ES3036447T3 - New strain of lactobacillus reuteri - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la cepa de Lactobacillus reuteri LMG P-27481, que posee actividad antiinflamatoria, inmunomoduladora y capacidad para inhibir microorganismos patógenos. Este microorganismo puede resultar útil como probiótico para mejorar la salud humana y prevenir y/o tratar trastornos gastrointestinales, en particular el tratamiento de la diarrea causada por Clostridium difficile. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas, alimentos o dispositivos médicos que contienen la cepa de Lactobacillus reuteri LMG P-27481. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Nueva cepa deLactobacillus reuteri

La presente invención se refiere a la cepa deLactobacillus reuteriLMG P-27481 dotada de actividad antiinflamatoria, actividad inmunomoduladora y capacidad de inhibición de microorganismos patógenos. El microorganismo puede resultar útil y contribuir como probiótico a la mejora del estado de salud del hombre y a la prevención y/o el tratamiento de trastornos gastrointestinales, con referencia especial al tratamiento de la diarrea causada porClostridium difficile.La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas o productos alimenticios o productos médicos que comprenden la cepa deLactobacillus reuteriLMG P-27481.

Estado de la técnica anterior

La diarrea es un trastorno de la defecación caracterizado por un aumento de la emisión de una cantidad diaria de heces superior a 200 g con disminución de la consistencia de las mismas y por un aumento de la frecuencia de las evacuaciones intestinales. Puede ser aguda si la duración es menor a dos semanas, persistente si está comprendida entre dos y cuatro semanas y crónica si tiene una duración superior (1). La diarrea aguda en el 70 % de los casos la desencadenan agentes infecciosos (tales comoStaphylococcus aureus, Escherichia coli, Clostridium difficile,Salmonellaspp., Norovirus, etc.), pero también puede ser debida a la utilización de fármacos (por ejemplo, antibióticos, sustancias quimioterapéuticas), o a algunas patologías (diverticulitis, isquemia intestinal, alergias o intolerancias). La diarrea aguda debida a una causa infecciosa es un problema grave en los países en desarrollo, sobre todo para la población pediátrica, en la que anualmente mueren, como mínimo, 4 millones de niños menores de 5 años. Esta patología, de hecho, puede propagarse fácilmente en zonas que se encuentran en condiciones higiénico-sanitarias precarias: falta de agua potable, sobrepoblación, presencia de residuos no eliminados, cocción inadecuada de algunos tipos de alimentos. La diarrea debida a causas infecciosas puede ir acompañada de otros síntomas, que dependen del tipo de microorganismo responsable del estado patológico. Se pueden presentar náuseas, vómitos, fiebre y la diarrea puede ser acuosa o sanguinolenta. Los microorganismos capaces de invadir el epitelio intestinal(Salmonella, Shigella,etc.) o de producir toxinas citotóxicas(Clostridium difficile)determinan dolor abdominal, fiebre alta y diarrea sanguinolenta. En lo que se refiere al tratamiento, dado que la diarrea es la expresión de un proceso patológico subyacente, el fármaco antidiarreico puede ser solo una medida paliativa, hasta que el propio organismo o el médico encuentren un remedio para la causa subyacente. En primer lugar, la diarrea altera el equilibrio hidroelectrolítico del organismo, por lo tanto, incluso antes de la administración de fármacos antidiarreicos, es necesario proporcionar la reintegración de líquidos, sales y azúcares. Para este objetivo existen en el mercado soluciones de rehidratación oral específicas, que contienen electrolitos y glucosa, siendo recomendada su utilización tanto por la OMS (Organización Mundial de la Salud) como por las compañías pediátricas internacionales (ESPGHAN, ESPID) (2). En los casos más graves se puede recurrir a la utilización de soluciones electrolíticas por vía intravenosa. En caso de diarrea aguda debida a infección bacteriana la terapia mediante antibióticos es controvertida, ya que a menudo estas infecciones tienden a autolimitarse y la propia diarrea contribuye a reducir el recuento microbiano intestinal.

Por el contrario, una alternativa pueden ser los probióticos, cuya utilización se ha revelado como eficaz en la prevención y el tratamiento de la mayoría de las tipologías de diarrea (diarrea aguda por Rotavirus y diarrea infecciosa, diarrea asociada a la ingestión de antibióticos, diarrea porClostridium difficile,diarrea por radioterapia, diarrea del viajero, diarrea por nutrición enteral, etc.), a través de la inhibición competitiva de los patógenos, la estabilización de la microbiota residente y la mitigación del aumento de la permeabilidad intestinal, por ejemplo, asociada a las infecciones por Rotavirus.

Sin embargo, según los metaanálisis más recientes, la eficacia de los probióticos no parece estar confirmada por datos clínicos en el caso de algunas diarreas, tales como la diarrea del viajero (3). Además, actualmente, los mayores registros sobre la eficacia de los probióticos sustancialmente se limitan a los pacientes pediátricos, en los que la acción beneficiosa de los probióticos se expresaría principalmente a través de la reducción en la duración de los estados de diarrea y fiebre, pero no en el número de evacuaciones diarias y síntomas secundarios, por ejemplo, vómitos. En los adultos, en cambio, la acción beneficiosa de los probióticos no ha sido totalmente demostrada, aunque se puede suponer que los resultados obtenidos en niños pueden extenderse también a la población adulta. Además, cabe destacar que no todos los probióticos resultaron ser eficaces y que las posibles ventajas son absolutamente específicas de cada cepa, aparte del hecho de que la mayoría de los estudios disponibles se refieren a la diarrea por Rotavirus (3).

Los probióticos, también llamados comúnmente fermentos lácticos, se pueden definir como microorganismos vivos que, una vez ingeridos en cantidades adecuadas, ejercen efectos beneficiosos sobre la salud de quien los ingiere (4-6). Los fermentos lácticos incluyen, de hecho, microorganismos y, precisamente, bacterias lácticas vivas y vitales, es decir capaces de reproducirse (5-7).

Las cepas de bacterias incluidas en las diferentes preparaciones de fermentos son diversas (8). Los microorganismos incluidos en los fermentos lácticos, para que sean eficaces y bien tolerados durante el tratamiento, deben presentar, en primer lugar, características particulares y exactamente (4,5):

• no deben ser patógenos ni causar infecciones u otras patologías a quien los ingiera.

