ES3035812T3 - Methods and kits for preparing nucleic acid libraries - Google Patents

Abstract

Esta invención se refiere a métodos, composiciones y kits para la extensión de un polinucleótido y la preparación de una biblioteca de secuenciación de polinucleótidos, que implica la generación de un polinucleótido diana modificado en un oligonucleótido molde adaptador y el marcado de una o dos cadenas de una secuencia diana. La biblioteca de secuenciación es adecuada para la secuenciación masiva paralela y comprende una pluralidad de moléculas de ácido nucleico bicatenario. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y kits para la preparación de bibliotecas de ácidos nucleicos

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a métodos para la extensión de polinucleótidos diana. Se añade una secuencia adaptadora al extremo 3' de los ácidos nucleicos monocatenarios.

La secuenciación de ADN de próxima generación promete revolucionar la medicina clínica y la investigación básica. Sin embargo, si bien esta tecnología puede generar cientos de miles de millones de nucleótidos de secuencia de ADN en un solo experimento, la tasa de error de ~ 1 % resulta en cientos de millones de errores de secuenciación. Estos errores dispersos se vuelven extremadamente problemáticos cuando se realiza una "secuenciación profunda" de mezclas genéticamente heterogéneas, como tumores o poblaciones microbianas mixtas.

Para superar las limitaciones en la precisión de la secuenciación, se han descrito varios métodos. La secuenciación dúplex (Schmitt et al., PNAS 109: 14508-14513) es uno de ellos. Este enfoque reduce considerablemente los errores al etiquetar y secuenciar de forma independiente cada una de las dos cadenas de un dúplex de ADN. Como las dos cadenas son complementarias, las mutaciones verdaderas se encuentran en la misma posición en ambas cadenas. Por el contrario, los errores de PCR o secuenciación resultan en mutaciones en una sola cadena y, por lo tanto, pueden descartarse como un error técnico. Otro enfoque, denominado sistema de secuenciación segura ("Safe-SeqS"), fue descrito por Kinde et al. (PNAS 2011 Jun 7; 108(23): 9530-5). Las claves de este enfoque son (i) la asignación de un identificador único (UID) a cada molécula plantilla, (ii) la amplificación de cada molécula plantilla con etiqueta única para crear familias de UID, y (iii) la secuenciación redundante de los productos de amplificación. Los fragmentos de PCR con el mismo UID se consideran mutantes ("supermutantes") solo si >95 % de ellos contienen la misma mutación. Las patentes estadounidenses US 8,722,368, US 8,685,678 y US 8,742,606 describen métodos de secuenciación de polinucleótidos unidos a una región de bases degeneradas para determinar/estimar el número de polinucleótidos de partida diferentes. Sin embargo, estos métodos no son fáciles de utilizar para la secuenciación dirigida de amplicones y, a menudo, implican la ligadura para unir la región de bases degeneradas. Para el enriquecimiento y la secuenciación dirigidos de amplicones, no es fácil secuenciar eventos de fusión o translocación. Además, a veces resulta difícil diseñar pares de cebadores adecuados para cubrir una región de puntos calientes sin perder algunas regiones por no ser secuenciables, ya que el sitio del cebador no se puede secuenciar. Para la amplificación multiplex en un solo tubo, las regiones superpuestas no se pueden amplificar, lo que resulta en la pérdida de información de secuenciación en la región de unión del cebador de un polinucleótido diana. Para fragmentos diana de pequeño tamaño, tales como ADN plasmático, ARN pequeño o miARN, el diseño de un par de cebadores también es difícil, ya que no hay mucho espacio para diseñar la secuencia del cebador. El documento WO 2007062495 proporciona métodos para añadir una etiqueta de secuencia terminal a moléculas de ácido nucleico. El oligonucleótido utilizado en los métodos comprende: una porción sobresaliente 5' que comprende una primera etiqueta de secuencia idéntica, una porción de secuencia que hibrida con la molécula de ácido nucleico diana, comprendiendo dicha porción que hibrida una sección de ácido ribonucleico y; c) un extremo 3' bloqueado donde el ribonucleótido se digiere y por lo tanto se vuelve un extremo 3'OH libre extensible.

La secuenciación dirigida de próxima generación suele implicar el análisis de fragmentos grandes y complejos, lo que se logra mediante PCR multiplex (la amplificación simultánea de diferentes secuencias de ADN diana en una sola reacción de PCR). Sin embargo, los resultados obtenidos con PCR multiplex suelen complicarse por artefactos en los productos de amplificación. Estos incluyen resultados falsos negativos debidos a fallos de reacción y resultados falsos positivos (como la amplificación de productos espurios) debido a eventos de cebado inespecífico. Dado que la posibilidad de cebado inespecífico aumenta con cada par de cebadores adicional, las condiciones deben modificarse según sea necesario a medida que se añaden grupos de cebadores individuales.

Descripción detallada

Para facilitar la comprensión de la invención, a continuación, se definen varios términos. Como se usa en el presente documento, una "muestra" se refiere a cualquier sustancia que contenga o se presuma que contenga ácidos nucleicos, e incluye una muestra de tejido o fluido aislada de uno o más individuos. En particular, la muestra de ácido nucleico puede obtenerse de una sola célula, un organismo o una combinación de organismos seleccionados entre virus, bacterias, hongos, plantas y animales. Preferiblemente, la muestra de ácido nucleico se obtiene de un mamífero. En una realización preferida, el mamífero es un ser humano. La muestra de ácido nucleico puede obtenerse de una muestra de fluido corporal o biopsia de tejido de un sujeto, o de células cultivadas. El fluido corporal puede seleccionarse entre sangre completa, suero, plasma, orina, esputo, bilis, heces, médula ósea, linfa, semen, exudado mamario, bilis, saliva, lágrimas, lavados bronquiales, lavados gástricos, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, líquido peritoneal, derrame pleural y líquido amniótico. Una "muestra individual" puede ser una sola célula, que puede ser una célula T o una célula B, mientras que la pluralidad de muestras puede estar formada por muchas células sanguíneas en una muestra de sangre.

Como se usa en el presente documento, el término "secuencia de nucleótidos" se refiere a un homopolímero o heteropolímero de desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos u otros ácidos nucleicos.

Como se usa en el presente documento, el término "nucleótido" se refiere generalmente a los componentes monoméricos de las secuencias de nucleótidos, aunque estos monómeros pueden ser análogos de nucleósidos y/o nucleótidos, y/o nucleósidos modificados, tal como nucleósidos modificados con amino, además de nucleótidos. Además, "nucleótido" incluye estructuras análogas no naturales. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos u otros ácidos nucleicos.

Como se usa en el presente documento, el término "ácido nucleico" se refiere a al menos dos nucleótidos unidos covalentemente. Un ácido nucleico generalmente contiene enlaces fosfodiéster, aunque en algunos casos se incluyen análogos de ácidos nucleicos que pueden tener cadenas principales alternativas. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios, según se especifique, o contener porciones de secuencias tanto bicatenarias como monocatenarias. El ácido nucleico puede ser ADN, tanto genómico como ADNc, ARN, mezclas de ADN y ARN, o híbridos de ADN-ARN, donde el ácido nucleico contiene cualquier combinación de desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos, y cualquier combinación de bases, incluyendo uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina, hipoxantina, etc. La referencia a una "secuencia de ADN" o "secuencia de ARN" puede incluir tanto ADN o ARN monocatenario como bicatenario. Una secuencia específica, a menos que el contexto indique lo contrario, se refiere al ADN o ARN monocatenario de dicha secuencia, al dúplex de dicha secuencia con su complemento (ADN o ARN bicatenario) y/o al complemento de dicha secuencia.

Como se usa en el presente documento, el "polinucleótido" y "oligonucleótido" son tipos de "ácido nucleico" y generalmente se refieren a cebadores o fragmentos de oligómeros que se van a detectar. No se pretende distinguir la longitud entre los términos "ácido nucleico", "polinucleótido" y "oligonucleótido", y estos términos se utilizarán indistintamente. "Ácido nucleico", "ADN" y "ARN" y términos similares también incluyen análogos de ácidos nucleicos. El oligonucleótido no se deriva necesariamente de ninguna secuencia existente o natural, sino que puede generarse de cualquier manera, incluyendo síntesis química, replicación de ADN, transcripción inversa o una combinación de estas.

Como se usa en el presente documento, los términos "secuencia diana", "ácido nucleico diana", "polinucleótido diana" y "ácidos nucleicos de interés" se utilizan indistintamente y se refieren a una región deseada que se va a amplificar, detectar o ambas cosas, o que es objeto de hibridación con un oligonucleótido o polinucleótido complementario (por ejemplo, un oligómero de bloqueo) o que se somete a un proceso de extensión de cebadores. La secuencia diana puede estar compuesta de ADN, ARN, análogos de estos o combinaciones de estos. La secuencia diana puede ser monocatenaria o bicatenaria. En los procesos de extensión, el polinucleótido diana que forma un dúplex de hibridación con un oligonucleótido (plantilla) puede denominarse "cebador", o el ácido nucleico diana que forma un dúplex de hibridación con el cebador también puede denominarse "plantilla". Una plantilla sirve como patrón para la síntesis de un polinucleótido complementario. Una secuencia diana puede derivarse de cualquier organismo vivo o que haya estado vivo, incluyendo, entre otros, procariotas, eucariotas, plantas, animales y virus, así como secuencias diana sintéticas y/o recombinantes, o una combinación de estas.

"Cebador", tal como se utiliza en este documento, se refiere a un oligonucleótido o polinucleótido, ya sea de origen natural o sintético, capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis cuando se somete a condiciones que inducen la síntesis de un producto de extensión del cebador, complementario a una cadena de ácido nucleico; es decir, en presencia de nucleótidos y un agente de polimerización, a una temperatura y un tampón adecuados. Dichas condiciones incluyen la presencia de cuatro o más trifosfatos de desoxirribonucleósido diferentes y un agente inductor de polimerización, como la ADN polimerasa, y/o la ARN polimerasa y/o la transcriptasa inversa, en un tampón adecuado ("tampón" incluye sustituyentes que son cofactores o que afectan al pH, la fuerza iónica, etc.), y a una temperatura adecuada. Los cebadores Como se usa en el presente documento se seleccionan para que sean sustancialmente complementarios a una cadena de cada secuencia específica que se va a extender. Esto significa que los cebadores deben ser lo suficientemente complementarios como para hibridar con sus respectivas cadenas. Puede estar presente un nucleótido no complementario.

Como se usa en el presente documento, el término "complementario" se refiere a la capacidad de dos secuencias de nucleótidos, ya sea aleatoriamente o por diseño, de unirse entre sí de forma específica mediante enlaces de hidrógeno a través de sus bases púricas y/o pirimidínicas, según las reglas habituales de Watson-Crick para la formación de complejos de ácidos nucleicos dúplex. También puede referirse a la capacidad de las secuencias de nucleótidos, que pueden incluir nucleótidos modificados, o análogos de desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos, o combinaciones de los mismos para unir específicamente secuencias entre sí mediante métodos distintos a las reglas habituales de Watson-Crick para formar estructuras dúplex de ácidos nucleicos alternativas.

Como se usa en el presente documento, los términos "hibridación" y "recocido" son intercambiables y se refieren al proceso mediante el cual dos secuencias de nucleótidos complementarias se unen para formar una secuencia o segmento dúplex.

Los términos "dúplex" y "bicatenario" son intercambiables, lo que significa una estructura formada como resultado de la hibridación entre dos secuencias complementarias de ácidos nucleicos. Estos dúplex pueden formarse mediante la unión complementaria de dos segmentos de ADN, dos segmentos de ARN, un segmento de ADN y otro de ARN, o dos segmentos compuestos por una mezcla de ARN y ADN, estas últimas estructuras también pueden denominarse dúplex híbridos. Cualquiera o ambos miembros de estos dúplex pueden contener nucleótidos modificados y/o análogos de nucleótidos, así como análogos de nucleósidos. Como se divulga en el presente documento, estos dúplex se forman como resultado de la unión de uno o más oligonucleótidos bloqueantes a una secuencia de muestra.

Como se usa en el presente documento, los términos "ácido nucleico de tipo silvestre", "ácido nucleico normal", "ácido nucleico con nucleótidos normales", "ADN de tipo silvestre" y "plantilla de tipo silvestre" se utilizan indistintamente y se refieren a un polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos se considera normal o inalterada.

Como se usa en el presente documento, los términos "polinucleótido mutante", "ácido nucleico mutante", "ácido nucleico variante" y "ácido nucleico con nucleótidos variantes" se refieren a un polinucleótido cuya secuencia de nucleótidos difiere de la del polinucleótido silvestre correspondiente. La diferencia en la secuencia de nucleótidos del polinucleótido mutante con respecto a la del polinucleótido de tipo silvestre se denomina "mutación", "nucleótido variante" o "variación". El término "uno o más nucleótidos variantes" también se refiere a una o más sustituciones, eliminaciones, inserciones, metilaciones y/o modificaciones de nucleótidos.

"Amplificación", como se usa en el presente documento, se refiere al uso de cualquier procedimiento de amplificación para aumentar la concentración o el número de copias de una secuencia de ácido nucleico particular dentro de una mezcla de secuencias de ácidos nucleicos. La amplificación puede ser lineal o exponencial.

Los términos "producto amplificado" o "amplicón" se refieren a un fragmento de ADN o ARN amplificado por una polimerasa mediante cebadores en un método de amplificación.

Los términos "producto de extensión del cebador" se refieren a un fragmento de ADN o ARN extendido por una polimerasa mediante uno o un par de cebadores en una reacción, que puede implicar una extensión de una sola etapa, por ejemplo, la síntesis de ADNc de primera cadena, o múltiples ciclos de extensión que pueden ser una amplificación lineal, o síntesis de ADNc, o muchos ciclos de extensión que pueden ser una amplificación exponencial como la PCR.

El término "compatible" se refiere a una secuencia de cebador o a una porción de ella que es idéntica, o sustancialmente idéntica, complementaria, sustancialmente complementaria o similar a una secuencia de cebador de PCR/secuenciación de la secuencia de cebador utilizada en una plataforma de secuenciación paralela masiva.

La práctica de la presente invención empleará, salvo indicación contraria, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología y técnicas de ADN recombinante, que son competencia de un experto en la materia.

La invención se expone en el grupo de las reivindicaciones adjuntas.

En el presente documento se divulga, pero no forma parte de la invención un oligonucleótido plantilla removible (RTO) para generar una biblioteca de polinucleótidos que comprende:

(a) una secuencia aleatoria 3';

(b) el extremo 3' está unido a una fracción bloqueadora, lo que hace que vuelve al RTO inextensible;

(c) una secuencia universal, 5' a la secuencia aleatoria; y

(b) una secuencia/modificación de nucleótidos (NSM) reconocible por un agente,

donde RTO sirve como plantilla, no se incorpora al producto de reacción y se destruye/elimina tras la reacción,

donde la secuencia/modificación de nucleótidos facilita la eliminación del RTO.

En una realización descrita en el presente documento, la fracción bloqueadora 3' y la NSM son la misma. La fracción bloqueadora 3' y la NSM pueden ser biotina, y el agente es avidina o estreptavidina. La NSM permite la eliminación del RTO, por ejemplo, mediante digestión que produce la escisión de la cadena, o mediante purificación por afinidad. La molécula de RTO comprende una o varias fracciones de NSM que lo hacen degradable o no interfiere ni compite en una o más reacciones posteriores a la reacción de extensión, donde la fracción es reconocible por un agente, lo que facilita la digestión/eliminación del RTO.

El oligonucleótido plantilla removible (RTO) también puede denominarse oligos plantilla adaptadores (ATO). Los términos RTO y ATO se pueden usar indistintamente y se refieren a oligonucleótidos que sirven como plantillas para extender los extremos de las dianas con el fin de modificarlas y añadir secuencias conocidas mediante la extensión de la polimerasa. El término oligos plantilla adaptadores (ATO), u oligonucleótido plantilla removible (RTO), se refiere a una población de secuencias que tienen una región común (universal) entre cada miembro de la población y una secuencia aleatoria variable (denominada N, donde N es cada una de las cuatro bases). Por lo tanto, la población de oligonucleótidos plantilla adaptadores (ATO) se refiere a una pluralidad de secuencias diferentes debido a la naturaleza aleatoria de los extremos 3'.

Se describe, pero no forma parte de la invención un oligos plantilla adaptadores (ATO) para la extensión de polinucleótidos que comprende:

(a) una secuencia aleatoria 3';

(b) el extremo 3' está unido con un bloqueador, lo que hace que ATO no sea extensible; y

(c) una secuencia universal, 5' respecto a la secuencia aleatoria;

donde ATO sirve como plantilla para dirigir una reacción de extensión por una polimerasa.

El término secuencia universal se refiere a la totalidad del ATO desde su extremo 5' hasta el primer nucleótido de la secuencia aleatoria o específica diana, y se denomina así porque es una "secuencia universal" presente en todos los ATO.

La molécula del ATO puede comprender además una o varias fracciones que hacen que ATO sea degradable o no interfiera ni compita en una o más reacciones posteriores a la reacción de extensión, donde la fracción es reconocible por un agente que facilita la digestión/eliminación del ATO.

Se describe, pero no forma parte de la invención un oligos plantilla adaptadores (ATO) para la extensión de polinucleótidos que comprende:

(a) una secuencia aleatoria 3' de 3 a 36 bases 'N';

(b) un extremo 3' con un bloqueador, que hace que ATO no sea extensible;

(c) una secuencia universal, 5' respecto a la secuencia aleatoria;

(d) nucleótidos o enlaces modificados opcionales que hacen que el ATO sea resistente a la escisión por exonucleasa 3'; y

(e) una fracción que hace que el ATO sea degradable.

Las fracciones son nucleótidos de uracilo, donde el agente es una dU-glicosilasa, o una dU-glicosilasa y una endonucleasa apurínica/apirimidínica, que es capaz de digerir/eliminar el ATO tras la primera reacción de extensión.

En otra realización descrita en el presente documento, las fracciones son ribonucleótidos, donde los ribonucleótidos se incorporan durante la síntesis de oligos dentro del ATO en lugar de cualquier nucleótido o de todos los nucleótidos; donde el agente es una ribonucleasa, que es capaz de digerir/eliminar el ATO tras la primera reacción de extensión.

El ATO puede ser un oligo de ARN, un oligo de ADN o una combinación de oligos de ADN y ARN.

El ATO puede ser una combinación de uno o más ATO diferentes. La combinación del ATO puede variar en secuencia. Los ATO combinados pueden variar en diseño. Los ATO combinados pueden variar en función. En el presente documento el término 'ATO' puede referirse a una combinación de uno o más ATO, a cualquier secuencia del ATO, a cualquier diseño del ATO con cualquier combinación de características de diseño, o a cualquier combinación del ATO con cualquier combinación de funciones. Al utilizar una combinación de uno o más ATO, puede haber variación dentro de la secuencia universal según el ATO utilizado; en estos casos también se utiliza el término secuencia universal.

En otra realización descrita en el presente documento, la fracción degradable es una secuencia reconocible por una enzima de restricción, donde el agente es una enzima de restricción.

La secuencia universal puede comprender una secuencia promotora de la ARN polimerasa. Se puede utilizar cualquier ARN polimerasa, como la ARN polimerasa T7, o la ARN polimerasa T3, o la ARN polimerasa SP6 o una combinación de estas. La secuencia universal puede comprender una secuencia promotora de ARN polimerasa y/o un sitio de cebado, ubicado en el extremo 3' de la secuencia promotora. El sitio de cebado proporciona una secuencia de unión al cebador para la amplificación posterior.

La secuencia universal puede ser bicatenaria o parcialmente bicatenaria. La protección de la secuencia universal como región bicatenaria impide la hibridación con los extremos 3' aleatorizados del polinucleótido diana y el ATO. En una realización descrita en el presente documento, el ATO comprende una secuencia de la porción 5' del tallo que es complementaria o parcialmente complementaria a la totalidad o parte de la secuencia universal, que puede formar una estructura de tallo-bucle o una estructura de tallo-bucle dividida. La molécula del ATO puede comprender, en orden 5' a 3': una porción del tallo 5', una secuencia de ARN polimerasa, una secuencia de sitio de cebado y una secuencia aleatoria/degenerada 3', una mezcla de secuencias aleatorias/degeneradas y específicas, o una secuencia específica de secuencia. Una secuencia de ARN polimerasa puede estar ubicada en la parte del bucle, o en parte del tallo y parte del bucle, o en el tallo. La parte del bucle puede comprender un enlace no copiable. Alternativamente, la parte del bucle puede no comprender un enlace no copiable. Alternativamente, la parte del tallo puede comprender un enlace no copiable. Si el extremo 5' de la porción del tallo comprende una secuencia adicional, puede haber un enlace no copiable entre la porción del tallo y la secuencia adicional. Alternativamente, la parte del tallo puede no comprender un enlace no copiable. En otra realización descrita en el presente documento, la porción del tallo 5' comprende un enlace no copiable. El enlace no copiable puede seleccionarse, entre otros, de fosforamidita del espaciador C3, o un espaciador de trietilenglicol, o un espaciador de hexaetilenglicol de 18 átomos o 1 ',2'-didesoxirribosa (dEspaciador).

La parte del tallo bicatenario puede comprender una o más regiones no complementarias, donde una o más regiones en la cadena de la secuencia universal comprende una o más secuencias aleatorias, degeneradas o un apareamiento erróneo diseñado específicamente. La porción del tallo puede formar dos o más secciones divididas separadas por uno o más enlaces no copiables. La porción del tallo puede formar dos o más secciones divididas separadas por uno o más pares de bases erróneos.

En otra realización como se describe en el presente documento, un ATO comprende una cadena superior independiente que es complementaria o parcialmente complementaria a la totalidad o parte de la cadena inferior, incluida la secuencia universal. El extremo 5' de la cadena superior independiente puede comprender un grupo fosfato.

El ATO puede comprender una o más fracciones de unión por afinidad, que se unen en cualquier posición del ATO. Esta fracción de unión por afinidad puede ser biotina.

La secuencia universal del ATO puede comprender una o más secuencias aleatorias o específicas de la secuencia que actúan como una secuencia de identificación única (UID) adicional. Las una o más secuencias de UID pueden residir en el tallo del ATO. La o las secuencias de UID pueden residir en el bucle del ATO. La o las secuencias de UID pueden residir en el tallo y el bucle del ATO; puede haber dos o más UID presentes tanto en el tallo como en el bucle del ATO.

La secuencia del ATO puede comprender en cualquier posición un nucleótido o nucleótidos no canónicos (no dA, no dG, no dT, no dC), que puede ser un nucleótido natural o artificial. El nucleótido o nucleótidos no canónico puede ser un nucleótido universal. El nucleótido no canónico puede comprender una base de inosina. La secuencia aleatoria 3' puede estar compuesta total o parcialmente por nucleótidos no canónicos. La secuencia universal puede estar compuesta total o parcialmente por nucleótidos no canónicos.

El extremo 3' del ATO puede contener nucleótido o nucleótidos modificados o enlaces que lo hacen resistente a la actividad exonucleasa 3' de una ADN polimerasa. Los enlaces modificados incluyen un enlace fosforotioato.

El ATO puede comprender además una secuencia específica 3' de la secuencia aleatoria, donde la secuencia específica es capaz de hibridar con un sitio específico del polinucleótido diana, o una secuencia específica no diseñada para una diana específica, y parte de la secuencia aleatoria/degenerada 3' sirve como plantilla para la extensión del polinucleótido por una polimerasa. La secuencia aleatoria 3' del ATO puede estar separada en dos o más porciones mediante secuencias específicas especialmente diseñadas, y parte de la secuencia aleatoria/degenerada/específica diana 3' sirve como plantilla para la extensión del polinucleótido diana por una polimerasa.

La presente divulgación proporciona además una composición que no forma parte de la invención, que comprende al menos una polimerasa de ácido nucleico y uno o más oligonucleótidos plantilla adaptadores (ATO) de cualquier combinación o mezcla de los descritos. La polimerasa de ácido nucleico puede ser una polimerasa de ADN o ARN, o una transcriptasa inversa, o una mezcla de cualquier combinación de ADN, ARN polimerasas y de transcriptasa inversa. Preferiblemente, la polimerasa tiene actividad de desplazamiento de cadena. La polimerasa puede tener actividad de exonucleasa 3' a 5'. La polimerasa puede ser una mezcla de una o más polimerasas de ADN diferentes, o una o más polimerasas de ARN, o una combinación de una o más ADN o ARN polimerasas. La polimerasa es una polimerasa dependiente de plantilla y no una polimerasa independiente de plantilla.

Los métodos para la extensión de una población de polinucleótidos diana han sido descritos en las reivindicaciones adjuntas. No forma parte de la invención un método para extender un polinucleótido diana que comprende la incubación del polinucleótido diana con una composición como la descrita en este documento, en condiciones suficientes para permitir la extensión del extremo 3' del polinucleótido diana con uno o más ATO como plantilla (denominada "reacción del ATO"), donde uno o más ATO pueden hibridar en cualquier lugar o un lugar específico del polinucleótido diana. En otro aspecto descrito en el presente documento, el método comprende además la degradación de uno o más ATO tras la extensión del polinucleótido diana.

La primera reacción del ATO puede ser una reacción de extensión, donde el polinucleótido diana se extiende como cebador y uno o más ATO actúan como plantilla. Alternativamente, la primera reacción del ATO puede ser una reacción de extensión-ligación (reacción de relleno de muescas), donde el polinucleótido diana se extiende y se liga con la porción 5' del tallo o la cadena superior de uno o más ATO. Alternativamente, la primera reacción puede ser solo de ligadura, donde el polinucleótido diana se hibrida con la porción de la secuencia aleatoria 3' de uno o más ATO y se liga directamente con la porción 5' del tallo o la cadena superior de uno o más ATO.

El ATO comprende una o varias fracciones que vuelven degradable a ATO, en donde la fracción es reconocible por un agente que facilita la digestión/eliminación del ATO. Alternativamente, el ATO comprende una o varias fracciones que vuelven no interferente y/o no competitivo a ATO en la reacción posterior a la reacción de extensión.

En algunas realizaciones, como se describe en el presente documento, la molécula del ATO comprende una fracción de bases dU y es degradable mediante incubación con una dU-glicosilasa (que crea sitios abásicos), seguida de incubación a una temperatura superior a 80 °C (introduce roturas en los sitios abásicos), o una mezcla de dU-glicosilasa y una endonucleasa apurínica/apirimidínica. El método proporcionado comprende ATO con bases dU e incubación con una dU-glicosilasa para degradar la molécula del<a>T<o>, o bien la incubación con una dU-glicosilasa y la posterior incubación a una temperatura superior a 80 °C degrada la molécula del ATO, o bien el ATO se incuba con una mezcla de dU-glicosilasa y una endonucleasa apurínica/apirimidínica. En otros aspectos, como se describe en el presente documento, el ATO comprende un ribonucleótido y es degradable con una ribonucleasa en condiciones suficientes para la actividad de la ribonucleasa. En aspectos relacionados, como se describe en el presente documento, la ribonucleasa se selecciona del grupo que consiste en RNasa H, RNasa HII, RNasa A y RNasa TI.

En otras realizaciones, como se describe en el presente documento, la fracción puede ser un nucleótido modificado o un análogo de nucleótido. El nucleótido modificado puede ser un nucleótido no canónico (no dA, no dG, no dT, no dC), que es un nucleótido natural o artificial. El nucleótido no canónico puede ser un nucleótido universal. El nucleótido no canónico puede comprender una base de inosina, donde la inosina se utiliza para reemplazar una posición de guanina en la secuencia del ATO, donde la desoxiInosina dirige preferentemente la incorporación de dC en la cadena naciente en crecimiento por la ADN polimerasa, con la expectativa y el entendimiento de que otros residuos pueden incorporarse con menor frecuencia.

Los nucleótidos/análogos modificados pueden estar presentes en la secuencia universal 5' (porción universal 5'), o en la porción aleatoria/degenerada 3', o los nucleótidos/análogos modificados pueden estar presentes tanto en la porción universal 5' como en la secuencia aleatoria 3' (porción aleatoria 3').

La fracción puede debilitar el enlace del apareamiento de bases o ser una modificación que sea degradable/eliminable tras la primera reacción de extensión del ATO. Debido a la débil unión, el ATO no puede interferir ni competir con el cebador normal para unirse a la misma plantilla en la reacción posterior. Además, debido a la digestión por un agente, el ATO no puede interferir con la reacción subsiguiente.

La modificación que proporciona enlaces de hidrógeno intermoleculares más débiles en el apareamiento de bases que el apareamiento de bases canónico estándar puede ser cualquier nucleótido natural o análogo de nucleótido artificial. El nucleótido no canónico natural preferido utilizado en el ATO es la inosina, que puede utilizarse para reemplazar dG y aparearse con dC, pero es más débil que dG:dC.

Los análogos de ácidos nucleicos son compuestos análogos (estructuralmente similares) al ARN y al ADN naturales. Los ácidos nucleicos son cadenas de nucleótidos compuestas por tres partes: una cadena principal de fosfato, un azúcar pentosa, ya sea ribosa o desoxirribosa, y una de cuatro nucleobases. Un análogo puede tener cualquiera de estas alteraciones. Normalmente, las nucleobases análogas confieren, entre otras cosas, diferentes propiedades de apareamiento y apilamiento de bases. Algunos ejemplos son las bases universales, que pueden aparearse con las cuatro bases canónicas, y los análogos de la estructura principal de fosfatoazúcar, que afectan a las propiedades de la cadena. La porción aleatoria 3' del ATO, que funciona como plantilla y se hibrida con cualquier parte de un polinucleótido, puede comprender una o más bases universales.

Las bases universales son compuestos análogos que pueden reemplazar cualquiera de las cuatro bases del ADN con interacciones débiles entre pares de bases. Las bases universales comúnmente utilizadas pueden ser 3-nitropirrol, 5-nitroindol o 2'-desoxiinosina. La inosina muestra un ligero sesgo en la hibridación de nucleótidos, favoreciendo la dI:dC sobre otros emparejamientos.

Las bases canónicas pueden tener un grupo carbonilo o amina en los carbonos que rodean el átomo de nitrógeno más alejado del enlace glucosídico, lo que les permite aparearse (emparejamiento de bases Watson-Crick) mediante enlaces de hidrógeno (amina con cetona, purina con pirimidina).

Las bases universales pueden aparearse indiscriminadamente con cualquier otra base, pero, en general, reducen considerablemente la temperatura de fusión de la secuencia; algunos ejemplos incluyen la 2'-desoxiinosina (desoxinucleótido de hipoxantina) y sus derivados, análogos de nitroazol y bases aromáticas hidrófobas sin enlaces de hidrógeno (fuertes efectos de apilamiento). En esta divulgación se ha explorado esta propiedad para lograr que el ATO que contiene inosina tenga una Tm menor que la del oligonucleótido normal, de modo que el ATO no interfiera con la reacción subsecuencial, donde la temperatura de hibridación es mayor que la Tm de la porción universal del ATO.

La desoxiInosina, una base natural, fue considerada la primera base "universal" - lo que significa que podía aparearse con las demás bases naturales, A, C, G y T. De hecho, estudios sobre la desoxiInosina indican que funciona como un análogo específico de la desoxiGuanosina, aunque no se autoagrega como la desoxiGuanosina.

Los nucleótidos de apareamiento débil en la porción universal del ATO comprenden nucleótidos modificados, análogos de nucleótidos y/o enlaces modificados, que pueden ser, entre otros, enlaces de inosina, dinosina o fosforotioato, enlace metilfosfonato. Se puede utilizar cualquier modificación de los nucleótidos o/y enlaces, siempre que proporcione un apareamiento débil en comparación con los nucleótidos o enlaces nativos. El apareamiento débil en la porción universal del ATO también puede estar relacionado con el cebador utilizado en la reacción posterior. Si los nucleótidos de apareamiento débil son nucleótidos nativos normales, el cebador utilizado en la reacción posterior puede incluir nucleótidos de apareamiento fuerte, que son nucleótidos modificados o/y enlaces modificados. Los nucleótidos modificados que proporcionan capacidad de apareamiento fuerte o débil pueden incluir, entre otros, LNA, ARN O-me, 2-amino-dA, 2-tiol-dT, 2-aminopurina, bases 2' FluoARN, AP-dC, C5-propino y merhilanálogos de dC y dT, desoxiinosina, desoxiuridina o nucleótidos de superbases (Epoch BioScience).

El ATO puede comprender una secuencia de la porción del tallo 5' que es complementaria a una parte de la secuencia universal, que son capaces de formar una estructura de tallo-bucle,

donde la porción del bucle puede comprender un enlace no copiable,

donde el enlace no copiable puede seleccionarse del grupo, pero no limitarse a un espaciador C3 fosforamidita, o un espaciador de trietilenglicol, o un espaciador de hexaetilenglicol de 18 átomos o 1',2'-didesoxirribosa (dEspaciador).

La secuencia de la porción del tallo 5' puede comprender una secuencia complementaria o sustancialmente complementaria a una parte de la secuencia universal 5', preferiblemente a la parte adyacente a la secuencia aleatoria. En una realización descrita en el presente documento, la porción del bucle puede comprender un enlace no copiable, donde la polimerasa en la reacción del ATO puede presentar actividad de desplazamiento de cadena o actividad de exonucleasa 5' a 3'. Es deseable que el polinucleótido diana hibride únicamente con la secuencia aleatoria/degenerada/específica del ATO en 3', no con la secuencia universal 5'. Esto se logra mediante la estructura de tallo-bucle, que impide que el polinucleótido diana hibride con la secuencia universal del ATO en la reacción del ATO. En la reacción del ATO, el polinucleótido diana hibrida con la secuencia aleatoria en el extremo 3' y se extiende mediante una ADN polimerasa, una ARN polimerasa, una transcriptasa inversa o una combinación de ADN, ARN polimerasa y transcriptasa inversa. La cadena extendida desplaza la porción del tallo y se detiene en el enlace no copiable. Además, en la reacción posterior a la primera reacción del ATO, la estructura de tallo-bucle impide que el ATO compita con la unión al polinucleótido diana modificado, de modo que cualquier cebador añadido pueda unirse eficazmente al polinucleótido diana modificado para la amplificación. En esta realización descrita en el presente documento, la porción del tallo y el enlace no copiable actúan como una fracción que hace que el ATO no interfiera ni compita en la reacción posterior. El ATO puede o no contener otras modificaciones, tal como uno o más nucleótidos de uracilo o ribonucleótidos, que pueden digerirse tras la reacción del ATO.

En otra realización descrita en el presente documento, la parte del bucle del ATO puede contener nucleótidos digeribles, tal como uno o más nucleótidos de uracilo o ribonucleótidos. En la reacción del ATO, el polinucleótido diana hibrida con la secuencia aleatoria 3' y se extiende mediante una ADN polimerasa. La cadena extendida se une al extremo 5' de la cadena del tallo, que contiene un grupo fosfato 5', y se liga mediante una ADN ligasa. La reacción comprende la acción de una ADN polimerasa con actividad de relleno de mellas, como la polimerasa 1 o fragmentos grandes de Klenow, y una ADN ligasa. La molécula del ATO puede contener múltiples nucleótidos de uracilo o ribonucleótidos. Tras la reacción del ATO, la molécula del ATO puede digerirse.

