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ES3035811T3 - Specific increase of dopamine synthesis through targeting of the guanylate cyclase 2c receptor in the treatment of parkinson's disease - Google Patents

Specific increase of dopamine synthesis through targeting of the guanylate cyclase 2c receptor in the treatment of parkinson's disease

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ES3035811T3
ES3035811T3 ES18710566T ES18710566T ES3035811T3 ES 3035811 T3 ES3035811 T3 ES 3035811T3 ES 18710566 T ES18710566 T ES 18710566T ES 18710566 T ES18710566 T ES 18710566T ES 3035811 T3 ES3035811 T3 ES 3035811T3
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ES
Spain
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gucy2c
cell
disease
agonist
parkinson
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Der Heide Lars Philip Van
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Universiteit Van Amsterdam
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Abstract

En algunas realizaciones, la invención se refiere a medios y métodos para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. En algunas realizaciones, los medios y métodos implican un agonista de GUCY2C. La invención también se refiere a sistemas de prueba y células adecuados para identificar nuevos compuestos candidatos para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Aumento específico de la síntesis de dopamina mediante el direccionamiento del receptor de guanilato ciclasa 2C en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson
La invención se refiere a medios y métodos para inducir y/o mejorar la señalización de Guanilato Ciclasa 2C en células y el uso de los mismos en la producción de dopamina mediante células dopaminérgicas. La invención también se refiere a medios y métodos para el tratamiento de un individuo que tiene la enfermedad de Parkinson o está en riesgo de desarrollar esta enfermedad.
La enfermedad de Parkinson (PD) es el trastorno neurológico más prevalente después de la patología de Alzheimer. Su característica principal es la degeneración progresiva de las neuronas dopaminérgicas en la pars compacta de la sustancia negra (SNpc) (Kalia LV and Lang AE, 2015). Esta región anatómica surge del mesencéfalo durante el desarrollo y eventualmente crea proyecciones hacia el estriado dorsal, una de las áreas del prosencéfalo que componen los ganglios basales (Smidt MP and Burbach JP, 2007; Baladron J and Hamker FH, 2015). La conectividad funcional entre ambas estructuras se conoce ampliamente como la vía nigroestriatal y depende de la liberación de dopamina (Ikemoto S et al., 2015). Este neurotransmisor interactúa con los receptores postsinápticos estriatales después de ser liberado por los eferentes nigrales, regulando en última instancia el control motor. En consecuencia, en pacientes con PD en los que hay una pérdida prominente de neuronas en la SNpc, la falta resultante de liberación de dopamina en el cuerpo estriado desencadena la aparición de síntomas motores. Clásicamente, estas manifestaciones Parkinsonianas pueden clasificarse en bradicinesia o lentitud de movimientos corporales, temblor en reposo, rigidez muscular y anomalías de la marcha (Kalia LV and Lang AE, 2015).
Sin embargo, las alteraciones motoras solamente aparecen cuando la degeneración de la SNpc se produce en un estadio avanzado, y están precedidas por un conjunto de síntomas no motores que a menudo incluyen disfunción olfativa, depresión o estreñimiento (Mahlknecht P et al., 2015). La causa fisiológica de estos síntomas tempranos no se entiende completamente y, al menos parcialmente, se piensa que está mediada por el mal funcionamiento de redes fuera de la vía nigroestriatal y el desequilibrio de neurotransmisores aparte de la dopamina (Kalia LV and Lang AE, 2015). Interesantemente, la latencia entre el inicio de la fase prodrómica y las manifestaciones motoras podría ser de más de una década (Postuma RB et al., 012). Por lo tanto, el período premotor podría ofrecer a los médicos una ventana temporal que podría aprovecharse para prevenir un desarrollo adicional de la enfermedad. Desafortunadamente, surgen dos inconvenientes importantes cuando se intenta emplear esta estrategia para abordar la PD: (1) los síntomas no motores son sutiles al ojo clínico y no están necesariamente vinculados a esta enfermedad en particular, y (2) la comprensión actual de la base molecular de la PD está lejos de ser completa, rara vez considera la etiología subyacente del trastorno y a menudo admite una interacción compleja de factores ambientales y genéticos (Kalia LV and Lang AE, 2015; Mahlknecht P et al., 2015).
La biosíntesis de dopamina es compleja y está integrada con varias otras vías de biosíntesis. La dopamina se produce a partir de L-tirosina en dos reacciones. La enzima tirosina hidroxilasa (Th) convierte L-tirosina en L-dopa y la L-aminoácido aromático descarboxilasa (AADC) convierte L-dopa para formar dopamina (Clarke CE, 2004). También se sabe que ambas enzimas participan en la síntesis de dos catecolaminas adicionales (es decir, norepinefrina y epinefrina), mientras que solo la última se comparte con la producción de serotonina (Purves D et al., 2001). Además, un circuito de retroalimentación negativa regulado por la cantidad de neurotransmisor regula negativamente la actividad de las enzimas. Además, Th actúa como paso limitante de la velocidad en la vía de síntesis. La dopamina interactúa con la región catalítica de Th para disminuir su actividad (Dunkley PR et al., 2004). La dopamina también está sujeta a degradación. Las enzimas catecol-O-metiltransferasa (COMT) y monoaminooxidasa B (MAOB) están involucradas en la degradación de dopamina y la convierten en ácido homovanílico (Clarke CE, 2004).
Los fármacos más comunes para la enfermedad de Parkinson son: levodopa; levodopa combinada con inhibidores periféricos de AADC (por ejemplo, carbidopa); inhibidores de MAOB e inhibidores de COMT (Kalia LV and Lang AE, 2015). Estos fármacos pueden tomarse oralmente y pueden atravesar la barrera hematoencefálica (BBB), con la excepción de carbidopa, que no puede llegar al sistema nervioso central (CNS) (Ahlskog JE et al., 1989; Gershanik OS, 2015). Una desventaja de estos tratamientos es que presentan efectos secundarios (graves). Se cree que esto se debe, entre otras cosas, al hecho de que los fármacos no son lo suficientemente específicos.
Por ejemplo, se sabe que los fármacos afectan a las neuronas dopaminérgicas fuera de la SNpc, como las del área tegmental ventral o algunos núcleos hipotalámicos (Upadhya MA et al., 2016). La estimulación de la producción de dopamina en estas células diana puede provocar efectos secundarios del tratamiento. Además, las enzimas de biosíntesis de dopamina también participan en la producción de otros compuestos además de la dopamina. El tratamiento con levodopa puede interferir con la síntesis de estos otros compuestos y ejercer efectos no deseados fuera de la diana en las neuronas noradrenérgicas y serotoninérgicas (Carta M et al., 2007; Navailles S et al., 2014).
La falta de especificidad de los fármacos disponibles dirigidos a la PD desencadena efectos secundarios inevitables, destacando principalmente las discinesias inducidas por levodopa. La levodopa administrada oralmente puede atravesar la BBB y, una vez en el cerebro, incorporarse a las terminales dopaminérgicas del estriado dorsal. Allí, AADC la convierte en dopamina, el transportador vMAT2 lo importa a vesículas y finalmente la libera en la hendidura sináptica. Este resultado del tratamiento con levodopa explica sus efectos benéficos en pacientes con PD. Sin embargo, la levodopa también puede incorporarse a las terminales serotoninérgicas estriatales, en las cuales AADC está igualmente presente. Se ha reportado que la dopamina, o "serotonina falsa", puede sintetizarse y además liberarse desde las terminales serotoninérgicas de una manera dependiente de la actividad tras la administración de levodopa. En experimentos elegantes realizados en ratas parkinsonianas inducidas con 6-OHDA, las discinesias derivadas de levodopa se pudieron abolir eliminando las terminales serotoninérgicas en el estriado dorsal o silenciando la liberación del neurotransmisor con agonistas de los autorreceptores de serotonina (Carta M et al., 2007).
Es un objetivo de la presente invención proporcionar medios y métodos para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson que tengan menos efectos secundarios. Un objetivo adicional de la invención es utilizar compuestos conocidos e identificar nuevos compuestos para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. Un tratamiento de la invención es particularmente eficaz en los primeros estadios de la enfermedad de Parkinson.
Sumario de la invención
La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.
La invención proporciona un agonista de GUCY2C para uso en el tratamiento de un individuo que tiene la enfermedad de Parkinson, que comprende además la administración de un inhibidor de PDE al individuo.
La invención proporciona además un método para aumentar la producción de dopamina mediante una célula dopaminérgica, comprendiendo el método poner en contacto dicha célulaex vivocon un agonista de GUCY2C y proporcionando a dicha célula un inhibidor de PDE, aumentando así la señalización de Guanilato Ciclasa 2C (GUCY2C) en dicha célula.
También se proporciona un método para aumentar el nivel de fosforilación de Ser40 de la tirosina hidroxilasa en una célula dopaminérgica, comprendiendo el método poner en contacto dicha célulaex vivocon un agonista de GUCY2C y proporcionando a dicha célula con un inhibidor de PDE, aumentando así la señalización de GUCY2C en dicha célula.
La invención describe además una célula humana aislada o recombinante que comprende la expresión ectópica de GUCY2C humana y/o la expresión ectópica de tirosina hidroxilasa humana.