• deben ser capaces de resistir la acidez del ácido gástrico y la bilis.

• deben ser capaces de colonizar, como mínimo, temporalmente, el intestino

• deben ser capaces de producir sustancias antimicrobianas (es decir, activas contra otros microorganismos peligrosos para nuestro organismo).

Los fermentos lácticos no actúan únicamente restableciendo el equilibrio de la microflora intestinal (9), tal como se creía hace algún tiempo, sino que resultó que, entre los principales mecanismos de acción, pueden determinar un efecto:

• de tipo protector, sobre todo contra las infecciones de la mucosa intestinal (4,5)

• de modulación positiva del sistema inmune (4,5)

• de inhibición de la adhesión sobre la pared intestinal y, por tanto, del crecimiento de las bacterias patógenas (5)

Entonces, desde el punto de vista clínico, los fermentos lácticos se estudiaron, sobre todo, para la prevención y el tratamiento de diferentes patologías intestinales (8). En la gastroenteritis, por ejemplo, la administración de fermentos lácticos permitió alcanzar una reducción de la sintomatología en menos tiempo (10). En las diarreas de origen infeccioso la administración de fermentos lácticos demostró ser eficaz en la reducción tanto de la duración como de la gravedad de la diarrea (11). En las diarreas debidas a la ingesta de antibióticos (situación que afecta a 1 individuo de cada 5 que ingieren antibióticos), en las que los propios antibióticos determinan una alteración de la microflora intestinal, la administración de algunos fermentos lácticos que contienen cantidades adecuadas de bacterias disminuyó tanto el riesgo de desarrollar diarrea durante el tratamiento antibiótico, como la duración y la gravedad de la diarrea una vez se había presentado la misma (10). En el síndrome del intestino irritable (SII) la ingestión de fermentos lácticos demostró una reducción significativa del dolor y la hinchazón abdominal (8).

En la diarrea del viajero la administración preventiva de probióticos determinó una protección bastante buena contra la colonización del intestino por bacterias que podrían haber causado infecciones intestinales (9). En la enfermedad inflamatoria intestinal crónica (enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa) la utilización de fermentos lácticos dio algunos resultados positivos sobre todo en términos de mantenimiento de la remisión de los síntomas (12).

Además, existen diversas patentes relacionadas, en general, con la utilización de probióticos, solos o en asociación con prebióticos, en la prevención o el tratamiento de patologías intestinales, con referencia particular a la patología diarreica (Patentes US20110014167A1; US005837238A; WO2002070670A1; EP2753687A1) (13-16).

En particular, la Patente US20110014167A1 se refiere a una combinación de un protobiótico(Lactobacillus rhamnosus),un prebiótico (inulina) y fibras (polisacáridos de soja) para el tratamiento de la diarrea, en particular la diarrea aguda. El documento reivindica la combinación de los efectos beneficiosos de los distintos componentes de la composición sobre la disminución de los efectos diarreicos, la estimulación del sistema inmune, la mejora de la microflora intestinal y los efectos antipatogénicos. Los límites de dicha invención son el hecho de que, de forma preferente, se trata de una formulación líquida, orientada a las necesidades nutricionales de lactantes menores de 3 años y, de forma más preferente, menores de 12 meses. Por lo tanto, una solución de rehidratación específica para niños prematuros, nacidos a término o en período de destete hacia la alimentación sólida, que por diversos motivos pueden estar sujetos a una alteración de la microflora intestinal aún no bien formada y, en consecuencia, a la aparición de formas diarreicas de diferente origen, no necesariamente ligadas a la presencia de patógenos, tales como Rotavirus,Salmonella, C. difficileo a la utilización de antibióticos.

La Patente US005837238A, en cambio, se refiere a la utilización de una o más cepas deLactobacillus reuterien el tratamiento de la diarrea, en particular la diarrea causada por Rotavirus. La invención da a conocer la administración de las células bacterianas liofilizadas en una suspensión líquida (agua, zumo de fruta, leche, yogur, etc.) o, de forma alternativa, en cápsulas de gelatina, a una concentración de, como mínimo, 108 células por día, durante un período de uno a siete días, dependiendo de la gravedad de la gastroenteritis, para disminuir la diarrea y los vómitos. Para apoyar tal indicación se menciona un estudio clínico con enmascaramiento doble, en el que la cepaL. reuteriSD2112 dio lugar a una disminución de la duración de la diarrea acuosa y los vómitos en niños de 6 y 36 meses de edad. El 75 % de los pacientes tratados estaban afectados por Rotavirus. No se mostró ninguna evidencia que apoyara posibles efectos positivos de la presente invención sobre otros patógenos intestinales, tales comoShigella, Salmonella, S. aureusoC.

difficile.

La Patente W02002070670A1 se refiere a la cepaLactobacillus reuteriProbio-16 y a sus características de inhibiciónin vitrode Rotavirus y otros organismos patógenos. La bacteria en cuestión fue aislada de cerdos, por lo tanto, no tiene origen humano, y la patente no muestra ningún estudio relacionado con la ingestión de la misma, durante periodos cortos o largos, por el hombre, lo que constituye una gran limitación en términos de seguridad de utilización para un probiótico.

La patente EP2753687A1 se refiere a la utilización de una o más cepas bacterianas, pertenecientes al géneroLactobacillusy/oBifidobacteria,para inhibir o disminuir el crecimiento de diversos biotipos deE. coliy de Clostridia, incluyendoC. difficile, Listeria monocytogenes, Enterococcus sp.yKlebsiella sp.Sin embargo, dicho documento solo muestra evidenciain vitrode la actividad inhibidora de las varias bacterias estudiadas y no menciona tampoco estudios en animales o en el hombre que, por un lado, podrían confirmar la eficaciain vivo,y, por otro lado, ser evidencia del perfil de seguridad de utilización.

