido 196 está sustituida por asparagina o glicina, la posición de aminoácido 197 está sustituida por valina, la posición de aminoácido 231 está sustituida por treonina o alanina, la posición de aminoácido 235 está sustituida por ácido aspártico o alanina, la posición de aminoácido 237 está sustituida por serina y la posición de aminoácido 239 está sustituida por alanina o isoleucina. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una o más sustituciones adicionales en posiciones de aminoácidos distintas de las posiciones 27, 28, 29, 31, 33, 34, 54, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 102, 105, 106, 108, 114, 163, 164, 165, 166, 168, 170, 171, 173, 193, 194, 195, 196, 197, 231, 235, 237 y 239. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 27. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 28. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 29. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 31. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 33. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 34. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 54. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 55. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 57. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 59. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 61. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 63. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 65. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 102. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 105. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 106. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 108. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 114. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 163. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 164. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 165. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 166. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 168. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 170. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 171. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 173. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 193. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 194. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 195. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 196. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 197. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 231. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 235. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 237. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una sustitución en la posición 239. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende sustituciones en las posiciones 34, 65, 102, 163, 197 y 231. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende sustituciones en las posiciones 28, 57, 166 y 235. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende sustituciones en las posiciones 108, 168, 194 y 239. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende sustituciones en las posiciones 28, 55, 114, 166, 195 y 237. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende sustituciones en las posiciones 31, 63, 108, 170 y 194. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende sustituciones en las posiciones 29, 65, 108, 166, 195 y 231. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende sustituciones en las posiciones 27, 59, 102, 173 y 194. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende sustituciones en las posiciones 31, 65, 108, 171 y 193. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende sustituciones en las posiciones 34, 164 y 195. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende sustituciones en las posiciones 33, 105, 171, 195 y 231. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende sustituciones en las posiciones 31,65, 108, 170 y 194. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende sustituciones en las posiciones 27, 106, 171 y 195. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende sustituciones en las posiciones 31, 54, 165, 196 y 235. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende sustituciones en las posiciones 28, 59, 108, 166 y 196. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende sustituciones en las posiciones 34, 61, 108, 194 y 239. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende sustituciones en las posiciones 31,65, 108, 171 y 194.

En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde las posiciones de aminoácidos 34, 65, 102, 163, 197 y 231 están sustituidas, y en donde la hKd y la cKd son aproximadamente las mismas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde las posiciones de aminoácidos 34, 65, 102, 163, 197 y 231 están sustituidas, y en donde la hKd y la cKd están entre aproximadamente 3 nM y aproximadamente 5 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde las posiciones de aminoácidos 28, 57, 166 y 235 están sustituidas, y en donde la hKd y la cKd son aproximadamente las mismas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde las posiciones de aminoácidos 28, 57, 166 y 235 están sustituidas, y en donde la hKd y la cKd están entre aproximadamente 3 nM y aproximadamente 5 nM.

En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde las posiciones de aminoácidos 108, 168, 194 y 239 están sustituidas, y en donde la hKd y la cKd son aproximadamente las mismas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde las posiciones de aminoácidos 108, 168, 194 y 239 están sustituidas, y en donde la hKd y la cKd están entre aproximadamente 3 nM y aproximadamente 5 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde las posiciones de aminoácidos 28, 55, 114, 166, 195 y 237 están sustituidas, y en donde la hKd y la cKd son aproximadamente las mismas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde las posiciones de aminoácidos 28, 55, 114, 166, 195 y 237 están sustituidas, y en donde la hKd y la cKd están entre aproximadamente 3 nM y aproximadamente 5 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde las posiciones de aminoácidos 31, 63, 108, 170 y 194 están sustituidas, y en donde la hKd y la cKd son entre aproximadamente 1,5 veces y aproximadamente 2 veces más altas que la unión afinidad hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde las posiciones de aminoácidos 31, 63, 108, 170 y 194 están sustituidas, y en donde la hKd y la cKd están entre aproximadamente 6 nM y aproximadamente 10 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde las posiciones de aminoácidos 29, 65, 108, 166, 195 y 231 están sustituidas, y en donde la hKd y la cKd son entre aproximadamente 1,5 veces y aproximadamente 2 veces más altas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde las posiciones de aminoácidos 29, 65, 108, 166, 195 y 231 están sustituidas, y en donde la hKd y la cKd están entre aproximadamente 6 nM y aproximadamente 10 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde las posiciones de aminoácidos 27, 59, 102, 173 y 194 están sustituidas, y en donde la hKd y la cKd son de aproximadamente 3 veces a aproximadamente 5 veces más altas que la unión afinidad hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde las posiciones de aminoácidos 27, 59, 102, 173 y 194 están sustituidas, y en donde la hKd y la cKd están entre aproximadamente 11 nM y 20 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde las posiciones de aminoácidos 31, 65, 108, 171 y 193 están sustituidas, y en donde la hKd y la cKd son de aproximadamente 6 veces a aproximadamente 15 veces más altas que la unión afinidad hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde las posiciones de aminoácidos 31,65, 108, 171 y 193 están sustituidas, y en donde la hKd y la cKd están entre aproximadamente 25 nM y aproximadamente 40 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde las posiciones de aminoácidos 34, 164 y 195 están sustituidas, y en donde la hKd y la cKd son de aproximadamente 3 veces a aproximadamente 5 veces más altas que la unión afinidad hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID No .22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde las posiciones de aminoácidos 34, 164 y 195 están sustituidas, y en donde la hKd y la cKd están entre aproximadamente 11 nM y 20 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde las posiciones de aminoácidos 33, 105, 171, 195 y 231 están sustituidas, y en donde la hKd y la cKd son de aproximadamente 6 veces a aproximadamente 15 veces más altas que la unión afinidad hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO.

22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde las posiciones de aminoácidos 33, 105, 171, 195 y 231 están sustituidas, y en donde la hKd y la cKd están entre aproximadamente 40 nM y aproximadamente 60 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde las posiciones de aminoácidos 31, 65, 108, 170 y 194 están sustituidas, y en donde la hKd y la cKd son de aproximadamente 3 veces a aproximadamente 5 veces más altas que la unión afinidad hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde las posiciones de aminoácidos 31, 65, 108, 170 y 194 están sustituidas, y en donde la hKd y la cKd están entre aproximadamente 11 nM y 20 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde las posiciones de aminoácidos 27, 106, 171 y 195 están sustituidas, y en donde la hKd y la cKd son de aproximadamente 6 veces a aproximadamente 15 veces más altas que la unión afinidad hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde las posiciones de aminoácidos 27, 106, 171 y 195 están sustituidas, y en donde la hKd y la cKd están entre aproximadamente 40 nM y 60 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde las posiciones de aminoácidos 31, 54, 165, 196 y 235 están sustituidas, y en donde la hKd y la cKd son de aproximadamente 3 veces a aproximadamente 5 veces más altas que la unión afinidad hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID No .22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde las posiciones de aminoácidos 31, 54, 165, 196 y 235 están sustituidas (10B2), y en donde la hKd y la cKd están entre aproximadamente 11 nM y aproximadamente 20 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde las posiciones de aminoácidos 28, 59, 108, 166 y 196 están sustituidas, y en donde la hKd y la cKd son de aproximadamente 25 veces a aproximadamente 50 veces más altas que la unión afinidad hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID No .22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde las posiciones de aminoácidos 28, 59, 108, 166 y 196 están sustituidas, y en donde la hKd y la cKd están entre aproximadamente 125 nM y aproximadamente 140 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde las posiciones de aminoácidos 34, 61, 108, 194 y 239 están sustituidas, y en donde la hKd y la cKd son de aproximadamente 20 veces a aproximadamente 50 veces más altas que la unión afinidad hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde las posiciones de aminoácidos 34, 61, 108, 194 y 239 están sustituidas, y en donde la hKd y la cKd están entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 120 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde las posiciones de aminoácidos 31, 65, 108, 171 y 194 están sustituidas, y en donde la hKd y la cKd son de aproximadamente 20 veces a aproximadamente 50 veces más altas que la unión afinidad hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde las posiciones de aminoácidos 31,65, 108, 171 y 194 están sustituidas, y en donde la hKd y la cKd están entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 120 nM.