También se describe un método para identificar un compuesto candidato para modificar la producción de dopamina mediante una célula dopaminérgica, comprendiendo el método cultivar una célula humana aislada o recombinante que comprende expresión ectópica de GUCY2C humana y/o expresión ectópica de tirosina hidroxilasa humana; poniendo en contacto dicha célula con el compuesto candidato y determinando la actividad de la tirosina hidroxilasa en dicha célula.
Se describe además un método para identificar un compuesto candidato para modificar la producción de dopamina mediante una célula dopaminérgica, comprendiendo el método cultivar una célula humana aislada o recombinante que comprende expresión ectópica de GUCY2C humana y/o expresión ectópica de tirosina hidroxilasa humana; poniendo en contacto dicha célula con el compuesto candidato y determinando si la señalización de GUCY2C ha aumentado en dicha célula.
La invención también describe el uso de un gen de GUCY2C, un ARN o una proteína codificada por el gen como una diana para identificar un compuesto que sea activo en la modulación de la actividad de la tirosina hidroxilasa en una célula dopaminérgica.
También se describe un método para el tratamiento de un individuo que tiene la enfermedad de Parkinson, o está en riesgo de desarrollar la enfermedad, comprendiendo el método la administración de un agonista de GUCY2C al individuo con necesidad del mismo.
Descripción detallada de la invención
La Guanilato Ciclasa 2C (GUCY2C) es un miembro de la familia de las guanilil ciclasas. Se describen varios aspectos de la estructura y función de la proteína en Vaandrager (Mol. Cell. Biochem. 2002; 230:73-83). La expresión del gen y la función de la proteína están altamente reguladas y dependen de la célula/tejido particular estudiado.
El gen de GUCY2C y la proteína codificada por el gen se conocen bajo varios alias, entre los que cuales Receptor STA; Guanilato Ciclasa Intestinal; Guanilil Ciclasa C; EC 4.6.1.2; GUC2C; HSTAR; StAr ; GC-C; Guanilato Ciclasa 2C; Receptor de Enterotoxina Termoestable; EC 4.6.1; DIAR6; MECIL; y MUCIL. Los Ids externos para el gen/proteína de GUCY2C son HGNC: 4688; Entrez Gen: 2984; Ensembl: ENSG00000070019; OMIM: 601330 y UniProtKB: P25092.
La tirosina hidroxilasa o tirosina 3-monooxigenasa es la enzima responsable por catalizar la conversión del aminoácido L-tirosina en L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA). La L-DOPA es un precursor de dopamina, que, a su vez, es un precursor de los importantes neurotransmisores norepinefrina (noradrenalina) y epinefrina (adrenalina). La tirosina hidroxilasa cataliza el paso limitante de la velocidad en esta síntesis de catecolaminas. En humanos, la tirosina hidroxilasa está codificada por el gen de TH y la enzima está presente en el sistema nervioso central (CNS), las neuronas simpáticas periféricas y la médula suprarrenal. La proteína o el gen se conoce bajo varios nombres diferentes, tal como Tirosina 3-Hidroxilasa; EC 1.14.16.2; TYH; Distonía; EC 1.14.16; DYT14; y DYT5b. Los Ids externos para el gen o proteína de TH son HGNC: 11782; Entrez Gene: 7054; Ensembl: ENSG00000180176; OMIM: 191290 y UniProtKB: P07101.
La señalización de GUCY2C está mediada por el aumento del guanosín-3',5'-monofosfato cíclico celular (cGMP). Existen muchos mediadores corriente abajo del cGMP que incluyen, dependiendo entre otros, del tipo de célula, tejido y/o estado metabólico del mismo: fosfodiesterasas intracelulares (PDE), proteínas cinasas (PK) y proteínas unidas a la membrana y canales iónicos. Cuando en la presente memoria se hace referencia a la señalización de GUCY2C en el contexto de una neurona dopaminérgica, se hace referencia a un aumento de cGMP.
Una célula dopaminérgica es una célula que puede producir dopamina. Estas células suelen ser células neuronales especializadas. Estas células neuronales se caracterizan típicamente mediante la detección de fluorescencia histoquímica de dopamina en las células. Se pueden discriminar varios grupos de células dopaminérgicas. El grupo celular A8 es uno de estos grupos; es un pequeño grupo de células dopaminérgicas en roedores y primates. Se localiza en la formación reticular del mesencéfalo dorsolateral a la sustancia negra al nivel del núcleo rojo y caudalmente. En el ratón se identifica con el campo retrorrubral definido por tinciones clásicas. El grupo de células A9 es un grupo densamente empacado de células dopaminérgicas y está ubicado en el mesencéfalo ventrolateral de roedores y primates. Es en su mayor parte idéntica a la pars compacta de la sustancia negra tal como se define sobre la base de las tinciones de Nissl. El grupo celular A10 es un gran grupo de células dopaminérgicas en el tegmento ventral del mesencéfalo de roedores y primates. Las células se localizan en su mayor parte en el área tegmental ventral, el núcleo lineal y, en primates, la parte de la sustancia gris central del mesencéfalo situada entre los complejos nucleares oculomotores izquierdo y derecho. Las células dopaminérgicas de las reivindicaciones son células dopaminérgicas que expresan el receptor de GUCY2C, tales como preferiblemente las células del grupo A8, grupo A9 o grupo A10 descritas anteriormente. Se conocen otras células dopaminérgicas, algunas de las cuales se enlistan a continuación en la presente memoria. El grupo A11 es un pequeño grupo de células dopaminérgicas ubicadas en el núcleo periventricular posterior y el núcleo periventricular intermedio del hipotálamo en el macaco. En la rata, también se encuentran pequeñas cantidades de células asignadas a este grupo en el núcleo posterior del hipotálamo, el área supramamilar y el núcleo reuniens. El grupo A12 es un pequeño grupo de células en el núcleo arqueado del hipotálamo en primates. En la rata también se observan algunas células pertenecientes a este grupo en la porción anteroventral del núcleo paraventricular del hipotálamo. El grupo A13 se distribuye en conjuntos que, en el primate, son ventrales y mediales al tracto mamilotalámico del hipotálamo; unos pocos se extienden hasta el núcleo reuniens del tálamo. En el ratón, A13 se encuentra ventral al tracto mamilotalámico del tálamo en la zona incerta. El grupo A14 tiene algunas células observadas en y cerca del núcleo periventricular preóptico del primate. En el ratón, las células en el núcleo preóptico anterodorsal se asignan a este grupo. El grupo A16 se encuentra en el bulbo olfatorio de vertebrados, incluyendo roedores y primates. El grupo Aaq es un grupo disperso de células ubicado en la mitad rostral de la capa gris central del mesencéfalo en primates. Es más prominente en el mono ardilla (Saimiri) que en el macaco. Existen otros varios grupos en primates, ratones y otras especies (Felten et al (1983). Brain Research Bulletin. 10 (2): 171-284 y Dahlstrom A et al 1964). Acta Physiologica Scandinavica. 62: 1-55. Las células dopaminérgicas también pueden generarse artificialmente. Para ello es posible proporcionar a las células artificiales con enzimas, receptores y/o regiones codificantes necesarias. En el contexto de la presente invención se han proporcionado células HEK con Th y/o GUCY2C. La célula dopaminérgica es preferiblemente una célula neuronal dopaminérgica. Las células dopaminérgicas son preferiblemente células del mesencéfalo o del cuerpo estriado. La célula dopaminérgica es preferiblemente una célula neuronal dopaminérgica que expresa GUCY2C en la membrana celular. Preferiblemente una célula de la sustancia negra. Las células neuronales pueden tener proyecciones muy grandes, tanto entrantes como salientes. La célula normalmente se asigna a una sección del cerebro dependiendo de la presencia del núcleo de la célula. Por ejemplo, una célula neuronal del mesencéfalo tiene una parte celular con el núcleo ubicado en el mesencéfalo. La célula puede tener proyecciones como axones o dendritas que pasan y/o terminan en otras partes del cerebro como el cuerpo estriado.
Una fosfodiesterasa (PDE) es una enzima que rompe un enlace fosfodiéster. El término generalmente se refiere a las fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos. Sin embargo, existen muchas otras familias de fosfodiesterasas, incluyendo las fosfolipasas C y D, la autotaxina, la fosfodiesterasa de esfingomielina, las ADNasas, las ARNasas y las endonucleasas de restricción (todas rompen la cadena principal de fosfodiéster del ADN o ARN), así como numerosas fosfodiesterasas de moléculas pequeñas menos caracterizadas.
Las fosfodiesterasas de nucleótidos cíclicos comprenden un grupo de enzimas que degradan el enlace fosfodiéster en las moléculas de segundo mensajero cAMP y cGMP Ellas regulan la localización, duración y amplitud de la señalización de nucleótidos cíclicos dentro de los dominios subcelulares. Por lo tanto, las PDE son reguladores importantes de la transducción de señales mediada por estas moléculas de segundo mensajero.
