ES3036047T3 - A method of processing a biological sample - Google Patents

Abstract

Se describe un método de procesamiento de una muestra biológica que contiene múltiples metabolitos. El método comprende los pasos de pretratar la muestra biológica con un solvente de extracción de metabolitos para proporcionar una muestra pretratada, separar una primera alícuota de la muestra pretratada mediante cromatografía líquida de fase inversa (RPLC) para proporcionar un primer eluyente que contiene metabolitos hidrófobos resueltos y separar una segunda alícuota de la muestra pretratada mediante cromatografía de interacción líquida de interacción hidrófila (HILIC) para proporcionar un segundo eluyente que contiene metabolitos hidrófilos resueltos. El primer y el segundo eluyente se ensayan utilizando espectroscopia de masas en tándem dirigida operada en modo de monitorización de reacción múltiple. Cada paso de cromatografía líquida (LC) se enlaza directamente con la espectrometría de masas en tándem (MS/MS) en un único análisis LC-MS/MS. El solvente de extracción normalmente comprende metanol, isopropanol y un tampón de acetato. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Un procedimiento para preparar una muestra biológica

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento de procesamiento de una muestra biológica, en particular un procedimiento de procesamiento de una muestra biológica para el perfilado metabólico de la muestra biológica.

Antecedentes de la invención

Típicamente, los metabolitos de interés para una condición de salud particular se "identifican" realizando los llamados estudios de "descubrimiento" no dirigidos. Por ejemplo, se analizan bioespecímenes de dos grupos de individuos, uno expuesto al (futuro) resultado sanitario ((futuros) "casos") y otro no expuesto al (futuro) resultado sanitario ((futuros) "no casos" o "controles")), mediante un proceso analítico de "metabolómica" y se intenta identificar "señales" diferenciales entre los (futuros) casos y los (futuros) controles. Sin embargo, la identificación de metabolitos en el análisis metabolómico no dirigido basado en la espectrometría de masas se consigue principalmente mediante la búsqueda basada en la masa seguida de la verificación manual. En primer lugar, se busca el valor m/z de un ion molecular de interés en una(s) base(s) de datos. Los metabolitos que tienen pesos moleculares dentro de un intervalo de tolerancia especificado respecto al valor m/z de la consulta se recuperan de las bases de datos como identificaciones putativas. Sin embargo, las identificaciones putativas a partir de la búsqueda basada en la masa rara vez son únicas, debido a la existencia de isómeros, y/o diferentes composiciones químicas que dan lugar a la misma relación m/z, y a la limitada precisión de los espectrómetros de masas. En algunos casos, un ion molécula puede tener más de 100 identificaciones putativas.

Se conoce un procedimiento para separar y analizar metabolitos en muestras biológicas por Song et al. (RSC Adv. 2017, 7, 31838).

Los metabolitos diferenciales, que sólo se identifican tentativamente no pueden aprobarse para pruebas de laboratorio clínico. Este problema de posible ambigüedad de los compuestos se acentúa aún más cuando se intenta identificar combinaciones específicas de metabolitos. Así pues, sólo se pueden desarrollar pruebas de diagnóstico o pronóstico clínicamente significativas basadas en la metabolómica cuando se pueden extraer e identificar sin ambigüedad las moléculas relevantes. La colección de procedimientos analíticos elaborados en esta aplicación consigue exactamente esto. Otros enfoques de la metabolómica utilizarán enfoques más específicos, en los que se empleará una colección de ensayos dirigidos a un conjunto de compuestos metabolitos estrechamente relacionados para buscar diferencias entre grupos de individuos; ejemplos típicos son los análisis de aminoácidos, los análisis de carnitina o la llamada "lipidómica". Una limitación importante de estos enfoques centrados en las clases de compuestos es el hecho de que sólo se puede lograr un diagnóstico clínicamente significativo o la predicción de enfermedades complejas cuando se combinan metabolitos de diferentes clases de compuestos y, posiblemente, otras variables. Esto se ejemplificará ampliamente a lo largo de esta solicitud.

Además, para diagnosticar o predecir el riesgo de que se desarrolle una enfermedad sindrómica en individuos asintomáticos, se ha hecho evidente que un único "biomarcador" no bastará para predecir la enfermedad. Es más, para lograr un diagnóstico o predicción del riesgo de enfermedad clínicamente significativo, ya sea de "alto riesgo" o de "bajo riesgo", para síndromes complejos puede ser necesario desarrollar una colección de pruebas de pronóstico multivariable en lugar de una única prueba de pronóstico. Para permitir el descubrimiento de múltiples pruebas de pronóstico multivariable dentro de colecciones de metabolitos de interés, se requiere una tecnología analítica que pueda ofrecer una cuantificación precisa y rentable en el tiempo de grandes colecciones de metabolitos de interés.

Es un objeto de la invención superar los problemas anteriormente referidos.

Sumario de la invención

La presente invención aborda la necesidad de una metodología de ensayo de una muestra biológica para identificar y cuantificar inequívocamente metabolitos en la muestra. Los procedimientos de la invención pueden emplearse para detectar firmas de enfermedad, fenotipos metabólicos, actividad y eficacia de fármacos y el descubrimiento de nuevos mediadores biológicos. La presente invención se dirige particularmente a los procedimientos de perfilado de metabolitos de muestras biológicas para identificar firmas que sean diagnósticas o predictivas de enfermedades, especialmente trastornos del embarazo (por ejemplo, trastornos hipertensivos del embarazo, o más específicamente preeclampsia, diabetes gestacional y parto prematuro espontáneo y no espontáneo). Una realización de los procedimientos de la invención está dirigida a analizar muestras de sangre para detectar firmas de metabolitos únicos y múltiples de preeclampsia que se presentan antes de la aparición de los síntomas de la enfermedad. Los Solicitantes han desarrollado una metodología como la expuesta en la reivindicación 1 que puede ensayar cualitativa y cuantitativamente un gran número de metabolitos (véase la Tabla 11 para un conjunto ejemplar de metabolitos con relevancia para el trastorno hipertensivo del embarazo o más específicamente la preeclampsia) en un alto rendimiento, precisa y robusta, incluyendo la resolución y detección cuantitativa de metabolitos estrechamente relacionados tales como 2-HBA y 3-HBA, leucina e isoleucina, y esfingosina-1-fosfato y esfinganina-1-fosfato, lo que hasta ahora no ha sido posible utilizando técnicas basadas en MS. El procedimiento de la reivindicación 1 emplea el pretratamiento de la muestra para extraer metabolitos (por precipitación o/y extracción en fase sólida), la separación de metabolitos en la muestra pretratada mediante cromatografía líquida (LC), y el ensayo del eluyente de LC mediante espectroscopia de masas (MS). El procedimiento de la reivindicación 1 emplea un enfoque de cromatografía dual, es decir, una primera separación por LC para proporcionar un eluyente enriquecido en metabolitos hidrófobos, y una segunda separación por LC para proporcionar un eluyente enriquecido en metabolitos hidrófilos, y luego ensayar ambos eluyentes con MS, permite resolver, identificar y cuantificar con precisión metabolitos estrechamente relacionados (Ejemplo 6). Se ha descubierto que el uso de la MS en tándem dirigida en modo de monitorización de reacciones múltiples mejora la especificidad de los perfiles en el contexto de metabolitos sanguíneos estrechamente relacionados: en este procedimiento, un ion precursor de un compuesto de interés se disocia de forma controlada y genera iones de producto cuantificador e iones de producto cualificador en proporciones predecibles. Con la identificación de pares específicos de ion precursor-ion cuantificador e ion precursor-ion cuantificador para metabolitos, y más particularmente para metabolitos sanguíneos estrechamente relacionados, se consigue una especificidad insuperable. Además, o en caso de que no puedan encontrarse pares de iones específicos, se ha comprobado que el control de la relación cuantificador/cuantificador proporciona una garantía adicional de que la LC-MS/MS cuantifica específicamente el compuesto de interés.

El procedimiento de la reivindicación 1 emplea MS en tándem ya que es particularmente adecuado para el perfilado de metabolitos relacionados con trastornos hipertensivos del embarazo, y en particular MS en tándem llevada a cabo bajo ionización por electroaspersión tanto positiva como negativa (Ejemplo 7). El procedimiento de la reivindicación 1 emplea un disolvente de extracción de metabolitos que es capaz de extraer un amplio espectro de metabolitos, incluidos los metabolitos que se han identificado como relevantes para predecir la preeclampsia (Ejemplo 2, 3 y 4). Aunque se describe principalmente refiriéndose a muestras de sangre y a la detección de metabolitos que pueden funcionar como variables pronósticas de la preeclampsia, el procedimiento de la reivindicación 1 puede aplicarse a otras muestras biológicas tales como otros fluidos y tejidos humanos y animales, levaduras, bacterias, células de cultivos y medios de crecimiento, y puede emplearse para detectar firmas de otras enfermedades y fenotipos, o en el descubrimiento/desarrollo de fármacos y en la investigación básica.

La invención proporciona un procedimiento de perfilado metabólico cuantitativo de una muestra biológica que contiene múltiples metabolitos que representan una pluralidad de diferentes clases de metabolitos como se establece en las reivindicaciones 1 a 13.

En una realización, el procedimiento emplea LC directamente guionizada a MS, en lo sucesivo "LC-MS en línea" o "LC-MS".

En una realización, el disolvente de extracción de metabolitos comprende metanol, isopropanol y un tampón de acetato de amonio.

En una realización, el disolvente de extracción de metabolitos comprende metanol, isopropanol y un tampón de acetato de amonio en una relación de aproximadamente 10:9:1 (v/v/v).

El método de la invención emplea una etapa de LC dual en la que una primera alícuota de la muestra se somete a un proceso de separación usando una forma de LC para proporcionar un primer eluyente compatible con espectrometría de masas en el que los metabolitos de un primer tipo se resuelven entre sí (por ejemplo, metabolitos hidrófobos), y una segunda alícuota de la muestra se somete a un procedimiento de separación utilizando una segunda forma de LC para obtener un segundo eluyente compatible con la espectrometría de masas en el que los metabolitos de un segundo tipo se separan entre sí (por ejemplo, metabolitos hidrófilos). Las mezclas de metabolitos hidrófobos dentro de una muestra se resuelven empleando LC de fase inversa (por ejemplo, fases de enlace C18-, C8-, C4-, ciano-, fenil-, pentafluorofenil-). Las mezclas de metabolitos hidrófilos dentro de una muestra se resuelven en metabolitos hidrófilos empleando LC de interacción hidrófila (por ejemplo, sílice desnuda, fase con enlace diol, etc.).

Así, la etapa de LC comprende separar una primera alícuota de la muestra pretratada mediante cromatografía líquida en fase inversa para proporcionar un primer eluyente compatible con espectrometría de masas que contiene metabolitos hidrófobos resueltos, separar una segunda alícuota de la muestra pretratada mediante HILIC para proporcionar un segundo eluyente compatible con espectrometría de masas que contiene metabolitos hidrófilos resueltos, y ensayar el primer y segundo eluyentes utilizando espectroscopia de masas en tándem en línea.

En una realización, la RPLC emplea una mezcla variable de una primera fase (A) móvil que comprende agua, metanol y un tampón volátil (por ejemplo, un tampón de acetato de amonio) y una segunda fase (B) móvil que comprende metanol, acetonitrilo, isopropanol y un tampón volátil (por ejemplo, un tampón de acetato de amonio).

En una realización, las fases móviles de RPLC se mezclan según un gradiente volumétrico variable de aproximadamente 1-20 % (preferentemente aproximadamente 10 %) a 80-100 % (preferentemente aproximadamente 100 %) de fase móvil B durante un periodo adecuado, por ejemplo 1-20 minutos o aproximadamente 8-12 minutos, preferentemente aproximadamente 10 minutos. El gradiente volumétrico variable puede ser un gradiente lineal o un gradiente escalonado.

En una realización, la HILIC emplea una mezcla variable de una primera fase (A) móvil que comprende un tampón de formiato de amonio volátil y una segunda fase (B) móvil que comprende acetonitrilo.

En una realización, las fases móviles HILIC se mezclan según un gradiente volumétrico variable de aproximadamente 80 100 % (preferentemente aproximadamente 100 %) a 40-60 % (preferentemente aproximadamente 50 %) de fase B móvil durante un periodo de aproximadamente 8-12 minutos, preferentemente aproximadamente 10 minutos. El gradiente volumétrico variable puede ser un gradiente lineal o un gradiente escalonado.

En https://www.nestgrp.com/protocols/trng/buffer.shtml puede encontrarse una lista de tampones compatibles con la espectrometría de masas para su empleo en LC-MS.

En una realización, la muestra biológica comprende al menos un estándar interno marcado con isótopos estables (SIL-IS) correspondiente a un metabolito relevante del trastorno hipertensivo del embarazo. En una realización, al menos un SIL-IS se añade a la muestra biológica antes del pretratamiento con el disolvente de extracción de metabolitos. En una realización, se añade una pluralidad de SIL-IS a la muestra. En una realización, el al menos un SIL-IS corresponde a un metabolito relevante del trastorno hipertensivo del embarazo. En una realización, la pluralidad de SIL-IS corresponden cada uno independientemente a un metabolito relevante del trastorno hipertensivo del embarazo. En la Tabla 11 se ofrece una lista de metabolitos relevantes para los trastornos hipertensivos del embarazo.

En una realización, la pluralidad de metabolitos relevantes del trastorno hipertensivo del embarazo representan una pluralidad de clases de metabolitos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 clases) seleccionadas de acetilos, alcanos acíclicos, acilcarnitinas, aldehídos, aminoácidos, aminocetonas, aralquilaminas, benceno y derivados sustituidos, tetrapirrolos y derivados, bifenilos y derivados, carnitinas, colinas, corticosteroides y derivados, cumarinas y derivados, diacilgliceroles, ácidos dicarboxílicos, dipéptidos, eicosanoides, ácidos grasos (incluidos los ácidos grasos hidroperóxidos, los ácidos grasos ceto- o hidroxi-, los ácidos grasos saturados, los ácidos grasos insaturados, los ácidos grasos epoxi), glicerofosfolípidos, hidroxiácidos y derivados, fosfatos monosacáridos, aminoácidos N-acil-alfa, ácidos fenilpropanoicos, fosfosfingolípidos, compuestos azacíclicos (por ejemplo, piridinas), esfingolípidos, alcoholes de azúcar, andrógenos y esteroides (por ejemplo, testosteronas), vitamina D y derivados.

En una realización, la pluralidad de metabolitos relevantes del trastorno hipertensivo del embarazo incluye al menos uno, una pluralidad, o todos, de los metabolitos de la Tabla 11 (Metabolitos de interés). En una realización, la pluralidad de metabolitos relevantes del trastorno hipertensivo del embarazo incluyen todos o sustancialmente todos 25-Hidroxivitamina D3 (HVD3); ácido 2-hidroxibutanoide (2-HBA); L-leucina (L-LEU); Citrulina (CR); ácido Docohexaenoico (DHA); Dilinoleoilglicerol: 1,3Dilinoleoil-glicerol: 1,2-Dilinoleoil-glicerol (mezcla de isómeros) (DLG); colina (CL); L-isoleucina (L-ISO); L-metionina (L-MET); NG-Monometil-L-arginina (NGM); dimetilarginina Asimétrica (ADMA); Taurina (TR); Estearoilcarnitina (SC); 1-heptadecanoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (1-HD); Biliverdina (BV); Esfingosina 1-fosfato (S-1-P); y ácido eicosapentaenoico (EPA).