En el presente documento, en una realización adicional, se proporciona una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO: 22), que comprende una región de cadena pesada variable (VH), un región de cadena ligera variable (VL), un enlazador que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 1), en donde VH comprende regiones determinantes de complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3, en donde VL comprende regiones determinantes de complementariedad CDR1 de LC, CDR2 de LC y CDR3 de LC, que comprenden al menos una mutación en CDR1, CDR2 o CDR3 de VH, y CDR1 de LC, CDR2 de LC o CDR3 de LC de VL, en donde la al menos una mutación no está en las posiciones de aminoácidos 26, 30, 32, 35, 50, 51, 52, 53, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 67, 101, 103, 104, 107, 109, 110, 111, 112, 113, 167, 169, 172, 174, 175, 176, 192, 198, 232, 233, 234, 236 o 238. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende al menos una mutación en la posición de aminoácido seleccionada de 27, 28, 29, 31, 33, 34, 54,55,57,59,61, 63, 65, 102, 105, 106, 108, 114, 163,164,165,166,168,170,171, 173, 193, 194, 195, 196, 197, 231, 235, 237 y 239. En algunas realizaciones, la posición de aminoácido 34 está mutada a isoleucina, la posición 65 está mutada a glutamina, la posición 102 está mutada a alanina, la posición 163 está mutada a alanina, la posición 197 está mutada a valina y la posición 231 está mutada a treonina. En algunas realizaciones, la posición de aminoácido 28 está mutada a ácido glutámico, la posición 57 está mutada a lisina, la posición 166 está mutada a fenilalanina y la posición 235 está mutada a ácido aspártico. En algunas realizaciones, la posición de aminoácido 108 está mutada a histidina, la posición 168 está mutada a tirosina, la posición 194 está mutada a serina y la posición 239 está mutada a isoleucina. En algunas realizaciones, la posición de aminoácido 28 está mutada a metionina, la posición 55 está mutada a serina, la posición 114 está mutada a treonina, la posición 166 está mutada a fenilalanina, la posición 195 está mutada a leucina y la posición 237 está mutada a serina. En algunas realizaciones, la posición de aminoácido 31 está mutada a treonina, la posición 63 está mutada a lisina, la posición 108 está mutada a prolina, la posición 170 está mutada a valina y la posición 194 está mutada a ácido glutámico. En algunas realizaciones, la posición de aminoácido 29 está mutada a tirosina, la posición 65 está mutada a ácido glutámico, la posición 108 está mutada a prolina, la posición 166 está mutada a lisina, la posición 195 está mutada a ácido glutámico y la posición 231 está mutada a treonina. En algunas realizaciones, la posición de aminoácido 27 está mutada a asparagina, la posición 59 está mutada a ácido glutámico, la posición 102 está mutada a treonina, la posición 173 está mutada a tirosina y la posición 194 está mutada a tirosina. En algunas realizaciones, la posición de aminoácido 31 está mutada a asparagina, la posición 65 está mutada a alanina, la posición 108 está mutada a glutamina, la posición 171 está mutada a ácido aspártico y la posición 193 está mutada a isoleucina. En algunas realizaciones, la posición de aminoácido 34 está mutada a valina, la posición 164 está mutada a ácido glutámico y la posición 195 está mutada a isoleucina. En algunas realizaciones, la posición de aminoácido 33 está mutada a prolina, la posición 105 está mutada a asparagina, la posición 171 está mutada a lisina, la posición 195 está mutada a metionina y la posición 231 está mutada a alanina. En algunas realizaciones, la posición de aminoácido 31 está mutada a glicina, la posición 65 está mutada a ácido glutámico, la posición 108 está mutada a prolina, la posición 170 está mutada a valina y la posición 194 está mutada a ácido glutámico. En algunas realizaciones, la posición de aminoácido 27 está mutada a asparagina, la posición 106 está mutada a ácido aspártico, la posición 171 está mutada a histidina y la posición 195 está mutada a valina. En algunas realizaciones, la posición de aminoácido 31 está mutada a asparagina, la posición 54 está mutada a glicina, la posición 165 está mutada a tirosina, la posición 196 está mutada a asparagina y la posición 235 está mutada a alanina. En algunas realizaciones, la posición de aminoácido 28 está mutada a ácido glutámico, la posición 59 está mutada a ácido glutámico, la posición 108 está mutada a leucina, la posición 166 está mutada a serina y la posición 196 está mutada a glicina. En algunas realizaciones, la posición de aminoácido 34 está sustituida por leucina, la posición de aminoácido 61 está sustituida por ácido glutámico, la posición de aminoácido 108 está sustituida por prolina, la posición de aminoácido 194 está sustituida por asparagina y la posición de aminoácido 239 está sustituida por alanina. En algunas realizaciones, la posición de aminoácido 31 está sustituida por ácido glutámico, la posición de aminoácido 65 está sustituida por ácido aspártico, la posición de aminoácido 108 está sustituida por glicina, la posición de aminoácido 171 se sustituye por valina y la posición de aminoácido 194 se sustituye por ácido glutámico.

En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde la posición de aminoácido 34 está mutada a isoleucina, la posición 65 está mutada a glutamina, la posición 102 está mutada a alanina, la posición 163 está mutada a alanina, la posición 197 está mutada a valina y la posición 231 está mutada a treonina, y en donde la hKd y la cKd son aproximadamente las mismas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ iD NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde la posición de aminoácido 34 está mutada a isoleucina, la posición 65 está mutada a glutamina, la posición 102 está mutada a alanina, la posición 163 está mutada a alanina, la posición 197 está mutada a valina y la posición 231 está mutada a treonina, en donde la hKd y la cKd están entre aproximadamente 3 nM y 5 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde la posición de aminoácido 28 está mutada a ácido glutámico, la posición 57 está mutada a lisina, la posición 166 está mutada a fenilalanina y la posición 235 está mutada a ácido aspártico, y en donde la hKd y la cKd son aproximadamente las mismas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde la posición de aminoácido 28 está mutada a ácido glutámico, la posición 57 está mutada a lisina, la posición 166 está mutada a fenilalanina y la posición 235 está mutada a ácido aspártico, en donde la hKd y la cKd están entre aproximadamente 3 nM y aproximadamente 5 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde la posición de aminoácido 108 está mutada a histidina, la posición 168 está mutada a tirosina, la posición 194 está mutada a serina y la posición 239 está mutada a isoleucina, y en donde la hKd y la cKd son aproximadamente las mismas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ iD NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde la posición de aminoácido 108 está mutada a histidina, la posición 168 está mutada a tirosina, la posición 194 está mutada a serina y la posición 239 está mutada a isoleucina, en donde la hKd y la cKd están entre aproximadamente 3 nM y aproximadamente 5 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde la posición de aminoácido 28 está mutada a metionina, la posición 55 está mutada a serina, la posición 114 está mutada a treonina, la posición 166 está mutada a fenilalanina, la posición 195 está mutada a leucina y la posición 237 está mutada a serina, y en donde la hKd y la cKd son aproximadamente las mismas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde la posición de aminoácido 28 está mutada a metionina, la posición 55 está mutada a serina, la posición 114 está mutada a treonina, la posición 166 está mutada a fenilalanina, la posición 195 está mutada a leucina y la posición 237 está mutada a serina, en donde la hKd y la cKd están entre aproximadamente 3 nM y aproximadamente 5 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena única comprende una secuencia en donde la posición de aminoácido 31 está mutada a treonina, la posición 63 está mutada a lisina, la posición 108 está mutada a prolina, la posición 170 está mutada a valina y la posición 194 está mutada a ácido glutámico, y en donde la hKd y la cKd son entre aproximadamente 1,5 veces y aproximadamente 2 veces más altas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena única comprende una secuencia en donde la posición de aminoácido 31 está mutada a treonina, la posición 63 está mutada a lisina, la posición 108 está mutada a prolina, la posición 170 está mutada a valina y la posición 194 está mutada a ácido glutámico, en donde la hKd y la cKd están entre aproximadamente 6 nM y aproximadamente 10 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena única comprende una secuencia en donde la posición de aminoácido 29 está mutada a tirosina, la posición 65 está mutada a ácido glutámico, la posición 108 está mutada a prolina, la posición 166 está mutada a lisina, la posición 195 está mutada a ácido glutámico y la posición 231 está mutada a treonina, y en donde la hKd y la cKd son entre aproximadamente 1,5 veces y aproximadamente 2 veces más altas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena única comprende una secuencia en donde la posición de aminoácido 29 está mutada a tirosina, la posición 65 está mutada a ácido glutámico, la posición 108 está mutada a prolina, la posición 166 está mutada a lisina, la posición 195 está mutada a ácido glutámico y la posición 231 está mutada a treonina, en donde la hKd y la cKd están entre aproximadamente 6 nM y aproximadamente 10 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena única comprende una secuencia en donde la posición de aminoácido 27 está mutada a asparagina, la posición 59 está mutada a ácido glutámico, la posición 102 está mutada a treonina, la posición 173 está mutada a tirosina y la posición 194 está mutada a tirosina, y en donde la hKd y la cKd son entre aproximadamente 3 veces y aproximadamente 5 veces más altas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena única comprende una secuencia en donde la posición de aminoácido 27 está mutada a asparagina, la posición 59 está mutada a ácido glutámico, la posición 102 está mutada a treonina, la posición 173 está mutada a tirosina y la posición 194 está mutada a tirosina, en donde la hKd y la cKd están entre aproximadamente 11 nM y 20 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena única comprende una secuencia en donde la posición de aminoácido 31 está mutada a asparagina, la posición 65 está mutada a alanina, la posición 108 está mutada a glutamina, la posición 171 está mutada a ácido aspártico y la posición 193 está mutada a isoleucina, y en donde la hKd y la cKd son de aproximadamente 6 veces a aproximadamente 15 veces más altas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena única comprende una secuencia en donde la posición de aminoácido 31 está mutada a asparagina, la posición 65 está mutada a alanina, la posición 108 está mutada a glutamina, la posición 171 está mutada a ácido aspártico y la posición 193 está mutada a isoleucina, en donde la hKd y la cKd están entre aproximadamente 25 nM y aproximadamente 40 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde la posición de aminoácido 34 está mutada a valina, la posición 164 está mutada a ácido glutámico y la posición 195 está mutada a isoleucina, y en donde la hKd y la cKd son de aproximadamente 3 veces a aproximadamente 5 veces más altas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde la posición de aminoácido 34 está mutada a valina, la posición 164 está mutada a ácido glutámico y la posición 195 está mutada a isoleucina, en donde la hKd y la cKd están entre aproximadamente 11 nM y 20 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde la posición de aminoácido 33 está mutada a prolina, la posición 90 está mutada a asparagina, la posición 105 está mutada a asparagina, la posición 171 está mutada a lisina, la posición 195 está mutada a metionina y la posición 231 está mutada a alanina, y en donde la hKd y la cKd son entre aproximadamente 6 veces y aproximadamente 15 veces más altas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde la posición de aminoácido 33 está mutada a prolina, la posición 90 está mutada a asparagina, la posición 105 está mutada a asparagina, la posición 171 está mutada a lisina, la posición 195 está mutada a metionina y la posición 231 está mutada a alanina, en donde la hKd y la cKd están entre aproximadamente 40 nM y 60 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena única comprende una secuencia en donde la posición de aminoácido 31 está mutada a glicina, la posición 65 está mutada a ácido glutámico, la posición 108 está mutada a prolina, la posición 170 está mutada a valina y la posición 194 está mutada a ácido glutámico, y en donde la hKd y la cKd son de aproximadamente 3 veces a aproximadamente 5 veces más altas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena única comprende una secuencia en donde la posición de aminoácido 31 está mutada a glicina, la posición 65 está mutada a ácido glutámico, la posición 108 está mutada a prolina, la posición 170 está mutada a valina y la posición 194 está mutada a ácido glutámico, en donde la hKd y la cKd están entre aproximadamente 11 nM y 20 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena única comprende una secuencia en donde la posición de aminoácido 27 está mutada a asparagina, la posición 106 está mutada a ácido aspártico, la posición 171 está mutada a histidina y la posición 195 está mutada a valina, y en donde la hKd y la cKd son entre aproximadamente 6 veces y aproximadamente 15 veces más altas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena única comprende una secuencia en donde la posición de aminoácido 27 está mutada a asparagina, la posición 106 está mutada a ácido aspártico, la posición 171 está mutada a histidina y la posición 195 está mutada a valina, en donde la hKd y la cKd están entre aproximadamente 40 nM y 60 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena única comprende una secuencia en donde la posición de aminoácido 31 está mutada a asparagina, la posición 54 está mutada a glicina, la posición 165 está mutada a tirosina, la posición 196 está mutada a asparagina y la posición 235 está mutada a alanina, y en donde la hKd y la cKd son entre aproximadamente 3 veces y aproximadamente 5 veces más altas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena única comprende una secuencia en donde la posición de aminoácido 31 está mutada a asparagina, la posición 54 está mutada a glicina, la posición 165 está mutada a tirosina, la posición 196 está mutada a asparagina y la posición 235 está mutada a alanina, en donde la hKd y la cKd están entre aproximadamente 11 nM y aproximadamente 20 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde la posición de aminoácido 28 está mutada a ácido glutámico, la posición 59 está mutada a ácido glutámico, la posición 108 está mutada a leucina, la posición 166 está mutada a serina y la posición 196 está mutada a glicina, y en donde la hKd y la cKd son entre aproximadamente 20 veces y aproximadamente 50 veces más altas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde la posición de aminoácido 28 está mutada a ácido glutámico, la posición 59 está mutada a ácido glutámico, la posición 108 está mutada a leucina, la posición 166 está mutada a serina y la posición 196 está mutada a glicina, en donde la hKd y la cKd están entre aproximadamente 125 nM y aproximadamente 140 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde la posición de aminoácido 34 está mutada a leucina, la posición de aminoácido 61 está mutada a ácido glutámico, la posición de aminoácido 108 está mutada a prolina, la posición de aminoácido 194 está mutada a asparagina, la posición de aminoácido 239 está mutada a alanina, y en donde la hKd y la cKd son entre aproximadamente 20 veces y aproximadamente 50 veces más altas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde la posición de aminoácido 34 está mutada a leucina, la posición de aminoácido 61 está mutada a ácido glutámico, la posición de aminoácido 108 está mutada a prolina, la posición de aminoácido 194 está mutada a asparagina, , la posición de aminoácido 239 está mutada a alanina, en donde la hKd y la cKd están entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 120 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde la posición de aminoácido 31 está mutada a ácido glutámico, la posición de aminoácido 65 está mutada a ácido aspártico, la posición de aminoácido 108 está mutada a glicina, la posición de aminoácido 171 está mutada a valina y la posición de aminoácido 194 está mutada a ácido glutámico, y en donde la hKd y la cKd son de aproximadamente 20 veces a aproximadamente 50 veces más altas que la afinidad de unión hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla comprende una secuencia en donde la posición de aminoácido 31 está mutada a ácido glutámico, la posición de aminoácido 65 está mutada a ácido aspártico, la posición de aminoácido 108 está mutada a glicina, la posición de aminoácido 171 está mutada a valina, y la posición de aminoácido 194 está mutada a ácido glutámico, y en donde la hKd y la cKd están entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 120 nM.