Szajewska H et al “Meta-analysis:Lactobacillus reuteristrain DSM 17938 (and the original strain ATCC 55730) for treating acute gastroenteritis in children”, y Miglena Georgieva et al “USE OF THE PROBIOTICLactobacillus reuteriDSM 17938 IN THE PREVENTION OF ANTIBIOTIC-ASSOCIATED INFECTIONS IN HOSPITALIZED BULGARIAN CHILDREN: A RANDOMIZED, CONTROLLED TRIAL” dan a conocer la utilización de una cepa deL. reuteri(DSM 17938) para el tratamiento de la diarrea inducida porC. difficile.Todos los documentos anteriores no lograron resolver completamente el problema del tratamiento de los trastornos diarreicos, en particular los causados por infecciones porClostridium difficile,bien porque en general trataban el problema diarreico como un síntoma de una enfermedad subyacente, o porque no mostraban pruebas directas del efecto del tratamiento sobreC. difficile.Actualmente se ha descubierto de forma sorprendente que la cepaLactobacillus reuteriLMG P-27481 consigue superar los problemas del estado de la técnica anterior ya que posee propiedades probióticas óptimas, en términos de colonización, resistencia a los ácidos gástricos y a las sales biliares, perfil de seguridad y estimulación del sistema inmune. Además, esta cepa demostró una importante capacidad antimicrobiana contra los patógenos intestinales más comunes (por ejemplo,E. col, Salmonella,Rotavirus) y, más en particular, contra el patógenoClostridium difficile,el crecimiento de los mismos se reduce fuertemente, tanto en pruebasin vitrocomo en experimentos con animales. Por estas razones la cepaLactobacillus reuteriLMG P-27481 se ofrece como candidato óptimo en la prevención y el tratamiento de la patología diarreica, especialmente la inducida porC. difficile.

Los lactobacilos son microorganismos ampliamente presentes en la naturaleza, metabolizan anaeróbicamente los carbohidratos para producir ácido láctico. Son muy utilizados por sus propiedades probióticas y resultan útiles para el equilibrio de la flora intestinal.

Lactobacillus reuteries una especie bacteriana perteneciente al géneroLactobacillus,filoFirmicutes,representada en el tracto gastroentérico humano y animal, con crecimiento óptimo a 37 °C y perfil heterofermentativo obligado, lo que da lugar a la formación de dióxido de carbono, etanol, ácido acético, ácido láctico, después de la fermentación de azúcares. Además,L. reuteriproduce sustancias antimicrobianas, así como folato y cobalamina (vitamina B12).

La presente invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjuntas.

La presente invención se refiere a:

1. la cepa deLactobacillus reuteriLMG P-27481

2. la cepa deLactobacillus reuteriLMG P-27481 para su utilización en el tratamiento de infecciones diarreicas inducidas porClostridium difficile

3. composiciones farmacéuticas para el tratamiento de infecciones diarreicas inducidas porClostridium difficile

4. complementos alimenticios y productos médicos útiles en el tratamiento de las infecciones diarreicas inducidas porClostridium difficile

Descripción breve de las figuras

Las siguientes figuras se adjuntan a la presente descripción:

Figura 1 Supervivenciain vitrode la cepaL. reuteriLMG P-27481 al tránsito gástrico

Figura 2 Resistencia de la cepaL. reuteriLMG P-27481 a las sales biliares

Figura 3 Análisis de las células y los sobrenadantes para la expresión de los marcadores de Interleucina 10 Figura 4 Análisis de las células y los sobrenadantes para la expresión de los marcadores de Interleucina 12 Figura 5 Determinación del índice antiinflamatorio deL. reuteriLMG P-27481 y de las cepas de referencia Figura 6 Peso corporal de los animales en la infección espontánea por CD después de tratamiento antibiótico.

Se muestra la comparación del peso corporal de los ratones entre el inicio del tratamiento (columna blanca) y el final del tratamiento (columna negra). El grupo 1 (control) no recibió ningún tratamiento. El grupo 2 recibió solo antibiótico durante 2 semanas. El grupo 3 recibió terapia antibiótica durante 2 semanas y tratamiento concomitante con probiótico. (*) aportado estadísticamente significativo con respecto a los mismos animales al inicio del tratamiento.

Figura 7 Niveles de inflamación de la mucosa, expresados en términos de actividad de mieloperoxidasa (MPO), en la membrana mucosa del colon de animales que desarrollaron infección espontánea por CD después de terapia con antibióticos. El grupo 1 (control) no recibió ningún tratamiento. El grupo 2 recibió solo antibiótico durante 2 semanas. El grupo 3 recibió terapia antibiótica durante 2 semanas y tratamiento concomitante con probiótico. (*) aportado estadísticamente significativo con respecto al grupo tratado con antibiótico durante 2 semanas (grupo 2).

Figura 8 Peso corporal de los animales en la infección inducida por CD después del tratamiento antibiótico. El grupo 1 (control) no recibió ningún tratamiento. El grupo 2 recibió antibiótico y expuesto a CD. El grupo 3 recibió la terapia antibiótica, CD yL. reuteriLMG P-27481 antes de finalizar la terapia antibiótica. El grupo 4 recibió la terapia antibiótica, c D yL. reuteriLMG P-27481 después de la expuesto a CD. (*) aportado estadísticamente significativo con respecto a los mismos animales al inicio del tratamiento.

Figura 9 Detección de ADN de CD mediante RT-PCR en las muestras de heces de los diferentes grupos experimentales. El grupo 2 recibió antibiótico y expuesto a CD. El grupo 3 recibió la terapia antibiótica, CD yL. reuteriLMG P-27481 antes de finalizar la terapia antibiótica. El grupo 4 recibió la terapia antibiótica, CD yL reuteriLMG P-27481 después de la expuesto a CD. (*) aportado estadísticamente significativo con respecto al grupo 2.

Figura 10 Niveles de inflamación de la mucosa, expresados en términos de actividad de MPO, en la membrana mucosa intestinal de animales con infección inducida por CD después de terapia antibiótica. El grupo 1 (control) no recibió ningún tratamiento. El grupo 2 recibió antibiótico y expuesto a CD. El grupo 3 recibió la terapia antibiótica, CD yL. reuteriLMG P-27481 antes de finalizar la terapia antibiótica. El grupo 4 recibió la terapia antibiótica, c D yL. reuteriLMG P-27481 después de la expuesto a CD. (*) aportado estadísticamente significativo con respecto al grupo 2.