En una realización, el tampón de acetato es un tampón de acetato de amonio. En una realización, el tampón de acetato tiene una concentración de aproximadamente 150-250 mM, preferentemente de aproximadamente 200 mM. En una realización, el tampón está configurado para amortiguar el pH del disolvente de extracción a aproximadamente 4-5, preferentemente a aproximadamente 4,5. En una realización, el disolvente de extracción comprende metanol e isopropanol en una relación de 5-15:5-15. En una realización, el disolvente de extracción comprende metanol e isopropanol en cantidades aproximadamente iguales (es decir, 8-12:8-12). En una realización, el disolvente de extracción comprende metanol, isopropanol y tampón en una relación de aproximadamente 10:9:1 (v/v/v).

En una realización, el disolvente de extracción de metabolitos comprende aproximadamente 0,01 % a 0,1 % de antioxidante (m/v). En una realización, el disolvente de extracción de metabolitos comprende aproximadamente un 0,05 % de antioxidante (vm/v). En una realización, el antioxidante es 3,5-Di-tert-4-butil-hidroxitolueno BHT (CAS:128-37-0). Otros antioxidantes que podrían emplearse incluyen, por ejemplo, una mezcla de ácido ascórbico (CAS: 50-81-7) con ácido etilendiaminotetraacético (ED<t>A; CAS:). 60-00-4); butilhidroxianisol (BHA; CAS:25013-16-5), butilhidroxitolueno que utilizamos (BHT,CAS:128-37-0), y galato de propilo (PG; CAS:121-79-9).

En una realización, el disolvente de extracción de metabolitos se añade a la muestra biológica en dos alícuotas separadas y se mezcla después de la adición de la primera alícuota y de nuevo después de la adición de la segunda alícuota. En una realización, el disolvente y la muestra se mezclan tras la adición de la segunda alícuota. En una realización, el disolvente y la muestra se mezclan mediante vórtex.

En una realización, la mezcla de muestra biológica y disolvente de extracción se incuba a una temperatura menor que 5 °C (es decir, típicamente menor que -20 °C, -10 °C, -5 °C, o 0 °C) durante un periodo de tiempo para ayudar a la precipitación de la proteína, antes de la separación de la proteína precipitada. En una realización, la proteína precipitada se separa por centrifugación para proporcionar la muestra pretratada que normalmente está sustancialmente libre de proteína y enriquecida en metabolitos.

En una realización, la muestra biológica es una muestra líquida y se recoge y almacena en un dispositivo de micromuestreo volumétrico absorbente (VAM). El Solicitante ha descubierto que el uso de un dispositivo VAM proporciona un control preciso del volumen de la muestra de sangre, una consideración importante para aplicaciones en las que se requiere un análisis cualitativo preciso de metabolitos, tal como la detección o predicción de enfermedades.

Así, en una realización, el método incluye las etapas de proporcionar una muestra biológica en un medio de absorción tal como se recoge preferentemente con un dispositivo de muestreo de control de volumen que -por diseño- recoge un volumen controlado de la muestra en un medio de absorción adecuado (por ejemplo, un dispositivo de micromuestreo de absorción volumétrica); y extraer la muestra biológica obtenida volumétricamente de dicho dispositivo de medio de absorción. En una realización, la muestra biológica se extrae del medio de absorción directamente en el disolvente de extracción de metabolitos.

La espectrometría de masas en tándem se lleva a cabo en modo de monitorización de reacción múltiple.

En una realización, la espectrometría de masas en tándem comprende una técnica de ionización que permite el análisis directo de un efluente de LC, como la ionización por electroaspersión, y técnicas de ionización derivadas de la misma, ionización química a presión atmosférica o fotoionización a presión atmosférica, o bombardeo rápido continuo de átomos.

Cuando los métodos de la invención se usan de tal manera que el LC-eluyente se fracciona, se deposita en gotitas discretas sobre una superficie, o se traza sobre una superficie, para preservar la resolución espacial tal como se consigue por la cromatografía para análisis posteriores, la espectrometría de masas en tándem puede realizarse usando también otras técnicas de ionización. Entre ellos, por ejemplo, la ionización por electrones, la ionización química, la ionización por desorción de campo, la ionización por desorción láser asistida por matriz, la ionización por desorción láser mejorada en superficie.

En una realización, la espectroscopia de masas en tándem se lleva a cabo bajo ionización por electroaspersión tanto positiva como negativa. El Solicitante ha descubierto que en aplicaciones en las que se analizan múltiples metabolitos, es difícil cargar suficientemente todos los metabolitos de interés cuando todos ellos (o sus fragmentos) deben llevar la misma carga. El solicitante ha abordado esta cuestión empleando un procedimiento en el que las muestras se analizan mediante MS en tándem utilizando ionización por electroaspersión positiva y negativa.

En una realización, el procedimiento es un método de perfilado cualitativo y/o cuantitativo de trastornos de metabolitos relacionados con el embarazo en la muestra biológica. En una realización, el procedimiento es un método de perfil cualitativo y/o cuantitativo de metabolitos relacionados con la preeclampsia en la muestra biológica. En una realización, el procedimiento es un método de perfilado de metabolitos seleccionados de la Tabla 11, por ejemplo, todos o sustancialmente todos los metabolitos de la Tabla 11. En una Realización, el procedimiento es un método de perfilado de todos o sustancialmente todos los metabolitos 25-Hidroxivitamina D3 (HVD3); ácido 2-hidroxibutanoide (2-HBA); L-leucina (L-LEU); Citrulina (CR); ácido Docohexaenoico (DHA); Dilinoleoil-glicerol: 1,3Dilinoleoil-glicerol: 1,2-Dilinoleoil-glicerol (mezcla de isómeros) (DLG); colina (CL); L-isoleucina (L-ISO); L-metionina (L-MET); NG-Monometil-L-arginina (NGM); dimetilarginina Asimétrica (ADMA); Taurina (TR); Estearoilcarnitina (SC); 1-heptadecanoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (1-HD); Biliverdina (BV); Esfingosina 1-fosfato (S-1-P); y ácido eicosapentaenoico (EPA).

En una realización, la muestra biológica es un líquido, por ejemplo, sangre, o un derivado sanguíneo tal como suero o plasma, así como orina, sudor, saliva, lágrimas, líquido amniótico, líquido cefalorraquídeo o aspirado de pezón. En una realización, la muestra biológica se obtiene de una mujer embarazada.

En una realización, el tampón de acetato es un tampón de acetato de amonio. Pueden emplearse otras sales volátiles de acetato. En una realización, el tampón de acetato tiene una concentración de aproximadamente 150-250 mM, preferentemente de aproximadamente 200 mM. En una realización, el tampón está configurado para amortiguar el pH del disolvente de extracción a aproximadamente 4-5, preferentemente a aproximadamente 4,5. En una realización, el disolvente de extracción comprende metanol e isopropanol en una relación volumétrica de aproximadamente 5-15:5-15. En una realización, el disolvente de extracción comprende metanol e isopropanol en cantidades aproximadamente iguales, por ejemplo, en una relación de 8-12:8-12. En una realización, el disolvente de extracción comprende metanol, isopropanol y tampón en una relación de aproximadamente 10:9:1 (v/v/v). En una realización, el disolvente de extracción comprende metanol, isopropanol y tampón de acetato de amonio en una relación de aproximadamente 10:9:1 (v/v/v).

La presente invención se refiere además a un método según la reivindicación 14, en el que dicho método es un método para detectar o predecir el riesgo de un trastorno relacionado con el embarazo en una mujer embarazada, comprendiendo el método las etapas de procesar una muestra biológica que contiene múltiples metabolitos obtenidos de una mujer embarazada según un método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para proporcionar un nivel de al menos un metabolito, comparar el nivel del al menos un metabolito con un nivel de referencia, y detectar o predecir el riesgo un trastorno relacionado con el embarazo en base a la comparación.

Métodos para comparar el nivel de metabolitos con un nivel de referencia, y detectar o predecir el riesgo un trastorno relacionado con el embarazo en base a la comparación, son descritos en EP3206033 y US2015168419. Normalmente, la LC-MS es una LC-MS en línea. Normalmente, el trastorno relacionado con el embarazo se selecciona de entre la preeclampsia, la diabetes gestacional y el parto prematuro espontáneo y no espontáneo. Normalmente, la muestra se obtiene antes de la aparición de cualquier síntoma clínico del trastorno precoz del embarazo, por ejemplo, entre las 11 y las 18 semanas de gestación.

Descripción Detallada de la Invención

Definiciones y preferencias generales

Cuando se utilicen en la presente memoria y a menos que se indique específicamente lo contrario, los siguientes términos tienen los siguientes significados, además de cualquier significado más amplio (o más restringido) que los términos puedan tener en la técnica:

Salvo que el contexto exija lo contrario, el uso en la presente memoria del singular se entenderá que incluye el plural yviceversa.Los términos "una" o "un" utilizados en relación con una entidad deben entenderse refiriéndose a una o varias de esas entidades. Como tales, los términos "un" (o "una"), "uno o más" y "al menos uno" se utilizan indistintamente en la presente memoria.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "comprende", o variaciones del mismo tales como "comprenden" o "que comprende", deben entenderse para indicar la inclusión de cualquier número entero recitado (por ejemplo, un rasgo, elemento, característica, propiedad, etapa de método/proceso o limitación) o grupo de números enteros (por ejemplo, rasgos, elementos, características, propiedades, etapas de método/proceso o limitaciones) pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros. Por lo tanto, en la presente memoria, el término "que comprende" es inclusivo o abierto y no excluye números enteros o etapas de procedimiento/proceso adicionales no repetidos.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "enfermedad" se utiliza para definir cualquier condición anormal que deteriora la función fisiológica y se asocia con síntomas específicos. El término se utiliza en sentido amplio para englobar cualquier trastorno, enfermedad, anomalía, patología, dolencia, afección o síndrome en el que la función fisiológica esté alterada, independientemente de la naturaleza de la etiología (o incluso de si se ha establecido la base etiológica de la enfermedad). Por lo tanto, abarca afecciones derivadas de infecciones, traumatismos, lesiones, intervenciones quirúrgicas, ablación radiológica, intoxicaciones o deficiencias nutricionales. Ejemplos de enfermedades incluyen enfermedades inflamatorias, enfermedades metabólicas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades autoinmunes, enfermedades neurológicas, enfermedades degenerativas, enfermedades hepáticas y enfermedades pulmonares. En una realización, la enfermedad es un trastorno sindrómico. En una realización, la enfermedad/trastorno es un trastorno del embarazo, por ejemplo, un trastorno hipertensivo del embarazo o una enfermedad metabólica asociada al embarazo. En la presente memoria, el término "trastorno hipertensivo del embarazo" se refiere a una complicación del embarazo caracterizada por la hipertensión e incluye la hipertensión crónica (incluida la leve y la grave), la hipertensión gestacional, la preeclampsia y la eclampsia.

El término "preeclampsia" incluye la preeclampsia pretérmino, la preeclampsia a término y la preeclampsia de aparición temprana. La preeclampsia se define como presión arterial elevada después de 20 semanas de gestación (> 140 mm Hg sistólica o > 90 mm Hg diastólica) más proteinuria (> 0,3 g/24 horas).

El término "preeclampsia pretérmino" se refiere a la aparición de preeclampsia que da lugar al parto del bebé antes de las 37 semanas de gestación.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "tratamiento" o "tratar" se refiere a una intervención (por ejemplo, la administración de un agente a un sujeto) que cura, mejora o disminuye los síntomas de una enfermedad o elimina (o disminuye el impacto de) su(s) causa(s) (por ejemplo, la reducción de la acumulación de niveles patológicos de enzimas lisosomales). En este caso, el término se utiliza como sinónimo de "terapia".

Además, los términos "tratamiento" o "tratar" se refieren a una intervención (por ejemplo, la administración de un agente a un sujeto) que evita o retrasa la aparición o progresión de una enfermedad o reduce (o erradica) su incidencia dentro de una población tratada. En este caso, el término tratamiento se utiliza como sinónimo del término "profilaxis".

Tal como se usa en la presente memoria, unacantidad eficazo unacantidad terapéuticamente eficazde un agente define una cantidad que puede administrarse a un sujeto sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable, pero que es suficiente para proporcionar el efecto deseado, por ejemplo, el tratamiento o profilaxis manifestado por una mejora permanente o temporal de la condición del sujeto. La cantidad variará de un sujeto a otro, en función de la edad y el estado general del individuo, el modo de administración y otros factores. Así pues, aunque no es posible especificar una cantidad efectiva exacta, los expertos en la técnica podrán determinar una cantidad "efectiva" apropiada en cualquier caso individual utilizando la experimentación rutinaria y los conocimientos generales antecedentes. Un resultado terapéutico en este contexto incluye la erradicación o disminución de los síntomas, la reducción del dolor o las molestias, la prolongación de la supervivencia, la mejora de la movilidad y otros marcadores de mejoría clínica. Un resultado terapéutico no tiene por qué ser una curación completa.

En el contexto del tratamiento y de las cantidades eficaces definidas anteriormente, el términosujeto(que debe entenderse que incluye "individuo", "animal", "paciente" o "mamífero" cuando el contexto lo permite) define cualquier sujeto, en particular un sujeto mamífero, para el que está indicado el tratamiento. Los sujetos mamíferos incluyen, pero no se limitan a, humanos, animales domésticos, animales de granja, animales de zoológico, animales de deporte, animales de compañía como perros, gatos, cobayas, conejos, ratas, ratones, caballos, ganado vacuno, vacas; primates como simios, monos, orangutanes y chimpancés; cánidos como perros y lobos; félidos como gatos, leones y tigres; équidos como caballos, burros y cebras; animales de abasto como vacas, cerdos y ovejas; ungulados como ciervos y jirafas; y roedores como ratones, ratas, hámsters y cobayas. En realizaciones preferentes, el sujeto es un ser humano.