En otra realización descrita en el presente documento, la parte del bucle del ATO puede comprender nucleótidos que pueden digerirse, como el nucleótido de uracilo, o los ribonucleótidos. En la primera reacción, el polinucleótido diana hibrida con la secuencia aleatoria 3' adyacente al extremo 5' de la cadena del tallo y se liga al extremo 5' de la cadena del tallo mediante una ADN ligasa. La porción de la secuencia universal 5' puede comprender múltiples nucleótidos de uracilo o ribonucleótidos. Tras la primera reacción, la porción de la secuencia universal 5' puede digerirse.

En otra realización descrita en el presente documento, el ATO comprende una cadena superior separada que es complementaria o sustancialmente complementaria a una parte o a la totalidad de la secuencia universal, capaces de formar una estructura parcialmente bicatenaria. Es deseable que el polinucleótido diana hibride únicamente con la secuencia aleatoria 3' del ATO, no con la secuencia universal 5'. Esto se logra gracias a la estructura bicatenaria proporcionada por la cadena superior, que impide que el polinucleótido diana se hibride con la secuencia universal del ATO en la primera reacción del ATO. El ATO puede contener otras modificaciones, como nucleótidos de uracilo o ribonucleótidos, que pueden digerirse después de la primera reacción. En la primera reacción del ATO, el polinucleótido diana se hibrida con la secuencia aleatoria 3' y se extiende mediante una ADN polimerasa. La cadena extendida puede desplazar la cadena superior. Alternativamente, la cadena extendida se une al extremo 5' de la cadena superior, que presenta un grupo fosfato en el extremo 5', y posteriormente se liga mediante una ADN ligasa. La reacción comprende la ADN polimerasa con actividad de relleno de mellas, como la Polimerasa 1 o fragmentos grandes de Klenow, y la ADN ligasa. La porción de la secuencia universal 5' puede comprender múltiples nucleótidos de uracilo o ribonucleótidos. Tras la primera reacción, la porción de la secuencia universal 5' puede digerirse. En otro aspecto descrito en el presente documento, en la primera reacción, el polinucleótido diana puede hibridar con la secuencia aleatoria 3' adyacente al extremo 5' de la cadena superior y se liga al extremo 5' de la cadena superior mediante una ADN ligasa. Tanto la porción de la secuencia universal 5' como la porción aleatoria 3' pueden comprender múltiples nucleótidos de uracilo. Tras la primera reacción, la molécula del ATO puede digerirse.

En las realizaciones descritas en el presente documento, donde se utiliza la ligadura, el extremo 5' de la cadena separada superior puede contener un grupo fosfato, el extremo 3' de la cadena separada superior puede contener biotina. En las realizaciones descritas en el presente documento, donde se utiliza la extensión sin ligadura, el extremo 5' de la cadena separada superior no contiene un grupo fosfato, el extremo 3' de la cadena separada superior no comprende biotina, pero la cadena separada superior puede contener nucleótidos que pueden ser digeridos, tal como el nucleótido uracilo.

La porción de secuencia aleatoria puede tener cualquier longitud, que puede tener un rango de 3 a 48 nucleótidos, preferiblemente tener un rango de 3 tener un rango a 36 nucleótidos, o lo más preferiblemente tener un rango de 12 a 30 nucleótidos. Específicamente, la porción de secuencia aleatoria tiene 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o más nucleótidos. La secuencia aleatoria puede comprender nucleótidos completamente aleatorios, donde cualquiera de los cuatro nucleótidos puede estar presente en cualquier posición. Alternativamente, los nucleótidos degenerados pueden estar presentes en algunos lugares. La porción de secuencia aleatoria puede comprender uno o más nucleótidos específicos (no aleatorios) en una o más ubicaciones específicas; por ejemplo, el nucleótido del terminal 3' puede ser un nucleótido específico, tal como un residuo T, o un residuo A, o un residuo G o un residuo C. El nucleótido específico del terminal 3' se selecciona para una modificación de unión fácil y económica, tal como biotina, un espaciador o un bloqueador de fosfato. La secuencia aleatoria puede comprender nucleótidos degenerados o semidegenerados o completamente aleatorios, así como nucleótidos específicos, donde los nucleótidos aleatorios predominan. La secuencia aleatoria también puede comprender nucleótidos modificados, ya sean naturales o artificiales. Estos nucleótidos modificados pueden ser de base universal, como se describió anteriormente. La secuencia aleatoria puede presentar un sesgo de secuencia, tal como una secuencia completa rica en residuos C y G, lo que significa que más del 50 % de los nucleótidos están compuestos por C y G, o rica en residuos de A y T lo que significa más del 50 % de los nucleótidos están compuestos por A y T. La secuencia aleatoria puede ser reemplazada parcial o totalmente por una secuencia específica diana.

El ATO se hibrida con el polinucleótido diana mediante una secuencia aleatoria en condiciones no restrictivas, donde el extremo 3' del polinucleótido se hibrida con la secuencia aleatoria y, En una realización descrita en el presente documento, como se describe en el presente documento, se extiende utilizando ATO como plantilla.

Como se ha descrito, la secuencia aleatoria actúa como plantilla, que hibrida con el polinucleótido diana y dirige la extensión del polinucleótido diana utilizando ATO como plantilla. Además, la secuencia aleatoria también desempeña una segunda función como UID (identificador único, código de barras molecular) en la secuenciación de próxima generación.

En otra realización descrita en el presente documento, la molécula del ATO puede comprender una secuencia específica adicional en 3', ubicada en 3' de la porción de secuencia aleatoria. La secuencia específica adicional 3' puede comprender la secuencia, que es capaz de hibridar con una ubicación específica de un polinucleótido diana. Esta secuencia puede comprender la secuencia especifica adicional 3' puede comprender una secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción, que, al hibridar con la secuencia diana, puede causar un corte en el polinucleótido diana por una enzima.

El extremo 3' del ATO puede estar unido a un grupo bloqueador, lo que vuelve al ATO no extensible. Se puede utilizar cualquier grupo bloqueador. Generalmente, el extremo 3' del ATO se "bloqueará" para impedir que el ATO actúe como cebador, excepto cuando la extensión del ATO sea necesaria por diseño, en cuyo caso el extremo 3' no se bloquea y se permitirá la extensión. El "bloqueo" se puede lograr uniendo una fracción química, como la biotina o un grupo fosfato, al hidroxilo 3' del último nucleótido, que puede, dependiendo del grupo seleccionado, servir una doble función actuando también como fracción de captura por afinidad para la posterior eliminación o captura del ATO tras la reacción del ATO. El bloqueo también se puede lograr eliminando el 3' OH o utilizando un nucleótido que carezca de 3' OH, como un didesoxinucleótido. El grupo bloqueador puede seleccionarse del grupo que consiste en al menos un ribonucleótido, al menos un desoxinucleótido, un espaciador C3, un fosfato, un didesoxinucleótido, un grupo amino y una desoxitimidina invertida.

La reacción del ATO contiene preferiblemente polimerasa con actividad exonucleasa 3' a 5', por lo tanto, la molécula del ATO comprende preferiblemente nucleótidos modificados o enlaces en el extremo 3', que impiden la digestión por la polimerasa. Se puede utilizar cualquier modificación resistente. Un ejemplo es que el extremo 3' comprende un enlace modificado entre los nucleótidos finales, preferiblemente los dos nucleótidos finales, en esta posición, de modo que comprende una fracción resistente como el fosforotioato en lugar del fosfodiéster convencional.

En una realización descrita en el presente documento, la porción de la secuencia universal 5' forma parte de una secuencia que funciona como plantilla para la extensión del polinucleótido diana, cuyo producto equivale a añadir un adaptador para la preparación de la biblioteca de secuenciación mediante ligadura. Sin embargo, la secuencia extendida - similar al adaptador se sintetiza nuevamente y no está unida a ningún oligonucleótido añadido. La porción de la secuencia universal 5' comprende una secuencia cebadora o una secuencia de unión a cebadores, que es compatible con la secuenciación de próxima (o tercera) generación (NGS) u otra secuenciación paralela masiva. Por ejemplo, la porción de la secuencia universal 5' puede comprender secuencias cebadoras de secuenciación para la plataforma Illumina y/o secuencias cebadoras de anclaje para la plataforma Illumina.

La porción de la secuencia universal 5' puede formar una estructura de tallo-bucle o de horquilla, donde el extremo de la parte del tallo está cerca al extremo 5' de la porción de la secuencia aleatoria. El extremo 5' del tallo puede formar una saliente 5'. La parte del tallo puede tener cualquier longitud. La parte del tallo puede tener cualquier longitud que varía de 3 a 30 nucleótidos, preferiblemente de 4 a 24 nucleótidos. La parte del tallo puede ser completamente bicatenaria, o preferiblemente no completamente bicatenaria. La parte del tallo puede comprender una o más regiones de no apareamiento. La región(es) de no apareamiento puede comprender una secuencia aleatoria, que cumple la función de UID (código de barras molecular) en NGS. La parte del tallo puede comprender una secuencia reconocible y escindible por una enzima, por ejemplo, un sitio de enzima de restricción. La formación del tallo puede impedir la hibridación de la secuencia universal con el polinucleótido diana. La parte del bucle puede tener cualquier longitud, de 0 a 36 nucleótidos, preferiblemente de 1 a 30 nucleótidos. El bucle puede estar compuesto, parcial o totalmente, por un análogo de nucleótido u otro enlace químico, que no es copiable por una polimerasa, por ejemplo, un sitio abásico, un monómero de hexetilenglicol (HEG), un espaciador de hexaetilenglicol de 18 átomos o una 1',2'-didesoxirribosa (dEspaciador). El enlazador no copiable impide la extensión mediada por la polimerasa en la parte 5' del ATO.

La molécula del ATO comprende nucleótidos seleccionados del grupo que consiste en 5'-monofosfato de 2'-desoxitimidina (dTMP), 5'-monofosfato de 2'-desoxiguanosina (dGMP), 5'-monofosfato de 2'-desoxiadenosina (dAMP), 5'-monofosfato de 2'-desoxicitidina (dCMP), 5'-monofosfato de 2'-desoxiuridina (dUMP), monofosfato de timidina (TMP), monofosfato de guanosina (GMP), monofosfato de adenosina (AMP), monofosfato de citidina (CMP), monofosfato de uridina (UMP), un análogo de base y combinaciones de los mismos. También se contempla que el ATO comprenda un nucleótido modificado o una modificación de enlace, como se define en este documento.

Los oligonucleótidos o polinucleótidos modificados pueden comprender uno o más azúcares y/o uno o más enlaces internucleotídicos de las unidades de nucleótidos en el oligopolinucleótido, que se sustituyen por grupos no “naturales”. En un aspecto descrito en el presente documento, esta realización contempla un ácido nucleico peptídico (PNA). En los compuestos de PNA, la estructura principal de azúcar de un polinucleótido se reemplaza por una estructura principal que contiene amida. Las estructuras principales de oligopolinucleótidos modificados pueden contener un átomo de fósforo, incluyendo, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metilo y otros alquilfosfonatos. Los oligonucleótidos o polinucleótidos modificados también pueden contener una o más fracciones de azúcar sustituidas. Otras modificaciones incluyen aquellas que extienden el código genético, tales como, sin limitación, Iso-dC e Iso-dG. Iso-dC e Iso-dG son variantes químicas de la citosina y la guanina, respectivamente. Iso-dC forma enlaces de hidrógeno con Iso-dG, pero no con dG. De igual manera, Iso-dG forma pares de bases con Iso-dC, pero no con dC. En un aspecto descrito en el presente documento, una modificación del azúcar incluye ácidos nucleicos bloqueados (LNA).

Un polinucleótido diana puede estar fragmentado aleatoria o específicamente, o una combinación de ambos, de forma natural o artificial, el extremo 3' del polinucleótido diana fragmentado se extiende tras la hibridación con la secuencia aleatoria o específica de un ATO. La combinación de la secuencia aleatoria del extremo 3' del polinucleótido diana y la parte extendida de una plantilla aleatoria proporciona una secuencia de identificación única (UID, código de barras molecular) que puede utilizarse para agrupar las lecturas de secuenciación en familias. Además, el ATO puede comprender uno o más UID adicionales ubicados en la secuencia universal. El UID adicional puede estar ubicado en el bucle, cerca del extremo 5' de la parte del tallo y la porción de secuencia aleatoria. El UID adicional puede estar ubicado en el tallo, en cualquier lugar entre la secuencia aleatoria de 3' y el bucle. El UID adicional puede tener cualquier longitud. El UID adicional puede tener cualquier longitud, que puede tener un rango de 2 a 48 nucleótidos, preferiblemente tener un rango de 3 a 36 nucleótidos. El UID adicional puede estar compuesto por nucleótidos completamente aleatorios, donde cualquiera de los cuatro nucleótidos puede estar presente en cualquier lugar. Alternativamente, puede haber nucleótidos degenerados en algunos lugares.

La molécula del ATO puede estar compuesta por un nucleótido no canónico, análogo o modificación, que sea reconocible y escindible por un agente. El nucleótido no canónico se selecciona del grupo que consiste en dUMP, dIMP y 5-OH-Me-dCMP. El agente capaz de escindir una porción de base del nucleótido no canónico es una enzima N-glicosilasa. La N-glicosilasa se selecciona del grupo que consiste en uracil N-glicosilasa (UNG), hipoxantina-N-glicosilasa e hidroxi-metil citosina-N-glicosilasa. Cuando el nucleótido no canónico es dUMP y la enzima capaz de escindir una porción de base del nucleótido no canónico es UNG. Cuando el nucleótido no canónico es dUMP, la enzima capaz de escindir una porción de base del nucleótido no canónico es UNG, y la cadena principal de fosfodiéster se escinde con DMED. En una realización descrita en el presente documento, los nucleótidos de uracilo se incorporan al ATO durante la síntesis de oligo en el lugar de los nucleótidos de timina. El ATO que comprende un nucleótido no canónico puede sintetizarse en presencia de dos o más nucleótidos no canónicos diferentes, por lo que se sintetiza un ATO que comprende dos o más nucleótidos no canónicos diferentes. Cuando el ATO que comprende un nucleótido no canónico se sintetiza en presencia de tres nucleótidos canónicos y un nucleótido no canónico, o de los cuatro nucleótidos canónicos y un nucleótido no canónico, el nucleótido no canónico se proporciona en una proporción adecuada para degradar el ATO tras la reacción del ATO. Normalmente, la enzima reparadora por escisión de bases puede seleccionarse del grupo que consiste en ADN glicosilasas, AP endonucleasas y desoxifosfodiesterasas. Preferiblemente, la ADN glicosilasa puede seleccionarse del grupo que consiste en uracilo-ADN glicosilasa, 3-metiladenina ADN glicosilasa, hidrato de pirimidina-ADN glicosilasa, FaPy-ADN glicosilasa y ADN glicosilasa de desajuste de timina. Más preferiblemente, la ADN glicosilasa es uracilo-ADN glicosilasa. La uracilo-ADN glicosilasa (UDG) o uracilo-N-glicosilasa (UNG) es una enzima que cataliza la liberación de uracilo libre del ADN monocatenario y bicatenario de más de 6 pares de bases.

En una realización descrita en el presente documento, la molécula del ATO puede comprender ribonucleótidos, que se incorporan durante la síntesis de oligos en el ATO, en el lugar de cualquiera de los nucleótidos o todos los nucleótidos; donde el agente es RNasa, que es capaz de degradar/eliminar el ATO tras la reacción del ATO. El ATO puede ser ARN en toda su longitud o estar parcialmente formado por ARN. Cualquier parte del ATO puede ser ARN, preferiblemente, la porción de la secuencia universal es<a>R<n>.

En otra realización descrita en el presente documento, la secuencia del ATO puede comprender una secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción, ubicada en la secuencia universal o en la secuencia específica adicional 3'; donde el agente es una enzima de restricción capaz de degradar/eliminar el ATO tras la reacción del ATO. La secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción puede estar ubicada en la parte del tallo del ATO, que puede ser escindida por una enzima de restricción.

En otra realización descrita en el presente documento, la molécula del ATO puede comprender una fracción de unión por afinidad, que se une en cualquier posición del ATO; donde el agente es una proteína o un anticuerpo, que es capaz de eliminar el ATO tras la reacción del ATO. Por ejemplo, la fracción de unión por afinidad es biotina; donde el agente es avidina o estreptavidina. En ciertas realizaciones descritas en el presente documento, el ATO puede comprender una o más fracciones incorporadas en el terminal 5' o 3' o en cualquier posición interna del ATO que permita la eliminación por afinidad del ATO de la mezcla de reacción tras la reacción del ATO. Las fracciones de afinidad preferidas son aquellas que pueden interactuar específicamente con un ligando afín. Por ejemplo, una fracción de afinidad puede incluir biotina, digoxigenina, etc. Otros ejemplos de grupos de captura incluyen ligandos, receptores, anticuerpos, haptenos, enzimas, grupos químicos reconocibles por anticuerpos o aptámeros. Las fracciones de afinidad pueden inmovilizarse en cualquier sustrato o soporte sólido deseado. Los ejemplos de sustratos deseados incluyen, por ejemplo, partículas, perlas, perlas magnéticas, perlas atrapadas ópticamente, placas de microtitulación, portaobjetos de vidrio, papeles, tiras reactivas, geles, otras matrices, nitrocelulosa o nailon. Por ejemplo, cuando la fracción de captura es biotina, el sustrato puede incluir estreptavidina. En algunos casos, el soporte sólido es una perla. Entre los ejemplos de perlas se incluyen, entre otros, perlas de estreptavidina, perlas de agarosa, perlas magnéticas, perlas conjugadas con anticuerpos (p. ej., microperlas antiinmunoglobulina), perlas conjugadas con proteína A, perlas conjugadas con proteína G, perlas conjugadas con proteína A/G, perlas conjugadas con proteína L, perlas conjugadas con oligo-dT, perlas de sílice, perlas similares a sílice, microperlas antibiotina y perlas antifluorocromo.

Si bien parte de la secuencia aleatoria de un RTO actúa como secuencia de identificación única (UID), el RTO puede comprender un UID adicional ubicado en la porción de secuencia universal.

Los métodos de la invención han sido descritos en las reivindicaciones adjuntas. También se proporciona un método para generar una biblioteca de polinucleótidos que comprende:

(i) generar un polinucleótido diana modificado utilizando un polinucleótido diana de una muestra como cebador y utilizando un oligonucleótido plantilla removible (RTO) de cualquiera de los RTO mencionados anteriormente como plantilla;

(ii) eliminar el RTO; y

(iii) generar una secuencia del primer complemento (CS) del polinucleótido diana modificado utilizando un primer cebador, el cual comprende una secuencia universal,

donde la generación comprende la extensión del cebador hibridado con una plantilla mediante una polimerasa. Por lo tanto, la presente divulgación proporciona un método para extender una población de polinucleótidos diana con extremos 3' monocatenarios, que comprende:

(i) incubar los polinucleótidos diana con oligonucleótidos plantilla adaptadores (ATO) que tienen

(a) una secuencia aleatoria 3';

(b) un extremo 3' con un bloqueador, que hace que el ATO no sea extensible; y

(c) una secuencia universal, 5' respecto a la secuencia aleatoria,

donde los polinucleótidos diana hibridan con la secuencia aleatoria 3' del ATO;

(ii) realizar una extensión por polimerasa de los polinucleótidos diana utilizando el ATO como plantilla, produciendo así polinucleótidos diana extendidos con una secuencia universal 3'. El método puede comprender además (iii) la generación de una primera secuencia complementaria (CS) de los polinucleótidos diana modificados, donde la generación de la primera CS comprende la extensión mediante polimerasa a partir de la secuencia universal 3' utilizando los polinucleótidos diana modificados como plantillas.

La presente divulgación proporciona un método para la extensión de polinucleótidos que comprende:

(i) la generación de un polinucleótido diana modificado mediante la incubación de polinucleótidos diana con la composición descrita anteriormente, donde el extremo 3' del polinucleótido diana se hibrida con la secuencia aleatoria 3' de un oligonucleótido plantilla adaptadore (primer ATO) en una reacción enzimática de primer ATO, en el que el extremo 3' del polinucleótido diana se extiende utilizando un ATO como plantilla, donde si existe un extremo 3' saliente, el extremo 3' del polinucleótido diana se recorta antes de que tenga lugar la extensión. En una realización descrita en el presente documento, el polinucleótido modificado, tras la extensión del extremo 3' en ATO, se incuba opcionalmente con una ligasa de circularización de ADN monocatenario, lo que da como resultado la circularización del polinucleótido monocatenario modificado.

El método comprende además (ii) generar una primera secuencia del complemento (CS) del polinucleótido diana modificado.

La etapa (ii) puede comprender el uso del polinucleótido diana modificado como plantilla para una ronda de amplificación, como plantilla para rondas secuenciales de amplificación o como plantilla para rondas secuenciales de amplificación separadas por una etapa de purificación.

En un aspecto la invención proporciona un método para extender una población de polinucleótidos diana que comprende:

(i) incubar los polinucleótidos diana con oligonucleótidos plantilla adaptadores (ATO) que tienen

(a) un extremo 3' con un bloqueador, que hace que el ATO no sea extensible;

(b) una secuencia aleatoria 3';

(c) al menos un nucleótido de uracilo; y

(d) una secuencia universal, 5' a la secuencia aleatoria,

donde el polinucleótido diana hibrida con la secuencia aleatoria 3' del ATO;

(ii) realizar una extensión por polimerasa de los polinucleótidos diana utilizando el ATO como plantilla, produciendo así polinucleótidos diana extendidos con una secuencia universal 3';

(iii) tratar con una enzima que tiene actividad de dU-glicosilasa; y

(iv) generar una primera secuencia complementaria (CS) de los polinucleótidos diana modificados, donde la generación de la primera CS comprende la extensión mediante polimerasa a partir de la secuencia universal 3' utilizando los polinucleótidos diana modificados como plantillas.

En una realización de la invención, dicha generación de una primera CS comprende extensión usando un primer cebador y usando el polinucleótido diana modificado como plantilla, donde el primer cebador se hibrida con el polinucleótido diana modificado y se extiende mediante una polimerasa. El primer cebador se hibrida con la región universal extendida 3' del polinucleótido diana modificado. El primer cebador puede incluir una secuencia adicional compatible con una plataforma de NGS, por ejemplo, una cola 5' que contiene las secuencias necesarias.

En otra realización descrita en el presente documento, dicha generación de la primera CS comprende la transcripciónin vitrousando una ARN polimerasa que utiliza la región promotora de la ARN polimerasa bicatenaria en el polinucleótido diana modificado, generado mediante la extensión en un promotor de ARN polimerasa que contiene ATO. En otra realización descrita en el presente documento, la ARN polimerasa bicatenaria del polinucleótido diana modificado se genera hibridando un nucleótido con el polinucleótido diana modificado tras la digestión o la eliminación de los ATO.

En otra realización descrita en el presente documento, dicha generación de la primera CS comprende la desnaturalización térmica del polinucleótido diana modificado, la autohibridación de la estructura de tallo-bucle 3' del polinucleótido diana modificado y el autocebado para extenderlo y formar la primera CS.

En otra realización descrita en el presente documento, dicha generación de la primera CS comprende el hibridación del cebador específico diana con el polinucleótido diana modificado y su extensión mediante una polimerasa. El cebador específico diana se hibrida con la secuencia diana de interés. El extremo bicatenario de la primera CS puede ligarse a un adaptador.

El método puede comprender además la digestión del ATO antes o después de generar una secuencia del primer complemento (CS) del polinucleótido diana modificado.

El método puede comprender además la captura por afinidad antes o después de generar una secuencia del primer complemento (CS) del polinucleótido diana modificado.

En la primera reacción del ATO, el método puede comprender extensión y ligadura, donde una ADN polimerasa extiende el extremo 3' diana y una ADN ligasa liga la secuencia diana extendida a la porción 5' del tallo del ATO o a la cadena separada superior del ATO.

El método de la invención puede comprender además la generación de una primera CS modificada mediante la incubación de la primera CS con la composición descrita anteriormente, donde el extremo 3' de la primera CS se hibrida con la secuencia aleatoria 3' de un oligos plantilla adaptadores (segundo ATO) en una segunda reacción enzimática del ATO, en la que el extremo 3' de la primera CS se extiende utilizando un ATO como plantilla, en donde si hay un saliente 3', el extremo 3' de la primera CS se recorta antes de que tenga lugar la extensión, donde el segundo ATO comprende una secuencia universal 5' diferente del primer ATO.

El método puede comprender además la generación de una primera CS modificada mediante la ligadura de adaptadores en los productos de la etapa (ii).

El método de la invención puede comprender además la extensión de un segundo cebador hibridado con la primera CS o con la primera CS modificada, generando así una segunda CS, donde el segundo cebador comprende una porción específica diana o una secuencia universal, o bien una secuencia 3' específica diana y una secuencia 5' universal.

El método puede comprender además la separación de la reacción del polinucleótido diana modificado en dos reacciones separadas, donde cada reacción contiene un cebador complementario a la región universal del polinucleótido diana modificado, con una reacción que comprende un segundo cebador específico diana, o un grupo de cebadores específicos diana, complementario a la cadena directa de una secuencia diana, y una segunda reacción que comprende un segundo cebador específico diana, o un grupo de cebadores específicos diana, complementario a la cadena inversa de la secuencia diana, donde la cadena directa y la cadena inversa de la secuencia diana son complementarias.

En otra realización descrita en el presente documento, los grupos de cebadores específicos diana pueden contener una mezcla de cebadores, donde los cebadores individuales pueden dirigirse a la cadena directa o a la inversa para diferentes dianas, de modo que el grupo final puede dirigirse a diferentes regiones de las cadenas directa e inversa. Donde las cadenas directa e inversa de la secuencia diana son complementarias, y los cebadores específicos diana, directa e inversa, se separan en dos grupos de cebadores diferentes, siempre que se tenga en cuenta que no se añadan al mismo grupo dos cebadores que dirijan a las cadenas directa e inversa si son capaces de actuar conjuntamente como cebadores para PCR, lo que genera productos de PCR no deseados. Además, todas las referencias a grupos 'directos' y/o 'inversos' permiten que cada grupo contenga cebadores que dirijan tanto a las cadenas directa como a la inversa, como se mencionó anteriormente.

El método de acuerdo con la invención puede comprender además la hibridación de un cebador complementario a la región universal del polinucleótido diana modificado, seguida de una o más rondas de amplificación lineal para generar una secuencia de primer complemento (CS). El producto de la reacción de amplificación lineal se divide en dos reacciones separadas, cada una con un cebador complementario a la región universal del polinucleótido diana modificado, con una reacción que comprende un segundo cebador específico diana, o un grupo de cebadores específicos diana, complementario a la cadena directa de la secuencia diana, y una segunda reacción que comprende un segundo cebador específico diana, o un grupo de cebadores específicos diana, complementario a la cadena inversa de la secuencia diana, donde la cadena directa y la cadena inversa de la secuencia diana son complementarias.

El método puede comprender además una etapa de reparación del extremo del polinucleótido diana bicatenario, seguida de la ligadura de un adaptador bicatenario. A continuación, el producto de la ligadura se hibrida con un cebador complementario a la región universal del producto de ligadura del polinucleótido diana, seguida de una o más rondas de amplificación lineal. El producto de la reacción de amplificación lineal se separa en dos reacciones independientes, cada una de las cuales contiene un cebador complementario a la región universal del polinucleótido diana modificado, con una reacción que comprende un segundo cebador específico diana, o un grupo de cebadores específicos diana, complementario a la cadena directa de la secuencia diana, y una segunda reacción comprende un segundo cebador específico diana, o un grupo de cebadores específicos diana, complementario a la cadena inversa de la secuencia diana, donde la cadena directa y la cadena inversa de la secuencia diana son complementarias.

Cuando los polinucleótidos diana de una muestra son bicatenarios y los segundos cebadores son específicos diana, la reacción posterior a la reacción del ATO para la amplificación específica diana puede consistir en dividir los productos de la reacción del ATO o el producto de la primera CS amplificada linealmente en dos reacciones independientes, la reacción directa comprende uno o más segundos cebadores específicos diana complementarios a la cadena directa de la secuencia diana, y la reacción inversa comprende uno o más segundos cebadores específicos diana complementarios a la cadena inversa de la secuencia diana, donde la cadena directa y la cadena inversa de la secuencia diana son complementarias.

En un aspecto descrito en el presente documento, dicha generación de la primera CS comprende una extensión de una sola etapa o una amplificación lineal utilizando el primer cebador, que es un cebador universal dirigido a la parte universal extendida en 3' del polinucleótido. La amplificación lineal puede tener 1-30 ciclos, o 2-25 ciclos, o 3-24 ciclos, o 4-23 ciclos, o 5-22 ciclos, 6-21 ciclos, o 7-20 ciclos, u 8-19 ciclos o 9-18 ciclos o 10-17 ciclos.

En otro aspecto descrito en el presente documento, dicha generación de la primera CS comprende una reacción de transcripción inversa utilizando transcriptasa inversa si la diana es ARN.

El método puede comprender además una amplificación exponencial utilizando un primer cebador y un segundo cebador. El primer cebador puede ser un cebador universal dirigido a la parte universal extendida en 3' del polinucleótido diana modificado; el segundo cebador puede ser un cebador universal dirigido a la parte universal extendida en 3' de la primera CS. Como alternativa, el segundo cebador es un cebador específico diana hibridación con una región de interés específica de la primera CS. El segundo cebador puede ser un grupo de múltiples cebadores dirigidos a múltiples regiones de secuencia de interés. Cuando el segundo cebador es específico diana, tras la amplificación lineal o exponencial utilizando el segundo cebador, se utiliza un tercer cebador específico diana anidado para una amplificación adicional.

El primer, segundo o tercer cebador pueden comprender una secuencia de código de barras de muestra (SBC) y una o más secuencias universales adicionales necesarias para la compatibilidad con una plataforma de NGS.

El método puede comprender la fragmentación, o fragmentación/etiquetado, de los polinucleótidos diana antes de la primera reacción del ATO.

En una realización descrita en el presente documento, dicha fragmentación y/o etiquetado de polinucleótidos diana comprende la puesta en contacto de polinucleótidos bicatenarios con una transposasa unida al ADN del transposón, donde el ADN del transposón comprende un sitio de unión para transposasas y una secuencia universal, en donde el complejo transposasa Tn5/ADN del transposón se une a las localizaciones diana del polinucleótido bicatenario y escinde los polinucleótidos bicatenarios en una pluralidad de fragmentos bicatenarios, donde cada fragmento bicatenario tiene el ADN del transposón unido a cada extremo 5' del fragmento bicatenario. El método comprende además la desnaturalización térmica de los polinucleótidos diana fragmentados antes de la primera reacción del ATO. La transposasa puede ser la transposasa Tn5. El ADN del transposón puede comprender una secuencia de código de barras, y puede comprender un sitio de cebado. El

ADN del transposón comprende un sitio de unión para Tnp bicatenario de 19 pb y un saliente, donde el saliente puede comprender un UID y un sitio de cebado. El ADN del transposón comprende un sitio de unión para la

Tnp bicatenaria de 19 pb y una estructura de tallo-bucle de ácido nucleico. Las transposasas unidas pueden eliminarse de los fragmentos bicatenarios antes de la primera reacción del ATO. Las transposasas Tn5 forman complejos con el ADN del transposón, el complejo transposasa Tn5/ADN del transposón se une a las localizaciones diana a lo largo del ADN genómico bicatenario escindiendo el ADN genómico bicatenario en una pluralidad de fragmentos bicatenarios. El ADN del transposón comprende un sitio de unión para la transposasa

Tn5 (Tnp) bicatenaria de 19 pb en un extremo y un saliente monocatenario largo que incluye una región de código de barras, un sitio de cebado y otra secuencia. Tras la transposición, la Tnp y el ADN del transposón se unen entre sí y dimerizan para formar transposomas. Los transposomas capturan o se unen aleatoriamente a los polinucleótidos diana. A continuación, las transposasas del transposoma cortan el ADN genómico con una transposasa que corta la cadena superior y una transposasa que corta una cadena inferior, para crear un fragmento de ADN. El ADN del transposón se inserta aleatoriamente en los polinucleótidos, dejando un espacio de 9 pb en ambos extremos del sitio de transposición/inserción. El resultado es un fragmento de ADN con un sitio de unión Tnp del ADN del transposón unido a la posición 5' de una cadena superior y un sitio de unión Tnp del ADN del transposón unido a la posición 5' de una cadena inferior.

En otra realización descrita en el presente documento, dicha fragmentación de polinucleótidos diana comprende la puesta en contacto del ADN bicatenario con una enzima CRIPSR/Cas9 unida a un ARN guía, donde el complejo CRISPR/Cas9/ARN guía se une a una región del polinucleótido diana determinada por la secuencia del ARN guía. El complejo CRISPR/Cas9/ARN guía/ADN produce una rotura bicatenaria determinada por la secuencia dirigida por el ARN guía. En otra realización descrita en el presente documento, solo se induce una rotura monocatenaria.

Dicha fragmentación puede comprender el uso de fragmentación dirigida mediante una herramienta de edición genómica. La herramienta de edición genómica puede comprender repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas y la enzima proteína 9 asociada a CRISPR (CRISPR/Cas9). La enzima puede pertenecer a la Clase I. La enzima de Clase I es una enzima de Tipo I, Tipo III o Tipo IV. La enzima puede pertenecer a la Clase II. La enzima de Clase II es una enzima de Tipo II, Tipo V o Tipo VI. La enzima puede comprender cualquier combinación de enzimas de Clase I y Clase II. La combinación puede estar compuesta por cualquier combinación de enzimas de Tipo I, Tipo II, Tipo III, Tipo IV, Tipo V o Tipo VI. Se utiliza un grupo de ARN guía para dirigirse a múltiples regiones del genoma e inducir roturas de ADN. Las roturas de ADN pueden ser de cadena sencilla o doble. Las roturas de ADN pueden ser una combinación de roturas de cadena sencilla y doble. El grupo consta de cualquier número de ARN guía.

En otra realización descrita en el presente documento, dicha fragmentación y etiquetado de polinucleótidos diana comprende poner en contacto polinucleótidos diana monocatenarios con un cebador aleatorio que comprende una secuencia universal 5' y una secuencia aleatoria 3', extendiendo el cebador aleatorio en el polinucleótido diana para generar polinucleótidos fragmentados etiquetados en 5'.

El polinucleótido diana, o el polinucleótido diana fragmentado, comprende un grupo hidroxilo 3' libre. El polinucleótido diana puede ser ADN monocatenario, o ARN monocatenario o una combinación de ARN y ADN monocatenarios.

Una realización descrita en el presente documento proporciona un método para extender polinucleótidos que comprende:

mezclar el polinucleótido diana con la ADN polimerasa, el oligonucleótido plantilla adaptador (ATO) descrito anteriormente, que comprende una secuencia aleatoria 3' con el extremo 3' bloqueado y modificado para ser resistente a la actividad 3'exonucleasa;

incubar la mezcla en condiciones capaces de promover la hibridación, recortar el extremo 3' saliente, si lo hay, y extender para generar un polinucleótido diana modificado;

opcionalmente, degradar el ATO; y

amplificar el polinucleótido diana modificado utilizando cebadores compatibles con una plataforma de NGS, con una, o dos o más rondas de amplificación lineal y/o exponencial.