La nomenclatura de PDE designa la familia de PDE con un número arábigo, luego una letra mayúscula indica el gen de esa familia y un segundo y último número arábigo indica la variante de empalme derivada de un solo gen (por ejemplo, PDE1C3: familia 1, gen C, variante de empalme 3). La superfamilia de enzimas PDE en mamíferos se clasifica en 12 familias, concretamente PDE1-PDE12. Diferentes PDEs de la misma familia están relacionadas funcionalmente a pesar de que sus secuencias de aminoácidos pueden mostrar una divergencia considerable. Las PDEs tienen diferentes especificidades de sustrato. Algunas son hidrolasas selectivas de cAMP (PDE4, 7 y 8); otras son selectivas de cGMP (PDE5, 6 y 9). Otras pueden hidrolizar tanto cAMP como cGMP (PDE1, 2, 3, 10 y 11).
Un inhibidor de la fosfodiesterasa es un fármaco que bloquea uno o más de los subtipos de la enzima fosfodiesterasa (PDE), impidiendo así la inactivación de los segundos mensajeros intracelulares de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) y monofosfato de guanosina cíclico (cGMP) por los respectivos subtipos de PDE. Se conocen varios inhibidores de PDE selectivos y no selectivos. Entre los inhibidores no selectivos de PDE están cafeína, aminofilina, IBMX (3-isobutil-1-metilxantina), paraxantina, pentoxifilina y teofilina. Se dice que estos compuestos no son selectivos, sin embargo, su actividad aún puede variar. Esto puede ser el resultado de diferencias en la preferencia, en la afinidad y/o en la farmacocinética, entre otras. En algunas realizaciones, el inhibidor de PDE es un inhibidor no selectivo tal como IBMX.
La familia de péptidos de guanilina tiene 3 subclases de péptidos que contienen 3 enlaces disulfuro intramoleculares encontrados en enterotoxinas bacterianas termoestables (ST), o 2 disulfuros observados en guanilina y uroguanilina, o un solo disulfuro ejemplificado por linfoguanilina. Estos péptidos se unen y activan los receptores de la superficie celular que tienen actividad intrínseca de guanilato ciclasa (GC), tal como GUCY2C.
La guanilina es un ligando agonista natural de GUCY2C. Es un polipéptido de 15 aminoácidos. Es secretada por las células caliciformes en el colon. La guanilina actúa como un agonista del receptor de guanilil ciclasa GC-C y regula el transporte de electrolitos y agua en los epitelios intestinales y renales. Al unirse al receptor, la guanilina aumenta la concentración intracelular de cGMP, induce la secreción de cloruro y disminuye la absorción de líquido intestinal, lo que finalmente provoca diarrea. El péptido estimula la enzima a través de la misma región de unión al receptor que las enterotoxinas termoestables. Se conoce bajo varios nombres, algunos de los cuales son activador de guanilato ciclasa 2A; Proteína Activadora de Guanilato Ciclasa 1; Proteína Activadora de Guanilato Ciclasa I; Prepro-Guanilina; GCAP-1; GUCA2; Activador de Guanilato Ciclasa 2A; y STARA. Los Ids externos para el gen/proteína de guanilina son HGNC: 4682; Entrez Gene: 2980; Ensembl: ENSG00000197273; OMIM: 139392; y UniProtKB: Q02747.
La uroguanilina un ligando agonista natural de GUCY2C. Es un péptido de 16 aminoácidos que es secretado por las células en el duodeno y el intestino delgado proximal. La guanilina actúa como un agonista del receptor de guanilil ciclasa GC-C y entre otros regula el transporte de electrolitos y agua en los epitelios intestinales y renales. En humanos, el péptido de uroguanilina está codificado por el gen de GUCA2B. El gen y la proteína se conocen bajo diferentes nombres, Activador de Guanilato Ciclasa 2B, Prepro-Uroguanilina, GCAP-II y UGN. Los Ids externos para el gen y la proteína son HGNC: 4683; Entrez Gene: 2981; Ensembl: ENSG00000044012; OMIM: 601271; y UniProtKB: Q16661.
La linfoguanilina es un ligando agnóstico natural de GUCY2C. Se describe entre otros en Forte et al. Endocrinology. 1999 Apr;140(4):1800-6.
Un derivado funcional de guanilina, linfoguanilina o uroguanilina tiene la misma actividad en especie, no necesariamente en cantidad. Un derivado funcional preferiblemente tiene la misma secuencia de aminoácidos que guanilina, uroguanilina o STh o tiene una secuencia de aminoácidos alterada que es muy similar a guanilina, uroguanilina o STh. Uno de estos derivados es linaclotida. La linaclotida es un péptido que imita a guanilina y uroguanilina endógenas. Es un tetradecapéptido sintético (péptido de 14 aminoácidos) con la secuencia CCEYCCNPACTGCY (H-Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH). La linaclotida tiene tres enlaces disulfuro que están entre (cuando se numera de izquierda a derecha) Cys1 y Cys6, entre Cys2 y Cys10, y entre Cys5 y Cys13;[9]. Tres agonistas peptídicos similares de GUCY2C están en desarrollo clínico: linaclotida (Linzess™, Forest Laboratories and Ironwood Pharmaceuticals, Inc.); SP-304 (plecanatida) y SP-333 (Synergy Pharmaceuticals, Inc.). Un derivado funcional puede tener un grupo químico unido al extremo N y/o C terminal. El grupo químico puede tener uno o dos aminoácidos en enlace peptídico. El derivado funcional puede derivarse de guanilina o uroguanilina mediante modificación química de una o más cadenas laterales de residuos de aminoácidos. Una de estas modificaciones o grupo químico puede ser una modificación para facilitar aún más el paso de la barrera hematoencefálica. La guanilina que se inyecta en el torrente sanguíneo ingresa rápidamente al cerebro (WO2013016662). La guanilina es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica (BBB). La administración al cerebro puede ser un desafío en el desarrollo de fármacos. Aunque la barrera hematoencefálica impide que muchos fármacos alcancen sus dianas, los vectores moleculares, conocidos como lanzaderas BBB, ofrecen una gran promesa para superar con seguridad este formidable obstáculo. En los últimos años, las lanzaderas peptídicas han recibido una atención creciente debido a su menor coste, inmunogenicidad reducida y mayor versatilidad química que los anticuerpos tradicionales caballo de Troya y otras proteínas. Las lanzaderas BBB adecuadas se describen en Oller-Salvia et al (Chem. Soc. Rev., 2016, 45, 4690-4707). En una realización preferible, el derivado funcional de guanilina o uroguanilina es guanilina o uroguanilina fusionada a un péptido lanzadera BBB de la tabla 1 de Oller-Salvia et al. La fusión normalmente se realiza mediante un enlace peptídico. Se puede introducir un enlazador entre las dos unidades funcionales. El enlazador es preferiblemente un enlazador peptídico de 1-20, preferiblemente 1,15, preferiblemente 1-10 y más preferiblemente 1-5 residuos de aminoácidos.
Un ligando GUCY2C es una molécula que se une a una parte extracelular de GUCY2C y que modula la actividad del receptor. Un ligando que aumenta la señalización del receptor se denomina como un agonista de GUCY2C. La señalización normalmente aumenta hasta el nivel de un ligando natural del receptor. La activación es preferiblemente al menos el 50% del nivel de activación alcanzado por un ligando natural del receptor probado bajo condiciones idénticas (por supuesto, bajo condiciones de saturación suficiente). El nivel de actividad de la señalización normalmente se mide midiendo la producción de cGMP intracelular. También se puede medir midiendo el nivel de una actividad resultante del nivel de cGMP en la célula.
Un agonista de GUCY2C es una molécula que se une a una parte extracelular de GUCY2C y aumenta la señalización de la proteína. El aumento en este contexto incluye la inducción de la señalización mediante un receptor de GUCY2C silencioso y un aumento de la señalización además de una actividad de señalización ya existente del receptor. La inducción o el aumento de una actividad de señalización existente se mide normalmente comparando los resultados integrados de varias células, normalmente un grupo de al menos 10.000 células. En tales casos, la inducción de la señalización es una señal de indetectable a detectable. Un aumento sobre una actividad existente es una actividad mayor en comparación con la ausencia del agonista bajo condiciones por lo demás idénticas. Un aumento de la señalización incluye, por tanto, un aumento de niveles de señalización de indetectables a detectables.
Se conocen varios agonistas en la técnica. Los más conocidos son los miembros de la familia de péptidos de guanilina. Estos incluyen, por ejemplo, los péptidos mencionados anteriormente y los péptidos bacterianos ST, tal como el STa deE. coli; el ST deV. coleray el Yenterocolitica(Fonteles et al 2011; Can. J. of Phys. And Pharmac. 89: 575-85). US8,748,575 (Wolfe et al) describe las proteínas guanilina y uroguanilina de varias especies. Wolfe et al también describen varios derivados de guanilina y uroguanilina que son agonistas de GUCY2C. También se describen varios péptidos bacterianos que imitan la acción de los péptidos mencionados anteriormente. Estos péptidos y mutantes de los mismos son agonistas de GUCY2C. US2012/0108525 (Curie et al) describe varios agonistas de GUCY2C y el uso de estos agonistas en el tratamiento de trastornos gastrointestinales. WO2013016662 (Ganat et al) describe que los conjugados de guanilina tienen una carga útil para dirigir la carga útil al cerebro. En particular, se describe el uso de la carga útil L-Dopa.