Como se usa en la presente memoria, el término "metabolito" o "metabolitos" se refiere a productos intermedios y productos del metabolismo, y en particular del metabolismo de mamíferos. Algunos ejemplos de metabolitos son la L-arginina, la colina, el ácido adípico, el ácido 2-hidroxibutanoico y la 25-hidroxi vitamina D3. Los metabolitos pueden clasificarse según su clase. Entre los ejemplos de clases de metabolitos se incluyen acetilos, alcanos acíclicos, acilcarnitinas, aldehídos, aminoácidos, aminocetonas, aralquilaminas, benceno y derivados sustituidos, tetrapirrolos y derivados, bifenilos y derivados, carnitinas, colinas, corticosteroides y derivados, cumarinas y derivados, diacilgliceroles, ácidos dicarboxílicos, dipéptidos, eicosanoides, ácidos grasos (incluidos ácidos grasos hidroperoxílicos, ceto- o hidroxiácidos grasos, ácidos grasos saturados, ácidos grasos insaturados, ácidos grasos epoxi), glicerofosfolípidos, hidroxiácidos y derivados, fosfatos monosacáridos, N-acil-alfa-aminoácidos, ácidos fenilpropanoicos, fosfingolípidos, compuestos azocíclicos (por ejemplo, piridinas), esfingolípidos, alcoholes de azúcar, andrógenos, estrógenos y derivados (por ejemplo, testosteronas), vitamina D y derivados. En una realización, la invención es un procedimiento de perfilado de al menos un metabolito de al menos una de estas clases. En una realización, la invención es un procedimiento de perfilado de al menos un metabolito de una pluralidad (es decir, 2, 4, 6, 8, 10, 15 o 20) de estas clases. En una realización, la invención es un procedimiento de perfilado de al menos un metabolito de todas o sustancialmente todas estas clases.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "metabolitos múltiples" aplicado a una muestra biológica se refiere a la muestra que contiene al menos 5 o 10 metabolitos diferentes, y en general contiene al menos 20, 40, 50, 70, 90 o 100 metabolitos diferentes. Los procedimientos de la invención pueden emplearse para perfilar múltiples metabolitos en una muestra biológica, y en particular proporcionar un perfil cualitativo y cuantitativo de múltiples metabolitos en una muestra biológica.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "metabolito relevante para trastornos del embarazo" se refiere a un metabolito cuyos niveles pueden usarse para diagnosticar o predecir el riesgo de o la predisposición a un trastorno del embarazo, por ejemplo, preeclampsia, diabetes gestacional y parto prematuro espontáneo y no espontáneo; en la Tabla 11 se refieren ejemplos de tales metabolitos. La expresión "prácticamente todos los metabolitos relevantes para la preeclampsia de la Tabla 11" se refiere a al menos el 70 %, 80 % o 90 % de los metabolitos de la Tabla 11.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "perfil metabólico" se refiere a la determinación de un metabolito (o preferentemente metabolitos) en una muestra biológica mediante espectroscopia de masas, preferentemente LC-MS, LC-MS dual, e idealmente LC-MS/MS dual. La determinación de metabolitos en la muestra puede ser una determinación de todos los metabolitos, o de metabolitos seleccionados. Preferentemente, la determinación es una determinación de metabolitos relevantes para los trastornos hipertensivos del embarazo, especialmente la preeclampsia. La determinación de metabolitos puede ser cualitativa, cuantitativa o una combinación de cualitativa y cuantitativa. En una realización, la determinación cuantitativa es la determinación cuantitativa relativa, es decir, la determinación de la abundancia de un metabolito específico en la muestra en relación con una cantidad conocida de un patrón interno marcado con isótopos estables (es decir, SIL-IS) correspondiente al metabolito de interés. En otra realización, la determinación cuantitativa se determina en términos absolutos. Los perfiles metabólicos de una muestra pueden emplearse en estudios de casos y controles (especialmente en estudios de casos y controles anidados) para identificar metabolitos y combinaciones de metabolitos que puedan funcionar como variables pronósticas y diagnósticas de la enfermedad. En una realización, el perfil metabólico es un perfil diana, para la determinación de metabolitos específicos, que suele emplear ajustes de MS sintonizados, y generalmente emplea ionización por electroaspersión - análisis MS/m S de triple cuadrupolo (QqQ). En una realización, el perfil metabólico comprende el perfil de metabolitos estrechamente relacionados. Por ejemplo, el perfil de una muestra que contenga 2-HBA y 3-HBA, o leucina (LEU) e isoleucina (I-LEU), o esfingosina-1-fosfato y esfinganina-1-fosfato.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "disolvente de extracción de metabolitos" se refiere a un disolvente empleado para extraer metabolitos de otros componentes de la muestra, especialmente proteínas, y que comprende metanol, isopropanol y tampón de acetato. En una realización, el tampón de acetato tiene una concentración de aproximadamente 150-250 mM, preferentemente de aproximadamente 200 mM. En una realización, el tampón está configurado para amortiguar el pH del disolvente de extracción a aproximadamente 4-5, preferentemente a aproximadamente 4,5. En una realización, el disolvente de extracción comprende metanol e isopropanol en una relación volumétrica de aproximadamente 5-15:5-15, o 8-12:8-12. En una realización, el disolvente de extracción comprende metanol, isopropanol y tampón acetato en una relación de aproximadamente 10-30:10-30:1-5 (v/v/v). En una realización, el disolvente de extracción comprende metanol, isopropanol y tampón de acetato de amonio en una relación de aproximadamente 10:9:1 (v/v/v).

Tal como se usa en la presente memoria, el término "cromatografía" se refiere a un procedimiento en el que una mezcla química se separa en componentes como resultado de la distribución diferencial y o adsorción debida a las propiedades fisicoquímicas diferenciales de los componentes entre dos fases de diferente estado físico, de las cuales una es estacionaria y otra móvil.

Como se usa en la presente memoria, el término "cromatografía líquida" o "LC" significa un procedimiento de retardo selectivo de uno o más componentes de una solución fluida a medida que el fluido percola uniformemente a través de una columna de una sustancia finamente dividida, o a través de pasajes capilares. El retardo resulta de la distribución de los componentes de la mezcla entre una o más fases estacionarias y el fluido a granel, (es decir, la fase móvil), a medida que este fluido se mueve en relación con la(s) fase(s) estacionaria(s). Entre los ejemplos de "cromatografía líquida" se incluyen la cromatografía líquida de fase normal (NPLC), la cromatografía líquida de fase inversa (RPLC), la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), la cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UHPLC) y la cromatografía líquida de flujo turbulento (TFLC) (a veces conocida como cromatografía líquida de alta turbulencia (HTLC) o cromatografía líquida de alto rendimiento).

Tal como se usa en la presente memoria, el término "cromatografía líquida de alto rendimiento" o "HPLC" (a veces conocido como "cromatografía líquida de alta presión") se refiere a cromatografía líquida en la que el grado de separación se incrementa forzando la fase móvil bajo presión a través de una fase estacionaria, típicamente una columna densamente empaquetada.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "cromatografía líquida de ultra alto rendimiento" o "UHPLC" (a veces conocido como "cromatografía líquida de ultra alta presión") se refiere a cromatografía líquida en la que el grado de separación se aumenta forzando la fase móvil a alta presión a través de una fase estacionaria, típicamente una columna densamente empaquetada con una fase estacionaria que comprende partículas de empaquetamiento que tienen un diámetro medio menor que 2|jm.

Como se usa en la presente memoria, el término "cromatografía líquida de flujo turbulento" o "TFLC" (a veces conocido como cromatografía líquida de alta turbulencia o cromatografía líquida de alto rendimiento) se refiere a una forma de cromatografía que utiliza flujo turbulento del material que se está ensayando a través del empaquetamiento de la columna como base para realizar la separación. La TFLC se ha aplicado en la preparación de muestras que contenían dos fármacos sin nombre antes de su análisis por espectrometría de masas. Véase, por ejemplo, Zimmer et al., J Chromatogr A 854: 23-35 (1999); véase también, U.S. Pat. Nos. 5.968.367, 5.919.368, 5.795.469, y 5.772.874, que explican con más detalle el TFLC. Los expertos en la técnica entienden por "flujo turbulento". Cuando el fluido fluye lenta y suavemente, el flujo se denomina "flujo laminar". Por ejemplo, el fluido que circula por una columna de HPLC con tasas de caudal bajas es laminar. En el flujo laminar, el movimiento de las partículas del fluido es ordenado, con partículas que se mueven generalmente en líneas rectas. A mayor velocidad, la inercia del agua vence a las fuerzas de fricción del fluido y se produce un flujo turbulento. El fluido que no está en contacto con el límite irregular "sobrepasa" al que está frenado por la fricción o desviado por una superficie irregular. Cuando un fluido fluye turbulentamente, lo hace en remolinos (o vórtices), con más "resistencia" que cuando el flujo es laminar. Existen muchas referencias que ayudan a determinar si el flujo de un fluido es laminar o turbulento (por ejemplo, Turbulent Flow Analysis Measurement and Prediction, P S. Bernard & J. M. Wallace, John Wiley & Sons, Inc., (2000); An Introduction to Turbulent Flow, Jean Mathieu & Julian Scott, Cambridge University Press (2001)).

Tal como se usa en la presente memoria, el término "cromatografía líquida dual" o "LC dual" aplicado a una muestra biológica se refiere a una etapa de separación en la que una primera alícuota de la muestra se somete a un primer tipo de LC (es decir, RPLC C18) y una segunda alícuota de la muestra se somete a un segundo tipo de LC (es decir, HILlC). Esto es especialmente adecuado para los procedimientos de la invención en los que se perfilan múltiples metabolitos, ya que la doble separación LC de la muestra proporciona una mejor resolución de los metabolitos y, por lo tanto, una mejor determinación analítica. En una realización, la etapa de LC dual comprende tres o más etapas de cromatografía que se realizan en alícuotas separadas de la misma muestra, por ejemplo, dos etapas de RPLC que están configuradas para separar conjuntos (diferentes) de metabolitos hidrofóbicos, y dos etapas de HILIC que están configuradas para separar conjuntos (diferentes) de metabolitos hidrofílicos. Puede emplearse cuando el conjunto de metabolitos de la muestra es demasiado amplio para ser analizado adecuadamente por espectrometría de masas en línea en un único análisis dual RPLC-MS - HILIC-MS.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "extracción en fase sólida" o "SPE" se refiere a un procedimiento en el que una mezcla química se separa en componentes como resultado de la afinidad de los componentes disueltos o suspendidos en una solución (es decir, fase móvil) por un sólido a través o alrededor del cual se hace pasar la solución (es decir, fase sólida). En algunos casos, a medida que la fase móvil pasa a través o alrededor de la fase sólida, los componentes no deseados de la fase móvil pueden ser retenidos por la fase sólida, lo que resulta en una purificación del analito en la fase móvil. En otros casos, el analito puede ser retenido por la fase sólida, permitiendo que componentes no deseados de la fase móvil pasen a través o alrededor de la fase sólida. En estos casos, se utiliza una segunda fase móvil para eluir el analito retenido de la fase sólida para su posterior procesamiento o análisis. La SPE, incluida la TFLC, puede funcionar mediante un mecanismo de modo unitario o mixto. Los mecanismos de modo mixto utilizan el intercambio iónico y la retención hidrófoba en la misma columna; por ejemplo, la fase sólida de una columna SPE de modo mixto puede presentar un fuerte intercambio aniónico y retención hidrófoba; o puede presentar una columna con un fuerte intercambio catiónico y retención hidrófoba.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "en línea" aplicado a la espectrometría de masas se refiere a la espectrometría de masas equipada con cualquier fuente de ionización que permite la ionización en tiempo real de analitos presentes en un eluyente de LC que se conduce directa y continuamente a un espectrómetro de masas.

Como se usa en la presente memoria, el término "espectrometría de masas" o "MS" se refiere a una técnica analítica para identificar compuestos por su masa. MS se refiere a procedimientos de filtrado, detección y medición de iones en base a su relación masa-carga, o "m/z". La tecnología MS generalmente incluye (1) ionizar los compuestos para formar compuestos cargados; y (2) detectar el peso molecular de los compuestos cargados y calcular una relación masa-carga. Los compuestos pueden ionizarse y detectarse por cualquier medio adecuado. Un "espectrómetro de masas" incluye generalmente un ionizador y un detector de iones. En general, se ionizan una o varias moléculas de interés y los iones se introducen posteriormente en un instrumento de espectrometría de masas donde, debido a una combinación de campos magnéticos y eléctricos, los iones siguen una ruta en el espacio que depende de la masa ("m") y la carga ("z"). Véase, por ejemplo, U.S. Pat. No. 6.204.500, titulada "Mass Spectrometry From Surfaces;" U.S. Pat. No. 6.107.623, titulado "Methods and Apparatus for Tandem Mass Spectrometry"; U.S. Pat. No. 6.268.144, titulado "ADN Diagnostics Based On Mass Spectrometry;" U.S. Pat. No. 6.124.137, titulado "Surface-Enhanced Photolabile Attachment And Release For Desorption And Detection Of Analytes"; Wright et al., Prostate Cancer and Prostatic Diseases 1999, 2:. 264-76; y Merchant y Weinberger, Electrophoresis 2000, 21:. 1164-67.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "espectrometría de masas en tándem" se refiere a un procedimiento que comprende al menos dos etapas de análisis de masa, ya sea en conjunción con un proceso de disociación o una reacción química que provoca un cambio en la masa o carga de un ion. La principal ventaja de utilizar MS/MS es la discriminación frente al ruido químico, que puede tener su origen en distintas fuentes (por ejemplo, compuestos de la matriz, sangrado de la columna, contaminación de una fuente de iones).

Hay dos enfoques diferentes en MS/MS: en el espacio mediante el acoplamiento de dos o más partes físicamente distintas de un instrumento (por ejemplo, triple cuadrupolo (QqQ), o cuadrupolo - tiempo de vuelo, Qq-TOF, Triple TOF, orbitrampa cuadrupolo); o en el tiempo mediante la realización de una secuencia de eventos en un dispositivo de almacenamiento de iones (por ejemplo, trampa de iones, IT) o híbridos de los mismos (por ejemplo, cuadrupolo - trampa de iones -orbitrampa). Los principales modos de barrido MS/MS en tándem son ion producto, ion precursor, pérdida neutra, monitorización de reacción seleccionada, monitorización de reacción múltiple y barridos MS".

Generalmente, la MS cuantitativa en tándem se realiza con un analizador de MS de triple cuadrupolo (QQQ).

Los procedimientos MS/MS generalmente implican la activación de iones seleccionados, típicamente por colisión con un gas inerte, suficiente para inducir la fragmentación (disociación inducida por colisión, CID) y generar iones producto. El barrido de iones producto implica la selección del ion precursor de interés (utilizando el primer filtro (Q1) de masa, su activación (q2) y un barrido (Q3) de análisis de masa para determinar sus iones producto. El escaneo de iones producto representa un procedimiento opuesto al del escaneo de iones precursores; el 2do filtro (Q3) de masas está configurado para analizar un único ion producto, mientras que el primer filtro (Q1) de masas se utiliza para escanear iones precursores que se disociarán (en q2) en dicho ion producto. El escaneo de pérdida neutra implica el escaneo de una fragmentación (pérdida neutra de masa fija predeterminada); Q1 y Q3 escanearán un intervalo m/z establecido en paralelo, pero con sus filtros desplazados de acuerdo con la masa neutra predeterminada. Es útil para el cribado rápido en estudios metabólicos. MS" se aplica habitualmente en los analizadores de trampa de iones. Se selecciona y aísla un ion precursor expulsando todas las demás masas del espectrómetro de masas. La CID del ion precursor produce iones que pueden tener masas diferentes (MS/MS). Se selecciona una masa de producto de un analito y se expulsan otros iones de fragmento de la célula. Este ion producto puede someterse, de nuevo, a CID, generando más iones producto que se analizan en masa (MS/MS/MS). Este procedimiento puede repetirse varias veces. Sin embargo, como ya se ha mencionado, para moléculas pequeñas como los metabolitos sólo se utiliza en la práctica la MS/MS o la MS/MS/MS. La monitorización de reacción seleccionada (SRM) es un caso especial de la monitorización de iones seleccionados (SIM) en el que se utiliza un instrumento en tándem para mejorar la selectividad de la SIM, seleccionando tanto el ion precursor como el ion producto. El término monitorización de reacciones múltiples (MRM) se utiliza cuando se monitorizan varias reacciones diferentes en paralelo.

Como se usa en la presente memoria, el término "monitorización selectiva de iones" es un modo de detección para un instrumento de espectrometría de masas en el que sólo se detectan iones dentro de un intervalo de masa relativamente estrecho, típicamente aproximadamente una unidad de masa.