El método comprende además la fragmentación del polinucleótido diana antes de mezclarlo. El polinucleótido diana puede ser un polinucleótido fragmentado natural. Este polinucleótido fragmentado natural puede ser ácido nucleico plasmático circulante libre de células. Dichos polinucleótidos diana fragmentados pueden comprender la puesta en contacto de polinucleótidos bicatenarios con una transposasa unida al ADN del transposón, donde el ADN del transposón comprende un sitio de unión para transposasas y una secuencia universal, donde el complejo de transposasas/ADN del transposón se une a ubicaciones diana en el polinucleótido bicatenario y escinde los polinucleótidos bicatenarios en una pluralidad de fragmentos bicatenarios, donde cada fragmento bicatenario tiene el ADN del transposón unido a cada extremo 5' del fragmento bicatenario.

Además, se describe en el presente documento un método para generar una biblioteca de secuenciación que comprende:

añadir una secuencia adaptadora a un polinucleótido diana monocatenario según el ATO y las composiciones descritas anteriormente, extendiendo el polinucleótido diana monocatenario sobre una plantilla del ATO; y amplificar el polinucleótido diana etiquetado con el adaptador utilizando cebadores compatibles con una plataforma de NGS, donde el ATO comprende una secuencia adaptadora en la porción universal. La secuencia adaptadora proporciona una secuencia de cebado para la amplificación y la secuenciación de fragmentos de ácido nucleico y se utiliza, en algunos aspectos, para aplicaciones de secuenciación de próxima generación. En otros aspectos descritos en el presente documento, una "secuencia adaptadora" se utiliza como secuencia promotora para la generación de moléculas de ARN, donde la secuencia promotora es, por ejemplo, y sin limitación, una secuencia promotora de T7 o una secuencia promotora de SP6.

La presente divulgación proporciona un método para generar una biblioteca de polinucleótidos que comprende:

(i) generar un polinucleótido diana modificado utilizando un polinucleótido diana de una muestra que hibrida con la secuencia aleatoria 3' del oligos plantilla adaptadores (ATO) de cualquiera de los ATO mencionados anteriormente (primer ATO) en una primera reacción enzimática que añade una secuencia adaptadora al extremo 3' del polinucleótido diana; y

(ii) generar una primera secuencia complementaria (CS) del polinucleótido diana modificado utilizando un primer cebador, que comprende la secuencia universal, y utilizando el polinucleótido diana modificado como plantilla, donde el primer cebador se hibrida con la plantilla y se extiende mediante una polimerasa.

El polinucleótido diana se fragmenta preferiblemente de forma natural o artificial. El polinucleótido diana puede ser cualquier ácido nucleico, tal como ADN, ADNc, ARN, ARNm, ARN pequeño o microARN, o cualquier combinación de los mismos. El polinucleótido diana puede comprender una pluralidad de polinucleótidos diana. Cada uno de los polinucleótidos diana de la pluralidad puede comprender secuencias diferentes o la misma secuencia. Uno o más de los polinucleótidos diana, o una pluralidad de ellos, pueden comprender una secuencia variante.

Dependiendo del tipo de polinucleótido diana y del ATO, que puede ser ADN y/o ARN, los métodos pueden utilizar transcripción inversa o extensión de cebadores. Una reacción de extensión de cebadores puede consistir en una sola etapa. Una reacción de extensión de cebadores puede comprender la extensión de uno o más cebadores individuales una sola vez. Una reacción de extensión de cebadores puede comprender la extensión de uno o más cebadores individuales en una etapa. En la etapa (i), el extremo 3' o el extremo 3' recortado de los polinucleótidos diana actúa como cebador, que se extiende utilizando ATO como plantilla, en la etapa (ii), los cebadores de extensión o amplificación son el primer cebador que se hibrida con la parte extendida 3' del polinucleótido diana.

En una realización descrita en el presente documento, en la etapa (i), el extremo 3' de los polinucleótidos diana que actúan como cebadores se hibrida con el ATO a través del extremo 3' de la secuencia, que puede estar fragmentada aleatoria o específicamente. Se recortan para eliminar el saliente 3', si lo hay, mediante la actividad exonucleasa 3' a 5' de una polimerasa, y se extiende utilizando ATO como plantilla para generar polinucleótidos diana modificados. Debido a la naturaleza de la aleatoriedad de la porción de la secuencia aleatoria 3' del ATO, la hibridación perfecta entre el extremo 3' de los polinucleótidos diana y un ATO puede no ser fácil de obtener, por lo que se aplican condiciones menos rigurosas. Por ejemplo, se puede utilizar una alta concentración del ATO, una baja temperatura de hibridación, tal como 4 grados C, y/o múltiples ciclos de extensión, y/o tiempos de hibridación más largos. La extensión puede realizarse mediante cualquier polimerasa y/o cualquier transcriptasa inversa, o mezcla de diferentes polimerasas. Preferiblemente, la ADN polimerasa puede tener una actividad exonucleasa de 3' a 5', de modo que cualquier saliente 3', si está presente, se digiere (recorta) y puede tener lugar la extensión. La ADN polimerasa puede contener actividad de desplazamiento de cadena, de modo que la estructura de tallo-bucle y la porción universal bicatenaria de las moléculas del ATO se pueden abrir y copiar. Alternativamente, la ADN polimerasa puede contener actividad exonucleasa de 5' a 3', de modo que el extremo 5' de la estructura de tallo-bucle y la porción universal bicatenaria de las moléculas del ATO se pueden digerir y la cadena inferior del ATO se copia. La ADN polimerasa es preferiblemente activa a baja temperatura. La polimerasa puede contener una mezcla de diferentes polimerasas que pueden tener actividad exonucleasa de 3' a 5', actividad exonucleasa de 5' a 3' y/o actividad de desplazamiento de cadena. Las polimerasas que pueden utilizarse para poner en práctica los métodos divulgados en el presente documento incluyen, entre otras, la ADN polimerasa Deep VentR™, la ADN polimerasa Taq LongAmp™, la ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion™, la ADN polimerasa Hot Start de alta fidelidad Phusion™, la ADN polimerasa VentR®, la ADN polimerasa Hot Start DyNAzyme™ II, la ADN polimerasa Hot Start Phire™, la ADN polimerasa Taq Crimson LongAmp™, la ADN polimerasa EXT DyNAzyme™, la ADN polimerasa Taq LongAmp™, la ADN polimerasa Taq con tampón Taq estándar (sin Mg), ADN polimerasa Taq con tampón Taq estándar, ADN polimerasa Taq con tampón ThermoPol II (sin Mg), ADN polimerasa Taq con tampón ThermoPol, ADN polimerasa Crimson Taq™, ADN polimerasa Crimson Taq™ con tampón (sin Mg), ADN polimerasa (exo-) VentR®, Hemo KlenTaq™, ADN polimerasa (exo-) Deep VentR™, Kit de síntesis de ADNc de primera cadena ProtoCSript® AMV, Kit de síntesis de ADNc de primera cadena ProtoScript® M-MuLV, ADN polimerasa Bst de longitud completa, ADN polimerasa Bst de fragmento grande, ADN polimerasa Taq con tampón ThermoPol, ADN polimerasa de 9° Nm, ADN polimerasa Crimson Taq™, ADN polimerasa Crimson Taq™ con tampón (sin Mg), ADN polimerasa (exo-) Deep VentR™, ADN polimerasa Deep VentR™, ADN polimerasa EXT DyNAzyme™, ADN polimerasa Hot Start DyNAzyme™ II, Hemo KlenTaq™, ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion™, ADN polimerasa Hot Start de alta fidelidad Phusion™, ADN polimerasa IV Sulfolobus, ADN polimerasa Therminator™ y, ADN polimerasa Therminator™, ADN polimerasa Therminator™ II, ADN polimerasa Therminator™ III, a Dn polimerasa VentR®, ADN polimerasa (exo) VentR®, ADN polimerasa Bsu, fragmento grande, ADN polimerasa Bst, fragmento grande, ADN polimerasa I (E. coli), ADN polimerasa I, Fragmento Grande (Klenow), fragmento Klenow (3' ^ 5' exo-),<a>D<n>polimerasa phi29, ADN polimerasa T4, ADN polimerasa T7 (sin modificar), transcriptasas inversas y ARN polimerasas, transcriptasa inversa de AMV, transcriptasa inversa M-MuLV, A r N polimerasa phi6 (RdRp), ARN polimerasa SP6 y ARN polimerasa T7.

Las ligasas que pueden utilizarse para poner en práctica los métodos de la divulgación incluyen, entre otras, la ADN ligasa T4, la ARN ligasa T4, la ADN ligasa de E. coli y la ARN ligasa de E. coli.

Se pueden realizar múltiples ciclos de extensión mediante termociclado de temperaturas: hibridación, extensión y desnaturalización. El polinucleótido diana modificado tiene una porción 3' extendida, que puede comprender una secuencia aleatoria y una secuencia universal que proporciona un sitio de unión para un cebador. La parte 3' extendida también puede comprender UID adicional.

En una realización descrita en el presente documento, en la etapa (i), si la porción universal del ATO comprende nucleótidos de apareamiento débil, como la inosina, podría no ser necesaria la eliminación del ATO tras la primera reacción de extensión. De lo contrario, la eliminación o digestión del ATO de la mezcla de reacción puede realizarse por cualquier medio. Por ejemplo, si el ATO comprende residuos de uracilo, se digiere/elimina el ATO mediante digestión con UNG; si el ATO comprende ARN, se digiere o elimina el ATO mediante digestión con RNasa; si el ATO comprende un sitio de enzima de restricción, se digiere/elimina el ATO mediante digestión con enzimas de restricción; o si el ATO comprende biotina, se elimina el ATO mediante captura en perlas de estreptavidina. En otra realización descrita en el presente documento, podría no ser necesario digerir o eliminar el ATO de la mezcla de reacción si el ATO presenta la estructura de horquilla/tallo-bucle (Figs. 3B y 3C), ya que la estructura de horquilla del ATO imposibilita la hibridación del ATO con la parte extendida 3' del polinucleótido diana modificado.

En una realización descrita en el presente documento, la primera reacción del ATO es una reacción de extensión del cebador, donde el polinucleótido diana, que sirve como cebador, se extiende sobre la plantilla del ATO mediante una ADN polimerasa. La ADN polimerasa puede presentar una actividad de desplazamiento de cadena o una actividad de exonucleasa 5' a 3', donde durante la extensión se abre la estructura de tallo-bucle o se desplaza o digiere la cadena superior del ATO. Se puede utilizar cualquier polimerasa, por ejemplo, la exo-Klenow, Bst polimerasa o la ADN polimerasa T4.

En otra realización descrita en el presente documento, la primera reacción es una reacción de extensiónligación, donde una ADN polimerasa extiende la diana y una ADN ligasa liga la secuencia diana extendida a la porción del tallo 5' del ATO o a la cadena superior del ATO. Se puede utilizar cualquier ADN polimerasa y ADN ligasa, por ejemplo, el fragmento grande de Klenow, ADN ligasa T4.

En otra realización descrita en el presente documento, la primera reacción es una reacción de ligación, donde una ADN ligasa liga el polinucleótido diana a la porción del tallo 5' del ATO o a la cadena superior del ATO. Se puede utilizar cualquier ADN ligasa, por ejemplo, la ADN ligasa T4.

Tras la primera reacción, el método puede comprender la digestión de parte del ATO o eliminación de parte del ATO mediante captura por afinidad.

El método puede comprender la generación de una primera CS modificada mediante la hibridación de la primera CS con la secuencia aleatoria 3' del segundo ATO de uno cualquiera de los ATO mencionados anteriormente en una reacción enzimática que añade una secuencia adaptadora al extremo 3' de la primera CS, donde el segundo ATO comprende una secuencia universal 5' diferente del primer ATO.

El método descrito en el presente documento puede comprender además la generación de una primera CS modificada mediante la ligación de adaptadores bicatenarios en los productos de la etapa (ii).

En la etapa posterior a la digestión/eliminación del ATO, o sin digestión/eliminación del ATO, se genera una primera secuencia complementaria (CS) del polinucleótido diana modificado. La primera secuencia complementaria (CS) puede generarse mediante la extensión de un cebador. El cebador puede ser un cebador universal, capaz de hibridar con la parte extendida 3' del polinucleótido diana modificado y extenderse. Dependiendo del tipo de polinucleótidos diana, ya sean ADN, ARN o una combinación de ARN y ADN, los métodos pueden utilizar transcripción inversa y/o extensión de cebadores mediante una ADN polimerasa y/o transcriptasa inversa. La reacción de extensión del cebador puede ser una sola etapa de extensión del cebador. Alternativamente, la reacción de extensión del cebador puede consistir en múltiples ciclos de amplificación lineal utilizando el primer cebador. La primera CS generada comprende una secuencia universal 5' y la secuencia complementaria 3' de los polinucleótidos diana. El primer cebador comprende una secuencia universal 3' idéntica o sustancialmente idéntica a la porción de secuencia universal del ATO. El primer cebador puede comprender además otra porción de secuencia universal 5', compatible con una plataforma de secuenciación. El primer cebador puede comprender además una secuencia de código de barras de muestra (SBC) entre la secuencia universal 3' y la otra porción universal 5'.

En una realización descrita en el presente documento, el método comprende, además: generar una primera CS modificada utilizando la primera CS como cebador y utilizando un segundo oligos plantilla adaptadores (ATO) de uno cualquiera de los oligo mencionados anteriormente como plantilla. El extremo 3' de la primera CS se extiende sobre una plantilla del ATO para generar la primera CS extendida, que comprende una segunda secuencia universal en el extremo 3'. Tras la eliminación del segundo ATO, la primera CS puede amplificarse por PCR utilizando dos cebadores universales.

En otra realización descrita en el presente documento, el método comprende, además: extender un segundo cebador hibridado con la primera Cs o con la primera CS modificada, formando así una segunda CS, donde el segundo cebador comprende una porción específica diana o una secuencia universal, o una secuencia específica diana en 3' y una secuencia universal en 5'. En un aspecto descrito en el presente documento, cuando el segundo cebador es un cebador específico diana, este puede comprender una porción específica diana en 3' con o sin una porción universal en 5'. La extensión con el segundo cebador puede ser una extensión de una sola etapa o múltiples ciclos de amplificación lineal. Como alternativa, la etapa (ii) y esta etapa se combinan en una única reacción de PCR, que utiliza el primer cebador para generar la primera CS y usa el segundo cebador para formar una segunda CS, donde la primera Cs y la segunda CS se generan simultáneamente tras el primer ciclo de PCR. Tras la reacción de PCR o la amplificación lineal, el producto puede purificarse o los cebadores se eliminan mediante digestión con nucleasas monocatenarias específicas. Si el primer cebador contiene un código de barras de muestra, los productos de PCR purificados de varias muestras pueden agruparse. El producto de PCR o amplificación lineal purificado (agrupado) se amplifica posteriormente por PCR utilizando terceros cebadores anidados específicos diana para la primera CS y un cebador universal para la segunda CS. Los terceros cebadores anidados específicos diana para la primera CS comprenden una porción específica diana 3' y una porción de la secuencia universal 5', donde la porción de la secuencia universal 5' es compatible con una plataforma de NGS. El producto de PCR se purifica y queda listo para la secuenciación. En otro aspecto descrito en el presente documento, cuando el segundo cebador es un cebador específico diana, que puede comprender una porción específica diana 3' y una porción universal 5', donde la porción universal 5' es compatible con una plataforma de NGS. La etapa (ii) y esta etapa se combinan en una única reacción de PCR, que utiliza el primer cebador para generar la primera CS y utiliza el segundo cebador para formar la segunda Cs , donde la primera CS y la segunda CS se generan simultáneamente tras el primer ciclo de PCR. El producto de PCR se purifica y queda listo para la secuenciación.

Cuando el polinucleótido diana original de una muestra es bicatenario, la reacción de extensión de un segundo cebador hibridado con la primera CS puede dividirse en dos reacciones separadas, la reacción directa comprende un segundo cebador específico diana, complementario a la cadena directa de la secuencia diana, la reacción inversa comprende un segundo cebador específico diana, complementario a la cadena inversa de la secuencia diana, donde la cadena directa y la cadena inversa de la secuencia diana son complementarias.

En las etapas (i) o (ii), la extensión puede comprender una extensión de un solo paso o una amplificación lineal utilizando el primer o el segundo cebador. En la etapa (ii), la extensión puede comprender una amplificación exponencial utilizando el primer y el segundo cebador.

El primer cebador puede comprender una secuencia de código de barras de muestra (SBC) y una secuencia universal 5' adicional compatible con una plataforma de NGS.

En un aspecto descrito en el presente documento, la divulgación proporciona un método para extender un polinucleótido diana que comprende: mezclar el polinucleótido diana con una enzima polimerasa, una molécula del ATO que comprende secuencias adaptadoras NGS y una secuencia escindible; realizar la reacción de recorte y extensión, inactivar la polimerasa por calor, seguida de la incubación con una enzima ligasa de circularización monocatenaria específica; opcionalmente, incluir una reacción de escisión o una reacción de amplificación con cebadores inversos y directos, cualquiera de las cuales se realiza para resolver la molécula circular en una molécula de biblioteca de NGS lineal completa.

En otro aspecto descrito en el presente documento, el método proporciona un método para extender un polinucleótido diana que comprende mezclar el polinucleótido diana con enzimas polimerasas, ATO que comprende la secuencia adaptadora NGS; realizar la reacción de recorte y extensión, seguida de la incubación con un primer cebador complementario a la secuencia adaptadora NGS universal, una ADN polimerasa y dNTP para realizar una reacción de extensión para generar CS y una molécula de sustrato bicatenaria; realizando una ligadura con ligasa de ADN T4 y un adaptador de extremo romo o de cola T que se forma mediante el hibridación de dos oligonucleótidos que comprenden una secuencia adaptadora NGS y un complemento truncado y un fosfato 3', en donde el oligonucleótido se liga al fosfato 5' de la molécula de polinucleótido diana modificada para completar una molécula de biblioteca de NGS lineal.

La presente divulgación proporciona además un método para determinar con precisión la secuencia de un polinucleótido diana, que comprende:

(i) secuenciar al menos una de las segundas CS amplificadas de cualquiera de los métodos mencionados anteriormente;

(ii) alinear al menos dos secuencias que contengan el mismo UID de (i) y/o alinear las mismas secuencias diana de dos reacciones, generando cada reacción información de secuencia de una cadena o cadena complementaria de una secuencia diana dúplex; y

(iii) determinar una secuencia consenso y/o una secuencia variante idéntica de dos reacciones basándose en (ii), donde la secuencia consenso y/o la secuencia variante representa con precisión la secuencia del polinucleótido diana.

La presente divulgación proporciona además un kit para generar una biblioteca de polinucleótidos que comprende un oligos plantilla adaptadores (ATO) de una cualquiera de los ATO mencionados anteriormente y cebadores compatibles con una plataforma de NGS.

Los kit de la invención han sido definidos en las reivindicaciones adjuntas.

Un kit para generar una biblioteca de polinucleótidos comprende un oligos plantilla adaptadores (ATO) descrito anteriormente, polimerasa y cebadores compatibles con la plataforma de NGS.

Un polinucleótido diana es un polinucleótido, un polinucleótido modificado o una combinación de estos, como se describe a continuación. El polinucleótido diana es, en diversas realizaciones, ADN, ARN o una combinación de estos. En otra realización, el polinucleótido diana es un ácido nucleico tratado químicamente, incluyendo, entre otras, realizaciones en las que el polinucleótido sustrato es ADN tratado con bisulfito para detectar el estado de metilación mediante NGS.

Los polinucleótidos diana se obtienen de fuentes naturales o pueden ser sintéticos. Las fuentes naturales son ARN y/o ADN genómico de un procariota o un eucariota. Por ejemplo, y sin limitación, la fuente puede ser un ser humano, un ratón, un virus, una planta o una bacteria. En diversos aspectos descritos en el presente documento, el polinucleótido diana se extiende en el extremo 3' con una secuencia adaptadora para su uso en ensayos con microarreglos y la creación de bibliotecas para la secuenciación de ácidos nucleicos de próxima generación.

Si la fuente del polinucleótido diana es ADN o ARN genómico, o ambos, en algunas realizaciones, dicho ADN o ARN genómico, o ambos, se fragmentan antes de su extensión. La fragmentación del ADN/ARN genómico es un procedimiento general conocido por los expertos en la materia y se realiza, por ejemplo y sin limitación, in vitro, mediante cizallamiento (nebulización) del ADN/ARN, escisión del ADN/ARN con una endonucleasa, sonicación del ADN/ARN, calentamiento del ADN/ARN, irradiación del ADN/ARN con fuentes radiactivas alfa, beta, gamma u otras, luz, escisión química del ADN/ARN en presencia de iones metálicos, escisión radical y combinaciones de estas. La fragmentación del ADN/ARN genómico también puede ocurririn vivo,por ejemplo y sin limitación, debido a apoptosis, radiación o exposición a amiantos. De acuerdo con los métodos descritos en este documento, no es necesario que una población de polinucleótidos diana tenga un tamaño uniforme. Por lo tanto, los métodos de la divulgación son eficaces para su uso con una población de fragmentos de polinucleótidos diana de diferentes tamaños.

Como se usa en el presente documento, una "secuencia complementaria (CS) del polinucleótido diana" es un polinucleótido que comprende una secuencia complementaria a una secuencia diana o un complemento de la misma (complemento de una secuencia complementaria a una secuencia diana). En algunas realizaciones, una secuencia complementaria del polinucleótido diana comprende una primera secuencia complementaria. Una "primera secuencia complementaria" es un polinucleótido transcrito de forma inversa a partir de un polinucleótido diana o formado a partir de una reacción de extensión del cebador en un polinucleótido diana o un polinucleótido de ARN transcrito a partir de un promotor de ARN polimerasa bicatenario a partir del polinucleótido diana modificado por una ARN polimerasa. Un polinucleótido diana modificado es un polinucleótido diana extendido sobre ATO que comprende una secuencia aleatoria y una secuencia universal.

Una secuencia complementaria del polinucleótido diana comprende una segunda secuencia complementaria. Una " segunda secuencia del complemento" es un polinucleótido que comprende una secuencia complementaria a una primera secuencia complementaria. Una secuencia complementaria del polinucleótido diana puede comprender un UID. Por ejemplo, una primera secuencia complementaria puede comprender un UID proporcionada por una secuencia aleatoria del ATO y por la parte del extremo 3' del polinucleótido diana fragmentado aleatoriamente.

El segundo o tercer cebador puede ser un grupo de una pluralidad de segundo o tercer cebadores. Cada segundo o tercer cebador de una pluralidad de segundos o terceros cebadores se extiende simultáneamente, se extiende en la misma cámara de reacción.

La etapa de amplificación utilizando segundos cebadores específicos diana puede dividirse en dos reacciones: reacción directa y reacción inversa. La reacción directa comprende un grupo directo de múltiples segundos cebadores específicos diana que se hibridan con las primeras cadenas de las múltiples CS diana de una muestra, y la reacción inversa comprende un grupo inverso de múltiples segundos cebadores específicos diana que se hibridan con las segundas cadenas de las múltiples CS diana de la misma muestra. Los cebadores utilizados para generar productos de PCR en la PCR anidada pueden comprender un cebador universal dirigido a la porción de la secuencia universal 5' de los primeros cebadores y un tercer grupo de múltiples cebadores específicos diana que se hibridan con las segundas cadenas de las múltiples secuencias diana, donde el tercer grupo de cebadores específicos diana (cebadores internos) está anidado con el grupo de segundos cebadores específicos diana (cebadores externos). Los cebadores universales en las reacciones directa e inversa pueden ser los mismos.

Las mezclas de reacción pueden comprender múltiples reacciones para más de una muestra, que pueden ser dos, tres, más de tres o más de 10 muestras. Diferentes muestras pueden procesarse juntas en paralelo. Cada muestra puede comprender dos reacciones: reacción directa y reacción inversa. Las diferentes reacciones de muestra (todas las reacciones directas o todas las reacciones inversas) se pueden mezclar preferiblemente después de la etapa (ii), donde la identidad de cada muestra se asigna en la amplificación mediante los primeros cebadores con SBC. Todas las reacciones directas o inversas posteriores a la etapa (ii) se pueden procesar en una sola mezcla.

El método comprende además el análisis de las lecturas de NGS derivadas de la reacción directa y la reacción inversa, que representan dos cadenas diferentes de secuencias diana, lo que implica generar secuencias consenso con corrección de errores mediante (i) la agrupación en familias que contienen las mismas secuencias identificadoras (UID) de secuencia aleatorios; (ii) la eliminación de las secuencias diana de la misma familia que tengan una o más posiciones de nucleótidos donde la secuencia diana discrepe con los miembros mayoritarios, y (iii) el examen de si aparecen las mismas mutaciones en las dos reacciones, que representan diferentes cadenas de una secuencia diana.

El método comprende además el análisis de las lecturas de NGS derivadas de la reacción directa y la reacción inversa, que representan dos cadenas diferentes de secuencias diana, lo que implica generar secuencias consenso mediante la agrupación en familias que contienen las mismas secuencias identificadoras (UID) de secuencia aleatorias; y el recuento del número de familias. Este método proporciona un recuento preciso de la cantidad de ácidos nucleicos diana originales presentes en una muestra.

Los métodos pueden utilizarse para cuantificar las moléculas de partida, el recuento de familias de UID de una secuencia diana en comparación con otras muestras o la comparación entre la reacción directa y la reacción inversa pueden proporcionar información precisa sobre el recuento.

El UID tiene un doble propósito. En primer lugar, la asignación de un UID único a cada molécula plantilla original de ADN o ARN. En segundo lugar, la amplificación de cada plantilla con etiqueta única, de modo que se generen muchas moléculas hijas con la misma secuencia de UID (definidas como una familia de UID). Si una mutación preexistía en la molécula plantilla utilizada para la amplificación, dicha mutación debería estar presente en cada molécula hija que contenga ese UID.

Los cebadores universales pueden contener uno, dos o más fosforotioatos terminales para hacerlos resistentes a cualquier actividad de exonucleasa. También pueden contener secuencias de injerto 5' necesarias para la hibridación con la celda de flujo de NGS, por ejemplo, la celda de flujo Illumina GA IIx. Finalmente, pueden contener una secuencia índice entre la secuencia de injerto y la secuencia etiqueta universal. Esta secuencia índice permite analizar simultáneamente los productos de<p>C<r>de múltiples individuos diferentes en el mismo compartimento de la celda de flujo del secuenciador.

La secuencia de ácido nucleico diana de una muestra puede comprender un fragmento de ácido nucleico o un gen que contiene uno o más nucleótidos variantes y puede seleccionarse del grupo que consiste en uno o más SNP/eliminaciones/inserciones asociadas a trastornos, uno o más reordenamientos cromosómicos, genes de trisomía o cáncer, genes de resistencia a fármacos y genes de virulencia. El gen asociado a un trastorno puede incluir, entre otros, genes asociados al cáncer y genes asociados a una enfermedad hereditaria. La muestra puede ser ADN genómico, ácido nucleico circulante, ARN, ARNm, ARN pequeño, microARN o ADN o ARN FFPE.

Los uno o más nucleótidos variantes en la región diagnóstica de la secuencia del polinucleótido diana pueden incluir una o más sustituciones de nucleótidos, reordenamientos cromosómicos, eliminaciones, inserciones y/o metilación anormal.

La metilación del ADN es una modificación epigenética importante del genoma. La metilación anormal del ADN puede provocar el silenciamiento de genes supresores de tumores y es común en diversas células cancerosas humanas. Para detectar la presencia de cualquier metilación anormal en el polinucleótido diana, se debe realizar un tratamiento preliminar antes de aplicar el presente método. Preferiblemente, la muestra de ácido nucleico debe modificarse químicamente mediante un tratamiento con bisulfito, que convertirá la citosina en uracilo, pero no la citosina metilada (es decir, 5-metilcitosina, que es resistente a este tratamiento y permanece como citosina). Con estas modificaciones, el método puede aplicarse a la detección de una o más metilaciones anormales en el ácido nucleico diana. En otra realización, la modificación mediante tratamiento con bisulfito se produce después de la reacción con ATO. En otra realización, la modificación mediante tratamiento con bisulfito se produce después de la generación de la primera CS.

La presente divulgación proporciona un método para analizar una muestra biológica con el fin de determinar la presencia y/o la cantidad y/o frecuencia de mutaciones o polimorfismos en múltiples loci de diferentes secuencias de ácidos nucleicos diana. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método para analizar una muestra biológica con el fin de detectar anomalías cromosómicas, por ejemplo, trisomías. La reacción con ATO puede ir seguida de secuenciación de próxima generación, PCR digital, microarreglos u otros análisis de alto rendimiento. El número de multiplexaciones de loci diana puede ser superior a 5, o superior a 10, o superior a 30, o superior a 50, o superior a 100, o superior a 500, o superior a 1000 o incluso superior a 2000.

Cuando una concentración de mutante en una muestra es muy baja (por ejemplo, si hay uno o dos mutantes), tras dividir el ácido nucleico de la muestra en dos reacciones, solo una puede contener el mutante. La comparación de las secuencias de dos cadenas de ambas reacciones puede revelar que solo una puede contener la mutación. Se clasificará como mutación verdadera si más de una familia de lecturas contiene la misma mutación, incluso si esta aparece en una sola reacción.

En otra realización descrita en el presente documento, el polinucleótido diana modificado puede amplificarse mediante amplificación lineal o exponencial antes de dividir el ácido nucleico de la muestra en dos reacciones, para una o más rondas de amplificación posteriores. Debido al aumento en el número de copias de todas las moléculas originales, la comparación de las secuencias de dos cadenas de las dos reacciones tiene mayor probabilidad de revelar la presencia de una mutación.

En otra realización descrita en el presente documento, el polinucleótido diana modificado no se divide en dos reacciones, y solo una de las dos cadenas se investiga para detectar la presencia de la mutación.

En otra realización descrita en el presente documento, el polinucleótido diana no se divide en dos reacciones, y ambas cadenas se amplifican por separado y secuencialmente para permitir su análisis.

La liberación de ADN libre de células al torrente sanguíneo desde células tumorales moribundas ha sido bien documentada en pacientes con diversos tipos de cáncer. La investigación ha demostrado que el ADN tumoral circulante puede utilizarse como biomarcador no invasivo para detectar la presencia de malignidad, seguir la respuesta al tratamiento o monitorizar la recurrencia. Sin embargo, los métodos actuales de detección presentan limitaciones significativas. Los métodos de secuenciación de próxima generación (NGS) han revolucionado la exploración genómica al permitir la secuenciación simultánea de cientos de miles de millones de pares de bases en una fracción de tiempo y coste mucho menor que los métodos tradicionales. Sin embargo, una tasa de error de aproximadamente el 1 % resulta en cientos de millones de errores de secuenciación, lo cual es inaceptable cuando se busca identificar mutantes raros en mezclas genéticamente heterogéneas, como tumores y plasma. Los métodos de esta invención superan estas limitaciones en la precisión de la secuenciación. El ADN libre de células portador de mutaciones puede verse oscurecido por un exceso relativo de ADN de tipo silvestre de fondo; la detección ha demostrado ser un desafío. El método reduce considerablemente los errores al etiquetar y secuenciar de forma independiente cada dúplex de ADN original.

Los métodos de la presente invención pueden mejorar sustancialmente la precisión de la secuenciación masiva paralela. Este enfoque se puede utilizar fácilmente para identificar mutantes raros en una población de plantillas de ADN. Cada una de las dos cadenas de una plantilla diana en la muestra está etiquetada de forma única y secuenciada de forma independiente. La comparación de las secuencias de las dos cadenas da como resultado concordancia o discordancia. La concordancia proporciona la confianza para clasificar una mutación como verdaderamente positiva.

Tras la secuenciación, los miembros de cada familia de lectura se identifican y agrupan por compartir la misma secuencia de etiqueta de UID. Las secuencias de la familia etiquetada con UID únicamente y una o dos cadenas de secuencias diana se comparan para crear una secuencia consenso. Esta etapa filtra los errores aleatorios introducidos durante la secuenciación o la PCR para obtener un grupo de secuencias, cada una derivada de una molécula individual de ADN monocatenario.

Además de su aplicación para la detección de alta sensibilidad de variantes raras de ADN, el identificador de secuencia aleatorio con código de barras del cebador específico diana también puede utilizarse para el recuento de moléculas individuales y determinar con precisión el número relativo o absoluto de copias de ADN y/o ARN. Dado que el etiquetado se produce antes de la amplificación principal, la abundancia relativa de variantes en una población puede evaluarse con precisión, dado que la representación proporcional no está sujeta a sesgos de amplificación.

Los métodos de la presente invención reducen considerablemente los errores al etiquetar cada secuencia diana con un identificador de secuencia aleatorio y secuenciar las dos cadenas. El análisis proporciona secuencias consenso con corrección de errores al agrupar las secuencias etiquetadas únicamente secuenciadas; se eliminan las secuencias diana de la misma familia que tienen una o más posiciones de nucleótidos donde la secuencia diana discrepa de la mayoría de los miembros de la familia; y las mismas mutaciones que aparecen en las dos poblaciones serían las mutaciones verdaderas.

El método puede utilizarse para detectar mutaciones en cualquier muestra, como FFPE o sangre. El recuento preciso de las lecturas de secuenciación que reflejan las moléculas originales presentes en una muestra proporciona información sobre variaciones en el número de copias o para la prueba prenatal de anomalías cromosómicas.

Los reactivos empleados en los métodos de la invención pueden empacarse en kits. Los kits incluyen uno o más ATO, polimerasas, los cebadores, en recipientes separados o en un único recipiente para la mezcla maestra. El kit también puede contener otros reactivos y materiales adecuadamente empacados necesarios para la extensión, la amplificación y el enriquecimiento, por ejemplo, tampones, dNTP y/o medios de polimerización; y para el análisis de detección, por ejemplo, y enzimas, así como instrucciones para realizar el ensayo.

Breve descripción de los dibujos

La FIG.1A representa un esquema de una realización ilustrativa. Un polinucleótido diana (uno o más productos de PCR, o<a>D<n>, o ARN, o cualquier mezcla de los mismos) puede ser bicatenario, solo se muestra una de dos cadenas (cadena directa). En la etapa (i), las moléculas del ATO se hibridan con secuencias de polinucleótidos diana monocatenarios en una o más ubicaciones. Los extremos 3' del polinucleótido diana se hibridan con la porción de secuencia aleatoria 3' del ATO, se recorta si hay alguna saliente 3' presente y se extiende utilizando ATO como plantilla. La extensión genera un polinucleótido diana modificado, que comprende una secuencia aleatoria como UID y una secuencia universal 3' como sitio de cebado. Después de la etapa (i), los ATO se digieren o eliminan por captura por afinidad. En alguna realización, el ATO no se digiere ni se elimina. En la etapa (ii), se añaden los primeros cebadores universales para hibridar con el polinucleótido diana modificado y se extienden para generar las secuencias del primer complemento (CS).

