ES3035541T3 - Neurodegenerative disease treatment apparatus - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y/o la mejora de la función cognitiva, en particular las asociadas con oligómeros, agregados o depósitos proteicos, mediante energía acústica, como el ultrasonido. Un ejemplo de dicha enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de Alzheimer. La presente invención proporciona un método para mejorar la función cognitiva y/o la memoria en una persona con deterioro de la memoria y/o la función ejecutiva. Este método incluye los pasos de identificar una región del cerebro del individuo que se va a tratar con energía acústica, aplicar un nivel clínicamente seguro de energía acústica a dicha región y, de este modo, saturar total o sustancialmente dicha región con energía acústica, mejorando así la memoria del individuo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Aparato para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas

Referencia cruzada

Esta solicitud reivindica la prioridad de solicitud provisional australiana núm. 2014902366.

Campo de la invención

La presente invención se dirige a un aparato adecuado para usarse en métodos para tratar enfermedades neurodegenerativas y/o mejorar la función cognitiva, en particular las asociadas con ensambles de proteínas, oligómeros, agregados o depósitos, mediante el uso de ultrasonido. Un ejemplo de tal enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de Alzheimer.

Antecedentes de la invención

Varias enfermedades neurodegenerativas se asocian con o son provocadas por la agregación y/o deposición de proteínas en el cerebro. Una de estas enfermedades es la enfermedad de Alzheimer (AD), que se caracteriza por la presencia de monómeros del péptido Ap que primero forman oligómeros solubles y después se agregan en depósitos fibrilares extracelulares conocidos como placas de amiloide. Los niveles de Ap se elevan en el cerebro de AD debido a su mayor producción y/o eliminación deficiente, con estrategias terapéuticas recientes dirigidas a ambos procesos. Esto incluye la inhibición de secretasas para reducir la producción de Ap, así como también enfoques de inmunización activa y, en particular, pasiva para el aclaramiento. Sin embargo, estas estrategias son desafiantes; la inhibición de las secretasas afecta a sustratos adicionales con posibles efectos fuera de la diana, mientras que la inmunización pasiva puede ser costosa una vez que se demuestra la eficacia en los ensayos clínicos.

Hasta la fecha, no existen tratamientos efectivos para mejorar la función cognitiva y/o la memoria en personas que tienen la enfermedad de Alzheimer o cualquier otra enfermedad asociada con o provocada por la presencia extracelular de proteínas patógenas, tales como oligómeros de proteínas, agregados y/o depósitos en el cerebro.

La referencia a cualquier técnica anterior en la descripción no es un reconocimiento o sugerencia de que esta técnica anterior forme parte del conocimiento general común en cualquier jurisdicción o que esta técnica anterior pueda esperarse razonablemente que sea entendida, considerada relevante y/o combinada con otras piezas de la técnica anterior por un experto en la técnica.

El documento US2010/143241 describe un método para abrir la barrera hematoencefálica (BBB) mediante el uso de ultrasonido y microburbujas preformadas. Con este método, los agentes diagnósticos o terapéuticos pueden administrarse al cerebro. Este método puede abrir una región focal de la BBB y administrar agentes de manera dirigida o el método puede abrir regiones grandes (o la totalidad) del cerebro para una administración más global de agentes. En un ejemplo, el método puede usarse para administrar agentes de contraste (por ejemplo, agentes que aumentan o disminuyen la señal de la obtención de imágenes por resonancia magnética) al cerebro y de esta manera mejorar la calidad o el contenido de información de los datos de obtención de imágenes. En otro ejemplo, puede usarse un escáner de ultrasonido diagnóstico clínico estándar para abrir regiones específicas de la BBB y administrar agentes diagnósticos o terapéuticos.

El documento US2004/049134 describe un sistema y métodos para el tratamiento terapéutico de placas cerebrales, fibrillas, enfermedades de deposición relacionadas con proteínas anormales o propensas a la agregación. El sistema emplea medios de terapia de exposición acústica para suministrar energía terapéutica a al menos una región del cerebro. La terapia soporta al menos uno de los siguientes procesos: (i) ruptura física, erosión, desenredamiento, desagregación, disolución, desaglomeración, desamalgamación o permeación de los depósitos, (ii) interferencia en al menos un proceso de formación de depósitos, reacción química relacionada con la deposición o vía biológica o genética que contribuye a los depósitos o procesos relacionados con la deposición, y (iii) ayuda a la recuperación, crecimiento, regeneración o funcionalidad mejorada de células relacionadas con el cerebro o vías funcionales afectadas negativamente, estresadas o dispuestas a los depósitos, procesos de deposición o estado de enfermedad por deposición, o apoyo al crecimiento de células recién trasplantadas en cualquier parte de la anatomía relacionada con el cerebro. El sistema y los métodos tratan la enfermedad de Alzheimer y otros trastornos relacionados con la deposición en el cerebro, con efectos secundarios adversos mínimos para el paciente y pueden usarse en cooperación con un fármaco.

El documento US2013/281890 describe métodos y sistemas para la estimulación cerebral profunda o superficial mediante el uso de múltiples modalidades terapéuticas, que incluyen la regulación positiva o negativa mediante el uso de ultrasonido que afecta uno o múltiples puntos en un circuito neural para producir potenciación a largo plazo (LTP) o depresión a largo plazo (LTD). También se describen: métodos y sistemas para el control de retroalimentación del paciente de la neuromodulación profunda no invasiva o superficial del cerebro; dispositivos para producir ultrasonido conformado o dirigido para la neuromodulación profunda no invasiva o superficial del cerebro; métodos y sistemas que usan haces de ultrasonido que se cruzan; técnicas de ultrasonido no invasivas para controlar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica; neuromodulación no invasiva de la médula espinal mediante energía de ultrasonido; métodos y sistemas para la neuromodulación no invasiva mediante el uso de ultrasonido para evaluar la viabilidad del tratamiento de neuromodulación mediante el uso de modalidades no ultrasonido/ultrasonido; y método y sistemas para la neuromodulación mediante el uso de ultrasonido suministrado en sesiones.

El alcance de la invención se expone en las reivindicaciones adjuntas. Las descripciones de los métodos mediante el uso del aparato reivindicado son solo ilustrativas y no se reivindican.

La presente invención aborda uno o más problemas descritos anteriormente.

La presente descripción proporciona un método para mejorar la función cognitiva en un individuo con función cognitiva deteriorada, el método incluye las etapas de:

- identificar una región del cerebro del individuo a tratar con energía acústica;

- aplicar un nivel clínicamente seguro de energía acústica a la región, de esta manera se satura o se satura sustancialmente la región con energía acústica;

de esta manera se mejora la función cognitiva en el individuo.

La presente descripción proporciona un método para mejorar la función cognitiva en un individuo con una enfermedad neurodegenerativa caracterizada por la agregación de una proteína patológica, el método incluye las etapas de: aplicar un nivel clínicamente seguro de energía acústica a sitios dentro de una región del cerebro asociada con la afección, de esta manera se satura o se satura sustancialmente la región con energía acústica; en donde la aplicación a al menos algunos de los sitios no dirige la energía acústica a depósitos capaces de ser observados mediante imágenes de la proteína;

de esta manera se mejora la función cognitiva en el individuo. Preferentemente, la ubicación de los depósitos capaces de ser observados mediante imágenes de la proteína en el cerebro del individuo no se ha determinado previamente mediante la obtención de imágenes.

La presente descripción proporciona un método para mejorar la memoria en un individuo con función de memoria deteriorada, el método incluye las etapas de:

- identificar una región del cerebro del individuo a tratar con energía acústica;

- aplicar un nivel clínicamente seguro de energía acústica a la región, de esta manera se satura o se satura sustancialmente la región con energía acústica;

de esta manera se mejora la memoria en el individuo.

Preferentemente, la identificación de una región del cerebro como se describe en la presente descripción incluye determinar un volumen del cerebro sobre la base de los síntomas mostrados por el individuo, típicamente síntomas clínicamente observables o bioquímicamente detectables, o

determinar un volumen del cerebro sobre la base de una asociación conocida con una enfermedad neurodegenerativa, en particular aquellas asociadas con oligómeros, agregados o depósitos de proteínas, o determinar un volumen del cerebro que incluye un volumen que rodea un sitio que tiene proteína extracelular en una forma patogénica, tal como oligómeros, un agregado o depósito.

El método incluye además determinar una pluralidad de sitios de aplicación discretos para la aplicación de energía acústica para saturar o saturar sustancialmente la región con energía acústica.

El método incluye además determinar una trayectoria de escaneo a lo largo de la cual se va a aplicar energía acústica para saturar o saturar sustancialmente la región con energía acústica. Preferentemente, el método incluye además determinar una pluralidad de sitios de aplicación discretos para la aplicación de energía acústica a lo largo de la trayectoria de exploración.

Típicamente, aplicar un nivel clínicamente seguro de energía acústica a la región incluye proporcionar energía acústica continuamente, o en los sitios de aplicación, a lo largo de una trayectoria de exploración.

En una modalidad, la trayectoria de exploración se define por un patrón predeterminado. La trayectoria de exploración puede seleccionarse del grupo que consiste en lineal, serpentina, un patrón de trama, espiral y aleatorio.

Cada sitio de aplicación puede estar separado a lo largo de la trayectoria de escaneo o cada sitio de aplicación subsecuente puede superponerse con el sitio de aplicación anterior.

La aplicación de un nivel clínicamente seguro de energía acústica a la región incluye la aplicación de energía acústica en un sitio de aplicación de manera que un volumen de tratamiento correspondiente se vea afectado terapéuticamente por la energía acústica, y en donde la saturación o la saturación sustancial de la región con energía acústica incluye la aplicación de energía acústica en una pluralidad de sitios de aplicación discretos o uno o más sitios de aplicación extendidos de manera que el(los) volumen(es) de tratamiento correspondiente(s) corresponda(n) sustancialmente con la región.

La pluralidad de sitios de aplicación puede seleccionarse de manera que los volúmenes de tratamiento de al menos algunos sitios se superpongan para formar un grupo de volúmenes de tratamiento que corresponda sustancialmente con la región.

La pluralidad de sitios de aplicación puede seleccionarse de manera que sus volúmenes de tratamiento correspondientes se superpongan para formar un volumen de tratamiento contiguo que corresponda sustancialmente con la región.

El método puede incluir además determinar un orden o aplicación de energía acústica en la pluralidad de sitios de aplicación. El orden o la aplicación de energía acústica puede determinarse para aplicar un nivel clínicamente seguro de energía acústica. Típicamente, esto implica minimizar uno o más de los siguientes: calentamiento, inflamación del cerebro, extravasación de glóbulos rojos, hemorragia o edema.

Un orden de aplicación de energía acústica a la pluralidad de sitios de aplicación puede determinarse de manera que se proporcione un período de retardo mínimo entre una aplicación de energía acústica a sitios de aplicación con volúmenes de tratamiento adyacentes o superpuestos. Preferentemente, un orden o aplicación de energía acústica no incluye aplicar secuencialmente energía acústica a sitios de aplicación con volúmenes de tratamiento adyacentes o superpuestos.

Una región del cerebro puede ser el cerebro completo, el hemisferio, el cerebro anterior o una región del cerebro de un individuo conocido por estar asociado con una afección que involucra la presencia de proteínas que adoptan estructuras patogénicas en una región extracelular. Tales estructuras pueden ser oligómeros, agregados y/o depósitos. La región puede ser una o más de las siguientes: cerebro, hemisferio cerebral, telencéfalo, cerebro anterior, corteza, lóbulo frontal, corteza prefrontal, giro precentral, corteza motora primaria, corteza premotora, lóbulo temporal, corteza auditiva, corteza temporal inferior, giro temporal superior, giro fusiforme, giro parahipocampal, corteza entorrinal, lóbulo parietal, corteza somatosensorial, giro postcentral, lóbulo occipital, corteza visual, corteza insular, corteza cingulada, subcortical, hipocampo, giro dentado, cuerno de Amón, amígdala, ganglios basales, estriado, caudado, putamen, núcleo accumbens, tubérculo olfatorio, globus pallidus, núcleos subtalámicos, corteza piriforme, bulbo olfativo, fórnix, cuerpos mamilares, cerebro anterior basal, núcleo basal de Meynert, diencéfalo, tálamo, hipotálamo, mesencéfalo, tectum, tegmento, sustancia negra, cerebelo, médula espinal y nervios craneales.

En un sujeto identificado como portador de la enfermedad de Alzheimer, la región puede seleccionarse del grupo que consiste en el cerebro, hemisferio cerebral, telencéfalo, prosencéfalo, corteza, lóbulo frontal, corteza prefrontal, giro precentral, lóbulo temporal, corteza auditiva, corteza temporal inferior, giro temporal superior, giro fusiforme, giro parahipocampal, corteza entorrinal, corteza insular, corteza cingulada, subcortical, hipocampo, giro dentado, cuerno de Amón, amígdala, corteza piriforme, bulbo olfativo, fórnix, cuerpos mamilares, prosencéfalo basal y núcleo basal de Meynert. Preferentemente, la región no se identifica únicamente como una placa.