Tal como se usa en la presente memoria, "modo de reacción múltiple", a veces conocido como "monitorización de reacción seleccionada", es un modo de detección para un instrumento de espectrometría de masas en el que se detectan selectivamente un ion precursor y uno o más iones de fragmento. En una realización, la espectrometría de masas de la invención emplea detección en modo de reacción múltiple que típicamente emplea metabolitos de pares de iones precursores-cuantificadores y de iones precursores-calificadores específicos de compuestos, y opcionalmente una etapa de monitorización de la relación iones Cuantificadores/Calificadores. En condiciones de espectrometría de masas en tándem bien definidas, un ion precursor producido a partir de un compuesto de interés se disociará de forma controlada y generará iones producto cuantificadores e iones producto cualificadores en proporciones predecibles. Mediante el control de la relación cuantificador/cuantificador, se obtiene una garantía adicional de que la LC-MS/MS está cuantificando específicamente el compuesto de interés. La probabilidad de que una interferencia eluya en el mismo tiempo de retención, cree el mismo ion precursor y se disocie en los mismos iones cuantificadores y calificadores en la misma proporción que la diana de interés se considera muy baja. En casos concretos, puede considerarse el uso de más de una relación Cuantificador/Cualificador. Se establece la relación ion Cuantificador/ion Cuantificador (o viceversa) adecuada para cada metabolito y SIL-IS.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "operar en modo de iones negativos" se refiere a aquellos procedimientos de espectrometría de masas en los que se generan y detectan iones negativos. El término "funcionamiento en modo de iones positivos", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a aquellos procedimientos de espectrometría de masas en los que se generan y detectan iones positivos.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "ionización" o "ionizante" se refiere al procedimiento de generar un ion de analito que tiene una carga eléctrica neta igual a una o más unidades de electrones. Los iones negativos son los que tienen una carga neta negativa de una o más unidades de electrones, mientras que los iones positivos son los que tienen una carga neta positiva de una o más unidades de electrones.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "ionización de electrones" o "El" se refiere a procedimientos en los que un analito de interés en una fase gaseosa o vapor interactúa con un flujo de electrones. El impacto de los electrones con el analito produce iones de analito, que pueden someterse a continuación a una técnica de espectrometría de masas.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "ionización química" o "Cl" se refiere a procedimientos en los que un gas reactivo (por ejemplo, amoníaco) se somete a impacto de electrones, y se forman iones de analito por la interacción de iones de gas reactivo y moléculas de analito.

Como se usa en la presente memoria, el término "bombardeo rápido de átomos" o "FAB" se refiere a procedimientos en los que un haz de átomos de alta energía (a menudo Xe o Ar) impacta en una muestra no volátil, desorbitando e ionizando moléculas contenidas en la muestra. Las muestras de prueba se disuelven en una matriz líquida viscosa tal como glicerol, tioglicerol, alcohol m-nitrobencílico, éter corona 18-corona-6, éter 2-nitrofeniloctilo, sulfolano, dietanolamina y trietanolamina. La elección de una matriz adecuada para un compuesto o una muestra es un procedimiento empírico.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "ionización por desorción láser asistida por matriz" o "MALDI" se refiere a procedimientos en los que una muestra no volátil se expone a irradiación láser, que desorbe e ioniza analitos en la muestra por diversas rutas de ionización, incluyendo fotoionización, protonación, desprotonación y desintegración de cúmulos. Para el MALDI, la muestra se mezcla con una matriz que absorbe energía, lo que facilita la desorción de las moléculas del analito.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "ionización por desorción láser mejorada en superficie" o "SELDI" se refiere a otro procedimiento en el que una muestra no volátil se expone a irradiación láser, que desorbe e ioniza analitos en la muestra por diversas rutas de ionización, incluyendo fotoionización, protonación, desprotonación y desintegración de cúmulos. Para SELDI, la muestra se une normalmente a una superficie que retiene preferentemente uno o más analitos de interés. Al igual que en MALDI, este procedimiento también puede emplear un material absorbente de energía para facilitar la ionización.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "ionización por electroaspersión" o "ESI", se refiere a procedimientos en los que una solución se hace pasar a lo largo de una longitud corta de tubo capilar, al extremo del cual se aplica un potencial eléctrico positivo o negativo elevado. La solución que llega al extremo del tubo se vaporiza (nebuliza) en un chorro o pulverización de gotitas muy pequeñas de solución en vapor disolvente. Esta niebla de gotitas fluye a través de una cámara de evaporación. A medida que las gotas se hacen más pequeñas, la densidad de la carga eléctrica superficial aumenta hasta que la repulsión natural entre cargas similares hace que se liberen iones y moléculas neutras. La ESI calentada es similar, pero incluye una fuente de calor para calentar la muestra mientras se encuentra en el tubo capilar. En una realización, la fuente de ionización Agilent Jet Stream se refiere a una variante ESI que utiliza la tecnología de enfoque por gradiente térmico para generar condiciones ESI optimizadas.

Como se usa en la presente memoria, el término "ionización química a presión atmosférica" o "APCI," se refiere a métodos de espectrometría de masas que son similares a ESI; sin embargo, APCI produce iones por reacciones de molécula de iones que ocurren dentro de un plasma a presión atmosférica. El plasma se mantiene mediante una descarga eléctrica entre el capilar de pulverización y un contraelectrodo. A continuación, los iones se extraen normalmente en el analizador de masas mediante un conjunto de etapas de desnatado con bombeo diferencial. Puede utilizarse un contraflujo de gas N2 seco y precalentado para mejorar la eliminación del disolvente. La ionización en fase gaseosa en APCI puede ser más eficaz que la ESI para analizar especies menos polares.

El término "fotoionización a presión atmosférica" o "APPI" como se usa en la presente memoria se refiere a la forma de espectrometría de masas en la que el mecanismo para la fotoionización de la molécula M es absorción de fotones y eyección de electrones para formar el ion molecular M+. Dado que la energía del fotón suele estar justo por encima del potencial de ionización, el ion molecular es menos susceptible a la disociación. En muchos casos puede ser posible analizar las muestras sin necesidad de cromatografía, con el consiguiente ahorro de tiempo y dinero. En presencia de vapor de agua o disolventes próticos, el ion molecular puede extraer H para formar MH+. Esto suele ocurrir si M tiene una gran afinidad por los protones. Esto no afecta a la precisión de la cuantificación porque la suma de M+ y MH+ es constante. Los compuestos fármacos en disolventes próticos suelen observarse como MH+, mientras que los compuestos no polares, tales como el naftaleno o la testosterona, suelen formar M+. Véase, por ejemplo, Robb et al., Anal. Chem. 2000, 72(15): 3653-3659.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "desorción de campo" se refiere a procedimientos en los que una muestra de prueba no volátil se coloca sobre una superficie de ionización, y se utiliza un campo eléctrico intenso para generar iones de analito.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "desorción" se refiere a la eliminación de un analito de una superficie y/o la entrada de un analito en una fase gaseosa. La desorción térmica por láser es una técnica en la que una muestra que contiene el analito se desorbe térmicamente en la fase gaseosa mediante un impulso láser. El láser incide en la parte posterior de una placa de 96 pocillos fabricada especialmente con una base metálica. El pulso láser calienta la base y el calor hace que la muestra pase a la fase gaseosa. A continuación, la muestra en fase gaseosa se introduce en el espectrómetro de masas.

Como se usa en la presente memoria, una "cantidad" de un analito en una muestra de fluido corporal se refiere generalmente a un valor absoluto que refleja la masa del analito detectable en volumen de muestra. Sin embargo, una cantidad también contempla una cantidad relativa en comparación con otra cantidad de analito. Por ejemplo, una cantidad de un analito en una muestra puede ser una cantidad superior a un control o nivel normal del analito normalmente presente en la muestra.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "muestra biológica" se refiere a líquidos biológicos tales como sangre o derivados sanguíneos (es decir, plasma, suero, capa leucocitaria, plasma rico en plaquetas, preparaciones de eritrocitos), saliva, líquido cefalorraquídeo, sudor, orina u otras muestras biológicas incluyendo células o tejidos, bacterias, virus, hongos, líneas celulares, medios de cultivo celular, placenta y líquido amniótico.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "dispositivo de muestreo absorbente" se refiere a un dispositivo de muestreo de líquido para material biológico tal como sangre que emplea un medio de absorción que absorbe rápidamente fluido biológico sobre el medio de absorción donde el fluido se almacena en un formato seco. En una realización, el dispositivo de muestreo por absorción es un "dispositivo de muestreo por absorción con control de volumen", que es un dispositivo de muestreo por absorción configurado para muestrear fluido de forma volumétrica o con control de volumen. El muestreo volumétrico se consigue utilizando un volumen interno fijo reproducible para el medio de absorción (controlando la capacidad del medio), o controlando el volumen depositado en el medio de absorción, en este último caso empleando a menudo tecnología de microfluidos. Un ejemplo es un "dispositivo de micromuestreo volumétrico absorbente" o "dispositivo VAM", que se refiere a dispositivos de muestreo de sangre que emplean un material poroso hidrófilo con volúmenes internos predefinidos. Se describen en EP2785859 y EP16753193 (Neoteryx LLC). Algunos ejemplos son el micromuestreador Neoteryx MITRA, disponible en Neoteryx de Torrence California, US. Otros tipos de dispositivos de muestreo con control de volumen son el dispositivo HEMAXIS de DBS Systems (control de la deposición de volumen) y el HEMASPOT de SpotON Sciences (control de la capacidad del medio). Las muestras recogidas de este modo también se conocen como muestras de "líquido seco" o "sangre seca".

Los procedimientos analíticos están típicamente en base a uno o más de los siguientes:

1. el uso de un disolvente de extracción / disolvente de precipitación de proteínas que permita la extracción de los diferentes tipos (clases) de metabolitos. En una realización, la composición disolvente de extracción es una mezcla de metanol, isopropanol y 200 mM de acetato de amonio (acuoso) en una relación 10:9:1, que a su vez se enriquece con 0,05 % de 3,5-Di-tert-4-butil-hidroxitolueno (Ejemplo 3). Se ejemplifican las características de nuestra formulación en términos de recuperación en todas las clases de metabolitos relevantes, así como en términos de reproducibilidad en comparación con una selección de composiciones disolventes de extracción conocidas. En el Ejemplo 4, se demuestra la capacidad de la formulación para extraer metabolitos de interés de diferentes tipos de preparados sanguíneos. El Ejemplo 5 muestra que la formulación también es adecuada para extraer de forma reproducible los metabolitos de interés de la sangre recogida mediante un microdispositivo de micromuestreo volumétrico por absorción. Esto es significativo, ya que los procedimientos para analizar y cuantificar combinaciones pronósticas de metabolitos transportados por la sangre, y/o metabolitos junto con otras clases de biomoléculas transportadas por la sangre para un futuro estado de salud, dependen de un estricto control del volumen de la muestra. En el pronóstico, las biomoléculas de interés suelen estar presentes en la sangre de todos los individuos; los niveles entre un futuro caso y un futuro no caso serán a menudo sutiles (ya que todos los individuos en el momento de la toma de muestras están aparentemente libres de la enfermedad). Por este motivo, el volumen de muestra (véase también el ejemplo 2) disponible para el análisis debe ser el mismo para todas las muestras al inicio del procedimiento analítico.

2. El uso de un sistema de Cromatografía Líquida (LC) dual (de Alta Presión) para permitir la identificación y cuantificación de las diferentes clases de metabolitos en una corta tirada analítica. Los sistemas cromatográficos se desarrollaron de forma que pudieran unirse directamente a un sistema de detección por espectrometría de masas. Este sistema de cromatografía dual se desarrolló específicamente para separar adecuadamente los diferentes tipos / clases de metabolitos y, al mismo tiempo, generar una señal detectable a nivel del espectrómetro de masas [Ejemplo 6]; un sistema cromatográfico único, con un tiempo de respuesta corto, no es eficaz para generar de forma robusta una señal detectable en todas las clases. La capacidad de 1) analizar de forma exhaustiva metabolitos de diferentes clases, en función de su relevancia para el diagnóstico o el pronóstico, en 2) un plazo de entrega lo suficientemente corto es importante para generar datos sobre conjuntos de muestras suficientemente grandes (necesarios para permitir modelos multivariables estadísticamente sólidos) en bastidores de tiempo y costes económicamente viables.

3. El uso de una forma de espectrometría de masas cuantitativa, es decir, un sistema de espectrometría de masas en tándem (MS/MS) operado en el modo de Monitorización de Reacción Múltiple (también conocido como Monitorización de Reacción Única) para permitir el análisis sensible y específico de metabolitos (Ejemplo 7). Para ello, las muestras se someten a ionización en condiciones que producen formas ionizadas de los metabolitos de interés. A continuación, los metabolitos ionizados se fragmentan en iones fragmento derivados del metabolito, o iones producto. Normalmente, se determinan las cantidades de dos fragmentos específicos por metabolito para identificar y cuantificar las cantidades de los metabolitos originarios en la muestra (para más detalles, véase más adelante). Para cada metabolito se desarrolló un ensayo LC-MS/MS específico para cada una de las dianas de interés, así como para cada uno de los SIL-IS; un ensayo LC-MS/MS particular implica una combinación de los puntos 2 y 3 anteriores.

4. Para identificar inequívocamente un metabolito / SIL-IS de interés, cada uno de los ensayos constituirá típicamente un conjunto específico de parámetros experimentales que identificarán inequívocamente el compuesto de interés. Cabe señalar que los valores de estos parámetros experimentales son específicos y están optimizados para la tecnología LC-MS/MS utilizada. En el caso de los ensayos LC-MS/MS considerados, este conjunto de parámetros específicos son los siguientes:

a. Tiempo de retención (Rt): El tiempo transcurrido entre la inyección y la aparición del pico máximo (en el detector). Se establece el tiempo de retención específico para cada metabolito.

b. Ion precursor m/z: Relación masa / carga del ion que se deriva directamente del compuesto diana mediante un procedimiento de carga que tiene lugar en la fuente de ionización del espectrómetro de masas. En este trabajo, el ion precursor suele ser una forma protonada [M+H]+ o desprotonada [M-H]- del compuesto diana. En algunos casos, el ion precursor considerado ha sufrido una pérdida adicional de una entidad neutra (por ejemplo, una molécula de agua (H2O)) en la fuente de ionización. En otros casos, la ionización del compuesto de interés se produce tras la formación de un aducto entre el compuesto neutro y otro ion (por ejemplo, un aducto de amonio) disponible. Se establece el ion precursor apropiado para cada metabolito.

c. Carga del ion precursor: La carga del ion que se deriva directamente del compuesto diana mediante un procedimiento de carga que tiene lugar en la fuente de ionización del espectrómetro de masas, el ion precursor puede tener carga positiva o negativa. Se establece el estado de carga adecuado para cada metabolito.

d. Ion Producto Cuantificador: Ion formado como producto de una reacción en la que interviene un ion precursor particular. La reacción puede ser de diferentes tipos, incluyendo la disociación unimolecular para formar iones fragmento, una colisión ión-molécula, una reacción ión-molécula, o simplemente implicar un cambio en el número de cargas. En general, el ion producto cuantificador es el fragmento más intenso y/o específico del compuesto de interés. Los datos del ion producto cuantificador se utilizan para cuantificar el compuesto de interés. Se establece el ion producto cuantificador apropiado para cada metabolito y SIL-IS.

e. Ion Producto Calificador: Ion formado como producto de una reacción en la que interviene un ion precursor particular. La reacción puede ser de diferentes tipos, incluyendo la disociación unimolecular para formar iones fragmento, una colisión ión-molécula, una reacción ión-molécula, o simplemente implicar un cambio en el número de cargas. En general, el ion producto calificador es un fragmento menos intenso que el compuesto de interés. Los datos del ion producto calificador se utilizan como confirmación adicional de que la LC-MS/MS es específica del compuesto de interés. En casos específicos, se considera el uso de más de un ion calificador. Se establece el ion producto calificador apropiado para cada metabolito y SIL-IS.

f. Relación ion Cuantificador/ion Cualificador (o viceversa): en condiciones de espectrometría de masas en tándem bien definidas, un ion precursor producido a partir de un compuesto de interés se disociará de forma controlada y generará iones producto cuantificador e iones producto cualificador en proporciones predecibles. Mediante el control de la relación cuantificador/cuantificador, se obtiene una garantía adicional de que la LC-MS/MS está cuantificando específicamente el compuesto de interés. La probabilidad de que una interferencia eluya en el mismo tiempo de retención, cree el mismo ion precursor y se disocie en los mismos iones cuantificadores y calificadores en la misma proporción que la diana de interés se considera muy baja. En casos concretos, puede considerarse el uso de más de una relación Cuantificador/Cualificador. Se establece la relación ion Cuantificador/ion Cuantificador (o viceversa) adecuada para cada metabolito y SIL-IS.

