ES3035340T3 - Methods and constructs for locating and profiling single cells in a biological sample - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere, en general, a la preparación de muestras biológicas para la secuenciación de nueva generación. En particular, utiliza una combinación de códigos de barras de secuencia y características visibles de las microesferas, como combinaciones de marcadores fluorescentes, para la identificación de productos de ARNm procedentes de una sola célula y su localización en la muestra. Para lograr este efecto, la presente invención proporciona una nueva construcción que comprende una microesfera acoplada a dicha característica visible, donde dicha microesfera está acoplada a un primer oligonucleótido mediante un enlazador escindible, preferiblemente fotoescindible. Dicho primer oligonucleótido comprende a) una secuencia de control de amplificación, b) una secuencia de código de barras específica para dicha característica de la microesfera y c) una secuencia de anclaje o captura, preferiblemente una secuencia poli-A, para hibridar con una secuencia complementaria. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y construcciones para localizar y perfilar células individuales en una muestra biológica

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a la preparación de muestras biológicas para la secuenciación de próxima generación. Particularmente, la invención utiliza una combinación aleatoria de microperlas con etiquetas microscópicamente detectables o visibles de otro modo acopladas al código de barras de secuencia para el etiquetado espacial y la identificación de productos de ARNm o ADN que se originan a partir de una única posición y para localizar dicha única posición en el portaobjetos de muestra.

Antecedentes de la invención

En el entorno celular complejo, las células de un tejido a menudo muestran múltiples fenotipos, lo que se refleja en los perfiles de expresión de ARN de las células. En la técnica anterior, el perfilado de la expresión de ARN se ha aplicado a células individuales en suspensiones, utilizando normalmente micropocillos o gotas de emulsión donde las células individuales se encapsulan junto con microperlas recubiertas con una secuencia de código de barras celular único y poli-T que captura el ARNm poli-A de la célula en lisis, etiquetando el extremo 3' del ARNm con la secuencia de código de barras celular en reacción de transcripción inversa y síntesis de ADNc (véase, p. ej., Macosko et al 2015 y WO2016040476 del Broad Institute Inc.). Después de secuenciar, los transcritos de ARNm derivados de la misma célula original pueden agruparse en base al código de barras celular, y pueden generarse perfiles de expresión génica separados de todas las células. Las perlas de código de barras celular actuales, sin embargo, se dirigen solo a células en suspensión.

Para comprender la estructura del tejido, funciones celulares e interacciones célula a célula dentro de los tejidos, existe la necesidad de enlazar los datos de expresión de ARN con la imagen celular y la información espacial obtenida del examen de células o secciones de tejido con resolución de células individuales y manera de alto rendimiento. El documento WO2021046232 describe un sistema basado en códigos de barras legibles ópticamente para la caracterización de interacciones moleculares de células individuales. El sistema depende del uso de sondas de oligonucleótidos con múltiples etiquetas fluorescentes. Todavía se necesitan métodos mejorados.

Compendio de la invención

La presente invención, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas, se basa en un nuevo diseño de microperlas con etiquetas visibles acopladas con códigos de barras específicos de etiquetas que permiten enlazar los datos de secuenciación de ARNm o ADN obtenidos a coordenadas espaciales de las células en una muestra biológica perfilada para la expresión de ARN.

Un objeto de la invención es proporcionar una construcción para detectar dianas de ácido nucleico, comprendiendo dicha construcción una perla, preferiblemente una perla magnética, en donde dicha perla comprende una o varias características visualmente detectables y/o dicha perla está acoplada a una o varias entidades visualmente detectables, y en donde dicha perla comprende un oligonucleótido, y dicho oligonucleótido comprende a) una secuencia handle de amplificación, b) una secuencia de código de barras específica para una o varias de dichas características y/o entidades visualmente detectables y c) una secuencia de captura o anclaje 3' terminal, y en donde dicho oligonucleótido está dispuesto para poder desprenderse de dicha perla. Preferiblemente, dicha secuencia de captura o anclaje terminal comprende una secuencia poli-A para hibridar con una secuencia poli-T complementaria en perlas de código de barras celular disponibles comercialmente.

Alternativamente, también la secuencia de código de barras celular puede colocarse en la misma construcción con etiquetas visibles.

Otro objeto de la invención es proporcionar una composición que comprenda varias construcciones como se ha definido anteriormente preferiblemente con una mezcla de distintas características o entidades visualmente detectables.

Otro objeto de la invención es proporcionar una placa o chip de pocillos que comprenda la composición según la presente invención cargada en los pocillos de dicha placa o chip.

Otro objeto de la invención es proporcionar un kit que comprenda la placa o chip de pocillos como se ha definido anteriormente y una entidad legible por ordenador que comprenda un archivo de una fotografía o escaneo de dicha placa o chip con la composición de la presente invención cargada en los pocillos de dicha placa o chip.

Otro objeto de la invención es proporcionar un uso de dicha construcción o composición para identificar dianas de ácido nucleico o productos de secuenciación de ARNm deseados que se originan a partir de una célula individual o posición en una muestra biológica.

Otro objeto de la invención es proporcionar un método para perfilar muestras biológicas a nivel de una célula individual, comprendiendo el método las etapas de:

- cargar la construcción o la composición de la presente invención con una muestra biológica conjuntamente o secuencialmente en cualquier orden a un sustrato que comprende pocillos,

- fotografiar o escanear los pocillos en dicho sustrato con un microscopio, preferiblemente un microscopio óptico o un microscopio de fluorescencia, antes y/o después de cargar la muestra biológica en dicho sustrato; y

- determinar opcionalmente la ubicación o coordenada de un pocillo específico que tiene una característica y/o entidad visualmente detectable distinta o combinación de las mismas en el sustrato cargado.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1.A. Métodos actuales para ARNseq de una célula individual usando carga aleatoria de perlas Cell barcoding (CellBC) en pocillos o gotas. El código de barras celular específico de perla único y las secuencias poliT en oligos de perla capturan y etiquetan los ARN poliA de la célula en lisis. Sin embargo, no es posible una coordinación espacial entre imagen y datos. B. El nuevo método con microperlas Colour barcoding (ColourBC) junto con perlas CellBC proporciona coordenadas espaciales para los datos e imágenes. Se cargan aleatoriamente múltiples perlas ColourBC de diferentes colores en pocillos o gotas, cada una con oligos de etiquetado de color con cola de poliA escindibles que se unirán a la perla CellBC junto con ARN de la célula, y enlazan los datos a ubicaciones espaciales. C. Forma alternativa de código de barras espacial con perlas ColourBC sin perlas CellBC. Tanto los oligos CellBC como ColourBC están en las mismas perlas ColourBC, los oligos ColourBC con, p. ej., un enlazador fotoescindible. Después de cargar en múltiples perlas por pocillo con células, los oligos ColourBC se liberan de las perlas y se capturan por las secuencias complementarias de los oligos CellBC en todas las perlas en el pocillo. La red de combinación de ColourBC y CellBC es única para cada pocillo y las moléculas de ARN etiquetadas también por las secuencias CellBC pueden enlazarse a la ubicación espacial basándose en la imagen de escaneo del microscopio.

Figura 2.El ejemplo de 16 microperlas ColourBC diferentes creadas a partir de cuatro oligos etiquetados fluorescentemente, azul (B), verde (G), amarillo (Y), rojo (R) y 0, 1, 2, 3 y 4 combinaciones de colores de las mismas dan lugar a 16 tipos diferentes de microperlas. Cuando la mezcla de estos 16 tipos de perlas se carga aleatoriamente en los pocillos del chip, ajustando múltiples perlas por pocillo, pueden formar en 1 de 65535 combinaciones diferentes por cada pocillo según el cálculo de permutación, haciendo los pocillos altamente únicos. Colores adicionales (fluorescentes y no fluorescentes), diferentes tamaños y formas de perlas y las etiquetas de color unidos también a las perlas CellBC, aumentarán adicionalmente el número de combinaciones posibles. El número de combinaciones posibles se calculó con la herramienta en https://stattrek.com/onlinecalculator/combinations-permutaciones.aspx.

Figura 3.Las perlas de código de barras CellBC disponibles comercialmente tienen millones de copias de una secuencia CellBC única en su oligo de superficie, creada normalmente con síntesis dividida y agrupada, p. ej., en el método DropSeq, un tramo de código de barras aleatorio de 12 nucleótidos da lugar a casi 17 millones de códigos de barras diferentes y, por lo tanto, 17 millones de microperlas diferentes (Macosko et al, Cell 21 de mayo de 2015; 161(5): 1202-1214). El tramo de poliT en los oligos capturará e hibridará ARN con cola de poliA de las células de la sección de tejido. Las perlas CellBC parecen idénticas bajo el microscopio. En la invención, se cargará un número aleatorio de microperlas ColourBC de una mezcla de 16 tipos diferentes junto con perlas CellBC en los micropocillos y su oligo con cola de poliA fotoescindible sintético también obtendrá la misma secuencia CellBC que los ARN de la célula en el mismo micropocillo.