La biosíntesis de dopamina es compleja y está integrada con otras varias vías de biosíntesis. La dopamina se produce a partir de L-tirosina en dos reacciones. La enzima tirosina hidroxilasa (Th) convierte L-tirosina en levodopa (L-dopa) y L-aminoácido aromático descarboxilasa (AADC) descarboxila la levodopa para formar dopamina (Clarke Ce , 2004). La tirosina hidroxilasa se conoce bajo varios alias: Tirosina 3-Monooxigenasa; Tirosina 3-Hidroxilasa; EC 1.14.16.2; TYH; Distonía 14; EC 1.14.16; DYT14; y DYT5b. Los Ids externos para Th son HGNC: 11782; Entrez Gene: 7054; Ensembl: ENSG00000180176; OMIM: 191290 y UniProtKB: P07101.
Con el término "modulación de la producción de dopamina" se hace referencia al ajuste ascendente o descendente de un nivel de dopamina. La producción la realiza una célula dopaminérgica. Por tanto, modular la producción significa ajustar ascendentemente o descendentemente el nivel de dopamina en una neurona dopaminérgica, normalmente con el objetivo de aumentar la liberación de dopamina de la célula dopaminérgica. La liberación es preferentemente en el área de proyección de las neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo, preferentemente de la sustancia negra. El área de proyección es preferiblemente el cuerpo estriado. La modulación de la producción de dopamina se logra modulando la señalización de GUCY2C en la célula dopaminérgica. La modulación es preferiblemente un ajuste ascendente de la señalización, es decir, un ajuste ascendente del nivel de cGMP en la célula dopaminérgica. La modulación se logra típicamente modulando la actividad de la tirosina hidroxilasa (Th) en la célula. Th se puede medir de varias maneras. Una forma obvia es medir la producción del producto enzimático de Th en el contexto del sustrato que se le proporciona. Se ha descubierto que la actividad de Th depende de la fosforilación de serina. En la presente invención se ha desarrollado un método para modular la producción de dopamina mediante la modulación de la fosforilación de Ser 40 de Th. Como se indica en la presente memoria, la producción de dopamina mediante una célula dopaminérgica se aumenta al aumentar el nivel de fósforo de Ser 40 de Th (P-S40 de Th) en la célula, medido en relación con el nivel total de Th en la célula. Normalmente, el nivel de fósforo de Ser40 se compara con el nivel de Th que no está fosforilado en Ser40. Esto normalmente se hace en un ensayo como el descrito en los ejemplos en relación con las figuras 3-5. El ajuste ascendente o descendente de la fosforilación de Ser40 es típicamente un aumento del nivel de P-S40 de Th de al menos 10%, 20%, 30%, preferiblemente al menos 50% y más preferiblemente al menos 80% en comparación con el nivel en la célula no ajustada bajo circunstancias por demás idénticas. En caso de ajuste ascendente, el nivel de P-S40 de Th se ajusta preferiblemente a al menos 100% y preferiblemente al menos 200% más que el nivel no ajustado.
El ajuste ascendente del nivel de dopamina es típicamente un aumento respectivo del nivel de dopamina de al menos 10%, 20%, 30%, preferiblemente al menos 50% y más preferiblemente al menos 80% en comparación con el nivel en la célula no ajustada bajo circunstancias por demás idénticas. El nivel de dopamina se ajusta preferiblemente a al menos 100% y preferiblemente al menos 200% más que el nivel no ajustado.
El ajuste ascendente del nivel de cGMP es típicamente un aumento respectivo del nivel de cGMP de al menos 10%, 20%, 30%, preferiblemente al menos 50% y más preferiblemente al menos 80% cuando se compara con el nivel en la célula no ajustada bajo circunstancias por demás idénticas. El nivel de cGMP se ajusta preferiblemente a al menos 100% y preferiblemente al menos 200% más que el nivel no ajustado.
La invención describe un método para modular la producción de dopamina mediante una célula dopaminérgica, comprendiendo el método la modulación de la señalización por Guanilato Ciclasa 2C (GUCY2C) en dicha célula. La invención también describe un método para aumentar la producción de dopamina mediante una célula dopaminérgica, comprendiendo el método aumentar la señalización de Guanilato Ciclasa 2C (GUCY2C) en dicha célula.
La invención también describe un método para aumentar el nivel de fosforilación de Ser40 de tirosina hidroxilasa en una célula dopaminérgica, comprendiendo el método aumentar la señalización de GUCY2C en dicha célula.
Un aumento en el nivel de dopamina es típicamente un aumento del nivel de dopamina de al menos 10%, 20%, 30%, preferiblemente al menos 50% y más preferiblemente al menos 80% cuando se compara con el nivel en la célula no ajustada bajo circunstancias por demás idénticas. El nivel de dopamina se incrementa preferiblemente a al menos 100% y, preferiblemente, al menos 200% más que el nivel no ajustado.
Un método para aumentar la producción de dopamina mediante una célula dopaminérgica se logra preferiblemente aumentando la señalización de Guanilato Ciclasa 2C (GUCY2C) en dicha célula. El nivel de cGMP normalmente aumenta al menos 10%, 20%, 30%, preferiblemente al menos 50% y más preferiblemente al menos 80% en comparación con el nivel en la célula no ajustada bajo circunstancias por demás idénticas. Preferiblemente aumentado a al menos 100% y preferiblemente al menos 200% más que el nivel no ajustado.
La señalización de GUCY2C se puede modular de varias maneras. Una forma es modular el nivel de ARNm que codifica para GUCY2C. Esto se puede hacer introduciendo un casete de expresión con una región codificante para GUCY2C en la célula. Un nivel más alto de ARNm de GUCY2C en la célula conduce a más GUCY2C en la membrana y a una mayor señalización de GUCY2C en la célula.
El ajuste ascendente del nivel de señalización de GUCY2C se logra preferiblemente proporcionando una célula que contenga GUCY2C con un agonista de GUCY2C. El agonista es preferiblemente un miembro de la familia de guanilina de los péptidos, preferiblemente guanilina, uroguanilina o un derivado funcional de la misma.
El método para modular y preferiblemente aumentar la producción de dopamina comprende además preferiblemente proporcionar a la célula dopaminérgica con un inhibidor de PDE. En algunas realizaciones, el inhibidor de PDE es un inhibidor no selectivo tal como IBMX.
El ajuste ascendente del nivel de P-S40 de Th se logra preferiblemente proporcionando a una célula que contiene GUCY2C con un ligando GUCY2C, preferiblemente un agonista. El agonista es preferiblemente un miembro de la familia de guanilina de los péptidos, preferiblemente guanilina, linfoguanilina, uroguanilina o un derivado funcional de las mismas. El ajuste ascendente del nivel de señalización de GUCY2C también se puede lograr incrementando el número de receptores de GUCY2C en la membrana celular. Un método es mediante introducir un casete de expresión que comprende una región codificante de GUCY2C en la célula dopaminérgica. El casete de expresión se introduce preferiblemente por medio de un vector viral. Los ejemplos no limitantes de vectores adecuados son los vectores de virus adenoasociados o los vectores de lentivirus.
El método para modular y preferiblemente aumentar el nivel de P-S40 de Th comprende además proporcionar a la célula dopaminérgica con un inhibidor de PDE. En algunas realizaciones, el inhibidor de PDE es un inhibidor no selectivo tal como IBMX.
La invención describe un método para determinar si un compuesto es capaz de modular la producción de dopamina mediante una célula dopaminérgica, que comprende determinar si un compuesto es capaz de modular la actividad de un gen de GUCY2C, un ARN o una proteína codificada por el gen. El método preferiblemente comprende además poner en contacto la célula dopaminérgica con el compuesto; y determinar si el compuesto es capaz de modular la producción de dopamina mediante la célula dopaminérgica. La invención describe además un uso de un gen de GUCY2C, un ARN o una proteína codificada por el gen como una diana para identificar un compuesto que es activo en la modulación de la actividad de la tirosina hidroxilasa en una célula dopaminérgica. Con el nuevo uso de la modulación de la actividad de GUCY2C en una célula, el artesano apreciará que es posible encontrar nuevos agonistas de GUCY2C.
La invención proporciona un agonista de GUCY2C para uso en el tratamiento de un individuo que tiene la enfermedad de Parkinson, que comprende además la administración de un inhibidor de PDE. El inhibidor de PDE puede ser un inhibidor de PDE no selectivo. El individuo preferentemente tiene la enfermedad de Parkinson estadio 1, 2, 3 o 4. En una realización preferible, el individuo tiene la enfermedad de Parkinson estadio 1, 2 o 3, preferiblemente 1 o 2 y preferiblemente estadio 1. En la presente invención se observó que un agonista de guanilina estimula la producción de dopamina mediante células relevantes en una forma fisiológica y tiene muchos menos efectos secundarios que un tratamiento con levodopa. El tratamiento es particularmente eficaz en los estadios tempranos de la enfermedad, cuando la limitación de la producción de dopamina en el individuo sólo se vuelve aparente en la expresión de síntomas leves. En estos casos el individuo no tiene suficiente producción de dopamina normalmente debido al hecho de la desaparición parcial de las células dopaminérgicas. Sin embargo, especialmente en los estadios tempranos, el individuo suele tener suficientes células para proporcionar una producción adecuada de dopamina tras el tratamiento de la invención. El tratamiento puede tener éxito y lograr que el individuo vuelva a estar asintomático. El agonista es preferiblemente guanilina o un derivado funcional de la misma. El tratamiento preferiblemente comprende además la administración de un inhibidor de PDE al individuo.