La disponibilidad de los 6 parámetros anteriores definirá con gran certeza un ensayo altamente específico para un compuesto de interés. En algunos casos, no se dispondrá de los 6 parámetros, por ejemplo, cuando el ion precursor no se disocie en iones producto significativos.

Para estas dianas de metabolitos en las que se coanaliza un patrón SIL-IS estructuralmente idéntico, se dispone de una métrica de especificidad adicional: la diana de metabolitos y el SIL-IS tienen -aparte de su masa- propiedades fisicoquímicas casi idénticas y, por tanto, tendrán el mismo tiempo de retención. En raras ocasiones no se consigue una coelución perfecta debido al llamado efecto deuterio, pero en estos casos la diferencia en el tiempo de retención del metabolito y del SIL-IS será constante y bastante pequeña.

Los conjuntos de parámetros específicos establecidos para metabolitos ejemplares y SIL-IS asociados a través de las clases de metabolitos de interés para la predicción de preeclampsia, junto con algunos ajustes de fuente de ionización específicos del instrumento (pero no limitantes) se elaboran en el Ejemplo 7.

5. El uso de SIL-ISs para posibilitar la espectrometría de masas por dilución de isótopos estables, para conseguir cuantificaciones exactas y precisas de compuestos basados en la espectrometría de masas. En resumen, la espectrometría de masas por dilución de isótopos estables se basa en el principio de enriquecer todas las muestras de estudio con el mismo volumen de una mezcla bien definida de SIL-IS al inicio del procedimiento analítico. Estos SIL-IS son típicamente idénticos a los compuestos endógenos de interés, en este caso metabolitos, pero tienen un número de átomos específicos (típicamente Hidrógeno 1H, Carbono 12C, Nitrógeno 14N u Oxígeno 16O) dentro de su estructura molecular sustituidos por un isótopo estable y pesado del mismo elemento (típicamente Deuterio 2H, Carbono 13C Nitrógeno 15N u Oxígeno 18O). Por lo tanto, los SIL-IS son químicamente idénticos, pero tienen una masa "más pesada" diferente a la de sus homólogos endógenos. Al ser químicamente idénticos, "experimentarán" toda la variabilidad experimental por igual los metabolitos endógenos de interés. F.i., cualquier rendimiento de extracción diferencial entre las muestras de estudio durante la preparación de la muestra afectará igualmente al metabolito de interés y a su SIL-IS correspondiente. Igualmente, el metabolito de interés y su correspondiente SIL-IS se someterán a la misma cromatografía y suelen ser igualmente sensibles a la variabilidad durante el análisis por espectrometría de masas. Como resultado, la relación entre la señal de cualquier metabolito diana y su correspondiente señal SIL-IS es en gran medida invariable a la variabilidad experimental, por lo que la relación "señal de metabolito / señal SIL-IS correspondiente" está directamente relacionada con la concentración original de la diana en la muestra de sangre. Así, en los procedimientos divulgados en la presente memora, la forma preferente de cuantificar con precisión la cantidad de un metabolito de interés en una muestra es mediante el establecimiento de la relación de "la cantidad del ion cuantificador del metabolito diana / la cantidad del ion cuantificador del SIL-IS correspondiente". En la presente memoria se divulgan procedimientos que permiten cuantificar una multitud de metabolitos diana diferentes en un único análisis de la muestra. Además, como todas las muestras del estudio se enriquecen con el mismo volumen de una mezcla bien definida de SIL-IS, se pueden comparar fácilmente los niveles de los metabolitos de interés en todas las muestras del estudio. Los SIL-IS son compuestos exógenos y, por tanto, no se encuentran en las muestras biológicas nativas, por lo que sus niveles añadidos actúan como referencia común para todas las muestras del estudio. La formulación de un ejemplo no limitativo de una mezcla SIL-IS, tal como se utiliza para la preeclampsia, se da en el Ejemplo 1.

6. El uso de protocolos específicos de procesamiento de muestras para el procesamiento simultáneo de grandes lotes de bioespecímenes con alta reproducibilidad y baja variabilidad técnica. En el Ejemplo 2 se ofrecen los detalles de un ejemplo no limitativo de un protocolo de procesamiento adecuado.

Ejemplificación

La invención se describirá ahora refiriéndose a Ejemplos específicos. Son meramente ejemplares y con fines meramente ilustrativos. No pretenden limitar en modo alguno el alcance del monopolio reivindicado o de la invención descrita. Estos ejemplos constituyen el mejor modo actualmente contemplado para practicar la invención.

Ejemplo 1: Preparación de la Mezcla de Patrones Internos

Como relevante para la aplicación de los procedimientos divulgados en la presente memoria, la formulación de un ejemplo no limitante de una mezcla SIL-IS, como se usa para la preeclampsia. La mezcla SIL-IS se preparó disolviendo el SIL-IS disponible en el disolvente especificado en la tabla siguiente y realizando las diluciones necesarias para obtener una mezcla SIL-IS que, al inyectarse en plasma (10 pl de mezcla SIL-IS para inyectarse en 40 pl de muestra), proporcione las concentraciones deseadas en plasma. Se presentan los cálculos para una mezcla de 4o ml de SIL-IS; los 40 ml se componen de 50:50 MeOH:H2O. Tras la Preparación, se crean alícuotas de 1200 pl (que sirven para 1 lote de 96 especímenes) y se almacenan a -20 °C hasta su uso.

Tabla 1: Composición y concentraciones de la mezcla SIL-IS para el estudio de la preeclampsia

continuación

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SIL-IS se adquirieron en: Fluka (Arklow, Irlanda), Fischer scientific (Blanchardstown, Irlanda), IsoSciences (King of Prussia, PA, USA), Sigma-Aldrich (Wicklow, Irlanda), Avanti Lipids (Alabaster, Alabama, USA), QMX Laboratories (Thaxted, Reino Unido), LGC (Teddington, U.K), Alfa Chemistry (Holtsville, NY, USA), Generon (Maidenhead, Reino Unido), Larodan (Solna, Suecia) y R&D Systems (Abingdon, Reino Unido). Dependiendo de las características fisicoquímicas del metabolito de interés, a veces se obtenía una forma salina del metabolito de interés.

Ejemplo 2: Metodología de Preparación de Bioespecimenes

Como parte de los métodos, se ha establecido una metodología dedicada de preparación de bioespecímenes, que implica la fortificación de las muestras con una mezcla SIL-IS relevante (cf. Ejemplo 1), y el uso de la formulación patentada [precipitación de proteínas-extracción de metabolitos] "crash", para extraer los metabolitos de interés. En cuanto a la manipulación de las muestras, minimizar cualquier fuente potencial de error es fundamental para garantizar unos resultados fiables y precisos. La fuente crítica de error en esta metodología se refiere a control de volúmenes; siendo los volúmenes más críticos el volumen real del espécimen disponible para el análisis, y, el volumen del SIL-IS añadido. Aunque los analistas de laboratorio experimentados podrán preparar las muestras con precisión, es preferente el uso de robots manipuladores de líquidos cuando se procesan grandes cantidades de bioespecímenes para minimizar la variabilidad técnica inducida por el ser humano.

En la presente memoria, como un ejemplo no limitante, se elabora un procedimiento de procesamiento de sangre dedicado, como relevante para los métodos de la presente solicitud, usando un robot de manipulación de líquidos.

El robot se configuró para permitir 96 muestras de sangre en paralelo, utilizando el formato bien establecido de 96 pocillos.

Instrumento:

Plataforma de Manipulación de Líquidos Automatizada Agilent Bravo (BRAVO, Modelo 16050-102, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), equipada con, un Cabezal de Puntas desechable de 96 LT, una estación de agitación orbital y una Estación Térmica Peltier (Agilent Technologies). La plataforma Robot tiene 9 estaciones predefinidas, que pueden utilizarse para placas de 96 pocilios (muestras, reactivos, cajas de puntas de pipeta) o estaciones funcionales (por ejemplo, la Estación Peltier, etc.).

Protocolo Experimental:

En resumen, se realizaron las siguientes etapas para cada lote de 96 alícuotas de 40 pl; los lotes parciales (n<96) se procesan de forma idéntica:

1. Una placa de 96 posiciones (8 x 12 posiciones, PN:WO00059X, Wilmut, Barcelona, España) con muestras preordenadas y prealicuotadas de 40 pl (crioviales de 0,65 ml, PN:W2DST, Wilmut, Barcelona, España), que constituyen un lote analítico, se recuperan del almacenamiento a -80 °C, se colocan en la cubierta BRAVO (agitador orbital) y se agitan en vórtex durante 20 minutos para facilitar la descongelación. Una vez descongelados, los viales se destaponan (manualmente).

2. Mientras tanto,

a. Se extrae una alícuota de SIL-IS previamente preparada (Ejemplo 1) de un almacenamiento a -20 °C para su acondicionamiento térmico, se agita el SIL-IS en vórtex (1 minuto) y se somete a sonicación (5 minutos), y a continuación se colocan los volúmenes adecuados en una columna (8 pocillos) de una placa de 96 pocillos de Polipropileno (PP). A continuación, la placa SIL-IS se coloca en la plataforma BRAVO (Peltier a 4 °C).

b. se extrajo la formulación patentada [precipitación de proteínas-extracción de metabolitos] "de choque" del almacén a -20 °C, se agitó y se llenó una placa de 96 pocillos de PP con los volúmenes adecuados; a continuación, la placa "de choque" se colocó en la plataforma del robot.

3. A continuación se inicia el protocolo BRAVO, cuyas etapas críticas son las siguientes:

a. Extraer 140 pl de SIL-IS de la columna llena de la placa SIL-IS y dispensar secuencialmente 10 pl en cada uno de los viales de muestras.

b. Las muestras fortificadas se someterán a vortex, en cubierta, durante 5 min a 1200 rpm

c. Adición de la solución de "choque"; esta parte de la preparación de la muestra se realiza en dos etapas separadas

i. Primera etapa: adición de 200 pl de solución "de choque", seguida de agitación en vórtex durante 1 minuto a 1200 rpm,

ii. Segunda etapa: adición de 140 pl de solución "de choque" y agitación en vórtex durante 4 minutos a 1000 rpm.

d. A continuación, se retira la placa de muestras del robot BRAVO y se agita en vórtex a 4 °C durante 10 minutos, seguido de 2 minutos de sonicación.

e. Transferencia de la placa de muestras al congelador, donde se mantienen a -20 °C durante 20 minutos para maximizar la precipitación de proteínas.

f. Después de la precipitación, los viales de muestras se centrifugan a 4 °C durante 20 min a una velocidad de 8000 rpm, luego se devuelven al robot BRAVO; la placa de muestras se coloca en la estación Peltier a 4 °C.

g. División del sobrenadante (es decir, el extracto de metabolitos) en dos alícuotas diferentes para permitir el análisis por separado de los compuestos hidrófobos e hidrófilos. Para ello, se aspiran 240 pl de sobrenadante y se dispensan 120 pl dos veces, en placas PP de 96 pocillos separadas (placas duplicadas de "extracto de muestra").

h. A continuación, las placas de extracto de muestras se secan mediante evaporación al vacío a 40 °C durante 60 minutos. Normalmente, 1 placa de extracto de muestra seca se transfiere a -80 °C hasta su posterior análisis, y la otra placa de extracto de muestra se devuelve al robot BRAVO para su reconstitución, preparando las muestras extraídas para el análisis LC-MS/MS (cf. Ejemplos 6 y 7).

i. Compuestos hidrófobos: Los extractos de muestras se reconstituyen en 60 pl de MeOH:AcN:IPA:200mM NH4OAc a pH 4,5 (35:35:25:5), y luego se agitan en vórtex en la cubierta durante 5 minutos, seguidos de sonicación (1 min).

ii. Compuestos hidrófilos: Los extractos de muestras se reconstituyen en 60pl de H2O:MeOH:200mM NH4OAc a pH 4,5, (92:3:5) y luego se agitan en vórtex en la cubierta durante 5 minutos, seguido de sonicación (1 min).

iii. Nota: Para las placas de extracto de muestras recuperadas a -80 °C, se aplica una etapa de acondicionamiento térmico en cubierta (temperatura ambiente) de 20 minutos antes de la reconstitución.

Mientras que el procedimiento ejemplificado anteriormente se aplicó en el análisis de metabolitos de interés relevantes para la preeclampsia; también se emplean variaciones de los procedimientos anteriores según sea apropiado para el resultado de salud en consideración, y los metabolitos de interés asociados. Entre las variantes no limitativas se incluyen

1. Pretratamiento de la muestra y posterior extracción de metabolitos mediante extracción en fase sólida en lugar del procedimiento de precipitación; existen protocolos robotizados para realizar la extracción en fase sólida.

2. La adición consecutiva de diferentes mezclas SIL-IS, por ejemplo, cuando hay SIL-IS que requieren diferentes disolventes de disolución.

Ejemplo 3: Extracción de metabolitos

Apuntalando la colección de métodos como se expone en esta solicitud, está la capacidad de identificar y cuantificar sin ambigüedad colecciones de metabolitos transmitidos por la sangre que son, por sí mismos y/o como parte de una combinación de metabolitos, relevantes para el diagnóstico o la predicción del riesgo de un resultado de salud futuro. En esta solicitud, la condición de salud considerada es una complicación del embarazo, más concretamente, pero sin limitarse a ella, la preeclampsia. A menudo, los métodos cuantitativos diana se centrarán en el análisis de una clase específica de compuestos que constituyan metabolitos con características fisicoquímicas similares, por ejemplo, aminoácidos, o acilcarnitinas o lípidos, etc, tras la disponibilidad de un flujo de trabajo analítico establecido para estas clases distintas de compuestos. Sin embargo, los inventores se dieron cuenta de que, para permitir la identificación de combinaciones no obvias de metabolitos transportados por la sangre, como se requiere para lograr un diagnóstico excepcional o la predicción de riesgos, es imperativo que los métodos permitan el análisis preciso de metabolitos a través de clases de metabolitos funcionalmente diferentes, con diferentes propiedades fisicoquímicas, y a través de diferentes estratos de concentración.

Además, como el propósito de la colección de métodos elaborados en la presente memoria es proporcionar las combinaciones específicas de metabolitos (con o sin variables adicionales) para (una) prueba(s) de pronóstico que puede(n) desplegarse en laboratorios clínicos de todo el mundo, se reconoció la necesidad de un procedimiento de extracción de metabolitos de una sola etapa. Además, los disolventes de extracción utilizados deben tener preferentemente un perfil de riesgo para la salud favorable, con el fin de limitar los riesgos de exposición nociva para el personal del laboratorio clínico.