Figura 4.Forma alternativa de usar las coordenadas ColourBC sin perlas CellBC separadas. Las perlas coloreadas o caracterizadas de otro modo soportan cada dos tipos de oligos con el ColourBC correspondiente, y al menos uno de los oligos soporta también un CellBC único para cada perla así como un código de barras molecular único opcional (UMB). Una forma de usar el principio se muestra en esta figura: un conjunto aleatorio de 3 tipos de perlas (de, p. ej., 16) está en un micropocillo, y sus oligos con extremo poliA sintéticos, (foto)escindibles, con ColourBC se liberan mediante luz UV o químicamente, los contenidos de los micropocillos se mezclan con imán y los oligos liberados hibridarán a los oligos de poli-T de las 3 perlas en el pocillo, enlazando sus CellBC únicos al conjunto de todos los ColourBC presentes en el micropocillo. El ARN celular también obtendrá los CellBC de las 3 perlas, y los datos de secuencia de estos 3 CellBC mapeados se agruparán entre sí. Además de los oligos presentados, se pueden formar redes similares de ColourBC y CellBC con otros sitios de estructuras de biblioteca: usando cebador aleatorio (en lugar de poli-A sintético) enlazado a ColourBC y PCRhandle2, y una vez liberado, usando esa síntesis de la 2a cadena de la perla unida al ADNc de la primera cadena. Otra forma más de usar el principio es colocar los elementos CellBC y ColourBC en las posiciones de lectura del índice de Illumina en cebadores de indexación, y realizar la PCR de tagmentación e indexación dentro de los micropocillos sellados, con dichos cebadores liberados de la mezcla aleatoria de las perlas Colour barcode en cada micropocillo.

Figura 5.Los micropocillos con microperlas ColourBC se escanean con un microscopio de fluorescencia, se guardan imágenes digitales ensambladas y las combinaciones de microperlas en cada micropocillo se registran mediante programas de análisis de imágenes. Después de cargar las perlas CellBC, el ARN poliA de las células lisadas o secciones de tejido se hibrida con los oligos de código de barras CellBC, junto con los oligos ColourBC con cola de poliA sintéticos liberados por UV de las microperlas ColourBC. Después de la transcripción inversa, amplificación de ADNc y preparación y secuenciación de bibliotecas, las secuencias CellBC se determinan a partir de las lecturas. Después de la alineación de lectura contra el genoma diana, los recuentos de las lecturas génicas junto con los recuentos de lectura de las secuencias ColourBC se ordenan en una matriz para cada CellBC. La coordenada de los micropocillos posicionales se interpreta para cada CellBC enlazando la información de lectura de ColourBC a la imagen del microscopio analizada de cada micropocillo.

Figura 6.Forma alternativa de usar las perlas ColourBC junto con perlas CellBC que también están coloreadas. En este método, las perlas CellBC presentan características de tamaño y/o color adicionales distinguibles de las perlas ColourBC y soportan la información de secuencia de coincidencia de características incorporada en el oligo CellBC. Como las perlas CellBC tienen, por lo tanto, múltiples características, este método produce un mayor número de combinaciones posibles de perlas que el método de la Figura 1 y tiene un proceso de síntesis de código de barras de perlas más simple que el método de la Figura 4. Como en el método de la Figura 3, esto requiere que al menos una perla CellBC y una perla ColourBC entren en un pocillo. Se recomienda tener perlas CellBC de mayor tamaño que las perlas ColourBC, para maximizar su área superficial y, por lo tanto, proporcionar una mayor capacidad de unión a ARNm. En este ejemplo, un conjunto de 2 perlas CellBC con colores Coll y Col2 (de, por ejemplo, 12 características) están en un pocillo con 3 perlas ColourBC con combinaciones de colores B, BG y GYR (de, p. ej., 16). Como en la Figura 3, los oligos con extremo poliA sintéticos, (foto)escindibles, con ColourBC se liberan con luz UV o químicamente y los oligos liberados hibridarán a los oligos poli-T de ambas perlas CellBC. El ARN poliA celular unido también obtendrá códigos de barras únicos de estas mismas 2 perlas CellBC, y los datos de secuencia de estas pueden fusionarse. En caso de que el chip contenga pocillos con la perla CellBC Coll con las mismas 3 perlas ColourBC y pocillos con CellBC Col2 también con las mismas 3 perlas ColourBC, el mapeo de los datos de estos pocillos es un desafío espacialmente incluso si las secuencias CellBC específicas de la perla son distintas. En tal caso, las similitudes de perfil de transcriptoma entre los códigos de barras celulares pueden utilizarse en predicción espacial. Además, las perlas ColourBC pueden tener múltiples etiquetas de secuencia alternativas para el mismo color o característica visible, para aumentar el número de combinaciones distintas en el nivel de secuencia, p. ej., perlas azules visualmente idénticas que tienen secuencias B1 (GCACTA), B2 (TCTAGG), B3 (CATTGT), todas etiquetando independientemente las perlas azules.

Figura 7.Forma alternativa de usar las perlas ColourBC en pocillos que tienen los oligos CellBC inmovilizados en el fondo del pocillo y/o la superficie de la pared, en lugar de la superficie de la perla. Los conjuntos aleatorios de secuencias CellBC1-CellBC(n), únicas para cada pocillo y al menos una por pocillo, se pueden crear de varias maneras, p. ej., mediante amplificación en puente. En primer lugar, un oligo PCRhandle1 (SEQ ID NO: 31) junto con un oligo de poliA escindible separado (SEQ ID NO: 32) se inmovilizan densamente en todos los pocillos y se usan luego como cebadores en la PCR de amplificación en puente para un oligo plantilla que contiene una secuencia complementaria inversa de PCRhandle1, una secuencia CellBC aleatoria, p. ej., N(12) o NNNNNNNNNNNN y una secuencia poliA (SEQ ID NO: 33). La adición del oligo plantilla a la reacción de PCR de amplificación en puente en concentración muy diluida permite la clusterización local de solo una o unas pocas secuencias CellBC diferentes por pocillo, creando por lo tanto un conjunto único de códigos de barras celulares amplificadas por pocillo. Después de la PCR, el oligo poliT se escinde y se retira, dejando sólo oligos de captura de ARNm que contienen CellBC monocatenario en la superficie del pocillo. Después de esto, la matriz de pocillos puede cargarse y pueden formarse imágenes con las células y conjuntos aleatorios de perlas ColourBC con un oligo que comprende PCRhandle2, un código de barras de etiquetado de características y un poliA. Este oligo escindible de las perlas ColourBC se unirá a los oligos de CellBC inmovilizados junto con el ARNm de las células lisadas, proporcionando información espacial para cada célula y pocillo, como en las Figuras previas.

Descripción detallada de realizaciones

Las construcciones, composiciones y métodos descritos en detalle a continuación proporcionan medios para generar datos de ubicación para una célula individual de una muestra biológica, tal como una sección de tejido, entre datos de transcriptoma de una célula individual, en la escala de decenas de miles de células por experimento. La eficacia de cualquier número de técnicas y aplicaciones de diagnóstico para ensayar diversos cuadros clínicos puede mejorarse mediante el uso de las composiciones descritas en esta memoria. Los métodos y composiciones descritos en esta memoria amplían enormemente el poder de fenotipado de células individuales combinando información de ubicación y transcritos de las mismas células individuales a una escala sin precedentes.

Como se emplea en esta memoria, el término "construcción" se refiere a un conjunto sintetizado químicamente y opcionalmente modificado por ingeniería genética que comprende una perla unida (preferiblemente de forma covalente) a al menos una secuencia de oligonucleótidos por un enlazador. Cada secuencia de oligonucleótidos comprende preferiblemente varios elementos funcionales: una secuencia handle de amplificación; una secuencia de código de barras, una secuencia de código de barras molecular único opcional (UMB) que está posicionada adyacente al código de barras en su extremo 5' o 3', y una secuencia de anclaje para hibridar con una secuencia de captura que comprende una secuencia complementaria al anclaje.

El término "perla" se refiere en esta memoria a un soporte sólido que puede abarcar cualquier tipo de esfera, bola, cojinete, cilindro u otra configuración similar sólida, porosa o hueca compuesta por plástico, cerámica, metal o material polimérico (por ejemplo, hidrogel) sobre el que puede inmovilizarse un ácido nucleico (p. ej., covalentemente o no covalentemente). La perla puede comprender una partícula discreta que puede ser esférica (p. ej., microesferas) o tener una forma no esférica o irregular, tal como cúbica, cuboide, piramidal, cilíndrica, cónica, oblonga o en forma de disco, y similares.

El término "secuencia handle de amplificación" se refiere generalmente a un componente funcional de la secuencia de oligonucleótidos en la construcción de la presente divulgación que proporciona un sitio de hibridación para la amplificación de la secuencia de oligonucleótidos. En algunas realizaciones, cuando está presente en la primera o en secuencias de oligonucleótidos adicionales, la secuencia handle de amplificación puede ser la mismo o diferente, dependiendo de las técnicas que se pretenden usar para la amplificación.

El término "código de barras" (BC) describe generalmente una secuencia de oligonucleótidos definida, que cuando es un elemento funcional de la construcción de la presente divulgación, puede usarse para identificar una célula o pocillo particular en un sustrato.

El término "código de barras molecular único" (UMB) se refiere generalmente a un nucleótido aleatorio, que cuando es un elemento funcional de la construcción de la presente divulgación, es específico para esa construcción. El UMB permite la identificación de duplicados de amplificación de la secuencia de oligonucleótidos de construcción con la que está asociado.