En un sujeto identificado como portador de demencia frontotemporal, la región puede seleccionarse del grupo que consiste en cerebro, hemisferio cerebral, telencéfalo, cerebro anterior, corteza, lóbulo frontal, corteza prefrontal, giro precentral, corteza motora primaria, corteza premotora, lóbulo temporal, corteza auditiva, corteza temporal inferior, giro temporal superior, giro fusiforme, giro parahipocampal, corteza entorrinal, lóbulo parietal, corteza somatosensorial, giro postcentral, lóbulo occipital, corteza visual, corteza insular, corteza cingulada, subcortical, hipocampo, giro dentado, cuerno de Amón, amígdala, ganglios basales, estriado, caudado, putamen, núcleo accumbens, tubérculo olfativo, globo de pallidus, núcleos subtalámicos, corteza piriforme, bulbo olfativo, fórnix, cuerpos mamilares, cerebro basal anterior, núcleo basal de Meynert, mesencéfalo, tectum, tegmento, sustancia negra, cerebelo, mielencéfalo, médula oblongata, metencéfalo, puente y cerebelo.

En un sujeto identificado como portador de la enfermedad de Parkinson, la región puede seleccionarse del grupo que consiste en sustancia negra, ganglios basales, estriado, caudado, putamen, núcleo accumbens, cerebro, hemisferio cerebral, telencéfalo, cerebro anterior y corteza.

Como se usa en la presente descripción, la energía acústica proporcionada puede proporcionar condiciones para un aumento en la permeabilidad de la barrera hematoencefálica o activar la microglía. Las condiciones para un aumento en la permeabilidad de la barrera hematoencefálica se describen más detalladamente en la presente descripción.

Preferentemente, un nivel clínicamente seguro de energía acústica no da como resultado un calentamiento detectable, inflamación del cerebro, extravasación de glóbulos rojos, hemorragia o edema.

La energía acústica puede ser ultrasonido. El ultrasonido puede estar enfocado o no enfocado.

Una persona con función cognitiva y/o de la memoria deteriorada puede identificarse como que tiene una enfermedad neurodegenerativa provocada por la agregación patológica de una o más de las proteínas: Beta amiloide, fragmentos de amiloide, proteína precursora de amiloide, fragmentos de proteína precursora de amiloide y péptido británico. Típicamente, una mejora en la función cognitiva o la memoria se determina mediante pruebas neuropsicológicas estandarizadas.

La presente descripción proporciona un método para mejorar la memoria en un individuo con función de memoria deteriorada, el método incluye las etapas de:

- proporcionar a un individuo con función de memoria deteriorada;

- identificar una región del cerebro del individuo a tratar con energía acústica;

- aplicar un nivel clínicamente seguro de energía acústica a la región, de esta manera se satura o se satura sustancialmente la región con energía acústica;

de esta manera se mejora la memoria en el individuo.

La presente descripción proporciona un método para mejorar la función cognitiva en un individuo con función cognitiva deteriorada, el método incluye las etapas de:

- proporcionar a un individuo con función cognitiva deteriorada;

- identificar una región del cerebro del individuo a tratar con energía acústica;

- aplicar un nivel clínicamente seguro de energía acústica a la región, de esta manera se satura o se satura sustancialmente la región con energía acústica;

de esta manera se mejora la función cognitiva en el individuo.

La presente descripción proporciona un método para tratar una enfermedad neurodegenerativa asociada con una proteína patógena extracelular, el método incluye las etapas de:

- proporcionar un individuo identificado como portador de una enfermedad neurodegenerativa asociada con una proteína patógena extracelular;

- identificar una región del cerebro del individuo a tratar con energía acústica;

- aplicar un nivel clínicamente seguro de energía acústica a la región, de esta manera se satura o se satura sustancialmente la región con energía acústica;

de esta manera se trata la enfermedad neurodegenerativa en el individuo.

El método puede realizarse sin la adición de un agente terapéutico exógeno.

Típicamente, un método también incluye la etapa de administrar un agente para promover el aumento de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica. En una forma preferida, ese agente promueve la cavitación. Un agente que promueve la cavitación puede ser un agente de microburbujas como se describe en la presente descripción. La microburbuja puede proporcionarse al sujeto mediante infusión continua o un único bolo. La infusión puede ocurrir secuencialmente a, o después del inicio de, o simultáneamente con, la aplicación del ultrasonido.

La presente descripción proporciona un método para tratar una enfermedad neurodegenerativa asociada con una proteína patógena extracelular, el método incluye las etapas de:

- proporcionar un individuo identificado como portador de una enfermedad neurodegenerativa asociada con una proteína patógena extracelular;

- identificar una región del cerebro del individuo a tratar con energía acústica;

- aplicar un nivel clínicamente seguro de energía acústica a la región, de esta manera se satura o se satura sustancialmente la región con energía acústica;

de esta manera se trata la enfermedad neurodegenerativa en el individuo, en donde la ubicación de la proteína patógena en el cerebro no se ha determinado previamente en el sujeto. Preferentemente, la ubicación de la proteína patógena no se ha determinado mediante ningún método de obtención de imágenes tal como la obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI).

La presente descripción proporciona un método para tratar una enfermedad neurodegenerativa asociada con una proteína patógena extracelular que incluye las etapas de:

- proporcionar un sujeto identificado como portador de una enfermedad neurodegenerativa asociada con una proteína patógena extracelular;

- aplicar ultrasonido a una región del cerebro del sujeto para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica,

de esta manera se trata la enfermedad neurodegenerativa.

La presente descripción proporciona un método para tratar una enfermedad neurodegenerativa asociada con una proteína patógena extracelular que incluye las etapas de:

- proporcionar un sujeto identificado como que tiene una enfermedad neurodegenerativa asociada con una proteína patógena extracelular

- aplicar ultrasonido a todo el cerebro o una región del cerebro del sujeto para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica;

- administrar un agente de microburbujas al sujeto,

de esta manera se trata la enfermedad neurodegenerativa. Típicamente, la etapa de aplicar el ultrasonido se repite.

Cualquier método descrito en la presente descripción puede incluir además la etapa de determinar que la permeabilidad de la barrera hematoencefálica ha aumentado.

La presente descripción proporciona un método para tratar una enfermedad neurodegenerativa que consiste de aplicar un ultrasonido al cerebro de un sujeto, para tratar de esta manera la enfermedad neurodegenerativa.

La presente descripción también proporciona un método para tratar una enfermedad neurodegenerativa asociada con la acumulación de una proteína patógena extracelular que incluye

- posicionar al menos un emisor de ultrasonido en una ubicación anatómica cerca de una región del cerebro de un sujeto identificado como que tiene una enfermedad neurodegenerativa asociada con una proteína patógena extracelular;

- aplicar ultrasonido al cerebro del sujeto para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica,

de esta manera se trata la enfermedad neurodegenerativa. Típicamente, la proteína patogénica extracelular es una proteína que está presente en el exterior de la célula cuando se aplica el ultrasonido.

La presente descripción proporciona un método para mejorar la función cognitiva en un individuo con una enfermedad neurodegenerativa caracterizada por la agregación de una proteína patológica, el método incluye las etapas de:

aplicar un nivel clínicamente seguro de energía acústica a sitios dentro de una región del cerebro asociada con la afección, de esta manera se satura o se satura sustancialmente la región con energía acústica; en donde la aplicación a al menos algunos de los sitios no dirige la energía acústica a depósitos capaces de ser observados mediante imágenes de la proteína;

de esta manera se mejora la función cognitiva en el individuo. Preferentemente, la ubicación de los depósitos capaces de ser observados mediante imágenes de la proteína en el cerebro del individuo no se ha determinado previamente mediante la obtención de imágenes. Los sitios pueden estar sustancialmente distribuidos uniformemente por toda la región o la distribución de los sitios por toda la región no se correlaciona con la distribución de los depósitos capaces de ser observados mediante imágenes de la proteína a un nivel estadísticamente significativo.

La energía acústica puede aplicarse a una presión superior a 0,4 MPa. Típicamente, esta presión se usa cuando la aplicación de la energía acústica está fuera del cráneo, es decir, transcranealmente. De cualquier otra manera, la energía acústica puede aplicarse con un índice mecánico de entre 0,1 y 2.

La etapa de aplicar la energía acústica puede repetirse.

Típicamente, la aplicación de la energía acústica no está guiada por imágenes.

La invención se dirige a un aparato para, o cuando se usa para, aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica en un sujeto identificado como que tiene una enfermedad neurodegenerativa que incluye: un dispositivo emisor de ultrasonido que consiste de un transductor de ultrasonido con generación y amplificación de señales apropiadas, y un acoplador de fluidos para transmitir la salida ultrasónica y un agente de microburbujas. El dispositivo emisor de ultrasonido del aparato puede usar un transductor de ultrasonido no enfocado o una serie de transductores no enfocados o un transductor de ultrasonido de matriz en fase (es decir, ultrasonido enfocado).

Como se usa en la presente, excepto cuando el contexto lo requiera de cualquier otra manera, el término “comprender” y variaciones del término, tales como “que comprende”, “comprende” y “comprendido”, no pretenden excluir aditivos, componentes, enteros o etapas adicionales. “Que comprende” y “que incluye” pretenden tener el mismo significado.

Otros aspectos de la presente invención y otras modalidades de los aspectos descritos en los párrafos anteriores se harán evidentes a partir de la siguiente descripción, dada a manera de ejemplo y con referencia a las Figuras adjuntas.

Breve descripción de las Figuras

Figura 1: El ultrasonido de barrido (SUS) restaura la memoria en un modelo de ratón con Alzheimer. (A) Configuración del equipo de SUS. (B y C) La abertura de la barrera hematoencefálica (BBB) por ultrasonido se monitoreó mediante la inyección de ratones de tipo silvestre con colorante azul de Evans que se une a la albúmina, una proteína que normalmente se excluye del cerebro. (B) Un único punto de entrada reveló una abertura focal de la BBB en respuesta al tratamiento con ultrasonido, con el colorante azul de Evans capaz de entrar al cerebro en este punto. (C) Se demostró una abertura generalizada de la BBB 1 hora después del SUS con un escáner de fluorescencia Odyssey LI-COR de cortes de cerebro mediante el uso de nitrocelulosa con puntos con concentraciones crecientes de colorante azul como control. (D) Esquema de tratamiento para la primera cohorte de ratones APP23 formadores de placas de Ap hemicigotos machos (edad media, 12,8 meses). Los ratones recibieron tratamiento con SUS o simulado por una duración total del experimento de 6 semanas. Los ratones se asignaron aleatoriamente a grupos de tratamiento. Mediante el uso de métodos histológicos, transferencia Western, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y microscopía confocal, medimos el efecto del tratamiento con SUS en la patología por amiloide en el cerebro de ratón. Antes del último tratamiento con SUS, todos los ratones se probaron en el laberinto en Y. (E) La secuencia de entradas de brazos en el laberinto en Y se usó para obtener una medida de alternancia, que refleja la memoria de trabajo espacial. El porcentaje de alternancia se calculó mediante el número de secuencias de alternancia completas (es decir, ABC, BCA y CAB) dividido por el número de oportunidades de alternancia. La alternancia espontánea se restauró en los ratones APP23 tratados con SUS en comparación con los tratados simulados mediante el uso de compañeros de camada no-Tg como controles (n = 10 por grupo; ANOVA unidireccional seguida de la prueba posterior de Dunnett, P < 0,05). (F) El número total de entradas de brazos no difirió entre los grupos.

Figura 2: el SUSing reduce las placas de Ap en un modelo de ratón de Alzheimer. (A) Imágenes representativas de secciones coronales que flotan libremente de ratones APP23 de 12 meses de edad con y sin tratamiento. La tinción de plata de Campbell Switzer revela placas compactas y maduras (ámbar) y depósitos de Ap más difusos (negro), ver acercamiento (B). (C,D) La cuantificación de placas de amiloide revela una reducción del 56 % en el área de la corteza ocupada por placas (prueba t no pareada, P=0,017) y una reducción del 52 % en el número de placas por sección (prueba t, P=0,014) en ratones APP23 tratados con SUS en comparación con tratados simulados (n=10 por grupo). Secciones representativas de cerebros tratados con SUS frente a controles teñidos con Tioflavina S (E) y 4G8 (F). Barras de escala: A=1 mm, B,F,G=200 pm. (G) La carga de placa trazada como una función de la edad confirmó que el grupo tratado con SUS tenía una carga de placa significativamente menor que el grupo tratado simulado. La carga de placa basal al inicio del tratamiento se indica mediante círculos abiertos. Barras de escala, 1 mm (panel A) y 200 pm (panel B).