El agonista de GUCY2C es activo por sí solo. Por lo tanto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un agonista de GUCY2C y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en el que el agonista de GUCY2C es el único ingrediente farmacéuticamente activo para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. WO2013/016662 describe un ligando conjugado de GUCY2C a una carga útil para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. Los inventores de WO2013/016662 fallaron en reconocer el efecto de un agonista de GUCY2C sobre la producción de dopamina y el tratamiento de individuos con enfermedad de Parkinson, particularmente en estadio temprano. WO2013/016662 describe que es la carga útil la que tiene el efecto terapéutico. Según WO2013/016662 la carga útil puede ser una fracción terapéutica o diagnóstica. En la presente invención, el agonista se proporciona sin dicha fracción adicional. Se proporciona sin una fracción diagnóstica o terapéutica como se describe en WO2013/016662. El efecto terapéutico de un agonista de GUCY2C solo permaneció oculto en WO2013/016662. Un tratamiento de la enfermedad de Parkinson como se describe en la presente memoria comprende además preferiblemente proporcionar a dicha célula con un inhibidor de PDE. En algunas realizaciones, el inhibidor de PDE es un inhibidor no selectivo tal como IBMX. En esta realización, el agonista de GUCY2C no tiene carga útil adicional ni etiqueta para fines de diagnóstico o detección. El agonista de GUCY2C y el inhibidor de PDE son preferiblemente los únicos ingredientes farmacéuticamente activos del medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.
La invención también proporciona un método para aumentar la producción de dopamina mediante una célula dopaminérgica, comprendiendo el método aumentar la señalización de Guanilato Ciclasa 2C (GUCY2C) en dicha célula. Además, se proporciona un método para aumentar el nivel de fosforilación de Ser40 de la tirosina hidroxilasa en una célula dopaminérgica, comprendiendo el método aumentar la señalización de GUCY2C en dicha célula. La señalización de GUCY2C se incrementa preferiblemente poniendo en contacto dicha célula con un agonista de GUCY2C. Dicho agonista es preferiblemente guanilina o un derivado funcional de la misma. El método comprende además proporcionar a dicha célula con un inhibidor de PDE. Dicha célula es preferiblemente una neurona dopaminérgica, preferiblemente una neurona dopaminérgica del mesencéfalo.
En los ejemplos, la invención describe un sistema de prueba para determinar si un compuesto, preferiblemente un ligando GUCY2C, preferiblemente un agonista de GUCY2C, es capaz de activar GUCY2C, o aumentar el nivel de fosforilación de ser40 de la tirosina hidroxilasa, o aumentar la producción de dopamina. Un sistema de prueba de este tipo puede comprender adecuadamente una célula humana aislada o recombinante que comprende la expresión ectópica de GUCY2C humana y/o la expresión ectópica de la tirosina hidroxilasa humana. Esta célula es ideal para realizar métodos para identificar agonistas de GUCY2C con propiedades similares o mejores que un agonista de GUCY2C natural. En una realización preferible, la célula comprende la expresión ectópica de GUCY2C humana y la expresión ectópica de la tirosina hidroxilasa humana. Se prefiere la expresión ectópica porque dichas células pueden elegirse para un mejor desempeño en sistemas de cribadoin vitro.Las célula nerviosas que normalmente expresan Th a menudo no son las células del mejor desempeño y, si son adecuadas para cultivos robustos, fáciles y rápidosin vitro,han perdido o ganado propiedades que dificultan el análisis de los resultados. Los sistemas de expresión ectópica también permiten la fácil identificación/confirmación de la vía mediante la cual funciona el compuesto, ya que los controles se producen fácilmente (las mismas células sin la expresión ectópica de una o más de las proteínas). Con el término "expresión ectópica" se entiende la expresión de un gen o la presencia de una proteína en un tejido o célula donde normalmente no se expresa. Se pueden utilizar varias células en este contexto. Es preferiblemente una célula inmortalizada. Preferiblemente una célula adaptada a un cultivoin vitro. En una realización preferible, la célula es una célula de primate, preferiblemente una célula humana. En una realización particularmente preferible, la célula es una célula HEK. Las células mencionadas son particularmente adecuadas para identificar un compuesto candidato para modificar la producción de dopamina mediante una célula dopaminérgica. La invención, por lo tanto, también describe un método para identificar un compuesto candidato para modificar la producción de dopamina mediante una célula dopaminérgica, comprendiendo el método cultivar una célula como se menciona en este párrafo; poniendo en contacto dicha célula con el compuesto candidato y determinando la actividad de la tirosina hidroxilasa en dicha célula. La actividad de Th se puede medir de varias maneras. En una realización preferible, la actividad se mide midiendo de la fosforilación de Th, preferiblemente se determina la fosforilación de ser40 de la tirosina hidroxilasa.
La invención también describe el uso de un gen de GUCY2C, un ARN o una proteína codificada por el gen como una diana para identificar un compuesto que sea activo en la modulación de la actividad de la tirosina hidroxilasa en una célula dopaminérgica. Además, se proporciona un método de tratamiento de un individuo que tiene la enfermedad de Parkinson, o está en riesgo de desarrollar la enfermedad, comprendiendo el método la administración de un agonista de GUCY2C al individuo con necesidad del mismo. En una realización preferible, el método comprende además administrar un inhibidor de PDE al individuo.
El inhibidor de PDE en el contexto de las realizaciones de la presente invención puede ser un inhibidor de PDE no selectivo tal como IBMX.
El individuo que padece la enfermedad de Parkinson, o está en riesgo de desarrollar la enfermedad, es preferiblemente un humano. La proteína y/o gen de GUCY2C es preferiblemente una proteína o gen de GUCY2C humana. El miembro de la familia de péptidos de guanilina es preferiblemente un miembro humano. La guanilina o uroguanilina es preferiblemente guanilina o uroguanilina humana. Un derivado funcional de guanilina o uroguanilina es preferiblemente un derivado funcional de guanilina o uroguanilina humana.
El ligando tal como un agonista, el inhibidor de PDE o la combinación de los mismos se administran preferiblemente al cerebro del individuo. En algunas realizaciones, el inhibidor de PDE es un inhibidor no selectivo tal como IBMX.
La enfermedad de Parkinson generalmente comienza lentamente con síntomas menores. La enfermedad puede progresar lenta o rápidamente. Durante esta progresión los síntomas empeoran y pueden aparecer nuevos síntomas. Se pueden identificar varios estadios de la enfermedad que se correlacionan más o menos con la pérdida progresiva de neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra. A menudo se identifican 5 estadios. El estadio 1 generalmente se caracteriza por síntomas leves que generalmente no interfieren con las actividades diarias. El temblor y otros síntomas de movimiento generalmente ocurren solo en un lado del cuerpo. Los amigos y familiares pueden notar cambios en la postura, la forma de caminar y las expresiones faciales. En el estadio 2 los síntomas comienzan a empeorar. El temblor, la rigidez y otros síntomas de movimiento afectan a ambos lados del cuerpo. Pueden volverse aparentes problemas para caminar y mala postura. En este estadio, la persona todavía es capaz de vivir sola, pero completar las tareas cotidianas se vuelve más difícil y puede llevar más tiempo. El estadio 3 se considera un estadio intermedio en la progresión de la enfermedad. La pérdida del equilibrio y la lentitud de los movimientos son características de esta fase. Las caídas son más comunes. Aunque la persona todavía es totalmente independiente, los síntomas afectan significativamente las actividades de la vida diaria, como vestirse y comer. Los síntomas del Parkinson son graves y muy limitantes en el estadio 4. Es posible permanecer de pie sin ayuda, pero para moverse puede ser necesario un andador. La persona necesita ayuda con las actividades de la vida diaria y no puede vivir sola. El estadio 5 es el estadio más avanzado y debilitante de la enfermedad de Parkinson. La rigidez en las piernas puede hacer que sea imposible estar de pie o caminar. La persona necesita una silla de ruedas o está postrada en cama. Se requiere atención de enfermería las 24 horas para todas las actividades. La persona puede experimentar alucinaciones y delirios. Si bien el estadio cinco se centra en los síntomas motores, la comunidad de Parkinson reconoce que también existen muchos síntomas no motores importantes.
Para usos médicos en el contexto del Parkinson y el tratamiento de individuos que padecen la enfermedad de Parkinson, se prefiere que el individuo no tenga una forma completamente avanzada de la enfermedad de Parkinson. En tales casos la sustancia negra queda (casi) completamente destruida. Para la presente invención se prefiere que el individuo tenga enfermedad de Parkinson estadio 1, 2, 3 o 4. En una realización preferible, el individuo tiene la enfermedad de Parkinson estadio 1, 2 o 3. Preferiblemente estadio 1 o estadio 2. Una ventaja de la presente invención es que los primeros estadios de la enfermedad pueden tratarse adecuadamente sin inducir muchos de los efectos secundarios asociados con las terapias estándar actuales. Las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra son estimuladas para producir más dopamina para compensar la pérdida de células dopaminérgicas en la sustancia negra mientras que al mismo tiempo no producen dopamina en exceso, o tienen una producción excesiva de dopamina en células no diana, es decir, neuronas dopaminérgicas que no están en la sustancia negra.