El "enlazador" se refiere a cualquier fracción usada para unir o asociar la perla a la porción de secuencia de oligonucleótidos de las construcciones. Por tanto, en una realización, el enlazador es un enlace covalente. En otra realización, el enlazador es un enlace no covalente. Los enlazadores usados en las construcciones de las composiciones y métodos son escindibles en una realización. Los enlazadores usados en las construcciones de las composiciones y métodos son no escindibles en una realización. Sin limitación, en una realización, el enlazador es un enlazador escindible, p. ej., un enlace disulfuro o un enlace fotoescindible. En un ejemplo, las partes de la construcción se enlazan entre sí a través de un enlace estreptavidina-biotina. En otro ejemplo, el enlazador comprende un complejo de biotina unido a la secuencia de oligonucleótidos de la construcción mediante un enlace disulfuro, con estreptavidina fusionada y recubierta con la perla. En otra realización, la biotina se recubre con la perla y la estreptavidina se fusiona con la secuencia de oligonucleótidos de la construcción. En otra realización, la superficie de la perla está carboxilada y la secuencia de oligonucleótidos está aminada y enlazada a la perla con reacción de EDC. El grupo amino fotoescindible puede usarse para permitir la fotoescindibilidad con luz UV.

Por el término "sustrato" se entiende preferiblemente un portaobjetos, una placa o un chip de múltiples pocillos. Los sustratos son convencionales y pueden ser vidrio, polímero o de cualquier material convencional adecuado para los protocolos de ensayo o diagnóstico particulares. Los sustratos pueden comprender una matriz de micropocillos para posicionar células a partir de una muestra biológica. El sustrato también puede ser una membrana con estructura de pocillo y con poros microscópicos en las partes inferiores de pocillo, para permitir lavado y carga de perlas más fáciles.

Los términos "visible" y "visualmente detectable" se usan en esta memoria para referirse a una característica de las presentes construcciones o una entidad acoplada a dicha construcción que son observables mediante inspección visual, con o sin iluminación previa, o activación química o enzimática. En una realización de la invención, tales características visualmente detectables pueden referirse al color, tamaño o forma de la construcción. Alternativamente, tales características visualmente detectables pueden absorber y emitir luz en una región del espectro que varía de aproximadamente 400 a aproximadamente 800 nm. Para los fines de la invención, la detección de la presente construcción por sus propiedades visibles significa que la construcción se observa preferiblemente, con o sin iluminación o activación química o enzimática, con la ayuda de un dispositivo de detección de base óptica, incluyendo, sin limitación, espectrofotómetros de absorción, microscopios de luz de transmisión, microscopios de fluorescencia, cámaras digitales y escáneres.

Como se emplea en esta memoria, una "muestra biológica", como se usa en los métodos descritos en esta memoria, se refiere a una muestra de origen natural o muestra preparada deliberadamente o biblioteca que contiene una o más células. En una realización, una muestra contiene una población de células o fragmentos celulares, incluyendo, sin limitación, componentes de la membrana celular, exosomas y componentes sub celulares. Las células pueden ser una población homogénea de células, tales como células aisladas de un tipo particular, o una mezcla de diferentes tipos de células, tal como de un fluido biológico o tejido de un sujeto humano o mamífero u otra especie. Otras muestras más para su uso en los métodos y con las composiciones incluyen, sin limitación, muestras de sangre, incluyendo suero, plasma, sangre completa y sangre periférica, saliva y orina. En una realización, la muestra es una "sección de tejido" que se refiere a un trozo de tejido que se ha obtenido de un sujeto, fijado, seccionado y montado en una superficie plana, p. ej., un portaobjetos de microscopio. Las secciones de tejido también pueden clasificarse como "muestras celulares planas" que se refieren a un material sustancialmente plano, es decir, bidimensional, que contiene células. Una muestra celular plana puede hacerse, p. ej., cortando una biopsia de tejido tridimensional que contiene células en secciones y montando las secciones sobre una superficie plana. Las células pueden fijarse usando cualquier número de reactivos incluyendo formalina, etanol, metanol, DSP, paraformaldehído, metanol: ácido acético y otros reactivos de fijación similares o estabilizantes de tejido/ARN.

Las construcciones y métodos descritos en esta memoria pueden usarse para analizar células de un sujeto para determinar, por ejemplo, qué tipo de tipos de células existe en el tejido, en qué ubicaciones y proporciones existen, si la célula es normal o no, o para determinar si las células están respondiendo a un tratamiento. En una realización, el método puede emplearse para determinar el grado de displasia en células cancerosas. En estas realizaciones, las células pueden ser una muestra de un organismo multicelular. Una muestra biológica puede aislarse de un individuo, p. ej., de un tejido blando. En casos particulares, el método puede usarse para distinguir diferentes tipos de células cancerosas en muestras frescas congeladas, crioconservadas y fijadas en metanol o embebidas en parafina fijadas en formalina (FFPE). En realizaciones alternativas, el método descrito anteriormente puede ponerse en práctica en muestras celulares planas que se han fijado de otras maneras.

En una realización, la presente invención se refiere a una construcción para detectar dianas de ácido nucleico, comprendiendo dicha construcción una perla, preferiblemente una perla magnética, en donde dicha perla comprende una o varias características visualmente detectables y/o dicha perla está acoplada a una o varias entidades visualmente detectables, y en donde dicha perla comprende un oligonucleótido, y dicho oligonucleótido comprende a) una secuencia handle de amplificación, b) una secuencia de código de barras específica para una o varias de dichas características y/o entidades visualmente detectables y c) una secuencia de captura o anclaje 3' terminal, y en donde dicho oligonucleótido está dispuesto para poder desprenderse de dicha perla.

En una realización preferida, dicha característica visualmente detectable es el tamaño de la perla, el color de la perla, la forma de la perla o una combinación de los mismos.

En otra realización preferida, dicho oligonucleótido está enlazado a dicha perla a través de un enlace escindible.

En otra realización preferida, dicho enlace escindible es un enlace de estreptavidina-biotina o carboxilato-amina fotoescindible.

En otra realización preferida, dicha perla se acopla a dicha una o varias entidades visualmente detectables a través de un enlace estreptavidina-biotina o carboxilato-amina o a través de cualquier otro enlace.

En otra realización preferida, dicha una o varias entidades visualmente detectables comprenden una etiqueta fluorescente, preferiblemente, sin limitación, seleccionada del grupo que consiste en: colorantes de cianina, colorantes rojo de Texas y colorantes de amidita de fluoresceína.

En otra realización preferida, dicha perla se acopla adicionalmente a un antígeno o un anticuerpo.

En otra realización preferida, dicha secuencia handle de amplificación es complementaria a un cebador de PCR que comprende una secuencia adaptadora compatible con la secuenciación de próxima generación.

En otra realización preferida, dicha construcción comprende un segundo oligonucleótido acoplado a dicha perla, comprendiendo dicho segundo oligonucleótido a) una segunda secuencia handle de amplificación preferiblemente complementaria a un cebador de PCR que comprende una secuencia adaptadora compatible con la secuenciación de próxima generación, b) una secuencia de código de barras específica para una o varias de características y/o entidades visualmente detectables de la perla, c) una secuencia de código de barras específica para la perla, d) una secuencia de código de barras molecular único opcional, y e) una secuencia poli-T terminal.

En otra realización, la presente invención se refiere a una composición que comprende la construcción como se ha definido anteriormente.

En una realización preferida, dicha composición comprende una mezcla de varias construcciones que proporcionan una mezcla de distintas características o entidades visualmente detectables.

En una realización preferida, dicha mezcla de varias construcciones comprende al menos 2, 3, 4, 5 o 6, preferiblemente al menos 16, características y/o entidades visualmente detectables separadas.

En una realización preferida, dicha composición comprende una multiplicidad de dichas construcciones que tienen al menos 15 conjuntos variables de características visualmente detectables tales como etiquetas fluorescentes acopladas a dichas construcciones, en donde

en la primera construcción, dicha etiqueta fluorescente consiste en un primer colorante fluorescente;

en la segunda construcción, dicha etiqueta fluorescente consiste en un segundo colorante fluorescente; en la tercera construcción dicha etiqueta fluorescente consiste en un tercer colorante fluorescente;

en la cuarta construcción, dicha etiqueta fluorescente consiste en un cuarto colorante fluorescente;

en la quinta construcción, dicha etiqueta fluorescente consiste en una mezcla del primer y segundo colorantes fluorescentes;

en la sexta construcción, dicha etiqueta fluorescente consiste en una mezcla del primer y tercer colorantes fluorescentes;

en la séptima construcción, dicha etiqueta fluorescente consiste en una mezcla del primer y cuarto colorantes fluorescentes;

en la octava construcción, dicha etiqueta fluorescente consiste en una mezcla del segundo y tercer colorantes fluorescentes;

en la novena construcción, dicha etiqueta fluorescente consiste en una mezcla del segundo y cuarto colorantes fluorescentes;

en la décima construcción, dicha etiqueta fluorescente consiste en una mezcla del tercer y cuarto colorantes fluorescentes;

en la undécima construcción, dicha etiqueta fluorescente consiste en una mezcla del primer, segundo y tercer colorantes fluorescentes;

en la duodécima construcción, dicha etiqueta fluorescente consiste en una mezcla del primer, tercer y cuarto colorantes fluorescentes;

en la decimotercera construcción, dicha etiqueta fluorescente consiste en una mezcla del segundo, tercer y cuarto colorantes fluorescentes;

en la decimocuarta construcción, dicha etiqueta fluorescente consiste en una mezcla del primer, segundo y cuarto colorantes fluorescentes; y

en la decimoquinta construcción, dicha etiqueta fluorescente consiste en una mezcla del primer, segundo, tercer y cuarto colorantes fluorescentes.