Descripción de la invención

La cepa a la que se refiere la presente invención esLactobacillus reuteriLMG P-27481, presentada el 1 de marzo de 2013 en el centro para la colección de microorganismos BCCM/LMG Bacteria Collection de la universidad de Gante (Bélgica), autorizado en virtud del Tratado de Budapest por Moviscom srl (Via dei Pirenei 10 00144 Roma, Italia) y posteriormente, el 13 de febrero de 2015, cedida definitivamente a Probioresearch srl, incluyendo el derecho a hacer referencia al material biológico presentado en la solicitud de patente y el consentimiento incondicional e irrevocable para que dicho material se ponga a disposición del público, de conformidad con la Regla 33 de la EPC.

Dicha cepa se estudió en detalle para su caracterización genética y sus características funcionales con el fin de identificar su actividad probiótica mediante:

• Aislamiento y purificación

• Identificación taxonómica

• Bioseguridad

• Evaluaciones funcionalesin vitro

Aislamiento y purificación

El aislamiento de la cepa se llevó a cabo mediante el cribado de 21 muestras fecales de otros tantos niños sanos de edades comprendidas entre 6 meses y 4,5 años de edad. Estas muestras se obtuvieron con el consentimiento informado de los padres de los niños.

Identificación taxonómica

La cepa fue sometida a la identificación taxonómica mediante la identificación específica de género, especie y cepa llevada a cabo con la técnica de PCR.

La secuenciación del gen codificante del ARNr 16S se llevó a cabo, además, mediante amplificación del ADN y posterior visualización y cuantificación en gel de agarosa. La secuenciación se comprobó con respecto a un control positivo de otra cepa conocida deLactobacillus reuteri.

En lo que se refiere abioseguridadde la cepaL. reuteriLMG P-27184:

se estudiaron

• la sensibilidad a los antibióticos

• el perfil de plásmidos

Sensibilidad a los antibióticos

Se determinaron las concentraciones mínimas inhibidoras (CMI) de 15 antibióticos utilizando el procedimiento de la norma ISO 10932:2010 tal como se sugiere en la Opinión Científica EFSA 2012 (17). Como control interno de la eficacia y fiabilidad de las pruebas realizadas, se tomó la cepaLactobacillus paracaseiATCC 334 de acuerdo con la norma ISO mencionada anteriormente.

La cepaLactobacillus reuteriLMG P-27481 resultó ser sensible a todos los antibióticos considerados por la EFSA al definir los puntos de corte para la especieL. reuteri.La cepa, por tanto, está dotada del requisito fundamental de sensibilidad a los antibióticos necesario para garantizar la seguridad de su utilización en el hombre.

Perfil de plásmidos

Se verificó la presencia de plásmidos para comprobar el posible efecto de la transmisión genética de la resistencia a los antibióticos. La cepa fue sometida a la extracción de plásmidos mediante lisis alcalina por Anderson & McKay 1983 (18) con la finalidad de verificar la presencia de elementos genéticos móviles dentro de las células de la cepa. Para la cepaLactobacillus reuteriLMG P-27481 se observó la ausencia de plásmidos. Este dato es especialmente importante ya que no permite la transmisión genética de resistencia a los antibióticos por parte de la cepa sometida a prueba.

Para lacaracterización funcional in vitrode la cepa se determinaron los siguientes parámetros:

• Tolerancia al tránsito gástrico

• Tolerancia al tránsito intestinal

• Producción de peróxido de hidrógeno

Tolerancia al tránsito gástrico

El análisis de resistencia de la cepa al ácido gástrico simulado se llevó a cabo según las indicaciones proporcionadas por Charteris et al. 1998 (19), utilizando como cepa de referencia laLactobacillus reuteriRC-14. Se observó una capacidad significativa de la cepa LMG P-27481 de sobrevivir al tránsito gástrico simulado, al contrario de lo encontrado para la cepa de referencia. Después de 3 horas de contacto con el ácido gástrico simulado la vitalidad deL. reuterilMg P-27481 resultó ser todavía óptima, mientras que para la cepa de referencia se observó una pérdida de vitalidad elevada (correspondiente a 2,76 Iog10 UFC/ml) (figura 1).

Tolerancia al tránsito intestinal

Se determinó la capacidad de la cepa para resistir las condiciones de tránsito intestinal mediante la exposición al jugo pancreático y sales biliares simulados, mediante ensayosin vitro.Como referencia se utilizó la cepa deLactobacillus reuteriRC-14.

> Toleranciaal jugo pancreático simulado

La tolerancia al jugo pancreático simulado se llevó a cabo según las indicaciones proporcionadas por Charteris et al. 1998 (19).

Lactobacillus reuteriLMG P-27481 mostró una fuerte resistencia a la exposición al jugo pancreático simulado con hasta 4 horas de coincubación. Incluso la cepa de referencia manifestó una buena tolerancia, aunque en menor medida queL. reuteriLMG P-27481 (tabla 1).

Tabla 1

> La tolerancia a las sales biliares

El análisis se realizó comparando la capacidad de la cepaL. reuteriLMG P-27481 con respecto aL. reuteriRC-14 de crecimiento en medio selectivo para lactobacilos con y sin la adición del 0,3 % de sales biliares liofilizadas. Los microorganismos se incubaron a 37 °C durante aproximadamente 6 horas en microaerofilia monitorizando el crecimiento cada hora durante el período de incubación. El procedimiento de referencia es el de Gilliland et al. 1984 (20).

La dinámica de sensibilidad de las cepas a la presencia de bilis en el medio de cultivo se representa en la figura 2.Lactobacillus reuteriLMG P-27481 muestra una buena tolerancia a la bilis, mientras que la cepa de referencia manifiesta una mayor susceptibilidad con marcada reducción de la densidad óptica con respecto a su propio control cultivado en medio normal sin adición de bilis.

Producción de peróxido de hidrógeno

La producción de peróxido de hidrógeno por la cepa se determinó por vía cuantitativa según el procedimiento de Yap & Gilliland 2000 (21). Los resultados, mostrados en la tabla 2, muestran los niveles de H2O2 producidos después de 1 y 24 horas de incubación a 5 °C en condiciones de microaerofilia.