Preferiblemente, los compuestos de la invención se utilizan como un medicamento. Los medicamentos de la invención se pueden utilizar adecuadamente para el tratamiento de un individuo que padece la enfermedad de Parkinson o está en riesgo de padecer la enfermedad de Parkinson. Las composiciones farmacéuticas de la invención son particularmente adecuadas para aumentar la producción de dopamina mediante las células dopaminérgicas como se describe en la presente memoria.
Métodos de administración
Una vez formulado, un compuesto o composición de la invención puede administrarse directamente a un sujeto; o administrarse a células in vitro.
La administración directa de las composiciones a un sujeto generalmente se realizará mediante inyección, ya sea por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, o se administrará en el espacio intersticial de un tejido. Otros modos de administración incluyen la administración tópica, oral, cateterizada y pulmonar, supositorios y aplicaciones transdérmicas, agujas y pistolas de partículas o hipopulverizadores. El tratamiento de dosificación puede ser un esquema de dosis única o un esquema de dosis múltiples. La administración se realiza preferentemente al cerebro del individuo. Una vía de administración preferible es a través del epitelio de la nariz.
En general, la administración de ácidos nucleicos para aplicaciones tanto ex vivo como in vitro se puede lograr, por ejemplo, mediante transferencia génica utilizando un vector que incluye un virus, transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, polybrene® transfección mediada, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación de polinucleótido(s) en liposomas y microinyección directa del ADN en los núcleos, todas ellas bien conocidas en la técnica.
Sin limitarse a la teoría, se cree que la modulación y preferiblemente el aumento de la señalización de GUCY2C en una célula dopaminérgica de un individuo que tiene la enfermedad de Parkinson o está en riesgo de desarrollar la enfermedad modula y preferiblemente aumenta la actividad de Th en la célula. El tratamiento alivia las anomalías motoras en individuos con PD o en riesgo de la misma. Esta enzima, al catalizar el paso limitante de la tasa en la producción de dopamina, establece la velocidad general de toda la vía biosintética. Th tiene un dominio regulador N-terminal, un dominio catalítico central y un dominio de tetramerización C-terminal (Tekin I et al., 2014). El dominio más atractivo para aumentar la actividad de Th se encuentra en la región N-terminal, que incluye tres serinas susceptibles a fosforilación (es decir, Ser19, Ser31 y Ser40). La importancia reguladora de estos residuos se refleja en su amplia conservación evolutiva (Fig. 1). Se sabe que la fosforilación independiente de Ser31 y Ser40 aumenta la actividad de Th in vitro e in situ. La fosforilación de Ser31 funciona exclusivamente aumentando la afinidad de Th por uno de sus cofactores (es decir, BH4), mientras que Ser40 también impide el ciclo de retroalimentación negativa al bloquear la interacción de la dopamina con el dominio catalítico de Th (Dunkley PR et al., 2004). Por lo tanto, Ser40 es una diana prometedora y creemos que aumentar su fosforilación resuelve una limitación importante del tratamiento con levodopa.
Un objetivo de la invención es aumentar la actividad de Th induciendo la fosforilación de Ser40 específicamente en el mesencéfalo. Las principales cinasas que se sabe que fosforilan este residuo son las proteínas cinasas dependientes de cAMP y cGMP (PKA y PKG, respectivamente) (Campbell DG et al., 1986; Roskoski R Jr et al., 1987). Ambas enzimas son basalmente inactivas debido a la interacción de la región reguladora con el centro catalítico. Mientras que las contrapartes reguladoras y catalíticas de PKA corresponden a polipéptidos separados, PKG es una única cadena de aminoácidos que incluye ambos dominios. Con la finalidad de activarse, ambas cinasas dependen de la interacción del nucleótido cíclico correspondiente con la región reguladora de la enzima, de forma que el centro catalítico se libera para fosforilar diferentes sustratos (Scholten A et al., 2008). Entre sus diversos objetivos, Ser40 en Th es la diana preferible en la presente invención.
Gong R et al., 2011, reportaron sobre la presencia de guanilil ciclasa 2C particulada (GUCY2C) en el cerebro. Una observación idéntica está registrada en el Allen Brain Atlas. La expresión de GUCY2C está restringida a las neuronas A8-A10. Hasta hace menos de una década, se pensaba que este receptor se expresaba exclusivamente en el tracto gastrointestinal, donde interactúa con ligandos endógenos como la guanilina, la uroguanilina o la toxina termoestable secretada por E. coli (toxina ST). Tras la activación, este receptor produce cGMP y, en última instancia, disminuye la absorción de agua al estimular un canal de cloro saliente (CFTR) e inhibir un canal de sodio entrante (NHE3) (Fiskerstrand T et al., 2012).
La presente invención muestra que la activación de GUCY2C aumenta la fosforilación de Ser40 y, por lo tanto, la actividad de Th específicamente en el mesencéfalo. Sin limitarse a la teoría, se cree que esto se consigue mediante dos mecanismos. La producción de cGMP activa la PKG y activa indirectamente la PKA mediante la inhibición de la fosfodiesterasa 3, una enzima involucrada en la descomposición del cAMP a su forma no cíclica (Fig. 2) (Fiskerstrand T et al., 2012).
La presente aproximación aborda un problema de especificidad en el cerebro, ya que afecta la vía nigroestriatal y mantiene la capacidad de inducir la síntesis de dopamina y su liberación final. Th se coexpresa con GUCY2C en el mesencéfalo, y los ratones deficientes en GUCY2C exhiben una menor liberación de dopamina en el cuerpo estriado en comparación con sus compañeros de camada de tipo silvestre (wt) (Gong R et al., 2011).
Descripción breve de las figuras
Figura 1. Alineamiento de secuencias múltiples del dominio regulador de Th en diferentes especies. Los tres residuos de serina resaltados (Ser19, Ser31 y Ser40) son susceptibles a la fosforilación y están bien conservados a lo largo de la evolución. La fosforilación de Ser31 y Ser40 se correlaciona directamente con una actividad aumentada de la enzima. Obsérvese que los aminoácidos que rodean ambos residuos prácticamente no cambian, conservando así la secuencia consenso y explicando por qué esas serinas están fosforiladas en diferentes organismos. '*' representa la máxima conservación, seguido de ':' y '.'.
Figura 2. Vías teóricas mediante las cuales la activación de GUCY2C puede conducir a una actividad aumentada de Th. Una alternativa es la activación directa de PKG por cGMP, mientras que la otra consiste en la activación indirecta de PKA a través de la inhibición mediada por cGMP de PDE3, una enzima involucrada en la degradación de cAMP en su forma no cíclica.
Figura 3. Las células HEK son un modelo adecuado para estudiar la fosforilación de Ser40 inducida por GUCY2C. (A) Datos de RT-qPCR de extractos de HEK intactos. El material de entrada fue 10 ng de ARN total. Cp corresponde al número de ciclo en el que la expresión comienza a considerarse positiva. (-) representa el control de agua, que es negativo en todos los casos. (B) Los cultivos de HEK se transfectaron con Th y se trataron con un análogo de cGMP 48 horas después de la siembra. Se estudiaron los cambios en la fosforilación de Ser40. La gráfica representa el análisis estadístico (n=6; Media±SEM). Prueba t de Student no pareada (valor p: ****<0.0001). En este caso, 'Cambio de veces' corresponde a la proporción P-Ser40/Th Total.
Figura 4. La activación de GUCY2C aumenta la fosforilación de Ser40. Imágenes de inmunocitoquímica (A) y análisis de inmunotransferencia tipo Western (B) de cultivos de HEK transfectados con Th o Th+GUCY2C. (C) Las células HEK cotransfectadas se trataron con guanilina (G) o uroguanilina (UroG) y se estudiaron los cambios en la fosforilación de Ser40. La grafica representa el análisis estadístico (n=3 para Control, n=6 para Guanilina, n=9 para Uroguanilina; Media ± SEM). Prueba t de Student no pareada (valor p: **<0.01).
Figura 5. El aumento de la fosforilación de Ser40 es proporcional a la cantidad de cGMP producido tras la estimulación con GUCY2C. (A) Los cultivos de HEK fueron tratados con guanilina, en presencia o ausencia de IBMX. La grafica muestra el análisis estadístico (n=3 para Control±Guanilina, n=6 para IBMX±Guanilina; Media±SEM). Prueba t de Student no pareada (valores p: ****<0.0001, **<0.01, *<0.05). (B) Las células HEK fueron cotransfectadas con Th y el GUCY2C wt o un mutante con ganancia de función (R792S). Se estudió la fosforilación de Ser40 después del tratamiento con guanilina (G). La grafica muestra el análisis estadístico (n=4 para wt, n=3 para wt+Guanilina, n=4 para R792S±Guanilina; Media±SEM). Prueba t de Student no pareada (valores p: ***<0.001, **<0.01).