En otra realización preferida, dicho primer colorante fluorescente es Cy5, el segundo colorante fluorescente es Cy3, el tercer colorante fluorescente es Atto425 y el cuarto colorante fluorescente es FAM.

En otra realización preferida, se usan diferentes tamaños, formas o colores visibles (no fluorescentes) en perlas, con o sin colorantes fluorescentes, para crear múltiples construcciones de perlas distintas.

En otra realización preferida, dicha composición comprende además una segunda construcción (es decir, una perla CellBC) que comprende una perla acoplada a un segundo oligonucleótido, comprendiendo dicho segundo oligonucleótido a) una segunda secuencia handle de amplificación, b) una secuencia de código de barras específica de la perla, c) una secuencia de código de barras molecular único opcional, y d) una segunda secuencia de anclaje, preferiblemente una secuencia poli-T, para hibridar con una secuencia complementaria. En otra realización preferida, dicho segundo oligonucleótido que comprende a) una segunda secuencia handle de amplificación, b) una secuencia de código de barras específica de la perla, c) una secuencia de código de barras molecular único opcional, y d) una segunda secuencia de anclaje, preferiblemente una secuencia poli-T, puede unirse o inmovilizarse directamente a una parte inferior y/o pared de un pocillo en un sustrato (véase, p. ej., la Figura 7).

En otra realización, la presente invención se refiere a un uso de la construcción o la composición como se ha definido anteriormente para identificar productos de secuenciación de ARNm que se originan a partir de una célula individual.

En otra realización, la presente invención se refiere a un método para perfilar muestras biológicas a nivel de una célula individual, comprendiendo el método la etapa de:

- cargar la construcción como se define en la presente divulgación o la composición como se define en la presente descripción con una muestra biológica junto o secuencialmente en cualquier orden a un sustrato que comprende pocillos,

- fotografiar o escanear los pocillos en dicho sustrato con un microscopio, preferiblemente un microscopio óptico o un microscopio de fluorescencia, antes y/o después de cargar la muestra biológica en dicho sustrato; y

- determinar opcionalmente la ubicación o coordenada de un pocillo específico que tiene una característica y/o entidad visualmente detectable distinta o combinación de las mismas en el sustrato cargado.

La determinación de la ubicación o coordenadas de los pocillos/muestras se logra examinando la fotografía o la imagen escaneada obtenida en el método ya que las propiedades visuales de las construcciones de la presente invención son visibles en la fotografía o la imagen escaneada y, por lo tanto, se puede determinar la ubicación de cada tipo de construcciones o mezclas de las mismas. En una realización preferida, los pocillos/muestras en un sustrato se fotografían o escanean solo una vez en el presente método, es decir, el presente método no requiere tomar fotos o escaneos consecutivas del sustrato con conjuntos cambiantes de etiquetas, tales como sondas oligonucleotídicas etiquetadas o perlas etiquetadas.

En una realización preferida, el método comprende las etapas de:

- cargar la construcción o la composición tal como se define en la presente invención con una muestra biológica conjuntamente o secuencialmente en cualquier orden en un sustrato que comprende micropocillos,

- fotografiar o escanear los micropocillos cargados en dicho sustrato con un microscopio, preferiblemente un microscopio óptico o un microscopio de fluorescencia,

- someter las muestras en los micropocillos a condiciones que favorezcan la lisis celular, la liberación de ácido nucleico y después opcionalmente a una reacción de transcriptasa inversa,

- amplificar los ácidos nucleicos liberados o los productos de reacción de transcriptasa inversa para facilitar la preparación de una biblioteca de secuenciación de los productos amplificados, en donde los productos de amplificación contienen secuencias de código de barras específicas de una o varias de las características y/o entidades visualmente detectables de las construcciones,

- preparar una biblioteca de secuenciación y secuenciar la biblioteca; y

- opcionalmente identificar la ubicación específica de los micropocillos a partir de la cual se originó cada producto secuenciado analizando los datos de secuenciación con información de código de barras específica de características y/o entidades visualmente detectables de las construcciones para enlazar una determinada característica y/o entidad o combinación visualmente detectable de la misma a un producto secuenciado, y determinar la ubicación de un micropocillo específico que tiene la característica y/o entidad o combinación visualmente detectable correspondiente de la misma en el sustrato cargado tal como se fotografió o escaneó en el método.

Por tanto, la invención puede usarse para crear una biblioteca de secuenciación de células individuales fusionando microperlas de captura de ARNm con código de barras único con una célula individual en un micropocillo; lisar la célula capturando de ese modo el ARNm en los oligonucleótidos de captura de ARNm en la microperla; realizar una reacción de transcripción inversa en dicho micropocillo para convertir el ARNm de las células en ADNc de primera cadena que contiene dichos códigos de barras únicos que registran la ubicación de cada ARNm en la placa de micropocillos y secuenciando posteriormente los ADNc producidos.

En una realización preferida, el método comprende las etapas de:

i) proporcionar múltiples construcciones según la presente invención, en donde dichas construcciones comprenden una pluralidad de primeras perlas, en donde dicha primera perla tiene una combinación específica de características y/o entidades visualmente detectables tales como color, etiquetas, un tamaño o forma de perla específica, y en donde dicha primera perla está acoplada a un primer oligonucleótido mediante un enlazador fotoescindible, comprendiendo dicho primer oligonucleótido a) una secuencia handle de amplificación, b) una secuencia de código de barras específica para una o varias de dichas características y/o entidades visualmente detectables y c) una secuencia terminal que comprende una secuencia poli-A;

ii) cargar aleatoriamente múltiples construcciones obtenidas en la etapa i) en micropocillos, junto con la captura de construcciones que comprenden una perla magnética que comprende un segundo oligonucleótido, comprendiendo dicho segundo oligonucleótido a) una segunda secuencia handle de amplificación, b) una secuencia de código de barras específica de la perla, c) una secuencia de código de barras molecular único opcional, y d) una segunda secuencia terminal que comprende una secuencia poli-T, y una muestra biológica que comprende células individuales o alternativamente colocar células o una sección de tejido sobre un portaobjetos de vidrio sobre un sustrato que comprende micropocillos; y

iii) fotografiar o escanear el sustrato cargado con un microscopio de fluorescencia o un microscopio óptico.

En una realización más preferida, el método comprende además las etapas de:

iv) sellar o compartimentar los micropocillos del sustrato cargado p. ej., con una membrana semipermeable u otro material poroso, capa de aceite o gel, o el portaobjetos de vidrio que soporta las células o tejidos sobre la superficie;

v) lisar las células para liberar el ARNm dentro de los micropocillos con etapas de congelación o calentamiento, o con un tampón de lisis añadido en los micropocillos a través de la membrana o sellado poroso en la parte superior o inferior de los micropocillos, o agente de lisis soportado por el sellado de gel;

vi) desprender el primer oligonucleótido de la primera perla sometiendo el sustrato a luz UV, y someter las muestras en micropocillos a condiciones que favorezcan la hibridación de secuencias poli-A y poli-T del ARNm liberado y el segundo oligonucleótido, así como el primer y segundo oligonucleótidos entre sí para unir dicho ARNm y el primer oligonucleótido a la perla magnética de la construcción de captura;

vii) recoger y agrupar las muestras de los micropocillos y separar la perla magnética con ARNm unidos y el primer y segundo oligonucleótidos unidos del resto del contenido de la muestra con un imán y etapas de lavado facilitadas por centrifugación;

viii) someter las perlas magnéticas separadas con ARNm unidos, y el primer y segundo oligonucleótidos a una reacción de transcriptasa inversa con un oligonucleótido de cambio de plantilla que comprende una tercera secuencia handle de amplificación; alternativamente, la transcripción inversa puede realizarse directamente sobre los micropocillos antes de recoger y agrupar en la etapa vii);

ix) someter los productos de la reacción de transcriptasa inversa a una reacción de PCR con cebadores que se unen a la primera, segunda y tercera secuencia handle de amplificación o un complemento de las mismas para producir productos de reacción de PCR que no están unidos a las perlas magnéticas;

x) separar los productos de PCR de las perlas magnéticas;

xi) opcionalmente seleccionar por tamaño los productos de PCR en un primer grupo de secuencias que tienen la longitud inferior a aproximadamente 200 pb y un segundo grupo que tiene la longitud superior a aproximadamente 200 pb;

xii) introducir el índice de secuenciación y las secuencias adaptadoras (preferiblemente con métodos apropiados de tagmentación, fragmentación, reparación de extremos, adición de colas A, ligación o PCR cuando sea necesario) y secuenciar los productos de PCR, opcionalmente en los grupos obtenidos en la etapa xi);

xiii) identificar los productos de ARNm de una célula individual analizando los datos de secuenciación, preferiblemente comparando las combinaciones de las secuencias de código de barras específicas de una característica y/o entidad visualmente detectable o combinación de las mismas derivadas del primer oligonucleótido y la secuencia de código de barras específica de la perla magnética derivada del segundo oligonucleótido y/u opcionalmente la secuencia de código de barras molecular único derivada del segundo oligonucleótido, presente en el mismo producto de PCR secuenciado, con un producto de PCR secuenciado que comprende una combinación de una secuencia de ARNm y la secuencia de código de barras específica de la perla derivada del segundo oligonucleótido y/u opcionalmente la secuencia de código de barras molecular único derivada del segundo oligonucleótido;

xiv) opcionalmente localizar la ubicación de una célula individual o tejido comparando las combinaciones de las secuencias de código de barras específicas de una característica y/o entidad visualmente detectable o de una combinación de las mismas, derivadas del primer oligonucleótido y de la fotografía o escaneo del sustrato cargado tomada con un microscopio de fluorescencia o un microscopio óptico en la etapa iii).