En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla no se une a CD3 de ratón.

En una realización, se proporciona un polinucleótido que codifica una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla de acuerdo con la presente divulgación. En una realización, se proporciona un vector que comprende el polinucleótido descrito en el presente documento. En una realización, se proporciona una célula hospedadora transformada con el vector descrito en el presente documento. En una realización adicional, se proporciona una composición farmacéutica que comprende (i) una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla de acuerdo con la presente divulgación, el polinucléotido de acuerdo con la presente divulgación, el vector de acuerdo con la presente divulgación o la célula hospedadora de acuerdo con la presente divulgación, y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otra realización, se proporciona un procedimiento para la producción de una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla de acuerdo con la presente divulgación, comprendiendo dicho procedimiento cultivar un hospedador transformado o transfectado con un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla de acuerdo con la presente divulgación en condiciones que permiten la expresión de la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla y recuperar y purificar la proteína producida a partir del cultivo.

En otra realización, se proporciona un método para el tratamiento o la mejora de una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral, una enfermedad inflamatoria, un trastorno inmunológico, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad infecciosa, una enfermedad vírica, una reacción alérgica, una reacción parasitaria, una enfermedad de injerto contra hospedador o una enfermedad de hospedador contra injerto que comprende la administración de la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla de acuerdo con la presente divulgación, a un sujeto que lo necesita. En algunas realizaciones, el sujeto es humano. En algunas realizaciones, el método comprende además la administración de un agente en combinación con la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla de acuerdo con la presente divulgación.

En el presente documento, en una realización, se proporciona una proteína de unión multiespecífica que comprende la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla de acuerdo con la presente divulgación. Una realización describe un anticuerpo que comprende la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla de acuerdo con la presente divulgación. Una realización adicional proporciona un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo de dominio único, un dominio pesado variable, un péptido o un ligando, que comprende la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla de acuerdo con la presente divulgación. En el presente documento, en una realización, se describe un anticuerpo que comprende la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla de acuerdo con la presente divulgación, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo scFv. Otra realización describe una proteína de unión multiespecífica o anticuerpo que comprende la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla de acuerdo con la presente divulgación y un dominio de unión a albúmina sérica.

Las características novedosas de la invención se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención haciendo referencia a la siguiente descripción detallada que expone realizaciones ilustrativas, en la que se utilizan los principios de la invención y los dibujos adjuntos de los cuales:

Breve descripción de los dibujos

La FIGURA 1 ilustra la titulación de fagos en biotina-CD3£ y biotina-HSA.

La FIGURA 2 ilustra las secuencias de aminoácidos de la proteína de unión a CD3 humano (SEQ ID NO: 22). CDR1 de HC se indica en la primera secuencia sombreada (GFTFNKYAMN (SEQ ID NO: 23)), CDR2 de HC se indica en la segunda secuencia sombreada (RIRSKYNNYAt Yy ADSVK (SEQ ID NO: 24)), CDR3 de HC se indica en la tercera secuencia sombreada (HGN<f>G<n>SYISYWAY (SEQ ID NO: 25)), CDR1 de Le se indica en la cuarta secuencia sombreada (GSSTGAVt Sg NYPN (SEQ ID NO: 26)), CDR2 de LC se indica en la quinta secuencia sombreada (GTKFLAP (SEQ ID NO: 27)), y CDR3 se indica en la sexta secuencia sombreada (VLWYSNRWV (SEQ ID NO: 28)).

La FIGURA 3 ilustra los perfiles de los dieciséis clones seleccionados para determinaciones de Kd más precisas. La FIGURA 4 ilustra la temperatura de exposición hidrófoba (Th °C) para varias variantes de scFv anti-CD3£ humano.

Descripción detallada de la invención

Determinadas definiciones

La terminología utilizada en el presente documento es con el fin de describir casos particulares únicamente y no pretende ser limitativa. Como se usa en el presente documento, las formas en singular "un", "uno/una" y "el/la" pretenden incluir las formas en plural también, a menos que el contexto indique claramente otra cosa. Además, en la medida en que los términos y expresiones "que incluye/n", "incluye", "que tiene", "tiene", "con", o las variantes de los mismos, se utilizan en la descripción detallada y/o en las reivindicaciones, tales términos pretenden ser inclusivos de una manera similar al término "que comprende".

Las expresiones "aproximadamente" o "de manera aproximada" significa dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular determinado por un experto en la materia, que dependerá en parte de cómo se mida o determine el valor, por ejemplo, de las limitaciones del sistema de medida. Por ejemplo, "aproximadamente" puede significar más/menos 1 o más de 1 desviación típica, según la práctica en el valor dado. Cuando se describan valores particulares en la solicitud y en las reivindicaciones, a menos que se indique lo contrario, se debe suponer que el término "aproximadamente" significa un intervalo de error aceptable para el valor particular.

Los términos "individuo", "paciente", o "sujeto" se usan indistintamente. Ninguno de los términos requiere ni está limitado a una situación caracterizada por la supervisión (por ejemplo, constante o intermitente) de un trabajador de la salud (por ejemplo, un médico, una enfermera titulada, una enfermera practicante, un médico asistente, un celador o un trabajador de cuidados paliativos).

Como se usa en el presente documento, "semitiempo de eliminación" se utiliza en su sentido ordinario, como se describe en Goodman and Gillman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics 21-25 (Alfred Goodman Gilman, Louis S. Goodman y Alfred Gilman, eds., 6a ed. 1980). Brevemente, la expresión quiere decir que abarca una medida cuantitativa del transcurso de tiempo de la eliminación del fármaco. La eliminación de la mayoría de fármacos es exponencial (es decir, sigue una cinética de primer orden), dado que las concentraciones de fármaco no se aproximan a las requeridas para la saturación del proceso de eliminación. La tasa de un proceso exponencial puede expresarse por su constante de velocidad, k, que expresa el cambio fraccional por unidad de tiempo o por su semitiempo, t<i / 2>el tiempo requerido para completar un 50 % del proceso. Las unidades de estas dos constantes son tiempo<-1>y tiempo, respectivamente. Una constante de velocidad de primer orden y el semitiempo de la reacción se relacionan de forma simple (k*t<i /2>=0,693) y por consiguiente, pueden intercambiarse. Dado que la cinética de eliminación de primer orden establece que se pierde una fracción constante de fármaco por unidad de tiempo, un gráfico del log de la concentración de fármaco frente al tiempo es lineal siempre, tras la fase de distribución inicial (es decir, después de la absorción del fármaco y la distribución se completa). El semitiempo para la eliminación del fármaco puede determinarse con exactitud a partir de tal gráfico.

Como se usa en el presente documento, la expresión "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia se define como el porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos en la secuencia específica, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia y sin tomar en consideración ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación para determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede lograrse de diversas maneras que se encuentran dentro de las capacidades del experto en la técnica, por ejemplo, usando programas informáticos disponibles de manera pública, tales como los programas BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros adecuados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se estén comparando.

El término restos (o regiones) de "marco" o "FR" se refieren a restos de dominio variable distintos de los restos de región de CDR o hipervariable como se define en el presente documento. Un "marco consenso humano" es un marco que representa los restos de aminoácidos que se encuentran más habitualmente en una selección de secuencias marco de VL o VH de inmunoglobulina humana.

Como se usa en el presente documento, "región variable" o "dominio variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida uniformemente en todos los dominios variables de anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamados regiones determinantes de la complementariedad (CDR) o regiones hipervariables, tanto en los dominios variables de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las porciones más conservadas de los dominios variables se denominan la región marco conservada (FR). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras naturales comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan en gran medida una configuración de lámina p, conectadas por tres CDR, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina p. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas muy cerca de las regiones FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al. Sequences o f Proteins o f Immunological Interest, Quinta edición, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, sino que presentan diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpos. "Numeración de restos de dominio variable como en Kabat" o "numeración de posición de aminoácidos como en Kabat", y variaciones de la misma, se refiere al sistema de numeración usado para los dominios variables de cadena pesada o los dominios variables de cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., Sequences o f Proteins o f Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). Utilizando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales correspondientes a un acortamiento o inserción en, una FR o CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir una única inserción de aminoácido (resto 52a de acuerdo con Kabat) después del resto 52 de H2 y restos insertados (por ejemplo, los restos 82a, 82b y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) después del resto 82 de FR de la cadena pesada. La numeración de Kabat de los restos puede determinarse para un anticuerpo dado por alineación en las regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat "patrón". No se pretende que las CDR de la presente divulgación correspondan necesariamente a la convención de numeración de Kabat.