Figura 3: el SUSing reduce Ap y fragmentos de APP en el modelo de ratón de Alzheimer. (A a D) La transferencia Western de las fracciones enriquecidas extracelulares (A) y solubles en Tritón (B) de los cerebros de la primera cohorte de ratones APP23 con anticuerpos anti-Ap 6E10 y 4G8 reveló una reducción en las especies de Ap distintas en ambas fracciones en ratones tratados con SUS en comparación con tratados simulados. Estos datos se cuantifican en (C) y (D), respectivamente. Las transferencias Western muestran reducciones significativas de especies HMW (incl. sAPp y Ap), el Ap*56 oligomérico de 56-kD (*56) y Ap trimérico (3-mer)/CTFp, en la fracción enriquecida extracelular y de *56 y 3-mer/CTFp en la fracción soluble en Tritón (pruebas t no pareadas,P< 0,05). Se usó GAPDH (glicerol 3-fosfato deshidrogenasa) para la normalización. MWM, marcador de peso molecular. (E) ELISA para Ap42 en la fracción soluble en Tritón reveló una reducción significativa en cerebros de ratones tratados con SUS en comparación con tratados simulados (prueba t no pareada,P< 0,05;n =10 por grupo).

Figura 4: Fagocitosis microglial y captación lisosomal de Ap inducida por el tratamiento con SUS. (A y B) Las placas en animales tratados simulados estaban rodeadas de microglía positiva para CD68 lisosomal que contenía algo de Ap. (C y D) Por el contrario, las placas en cerebros de ratón tratados con SUS estaban rodeadas de microglía que contenía significativamente más Ap en sus compartimentos lisosomales, con algunas placas que parecían ser fagocitadas completamente por microglía. (E) Se observó un aumento de dos veces en Ap internalizado por microglía en cerebros de ratones tratados con SUS en comparación con tratados simulados (prueba t no pareada, P = 0,002). (F a I) Placas fotografiadas a gran aumento en 3D. El marcaje con CD68 reveló el grado de Ap en el sitio de la placa que fue internalizado por la microglía en lisosomas. Se usó 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para visualizar núcleos. (J) El análisis confocal de Ap y CD68 reveló que 6 de 8 ratones tratados con SUS y 0 de 8 ratones tratados simulados tenían "placas despejadas" en áreas corticales, con Ap que estaba casi completamente dentro de los lisosomas microgliales (prueba exacta de Fisher, P = 0,007; n = 8 por grupo, con cuatro secciones analizadas en cada caso). Barras de escala, 100 pm (A y C) y 10 pm (B, D, y F a I).

Figura 5: Los cerebros tomados de ratones APP23 coincidentes por edad donde solo se usaron puntos de entrada únicos; esto no dio como resultado reducciones significativas en la patología de Ap.

Figura 6. El tratamiento con SUS rescata los déficits de memoria en un modelo de ratón con AD. (A) Esquema de tratamiento de una segunda cohorte de 20 ratones APP23 coincidentes por sexo y 10 compañeros de camada no-Tg para determinar el resultado funcional del protocolo de tratamiento con SUS en pruebas de comportamiento más sólidas. Los ratones se analizaron en la tarea de APA, una prueba de aprendizaje espacial dependiente del hipocampo en la que los ratones aprendieron a evitar una zona de choque en una arena giratoria. Después de la prueba de APA, los ratones APP23 se dividieron en dos grupos con rendimiento coincidente y recibieron tratamiento con SUS o simulado semanalmente durante 7 semanas. Esto fue seguido de una reprueba de APA y una prueba de reconocimiento de objetos novedosos (NOR). Un día después del tratamiento final con SUS, los ratones se sacrificaron y los extractos de cerebro se analizaron mediante transferencia Western y ELISA. (B) Veinte ratones APP23 y 10 compañeros de camada no-Tg se probaron en la prueba de APA, con una sesión de habituación (etiquetada H) seguida de cuatro sesiones de entrenamiento (etiquetadas D1 a D4). (C) En la reprueba de APA, los ratones tratados con SUS mostraron un aprendizaje mejor que los ratones tratados simulados cuando se probaron para el aprendizaje de inversión (P = 0,031). (D) Los ratones tratados con SUS también mostraron mejoría cuando los primeros 5 min (memoria a largo plazo) y los últimos 5 min (memoria a corto plazo) se trazaron por separado (P=0,031). (E) La reprueba de APA fue seguida de la prueba de NOR para determinar el tiempo pasado con el objeto novedoso (etiquetado N) en comparación con el objeto familiar. (F) El análisis de la relación de discriminación que divide la medida anterior por el tiempo total gastado explorando ambos objetos reveló que los ratones APP23 tratados con SUS mostraron una preferencia aumentada por el objeto novedoso en comparación con los ratones APP23 tratados simulados (P = 0,036).

Figura 7. Captación aumentada de Ap por células microgliales en presencia de albúmina. La captación de Ap42 aumenta en un 65 % por la presencia de albúmina en células microgliales BV-2 (prueba t, P=0,0188). La citocalasina D se incluyó como control para inhibir la captación. Se muestra un cultivo de BV-2 incubado con albúmina (verde: LAMP2; rojo: Ap). Barra de escala: 25 pm.

Figura 8. Alterada la morfología después del ultrasonido pero sin alteración del número de microglía en ratones tratados con SUS. (A) Se observó un aumento de dos veces en el Ap internalizado por microglía en los cerebros tratados con SUS en comparación con los tratados simulados (prueba t no pareada, P=0,002). (B) El análisis confocal de Ap y CD68 revela que 6/8 ratones tratados con SUS y 0/8 ratones tratados simulados tenían 'placas despejadas' en áreas corticales, con Ap que estaba casi completamente dentro de los lisosomas microgliales (prueba exacta de Fisher, P=0,007, n= 8 por grupo, con cuatro secciones analizadas en cada caso). Secciones de ratones No-Tg (C), APP23 tratados simulados (D) y APP23 tratados con SUS (E) teñidos con el marcador microglial Iba1. (F) El área superficial microglial no difiere entre los tres grupos. (G) Tampoco hay diferencia en el tamaño de los cuerpos celulares microgliales entre los tres grupos. (H,I) Un análisis del esqueleto en el que tanto los puntos finales del proceso microglial sumados (H) como la longitud del proceso sumada (l) se normalizaron por célula, lo que muestra que la microglía en el grupo tratado con SUS está más activada. (K-M) Esto también se refleja por el aumento quíntuple en el área superficial de la inmunorreactividad para CD68 (prueba t, P=0,001) (K), un marcador de lisosomas microgliales/macrófagos, en los ratones APP23 tratados con SUS (M) en comparación con los tratados simulados (L). Barras de escala: C-E, L,M=100 pm.

Figura 9. Ausencia de daño cerebral después del tratamiento con ultrasonido de barrido (SUS) repetido o a corto plazo. (A,B) La BBB se abre en todo el cerebro después del tratamiento con SUS, como lo demuestra la extravasación del azul de Evans prevalente tan pronto como 30 min después del tratamiento. (C-E) Ausencia de edemas, extravasación de eritrocitos y neuronas "oscuras" reveladas por tinción de Nissl (acercamiento: giro dentado) de la cohorte 1 (ratones APP23, 5 tratamientos durante un período de seis semanas) (C-D) y (E-H) tinción de hematoxilina y eosina, que muestra la corteza (E,F) y el hipocampo (G,H). (I,K) Ausencia de daño isquémico después del tratamiento con SUS de ratones de tipo silvestre ya sea 4 h (I) o 24 h después del tratamiento con SUS (J) mediante el uso de tinción de fucsina ácida. Barras de escala: C=1 mm, E,F=50 pm, D,G,H=200 pm, I,K=50 pm.

Figura 10. Análisis de ratones tratados con SUS para marcadores inflamatorios. (A,B) La inmunorreactividad (porcentaje de área inmunorreactiva) para el marcador astrocítico GFAP aumenta en APP23 en comparación con los ratones No-Tg, pero no hay diferencia entre los ratones APP23 tratados simulados (A) y los tratados con SUS (B). (C,D) Los núcleos positivos para NFkB como marcador de inflamación crónica excesiva están ausentes en ratones de tipo silvestre. En ratones APP23, los núcleos positivos para NFkB son bajos en número y se confinan a las placas, sin diferencia obvia entre los ratones APP23 tratados con SUS (C) y los tratados simulados (D). (Azul, DAPI; verde, Iba1; rojo, NFkB nuclear). Barras de escala: 200 |jm.

Figura 11. El tratamiento con SUS reduce el Ap en una segunda cohorte de ratones con AD. (A) Se analizó una segunda cohorte de ratones APP23 mediante transferencia Western con el anticuerpo anti-Ap WO-2; las condiciones de gel y la transferencia se optimizaron para revelar específicamente el monómero y el trímero. El monómero se capturó eficientemente mediante el uso de dos membranas intercaladas. (B) Las transferencias mostraron una reducción significativa del monómero (reducción de cinco veces) y el trímero (reducción de dos veces) en la fracción extracelular (pruebas t no pareadas, P < 0,05). (C) ELISA para Ap42 en la fracción insoluble en guanidina reveló una reducción doble en ratones tratados con SUS en comparación con ratones tratados simulados (pruebatno pareada,P< 0,008;n= 10 por grupo).

Descripción detallada de las modalidades

Ahora se hará referencia en detalle a ciertas modalidades de la invención. Si bien la invención se describirá junto con las modalidades, se debe entender que la intención no es limitar la invención a esas modalidades. Por el contrario, la invención pretende cubrir todas las alternativas, modificaciones y equivalentes, que pueden incluirse dentro del alcance de la presente invención como se define por las reivindicaciones. Un experto en la técnica reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente descripción, que podrían usarse en la práctica de la presente invención. La presente invención no se limita de ninguna manera a los métodos y materiales descritos.

Los expertos en la técnica apreciarán que pueden hacerse numerosas variaciones y/o modificaciones a la invención como se muestra en las modalidades específicas sin apartarse del alcance de la invención como se limita por el alcance de las reivindicaciones. Las presentes modalidades deben considerarse, por lo tanto, en todos los aspectos como ilustrativas y no restrictivas.

Cualquier descripción de documentos, actos, materiales, dispositivos, artículos o similares que se haya incluido en la presente descripción es únicamente para el propósito de proporcionar un contexto para la presente invención.

Los inventores han desarrollado un enfoque terapéutico no invasivo, no farmacológico y selectivo de la región para restaurar la función cognitiva y/o de la memoria. Se cree que esto se logra mediante la eliminación de proteínas patógenas, tales como amiloide-p (Ap).

La invención es sorprendente ya que en el campo se creía que un aumento de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica estaba asociado con la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer.

Inesperadamente, los métodos de la invención no requieren agentes terapéuticos adicionales, tales como anticuerpos contra Ap, para el tratamiento.

Además, el método de la invención no requiere la identificación de la ubicación de las regiones asociadas con la proteína extracelular patógena, por ejemplo, a través de obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI). En otras palabras, la energía acústica, tal como el ultrasonido, puede dirigirse mediante técnicas de orientación simples, tales como orientar físicamente uno o más transductores en una pieza de cabeza, de esta manera se eliminan las complejidades del enfoque electrónico y se reduce la necesidad de guía de imagen. Este tratamiento también tiene la ventaja de tratar afecciones en las que el sitio preciso de la terapia no está bien definido. Un enfoque muy centrado tiene más probabilidades de ser fallido o solo cubrir parcialmente la región objetivo.

Sin estar ligado a ninguna teoría o modo de acción, se cree que el aumento de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica conduce a al menos uno de los siguientes procesos: i) eliminación de los agregados proteicos patológicos del cerebro a la sangre, después de la abertura de la barrera hematoencefálica, ii) suministro de componentes sanguíneos endógenos tales como albúmina o enzimas al cerebro que pueden unirse y desagregar los depósitos de proteínas, iii) suministro de anticuerpos endógenos y moléculas inflamatorias y complemento que pueden reducir los depósitos de proteínas al cerebro, iv) activación de microglía y astrocitos en el cerebro que conducen a la fagocitosis y reducción de los depósitos de proteínas, v) entrada de células inmunitarias al cerebro desde la sangre o la vasculatura que conducen a la fagocitosis y reducción de los depósitos de proteínas y/o, vi) activación de procesos en células neuronales que pueden conducir a la eliminación de los depósitos de proteínas.

Las ventajas de la invención descrita en la presente descripción incluyen que el método es no invasivo y transcraneal, no requiere la administración de un compuesto terapéutico y no requiere la identificación de la ubicación de agregados o depósitos de proteínas en el cerebro. Los métodos descritos en la presente descripción también son ventajosos ya que facilitan la eliminación de depósitos oligoméricos que no existen en depósitos capaces de ser observados mediante imágenes.

La estructura de la barrera hematoencefálica rodea los vasos sanguíneos en el cerebro y evita que la mayoría de las moléculas en la sangre entren al cerebro y tengan efectos. Por el contrario, la barrera hematoencefálica evita que el movimiento o la eliminación de moléculas en el cerebro entre en la circulación periférica. Además, la invención permite un aumento temporal en la permeabilidad de la barrera sangre-cerebro, lo que permite de esta manera restaurar la función natural de la barrera sangre-cerebro después de un período de tiempo.