Tabla 2

La cepaL. reuteriLMG P-27481, caracterizada tal como se describió anteriormente, demostró tener actividad probiótica y se estudió más a fondo para comprobar si sería adecuada para prevenir/tratar diarreas de diversos orígenes.

Dentro de la caracterización de la eficacia de esta cepa en el tratamiento y/o la prevención de la diarrea, se tomaron en consideración otras cepas probióticas de referencia con el fin de verificar y cuantificar el efecto de la cepa en estudio. En particular, las cepas bacterianas utilizadas como referencia fueron:

-Lactobacillus reuteriDSM 17938;

-Lactobacillus rhamnosusATCC 53103 (también conocida como LGG®)

Se escogió utilizar exactamente estas dos cepas como referencia, dado que existe una amplia literatura relacionada con sus efectos en el tratamiento de la diarrea, en particular la diarrea aguda. La presente invención también se refiere a:

• composiciones farmacéuticas que comprenden la cepa a la que se refiere la presente invención y aditivos tolerables farmacéuticamente y a su utilización en el tratamiento de infecciones diarreicas debidas aClostridium difficile.

•productos médicos que comprenden la cepa, según las reivindicaciones 1 a 3, y aditivos habitualmente utilizados en el sector para su utilización en el tratamiento de infecciones diarreicas inducidas porClostridium difficile

•complementos alimenticios que comprenden la cepa de la presente invención y aditivos tolerables nutracéuticamente útiles en el tratamiento de infecciones diarreicas inducidas porClostridium difficile.

Sección VIII: Ejemplos

Ejemplo 1

Actividad inhibidora de L. reuteri LMG P-27481 contra bacterias patógenas intestinales

Objetivo: comprobar la capacidad de las cepas de prueba para ejercer una acción inhibidora contra patógenos intestinales.

Los patógenos utilizados en los ensayos fueron obtenidos de TCC y de Colección de Cultivos, Universidad de Gotemburgo (Suecia). Las cepas bacterianas se mantuvieron en agar Rogosa(L. reuteri y L. rhamnosus),LB(E. col, S. aureus, Salmonella)y BHI (C.difficile).El Rotavirus (ATCC VR-2018) se extendió y tituló en células MA-104 (riñón de mono rhesus).

Las dos cepas deL. reuteriyL. rhamnosusse inocularon por separado a concentraciones de 107 UFC/ml y se cultivaron en caldo MRS durante 24 horas en anaerobiosis. Al final de la incubación se centrifugó el cultivo (13.000 g a 4 °C), se filtró el sobrenadante (0,22 pm) y se corrigió el pH a 7,0. A continuación, este medio se inoculó conE. col, S. aureus, SalmonellaoC. difficile(107 UFC/ml) y se incubó a 37 °C. Se recogió una alícuota del medio a diferentes intervalos de tiempo (6, 12 y 24 horas desde el inóculo) y las bacterias vivas se cuantificaron mediante recuento microbiano vital con diluciones en serie sembradas en placas de medio agarizado adecuadas, incubadas a 37 °C en aerobiosis(E. col, S. aureus, Salmonella)o anaerobiosis (C.

difficile).

Para cada ensayo se llevaron a cabo 3 experimentos con determinaciones por triplicado.

Tabla 3

Tabla 4

Tabla 5

Tabla 6

A partir de los resultados se observa que ambas cepas deL. reuterireducen el crecimiento de los patógenos intestinales Gram negativosE. coliySalmonella,en una medida similar.Lactobacillus rhamnosusATCC 53103 no muestra ninguna actividad inhibidora contraE. coliy una acción claramente inferior frente aSalmonella.En cuanto a S.aureus,se observa una actividad inhibidora mínima para las 2 cepas deL. reuteri,mientras queL. rhamnosusno muestra ninguna actividad ni siquiera hacia este microorganismo (tablas 3, 4 y 5).

C. difficilese debería discutir aparte, dado que solo la cepaL. reuteriLMG P-27481 demostró ser capaz de reducir significativamente su crecimiento (tabla 6).

Ejemplo 2

Actividad inhibidora de L. reuteri LMG P-27481 contra Rotavirus

El objetivo de estos experimentos fue verificar la capacidad de las cepas de prueba para proteger las células epiteliales intestinales humanas de la infección por Rotavirus.

Se utilizó un modeloin vitrocon células epiteliales intestinales humanas (HT-29) sensibles a la infección natural con Rotavirus humano. Se comprobó la capacidad de la cepaL. reuteriLMG P- 27481, comparándola con otra cepa deL. reuteri(DSM 17938) y conLactobacillus rhamnosusATCC 53103, para influir en la infección por Rotavirus de células HT-29, utilizando dos diseños experimentales:

A) Pretratamiento- Las monocapas confluentes de células HT-29 se lavaron con DMEM sin antibiótico y, a continuación, se incubaron con medio DMEM que contenía las cepas en evaluación con una multiplicidad de infección de 1:50 (células epiteliales:bacteria). Las bacterias se dejaron en contacto con las células epiteliales durante dos horas, a continuación, se retiró el medio y las células se infectaron durante 1 hora a 37 °C con Rotavirus (previamente sometido a activación durante 1 hora a 37 °C con tripsina 10 |xg/ml). Después de una hora se retiró el medio y se reemplazó con medio completo al que se había adicionado tripsina (2 pg/ml), necesario para garantizar la reinfección de las partículas víricas liberadas. A continuación, las células se incubaron durante 72 horas a 37 °C. Al finalizar la incubación, se recogieron las células y el medio, y se procedió a la extracción del ADN total y a la cuantificación de las copias del genoma vírico mediante PCR cuantitativa.

B) Competencia: Las monocapas confluentes de células HT-29 se lavaron e incubaron con medio DMEM sin antibiótico. De forma paralela, el Rotavirus fue sometido a activación proteolítica (1 hora a 37 °C con tripsina 10 pg/ml) y, a continuación, se incubó con las cepas en evaluación (recogidas de un cultivo durante el crecimiento logarítmico y diluidas correspondientemente a una multiplicidad de infección de 1:50 sobre las células epiteliales). Las bacterias se mantuvieron en contacto con el virus durante 90 minutos a 37 °C. A continuación, la mezcla de virus y bacterias se centrifugó a 3.500 revoluciones durante 10 minutos. El sobrenadante (sin bacterias) se añadió a las células epiteliales durante una hora a 37 °C. Después de una hora, se retiró el medio de cultivo de las células epiteliales y se reemplazó con medio completo al que se había adicionado tripsina (2 pg/ml). A continuación, las células se incubaron durante 72 horas a 37 °C. Al finalizar la incubación, se recogieron las células y el medio, y se procedió a la extracción total del ADN. La cuantificación de las copias del genoma vírico se llevó a cabo mediante PCR cuantitativa.