Como se usa en el presente documento, el término "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de las proteínas descritas en la divulgación a sus dianas de unión y se expresa numéricamente usando valores "Kd". Si se indica que dos o más proteínas tienen afinidades de unión comparables hacia sus dianas de unión, entonces los valores Kd para la unión de las proteínas respectivas hacia sus dianas de unión, están dentro de ±2 veces entre sí. Si se indica que dos o más proteínas tienen afinidades de unión comparables hacia una sola diana de unión, entonces los valores Kd para la unión de las proteínas respectivas hacia dicha única diana de unión, están dentro de ±2 veces entre sí. Si se indica que una proteína se une a dos o más dianas con afinidades de unión comparables, entonces los valores Kd para la unión de dicha proteína a las dos o más dianas están dentro de ± 2 veces entre sí. En general, un valor Kd más alto corresponde a una unión más débil. En algunas realizaciones, la "Kd" se mide mediante un ensayo de unión de antígenos radiomarcados (RIA) o ensayos de resonancia de plasmones de superficie usando un BIAcore™-2000 o un BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.). En determinadas realizaciones, una "tasa de activación" o "tasa de asociación" o "tasa de asociación" o "kon" y una "tasa de desactivación" o "tasa de disociación" o "tasa de disociación" o "koff' también se determinan con la técnica de resonancia de plasmones de superficie usando un BIAcore™-2000 o un BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.). En realizaciones adicionales, la "Kd", "kon" y "koff" se miden usando los sistemas Octet® (Pall Life Sciences).

En el presente documento se describen proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla, composiciones farmacéuticas así como ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes y células hospedadoras para preparar tales proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla. También se proporcionan métodos para usar las proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla divulgadas en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades, afecciones y trastornos. En algunas realizaciones, las proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla son capaces de unirse específicamente a un dominio de CD3, así como un antígeno diana y un dominio de ampliación de semivida, tal como un anticuerpo de unión a dominio único frente a albúmina sérica humana (HSA).

Dominio de unión a CD3

La especificidad de la respuesta de los linfocitos T está mediada por el reconocimiento de antígeno (presentado en el contexto de un complejo de histocompatibilidad principal, MHC) por el complejo de receptor de linfocitos T. Como parte del complejo de receptor de linfocitos T, CD3 es un complejo proteico que incluye una cadena de CD3<y>(gamma), una cadena de CD38 (delta) y dos cadenas de CD3<e>(épsilon) que están presentes en la superficie celular. CD3 se asocia con las cadenas a (alfa) y p (beta) del receptor de linfocitos T (TCR), así como CD3 Z (zeta) en conjunto para comprender el complejo de receptor de linfocitos T. El agrupamiento de CD3 en linfocitos T, tal como mediante anticuerpos anti-CD3 inmovilizados, conduce a la activación de linfocitos T similar al acoplamiento del receptor de linfocitos T pero independiente de su especificidad típica de clon.

En un aspecto, las proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla descritas en el presente documento comprenden un dominio que se une específicamente a CD3. En un aspecto, las proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla descritas en el presente documento comprenden un dominio que se une específicamente a CD3 humano. En un aspecto, las proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla descritas en el presente documento comprenden un dominio que se une específicamente a CD3 de macaco cangrejero. En un aspecto, las proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla descritas en el presente documento comprenden un dominio que se une a CD3 humano y CD3 de macaco cangrejero. En algunas realizaciones, las proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla descritas en el presente documento comprenden un dominio que se une específicamente a CD3y. En algunas realizaciones, las proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla descritas en el presente documento comprenden un dominio que se une específicamente a CD38. En algunas realizaciones, las proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla descritas en el presente documento comprenden un dominio que se une específicamente a CD3e.

En otro aspecto, se proporciona una proteína de unión multiespecífica que comprende una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla de acuerdo con la presente divulgación. En algunas realizaciones, la proteína multiespecífica que comprende una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla de acuerdo con la presente divulgación se une específicamente al receptor de linfocitos T (TCR). En determinados casos, la proteína multiespecífica que comprende una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla de acuerdo con la presente divulgación se une a la cadena a del TCR. En determinados casos, la proteína multiespecífica que comprende una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla de acuerdo con la presente divulgación se une a la cadena p del TCR.

En determinadas realizaciones, el dominio de unión a CD3 de las proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla descritas en el presente documento presenta no solo afinidades de unión a CD3 potentes con CD3 humano, sino que también muestran una reactividad cruzada excelente con las proteínas CD3 de macaco cangrejero respectivas. En algunos casos, el dominio de unión a CD3 de las proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla es de reactividad cruzada con CD3 de macaco cangrejero. En determinados casos, la Kd para unir CD3 humano (hKd) es aproximadamente la misma que la Kd para unir CD3 de macaco cangrejero (cKd). En determinados casos, la relación entre hKd y cKd (hKd:cKd) está entre aproximadamente 20:1 y aproximadamente 1:2.

En algunas realizaciones, el dominio de unión a CD3 de la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla puede ser cualquier dominio que se una a CD3, incluyendo, pero sin limitación, dominios de un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado.

En algunos casos, es beneficioso para el dominio de unión a CD3 que se derive de la misma especie en la que la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla se utilizará finalmente. Por ejemplo, para su uso en seres humanos, sería beneficioso para el dominio de unión a CD3 de la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla que comprendiera restos humanizados o humanos del dominio de unión a antígeno de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

Por lo tanto, en un aspecto, el dominio de unión a antígeno comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humanizado o humano o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo murino. En una realización, el dominio de unión anti-CD3 humanizado o humano comprende una o más (por ejemplo, las tres) de región determinante de complementariedad 1 de cadena ligera (CDR1 de LC), región determinante de complementariedad 2 de cadena ligera (CDR2 de LC) y región determinante de complementariedad 3 de cadena ligera (CDR3 de LC) de un dominio de unión anti-CD3 humanizado o humano descrito en el presente documento y/o una o más (por ejemplo, las tres) de región determinante de complementariedad 1 de cadena pesada (CDR1 de HC), región determinante de complementariedad 2 de cadena pesada (CDR2) y región determinante de complementariedad 3 de cadena pesada (CDR3) de un dominio de unión anti-CD3 humanizado o humano descrito en el presente documento, por ejemplo, un dominio de unión anti-CD3 humanizado o humano comprende una o más, por ejemplo, las tres, LC CDR y una o más, por ejemplo, las tres, HC CDR.

En algunas realizaciones, el dominio de unión anti-CD3 humanizado o humano comprende una región variable de cadena ligera humanizada o humana específica para CD3, donde la región variable de cadena ligera específica para CD3 comprende CDR de cadena ligera humana o no humana en una región marco conservada de cadena ligera humana. En determinados casos, la región marco conservada de cadena ligera es una región marco conservada de cadenas ligera A (lambda). En otros casos, la región marco conservada de cadena ligera es una región marco conservada de cadena ligera k (kappa).

En algunas realizaciones, el dominio de unión anti-CD3 humanizado o humano comprende una región variable de cadena pesada humanizada o humana específica para CD3, donde la región variable de cadena pesada específica para CD3 comprende CDR de cadena pesada humana o no humana en una región marco conservada de cadena pesada humana.

En determinados casos, las regiones determinantes de complementariedad de la cadena pesada y/o ligera se derivan de anticuerpos anti-CD3 conocidos, tales como, por ejemplo, muromonab-CD3 (OKT3), otelixizumab (TRX4), teplizumab (MGA031), visilizumab (Nuvion), SP34, TR-66 o X35-3, VIT3, BMA030 (documento BW264/56), CLB-T3/3, CRIS7, YTH12.5, F111-409, CLB-T3.4,2, TR-66, WT32, SPv-T3b, 11D8, XNM41, XIII-46, XIII-87, 12F6, T3/RW2-8C8, T3/RW2-4B6, OKT3D, M-T301, SMC2, F101.01, UCHT-1 y WT-31.

En una realización, el dominio de unión anti-CD3 es un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) que comprende una cadena ligera y una cadena pesada de una secuencia de aminoácidos proporcionada en el presente documento. Como se usa en el presente documento, "fragmento variable de cadena sencilla" o "scFv" se refiere a un fragmento de anticuerpo que comprende una región variable de una cadena ligera y al menos un fragmento de anticuerpo que comprende una región variable de una cadena pesada, en donde las regiones variables de cadena ligera y pesada están unidas de forma contigua a través de un enlazador polipeptídico flexible corto y son capaces de expresarse como una cadena polipeptídica individual y en donde el scFv retiene la especificidad del anticuerpo del cual se deriva intacta. En una realización, el dominio de unión anti-CD3 comprende: una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones), pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera proporcionada en el presente documento o una secuencia con un 95-99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos proporcionada en el presente documento; y/o una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones), pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada proporcionada en el presente documento o una secuencia con un 95-99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos proporcionada en el presente documento. En una realización, el dominio de unión anti-CD3 humanizado o humano es un scFv y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en el presente documento, se une a una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en el presente documento, a través de un enlazador de scFv. La región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada de un scFv puede estar, por ejemplo, en cualquiera de las siguientes orientaciones: región variable de cadena ligeraenlazador de scFv-región variable de cadena pesada o región variable de cadena pesada-enlazador de scFv-región variable de cadena ligera.

En algunos casos, los scFv que se unen a CD3 se preparan de acuerdo con métodos conocidos. Por ejemplo, las moléculas scFv pueden producirse uniendo las regiones Vh y VL juntas utilizando enlazadores polipeptídicos flexibles. Las moléculas scFv comprenden un enlazador de scFv (por ejemplo, un enlazador de Ser-Gly) con una longitud y/o composición de aminoácidos optimizada. En consecuencia, en algunas realizaciones, la longitud del enlazador de scFv es de modo que el dominio VH o VL puede asociarse de forma intermolecular con el otro dominio variable para formar el sitio de unión de CD3. En determinadas realizaciones, tales enlazadores de scFv son "cortos", es decir, consisten en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 restos de aminoácidos. Por lo tanto, en determinados ejemplos, los enlazadores de scFv consisten en aproximadamente 12 o menos restos de aminoácidos. En el caso de 0 restos de aminoácidos, el enlazador de scFv es un enlace peptídico. En algunas realizaciones, estos enlazadores de scFv consisten en aproximadamente 3 a aproximadamente 15, por ejemplo, 8, 10 o 15 restos de aminoácidos contiguos. Respecto a la composición de aminoácidos de los enlazadores de scFv, los péptidos se seleccionan de modo que confieren flexibilidad, no interfieren con los dominios variables así como que permiten el plegamiento intracatenario para reunir los dos dominios variables para formar un sitio de unión a CD3 funcional. Por ejemplo, los enlazadores de scFv que comprenden restos de glicina y serina generalmente proporcionan resistencia a proteasas. En algunas realizaciones, los enlazadores en un scFv comprenden restos de glicina y serina. La secuencia de aminoácidos de los enlazadores de scFv puede optimizarse, por ejemplo, mediante métodos de presentación en fagos para mejorar la unión de CD3 y el rendimiento de producción del scFv. Entre los ejemplos de enlazadores de scFv de péptidos adecuados para unirse a un dominio variable de cadena ligera y a un dominio variable de cadena pesada en un scFv se incluyen, pero sin limitación, (GS)<n>(SEQ ID NO: 96), (GGS)<n>(SEQ ID NO: 97), (GGGS)<n>(SEQ ID NO: 98), (GGSG)<n>(SEQ ID NO: 99), (GGSGG)<n>(SEQ ID NO: 100), (GGGGS)<n>(SEQ ID NO: 101), (GGGGG)<n>(SEQ ID NO: 102) o (GGG)<n>(SEQ ID NO: 103), en donde n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En una realización, el enlazador de scFv puede ser (GGGGS)<4>(SEQ ID NO: 104) o (GGGGS)<3>(SEQ ID NO: 1). La variación en la longitud del enlazador puede retener o mejorar la actividad, dando lugar a una eficacia superior en estudios de actividad.