Un sujeto que necesita tratamiento puede ser uno que presenta una función de memoria, función cognitiva o síntomas subclínicos o clínicos de una enfermedad neurodegenerativa. La selección de un individuo para el tratamiento puede implicar una etapa de cribado para identificar si el individuo presenta una función cognitiva, función de la memoria o una manifestación clínica de una enfermedad neurodegenerativa. Un sujeto que necesita tratamiento puede ser uno que se identifica como que tiene una enfermedad de etapa temprana, intermedia o tardía y, en el caso de la enfermedad de Alzheimer, puede identificarse como que tiene oligómeros o placas de Ap difusas.

En la enfermedad de Alzheimer hay un deterioro cognitivo significativo desde un nivel previo de rendimiento en una o más áreas de dominios cognitivos, preferentemente documentado mediante pruebas neuropsicológicas estandarizadas. Los dominios cognitivos que se ven afectados en la enfermedad de Alzheimer incluyen aprendizaje y memoria, atención compleja, función ejecutiva, cognición social y motora, y lenguaje. Esta lista de dominios no es exhaustiva

Además, otras enfermedades neurodegenerativas que podrían tratarse mediante la invención se caracterizan por déficits en los dominios cognitivos enumerados, así como también en la función motora.

Se documenta un deterioro de la memoria y el aprendizaje y al menos otro dominio cognitivo. El deterioro de la cognición es progresivo y gradual.

Las pruebas neuropsicológicas estandarizadas de cognición que podrían administrarse para identificar a un individuo que necesita tratamiento o para determinar la efectividad del tratamiento incluyen cualquiera de las siguientes pruebas o uno o más de sus componentes: Batería de pruebas neuropsicológicas, Escala de valoración cognitiva de la enfermedad de Alzheimer (ADAS-cog), Examen del estado mental mínimo, Batería de deterioro grave, Escala de valoración de la discapacidad para la demencia, Suma de recuadros de la Escala de valoración clínica de demencia, Impresión global del cambio clínico del estudio cooperativo de la enfermedad de Alzheimer, Escala de memoria visual inmediata de Wechsler, Escala de memoria verbal inmediata de Wechsler, Prueba de aprendizaje verbal auditivo de Rey, Span de dígitos de memoria de Wechsler, Prueba de asociación de palabras controlada, Prueba de fluidez de categorías, Escala de memoria visual retardada de Wechsler, Escala de memoria verbal retardada de Wechsler, RAVLT retardado, Escala de memoria de Wechsler, Tarea de Stroop, Tarea de clasificación de tarjetas de Wisconsin, u otras pruebas de memoria y función ejecutiva.

Un paciente con disfunción cognitiva causada por una enfermedad neurodegenerativa puede tener una o más de las siguientes deficiencias en los dominios destacados, por ejemplo:

- Aprendizaje y memoria: No puede hacer un seguimiento de los planes, se repiten en la conversación, necesita recordatorios frecuentes para realizar tareas;

- Atención compleja: Dificultad en entornos con múltiples estímulos, dificultad para retener nueva información en la mente;

- Función ejecutiva: Incapacidad para realizar proyectos complejos, incapacidad para tomar decisiones;

- Idioma: Dificultades con el lenguaje expresivo o receptivo, uso de términos generales en lugar de la palabra correcta, puede que no recuerde los nombres de amigos y familiares;

- Perceptivo-motor: Dificultad con tareas y actividades motoras previamente familiares, navegación; y

- Cognición social: Los cambios en el comportamiento, la digresión de las normas sociales, la toma de decisiones imprudentes, muestran una visión deficiente de estas decisiones.

Un paciente con demencia frontotemporal puede presentar deficiencias en uno o más de los dominios del lenguaje, cognición social, motor-perceptual, función ejecutiva y atención compleja sin deterioro del aprendizaje y la memoria, o puede estar presente un deterioro del aprendizaje y la memoria. En la enfermedad de Parkinson, los déficits motores pueden estar presentes con o sin déficits en otros dominios de la cognición, o pueden estar presentes déficits. En la enfermedad de Huntington, pueden estar presentes déficits motores sin déficits en otros dominios de la cognición, o pueden estar presentes déficits. En la esclerosis lateral amiotrófica, los déficits motores pueden estar presentes sin déficits en otros dominios de la cognición, o pueden estar presentes déficits.

Las enfermedades neurodegenerativas a las que puede aplicarse la invención son aquellas en las que la proteína patógena es extracelular y causa o contribuye a la enfermedad o un síntoma de esta. La proteína patógena puede estar en una forma patógena cuando está en una estructura alterada tal como un oligómero, un agregado o un depósito. La enfermedad de Alzheimer, la demencia con cuerpos de Lewy, la enfermedad de Parkinson, la degeneración lobar frontal y la demencia familiar británica y danesa son ejemplos no limitantes de enfermedades asociadas con proteínas patógenas extracelulares. La enfermedad de Alzheimer es el ejemplo más común de estas enfermedades en las que se forman oligómeros o placas compuestas de beta amiloide en el cerebro. Otras enfermedades neurodegenerativas son causadas por la agregación patológica de una o más de las proteínas: Beta amiloide, fragmentos de amiloide, proteína precursora de amiloide, fragmentos de proteína precursora de amiloide o péptido británico.

En una modalidad preferida, la afección, enfermedad o síndrome es la enfermedad de Alzheimer. En estas modalidades, el individuo a tratar puede presentar deterioro en los siguientes dominios cognitivos que incluyen aprendizaje y memoria, atención compleja, función ejecutiva, cognición social y lenguaje. Alternativamente, la persona puede presentar uno o más de los siguientes síntomas: Deterioro cognitivo asociado a la edad, disfunción neuronal asociada a la edad no restringida al deterioro cognitivo, pérdida de memoria a corto plazo, incapacidad para adquirir nueva información, deterioro de la memoria semántica, apatía, deterioro cognitivo leve, problemas de lenguaje, ejecutivos o visuoconstructivos o apraxia, deterioro de la memoria a largo plazo, irritabilidad y agresión, y agotamiento.

El tratamiento como se usa en la presente descripción se refiere al tratamiento terapéutico y también implica mejorar un síntoma asociado con una enfermedad. El tratamiento terapéutico puede medirse por un aumento o recuperación en una o más de las siguientes del grupo que consiste de función cognitiva; memoria a corto plazo; capacidad de adquirir nueva información; memoria semántica; apatía; problemas de lenguaje, ejecutivos o visuoconstructivos o apraxia; memoria a largo plazo; irritabilidad y agresión; o agotamiento. El tratamiento también puede medirse a través de la reducción en la presencia de proteína patógena o una reducción en las formas particulares de proteína patógena tales como agregados o depósitos de proteínas. La presencia y reducción de la proteína patógena que puede visualizarse o detectarse mediante técnicas de obtención de imágenes o técnicas bioquímicas descritas en la presente descripción. Por ejemplo, en relación con la enfermedad de Alzheimer, el tratamiento puede referirse a una reducción en las isoformas solubles o insolubles del péptido de amiloide-p o una reducción en el número de placas de amiloidep. Alternativamente, el resultado del tratamiento puede determinarse mediante pruebas neuropsicológicas o cognitivas. La mejora de la memoria puede determinarse mediante pruebas de memoria, típicamente una prueba administrada por un profesional clínico. Las pruebas neuropsicológicas estandarizadas de cognición que podrían administrarse para evaluar la efectividad del tratamiento incluyen cualquiera de las siguientes pruebas o uno o más de sus componentes: Batería de pruebas neuropsicológicas, Escala de valoración de la enfermedad de Alzheimersubescala cognitiva (ADAS-cog), Examen de estado mental mínimo, Batería de deterioro grave, Escala de valoración de la discapacidad para la demencia, Suma de casillas de la Escala de valoración clínica de demencia, Impresión global de cambio clínico del estudio cooperativo de la enfermedad de Alzheimer, Escala de memoria visual inmediata de Wechsler, Escala de memoria verbal inmediata de Wechsler, Prueba de aprendizaje verbal auditivo de Rey, Span de dígitos de memoria de Wechsler, Prueba de asociación de palabras controlada, Prueba de fluidez de categorías, Escala de memoria visual retardada de Wechsler, Escala de memoria verbal retardada de Wechsler, Prueba de aprendizaje verbal auditivo de Rey, Escala de memoria de Wechsler, Tarea de Stroop, Tarea de clasificación de cartas de Wisconsin, Prueba de trazado, o cualquier otra prueba de memoria y función ejecutiva sola o en combinación.

La energía acústica, tal como el ultrasonido, puede aplicarse a todo el cerebro o a una región del cerebro. Una región del cerebro puede ser un hemisferio o un prosencéfalo. La región puede ser al menos 25 % en volumen del cerebro. La región del cerebro puede ser una que se conoce que está asociada con la deposición de proteínas patógenas. Las regiones particulares del cerebro que se tratarán para el tratamiento efectivo diferirán en dependencia de la enfermedad. Por ejemplo, para la enfermedad de Alzheimer las áreas que pueden dirigirse incluyen el hipocampo, lóbulo temporal y/o el cerebro basal, más específicamente, el hipocampo, fórnix, cuerpo mamilar y giro dentado, giro cingulado posterior y lóbulo temporal. Para la demencia frontotemporal, la región del cerebro a tratar incluye la corteza. Para la esclerosis lateral amiotrófica, la región a tratar incluye la médula espinal, la corteza motora, el tronco encefálico.

La identificación de una región del cerebro a la que se aplica energía acústica puede incluir la determinación de un volumen del cerebro sobre la base de los síntomas mostrados por el individuo, típicamente síntomas clínicamente observables o bioquímicamente detectables, o la determinación de un volumen del cerebro sobre la base de una asociación conocida con una enfermedad neurodegenerativa, en particular aquellas asociadas con oligómeros de proteínas, agregados o depósitos, o la determinación de un volumen del cerebro que incluye un volumen que rodea un sitio que tiene proteína extracelular en una forma patogénica, tal como oligómeros, un agregado o depósito.

El enfoque de la fuente de energía acústica, típicamente un transductor de ultrasonido, puede moverse en un patrón con espacio entre los sitios de aplicación individuales en una región del cerebro como se describe en la presente descripción o el cerebro completo. El enfoque puede moverse mediante un sistema de posicionamiento motorizado.

En una forma preferida, los métodos de la invención implican la aplicación de ultrasonido enfocado a una pluralidad de ubicaciones en el cerebro. El ultrasonido enfocado puede aplicarse en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más ubicaciones en el cerebro o en cada hemisferio.

También se contempla que cualquier enfermedad, afección o síndrome que sea una consecuencia de o esté asociado con la agregación o deposición de proteínas en el cerebro, pueda tratarse mediante un método de la invención. Además, un síntoma de una enfermedad, afección o síndrome que es una consecuencia de o está asociado con la agregación o deposición de proteínas en el cerebro, puede reducirse en gravedad o incidencia mediante un método de la invención.

El aumento de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica puede promoverse mediante varios agentes. Estos agentes se basan en el principio de que las microburbujas biológicamente inertes y preformadas, con una cubierta de lípido o polímero, un núcleo de gas estabilizado y un diámetro de menos de 10 pm, pueden administrarse sistémicamente y subsecuentemente exponerse a pulsos de ultrasonido enfocados suministrados no invasivamente. Las microburbujas dentro del volumen objetivo se convierten de esta manera en "activadas acústicamente" por lo que se conoce como cavitación acústica. En este proceso, las microburbujas se expanden y contraen con la rarefacción y compresión de la presión acústica durante varios ciclos. Esta actividad se ha asociado con una serie de efectos que incluyen el desplazamiento de la pared del vaso a través de la dilatación y las contracciones. Se cree que la interacción mecánica entre ultrasonido, microburbujas y la vasculatura abre transitoriamente las uniones estrechas, aumentando de esta manera la permeabilidad de la barrera hematoencefálica.

El agente de microburbujas puede ser cualquier agente conocido en la técnica que incluye microesferas de tipo lipídico o microesferas de tipo proteico o una de sus combinaciones en una suspensión inyectable. Por ejemplo, el agente puede seleccionarse del grupo que consiste en octafluoropropano/albúmina (Optison), una microesfera lipídica de perflutreno (Definity), suspensión de microburbujas de galactosa-ácido palmítico (Levovist) aire/albúmina (Albunex y Quantison), aire/ácido palmítico (Levovist/SHU508A), perfluoropropano/fosfolípidos (MRX115, DMP115), dodecafluoropentano/surfactante (Echogen/QW3600), perfluorobutano/albúmina (perfluorocarbono expuesto a dextrosa sonicada con albúmina), perfluorocarbono/surfactante (QW7437), perfluorohexano/surfactante (Imagent/AF0150), hexafluoruro de azufre/fosfolípidos (Sonovue/BRI), perfluorobutano/fosfolípidos (BR14), aire/cianoacrilato (Sonavist/SHU563A) y perfluorocarbono/surfactante (Sonazoid/NC100100).