Para cada ensayo se llevaron a cabo 3 experimentos con determinaciones por duplicado.

Todas las cepas sometidas a prueba mostraron una capacidad significativa de reducción de la replicación del Rotavirus en las células epiteliales intestinales humanas en ambos esquemas de tratamiento utilizados (tabla 7).

Tabla 7

Ejemplo 3

Capacidad de L. reuteri LMG P-27481 para adherirse a una monocapa de células epiteliales intestinales

El objetivo de estos experimentos fue verificar la capacidad de las cepas de prueba para adherirse a una monocapa de células epiteliales intestinales humanas.

Se hicieron crecer células epiteliales intestinales humanas (HT29) hasta formar monocapas confluentes. Cuarenta y ocho horas después de haber obtenido la confluencia, las monocapas se lavaron y se incubaron con medio DMEM al que se habían adicionado las cepas en evaluación a una multiplicidad de infección de 1:10 (células epiteliales:bacteria). La incubación se llevó a cabo durante 90 minutos a 37 °C en presencia de una ligera oscilación de la placa para favorecer el contacto con las células. Al final de la incubación, se eliminó el medio de cultivo, se lavaron las células con DMEM estéril para eliminar las bacterias no adheridas y se cuantificaron las células bacterianas adheridas mediante recuento microbiano vital llevando a cabo diluciones en serie sembradas en placas de medio MRS agarizado incubadas a 37 °C en anaerobiosis.

Para cada ensayo se llevaron a cabo 3 experimentos con determinaciones por duplicado.

Todas las cepas sometidas a prueba mostraron la capacidad de adherirse a la monocapa celular intestinal humana.L. reuteriLMG P-27481 resultó ser más eficaz queL. reuteriDSM 17938 (aproximadamente 1,55 veces mejor) y similar aL. rhamnosusATCC 53103 (tabla 8).

Tabla 8

Ejemplo 4

Actividad inmunomoduladora de L. reuteri LMG P-27481

El objetivo de estos experimentos fue comprobar la capacidad inmunomoduladora de las cepas de prueba en células dendríticas humanas.

Las células dendríticas humanas se produjeron a partir de monocitos obtenidos de sangre periférica de donantes sanos. Los monocitos se diferenciaron en células dendríticas mediante la adición de factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF, 5 ng/ml) e IL-4 (2,5 ng/ml) para obtener células dendríticas (DC,dendritic cells)inmaduras. El día del experimento las DC se recogieron en pocillos, se lavaron mediante centrifugación, se contaron y se sacaron alícuotas para obtener los siguientes grupos experimentales:

DC DC cada una de las tres cepas bajo análisis

DC sobrenadante de las tres cepas bajo análisis

DCSalmonella

DC cada una de las tres cepas bajo análisisSalmonella

DC sobrenadante de las tres cepas bajo análisisSalmonella

Las DC se incubaron conSalmonella(MOI 10:1 bacterias:DC) o con las cepas de lactobacilos en evaluación (MOI 10:1) o con la adición del 2 % de medio MRS acondicionado por cepas probióticas (véase anteriormente, correspondiente a una MOI 10:1) durante 1 hora. A continuación, las células se lavaron mediante centrifugación y se incubaron durante 24 horas adicionales en un medio que contenía gentamicina (100 |xg/ml). El sobrenadante del cultivo se recogió y se utilizó para la cuantificación de citocinas (IL-10 e IL12p70) y la posterior determinación del índice antiinflamatorio (proporción de concentración IL-10/IL12p70). Para cada ensayo se llevaron a cabo 3 experimentos con determinaciones por duplicado.

Resultados

Los resultados obtenidos se representan en las figuras 3, 4 y 5.

Se encontró que las células vivas deL. reuteriLMG P-27481, a diferencia deL. reuteriDSM 17938 yL. rhamnosusATCC 53103, estimulan fuertemente la secreción de IL-10, mientras que el sobrenadante de todas las cepas estimula la secreción de IL-10 con una actividad más fuerte deL. rhamnosusATCC 53103 (figura 3A). LaSalmonellainduce una liberación significativa de IL-10 pero la intervención de las cepas probióticas no produce ninguna contribución (figura 3B).

L. reuteriLMG P-27481 también reveló ser el estímulo más eficaz para la secreción de IL-12p70 mientras que el sobrenadante muestra una estimulación de IL-12 comparable paraL. reuteriLMGP-27481 yL. rhamnosusATCC 53103, inferior que la producida porL. reuteriDSM 17938 (figura 4A). LaSalmonellaindujo fuertemente IL-12p70 y todas las cepas revelaron ser capaces de contrarrestar este efecto (figura 4B). El índice antiinflamatorio (proporción IL-10/IL-12) reveló queL. reuteriLMGP-27481 es la cepa más eficaz para inducir la respuesta antiinflamatoria (figura 5A), mientras que, en presencia deSalmonella, todas las cepas sometidas a prueba se comportan de forma análoga (figura 5B).

Ejemplo 5

Efecto de Lactobacillus reuteri LMG P-27481 sobre la inflamación inducida por la infección espontánea por C. difficile después del tratamiento antibiótico.

El objetivo de este estudio fue comprobar el efecto antiinflamatorio deL. reuteriLMGP- 27481 evaluado en un modelo murino de infección porC. difficile(CD), basado en la colonización espontánea por CD en ratones sometidos a tratamiento antibiótico de amplio espectro.