La FIG. 1B muestra un esquema de una realización ilustrativa. En la etapa (i), los ATO se hibridan con secuencias monocatenarias del polinucleótido diana en una o más ubicaciones. El extremo 3' del polinucleótido diana hibrida con la porción aleatoria 3' del ATO, se recortan si existe alguna saliente 3' y se extienden utilizando el ATO como plantilla. El ATO comprende una estructura de tallo-bucle y la porción del bucle comprende un enlace no copiable. La extensión desplaza la secuencia de la porción del tallo 5' y se detiene en el enlace no copiable. La extensión genera un polinucleótido diana modificado, que comprende una secuencia aleatoria como UID y una secuencia universal 3' como sitio de cebado. Tras la etapa (i), los ATO se digieren o se eliminan por captura por afinidad. En algunas realizaciones, el ATO no se digiere ni se elimina. En la etapa (ii), se añaden los primeros cebadores universales para hibridar con el polinucleótido diana modificado y se extienden para generar las secuencias del primer complemento (CS).

La FIG. 1C muestra un esquema de una realización ilustrativa. En la etapa (i), los ATO se hibridan con secuencias monocatenarias del polinucleótido diana en una o más ubicaciones. El extremo 3' del polinucleótido diana hibrida con la porción aleatoria 3' del ATO, se recorta si hay alguna saliente 3' y se extiende utilizando el ATO como plantilla. El ATO presenta una estructura de tallo-bucle, y la porción del bucle contiene una modificación que puede digerirse o escindirse, como el nucleótido de uracilo, lo que permite romper la horquilla. La cadena de extensión se une a la secuencia de la porción del tallo 5' y se liga a la porción del tallo 5', que contiene el grupo fosfato 5'. La extensión-ligación genera un polinucleótido diana modificado, que comprende una secuencia aleatoria como UID y una secuencia universal 3' como sitio de cebado. En algunas realizaciones, el extremo 3' de una cadena del polinucleótido diana se hibrida con la porción de secuencia aleatoria 3' del ATO inmediatamente adyacente a la porción 5' del tallo del ATO y se liga a dicha porción mediante ligadura de ADN. Esta ligadura puede realizarse sin usar ADN polimerasa. Tras la etapa (i), los ATO pueden escindirse en la modificación, la parte inferior del ATO puede digerirse o eliminarse mediante captura por afinidad. En la etapa (ii), se añaden los primeros cebadores universales para hibridar con el polinucleótido diana modificado y se extienden para generar las secuencias del primer complemento (CS).

La FIG. 1D muestra un esquema de una realización ilustrativa. En la etapa (i) de la reacción, los ATO se hibridan con secuencias monocatenarias de polinucleótidos diana en una o más ubicaciones. El extremo 3' de una cadena del polinucleótido diana hibrida con la porción de la secuencia aleatoria 3' del ATO, se recorta si existe alguna saliente 3' y se extiende utilizando ATO como plantilla. El ATO comprende una estructura bicatenaria; su porción universal se forma con dos secuencias diseñadas para hibridarse y formar una región bicatenaria, una parte inferior del ATO que contiene la secuencia aleatoria y una parte superior separada. La extensión del nucleótido diana desplaza o digiere la secuencia de la parte superior mediante una ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de cadena o actividad de exonucleasa 5' a 3'. La extensión genera un polinucleótido diana modificado, que comprende una secuencia aleatoria como UID y una secuencia universal 3' como sitio de cebado. El ATO puede digerirse después de la primera reacción. En algunas realizaciones, el extremo 3' de una cadena del polinucleótido diana hibrida con la porción de secuencia aleatoria 3' del ATO, se recorta si existe alguna saliente 3' y se extiende utilizando ATO como plantilla. La cadena de extensión se une a la secuencia de la parte superior 5' y se liga a dicha parte, que contiene el grupo fosfato 5'. La extensiónligación genera un polinucleótido diana modificado, que comprende una secuencia aleatoria como UID y una secuencia universal 3' como sitio de cebado. En algunas realizaciones, el extremo 3' de una cadena del polinucleótido diana hibrida con la porción de secuencia aleatoria 3' del ATO inmediatamente adyacente al extremo 5' de la parte superior del ATO y se liga a dicha parte mediante una ADN ligasa. Esta ligación puede realizarse sin utilizar ADN polimerasa. Tras la etapa (i), los ATO o la parte inferior del ATO pueden eliminarse mediante digestión o captura por afinidad. En la etapa (ii), se añaden los primeros cebadores universales para hibridar con el polinucleótido diana modificado y se extienden para generar las secuencias del primer complemento (CS).

La FIG. 2 muestra un esquema de una realización ilustrativa.

(A) Se proporcionan segundos cebadores específicos diana para hibridar la primera CS y se extienden para generar una segunda CS. El segundo cebador específico diana comprende una porción específica diana 3' y una porción universal 5'. La extensión puede ser una extensión de una sola pasada, o múltiples ciclos de amplificación lineal, o amplificación por PCR utilizando tanto el primer cebador como el segundo. Opcionalmente, la segunda CS puede amplificarse por PCR utilizando cebadores universales compatibles con la plataforma de NGS.

(B) Se proporcionan segundos cebadores específicos diana para hibridar la primera CS y se extienden para generar una segunda CS. El segundo cebador específico diana comprende una porción específica diana 3' con o sin porción universal 5'. La extensión puede ser de una sola pasada, o múltiples ciclos de amplificación lineal o de amplificación por PCR utilizando tanto el primer cebador como el segundo. La segunda CS se amplifica por PCR utilizando terceros cebadores anidados específicos diana y cebadores universales compatibles con la plataforma de NGS. Opcionalmente, la segunda CS puede amplificarse por PCR utilizando cebadores universales compatibles con la plataforma de NGS.

(C) El primer cebador se hibrida con la secuencia adaptadora añadida del polinucleótido diana y se extiende para generar un ADN bicatenario de la primera CS. El ADN bicatenario de la primera CS se liga a un adaptador a través de una ligadura bicatenaria mediante una ADN ligasa. Solo es necesario ligar la cadena del C<s>. El producto de la ligadura puede capturarse opcionalmente por afinidad en un soporte sólido. Tras la ligadura, la producción puede amplificarse con dos cebadores universales.

(D) El polinucleótido diana se trata con bisulfito, lo que convierte la citosina no metilada (C) en uracilo y deja intacta la citosina metilada. Los ATO se hibridan con secuencias monocatenarias del polinucleótido diana en una o más ubicaciones. El extremo 3' de una cadena del polinucleótido diana se hibrida con la porción de la secuencia aleatoria 3' del ATO, se recorta si existe alguna saliente 3', y se extiende utilizando ATO como plantilla. La extensión genera un polinucleótido diana modificado, que comprende una secuencia aleatoria como UID y una secuencia universal 3' como sitio de cebado. El ATO puede digerirse después de la primera reacción. El polinucleótido diana modificado se hibrida con un cebador universal, cuyo extremo 3' está diseñado para hibridar con la secuencia universal del polinucleótido diana modificador, con o sin una secuencia universal 5' adicional, y con un grupo de cebadores específicos diana, que comprenden una porción específica diana 3', con o sin una porción universal 5' adicional. La mezcla de dos cebadores se amplifica mediante uno o más ciclos de PCR, utilizando tanto el cebador universal como uno o más cebadores específicos diana. El producto de esta amplificación puede utilizarse directamente para la secuenciación de próxima generación o puede procesarse posteriormente para obtener un producto adecuado para la secuenciación de próxima generación.

(E) Los ATO se hibridan con secuencias monocatenarias de polinucleótidos diana en una o más ubicaciones. El extremo 3' de una cadena del polinucleótido diana se hibrida con la porción de la secuencia aleatoria 3' del ATO, se recorta si existe alguna saliente 3' y se extiende utilizando ATO como plantilla. La extensión genera un polinucleótido diana modificado, que comprende una secuencia aleatoria como UID y una secuencia universal 3' como sitio de cebado. El ATO puede digerirse después de la primera reacción. El polinucleótido diana modificado se somete posteriormente a un tratamiento con bisulfato. El polinucleótido diana modificado se hibrida con un cebador universal, cuyo extremo 3' está diseñado para hibridar con la secuencia universal del polinucleótido diana modificador, con o sin una secuencia universal 5' adicional, y un grupo de uno o más cebadores específicos diana, que comprenden una porción específica diana 3', con o sin una porción universal 5' adicional. La mezcla de dos cebadores se amplifica mediante uno o más ciclos de PCR utilizando tanto el cebador universal como uno o más cebadores específicos diana. El producto de esta amplificación puede utilizarse directamente para la secuenciación de próxima generación o puede procesarse posteriormente para obtener un producto adecuado para la secuenciación de próxima generación.

(F) La primera CS se hibrida con un segundo ATO y genera una primera CS modificada con una secuencia adaptadora añadida al extremo 3' de la primera CS. La primera CS puede generarse mediante amplificación lineal utilizando un primer cebador que contiene biotina. Opcionalmente, tras la amplificación lineal, la primera CS se captura por afinidad con avidina y la CS no perteneciente a la primera CS se elimina mediante lavado. Se añade el segundo ATO y se repite la reacción de extensión como la primera reacción. Tras la reacción de extensión, el producto no reaccionado se elimina mediante lavado y se amplifica con dos cebadores universales dirigidos a ambos extremos de la secuencia universal. El cebador universal dirigido al extremo 5' de la primera CS puede ser un cebador de nido.

(G) El polinucleótido diana modificado se divide en una o más alícuotas. Cada alícuota se combina con un cebador universal, la porción 3' de este cebador está diseñada para hibridar con la secuencia universal del polinucleótido diana modificador y tiene una cola 5' que contiene las secuencias necesarias para la secuenciación de próxima generación. Se añade un cebador específico de diana diferente o un grupo de cebadores específicos de diana, los cebadores están diseñados para amplificar las regiones diana del polinucleótido diana. Los cebadores específicos diana comprenden una porción 3' específica diana con una porción universal 5' que contiene las secuencias necesarias para la secuenciación de próxima generación. La mezcla se amplifica mediante uno o más ciclos de PCR utilizando tanto el cebador universal como el o los cebadores específicos diana. El producto de esta amplificación serán productos de PCR, cada uno con regiones diana amplificadas del polinucleótido original e incluirá todas las secuencias necesarias para compatibilidad con la secuenciación de próxima generación.

(H) El polinucleótido diana modificado se combina con un cebador universal, el cebador está diseñado para hibridar con la secuencia universal del polinucleótido diana modificador, con o sin una secuencia universal 5' adicional, se añade un cebador específico diana o un grupo de cebadores específicos diana. Los cebadores específicos diana comprenden una secuencia específica 3' diana con o sin una secuencia universal 5'. La mezcla se amplifica mediante uno o más ciclos de PCR utilizando tanto el cebador universal como el, los cebadores específicos diana. El producto de esta amplificación serán fragmentos de PCR que contienen regiones diana amplificadas del polinucleótido original, con o sin secuencias universales '3 y 5'. El primer producto de amplificación puede purificarse para eliminar los reactivos que ya no son necesarios en la primera reacción de PCR. Los productos de PCR se combinan con un segundo cebador universal anidado, la porción 3' de este cebador está diseñada para hibridar con la secuencia universal del primer producto de PCR y tiene una cola 5' que contiene las secuencias necesarias para la secuenciación de próxima generación, y un cebador específico diana anidado en forma diferente, o grupo de cebadores específicos diana anidados, que comprenden una porción 3' específica diana con una porción universal 5' que contiene secuencias necesarias para la secuenciación de próxima generación. La mezcla se amplifica mediante uno o más ciclos de PCR utilizando tanto el cebador universal como el, los cebadores específicos diana. El producto de esta amplificación son productos de PCR que han amplificado la región diana del polinucleótido original e incluyen todas las secuencias necesarias para la compatibilidad con la secuenciación de próxima generación.

La FIG. 3 muestra un esquema de una realización ilustrativa. Los oligos plantilla adaptadores incluyen (A), además de cualquier combinación de los componentes de diseño mencionados en (A-T) un ATO que comprende una secuencia aleatoria 3', una secuencia degenerada, una secuencia aleatoria con sesgo nucleotídico o una secuencia específica diana; el extremo 3' está unido a una fracción bloqueadora, lo que hace que el ATO sea inextensible; una secuencia universal, 5' respecto a la secuencia aleatoria; y una o más fracciones que pueden ser una secuencia/modificación de nucleótidos (NSM) reconocibles por un agente.

(B) Además de cualquier combinación de los componentes de diseño mencionados en (A-T), un ATO que comprende una estructura de horquilla/tallo-bucle, donde se indica la secuencia de la porción del tallo. La porción del bucle puede estar compuesta por un enlace no copiable o uno o más nucleótidos escindibles.

(C) Además de cualquier combinación de los componentes de diseño mencionados en (A-T), un ATO que comprende una estructura de horquilla/tallo-bucle, donde se indica la secuencia de la porción del tallo. La porción del tallo puede estar compuesta por uno o más enlaces no copiables o uno o más nucleótidos escindibles.

(D) Además de cualquier combinación de los componentes de diseño mencionados en (A-U), un ATO que comprende una estructura de horquilla/tallo-bucle, donde se indica la secuencia de la porción del tallo. La porción del tallo puede estar compuesta por uno o más enlaces no copiables o uno o más nucleótidos escindibles. La región del bucle puede contener una secuencia aleatoria, una secuencia degenerada, una secuencia aleatoria con sesgo de nucleótidos o una secuencia específica diana capaz de actuar como identificador único.

(E) Además de cualquier combinación de los componentes de diseño mencionados en (A-J), un ATO diseñado con dos cadenas separadas que comprende una cadena superior separada que es complementaria o sustancialmente complementaria a la totalidad o parte de la cadena inferior del ATO, siendo la parte inferior del ATO equivalente al ATO en (A).

(F) Además de cualquier combinación de los componentes de diseño mencionados en (A-U), un ATO cuyo sitio universal esté compuesto total o parcialmente por una secuencia diseñada para funcionar como promotor de la ARN polimerasa.

(G) Además de cualquier combinación de los componentes de diseño mencionados en (A-U), un ATO cuyo sitio universal esté compuesto parcialmente por una secuencia diseñada para funcionar como promotor de la ARN polimerasa y una secuencia separada diseñada para funcionar como sitio de cebado.

(H) Además de cualquier combinación de los componentes de diseño mencionados en (A-U), un ATO que comprende una estructura de horquilla/tallo-bucle, donde se indica la secuencia de la porción del tallo, la porción del bucle puede incluir un enlace no copiable, uno o más nucleótidos escindibles y tiene una secuencia diseñada para funcionar como promotor de la ARN polimerasa.

(I) Además de cualquier combinación de los componentes de diseño mencionados en (A-U), un ATO que comprende una estructura de horquilla/tallo-bucle, donde la porción del tallo está separada en dos o más regiones separadas por una secuencia aleatoria, una secuencia degenerada o una secuencia aleatoria con sesgo nucleotídico, que está abarcada por un enlace incopiable o una longitud equivalente de secuencia aleatoria, una secuencia degenerada o una secuencia aleatoria con sesgo nucleotídico. (J) Además de cualquier combinación de los componentes de diseño mencionados en (A-U), un ATO que comprende una secuencia 3' diseñada para ser específica diana, una secuencia aleatoria, una secuencia degenerada o una secuencia aleatoria con sesgo nucleotídico 5' respecto a la secuencia específica diana, y una secuencia universal 5' respecto a la secuencia aleatoria.

(K) Además de cualquier combinación de los componentes de diseño mencionados en (A-U), un ATO cuya cadena inferior contiene un sitio universal y está compuesta parcialmente por una secuencia diseñada para funcionar como promotor de la ARN polimerasa y una secuencia separada diseñada para funcionar como sitio de cebado, y la cadena superior es un segundo oligo parcial o totalmente complementario a la cadena inferior, capaz de formar un promotor de la ARN polimerasa bicatenario.

(L) Además de cualquier combinación de los componentes de diseño mencionados en (A-U), un ATO que comprende una estructura de horquilla/tallo-bucle, donde se indica la secuencia de la porción del tallo. La región del bucle puede contener una secuencia aleatoria, una secuencia degenerada, una secuencia aleatoria con sesgo de nucleótidos o una secuencia específica diana capaz de actuar como identificador único, y estar compuesta por un enlace no copiable o uno o más nucleótidos escindibles.

(M) Además de cualquier combinación de los componentes de diseño mencionados en (A-U), un ATO que comprende una estructura de horquilla/tallo-bucle, donde se indica la secuencia de la porción del tallo. La porción del tallo puede estar compuesta por uno o más enlaces no copiables o uno o más nucleótidos escindibles. La región del bucle puede contener una secuencia aleatoria, una secuencia degenerada, una secuencia aleatoria con sesgo nucleotídico o una secuencia específica diana capaz de actuar como identificador único.

(N) Además de cualquier combinación de los componentes de diseño mencionados en (A-U), un ATO que comprende una estructura de horquilla/tallo-bucle, donde la porción del tallo está dividida en dos o más regiones separadas por una secuencia aleatoria, una secuencia degenerada o una secuencia aleatoria con sesgo nucleotídico, que está abarcada por un enlace no copiable o una secuencia aleatoria de longitud equivalente, una secuencia degenerada o una secuencia aleatoria con sesgo nucleotídico. La porción del bucle puede estar compuesta por un enlace no copiable o uno o más nucleótidos escindibles.

(O) Además de cualquier combinación de los componentes de diseño mencionados en (A-U), un ATO con una secuencia aleatoria en 3', una secuencia degenerada o una secuencia aleatoria con sesgo nucleotídico, y un extremo 3' muy adecuado para su uso como cebador y permitir la extensión del ATO.

(P) Además de cualquier combinación de los componentes de diseño mencionados en (A-U), un ATO con una secuencia específica diana en 3' y un extremo 3' muy adecuado para su uso como cebador y permitir la extensión del ATO.

(Q) Además de cualquier combinación de los componentes de diseño mencionados en (A-U), un ATO que comprende una estructura de horquilla/tallo-bucle, donde se indica la secuencia de la porción del tallo. La porción del bucle puede estar compuesta por un enlace no copiable o uno o más nucleótidos escindibles. El extremo 5' del ATO está compuesto por un aceptor de ligadura, tal como un fosfato.

(R) Además de cualquier combinación de los componentes de diseño mencionados en (A-U), un ATO que comprende una estructura de horquilla/tallo-bude, donde se indica la secuencia de la porción del tallo. La porción del bucle puede estar compuesta por un enlace no copiable o uno o más nucleótidos escindibles. El extremo 5' del ATO comprende una fracción de purificación por afinidad, tal como la biotina.

(S) Además de cualquier combinación de los componentes de diseño mencionados en (A-U), un ATO lineal con un extremo 5' que comprende un aceptor de ligación, tal como un fosfato.

(T) Además de cualquier combinación de los componentes de diseño mencionados en (A-U), un ATO lineal con un 5' que comprende una fracción de purificación por afinidad, tal como la biotina.

(U) Además de cualquier combinación de los componentes de diseño mencionados en (A-U), un ATO lineal compuesto únicamente por una secuencia aleatoria con un 3' bloqueado para evitar la extensión y un fosfato 5'.

La FIG. 4 muestra un esquema de una realización ilustrativa. El proceso de fragmentación enzimática mediante nucleasas o el cizallamiento físico del ADN por sonicación puede sustituirse por la fragmentación mediante el uso de una transposasa. En la etapa (i), se incuba un polinucleótido (ADN) bicatenario diana con ADN del transposón y una transposasa. Una vez completada la reacción de transposición aleatoria, el polinucleótido diana contendrá múltiples copias del ADN del transposón, lo que genera extremos 3' libres en el polinucleótido diana y extremos 5' libres del ADN del transposón. En la etapa (ii), las moléculas del ATO se hibridan con secuencias monocatenarias del polinucleótido diana en una o más ubicaciones. Los extremos 3' libres generados como resultado de la transposición aleatoria de una cadena del polinucleótido diana se hibridan con la porción de la secuencia aleatoria 3' del ATO, se recortan si hay alguna saliente 3' y se extienden utilizando ATO como plantilla. La extensión genera un polinucleótido diana modificado, que comprende una secuencia universal 5' del ADN del transposón, una región del polinucleótido diana 3' respecto al ADN del transposón, una secuencia aleatoria como UID 3' respecto al polinucleótido diana y una segunda secuencia universal 3' como sitio de cebado. Tras la etapa (ii), los ATO se digieren o eliminan mediante captura por afinidad. En algunas realizaciones, el ATO no se digiere ni se elimina. En la etapa (iii), el polinucleótido diana modificado se utiliza como material de partida para la generación de la cadena del complemento (CS), la amplificación por PCR u otros procesos posteriores.

La FIG. 5 muestra un esquema de una realización ilustrativa. Un polinucleótido diana (productos de PCR, o ADN o ARN de cualquier origen, o cualquier mezcla de estos) puede ser bicatenario, solo se muestra una de las dos cadenas (cadena directa). En la etapa (i), las moléculas del ATO se hibridan aleatoriamente con secuencias monocatenarias del polinucleótido diana en una o más ubicaciones. En la etapa (ii), el extremo 3' de las moléculas del ATO se extiende utilizando el polinucleótido diana como plantilla. La extensión genera una copia modificada del polinucleótido diana, que comprende una secuencia universal 5', una secuencia aleatoria como UID y, en el extremo 3', una copia del polinucleótido diana. Tras la etapa (ii), la copia modificada del polinucleótido diana se purifica para eliminar el ATO no utilizado. En algunas realizaciones, el ATO no se digiere ni se elimina. En la etapa (iii), un segundo ATO se hibrida con el polinucleótido diana modificado en una o más ubicaciones. El extremo 3' de la copia del polinucleótido diana modificado se hibrida con la porción de la secuencia aleatoria 3' del ATO, se recorta si existe alguna saliente 3' y se extiende utilizando ATO como plantilla. La extensión genera un polinucleótido diana modificado dual, que comprende sitios universales 3' y 5' que pueden actuar como sitios de cebado. Dentro de estos se encuentran dos secuencias aleatorias diferentes como UID y, centralmente, una copia del polinucleótido diana.

La FIG. 6 muestra un esquema de una realización ilustrativa. Un polinucleótido diana (productos de PCR, o ADN o ARN de cualquier origen, o cualquier mezcla de estos) puede ser bicatenario, solo se muestra una de las dos cadenas (cadena directa). En la etapa (i), las moléculas del ATO diseñadas con secuencias específicas diana se hibridan con secuencias monocatenarias del polinucleótido diana en una o más ubicaciones. En la etapa (ii), los extremos 3' de las moléculas del ATO se extienden utilizando el polinucleótido diana como plantilla. La extensión genera una copia modificada del polinucleótido diana, que comprende una secuencia universal 5', una secuencia aleatoria como UID y, en el extremo 3', una copia del polinucleótido diana. Tras la etapa (ii), la copia modificada del polinucleótido diana se purifica para eliminar el ATO no utilizado. En algunas realizaciones, el ATO no se digiere ni se elimina. En la etapa (iii), un segundo ATO se hibrida con el polinucleótido diana modificado en una o más ubicaciones. El extremo 3' de la copia modificada del polinucleótido diana se hibrida con la porción de secuencia aleatoria 3' del ATO, se recorta si existe alguna saliente 3' y se extiende utilizando ATO como plantilla. La extensión genera un polinucleótido diana modificado dual, que comprende sitios universales 3' y 5' que pueden actuar como sitios de cebado, dentro de estos se encuentran dos secuencias aleatorias diferentes como UID y, centralmente, una copia del polinucleótido diana.

La FIG. 7 muestra un esquema de una realización ilustrativa. Un polinucleótido diana (producto de PCR, o ADN o ARN de cualquier origen, o una mezcla de estos) puede ser bicatenario, solo se muestra una de las dos cadenas (cadena directa). En la etapa (i), los polinucleótidos diana se fragmentan antes de que el polinucleótido diana monocatenario se hibride aleatoriamente con moléculas del ATO en una o más ubicaciones. El extremo 3' del polinucleótido diana se hibrida con la porción de secuencia aleatoria 3' del ATO, se recorta si existe alguna saliente 3' y se extiende utilizando ATO como plantilla. La extensión genera un polinucleótido diana modificado, que comprende una secuencia aleatoria como UID y una secuencia universal 3' como sitio de cebado.

La FIG. 8 muestra un esquema de una realización ilustrativa. (a) Un polinucleótido diana (producto de PCR, o ADN o ARN, o cualquier mezcla de estos) puede ser bicatenario, solo se muestra una de las dos cadenas (cadena directa). En la etapa (i), los polinucleótidos diana se fragmentan antes de que el polinucleótido diana monocatenario se hibride aleatoriamente con moléculas del ATO en una o más ubicaciones, el ATO contiene una secuencia promotora de la ARN polimerasa. El extremo 3' del polinucleótido diana se hibrida con la porción de secuencia aleatoria 3' del ATO, se recorta si hay alguna saliente 3' y se extiende utilizando ATO como plantilla. La extensión genera un polinucleótido diana modificado que incluye una región de secuencia bicatenaria entre el polinucleótido diana y el ATO, que comprende una secuencia aleatoria como UID y una secuencia universal 3' que incluye un promotor de la ARN polimerasa. Tras la etapa (i), el polinucleótido diana modificado se purifica opcionalmente para eliminar el ATO no utilizado. En algunas realizaciones, el ATO no se digiere ni se elimina. En la etapa (ii), el promotor de la ARN polimerasa bicatenaria del polinucleótido diana modificado se utiliza para generar copias de ARN (secuencia del primer complemento) del polinucleótido diana modificado.

(b) Un polinucleótido diana (productos de PCR, o ADN o ARN de cualquier origen, o una mezcla de estos) puede ser bicatenario, solo se muestra una de las dos cadenas (cadena directa). En la etapa (i), los polinucleótidos diana se fragmentan antes de que el polinucleótido diana monocatenario se hibride aleatoriamente con moléculas del ATO en una o más ubicaciones, el ATO contiene una secuencia promotora de la ARN polimerasa. El extremo 3' del polinucleótido diana se hibrida con la porción de secuencia aleatoria 3' del ATO, se recorta si existe alguna saliente 3' y se extiende utilizando el ATO como plantilla. La extensión genera un polinucleótido diana modificado, que comprende una secuencia aleatoria como UID y una secuencia universal 3' como sitio de cebado, que incluye regiones complementarias capaces de formar una horquilla en el extremo 3' del polinucleótido diana modificado. Tras la etapa (i), los ATO se digieren o eliminan mediante captura por afinidad. En algunas realizaciones, el ATO no se digiere ni se elimina. En la etapa (ii), se permite que el extremo 3' del polinucleótido diana modificado forme una pequeña horquilla mediante la hibridación consigo mismo, el extremo 3' actúa entonces como cebador que, una vez extendido, genera la secuencia del primer complemento, que incluye un promotor de la ARN polimerasa bicatenaria. En la etapa (iii), el promotor de la ARN polimerasa bicatenaria del polinucleótido diana modificado se utiliza para generar copias de ARN (secuencia del primer complemento) del polinucleótido diana modificado.

La FIG. 9 muestra un esquema de una realización ilustrativa. Un polinucleótido diana (productos de PCR, o ADN, o ARN de cualquier origen o cualquier mezcla de estos) puede ser bicatenario, solo se muestra una de las dos cadenas (cadena directa). En la etapa (i), los polinucleótidos diana se fragmentan antes de que el polinucleótido diana monocatenario se hibride aleatoriamente con moléculas del ATO en una o más ubicaciones. El extremo 3' del polinucleótido diana se hibrida con la porción de la secuencia aleatoria 3' del ATO, se recorta si existe alguna saliente 3' y se extiende utilizando ATO como plantilla. La extensión genera un polinucleótido diana modificado, que comprende una secuencia aleatoria como UID y una secuencia universal 3' como sitio de cebado, que incluye regiones complementarias capaces de formar una horquilla en el extremo 3' del polinucleótido diana modificado. Tras la etapa (i), los ATO se digieren o eliminan mediante captura por afinidad. En algunas realizaciones, el ATO no se digiere ni se elimina. En la etapa (ii), se permite que el extremo 3' del polinucleótido diana modificado forme una pequeña horquilla mediante la hibridación consigo mismo, el extremo 3' actúa entonces como cebador, que, una vez extendido, generará la primera secuencia complementaria.

La FIG. 10 muestra un esquema de una realización ilustrativa. Un polinucleótido diana (productos de PCR, o ADN o ARN de cualquier origen, o una mezcla de estos) puede ser bicatenario, solo se muestra una de las dos cadenas (cadena directa). En la etapa (i), los polinucleótidos diana se fragmentan antes de que el polinucleótido diana monocatenario se hibride aleatoriamente con moléculas del ATO en una o más ubicaciones. El extremo 3' del polinucleótido diana se hibrida con la porción de secuencia aleatoria 3' del ATO, se recorta si hay alguna saliente 3' y se extiende utilizando ATO como plantilla. La extensión genera un polinucleótido diana modificado, que comprende una secuencia aleatoria como UID y una secuencia universal 3' como sitio de cebado. Tras la etapa (i), los ATO se digieren o eliminan mediante captura por afinidad. En algunas realizaciones, el ATO no se digiere ni se elimina. En la etapa (ii), se añaden cebadores específicos diana al polinucleótido diana modificado, que se extienden mediante una polimerasa hasta alcanzar el extremo 5' del polinucleótido diana modificado. En la etapa (iii), los adaptadores bicatenario se mezclan con el polinucleótido diana modificado junto con enzimas adecuadas y, posteriormente, los adaptadores se ligan al ADN bicatenario 5' del polinucleótido diana modificado.

La FIG. 11 muestra un esquema de una realización ilustrativa. Para medir la eficiencia con la que se produce la extensión 3' del polinucleótido diana para generar la diana modificada, se utilizó PCR cuantitativa (qPCR) de polinucleótidos. El polinucleótido diana utilizado fue un oligo de ADN monocatenario de longitud y secuencia conocidas, el control interno (IC). El polinucleótido diana utilizado también fue ADN genómico mezclado con un 10 % de la cantidad de oligo de ADN monocatenario de longitud y secuencia conocidas, el control interno (IC).

Una vez producido el polinucleótido diana modificado, ambos se utilizaron independientemente como plantilla para 3 reacciones de qPCR diferentes, una con dos cebadores ubicados dentro de la secuencia del polinucleótido diana (cebador directo y cebador inverso 1), una con un cebador ubicado dentro de la secuencia del polinucleótido diana y uno presente en la secuencia universal añadido al polinucleótido diana modificado (cebador directo y cebador inverso 2), y otra con un cebador ubicado dentro de la secuencia del polinucleótido diana y una presente al final de la secuencia universal añadida al polinucleótido diana modificado con una cola no homóloga al polinucleótido diana modificado (cebador directo y cebador inverso 3), todas estas reacciones incluyeron una sonda de qPCR de doble etiquetado ubicada dentro del polinucleótido diana (sonda). El valor de 'CT' donde se detectó una sola amplificación fluorescente para los cebadores específicos de control del IC, en comparación con el valor de 'CT' donde se detectó una sola amplificación fluorescente para pares de cebadores ubicados dentro del IC y la secuencia universal, proporciona una indicación proporcional de la eficiencia de la extensión 3' del polinucleótido diana. Dado que los valores de 'CT' son muy similares, la eficiencia puede interpretarse como de entre 50 % -100 %.

La FIG. 12 muestra un esquema de una realización ilustrativa. Un polinucleótido diana (productos de PCR, o ADN o ARN de cualquier origen, o una mezcla de estos) puede ser bicatenario, solo se muestra una de las dos cadenas (cadena directa). En la etapa (i), los polinucleótidos diana se fragmentan antes de que el polinucleótido diana monocatenario se hibride aleatoriamente con moléculas del ATO en una o más ubicaciones. El extremo 3' del polinucleótido diana se hibrida con la porción de secuencia aleatoria 3' del ATO, se recorta si hay alguna saliente 3' y se extiende utilizando ATO como plantilla. La extensión genera un polinucleótido diana modificado, que comprende una secuencia aleatoria como UID y una secuencia universal 3' como sitio de cebado, que incluye regiones complementarias capaces de formar una horquilla en el extremo 3' del polinucleótido diana modificado. En la etapa (ii), se permite que el extremo 3' del polinucleótido diana modificado forme una pequeña horquilla mediante hibridación consigo misma. En la etapa (iii), el extremo 3' actúa como cebador que, una vez extendido, genera la primera cadena complementaria. Tras la etapa (iii), los ATO se digieren o eliminan mediante captura por afinidad. En algunas realizaciones, el ATO no se digiere ni se elimina. En la etapa (iv), el ADN bicatenario de la primera CS se liga a un adaptador mediante ligación bicatenaria con una ADN ligasa. En la etapa (v), los ATO restantes se digieren y la horquilla se rompe mediante la incubación de la mezcla de reacción con una mezcla de dU-glicosilasa, una endonucleasa apurínica/apirimidínica y una nucleasa S1. El producto bicatenario final se puede utilizar directamente para la secuenciación en un secuenciador de próxima generación compatible (p. ej., MiSeq).

La FIG. 13 muestra un esquema de una realización ilustrativa. Se muestran todas las etapas utilizadas en la generación de un panel de secuenciación dirigida de próxima generación, desde el material de partida hasta el análisis de los datos de secuenciación. Un polinucleótido diana (productos de PCR, o ADN, o ARN o cualquier mezcla de estos) puede ser bicatenario, solo se muestra una de las dos cadenas (cadena directa). En la etapa (i), los polinucleótidos diana se fragmentan enzimáticamente. En la etapa (II), se determinó la distribución de tamaño del polinucleótido diana fragmentado utilizando un chip bioanalizador de alta sensibilidad. En la etapa (iii), los polinucleótidos diana fragmentados se hibridan aleatoriamente con moléculas del ATO en una o más ubicaciones. El extremo 3' del polinucleótido diana se hibrida con la porción de la secuencia aleatoria 3' del ATO, se recorta si existe alguna saliente 3' y se extiende utilizando ATO como plantilla. La extensión genera un polinucleótido diana modificado, que comprende una secuencia aleatoria 3' como UID, una secuencia universal 3' como sitio de cebado. En la etapa (iii), los ATO se digieren o eliminan mediante captura por afinidad. En algunas realizaciones, el ATO no se digiere ni se elimina. En la etapa (iv), el polinucleótido diana modificado, un cebador universal diseñado para unirse al sitio universal del ATO, un grupo de cebadores específicos del gen, tampones adecuados, enzimas adecuadas, dNTP y otros aditivos se combinan y se utilizan para amplificar exponencialmente el polinucleótido diana modificado. En la etapa (v), se purifican los productos de PCR. En la etapa (vi), el primer producto de PCR, un segundo cebador universal diseñado para unirse al sitio universal del producto de PCR, un segundo grupo anidado de cebadores específicos del gen, tampones adecuados, enzimas adecuadas, dNTP y otros aditivos se combinan y se utilizan para amplificar exponencialmente el polinucleótido diana modificado. En la etapa (vii), se purifican los segundos productos de PCR. En la etapa (viii), se determinó la distribución de tamaños de la biblioteca de secuenciación final mediante un chip bioanalizador de alta sensibilidad. Posteriormente, la biblioteca se secuenció con un secuenciador MiSeq con secuenciación de extremos de pares de 150 pb. Los datos de secuenciación se analizaron posteriormente mediante una combinación del alineador bwa y guiones de Python para el filtrado de datos personalizado. La figura de datos (H) representa la distribución de los tamaños del inserto obtenido a partir de los datos de secuenciación generados por MiSeq, (I) representa la distribución de las lecturas de todos los cebadores presentes en los grupos utilizados en las amplificaciones exponenciales, (J) muestra el número de 'familias de código de barras' identificadas en los datos de secuenciación de un tamaño de familia con al menos 3 lecturas.