Típicamente, los metabolitos se extraen de una bioespecífica, y más específicamente de una muestra de sangre, mediante una etapa combinada [precipitación de proteínas-extracción de metabolitos] utilizando una mezcla de disolventes principalmente orgánicos. En función de las propiedades fisicoquímicas de las clases de metabolitos de interés, suelen utilizarse distintas mezclas disolventes. Sin embargo, como ya se ha mencionado, es necesario realizar una extracción adecuada de todas las clases de metabolitos de interés, ejemplificadas en la presente memoria por una colección de metabolitos que son supuestamente de interés para predecir el riesgo de preeclampsia.

Como parte de los procedimientos divulgados en la presente memoria, los inventores idearon una formulación [precipitación de proteínas-extracción de metabolitos] constituida por metanol (MeOH; CAS: 67-56-1), isopropanol (IPA; CAS:). 67-63-0) y un Acetato de Amonio acuoso (NH4OAc; C<a>S:). 631-61-8) tampón. Además, al disolvente se le añadió el antioxidante 3,5-Di-tert-4-butil-hidroxitolueno (BHT; CAS:). 128-37-0). Una de las formulaciones preferentes consiste en MeOH:IPA:200mM NH4OAc en una relación 10:9:1, complementada con 0,05 % (p/v) de 3,5-Di-tert-4-butilhidroxitolueno, BHT En el resto de esta solicitud, esta formulación específica se identificará como disolvente "de choque".

En el siguiente ejemplo no limitativo, las características de extracción favorables de la formulación "crash" divulgada en la presente memoria se ilustran mediante la comparación de sus métricas de recuperación e imprecisión con las de una selección de disolventes de extracción bien establecidos y optimizados.

Elección de comparadores

Se identificaron disolventes de precipitación de proteínas - extracción de metabolitos en la bibliografía con el fin de compararlos con el disolvente de precipitación/extracción de la invención:

- Want EJ et al., Anal Chem, 2006, 78, 743-752, doi: 10.1021/ac051312t

- Polson C et al., J Chromatogr B, 2003, 785, 263-275, doi: 10.1016/S1570-0232(02)00914-5

- Dutta A e t al., J Biomol Tech, 2012, 23, 128-135, doi: 10.7171/jbt.12-2304-001

- Bruce SJ et al., Anal Chem, 2009, 81, 3285-3296, doi: 10.1021/ac8024569

Se seleccionaron los disolventes de precipitación/extracción más eficaces según se informa en estas publicaciones como comparadores para la formulación de la invención,

Tabla 2. Composición de las soluciones [precipitación de proteínas - extracción de metabolitos] consideradas

Mientras que en las publicaciones mencionadas las soluciones [precipitación de proteínas - extracción de metabolitos] se añadieron a menudo en diferentes relaciones disolvente-volumen a muestra-volumen, el experimento comparativo realizado consideró la relación disolvente-volumen a muestra-volumen en todo momento, de acuerdo con el procedimiento divulgado en la presente solicitud (Ejemplo 2), con la excepción para el comparador #7.

Diseño experimental

En la evaluación de las soluciones de [precipitación de proteínas - extracción de metabolitos], se consideran 2 métricas clave:

1) Su capacidad para extraer con buen rendimiento (recuperación) los metabolitos de interés. En la presente memoria, el conjunto de metabolitos de interés lo constituyen metabolitos que podrían tener relevancia en el pronóstico de la preeclampsia.

2) Su capacidad para extraer los metabolitos de interés de forma consistente con baja imprecisión (repetibilidad).

Para evaluar la recuperación, se extrajeron alícuotas de la misma muestra en condiciones experimentales idénticas con cada una de las 8 soluciones [precipitación de proteínas - extracción de metabolitos] (Ejemplo 2 Tabla 2.1). A continuación, todos los extractos se enriquecieron con el mismo volumen de una mezcla SIL-IS (cf. Ejemplo 1), y las muestras resultantes se analizaron de nuevo utilizando los procedimientos analíticos elaborados en los Ejemplos 6 y 7. Para cada extracto, se determina la relación "señal de metabolito / señal SIL-IS correspondiente". Para cada metabolito de interés, el SIL-IS correspondiente se someterá a la misma cromatografía y con normalidad será igualmente sensible a la variabilidad durante el análisis por espectrometría de masas. Como resultado, la relación entre la señal de cualquier metabolito diana y su correspondiente señal SIL-IS está directamente relacionada con el rendimiento de la extracción. Dado que todos los extractos tienen las mismas cantidades de SIL-IS (añadidas después de la extracción), se pueden comparar los rendimientos de extracción de las diferentes soluciones [precipitación de proteínas - extracción de metabolitos]. Para generar datos estadísticamente significativos, se extrajeron 6 veces (réplicas técnicas) alícuotas idénticas de la misma muestra de plasma con cualquiera de los 8 disolventes [precipitación de proteínas - extracción de metabolitos]. Los rendimientos relativos de extracción de todos los metabolitos para cualquiera de los comparadores se expresan en relación con el rendimiento obtenido para la extracción "de choque". Los valores de comparación <100 % indican un rendimiento de extracción inferior al obtenido con el "choque"; Los valores del comparador >100 % indican un rendimiento de extracción superior al obtenido con el "choque" y los valores del comparador del 100 % indican un rendimiento igual al del "choque".

Para evaluar la imprecisión, se realizó el mismo experimento que para la evaluación de la recuperación, con una diferencia clave: todas las alícuotas de muestra se enriquecieron con el mismo volumen de la mezcla SIL-IS (ejemplo 1) antes de la extracción. Dado que los SIL-IS son químicamente idénticos a sus homólogos metabolitos, "experimentarán" toda la variabilidad experimental igual que el endógeno de interés y, por tanto, cualquier rendimiento de extracción diferencial entre las distintas soluciones [precipitación de proteínas - extracción de metabolitos] afectará por igual al metabolito de interés y a su SIL-IS correspondiente. Dado que el resto del trabajo analítico también se mantiene igual (cf. Ejemplos 6&7), cualquier diferencia en la imprecisión analítica total al comparar las extracciones de los comparadores puede atribuirse a las diferencias en la repetibilidad de la extracción entre los comparadores. La imprecisión analítica total se mide calculando los coeficientes de variación (%CV) de "señal de metabolito / señal SIL-IS correspondiente" para extracciones replicadas (n=6).

Procedimiento experimental

Bioespecímenes utilizados:un conjunto de muestras de plasma EDTA obtenidas de 10 mujeres embarazadas en el 2do trimestre de gestación. Las muestras de plasma se obtuvieron comercialmente de BBI solutions (Cardiff, Reino Unido). De esta muestra se prepararon cientos de alícuotas de 40 microlitros en viales "Eppendorf" de polipropileno (PP) de 1,5 ml y se almacenaron a -80 °C hasta su uso. Para el experimento de Recuperación e Imprecisión se utilizaron 96 alícuotas (8 comparadores * 6 réplicas * 2 (con picos pre-extracción y con picos post-extracción de SIL-IS)); los dos experimentos fueron ejecutados al mismo tiempo, por un solo operador.

Mezcla SIL-IS utilizada:la mezcla según el Ejemplo 7 (Número de lote interno: #29).

[precipitación de proteínas - extracción de metabolitos] soluciones:todos los disolventes utilizados eran de calidad HPLC o superior, todos los demás reactivos eran al menos de calidad analítica (Metanol, Etanol, Isopropanol, Acetonitrilo, Acetona: Fisher Scientific; Cloroformo, ácido Tricloroacético: Sigma Aldrich; BHT: Supelco; NH4OAc: Fluka). El agua era agua ultrapura interna de Tipo 1 (@ 18MQ).

Protocolo de extracción:

Las 96 alícuotas de 40 pl de EDTA se prepararon por lotes, usando una versión manual del procedimiento como se ejemplifica en el Ejemplo 2.

En resumen, se realizaron las siguientes etapas para cada alícuota de 40 pl:

1. Adición de 10 pl de mezcla SIL-IS (Pre) o H2O (Post)

2. Vortex durante 1 minuto

3. Incubar durante 15 minutos

4. Añadir 350 pl de[precipitación de proteínas - extracción de metabolitos] solución[150 pl para #7].

5. Vortex intensivo durante 1 minuto.

6. Conservar 10 minutos a 4 °C

7. Sonicar durante 2 minutos

8. Colocar en el congelador durante 20 minutos

9. Centrifugar durante 15 min a 14000 rpm (15339 g); temperatura de centrifugación fijada en 4 °C

10. Transferir 300 pl del sobrenadante (extracto) a un segundo tubo PP de 1,5 ml [150 pl para #7].

11. Añadir 10 pl de agua (Pre) o de mezcla SIL-IS (Post) a cada extracto.

12. Vortex 1 minuto

13. Distribuya cada extracto en 2 viales de vidrio (1,5 ml, marrón, alta recuperación; Agilent, Little Island, Irlanda), 150 pl cada uno [75 pl cada uno para #7].

14. Transferir todos los extractos a un concentrador de vacío y evaporar los extractos 90 minutos a 40 °C, hasta que se sequen.

15. Almacenar los extractos a -80 °C hasta su posterior análisis.

LC-MS/Análisis MS:

Antes del análisis se aleatorizaron todos los extractos (para evitar sesgos experimentales), utilizando un generador de números aleatorios (Microsoft Office Excel).

Los extractos se reconstituyeron y analizaron utilizando los procedimientos según los Ejemplos 6 y 7. En detalle, para el procedimiento hidrofóbico, las muestras se reconstituyeron en MeOH:Acetonitrilo:IPA:200mM NH4OAc a pH 4.5 (35:35:25:5), mientras que para el procedimiento hidrófilo las muestras se reconstituyeron en H2O:MeOH:200mM NH4OAc a pH 4,5, (92:3:5).

Resultados

En la Tabla 3, se resumen los rendimientos de extracción para la formulación de la invención y los diversos comparadores. Los datos corresponden a las respuestas (señal del metabolito / señal del SIL-IS), con el SIL-IS añadido después de la extracción. El rendimiento de extracción indicado es la media de 6 repeticiones técnicas. Los rendimientos de los comparadores se expresan en relación con el rendimiento de la Referencia, es decir, "choque".

Tabla 3:Resumen de los rendimientos de extracción

continuación

*es una señal combinada de 1,3-rac-Dilinoleoil-glicerol y 1,2-rac-Dilinoleoil-glicerol.

Tabla 4:Datos de precisión resumidos

continuación

* es una señal combinada de 1,3-rac-Dilinoleoil-glicerol y 1,2-rac-Dilinoleoil-glicerol.

En la Tabla 4, se resumen los datos de imprecisión para la formulación de la invención y los diversos comparadores. Los datos corresponden a las respuestas (señal del metabolito / señal del SIL-IS), con el SIL-IS enriquecido antes de la extracción. El coeficiente de variación porcentual (%CV) se calcula para 6 réplicas técnicas.

En términos de recuperación, los comparadores #2 y #7 son claramente inferiores. Los comparadores #4 y #5 dan lugar, en términos generales, a rendimientos de extracción inferiores en comparación con el choque patentado, mientras que el #4 tampoco extrae uno de los metabolitos de interés. Los comparadores #1 ofrecen rendimientos de extracción muy similares, y el #6 da lugar a una recuperación favorable para muchas de las dianas de interés, aunque tanto el comparador #1 como el #6 no consiguen extraer algunos metabolitos por completo. Además, debe tenerse en cuenta que el comparador #6, aunque es un disolvente de extracción muy eficaz para la mayoría de los metabolitos, contiene cloroformo, que es una sustancia CMR y debe evitarse en los procedimientos de laboratorio siempre que sea posible. El comparador #3 ofrece rendimientos similares al "choque" patentado. Sólo los comparadores #3 y #5 y el "choque" patentado extraen todos los metabolitos de interés.

En cuanto a la imprecisión, destaca claramente el "choque" propietario, con una imprecisión >25 %CV para un solo metabolito de interés. Con vistas a utilizar las mediciones de metabolitos y/o combinaciones de mediciones de metabolitos en el diagnóstico o la predicción del riesgo de un resultado de salud futuro, una buena reproducibilidad es incluso más importante que unos rendimientos de extracción superiores. Tomando en conjunto los datos de recuperación y de imprecisión, los datos ejemplares que se muestran aquí confirman que la nueva formulación, "choque", desarrollada por los inventores, es superior a todos los demás disolventes [de precipitación de proteínas - extracción de metabolitos] probados, lo que hace que este disolvente "choque", y, o composiciones derivadas del mismo, sean muy adecuados para los objetivos expuestos en esta solicitud.

Ejemplo 4: Extracción de metabolitos de diferentes tipos de sangre

En el siguiente ejemplo no limitativo, las capacidades de la formulación de precipitación de proteínas-extracción de metabolitos de la invención (cf. Ejemplo 3) para extraer metabolitos de interés de diferentes tipos de análisis de sangre. Se compara la cifra de méritos de la extracción para el plasma EDTAy el suero, que son derivados sanguíneos típicos, sirviendo el primero como referencia. Con el único fin de ejemplificar, se consideraron las siguientes métricas; es decir, recuperación, precisión y linealidad (calibración).

Diseño experimental

Recuperación:Para comparar el rendimiento del "choque", se evalúa la recuperación de cualquiera de los SIL-IS, como parte de la mezcla SIL-IS (cf. ejemplo 1), en plasma y suero EDTA, obteniéndose ambos de mujeres embarazadas en su 2do trimestre de gestación (b B i Solutions, Cardiff, Reino Unido). El uso de los metabolitos SIL-IS para comparar las extracciones de plasma EDTA frente a las de suero se adopta porque es independiente de cualquier nivel diferencial de metabolitos entre el plasma EDTAy el suero; además, las muestras de plasma EDTAy suero se recogieron de individuos diferentes.

El procesamiento y análisis de la muestra se ejecutaron como se elaboró en el Ejemplo 6, 7 y 2. Tanto para el plasma como para el suero EDTA, los rendimientos de extracción se estiman comparando la señal media del metabolito SIL-IS en 6 muestras replicadas en las que se ha añadido SIL-IS a la muestra antes de la extracción (preextracción) con la señal media del metabolito SIL-IS en 6 muestras replicadas en las que se ha añadido SIL-IS a la muestra después de la extracción (postextracción). La relación (señal media del metabolito SIL-IS antes de la extracción) / (señal media del metabolito SIL-IS después de la extracción) se calcula para cada SIL-IS disponible en plasma y suero. A continuación, se fijaron como referencia (100 %) los rendimientos de extracción de metabolitos obtenidos en plasma EDTA con el "choque". A continuación, se calcularon también los correspondientes rendimientos relativos en suero.

Imprecisión:En vista de la colección de procedimientos divulgados en esta solicitud, es importante la capacidad de extraer los metabolitos de interés con alta reproducibilidad (precisión) (cf. también el Ejemplo 3). Para evaluar la imprecisión, se analizaron los metabolitos de interés presentes en las muestras de plasma EDTAy en las muestras de Suero (6 réplicas de cada una), según los Ejemplos 5&6, en el mismo experimento. Dado que el trabajo analítico es idéntico para las muestras de plasma EDTA y de suero, cualquier diferencia en la imprecisión analítica total puede atribuirse a las diferencias en la matriz de la muestra, es decir, plasma EDTA frente a suero. La imprecisión analítica total se mide calculando los coeficientes de Varianza (%CV) de "señal de metabolito / señal SIL-IS correspondiente" para extracciones replicadas (n=6). Se recopilaron y evaluaron los datos de imprecisión.