En algunas realizaciones, el dominio de unión a CD3 de una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene una afinidad para CD3 en células que expresan CD3 con una K<d>de 1000 nM o menos, 500 nM o menos, 200 nM o menos, 100 nM o menos, 80 nM o menos, 50 nM o menos, 20 nM o menos, 10 nM o menos, 5 nM o menos, 1 nM o menos o 0,5 nM o menos. En algunas realizaciones, el dominio de unión a CD3 de una proteína de unión CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene una afinidad para CD3<e>,<y>o 8 con una K<d>de 1000 nM o menos, 500 nM o menos, 200 nM o menos, 100 nM o menos, 80 nM o menos, 50 nM o menos, 20 nM o menos, 10 nM o menos, 5 nM o menos, 1 nM o menos o 0,5 nM o menos. En realizaciones adicionales, el dominio de unión a CD3 de una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene una afinidad baja para CD3, es decir, aproximadamente 100 nM o mayor.

En determinadas realizaciones, las proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla descritas en el presente documento se unen a<c>D3 humano con una Kd humana (hKd) y a CD3 de macaco cangrejero con una Kd de macaco cangrejero (cKd). En algunas realizaciones, hKd y cKd están entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 2 nM, de aproximadamente 3 nM a aproximadamente 5 nM, de aproximadamente 6 nM a aproximadamente 10 nM, de aproximadamente 11 nM a aproximadamente 20 nM, de aproximadamente 25 nM a aproximadamente 40 nM, de aproximadamente 40 nM a aproximadamente 60 nM, de aproximadamente 70 nM a aproximadamente 90 nM, de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 120 nM, de aproximadamente 125 nM a aproximadamente 140 nM, de aproximadamente 145 nM a aproximadamente 160 nM, de aproximadamente 170 nM a aproximadamente 200 nM, de aproximadamente 210 nM a aproximadamente 250 nM, de aproximadamente 260 nM a aproximadamente 300 nM.

En algunas realizaciones, la hKd y cKd de las proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla son aproximadamente las mismas que la Kd de una proteína de unión a CD3 que tiene la secuencia como se expone en SEQ ID NO. 22. En algunas realizaciones, la hKd y cKd de las proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla son de aproximadamente 1,1 veces a aproximadamente 1,5 veces la Kd de una proteína de unión a CD3 que tiene la secuencia como se expone en SEQ ID NO. 22. En algunas realizaciones, la hKd y cKd de las proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla son de aproximadamente 1,5 veces a aproximadamente 2 veces la Kd de una proteína de unión a CD3 que tiene la secuencia como se expone en SEQ ID NO. 22. En algunas realizaciones, la hKd y cKd de las proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla son de aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 3 veces la Kd de una proteína de unión a CD3 que tiene la secuencia como se expone en SEQ ID NO. 22. En algunas realizaciones, la hKd y cKd de las proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla son de aproximadamente 3 veces a aproximadamente 5 veces la Kd de una proteína de unión a CD3 que tiene la secuencia como se expone en SEQ ID NO. 22. En algunas realizaciones, la hKd y cKd de las proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla son de aproximadamente 6 veces a aproximadamente 15 veces la Kd de una proteína de unión a CD3 que tiene la secuencia como se expone en SEQ ID NO. 22. En algunas realizaciones, la hKd y cKd de las proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla son de aproximadamente 15 veces a aproximadamente 20 veces la Kd de una proteína de unión a CD3 que tiene la secuencia como se expone en SEQ ID NO. 22. En algunas realizaciones, la hKd y cKd de las proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla son de aproximadamente 20 veces a aproximadamente 50 veces la Kd de una proteína de unión a CD3 que tiene la secuencia como se expone en SEQ ID NO. 22. En algunas realizaciones, la hKd y cKd de las proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla son de aproximadamente 55 veces a aproximadamente 70 veces la Kd de una proteína de unión a CD3 que tiene la secuencia como se expone en SEQ ID NO. 22. En algunas realizaciones, la hKd y cKd de las proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla son de aproximadamente 75 veces a aproximadamente 100 veces la Kd de una proteína de unión a CD3 que tiene la secuencia como se expone en SEQ ID NO. 22. En algunas realizaciones, la hKd y cKd de las proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla son de aproximadamente 120 veces a aproximadamente 200 veces la Kd de una proteína de unión a CD3 que tiene la secuencia como se expone en SEQ ID NO. 22.

En algunas realizaciones, la relación entre la hKd y cKd (hKd: cKd) varía de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 1:2. La afinidad de unión a CD3 puede determinarse, por ejemplo, por la capacidad de la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla en sí o de su dominio de unión a CD3 para unirse a CD3 revestida en una placa de ensayo; presentado en la superficie de una célula microbiana; en solución; etc. La actividad de unión de la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla en sí o de su dominio de unión a CD3 de la presente divulgación a CD3 puede ensayarse mediante la inmovilización del ligando (por ejemplo, CD3) o de la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla en sí o de su dominio de unión a CD3, en una perla, sustrato, célula, etc. Los agentes se pueden añadir en un tampón adecuado y las parejas de unión pueden incubarse durante un período de tiempo a una temperatura dada. Después de los lavados para eliminar el material no unido, la proteína unida se puede liberar con, por ejemplo, SDS, tampones con un pH alto o bajo y similares y analizarse, por ejemplo, mediante resonancia de plasmones superficiales (SPR).

En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla CD3 tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 94 y SEQ ID NO. 95.

En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla CD3 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 8, en donde la hKd es aproximadamente 3,8 nM, y en donde la cKd es aproximadamente 3,5 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla CD3 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 9, en donde la hKd es aproximadamente 4,1 nM, y en donde la cKd es aproximadamente 3,4 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla CD3 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 10, en donde la hKd es aproximadamente 4,3 nM, y en donde la cKd es aproximadamente 4,2 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla CD3 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO.

11, en donde la hKd es aproximadamente 4,7 nM, y en donde la cKd es aproximadamente 4,9 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla CD3 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 12, en donde la hKd es aproximadamente 6,4 nM, y en donde la cKd es aproximadamente 6,6 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla CD3 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 13, en donde la hKd es aproximadamente 8 nM, y en donde la cKd es aproximadamente 6,6 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla c D3 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 14, en donde la hKd es aproximadamente 20 nM, y en donde la cKd es aproximadamente 17 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla CD3 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO.

15, en donde la hKd es aproximadamente 37 nM, y en donde la cKd es aproximadamente 30 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla CD3 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 16, en donde la hKd es aproximadamente 14 nM, y en donde la cKd es aproximadamente 13 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla CD3 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 17, en donde la hKd es aproximadamente 50 nM, y en donde la cKd es aproximadamente 47 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla CD3 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 18, en donde la hKd es aproximadamente 16 nM, y en donde la cKd es aproximadamente 16 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla CD3 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO.

19, en donde la hKd es aproximadamente 46 nM, y en donde la cKd es aproximadamente 43 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla CD3 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 20, en donde la hKd es aproximadamente 18 nM, y en donde la cKd es aproximadamente 17 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla CD3 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 21, en donde la hKd es aproximadamente 133 nM, y en donde la cKd es aproximadamente 134 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla<c>D3 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 94, en donde la hKd es aproximadamente 117 nM, y en donde la cKd es aproximadamente 115 nM. En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla CD3 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO.

95, en donde la hKd es aproximadamente 109 nM, y en donde la cKd es aproximadamente 103 nM.

En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla CD3 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 8, en donde la hKd y cKd son aproximadamente las mismas que la Kd hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla CD3 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 9, en donde la hKd y cKd son aproximadamente las mismas que la Kd hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla CD3 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 10, en donde la hKd y cKd son aproximadamente las mismas que la Kd hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla CD3 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 11, en donde la hKd y cKd son aproximadamente las mismas que la Kd hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla CD3 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 12, en donde la hKd y cKd son aproximadamente las mismas que la Kd hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla CD3 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 13, en donde la hKd y cKd son aproximadamente las mismas que la Kd hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla CD3 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 14, en donde la hKd y cKd son de aproximadamente 3 veces a aproximadamente 5 veces más altas que la Kd hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla CD3 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 15, en donde la hKd y cKd son de aproximadamente 3 veces a aproximadamente 5 veces más altas que la Kd hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla CD3 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 16, en donde la hKd y cKd son de aproximadamente 3 veces a aproximadamente 5 veces más altas que la Kd hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla CD3 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 17, en donde la hKd y cKd son de aproximadamente 6 veces a aproximadamente 15 veces más altas que la Kd hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla CD3 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 18, en donde la hKd y cKd son de aproximadamente 3 veces a aproximadamente 5 veces más altas que la Kd hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 19 (2A4), en donde la hKd y cKd son de aproximadamente 6 veces a aproximadamente 15 veces más altas que la Kd hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla CD3 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 20, en donde la hKd y cKd son de aproximadamente 3 veces a aproximadamente 5 veces más altas que la Kd hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla CD3 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 21, en donde la hKd y cKd son de aproximadamente 20 veces a aproximadamente 50 veces más altas que la Kd hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla CD3 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 94, en donde la hKd y cKd son de aproximadamente 20 veces a aproximadamente 50 veces más altas que la Kd hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22). En algunas realizaciones, la proteína de unión al fragmento variable de cadena sencilla CD3 tiene una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO. 95, en donde la hKd y cKd son de aproximadamente 20 veces a aproximadamente 50 veces más altas que la Kd hacia CD3 de una proteína que tiene la secuencia como se expone en anti-CD3 de tn (SEQ ID NO. 22).