En otra realización preferida, el método comprende las etapas de:

i) proporcionar múltiples construcciones que comprenden oligonucleótidos primero y segundo como se ha definido anteriormente, en donde dichas construcciones comprenden una pluralidad de primeras perlas, en donde dicha primera perla tiene una combinación específica de características y/o entidades visualmente detectables tales como color, etiquetas, un tamaño o forma de perla específica, y en donde dicha primera perla está acoplada a un primer oligonucleótido por un enlazador fotoescindible, comprendiendo dicho primer oligonucleótido a) una secuencia handle de amplificación, b) una secuencia de código de barras específica para una o varias de dichas características y/o entidades visualmente detectables y c) una secuencia terminal que comprende una secuencia poli-A, y en donde dicha primera perla comprende además una pluralidad de segundos oligonucleótidos acoplados a dicha perla, comprendiendo dicho segundo oligonucleótido a) una segunda secuencia handle de amplificación complementaria a un cebador de PCR que comprende una secuencia adaptadora compatible con la secuenciación de próxima generación, b) una secuencia de código de barras específica para una o varias de características y/o entidades visualmente detectables de la perla, c) una secuencia de código de barras específica para la perla, d) una secuencia de código de barras molecular único opcional, y e) una secuencia poli-T terminal;

ii) cargar aleatoriamente múltiples construcciones obtenidas en la etapa i) en micropocillos y una muestra biológica que comprende células individuales o alternativamente colocar células o una sección de tejido sobre un portaobjetos de vidrio sobre un sustrato que comprende micropocillos; y

iii) fotografiar o escanear el sustrato cargado con un microscopio de fluorescencia o un microscopio óptico.

En una realización preferida de la invención, la detección de la construcción de la presente invención no depende de la adición de sonda(s) oligonucleotídica(s) a dichos pocillos/muestras, comprendiendo dicha(s) sonda(s) una etiqueta ópticamente legible y teniendo secuencia(s) complementaria(s) a dicho primer y/o segundo oligonucleótidos.

Los verbos "comprender" e "incluir" se usan en este documento como limitaciones abiertas que no excluyen ni requieren la existencia de características no enumeradas. Las características enumeradas en las reivindicaciones dependientes se pueden combinar libremente entre sí a menos que se indique explícitamente lo contrario. Además, debe entenderse que el uso de "un" o "una", es decir, una forma singular, a lo largo de este documento no excluye una pluralidad.

La referencia a lo largo de esta memoria descriptiva a una realización o una realización significa que un rasgo, estructura o característica particular descrito en relación con la realización se incluye en al menos una realización de la presente invención. Por lo tanto, las apariciones de las expresiones "en una realización preferida" o "en una realización" en varios lugares a lo largo de esta memoria descriptiva no se refieren necesariamente a la misma realización en su totalidad. Cuando se hace referencia a un valor numérico usando un término tal como, por ejemplo, aproximadamente o sustancialmente, también está descrito el valor numérico exacto.

Sección experimental

Los siguientes ejemplos describen cuatro versiones del presente método para crear coordenadas visuales con código de barras de perlas para el análisis espacial de ARNseq de células o tejidos individuales. Estos ejemplos no deben interpretarse para englobar todas y cada una de las variaciones que resultan evidentes como resultado de la enseñanza proporcionada en esta memoria.

Ejemplo 1

Diseño y validación de Colour Barcode Microbeads

Se diseñaron 16 diferentes construcciones de Colour Barcode Microbead, donde se usaron Dynabeads magnéticas de 2,8 pm de diámetro y recubiertas con estreptavidina (M-280, ThermoFisher Scientific, número de catálogo 11205D), como esqueletos de perlas. Para la tinción de las perlas de un solo color o multicolor, se ordenaron cuatro oligos cortos biotinilados 5' con tramo de 10 C como espaciador y cada uno con diferentes etiquetas fluorescentes azules (Atto425), verdes (FAM), amarillas (Cy3) y rojas (Cy5) en el extremo 3' de Integrated DNA Technologies (SEQ ID NO: 22-25). La secuencia de los oligos de tinción es irrelevante y puede reemplazarse por otras secuencias o moléculas espadadoras. Se diseñó otro conjunto de 16 oligos de etiquetado Colour barcode diferentes con biotina fotoescindible (PCbio) (liberada por exposición a UV a longitudes de onda de 300-350 nm) en el extremo 5' (SEQ ID NO: 1-16) con las siguientes características: un secuencia handle de amplificación genérica de extremo 5' (PCRhandle2) para la preparación de la biblioteca de secuenciación de próxima generación, una secuencia de código de barras única específica para cada construcción de color de perla, y un tramo poliA en el extremo 3' (Figura 4 y tabla de la Figura 5). Se prepararon 16 lotes de perlas, cada uno con uno de los 16 oligos Colour barcode. 15 de los lotes también se tiñeron con una combinación diferente de 1,2, 3 o 4 de los oligos biotinilados etiquetados fluorescentemente. El lote n° 16 de perlas se usó como no fluorescente, etiquetado solo con el oligo Colour barcode.

Las Dynabeads con estreptavidina tienen la capacidad de unirse a ~200 pmoles de oligos de ADN biotinilados por mg de perlas y los oligos etiquetados y no etiquetados se añadieron a las perlas en proporciones de 1:1 a 1:10 dependiendo de las intensidades de señal de cada fluorocromo. Después de la incubación de 15 min a RT en tubos rodantes, las perlas se lavaron cuidadosamente 5 veces con PBS y se sedimentaron mediante imán en cada ronda de lavado. Se usó tampón de lavado y unión a Dynabead 1X (B&W) en estas etapas (Tris-HCl 5 mM (pH 7,5), EDTA 0,5 mM, NaCl 1 M). Las intensidades de fluorescencia y las integridades de las perlas se comprobaron con un microscopio Zeiss Axiolmager. La selección de etiquetas, intensidades de tinción y tiempos de exposición necesitan ajustarse en cada laboratorio de usuario para que sea compatible con sus especificaciones de microscopio fluorescente. La unión y liberación apropiadas del oligo Colour barcode se probó de cada 16 lotes de perlas incubándolos con perlas Cell barcoding comerciales (MACOSKO 2011-10 B, ChemGenes, EE.UU., en lo sucesivo denominadas perlas CellBC o Cell barcoding) con exposición a UV 10 min (sistema de formación de imágenes Bio-Rad ChemiDoc) para liberar el oligo, seguido de hibridación de 20 min de poliA a poliT, separación posterior de perlas CellBC no magnéticas de las perlas Colour barcode magnéticas con imán, 3 rondas de tampón SSC completo (Sigma Aldrich, número de catálogo S6639) etapas de lavado y centrifugación de perlas CellBC, amplificación por PCR en reacción a granel (SEQ ID NO: 19 and 26) y detección por electroforesis en gel del producto del tamaño correcto (~ 180 pb). Después de la comprobación de calidad, los 16 lotes de perlas preparados se mezclaron en proporciones iguales y esta mezcla madre de perlas se almacenó a 4 en tampón Tris-PBS y se protegió de la luz.

Carga de matriz de micropocillos

Se granuló una alícuota de mezcla madre de perlas ColourBC que contenía ~ 100 000 perlas con imán y se lavó una vez, y se suspendió en 200 gl de PBS con una mezcla de pipeta completa pero suave al menos 20 veces, y luego se cargó aleatoriamente en un área de matriz de micropocillos de 1 cm x 1 cm que consistía en 20 000 micropocillos del tamaño de 20 gm de diámetro y 20 gm de profundidad (geometría personalizada diseñada y fabricada de polidimetilsulfóxido (PDMS) pero funcionalizada de otro modo según el protocolo de Seq-Well por Gierahn et al 2017). Se usaron marcos de silicona retirables alrededor del área de la matriz y un portaobjetos de cubierta de vidrio encima del tampón para ayudar a una eficiencia de carga igual y a prevenir la evaporación del tampón. Se colocó un imán plano bajo la placa de matriz para sujetar la carga de perlas. Durante la carga de 10 min, el imán se retiró cuidadosamente dos veces y el chip se agitó suavemente de manera horizontal para potenciar que las perlas restantes entre los micropocillos se asentaran en los pocillos. La calidad de carga también se comprobó con un microscopio óptico. Se retiró tampón adicional, manteniendo la matriz de portaobjetos todavía en el imán, y se dejaron secar los portaobjetos durante al menos 30 min protegidos de la luz. Las matrices cargadas y secadas se almacenaron en placas de Petri cubiertas a 4 °C protegidas de la luz, hasta la siguiente etapa.