La FIG. 14 muestra un esquema de una realización ilustrativa. Se muestran todos las etapas utilizadas en la generación de una biblioteca de ADN de genoma completo, desde el material de partida hasta la biblioteca final. Un polinucleótido diana (productos de PCR, o ADN, o ARN o cualquier mezcla de estos) puede ser bicatenario, solo se muestra una de las dos cadenas (cadena directa). En la etapa (i), los polinucleótidos diana se fragmentan enzimáticamente. En la etapa (II), se determinó la distribución del tamaño del polinucleótido diana fragmentado utilizando un chip bioanalizador de alta sensibilidad. En la etapa (iii), los polinucleótidos diana fragmentados se hibridan aleatoriamente con moléculas del ATO en una o más ubicaciones. El extremo 3' del polinucleótido diana se híbrida con la porción de secuencia aleatoria 3' del ATO, se recorta si existe alguna saliente 3' y se extiende utilizando a To como plantilla. La extensión genera un polinucleótido diana modificado, que comprende una secuencia aleatoria 3' como UID, una secuencia universal 3' como sitio de cebado. En la etapa (iii), los ATO se digieren o eliminan mediante captura por afinidad. En algunas realizaciones, el ATO no se digiere ni se elimina. En la etapa (iv), el polinucleótido diana modificado, un cebador universal diseñado para unirse al sitio universal del ATO, tampones y enzimas adecuados, dNTP y otros aditivos se combinan y se utilizan para amplificar linealmente el polinucleótido diana modificado para generar la primera CS (secuencia del complemento). Opcionalmente, los productos se purifican. En la etapa (v), las CS lineales se hibridan aleatoriamente con moléculas del ATO en una o más ubicaciones. El extremo 3' de la CS lineal se hibrida con la porción de secuencia aleatoria 3' del ATO, se recorta si hay alguna saliente 3' y se extiende utilizando ATO como plantilla. La extensión genera una CS modificada, que en cada extremo comprende una secuencia aleatoria como UID, secuencias universales 3' y 5' diferentes como sitios de cebado. En la etapa (vi), los ATO se digieren o eliminan mediante captura por afinidad. En algunas realizaciones, el ATO no se digiere ni se elimina. En la etapa (vii), el producto de CS modificada, dos cebadores universales diferentes diseñados para unirse a los sitios universales en los extremos 5' y 3' del producto de CS modificada, los tampones, enzimas, dNTP y otros aditivos necesarios se combinan y se utilizan para amplificar exponencialmente el producto de CS modificada. En la etapa (viii), se purifican los segundos productos de PCR. En la etapa (ix), se determinó la distribución de tamaño de la biblioteca de secuenciación final utilizando un chip bioanalizador de alta sensibilidad.

La FIG. 15 muestra un esquema de una realización ilustrativa. Un polinucleótido diana (productos de PCR, o ADN, o ARN o cualquier mezcla de estos) puede ser bicatenario, solo se muestra una de las dos cadenas (cadena directa). En la etapa (i), los polinucleótidos diana monocatenarios se hibridan aleatoriamente con moléculas del ATO en una o más ubicaciones. El extremo 3' del polinucleótido diana se hibrida con la porción de secuencia aleatoria 3' del ATO, se recorta si existe alguna saliente 3' y se extiende utilizando ATO como plantilla. La extensión genera un polinucleótido diana modificado, que comprende una secuencia aleatoria de longitud variable como UID, una secuencia universal 3' como sitio de cebado. En la etapa (ii), el polinucleótido diana modificado se purifica para eliminar el ATO no utilizado. En algunas realizaciones, el ATO no se digiere ni se elimina. En la etapa (iii), el polinucleótido diana modificado, un cebador universal diseñado para unirse al sitio universal en el producto de PCR, un cebador específico del gen, tampones adecuados, enzimas adecuadas, dNTP y otros aditivos se combinan y utilizan para amplificar exponencialmente el polinucleótido diana modificado.

La FIG. 16 muestra un esquema de una realización ilustrativa. Un polinucleótido diana (productos de PCR, o ADN, o ARN o cualquier mezcla de estos) puede ser bicatenario, solo se muestra una de las dos cadenas (cadena directa).

(A) El polinucleótido diana modificado se divide en dos alícuotas aproximadamente iguales. A cada una de estas alícuotas se le añade un cebador universal, el extremo 3' de este cebador está diseñado para hibridar con la secuencia universal del polinucleótido diana modificador y tiene una cola 5' que contiene las secuencias necesarias para la secuenciación de próxima generación. A cada alícuota se le añade un cebador específico diana diferente o un grupo de cebadores específicos diana, los cebadores de cada grupo están diseñados para amplificar la cadena directa o inversa de las regiones diana del polinucleótido diana. Los cebadores específicos diana constan de una porción específica diana 3' con una porción universal 5' que contiene las secuencias necesarias para la secuenciación de próxima generación. Las dos mezclas separadas se amplifican mediante múltiples ciclos de amplificación por PCR utilizando el cebador universal y uno o más cebadores específicos diana. El producto de esta amplificación serán dos grupos separados de productos de PCR, cada uno de los cuales ha amplificado una u otra cadena del polinucleótido original e incluirá todas las secuencias necesarias para compatibilidad con la secuenciación de próxima generación.

(B) El polinucleótido diana modificado se divide en dos alícuotas aproximadamente iguales. A cada una de estas alícuotas se le añade un cebador universal, diseñado para hibridar con la secuencia universal del polinucleótido diana modificador, con o sin una secuencia universal 5' adicional. A cada alícuota se le añade un cebador específico diana diferente o un grupo de cebadores específicos diana, los cebadores de cada grupo están diseñados para amplificar la cadena directa o inversa de las regiones diana del polinucleótido diana. Los cebadores específicos diana comprenden una secuencia específica diana 3' con o sin una secuencia universal 5'. Las dos mezclas separadas se amplifican mediante múltiples ciclos de amplificación por PCR utilizando el cebador universal y un grupo de cebadores específicos diana. El producto de esta amplificación serán dos grupos separados de productos de PCR, cada uno de los cuales ha amplificado una u otra cadena del polinucleótido original, con o sin secuencias universales '3 y 5'. El primer producto de amplificación puede purificarse para eliminar los reactivos que ya no son necesarios en la primera reacción de<p>C<r>. Cada uno de los dos grupos separados de productos de PCR se combina con un segundo cebador universal, el cebador universal utilizado en la primera PCR o cebador universal anidado, el 3' de este cebador está diseñado para hibridar con la secuencia universal del primer producto de PCR y tiene una cola 5' que contiene las secuencias necesarias para la secuenciación de próxima generación, y un cebador específico diana anidado diferente o un grupo de cebadores específicos diana anidados, que comprende una porción específica diana 3' con una porción universal 5' que contiene las secuencias necesarias para la secuenciación de próxima generación. Las dos mezclas separadas se amplifican mediante múltiples ciclos de amplificación por PCR utilizando el cebador universal y un grupo de cebadores específicos diana. El producto de esta amplificación serán dos grupos separados de productos de PCR, cada uno de los cuales ha amplificado una u otra de las cadenas del polinucleótido original e incluirá todas las secuencias necesarias para la compatibilidad con la secuenciación de próxima generación.

(C) El polinucleótido diana modificado se combina con un cebador universal, el cebador está diseñado para hibridar con la secuencia universal del polinucleótido diana modificador, con o sin una secuencia universal 5' adicional. A continuación, el polinucleótido diana modificado se amplifica linealmente mediante una o más rondas de amplificación. El producto de amplificación lineal puede purificarse para eliminar los reactivos que ya no sean necesarios de la reacción de amplificación lineal. El producto de amplificación lineal se divide en dos alícuotas aproximadamente iguales. A cada una de estas alícuotas se le añade un cebador universal, el extremo 3' de este cebador está diseñado para hibridar con la secuencia universal del polinucleótido diana modificador y tiene una cola 5' que contiene las secuencias necesarias para la secuenciación de próxima generación. A cada alícuota se le añade un cebador específico diana diferente o grupo de cebadores específicos diana, cada grupo contiene cebadores diseñados para amplificar regiones diana de la cadena directa o inversa del polinucleótido diana. Los cebadores específicos diana constan de una porción específica diana 3' con una porción universal 5' que contiene las secuencias necesarias para la secuenciación de próxima generación. Las dos mezclas separadas se amplifican mediante múltiples ciclos de amplificación por PCR utilizando tanto el cebador universal como un grupo de cebadores. El producto de esta amplificación serán dos grupos separados de productos de PCR, cada uno de los cuales ha amplificado una u otra cadena del polinucleótido original, e incluye todas las secuencias necesarias para compatibilidad con la secuenciación de próxima generación.

(D) El polinucleótido diana modificado se combina con un cebador universal, el cebador está diseñado para hibridar con la secuencia universal del polinucleótido diana modificador, con o con una secuencia universal 5' adicional. El polinucleótido diana modificado se amplifica linealmente mediante una o más rondas de amplificación. El producto de amplificación lineal puede purificarse para eliminar los reactivos que ya no son necesarios de la primera reacción de PCR. El producto de amplificación lineal se divide en dos alícuotas aproximadamente iguales. A cada una de estas alícuotas se le añade un cebador universal, el cebador está diseñado para hibridar con la secuencia universal del polinucleótido diana modificador, con o con una secuencia universal 5' adicional. A cada alícuota se le añade un cebador específico diana diferente o un grupo de cebadores específicos diana, cada grupo contiene cebadores diseñados para amplificar regiones diana de la cadena directa o inversa del polinucleótido diana. Los cebadores específicos diana comprenden una secuencia específica diana 3' con o sin una secuencia universal 5'. Las dos mezclas separadas se amplifican mediante múltiples ciclos de amplificación por PCR utilizando el cebador universal y un grupo de cebadores. El producto de esta amplificación serán dos grupos de productos separados de productos de PCR, cada uno de los cuales ha amplificado una u otra cadena del polinucleótido original, con o sin secuencias universales '3 y 5'. El primer producto de amplificación puede purificarse para eliminar los reactivos que ya no son necesarios en la primera reacción de PCR. Cada uno de los dos grupos separados de productos de PCR se combina con un segundo cebador universal anidado o con el cebador universal utilizado en la primera amplificación, el 3' de este cebador se diseña para hibridar con la secuencia universal del primer producto de PCR y tiene una cola 5' que contiene las secuencias necesarias para la secuenciación de próxima generación, y un cebador específico diana anidado diferente o grupo de cebadores específicos diana anidados que comprenden una porción específica diana 3' con una porción universal 5' que contiene las secuencias necesarias para la secuenciación de próxima generación. Las dos mezclas separadas se amplifican mediante múltiples ciclos de amplificación por PCR utilizando el cebador universal y un grupo de cebadores. El producto de esta amplificación serán dos grupos separados de productos de p Cr , cada uno de los cuales ha amplificado una u otra de las cadenas del polinucleótido original e incluirá todas las secuencias necesarias para la compatibilidad con la secuenciación de próxima generación.

(E) Los polinucleótidos diana modificados se combinan con un cebador universal, el cebador está diseñado para hibridar con la secuencia universal del polinucleótido diana modificador, con o sin una secuencia universal 5' adicional, se añade un cebador específico diana o un grupo de cebadores específicos diana, los cebadores están diseñados para amplificar la cadena directa o inversa del polinucleótido diana. Los cebadores específicos diana comprenden una secuencia específica diana 3' con o sin una secuencia universal 5'. La mezcla se amplifica mediante múltiples ciclos de amplificación por PCR utilizando tanto el cebador universal como uno o más cebadores específicos diana. El producto de esta amplificación es un grupo de productos de PCR que ha amplificado una u otra de las cadenas del polinucleótido original, con o sin secuencias universales '3 y 5'. El primer producto de amplificación se purifica para eliminar todos los cebadores monocatenarios no utilizados. El primer producto de amplificación purificado se combina con un cebador universal, el cebador está diseñado para hibridar con la secuencia universal del polinucleótido diana modificador, con o sin una secuencia universal 5' adicional, se añade un cebador específico diana o un grupo de cebadores específicos diana, uno o más cebadores específicos diana están diseñados para amplificar la cadena directa o inversa del polinucleótido diana que no se direccionó en la primera reacción de amplificación. Si la cadena directa fue direccionada en la primera reacción, entonces la inversa se direcciona en la segunda. Los cebadores específicos diana comprenden una secuencia específica diana 3' con o sin una secuencia universal 5'. La mezcla se amplifica con múltiples ciclos de amplificación por PCR utilizando tanto el cebador universal como uno o más cebadores específicos diana. El segundo producto de amplificación se purifica para eliminar todos los cebadores no utilizados. El segundo producto de amplificación se divide en dos alícuotas aproximadamente iguales. A cada una de estas alícuotas se le añade un segundo cebador universal, el 3' de este cebador está diseñado para hibridar con la secuencia universal del polinucleótido diana modificador y tiene una cola 5' que contiene las secuencias necesarias para la secuenciación de próxima generación. A cada alícuota se le añade un cebador anidado específico diana diferente o un grupo de cebadores anidados específicos diana, los cebadores están diseñados para amplificar la cadena directa o inversa del polinucleótido diana. Los cebadores específicos diana constan de una porción específica diana 3' y una porción universal 5' que contiene las secuencias necesarias para la secuenciación de próxima generación. Las dos mezclas separadas se amplifican mediante múltiples ciclos de amplificación por PCR utilizando el cebador universal y uno o más cebadores específicos diana. El producto de esta amplificación serán dos grupos separados de productos de PCR, cada uno de los cuales ha amplificado una u otra de las cadenas del polinucleótido original e incluirá todas las secuencias necesarias para compatibilidad con la secuenciación de próxima generación.

(F) Los polinucleótidos diana modificados se combinan con un cebador universal, el cebador está diseñado para hibridar con la secuencia universal del polinucleótido diana modificador, con una secuencia universal 5' adicional, se añade un cebador específico diana o un grupo de cebadores específicos diana, los cebadores están diseñados para amplificar la cadena directa o inversa del polinucleótido diana. Los cebadores específicos diana comprenden una secuencia específica diana 3' con una secuencia universal 5'. La mezcla se amplifica mediante múltiples ciclos de amplificación por PCR utilizando el cebador universal y uno o más cebadores específicos diana. El producto de esta amplificación será un grupo de productos de PCR, cada uno de los cuales ha amplificado una u otra de las cadenas del polinucleótido original, con una secuencia universal 5' y 3'. El primer producto de amplificación se purifica para eliminar todos los cebadores no utilizados. El primer producto de amplificación purificado se combina con un cebador universal, el cebador se diseña para hibridar con la secuencia universal del polinucleótido diana modificador, con una secuencia universal 5' adicional, se añade un cebador específico diana o un grupo de cebadores específicos diana, los uno o más cebadores específicos diana están diseñados para amplificar la cadena directa o inversa del polinucleótido diana, que no se haya direccionado en la primera reacción de amplificación. Si la cadena directa se dirigió en la primera reacción, la inversa se dirigió en la segunda. Los cebadores específicos diana comprenden una secuencia específica diana 3' con una secuencia universal 5'. La mezcla se amplifica con múltiples ciclos de amplificación por PCR utilizando tanto el cebador universal como uno o más cebadores específicos diana. El segundo producto de amplificación se purifica para eliminar todos los cebadores no utilizados. El segundo producto de amplificación se mezcla con dos cebadores universales, el 3' de estos cebadores están diseñados para hibridar con las secuencias universales en los extremos 3' y 5' de los productos de amplificación, y tienen una cola 5' que contiene las secuencias necesarias para la secuenciación de próxima generación. Las dos mezclas se amplifican mediante múltiples ciclos de amplificación por PCR utilizando ambos cebadores universales. El producto de esta amplificación será un grupo de productos de PCR, cada uno de los cuales ha amplificado ambas cadenas del polinucleótido original de forma independiente, e incluirá todas las secuencias necesarias para la compatibilidad con la secuenciación de próxima generación.

La FIG. 17 muestra un esquema de una realización ilustrativa. Se muestra un polinucleótido diana de ADN. El proceso de fragmentación enzimática mediante nucleasas, o el cizallamiento físico del ADN por sonicación, o mediante el uso de una transposasa, puede sustituirse por el direccionamiento individual o multiplexado de herramientas de edición genómica, tales como un tipo I, tipo II, tipo III, o combinaciones de estos de genes CAS, y subtipos de enzimas CRISPR. Como ejemplo, se incuban enzimas CRISPR/Cas9 con ADN y una mezcla de uno o más ARN guía. Esto da como resultado una asociación del ADN, la enzima CRISPR/Cas9 y el ARN guía, donde el ARN guía se dirige a la escisión bicatenaria o monocatenaria del ADN. El ADN fragmentado dirigido puede entonces purificarse y utilizarse en cualquier proceso posterior, como una primera reacción del ATO.

La FIG. 18 muestra un esquema de una realización ilustrativa. Un polinucleótido diana (productos de PCR, o ADN, o ARN o cualquier mezcla de estos) puede ser bicatenario, solo se muestra una de las dos cadenas (cadena directa). En la etapa (i), las moléculas del ATO se hibridan con secuencias monocatenarias del polinucleótido diana en una o más ubicaciones. Los extremos 3' del polinucleótido diana se hibridan con la porción de la secuencia aleatoria 3' del ATO, se recortan si hay alguna saliente 3' y se extienden utilizando el ATO como plantilla. La extensión genera un polinucleótido diana modificado, que comprende una secuencia aleatoria como UID. Tras la etapa (i), los ATO se digieren o eliminan por captura por afinidad. En algunas realizaciones, el ATO no se digiere ni se elimina. En la etapa (ii), el polinucleótido diana se somete a un proceso de reparación de extremos seguido de la ligadura con un adaptador bicatenario. El producto de esta reacción de ligadura será un polinucleótido diana modificado que contiene una secuencia corta ligada en 5' y una secuencia universal ligada en '3 más larga. Esto puede utilizarse posteriormente en procesos posteriores.

La FIG. 19 muestra un esquema de una realización ilustrativa. Un polinucleótido diana (productos de PCR, o ADN, o ARN o cualquier mezcla de estos) puede ser bicatenario, solo se muestra una de las dos cadenas (cadena directa). Esta representación aprovecha la capacidad de las polimerasas de usar solo ADN, y no ARN, como cebador para la extensión del polinucleótido. En la primera ronda, las moléculas del ATO se hibridan con secuencias monocatenarias del polinucleótido diana en una o más ubicaciones. Los extremos 3' del polinucleótido diana se hibridan con la porción de la secuencia aleatoria 3' del ATO, se recorta si hay alguna saliente 3' presente, y solo se extiende el ADN utilizando un ATO como plantilla y una polimerasa incapaz de usar cebadores de ARN. Los ATO se digieren o eliminan mediante captura por afinidad. En algunas realizaciones, el ATO no se digiere ni se elimina. El extremo 3' del polinucleótido de ADN diana modificado forma una pequeña horquilla mediante hibridación consigo mismo, el extremo 3' actúa luego como cebador, que una vez extendido genera la primera cadena complementaria. El ADN bicatenario, con una horquilla, actuara para permite preferentemente que el dúplex se reforme durante la segunda ronda de hibridación del ATO. Los extremos 3' del polinucleótido de ARN diana se hibridan con la porción de secuencia aleatoria 3' del ATO y se extienden utilizando un ATO como plantilla y una polimerasa. El extremo 3' del polinucleótido de ARN diana modificado forma una pequeña horquilla mediante hibridación consigo misma, el extremo 3' actúa entonces como cebador, que una vez extendido genera la primera cadena complementaria. Las horquillas pueden entonces ser digeridas. Los híbridos ADN:ADN y ARN:ADN resultantes pueden formar la plantilla para su posterior procesamiento. Dicha generación de una biblioteca de secuenciación de ADN, o ARN, o ADN+ARN mediante la amplificación selectiva de ADN y/o ARN.

Ejemplos

Ejemplo 1

Uso de ácido desoxirribonucleico (ADN) como polinucleótido diana para la producción de una biblioteca de secuenciación de próxima generación (por ejemplo y sin limitación, compatible con los secuenciadores de próxima generación de Illumina) utilizando, por ejemplo y sin limitación, oligo(s) plantilla adaptadores con una estructura de tallo-bucle, donde el bucle comprende un espaciador químico (por ejemplo y sin limitación, un espaciador C3, un espaciador C18).

Materiales

Polinucleótido diana, ADNg humano (BIO-35025)

Enzima fragmentadora de ADN, Kit KAPA Frag (Roche, 7962517001)

Oligos plantilla adaptadores (ATO), 1-014, 1-015, 1-016, 1-017, 1-018 (Tabla 1)

ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

Tampón de ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

ADN polimerasa I, Fragmento grande (Klenow) (NEB, M0210L)

ADN polimerasa I, Fragmento grande (Klenow) (NEB, M0212L)

Los dNTP (NEB, N0447s)

Enzima USER® (NEB, M5505S)

ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion® (NEB, M0530S)

Tampón Phusion (NEB, M0530S)

Cebadores 2-001, 2-002, 2-003 (Tabla 2)

Sulfato de amonio (SIGMA, A4418)

Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, A63881)

Kit bioanalizador de alta sensibilidad de Agilent (ID del producto 5067-4626).

Método

Hibridación de uno o más oligo de plantilla adaptadora con ácidos desoxirribonucleicos

Una cantidad adecuada de ácido desoxirribonucleico (ADN), ya sea fragmentado o no, monocatenario o bicatenario, de cualquier longitud, se mezclan con uno o más oligo de plantilla adaptadora (uno o más ATO); por ejemplo, y sin limitación, un oligo que forma una horquilla, en un tampón adecuado. En este ejemplo, se fragmentó ADNg humano utilizando el kit Frag, generando ADN fragmentado entre 100-400 pb, como se muestra en la sección (A) de la Figura 14. Se mezclaron 25 ng con 50 pmoles de cada uno de los cuatro ATO (1-001, 1-002, 1-003, 1-004) para un total de 200 pmoles del ATO, en H2O, hasta un volumen final de 15 pl. La mezcla se calienta a una temperatura adecuada, en este ejemplo a 95 °C, durante un tiempo adecuado, en este ejemplo, 2 minutos, u otras temperaturas o tiempos que puedan dar como resultado la desnaturalización de ácidos nucleicos bicatenarios en monocatenarios. La mezcla de ácidos nucleicos y uno o más ATO se enfría posteriormente, en este ejemplo, a 4 °C durante 2 minutos, u otras temperaturas o tiempos adecuados capaces de promover la hibridación entre ácidos nucleicos y uno o más ATO, como se muestra en la sección (B) de la Figura 14.

Extensión del polinucleótido diana mediante su uso como cebador con uno o más oligonucleótidos plantilla adaptadores como plantilla

Se combina una cantidad adecuada de una o más ADN polimerasas, con o sin corrección de errores, con o sin actividad de desplazamiento de cadena (por ejemplo y sin limitación, Bst polimerasa, ADN polimerasa I, Fragmento Grande (Klenow), ADN polimerasa Taq o Phusion), mezclada con uno o mástampones adecuados, y los dNTP adecuados, con la mezcla de ADN-uno o más ATO. En este ejemplo, se combinan un total 2.5 unidades de Klenow y 2.5 unidades de ADN polimerasa TAQ, 2 pl de tampón de ADN polimerasa TAQ 10x y 10 nmoles de cada dNTP (dATP/dTTP/dCTP/dGTP) con la mezcla de ATO de ADN hasta alcanzar un volumen final de 20 pl. Para promover aún más la hibridación de ácido nucleico diana y uno o más ATO en presencia de una o más ADN polimerasas y uno o más tampones, en este ejemplo la mezcla se incuba a menos de 25 °C durante 30 minutos, o a otras temperaturas o tiempos adecuados capaces de promover la hibridación entre los ácidos nucleicos y los ATO. Para iniciar la extensión de los polinucleótidos diana utilizando la secuencia del ATO como plantilla, en este ejemplo, la temperatura de incubación se aumenta a 37 °C durante 30 minutos, o a otras temperaturas adecuadas capaces de promover la actividad de la ADN polimerasa. El producto es un polinucleótido diana modificado. Como se muestra en la sección (C) de la Figura 14.

Degradación de uno o más oligos plantilla adaptadores

Los uno o más oligos plantilla adaptadores se degradan selectivamente mediante la adición de una combinación de, por ejemplo, pero sin limitarse a, dU-glicosilasa y una endonucleasa apurínica/apirimidínica, en este ejemplo, se añadieron 2 unidades de la enzima USER a la mezcla de reacción de 20 pl del polinucleótido diana modificado, seguido por incubaciones secuenciales, en este ejemplo, de 37 °C durante 30 minutos y, posteriormente, 25 °C durante 15 minutos, u otras temperaturas y tiempos adecuados capaces de promover la actividad enzimática. Los uno o más ATO degradados pueden eliminarse opcionalmente mediante cualquier método de purificación adecuado. Como se muestra en la sección (D) de la Figura 14.

Extensión en un paso o amplificación lineal del polinucleótido diana modificado

El producto de extensión del polinucleótido diana (polinucleótido diana modificado), purificado o no, se combina con un cebador complementario a la secuencia conservada (universal) presente ahora en el 3' de las moléculas de ADN diana, una ADN polimerasa con o sin corrección de errores (por ejemplo, y sin limitación la ADN polimerasa Phusion), uno o más tampones adecuados, y uno o más dNTP adecuados. En este ejemplo, todo el polinucleótido diana modificado tratado mediante USER, purificado o no, se combina con 50 pmoles de un cebador complementario a la secuencia universal presente ahora en el extremo 3' de las moléculas de ADN diana (2-001), 2 unidades de ADN polimerasa Phusion, 10 pl de tampón de ADN polimerasa Phusion 5x y 12 nmoles de cada dNTP (dATP/dTTP/dCTP/dGTP). La mezcla se termocicla para extender en un paso o amplificar linealmente el producto de extensión del ácido nucleico diana para generar la secuencia del primer complemento (CS), en este ejemplo, 98 °C durante 30 segundos, 5 ciclos de 98 °C durante 5 segundos, 60 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 1 minuto, seguidos de 72 °C durante 2 minutos. El producto de CS lineal puede purificarse opcionalmente mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, utilizando perlas magnéticas. Como se muestra en la sección (E) de la Figura 14.

Hibridación de uno o más segundos oligos plantilla adaptadores a la primera cadena complementaria

Los primeros productos de CS se mezclan con una cantidad adecuada de uno o más segundos oligos plantilla adaptadores (por ejemplo, y sin limitación, un oligo que forma una horquilla) en un tampón adecuado. En este ejemplo, los primeros productos de CS se mezclan con 200 pmoles del ATO (1-018) en H2O hasta un volumen final de 15 ul. La mezcla se calienta a una temperatura adecuada, en este ejemplo, 95 °C, durante un tiempo adecuado, en este ejemplo, 2 minutos o a otras temperaturas o tiempos que puedan provocar la desnaturalización de los ácidos nucleicos bicatenarios en monocatenarios. En este ejemplo, la mezcla de ácidos nucleicos y uno o más ATO se enfría posteriormente a 4 °C durante 2 minutos, o a otras temperaturas o tiempos adecuados capaces de promover la hibridación entre los ácidos nucleicos y los ATO. Como se muestra en la sección (F) de la Figura 14.

Extensión de la primera cadena complementaria mediante su uso como cebador con uno o más segundos oligos plantilla adaptadores como una plantilla para formar la primera cadena complementaria modificada.

Se combina una cantidad adecuada de una o más ADN polimerasas, con o sin corrección de errores, con o sin actividad de desplazamiento de cadena (por ejemplo y sin limitación, ADN polimerasa Taq o Phusion), mezclada con uno o más tampones adecuados y dNTP adecuados, con la mezcla de ADN-uno o más ATO. En este ejemplo, se combinan 2,5 unidades de Klenow y 2,5 unidades de TAQ ADN polimerasa, 2 |jl de tampón ADN polimerasa TAQ10x y 10 nmoles de cada dNTP (dATP/dTTP/dCTP/dGTP) con la mezcla de ATO de ADN hasta alcanzar un volumen final de 20 jl. Para promover aún más la hibridación del ácido nucleico diana y los ATO en presencia de ADN polimerasa y tampón, la mezcla de este ejemplo se incuba a menos de 25 °C durante 30 minutos, o a otras temperaturas o tiempos adecuados capaces de promover la hibridación entre los ácidos nucleicos y los ATO. Para promover la extensión de los ácidos nucleicos diana utilizando la secuencia de uno o más ATO como plantilla, en este ejemplo, la temperatura de incubación se aumenta a 37 °C durante 30 minutos, o a otras temperaturas adecuadas capaces de promover la actividad de la ADN polimerasa. Como se muestra en la sección (G) de la Figura 14.

Degradación de uno o más oligos plantilla adaptadores

Los uno o más oligos plantilla adaptadores se degradan selectivamente mediante la adición de una combinación de, por ejemplo pero sin limitarse a, dU-glicosilasa y una endonucleasa apurínica/apirimidínica, en este ejemplo, se añadieron 2 unidades de la enzima USER a la mezcla de reacción de 20 j l del polinucleótido diana modificado, seguido por incubaciones secuenciales de, en este ejemplo, 37 °C durante 30 minutos y, posteriormente, a 25 °C durante 15 minutos, u otras temperaturas y tiempos adecuados capaces de promover la actividad enzimática. Los uno o más ATO degradados pueden eliminarse opcionalmente mediante cualquier método de purificación adecuado. Como se muestra en la sección (H) de la Figura 14.

Amplificación exponencial del producto de la primera cadena complementaria modificada mediante PCR

El producto de la primera CS modificada, purificada o sin purificar, se combina con dos cebadores, uno con la similitud de secuencia con, y diseñada para unirse a la extensión formada con el primer uno o más ATO, y que contendrá secuencias compatibles y necesarias para la secuenciación mediante tecnologías de secuenciación de próxima generación (por ejemplo, y sin limitación, secuencias adaptadoras P5 o P7, secuencias índice de paciente/muestra, secuencias de Illumina o de lectura 1 o 2 personalizadas para compatibilidad con los secuenciadores de próxima generación de Illumina), y un segundo cebador con similitud de secuencia con, y diseñado para unirse a, la extensión formada con el segundo uno o más ATO y también contiene secuencias compatibles y necesarias para la secuenciación mediante tecnologías de secuenciación de próxima generación (por ejemplo, y sin limitación, secuencias adaptadoras P5 o P7, secuencias índice de paciente/muestra, secuencias de Illumina o de lectura 1 o 2 personalizadas para compatibilidad con los secuenciadores de próxima generación de Illumina), una polimerasa correctora (por ejemplo, y sin limitación, la ADN polimerasa Phusion, Q5), uno o más tampones adecuados, y dNTP adecuados, y otros aditivos adecuados o necesarios (por ejemplo, y sin limitación, DMSO, betaína y sulfato de amonio). En este ejemplo, los primeros productos de Cs modificados y purificados se combinan con 50 pmoles de cada uno de dos cebadores (2-002 y 2-003), 2 unidades de ADN polimerasa Phusion, 10 j l de tampón de ADN polimerasa Phusion 5x, 10 nmoles de cada dNTP (dATP/dTTP/dCTP/dGTP) y 1 jm ol de sulfato de amonio en un volumen final de 50 jl. La mezcla se termocicla para amplificar exponencialmente el primer producto de CS modificado; en este ejemplo, 98 °C durante 30 segundos, 12x ciclos de 98 °C durante 5 segundos, 60 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 1 minuto, seguidos de 72 °C durante 2 minutos. El producto de amplificación puede purificarse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, utilizando perlas magnéticas. El producto de amplificación final será compatible, por ejemplo, con la secuenciación de próxima generación en una plataforma Illumina. Como se muestra en la sección (I) de la Figura 14.

Resultados

Utilizando un kit de bioanalizador de alta sensibilidad de Agilent para evaluar la biblioteca de secuenciación completa final, pudimos demostrar que el producto final de la preparación de la biblioteca tiene una distribución de tamaño equivalente a la esperada dada la distribución del material de partida. Como se muestra en la sección (J) de la Figura 14.

Conclusión

Mediante la combinación de una primera reacción del ATO con ADNg fragmentado, un proceso de amplificación lineal para generar múltiples primeras cadenas complementarias y una segunda reacción del ATO con el producto de amplificación lineal como polinucleótido diana, seguida de una amplificación global, hemos validado con éxito este enfoque tecnológico para su uso en la generación de bibliotecas de secuenciación.

Ejemplo 2

Utilización de ácido desoxirribonucleico (ADN) como polinucleótido diana para la producción de una biblioteca de secuenciación de próxima generación de amplicones dirigidos (por ejemplo y sin limitación, compatible con los secuenciadores de próxima generación de Illumina), utilizando, por ejemplo y sin limitación, uno o más oligos plantilla adaptadores con una horquilla producida mediante un espaciador químico (por ejemplo y sin limitación, un espaciador C3, un espaciador C18).

Materiales

Polinucleótido diana, ADNg humano (BIO-35025)

Enzima fragmentadora de ADN, Kit KAPA Frag (Roche, 7962517001)

Uno o más oligos plantilla adaptadores (ATO), 1-006 (Tabla 1)

ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

Tampón de ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

ADN polimerasa I, Fragmento grande (Klenow) (NEB, M0210L, M0212L)

Los dNTP (NEB, N0447s)

ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion® (NEB, M0530S)

Tampón Phusion (NEB, M0530S)

Enzima USER® (NEB, M5505S)

Cebadores, 2-0042-005 (Tabla 2)

Sulfato de amonio (SIGMA, A4418)

Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, A63881)

Kit bioanalizador de alta sensibilidad de Agilent (ID de producto 5067-4626)

Tinción en gel de ácidos nucleicos SYBR™ Green I (Invitrogen, S7563)

Método

Hibridación de uno o más oligos plantilla adaptadores con ácidos desoxirribonucleicos

Igual que en el ejemplo 1, con un total de 25 ng de polinucleótido diana fragmentado, 100 pmoles del ATO 1 006 para un total de 100 pmoles del ATO, en H2O hasta un volumen final de 7.5 pl. Como se muestra en las secciones (A) y (B) de la Figura 13.

Extensión del ácido desoxirribonucleico diana mediante su uso como cebador con los uno o más oligos plantilla adaptadores como plantilla

Igual que en el ejemplo 1, con un total de 1.25 unidades de Klenow y 1.25 unidades de ADN polimerasa TAQ, 1 pl de tampón de a Dn polimerasa TAQ 10x, y 5 nmoles de cada dNTP (dATP/dTTP/dCTP/dGTP), combinado con la mezcla de ATO de ADN hasta un volumen final de 10 pl. Como se muestra en la sección (C) de la Figura 13.