En este modelo experimental, ratones C57BI/6 de 6 semanas de edad fueron sometidos a tratamiento con un antibiótico de amplio espectro (cefoperazona 0,5 mg/ml) durante 2 semanas. Los animales recibieron una suplementación diaria deL. reuteriLMG P-27481 (109 UFC/día) o solo portador por vía intragástrica en el período concomitante a la terapia antibiótica. Los animales se sacrificaron al final de las 2 semanas de terapia antibiótica y administración concomitante de probiótico.

Se determinó la variación del peso corporal de los animales durante la experimentación para evaluar el estado general de salud de los animales.

A continuación, se llevó a cabo el estudio del efecto antiinflamatorio del probiótico mediante la determinación de la mieloperoxidasa (MPO) en la pared del colon y el análisis histológico de secciones de ciego.

Peso corporal

Los ratones de control no tratados con antibióticos mostraron una relativa estabilidad del peso corporal, mientras que los ratones sometidos durante 2 semanas a terapia antibiótica mostraron una reducción de peso significativa. La administración del probióticoL. reuteriLMG P-27481 contrastó la pérdida de peso debida al antibiótico y los animales mostraron una tendencia similar a los controles que no recibieron antibiótico (figura 6).

Mieloperoxidasa (MPO)

La inflamación a nivel de la membrana mucosa intestinal, en términos de infiltración debida a neutrófilos, se cuantificó midiendo el nivel de actividad de la MPO en la pared del colon. Tal como se muestra en la figura 7, los ratones de control (sin ningún tratamiento) mostraron un nivel muy bajo de actividad de MPO, a diferencia de los ratones sometidos al tratamiento antibiótico, que mostraron un aumento consistente en el nivel de MPO.

La administración del probióticoL. reuteriLMG P-27481 de forma concomitante al tratamiento antibiótico determinó una reducción significativa de la actividad de MPO.

Histopatología de la mucosa intestinal

La extensión de la inflamación a nivel de la mucosa también se evaluó mediante análisis histopatológico. Se encontró que en el ciego de los ratones que recibieron la administración de antibióticos durante 2 semanas existe un estado de inflamación de la mucosa y submucosa asociado a un ligero daño epitelial. En los ratones que ingirieronL. reuteriLMG P-27481 durante la terapia antibiótica se redujo la extensión de la inflamación de la mucosa, así como el edema submucoso.

El probiótico, ingerido de forma contemporánea al antibiótico resulta ser eficaz en la reducción de la gravedad de los efectos asociados a la terapia antibiótica. La reversión espontánea de los efectos negativos asociados al antibiótico aparece tanto en relación con el peso corporal, que tiende espontáneamente a volver a la normalidad, como en relación con el nivel de inflamación de la membrana mucosa intestinal.

Ejemplo 6

Efecto de Lactobacillus reuteri LMG P-27481 en un modelo de exposición a C. difficile (CD) después de terapia antibiótica.

Este modelo se basa en la infección inducida, mediante la administración oral de CD, en ratones sometidos a tratamiento antibiótico de amplio espectro.

El objetivo del estudio fue verificar el efecto de la suplementación conL. reuteriLMG P-27481 en la prevención/tratamiento de la colonización por expuesto a CD después de la alteración de la flora microbiana intestinal debido a la terapia antibiótica. En este modelo experimental, ratones C57BI/6 de 6 semanas de edad se trataron durante 10 días con un antibiótico de amplio espectro (cefoperazona 0,5 mg/ml), conocido por causar una disbiosis significativa. Un grupo de animales no recibió el tratamiento antibiótico y fue considerado como control (grupo 1).

Después de 48 horas desde el final de la terapia antibiótica, los ratones recibieron una exposición a una suspensión de la cepa de CD VPI 10463 (105 UFC).

El tratamiento con el probióticoL. reuteriLMG P-27481 (109 UFC/día) por vía intragástrica se llevó a cabo durante 8 días después de finalizada la terapia antibiótica 2 días previos a la finalización de la administración del antibiótico (grupo 3). Otro grupo de ensayo recibió el probiótico en las mismas dosis diarias del grupo 3, pero empezando 24 horas después de la expuesto a CD (grupo 4). Los animales del grupo 2 recibieron solo antibiótico y CD, sin probiótico.

Los animales se sacrificaron 5 días después de la expuesto a CD y se llevaron a cabo las siguientes determinaciones:

a) cambio de peso corporal durante la prueba (T0 = primera dosis de antibiótico versus sacrificio); b) colonización de CD en el ciego mediante análisis de PCR en tiempo real, cultivo mediante siembra en medio selectivo para cuantificar la carga de CD en el ciego y búsqueda/titulación de toxinas de CD en la luz cecal con ensayo de citotoxicidad en monocapa de fibroblastos;

c) entidad de inflamación en la membrana mucosa del ciego/colon con dosificación de MPO y análisis histológico de secciones de ciego y colon.

Peso corporal

Los animales de control no tratados con antibióticos mostraron un peso corporal relativamente estable durante la prueba, mientras que los animales tratados con antibióticos y posteriormente infectados con CD mostraron una reducción significativa en el peso corporal en 5 días, después de la infección por CD. La administración deL. reuteriLMG P-27481, tanto antes como después de la expuesto a CD, eliminó por completo la pérdida de peso debida a la infección por CD (figura 8).

Contenido del ciego

Citotoxicidad

Después del sacrificio de los ratones, se recogió el contenido del ciego, se centrifugó y en el sobrenadante obtenido se determinó la citotoxicidad, debida a las toxinas de CD sobre una monocapa de células Vero. El contenido fecal de los ratones de control (grupo 1) no mostró ningún efecto citotóxico sobre las células Vero, al contrario de lo que ocurrió en los ratones tratados con antibiótico y posteriormente infectados con CD en los que se observó una citotoxicidad del orden del 80 %. El tratamiento de animales conL. reuteriLMG P-27481, tanto antes como después de la infección con CD, redujo drásticamente la citotoxicidad inducida por CD.

Toxina A y toxina B

Para confirmar la presencia de toxinas debidas a CD en el intestino se determinaron las toxinas A y B en el contenido cecal mediante prueba inmunoenzimática.

Los animales del grupo 1 (control) obviamente fueron negativos, mientras que después del tratamiento antibiótico y CD (grupo 2) fueron fuertemente positivos (++++). El tratamiento preventivo conL. reuteriLMG P-27481 (grupo 3) redujo la positividad (++/+++) mientras que el tratamiento posterior a la infección por CD (grupo 4) determinó una negatividad completa.