Análisis de imágenes para coordenadas

Se usó un escáner de microscopio fluorescente Zeiss Axiolmager para escanear toda el área de la matriz para los 4 colores fluorescentes y sus combinaciones se usaron en perlas, y el programa Zen 2.3 Lite asociado para formar una única imagen grande ensamblada del área. La imagen se guardó como 4 canales de microscopio fluorescente y 1 de luz en un formato de imagen de múltiples capas apiladas. El análisis de imágenes y el algoritmo de aprendizaje automático se crearon, entrenaron y validaron con un software de aprendizaje automático específico diseñado para el análisis de imágenes al microscopio. Se entrenó el algoritmo para reconocer las 16 clases diferentes de perlas (construcciones) basándose en sus combinaciones de color, para reconocer los micropocillos de 20 gm de diámetro, para contar el número de cada tipo de estas clases de perlas dentro de cada micropocillo, y para dar una coordenada posicionada en X-Y en la matriz para cada una de tales composiciones de características. Casi todos los pocillos cargados con este protocolo de carga contenían de 1 a más de 10 perlas por pocillo, teniendo la mayoría de los micropocillos 3-8 perlas como se predice por la distribución de Poisson. De las 16 características posibles, son posibles el total de 65535 combinaciones teóricas (Fig. 2), y el algoritmo Al mapea y registra los pocillos con composición única de características de perlas. También se marcó en el mapa una lista de combinaciones no únicas.

A menos que se avance inmediatamente a la siguiente etapa, los portaobjetos precargados y coordinados con la imagen pueden prepararse en stock de antemano y almacenarse a 4 °C secos con el imán por debajo si se manipulan, y protegerse de la luz y el polvo.

Experimento de ARNseq de células individuales con protocolo Seq-Well combinado con el presente método

Se humedecieron chips precargados y de imagen durante 2 horas con PBS, con imán bajo el chip y protegido de la luz. Se prelavaron 20000 perlas Cell barcoding (CellBC), sintetizadas a medida en perlas de poliestireno de 10 pm de diámetro (ChemGenes, MACOSKO-2011-10 B con SEQ ID NO: 17, síntesis descrita en Macosko et al 2015) y se cargaron en un volumen de 200 pl de tampón de carga de perlas (receta en Gierahn et al 2017) en el área de micropocillos deseada con agitación horizontal suave durante 30 min, y usando marcos de silicio y protección frente a la luz. Después de esto, se añadieron 5000 células mononucleares de sangre periférica en 200 pl de medio RPMI y las células se dejaron reposar de manera similar durante 30 minutos. Los pocillos se sellaron con membrana semipermeable y las células se lisaron con tampón de lisis, adaptado del protocolo Seq-Well (Gierahn et al 2017). Se usó una exposición a luz UV de 5 min para liberar los oligos fotoescindibles de las perlas Colour barcode. Después de la incubación de 20 min, se retiró la membrana, se recogieron y lavaron las perlas CellBC, se realizó la síntesis de ADNc de 1a cadena con transcripción inversa con oligo de cambio de plantilla (SEQ ID NO: 18) seguido de tratamiento con Exol, amplificación por PCR de ADNc de longitud completa (SEQ ID NO: 19) y preparación de biblioteca de Illumina basada en tagmentación (SEQ ID NO: 20 y cebador de indexación de Illumina Nextera i7 estándar) con etapas de lavado, purificación y cuantificación apropiadas, siguiendo los protocolos DropSeq (Macosko et al 2015) y Seq-Well (Gierahn et al 2017). La selección por tamaño de fragmentos de <200 pb y la preparación de bibliotecas separadas (con SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 27) de los Colour barcodes enlazados a los Cell barcodes, siguió el protocolo CITE-seq para bibliotecas ADT (etiqueta determinante de anticuerpos) (Stoeckius et al 2017).

Secuenciación y análisis de datos

Las bibliotecas se secuenciaron con la plataforma Illumina NextSeq500 y el kit de secuenciación de ciclo High Output 75. Se usó el cebador de secuenciación de lectura 1 personalizado (SEQ ID NO: 21) para secuenciar 20 pb para la lectura 1 que cubre el código de barras celular de 12 pb y el código de barras molecular de 8 pb (UMB) derivado de las perlas CellBC. Los cebadores de secuenciación estándar de lectura 2 de Illumina incluidos en el cartucho de secuenciación produjeron lecturas de 55 pb de las secuencias génicas derivadas de ARNm capturados por las perlas CellBC, así como los códigos de barras de perlas de color derivados de los oligos característicos desprendidos por UV que también fueron capturados por las perlas CellBC. El procesamiento de archivos fastq sin procesar siguió la canalización de análisis de datos Drop-Seq disponible públicamente (Macosko et al 2015) y, para el código de barras de color, la tubería CITE-seq (Stoeckius et al 2017). Se creó una matriz de expresión génica combinada a partir de los recuentos de transcritos alineados con el genoma de referencia y los recuentos de códigos de barras de color que se enlazan al mismo código de barras celular. Esta matriz se hizo coincidir adicionalmente con el mapa visual de las coordenadas espaciales X-Y de las células y perlas en los pocillos, creadas anteriormente con el algoritmo de aprendizaje automático a partir de la imagen del escáner del microscopio.

Ejemplo 2

Se probó otra variación del protocolo descrito en el Ejemplo 1 con diferentes tamaños (3, 6, 8 o 10 um) y colores visuales de las perlas, combinados con solo una única etiqueta de fluorescencia FAM. Dicho conjunto de perlas es más fácil de usar con una gran variedad de microscopios de usuario final ya que necesitan menos optimización en comparación con los conjuntos de excitación, emisión y filtro de multifluorescencia, y posibles limitaciones de autofluorescencia de algunas perlas. Las perlas en diversos tamaños, colores y recubrimientos superficiales o funcionalizaciones están disponibles de muchos proveedores (p. ej., Sferotech, Bangs Laboratories, PolySciences, Abvigen). Cuando se usaron perlas carboxiladas en lugar de recubrimiento con estreptavidina, el oligo de tinción etiquetado con FAM se ordenó con un grupo amina 5' en lugar de biotina, y respectivamente los oligos Colour barcode se ordenaron con un grupo amina en el extremo 5' fotoescindible (GeneLink). Se usó activación de EDC para formar un enlace de amida entre los grupos carboxilo en perlas y la amina primaria del oligo, siguiendo las instrucciones del proveedor de reactivos (ThermoFisher Scientific, número de catálogo 22980). En el caso de perlas no magnéticas, se imantaron con nanopartículas magnéticas aminadas (Merck Life Science, número de catálogo 747327) en la misma reacción de EDC. Las perlas enlazadas se lavaron cuidadosamente al menos 3 veces para eliminar los oligos y etiquetas no unidos, antes de mezclar los lotes de perlas. De lo contrario, el protocolo fue similar al Ejemplo 1, las perlas cargadas se escanearon con un microscopio de fluorescencia AxioImager equipado con una cámara en color y la imagen en color ensamblada, apilada con la imagen de fluorescencia verde (para etiqueta FAM), se analizó con un algoritmo de aprendizaje automático entrenado para reconocer las siguientes 20 clases de perlas y las reconoce y cuenta de cada micropocillo. Conjuntos aleatorios de perlas del grupo de 20 tipos de perlas producen más de un millón de combinaciones únicas de tipos de perlas por pocillo (https://stattrek.com/onlinecalculator/combinations-permutaciones.aspx) como la suma de todas las posibles combinaciones de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20 perlas de entre 20 tipos de perlas totales a 20+190+1140+4845+15504+38760+77520+125970+167960+184756+167960+125970+ 77520+38760+15504+4845+1140+190+20+1=1048575 posibles combinaciones por pocillo. Por ejemplo, en una matriz con 10000 pocillos y cargando con 80000 perlas aleatoriamente en distribución de Poisson, la proporción de pocillos no informativos/no únicos con 0, 1 o 2 perlas solo puede mantenerse en menos del 2 %.