Calibración:A la vista de la colección de procedimientos divulgados en esta solicitud, la capacidad de cuantificar (relativamente) los metabolitos de interés es importante; es decir, uno debe ser capaz de diferenciar un alto nivel de metabolito de un bajo nivel de metabolitos como presentes en diferentes muestras (de pacientes). La cuantificación suele realizarse estableciendo curvas de calibración en un intervalo (relevante) y leyendo el nivel de una muestra desconocida a partir de dicha curva. Como parte de los procedimientos de Garantía de Calidad, se establecen curvas de calibración para todos los metabolitos de interés. Para evaluar si la formulación patentada de la solución [precipitación de proteínas - extracción de metabolitos] ("choque") permite también la cuantificación en suero, se preparó una curva de calibración única de 8 puntos en suero (Technopath, Tipperary, Irlanda) de forma idéntica a la utilizada para el plasma EDTA. Se trazaron curvas de calibración y se estableció una función de calibración adecuada mediante regresión (lineal). La evaluación de r2 (coeficiente de correlación - al cuadrado) se utiliza para evaluar la bondad del ajuste y como indicador de si la extracción de metabolitos con la formulación "choque" admite la cuantificación en todos los metabolitos de interés.

Resultados

En la Tabla 5, se resumen los resultados de las evaluaciones de recuperación, precisión y calibración para las extracciones de plasma y suero EDTA utilizando la formulación patentada "choque". Los datos en negrita se consideran de alta calidad (respectivamente, rendimiento de extracción relativo superior >125 % de la referencia, imprecisión baja %CV<15 %, o r2 >0,98), mientras que los valores sombreados se consideran de baja calidad (respectivamente, rendimiento de extracción relativo inferior <75 % de la referencia, imprecisión alta %CV>25 %, o r2 <0,90).

No todos los SIL-IS correspondientes estaban disponibles, de ahí los valores vacíos en la Recuperación del ISTD. El valor vacío en la métrica "precisión" correspondería a niveles por debajo del "límite de detección" para estos metabolitos de interés dentro del marco analítico utilizado.

Tabla 5: Comparación de las métricas de extracción para suero frente a plasma EDTA

continuación

* La lectura es una señal combinada de 1,3-rac-Dilinoleoil-glicerol y 1,2-rac-Ditinoleoil-glicerol.

De la Tabla 5, puede concluirse que la formulación de precipitación/extracción de la invención permite la extracción eficaz y cuantificable de metabolitos de interés a través de todas las clases de metabolitos relevantes tanto de Suero como de Plasma EDTA.

Tomados en conjunto los datos ejemplares, pero no limitativos de recuperación, imprecisión y calibración, los datos tal como se muestran en la presente memoria confirman que la formulación novedosa, "choque", tal como la han desarrollado los inventores, es adecuada para extraer metabolitos de interés a través de clases de metabolitos con diferentes propiedades fisicoquímicas a partir de diferentes tipos de muestras de sangre. Esto confirma que este disolvente "de choque", y, o composiciones derivadas del mismo, son muy adecuados para los objetivos expuestos en esta solicitud.

Ejemplo 5: Extracción mediante dispositivo de micromuestreo volumétrico absorbente

También se ejemplifica un ejemplo no limitante de la capacidad de la formulación de precipitación/extracción de la invención para extraer metabolitos de interés de muestras de sangre recogidas con un dispositivo de micromuestreo volumétrico absorbente (Neoteryx 20 pl Mitra Microsamplers, Neoteryx, CA, USA). Este tipo de dispositivo de micromuestreo volumétrico absorbente es similar a la tecnología de las manchas de sangre seca (DBS). Por lo tanto, el término "DBS" se utilizará en todo momento cuando se hable de la recogida de todas estas tecnologías de recogida de muestras.

En vista de los objetivos de la colección de métodos divulgados en la presente memoria, es decir, el desarrollo de pruebas de pronóstico novedosas que puedan desplegarse fácilmente en diferentes entornos de atención sanitaria clínica en todo el mundo, y más específicamente en entornos de atención prenatal de primera línea, el uso de la tecnología de DBS es una alternativa atractiva al muestreo de plasma venoso convencional.

Facilidad de uso:La DBS es menos invasiva que la extracción convencional de muestras de sangre total, plasma o suero, ya que la sangre puede extraerse mediante un pequeño pinchazo en el dedo (o en el talón en el caso de las aplicaciones pediátricas). Debido a la facilidad de su recogida, la<d>B<s>puede obtenerse en un entorno no hospitalario por técnicos mínimamente formados o incluso en casa por los propios pacientes. Además, el procedimiento de DBS no requiere necesariamente el uso de un anticoagulante, o la separación del plasma, lo que limita el número de manipulaciones. La posibilidad de recoger muestras de sangre sin necesidad de contar con un flebotomista cualificado facilitará considerablemente la implantación de pruebas de pronóstico, como las consideradas en esta aplicación, en entornos de recursos bajos y medios.

Procedimiento rentable:el coste de envío/almacenamiento de muestras de DBS se reduce sustancialmente, porque las muestras de DBS pueden almacenarse típicamente a temperatura ambiente, aliviando la necesidad de transporte en cadena logística en frío de muestras de sangre a un laboratorio clínico central; esto permitirá de nuevo significativamente el despliegue de pruebas de diagnóstico o pronóstico, como se considera en esta solicitud, en entornos de recursos bajos y medios.

Estabilidad de los analitos:se ha informado en numerosas publicaciones que las muestras recogidas mediante DBS y almacenadas durante muchos meses (incluso años) a temperatura ambiente son tan estables como las muestras de plasma que se almacenaron a -20 °C.

Seguridad mejorada:durante el secado, la mayoría de los agentes patógenos se desactivan en los medios de DBS, lo que reduce al mínimo el riesgo de infección. Del mismo modo, se considera que la transferencia de material sanguíneo a un medio de DBS tiene un bajo riesgo de infección.

En vista de los procedimientos aquí considerados, no pueden utilizarse las recogidas típicas de DBS, es decir, manchar una gota de sangre en tipos específicos de tarjetas de papel de filtro, ya que no controlan el volumen de muestra de sangre que se recoge. Las pruebas de pronóstico que se divulgan en la presente memoria se basan en el análisis de metabolitos de interés (posiblemente en combinación con otros compuestos que circulan en la sangre de un individuo), que siempre están presentes independientemente del resultado (futuro) de salud. El rendimiento pronóstico de las pruebas divulgadas en esta solicitud se deriva de los cambios combinados no triviales en los niveles de un conjunto específico de metabolitos de interés (posiblemente en combinación con otras variables) como disponibles en un volumen específico, y la asociación de los mismos con la probabilidad de que se produzca el (futuro) resultado de salud. Esto es muy distinto de las aplicaciones (de diagnóstico) en las que el compuesto de interés, tal y como está presente en la bioespecie recogida por DBS, está presente o no está presente (binario), o depende de la relación de 2 compuestos. En estos casos, el volumen de la muestra recogida es irrelevante.

Por esta razón, los inventores se dieron cuenta de que, para desplegar las pruebas de pronóstico en base a la utilización de la tecnología DBS para la recogida de muestras de sangre, el volumen de la muestra de sangre debe ser conocido y preciso. Esto puede conseguirse manualmente utilizando, por ejemplo, capilares graduados para recoger la sangre y depositarla después en una tarjeta DBS. Otras tecnologías más avanzadas, como los dispositivos de micromuestreo volumétrico absorbente de Neoteryx (Neoteryx, CA, US) o HemaXis y otras tecnologías de muestreo DBS del sistema DBS (sistema DBS, Gland, Suiza), o HemaSpot de Spot On Sciences (Austin, TX, US), pero sin limitarse a ellas.

En la presente memoria, se evalúan las capacidades de la formulación de precipitación/extracción de la invención para extraer metabolitos de interés a partir de muestras de sangre tal como se recogen usando Neoteryx 20 pl Mitra Microsamplers, Neoteryx, CA, USA).

Las cifras de méritos de extracción se comparan para la extracción de metabolitos de calibradores derivados de plasma EDTA (r2) y controles de calidad (precisión) de los que i) 40 pl se extrajeron de la manera convencional (cf Ejemplo 2) para usarse como referencia y ii) 20 pl se muestrearon en 20 pl Mitra Microsampler. Después del secado, los dispositivos Mitra Microsampler se extrajeron con un protocolo que se mantuvo en gran medida igual (cf. Ejemplos 3 & 2) que, para las muestras líquidas convencionales, para conseguir datos comparativos significativos, así como para ilustrar la aplicabilidad genérica de los procedimientos de procesamiento de muestras divulgados en otras partes de esta solicitud. El análisis posterior de los extractos por LC-MS/MS fue idéntico y según los procedimientos de los Ejemplos 6 y 7.

Además, se investigó la confirmación de si el "choque" también extraerá los metabolitos de interés de sangre total mediante el muestreo de i) sangre total EDTA fresca y ii) plasma EDTA fresco -recogidos de la misma persona al mismo tiempo- con micromuestreadores Mitra de 20 pl. Ambos se extrajeron y analizaron con el mismo protocolo que los calibradores y los QCs descritos anteriormente.

Ejecución Experimental

Se recuperaron del congelador a -80 °C un conjunto de calibradores ya preparados y seis muestras de promedio de QC ya preparadas, es decir, alícuotas con un valor relativo de "40" (cf, calibración). Se utilizaron micromuestras Neoteryx de 20 pl para sumergirlas en el plasma durante 6 segundos y, a continuación, se colocaron a secar en una bolsa desecante durante toda la noche, protegidas de la luz. Además, se dividió en dos partes una muestra de sangre total recién extraída de una mujer voluntaria sana (no embarazada) y se obtuvo plasma EDTA por centrifugación de una parte, para preparar plasma naive comparable. A continuación, tanto la sangre total ingenua como el plasma ingenuo se recogieron en un micromuestreador Neoteryx de 20 pl y se colocaron a secar en una bolsa desecada durante toda la noche, protegidos de la luz.

Al día siguiente, los muestreadores Neoteryx de 20 pl se separaron de su soporte en tubos Eppendorf de polipropileno de 1,2 ml. A continuación, los tubos se agitaron suavemente durante 30 minutos tras añadir 350 pl de la solución de "choque" patentada, para lo cual la solución de "choque" se prefortificó con 10 pl de SIL-IS (cf. Ejemplo 1), luego se sonicaron los tubos durante 5 minutos y se transfirieron a un congelador a -20 °C durante 20 minutos; después se agitaron brevemente durante 3 segundos y luego se centrifugaron durante 15 minutos a 1400 rpm a 4 °C. Se extrajo el sobrenadante y se distribuyó en 2 viales (150 pl en cada uno) y luego se evaporó durante 1 hora a 40 °C, tras lo cual un juego se reconstituyó inmediatamente y se analizó con HILIC-MS/MS (ejemplos 6 & 7); el otro juego se almacenó a -80 °C hasta su análisis con análisis hidrofóbico RPLC-MSMS (ejemplos 6 & 7).

Paralelamente, un 2do conjunto de calibradores ya preparados y otro conjunto de seis muestras de control de calidad (del mismo lote que las utilizadas para el muestreo en los muestreadores Neoteryx) se extrajeron con la formulación patentada "choque" y se analizaron posteriormente según los procedimientos genéricos (Ejemplos 6, 7 & 2).

Extractabilidad a partir de especímenes recién recolectados:

Para los metabolitos de interés, se determinó si la formulación patentada "de choque" permitía su extracción y posterior análisis LC-MS/MS a partir de sangre total y plasma EDTA naíve no enriquecidos, tal como se recogieron/almacenaron en un micromuestreador Mitra de 20 pl. La evaluación implicó la confirmación de la generación de una lectura cuantificable (relación señal Metabolito / señal SlL-IS). Los datos se presentan en la Tabla 6.

Imprecisión:En vista de la colección de procedimientos divulgados en esta solicitud, es importante la capacidad de extraer los metabolitos de interés con alta reproducibilidad (precisión) (cf. también el Ejemplo 2). Para evaluar la imprecisión, se analizaron los metabolitos de interés presentes en las muestras medias de QC (6 réplicas de cada una) en plasma EDTA extraído de forma convencional (referencia), así como en muestras medias de QC remuestreadas con micromuestreadores. Los datos de precisión correspondientes se presentan también en la Tabla 6.

Calibración:En vista de la colección de procedimientos divulgados en esta solicitud, la capacidad de cuantificar (relativamente) los metabolitos de interés es importante. Para evaluar si el "choque" patentado admite la cuantificación de metabolitos de interés a partir de muestras de sangre recogidas con una tecnología DBS ejemplar, se remuestreó una única curva de calibración de 8 puntos con micromuestreadores Neoteryx, se extrajo y se analizó. Las lecturas de la curva de calibración se compararon con una curva idéntica preparada en solución, en el mismo experimento. Se trazaron curvas de calibración y se estableció una función de calibración adecuada mediante regresión (lineal). La evaluación de r2 (coeficiente de correlación - al cuadrado) se utiliza para evaluar la bondad del ajuste y como indicador de si la extracción de metabolitos con la formulación "choque" admite la cuantificación en todos los metabolitos de interés. Los datos de "calibración" correspondientes se presentan también en la Tabla 6.

Resultados

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Chrom; mal resuelto a partir del ácido 2-Hidroxibutanoico; * por debajo del límite de detección para el espectrómetro de ensayo utilizado; * recuperación parcial con la formulación “de choque” utilizada, recuperaciones mejoradas alcanzables con el aumento de la fracción de IPA dentro de la formulación; la lectura es una señal combinada de 1,3-rac-dilinoleoilglicerol y 1,2-rac-dilinoleoil-glicero!

En la Tabla 6, se resumen los resultados de las evaluaciones de extractabilidad, precisión y calibración para las extracciones utilizando la formulación patentada "choque" a partir de muestras de sangre recogidas utilizando dispositivos de micromuestreo volumétrico Neoteryx Mitra, así como para muestras de plasma EDTA extraídas convencionalmente de comparador. Los datos en negrita se consideran de alta calidad (respectivamente, baja imprecisión %CV<15 %, o r2 >0,98), mientras que los valores sombreados se consideran de baja calidad (alta imprecisión %CV>25 %, o r2 <0,90).

A partir de la Tabla 6, puede concluirse que el "choque" patentado aquí divulgado permite la extracción eficaz y cuantificable de metabolitos de interés a través de todas las clases de metabolitos relevantes a partir de medios de recogida alternativos, y más específicamente a partir de medios de muestreo del tipo de tecnología DBS.

Tomando en conjunto los datos de extracción, imprecisión y calibración ejemplares, pero no limitantes, los datos tal como se muestran aquí confirman que la formulación novedosa, "choque", tal como la desarrollaron los inventores, es adecuada para extraer metabolitos de interés a través de clases de metabolitos con diferentes propiedades fisicoquímicas de diferentes tipos de muestras de sangre, y de diferentes medios de muestreo de muestras. Esto confirma que este disolvente "de choque", y, o composiciones derivadas del mismo, son muy adecuados para los objetivos expuestos en esta solicitud, y más concretamente para la realización de pruebas de pronóstico, como se divulga en otra parte de esta solicitud en la atención clínica de 1a línea.