Dominio de ampliación de semivida

La albúmina sérica humana (HSA) (masa molecular ~67 kDa) es la proteína más abundante en el plasma, presente en aproximadamente 50 mg/ml (600 pM) y tiene una semivida de aproximadamente 20 días en seres humanos. La HSA sirve para mantener el pH del plasma, contribuye a la presión sanguínea coloidal, funciona como transportadora de muchos metabolitos y ácidos grasos y sirve como una proteína transportadora farmacológica principal en el plasma.

La asociación no covalente con albúmina amplía el semitiempo de eliminación de las proteínas de vida corta. Por ejemplo, una fusión recombinante de un dominio de unión a albúmina a un fragmento Fab dio como resultado una disminución del aclaramiento in vivo de 25 y 58 veces y una ampliación de semivida de 26 y 37 veces cuando se administró por vía intravenosa a ratones y conejos respectivamente, en comparación con la administración del fragmento Fab solo. En otro ejemplo, cuando la insulina está acilada con ácidos grasos para promover la asociación con albúmina, se observó un efecto prolongado cuando se inyectaron subcutáneamente en conejos o cerdos. En conjunto, estos estudios demuestran un enlace entre la unión de albúmina y la acción prolongada.

En un aspecto, se proporciona una proteína de unión multiespecífica que comprende una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla de acuerdo con la presente divulgación y que comprende además un dominio de ampliación de semivida, por ejemplo, un dominio que se une específicamente a albúmina sérica. En algunas realizaciones, el dominio de unión a albúmina sérica de una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla puede ser cualquier dominio que se una a albúmina sérica, incluyendo, pero sin limitación, dominios de un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones, el dominio de unión a albúmina sérica son unos fragmentos variables de cadena única (scFv), un anticuerpo de dominio único, tal como un dominio variable de cadena pesada (VH), un dominio variable de cadena ligera (VL) y un dominio variable (VHH) de sdAb derivado de camélido, o fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos de unión a HSA, tales como Fab, Fab', fragmentos F(ab)2 y Fv, fragmentos que comprenden una o más CDR, anticuerpos de cadena sencilla (por ejemplo, fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv)), fragmentos Fv estabilizados con disulfuro (dsFv), anticuerpos heteroconjugados (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), fragmentos pFv, monómeros o dímeros de cadena pesada, monómeros o dímeros de cadena ligera y dímeros que consisten en una cadena pesada y una cadena ligera, péptido, ligando o entidad de molécula pequeña específica para la albúmina sérica. En determinadas realizaciones, el dominio de unión a HSA es un anticuerpo de dominio único. En otras realizaciones, el dominio de unión a albúmina sérica es un péptido. En realizaciones adicionales, el dominio de unión a la albúmina sérica es una molécula pequeña. Se contempla que el dominio de unión a albúmina sérica de la proteína de unión multiespecífica que comprende una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena única es bastante pequeño y de no más de 25 kD, no más de 20 kD, no más de 15 kD o no más de 10 kD en algunas realizaciones. En determinados casos, la unión de seroalbúmina es de 5 kD o menos si es una entidad peptídica o de molécula pequeña.

El dominio de ampliación de semivida de una proteína de unión multiespecífica que comprende una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena única proporciona una farmacodinámica y farmacocinética alteradas de la propia proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena única. Como anteriormente, el dominio de ampliación de semivida prolonga el semitiempo de eliminación. El dominio de ampliación de semivida altera las propiedades farmacodinámicas, incluyendo la alteración de la distribución tisular, penetración y difusión de la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena única. En algunas realizaciones, el dominio de extensión de la semivida proporciona una orientación mejorada del tejido (incluido el tumor), distribución tisular, penetración tisular, difusión dentro del tejido y eficacia mejorada en comparación con una proteína sin un dominio de extensión de semivida. En una realización, los métodos terapéuticos utilizan de manera eficaz y eficiente una cantidad reducida de la proteína de unión multiespecífica que comprende una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena única, dando como resultado efectos secundarios reducidos, tales como citotoxicidad de células no tumorales reducida.

Por otra parte, la afinidad de unión del domino de ampliación de semivida puede seleccionarse de modo que se dirija a un semitiempo de eliminación específico en una proteína de unión multiespecífica particular que comprende una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el dominio de ampliación de semivida tiene una afinidad de unión elevada. En otras realizaciones, el dominio de ampliación de semivida tiene una afinidad de unión media. En otras realizaciones más, el dominio de ampliación de semivida tiene una afinidad de unión baja o marginal. Las afinidades de unión ilustrativas incluyen Kd de l0 nM o menos (alta), entre 10 nM y 100 nM (media) y mayores de 100 nM (baja). Como anteriormente, las afinidades de unión a la albúmina sérica se determinan mediante métodos conocidos tales como resonancia de plasmones superficiales (SPR).

Dominio de unión al antígeno diana

Además de los dominios de CD3 y de ampliación de semivida descritos, las proteínas de unión multiespecíficas descritas en el presente documento en determinadas realizaciones también comprenden un dominio que se une a un antígeno diana. Un antígeno diana está implicado y/o asociado con una enfermedad, trastorno o afección. En particular, un antígeno diana asociado con una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral, una enfermedad inflamatoria, un trastorno inmunológico, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad infecciosa, una enfermedad vírica, una reacción alérgica, una reacción parasitaria, una enfermedad de injerto contra hospedador o una enfermedad de hospedador frente a injerto. En algunas realizaciones, un antígeno diana es un antígeno tumoral expresado en una célula tumoral. Como alternativa en algunas realizaciones, un antígeno diana se asocia con un patógeno, tal como un virus o una bacteria.

En algunas realizaciones, un antígeno diana es una molécula de superficie celular tal como una proteína, lípido o polisacárido. En algunas realizaciones, un antígeno diana está en una célula tumoral, célula infectada por virus, célula infectada por bacteria, glóbulo rojo dañado, célula de placa arterial o célula de tejido fibrótico.

El diseño de la proteína de unión multiespecífica que comprende una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla descrita en el presente documento permite al dominio de unión a un antígeno diana ser flexible en cuanto a que el dominio de unión a un antígeno diana puede ser cualquier tipo de dominio de unión, que incluye, pero sin limitación, dominios de un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones, el dominio de unión a un antígeno diana es un fragmento variable de cadena sencilla (scFv), un anticuerpo de dominio único, tal como un dominio variable de cadena pesada (VH), un dominio variable de cadena ligera (VL) y un dominio variable (VHH) de sdAb derivado de camélido. En otras realizaciones, el dominio de unión a un antígeno diana es un dominio de unión no de Ig, es decir, mimético de anticuerpos, tal como anticalinas, afilinas, moléculas affibody, afímeros, afitinas, alfacuerpos, avímeros, DARPin, finómeros, péptidos de dominio Kunitz y monocuerpos. En realizaciones adicionales, el dominio de unión a un antígeno diana es un ligando o péptido que se une o se asocia con un antígeno diana. En más realizaciones adicionales, el dominio de unión a un antígeno diana es una knotina. En más realizaciones adicionales, el dominio de unión a un antígeno diana es una entidad de molécula pequeña.

Modificaciones de proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla

Las proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla descritas en el presente documento abarcan derivados o análogos en los que (i) un aminoácido está sustituido con un resto de aminoácido que no es uno codificado por el código genético, (ii) el polipéptido maduro se fusiona con otro compuesto, tal como polietilenglicol o (iii) se fusionan aminoácidos adicionales con la proteína, tal como una secuencia líder o secretora o una secuencia para bloquear un dominio inmunogénico y/o para la purificación de la proteína.

Las modificaciones típicas incluyen, pero sin limitación, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfatidilinositol, reticulación, ciclación, la formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de enlaces cruzados covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de anclaje a GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas tal como arginilación y ubiquitinación.

Las modificaciones se realizan en cualquier parte de las proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla descritas en el presente documento, incluyendo la cadena principal peptídica, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos amino o carboxilo. Ciertas modificaciones peptídicas comunes que son útiles para la modificación de las proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla incluyen glicosilación, unión de lípidos, sulfatación, gamma-carboxilación de restos de ácido glutámico, hidroxilación, bloqueo del grupo amino o carboxilo en un polipéptido o de ambos, por una modificación covalente y ADP-ribosilación.

Polinucleótidos que codifican proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla

También se proporciona, en algunas realizaciones, son moléculas de polinucléotidos que codifican una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla o una proteína de unión multiespecífica que comprende una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla de acuerdo con la presente divulgación. En algunas realizaciones, las moléculas de polinucleótidos se proporcionan como una construcción de ADN. En otras realizaciones, las moléculas de polinucleótidos se proporcionan como un transcrito de ARN mensajero.

Las moléculas de polinucleótidos se construyen mediante métodos conocidos, tales como mediante la combinación de los genes que codifican los tres dominios de unión separados por enlazadores peptídicos o, en otras realizaciones, directamente enlazado mediante un enlace peptídico, en una construcción genética individual unida operativamente a un promotor adecuado y opcionalmente a un terminador de transcripción adecuado y expresarla en una bacteria u otro sistema de expresión adecuado, tal como, por ejemplo, células CHO. En las realizaciones donde el dominio de unión al antígeno diana es una molécula pequeña, los polinucleótidos contienen genes que codifican el dominio de unión a CD3 y el dominio de ampliación de semivida. En las realizaciones donde el dominio de ampliación de semivida es una molécula pequeña, los polinucleótidos contienen genes que codifican los dominios que se unen a CD3 y al antígeno diana. Dependiendo del sistema de vector y el hospedador utilizados, se puede usar cualquier número de elementos de transcripción y de traducción adecuados, incluidos los promotores constitutivos e inducibles. El promotor se selecciona de modo que dirige la expresión del polinucleótido en la célula hospedadora respectiva.

En algunas realizaciones, el polinucleótido se inserta en un vector, preferentemente un vector de expresión, que representa una realización adicional. Este vector recombinante puede construirse de acuerdo con métodos conocidos. Entre los vectores de interés particular se incluyen plásmidos, fagémidos, derivados de fagos, virus (por ejemplo, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus herpes, lentivirus y similares) y cósmidos.

Puede utilizarse una variedad de sistemas de expresión vector/hospedador para contener y expresar el polinucleótido que codifica el polipéptido de la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla descrita. Ejemplos de vectores de expresión para la expresión en E. coli son pSKK (Le Gall et al., J Immunol Methods. (2004) 285(1):111-27) o pcDNA5 (Invitrogen) para la expresión en células de mamífero, PICHIAPINK™ Yeast Expression Systems (Invitrogen), BACUVANCE™ Baculovirus Expression System (GenScript).

