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ES3035801T3 - Recombinant vaccinia virus and pharmaceutical composition comprising same - Google Patents

Recombinant vaccinia virus and pharmaceutical composition comprising same

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ES3035801T3
ES3035801T3 ES19741656T ES19741656T ES3035801T3 ES 3035801 T3 ES3035801 T3 ES 3035801T3 ES 19741656 T ES19741656 T ES 19741656T ES 19741656 T ES19741656 T ES 19741656T ES 3035801 T3 ES3035801 T3 ES 3035801T3
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ES
Spain
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ihd
cancer
gene
vaccinia virus
virus
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ES19741656T
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English (en)
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Sujeong Kim
Heonsik Choi
Minjung Kim
Jaeil Shin
Soonoh Hong
Hyesun Lee
Soondong Lee
Hwanjun Choi
Joonsung Kim
Jieun Hong
Eunjin Lee
Haesu Kang
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Kolon Life Science Inc
Original Assignee
Kolon Life Science Inc
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Abstract

La presente invención se refiere a un virus vaccinia recombinante que comprende un gen que codifica sPD-1 o hialuronidasa, y a una composición farmacéutica que lo comprende. El virus vaccinia recombinante, que comprende un gen para la terapia contra el cáncer y que suprime la expresión de los genes K3L, TK o VGF, presenta un excelente efecto antitumoral. Por lo tanto, el virus vaccinia recombinante de la presente invención puede utilizarse ventajosamente en el tratamiento del cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Virusvacciniarecombinante y composición farmacéutica que lo comprende
Campo Técnico
La presente invención se refiere a un virusvacciniarecombinante que comprende un gen que codifica la proteína de muerte celular programada-1 (sPD-1), un gen que codifica hialuronidasa y un gen que codifica interleucina (IL)-12, y una composición farmacéutica que los comprende.
Estado de la Técnica
Recientemente, se han llevado a cabo activamente estudios sobre virus oncolíticos modificados mediante manipulación genética de varios virus con el fin de desarrollar agentes terapéuticos contra el cáncer. Sin embargo, los problemas con los virus oncolíticos aún no se han resuelto por completo. Por ejemplo, para desarrollar un agente anticancerígeno, se produjo un virus con capacidad de replicación selectiva en tumores mediante manipulación genética. Sin embargo, se han encontrado los siguientes problemas: este virus destruye tanto células normales como cancerosas y además tiene efectos anticancerígenos insuficientes. En consecuencia, existe una demanda continua de desarrollo de una técnica que permita a los virus oncolíticos tener mayor selectividad y eficacia contra las células cancerosas mientras minimizan las influencias sobre las células normales.
Por otro lado, el virusvacciniaes un virus de ADN envuelto con ADN genómico lineal de doble cadena de aproximadamente 200 kbp que codifica aproximadamente 200 genes independientes. El virusvacciniafue utilizado por primera vez por Edward Jenner en el siglo XVIII como vacuna profiláctica contra la viruela. Desde entonces, el virusvacciniase ha utilizado para desarrollar diversas vacunas profilácticas. En las primeras vacunas contra el virusvacciniase utilizó un virus de tipo silvestre y los pacientes vacunados mostraron efectos secundarios graves, como infección sistémica o infección progresiva. Por lo tanto, para reducir los efectos secundarios, se desarrollaron virusvacciniamodificados con toxicidad atenuada, como el virusvacciniaAnkara modificado (MVA), el LC16m8 (derivado de la cepa Lister) y el virusvacciniaNueva York (NYVAC, derivado de la cepavacciniaCopenhague). Sobre la base de estos virusvacciniase han desarrollado vacunas aplicables a diversas enfermedades. En particular, cepas del virusvacciniacomo Western Reserve (WR), NYVAC, Wyeth y Lister también se están desarrollando como virus oncolíticos.
El documento WO2016/008976 divulga un virusvacciniaque expresa un inhibidor de puntos de control. El documento WO2014/047350 divulga un virusvacciniaque expresa un compuesto que antagoniza la actividad de PD-1 y expresa IL-12.
Zuqiang Liu et al. enseñan la combinación de un virusvacciniaoncolítico y un inhibidor de puntos de control para su uso en el tratamiento del cáncer.
Mee Y Bartee et al. divulgan un virus mixomavirus oncolítico y un inhibidor de puntos de control para su uso en el tratamiento del cáncer.
El documento WO2018/057755 divulga virusvacciniaoncolíticos que expresan una hialuronidasa.
Divulgación de la invención
Problema técnico
Un objetivo de la presente invención es proporcionar un virusvacciniarecombinante que comprende un gen que codifica la proteína soluble de muerte celular programada 1 (sPD-1), un gen que codifica hialuronidasa y un gen que codifica interleucina (IL)-12 y que opcionalmente tiene expresión suprimida de algunos genes en el mismo, y una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento del cáncer, que lo comprende como ingrediente activo.
Solución al problema
Para lograr el objetivo anterior, la presente invención proporciona un virusvacciniarecombinante, que comprende un gen que codifica la proteína de muerte celular programada soluble 1 (sPD-1), un gen que codifica hialuronidasa y un gen que codifica interleucina (IL)-12.
Además, la presente invención proporciona una composición que contiene, como ingrediente activo, el virusvacciniarecombinante de la invención, para su uso en la prevención o tratamiento del cáncer.
Efectos ventajosos de la invención
El virusvacciniarecombinante de acuerdo con la presente invención, tiene un excelente efecto antitumoral. Por lo tanto, el virusvacciniarecombinante de la presente invención se puede utilizar de forma útil para tratar el cáncer.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 ilustra un diagrama esquemático de la estructura genética del virusvacciniaIHD-W (IHD-W-VV01) en el que se eliminan VGF, TK y K3L. Los términos abreviados relacionados con la eliminación de genes virales y la introducción de genes terapéuticos tienen los significados que se muestran en la Tabla 1 a continuación.
[Tabla 1]
La Fig.2 ilustra un diagrama esquemático de la estructura genética de IHD-W-VV02 en el que se eliminan VGF, TK y K3L y en el que se inserta el gen de sPD1-Fc.
La Fig.3 ilustra los resultados obtenidos al realizar la electroforesis del producto de PCR del ADNg de IHD-W-VV02, que identifica que se ha insertado el gen de sPD1-Fc.
La Fig.4 ilustra los resultados obtenidos al realizar transferencia Western de proteínas secretadas por células HeLa infectadas con IHD-W-VV02, que muestra que se ha expresado el gen de sPD1-Fc.
La Fig.5 ilustra un diagrama esquemático de la estructura genética de IHD-W-VV03 en el que se eliminan VGF, TK y K3L y en el que se inserta el gen de PH20.
La Fig.6 ilustra los resultados obtenidos al realizar la electroforesis del producto de PCR del ADNg de IHD-W-VV03, que muestra que se ha insertado el gen de PH20.
La Fig.7 ilustra los resultados obtenidos al realizar transferencia Western de proteínas secretadas por células HeLa infectadas con IHD-W-VV03, que muestra que se ha expresado el gen de PH20.
La Fig.8 ilustra un diagrama esquemático de la estructura genética de IHD-W-VV04 en el que se eliminan VGF, TK y K3L y en el que se inserta el gen de IL-12.
La Fig.9 ilustra los resultados obtenidos al realizar la electroforesis del producto de PCR del ADNg de IHD-W-VV04, que muestra que se ha insertado el gen de IL-12.
La Fig.10 ilustra los resultados obtenidos al realizar transferencia Western de proteínas secretadas por células HeLa infectadas con IHD-W-VV04, que muestra que se ha expresado el gen de IL-12.
La Fig.11 ilustra un diagrama esquemático de la estructura genética de IHD-W-VV05 en el que se eliminan VGF, TK y K3L y en el que se insertan los genes de sPD1-Fc y PH20.
La Fig.12 ilustra los resultados obtenidos al realizar la electroforesis del producto de PCR del ADNg de IHD-W-VV05, que identifica que se han insertado los genes de sPD1-Fc y PH20.
La Fig.13 ilustra los resultados obtenidos al realizar transferencia Western de proteínas secretadas por células HeLa infectadas con IHD-W-VV05, que muestra que se han expresado los genes de sPD1-Fc y PH20.
La Fig.14 ilustra un diagrama esquemático de la estructura genética de IHD-W-VV06 en el que se eliminan VGF, TK y K3L y en el que se insertan los genes de sPD1-Fc, PH20 e IL-12.
La Fig.15 ilustra los resultados obtenidos al realizar la electroforesis del producto de PCR del ADNg de IHD-W-VV06, que identifica que se han insertado los genes de sPD1-Fc, PH20 e IL-12.
La Fig.16 ilustra los resultados obtenidos al realizar transferencia Western de proteínas secretadas por células HeLa infectadas con IHD-W-VV06, que muestra que se han expresado los genes de sPD1-Fc, PH20 e IL-12. La Fig.17 ilustra un diagrama esquemático de la estructura genética del virusvacciniaWR (WR-VV01) en el que la expresión de VGF, TK y K3L está inactivada. Los términos abreviados relacionados con la inactivación de genes virales y la introducción de genes terapéuticos tienen los significados que se muestran en la Tabla 2 a continuación.
[Tabla 2]
La Fig.18 ilustra un diagrama esquemático de la estructura genética de WR-VV06 en el que se inactiva la expresión de VGF, TK y K3L y en el que se insertan los genes de sPD1-Fc, PH20 e IL-12.
La Fig.19 ilustra los resultados obtenidos al realizar la electroforesis del producto de PCR del ADNg de WR-VV06, que muestra que se han insertado los genes de sPD1-Fc, PH20 e IL-12.
La Fig.20a ilustra los resultados obtenidos al realizar transferencia Western de proteínas secretadas por células HeLa infectadas con WR-VV06, que muestra que se han expresado los genes de sPD1-Fc, PH20.
La Fig.20b ilustra los resultados obtenidos al realizar una prueba ELISA sobre proteínas secretadas por células HeLa infectadas con WR-VV06, que muestra que se ha expresado el gen de IL-12.
La Fig.21 ilustra un diagrama esquemático de la estructura genética del virusvacciniaLister (Lister-VV01) en el que se eliminan VGF, TK y K3L. Los términos abreviados relacionados con la eliminación de genes virales y la introducción de genes terapéuticos tienen los significados que se muestran en la Tabla 3 a continuación.
[Tabla 3]
La Fig.22 ilustra un diagrama esquemático de la estructura genética de Lister-VV06 en el que se eliminan VGF, TK y K3L y en el que se insertan los genes de sPD1-Fc, PH20 e IL-12.
La Fig.23 ilustra los resultados obtenidos al realizar la electroforesis del producto de PCR del ADNg de Lister-VV06, que muestra que se han insertado los genes de sPD1-Fc, PH20 e IL-12.
La Fig.24a ilustra los resultados obtenidos al realizar transferencia Western de proteínas secretadas por células HeLa infectadas con Lister-VV06, que muestra que se han expresado los genes de sPD1-Fc, PH20.
La Fig.24b ilustra los resultados obtenidos al realizar una prueba ELISA sobre proteínas secretadas por células HeLa infectadas con Lister-VV06, que muestra que se ha expresado el gen de IL-12.
La Fig.25 ilustra los resultados obtenidos mediante la administración intratumoral, a un modelo de tumor colorrectal de ratón, de IHD-W-VV02, IHD-W-VV03 e IHD-W-VV05, y luego midiendo el crecimiento del tumor.
La Fig.26 ilustra los resultados obtenidos mediante la administración intratumoral, a un modelo de melanoma de ratón, de IHD-W-VV01 e IHD-W-VV05, y luego midiendo el crecimiento del tumor.
La Fig.27 ilustra los resultados obtenidos mediante la administración intratumoral, a un modelo de tumor de pulmón de ratón, de IHD-W-VV01 e IHD-W-VV05, y luego midiendo el crecimiento del tumor.
La Fig.28 ilustra los resultados obtenidos mediante la administración intratumoral, a un modelo de tumor colorrectal de ratón, de IHD-W-VV02, IHD-W-VV03, IHD-W-VV04 e IHD-W-VV06, y luego midiendo el crecimiento del tumor.
La Fig.29 ilustra los resultados obtenidos mediante la administración intratumoral, a un modelo de tumor de pulmón de ratón, de IHD-W-VV02, IHD-W-VV03, IHD-W-VV04 e IHD-W-VV06, y luego midiendo el crecimiento del tumor.
La Fig.30 ilustra los resultados obtenidos mediante la administración intratumoral, a un modelo de tumor colorrectal de ratón, de IHD-W-VV05 e IHD-W-VV06, y luego midiendo el crecimiento del tumor.
La Fig.31 ilustra los resultados obtenidos mediante la administración intratumoral, a un modelo de melanoma de ratón, de IHD-W-VV05 e IHD-W-VV06, y luego midiendo el crecimiento del tumor.
La Fig.32 ilustra los resultados obtenidos mediante la administración intratumoral, a un modelo de tumor de pulmón de ratón, de IHD-W-VV05 e IHD-W-VV06, y luego midiendo el crecimiento del tumor.
La Fig.33 ilustra los resultados obtenidos mediante la administración intratumoral, a un modelo de melanoma de ratón, de IHD-W-VV01 e IHD-W-VV06, y luego midiendo el crecimiento del tumor.
La Fig.34 ilustra los resultados obtenidos mediante la administración intratumoral, a un modelo de tumor de pulmón de ratón, de IHD-W-VV01 e IHD-W-VV06, y luego midiendo el crecimiento del tumor.
La Fig.35 ilustra los resultados obtenidos mediante la administración intratumoral, a un modelo de tumor de pulmón de ratón, de WR-VV01 y WR-VV06, y luego midiendo el crecimiento del tumor.
La Fig.36 ilustra los resultados obtenidos mediante la administración intratumoral, a un modelo de tumor de pulmón de ratón, de Lister-VV01 y Lister-VV06, y luego midiendo el crecimiento del tumor.
La Fig.37 ilustra los resultados obtenidos al determinar la capacidad de destrucción celularin vitrode IHD-W-VV06, WR-VV06 y Lister-VV06.
Mejor modo de llevar a cabo la invención
En aspecto de la presente invención, se proporciona un virusvacciniarecombinante que comprende un gen que codifica la proteína de muerte celular programada soluble 1 (sPD-1), un gen que codifica hialuronidasa y un gen que codifica IL-12.