El agente de microburbujas puede proporcionarse como una infusión continua o como una dosis única en bolo. Se preferiría una infusión continua de microburbujas, preferentemente proporcionada durante la duración de la aplicación de ultrasonido. Típicamente, el agente de microburbujas se suministra por vía intravenosa a través de la circulación sistémica.

Para los métodos de la invención que incluyen el uso de un agente tal como una microburbuja u otra promoción basada en la cavitación de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica, el agente puede localizarse en, o cerca de, o en una región que se diana con el ultrasonido de manera que se minimice el potencial de daño no deseado de los efectos de la cavitación.

La etapa de aplicación, para el suministro de ultrasonido, puede comprender el suministro de ultrasonido desde una fuente de ultrasonido a través de un acoplador de fluido aplicado directamente a la cabeza del sujeto. En esta solicitud, el acoplador de fluido puede aplicarse a solo un lado o aspecto de la cabeza del sujeto. La cabeza puede ser una cabeza no modificada o una cabeza con una ventana creada quirúrgicamente en el cráneo, el acoplador de fluidos está en contacto con la ventana. El ultrasonido puede generarse mediante un transductor de ultrasonido no enfocado o un transductor de ultrasonido de matriz en fase (es decir, ultrasonido enfocado). Significativamente, el transductor de ultrasonido de matriz en fase puede ser una matriz en fase de diagnóstico. Las matrices de fase de diagnóstico generalmente tienen menor potencia y están disponibles comúnmente. El acoplador de fluido puede comprender un volumen contenido de fluido (por ejemplo, aproximadamente 50 cc, aproximadamente 100 cc, aproximadamente 200 cc, aproximadamente 400 cc, aproximadamente 500 cc, aproximadamente 600 cc o aproximadamente 1 litro). El fluido puede ser, por ejemplo, agua, gel ultrasónico, o una sustancia de impedancia acústica comparable. El fluido puede contenerse en un cilindro de fluido con al menos una porción de extremo flexible que se adapta a la cabeza del sujeto. En otras modalidades, el volumen contenido de fluido puede ser un contenedor de fluido flexible o elástico.

El aumento de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica puede determinarse mediante cualquier método de obtención de imágenes adecuado. Preferentemente, el método de obtención de imágenes es la resonancia magnética, un método de obtención de imágenes ópticas, tomografía por emisión de positrones (PET), tomografía computarizada (CT) o tomografía axial computarizada (CAT) o ultrasonido. Si se aplica un nivel de energía acústica, el aumento de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica podría determinarse mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción y se podría aplicar subsecuentemente un nivel aumentado de energía acústica hasta que la permeabilidad de la barrera hematoencefálica hubiera aumentado a un nivel clínicamente relevante.

Cualquier parámetro de ultrasonido que resulte en una aplicación clínicamente segura de energía acústica es útil en la invención. Típicamente, los parámetros de ultrasonido que se prefieren son aquellos que dan como resultado un aumento de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica o activan la fagocitosis de la microglía. Varios parámetros de ultrasonido pueden manipularse para influir en el aumento de la permeabilidad en la barrera sangre-cerebro y estos incluyen amplitud de presión, frecuencia de ultrasonido, duración de ráfaga, frecuencia de repetición del pulso, tamaño del punto focal y profundidad focal. Ahora se describen varios parámetros que son útiles en un método de la invención.

El tamaño del punto focal útil en un método de la invención incluye aproximadamente un ancho axial de 1 mm a 2 cm. Típicamente, el tamaño del punto focal tiene un ancho axial de aproximadamente 1 mm a 1,5 cm, preferentemente de 1 mm a 1 cm, aún con mayor preferencia de 1 mm a 0,5 cm. La longitud del punto focal puede ser de aproximadamente 1 cm a hasta aproximadamente 15 cm, preferentemente de 1 cm a 10 cm, incluso con mayor preferencia de 1 cm a 5 cm. El tamaño focal útil en un método de la invención es uno que permite un aumento en la permeabilidad de la barrera hematoencefálica del sujeto.

La profundidad focal del ultrasonido generalmente depende de las áreas del cerebro afectadas por la enfermedad. Por lo tanto, la profundidad focal máxima sería la medición desde la parte superior del cerebro hasta la base, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 cm. La profundidad focal podría alterarse mediante el enfoque electrónico, preferentemente mediante el uso de un transductor de matriz anular.

Típicamente, el ultrasonido se aplica en modo de onda continua, modo de ráfaga o ultrasonido pulsado. Preferentemente, el ultrasonido se aplica en modo ráfaga o ultrasonido pulsado. Los parámetros de duración del pulso que son útiles en un método de la invención incluyen entre aproximadamente 1 a aproximadamente 100 milisegundos, preferentemente la duración del pulso o la duración de ráfaga es de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 milisegundos. Las frecuencias de repetición de modo ráfaga ilustrativas pueden estar entre aproximadamente 10 Hz a 100 kHz, 10 Hz a 1 kHz, 10 Hz a 500 Hz o 10 Hz a 100 Hz.

El ciclo de trabajo (% del tiempo que se aplica el ultrasonido durante el tiempo) viene dado por la ecuación ciclo de trabajo = duración del pulso x frecuencia de repetición del pulso x 100. Típicamente, el ciclo de trabajo es de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 1 % a aproximadamente 20 %, aproximadamente 1 % a aproximadamente 10 % o aproximadamente 1 % a aproximadamente 5 %.

La presión de ultrasonido útil en un método de la invención es la mínima requerida para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica. El cráneo humano atenúa las ondas de presión del ultrasonido, que también depende de la frecuencia central del transductor, con frecuencias centrales más bajas del transductor de ultrasonido que provocan una mejor propagación y menos atenuación. Un ejemplo no limitante de presión de ultrasonido es entre 0,1 MPa a 2 MPa, preferentemente aproximadamente 0,4 o 0,5 MPa. Típicamente esta presión se aplica al cráneo, es decir, transcranealmente. El índice mecánico caracteriza la relación entre la amplitud de la presión negativa máximain situy frecuencia central con índice mecánico = Presión (MPa) / raíz cuadrada de la frecuencia central (MHz) si este índice mecánico estuviera libre de atenuación / medido desde dentro del cráneo, el índice mecánico estaría entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 2, preferentemente de aproximadamente 0,1 a 1 o de 0,1 a 0,5.

Un ejemplo no limitante de un sistema que es capaz de abrir la barrera hematoencefálica es el sistema TIPS (Philips Research). Consiste en un transductor de ultrasonido enfocado que genera un haz de ultrasonido enfocado con una frecuencia central de 1-1,7 MHz, profundidad focal de 80 mm, diámetro exterior activo de 80 mm, diámetro interior activo de 33,5 mm que se acciona mediante una fuente de señal acústica programable dentro de la consola y se une a un conjunto de movimiento de precisión. Un ejemplo adicional de un sistema que es capaz de generar un haz de ultrasonido adecuado para la interrupción de la barrera hematoencefálica es el ExAblate Neuro® (Insightec) system. Los parámetros adecuados para la abertura de la barrera hematoencefálica en humanos, tales como la frecuencia central y la dosis de microburbujas, pueden ser diferentes a los de los ratones.

Para cualquiera de los métodos o aparatos de la invención, el transductor de ultrasonido puede tener una frecuencia de salida de entre 0,1 a 10 MHz, o 0,1 a 2 MHz. El ultrasonido puede aplicarse durante un tiempo entre 10 milisegundos y 10 minutos. El ultrasonido puede aplicarse continuamente o en modo ráfaga.

Los agentes de contraste de imágenes, usados en cualquier método de la invención, pueden seleccionarse del grupo que consiste en agentes de contraste de resonancia magnética, agentes de contraste de rayos X (y tomografía computarizada por rayos X), agentes de contraste ópticos, agentes de contraste de tomografía por emisión de positrones (PET), agentes de contraste de tomografía computarizada de emisión de un solo fotón (SPECT) o agentes de obtención de imágenes moleculares. Por ejemplo, el agente de contraste para la obtención de imágenes puede seleccionarse del grupo que consiste en gadopentetato de dimeglumina, gadodiamida, gadoteridol, gadobenato de dimeglumina, gadoversetamida, iopromida, lopamidol, loversol o lodixanol, y lobitridol.

La frecuencia de aplicación del ultrasonido dependería generalmente de la gravedad del paciente. Los parámetros del ultrasonido y la repetición del tratamiento son de manera que hay un aumento en la permeabilidad de la barrera hematoencefálica pero preferentemente en donde no hay, o niveles clínicamente aceptables de, daño a las células parenquimatosas tales como daño endotelial o neuronal, extravasación de glóbulos rojos, hemorragia, calentamiento y/o inflamación del cerebro.

Cualquier método de la invención puede incluir además realizar una obtención de imágenes por resonancia magnética en un sujeto que comprende las etapas de (a) administrar un agente de contraste de resonancia magnética a un sujeto a través de la barrera hematoencefálica mediante el uso de cualquiera de los métodos de la invención y realizar una obtención de imágenes por resonancia magnética en dicho sujeto. En este contexto, el uso de la obtención de imágenes por resonancia magnética es para confirmar el aumento de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica y no para ubicar la presencia de una proteína patógena.

Otra modalidad de la invención implica proporcionar un agente de contraste para la obtención de imágenes al cerebro completo que incluye las etapas de administrar un agente de contraste para la obtención de imágenes al torrente sanguíneo de dicho sujeto; y aplicar ultrasonido al cerebro de dicho sujeto para abrir la barrera hematoencefálica y permitir que el agente de contraste de imagen cruce la barrera hematoencefálica. El agente de contraste para la obtención de imágenes se puede administrar al sujeto simultáneamente o secuencialmente con la aplicación del ultrasonido. En esta modalidad, la administración secuencial del agente de contraste puede ser anterior o posterior a la aplicación del ultrasonido. En una modalidad preferida, cualquiera de los agentes descritos en la presente descripción puede administrarse al torrente sanguíneo entre 1 a 4 horas, entre 2 a 4 horas o entre 3-4 horas después del tratamiento con ultrasonido mediante el uso de uno de los métodos de la invención.

Los ejemplos que siguen pretenden ilustrar pero de ninguna manera limitar la presente invención.

EJEMPLOS

El objetivo de este estudio fue establecer si una abertura transitoria de la BBB mediante el 'escaneo' del cerebro con un foco de ultrasonido podría ayudar en el aclaramiento de Ap.

Aquí se presenta un enfoque terapéutico no invasivo y no farmacológico para eliminar Ap y restaurar completamente las funciones de memoria en ratones con depósitos de Ap, mediante tratamientos de ultrasonido de barrido repetido (SUS) del cerebro.

Los datos experimentales se han generado mediante tratamientos semanales de ultrasonido de barrido (SUS) del cerebro en un modelo de ratón APP23 que deposita Ap de 12-13 meses de edad. Los investigadores han descubierto que el SUS combinado con microburbujas inyectadas por vía intravenosa interrumpe temporalmente la barrera hematoencefálica (BBB) sin provocar daño tisular. Es importante destacar que el SUS en combinación con microburbujas logró una restauración completa de la memoria espacial en el laberinto en Y, la memoria espacial y el aprendizaje en la prueba de APA, la memoria a corto plazo, el reconocimiento y la memoria visual en la prueba de NOR, así como también una reducción de las placas y los niveles de Ap con una eficacia comparable a la de la inmunización pasiva con Ap.

Ejemplo 1

Se estableció por primera vez en ratones de tipo silvestre C57BL/6 que la BBB puede abrirse repetidamente mediante ultrasonido, sin provocar daño tisular, ya sea mediante el uso de puntos de entrada únicos o mediante ultrasonido de barrido (SUSing) de todo el cerebro (Fig. 1 y 9). Los ratones se anestesiaron, se inyectaron por vía intravenosa con microburbujas junto con azul de Evans (EB) en experimentos piloto para demostrar la abertura exitosa de la BBB, y se colocaron bajo el foco de un transductor de ultrasonido TlpS (Philips), con gel de ultrasonido que se aplicó a la cabeza (Figura 1A). La disección del cerebro reveló que un solo pulso dio como resultado una columna azul de 1 mm de ancho que demostró una abertura centrada de la BBB (Figura 1B). Cuando el foco del haz de ultrasonido se movió en incrementos de 1,5 mm hasta que se sonicó (tratado con SUS) todo el cerebro anterior del ratón, la BBB se abrió en todo el cerebro, como lo evidencia la prevalencia de la extravasación de EB tan pronto como 30 min después del tratamiento (Fig. 1B y Fig. 9A y B). Optimizamos la configuración del ultrasonido y establecimos que una presión rarefactiva máxima de 0,8 MPa, una frecuencia de repetición de pulso de 10 Hz, un ciclo de trabajo del 10 % y un tiempo de sonicación de 6 s por punto no provocaron edemas ni extravasación de eritrocitos como se muestra por la tinción de hematoxilina y eosina, ni neuronas 'oscuras' como se revela mediante la tinción de Nissl (Figura 9).