20 tipos de perlas creadas en el ejemplo 2:

Azul-3 um-no fluorescente

Azul-6 um-no fluorescente

Amarilla-3 um-no fluorescente

Amarilla-6 um-no fluorescente

Roja-3 um-no fluorescente

Roja-6 um-no fluorescente

No coloreada-3 um-no fluorescente

No coloreada-6 um-no fluorescente

No coloreada-8 um-no fluorescente

No coloreada-10 um-no fluorescente

Azul-3 um-FAM

Azul-6 um-FAM

Amarilla-3 um-FAM

Amarilla-6 um-FAM

Roja-3 um-FAM

Roja-6 um-FAM

No coloreada-3 um-FAM

No coloreada-6 um-FAM

No coloreada-8 um-FAM

No coloreada-10 um-FAM

Ejemplo 3

Otra variación del protocolo es el método sin las perlas Cell barcode comerciales, pero en su lugar el oligo de Cell barcode es soportado por las perlas coloreadas u otras que se caracterizan visiblemente, junto con los oligos de ColourBC (véase la Figura 4). Opcionalmente, el nuevo oligo CellBC soportado en las perlas caracterizadas soporta una secuencia ColourBC adicional que coincide con el color o combinación de características de las perlas (SEQ ID NO: 28). Es esencial, sin embargo, que las perlas presentadas también soporten un oligo ColourBC escindible separado que se libere y capture aleatoriamente por todas las perlas en un pocillo dado. La secuencia de oligo CellBC única se creó para cada lote de perlas con oligo de esqueleto central biotinilado que consiste en PCRhandle1 y ColourBC opcional. Para crearlas, la síntesis dividida y agrupada de CellBC específica de perla de 12 pb, código de barras molecular totalmente aleatorio de 8 pb y secuencia poli-T de 30 pb se adaptó del protocolo descrito en Macosko et al 2015. Después de esto, los oligos ColourBC con extremo poli-A, y biotina fotoescindible en 5' e idénticos al ejemplo 1, se unieron a los lotes de perlas, se lavaron 5 veces, y después todos los lotes con perlas representadas se mezclaron y usaron en los experimentos en micropocillos. Las perlas se cargaron y se formaron imágenes como en el Ejemplo 1, pero no se añadieron perlas CellBC comerciales en las siguientes etapas. La carga de célula o tejido y el análisis posterior siguieron de otro modo los ejemplos 1 y 4. Múltiples perlas por pocillo crearon múltiples códigos de barras celulares por pocillo, pero como el color o la combinación de características fue única, permitió la coincidencia de múltiples Cell barcodes con una única combinación de ColourBC única en cada pocillo, y esto se permitió en la canalización de análisis bioinformático con esta versión del método.

Ejemplo 4

Otra variación del método es usar los micropocillos con código de barras de perlas para la captura espacial directa del ARN de secciones de tejido embebidas en parafina (FFPE) crioconservadas o fijadas en formalina, en lugar de células disociadas en suspensión. Para esto, se cortaron tejidos tumorales mamarios de ratón embebidos en TissueTek OCT Compound (Sakura) y congelados instantáneamente con criomicrotomo a secciones de 10 gm de espesor en portaobjetos de vidrio de microscopio estándar, y se mantuvieron a -80 °C hasta su uso. Las secciones se fijaron con metanol y se tiñeron con un protocolo de tinción estándar de hematoxilina-eosina (HE), seguido de un escaneo de imágenes con microscopio óptico para visualizar la estructura del tejido. Un portaobjetos de micropocillos preparado previamente con perlas ColourBC precargadas y con imagen fluorescente (como se describe en los ejemplos 1 y 3) se mantuvo en imán y se humedeció con tampón de permeabilización celular (pepsina al 0,1 % en HCl 0,1 N). La matriz humedecida se colocó en una cámara de sobremesa humidificada para evitar la evaporación de los pequeños volúmenes de líquido de los micropocillos en las siguientes etapas. Manteniendo los portaobjetos dentro de la cámara, se retiró el exceso de tampón de lisis de la parte superior del portaobjetos seguido de la colocación inmediata del portaobjetos de sección de tejido en la parte superior de éste de modo que el tampón de lisis llenara los pocillos y el tejido entrara en contacto. Una pieza delgada de metal pegada con cinta en la parte posterior del portaobjetos de tejido ayudó a mantenerlo firmemente y aún en su lugar con la potencia del imán bajo el portaobjetos de micropocillos. Alternativamente, se podría usar un clip mecánico. Se dejaron lisar las células y se hibridó el ARNm en las perlas durante 15 min a temperatura ambiente. Se inició una exposición a UV de 5 min al principio como en el Ejemplo 1 para liberar los oligos Colour barcode de las perlas e hibridarlos con los oligos Cell barcoding junto con el ARNm de las células en lisis. Después de esto, el portaobjetos de tejido se movió rápidamente y la matriz de micropocillos, mientras todavía estaba en el imán, se lavó inmediatamente 4 veces con tampón SSC para eliminar el exceso de ARN no hibridado y los oligos liberados por UV. Se recogieron las perlas del portaobjetos de micropocillos colocando el portaobjetos al revés hasta una cámara de portaobjetos con tampón SSC y tirando de las perlas con imán bajo la cámara. En el caso del protocolo del Ejemplo 1 con perlas CellBC comerciales no magnéticas, también se necesitó una etapa de centrifugación en portaobjetos. Las perlas en tampón se recogieron en un único tubo Eppendorf y se sedimentaron. Las siguientes etapas de transcripción inversa y preparación de bibliotecas se realizaron en reacción a granel en las perlas, como se refiere en el ejemplo 1, siguiendo estrechamente los protocolos descritos en Macosko et al 2015, Gierahn et al 2017 y Stoeckius et al 2017. El análisis de datos fue por lo demás similar al descrito en el Ejemplo 1, pero además, la imagen del microscopio de la sección de tejido original teñido con HE se superpuso sobre la información de secuenciación espacial de la expresión génica derivada de las posiciones de pocillos coordinados con perlas. La correspondencia entre imágenes de tejido y matriz para la superposición se guió por la forma de área de producción de datos de secuenciación del portaobjetos de micropocillos y con puntos de marcado auxiliares incorporados en ambos portaobjetos, registrados con el microscopio y alineados a partir de las imágenes.

Referencias

Gierahn TM, Wadsworth MH 2nd, Hughes TK, Bryson BD, Butler A, Satija R, Fortune S,

Love JC, Shalek AK. Seq-Well: portable, low-cost RNA sequencing of single cells at high

throughput. Nat Mcthods. 2017 Apr;14(4):395-398. doi: 10.1038/nmeth.4179. Epub 2017 Feb

13. PMID: 28192419; PMCID: PMC537Ó227.

Macosko EZ, Basu A, Satija R, Ncmcsh J, Shckhar K, Goldman M, Tirosh I, Bialas AR,

Kamitaki N, Martersteck EM, Trombetta JJ, Weitz DA, Sanes JR, Shalek AK, Regev A,

McCarroll SA. Highly Parallcl Genome-wide Expression Profílíng of Individual Cells Using

Nanolitcr Droplcts. Ccll. 2015 May 21; 161(5): 1202-1214. doi: 10.101ó/j.cell.2015.05.002.

PMID: 26000488; PMCID: PMC4481139.

Stoeckius M, Hafemeister C, Stephenson W, Houck-Loomis B, Chattopadhyay PK, Swerdlow

H, Satija R, Smibert P. Simultaneóos epitope and transcriptome measurement in single cells.

Nat Methods. 2017 Sep;14(9):865-868. doi: 10.1038/nmeth.4380. Epub 2017 Jul 31. PMID

28759029: PMCID: PMC5669064.

Lista de secuencias de oligonucleótidos y sus modificaciones:

SEQ ID NO: 1: /5PCbio/CCTTGGCACCCGAGAATTCCA ATCACG BAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO: 2: /5PCbio/CCTTGGCACCCGAGAATTCCA TTAGGC BAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO: 3: /5PCbio/CCTTGGCACCCGAGAATTCCA TGACCA BAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO: 5: /SPCbio/CCTTGGCACCCGAGAATTCCA GCCAAT BAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO: 6: /SPCbio/CCTTGGCACCCGAGAATTCCA CAGATC BAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO: 7: /SPCbio/CCTTGGCACCCGAGAATTCCA ACTTGA BAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO: 8: /5PCbio/CCTTGGCACCCGAGAATTCCA TGAACG BAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO: 10: /SPCbio/CCTTGGCACCCGAGAATTCCA TAGCTG BAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO: 11: /SPCbio/CCTTGGCACCCGAGAATTCCA AATACG BAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO: 12: /5PCbio/CCTTGGCACCCGAGAATTCCA TTCCAG BAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO: 13: /SPCbio/CCTTGGCACCCGAGAATTCCA ATCTGT BAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

SEQ ID NO: 14: /5PCbio/CCTTGGCACCCGAGAATTCCA ACTTGA BAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID NO: 15: /5PCbio/CCTTGGCACCCGAGAATTCCA TAACAG BAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID NO: 16: /5PCbio/CCTTGGCACCCGAGAATTCCA GATGTG BAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID NO: 17: (oligo DropSeq Cell barcoding, comercial, donde los tramos de BC indican el código de barras celular y N el código de barras molecular único UMB)

SEQ ID NO: 18: (DropSeq-TSO)

SEQ ID NO: 19: (cebador DropSeq-SMART-PCR)

SEQ ¡D NO: 20:

(oligo híbrido DropSeq-New_P5_SMART-PCR)

SEQ ID NO: 21: (cebador de secuenciación DropSeq-CustomReadl)

SEQ ID NO: 22: (oligo de etiquetado fluorescente de perla Colour)

SEQ ID NO: 23: (oligo de etiquetado fluorescente de perla Colour)

SEQ ID NO: 24: (oligo de etiquetado fluorescente de perla Colour)

SEQ ID NO: 25: (oligo de etiquetado fluorescente de perla Colour)

SEQ ID NO: 26: (cebador de amplificación PCR-handle 2 de perla Colour)

SEQ ID NO: 27:

(cebador lllumina Small RNA RPI1 para indexación de producto ColourBC, aquí índice 1 Í7 como ejemplo) SEQ ID NO: 28:

(oligo DropSeq Cell barcoding modificado cuando se usa en perlas ColourBC junto con oligos Colour barcoding, incluyendo la secuencia de etiquetado Coiour opcional indicada con la primera secuencia NNNNNN) SEQ ID NO: 31:

(oligo PCR-handle inmovilizado para amplificación en puente presentada en la Figura 7)

SEQ ID NO: 32

(oligo poliA inmovilizado fotoescindible para amplificación en puente presentado en la Figura 7)

SEQ ID NO: 33

(plantilla para la amplificación en puente en la Figura 7, incluyendo la secuencia aleatoria N/12 que crea los clústeres de CellBC muy específicos)

Claims (21)

REIVINDICACIONES

1. Una construcción para detectar dianas de ácido nucleico, comprendiendo dicha construcción una perla, preferiblemente una perla magnética, en donde dicha perla comprende una o varias características visualmente detectables y/o dicha perla está acoplada a una o varias entidades visualmente detectables, y en donde dicha perla comprende un oligonucleótido, y dicho oligonucleótido comprende a) una secuencia handle de amplificación, b) una secuencia de código de barras específica para una o varias de dichas características y/o entidades visualmente detectables y c) una secuencia de captura o anclaje 3' terminal, y en donde dicho oligonucleótido está dispuesto para poder desprenderse de dicha perla.