Degradación de uno o más oligos plantilla adaptadores

Igual que en el ejemplo 1. Como se muestra en la sección (D) de la Figura 13.

Primera amplificación exponencial del polinucleótido diana modificado mediante PCR

El polinucleótido diana modificado, purificado o no, se combina con un cebador universal complementario a la secuencia universal original en los uno o más ATO y ahora presente en el extremo 3' del polinucleótido diana, un grupo de cebadores específicos diana diseñados para dirigirse a regiones de ADN que contienen mutaciones de interés (por ejemplo, y sin limitación, uno o más polimorfismos de un solo nucleótido, uno o más indeles, una o más fusiones de ADN), una cantidad adecuada de una o más ADN polimerasas, con o sin corrección de errores (por ejemplo, y sin limitación, ADN polimerasa Taq o Phusion), uno o más tampones adecuados, uno o más dNTP adecuados y otros aditivos adecuados o necesarios (por ejemplo, y sin limitación, DMSO, betaína y sulfato de amonio). En este ejemplo, se combinaron 5 pl del polinucleótido diana modificado, 50 pmoles de 2-004, 100 pmoles de un grupo de cebadores específicos diana, 12 nmoles de cada dNTP (dATP/dTTP/dCTP/dGTP), 2 unidades de ADN polimerasa Phusion, 10 pl de tampón Phusion 5x y 1 pmol de sulfato de amonio en un volumen final de 50 pl. A continuación, la mezcla se termocicla para amplificar las regiones seleccionadas del producto de extensión del ácido nucleico diana; en este ejemplo, 98 °C durante 1 min, 15 ciclos de 98 °C durante 5 segundos, 60 °C durante 5 minutos y 72 °C durante 30 segundos, seguidos de 72 °C durante 2 minutos. El producto de amplificación puede purificarse opcionalmente mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, utilizando perlas magnéticas. En este ejemplo, los productos de PCR se eluyeron en 30 pl, como se muestra en la sección (E) de la Figura 13.

Segunda amplificación exponencial opcional del primer producto de amplificación exponencial mediante PCR El primer producto de amplificación exponencial purificado se combina con un segundo cebador universal anidado con similitud de secuencia y diseñado para unirse a la secuencia universal introducida por el primer cebador universal que contendrá secuencias compatibles y necesarias para la secuenciación mediante tecnologías de secuenciación de próxima generación (por ejemplo, y sin limitación, secuencias adaptadoras P5 o P7, secuencias de índice de paciente/muestra, secuencias de Illumina o de lectura 1 o 2 personalizadas para compatibilidad con los secuenciadores de próxima generación de Illumina), un segundo grupo de cebadores dirigidos, diseñados para dirigirse regiones de ADN, incluyendo o anidados, en relación con el primer grupo de cebadores, que también dirigen a regiones de ADN que contienen mutaciones de interés y que también contienen secuencias compatibles y necesarias para la compatibilidad con las tecnologías de secuenciación de próxima generación (por ejemplo, y sin limitación, secuencias adaptadoras P5 o P7, secuencias de índice de paciente/muestra, sitios de cebadores de secuenciación Illumina o de lectura 1 o 2 personalizadas (para compatibilidad con los secuenciadores Illumina de próxima generación), una polimerasa de corrección de errores (por ejemplo, y sin limitación, la ADN polimerasa Phusion, Q5), uno o más tampones adecuados, uno o más dNTP adecuados y otros aditivos adecuados o necesarios (por ejemplo, y sin limitación, DMSO, betaína y sulfato de amonio). En este ejemplo, se combinaron 10 ul del primer producto de amplificación purificado, 12.5 pmoles de 2-005, 50 pmoles de un grupo anidado de cebadores específicos diana, 5 nmoles de cada dNTP (dATP/dTTP/dCTP/dGTP), 1 unidad de ADN polimerasa Phusion, 5 pl de tampón Phusion 5x, 1x de SYBRgreen y 0.5 pmol de sulfato de amonio en un volumen final de 25 pl. A continuación, la mezcla se termocicla para amplificar las regiones seleccionadas del primer producto de amplificación exponencial; en este ejemplo, 98 °C durante 1 min, 15 ciclos de 98 °C durante 5 segundos, 60 °C durante 5 minutos y 72 °C durante 30 segundos, seguidos de 72 °C durante 2 minutos, como se muestra en la sección (F) de la Figura 13. El producto de amplificación puede purificarse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, con perlas magnéticas, y será apto para la secuenciación de próxima generación con una tecnología compatible. En este ejemplo, el segundo producto de amplificación exponencial se purificó previamente con perlas y se determinó su distribución de tamaño. Este se utilizó para generar lecturas de pares de 150 pb con un MiSeq, como se muestra en la sección (G) de la Figura 13.

Resultados

La combinación de la primera y la segunda amplificación exponencial permitió amplificar con éxito las regiones diana del polinucleótido diana modificado y producir una biblioteca de amplicones específica. La inclusión de SYBRgreen en las reacciones de la segunda amplificación exponencial permitió monitorizar la velocidad de amplificación de los productos finales de la biblioteca, el análisis de la curva de fusión mostró que, en comparación con un control sin plantilla, el método completo fue capaz de producir productos con un peso molecular sustancialmente mayor. Utilizando un kit de bioanalizador de alta sensibilidad de Agilent (ID de producto 5067-4626) para evaluar la biblioteca de secuenciación completa final, pudimos demostrar que el producto final de la preparación de la biblioteca tiene una distribución de tamaño equivalente a la esperada dada la distribución del material de entrada. Utilizando esta biblioteca para generar datos de secuenciación como parte de una ejecución agrupada con un MiSeq, se obtuvieron poco más de 3.6 millones de lecturas. Las lecturas se mapearon a una muestra de referencia mediante bwa, lo que resultó en una tasa de mapeo del 98 %. El análisis del tamaño del inserto para las lecturas mapeadas de extremos emparejados revela una distribución de insertos desde 26 pb (se filtraron los insertos de 25 pb o menos) hasta casi 400 pb. Con un tamaño máximo de inserto de aproximadamente 100 pb, como se muestra en la sección (H) de la Figura 13. El análisis de la eficiencia de cada cebador específico se realizó contando el número de lecturas en los resultados de la secuenciación que se mapean a cada uno de los sitios del cebador, como se muestra en la sección (I) de la Figura 13. Esto reveló una cobertura uniforme en todos los sitios diana. Gracias a la incorporación de UID, pudimos generar 'familias de códigos de barras' y contar el número de familias por sitio diana, como se muestra en la sección (J). Esto reveló un recuento máximo ligeramente superior a 1000 familias de códigos de barras.

Conclusión

Mediante la combinación de una primera reacción del ATO con ADNg fragmentado, un proceso de dos rondas de amplificación exponencial con un grupo de cebadores específicos diana y un segundo grupo anidado de cebadores específicos diana, validamos con éxito este enfoque tecnológico para su uso en la generación de bibliotecas de secuenciación basadas en amplicones específicos de cadena. La secuenciación exitosa del producto final de la biblioteca en un secuenciador Illumina MiSeq confirmó que contenía los componentes que habíamos diseñado en el orden correcto necesario para la secuenciación. El análisis de los datos reveló una amplificación multiplexada exitosa de más de 200 regiones diana diferentes con niveles similares de enriquecimiento para todos los cebadores. La comparación del número de familias de códigos de barras para cada uno de los sitios de cebadores revela muy poca variación entre todos los sitios, lo que indica que existe poco o ningún sesgo basado en las secuencias diana en la reacción del ATO.

Ejemplo 3

Utilización de ácido desoxirribonucleico (ADN) como polinucleótido diana para la incorporación de un promotor de una ARN polimerasa con el fin de impulsar la amplificación de ADN a ARN utilizando, por ejemplo, y sin limitación, uno o más oligos plantilla adaptadores que contengan una secuencia compatible con un promotor de la ARN polimerasa y capaz de funcionar como tal, así como una horquilla producida por una secuencia de nucleótidos.

Materiales

Polinucleótido diana, ADNg humano (BIO-35025)

Enzima fragmentadora de ADN, Kit KAPA Frag (Roche, 7962517001)

Oligos plantilla adaptadores (ATO), 1-012 (Tabla 1)

ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

Tampón de ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

ADN polimerasa I, Fragmento Grande (Klenow) (NEB, M0210L, M0212L)

Los dNTP (NEB, N0447s)

Enzima USER® (NEB, M5505S)

Kit de ARN IVT estándar T7-Scribe (CELLSCRIPT, C-AS3107)

Método

Hibridación de uno o más oligos plantilla adaptadores con ácidos desoxirribonucleicos

Igual que en el ejemplo 1, excepto el ATO contiene una o más secuencias compatibles con y capaces de actuar como promotor de la ARN polimerasa (por ejemplo, y sin limitación una secuencia promotora T7, T3 o SP6), en este ejemplo, el ATO 1-012 que contiene un promotor T7.

Extensión del ácido desoxirribonucleico diana mediante su uso como cebador con el oligos plantilla adaptadores como plantilla.

Igual que en el ejemplo 1.

Transcripciónin vitroutilizando una ARN polimerasa.

El producto de la extensión del ácido desoxirribonucleico diana (el polinucleótido modificado), purificado o sin purificar, se combina con un tampón adecuado, NTP adecuados, otros aditivos adecuados (por ejemplo, y sin limitación, DTT) y una ARN polimerasa adecuada (por ejemplo, y sin limitación, una ARN polimerasa T7 si se ha utilizado un promotor de ARN polimerasa T7), durante un tiempo y una temperatura adecuados para promover la actividad de la ARN polimerasa. En este ejemplo, se utilizaron 5 pl de polinucleótido diana modificado purificado y un kit comercial, siguiendo las instrucciones del fabricante, el kit de ARN IVT estándar T7-Scribe™ CELLScRlPT™, que se incubó a 37 °C durante 18 horas con un volumen final de 20 pl. El ARN producido se cuantificó utilizando un reactivo Qubit3 de alta sensibilidad; se midió un total de 107 ng/pl, lo que resultó en una cantidad total de 2035 ng de ARN producido tras la incubación de 18 horas durante la noche. El ARN puede entonces constituir el material de partida para cualquier aplicación posterior basada en ARN, por ejemplo, y sin limitación, secuenciación de próxima generación de ARN, síntesis de ADNc, hibridaciónin situ,qPCR o cualquier otro proceso posterior adecuado.

Resultados

El ATO, que contiene una secuencia diseñada para funcionar como promotor de una ARN polimerasa cuando es bicatenaria en una primera reacción del ATO para producir un polinucleótido diana modificado. Esta primera reacción se puede considerar exitosa, ya que su producto se utilizó en una reacción de transcripciónin vitroque generó un total de 2 pg de ARN.

Conclusión

Una secuencia de nucleótidos diseñada para funcionar como promotor de la ARN polimerasa puede incorporarse con éxito al diseño del ATO. Tras la primera extensión del ATO, una porción del polinucleótido diana modificado será bicatenaria y contendrá un promotor de la ARN polimerasa. Este promotor bicatenario de la ARN polimerasa puede utilizarse para amplificar el polinucleótido diana en ARN, en lugar de ADN. Esto permite amplificar de forma rápida y robusta una pequeña cantidad de ADN en ARN, que posteriormente puede utilizarse como plantilla para diversas aplicaciones posteriores, como la secuenciación de ARN y la síntesis de ADNc.

Ejemplo 4

Utilización de ácido desoxirribonucleico (ADN) como polinucleótido diana para la incorporación de un promotor de una ARN polimerasa que impulse la amplificación de ADN a ARN utilizando, por ejemplo, y sin limitación, uno o más oligonucleótidos plantilla adaptadores que contengan una secuencia compatible con el promotor de la ARN polimerasa y capaz de funcionar como tal, así como una secuencia de nucleótidos producida en horquilla, y un segundo oligo con complementariedad con el ATO.

Materiales

Polinucleótido diana, ADNg humano (BIO-35025)

Enzima fragmentadora de ADN, Kit KAPA Frag (Roche, 7962517001)

Oligos plantilla adaptadores (ATO), 1-019, 1-020 (Tabla 1)

ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

Tampón de ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

ADN polimerasa I, Fragmento Grande (Klenow) (NEB, M0210L, M0212L)

Los dNTP (NEB, N0447s)

Enzima USER® (NEB, M5505S)

Agencourt AMPureXP (Beckman Coulter, A63881)

Kit de ARN IVT estándar T7-Scribe (CELLSCRIPT, C-AS3107)

Método

Hibridación de uno o más oligos plantilla adaptadores con ácidos desoxirribonucleicos

Igual que en el ejemplo 3, excepto que se utiliza ATO 1-019.

Extensión del ácido desoxirribonucleico diana mediante su uso como cebador con los uno o más oligos plantilla adaptadores como plantilla

Igual que en el ejemplo 1.

Degradación de uno o más oligos plantilla adaptadores

Igual que en el ejemplo 1.

Producción de un promotor de ARN polimerasa bicatenario

El producto de extensión del ácido desoxirribonucleico diana, purificado o sin purificar, se combina con una secuencia complementaria a las una o más secuencias conservadas originalmente en los uno o más ATOs y ahora presente en las moléculas de ADN diana. En este ejemplo, 15 pl de polinucleótido diana modificado purificado, 100 pmoles de 1-020 en H2O, de un volumen final de 20 pl. La mezcla se calienta a una temperatura adecuada (en este ejemplo, 95 °C) y durante el tiempo necesario para facilitar la desnaturalización de los ácidos nucleicos bicatenarios en monocatenarios, en este ejemplo, 2 minutos. A continuación, la mezcla se enfría para permitir la formación de un complejo bicatenario entre el polinucleótido diana modificado y los uno o más oligonucleótidos complementarios de extensión desoxirribonucleica diana, en este ejemplo, a temperatura ambiente (25 °C) durante al menos 5 minutos.

Transcripciónin vitrocon ARN polimerasa

Igual que en el ejemplo 3.

Resultados

El ATO, que contiene una secuencia diseñada para funcionar como promotor de una ARN polimerasa cuando es bicatenaria en una primera reacción del ATO para producir un polinucleótido diana modificado. Esta primera reacción se puede considerar exitosa, ya que su producto se utilizó en una reacción de transcripciónin vitroque generó ARN.

Conclusión

Una secuencia de nucleótidos diseñada para funcionar como promotor de la ARN polimerasa puede incorporarse con éxito al diseño del ATO. Tras la primera extensión del ATO, este se digiere y se elimina, y el oligo complementario se hibrida con el polinucleótido diana modificado, una porción del polinucleótido diana modificado será bicatenaria y contendrá un promotor de la ARN polimerasa. Este promotor de la ARN polimerasa bicatenaria puede utilizarse para amplificar el polinucleótido diana en ARN, en lugar de ADN. Esto permite amplificar de forma rápida y robusta una pequeña cantidad de ADN en ARN, que posteriormente puede utilizarse como plantilla para diversas aplicaciones posteriores, como la secuenciación de ARN y la síntesis de ADNc.

Ejemplo 5

Utilizando ácido desoxirribonucleico (ADN) como polinucleótido diana para incorporar un promotor de una ARN polimerasa con el fin de producir la amplificación de ADN a ARN utilizando, por ejemplo, y sin limitación, uno o más oligos plantilla adaptadores con estructura de horquilla (tallo-bucle) producido con dos regiones de tallo cortas con complementariedad parcial o completa, separadas por una secuencia aleatoria, específicamente diseñada o elegida.

Materiales

Polinucleótido diana, ADNg humano (BIO-35025)

Enzima fragmentadora de ADN, Kit KAPA Frag (Roche, 7962517001)

Oligos plantilla adaptadores (ATO), 1-021 (Tabla 1)

ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

Tampón de ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

ADN polimerasa I, Fragmento Grande (Klenow) (NEB, M0210L, M0212L)

Los dNTP (NEB, N0447s)

ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion® (NEB, M0530S)

Tampón Phusion (NEB, M0530S)

Enzima USER® (NEB, M5505S)

Nucleasa S1 (ThermoFisher, EN0321)

Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, A63881)

Kit de ARN IVT estándar T7-Scribe (CELLSCRIPT, C-AS3107)

Método

Hibridación de uno o más oligos plantilla adaptadores con ácidos desoxirribonucleicos

Igual que en el ejemplo 3, excepto que el ATO, además de una secuencia diseñada para funcionar como promotor de la ARN polimerasa, contiene una horquilla formada por dos regiones cortas de complementariedad parcial o completa, separadas por una secuencia aleatoria, específicamente diseñada o elegida, 1-021. Extensión del ácido desoxirribonucleico diana mediante su uso como cebador con los uno o más oligos plantilla adaptadores como plantilla

Igual que en el ejemplo 3.

Generación de un producto de extensión de ácido desoxirribonucleico diana bicatenario que incluye un promotor de ARN polimerasa bicatenario

La mezcla de reacción del polinucleótido diana modificado se combina con una o más ADN polimerasas termoestables adicionales, con o sin corrección de errores (por ejemplo y sin limitación, ADN polimerasa Taq o Phusion), mezclada con uno o más tampones adecuados y dNTP adecuados. En este ejemplo, la reacción de 20 |jl del polinucleótido diana modificado, 2 unidades de ADN polimerasa Phusion, 6 j l de tampón Phusion 5x, 5 nmoles de cada dNTP (dATP/dTTP/dCTP/dGTP), en un volumen final de 30 j l . La mezcla se calienta a una temperatura adecuada, en este ejemplo 95 °C, durante un tiempo adecuado, en este ejemplo 2 minutos, o a otras temperaturas o tiempos que puedan provocar la desnaturalización de ácidos nucleicos bicatenarios en monocatenarios. A continuación, la muestra se enfría para permitir que las regiones de complementariedad (por ejemplo, y sin limitación, una secuencia de nucleótidos que forma una horquilla debido a la inclusión de dos regiones de complementariedad parcial o completa) dentro del producto de extensión de ácido desoxirribonucleico diana y uno o más oligos ATO para que autohibriden, en este ejemplo a temperatura ambiente (25 °C) durante 5 minutos. La región 3' del producto de extensión de ácido desoxirribonucleico diana modificado formará una pequeña horquilla y se autohibridará. A continuación, se eleva la temperatura a una temperatura adecuada durante el tiempo necesario para extender completamente el extremo 3', que actuará como cebador para iniciar la extensión y la formación de un producto de extensión de ácido desoxirribonucleico diana total o parcialmente bicatenario con una horquilla que separa las dos cadenas complementarias, en este ejemplo, 72 °C durante 10 minutos.

Degradación opcional de uno o más oligos plantilla adaptadores

Igual que en el ejemplo 1.

Transcripciónin vitrousando ARN polimerasa

Igual que en el ejemplo 3.

Resultados

El ATO, que contiene una secuenciación diseñada para funcionar como promotor de una ARN polimerasa cuando es bicatenaria, así como una secuencia que formaría una horquilla interna, se utilizó en una primera reacción del ATO para producir un polinucleótido diana modificado. Esta primera reacción puede considerarse exitosa, ya que su producto se utilizó en una reacción de transcripciónin vitroque generó ARN.

Conclusión

Una secuencia de nucleótidos diseñada para funcionar como promotor de la ARN polimerasa puede incorporarse con éxito al diseño del ATO en combinación con la horquilla interna y la extensión. Tras la primera extensión del ATO, demostramos que, tras la digestión y eliminación del ATO, las regiones de complementariedad pueden hibridarse nuevamente y extenderse para producir un polinucleótido diana modificado bicatenario con una horquilla. Este promotor de la ARN polimerasa bicatenario puede utilizarse para amplificar el polinucleótido diana en ARN, en lugar de ADN. Esto permite amplificar de forma rápida y robusta una pequeña cantidad de ADN en ARN, que posteriormente puede utilizarse como plantilla para diversas aplicaciones posteriores, como la secuenciación de ARN y la síntesis de ADNc.

Ejemplo 6

Utilizando ácido desoxirribonucleico (ADN) como polinucleótido diana para la producción de una biblioteca de secuenciación de próxima generación (por ejemplo y sin limitación, compatible con los secuenciadores de próxima generación de Illumina) usando, por ejemplo y sin limitación, uno o más oligos plantilla adaptadores con una horquilla producida con dos regiones cortas de complementariedad parcial o completa separadas por una secuencia aleatoria, específicamente diseñada o elegida.

Materiales

Polinucleótido diana, ADNg humano (BIO-35025)

Enzima fragmentadora de ADN, Kit KAPA Frag (Roche, 7962517001)

Oligos plantilla adaptadores (ATO), 1-013, 1-022 (Tabla 1)

ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

Tampón de ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

ADN polimerasa I, Fragmento Grande (Klenow) (NEB, M0210L, M0212L)

Los dNTP (NEB, N0447s)

ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion® (NEB, M0530S)

Tampón Phusion (NEB, M0530S)

Enzima USER® (NEB, M5505S)

Nucleasa S1 (ThermoFisher, EN0321)

Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, A63881)

Cebadores 2-002, 2-003 (Tabla 2)

Método

Hibridación de un oligo plantilla adaptador con ácidos desoxirribonucleicos

Igual que en el ejemplo 1, excepto que el ATO tiene, además de una secuencia diseñada para funcionar como una horquilla producida con dos regiones cortas de complementariedad parcial o completa separadas por una secuencia aleatoria, específicamente diseñada o elegida, 1-013.

Extensión del ácido desoxirribonucleico diana mediante su uso como cebador con los uno o más oligos plantilla adaptadores como plantilla.

Igual que en el ejemplo 1.

Generación de un polinucleótido diana modificado bicatenario

Igual que en el ejemplo 5.

Degradación del oligo plantilla adaptador y degradación de la horquilla

Igual que en el ejemplo 5, con la adición de la nucleasa S1. Esto puede requerir una etapa de inactivación adicional, donde S1 se inactiva mediante la adición de EDTA e incubación a 70 °C durante 10 minutos, o a temperaturas y tiempos similares que resultan en la inactivación de la nucleasa S1.

Extensión de un paso o amplificación lineal de un polinucleótido diana modificado bicatenario para generar la primera CS

Igual que en el ejemplo 1.

Hibridación de un segundo oligo plantilla adaptador con la primera CS

Igual que en el ejemplo 1, excepto que el ATO tiene, además de una secuencia diseñada para funcionar como una horquilla producida con dos regiones cortas de complementariedad parcial o completa separadas por una secuencia aleatoria, específicamente diseñada o elegida, 1-022.

Extensión de la primera CS mediante su uso como cebador con el segundo oligo plantilla adaptador como plantilla para formar una primera CS modificada.

Igual que en el ejemplo 1.

Generación de un polinucleótido diana modificado bicatenario.

Igual que en el ejemplo 5.

Degradación del oligo plantilla adaptador y degradación de la horquilla.

Como se indicó anteriormente.

Amplificación exponencial de la primera CS modificada mediante PCR.

Igual que en el ejemplo 1.

Resultados

Con este ejemplo, podemos demostrar que la autohibridación y la extensión de un polinucleótido diana modificado y la primera CS modificada produce una plantilla para la amplificación exponencial final, lo que resulta en una biblioteca completa de secuenciación de próxima generación del genoma completo.

Conclusión

Al combinar una primera reacción del ATO utilizando ADNg fragmentado, un proceso de autohibridación y extensión para generar ADN bicatenario, extensión de un paso o amplificación lineal para generar múltiples primeras cadenas complementarias, una segunda reacción del ATO utilizando el producto de amplificación lineal como un polinucleótido diana, seguido de una amplificación global, hemos validado exitosamente este enfoque tecnológico para su uso en la generación de bibliotecas de secuenciación.

Ejemplo 7

Uso de ácido desoxirribonucleico (ADN) como polinucleótido diana para la producción de una biblioteca de secuenciación de próxima generación (por ejemplo y sin limitación, compatible con los secuenciadores de próxima generación de Illumina) utilizando, por ejemplo y sin limitación, uno o más oligos plantilla adaptadores con una horquilla producida con dos regiones cortas de complementariedad parcial o completa separadas por una secuencia aleatoria, específicamente diseñada o elegida, y un adaptador ordinario bicatenario o parcialmente bicatenario.

Materiales

Polinucleótido diana, ADNg humano (BIO-35025)

Enzima fragmentadora de ADN, Kit KAPA Frag (Roche, 7962517001)

Oligos plantilla adaptadores (ATO), 1-022 (Tabla 1)

ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

Tampón de ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

ADN polimerasa I, Fragmento Grande (Klenow) (NEB, M0210L, M0212L)

Los dNTP (NEB, N0447s)

ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion® (NEB, M0530S)

Tampón Phusion (NEB, M0530S)

Enzima USER® (NEB, M5505S)

ADN ligasa T4 (NEB, M0202S)

Método

Hibridación de uno o más oligos plantilla adaptadores con ácidos desoxirribonucleicos

Igual que en el ejemplo 1, excepto que el ATO tiene, además de una secuencia diseñada para funcionar como una horquilla producida con dos regiones cortas de complementariedad parcial o completa, separadas por una secuencia aleatoria, específicamente diseñada o elegida, 1-022.

Extensión del polinucleótido diana mediante su uso como cebador con el oligo plantilla adaptador como plantilla Igual que en el ejemplo 1.

Generación de un polinucleótido diana modificado bicatenario

Igual que en el ejemplo 5.

Ligación de uno o más adaptadores bicatenarios al extremo del producto de extensión de ácido desoxirribonucleico diana bicatenario

El polinucleótido diana modificado bicatenario, purificado o sin purificar, se mezcla con una cantidad adecuada de extremo sobresaliente de nucleótido T 3' o de extremo romo, totalmente bicatenario, parcialmente bicatenario, con o sin horquilla, adaptador, una cantidad adecuada de una o más ligasas (por ejemplo y sin limitación, ADN ligasa T4), uno o más tampones adecuados, y cualquier otro reactivo o reactivos necesarios. En este ejemplo, 15 pl de polinucleótido diana modificado bicatenario purificado, 50 nmoles de adaptador, 100 unidades de ADN ligasa T4, 2 pl de tampón de ligasa 10x en un volumen final de 20 pl. La mezcla se incuba a una temperatura y un tiempo adecuados para permitir la ligadura completa a todos los extremos del producto de extensión del ácido nucleico diana bicatenario, en este ejemplo, a 25 °C durante 30 minutos, u otras temperaturas y tiempos adecuados capaces de promover la actividad enzimática.

Degradación opcional de oligonucleótidos plantilla de uno o más oligos plantilla adaptadores y degradación de horquilla

Igual que en el ejemplo 6.

Amplificación exponencial del producto de extensión ligado mediante PCR

Igual que en el ejemplo 1.

Resultados

Con este ejemplo, podemos demostrar que el uso de la autohibridación y la extensión de un polinucleótido diana modificado para generar una primera CS bicatenaria y la ligadura de un adaptador al extremo disponible produce con éxito un plantilla para la amplificación exponencial final, lo que resulta en una biblioteca completa de secuenciación de próxima generación del genoma completo.

Conclusión

Mediante la combinación de una primera reacción del ATO con ADNg fragmentado, un proceso de autohibridación y extensión para generar ADN bicatenario, la ligadura de un adaptador bicatenario al extremo expuesto para generar un segundo producto de ADN bicatenario, seguido de una amplificación global, hemos validado con éxito este enfoque tecnológico para su uso en la generación de bibliotecas de secuenciación.Ejemplo 8

Utilizando ácido desoxirribonucleico (ADN) como polinucleótido diana para producir una biblioteca de secuenciación de próxima generación sin 'PCR' (por ejemplo y sin limitación, compatible con los secuenciadores de próxima generación de Illumina) utilizando, por ejemplo y sin limitación, uno o más oligos plantilla adaptadores con una horquilla producida con dos regiones cortas de complementariedad parcial o completa separadas por una secuencia aleatoria, específicamente diseñada o específicamente elegida, y un adaptador ordinario bicatenario o parcialmente bicatenario.

Materiales

Polinucleótido diana, ADNg humano (BIO-35025)

Enzima fragmentadora de ADN, Kit KAPA Frag (Roche, 7962517001)

Oligos plantilla adaptadores (ATO), 1-023 (Tabla 1)

ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

Tampón de ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

ADN polimerasa I, Fragmento grande (Klenow) (NEB, M0210L, M0212L)

Los dNTP (NEB, N0447s)

ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion® (NEB, M0530S)

Tampón Phusion (NEB, M0530S)

Enzima USER® (NEB, M5505S)

Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, A63881)

ADN ligasa T4 (NEB, M0202S)

Método

Hibridación de uno o más oligos plantilla adaptadores con ácidos desoxirribonucleicos

Igual que en el ejemplo 1, excepto que el ATO tiene secuencias que forman una horquilla debido a la inclusión de dos regiones de complementariedad parcial o completa que comprenden secuencias adaptadoras P5 o P7, secuencias de índice de paciente/muestra, secuencias de Illumina o de lectura 1 o 2 personalizadas para compatibilidad con los secuenciadores de próxima generación de Illumina, 1-023.

Extensión del polinucleótido diana mediante su uso como cebador con los uno o más oligos plantilla adaptadores como plantilla

Igual que en el ejemplo 1.

Generación de un producto de extensión de ácido desoxirribonucleico diana bicatenario

Igual que en el ejemplo 5.

Hibridación y ligadura de uno o más adaptadores al extremo del producto de extensión de ácido desoxirribonucleico

diana bicatenario

Igual que en el ejemplo 7.

Degradación opcional de los uno o más oligonucleótidos plantilla adaptadores y degradación de horquilla Igual que en el ejemplo 6.

Resultados

Con este ejemplo, podemos demostrar que el uso de la autohibridación y extensión de un polinucleótido diana modificado para generar una primera Cs bicatenaria y la ligadura de un adaptador al extremo disponible produce con éxito una plantilla para la secuenciación de próxima generación sin 'PCR exponencial'.

Conclusión

Mediante la combinación de una primera reacción del ATO con ADNg fragmentado, un proceso de autohibridación y extensión para generar ADN bicatenario, ligadura de un adaptador bicatenario al extremo expuesto, para generar un segundo producto de ADN bicatenario, hemos validado con éxito este enfoque tecnológico para una secuenciación de próxima generación sin 'PCR exponencial'.

Ejemplo 9

Uso de ácido desoxirribonucleico (ADN) como polinucleótido diana para producir una biblioteca de secuenciación de próxima generación sin PCR (por ejemplo y sin limitación, compatible con los secuenciadores de próxima generación de Illumina) utilizando, por ejemplo y sin limitación, uno o más oligonucleótidos plantilla adaptadores con una estructuraO de horquilla (tallo-bucle, donde el bucle comprende un espaciador químico (por ejemplo y sin limitación, un espaciador C3, un espaciador C18) y un adaptador ordinario bicatenario o parcialmente bicatenario.

Materiales

Polinucleótido diana, ADNg humano (BIO-35025)

Enzima de fragmentación de ADN: Kit KAPA Frag (Roche, 7962517001)

Oligonucleótidos plantilla adaptadores (ATO), 1-023 (Tabla 1)

ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

Tampón de ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

ADN polimerasa I, Fragmento Grande (Klenow) (NEB, M0210L, M0212L)

Los dNTP (NEB, N0447s)

ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion® (NEB, M0530S)

Tampón Phusion (NEB, M0530S)

Enzima USER® (NEB, M5505S)

ADN ligasa T4 (NEB, M0202S)

Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, A63881)

Cebador 2-006 (Tabla 2)

Método

Hibridación de un oligo plantilla adaptador con ácidos desoxirribonucleicos

Igual que en el ejemplo 8, excepto que la horquilla del ATO se genera mediante un espaciador químico, 1-024. Extensión del polinucleótido diana mediante su uso como cebador con el oligos plantilla adaptadores como plantilla

Igual que en el ejemplo 1.

Degradación del oligo plantilla adaptador

Igual que en el ejemplo 1.

Extensión lineal para generar un polinucleótido diana modificado bicatenario.

El producto de extensión del ácido nucleico diana purificado se combina con un cebador oligonucleotídico complementario a la secuencia conservada presente en el extremo 3' de las moléculas de ADN diana modificadas, una polimerasa (por ejemplo y sin limitación, ADN polimerasa Phusion), uno o más tampones adecuados y dNTP adecuados. En este ejemplo, se utilizan 50 pmoles de un cebador complementario a la secuencia conservada presente ahora en las moléculas de ADN diana (2-006), 2 unidades de ADN polimerasa Phusion, 6 |jl de tampón de ADN polimerasa Phusion 5x, 12 nmoles de cada dNTP (dATP/dTTP/dCTP/dGTP) y 15 |jl de polinucleótido diana modificado purificado, en un volumen final de 30 jl. La mezcla se incuba, en este ejemplo, a 60-72 °C durante 30 minutos, o a otras temperaturas y tiempos adecuados capaces de promover la actividad enzimática para extender el o los oligonucleótidos para crear un producto de ADN bicatenario con extremos romos o cola A. Los productos pueden purificarse posteriormente mediante cualquier método de purificación adecuado.

Ligadura de uno más adaptadores ordinarios al extremo del producto de extensión de ácido desoxirribonucleico diana bicatenario

Igual que en el ejemplo 8.

Resultados:

Con este ejemplo, podemos demostrar que la combinación de una primera reacción del ATO, una ronda de extensión y la ligadura de un adaptador ordinario puede producir con éxito una plantilla para la secuenciación de próxima generación sin PCR.

Conclusión

Mediante la combinación de una primera reacción del ATO con ADN genómico fragmentado, una primera reacción del ATO, la eliminación del ATO y la hibridación de un oligo complementario a la secuencia universal, una extensión lineal de un paso, seguido por ligadura de un adaptador bicatenario al extremo 5' del polinucleótido diana modificado, hemos validado con éxito este enfoque tecnológico para la secuenciación de próxima generación sin 'PCR'.

Ejemplo 10

Uso de ácido desoxirribonucleico (ADN) como polinucleótido diana para la producción de una biblioteca de secuenciación de próxima generación (por ejemplo y sin limitación, compatible con los secuenciadores de próxima generación de Illumina) utilizando, por ejemplo y sin limitación, uno o más oligos plantilla adaptadores monocatenarios.

Materiales

Polinucleótido diana, ADNg humano (BIO-35025)

Enzima fragmentadora de ADN, Kit KAPA Frag (Roche, 7962517001)

Oligos plantilla adaptadores (ATO), 1-025, 1-026 (Tabla 1)

ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

Tampón de ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

ADN polimerasa I, Fragmento Grande (Klenow) (NEB, M0210L, M0212L)

Los dNTP (NEB, N0447s)

ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion® (NEB, M0530S)

Tampón Phusion (NEB, M0530S)

Enzima USER® (NEB, M5505S)

Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, A63881)

Cebador 2-002, 2-003 (Tabla 2)

Método

Hibridación de un oligo plantilla adaptador con ácidos desoxirribonucleicos

Igual que en el ejemplo 1, excepto que el ATO es monocatenario, 1-025.

Extensión del polinucleótido diana mediante su uso como cebador con los uno o más oligos plantilla adaptadores como plantilla.