Ejemplo 6: Doble Separación de Metabolitos por Cromatografía Líquida

Apuntalando la colección de métodos como se expone en esta solicitud, está la capacidad de identificar y cuantificar sin ambigüedad colecciones de metabolitos transmitidos por la sangre que son, por sí solos y/o como parte de una combinación de metabolitos, relevantes para el diagnóstico o la predicción del riesgo de un resultado de salud (futuro). Para permitir la identificación y cuantificación por espectrometría de masas (Ejemplo 7), los metabolitos de interés deben estar suficientemente resueltos entre sí, es decir, separados, para que el espectrómetro de masas pueda realizar una cuantificación precisa. La clave para ello es la necesidad de un tiempo de ciclo adecuado, es decir, el espectrómetro de masas debe ser capaz de recoger suficientes puntos de datos a lo largo de un pico cromatográfico para permitir la integración correcta, es decir, la cuantificación, de estos picos. Dado que las listas de metabolitos de interés suelen ser extensas y que la necesidad de coanálisis de SIL-IS está justificada, la necesidad de separación se hace evidente. Además, los metabolitos de interés deben entregarse al espectrómetro de masas de forma que se facilite su ionización y, al mismo tiempo, los disolventes de entrega deben ser compatibles con la detección por espectrometría de masas. Típicamente, pero no se limitan a, la ionización en electroaspersión es favorable cuando los compuestos de interés se entregan al espectrómetro de masas en un disolvente que tiene un contenido orgánico significativo, ya que estos últimos son típicamente más volátiles. Esto, a su vez, determinará el procedimiento cromatográfico óptimo que debe utilizarse para separar un metabolito de interés de otros, de acuerdo con las propiedades fisicoquímicas del metabolito de interés. Teniendo en cuenta estos prerrequisitos, y en vista de la colección de procedimientos divulgados en la presente memoria, los inventores establecieron un sistema cromatográfico dual para los extractos de metabolitos derivados de la sangre.

Típicamente, pero sin limitarse a ello, se generan 2 o más alícuotas como resultado del trabajo de extracción de metabolitos de las muestras de sangre. (cf. Ejemplo 2).

Para cada muestra de sangre, se someterá una alícuota a un análisis LC-MS/MS combinando Cromatografía Líquida de Fase Inversa C18 (RPLC) con análisis MS/MS (cf. Ejemplo 7). En este análisis se analizan los metabolitos hidrofóbicos de interés (y los SIL-IS asociados).

A continuación, otra alícuota, procedente de la misma muestra de sangre, se someterá a un análisis LC-MS/MS que combina Cromatografía Líquida de Interacción Hidrofílica (HILIC) con análisis MS/MS (cf. Ejemplo 7). En este análisis se analizan los metabolitos hidrófilos de interés (y los SIL-IS asociados).

Ejemplos típicos, pero no limitativos, de procedimientos de LC, se detallan a continuación:

Materiales y reactivos utilizados en las separaciones duales.

El acetato de amonio (NH4OAc) y el formiato de amonio (NH4HCOO) de calidad LC-MS se adquirieron a Fluka (Arklow, Irlanda). El ácido acético, el acetonitrilo (ACN), el metanol (MeOH) y el 2-Propanol (IPA) de calidad LC-MS óptima se adquirieron a Fischer scientific (Blanchardstown, Irlanda). Las sustancias de referencia de los metabolitos y los patrones marcados con isótopos estables (SIL) son los que se presentan en las Tablas 7 y 8.

Para la RPLC, el tipo de columna utilizado fue una columna Zorbax Eclipse Plus C18 Resolución Rápida HD 2,1 x 50 mm, 1,8 micrómetros (PN. 959757-902; Agilent Technologies, Little Island, Irlanda). Para el HILIC-MS/MS, el tipo de columna fue una Ascentis Express HILIC 150 x 2,1 mm, 2,7 micrómetros (PN. 53946-U: Sigma-Aldrich, Arklow, Irlanda) Instrumento: La plataforma LC-MS/MS utilizada consistía en un sistema LC 1260 Infinity (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania). Este último se acopló a un espectrómetro de masas Agilent Triple Quadrupole 6460 (QqQ-MS) equipado con una fuente de ionización JetStream Electrospray (Agilent Technologies, Santa Clara, Ca , USA) (Cf. Ejemplo 6).

RPLC:

El procedimiento RPLC se define mediante los siguientes ajustes/parámetros:

- Volumen de inyección: 7 pl

- Temperatura del horno de columna: 60 °C

- La RPLC en gradiente se realizó para resolver los metabolitos hidrófobos utilizando un sistema disolvente binario:

° fase móvil A: Tampón agua:MeOH:NH4OAc 200mM a pH 4,5, (92:3:5)

o fase móvil B: MeOH:Acetonitrilo:IPA:NH4OAc 200mM a pH 4,5 (35:35:25:5)

Se aplicó un programa de gradiente lineal: del 10 % de fase móvil B al 100 % de fase móvil B en 10 minutos, utilizando el siguiente programa de gradiente - tasa de flujo:

Utilizando este procedimiento cromatográfico, los metabolitos hidrófobos de interés y los SIL-IS correspondientes se caracterizaron por los siguientes tiempos de retención, detallados en la Tabla 7.

Tenga en cuenta: No todos los metabolitos de interés tienen disponible un SIL-IS acorde.

El eflujo de la columna de RPLC se condujo directamente al QqQ-MS para la determinación por espectrometría de masas de los compuestos hidrófobos de interés (Ejemplo 7).

Tabla 7:Tiempos de retención ejemplares para metabolitos hidrófobos de interés y SIL-IS

(continuación)

HILIC:

El procedimiento HILIC se define mediante los siguientes ajustes/parámetros:

- Volumen de inyección: 3 pl, por lo que el tapón de inyección estaba corcheteado por tapones de disolvente ACN de 3 pl; para ello se ideó un programa de inyector específico.

- Temperatura del horno de columna: 30 °C

- Se realizó HILIC en gradiente para resolver los metabolitos hidrófobos utilizando un sistema disolvente binario:

° fase móvil A: 50 mM Formiato de amonio (acuoso)

° fase móvil B: ACN

- Se aplicó un programa de gradiente por etapas lineal: de 10 % de fase móvil B a 100 % de fase móvil B en 10 minutos. utilizando el siguiente programa de gradiente - tasa de flujo:

Utilizando este procedimiento cromatográfico, los metabolitos hidrófilos de interés y SIL-IS correspondientes se caracterizaron por los siguientes tiempos de retención; Tabla 8. Tenga en cuenta: No todos los metabolitos de interés tienen disponible un SIL-IS acorde.

El eflujo de la columna de RPLC se condujo directamente al QqQ-MS para la determinación por espectrometría de masas de los compuestos hidrófobos de interés (Ejemplo 7).

Tabla8:Tiempos de retención ejemplares para metabolitos hidrófilos de interés y SIL-IS

continuación

Ejemplo 7: MS/MS en Tándem

La espectroscopia de masas en tándem se llevó a cabo con ionización por electrospray positiva y negativa y en modo de monitorización de reacciones múltiples (MRM). Para cada metabolito de interés, se establecieron y optimizaron específicamente los siguientes parámetros para todos y cada uno de los metabolitos de interés y cada SIL-IS disponible:

- m/z del ion precursor adecuado, incluido su modo de ionización preferido (positivo o negativo),

- Espectros de iones producto en distintas condiciones de voltaje de colisión (véase la inducción de colisiones iónmolécula en distintos regímenes de energía, que dan lugar a iones producto específicos) y selección de los iones producto Cuantificadores y Cualificadores más adecuados que se utilizarán para la identificación y las cuantificaciones por espectrometría de masas.

- Establecimiento de las relaciones ion Cuantificador / ion Cualificador de referencia que servirán para evaluar la especificidad.

- Además, también se optimizaron una serie de parámetros del instrumento específicos del ensayo por compuesto de interés: resoluciones cuadrupolares, tiempo de permanencia, voltaje del fragmentador, energía de colisión y voltaje V del Acelerador de células.

Al mismo tiempo, se optimizaron parámetros específicos del instrumento para mantener al máximo la integridad del compuesto en la fuente de electroaspersión y lograr un análisis de metabolitos sensible y específico; temperatura de la fuente, flujo de gas de vaina, flujo de gas de secado y voltaje capilar.

Instrumento: La plataforma LC-MS/MS utilizada consistía en un sistema LC 1260 Infinity (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania) acoplado a un espectrómetro de masas Agilent Triple Quadrupole 6460 (QqQ-MS) equipado con una fuente de ionización JetStream Electrospray (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).

RPLC-ESI-MS/MS

Para el procedimiento de espectrometría de masas utilizado para analizar los metabolitos hidrofóbicos de interés, los parámetros optimizados de la fuente de ionización por electroaspersión son los siguientes:

Los parámetros MRM establecidos para permitir la identificación inequívoca de los metabolitos hidrofóbicos de interés y según SIL-IS se presentan en laTabla 9.

Tabla 9.Parámetros MRM para los metabolitos hidrofóbicos de interés y SIL-IS asociados

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HILIC-MS/MS:

Para el procedimiento de espectrometría de masas utilizado para analizar los metabolitos hidrofílicos de interés, los parámetros optimizados de la fuente de ionización por electroaspersión son los siguientes:

Los parámetros MRM establecidos para permitir la identificación inequívoca de los metabolitos hidrofílicos de interés y según SIL-IS se presentan en la Tabla 10.

Tabla 10.Parámetros MRM para los metabolitos hidrofílicos de interés y SIL-IS asociados

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Ejemplo8: Metabolitos de interés

La Tabla 11.tabula una lista no limitativa de metabolitos de interés que se consideran en esta solicitud. Estos metabolitos, o clases de metabolitos, son considerados relevantes por los inventores con vistas a identificar combinaciones pronósticas no obvias de metabolitos, para predecir el riesgo de preeclampsia en una mujer embarazada antes de la aparición de síntomas clínicos de preeclampsia en la mujer. Cuando es posible, los metabolitos de interés se identifican por su número CAS, o/y su identificador HMDB; también se indican los pesos moleculares (na: no disponible).

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Para desarrollar la colección de métodos analíticos como se divulga a en la presente memoria, se adquirieron materiales de referencia para los metabolitos anteriores a: Fluka (Arklow, Irlanda), Fischer scientific (Blanchardstown, Irlanda), IsoSciences (King of Prussia, PA, USA), Sigma-Aldrich (Wicklow, Irlanda), Avanti Lipids (Alabaster, Alabama, USA), QMX Laboratories (Thaxted, Reino Unido), LGC (Teddington, U.K), Alfa Chemistry (Holtsville, N<y>, USA), Generon (Maidenhead, Reino Unido), Larodan (Solna, Suecia) y R&D Systems (Abingdon, Reino Unido). Dependiendo de las características fisicoquímicas del metabolito de interés, a veces se obtenía una forma salina del metabolito de interés.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de elaboración de perfiles metabólicos cuantitativos de una muestra biológica que contiene múltiples metabolitos que representan una pluralidad de clases de metabolitos diferentes, que comprende las etapas de:

pretratar la muestra biológica con un disolvente de extracción de metabolitos para obtener una muestra pretratada; separar una primera alícuota de la muestra pretratada mediante cromatografía líquida de fase inversa (RPLC) para proporcionar un primer eluyente que contenga metabolitos hidrófobos resueltos;

separar una segunda alícuota de la muestra pretratada mediante cromatografía de interacción líquida hidrofílica (HILIC) para proporcionar un segundo eluyente que contenga metabolitos hidrofílicos resueltos; y

ensayar el primer y segundo eluyentes mediante espectroscopia de masas en tándem diana operada en modo de monitorización de reacciones múltiples para perfilar cuantitativamente los metabolitos que representan la pluralidad de clases de metabolitos diferentes,

en el que el disolvente de extracción de metabolitos comprende metanol, isopropanol y un tampón de acetato y en el que la mezcla de muestra biológica y disolvente de extracción de metabolitos se incuba a una temperatura menor que 10 °C durante un período de tiempo para favorecer la precipitación de proteínas, antes de la separación de las proteínas precipitadas.

2. Un procedimiento según la Reivindicación 1 en el que cada cromatografía (LC) se hilvana directamente con la espectrometría de masas en tándem (MS/MS) en un único análisis LC-MS/MS.

3. Un procedimiento según las Reivindicaciones 1 o 2 en el que el disolvente de extracción de metabolitos comprende metanol, isopropanol y un tampón de acetato en una relación de aproximadamente 10:9:1 (v/v/v).

4. Un procedimiento según cualquier Reivindicación precedente en el que el disolvente de extracción de metabolitos comprende de 0,01 a 0,1 % de b Ht (m/v).

5. Un procedimiento según cualquiera de las Reivindicaciones precedentes en el que la mezcla de muestra biológica y disolvente de extracción de metabolitos se incuba a una temperatura menor que 5 °C durante un periodo de tiempo para favorecer la precipitación de las proteínas, antes de la separación de las proteínas precipitadas.

6. Un procedimiento según cualquiera de las Reivindicaciones precedentes en el que la muestra biológica es una muestra líquida y se recoge y almacena en un dispositivo de muestreo con control de volumen.

7. Un procedimiento según cualquiera de las Reivindicaciones anteriores en el que la espectroscopia de masas en tándem comprende ionización por electroaspersión en la que la espectroscopia de masas en tándem se lleva a cabo bajo ionización por electroaspersión tanto positiva como negativa.

8. Un procedimiento según cualquier Reivindicación precedente en el que la RPLC emplea una mezcla variable de una primera fase móvil que comprende agua, metanol y un tampón de acetato y una segunda fase móvil que comprende metanol, acetonitrilo, isopropanol y un tampón de acetato de amonio.

9. Un procedimiento según la Reivindicación 8 en el que las fases móviles se mezclan según un gradiente lineal de aproximadamente 0 % a 100 % o de aproximadamente 88 % a 50 % de fase móvil B durante un periodo de aproximadamente 8-12 minutos.

10. Un procedimiento según cualquier Reivindicación precedente en el que el HILIC emplea una mezcla variable de una primera fase móvil que comprende formiato de amonio y una segunda fase móvil que comprende acetonitrilo.

11. Un procedimiento según cualquier Reivindicación precedente en el que la muestra biológica comprende uno o más estándares internos marcados con isótopos estables (SIL-IS) correspondientes a uno o más metabolitos.

12. Un procedimiento según la Reivindicación 11 en el que la pluralidad de metabolitos representa una pluralidad de clases de metabolitos seleccionados de acetilos, alcanos acíclicos, acilcarnitinas, aldehídos, aminoácidos, aminocetonas, aralquilaminas, benceno y derivados sustituidos, tetrapirrolos y derivados, bifenilos y derivados, carnitinas, colinas, corticosteroides y derivados, cumarinas y derivados, diacilgliceroles, ácidos dicarboxílicos, dipéptidos, eicosanoides, ácidos grasos (incluidos los ácidos grasos hidroperoxílicos, ceto- o hidroxi-ácidos grasos, ácidos grasos saturados, ácidos grasos insaturados, ácidos grasos epoxi), glicerofosfolípidos, hidroxiácidos y derivados, fosfatos monosacáridos, N-acilalfa-aminoácidos, ácidos fenilpropanoicos, fosfosfingolípidos, compuestos azacíclicos (por ejemplo, piridinas), esfingolípidos, alcoholes de azúcar, andrógenos y esteroides (por ejemplo, testosteronas), vitamina D y derivados.

13. Un procedimiento según cualquiera de las Reivindicaciones precedentes, que es un método de elaboración de perfiles de metabolitos en la muestra biológica.

14. Un método para detectar o predecir el riesgo de un trastorno relacionado con el embarazo en una mujer embarazada, el método comprende las etapas de procesamiento de una muestra biológica que contiene múltiples metabolitos obtenidos de una mujer embarazada según un procedimiento de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 13 para proporcionar un nivel de al menos un metabolito, comparar el nivel del al menos un metabolito con un nivel de referencia, y detectar o predecir el riesgo de un trastorno relacionado con el embarazo en base a la comparación.