A continuación, tratamos con SUS diez ratones APP23 formadores de placas de Ap de 12-13 meses de edad durante un período de seis semanas (Figura 1D). A esta edad, los ratones APP23 tienen una carga de placas sustancial y déficits de memoria espacial (L. M. Ittner y otros, Cell 142, 387 (2010)). Los ratones APP23 del grupo de control (n=10) recibieron todas las inyecciones y se colocaron debajo del transductor de ultrasonido, pero no se emitió ultrasonido. Después del período de tratamiento de cuatro semanas, los ratones se sometieron a pruebas de comportamiento en un período de dos semanas en el que no se trataron. Analizamos las funciones de memoria espacial en el laberinto en Y. Esto reveló que la alternancia espontánea en los ratones APP23 tratados con SUS, pero no en los animales tratados simulados, se restauró a niveles de tipo silvestre (ANOVA unidireccional, seguido de la comparación múltiple de Dunnett, P<0,05) (Figura 1E). Las entradas totales al brazo no difirieron entre los grupos (Figura 1F).

Los ratones recibieron un tratamiento de ultrasonido adicional y se sacrificaron cuatro días después para el análisis histológico y bioquímico. Primero usamos tinción de plata de Campbell-Switzer que puede distinguir el núcleo compacto de las placas maduras de los depósitos de Ap más dispersos (Fig. 2A, B). Al analizar cada 8va sección de -0,8 a -2,8 mm desde el bregma para cada ratón (un total de 8-10 secciones por ratón), encontramos que el porcentaje del área del córtex ocupada por placas se redujo en un 56 % (prueba t no pareada, P=0,014) (Figura 2C) y el número promedio de placas por sección se redujo en un 52 % (prueba t no pareada, P=0,017) (Figura 2D) en los ratones tratados con SUS en comparación con los tratados simulados. Se usó tioflavina S (Figura 2E) e inmunohistoquímica con el anticuerpo 4G8 específico de Ap (Figura 2F) para confirmar la especificidad de la tinción de plata. También trazamos la carga de placa, como se determina en la Figura 2C, como una función de la edad e incluimos ratones no tratados para demostrar la línea de base de la carga de placa al inicio del tratamiento (Figura 2G).

Después se extrajo el hemisferio derecho de 10 ratones APP23 tratados con SUS y 10 tratados simulados y se usaron estos para obtener dos lisados, una fracción enriquecida en proteínas extracelulares y una fracción soluble en Tritón (S. Lesne y otros, Nature 440, 352 (2006)). Mediante transferencia Western con anticuerpos contra Ap pudimos identificar diferentes especies (Fig. 3A,B). Los niveles de las especies de Ap se cuantificaron y se encontraron reducciones significativas en la fracción extracelular para los tratados con SUS en comparación con los ratones tratados simulados para especies de alto peso molecular, que incluyen APP soluble (HMW incl. sAPPa; reducción del 58 %), Ap oligomérico *56 (Ap*56; reducción del 38 %) y el fragmento carboxilo terminal (CTFp) trímero de Ap/APP tóxico (CTFp; reducción del 29 %) (Figura 3C), y para *56 (50 %) y Ap trímero/CTFp (27 %) en la fracción soluble en Tritón (pruebas t no pareadas, P<0,05) (Figura 3D). Por ELISA se reveló una reducción del 17 % para Ap42 en los ratones tratados con SUS en comparación con los tratados simulados (prueba t no pareada, P<0,05, n=10 por grupo) (Fig. 3E).

El grado de reducción de Ap logrado mediante SUSing es comparable al logrado mediante la inmunización pasiva con Ap (A. Wang, P. Das, R. C. Switzer, 3ra, T. E. Golde, J. L. Jankowsky, J Neurosci 31, 4124 (2011); J. L. Frost y otros, Neurodegener Dis 10, 265 (2012)), pero notablemente, el SUSing funciona sin un agente terapéutico adicional tal como anticuerpos contra Ap. Para las vacunaciones pasivas, se ha propuesto una serie de mecanismos para eliminar Ap del cerebro, con efectos variables sobre la activación microglial. Se ha demostrado que las moléculas inmunitarias de origen sanguíneo, incluidos los anticuerpos específicos de Ap, ayudan a la fagocitosis de Ap por parte de la microglía y los macrófagos perivasculares. La albúmina es otra molécula neutralizante de Ap que está presente en la sangre y puede establecer un "sumidero periférico". El hecho de que la albúmina unida a azul de Evans pueda detectarse en el cerebro después del SUSing sugiere que puede ayudar en la absorción de Ap no solo en la periferia sino también en el cerebro (Figura 1A). Se ha demostrado que la albúmina entra en el cerebro después de la interrupción de la BBB mediante ultrasonido y es fagocitada rápidamente por las células gliales pero no por las neuronas. También se ha demostrado que la albúmina se une a Ap e inhibe la agregación del péptido. Proponemos que después del tratamiento con SUS, la albúmina entra en el cerebro y se une a Ap y el complejo es fagocitado después por la microglía, lo que explica la capacidad de SUS para aumentar la fagocitosis de Ap, así como también para reducir los niveles de oligómeros de Ap.

Para analizar la activación microglial, se usó microscopía confocal de disco giratorio, que reveló que la microglía en cerebros tratados con SUS engulle placas y que contienen el doble (prueba t no pareada, P=0,002) de Ap en compartimentos lisosomales que en los ratones APP23 tratados simulados, como se muestra por la tinción conjunta de Ap y el marcador lisosomal microglial CD68 (Fig. 4A-D,E). La reconstrucción 3D de alta resolución reveló una extensa internalización de Ap en los cerebros tratados con SUS en comparación con los tratados simulados (Fig. 4F a I). El análisis confocal de Ap y CD68 reveló además 'placas despejadas' en áreas corticales en ratones tratados con SUS para los cuales Ap estaba casi completamente dentro de los lisosomas microgliales. Estos se observaron en el 75 % de los ratones tratados con SUS y nunca en los ratones tratados simulados (prueba exacta de Fisher, p=0,007, ocho ratones por grupo, con cuatro secciones analizadas en cada caso (Figura 4J). Juntos, nuestros resultados revelan que el uso de SUSing activa la microglía residente y promueve la internalización de Ap, aunque se necesitan estudios adicionales para determinar el papel relativo de los diferentes mecanismos endógenos que probablemente eliminarán Ap. Para evitar una activación inmunitaria potencialmente excesiva en un entorno clínico (K. M. Lucin, T. Wyss-Coray, Neuron 64, 110 (2009)), el régimen de tratamiento con ultrasonido podría realizarse por etapas que cubren una área del cerebro a la vez.

La microscopía confocal de disco giratorio y la reconstrucción 3D de alta resolución revelan una internalización extensa de Ap en microglía en cerebros tratados con SUS en comparación con los tratados simulados. Se observaron placas despejadas en el 75 % de los ratones tratados con SUS pero nunca en los animales tratados simulados. Dado que el SUSing repetido no causa daño cerebral, nuestro estudio destaca su potencial como un enfoque terapéutico viable para la AD.

Los cerebros tomados de ratones APP23 coincidentes por edad en los que se aplicó ultrasonido en solo puntos de entrada únicos no dieron como resultado reducciones significativas en la patología de Ap (ver Figura 5). Esto resalta la ventaja de múltiples sitios de aplicación de ultrasonido como se describe en la presente descripción.

Para determinar el resultado funcional de nuestro protocolo de tratamiento con SUS en pruebas de comportamiento más robustas, a continuación analizamos una segunda cohorte de 20 ratones APP23 coincidentes con el sexo y compañeros de camada no-Tg (n = 10) en la tarea de evitación activa del lugar (APA), una prueba de aprendizaje espacial dependiente del hipocampo en la que los ratones aprenden a evitar una zona de choque en una arena giratoria (Fig. 6A, diseño del estudio). Los ratones APP23 y los compañeros de camada no-Tg se sometieron a 4 días de entrenamiento después de la habituación. Hubo efectos significativos del día de entrenamiento (F<384>= 5,49, P = 0,002) y genotipo (F<128>= 5,41, P = 0,028, ANOVA bidireccional), con el día como factor dentro de sujetos (Fig. 6B). Los ratones APP23 se dividieron en dos grupos con rendimiento coincidente en la prueba de APA y recibieron tratamiento con SUS o simulado semanalmente durante 7 semanas. Los ratones se volvieron a probar en la prueba de APA con la ubicación de la zona de choque en el área opuesta de la arena (aprendizaje de inversión). En la reprueba, hubo un efecto significativo del día (F<3,84>= 2,809, P = 0,044) y grupo de tratamiento (F<2,28>= 3,933, P = 0,0312). La prueba de comparaciones múltiples para efectos simples dentro de las filas mostró que los ratones tratados con SUS recibieron menos choques en los días 3 (P = 0,012) y 4 (P = 0,033) (Fig. 6C). Los ratones tratados con SUS también mostraron mejora cuando se trazaron por separado los primeros 5 min (memoria a largo plazo) y los últimos 5 min (memoria a corto plazo) de su rendimiento (F<2,28>= 3,951, P = 0,0308) (Figura 6D). También realizamos una prueba de NOR, que reveló un rendimiento mejorado después del tratamiento con SUS, con ratones tratados con SUS que mostraron una preferencia por el objeto novedoso (etiquetado N, Figura 6, E y F) [F<2,28>= 2,99, P = 0,066; t(20) = 2,33, P = 0,0356] en comparación con los animales de control tratados simulados.

Tras el sacrificio, realizamos un análisis de transferencia Western mediante el uso del anticuerpo específico de Ap WO-2, que mostró una reducción cinco veces del monómero y una reducción de dos veces del trímero en ratones APP23 tratados con SUS en comparación con tratados simulados (pruebas t no pareadas, P < 0,05) (Fig. 11, A y B). La ELISA de la fracción cerebral insoluble en guanidina reveló una reducción doble en Ab42 en muestras tratadas con SUS (P < 0,008, prueba t no pareada) (Figura 11C). En conjunto, estos datos demuestran que SUS tiene un efecto sólido sobre Ap y la función de la memoria en ratones con a D.

Se ha demostrado que la fagocitosis de Ap por microglía y macrófagos perivasculares está asistida por moléculas inmunitarias de origen sanguíneo, que incluyen anticuerpos específicos contra Ap. Otra molécula neutralizante de Ap es la albúmina, que está presente en la sangre y puede establecer un "fondo perdido periférico". El hecho de que la albúmina unida al colorante azul de Evans pueda detectarse en el cerebro después del tratamiento con SUS sugiere que la albúmina puede ayudar a la captura de Ap no solo en la periferia sino también en el cerebro. Para determinar si la albúmina puede facilitar la captación de Ap por microglía, incubamos células BV-2 microgliales en cultivo con Ap42 con y sin albúmina (10 mg/ml; equivalente al 20 % de la concentración en suero humano) y encontramos un aumento del 65 % en la captación de Ap42 en presencia de albúmina (prueba t, P = 0,0188) (Figura 7). Este resultado sugiere que después del tratamiento con SUS, la albúmina puede entrar en el cerebro y unirse a Ap, lo que facilita la fagocitosis microglial.

A continuación, se buscó determinar si la microglía en ratones APP23 tratados con SUS en comparación con tratados simulados difería en otras características mediante el uso de compañeros de camada no-Tg tratados simulados como control. Mediante el uso del marcador citoplasmático microglial Iba1 (molécula adaptadora de unión al calcio ionizado 1) (Fig. 8, C a E), primero determinamos el área superficial microglial total, pero no encontramos diferencias entre los tres grupos (prueba t) (Fig. 8F); tampoco hubo diferencia en el tamaño de los cuerpos celulares microgliales (prueba t) (Fig. 8G). La microglía en reposo tiene extensiones altamente ramificadas a diferencia de la microglía fagocítica activada. Para cuantificar el grado de ramificación, después de teñir con el marcador microglial activado Iba1, convertimos las imágenes en imágenes binarias que después se esquelificaron (para obtener la geometría arbórea más precisa posible). En este análisis, tanto los puntos finales del proceso microglial sumados como la longitud del proceso sumada se normalizaron por célula mediante el uso del complemento Analyze Skeleton en ImageJ (Institutos Nacionales de Salud) (Fig. 8H e I). Esto mostró que la microglía en el grupo tratado con SUS estaba más activada, un hallazgo que también se reflejó en un aumento de cinco veces en el área de inmunorreactividad para CD68 (prueba t, P = 0,001), un marcador específico de lisosomas microgliales y macrófagos (Fig. 8, K a M).

Finalmente, determinamos si el SUS reguló positivamente los marcadores inflamatorios asociados con el daño tisular. Primero evaluamos el marcador astrocítico GFAP (proteína ácida fibrilar glial) y encontramos una inmunorreactividad aumentada (porcentaje de área inmunorreactiva) en APP23 en comparación con ratones no-Tg, pero sin diferencia entre ratones APP23 tratados con SUS y tratados simulados (Fig. 10, A y B). También investigamos la localización nuclear del factor de transcripción NF-kB (factor nuclear kB), un marcador de inflamación crónica excesiva. Los núcleos positivos para NF-kB estaban ausentes en ratones de tipo silvestre. En los ratones APP23, se confinaron a placas, pero no observamos diferencias entre los animales tratados con SUS y los tratados simulados (Fig. 10, C y D). En conjunto, nuestro análisis sugirió que el tratamiento con SUS no condujo a una inflamación dañina.