Por lo tanto, las proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla como se describe en el presente documento, en algunas realizaciones, se producen introduciendo un vector que codifica la proteína como se ha descrito anteriormente en una célula hospedadora y cultivando dicha célula hospedadora en condiciones de modo que se expresen los dominios de proteína, puedan aislarse y, opcionalmente, además purificarse.

Producción de proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla

En el presente documento, en algunas realizaciones, se divulga un procedimiento para la producción de una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende cultivar un hospedador transformado o transfectado con un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla en condiciones que permiten la expresión de la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla y recuperar y purificar la proteína producida a partir del cultivo.

En una realización adicional, se proporciona un procedimiento dirigido a mejorar una o más propiedades, por ejemplo afinidad, estabilidad, tolerancia al calor, reactividad cruzada, etc., de la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla y/o las proteínas de unión multiespecíficas que comprenden una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla como se describe en el presente documento, en comparación con un compuesto de unión de referencia. En algunas realizaciones, se proporciona una pluralidad de bibliotecas de sustitución única, cada una correspondiente a un dominio diferente, o segmento de aminoácidos de la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla o compuesto de unión de referencia de tal manera que cada miembro de la biblioteca de sustitución única codifica solo un único cambio de aminoácido en su correspondiente dominio o segmento de aminoácidos. (Esto permite que todas las sustituciones potenciales en una proteína grande o sitio de unión a proteína se prueben con unas pocas bibliotecas pequeñas.) En algunas realizaciones, la pluralidad de dominios forma o cubre una secuencia contigua de aminoácidos de la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla o un compuesto de unión de referencia. Las secuencias de nucleótidos de diferentes bibliotecas de sustitución única se superponen con las secuencias de nucleótidos de al menos otra biblioteca de sustitución única. En algunas realizaciones, se diseña una pluralidad de bibliotecas de sustitución única de modo que cada miembro se superponga a cada miembro de cada biblioteca de sustitución única que codifica un dominio adyacente.

Los compuestos de unión expresados a partir de tales bibliotecas de sustitución única se seleccionan por separado para obtener un subconjunto de variantes en cada biblioteca que tiene propiedades al menos tan buenas como las del compuesto de unión de referencia y cuya biblioteca resultante es de tamaño reducido. (Es decir, el número de ácidos nucleicos que codifican el conjunto seleccionado de compuestos de unión es menor que el número de ácidos nucleicos que codifican miembros de la biblioteca original de sustitución única). Tales propiedades incluyen, pero sin limitación, afinidad por un compuesto diana, estabilidad con respecto a diversas condiciones tales como calor, pH alto o bajo, degradación enzimática, reactividad cruzada con otras proteínas y similares. Los compuestos seleccionados de cada biblioteca de sustitución única se denominan en el presente documento indistintamente como "compuestos precandidatos", o "proteínas precandidatas". Las secuencias de ácido nucleico que codifican los compuestos precandidatos de las bibliotecas de sustitución única separadas se mezclan a continuación en una PCR para generar una biblioteca mezclada, usando técnicas de mezclado de genes basadas en PCR.

En el presente documento se describe un flujo de trabajo ilustrativo del proceso de cribado. Las bibliotecas de compuestos precandidatos se generan a partir de bibliotecas de sustitución única y se seleccionan para unirse a la proteína o proteínas diana, después de lo cual las bibliotecas de precandidatos se barajan para producir una biblioteca de ácidos nucleicos que codifican compuestos candidatos que, a su vez, se clonan en un vector de expresión conveniente, tal como un sistema de expresión fagémido. Los compuestos candidatos que expresan fagos se someten a una o más rondas de selección para mejorar las propiedades deseadas, tal como la afinidad de unión a una molécula diana. Las moléculas diana pueden adsorberse o unirse de otro modo a una superficie de un pocillo u otro recipiente de reacción, o las moléculas diana pueden derivatizarse con un resto de unión, tal como biotina, que después de la incubación con compuestos de unión candidatos pueden capturarse con un resto complementario, tal como estreptavidina, unida a perlas, tales como perlas magnéticas, para el lavado. En regímenes de selección ilustrativos, los compuestos de unión candidatos se someten a una etapa de lavado prolongada de modo que solo se seleccionan compuestos candidatos con tasas de disociación muy bajas de una molécula diana. Los tiempos de lavado ilustrativos para tales realizaciones son al menos 8 horas; o en otras realizaciones, al menos 24 horas; o en otras realizaciones, al menos 48 horas; o en otras realizaciones, al menos 72 horas. Los clones aislados después de la selección se amplifican y se someten a un ciclo adicional de selección o se analizan, por ejemplo, secuenciando y realizando mediciones comparativas de la afinidad de unión, por ejemplo, mediante ELISA, únión por resonancia de plasmones superficiales, interferometría de biocapa (por ejemplo, sistema Octet, ForteBio, Menlo Park, CA) o similares.

En algunas realizaciones, el proceso se implementa para identificar una o más proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla y/o una proteína de unión multiespecífica que comprende una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla con estabilidad térmica mejorada, reactividad cruzada mejorada a un conjunto seleccionado de dianas de unión en comparación con la de una proteína de unión a CD3 de referencia, tal como una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 22. Las bibliotecas de sustitución única se preparan variando los codones en las regiones VH y VL de la proteína de unión a CD3 de referencia, incluyendo ambos codones en regiones marco y en CDR; en otra realización, las ubicaciones donde se varían los codones comprenden las CDR de las cadenas pesada y ligera de la proteína de unión a CD3 de referencia, o un subconjunto de tales CDR, tal como únicamente CDR1, únicamente CDR2, únicamente CDR3, o pares de las mismas. En otra realización, las ubicaciones donde se varían los codones se producen únicamente en regiones marco. En algunas realizaciones, una biblioteca comprende cambios de codón único únicamente de una proteína de unión a CD3 de referencia únicamente en regiones de marco de numeración tanto de VH como de VL en el intervalo de 10 a 250. En otra realización, las ubicaciones donde se varían los codones comprenden las CDR3 de las cadenas pesada y ligera de la proteína de unión a CD3 de referencia, o un subconjunto de tales CDR3. En otra realización, el número de ubicaciones donde se varían los codones de las regiones de codificación de VH y VL está en el intervalo de 10 a 250, de tal manera que hasta 100 ubicaciones están en la región de marco. Después de la preparación de la biblioteca de sustitución única, como se ha señalado anteriormente, se llevan a cabo las siguientes etapas: (a) expresar por separado cada miembro de cada biblioteca de sustitución individual como una proteína precandidata; (b) seleccionar miembros de cada biblioteca de sustitución única que codifican proteínas precandidatas que se unen a una pareja de unión que difiere del objetivo de unión original [por ejemplo un objetivo u objetivos de reacción cruzada deseados]; (c) mezclar miembros de las bibliotecas seleccionadas en una PCR para producir una biblioteca mezclada combinatoria; (d) expresar miembros de la biblioteca mezclada como proteínas de unión a CD3 candidatas; y (e) seleccionar miembros de la biblioteca mezclada una o más veces para proteínas de unión a CD3 candidatas que se unen a la pareja de unión original y (f) seleccionar adicionalmente las proteínas candidatas para unirse a la(s) diana(s) de reacción cruzada deseada(s) proporcionando así una proteína de unión a CD3 codificada por ácido nucleico con reactividad cruzada aumentada para la una o más sustancias con respecto a la proteína de unión a CD3 de referencia sin pérdida de afinidad por el ligando original. En realizaciones adicionales, el método puede implementarse para obtener una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla con reactividad disminuida a una sustancia o sustancias o un compuesto o compuestos o un epítopo o epítopos de reactividad cruzada seleccionados sustituyendo la etapa (f) por la siguiente etapa: agotar los compuestos de unión candidatos una o más veces del subconjunto de la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla candidata que se une al compuesto de reactividad cruzada no deseado.

Composiciones farmacéuticas

También se proporciona, en algunas realizaciones, son composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla descrita en el presente documento, un vector que comprende el polinucleótido que codifica el polipéptido de la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla o una célula hospedadora transformada por este vector y al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye, pero sin limitación, cualquier vehículo que no interfiera con la eficacia de la actividad biológica de los principios activos y que no sea tóxico para el paciente a la que se administra. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Tales vehículos pueden formularse mediante métodos convencionales y pueden administrarse al sujeto en una dosis adecuada. Preferentemente, las composiciones son estériles. Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la acción de microorganismos puede asegurarse por la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos.

En algunas realizaciones de las composiciones farmacéuticas, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla descrita en el presente documento está encapsulada en nanopartículas. En algunas realizaciones, las nanopartículas son fulerenos, cristales líquidos, liposoma, puntos cuánticos, nanopartículas supermagnéticas, dendrímeros o nanorods. En otras realizaciones de las composiciones farmacéuticas, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla se une a liposomas. En algunos casos, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla se conjugan a la superficie de liposomas. En algunos casos, la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla se encapsulan dentro de la cubierta de un liposoma. En algunos casos, el liposoma es un liposoma catiónico.

Las proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla descritas en el presente documento se contemplan para su uso como medicamento. La administración se efectúa por diferentes vías, por ejemplo mediante administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica o intradérmica. En algunas realizaciones, la vía de administración depende del tipo de terapia y del tipo de compuesto contenido en la composición farmacéutica. El régimen de dosificación se determinará por el médico responsable y otros factores clínicos. Las dosificaciones para un paciente cualquiera dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, área superficial del cuerpo, la edad, el sexo, la composición a administrar en particular, tiempo y vía de administración, el tipo de terapia, salud general y otros fármacos que se hayan administrado al mismo tiempo. Una dosis eficaz se refiere a las cantidades del principio activo que son suficientes para afectar al recorrido y la gravedad de la enfermedad, conduciendo a la reducción o la remisión de tal patología y puede determinarse usando métodos conocidos.

Métodos de tratamiento

En el presente documento también se proporcionan, en algunas realizaciones, métodos y usos para estimular el sistema inmunitario de un individuo que lo necesita que comprenden la administración de una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla descrita en el presente documento. En algunos casos, la administración de una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla descrita en el presente documento incluye y/o sostiene la citotoxicidad hacia una célula que expresa un antígeno diana. En algunos casos, la célula que expresa un antígeno diana es un cáncer o célula tumoral, una célula infectada por virus, una célula infectada por bacterias, un linfocito T o B autorreactivo, glóbulos rojos dañados, placas arteriales o tejido fibrótico.