El término "sPD-1" como se utiliza en este documento se refiere a un dominio extracelular o un fragmento de la muerte programada 1 (PD-1), que es una proteína transmembrana tipo I de 55 kDa y pertenece a una familia de moléculas de inmunoglobulina y es bien conocida como una molécula co-inhibitoria en las células T Además, el término sPD-1 puede usarse con un significado que incluye la proteína de fusión sPD-1 en el que se fusionan el sPD-1 de longitud completa o un fragmento de sPD-1 y una región Fc de inmunoglobulina. Un ejemplo específico de la proteína de fusión puede ser sPD-1-Fc en el que sPD-1 está unido a una región Fc de inmunoglobulina. En el presente documento, el sPD-1 y el Fc pueden unirse entre sí directamente o a través de un enlazador. En el presente documento, el enlazador puede ser un péptido compuesto de 1 a 50, de 2 a 45, de 3 a 40, de 5 a 30 o de 7 a 25 aminoácidos, y puede ser específicamente un péptido compuesto de 3 a 40 aminoácidos. El enlazador puede ser una secuencia de aminoácidos seleccionada, pero no limitada a, el grupo que consiste en GGGGS (SEQ ID NO: 123), GGGGSGGGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 124), SPKAQAGGGGSAQPQAEGSLGGGGSAKASAPAGGGGS (SEQ ID NO: 125), GGSGGSGGSGGSGGSEQEER (SEQ ID NO: 126), GGGGSGGGGGSGGS (SEQ ID NO: 127), SGGGGGSGGGSGGGGSGTHTCPPCP (SEQ ID NO: 128), GGSGGGGS (SEQ ID NO: 129) y GGGGSGGGGGSGGGS (SEQ ID NO: 130).
El sPD-1 puede ser parte de una secuencia del GenBank: NM_008798.2, y no está limitado a ninguna secuencia. Específicamente, el sPD-1 puede ser la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 131 o la SEQ ID NO: 133. Además, el sPD-1 puede tener una homología de aproximadamente el 90 %, 91 %, 92 %, 93 % o 94 % o más, preferiblemente aproximadamente el 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más, y lo más preferiblemente aproximadamente el 99 % o más, con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 131, siempre y cuando no se modifique la función del sPD-1.
Además, el término "gen sPD-1" como se utiliza en este documento se refiere a un gen que codifica la "proteína sPD-1" o un gen que codifica la "proteína de fusión sPD-1" en el que se fusionan la proteína sPD-1, una proteína diana y otras proteínas. Específicamente, el gen sPD-1 puede codificar la proteína de fusión sPD-1 que contiene una región Fc (sPD1-Fc). El gen sPD-1 puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 132 o 134. Además, el gen sPD-1 puede tener una homología de aproximadamente el 90 %, 91 %, 92 %, 93 % o 94 % o más, preferiblemente aproximadamente el 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más, y lo más preferiblemente aproximadamente el 99 % o más, con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 134, siempre y cuando no se modifique la función del sPD-1.
Además, el término "hialuronidasa" tal como se utiliza en este documento se refiere a una enzima que descompone el ácido hialurónico. La hialuronidasa puede derivarse de ovejas, ganado, ratones o humanos. Específicamente, la hialuronidasa puede ser hialuronidasa humana (PH20) o hialuronidasa humana recombinante (rHuPH20). La hialuronidasa puede ser, pero no se limita a, una secuencia del GenBank: NM_003117.4. Específicamente, la hialuronidasa puede tener la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 135. Además, específicamente, el gen de la hialuronidasa puede tener la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 136. Además, el gen de la hialuronidasa puede tener una homología de aproximadamente el 90 %, 91 %, 92 %, 93 % o 94 % o más, preferiblemente aproximadamente el 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más, y lo más preferiblemente aproximadamente el 99 % o más, con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 136, siempre y cuando no se modifique la función de la hialuronidasa.
Además, el término "IL-12" tal como se utiliza en este documento es una molécula que pertenece a la familia de las citocinas y está relacionada con el sistema inmunológico. La IL-12 puede ser la misma que la obtenida de cualquier animal, como humanos (hIL-12), ratones (mIL-12), caballos, ganado y cerdos. La IL-12 puede ser, pero no está limitada a, una secuencia divulgada en n M_000882.3 (hIL-12A), AY008847.1 (hIL-12B), NM_001159424.2 (mIL-12a) o NM_001303244.1 (mIL-12p) del GenBank. Específicamente, la IL-12 puede ser la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 137. Específicamente, el gen de IL-12 puede incluir un enlazador representado por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 138, la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 139 (subunidad p35), o la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 140 (subunidad p40). Además, el gen de IL-12 puede tener una homología de aproximadamente el 90 %, 91 %, 92 %, 93 % o 94 % o más, preferiblemente aproximadamente el 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más, y lo más preferiblemente aproximadamente el 99 % o más, con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 138 a la SEQ ID NO: 140, siempre y cuando no se modifique la función de la IL-12.
El virusvacciniarecombinante es un virusvacciniaque comprende el gen sPD-1, el gen de la hialuronidasa y el gen de IL-12. En el presente documento, el gen sPD-1, el gen de la hialuronidasa y el gen de IL-12 se insertan en el genoma del virusvaccinia.Además, los genes también pueden insertarse en diferentes posiciones del genoma del virusvaccinia; sin embargo, dichos genes pueden insertarse en la misma posición o en posiciones similares. A modo de ejemplo, cada uno de dichos genes puede insertarse en la posición TK, K3L o VGF del virusvaccinia.El virusvacciniarecombinante expresa sPD-1, hialuronidasa e IL-12 en una célula huésped. El virusvacciniarecombinante es un virusvacciniacapaz de expresar el gen sPD-1, el gen de la hialuronidasa y el gen de IL-12.
El virusvacciniamencionado anteriormente puede ser un virusvacciniaque tiene la expresión suprimida de cualquiera de los genes seleccionados del grupo que consiste en un gen que codifica K3L, un gen que codifica la timidina quinasa (TK), un gen que codifica el factor de crecimiento devaccinia(VGF) y combinaciones de los mismos. En el presente documento, las combinaciones pueden referirse a al menos dos de los genes que codifican K3L, el gen que codifica TK y el gen que codifica VGF.
Por ejemplo, el virusvacciniarecombinante puede ser un virusvacciniaque tiene el gen sPD-1, el gen de hialuronidasa y el gen de IL-12, que tiene la expresión suprimida de uno cualquiera seleccionado del grupo que consiste en el gen de K3L, el gen de TK, el gen del VGF y combinaciones de los mismos.
El término "VGF" tal como se utiliza en este documento se refiere al factor de crecimiento devaccinia.El factor de crecimiento devacciniaes una enzima que exhibe una actividad similar al factor de crecimiento epitelial. El factor de crecimiento devacciniacodificado por el gen del VGF exhibe una actividad de factor de crecimiento en caso de infección con el virus y puede sintetizarse en una etapa inicial de la infección causada por el virus. El VGF puede ser una secuencia del GenBank: AAO89288.1, a Bd52455.1 o AIX98927.1, pero no se limita a ellos. Específicamente, el VGF puede tener la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 141. Además, el gen del VGF puede ser la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 142. El VGF puede tener una homología de aproximadamente 70 % o 75 % o más, y preferiblemente aproximadamente 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 % u 89 % o más, con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 141. Además, el gen del VGF puede tener una homología de aproximadamente el 90 %, 91 %, 92 %, 93 % o 94 % o más, preferiblemente aproximadamente el 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más, y lo más preferiblemente aproximadamente el 99 % o más, con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 142.
El término "TK" tal como se utiliza en este documento se refiere a la timidina quinasa. La timidina quinasa es una enzima involucrada en la biosíntesis de nucleótidos. La timidina quinasa codificada por el gen de TK hace que un ácido fosfórico en una posición y del ATP se una a la timidina para que se puedan producir nucleótidos que constituyen un ADN viral. La TK puede ser una secuencia del GenBank: AAO89373.1, ABD52560.1 o AIX99011.1, pero no se limita a ellas. Específicamente, la TK puede tener la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 143. El gen de TK puede ser la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 144. La TK puede tener una homología de aproximadamente 70 % o 75 % o más, y preferiblemente aproximadamente 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 % u 89 % o más, con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 143. Además, el gen de TK puede tener una homología de aproximadamente el 90 %, 91 %, 92 %, 93 % o 94 % o más, preferiblemente aproximadamente el 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más, y lo más preferiblemente aproximadamente el 99 % o más, con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 144.
El término "K3L" tal como se utiliza en este documento se refiere a la proteína K3L. La proteína K3L codificada por el gen de K3L es una proteína que tiene una homología con el factor de iniciación de la traducción-2a (eIF-2a) y puede suprimir la acción de la proteína quinasa R (PKR), que es un activador del interferón. El K3L puede ser una secuencia del GenBank: AAO89313.1, ABD52483.1 o AGB75754.1, pero no se limita a ellas. Específicamente, el K3L puede tener la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 145. El gen de K3L puede ser la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 146. El K3L puede tener una homología de aproximadamente 70 % o 75 % o más, y preferiblemente aproximadamente 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 % u 89 % o más, con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 145. Además, el gen de K3L puede tener una homología de aproximadamente el 90 %, 91 %, 92 %, 93 % o 94 % o más, preferiblemente aproximadamente el 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % o más, y lo más preferiblemente aproximadamente el 99 % o más, con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 146.
La expresión suprimida de un gen de acuerdo con la presente invención significa que el gen no se expresa o solo se expresa una parte del gen mediante la eliminación parcial o total del gen o la inserción de un gen extraño en el gen, de modo que no se exhibe una actividad de una proteína codificada por el gen. Un método para eliminar el gen o insertar un gen extraño puede realizarse mediante métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, esto puede llevarse a cabo mediante métodos para insertar un gen extraño que se divulgan en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, de J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis (2003), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Virology Methods Manual, editado por Brian W J Mahy and Hillar O Kangro (1996), Academic Press and Expression of genes by Virus vaccinia vectors, y Current Protocols in Molecular Biology, publicado por John Wiley and Son (1998), capítulo 16. Específicamente, en una realización de la presente invención, se insertó un gen extraño utilizando el sistema de plásmido pGEM-T Easy (Promega, Cat No. A1360) o pGEM-T (Promega, Cat No. A3600).
El virusvacciniapuede seleccionarse, entre otros, del grupo que consiste en Western Reserve (WR), New York Virus vaccinia (NYVAC), Wyeth (The New York City Board of Health; NYCBOH), LC16m8, Lister, Copenhague, Tian Tan, USSR, Tashkent, Evans, International Health Division-J (IHD-J), International Health Division-White (IHD-W), variantes de los mismos y combinaciones de los mismos. Específicamente, el virusvacciniapuede ser WR, Lister o IHD-W, y puede tener una secuencia del GenBank: AY243312.1, DQ121394.1 o AIX98951.1. En una realización de la presente invención, el virusvacciniapuede ser IHD-W.
El término "V" o "virus V" como se utiliza en este documento se refiere a un virusvacciniarecombinante en el que se elimina el gen del factor de crecimiento devaccinia,VGF, y el virus no expresa el gen del VGF debido a la eliminación del gen del VGF.
Además, el término "T" o "virus T" como se utiliza en este documento se refiere a un virusvacciniarecombinante en el que se elimina el gen de la timidina quinasa (TK) y el virus no expresa el gen de TK debido a la eliminación de dicho gen.
Además, el término "K" o "virus K" como se utiliza en este documento se refiere a un virusvacciniarecombinante en el que se elimina el gen de K3L y el virus no expresa el gen de K3L debido a la eliminación de dicho gen.
Además, el término "VT" o "virus VT" como se utiliza en este documento se refiere a un virusvacciniarecombinante en el que se eliminan los genes del VGF y TK. Los métodos para inactivar la expresión del factor de crecimiento devacciniay la timidina quinasa son los descritos anteriormente.
Además, el término "IHD-W-VV01" como se utiliza en este documento se refiere a un virusvacciniaIHD-W recombinante en el que se eliminan los genes del VGF, TK y K3L. Los métodos para inactivar la expresión del factor de crecimiento devaccinia,la timidina quinasa y las proteínas K3L son los descritos anteriormente.
Además, el término "IHD-W-VV02" como se utiliza en este documento se refiere a un virusvacciniaIHD-W recombinante en el que se eliminan los genes del VGF, TK y K3L y se induce la expresión del gen de sPD1-Fc.
Además, el término "IHD-W-VV03" como se utiliza en este documento se refiere a un virusvacciniaIHD-W recombinante en el que se eliminan los genes del VGF, TK y K3L y se induce la expresión del gen de PH20.
Además, el término "IHD-W-W04" como se utiliza en este documento se refiere a un virusvacciniaIHD-W recombinante en el que se eliminan los genes del VGF, TK y K3L y se induce la expresión del gen de IL-12.
Además, el término "IHD-W-W05" como se utiliza en este documento se refiere a un virusvacciniaIHD-W recombinante en el que se eliminan los genes del VGF, TK y K3L y se induce la expresión de los genes de sPD1-Fc y PH20.
Además, el término "IHD-W-W06" como se utiliza en este documento se refiere a un virusvacciniaIHD-W recombinante en el que se eliminan los genes del VGF, TK y K3L y se induce la expresión de los genes de sPD1-Fc, PH20 e IL-12.
En concreto, como ejemplo del virusvacciniarecombinante de acuerdo con la presente invención, se pueden mencionar los siguientes. Las variantes del virusvacciniaWR pueden incluir virusvacciniaWR en los que se suprime la expresión de al menos uno de los genes del VGF, TK y K3L y se induce la expresión de los genes de sPD1-Fc, PH20 e IL-12.
Además, las variantes del virusvacciniaNYVAC pueden incluir virusvacciniaNYVAC en los que se suprime la expresión de al menos uno de los genes del VGF, TK y K3L y se induce la expresión de los genes de sPD1-Fc, PH20 e IL-12.
Además, las variantes del virusvacciniade Wyeth pueden incluir virusvacciniade Wyeth en los que se suprime la expresión de al menos uno de los genes del VGF, TK y K3L y se induce la expresión de los genes de sPD1-Fc, PH20 e IL-12.
Además, las variantes del virusvacciniaLister pueden incluir virusvacciniaLister en los que se suprime la expresión de al menos uno de los genes del VGF, TK y K3L y se induce la expresión de los genes de sPD1-Fc, PH20 e IL-12.
Además, las variantes del virusvacciniaTian tan pueden incluir virusvacciniaTian tan en los que se suprime la expresión de al menos uno de los genes del VGF, TK y K3L y se induce la expresión de los genes de sPD1-Fc, PH20 e IL-12.
Además, las variantes del virusvacciniaUSSR pueden incluir virusvacciniaUSSR en los que se suprime la expresión de al menos uno de los genes del VGF, TK y K3L y se induce la expresión de los genes de sPD1-Fc, PH20 e IL-12.
Además, las variantes del virusvacciniaTashkent pueden incluir virusvacciniaTashkent en los que se suprime la expresión de al menos uno de los genes del VGF, TK y K3L y se induce la expresión de los genes de sPD1-Fc, PH20 e IL-12.
Además, las variantes del virusvacciniaIHD-J pueden incluir virusvacciniaIHD-J en los que se suprime la expresión de al menos uno de los genes del VGF, TK y K3L y se induce la expresión de los genes de sPD1-Fc, PH20 e IL-12.
Además, las variantes del virusvacciniaIHD-W pueden incluir virusvacciniaIHD-W en los que se suprime la expresión de al menos uno de los genes del VGF, TK y K3L y se induce la expresión de los genes de sPD1-Fc, PH20 e IL-12.
En otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento del cáncer, que comprende, como ingrediente activo, el virusvacciniarecombinante de acuerdo con la presente invención. En el presente documento, como se describió anteriormente, el virusvacciniarecombinante puede ser un virusvacciniaen el que se induce la expresión de los genes de sPD1-Fc, PH20 e IL-12, y se suprime la expresión de los genes del VGF, TK o K3L, o combinaciones de los mismos. Los genes de sPD1-Fc, PH20, IL-12, VGF, TK y K3L son los descritos anteriormente.
El término "cáncer" tal como se utiliza en este documento puede ser cáncer sólido o cáncer de la sangre. En el presente documento, el tumor sólido puede seleccionarse del grupo que consiste en cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de tiroides, cáncer de mama, cáncer de cerebro, cáncer de cabeza y cuello, fibrosarcoma, cáncer de esófago, cáncer de piel, cáncer de timo, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de hígado, cáncer de ovario, cáncer de útero, cáncer de vejiga, cáncer de recto, cáncer de vesícula biliar, cáncer de las vías biliares, cáncer de páncreas y combinaciones de los mismos. De acuerdo con una realización de la presente invención, el cáncer puede ser cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de cabeza y cuello, fibrosarcoma, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de piel o cáncer colorrectal. Además, el cáncer sanguíneo puede seleccionarse del grupo que consiste en linfoma, leucemia aguda, mieloma múltiple y combinaciones de los mismos.
La composición farmacéutica de la presente invención puede contener además uno o más aditivos farmacéuticamente aceptables seleccionados del grupo que consiste en excipientes, lubricantes, agentes humectantes, edulcorantes, fragancias y conservantes.
La composición de la presente invención puede formularse de acuerdo con un método convencional. La composición de la presente invención puede formularse empleando un método conocido en la técnica a fin de proporcionar una liberación rápida, sostenida o retardada de un ingrediente activo, en particular después de
ser administrado a un mamífero. Dependiendo de la formulación, la composición de la presente invención puede administrarse apropiadamente a un individuo. Dicha administración puede ser parenteral, y entre sus ejemplos
se pueden incluir la vía intratumoral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, intraarterial, subcutánea, intranasal, epidural y oral. Una forma de preparación para administración parenteral puede ser
una preparación inyectable.
El individuo puede ser un mamífero, y el mamífero puede incluir, pero no está limitado a, primates (por ejemplo, humanos), ganado, ovejas, cabras, caballos, cerdos, perros, gatos, conejos, ratas, ratones, peces, aves y
similares. En concreto, el mamífero puede ser un ser humano. La composición de la presente invención puede
ser administrada apropiadamente por una persona experta en la materia dependiendo de la edad, sexo, peso,
gravedad de los síntomas de la enfermedad y vía de administración del paciente. La administración puede ser
una vez al día o varias veces al día, y puede administrarse repetidamente en un ciclo apropiado.
Una dosis preferida de una composición que contiene el virusvacciniarecombinante de la presente invención
varía dependiendo de la condición y el peso de un individuo, la gravedad de la enfermedad, la forma del
fármaco, la vía y la duración de la administración, y puede ser seleccionada apropiadamente por una persona
experta en la materia. En concreto, la dosis puede ser tal que un paciente reciba partículas virales, unidades
virales que tienen infectividad (TCID<50>), o unidades formadoras de placa (ufp) de 1*10<5>hasta 1*10<18>, y preferiblemente 1*10<5>, 2*10<5>, 5*10<5>, 1*10<®>, 2*10<®>, 5*10<®>, 1*10<7>, 2*10<7>, 5*10<7>, 1*10<8>2*10<8>, 5*10<8>, 1 2*10<9>, 5*10<9>, 1*10<10>, 5*10<10>, 1*10<11>, 5*10<11>, 1*10<12>, 1*10<13>, 1*10<14>, 1*10<15>, 1*10<1®>, 1*10<17>o más, en los que
se pueden incluir diversos valores e intervalos entre ellos. Además, una dosis de virus puede ser de 0.1 ml, 1
ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, ® ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml o más, y pueden incluirse todos los valores e intervalos
entre ellos.
Modo de la invención
A continuación, la presente invención se describirá con más detalle con referencia a los siguientes ejemplos.
Sin embargo, los siguientes ejemplos tienen como único fin ilustrar la presente invención, y la presente
invención no se limita a ellos.
I. Producción de virusvacciniarecombinante
Los presentes inventores construyeron plásmidos virales devacciniarecombinantes en los que se eliminan los
genes de TK, VGF y K3L o se inactiva su expresión. Utilizando estos plásmidos se produjeron virusvacciniarecombinantes en los que se suprime la expresión de los genes antes mencionados y se compararon sus propiedades como sustancias anticancerígenas. Además, los presentes inventores construyeron plásmidos
virales devacciniarecombinantes obtenidos mediante la inserción de genes de sPD1-Fc, PH20, IL-12 en los
plásmidos virales devacciniarecombinantes anteriores. Utilizando estos plásmidos se produjeron virusvacciniarecombinantes en los que se induce la expresión de los genes antes mencionados y se compararon sus propiedades como sustancias anticancerígenas.
Ejemplo 1. Producción de virus vaccinia IHD-W recombinante
Ejemplo 1.1. Producción del virus IHD-W-VV01
Ejemplo 1.1.1. Construcción del plásmido viral vaccinia IHD-W recombinante en el que se elimina el gen
del VGF
En primer lugar, se amplificaron mediante PCR las regiones genéticas que flanquean el gen del VGF en ambos
lados del ADN genómico del virusvacciniaIHD-W (ATCC, Cat No.v R-1441).En el presente documento, la información sobre los cebadores utilizados para la amplificación de secuencias de nucleótidos homólogas que
flanquean el gen del VGF en ambos lados se muestra en la Tabla 4 a continuación. De esta manera, se obtuvieron fragmentos de VGF-L(IHD-W) y VGF-R(IHD-W), y luego se ligaron con un plásmido pGEM-T Easy
para construir pGEM-T Easy-VGF-L(IHD-W) o pGEM-T Easy-VGF-R(IHD-W).
El pGEM-T Easy-VGF-R(IHD-W) y el pSP72 se trataron respectivamente con EcoRI y BglII, y luego se ligaron para construir pSP72-VGF-R(IHD-W). El pSP72-VGF-R(IHD-W) construido y el pGEM-T Easy-VGF-L(IHD-W) fueron tratados respectivamente con HindIII y BamHI, y ligados para construir pSP72-VGF-L-VGF-R(IHD-W).
A continuación, para introducir el promotor p11 y el gen LacZ en el pSP72-VGF-L-VGF-R(IHD-W), un casete de expresión p11-LacZ en el plásmido lanzadera WR VGF(i) construido en el Ejemplo 2.1.1 a continuación, y el pSP72-VGF-L-VGF-R(IHD-W) se trataron con NheI y PacI, y se ligaron para construir pSP72-VGF-L-p11-LacZ-VGF-R(IHD-W) (en adelante denominado "plásmido lanzadera VGF IHD-W").
Ejemplo 1.1.2. Construcción del plásmido viral vaccinia IHD-W recombinante en el que se elimina el gen de TK
En primer lugar, para obtener regiones genéticas que flanquean el gen de TK en ambos lados del ADN genómico del virusvacciniaIHD-W, se realizó PCR y, como resultado, se obtuvieron los fragmentos TK-L(IHD-W) y TK-R(IHD-W). En el presente documento, los cebadores utilizados se muestran en la Tabla 5 a continuación. El fragmento TK-R(IHD-W) obtenido y el plásmido pSP72 se trataron respectivamente con EcoRI y BglII y se ligaron para construir pSP72-TK-R(IHD-W). Además, el fragmento pSP72-TK-R(IHD-W) y el fragmento TK-L(IHD-W) se trataron respectivamente con PstI y BamHI, y se ligaron para construir pSP72-TK-L-TK-R(IHD-W).
El plásmido pSP72-TK-L-TK-R(IHD-W) construido y pSP72-TK-L-EGFP-pSE/L-p7.5-TK-R(WR), que es el plásmido lanzadera WR TK(i) construido en el Ejemplo 2.1.2 a continuación, se trataron respectivamente con EcoRI y NotI, y se ligaron para construir finalmente pSP72-TK-L-TF-EGFP-pSE/L-p7.5-Gpt-TK-R(IHD-W) (en adelante denominado "plásmido lanzadera IHD-W t K").
[Tabla 5]
Ejemplo 1.1.3. Construcción del plásmido viral vaccinia IHD-W recombinante en el que se elimina el gen de K3L
En primer lugar, las regiones genéticas que flanquean el gen de K3L en ambos lados del ADN genómico del virusvacciniaIHD-W se amplificaron mediante PCR y luego se insertaron respectivamente en pGEM-T Easy, para construir pGEM-T Easy-K3L-L(IHD-W) y pGEM-T Easy-K3L-R(IHD-W). En el presente documento, los cebadores utilizados se muestran en la Tabla 6 a continuación.
Para construir un casete de expresión génica dentro del plásmido lanzadera K3L, se amplificó el casete del gen p7.5-DsRed por PCR usando como plantilla el plásmido lanzadera WR K3L(i) construido en el Ejemplo 2.1.3 a continuación, y luego se insertó en pGEM-T Easy para construir pGEM-T Easy-p7.5-DsRed. Las secuencias de cebadores utilizadas para la amplificación del promotor p7.5 y del gen DsRed se muestran en la Tabla 6 a continuación.
[Tabla 6]
Los plásmidos pGEM-T Easy-p7.5-DsRed y pSP72 construidos se trataron respectivamente con HindIII y EcoRV, y luego se ligaron para completar pSP72-p7.5-DsRed. Además, el pSP72-p7.5-DsRed construido y el pGEM-T Easy-K3L-R(IHD-W) construido anteriormente se trataron con EcoRV y BamHI, y luego se ligaron para construir pSP72-p7.5-DsRed-K3L-R(IHD-W). A continuación, el pSP72-p7.5-DsRed-K3L-R(IHD-W) construido y el pGEM-T Easy-K3L-L(IHD-W) se trataron respectivamente con SalI y HindIII, y luego se ligaron para construir finalmente pSP72-K3L-L-p7.5-DsRed-K3L-R(IHD-W) (en adelante denominado "plásmido lanzadera IHD-W K3L").
Ejemplo 1.1.4. Producción de virus vaccinia IHD-W recombinante en el que se elimina el gen del VGF
Utilizando el plásmido lanzadera IHD-W VGF construido en el Ejemplo 1.1.1., se produjo un virusvacciniaIHD-W recombinante en el que se eliminó el gen del VGF mediante el siguiente método.
Para obtener un virus recombinante, se prepararon células HeLa en una placa de 6 pocillos a una condición de 3*105 células/pocillo y en estado de medio MEM conteniendo 2 % de suero bovino fetal. Luego, las células HeLa se transfectaron con 2 |jg del plásmido lanzadera IHD-W K3L utilizando jetPRIME y se trataron simultáneamente con el virusvacciniade tipo silvestre IHD-W a 0.05 MOI. Después de 4 horas de incubación, el medio se reemplazó con medio MEM que contenía 5 % de suero bovino fetal y luego las células se incubaron durante 48 horas más. Finalmente, las células infectadas se recolectaron con 500 j l del medio y luego se lisaron repitiendo la congelación y descongelación tres veces, para obtener virus crudos. Los virus crudos se utilizaron y se sometieron repetidamente a aislamiento de placa mediante un método convencional, de modo que se obtuvo el virusvacciniaV IHD-W recombinante puramente aislado.
Ejemplo 1.1.5. Producción de virus vaccinia IHD-W recombinante en el que se eliminan los genes del VGF y TK
Se obtuvo el virusvacciniaIHD-W recombinante VT en el que se eliminan los genes del VGF y TK en las mismas condiciones y métodos que en el Ejemplo 1.1.4., excepto que se utilizaron el plásmido lanzadera IHD-W TK construido en el Ejemplo 1.1.2. y el virusvacciniaIHD-W recombinante V producido en el Ejemplo 1.1.4.
Ejemplo 1.1.6. Producción del virus IHD-W-VV01
Se obtuvo el IHD-W-VV01 recombinante en el que se eliminan los genes del VGF, TK y K3L en las mismas condiciones y métodos que en el Ejemplo 1.1.4., excepto que se utilizaron el plásmido lanzadera IHD-W K3L construido en el Ejemplo 1.1.3. y el virusvacciniaIHD-W VT recombinante producido en el Ejemplo 1.1.5.; y su estructura genética se ilustra en la Fig. 1.
Ejemplo 1.2. Producción del virus IHD-W-VV02
Ejemplo 1.2.1. Construcción de plásmido viral vaccinia IHD-W recombinante en el que se elimina el gen de t K y se induce la expresión del gen de sPD1-Fc
Para construir un casete de expresión génica dentro del plásmido lanzadera TK, se amplificó el gen de sPD1-Fc por PCR utilizando, como plantilla, el plásmido pE3.1(EF1a.sPD-1.Fc) (proporcionado por el departamento de investigación de cáncer urológico del Centro Nacional del Cáncer), y luego se insertó en pGEM-T easy para construir pGEM-T easy-sPD1-Fc. Además, el promotor p7.5 se amplificó mediante PCR utilizando, como plantilla, el plásmido de luciferasa pGL4.1 p7.5, y luego se insertó en pGEM-T easy, para construir pGEM-T easy-p7.5. Los plásmidos pGEM-T easy-p7.5 y pGEM-T easy-sPD1-Fc construidos se trataron respectivamente con PacI y NheI, y luego se ligaron para completar pGEM-T easy-p7.5-sPD1-Fc. Las secuencias de cebadores utilizados para la amplificación del promotor p7.5 y del gen de sPD1-Fc se muestran en la Tabla 7 a continuación. El plásmido lanzadera iHD-W TK construido en el Ejemplo 1.1.2 se trató con EcoRI y SalI, y luego se insertó en él el casete del gen p7.5-sPD1-Fc mediante un método de clonación por infusión, para construir finalmente pSP72-TK-L-TF-pSE/L-EGFP-TF-TF-sPD1-Fc-p7.5-TK-R(IHD-W) (en adelante denominado "plásmido lanzadera IHD-W TK(sPD1-Fc)"). Las secuencias de cebadores utilizados para el proceso de clonación por infusión se muestran en la Tabla 7 a continuación.
[Tabla 7]
Ejemplo 1.2.2. Producción de virus vaccinia IHD-W recombinante en el que se eliminan los genes del VGF y K3L
Se obtuvo el virusvacciniaIHD-W recombinante VK en el que se eliminan los genes del VGF y K3L en las mismas condiciones y métodos que en el Ejemplo 1.1.4., excepto que se utilizaron el plásmido lanzadera IHD-W K3L construido en el Ejemplo 1.1.3. y el virusvacciniaIHD-W recombinante V producido en el Ejemplo 1.1.4.