Ejemplo 2

Diseño del estudio. El estudio tuvo como objetivo investigar cómo el tratamiento con ultrasonido de barrido (SUS) afectaría los niveles de Ap, la carga de placas, la fagocitosis microglial de Ap y la memoria espacial. Para este fin, se administró a APP23 machos de 12-13 meses de edad tratamiento con SUS o tratamiento simulado por una duración total del experimento de seis semanas. Mediante el uso de métodos histológicos, transferencia Western, ELISA y microscopía confocal medimos el efecto del tratamiento con SUS en la patología por amiloide. Los ratones se asignaron aleatoriamente a grupos de tratamiento. La condición de tratamiento se mantuvo enmascarada hasta el análisis. Todos los animales se incluyeron en el análisis. Los tamaños de muestra se eligieron en base a la experiencia previa y sobre la base de estudios de este tipo realizados por otros.

Modelos animales y ética. Los ratones APP23 hemicigotos machos sobre un fondo C57BL/6J y sus compañeros de camada no transgénicos se trataron una vez a la semana durante cuatro semanas con ultrasonido de barrido (SUS), o se trataron simuladamente. Los ratones APP23 expresan hAPP751 con la doble mutación sueca bajo el control del promotor murino Thy1.2 (C. Sturchler—Pierrat y otros, Proc Natl Acad Sci U S A 94, 13287 (1997)). Los ratones tenían de 12-13 meses de edad al inicio del tratamiento. Los ratones APP23 de esta edad se caracterizan por placas de amiloide maduras pronunciadas, principalmente en la corteza, así como también por déficits de memoria asociados. Los compañeros de camada de tipo silvestre de los ratones APP23 también se probaron en el laberinto en Y. Para el tratamiento simulado, los ratones recibieron todas las inyecciones y se colocaron debajo del transductor de ultrasonido, pero no se emitió ultrasonido. Después del período de tratamiento de cuatro semanas, los ratones se sometieron a pruebas de comportamiento en un período de dos semanas en el que no se trataron. Después de esto, los ratones tuvieron un tratamiento de ultrasonido más y se sacrificaron cuatro días después. La experimentación con animales fue aprobada por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Queensland (número de aprobación QBI/027/12/NHMRC).

Equipo de SUS. Se usó un sistema de ultrasonido enfocado integrado (Therapy Imaging Probe System, TIPS, Philips Research) (R. Seip y otros, IEEE Trans Biomed Eng 57, 61 (2010)). El sistema consistió en un transductor de matriz anular con un foco natural de 80 mm, un radio de curvatura de 80 mm, una envoltura esférica de 80 mm con una abertura central de 31 mm de diámetro, un sistema de posicionamiento tridimensional (3D) y un sistema motorizado programable para mover el foco de ultrasonido en los planos x e y para cubrir toda el área del cerebro. Un acoplador montado en el transductor se rellenó con agua desgasificada y se colocó en la cabeza del ratón con gel de ultrasonido para acoplarse para garantizar la propagación del ultrasonido al cerebro. La zona focal del conjunto era una elipse de aproximadamente 1,5 mm x 1,5 mm x 12 mm.

Anticuerpos y reactivos. Los anticuerpos contra el epítopo 1-16 (6E10) y 17-24 (4G8) del péptido Ap fueron de Covance. Los anticuerpos contra CD68 fueron de AbD Serotec (MCA195TT) y contra GAPDH de Millipore. Los anticuerpos secundarios fueron de Invitrogen, Cell Signaling y Dako. El kit de ELISA de amiloide p42 humano fue de Millipore (EZH542). Los niveles de proteína total se analizaron con un kit BCA de Pierce (23227). Los reactivos químicos eran de Sigma.

Producción de microburbujas. Se fabricaron y caracterizaron internamente microburbujas con cubierta lipídica con un núcleo de octafluoropropano. Una relación 1:5:2:1 de PEG6000, distearoil-fosfatidilcolina, distearilfosfatidiletanolamina y plurónico F68 se disolvió en una solución de cloruro de sodio al 0,9 %. La solución se añadió a viales de HPLC de vidrio y el aire se eliminó y se reemplazó con gas octafluoropropano para rellenar el espacio de cabeza del vial (Arcadophta). El día de su uso, los viales se calentaron a 37 °C y después se agitaron en un amalgamador dental durante 40 s a 4000 rpm. La concentración y el tamaño de las microburbujas se examinaron bajo un microscopio y se encontró que era de 1-5 x 107 microburbujas/ml con un intervalo de tamaño de 1-10 pm, y un diámetro medio de 4 pm (datos no mostrados).

Aplicación de SUS. Los ratones se anestesiaron con zoletil (20 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) y el pelo de la cabeza se afeitó y se depiló. Los ratones se inyectaron retroorbitalmente con 1 pl/g de peso corporal de solución de microburbujas y después se colocaron bajo el transductor de ultrasonido con la cabeza inmovilizada. (También se probaron inyecciones intravenosas, pero demostraron ser menos eficaces debido a las pequeñas venas de la cola de los ratones). Los parámetros para el suministro de ultrasonido fueron una presión rarefactiva máxima de 0,8 MPa, una frecuencia de repetición de pulso de 10 Hz, un ciclo de trabajo del 10 % y un tiempo de sonicación de 6 s por punto. El sistema de posicionamiento motorizado movió el foco del conjunto de transductores en una cuadrícula con 1,5 mm entre los sitios individuales de sonicación para que el ultrasonido se suministrara secuencialmente a todo el cerebro.

Monitoreo de la abertura de la barrera hematoencefálica y el daño al tejido cerebral. Para determinar la abertura exitosa de la barrera hematoencefálica (BBB), se inyectaron 4 ml/kg de una solución al 2 % de colorante azul de Evans (EB) en NaCl al 0,9 % junto con una dosis de 1 pl/g de las microburbujas y se realizó el tratamiento con SUS o simulado como se describió anteriormente. Después de 30 min, los ratones se anestesiaron profundamente y se perfundieron transcardíacamente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) seguido de paraformaldehído (PFA) al 4 % y se fotografiaron bajo un estereomicroscopio (Carl Zeiss). La EB se une a la albúmina en >99 % en la sangre y es impermeable a la BBB. Además, encontramos que el uso de SUSing aumentó la permeabilidad de la BBB a la albúmina y a la IgG de ratón mediante inmunofluorescencia en secciones (datos no mostrados). Para determinar el daño, las secciones de ratones tratados con SUS se tiñeron con hematoxilina y eosina para evaluar la extravasación de eritrocitos y el daño tisular, así como también con violeta de cresilo (tinción de Nissl) para evaluar las neuronas 'negras' dañadas.

Procesamiento de tejidos. Los ratones se anestesiaron profundamente con pentobarbital antes de ser perfundidos con 30 ml de PBS helado. Los cerebros se diseccionaron del cráneo y se cortaron a lo largo de la línea media. El hemisferio izquierdo se fijó en PFA al 4 % p/vol durante 24 horas, se crioprotegió en sacarosa al 30 % y se seccionó coronariamente a un grosor de 40 pm en un micrótomo de congelación deslizante. Una serie de secciones de uno de ocho se almacenó en PBS con azida de sodio a 4 °C hasta la tinción. El hemisferio derecho del cerebro se congeló en una suspensión de hielo seco/etanol y se almacenó a -80 °C hasta que se usó para el análisis bioquímico.

Evaluación de la carga de placas de amiloide. Una serie de una en ocho secciones coronales del cerebro se cortaron a un grosor de 40 pm en un micrótomo. Se procesó una serie completa de secciones para la tinción de plata de Campbell-Switzer (D. R. Thal, U. Rub, M. Orantes, H. Braak, Neurology 58, 1791 (2002)) mediante el uso de un protocolo disponible en línea en http://www.neuroscienceassociates.com/Documents/Publications/campbellswitzer_protocol.htm. Para el recuento de placas, se tiñó una serie completa de secciones de uno de cada ocho mediante el uso del método de Campbell-Switzer y se analizaron todas las secciones de -0,85 mm a -2,8 mm desde el bregma (8-10 secciones por ratón) después de fotografiarlas a un aumento de 16 x en un escáner de portaobjetos de campo brillante. La carga de placas en la corteza se obtuvo mediante el complemento de análisis de partículas de ImageJ (NIH) en imágenes codificadas de secciones mediante el uso del método de fracción de área.

Microscopía confocal de disco giratorio y renderización 3D. Las imágenes confocales se adquirieron mediante el uso de una cabeza confocal de disco giratorio (CSU-W1, Yokogawa) acoplada a un microscopio Zeiss Axio Observer Z1 invertido totalmente motorizado equipado con un objetivo de aire Plan-Apochromat 20x 0,8NA, un objetivo de aceite Plan-Apochromat 100x 1,4NA (Carl Zeiss) y una cámara ORCA-Flash4.0 sCMOS (Hamamatsu) controlada por Slidebook (v5.5; Intelligent Imaging Innovations, Inc.).

Cada pila de imágenes 3D consistió en planos de imagen de 2048 * 2048 píxeles (640 x 640 jm a 20x y 128 x 128 |jm a 100x) que se separaron por 1,2 jm y 0,4 jm para 20x y 100x, respectivamente, y se adquirieron a lo largo de la sección de tejido que comienza en el portaobjetos. Los tiempos de exposición (100 - 800 ms) se mantuvieron consistentemente para cada marcador en todos los experimentos para evitar cualquier incidencia de saturación de píxeles.

La microglía (positiva para CD68) se identificó mediante el uso de la segmentación automática en Imaris (Bitplane). Las superficies 3D de microglía se usaron para enmascarar el etiquetado de Ap de manera que pudiera determinarse el volumen de Ap internalizado. Se creó un renderizado 3D de placas mediante el uso de herramientas de contorno 3D en Imaris. Para la evaluación de la proporción de Ap contenida dentro de los lisosomas microgliales, se analizaron cinco ratones tratados simulados y cinco ratones tratados con SUS y las diferencias se probaron con una prueba t.

Extracción de proteínas. Realizamos una extracción en serie para obtener fracciones enriquecidas para proteínas extracelulares y una fracción soluble en Tritón como se describe en otra parte (S. Lesne y otros, Nature 440, 352 (2006)). El cerebro anterior del hemisferio derecho se colocó en cuatro veces el peso/volumen de tampón que contenía Tris-HCl 50 mM, pH 7,6, NP-40 al 0,01 %, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, SDS al 0,1 %, fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) 1 mM e inhibidores de proteasas Complete (Roche). El tejido se disoció con una jeringa y una aguja de calibre 19 y la solución se centrifugó a 800 x g durante 10 min para extraer las proteínas extracelulares solubles. Las proteínas solubles en Tritón e intracelulares se obtuvieron mediante la homogeneización del sedimento celular intacto en cuatro volúmenes de Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, Tritón X-100 al 1 % y centrifugación durante 90 min a 16000 x g. La concentración de proteína total se determinó mediante ensayo BCA (Pierce). Todas las etapas de extracción se llevaron a cabo a 4 °C y las alícuotas de las muestras se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

Transferencia Western. Se separaron 40 |jg de cada proteína enriquecida extracelularmente y soluble en Tritón en geles de Tris-Tricine al 10-20 % (Bio-Rad) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se sometieron a microondas a una configuración alta durante 30 s y se tiñeron brevemente en Ponceau-S para verificar la transferencia y la carga igual. Las membranas se bloquearon después en PBS que contenía reactivo de bloqueo Odyssey (Li-cor) y se incubaron durante la noche en una dilución 1:2000 de anticuerpo 6E10 y 4G8 (Covance). Para el control de carga, se usó anticuerpo anti-GAPDH de conejo (1:2000, Millipore). Después, las membranas se transfirieron con anticuerpos secundarios fluorescentes anti-IgGIR680 de ratón y anti-IgG-IR800 de conejo (Li-cor) y se obtuvieron imágenes en un escáner Li-cor Odyssey con configuraciones de detección de intensidad 4,0 para el canal 700 y 0,5 de intensidad para el canal 800. Las señales de las bandas detectadas se cuantificaron con el software Image Studio (Li-cor).

ELISA. Para la detección de Ap mediante ELISA, cuantificamos los niveles de Ap1-42 en la fracción soluble en Tritón, mediante el uso de kits de ELISA de Millipore (EZH542).