Igual que en el ejemplo 1

Degradación de uno o más oligos plantilla adaptadores

Igual que en el ejemplo 1

Amplificación lineal de un polinucleótido diana modificado

Igual que en el ejemplo 1

Hibridación de un segundo oligo plantilla adaptador con la primera cadena complementaria

Igual que en el ejemplo 1, excepto que el ATO es monocatenario, 1-026.

Extensión de la primera cadena complementaria mediante su uso como cebador con el oligonucleótido plantilla del segundo adaptador como plantilla para formar la primera cadena complementaria modificada

Igual que en el ejemplo 1

Degradación de uno o más oligos plantilla del segundo adaptador

Igual que en el ejemplo 1

Amplificación exponencial del producto de extensión de plantilla del segundo adaptador mediante PCR Igual que en el ejemplo 1

Resultados

Utilizando ATO monocatenario, podemos demostrar la correcta finalización de una biblioteca de secuenciación genómica de próxima generación, similar a la detallada en el ejemplo 1.

Conclusión

Mediante la combinación de una primera reacción del ATO con ADNg fragmentado, un proceso de amplificación lineal para generar múltiples primeras cadenas complementarias, una segunda reacción del ATO utilizando el producto de amplificación lineal como polinucleótido diana, seguida de una amplificación global, hemos validado con éxito este enfoque tecnológico para su uso en la generación de bibliotecas de secuenciación.Ejemplo 11

Uso de ácido desoxirribonucleico (ADN) como polinucleótido diana para la producción de una biblioteca de secuenciación de próxima generación (por ejemplo y sin limitación, compatible con los secuenciadores de próxima generación de Illumina) utilizando, por ejemplo y sin limitación, uno o más oligos plantilla adaptadores separados en dos cadenas complementarias.

Materiales

Polinucleótido diana, ADNg humano (BIO-35025)

Enzima fragmentadora de ADN, Kit KAPA Frag (Roche, 7962517001)

Oligos plantilla adaptadores (ATO), 1-027, 1-028, 1-029, 1-030 (Tabla 1)

ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

Tampón de ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

ADN polimerasa I, Fragmento Grande (Klenow) (NEB, M0210L, M0212L)

Los dNTP (NEB, N0447s)

ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion® (NEB, M0530S)

Tampón Phusion (NEB, M0530S)

Enzima USER® (NEB, M5505S)

Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, A63881)

ADN Ligasa T4 (NEB, M0202S)

Cebador 2-002, 2-003 (Tabla 2)

Método

Hibridación de un oligo plantilla adaptador con ácidos desoxirribonucleicos

Igual que en el ejemplo 1, excepto que el ATO es una mezcla molar igual de dos oligos monocatenarios 1-027 y 1-028.

Extensión del ácido desoxirribonucleico diana mediante su uso como cebador con los uno o más oligos plantilla adaptadores como plantilla y ligación

Igual que en el ejemplo 1, además la reacción contiene ADN ligasa. Si el extremo 3' del polinucleótido diana hibrida con el ATO y se encuentra directamente adyacente al extremo 5' fosforilado de la cadena superior del ATO, el extremo 3' del polinucleótido diana se liga al extremo 5' de la cadena superior del ATO sin necesidad de extensión. Si el extremo 3' del polinucleótido diana se hibrida con el ATO y se encuentra a cierta distancia del extremo 5' fosforilado de la cadena superior del ATO, la ADN polimerasa extiende dicho extremo 3' del polinucleótido diana y se liga al extremo 5' de la cadena superior del ATO. En este ejemplo, la reacción contiene los mismos componentes de extensión que en el ejemplo 1, y además con 100 unidades de ADN ligasa T4 y 2.5 |jl de tampón de ADN ligasa 10x, en un volumen final de 25 jl. La mezcla se incuba a una temperatura y un tiempo adecuados para permitir la ligadura o ligadura por extensión entre el extremo 3' del polinucleótido diana o su producto de extensión y uno o más oligos del complemento de la plantilla adaptadora, que es la cadena superior separada o el extremo 5' de la porción del tallo de la estructura del tallo del ATO, en este ejemplo 25 °C durante 30 minutos, u otras temperaturas y tiempos adecuados capaces de promover la actividad enzimática.

Degradación de uno o más oligos plantilla adaptadores

Igual que en el ejemplo 1.

Amplificación lineal opcional del polinucleótido diana modificado

Igual que en el ejemplo 1.

Hibridación opcional de un segundo oligo plantilla adaptador a la primera cadena complementaria

Igual que en el ejemplo 1, excepto que el ATO es una mezcla molar igual de dos oligos monocatenarios (1-029 y 1-030).

Extensión opcional de la primera cadena complementaria mediante su uso como cebador con el segundo oligo plantilla adaptador como plantilla para formar la primera cadena complementaria modificada y ligación como en la etapa anterior de este ejemplo.

Igual que en el ejemplo 1 y anteriores.

Degradación de uno o más segundos oligos plantilla adaptadores

Igual que en el ejemplo 1.

Amplificación exponencial del segundo producto de extensión de la plantilla adaptadora mediante PCR Igual que en el ejemplo 1.

Resultados

Utilizando un ATO dividido en dos cadenas complementarias, podemos demostrar la correcta finalización de una biblioteca de secuenciación genómica de próxima generación, similar a la detallada en el ejemplo 1. Conclusión

Mediante la combinación de una primera reacción del ATO con ADNg fragmentado, un proceso de amplificación lineal para generar múltiples primeras cadenas complementarias, una segunda reacción del ATO utilizando el producto de amplificación lineal como polinucleótido diana, seguida de una amplificación global, hemos validado con éxito este enfoque tecnológico para su uso en la generación de bibliotecas de secuenciación.Ejemplo 12

Utilizando ácido desoxirribonucleico (ADN) como polinucleótido diana para producir una biblioteca de secuenciación de próxima generación de amplicones dirigidos (por ejemplo y sin limitación, compatible con los secuenciadores de próxima generación de Illumina) usando por ejemplo y sin limitación, uno o más oligos plantilla adaptadores específicos diana (ATO) con una horquilla (tallo-bucle), donde el bucle comprende un espaciador químico (por ejemplo y sin limitación, un espaciador C3, un espaciador C18), donde el extremo 3' del ATO comprende una secuencia específica diana. La secuencia específica diana 3' se utiliza para guiar la hibridación entre el polinucleótido diana y el ATO. El ATO puede comprender una secuencia aleatoria 3' habitual entre la secuencia específica diana 3' y la secuencia universal 5', como se describe en otros ejemplos, o puede comprender una secuencia aleatoria 3' corta, ya que esta secuencia aleatoria 3' puede funcionar únicamente como UID y no como plantilla para la hibridación, o puede no comprender ninguna secuencia aleatoria 3'. La secuencia universal 5' puede comprender la secuencia promotora de la ARN polimerasa.

Materiales

Polinucleótido diana, ADNg humano (BIO-35025)

Enzima fragmentadora de ADN, Kit KAPA Frag (Roche, 7962517001)

Oligos plantilla adaptadores (ATO), varios.

ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

Tampón de ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

ADN polimerasa I, Fragmento Grande (Klenow) (NEB, M0210L, M0212L)

Los dNTP (NEB, N0447s)

ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion® (NEB, M0530S)

Tampón Phusion (NEB, M0530S)

Enzima USER® (NEB, M5505S)

Sulfato de amonio (SIGMA, A4418)

Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, A63881)

Cebador 2-002, 2-003 (Tabla 2)

Método

Hibridación de un grupo de oligos plantilla adaptadores con ácidos desoxirribonucleicos

Igual que en el ejemplo 1, excepto que los ATO son un grupo de 200 ATO diferentes cuyos extremos 3' tienen secuencias específicas diana.

Extensión del ácido desoxirribonucleico diana mediante su uso como cebador con los uno o más oligos plantilla adaptadores como plantilla.

Igual que en el ejemplo 1. Dado que el extremo 3' del polinucleótido diana puede ser un saliente al hibridar con su ATO, la exonucleasa 3' de la ADN polimerasa recorta el saliente antes de que se produzca la extensión. Degradación de uno o más oligos plantilla adaptadores

Igual que en el ejemplo 1.

Primera amplificación exponencial del producto de extensión de la plantilla adaptadora mediante PCR Igual que en el ejemplo 1.

Segunda amplificación exponencial del primer producto de amplificación exponencial mediante PCR para la generación de una biblioteca de secuenciación final

Igual que en el ejemplo 1.

Resultados

Mediante el uso de un grupo de ATO con secuencias específicas diana 3', podemos demostrar la finalización exitosa de una biblioteca de secuenciación de próxima generación de amplicones dirigidos, similar a la detallada en el ejemplo 2.

Conclusión

Mediante la combinación de una primera reacción del ATO con ADNg fragmentado y un grupo de ATO, un proceso de dos rondas de amplificación específica diana, hemos validado con éxito este enfoque tecnológico para su uso en la generación de bibliotecas de secuenciación de próxima generación diana.

Ejemplo 13

Utilizando ácido desoxirribonucleico (ADN) como polinucleótido diana para producir una biblioteca de secuenciación de próxima generación de amplicones dirigidos (por ejemplo y sin limitación, compatible con los secuenciadores de próxima generación de Illumina) utilizando, por ejemplo y sin limitación, uno o más oligos plantilla adaptadores específicos diana con una horquilla (un tallo-bucle), donde el bucle comprende un espaciador químico (por ejemplo y sin limitación, un espaciador C3, un espaciador C18), en una sola ronda de PCR.

Materiales

Polinucleótido diana, ADNg humano (BIO-35025)

Enzima fragmentadora de ADN, Kit KAPA Frag (Roche, 7962517001)

Oligos plantilla adaptadores (ATO), 1-014, 1-015, 1-016, 1-017.

ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

Tampón de ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

ADN polimerasa I, Fragmento Grande (Klenow) (NEB, M0210L, M0212L)

Los dNTP (NEB, N0447s)

ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion® (NEB, M0530S)

Tampón Phusion (NEB, M0530S)

Enzima USER® (NEB, M5505S)

Cebador 2-003 (Tabla 2)

Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, A63881)

Sulfato de amonio (SIGMA, A4418)

Tinción en gel de ácido nucleico SYBR™ Green I (Invitrogen, S7563)

Grupo de cebadores específicos diana con la siguiente cola 5' AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T

Método

Hibridación de uno o más grupos de oligos plantilla adaptadores con ácidos desoxirribonucleicos

Igual que en el ejemplo 2, excepto que se utilizó un grupo de 50 nmoles de cada ATO de 1-014, 1-015, 1-016 y 1-017.

Extensión del polinucleótido diana mediante su uso como cebador con los uno o más oligos plantilla adaptadores como plantilla

Igual que en el ejemplo 2.

Degradación de uno o más oligos plantilla adaptadores

Igual que en el ejemplo 2.

Amplificación exponencial del producto de extensión lineal mediante PCR para la generación de una biblioteca de secuenciación final

El polinucleótido diana modificado y purificado se combina con un cebador universal con similitud de secuencia con, diseñado para unirse a, las una o más secuencias conservadas introducidas por los uno o más ATO, que contiene secuencias compatibles y necesarias con tecnologías de secuenciación de próxima generación (por ejemplo y sin limitación, secuencias adaptadoras P5 o P7, secuencias índice del paciente/muestra, secuencias de Illumina o secuencias personalizadas de lectura 1 o 2 para compatibilidad con los secuenciadores de próxima generación de Illumina), un grupo de cebadores diseñados para regiones diana de ADN cercanas al grupo de oligos ATO, que también se dirigen a regiones de ADN con mutaciones de interés y que también contienen secuencias compatibles y necesarias para la compatibilidad con las tecnologías de secuenciación de próxima generación (por ejemplo y sin limitación, secuencias adaptadoras P5 o P7, secuencias de índice de paciente/muestra, sitios de cebadores de secuenciación Illumina o de lectura 1 o 2 personalizadas, para compatibilidad con los secuenciadores de próxima generación de Illumina), una polimerasa de corrección de errores (por ejemplo, y sin limitación, la ADN polimerasa Phusion, Q5), uno o más tampones adecuados, dNTP adecuados y otros aditivos adecuados o necesarios (por ejemplo, y sin limitación, DMSO, betaína y sulfato de amonio). En este ejemplo, se combinaron 20 pl del polinucleótido diana modificado purificado, 25 pmoles de 2 003, un total de 100 pmoles de un grupo de cebadores específicos diana, 10 nmoles de cada dNTP (dATP/dTTP/dCTP/dGTP), 1 unidad de ADN polimerasa Phusion, 10 pl de tampón Phusion 5x, SYBRgreen 1x y 1 pmol de sulfato de amonio en un volumen final de 50 pl. La mezcla se termocicla para amplificar las regiones seleccionadas, en este ejemplo, 98 °C durante 1 minuto, 15 ciclos de 98 °C durante 5 segundos, 60 °C durante 5 minutos y 72 °C durante 30 segundos, seguidos de 72 °C durante 2 minutos. El producto de amplificación puede purificarse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, con perlas magnéticas, y será apto para secuenciación de próxima generación con una tecnología compatible.

Resultados

Utilizando una sola ronda de amplificación exponencial, en lugar de dos rondas como se muestra en el ejemplo 2, pudimos generar una biblioteca de secuenciación de próxima generación de amplicones diana.

Conclusión

Combinando una primera reacción del ATO con ADNg fragmentado, un proceso de una sola ronda de amplificación exponencial con un grupo de cebadores específicos diana y un cebador universal, validamos con éxito este enfoque tecnológico para su uso en la generación de bibliotecas de secuenciación basadas en amplicones diana específicos de cadena.

Ejemplo 14

Usando ácido ribonucleico (ARN) como polinucleótido diana para la producción de una biblioteca de secuenciación de próxima generación (por ejemplo y sin limitación, compatible con los secuenciadores de próxima generación de Illumina) utilizando, por ejemplo y sin limitación, uno o más oligos plantilla adaptadores con una horquilla.

Materiales

Oligos plantilla adaptadores (ATO), 1-014, 1-015, 1-016, 1-017, 1-018.

ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

Tampón de ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

ADN polimerasa I, Fragmento Grande (Klenow) (NEB, M0210L, M0212L)

Los dNTP (NEB, N0447s)

ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion® (NEB, M0530S)

Tampón Phusion (NEB, M0530S)

Enzima USER® (NEB, M5505S)

Transcriptasa inversa de AMV (NEB, M0277S)

Fosfatasa antártica (NEB, M0289S)

Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, A63881)

Cebador 2-001, 2-002, 2-003 (Tabla 2)

Método

Hibridación de uno o más oligos plantilla adaptadores con ácidos ribonucleicos

Igual que en el ejemplo 1, excepto que se utilizaron 25 ng de ARN mensajero fragmentado como polinucleótido diana.

Extensión del ácido ribonucleico diana mediante su uso como cebador con los uno o más oligos plantilla adaptadores como plantilla

Igual que en el ejemplo 1, asegurándose además de que las ADN polimerasas seleccionadas sean capaces de utilizar un cebador de ARN y 5 unidades adicionales opcionales de fosfatasa antártica.

Degradación de uno o más oligos plantilla adaptadores

Igual que en el ejemplo 1, asegurándose además de que las etapas de digestión/eliminación no degraden el ARN de forma inespecífica.

Extensión en un solo paso o amplificación lineal de un polinucleótido diana modificado mediante transcriptasa inversa

El polinucleótido diana modificado, purificado o no, se combina con un cebador complementario a la secuencia conservada (universal) presente ahora en el extremo 3' de las moléculas de ARN diana, una transcriptasa inversa (por ejemplo y sin limitación, M-MuLV o transcriptasa inversa de AMV), uno o más tampones adecuados y dNTP adecuados. En este ejemplo, el polinucleótido diana modificado y purificado se mezcla con 50 nmoles de 2-001, 10 unidades de transcriptasa inversa de AMV, 2 pl de tampón de AMV 10x, 10 nmoles de cada dNTP (dATP/dTTP/dCTP/dGTP). La mezcla se incuba luego para producir ADNc (primera CS), en este ejemplo a 42 °C durante 30 minutos. El producto de transcripción inversa o producto de amplificación lineal puede purificarse luego mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, mediante perlas magnéticas.

Hibridación de uno o más segundos oligos plantilla adaptadores con la primera cadena complementaria. Igual que en el ejemplo 1.

Extensión de la primera cadena complementaria mediante su uso como cebador con el segundo oligo plantilla adaptadora como plantilla para formar la primera cadena complementaria modificada.

Igual que en el ejemplo 1.

Degradación de uno o más segundos oligos plantilla adaptadores

Igual que en el ejemplo 1.

Amplificación exponencial del producto de extensión de plantilla del segundo adaptador mediante PCR. Igual que en el ejemplo 1.

Resultados

Utilizando ARN como polinucleótido diana y un método similar al del ejemplo 1, hemos podido generar una biblioteca de secuenciación de ARN que contiene UID para evaluar la duplicación de lecturas, la detección de mutaciones de baja frecuencia y para mejorar el recuento de moléculas para una cuantificación más precisa. Conclusión

Mediante la combinación de una primera reacción del ATO con ARN mensajero fragmentado, un proceso de amplificación lineal con transcriptasa inversa para generar múltiples primeras cadenas complementarias, una segunda reacción del ATO con las primeras cadenas complementarias como polinucleótido diana, seguida de una amplificación global, hemos validado con éxito este enfoque tecnológico para su uso en la generación de bibliotecas de secuenciación de ARN.

Ejemplo 15

Usando ácido desoxirribonucleico (ADN) como polinucleótido diana para la producción de una biblioteca de secuenciación de próxima generación (por ejemplo y sin limitación, compatible con los secuenciadores de próxima generación de Illumina), utilizando, por ejemplo y sin limitación, uno o más oligos plantilla adaptadores de ARN con una horquilla producida mediante un espaciador químico (por ejemplo y sin limitación, un espaciador C3, un espaciador C18).

Materiales

Polinucleótido diana, ADNg humano (BIO-35025)

Enzima de fragmentación de ADN, Kit KAPA Frag (Roche, 7962517001)

Oligonucleótidos plantilla adaptadores (ATO), 1-031, 1-032.

Los dNTP (NEB, N0447s)

A D N p o lim e ra sa de a lta fide lid ad P h u s io n ® (N E B , M 0530 S )

Tampón Phusion (NEB, M0530S)

Enzima USER® (NEB, M5505S)

Cebadores 2-001, 2-002, 2-003 (Tabla 2)

Transcriptasa inversa de AMV (NEB, M0277S)

RNasa H (NEB, M0297S)

Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, A63881)

Método

Hibridación de un oligo plantilla adaptador con ácidos desoxirribonucleicos

Igual que en el ejemplo 1, excepto que se utilizan 200 pmoles de un ATO de ARN, 1-031.

Extensión del ácido desoxirribonucleico diana mediante su uso como cebador con los uno o más oligos plantilla adaptadores de ARN como plantilla

Igual que en el ejemplo 1, excepto que se utilizaron 10 unidades de transcriptasa inversa de AMV y 2 pl de tampón de AMV 10x, con una temperatura de extensión de 42 °C durante 30 minutos.

Degradación del oligonucleótido plantilla adaptador

Los oligonucleótidos plantilla adaptadores se degradan selectivamente mediante la adición de una RNasa (por ejemplo, y sin limitación, RNasa H, RNasa HII, RNasa A, RNasa T1), seguida de una incubación a 37 °C durante 30 minutos, u otras temperaturas o tiempos adecuados que provoquen la degradación de los uno o más ATO de ARN, en este ejemplo, se mezclaron 10 unidades de RNasa H con los 20 polinucleótidos diana modificados y se incubaron a 37 °C durante 30 minutos y se inactivaron mediante incubación a 65 °C durante 20 minutos. Los uno o más ATO degradados pueden eliminarse opcionalmente mediante cualquier método de purificación adecuado.

Amplificación lineal de un polinucleótido diana modificado

Igual que en el ejemplo 1.

Hibridación de un segundo oligo plantilla adaptador con la primera cadena complementaria

Igual que en el ejemplo 1, excepto que se utilizan 200 pmoles de un ATO de ARN (1-032).

Extensión de la primera cadena complementaria mediante su uso como cebador con el segundo oligo plantilla adaptador como plantilla para formar la primera cadena complementaria modificada.

Igual que en el ejemplo 1, excepto que se utilizaron 10 unidades de transcriptasa inversa de AMV y 2 pl de tampón de AMV 10x, con una temperatura de extensión de 42 °C durante 30 minutos.

Degradación de uno o más segundos oligo plantilla adaptadores

Como en la etapa anterior de 'degradación del oligo plantilla adaptador'.

Amplificación exponencial del producto de extensión de la segunda plantilla adaptadora mediante PCR Igual que en el ejemplo 1.

Resultados

Utilizando un ATO de ARN y un método similar al del ejemplo 1, hemos generado una biblioteca de secuenciación que contiene UID para evaluar la duplicación de lecturas y la detección de mutaciones de baja frecuencia.

Conclusión

Mediante la combinación de una primera reacción del ATO con un ATO de ARN y ADNg fragmentado, un proceso de amplificación lineal para generar múltiples primeras cadenas complementarias, una segunda reacción del ATO usando un segundo ATO de ARN el producto de amplificación lineal como polinucleótido diana, seguido de una amplificación global, hemos validado con éxito este enfoque tecnológico para su uso en la generación de bibliotecas de secuenciación.

Ejemplo 16

Utilizando ácido ribonucleico (ARN) como polinucleótido diana para la determinación de un sitio de inicio de la transcripción, utilizando, por ejemplo y sin limitación, uno o más oligo plantilla adaptadores con una horquilla producida mediante un espaciador químico (por ejemplo y sin limitación, un espaciador C3, un espaciador C18). Materiales

Oligos plantilla adaptadores (ATO), 1-014.

ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

Tampón de ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

ADN polimerasa I, Fragmento Grande (Klenow) (NEB, M0210L, M0212L)

Los dNTP (NEB, N0447s)

ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion® (NEB, M0530S)

Tampón Phusion (NEB, M0530S)

Enzima USER® (NEB, M5505S)

Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, A63881)

Cebadores, 2-003 (Tabla 2)

Transcriptasa inversa de AMV (NEB, M0277S)

Método

Transcripción inversa específica diana para producir ADNc

Una cantidad adecuada de ácido ribonucleico (ARN), ya sea fragmentado o sin fragmentar, de cualquier longitud, se mezcla con una cantidad adecuada de uno o más cebadores específicos de genes dirigidos a una región de ARN (por ejemplo y sin limitación, ARN mensajero, microARN, ARN ribosómico o ARN no codificante) cuyo sitio de inicio de transcripción es indeterminado, en un tampón adecuado. En este ejemplo, se combinaron 100 ng de ARNm con 10 pmoles de cebador específico diana, 10 unidades de transcriptasa inversa de AMV, 2 ul de tampón de AMV 10x y 10 nmoles de cada dNTP (dATP/dTTP/dCTP/dGTP), en un volumen final de 20 ul. La mezcla se calienta a una temperatura adecuada, en este ejemplo 65 °C, durante un tiempo adecuado, en este ejemplo 2 minutos, u otras temperaturas o tiempos que puedan provocar la desnaturalización de ácidos nucleicos bicatenarios en monocatenarios. Los ácidos nucleicos y el cebador específico diana se enfrían posteriormente a, en este ejemplo, 25 °C durante 5 minutos, u otras temperaturas o tiempos adecuados capaces de promover la hibridación y la transcripción inversa entre los ácidos nucleicos y uno o más cebadores específicos del gen. A continuación, la mezcla se incuba para producir ADNc, en este ejemplo a 42 °C durante 30 minutos. El ADNc puede purificarse posteriormente mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, utilizando perlas magnéticas.

Hibridación de un oligo plantilla adaptador a ADNc

Igual que en el ejemplo 1.

Extensión de ADNc mediante su uso como cebador con los uno o más oligos plantilla adaptadores como plantilla

Igual que en el ejemplo 1.

Degradación de uno o más oligos plantilla adaptadores

Igual que en el ejemplo 1.

Amplificación exponencial del producto de extensión del ácido desoxirribonucleico complementario diana mediante PCR para la generación de una biblioteca de secuenciación final

El ADNc modificado se combina con un cebador universal complementario a la secuencia conservada introducida por uno o más ATO, un segundo cebador diseñado para dirigirse a una región de ARNm cercana al cebador específico del gen inicial, una ADN polimerasa (por ejemplo y sin limitación, ADN polimerasa Taq o Phusion), uno o más tampones adecuados, dNTP adecuados y otros aditivos adecuados o necesarios (por ejemplo y sin limitación, DMSO, betaína y sulfato de amonio). En este ejemplo, se utilizan 5 ul de ADNc, 10 pmoles de 2-003, 10 pmoles de un cebador específico diana, 2 unidades de ADN polimerasa Phusion, 10 ul de tampón de ADN polimerasa Phusion 5x y 10 nmoles de cada dNTP (dATP/dTTP/dCTP/dGTP) en un volumen final de 50 ul. A continuación, la mezcla se termocicla para amplificar exponencialmente el producto de extensión del ácido nucleico diana, en este ejemplo, 98 °C durante 30 segundos, 25 ciclos de 98 °C durante 5 segundos, 60 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 1 minuto, seguidos de 72 °C durante 2 minutos. El producto de amplificación puede purificarse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, con perlas magnéticas. El producto purificado puede utilizarse posteriormente en procesos de desarrollo, tal como la electroforesis en gel para identificar productos principales, la clonación y secuenciación, o directamente en sistemas de clonación compatibles y la secuenciación tras las transformaciones y la selección de colonias.

Amplificación exponencial del producto de extensión del ácido desoxirribonucleico complementario diana mediante PCR para la generación de una biblioteca de secuenciación final

Esto puede realizarse junto con, o en vez de la etapa anterior. El método es como en la etapa anterior, excepto que el cebador específico diana requiere una cola 5' que contiene secuencias compatibles y necesarias con las tecnologías de secuenciación de próxima generación (por ejemplo, y sin limitación, secuencias adaptadoras P5 o P7, secuencias de índice de paciente/muestra, secuencias de Illumina o de lectura 1 o 2 personalizadas para compatibilidad con los secuenciadores de próxima generación de Illumina). El producto de amplificación puede purificarse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, mediante perlas magnéticas, y será apto para la secuenciación de próxima generación con una tecnología compatible.

Resultados

Utilizando un cebador específico para un gen, se generó con éxito ADNc que se utilizó como plantilla para una reacción del ATO, cuyo producto, cuando se usa con dos cebadores adicionales, generó una biblioteca secuenciable en un equipo Illumina, cuyos resultados revelaron el sitio de inicio de la transcripción del transcrito seleccionado.

Conclusión

Logramos adaptar esta tecnología para identificar el sitio de inicio de la transcripción de un gen seleccionado combinando la producción de ADNc específico para el gen con un cebador cerca del extremo 5' del ARNm. Dado que solo se necesita un pequeño número de lecturas para identificar todos los posibles sitios de inicio de la transcripción, no es necesaria una secuenciación completa, incluso en equipos con un rendimiento reducido. El enfoque para generar un producto compatible con la secuenciación de próxima generación se utiliza mejor como una pequeña adición a otra biblioteca donde se requiere una mayor profundidad, o como una multiplexación de un gran número de cebadores específicos del gen para identificar diversos sitios de inicio de la transcripción.

Ejemplo 17

Utilizando una mezcla de ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN) como polinucleótidos diana para producir una biblioteca combinada de secuenciación de próxima generación de<a>D<n>y ARN (por ejemplo y sin limitación, compatible con los secuenciadores de próxima generación de Illumina), utilizando, por ejemplo y sin limitación, uno o más oligos plantilla adaptadores con una horquilla producida mediante un espaciador químico (por ejemplo y sin limitación, un espaciador C3, un espaciador C18).

Materiales

Polinucleótido diana, ADNg humano (BIO-35025)

Enzima fragmentadora de ADN, Kit KAPA Frag (Roche, 7962517001)

Oligos plantilla adaptadores (ATO), 1-014, 1-015, 1-016, 1-017, 1-018 (Tabla 1)

ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

Tampón de ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

ADN polimerasa I, Fragmento Grande (Klenow) (NEB, M0210L, M0212L)

Los dNTP (NEB, N0447s)

ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion® (NEB, M0530S)

Tampón Phusion (NEB, M0530S)

Enzima USER® (NEB, M5505S)

Cebadores 2-001, 2-002, 2-003 (Tabla 2)

Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, A63881)

Sulfato de amonio (SIGMA, A4418)

Transcriptasa inversa de AMV (NEB, M0277S)

Método

Hibridación de uno o más oligonucleótidos plantilla adaptadores con ácidos nucleicos

Igual que en el ejemplo 1, excepto que el polinucleótido diana es una mezcla de ARN y ADN.

Extensión del ácido nucleico diana mediante su uso como cebador con los uno o más oligos plantilla adaptadores como plantilla

Igual que en el ejemplo 1, con la adición de asegurar que las polimerasas puedan usar un cebador de ARN. Degradación de uno o más oligos plantilla adaptadores

Igual que en el ejemplo 1.

Extensión en un paso o amplificación lineal del producto de extensión de la plantilla adaptadora

Igual que en el ejemplo 1, con la adición de 10 unidades de transcriptasa inversa de AMV.

Hibridación de uno o más segundos oligos plantilla adaptadores para la formación de la primera cadena complementaria

Igual que en el ejemplo 1.

Extensión de la primera cadena complementaria mediante su uso como cebador con el segundo oligo plantilla adaptador como plantilla para la formación de la primera cadena complementaria modificada

Igual que en el ejemplo 1.

Degradación de uno o más segundos oligos plantilla adaptadores

Igual que en el ejemplo 1.

Amplificación exponencial del segundo producto de extensión de la plantilla adaptadora mediante PCR Igual que en el ejemplo 1.

Resultados

Utilizando un método similar al del ejemplo 1, logramos combinar ARN y ADN para producir una biblioteca de secuenciación de próxima generación que incluye UID, adecuada para la eliminación de duplicados de PCR y la corrección de errores para la identificación de mutaciones de baja frecuencia.

Conclusión

La posibilidad de combinar ADN y ARN para generar una biblioteca de secuenciación mixta ofrece numerosas aplicaciones potenciales, especialmente dada la naturaleza inherente de la tecnología para incluir UID para todos los polinucleótidos diana. Por ejemplo, la secuenciación tanto del ARN como del ADN podría permitir un análisis comparativo de mutaciones.

Ejemplo 18

Utilización de una mezcla de ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN) como polinucleótidos diana para producir una biblioteca combinada de secuenciación de próxima generación de ADN y ARN (por ejemplo y sin limitación, compatible con los secuenciadores de próxima generación de Illumina), utilizando, por ejemplo y sin limitación, múltiples oligos plantilla adaptadores con una horquilla producida con dos regiones cortas de complementariedad parcial o completa, separadas por una secuencia aleatoria, específicamente diseñada o elegida, que asignan diferentes identidades únicas a las moléculas de ARN y ADN para su separación tras la secuenciación.

Materiales

Polinucleótido diana, ADNg humano (BIO-35025)

Enzima fragmentadora de ADN, Kit KAPA Frag (Roche, 7962517001)

A D N P o lim e ra sa I, F ra g m e n to G rand e (K le n o w ) (N E B , M 0210L , M 0212 L )

O lig os p lan tilla a d a p ta d o re s (A T O ), 1-013, 1-033, 1 -036 (T ab la 1)

Los dNTP (NEB, N0447s)

ADN Polimerasa de Alta Fidelidad Phusion® (NEB, M0530S)

Tampón Phusion (NEB, M0530S)

ADN Polimerasa Deep VentR™ (NEB, M0258S)

ADN Polimerasa Tth (SIGMA, 000000011480022001)

Enzima USER® (NEB, M5505S)

Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, A63881)

Cebadores 2-002,2-003 (Tabla 2)

Sulfato de amonio (SIGMA, A4418)

Transcriptasa inversa de AMV (NEB, M0277S)

Método

Hibridación de un oligo plantilla adaptador con ácidos nucleicos

Igual que en el ejemplo 1, excepto que se utiliza ATO 1-033.

Extensión específica de la extensión del ácido desoxirribonucleico diana, pero no del ácido ribonucleico, mediante su uso como cebador con el oligo plantilla adaptador

Una cantidad adecuada de una o más ADN polimerasas, capaz de utilizar un cebador de ADN, pero no uno de ARN, con o sin corrección de errores (por ejemplo, y sin limitación, ADN polimerasa Deep VentR™, ADN polimerasa Taq LongAmp® Hot Start o una ADN polimerasa OneTaq® Hot Start), mezclada con uno o más tampones adecuados y dNTP adecuados, se combina con la mezcla de ATO de ADN/ARN. En este ejemplo, se combinan un total de 2 unidades de ADN polimerasa Deep VentR, 2 pl de tampón de ADN polimerasa Deep VentR 10x, y 10 nmoles de cada dNTP (dATP/dTTP/dCTP/dGTP) con la mezcla de ATO de ADN hasta un volumen final de 20 pl. Para promover aún más la hibridación del ácido nucleico diana y uno o más ATO en presencia de una o más ADN polimerasas y uno o más tampones, en este ejemplo, la mezcla se incuba a menos de 25 °C durante 30 minutos, o a otras temperaturas o tiempos adecuados capaces de promover la hibridación entre los ácidos nucleicos y uno o más ATO. Para iniciar la extensión de los polinucleótidos diana utilizando la secuencia del ATO como plantilla, en este ejemplo, la temperatura de incubación se aumenta a 37 °C durante 30 minutos, o a otras temperaturas adecuadas capaces de promover la actividad de la ADN polimerasa. El producto es un polinucleótido diana modificado.

Generación de un polinucleótido diana modificado bicatenario

Igual que en el ejemplo 5.

Degradación de uno o más oligos plantilla adaptadores

Igual que en el ejemplo 1.

Hibridación de uno o más segundos oligos plantilla adaptadores con ácidos nucleicos

Igual que en el ejemplo 1, excepto que se utiliza ATO 1-036.

Extensión de la extensión del ácido ribonucleico diana, mediante su uso como cebador con el oligo plantilla adaptador como plantilla

Se combina una cantidad adecuada de una o más ADN polimerasas, capaz de utilizar uno o más cebadores de ARN, con o sin corrección de errores (por ejemplo y sin limitación, ADN Polimerasa I deE. coli),mezclada con uno o más tampones adecuados, y dNTP adecuados se combina con la mezcla de uno o más ATO ADN/ARN. En este ejemplo, se combina un total de 2.5 unidades de Klenow, 2 pl de tampón de Klenow 10x y 10 nmoles de cada dNTP (dATP/dTTP/dCTP/dGTP) con la mezcla de ATO de ADN hasta alcanzar un volumen final de 20 pl. Para promover aún más la hibridación del ácido nucleico diana y uno o más ATO en presencia de uno o más ADN polimerasas y uno o más tampones, en este ejemplo, la mezcla se incuba por debajo de 25 °C durante 30 minutos, o a otras temperaturas o tiempos adecuados capaces de promover la hibridación entre los ácidos nucleicos y uno o más ATO. Para iniciar la extensión de los polinucleótidos diana utilizando la secuencia del ATO como plantilla, en este ejemplo, la temperatura de incubación se aumenta a 37 °C durante 30 minutos, o a otras temperaturas adecuadas capaces de promover la actividad de la ADN polimerasa. El producto es un polinucleótido diana modificado.