Ejemplos
Materiales y métodos
Cultivo celular
Las células HEK se mantuvieron en placas Petri de 100 mm y se cultivaron en medio DMEM suplementado con L-glutamina, penicilina-estreptomicina (Pen&Strep) y 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (HIFBS). Las condiciones de crecimiento fueron 37°C y 5% de CO2. Para los pasajes de días alternos, los cultivos de HEK se dividieron en una dilución de 1:3. Del viernes al lunes, la proporción de división se duplicó para todas las líneas celulares. Para el pase, los cultivos se enjuagaron con PBS y se incubaron con 1 mL de tripsina durante 5 minutos. Las células se resuspendieron en medio de cultivo y finalmente se dividieron hasta la dilución adecuada. Los experimentos se realizaron en placas de 12 pocillos. Para el análisis inmunocitoquímico, se agregaron cubreobjetos estériles de 18 mm antes de la siembra. Se sembraron 500 pL de resuspensión celular en cada pocillo. Si los experimentos se iban a realizar 48 horas después de la preparación de la placa, la proporción de siembra para las células HEK era 1:5. Cuando los experimentos se llevaron a cabo 96 horas después de la siembra, 1:7 fue la dilución de trabajo para las células HEK. A menos que se indique lo contrario, los cultivos de HEK se procesaron 96 horas después de la siembra.
Transfección celular
Los plásmidos que codifican para Th de ratón y GUCY2C humana tenían una estructura principal pcDNA3.1. Las células HEK se transfectaron utilizando el método de fosfato de calcio. Las placas de 12 pocillos se refrescaron con 500 pL de medio de crecimiento antes de la transfección. Para cada par de pocillos, los plásmidos de interés no superaron 2.5 pg y se llenaron hasta 5 pg con el constructo vacío de pBlueScript. La mezcla de plásmidos se llevó a una concentración final de 250 mM de CaCl2 en un volumen total de 110 pL. Se llenó un tubo complementario con 110 pL de solución salina amortiguada con HEPES 2X (HEBS 2X: 1.5 mM de Na2HPO4, 50 mM de HEPES pH 7.05, 280 mM de NaCl). El tubo con CaCl2 se pipeteó gota a gota en el HEBS y se mezcló suavemente. Después de 60 segundos de incubación, se agregaron 110 pL de la mezcla final a cada pocillo. El medio fue reemplazado dentro de las siguientes 24 horas.
Tratamiento químico
24 horas antes de la administración de los diferentes compuestos, las células fueron privadas de suero con medio DMEM suplementado con L-glutamina y Pen&Strep. A menos que se indique lo contrario, la concentración de los diferentes reactivos se reporta en la Tabla 1 y la duración del tratamiento fue de 1 hora.
Inmunotrasferencia tipo Western
Las células se cosecharon en 150 pL de amortiguador de muestra Laemmli (2% de SDS, 10% de glicerol, 60 mM de Tris-Cl pH 6.8, 0.01% de azul de bromofenol, 50 mM de DTT recién agregado). Los pocillos se duplicaron en pares y se agruparon en los mismos tubos para minimizar la variabilidad. Las muestras se sonicaron a máxima potencia durante 3 minutos, se calentaron a 95 °C durante 5 minutos y se centrifugaron brevemente antes de cargarlas. Los geles corridos fueron de poliacrilamida al 10%, excepto para la detección de GUCY2C, que fue óptima en geles al 7% (375 mM de Tris-Cl pH 8.8, 0.1% de APS, 0.1% de SDS, 0.04% de TEMED). Los geles de apilamiento fueron de poliacrilamida al 5% (125 mM de Tris-Cl pH 6.8, 0.1% de APS, 0.1% de SDS, 0.04% de TEMED).
Se cargaron hasta 35 pL de muestra en cada ranura y se corrieron en la presencia de amortiguador tris-glicina y SDS al 0.1%. Las condiciones de corrida fueron 100 V durante los primeros 20 minutos, seguidos de 160 V hasta que el frente de migración alcanzó el fondo del gel. La transferencia se realizó a 100 V sobre membranas de nitrocelulosa de 0.2 pm, en la presencia de amortiguador tris-glicina y metanol al 20%. La duración de la transferencia fue de 140 minutos excepto para la detección de GUCY2C, que se transfirió durante 240 minutos en presencia de 0.1% de SDS. Posteriormente, las membranas se sumergieron en una solución de Ponceau S para verificar la eficiencia de la transferencia (0.1% de Ponceau S, 5% de ácido acético). Después de varios lavados con agua DEMI, las transferencias se incubaron durante 1 hora en la presencia de 5% de leche en polvo y TBS-T (154 mM de NaCl, 49.5 mM de Tris-Cl pH 7.4, 0.1% de Tween-20). La incubación con los anticuerpos primarios se realizó O/N a 4°C en TBS-T (consultar Tabla 2 para dilución y especies). Las membranas se enjuagaron en TBS-T durante 1 hora para eliminar el exceso de anticuerpo. La incubación con los anticuerpos secundarios se realizó durante 60 minutos a temperatura ambiente (dilución 1:10,000 en TBS-T, con la excepción del secundario de cabra que se diluyó 1:20,000). Los anticuerpos secundarios se fusionaron a la peroxidasa de rábano picante y se generaron contra la especie hospedera del anticuerpo primario. Después de lavados adicionales durante 1 hora, las transferencias se expusieron a una solución de quimioluminiscencia mejorada y la señal se detectó utilizando un generador de imágenes Odyssey (LI-COR). La densitometría de banda se realizó con LI-COR Image Studio Lite. Para las cuantificaciones gráficas, 'Cambio de veces' representa la proporción P-Ser40/Th total. Las comparaciones estadísticas entre pares de grupos corresponden a pruebas t de Student no pareadas, calculadas con GraphPad Prism. Los asteriscos indican los siguientes valores p: *<0.05, **<0.01, ***<0.001, ****<0.0001.
Inmunocitoquímica
Se retiró el medio de crecimiento de las placas de 12 pocillos que contenían cubreobjetos de 18 mm. Después de un paso de lavado con PBS helado, las células se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 20 minutos y posteriormente se lavaron 3 veces con PBS (137 mM de NaCl, 2 mM de KH2PO4, 100 mM de Na2HPO4, 2.7 mM de KCl). El bloqueo se realizó durante 1 hora en la presencia de 4% de suero fetal de burro y 0.2% de Tritón X-100. Posteriormente, los cubreobjetos se incubaron O/N a 4 °C con los anticuerpos primarios, diluidos en PBS y 0.2% de Triton X-100 (véase la Tabla 2 para información de anticuerpos). Después de enjuagar las células 3 veces con PBS, la incubación con el anticuerpo secundario se realizó durante 2 horas a temperatura ambiente (dilución 1:1,000 en PBS). Un paso de lavado adicional con PBS precedió a la incubación de 5 minutos con DAPI, diluido 1:3,000 en<p>B<s>. Después de un enjuague final con PBS, los cubreobjetos se embebieron con Fluorosave en portaobjetos de 60 x 20 mm. Las preparaciones finales se dejaron endurecer O/N a 4 °C antes de realizar el análisis bajo el microscopio de fluorescencia (Leica).
Aislamiento de ARN y RT-qPCR
Se descartó el medio de crecimiento de la placa de cultivo y se agregó 1 mLde Trizol a cada pocillo. Las células se lisaron directamente en la placa y se cosecharon en tubos Eppendorf. Se añadieron 200 pL de cloroformo y la mezcla se incubó durante 3 minutos después de agitación intensa. Las muestras se centrifugaron a 4°C durante 15 minutos a 12,000 rcf. Posteriormente, la fase acuosa superior se recolectó en un tubo nuevo y se desecharon las fases inferiores. Se añadieron a las preparaciones 10 pg de glucógeno y 500 pL de isopropanol. Después de una incubación de 10 minutos, las muestras se centrifugaron a 4°C durante 10 minutos a 12,000 rcf. Se retiró con cuidado el sobrenadante de los tubos y posteriormente se enjuagó la pella con 1 mL de etanol al 75%. A un breve paso de vórtice le siguió una centrifugación a 4 °C durante 5 minutos a 12,000 rcf. Los sobrenadantes se descartaron y, una vez que las pellas estuvieron moderadamente secas, se realizó una resuspensión en 30 pL de agua libre de ARNasa. Respecto al análisis RT-qPCR, las muestras de ARN purificado se diluyeron a una concentración final de 2.6 ng/pL. Para cada pocillo de reacción, los volúmenes de los diferentes reactivos fueron los siguientes: 5 pL de amortiguador SYBR Green 2X, 0.1 pL de transcriptasa reversa, 0.1 pL de inhibidor de ARNasa, 0.5 pL de cebador delantero 10 pM, 0.5 pL de cebador reverso 10 pM, 3.8 pL de<a>R<n>purificado 2.6 ng/pL. Las reacciones se llevaron a cabo en un LightCycler 480 (Roche) de acuerdo con el manual QuantiTect SYBR Green RT-PCR (Quiagen). El ARN ribosomal 18S se utilizó como control de carga. Los cebadores se diseñaron utilizando Primer-BLAST y su especificidad se probó en un gel de agarosa al 1.5% una vez finalizada la RT-qPCR.
Resultados
Las células HEK se pueden emplear para estudiar la inducción de la fosforilación de Ser40 tras la activación de GUCY2C.