Ejemplo 1.2.3. Producción del virus IHD-W-VV02
El IHD-W-VV02 recombinante, en el que se eliminan los genes del VGF, TK y K3L y se induce la expresión del gen de sPD1-Fc, se obtuvo en las mismas condiciones y métodos que en el Ejemplo 1.1.4., excepto que se utilizaron el plásmido lanzadera IHD-W TK(sPD1-Fc) construido en el Ejemplo 1.2.1. y el virusvacciniaIHD-W VK recombinante producido en el Ejemplo 1.2.2.; y su estructura génica se ilustra en la Fig. 2.
Ejemplo 1.2.4. Identificación de la inserción y expresión del gen de sPD1-Fc en IHD-W-VV02
El ADNg del IHD-W-VV02 recombinante producido en el Ejemplo 1.2.3. se obtuvo utilizando el kit de preparación Nucleospin (Cat # 740956250), y la estructura del ADNg del virus recombinante se identificó utilizando los cebadores en la Tabla 8 a continuación. Como se ilustra en la Fig. 3, los resultados obtenidos al identificar la estructura del ADN en cada una de las posiciones de VGF, TK y K3L mostraron que hay cambios en los tamaños de los fragmentos de PCR en las posiciones donde se han insertado los genes, en comparación con un grupo de control.
Se realizó transferencia Western para identificar que el gen de sPD1-Fc insertado se expresa, a través del virus recombinante, en las células infectadas. En primer lugar, las células HeLa se trataron con IHD-W-VV02 recombinante a 0.05 MOI durante 44 a 52 horas. Luego, el medio se reemplazó con medio MEM que no contenía suero bovino fetal y las células se incubaron durante 16 a 20 horas más. Se separaron el medio y las células y se obtuvieron proteínas de ellos, respectivamente. Las proteínas preparadas se cuantificaron mediante el método de ensayo de Bradford y luego se utilizó transferencia Western para identificar la expresión de la proteína. En el presente documento, se utilizó anti-mPdcdl (E-18) (Santacruz, Cat # SC-10299) como anticuerpo primario y se utilizó anti-cabra como anticuerpo secundario. Los resultados de la expresión se ilustran en la Fig. 4.
[Tabla 8]
Ejemplo 1.3. Producción del virus IHD-W-VV03
Ejemplo 1.3.1. Construcción de plásmido viral vaccinia IHD-W recombinante en el que se elimina el gen de TK y se induce la expresión del gen de PH20
El ADN del promotor pHyb se sintetizó a partir del plásmido pGL4.1-pHyb utilizando los cebadores que se muestran en la Tabla 9 a continuación, y luego se insertó en el vector pGEM-T easy mediante un método de clonación por infusión, para construir pGEM-T easy-pHyb. Para insertar el gen de PH20 en el pGEM-T EasypHyb construido, se sintetizaron respectivamente el exón 2, el exón 3 y el exón 4 de PH20 a partir de ADNg de células A549 mediante un proceso de PCR. En el presente documento, los cebadores utilizados se muestran en la Tabla 9 a continuación.
En primer lugar, para insertar PH20-Exon2, el plásmido pGEM-T easy-pHyb se trató con Spe1. El PH20-Exon2 se sintetizó a través de un proceso de PCR y luego se insertó en pGEM-T easy-pHyb linealizado mediante un método de clonación por infusión, para construir el plásmido pGEM-T easy-pHyb-PH20-Exon2. El plásmido pGEM-T Easy-pHyb-PH20-Exon2 construido se trató con SacI; y PH20-Exon3 y PH20-Exon4 se sintetizaron a través de un proceso de PCR, y luego se insertaron en el mismo mediante un método de clonación por infusión, para construir pGEM-T easy-pHyb-PH20. El plásmido lanzadera IHD-W TK construido en el Ejemplo 1.1.2 se trató con EcoRI y SalI, y luego se insertó en él el casete del gen pHyb-PH20 mediante un método de clonación por infusión, para construir finalmente pSP72-TK-L-TF-pSE/L-EGFP-TF-pHyb-PH20-TF-TK-R(IHD-W) (en adelante denominado "plásmido lanzadera IHD-W TK(PH20)"). Las secuencias de cebadores utilizados en el proceso de clonación por infusión se muestran en la Tabla 9 a continuación.
[Tabla 9]
Ejemplo 1.3.2. Producción del virus IHD-W-VV03
El IHD-W-VV03 recombinante, en el que se eliminan los genes del VGF, TK y K3L y se induce la expresión del gen de PH20, se obtuvo en las mismas condiciones y métodos que en el Ejemplo 1.1.4., excepto que se utilizaron el plásmido lanzadera IHD-W TK(PH20) construido en el Ejemplo 1.3.1. y el virusvacciniaIHD-W VK recombinante producido en el Ejemplo 1.2.2.; y su estructura génica se ilustra en la Fig. 5.
Ejemplo 1.3.3. Identificación de la inserción y expresión del gen de PH20 en IHD-W-VV03
El ADNg del IHD-W-VV03 recombinante producido en el Ejemplo 1.3.2. se obtuvo utilizando el kit de preparación Nucleospin (Cat # 740956250), y la estructura del ADNg del virus recombinante se identificó utilizando los cebadores en la Tabla 10 a continuación. Como se ilustra en la Fig. 6, los resultados obtenidos al identificar la estructura del ADN en cada una de las posiciones de VGF, TK y K3L mostraron que hay cambios en los tamaños de los fragmentos de PCR en las posiciones donde se han insertado los genes, en comparación con un grupo de control.
Se realizó transferencia Western para identificar que el gen de PH20 insertado se expresa, a través del virus recombinante, en las células infectadas. En primer lugar, las células HeLa se trataron con IHD-W-VV03 recombinante a 0.05 MOI durante 44 a 52 horas. Luego, el medio se reemplazó con medio MEM que no contenía suero bovino fetal y las células se incubaron durante 16 a 20 horas. Se separaron el medio y las células y se obtuvieron proteínas de ellos, respectivamente. Las proteínas preparadas se cuantificaron mediante el método de ensayo de Bradford y luego se utilizó transferencia Western para identificar la expresión de la proteína. En el presente documento, se utilizó anti-hPH20 (LsBio, Cat # LS-C331909) como anticuerpo primario y anti-conejo como anticuerpo secundario. Los resultados de la expresión se ilustran en la Fig. 7.
[Tabla 10]
Ejemplo 1.4. Producción del virus IHD-W-VV04
Ejemplo 1.4.1. Construcción de plásmido viral de vaccinia IHD-W recombinante en el que se elimina el gen de K3L y se induce la expresión del gen de IL-12
El plásmido pGL4.1-pI1L-B19R como plantilla de ADN se amplificó con los cebadores de la Tabla 11 a continuación para sintetizar el ADN del promotor pI1L-B19R y luego se realizó su inserción mediante un método de clonación por infusión para construir el plásmido pGEM-T Easy-pI1L-B19R. Para insertar en el plásmido el gen de IL-12 que codifica un único péptido, se amplificaron los genes de las subunidades p40 y p35 de IL-12 con los cebadores de la Tabla 11 a continuación utilizando el plásmido pVAX1-IL-12 como plantilla de ADN. En el presente documento, se insertó una secuencia que constituye un enlazador en el extremo 5' del cebador inverso p40 y en el extremo 3' del cebador directo p35. El gen de IL-12 amplificado anteriormente se insertó enel plásmido pGEM-T Easy-pI1L-B19R, que había sido linealizado con Xhol, mediante un método de clonación por infusión, para construir el plásmido pGEM-T Easy-pI1L-B19R-IL-12. El plásmido pGEM-T Easy-pI1L-B19R-IL-12 construido anteriormente y el plásmido lanzadera IHD-W K3L construido en el Ejemplo 1.1.3 se trataron respectivamente con NotI y luego se ligaron para construir el plásmido pSP72-K3L-L-p7.5-DsRed-pI1L-B19R-IL-12-TF-TF-K3L-R.
Se realizó PCR a partir del ADNg de DH1 con los cebadores de la Tabla 11 a continuación, y el gen marcador gusA obtenido se insertó en pGEM-T easy para construir pGEM-T easy-gusA. Los fragmentos de gusA se obtuvieron con los cebadores de la Tabla 11 a continuación utilizando el plásmido como plantilla. El plásmido pSP72-K3L-L-p7.5-DsRed-pI1L-BI9R-IL-12-TF-TF-K3L-R construido anteriormente se trató con BamHI y SacII, y luego se realizó una clonación por infusión para construir finalmente pSP72-K3L-L-p7.5-gusA-TF-pI1L-B19R-IL-12-TF-TF-K3L-R (en adelante denominado "plásmido lanzadera IHD-W K3L(IL-12)"). Las secuencias de cebadores utilizados en el proceso anterior se muestran en la Tabla 11 a continuación.
[Tabla 11]
Ejemplo 1.4.2. Producción del virus IHD-W-VV04
El IHD-W-VV04 recombinante, en el que se eliminan los genes del VGF, TK y K3L y se induce la expresión del gen de IL-12, se obtuvo en las mismas condiciones y métodos que en el Ejemplo 1.1.4., excepto que se utilizaron el plásmido lanzadera IHD-W K3L(IL-12) construido en el Ejemplo 1.4.1. y el virusvacciniaIHD-W recombinante VT producido en el Ejemplo 1.1.5.; y su estructura génica se ilustra en la Fig. 8.
Ejemplo 1.4.3. Identificación de la inserción y expresión del gen de IL-12 en IHD-W-VV04
El ADNg del IHD-W-VV04 recombinante producido en el Ejemplo 1.4.2 se obtuvo utilizando el kit de purificación Maxwell (Cat # AS 1330), y la estructura del ADNg del virus recombinante se identificó utilizando los cebadores en la Tabla 12 a continuación. Como se ilustra en la Fig. 9, los resultados obtenidos al identificar la estructura del ADN en cada una de las posiciones de VGF, TK y K3L mostraron que hay cambios en los tamaños de los fragmentos de PCR en las posiciones donde se han insertado los genes, en comparación con un grupo de control.
Se realizó transferencia Western para identificar que el gen de IL-12 insertado se expresa, a través del virus recombinante, en las células infectadas. En primer lugar, las células HeLa se trataron con IHD-W-VV04 recombinante a 0.05 MOI durante 44 a 52 horas. Luego, el medio se reemplazó con medio MEM que no contenía suero bovino fetal y las células se incubaron durante 16 a 20 horas. Se separaron el medio y las células y se obtuvieron proteínas de ellos, respectivamente. Las proteínas preparadas se cuantificaron mediante el método de ensayo de Bradford y luego se utilizó transferencia Western para identificar la expresión de la proteína. En el presente documento, se utilizó anti-mIL-12/IL-23 p40 (R&D Systems, Cat # MAB4991) como anticuerpo primario, y anti-rata como anticuerpo secundario. Los resultados de la expresión se ilustran en la Fig. 10.
[Tabla 12]
Ejemplo 1.5. Producción del virus IHD-W-VV05
Ejemplo 1.5.1. Construcción de plásmido viral de vaccinia IHD-W recombinante en el que se elimina el gen de TK y se induce la expresión de los genes de sPD1-Fc y PH20
El plásmido lanzadera IHD-W TK construido en el Ejemplo 1.1.2 y el plásmido pGEM-T Easy-p7.5-sPD1-Fc se trataron con NheI y SalI, y luego se ligaron para construir el plásmido pSP72-TK-L-TF-TF-sPD1-Fc-p7.5-TK-R(IHD-W). El plásmido y el plásmido pGEM-T Easy-pHyb-PH20 se trataron con SalI y BamHI y se ligaron para construir pSP72-TK-L-TF-pHyb-PH20-TF-TF-sPD1-Fc-p7.5-TK-R(IHD-W). Para insertar el gen marcador EGFP en el plásmido, se sintetizó el gen pSE/L-EGFP a través de un proceso de PCR utilizando el plásmido lanzadera IHD-W TK como plantilla. En el presente documento, los cebadores utilizados se muestran en la Tabla 13 a continuación. El plásmido lanzadera pSP72 TK-L-TF-pHyb-PH20-TF-TF-sPD1-Fc-p7.5-TK-R(IHD-W) se trató con PacI y el gen de pSE/L-EGFP sintetizado se insertó en él mediante un método de clonación por infusión para construir pSP72-TK-L-TF-pSE/L-EGFP-TF-pHyb-PH20-TF-TF-sPD1-Fc-p7.5-TK-R(IHD-W) (en adelante denominado "plásmido lanzadera IHD-W TK(sPD1-Fc PH20)").
[Tabla 13]
Ejemplo 1.5.2. Producción del virus IHD-W-VV05
El IHD-W-VV05 recombinante, en el que se eliminan los genes del VGF, TK y K3L y se induce la expresión de los genes de sPD1-Fc y PH20, se obtuvo en las mismas condiciones y métodos que en el Ejemplo 1.1.4., excepto que se utilizaron el plásmido lanzadera IHD-W TK(sPD1-Fc p H20) construido en el Ejemplo 1.5.1. y el virusvacciniaIHD-W VK recombinante producido en el Ejemplo 1.2.2.; y su estructura génica se ilustra en la Fig. 11.
Ejemplo 1.5.3. Identificación de la inserción y expresión de los genes de sPD1-Fc y PH20 en el virus vaccinia recombinante IHD-W, IHD-W-VV05
El ADNg del IHD-W-VV05 recombinante producido en el Ejemplo 1.5.2 se obtuvo utilizando el kit de preparación Nucleospin (Cat # 740956250), y la estructura del ADNg del virus recombinante se identificó utilizando los cebadores en la Tabla 14 a continuación. Como se ilustra en la Fig. 12, los resultados obtenidos al identificar la estructura del ADN en cada una de las posiciones de VGF, TK y K3L mostraron que hay cambios en los tamaños de los fragmentos de PCR en las posiciones donde se han insertado los genes, en comparación con un grupo de control.
Se realizó transferencia Western para identificar que los genes de sPD1-Fc y PH20 insertados se expresan, a través del virus recombinante, en las células infectadas. En primer lugar, las células HeLa se trataron con IHD-W-VV05 recombinante a 0.05 MOI durante 44 a 52 horas. Luego, el medio se reemplazó con medio MEM que no contenía suero bovino fetal y las células se incubaron durante 16 a 20 horas. Se separaron el medio y las células y se obtuvieron proteínas de ellos, respectivamente. Las proteínas preparadas se cuantificaron mediante el método de ensayo de Bradford y luego se utilizó transferencia Western para identificar la expresión de la proteína. En el presente documento, para el gen de sPD1-Fc, se utilizó anti-mPdcd1 (E-18) (Santacruz, Cat # SC-10299) como anticuerpo primario y anti-cabra como anticuerpo secundario; y para el gen de PH20, se utilizó anti-hPH20 (LsBio, Cat # LS-C331909) como anticuerpo primario y anti-conejo como anticuerpo secundario. Los resultados de la expresión se ilustran en la Fig. 13.