Presencia de C. difficile

La presencia de CD en el intestino se determinó, además, mediante PCR que se llevó a cabo sobre el ADN total extraído de las heces.

Los resultados obtenidos están en línea con lo encontrado en las pruebas anteriores. De hecho, tal como se esperaba, el ADN fecal del grupo 1 fue negativo para CD, el grupo 2 fue fuertemente positivo, los grupos 3 y 4 resultaron ligeramente positivos y negativos (en comparación con el control), respectivamente.

Los datos semicuantitativos obtenidos con PCR se confirmaron mediante prueba de PCR en tiempo real. La figura 9 muestra cómo los ratones pertenecientes al grupo 2, sometidos únicamente a la terapia antibiótica y a la expuesto a CD, se revelaron fuertemente colonizados por CD, al mostrar valores de delta-Ct muy bajos. En cambio, dichos valores resultaron ser más elevados en los ratones de los grupos 3 y 4, demostrándose una colonización de CD muy reducida.

Prueba en cultivo

Los datos de PCR se confirmaron sembrando una alícuota del contenido del ciego en placas de agar sangre y procediendo a la identificación de las colonias mediante análisis MALDI-TOF. Esta prueba también arrojó resultados que pueden superponerse a los obtenidos en las pruebas descritas anteriormente. De hecho, se encontró que el tratamiento con el probiótico reduce las colonias de CS, mostrando un mejor efecto paraL. reuteriLMG P- 27481 administrado después de la exposición.

Mieloperoxidasa (MPO)

El nivel de infiltración de neutrófilos en la membrana mucosa se evaluó midiendo el nivel de actividad de MPO.

Los datos obtenidos se muestran en la figura 10, que muestra un aumento significativo de la actividad de MPO en la membrana mucosa de los ratones pertenecientes al grupo 2 (terapia antibiótica expuesto a CD) con respecto a los ratones de control, mostrando la presencia de una inflamación aguda. La administración deL. reuteriLMG P-27481 a partir de una fase temporal previa a la expuesto a CD (grupo 3) redujo la actividad de MPO en un 25 % mientras que la administración posterior a la exposición (grupo 4) determinó una reducción de la actividad de MPO superior al 50 % con respecto al grupo 2.

Todos los estudios analíticosin vitrorealizados sobre la cepaL. reuteriLMG P-27481 mostraron para este microorganismo una fuerte actividad probiótica y permitieron recoger elementos a favor de la utilización de la cepa en diarreas de diversa etiología. Dicha evaluación se basa en la capacidad de la cepaL. reuteriLMG P-27481 para utilizar la lactosa (datos internos), siendo así idealmente capaz de contribuir a aliviar los síntomas de mala digestión en sujetos intolerantes, y contrastar el crecimiento deClostridium difficile, al reducir en aproximadamente 1 logaritmo en las 24 horas el desarrollo del patógeno, a diferencia de las cepas de control que se mostraron sustancialmente ineficaces. La cepaL. reuteriLMG P-27481 reduce aún más el crecimiento de los patógenos intestinales Gram-negativosE. coliySalmonella,a diferencia de lo realizado porLactobacillus rhamnosusATCC 53103 que no muestra ninguna actividad inhibidora contra estos patógenos, y porLactobacillus reuteriDSM 17938 que muestra una actividad reducida o similar a la deL. reuteriLMG P-27481 en relación a los diferentes microorganismos sometidos a prueba.

Se debe hacer una discusión aparte paraC. difficileya que solo la cepaL. reuteriLMG P-27481 demostró ser capaz de reducir significativamente su crecimiento.

La cepaL. reuteriLMG P-27481 mostró, además, la capacidad de adherirse a las células intestinales en cultivo en niveles iguales o superiores que otras cepas sometidas a prueba y de inducir activamente la estimulación antiinflamatoria en las células dendríticas en cultivo, particularmente cuando se consideran en forma de células vivas y vitales. Dicha capacidad resulta ser de un interés particular precisamente con referencia aC. difficile,conocido por su capacidad de inducir un estímulo inflamatorio masivo con un aumento significativo en la expresión de IL-8. Los datos obtenidos en los modelos murinos de infección porC. difficile,tanto la infección espontánea inducida por tratamiento antibiótico como la infección por expuesto a CD, muestran que la administración deL. reuteriLMG P-27481 determina una significativa contribución de eficacia en la reducción de la gravedad de los efectos asociados a la infección.

Todos los datos experimentales obtenidos sobre la cepaL. reuteriLMG P-27481 demuestran una considerable eficacia de este microorganismo en el tratamiento de las afecciones intestinales de diverso origen. En particular, se observó una fuerte reducción de los estados inflamatorios inducidos por varios estímulos, haciendo así de esta cepa un instrumento útil en el tratamiento de las diarreas agudas.

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Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Cepa deLactobacillus reuteriNo. LMG P-27481 depositada en el centro de colección de microorganismos BCCM/LMG Bacteria Collection de la Universidad de Gante (Bélgica).

2. Cepa, según la reivindicación 1, para su utilización en el tratamiento de infecciones diarreicas, en la que dichas infecciones diarreicas son inducidas porClostridium difficile.

3. Composiciones farmacéuticas que comprenden la cepa, según, como mínimo, una de las reivindicaciones 1 a 2, y aditivos tolerables farmacéuticamente.

4. Composiciones, según la reivindicación 3, para su utilización en el tratamiento de infecciones diarreicas, en las que dichas infecciones diarreicas son inducidas porClostridium difficile.

5. Productos médicos que comprenden la cepa, según, como mínimo, una de las reivindicaciones 1 a 2, y aditivos utilizados en el sector.

6. Productos médicos, según la reivindicación 5, para el tratamiento de infecciones diarreicas, en los que dichas infecciones diarreicas son inducidas porClostridium difficile.

7. Complementos alimenticios útiles en el tratamiento de infecciones diarreicas que comprenden la cepa, según, como mínimo, una de las reivindicaciones 1 a 2 y aditivos habitualmente utilizados en el sector nutracéutico, en los que dichas infecciones diarreicas son inducidas porClostridium difficile.