Generación de un producto de extensión de ácido ribonucleico diana bicatenario

Igual que en el ejemplo 5, excepto que se añaden 10 unidades de transcriptasa inversa de AMV como polimerasa.

Degradación de uno o más oligos plantilla adaptadores y degradación de horquilla

Igual que en el ejemplo 5.

Extensión en un paso o amplificación lineal de uno o más productos de extensión de ácidos desoxirribonucleico y ribonucleico diana bicatenarios.

Igual que en el ejemplo 1, excepto que se utilizan 2.5 unidades de ADN polimerasa Tth y tampón de ADN polimerasa Tth, con una temperatura de extensión de 70 °C.

Hibridación de un tercer oligo plantilla adaptador con la extensión o uno o más productos amplificados lineales. Igual que en el ejemplo 1, excepto que se utiliza ATO 1-022.

Extensión del producto de extensión lineal mediante su uso como cebador con los uno o más terceros oligos plantilla adaptadores como plantilla para formar un segundo producto de extensión de plantilla adaptadora. Igual que en el ejemplo 1.

Degradación de uno o más terceros oligos plantilla adaptadores.

Igual que en el ejemplo 1.

Amplificación exponencial del segundo producto de extensión de plantilla adaptadora mediante PCR.

Igual que en el ejemplo 1.

Resultados

Utilizando un método similar al del ejemplo 1, logramos combinar ARN y ADN para producir una biblioteca de secuenciación de próxima generación que incluye UID, adecuada para eliminar duplicados de PCR y corregir errores para la identificación de mutaciones de baja frecuencia.

Conclusión

La posibilidad de combinar ADN y ARN para generar una biblioteca de secuenciación mixta, junto con la capacidad de separar durante el análisis bioinformático las lecturas que se originan con un polinucleótido diana de ADN y aquellas que se originan con un polinucleótido diana de ARN, permite una gran variedad de aplicaciones potenciales, especialmente dada la naturaleza inherente de la tecnología de incluir UID para todos los polinucleótidos diana. Por ejemplo, la secuenciación de ARN y ADN podría permitir el análisis comparativo de mutaciones. También es posible utilizar diferentes adaptadores para el ATO de ADN y ARN, de modo que puedan amplificarse de forma distinta para aumentar el número de copias de ADN en la biblioteca de secuenciación final.

Ejemplo 19

Utilización de ácido desoxirribonucleico (ADN) como polinucleótido diana para producir una plantilla adecuada para la amplificación por círculo rodante mediante uno o más oligos plantilla adaptadores con una horquilla (por ejemplo, y sin limitación, producidos con dos regiones cortas de complementariedad parcial o completa separadas por una secuencia aleatoria, específicamente diseñada o específicamente elegida) y un adaptador bicatenario unido con una horquilla.

Materiales

Polinucleótido diana, ADNg humano (BIO-35025)

Enzima fragmentadora de ADN, Kit KAPA Frag (Roche, 7962517001)

ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

Tampón de ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

A D N po lim e rasa I, F ragm e n to G ra n d e (K le n o w ) (N E B , M 0210L , M 0212 L )

O lig os p lan tilla ad a p ta d o re s (A TO ), 1-013 (T ab la 1)

Los dNTP (NEB, N0447s)

ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion® (NEB, M0530S)

Tampón Phusion (NEB, M0530S)

Enzima USER® (NEB, M5505S)

ADN ligasa T4 (NEB, M0202S)

Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, A63881)

Método

Hibridación de uno o más oligos plantilla adaptadores con ácidos desoxirribonucleicos

Igual que en el ejemplo 1.

Extensión del ácido desoxirribonucleico diana mediante su uso como cebador con los uno o más oligos plantilla adaptadores como plantilla

Igual que en el ejemplo 1.

Generación de un producto de extensión de ácido desoxirribonucleico diana bicatenario

Igual que en el ejemplo 5.

Degradación de uno o más oligos plantilla adaptadores

Igual que en el ejemplo 1.

Hibridación y ligadura de uno o más adaptadores bicatenarios con el extremo del producto de extensión de ácido desoxirribonucleico diana bicatenario

Igual que en el ejemplo 5, con la adición de que el adaptador forma una horquilla.

Resultados

Utilizando una combinación de un ATO que puede formar una horquilla y un adaptador con una horquilla, hemos producido con éxito un polinucleótido diana modificado circular.

Conclusión

La capacidad de generar un polinucleótido diana circulante permite la amplificación por círculo rodante, lo que permite la generación de productos muy largos, necesarios para ciertos procesos posteriores.

Ejemplo 20

Utilizando ácido desoxirribonucleico (ADN) como polinucleótido diana para producir una plantilla adecuada para la amplificación por círculo rodante mediante uno o más oligos plantilla adaptadores con una horquilla producida mediante un espaciador químico (por ejemplo, y sin limitación, un espaciador C3, un espaciador C18), se deben utilizar al menos dos oligos plantilla adaptadores que contengan regiones complementarias que puedan hibridarse, produciendo ADN bicatenario corto con un extremo 3' expuesto para permitir la extensión.

Materiales

Polinucleótido diana, ADNg humano (BIO-35025)

Enzima fragmentadora de ADN, Kit KAPA Frag (Roche, 7962517001)

ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

Tampón de ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

ADN polimerasa I, Fragmento Grande (Klenow) (NEB, M0210L, M0212L)

Oligos plantilla adaptadores (ATO), 1-034, 1-035 (Tabla 1)

Los dNTP (NEB, N0447s)

ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion® (NEB, M0530S)

Tampón Phusion (NEB, M0530S)

Enzima USER® (NEB, M5505S)

Método

Hibridación de uno o más oligos plantilla adaptadores a ácidos desoxirribonucleicos

Igual que en el ejemplo 1, con la adición del ATO

Extensión del ácido desoxirribonucleico diana mediante su uso como cebador con los uno o más oligos plantilla adaptadores como plantilla.

Igual que en el ejemplo 1.

Degradación de uno o más oligos plantilla adaptadores

Igual que en el ejemplo 1.

Extensión en un paso o amplificación lineal del polinucleótido diana modificado

Igual que en el ejemplo 1.

Hibridación de uno o más segundos oligos plantilla adaptadores con la primera cadena complementaria Igual que en el ejemplo uno, con la adición del uso del ATO

Extensión de la primera cadena complementaria mediante su uso como cebador con los uno o más segundos oligos plantilla adaptadores como plantilla para formar la primera cadena complementaria modificada Igual que en el ejemplo 1.

Degradación de uno o más segundos oligos adaptadores plantilla

Igual que en el ejemplo 1.

Autohibridación del segundo producto de extensión para generar una región bicatenaria de ADN cuyo extremo 3' actuará como cebador

El producto de extensión purificado se calienta en un tampón adecuado, a una temperatura adecuada, en este ejemplo, 95 °C, durante un tiempo adecuado, en este ejemplo, 2 minutos, u otras temperaturas o tiempos que puedan provocar la desnaturalización de los ácidos nucleicos bicatenarios en monocatenarios. Posteriormente, los productos de extensión se enfrían, en este ejemplo, a 25 °C durante 2 minutos, u otras temperaturas o tiempos adecuados, capaces de promover la hibridación entre las regiones de complementariedad presentes en los dos extremos de los productos de extensión. Las moléculas de ADN, ahora circulares, pueden utilizarse como plantilla para la amplificación por círculo rodante del ADN circular.

Resultados

De forma similar al ejemplo 19, hemos producido con éxito un producto circular cuyo extremo 3' puede funcionar como sitio de cebado para una posterior amplificación por círculo rodante.

Conclusión

La capacidad de generar un polinucleótido diana circular permite la amplificación por círculo rodante, lo que permite la generación de productos muy largos, necesarios para ciertos procesos posteriores. La falta de necesidad de un cebador adicional significa que se puede evitar la competencia con la autohibridación del ADN circular.

Ejemplo 21

Utilización de productos de PCR como polinucleótido diana para la producción de una biblioteca de secuenciación de próxima generación de alta diversidad de un solo (múltiples) amplicones (por ejemplo y sin limitación, compatible con los secuenciadores de próxima generación de Illumina) utilizando, por ejemplo y sin limitación, uno o más oligos plantilla adaptadores con una horquilla producida mediante un espaciador químico (por ejemplo y sin limitación, un espaciador C3, un espaciador C18).

Materiales

O lig os p lan tilla a d a p ta d o re s (A T O ), 1-014 (T ab la 1)

ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

Tampón de ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

ADN polimerasa I, Fragmento Grande (Klenow) (NEB, M0210L, M0212L)

Los dNTP (NEB, N0447s)

ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion® (NEB, M0530S)

Tampón Phusion (NEB, M0530S)

Enzima USER® (NEB, M5505S)

Cebadores 2-003 (Tabla 2)

Sulfato de amonio (SIGMA, A4418)

Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, A63881)

Método

Hibridación de uno o más oligos plantilla adaptadores con productos de PCR

Igual que en el ejemplo 1, excepto que el polinucleótido diana es un producto de PCR.

Extensión de productos de PCR diana mediante su uso como cebador con uno o más oligos plantilla adaptadores como plantilla

Igual que en el ejemplo 1.

Degradación de uno o más oligos plantilla adaptadores

Igual que en el ejemplo 1.

Amplificación exponencial del producto de extensión lineal mediante PCR para generar una biblioteca de secuenciación final

Igual que en el ejemplo 1, excepto que se reemplaza uno de los cebadores universales por un cebador específico diana con una cola 5' que contiene secuencias compatibles y necesarias con las tecnologías de secuenciación de próxima generación (por ejemplo, y sin limitación, secuencias adaptadoras P5 o P7, secuencias de índice de paciente/muestra, secuencias de Illumina o de lectura 1 o 2 personalizadas para compatibilidad con los secuenciadores de próxima generación de Illumina).

Resultados

Con un método similar al del ejemplo uno, hemos producido con éxito una biblioteca de secuenciación de próxima generación utilizando un único amplicón de PCR como polinucleótido diana.

Conclusión

La posibilidad de utilizar un amplicón de PCR directamente en la biblioteca, combinada con el cebado aleatorio que se observa al utilizar un ATO, nos permite generar una biblioteca de secuenciación de alta diversidad a partir de un único amplicón o de un grupo de amplicones muy similares. Esto será útil en muestras ambientales donde se utilizan grandes cantidades de amplicones muy similares.

Ejemplo 22

Utilización de ácido desoxirribonucleico (ADN) como polinucleótido diana para producir dos bibliotecas de secuenciación de próxima generación de amplicones diana (por ejemplo, y sin limitación, compatibles con los secuenciadores de próxima generación de Illumina).

Materiales

Polinucleótido diana, ADNg humano (BIO-35025)

Enzima fragmentadora de ADN, Kit KAPA Frag (Roche, 7962517001)

Oligos plantilla adaptadores (ATO), 1-006 (Tabla 1)

ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

Tampón de ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

ADN polimerasa I, Fragmento grande (Klenow) (NEB, M0210L, M0212L)

Los dNTP (NEB, N0447s)

ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion® (NEB, M0530S)

Tampón Phusion (NEB, M0530S)

Enzima USER® (NEB, M5505S)

Cebadores, 2-0042-005 (Tabla 2)

Sulfato de amonio (SIGMA, A4418)

Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, A63881)

Método

Hibridación de uno o más oligos plantilla adaptadores con ácidos desoxirribonucleicos

Igual que en el ejemplo 1.

Extensión de ácido desoxirribonucleico diana mediante su uso como cebador con uno o más oligos plantilla adaptadores como plantilla

Igual que en el ejemplo 1.

Degradación de uno o más oligos plantilla adaptadores

Igual que en el ejemplo 1.

Primera amplificación exponencial del producto de extensión de plantilla adaptadora mediante PCR con dos grupos diferentes de cebadores específicos diana

Al igual que en el ejemplo 2, con la diferencia de que el polinucleótido diana modificado se divide en dos alícuotas iguales, lo que resulta en una reducción de la sensibilidad, ya que el número de copias del polinucleótido diana se reduce aproximadamente un 50 % en cada reacción posterior, cada alícuota se combina con un cebador universal complementario a la secuencia conservada originalmente en los uno o más ATO y ahora presente en los extremos 3' de las moléculas de ADN diana modificadas, uno de dos grupos de cebadores diferentes (en adelante, denominados 'Grupo1a' y 'Grupo2a', los cebadores Grupo1 están diseñados para dirigirse a una cadena de ADN de las regiones diana que contiene cambios de interés, mientras que Grupo2 está diseñado para dirigirse a la cadena complementaria de las regiones diana.

Segunda amplificación exponencial del primer producto de amplificación exponencial mediante PCR

Al igual que en el ejemplo 2, con la excepción de que se utilizan dos grupos separados de cebadores anidados, se diseñó un grupo de cebadores anidados (Grupo1b o Grupo2b) para dirigirse a regiones de ADN relativas al primer grupo de cebadores (Grupo1a o Grupo2a), que también se dirige a regiones de ADN que contienen mutaciones de interés y que además contiene secuencias compatibles y necesarias para la compatibilidad con las tecnologías de secuenciación de próxima generación (por ejemplo, y sin limitación, secuencias adaptadoras P5 o P7, secuencias de índice de paciente/muestra, sitios de cebadores de secuenciación de Illumina o lecturas 1 o 2 personalizadas, para la compatibilidad con los secuenciadores de próxima generación de Illumina). Resultados

Hemos aplicado con éxito el método del ejemplo 2 a dos grupos separados de cebadores, donde cada grupo de cebadores se dirige a una sola cadena, la directa o la inversa. Hemos podido demostrar que todos los cebadores del grupo son capaces de amplificar sus dianas con eficiencia variable, y al generar familias de códigos de barras, se observa una eficiencia constante en todas las dianas.

Conclusión

Si acepta la reducción de la eficiencia máxima al dividir el polinucleótido diana de entrada en dos grupos de análisis separados, puede analizar ambas cadenas del polinucleótido diana de forma independiente, lo que le permite comparar las mutaciones identificadas en ambas cadenas para un mayor nivel de corrección de errores y la confianza de que una mutación es correcta, ya que puede detectar su presencia en ambos grupos de cebadores, lo que reduce en gran medida la probabilidad de que una mutación encontrada en ambos grupos sea un error de cualquier tipo.

Ejemplo 23

Utilizando ácido desoxirribonucleico (ADN) como polinucleótido diana para producir dos bibliotecas de secuenciación de próxima generación de amplicones dirigidos (por ejemplo, y sin limitación, compatibles con los secuenciadores de próxima generación de Illumina), reduciendo considerablemente la posible pérdida de sensibilidad.

Materiales

Polinucleótido diana, ADNg humano (BIO-35025)

Enzima fragmentadora de ADN, kit KAPA Frag (Roche, 7962517001)

Oligos plantilla adaptadores (ATO), 1-006 (Tabla 1)

ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

Tampón de ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

ADN polimerasa I, Fragmento Grande (Klenow) (NEB, M0210L, M0212L)

Los dNTP (NEB, N0447s)

Phusion® ADN polimerasa de alta fidelidad (NEB, M0530S)

Tampón Phusion (NEB, M0530S)

Enzima USER® (NEB, M5505S)

Cebadores 2-004, 2-005 (Tabla 2)

Sulfato de amonio (SIGMA, A4418)

Agencourt AMPureXP (Beckman Coulter, A63881)

Método

Hibridación de uno o más oligos plantilla adaptadores con ácidos desoxirribonucleicos

Igual que en el ejemplo 1.

Extensión del ácido desoxirribonucleico diana mediante su uso como cebador con uno o más oligos plantilla adaptadores como plantilla

Igual que en el ejemplo 1.

Degradación de uno o más oligos plantilla adaptadores

Igual que en el ejemplo 1.

Amplificación lineal de polinucleótidos diana modificados

Igual que en el ejemplo 1.

Primera amplificación exponencial de la primera cadena complementaria mediante PCR con dos grupos diferentes de cebadores específicos diana dirigidos a cada cadena del ADN dúplex

Igual que en el ejemplo 22, excepto que la primera cadena complementaria se utiliza como plantilla y se divide en dos grupos.

Segunda amplificación exponencial del primer producto de amplificación exponencial mediante PCR.

Igual que en el ejemplo 22.

Resultados

Al igual que en los ejemplos 2 y 22, hemos creado con éxito una biblioteca de secuenciación de próxima generación de amplicones diana.

Conclusión

Utilizando el enfoque de este ejemplo, de amplificación lineal del polinucleótido diana modificado, podemos superar la limitación del método del ejemplo 22, ya que amplificamos el polinucleótido diana original, lo cual es importante, tras la incorporación de los UID. Esto significa que se pueden utilizar dos o más grupos de amplificación específica de cadena sin que, en teoría, se reduzca la eficiencia máxima de cada uno de ellos.

Ejemplo 24

Utilización de ácido desoxirribonucleico (ADN) como polinucleótido diana para la producción de dos bibliotecas de secuenciación de próxima generación de amplicones dirigidos (por ejemplo y sin limitación, compatibles con los secuenciadores de próxima generación de Illumina) en un tubo, utilizando, por ejemplo y sin limitación, uno o más oligos plantilla adaptadores con una horquilla producida mediante un espaciador químico (por ejemplo y sin limitación, un espaciador C3, un espaciador C18).

Materiales

Polinucleótido diana, ADNg humano (BIO-35025),

Enzima fragmentadora de ADN, kit KAPA Frag (Roche, 7962517001)

Oligos plantilla adaptadores (ATO), 1-006 (Tabla 1)

ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

Tampón de ADN polimerasa TAQ (NEB, M0273L)

ADN polimerasa I, Fragmento Grande (Klenow) (NEB, M0210L, M0212L)

Los dNTP (NEB, N0447s)

ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion® (NEB, M0530S)

Tampón Phusion (NEB, M0530S)

Enzima USER® (NEB, M5505S)

Cebadores, 2-004, 2-005 (Tabla 2)

Sulfato de amonio (SIGMA, A4418)

Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, A63881)

Exonucleasa I (NEB, M0293S)

Método

Hibridación de uno o más oligos plantilla adaptadores con ácidos desoxirribonucleicos

Igual que en el ejemplo 1.

Extensión del ácido desoxirribonucleico diana mediante su uso como cebador con uno o más oligos plantilla adaptadores como plantilla

Igual que en el ejemplo 1.

Degradación de uno o más oligos plantilla adaptadores

Igual que en el ejemplo 1.

Primera amplificación exponencial del producto de extensión de plantilla adaptadora mediante PCR de los primeros grupos de cebadores específicos diana

Igual que en el ejemplo 2, con uno de los dos grupos de cebadores utilizados en el ejemplo 22.

Eliminación del cebador no utilizado de la primera mezcla de reacción de amplificación exponencial El primer producto de amplificación exponencial se mezcla con una nucleasa monocatenaria específica (por ejemplo, exonucleasa 1), a una temperatura de, por ejemplo, 37 °C, durante un tiempo, por ejemplo 15 minutos, o cualquier otro tiempo o temperatura adecuados capaces de generar actividad enzimática que degrade todo el ADN monocatenario presente en el producto de amplificación exponencial. En este ejemplo, se añadieron 20 unidades de exonucleasa I a los primeros productos de amplificación y se incubaron a 37 °C durante 25 minutos. La nucleasa monocatenaria específica puede inactivarse incubando la mezcla de reacción a una temperatura de, en este ejemplo, 80 °C, durante un tiempo, en este ejemplo 15 minutos, suficiente para inactivar la nucleasa específica monocatenaria. Opcionalmente, el producto de amplificación puede purificarse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, utilizando perlas magnéticas.

Segunda amplificación exponencial del producto de extensión de la plantilla adaptadora mediante PCR con los primeros grupos de cebadores específicos diana

Igual que en la primera amplificación exponencial, pero utilizando un segundo grupo diferente de cebadores específicos diana.

Eliminación del cebador no utilizado de la segunda mezcla de reacción de amplificación exponencial Igual que en la primera eliminación de cebadores no utilizados.

Terceras amplificaciones exponenciales del segundo producto de amplificación exponencial mediante PCR Igual que en la segunda amplificación exponencial del ejemplo 22, excepto que las plantillas son los productos de los segundos productos de amplificación de este ejemplo, que se han dividido en dos alícuotas iguales. Resultados

Al igual que en los ejemplos 2, 22 y 23, hemos creado con éxito una biblioteca de secuenciación de próxima generación de amplicones diana.

Conclusión

Utilizando el enfoque de este ejemplo, de dos amplificaciones exponenciales secuenciales, podemos superar la limitación del método del ejemplo 22, ya que amplificamos el polinucleótido diana original, lo cual es importante, después de la incorporación de los UID. Esto significa que se pueden utilizar dos o más grupos de amplificación específica de cadena sin que, en teoría, se reduzca la eficiencia máxima de cada uno de ellos.

Ejemplo 25

Se diseñó un panel de puntos calientes de mutación de cáncer, con 245x2 pares de cebadores. El panel contiene cuatro grupos de cebadores que se utilizan para generar bibliotecas de amplicones de regiones genómicas de "puntos calientes" que mutan frecuentemente en genes de cáncer humano. El panel de puntos calientes se diseñó para amplificar 245 amplicones que abarcan aproximadamente 3,000 mutaciones COSMIC de 50 oncogenes y genes supresores de tumores.

ABL1 EZH2 JAK3 PTEN

AKT1 FBXW7 IDH2 PTPN11

ALK FGFR1 KDR RBI

APC FGFR2 KIT RET

ATM FGFR3 KRAS SMAD4

BRAF FLT3 MET SMARCB1

CDH1 GNA11 MLH1 SMO

CDKN2A GNAS MPL SRC

CSF1RGNAQNOTCH1 STK11

CTNNB1 HNF1A NPM1 TP53

EGFR HRAS NRAS VHL ERBB2 IDH1 PDGFRA

ERBB4 JAK2 PIK3CA

el grupo Fp5 contiene el primer grupo de cebadores directos, que son cebadores específicos diana sin cola; el grupo Fp7 contiene el segundo grupo de cebadores directos, que son cebadores anidados con la estructura: cola 5' (universal) - específica diana;

el grupo Rp5 contiene el primer grupo de cebadores inversos, que son cebadores específicos diana sin cola; el grupo Rp7 contiene el segundo grupo de cebadores inversos, que son cebadores anidados con la estructura: cola 5' (universal) - específica diana.

Cada grupo contiene 245 cebadores.

En la primera reacción, los ATO se hibridan con las secuencias del polinucleótido diana de una muestra. El polinucleótido diana se extiende utilizando ATO como plantilla. La extensión genera un polinucleótido diana modificado, que comprende una secuencia aleatoria como UID y una secuencia universal 3'.

En la segunda reacción, se añaden los primeros cebadores universales y el grupo Fp5 o Rp5 de cebadores específicos diana para hibridar con el polinucleótido diana modificado, y las secuencias diana se amplifican por PCR. Se lleva a cabo una tercera reacción utilizando cebadores específicos diana anidados (Fp7 o Rp7) y cebadores universales.

Cada biblioteca de amplicones etiquetados se purificó posteriormente a partir de pequeños fragmentos de ADN residuales y se determinó la concentración de ADN. A continuación, estas bibliotecas de amplicones purificadas y marcadas individualmente se agruparon equimolarmente, dando como resultado un grupo de amplicones o una muestra para secuenciación.

Todos los cebadores se sintetizaron con Eurofins o Eurogentec y se diluyeron a 10 pM. Las ADN polimerasas se adquirieron de Promega, Thermo Fisher o NEB.

Tabla 1

Oligos de la Plantilla Adaptadora

ID Seq-ID Secuencia (5’ a 3')

1-001 1 CTC TCT A76 G6C A67 C66 T6A 7NN NNN NNN NNN NNN NNN

NNN NNN NG [PHO]

1-002 2 CTC TCT AT6 G6C A6T C66 T6A TNN NNN NNN NNN NNN NNN

NNN NNN NG [PHO]

1-003 3 CTC TCT A[U][I] G[I]C A[I][U] C[l][l] T[I]A [U]NN NNN NNN NNN

NNN NNN NNN NNN NG [SpC3]

l-004a 4 CTC TC[U] A[U]G GGC AG[U] CGG (U]GA [U]NN NNN NNN NNN

NNN NNN NNN NNN NG(SpC3]

1-005 5 CTC TC[U] A(U]G GGC AG[U] CGG [U]GA [UjNN NNN NNN NNN

NNN NNN NNN NNA*C*A[SpC3]

1-006 6 ATC ACC GAC TG [SpC18] CTC TC[U] A[U]G GGC AG[U] CGG

[U]GA (UjNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNA*C*A [SpC3]

1-007 7 CTC TC8 A8G GGC AG8 CGG 8GA 8NN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NN T*T*G [SpC3]

1-008 3 AGA [U]CG GA[U] GAG C [SpC18] TCA GAC GTG TGC TC[U] TCC GA[U] CTN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN A*C*A [SpC3] 1-009 9 AGA [U]CG GA[U] GAG C [SpC18] CTA CAC GAC GCT CT[U] CCG A[U]CTNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNA*C*A [SpC3]

1-010 10 CGN NAG A[U]C GGA (U]GA GC(SpC18] TCA GAC GTG TGC TC[U]

TCC GA[U] C[U]N NCG NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN

*G*T[SpC3]

1-011 11 CGN NTG [U]AG AA[U] CAT G[SpC18] ACA CTG ACG ACA TGG [U]TC (U]AC ANN CGN NNN NNN NNN NNN NNN NNN N*G*T[SpC3]

1-012 12 AGA [U]CG GA[U] GAG CTA ATA CGA CTC ACT ATA GTC AGA CGT GTG CTC [U]TC CGA [U]C[U] NNN NNN NNN NNN NNN N*G[SpC3]

1-013 13 AGA [U]CG GA[U] GAG C [SpC18] GTCTGA AAA AAT CAG ACG TGT GCT C [U]TC CGA [U]C[U] NNN NNN NNN NNN NNN N*G[SpC3]

l-004b 14 [PHO] ATC ACC GAC TGC CCA TAG AGA G [PHO]

1-014 15 NCG NNN AGA [U]CG GA[U] GAG C [SpC18] TCA GAC GTG TGC TC[U] TCC GA[U] C[U]N NNC GNN NNN NNN NNN NNN NN*T(SpC3]

1-015 16 NCA NNN AGA [U]CG GA[U] GAG C [SpC18] TCA GAC GTG TGC TC[U] TCC GA[U] C[U]N NNT GNN NNN NNN NNN NNN NN*A[SpC3]

1-016 17 NCC NNN AGA [U]CG GA[U] GAG C [SpC18] TCA GAC GTG TGC TC[U] TCC GA[U] C[U]N NNG GNN NNN NNN NNN NNN NN*C[SpC3]

1-017 18 NGG NNN AGA [U]CG GA[U] GAG C [SpC18] TCA GAC GTG TGCTC[U] TCC GA[U] C[U]N NNC CNN NNN NNN NNN NNN NN*G[SpC3]

-018 19 AGA [U]CG GA[U] GAG C [SpC18] CTA CAC GAC GCT CT[U] CCG A[U]C TNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NN A*C*A [SpC3] -019 20 AGA [ll]CG GA[U] [SpC18] GAG CTA ATA CGA CTC ACT ATA GTC

AGA CGT GTG CTC [U]TC CGA [U]C[U] NNN NNN NNN NNN NNN

N*G[SpC3]

-020 21 GAT GAG CTA ATA CGA CTC ACT ATA GTC AGA CGT GTG CTC TTC CGA TCT

-021 22 AGA [U]CG CTA [U] [SpC18] GTC TGA AAA AAT CAG ACC TC[U]

TCG AGC TAA TAC GAC TCA CTA TAG CGA [U]C[U] NNN NNN

NNN NNN NNN N*G[SpC3]

-022 23 AGA [U]CG GA[U] GAG C [SpC18] GTC TGA AAA AAT CAG ACC

TAC ACG ACG CTC T[U]C CGA [U]CT NNN NNN NNN NNN NNN

NNN NNN N A*C*A [SpC3]

-023 24 AGA TCG GAA GAG CAC AAA AAA AAA AAA CAA GCA GAA GAC

GGC A[U]A CGA GAT CG[U] GAT GTG AC[U] GGA GTT CAG ACG

[U]GT GCT C[ll]T CCG AT*C*T NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN N A*C*A [SpC3]

-024 25 AGA TCG GAA GAG CAC A[SpC18] CAA GCA GAA GAC GGC A[U]A

CGA GAT CG[U] GAT GTG AC[U] GGA GTT CAG ACG [U]GT GCT

C[U]T CCG AT*C*T NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN N

A*C*A [SpC3]

-025 26 TCA GAC GTG TGC TC[U] TCC GA[U] C[U]N NNC GNN NNN NNN NNN NNN NN*T(SpC3]

-026 27 CTA CAC GAC GCT CT[U] CCG A[U]C TNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NN A*C*A [SpC3]

-027 28 TCA GAC G[U]G TGC TC[U] TCC GAT C[U]NN NNN NNN NNN NNN

NN*T[SpC3]

1-028 29 [PHO]AGA TCG GAA GAG CAC ACG TCT GA[PHO]

1-029 30 CTA CAC GAC GCT CT[U] CCG A[U]C TNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NN A*C*A [SpC3]

1-030 31 [PHOJAGA TCG GAA GAG CGT CGT GTA G[PHO]

1-031 32 rArGrA rTrCrG rGrArT rGrArG rC [SpC18] rTrCrA rGrArC rGrTrG rTrGrC rTrCrT rTrCrC rGrArT rCrTrNrN rNrNrN rNrNrN rNrNrN rNrNrN rNrN*rT[SpC3]

1-032 33 rArGrA rTrCrG rGrArT rGrArG rC [SpC18] rCrTrA rCrArC rGrArC rGrCrT rCrTrT rCrCrG rArTrC rTrNrN rNrNrN rNrNrN rNrNrN rNrNrN rNrNrN rNrNrN rNrN rA*rC*rA (SpC3]

1-033 34 CGA AGA [U]CG GA[U] GAG C [SpC18] GTC TGA AAA AAT CAG

ACG TGT GCT C [U]TC CGA [U]C[U] TCG NNN NNN NNN NNN

NNN N*G[SpC3]

1-034 35 AGA [U]CG GA[U] GAG C [SpC18] GCT C(U]T CCG A[U]C [U]NN NNN NNN NNN NNN NN*T(SpC3]

1-035 36 TC[U] AGC CTA C[U]C G [SpC18] [U]C[U] AGC CT[U] CTC GNN NNN NNN NNN NNN NN*T[SpC3]

1-036 37 GTC AGA [U]CG GA[U] GAG C [SpC18] GTC TGA AAA AAT CAG

ACG TGT GCT C [U]TC CGA [U]C[U] GAC NNN NNN NNN NNN

NNN N*G[SpC3]

Clave

* = enlace de fosforotioato

[PHO] = grupo fosfato 5'o 3'

[U] = 2'-desoxiuridina

[I] = 2'-desoxiinosina

[SpC3] = Espaciador C3

[SpC18] = Espaciador C18

6 = G, ácido nucleico bloqueado (LNA®)

7 = T, ácido nucleico bloqueado (LNA®)

8 = ácido nucleico bloqueado (LNA®)

N = A, T, C, o G

r = una 'r' minúscula que precede un nucleótido indica un nucleótido de ARN Tabla 2

Clave

* = enlace de fosforotioato

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un método para extender una población de polinucleótidos diana que comprende:

(i) incubar los polinucleótidos diana con oligonucleótidos plantilla adaptadores (ATO) que tienen

(a) un extremo 3' con un bloqueador, que hace que el ATO no sea extensible;

(b) una secuencia 3' aleatoria;

(c) al menos un nucleótido de uracilo; y

(d) una secuencia universal, 5' respecto a la secuencia aleatoria,

donde los polinucleótidos diana hibridan con la secuencia aleatoria 3' del ATO;

(ii) realizar una extensión por polimerasa de los polinucleótidos diana utilizando el ATO como plantilla, produciendo así polinucleótidos diana extendidos con una secuencia universal 3';

(iii) tratamiento con una enzima que tiene actividad dU-glicosilasa; y

(iv) generar una primera secuencia complementaria (CS) de los polinucleótidos diana modificados, donde la generación de la primera CS comprende la extensión de la polimerasa a partir de la secuencia universal 3' utilizando los polinucleótidos diana modificados como plantillas.

2. El método de la reivindicación 1 donde la extensión por polimerasa para producir la primera CS es mediante extensión de un cebador hibridado con la secuencia universal 3'.

3. El método de la reivindicación 2, donde la extensión de un cebador hibridado con la secuencia universal 3' se repite como amplificación lineal.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la primera CS se extiende usando el método de la reivindicación 1 para producir primeras secuencias complementarias extendidas que tienen una secuencia universal 3'.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la primera CS se extiende mediante una ADN ligasa para ligar adaptadores a la primera CS.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además la extensión de un cebador hibridado con la primera CS o la primera CS modificada, formando así una segunda CS, donde el cebador hibridado con la primera CS o la primera CS modificada comprende una porción específica diana 3', o una secuencia universal 5', o tanto una secuencia específica diana 3' como una secuencia universal 5'.

7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el oligonucleótido plantilla adaptador (ATO) comprende una secuencia aleatoria 3' de 3 a 36 bases 'N'.

8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde la secuencia universal comprende una secuencia capaz de actuar como un promotor de ARN polimerasa.

9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 donde el ATO comprende una secuencia de la porción del tallo 5' que es complementaria o parcialmente complementaria a una parte o a toda la secuencia universal, y es por lo tanto capaz de formar una estructura de tallo-bucle.

10. El método de la reivindicación 9, donde el ATO comprende en el orden 5' a 3': una porción de tallo 5', una secuencia de ARN polimerasa, una secuencia del sitio de cebado, una secuencia aleatoria 3' saliente monocatenaria y un extremo 3' con un bloqueador.

11. El método de la reivindicación 9 o la reivindicación 10 donde la estructura de tallo-bucle contiene un enlace no copiable seleccionado de un Espaciador C3, un espaciador de trietilenglicol, un espaciador de hexaetilenglicol de 18 átomos, o 1',2'-Didesoxirribosa (dEspaciador).

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, donde el extremo 3' esta bloqueado con una fracción seleccionada del grupo que consiste en al menos un ribonucleótido, al menos un desoxinucleótido, un espaciador C3, un fosfato, un didesoxinucleótido, un grupo amino, y una desoxitimidina invertida.

13. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el ATO comprende otra secuencia aleatoria que funciona como una plantilla para un identificador único (UID) una vez copiado con los polinucleótidos diana.

14. Un kit para generar una biblioteca de polinucleótidos que comprende un oligonucleótido plantilla adaptador (ATO) que tiene,

(a) un extremo 3' con un bloqueador, que hace que el ATO no sea extensible;

(b) una secuencia aleatoria 3';

(c) al menos un nucleótido de uracilo; y

(d) una secuencia universal, 5' a la secuencia aleatoria,

una polimerasa que tiene actividad de exonucleasa 3', una enzima que tiene actividad de dU-glicosilasa y cebadores compatibles con una plataforma de NGS.