[Tabla 14]
Ejemplo 1.6. Producción del virus IHD-W-VV06
Ejemplo 1.6.1. Producción de virus vaccinia IHD-W recombinante en el que se eliminan los genes del VGF, TK y K3L y se induce la expresión de los genes de sPD1-Fc, PH20 e IL-12
El IHD-W-VV06 recombinante, en el que se eliminan los genes del VGF, TK y K3L y se induce la expresión de los genes de sPD1-Fc, PH20 e IL-12, se obtuvo en las mismas condiciones y métodos que en el Ejemplo 1.1.4., excepto que se utilizaron el plásmido lanzadera IHD-W K3L(IL-12) construido en el Ejemplo 1.4.1. y el IHD-W-VV05 producido en el Ejemplo 1.5.2.; y su estructura génica se ilustra en la Fig. 14.
Ejemplo 1.6.2. Identificación de la inserción y expresión de los genes de sPD1-Fc, PH20 e IL-12 en IHD-W-VV06
El ADNg del IHD-W-VV06 recombinante producido en el Ejemplo 1.6.1 se obtuvo utilizando el kit de purificación Maxwell (Cat # AS1330), y la estructura del ADNg del virus recombinante se identificó utilizando los cebadores de la Tabla 15 a continuación. Como se ilustra en la Fig. 15, los resultados obtenidos al identificar la estructura del ADN en cada una de las posiciones de VGF, TK y K3L mostraron que hay cambios en los tamaños de los fragmentos de PCR en las posiciones donde se han insertado los genes, en comparación con un grupo de control.
Se realizó transferencia Western para identificar que los genes de sPD1-Fc, PH20 e IL-12 insertados se expresan, a través del virus recombinante, en las células infectadas. En primer lugar, las células HeLa se trataron con IHD-W-VV06 recombinante a 0.05 MOI durante 44 a 52 horas. Luego, el medio se reemplazó con medio MEM que no contenía suero bovino fetal y las células se incubaron durante 16 a 20 horas. Se separaron el medio y las células y se obtuvieron proteínas de ellos, respectivamente. Las proteínas preparadas se cuantificaron mediante el método de ensayo de Bradford y luego se utilizó transferencia Western para identificar la expresión de la proteína. En el presente documento, para el gen de sPD1-Fc, se utilizó anti-mPdcd1 (E-18) (Santacruz, Cat # SC-10299) como anticuerpo primario y anti-cabra como anticuerpo secundario; para el gen de PH20, se utilizó anti-hPH20 (LsBio, Cat # LS-C331909) como anticuerpo primario y anti-conejo como anticuerpo secundario; y para el gen de IL-12, se utilizó anti-mIL-12/IL-23 p40 (R&D Systems, Cat # mAb4991) como anticuerpo primario y anti-rata como anticuerpo secundario. Los resultados de la expresión se ilustran en la Fig. 16.
Ejemplo 2. Producción de virus vaccinia WR recombinante
Ejemplo 2.1. Producción del virus WR-VV01
Ejemplo 2.1.1. Construcción de plásmido viral vaccinia WR recombinante en el que se inactiva la expresión del gen del VGF
Las regiones genéticas que flanquean el gen del VGF en ambos lados del ADN genómico del virusvacciniaWR (ATCC, Cat No. VR-1354) se amplificaron por PCR y luego se insertaron respectivamente en pGEM-T Easy, para construir pGEM-T Easy-VGF-L(WR) y pGEM-T Easy-VGF-R(WR). La información sobre los cebadores utilizados para la amplificación de secuencias de nucleótidos homólogas que flanquean el gen del VGF en ambos lados se muestra en la Tabla 16 a continuación.
[Tabla 16]
LacZ, cuya expresión está regulada por el promotor p11, se utilizó como marcador para la detección de un virus en el que se había producido una recombinación en una posición del gen del VGF. Se amplificó un sitio promotor p11 en el ADNg de WR mediante PCR y se amplificó el gen LacZ en pAAV-LacZ (Stratagene, Cat No. 240071 52) mediante PCR. Luego, los resultados se insertaron en pGEM-T Easy y pGEM-T, respectivamente, para construir pGEM-T Easy-p11 y pGEM-T-LacZ, respectivamente. La información sobre los cebadores utilizados para la amplificación del promotor p11 y LacZ se muestra en la Tabla 19.
Para construir un plásmido lanzadera en el que se elimina parcialmente la función del gen del VGF, el pGEM-T Easy-VGF-L(WR) se trató con PvuII y PstI, y se ligó con un vector obtenido al tratar pSP72 (Promega, Cat No. P2191) con PvuII y PstI, para construir pSP72-VGF-L(WR). Además, el pGEM-T Easy-VGF-L-VGF-R(WR) se trató con EcoRV y BamHI, y se ligó con un vector obtenido al tratar el pSP72-VGF-L(WR) construido anteriormente con EcoRV y BamHI, para obtener pSP72-VGF-L-VGF-R(WR). Para introducir un casete de expresión de LacZ, el PGEM-T Easy-p11 se trató con SalI y NheI, y se ligó con un vector obtenido al tratar el pSP72-VGF-L-VGF-R(WR) con SalI y NheI, para construir pSP72-VGF-L-p11-VGF-R(WR). El pSP72-VGF-L-p11-VGF-R(WR) construido se trató con EcoRI y PacI, y luego el pGEM-T-LacZ construido anteriormente se cortó con EcoRI y PacI. Los resultados se ligaron para completar pSP72-VGF-L-p11-LacZ-VGF-R(WR) (en adelante denominado "plásmido lanzadera WR VGF(i)"), que es un plásmido lanzadera VGF.
Ejemplo 2.1.2. Construcción de plásmido viral vaccinia WR recombinante en el que se inactiva la expresión del gen de TK
Para obtener regiones genéticas que flanquean el gen de TK en ambos lados en el ADN genómico del virusvacciniaWR, se amplificó el ADNg de WR por PCR y luego los fragmentos de secuencia de nucleótidos homólogos ubicados en los lados izquierdo y derecho del gen de TK se insertaron respectivamente en pGEM-T Easy, para construir pGEM-T Easy-TK-L(WR) y pGEM-T Easy-TK-R(WR). La información sobre los cebadores utilizados para la amplificación de secuencias de nucleótidos homólogas que flanquean el gen de TK en ambos lados se muestra en la Tabla 17.
[Tabla 17]
Se utilizaron EGFP, cuya expresión está regulada por el promotor pSE/L, y Gpt, cuya expresión está regulada por el promotor p7.5, como marcadores para la detección de un virus en el que se había producido una recombinación en una posición del gen de TK. Se amplificó un sitio promotor p7.5 por PCR usando el ADNg de WR como plantilla, y el gen EGFP en pEGFP-N3 (Clontech, Cat No. 6080-1) y el gen Gpt en DH5a (Takara, Cat No. 9057) también se amplificaron por PCR. Luego, los resultados se insertaron respectivamente en pGEM-T Easy, para construir pGEM-T Easy-p7.5, pGEM-T Easy-EGFP y pGEM-T Easy-Gpt, respectivamente. Además, el promotor pSE/L y el TF se construyeron mediante hibridación de cebadores. Las secuencias de cebadores utilizados en los experimentos se muestran en la Tabla 17.
El pGEM-T Easy-p7.5 y el promotor pSE/L hibridado se trataron respectivamente con BamHI y PstI, y se ligaron para construir pGEM-T Easy-pSE/L-p7.5. Los pGEM-T Easy-pSE/L-p7.5 y pGEM-T Easy-EGFP construidos se trataron respectivamente con BgllI y Xhol, y luego se ligaron para construir pGEM-T Easy-EGFP-pSE/L-p7.5.
Para construir un plásmido lanzadera en el que se elimina parcialmente la función del gen de TK, el pSP72 se trató con EcoRI y BamHI, y el pGEM-T Easy-TK-R(WR) se trató con EcoRI y BamHI. Luego, los resultados se ligaron para construir pSP72-TK-R(WR). El pSP72-TK-R(WR) construido se trató con Xhol y PstI, y se ligó con el pGEM-T Easy-TK-L obtenido al ser tratado con SalI y PstI, para construir pSP72-TK-L-TK-R(WR). Para introducir un casete de expresión de EGFP, los pSP72-TK-L-TK-R(WR) y pGEM-T Easy-EGFP-pSE/L-p7.5 construidos se trataron respectivamente con EcoRI y PstI, y se ligaron para construir pSP72-TK-L-EGFP-pSE/L-p7.5-TK-R(WR).
Además, el pSP72-TK-L-EGFP-pSE/L-p7.5-TK-R(WR) construido y el oligómero TF hibridado se trataron respectivamente con PstI y NotI, y se ligaron para construir pSP72-TK-L-TF-EGFP-pSE/L-p7.5-TK-R(WR). Para introducir un casete de expresión de Gpt, los pSP72-TK-L-TF-EGFP-pSE/L-p7.5-TK-R(WR) y pGEM-T Easy-Gpt construidos se trataron respectivamente con EcoRI y SpeI, y luego se ligaron para construir finalmente pSP72-TK-L-TF-EGFP-pSE/L-p7.5-Gpt-TK-R(WR) (en adelante denominado "plásmido lanzadera WR TK(i)") que es un plásmido lanzadera TK.
Ejemplo 2.1.3. Construcción de plásmido viral vaccinia WR recombinante en el que se inactiva la expresión del gen de K3L
Se amplificaron mediante PCR una región genómica que flanquea el gen de K3L en el lado izquierdo y una parte del gen de K3L en el ADN genómico del virusvacciniaWR. En el presente documento, la amplificación se llevó a cabo con el codón de inicio del gen de K3L colocado inmediatamente después de la secuencia de K3L-L, y los cebadores utilizados para la amplificación de la secuencia homóloga en el lado izquierdo del gen de K3L se muestran en la Tabla 18. En el presente documento, se obtuvo un fragmento K3L-L-K3Li(WR) que se amplificó e incluye una parte que excluye y sigue al codón de inicio del gen de K3L y luego se ligó con un vector pGEM-T Easy, para construir pGEM-T Easy-K3L-L-K3Li(WR).
[Tabla 18]
El plásmido lanzadera IHD-W K3L construido en el Ejemplo 1.1.3 y el pGEM-T Easy-K3L-L-K3Li(WR) se trataron con SnaBI y HindIII, y se ligaron para construir pSP72-K3L-L-K3Li-p7.5-DsRed-TF-K3L-R(WR). Para introducir el codón de inicio de K3L en el pSP72-K3L-L-K3Li-p7.5-DsRed-TF-K3L-R(WR) construido, se realizó una mutación puntual utilizando cebadores como se muestra en la Tabla 18 anterior, de modo que finalmente se construyó el plásmido lanzadera pSP72-K3L-L-K3Li-p7.5-DsRed-TF-K3L<ATG>-K3L-R(WR) (en adelante denominado "plásmido lanzadera WR K3L(i)").
Ejemplo 2.1.4. Producción de virus vaccinia WR recombinante en el que se inactiva la expresión de los genes del VGF y TK
En primer lugar, se obtuvo el virusvacciniaWR recombinante Vi en el que la expresión del gen del VGF está inactivada en las mismas condiciones y métodos que en el Ejemplo 1.1.4., excepto que se utilizaron el plásmido lanzadera WR VGF(i) y el virus WR de tipo silvestre. Posteriormente, se obtuvo el virusvacciniaWR recombinante ViTi en el que la expresión de los genes del VGF y TK está inactivada con los mismos métodos que anteriormente, excepto que se utilizaron el plásmido lanzadera WR TK(i) y el virusvacciniaWR recombinante Vi.
Ejemplo 2.1.5. Producción del virus WR-VV01
En primer lugar, se obtuvo el virusvacciniaWR recombinante WR-VV01 en el que la expresión de los genes del VGF, TK y K3L está inactivada en las mismas condiciones y métodos que en el Ejemplo 1.1.4., excepto que se utilizaron el plásmido lanzadera WR K3L(i) y el virusvacciniaWR recombinante ViTi; y su estructura genética se ilustra en la Fig. 17.
Ejemplo 2.2. Producción del virus WR-VV06
Ejemplo 2.2.1. Construcción de plásmido viral vaccinia WR recombinante en el que se inactiva la expresión del gen de TK y se induce la expresión de los genes de sPD1-Fc y PH20
En primer lugar, el plásmido lanzadera WR TK(i) construido en el Ejemplo 2.1.2. y el plásmido lanzadera IHD-W TK(sPD1-Fc) construido en el Ejemplo 1.2.1. se trataron respectivamente con BamHI y EcoRI, y luego se ligaron para construir PSP72-TK-L-TF-TF-EGFP-pSE/L-TF-sPD1-Fc-p7.5-TK-R(WR) (en adelante denominado "plásmido lanzadera WR TKi(sPDI-Fc)"). Posteriormente, el plásmido así construido y el plásmido lanzadera IHD-W TK(PH20) construido en el Ejemplo 1.3.1 se trataron respectivamente con BamHI y PacI, y luego se ligaron para construir finalmente pSP72-TK-L-TF-pSE/L-EGFP-TF-pHyb-PH20-TF-TF-sPD1-Fc-p7.5-TK-R(WR) (en adelante denominado "plásmido lanzadera W r TKi(sPD1-Fc PH20)").
Ejemplo 2.2.2. Construcción de plásmido viral vaccinia WR recombinante en el que se inactiva la expresión del gen de K3L y se induce la expresión del gen de IL-12
Para construir un casete de expresión génica dentro del plásmido lanzadera WR K3Li, el plásmido lanzadera WR K3Li construido en el Ejemplo 2.1.3 y el plásmido lanzadera IHD-W K3L(IL-12) construido en el Ejemplo 1.4.1 se trataron con Sa1I y se ligaron para construir finalmente pSP72 K3L-L-p7.5-DsRed-TF-pI1L-B19R-IL-12-TF-TF_K3L-R(WR) (en adelante denominado "plásmido lanzadera WR K3Li(IL-12)").
Ejemplo 2.2.3. Producción del virus WR-VV06
En primer lugar, se obtuvo el virusvacciniaWR recombinante ViKi en el que la expresión de los genes del VGF y K3L está inactivada en las mismas condiciones y métodos que en el Ejemplo 1.1.4., excepto que se utilizaron el plásmido lanzadera WR K3Li construido en el Ejemplo 2.1.3. y el virusvacciniaWR recombinante Vi construido en el Ejemplo 2.1.4.
El virusvacciniaWR recombinante WR-VV05, en el que la expresión de los genes del VGF, TK y K3L está inactivada y la expresión de los genes de sPD1-Fc y p H20 está inducida, se obtuvo en las mismas condiciones y métodos que en el Ejemplo 1.1.4., excepto que se utilizaron el plásmido lanzadera WR TKi(sPD1-Fc PH20) construido en el Ejemplo 2.2.1. y el virusvacciniaWR recombinante ViKi.
El WR-VV06 recombinante, en el que se inactiva la expresión de los genes del VGF, TK y K3L y se induce la expresión de los genes de sPD1-Fc, PH20 e IL-12, se obtuvo en las mismas condiciones y métodos que en el Ejemplo 1.1.4., excepto que se utilizaron el plásmido lanzadera WR K3Li(IL-12) construido en el Ejemplo 2.2.2. y el WR-VV05 recombinante; y su estructura génica se ilustra en la Fig. 18.