También se proporcionan en el presente documento métodos y usos para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección asociados con un antígeno diana que comprenden la administración a un individuo que lo necesita de una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla descrita en el presente documento. Las enfermedades, trastornos o afecciones asociados con un antígeno diana incluyen, pero sin limitación, la infección vírica, una infección bacteriana, enfermedad autoinmunitaria, rechazo de trasplante, aterosclerosis o fibrosis. En otras realizaciones, la enfermedad, trastorno o afección asociados con un antígeno diana es una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral, una enfermedad inflamatoria, un trastorno inmunológico, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad infecciosa, una enfermedad vírica, una reacción alérgica, una reacción parasitaria, una enfermedad de injerto contra hospedador o una enfermedad de hospedador frente a injerto. En una realización, la enfermedad, trastorno o afección asociados con un antígeno diana es cáncer. En un caso, el cáncer es un cáncer hematológico. En otro ejemplo, el cáncer un cáncer de tumor sólido.

Como se usa en el presente documento, en algunas realizaciones, "tratamiento" o "tratar" o "tratado" se refiere a un tratamiento terapéutico en donde el objetivo es ralentizar (disminuir) una condición fisiológica no deseada, trastorno o enfermedad, u obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los fines descritos en el presente documento, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero sin limitación, el alivio de los síntomas; la disminución del alcance de la afección, trastorno o enfermedad; la estabilización (es decir, no empeoramiento) del estado de la afección, trastorno o enfermedad; el retraso en la aparición o la ralentización de la progresión de la afección, trastorno o enfermedad; la mejoría de la afección, trastorno o patología; y la remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable, o la potenciación o mejoría de la afección, trastorno o enfermedad. El tratamiento incluye desencadenar una respuesta clínicamente significativa sin niveles excesivos de efectos secundarios. El tratamiento también incluye prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. En otras realizaciones, "tratamiento" o "tratar" o "tratado" se refiere a medidas profilácticas, en donde el objeto es retrasar la aparición o reducir la gravedad de una condición fisiológica no deseada, trastorno o enfermedad particular, tales como, por ejemplo, es una persona que está predispuesta a una enfermedad (por ejemplo, un individuo que porta un marcador genético de una enfermedad como el cáncer de mama).

En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, las proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla se administran en combinación con un agente para el tratamiento de la enfermedad particular, trastorno o afección. Los agentes incluyen, pero sin limitación, terapias que implican anticuerpos, moléculas pequeñas (por ejemplo, agentes quimioterapéuticos), hormonas (esteroidea, péptido y similares), radioterapias (rayos y, rayos X y/o el suministro dirigido de radioisótopos, microondas, radiación UV y similares), terapias génicas (por ejemplo, antisentido, terapia retrovírica y similares) y otras inmunoterapias. En algunas realizaciones, las proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla se administran junto con agentes antidiarreicos, agentes antieméticos, analgésicos, opioides y/o agentes antiinflamatorios no esteroideos. En algunas realizaciones, las proteínas de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla se administran antes, durante o después de la cirugía.

Ejemplos

Ejemplo 1: Identificación de variantes de scFv anti-CD3 con afinidades variables por CD3e humano

Caracterización del fago anti-CD3e parental

El anti-CD3£ parental mostró una unión buena a biotina-CD3£ y baja unión a biotina-HSA (Figura 1).

Bibliotecas de fagos de scFv anti-CD3e

Se proporcionó una biblioteca de sustitución única para los dominios de CDR1 de cadena pesada, CDR2 de cadena pesada, CDR3 de cadena pesada, CDR1 de cadena ligera, CDR2 de cadena ligera y CDR3 de cadena ligera. Los residuos de aminoácidos variados en cada dominio se ilustran en la región resaltada en la Figura 2. Los restos variaron uno cada vez a través de mutagénesis NNN.

Selección de clones y determinación de la afinidad de unión

Las bibliotecas de sustitución única se unieron a CD3<e>humano biotinilado, se lavaron, se eluyeron y se contaron. Se utilizó CD3 de macaco cangrejero biotinilado como la diana de selección de la ronda 1 y se lavó durante 4 horas después de la unión de fago combinatoria a partir de las dos bibliotecas independientes (~2x selección). Se utilizó hu-CD3 biotinilado como el objetivo de selección de la ronda 2 y se lavó durante 3 horas después de la unión de ambas bibliotecas (<2x selección). Los insertos sometidos a PCR de la segunda ronda de selección se subclonaron en el vector de expresión de His6 pcDNA3.4 ("His6" divulgada como SEQ ID NO: 105). Se seleccionaron 180 clones y el ADN se purificó, se secuenció y se transfectó en Expi293. Se seleccionó un panel de dieciséis clones con una gama de afinidades por CD3<e>humano para una determinación de Kd más precisa (Figura 3).

Ejemplo 2: Ensayo de citotoxicidad

Un anticuerpo biespecífico dirigido a CD20 y CD3, que contiene una variante de scFv anti-CD3 identificada en el Ejemplo 1 se evalúa in vitro en su mediación de la citotoxicidad dependiente de linfocitos T para células diana CD20+.

Se incubaron células CD20+ REC-1 marcadas con fluorescencia (una línea celular de linfoma de células del manto, ATCC CRL-3004) con PBMC aisladas de donantes aleatorios o linfocitos CB 15 T (línea de linfocitos T estandarizada) como células efectoras en presencia del anticuerpo biespecífico CD20-CD3 que contiene una variante de scFv anti-CD3 identificada en el Ejemplo 1. Tras la incubación durante 4 h a 37 °C en una incubadora humidificada, la liberación del tinte fluorescente de las células diana al sobrenadante se determina en un espectrofluorómetro. Las células diana incubadas sin el anticuerpo biespecífico CD20-CD3 que contiene una variante de scFv anti-CD3 identificada en el Ejemplo 1 y las células diana totalmente lisadas mediante la adición de saponina al final de la incubación, sirven como controles negativos y positivos, respectivamente.

Basándose en las células diana vivas restantes medidas, el porcentaje de lisis celular específica se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula: [1-(número de dianas vivas<(muestra)>/número de dianas vivas<(espontánea)>)] x 100 %. Las curvas de respuesta a la dosis sigmoidea y los valores de CE<50>se calculan mediante regresión no lineal/ajuste logístico de 4 parámetros utilizando el software de GraphPad. Los valores de lisis obtenidos para una concentración de variante dada se utilizan para calcular las curvas de respuesta a la dosis sigmoideas mediante un análisis de ajuste logístico de 4 parámetros utilizando el software Prism.

Ejemplo 3: Estabilidad térmica de variantes de scFv anti-CD3 con afinidades variables por Cd3e humano

La temperatura de exposición hidrófoba (T<h>) de una proteína corresponde a la derivada del punto de inflexión del pico de fluorescencia del colorante y se sabe que se correlaciona con la temperatura de fusión (T<m>), que es una medida de la estabilidad de la proteína. El objetivo de este estudio fue evaluar la T<h>para varias variantes de scFv anti-CD3£ humano.

Producción de proteínas

Se clonaron secuencias de dominios de unión a scFv anti-CD3£ humano en pcDNA3.4 (Invitrogen), precedido por una secuencia líder y seguido por un marcador de 6x histidina (SEQ ID NO: 105). Se mantuvieron las células Expi293F (Life Technologies A14527) en suspensión en matraces Optimum Growth (Thomson) entre 0,2 a 8 x 1e6 células/ml en medios Expi 293. El ADN plasmídico purificado se transfectó en células Expi293F de acuerdo con los protocolos del kit del sistema de expresión Expi293 (Life Technologies, A14635) y se mantuvo durante 4-6 días tras la transfección. Los medios condicionados se purificaron parcialmente por cromatografía de afinidad y desalación. Las proteínas de scFv anti-CD3£ humano se concentraron con unidades de filtración centrífuga Amicon Ultra (EMD Millipore), se aplicaron a medios de exclusión por tamaño Superdex 200 (GE Healthcare) y se resolvieron en un tampón neutro que contiene excipientes. La combinación de fracciones y la pureza final se evaluaron mediante SDS-PAGE y SEC analítica (cromatorafía de exclusión por tamaño). La absorbancia de las soluciones de proteína purificada se determinó a 280 nm usando un SpectraMax M2 (Molecular Devices) y placas de 96 pocillos transparentes a los rayos UV (Corning 3635) y sus concentraciones se calcularon a partir de los coeficientes de extinción molar.

Fluorimetría de barrido diferencial

Las proteínas de scFv anti-CD3£ humano se diluyeron a cocentraciones que oscilaban entre 0,2 y 0,25 mg/ml junto con 5x colorante naranja SYPRO (Life Technologies S6651) en una concentración final de DMSO al 0,15% en un tampón neutro que contenía excipientes en microplacas ópticas MicroAmp EnduraPlate y película adhesiva (Applied Biosystems 4483485 y 4311971). Se cargó una placa que contenía mezclas de proteína y colorante diluidas en un instrumento de PCR en tiempo real ABI 7500 Fast (Applied Biosytems) y se sometió a un gradiente térmico de múltiples etapas de 25 °C a 95 °C. El gradiente térmico estaba constituido por una retención de dos minutos en cada etapa de un grado Celsius con excitación a 500 nm y emisión recogida con un filtro ROX. T<h>en grados centígrados se presenta, para varias variantes de proteína de scFv anti-CD3£ purificadas, en la Figura 4.

continuación

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla, que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9.

2. La proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla de la reivindicación 1, en donde dicha proteína comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

3. La proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.

4. Un polinucleótido que codifica una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 4.

6. Una célula hospedadora transformada con el vector de acuerdo con la reivindicación 5.

7. Una composición farmacéutica que comprende (i) una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, el polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 4, el vector de acuerdo con la reivindicación 5 o la célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. Un procedimiento para la producción de una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, comprendiendo dicho procedimiento cultivar un hospedador transformado o transfectado con un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en condiciones que permiten la expresión de la proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla y recuperar y purificar la proteína producida a partir del cultivo.

9. La proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para su uso en un método para el tratamiento o la mejora de un cáncer en un sujeto que lo necesita, en donde el cáncer es al menos uno de: un cáncer hematológico o un cáncer de tumor sólido.

10. Una proteína de unión multiespecífica que comprende una proteína de unión a CD3 de fragmento variable de cadena sencilla de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

11. La proteína de unión multiespecífica de la reivindicación 10, que comprende además un dominio de unión a antígeno diana y un dominio de unión a HSA (albúmina sérica humana).

12. La proteína de unión multiespecífica de las reivindicaciones 10 u 11 para su uso en un método para el tratamiento o la mejora de un cáncer en un sujeto que lo necesita, en donde el cáncer es al menos uno de: un cáncer hematológico o un cáncer de tumor sólido.