Estudiamos la regulación de Th a través de la activación de GUCY2C in vitro. Entre las diversas líneas celulares disponibles, en primer lugar, empleamos células HEK ya que son fácilmente transfectables y se habían utilizado previamente para estudiar el papel de GUCY2C en la producción de cGMP (Fiskerstrand T et al., 2012; Müller T et al., 2015). Comprobamos la presencia de los ARNm que codifican para las cinasas. Los datos de RT-qPCR mostraron una expresión positiva de las diferentes isoformas de PKG (PRKG1 y PRKG2) y los centros catalíticos de PKA (PRKACA y PRKACB), lo que sugiere que las células HEK son un modelo adecuado para nuestros propósitos (Fig.3A). Sin embargo, ni TH ni GUCY2C se expresan endógenamente en esta línea celular. Con el objetivo de comprobar si la señalización derivada de cGMP podría promover la fosforilación de Ser40, transfectamos células HEK con un plásmido codificante para Th y las tratamos con un análogo de cGMP artificial (es decir, 8-Bromo-cGMP). Como se esperaba, detectamos un aumento pequeño pero significativo en los niveles de P-Ser40 tras la administración del compuesto (Fig. 3B).
A continuación, para estudiar los efectos potenciales de la activación de GUCY2C en la fosforilación de Th, realizamos cotransfecciones con los plásmidos que codifican para ambas proteínas. El análisis de inmunotransferencia tipo Western reveló cultivos de HEK que expresan Th y GUCY2C. La transfección exclusiva con Th sirvió como control para la expresión y el reconocimiento de GUCY2C (Fig. 4B). El análisis inmunocitoquímico nos permitió identificar células individuales coexpresando ambas proteínas, requisito esencial para estudiar el posible vínculo entre el receptor y la fosforilación de Ser40 (Fig.4A). Lo más importante es que, dentro de este paradigma experimental en el que las cinasas se expresan de forma endógena mientras que Th y GUCY2C se cotransfectan, pudimos aumentar los niveles de P-Ser40 tras la administración por separado de diferentes ligandos del receptor (es decir, guanilina y uroguanilina) (Fig. 4C).
La inducción de P-Ser40 tras la activación de GUCY2C es proporcional a los niveles de cGMP
Respecto a las dos formas por las cuales la activación del receptor podría inducir la fosforilación de Ser40, ambas dependen de la producción inicial de cGMP (Fiskerstrand T et al., 2012). Para probar esta suposición, combinamos guanilina con la administración de IBMX, un inhibidor general de las fosfodiesterasas (PDEs). Esta familia de enzimas descompone los nucleótidos cíclicos en sus formas no cíclicas (Bender AT and Beavo JA, 2006). Por lo tanto, como las variantes cíclicas pueden activar PKA y PKG, planteamos la hipótesis de que la inhibición de las PDEs potenciaría la inducción de P-Ser40 tras la estimulación con GUCY2C. Sorprendentemente, el tratamiento con IBMX potenció el aumento de la fosforilación de Ser40 en comparación con la administración de guanilina (Fig. 5A). Estos datos muestran que el conjunto basal de nucleótidos cíclicos en las células HEK es grande y está continuamente sujeto a degradación por PDEs como mecanismo de retroalimentación negativa. El tratamiento combinado de guanilina con IBMX aumentó aún más la fosforilación de Ser40 en relación con IBMX solamente, lo que sugiere que los conjuntos de nucleótidos cíclicos basales y derivados de GUCY2C muestran efectos aditivos (Fig. 5A).
Sin embargo, dado que IBMX es un inhibidor general de PDE, sus efectos sobre la fosforilación de Ser40 resultan del aumento en los niveles de cAMP y cGMP Para correlacionar el grado de fosforilación de Ser40 exclusivamente con la cantidad de cGMP producido por el receptor, ideamos un enfoque alternativo. Un artículo anterior describió la existencia de mutaciones naturales en el gen codificante de GUCY2C humano, que generan un conjunto de receptores de ganancia de función (Müller T et al., 2015). Estas variantes producen más cGMP que la forma wt en la presencia de guanilina. El mutante con la mayor actividad contiene una sustitución de arginina por serina en la posición 792 (R792S), ubicada en el punto de inicio del dominio catalítico.
Los cultivos de HEK se cotransfectaron con los plásmidos que codifican para Th y la wt o la variante R792S de GUCY2C. En comparación con el receptor wt, el aumento en la fosforilación de Ser40 tras el tratamiento con guanilina fue 1.5 veces mayor cuando se cotransfectó el mutante R792S (Fig. 5B).
La presente invención muestra métodos para aumentar la actividad de Th específicamente en la vía nigroestriatal. Nos concentramos en la fosforilación de su dominio regulador. Se ha reportado que tanto la fosforilación de Ser31 como de Ser40 promueve dicho efecto (Dunkley PR et al., 2004).
En conclusión, nuestros experimentos indican que la vía de señalización subyacente a la activación de GUCY2C es específica para cada sistema modelo. Las células HEK muestran una inducción de la fosforilación de Ser40 que es proporcional a los niveles de actividad de GUCY2C.
La presente invención muestra que la combinación de ligandos GUCY2C con inhibidores de PDE sirve para aumentar la producción de dopamina mediante las células dopaminérgicas. Este hallazgo se utiliza como una terapia para la PD.
Los tratamientos actuales con levodopa a menudo se complementan con inhibidores de AADC que no pueden llegar al cerebro, pero impiden la síntesis de dopamina en los tejidos periféricos (Ahlskog JE et al., 1989). La terapia que proporciona la invención aporta un componente específico, dada la expresión cerebral selectiva de GUCY2C en la SNpc, y un componente más o menos no selectivo proporcionado por la amplia expresión de PDE.. Una inhibición inespecífica de PDEs no es una complicación importante para los tratamientos clínicos. De hecho, algunos fármacos ampliamente utilizados son inhibidores de PDEs que se expresan en diversos tejidos fuera de la diana. Un ejemplo representativo es sildenafil (Viagra), un inhibidor selectivo de PDE5. Esta fosfodiesterasa se expresa en el pene, donde pretende ejercer sus efectos, pero también en el corazón, el páncreas, el riñón o el cerebelo (Lin CS, 2004).
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Tabla 1. Ejemplo de una concentración, o intervalo de concentración y una función de diferentes compuestos utilizados en la presente invención
Compuesto Conc. Función
8-Bromo-cGMP 500 |JM Análogo de cGMP y activador de PKG
Guanilina 10 j M Ligando GUCY2C
Uroguanilina 1 j M Ligando GUCY2C
IBMX 100 j M Inhibidor general de la fosfodiesterasa
Tabla 2. Anticuerpos empleados en inmunotransferencia tipo Western (azul) e inmunocitoquímica (verde). La GUCY2C de ratón y de humano se detectó con los anticuerpos primarios de cabra y ratón, respectivamente. Anticuerpo Dilución Especies
GUCY2C 1:170 Ratón
GUCY2C 1:170 Cabra
Th Total 1:1,000 Oveja
Th Total 1:1,000 Conejo
P-Ser40 1:1,000 Conejo
Actina 1:3,000 Ratón
Anticuerpo primario Dilución Anticuerpo secundario
GUCY2C de cabra 1:100 Burro a Cabra 488
Th Total de conejo 1:1,000 Cabra a Conejo 488

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un agonista de GUCY2C para uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson en un individuo, que comprende además la administración de un inhibidor de PDE al individuo.
2. El agonista de GUCY2C para el uso de la reivindicación 1, en el que el individuo tiene la enfermedad de Parkinson en estadio 1, 2, 3 o 4.
3. El agonista de GUCY2C para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el agonista es guanilina o un derivado funcional de la misma.
4. El agonista de GUCY2C para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el inhibidor de PDE administrado es un inhibidor de PDE no selectivo.
5. El agonista de GUCY2C para el uso de la reivindicación 4, en el que el inhibidor de PDE no selectivo es IBMX.
6. Un método in vitro para aumentar la producción de dopamina mediante una célula dopaminérgica, comprendiendo el método poner en contacto dicha célulaex vivocon un agonista de GUCY2C y proporcionando a dicha célula con un inhibidor de PDE, aumentando así la señalización de Guanilato Ciclasa 2C (GUCY2C) en dicha célula.
7. Un método in vitro para aumentar el nivel de fosforilación de Ser40 de tirosina hidroxilasa en una célula dopaminérgica, comprendiendo el método poner en contacto dicha célulaex vivocon un agonista de GUCY2C y proporcionando a dicha célula con un inhibidor de PDE, aumentando así la señalización de GUCY2C en dicha célula.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, en el que dicho agonista es guanilina o un derivado funcional de la misma.
9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en el que la célula es una neurona dopaminérgica, preferiblemente una neurona dopaminérgica del mesencéfalo.
10. Un agonista de GUCY2C y un inhibidor de PDE para uso en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson en un individuo que padece la enfermedad de Parkinson o está en riesgo de desarrollar la enfermedad
11. Una composición farmacéutica que comprende un agonista de GUCY2C sin una fracción diagnóstica o terapéutica adicional y un inhibidor de PDE para tratar a un individuo que tiene la enfermedad de Parkinson, o está en riesgo de desarrollar la enfermedad.
12. La composición farmacéutica de la reivindicación 11, en la que el agonista es guanilina o un derivado funcional de la misma.
13. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12, en la que el inhibidor de PDE es un inhibidor de PDE no selectivo.
14. La composición farmacéutica de la reivindicación 13, en la que el inhibidor de PDE no selectivo es IBMX.
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