Ejemplo 2.2.4. Identificación de la inserción y expresión de los genes de sPD1-Fc, PH20 e IL-12 en WR-VV06
El ADNg del WR-VV06 recombinante producido en el Ejemplo 2.2.2 se obtuvo utilizando el kit de purificación Maxwell (Cat # AS1330), y la estructura del ADNg del virus recombinante se identificó utilizando los cebadores en la Tabla 19 a continuación. Como se ilustra en la Fig. 19, los resultados obtenidos al identificar la estructura del ADN en cada una de las posiciones de VGF, TK y K3L mostraron que hay cambios en los tamaños de los fragmentos de PCR en las posiciones donde se han insertado los genes, en comparación con un grupo de control.
Se realizó transferencia Western para identificar que los genes de sPD1-Fc y PH20 insertados se expresan, a través del virus recombinante, en las células infectadas. En primer lugar, las células HeLa se trataron con el WR-VV06 recombinante a 0.05 MOI durante 44 a 52 horas. Luego, el medio se reemplazó con medio MEM que no contenía suero bovino fetal y las células se incubaron durante 16 a 20 horas. Se separaron el medio y las células y se obtuvieron proteínas de ellos, respectivamente. Las proteínas preparadas se cuantificaron mediante el método de ensayo de Bradford y luego se utilizó transferencia Western para identificar la expresión de la proteína. En el presente documento, para el gen de sPD1-Fc, se utilizó anti-mPdcd1 (E-18) (Santacruz, Cat # SC-10299) como anticuerpo primario y anti-cabra como anticuerpo secundario; y para el gen de PH20, se utilizó anti-hPH20 (LsBio, Cat # LS-C331909) como anticuerpo primario y anti-conejo como anticuerpo secundario. Los resultados de la expresión se ilustran en la Fig. 20a.
Además, se realizó ELISA para identificar que el gen de IL-12 insertado se expresa, a través del virus recombinante, en las células infectadas. En primer lugar, las células HeLa se trataron con el WR-VV06 recombinante a 0.05 MOI. Después de 44 a 52 horas, sólo se separó el medio y se obtuvieron de él las proteínas expresadas. Para las proteínas preparadas, se utilizó el kit ELISA Mouse IL-12 p70 Quantikine (R&D Systems, Cat # M1270) para identificar el nivel de expresión de la proteína. En el presente documento, la solución madre de proteína se diluyó a 1/5,000 y se utilizó. Los resultados de la medición se ilustran en la Fig. 20b.
[Tabla 19]
Ejemplo 3. Producción de virus vaccinia Lister recombinante
Ejemplo 3.1. Producción del virus Lister-VV01
Ejemplo 3.1.1. Construcción de plásmido viral vaccinia Lister recombinante en el que se elimina el gen del VGF
En primer lugar, las regiones genéticas que flanquean el gen del VGF en ambos lados del ADN genómico del virusvacciniaLister (ATCC, VR-1549) se amplificaron por PCR y luego se insertaron respectivamente en pGEM-T Easy, para construir pGEM-T Easy-VGF-L(Lister) y pGEM-T Easy-VGF-R(Lister). La información sobre los cebadores utilizados para la amplificación de secuencias de nucleótidos homólogas que flanquean el gen del VGF en ambos lados se muestra en la Tabla 20 a continuación.
El vector pSP72 y el pGEM-T Easy-VGF-L(Lister) se trataron respectivamente con HindIII y SalI, y se ligaron para construir pSP72-VGF-L(Lister). Además, el pSP72-VGF-L(Lister) y el pGEM-T Easy-VGF-R(Lister) se trataron respectivamente con PacI y KpnI, y se ligaron para construir pSP72-VGF-L-VGF-R(Lister).
El vector pSP72-VGF-L-VGF-R(Lister) construido y el plásmido lanzadera IHD-W VGF construido en el Ejemplo 1.1.1. se trataron respectivamente con NheI y PacI, y se ligaron para construir finalmente pSP72-VGF-L-p11-LacZ-VGF-R(Lister) (en adelante denominado "plásmido lanzadera VGF Lister").
[Tabla 20]
Ejemplo 3.1.2. Construcción de plásmido viral vaccinia Lister recombinante en el que se elimina el gen de TK
Las regiones genéticas que flanquean el gen de TK en ambos lados del ADN genómico del virusvacciniaLister (ATCC, VR-1549) se amplificaron por PCR y luego se insertaron respectivamente en pGEM-T Easy, para construir pGEM-T Easy-TK-L(Lister) y pGEM-T Easy-TK-R(Lister). La información sobre los cebadores utilizados para la amplificación de secuencias de nucleótidos homólogas que flanquean el gen de TK en ambos lados se muestra en la Tabla 21 a continuación.
El pGEM-T Easy-TK-L(Lister) y el pGEM-T Easy-TK-R(Lister) se trataron respectivamente con BamHI y XmaI, y se ligaron para construir pGEM-T Easy-TK-L-TK-R(Lister). Además, el vector pSP72 y el pGEM-T Easy-TK-L-TK-R(Lister) se trataron respectivamente con SpeI y XmaI, y se ligaron para construir pSP72-TK-L-TK-R(Lister).
El vector pSP72-TK-L-TK-R(Lister) construido y el plásmido lanzadera IHD-W TK construido en el Ejemplo 1.1.2 se trataron respectivamente con NotI y SalI, y se ligaron para construir finalmente pSP72-TK-L-TF-pSE/L-EGFP-TK-R(Lister) (en adelante, "plásmido lanzadera Lister TK").
Ejemplo 3.1.3. Construcción de plásmido viral vaccinia Lister recombinante en el que se elimina el gen de K3L
El plásmido lanzadera IHD-W K3L construido en el Ejemplo 1.1.3 se trató con BglII y EcoRV, y un gen (brazo R) ubicado en el lado derecho del gen de K3L en el ADN genómico del virusvacciniaLister (ATCC, VR-1549) se amplificó por PCR. Luego, se realizó su inserción utilizando un método de clonación por infusión, para construir pSP72-p7.5-DsRed-TF-TF-K3L-R(Lister).
El pSP72-p7.5-DsRed-TF-TF-K3L-R(Lister) construido se trató con XhoI y HindIII, y un gen (brazo L) ubicado en el lado izquierdo del gen de K3L en el ADN genómico del virusvacciniaLister se amplificó mediante PCR. Luego, se realizó su inserción mediante un método de clonación por infusión, para finalmente construir pSP72-K3L-L-p7.5-DsRed-TF-TF-K3L-R(Lister) (en adelante denominado "plásmido lanzadera Lister K3L"). Las secuencias de cebadores utilizados en el proceso de clonación por infusión se muestran en la Tabla 22 a continuación.
[Tabla 22]
Ejemplo 3.1.4. Producción de virus vaccinia Lister recombinante en el que se elimina el gen del VGF
El virusvacciniaLister recombinante V en el que se eliminó el gen del VGF se obtuvo en las mismas condiciones y métodos que en el Ejemplo 1.1.4., excepto que se utilizaron el virusvacciniade tipo silvestre Lister y el plásmido lanzadera VGF Lister construido en el Ejemplo 3.1.1.
Ejemplo 3.1.5. Producción de virus vaccinia Lister recombinante en el que se eliminan los genes del VGF y TK
Se obtuvo el virusvacciniaLister recombinante VT en el que se eliminan los genes del VGF y TK en las mismas condiciones y métodos que en el Ejemplo 1.1.4., excepto que se utilizaron el virusvacciniaLister recombinante V producido en el Ejemplo 3.1.4. y el plásmido lanzadera Lister TK construido en el Ejemplo 3.1.2.
Ejemplo 3.1.6. Producción del virus Lister-VV01
Se obtuvo el Lister-VV01 recombinante en el que se eliminaron los genes del VGF, TK y K3L en las mismas condiciones y métodos que en el Ejemplo 1.1.4., excepto que se utilizaron el virusvacciniaLister VT recombinante producido en el Ejemplo 3.1.5. y el plásmido lanzadera Lister K3L construido en el Ejemplo 3.1.3. y cuya estructura genética se ilustra en la Fig. 21.
Ejemplo 3.2. Producción del virus Lister-VV06
Ejemplo 3.2.1. Construcción de plásmido viral vaccinia Lister recombinante en el que se elimina el gen de TK y se induce la expresión de los genes de sPD1-Fc y PH20
El plásmido construido en el Ejemplo 3.1.2 y el plásmido lanzadera IHD-W TK(sPD1-Fc PH20) construido en el Ejemplo 1.5.1 se trataron respectivamente con NotI y NheI, y se ligaron para construir finalmente pSP72-TK-L-TF-pSE/L-EGFP-pHyb-PH20-TF-TF-sPD1-Fc-p7.5-TK-R(Lister) (en adelante denominado "plásmido lanzadera Lister TK(sPD1-Fc PH20)").
Ejemplo 3.2.2. Construcción de plásmido viral vaccinia Lister recombinante en el que se elimina el gen de K3L y se induce la expresión del gen de IL-12
Para construir un casete de expresión génica dentro del plásmido lanzadera Lister K3L, el plásmido lanzadera Lister K3L construido en el Ejemplo 3.1.3 y el plásmido lanzadera IHD-W K3L(IL-12) construido en el Ejemplo 1.4.1 se trataron con SalI y se ligaron para construir finalmente pSP72 K3L-L-p7.5-DsRed-TF-pI1L-B19R-IL-12-TF-TF-K3L-R(Lister) (en adelante, "plásmido lanzadera Lister K3L(IL-12)").
Ejemplo 3.2.3. Producción del virus Lister-VV06
En primer lugar, se obtuvo el virusvacciniaLister VK recombinante en el que se eliminan los genes del VGF y K3L en las mismas condiciones y métodos que en el Ejemplo 1.1.4., excepto que se utilizaron el virusvacciniaLister V recombinante producido en el Ejemplo 3.1.4. y el plásmido lanzadera Lister K3L construido en el Ejemplo 3.1.3.
El virusvacciniaLister recombinante Lister-VV05, en el que se eliminan los genes del VGF, TK y K3L y se induce la expresión de los genes de sPD1-Fc y PH20, se obtuvo en las mismas condiciones y métodos que en el Ejemplo 1.1.4., excepto que se utilizaron el plásmido lanzadera Lister TK(sPD1-Fc PH20) construido en el Ejemplo 3.2.1. y el virusvacciniaLister recombinante VK.
Se obtuvo el Lister-VV06 recombinante en el que se eliminan los genes del VGF, TK y K3L y se induce la expresión de los genes de sPD1-Fc, PH20 e IL-12 en las mismas condiciones y métodos que en el Ejemplo 1.1.4., excepto que se utilizaron el plásmido lanzadera Lister K3L(IL-12) construido en el Ejemplo 3.2.2. y el Lister-VV05 recombinante; y su estructura génica se ilustra en la Fig. 22.
Ejemplo 3.2.4. Identificación de la inserción y expresión de los genes de sPD1-Fc, PH20 e IL-12 en Lister-VV06
El ADNg del Lister-VV06 recombinante producido en el Ejemplo 3.2.3 se obtuvo utilizando el kit de purificación de ácidos nucleicos totales virales Maxwell (Promega, Cat # AS1330), y la estructura del ADNg del virus recombinante, Lister-VV06, se identificó utilizando los cebadores en la Tabla 23 a continuación. Como se ilustra en la Fig. 23, los resultados obtenidos al identificar la estructura del ADN en cada una de las posiciones de VGF, TK y K3L mostraron que hay cambios en los tamaños de los fragmentos de PCR en las posiciones donde se han insertado los genes, en comparación con un grupo de control. Se realizó transferencia Western para identificar que el gen de sPD1-Fc insertado se expresa, a través del virus recombinante, en las células infectadas. En primer lugar, las células HeLa se trataron con Lister-VV06 recombinante a 0.05 MOI durante 44 a 52 horas. Luego, el medio se reemplazó con medio MEM que no contenía suero bovino fetal y las células se incubaron durante 16 a 20 horas. Se separaron el medio y las células y se obtuvieron proteínas de ellos, respectivamente.
Las proteínas preparadas se cuantificaron mediante el método de ensayo de Bradford y luego se utilizó transferencia Western para identificar la expresión de la proteína. En el presente documento, se utilizó antimPdcd1 (E-18) (Santacruz, Cat # SC-10299) como anticuerpo primario y anti-cabra como anticuerpo secundario. Además, se realizó transferencia Western para identificar que el gen PH-20 insertado se expresa, a través del virus recombinante, en las células infectadas. En el presente documento, se utilizó anti-hPH20 (LsBio, Cat # LS-C331909) como anticuerpo primario y anti-conejo como anticuerpo secundario. Los resultados de la expresión se ilustran en la Fig. 24a. Además, se realizó ELISA para identificar que el gen de IL-12 insertado se expresa, a través del virus recombinante, en las células infectadas. En primer lugar, las células HeLa se infectaron con Lister-VV06 recombinante a 0.05 MOI. Después de 44 a 52 horas, sólo se separó el medio y se obtuvieron de él las proteínas expresadas. Para las proteínas preparadas, se utilizó el kit ELISA Mouse iL-12 p70 Quantikine (R&D Systems, Cat # M1270) para identificar el nivel de expresión de la proteína. En el presente documento, la solución madre de proteína se diluyó a 1/5,000 y se utilizó. Los resultados de la medición se ilustran en la Fig. 24b.
[Tabla 23]
II. Determinación de la capacidad del virusvacciniarecombinante para destruir células tumoralesin vivo
Ejemplo experimental 1.Determinación de la eficacia de supresión tumoral, en modelo animal, del virusvacciniade la cepa IHD-W recombinante en el que se eliminan los genes del VGF, TK y K3L y se induce la expresión del gen de sPD1-Fc o PH20 o IL-12
Ejemplo experimental 1.1.Determinación de la eficacia de supresión tumoral, en modelo animal, de los virus IHD-W-VV02, IHD-W-VV03 e IHD-W-VV05
Se realizó una comparación de los efectos antitumorales entre los IHD-W-VV02, IHD-W-VV03 e IHD-W-VV05 recombinantes producidos en el Ejemplo 1 en un modelo de ratón.
Modelo de tumor colorrectal
En primer lugar, se preparó la línea celular de cáncer colorrectal CT26.WT incubándola en medio RPMI que contenía 10 % de suero bovino fetal. En un caso en el que las células estaban siendo incubadas en una incubadora bajo una condición de 37 °C y 5 % de CO2 ocupaban entre el 70 % y el 80 % de una placa, las células se prepararon para la inoculación de células cancerosas. Las células cancerosas preparadas se centrifugaron a 1,500 rpm durante 5 minutos a 4 °C para eliminar todo el sobrenadante y las células se prepararon agregándoles un excipiente (medio RPMI). Las 1*10® células así preparadas se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones BALB/c (BALB/cAnHsd; KOATECh , Corea) para preparar un modelo de tumor colorrectal de ratón. Después de una semana, en un caso en el que el volumen del tumor creció hasta aproximadamente 70 a 100 mm3, el modelo de ratón preparado se dividió en grupos para administrarles PBS, IHD-W-VV02, IHD-W-VV03 e IHD-W-VV05 con 4 ratones por grupo, y luego se administraron 50 j l de PBS (Welgene, Cat No. LB001-02) o cada uno de los virus a razón de 1*107 TCID50/50 |jl una vez en el tumor. Los resultados obtenidos midiendo el volumen del tumor después de la administración del virus se ilustran en la Fig. 25.