Pruebas de comportamiento. El laberinto en Y estaba hecho de plexiglás transparente y tenía tres brazos idénticos (40 x 9 x 16 cm) separados 120°. La plataforma central era un triángulo con una longitud de lado de 9 cm. La habitación se iluminó con 70 lux. Los ratones se habituaron a la sala de pruebas y el aparato 24 h antes de la prueba al estar en el laberinto durante 5 min. El día de la prueba, los ratones se colocaron en uno de los brazos y se les permitió explorar el laberinto durante 8 min. La entrada al brazo se definió como tener las cuatro extremidades dentro de uno de los brazos. Los ratones se grabaron en video y los videos se analizaron a ciegas. El laberinto se limpió con etanol al 70 % entre los animales. La secuencia de entradas de brazos se usó para obtener una medida de alternancia, que refleja la memoria de trabajo espacial. El porcentaje de alternancia se calculó mediante el número de secuencias de alternancia completas (ABC, BCA,<c>A<b>) dividido por el número de oportunidades de alternancia (entradas totales al brazo menos dos).

Estadísticas. Las estadísticas se realizaron con el software Prism 6 (GraphPad Software, Estados Unidos). Los valores siempre se informan como media ± error estándar. Se usó ANOVA unidireccional con la prueba post-hoc de Dunnett para tres grupos, y se usó la prueba t no pareada para comparar dos grupos. Cuando hubo diferencias significativas en la varianza entre los grupos, aplicamos la corrección de Welch.

Prueba de comportamiento - Prueba de evitación activa del lugar (APA). La tarea de APA es una prueba de aprendizaje espacial dependiente del hipocampo. Los ratones (ratones APP23 y controles de 9 compañeros de camada no transgénicos) se probaron durante cinco días en una arena elevada giratoria (grupo Bio-Signal) que tenía un piso de rejilla y una cerca circular de plástico transparente de 32 cm de alto que encerraba un diámetro total de rejilla de 77 cm. Las señales visuales de alto contraste estaban presentes en las paredes de la sala de pruebas. La arena y el piso se giraron a una velocidad de 0,75 rpm y se suministró una descarga leve de 500 ms, 60 Hz, 0,5 mA a través del piso de rejilla cuando el animal entró en una zona de descarga de 60 grados, y cada 1500 ms hasta que el animal salió de la zona de descarga. La zona de choque se mantuvo en una posición constante en relación con la habitación. Las pistas registradas se analizaron con el software de análisis de pistas (grupo Bio-Signal). Se realizó una sesión de habituación 24 horas antes de la primera sesión de entrenamiento en la que los animales se colocaron en la arena giratoria durante 5 minutos para explorar, pero los ratones no recibieron ninguna descarga durante este período. Después de esta prueba inicial, los ratones APP23 se dividieron en dos grupos con ratones emparejados de manera que el rendimiento de los dos grupos de ratones el día cuatro de la tarea fuera el mismo. Se realizaron cuatro sesiones de entrenamiento en días consecutivos, una por día con una duración de 10 min. Después de un período de tratamiento de 7 semanas en el que los ratones recibieron tratamiento con SUS o simulado (en el que los ratones simulados recibieron todas las inyecciones pero no se aplicó ultrasonido), se volvieron a probar en la tarea (aprendizaje de inversión). Para volver a probar la zona de choque, se cambió al lado opuesto de la arena y se cambiaron las señales visuales, pero los ratones se probaron en la misma habitación. El número de choques suministrados a los ratones APP23 tratados con SUS, los ratones APP23 tratados simulados y los ratones de tipo silvestre tratados simulados se compararon durante los días de prueba. Como medida adicional, dividimos el intervalo de 10 min en dos intervalos de 5 min, el primero una medida de memoria a largo plazo y el segundo de memoria de trabajo/corto plazo. Los datos se analizaron con un ANOVA bidireccional con el día de la prueba como un factor dentro de los sujetos y efectos simples del grupo probados con la prueba post-hoc de Fisher lSd .

Prueba de reconocimiento de objetos novedosos (NOR). Los ratones también se probaron en la prueba de NOR. Se usó una arena en forma de Y hecha de Perspex blanco (30 cm de altura x 16 cm de longitud x 8 cm de ancho). Los ratones se colocaron en un brazo inicial y los otros brazos contenían los objetos. Una cámara registró los ratones y se usó Ethovision XT para analizar el tiempo que el ratón pasó investigando menos de 2 cm del objeto con su nariz apuntando en la dirección del objeto. Entre cada ensayo, el laberinto se limpió a fondo con toallas de papel y 70 % de etanol. Durante dos días antes de la sesión de prueba, los ratones se sometieron a la habituación al laberinto en forma de Y durante 8 minutos cada uno sin ningún objeto en los brazos. El tercer día una fase de muestra fue seguida de una fase de elección. En la fase de muestra, se colocaron dos copias idénticas de un objeto al final de dos brazos. Los ratones exploraron los objetos durante 8 min. Después de un retraso de 30 min en el que el animal se volvió a colocar en su jaula de origen, se llevó a cabo una fase de elección en la que los objetos se reemplazaron por una tercera copia idéntica de uno de los objetos y un objeto novedoso al que los ratones no se habían expuesto. La fase de elección tuvo una duración de 4 min. No se contaron los momentos en que un animal trepó a un objeto. Qué objetos fueron objetos de muestra y objetos novedosos y en qué brazo se colocó el objeto novedoso se equilibraron dentro y entre grupos. Calculamos la preferencia por el objeto novedoso como el tiempo total gastado explorando el objeto novedoso restado del tiempo gastado explorando el objeto familiar. Las diferencias entre grupos se evaluaron mediante la prueba t de Student. También calculamos una relación de discriminación, al dividir esta medida por el tiempo total gastado explorando ambos objetos.

Captación microglial. Las células de microglía BV-2 (amablemente proporcionadas por el Dr. Trent Woodruff, Universidad de Queensland) se mantuvieron en DMEM que contenía suero fetal bovino al 1 %, aminoácidos no esenciales y antibióticos. Las células se pasaron cuando estaban al 80 % de confluencia y se usó un número de paso de 10-15 para los experimentos. Para los estudios de fagocitosis, las células se sembraron a una densidad de 30000 células por cámara en ocho portaobjetos de cámara de cultivo de tejido (Sarstedt). Ap42 biotinilado en el extremo N-terminal (JPET) se disolvió en DMSO y después se diluyó a una concentración de 1 mg/ml en PBS y se agregó a 37 °C durante 7 días para obtener Ap fibrilar (fAp42). Las células cultivadas en los pocillos de la cámara se trataron con 10 mg/ml de albúmina sérica humana (Sigma) en medio normal durante 24 h o solo con medio celular normal (control). Como control negativo para la fagocitosis, el inhibidor de la polimerización de actina citocalasina D se añadió a una concentración de 5 pM 1 h antes de la adición de fAp42. Las células se trataron después con 2,5 pg/ml de fAp42 durante 60 min y después se lavaron dos veces con medio normal y después se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 20 min. Las células se permeabilizaron mediante la adición de Tritón X-100 al 0,1 % y se bloquearon con albúmina sérica bovina al 1 % durante 1 h, antes de incubarse con el anticuerpo anti-LAMP2 (proteína de membrana asociada a lisosomas 2) (1:500, Sigma) durante la noche a 4 °C. Después de lavar con PBS, las células se incubaron con estreptavidina conjugada con Alexafluor 594 para marcar Ap biotinilado (1:1000, Invitrogen) durante 1 h a temperatura ambiente y después se tiñeron con DAPI y se cubrieron con medio de montaje fluorescente (Vectashield). Bajo microscopía confocal, se eligieron aleatoriamente tres o cuatro áreas que contenían más de 100 células en total en base a la tinción de DAPI. Los números de microglía que contienen fAp42 fagocitados se determinaron al contar el número de células que contenían fAp42 marcado con Alexafluor 594 dentro de las áreas positivas de LAMP2 y se expresaron como un porcentaje del número total de células contadas. Los datos son representativos de dos experimentos y se expresan como media ± error estándar de la media (SEM).

Análisis del esqueleto de microglía. Se aplicó un análisis esquelético para cuantificar la morfología microglial en imágenes obtenidas de cerebros fijados como se describe (5). En resumen, las secciones de 40 pm se tiñeron con Iba1 mediante el uso del método de níquel/DAB. Dos imágenes del córtex auditivo que cubre el hipocampo dorsal (un área rica en placas) se convirtieron cada una en imágenes binarias y después se esquelificaron mediante el uso del complemento Analyze Skeleton de ImageJ. Se determinó el número de puntos finales del proceso microglial sumados y la longitud del proceso sumada normalizada al número de microglia.

Los ejemplos en la presente descripción demuestran que el escaneo repetido (SUSing) de todo el cerebro es suficiente para mejorar notablemente la patología de los ratones que depositan Ap, histológicamente, bioquímicamente y conductualmente.

En conclusión, este estudio destaca el potencial del SUSing como un enfoque terapéutico viable para la AD y otras enfermedades con agregación de proteínas, como la demencia frontotemporal y la enfermedad de la neurona motora.

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   i.Aparato para mejorar la función cognitiva en un individuo con función cognitiva deteriorada, el aparato comprende un emisor de energía acústica en forma de un dispositivo emisor de ultrasonido que consiste de un transductor de ultrasonido de matriz en fase con una frecuencia de salida de entre 0,1 a 2 MHz, un acoplador de fluido para transmitir la salida ultrasónica, un agente de microburbujas, y un sistema de posicionamiento motorizado configurado para mover el foco del transductor de ultrasonido en un patrón con espacio entre los sitios de aplicación discretos en una región del cerebro, el transductor de ultrasonido configurado para aplicar energía acústica, en forma de energía de ultrasonido enfocada, a la pluralidad de sitios de aplicación discretos, de esta manera se satura o se satura sustancialmente la región del cerebro con energía ultrasónica enfocada, en donde la región del cerebro comprende un cerebro completo, o un hemisferio de este,

   en donde el transductor de ultrasonido se adapta para aplicar la energía de ultrasonido enfocada para lograr, en uso, un aumento en la permeabilidad de la barrera hematoencefálica del cerebro, y en donde el aparato se adapta para administrar el agente de microburbujas que, en uso, promueve un aumento en la permeabilidad de la barrera hematoencefálica, para mejorar de esta manera la función cognitiva en el individuo sin requerir un agente terapéutico.
2. 2. Aparato de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el dispositivo emisor de ultrasonido se configura para, en uso, aplicar energía de ultrasonido enfocada a la región del cerebro al proporcionar energía de ultrasonido enfocada continuamente, o en los sitios de aplicación, a lo largo de una trayectoria de barrido definida por un patrón predeterminado, opcionalmente o preferentemente la trayectoria de barrido se selecciona del grupo que consiste en lineal, serpentina, un patrón de trama, espiral y aleatorio, y opcionalmente en donde cada sitio de aplicación se separa a lo largo de la trayectoria de barrido.
3. 3. Aparato de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el dispositivo emisor de ultrasonido se configura de manera que se proporciona un período de retardo mínimo entre el dispositivo emisor de ultrasonido que aplica energía de ultrasonido enfocada a los sitios de aplicación con volúmenes de tratamiento adyacentes o superpuestos, y opcionalmente en donde el dispositivo emisor de ultrasonido se configura de manera que un orden o aplicación de energía de ultrasonido enfocada a la pluralidad de sitios de aplicación es tal que no se aplica secuencialmente energía de ultrasonido enfocada a los sitios de aplicación con volúmenes de tratamiento adyacentes o superpuestos.
4. 4. Aparato de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el dispositivo emisor de ultrasonido se configura de manera que, durante el uso, la energía de ultrasonido enfocada se aplica transcranealmente a una presión superior a 0,4 MPa.
5. 5. Aparato de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el dispositivo emisor de ultrasonido se configura para aplicar energía de ultrasonido enfocada con un ciclo de trabajo de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 1 % a aproximadamente 20 %, aproximadamente 1 % a aproximadamente 10 %, o aproximadamente 1 % a aproximadamente 5 %.
6. 6. Aparato de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el dispositivo emisor de ultrasonido se configura para aplicar energía de ultrasonido enfocada con una duración del pulso de entre aproximadamente 1 a aproximadamente 100 milisegundos, preferentemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 milisegundos, y/o con frecuencias de repetición en modo ráfaga de entre aproximadamente 10 Hz a 100 kHz, 10 Hz a 1 kHz, 10 Hz a 500 Hz o 10 Hz a 100 Hz.
7. 7. Aparato de acuerdo con la reivindicación 1 o 6, en donde el dispositivo emisor de ultrasonido se configura para aplicar energía de ultrasonido enfocada con un tamaño de punto focal de aproximadamente 1 mm a 2 cm, preferentemente 1 mm a 1,5 cm, preferentemente 1 mm a 1 cm, o preferentemente 1 mm a 0,5 cm de ancho axial, y/o con una longitud de un punto focal de aproximadamente 1 cm a aproximadamente 15 cm, preferentemente 1 cm a 10 cm, preferentemente 1 cm a 5 cm.
8. 8. Aparato de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el aparato se configura para, en uso, administrar el agente de microburbujas secuencialmente a, o después del inicio de, o simultáneamente con, la aplicación de la energía de ultrasonido enfocada por el dispositivo emisor de ultrasonido.