Como se ilustra en la Fig. 25, los resultados obtenidos al medir el tamaño del tumor el día 14 después del tratamiento con el virus mostraron que el grupo al que se le administró IHD-W-VV02, el grupo al que se le administró IHD-W-VV03 y el grupo al que se le administró IHD-W-VV05 exhiben un volumen tumoral menor que el del grupo al que se le administró PBS. Se identificó que en un caso en el que se compara el volumen del tumor entre los grupos a los que se les administró el virus, el grupo al que se le administró IHD-W-VV05 exhibe un volumen del tumor menor que el del grupo al que se le administró IHD-W-VV02 o el del grupo al que se le administró IHD-W-VV03.
Ejemplo experimental 1.2.Determinación de la eficacia de supresión tumoral, en modelo animal, de los virus IHD-W-VV01 e IHD-W-VV05
Se realizó una comparación de los efectos antitumorales entre el IHD-W-VV01 y el IHD-W-VV05 recombinantes producidos en el Ejemplo 1 en un modelo de ratón.
Modelo de tumor de piel
A continuación, se preparó la línea celular de cáncer de piel B16F10 incubándola en medio DMEM que contenía 10 % de suero bovino fetal. En un caso en el que las células estaban siendo incubadas en una incubadora bajo una condición de 37 °C y 5 % de CO2 ocupaban entre el 70 % y el 80 % de una placa, las células se prepararon para la inoculación de células cancerosas. Las células cancerosas preparadas se centrifugaron a 1,500 rpm durante 5 minutos a 4 °C para eliminar todo el sobrenadante y las células se prepararon agregándoles un excipiente (medio DMEM). Las 5*105 células así preparadas se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones C57BL/6N (C57BL/6NHsd; KOATECH, Corea) para preparar un modelo de tumor de piel de ratón. Después de una semana, en un caso en el que el volumen del tumor aumentó hasta aproximadamente 70 a 100 mm3, el modelo de ratón preparado se dividió en grupos a los que se les administró PBS, IHD-W-VV01 e IHD-W-VV05 con 6 ratones por grupo, y luego se les administró 50 j l de PBS (Welgene, Cat No. LB001-02) o a cada uno de los virus a razón de 1*10® TCID50/50 j l una vez en el tumor. Los resultados obtenidos midiendo el volumen del tumor después de la administración del virus se ilustran en la Fig. 26.
Como se ilustra en la Fig. 26, los resultados obtenidos al medir el volumen del tumor el día 12 después del tratamiento con el virus mostraron que el grupo al que se le administró IHD-W-VV05 exhibe un volumen tumoral menor que el del grupo al que se le administró IHD-W-VV01. En el grupo al que se le administró PBS, el volumen del tumor ya había alcanzado un promedio de 2,000 mm3 antes del día 12 después de la administración del virus. Por lo tanto, el grupo al que se le administró PBS fue sacrificado y los datos posteriores a 12 días se excluyeron del análisis.
Modelo de tumor pulmonar
A continuación, la línea celular de cáncer de pulmón LLC1 se incubó en una incubadora a 37 °C y 5 % de CO2 utilizando medio DMEM compuesto de 10 % de suero bovino fetal, 2 mM de L-glutamina y 1 % de antibióticosantimicóticos (GIBCO, Cat No. 15240-062). Se realizaron tres pases y luego se recolectaron las células en un caso en el que ocupaban entre el 70 % y el 80 % de la placa de cultivo durante el último pase. Se eliminó el sobrenadante de las células recolectadas y se le agregó un excipiente (DMEM) para que las células estuvieran preparadas para tener una concentración de 1*107/mL. Se inyectó por vía subcutánea una suspensión celular que contenía 1*10® células así preparadas en el flanco derecho de ratones C57BL/6N (C57BL/6NHsd; KOATECH, Corea) para preparar un modelo de tumor pulmonar de ratón. Después de una semana, en un caso en el que el volumen del tumor aumentó hasta aproximadamente 70 a 100 mm3, el modelo de ratón preparado se dividió en grupos para administrarles PBS, IHD-W-VV01 e IHD-W-VV05 con 6 ratones por grupo. Luego, se les administró 50 j l de PBS (Welgene, Cat No. LB001-02) o cada uno de los virus a razón de 1*10® TCID50/50 |jl una vez en el tumor. Los resultados obtenidos midiendo el volumen del tumor después de la administración del virus se ilustran en la Fig. 27.
Como se ilustra en la Fig. 27, los resultados obtenidos al medir el tamaño del tumor el día 14 después del tratamiento con el virus mostraron que el grupo al que se le administró IHD-W-VV01 y el grupo al que se le administró IHD-W-VV05 exhiben un volumen tumoral menor que el del grupo al que se le administró PBS. Se identificó que en un caso en el que se compara el volumen del tumor entre los grupos a los que se les administró el virus, el grupo al que se le administró IHD-W-VV05 exhibe un volumen del tumor menor que el del grupo al que se le administró IHD-W-VV01.
Ejemplo experimental 1.3.Determinación de la eficacia de supresión tumoral, en modelo animal, de los virus IHD-W-VV02, IHD-W-VV03, IHD-W-VV04 e IHD-W-VV06
Se realizó una comparación de los efectos antitumorales entre los IHD-W-VV02, IHD-W-VV03, IHD-W-VV04 e IHD-W-VV06 recombinantes producidos en el Ejemplo 1 en un modelo de ratón.
Modelo de tumor colorrectal
En primer lugar, se preparó la línea celular de cáncer colorrectal CT26.WT incubándola en medio RPMI que contenía 10 % de suero bovino fetal. En un caso en el que las células estaban siendo incubadas en una incubadora bajo una condición de 37 °C y 5 % de CO2 ocupaban entre el 70 % y el 80 % de una placa, las células se prepararon para la inoculación de células cancerosas. Las células cancerosas preparadas se centrifugaron a 1,500 rpm durante 5 minutos a 4 °C para eliminar todo el sobrenadante y las células se prepararon agregándoles un excipiente (medio RPMI). Las 1*10® células así preparadas se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones BALB/c (BALB/cAnHsd; KOATECH, Corea) para preparar un modelo de tumor colorrectal de ratón. Después de una semana, en un caso en el que el volumen del tumor aumentó hasta aproximadamente 70 a 100 mm3, el modelo de ratón preparado se dividió en grupos a los que se les administró PBS, IHD-W-VV02, IHD-W-VV03, IHD-W-VV04 e IHD-W-VV06 con 4 ratones por grupo, y luego se administraron 50 j l de PBS (Welgene, Cat No. LB001-02) o cada uno de los virus a razón de 1*107 TCID50/50 j l una vez en el tumor. Los resultados obtenidos midiendo el volumen del tumor después de la administración del virus se ilustran en la Fig. 28.
Como se ilustra en la Fig. 28, los resultados obtenidos al medir el volumen del tumor el día 14 después del tratamiento con el virus mostraron que el grupo al que se le administró IHD-W-VV02, el grupo al que se le administró IHD-W-VV03, el grupo al que se le administró IHD-W-VV04 y el grupo al que se le administró IHD-W-VV06 exhiben un volumen tumoral menor que el del grupo al que se le administró PBS. Se identificó que cuando se compara el volumen del tumor entre los grupos a los que se les administró el virus, el grupo al que se le administró IHD-W-VV06 exhibe un volumen del tumor menor que el del grupo al que se le administró iHD-W-VV02, el grupo al que se le administró IHD-W-VV03 o el grupo al que se le administró IHD-W-VV04.
Modelo de tumor pulmonar
A continuación, la línea celular de cáncer de pulmón LLC1 se incubó en una incubadora a 37 °C y 5 % de CO2 utilizando medio DMEM compuesto de 10 % de suero bovino fetal, 2 mM de L-glutamina y 1 % de antibióticosantimicóticos (GIBCO, Cat No. 15240-062). Se realizaron tres pases y luego se recolectaron las células en un caso en el que ocupaban entre el 70 % y el 80 % de la placa de cultivo durante el último pase. Se eliminó el sobrenadante de las células recolectadas y se le agregó un excipiente (DMEM) para que las células estuvieran preparadas para tener una concentración de 1*107/mL. Una suspensión celular que contenía 1*106 células así preparadas, se inyectó por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones C57BL/6N (C57BL/6NHsd; KOATECH, Corea) para preparar un modelo de tumor pulmonar de ratón. Después de una semana, en un caso en el que el volumen del tumor aumentó hasta aproximadamente 70 a 100 mm3, el modelo de ratón preparado se dividió en grupos para administrarles IHD-W-VV02, IHD-W-VV03, IHD-W-VV04 e IHD-W-VV06 con 6 ratones por grupo. Luego, se administraron 50 j l de PBS (Welgene, Cat No. LB001-02) o cada uno de los virus a razón de 1x10® TCID50/50 j l una vez en el tumor. Los resultados obtenidos midiendo el volumen del tumor después de la administración del virus se ilustran en la Fig. 29.
Como se ilustra en la Fig. 29, los resultados obtenidos al medir el tamaño del tumor el día 14 después del tratamiento con el virus mostraron que el grupo al que se le administró IHD-W-VV02, el grupo al que se le administró IHD-W-VV03, el grupo al que se le administró IHD-W-VV04 y el grupo al que se le administró IHD-W-VV06 exhiben un volumen tumoral menor que el del grupo al que se le administró PBS. Se identificó que cuando se compara el volumen del tumor entre los grupos a los que se les administró el virus, el grupo al que se le administró IHD-W-VV06 exhibe un volumen del tumor menor que el del grupo al que se le administró iHD-W-VV02, el grupo al que se le administró IHD-W-VV03 o el grupo al que se le administró IHD-W-VV04.
Ejemplo experimental 1.4.Determinación de la eficacia de supresión tumoral, en modelo animal, de los virus IHD-W-VV05 e IHD-W-VV06
Se realizó una comparación de los efectos antitumorales entre el IHD-W-VV05 y el IHD-W-VV06 recombinantes producidos en el Ejemplo 1 en un modelo de ratón.
Modelo de tumor colorrectal
En primer lugar, se preparó la línea celular de cáncer colorrectal CT26.WT incubándola en medio RPMI que contenía 10 % de suero bovino fetal. Cuando las células estaban siendo incubadas en una incubadora bajo una condición de 37 °C y 5 % de CO2 ocupaban entre el 70 % y el 80 % de una placa, las células se prepararon para la inoculación de células cancerosas. Las células cancerosas preparadas se centrifugaron a 1,500 rpm durante 5 minutos a 4 °C para eliminar todo el sobrenadante y las células se prepararon agregándoles un excipiente (medio RPMI). Las 1x10® células así preparadas se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones BALB/c (BALB/cAnHsd; KOATECH, Corea) para preparar un modelo de tumor colorrectal de ratón. Después de una semana, cuando el volumen del tumor aumentó de aproximadamente 70 a 100 mm3, el modelo de ratón preparado se dividió en grupos a los que se les administró PBS, IHD-W-VV05 e IHD-W-VV06 con 4 ratones por grupo, y luego se administraron 50 j l de PBS (Welgene, Cat No. LB001-02) o cada uno de los virus a razón de 1x107 TCID50/50 j l una vez en el tumor. Los resultados obtenidos midiendo el volumen del tumor después de la administración del virus se ilustran en la Fig. 30.
Como se ilustra en la Fig. 30, los resultados obtenidos al medir el volumen del tumor el día 14 después del tratamiento con el virus mostraron que el grupo al que se le administró IHD-W-VV05 y el grupo al que se le administró IHD-W-VV06 exhiben un volumen tumoral menor que el del grupo al que se le administró PBS. Se identificó que cuando se compara el volumen del tumor entre los grupos a los que se les administró el virus, el grupo al que se le administró IHD-W-VV06 exhibe un volumen del tumor menor que el del grupo al que se le administró IHD-W-VV05.
Modelo de tumor de piel
A continuación, se preparó la línea celular de cáncer de piel B16F10 incubándola en medio DMEM que contenía 10 % de suero bovino fetal. Cuando las células estaban siendo incubadas en una incubadora bajo una condición de 37 °C y 5 % de CO2 ocupaban entre el 70 % y el 80 % de una placa, las células se prepararon para la inoculación de células cancerosas. Las células cancerosas preparadas se centrifugaron a 1,500 rpm durante 5 minutos a 4 °C para eliminar todo el sobrenadante y las células se prepararon agregándoles un excipiente (medio DMEM). Las 5x105 células así preparadas se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones C57BL/6N (C57BL/6NHsd; KOATECH, Corea) para preparar un modelo de tumor de piel de ratón. Después de una semana, cuando el volumen del tumor aumentó de aproximadamente 70 a 100 mm3, el modelo de ratón preparado se dividió en grupos a los que se les administró PBS, IHD-W-VV05 e IHD-W-VV06 con 6 ratones por grupo, y luego se administraron 50 j l de PBS (Welgene, Cat No. LB001-02) o cada uno de los virus a razón de 1x10® TCID50/50 j l una vez en el tumor. Los resultados obtenidos midiendo el volumen del tumor después de la administración del virus se ilustran en la Fig. 31.
Como se ilustra en la Fig. 31, los resultados obtenidos al medir el volumen del tumor el día 12 después del tratamiento con el virus mostraron que el grupo al que se le administró IHD-W-VV0® exhibe un volumen tumoral menor que el del grupo al que se le administró IHD-W-VV05. En el grupo al que se le administró PBS, el volumen del tumor ya había alcanzado un promedio de 2,000 mm3 antes del día 12 después de la administración del virus. Por lo tanto, el grupo al que se le administró PBS fue sacrificado y los datos posteriores a 12 días se excluyeron del análisis.
Modelo de tumor pulmonar
A continuación, la línea celular de cáncer de pulmón LLC1 se incubó en una incubadora a 37 °C y 5 % de CO2 utilizando medio DMEM compuesto de 10 % de suero bovino fetal, 2 mM de L-glutamina y 1 % de antibióticosantimicóticos (GIBCO, Cat No. 15240-062). Se realizaron tres pases y luego se recolectaron las células cuando ocupaban entre el 70 % y el 80 % de la placa de cultivo durante el último pase. Se eliminó el sobrenadante de las células recolectadas y se le agregó un excipiente (DMEM) para que las células estuvieran preparadas para tener una concentración de 1*107/mL. Una suspensión celular que contenía 1*10® células así preparadas, se inyectó por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones C57BL/6N (C57BL/6NHsd; KOATECH, Corea) para preparar un modelo de tumor pulmonar de ratón. Después de una semana, cuando el volumen del tumor aumentó de aproximadamente 70 a 100 mm3, el modelo de ratón preparado se dividió en grupos para administrarles PBS, IHD-W-VV05 e IHD-W-VV06 con 6 ratones por grupo. Luego, se administraron 50 pl de PBS (Welgene, Cat No. LB001-02) o cada uno de los virus a razón de 1*10® TCID50/50 pl una vez en el tumor. Los resultados obtenidos midiendo el volumen del tumor después de la administración del virus se ilustran en la Fig. 32.
Como se ilustra en la Fig. 32, los resultados obtenidos al medir el volumen del tumor el día 14 después del tratamiento con el virus mostraron que el grupo al que se le administró IHD-W-VV05 y el grupo al que se le administró IHD-W-VV0® exhiben un volumen tumoral menor que el del grupo al que se le administró PBS. Se identificó que cuando se compara el volumen del tumor entre los grupos a los que se les administró el virus, el grupo al que se le administró IHD-W-VV0® exhibe un volumen del tumor menor que el del grupo al que se le administró IHD-W-VV05.
Ejemplo experimental 2.Determinación de la eficacia de supresión tumoral, en modelo animal, de varios virusvacciniarecombinantes en los que se eliminan los genes del VGF, TK y K3L o se inactiva su expresión y se induce la expresión del gen de sPD1-Fc o PH20 o IL-12.
Ejemplo experimental 2.1.Determinación de la eficacia de supresión tumoral, en modelo animal, de los virus IHD-W-VV01 e IHD-W-VV0®
Se realizó una comparación de los efectos antitumorales entre el IHD-W-VV01 y el IHD-W-VV0® recombinantes producidos en el Ejemplo 1 en un modelo de ratón.
Modelo de tumor de piel
A continuación, se preparó la línea celular de cáncer de piel B16F10 incubándola en medio DMEM que contenía 10 % de suero bovino fetal. Cuando las células estaban siendo incubadas en una incubadora bajo una condición de 37 °C y 5 % de CO2 ocupaban entre el 70 % y el 80 % de una placa, las células se prepararon para la inoculación de células cancerosas. Las células cancerosas preparadas se centrifugaron a 1,500 rpm durante 5 minutos a 4 °C para eliminar todo el sobrenadante y las células se prepararon agregándoles un excipiente (medio DMEM). Las 5*105 células así preparadas se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones C57BL/6N (C57BL/6NHsd; KOATECH, Corea) para preparar un modelo de tumor de piel de ratón. Después de una semana, cuando el volumen del tumor aumentó de aproximadamente 70 a 100 mm3, el modelo de ratón preparado se dividió en grupos a los que se les administró PBS, IHD-W-VV01 e IHD-W-VV0® con 4 ratones por grupo, y luego se administraron 50 pl de PBS (Welgene, Cat No. LB001-02) o cada uno de los virus a razón de 1*10® TCID50/50 pl una vez en el tumor. Los resultados obtenidos midiendo el volumen del tumor después de la administración del virus se ilustran en la Fig. 33.
Como se ilustra en la Fig. 33, los resultados obtenidos al medir el volumen del tumor el día 14 después del tratamiento con el virus mostraron que el grupo al que se le administró IHD-W-VV01 exhibe un volumen tumoral menor que el del grupo al que se le administró IHD-W-VV0®. En el grupo al que se le administró PBS, el volumen del tumor ya había alcanzado un promedio de 2,000 mm3 antes del día 12 después de la administración del virus. Por lo tanto, el grupo al que se le administró PBS fue sacrificado y los datos posteriores a 12 días se excluyeron del análisis.
Modelo de tumor pulmonar
A continuación, la línea celular de cáncer de pulmón LLC1 se incubó en una incubadora a 37 °C y 5 % de CO2 utilizando medio DMEM compuesto de 10 % de suero bovino fetal, 2 mM de L-glutamina y 1 % de antibióticosantimicóticos (GIBCO, Cat No. 15240-062). Se realizaron tres pases y luego se recolectaron las células cuando ocupaban entre el 70 % y el 80 % de la placa de cultivo durante el último pase. Se eliminó el sobrenadante de las células recolectadas y se le agregó un excipiente (DMEM) para que las células estuvieran preparadas para tener una concentración de 1*107/mL. Una suspensión celular que contenía 1*10® células así preparadas, se inyectó por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones C57BL/6N (C57BL/6NHsd; KOATECH, Corea) para preparar un modelo de tumor pulmonar de ratón. Después de una semana, cuando el volumen del tumor aumentó de aproximadamente 70 a 100 mm3, el modelo de ratón preparado se dividió en grupos para administrarles PBS, IHD-W-VV01 e IHD-W-VV0® con 6 ratones por grupo. Luego, se administraron 50 pl de PBS (Welgene, Cat No. LB001-02) o cada uno de los virus a razón de 1*106 TCID50/50 pl una vez en el tumor.
Los resultados obtenidos midiendo el volumen del tumor después de la administración del virus se ilustran en la Fig. 34.
Como se ilustra en la Fig. 34, los resultados obtenidos al medir el tamaño del tumor el día 14 después del tratamiento con el virus mostraron que el grupo al que se le administró IHD-W-VV01 y el grupo al que se le administró IHD-W-VV06 exhiben un volumen tumoral menor que el del grupo al que se le administró PBS. Se encontró que cuando se compara el volumen del tumor entre los grupos a los que se les administró el virus, el grupo al que se le administró IHD-W-VV06 exhibe un volumen del tumor menor que el del grupo al que se le administró IHD-W-VV01.
Ejemplo experimental 2.2.Determinación de la eficacia de supresión tumoral, en modelo animal, de los virus WR-VV01 y WR-VV06
Se realizó una comparación de los efectos antitumorales entre el WR-VV01 y el WR-VV06 recombinantes producidos en el Ejemplo 2 en un modelo de ratón.
Modelo de tumor pulmonar
A continuación, la línea celular de cáncer de pulmón LLC1 se incubó en una incubadora a 37 °C y 5 % de CO2 utilizando medio DMEM compuesto de 10 % de suero bovino fetal, 2 mM de L-glutamina y 1 % de antibióticosantimicóticos (GIBCO, Cat No. 15240-062). Se realizaron tres pases y luego se recolectaron las células cuando ocupaban entre el 70 % y el 80 % de la placa de cultivo durante el último pase. Se eliminó el sobrenadante de las células recolectadas y se le agregó un excipiente (DMEM) para que las células estuvieran preparadas para tener una concentración de 1*107/mL. Una suspensión celular que contenía 1*10® células así preparadas, se inyectó por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones C57BL/6N (C57BL/6NHsd; KOATECH, Corea) para preparar un modelo de tumor pulmonar de ratón. Después de una semana, cuando el volumen del tumor aumentó de aproximadamente 70 a 100 mm3, el modelo de ratón preparado se dividió en grupos para administrarles PBS, WR-VV01 y WR-VV06 con 6 ratones por grupo. Luego, se administraron 50 pl de PBS (Welgene, Cat No. LB001-02) o cada uno de los virus a razón de 1*10® TCID50/50 pl una vez en el tumor. Los resultados obtenidos midiendo el volumen del tumor después de la administración del virus se ilustran en la Fig. 35.
Como se ilustra en la Fig. 35, los resultados obtenidos al medir el tamaño del tumor el día 14 después del tratamiento con el virus mostraron que el grupo al que se le administró WR-VV01 y el grupo al que se le administró WR-VV0® exhiben un volumen tumoral menor que el del grupo al que se le administró PBS. Se encontró que cuando se compara el volumen del tumor entre los grupos a los que se les administró el virus, el grupo al que se le administró WR-VV0® exhibe un volumen del tumor menor que el del grupo al que se le administró WR-VV01.
Ejemplo experimental 2.3.Determinación de la eficacia de supresión tumoral, en modelo animal, de los virus Lister-VV01 y Lister-VV0®
Se realizó una comparación de los efectos antitumorales entre el Lister-VV01 recombinante y el Lister-VV0® producidos en el Ejemplo 3 en un modelo de ratón.
Modelo de tumor pulmonar
A continuación, la línea celular de cáncer de pulmón LLC1 se incubó en una incubadora a 37 °C y 5 % de CO2 utilizando medio DMEM compuesto de 10 % de suero bovino fetal, 2 mM de L-glutamina y 1 % de antibióticosantimicóticos (GIBCO, Cat No. 15240-062). Se realizaron tres pases y luego se recolectaron las células en un caso en el que ocupaban entre el 70 % y el 80 % de la placa de cultivo durante el último pase. Se eliminó el sobrenadante de las células recolectadas y se le agregó un excipiente (DMEM) para que las células estuvieran preparadas para tener una concentración de 1*107/mL. Una suspensión celular que contenía 1*10® células así preparadas se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones C57BL/6N (C57BL/6NHsd; KOATECH, Corea) para preparar un modelo de tumor pulmonar de ratón. Después de una semana, cuando el volumen del tumor aumentó de aproximadamente 70 a 100 mm3, el modelo de ratón preparado se dividió en grupos para administrarles PBS, Lister-VV01 y Lister-VV0® con 6 ratones por grupo. Luego, se administraron 50 pl de PBS (Welgene, Cat No. LB001-02) o cada uno de los virus a razón de 1*106 TCID50/50 pl una vez en el tumor. Los resultados obtenidos midiendo el volumen del tumor después de la administración del virus se ilustran en la Fig. 36.
Como se ilustra en la Fig. 36, los resultados obtenidos al medir el tamaño del tumor el día 14 después del tratamiento con el virus mostraron que el grupo al que se le administró Lister-VV06 exhibe un volumen tumoral menor que el del grupo al que se le administró PBS. Se encontró que cuando se compara el volumen del tumor entre los grupos a los que se les administró el virus, el grupo al que se le administró Lister-VV06 exhibe un volumen del tumor menor que el del grupo al que se le administró Lister-VV01.
III. Determinación de la capacidad de destrucción celularin vitrodel virusvacciniarecombinante en el que se eliminan los genes del VGF, TK y K3L o se inactiva su expresión y se induce la expresión de los genes de sPD1-Fc, PH20 e IL-12
Ejemplo experimental 1.Determinación de la eficacia de la eliminación de células tumorales causada por la administración de IHD-W-VV06, WR-VV06 o Lister-VV06
Se realizó el ensayo CCK-8 para identificar si el virusvacciniarecombinante IHD-W-VV06 producido en el Ejemplo 1, el virusvacciniarecombinante WR-VV06 producido en el Ejemplo 2 o el virusvacciniarecombinante Lister-VV06 producido en el Ejemplo 3 exhiben capacidad de destruir varios tipos de células cancerosas. Para identificar la capacidad de destrucción celular del virus recombinante en varias líneas celulares de cáncer de ratón, se preparó una línea celular de cáncer como se muestra en la Tabla 24 a continuación, y se incubó en una incubadora a 37 °C y 5 % de CO2. Luego, la línea celular se dispensó en una placa de 96 pocillos.
[Tabla 24]
En el presente documento, las respectivas líneas celulares se dispensaron de tal manera que el número de células por pocillo es 2 * 104 células para CT26-WT y Hep-55.1C, 1 * 104 células para Renca, LLC1, 4T1, CMT93 y B16F10, y 2 * 103 células para JC. Después de 24 horas de incubación, dada la capacidad de destruir células del virus de tipo silvestre de cada uno de los virus recombinantes, las líneas celulares se infectaron con los virusvacciniarecombinantes de la siguiente manera: a 1 MOI para IHD-W-VV06, a 1 MOI para WR-VV06 y a 10 MOI para Lister-VV06. En este caso, se utilizaron células no tratadas con virus como grupos de control respectivos. Después de 3 días, las células se tiñeron con solución de CCK-8 (Dojindo, Cat No. CK04) para determinar la viabilidad celular de las líneas de células cancerosas. Los resultados se ilustran en la Fig. 37. Como se ilustra en la Fig. 37, independientemente de la cepa devaccinia,los virus devacciniarecombinantes en los que se eliminan los genes del VGF, TK y K3L o se inactiva su expresión y se induce la expresión de los genes de sPD1-Fc, PH20 e IL-12 exhiben capacidad de destruir varios tipos de células cancerosas.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un virusvacciniarecombinante, que comprende:
un gen que codifica la proteína soluble de muerte celular programada 1 (sPD-1), un gen que codifica la hialuronidasa y un gen que codifica la interleucina (IL)-12.
2. El virusvacciniarecombinante de la reivindicación 1, en el que el sPD-1 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 131 o la SEQ ID NO: 133.
3. El virusvacciniarecombinante de la reivindicación 1, en el que el gen que codifica sPD-1 comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 132 o la SEQ ID NO: 134.
4. El virusvacciniarecombinante de la reivindicación 1, en el que la hialuronidasa comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 135.
5. El virusvacciniarecombinante de la reivindicación 1, en el que el gen que codifica la hialuronidasa comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 136.
6. El virusvacciniarecombinante de la reivindicación 1, en el que la IL-12 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 137.
7. El virusvacciniarecombinante de la reivindicación 1, en el que el gen que codifica IL-12 comprende cualquier secuencia de nucleótidos seleccionada entre la SEQ ID NO: 138, 139 y 140.
8. El virusvacciniarecombinante de la reivindicación 1, en el que el virusvacciniatiene suprimida la expresión de cualquiera de los genes seleccionados del grupo que consiste en un gen que codifica K3L, un gen que codifica la timidina quinasa (TK), un gen que codifica el factor de crecimiento devaccinia(VGF) y combinaciones de los mismos.
9. El virusvacciniarecombinante de la reivindicación 1, en el que el virusvacciniaes de una cepa seleccionada del grupo que consiste en Western Reserve (WR), New York Virusvaccinia(NYVAC), Wyeth (The New York City Board of Health), LC16m8, Lister, Copenhague, Tian Tan, USSR, Tashkent, Evans, International Health Division-J (IHD-J), International Health Division-White (IHD-W), variantes de los mismos y combinaciones de los mismos.
10. El virusvacciniarecombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la cepa del virusvacciniaes IHD-W.
11. Una composición que contiene, como ingrediente activo, el virusvacciniarecombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para su uso en la prevención o el tratamiento del cáncer.
12. La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el cáncer es cáncer sólido o cáncer sanguíneo, opcionalmente:
i) en donde el cáncer sólido es uno cualquiera seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de tiroides, cáncer de mama, cáncer de cerebro, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de esófago, cáncer de piel, cáncer de timo, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de hígado, cáncer de ovario, cáncer de útero, cáncer de vejiga, cáncer de recto, cáncer de vesícula biliar, cáncer de las vías biliares, cáncer de páncreas y combinaciones de los mismos; o
ii) en donde el cáncer sanguíneo es cualquiera seleccionado del grupo que consiste en linfoma, leucemia aguda, mieloma múltiple y combinaciones de los mismos.
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