2. La construcción según la reivindicación 1, en donde dicha secuencia de captura o anclaje 3' terminal comprende una secuencia poli-A, una secuencia handle de amplificación universal o una secuencia compatible con el cambio de plantilla.

3. La construcción según la reivindicación 1 o 2, en donde dicha característica visualmente detectable es el tamaño de la perla, color, luminiscencia o fluorescencia de la perla, forma de la perla o una combinación de los mismos.

4. La construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicho oligonucleótido está enlazado a dicha perla a través de un enlace escindible, preferiblemente un enlace fotoescindible, escindible químicamente o escindible enzimáticamente.

5. La construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicha perla se acopla adicionalmente a un compuesto químico, un antígeno o un anticuerpo.

6. La construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicha perla se acopla a dicha una o varias entidades visualmente detectables a través de un enlace estreptavidina-biotina o carboxilato-amina o a través de cualquier otro enlace.

7. La construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde dicha secuencia handle de amplificación es complementaria a un cebador de PCR, comprendiendo dicho cebador preferiblemente una secuencia adaptadora compatible con la secuenciación de próxima generación.

8. La construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde dicha construcción comprende un segundo oligonucleótido acoplado a dicha perla, comprendiendo dicho segundo oligonucleótido a) una segunda secuencia handle de amplificación preferiblemente complementaria a un cebador de PCR que comprende una secuencia adaptadora compatible con la secuenciación de próxima generación, b) una secuencia de código de barras específica para una o varias características y/o entidades visualmente detectables de la perla, c) una secuencia de código de barras específica para la perla, d) una secuencia de código de barras molecular único opcional, y e) una secuencia poli-T terminal o una secuencia compatible con cambio de plantilla.

9. Una composición que comprende una construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -8.

10. La composición según la reivindicación 9, en donde dicha composición comprende una mezcla de al menos 2 construcciones según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 que proporcionan una mezcla de distintas características o entidades visualmente detectables.

11. La composición según la reivindicación 10, en donde dicha mezcla de al menos 2 construcciones comprende al menos 6, preferiblemente al menos 16, características y/o entidades visualmente detectables separadas.

12. La composición según la reivindicación 11, en donde la cantidad de tipos de construcciones visualmente distintos es 16 y dicha característica visualmente detectable en dichas construcciones se selecciona del grupo que consiste en la forma, tamaño, color, luminiscencia y fluorescencia de las perlas.

13. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 9-12 cargada en una placa o chip de pocillos.

14. Una placa o chip de pocillos que comprende la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 9-12 cargada en los pocillos de dicha placa o chip.

15. Un kit que comprende la placa o chip de pocillos según la reivindicación 14 y una entidad legible por ordenador que comprende un archivo de una fotografía o escaneo de dicha placa o chip con la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 9-12 cargada en los pocillos de dicha placa o chip.

16. Uso de la construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 9-13 para identificar dianas de ácido nucleico o productos de secuenciación de ARNm deseados que se originan a partir de una célula individual, posición o coordenada.

17. Método para detectar la ubicación de muestras biológicas, comprendiendo el método las etapas de:

- cargar la construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 9-13 con una muestra biológica junto o secuencialmente en cualquier orden a un sustrato que comprende pocillos,

- fotografiar o escanear los pocillos en dicho sustrato con un microscopio, preferiblemente un microscopio óptico o un microscopio de fluorescencia, antes y/o después de cargar la muestra biológica en dicho sustrato; y

- determinar opcionalmente la ubicación o coordenada de un pocillo específico que tiene una característica y/o entidad visualmente detectable distinta o combinación de las mismas en el sustrato cargado.

18. El método según la reivindicación 17, que comprende además las etapas de:

- someter las muestras en los pocillos a condiciones que favorezcan la lisis celular, la liberación de ácido nucleico y después a una reacción de transcriptasa inversa,

- amplificar los productos de reacción de transcriptasa inversa, en donde los productos de amplificación contienen secuencias de código de barras específicas para una o varias de las características y/o entidades visualmente detectables de las construcciones,

- preparar una biblioteca de secuenciación a partir de los productos de reacción de transcriptasa inversa amplificados y secuenciar dicha biblioteca; y

- opcionalmente identificar ubicaciones específicas de los pocillos a partir de las cuales se originó cada producto secuenciado analizando los datos de secuenciación con información de código de barras específica para características y/o entidades visualmente detectables de las construcciones para enlazar una característica y/o entidad o combinación visualmente detectable determinada de las mismas a un producto secuenciado, y determinar la ubicación de un pocillo específico que tiene la característica y/o entidad o combinación visualmente detectable correspondiente de las mismas en el sustrato cargado tal como se fotografió o escaneó en el método.

19. El método según la reivindicación 17, en donde el método comprende las etapas de:

i) proporcionar múltiples construcciones según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde dichas construcciones comprenden una pluralidad de primeras perlas, en donde dicha primera perla tiene una combinación específica de características y/o entidades visualmente detectables tales como color, etiquetas, un tamaño o forma de perla específica, y en donde dicha primera perla está acoplada a un primer oligonucleótido mediante un enlazador fotoescindible, comprendiendo dicho primer oligonucleótido a) una secuencia handle de amplificación, b) una secuencia de código de barras específica para una o varias de dichas características y/o entidades visualmente detectables y c) una secuencia terminal que comprende una secuencia poli-A;

ii) cargar aleatoriamente múltiples construcciones obtenidas en la etapa i) en pocillos, junto con la captura de construcciones que comprenden una perla magnética que comprende un segundo oligonucleótido, comprendiendo dicho segundo oligonucleótido a) una segunda secuencia handle de amplificación, b) una secuencia de código de barras específica de la perla, c) una secuencia de código de barras molecular único opcional, y d) una segunda secuencia terminal que comprende una secuencia poli-T, y una muestra biológica que comprende células individuales o alternativamente colocar células o una sección de tejido sobre un portaobjetos de vidrio sobre un sustrato que comprende pocillos; y

iii) fotografiar o escanear el sustrato cargado con un microscopio de fluorescencia o un microscopio óptico.

20. El método según la reivindicación 19, que comprende además las etapas de:

iv) opcionalmente sellar o compartimentar los pocillos del sustrato cargado, preferiblemente con una membrana semipermeable u otro material poroso, capa de aceite o gel, o el portaobjetos de vidrio que soporta las células o tejidos sobre la superficie;

v) lisar las células para liberar el ARNm dentro de los pocilios con etapas de congelación o calentamiento, o con un tampón de lisis añadido a los pocillos a través de la membrana o sellado poroso en la parte superior o inferior de los pocillos, o agente de lisis soportado por el sellado de gel;

vi) desprender el primer oligonucleótido de la primera perla sometiendo el sustrato a luz UV, y someter las muestras en pocillos a condiciones que favorezcan la hibridación de secuencias poli-A y poli-T del ARNm liberado y el segundo oligonucleótido, así como el primer y segundo oligonucleótidos entre sí para unir dicho ARNm y el primer oligonucleótido a la perla magnética de la construcción de captura;

vii) recoger y agrupar las muestras de los pocillos y separar la perla magnética con ARNm unidos y el primer y segundo oligonucleótidos unidos del resto del contenido de la muestra con un imán y etapas de lavado facilitadas por centrifugación;

viii) someter las perlas magnéticas separadas con ARNm unidos, y el primer y segundo oligonucleótidos a una reacción de transcriptasa inversa con un oligonucleótido de cambio de plantilla que comprende una tercera secuencia handle de amplificación;

ix) someter los productos de la reacción de transcriptasa inversa a una reacción de PCR con cebadores que se unen a la primera, segunda y tercera secuencia handle de amplificación o un complemento de las mismas para producir productos de reacción de PCR que no están unidos a las perlas magnéticas;

x) separar los productos de PCR de las perlas magnéticas;

xi) opcionalmente seleccionar por tamaño los productos de PCR en un primer grupo de secuencias que tienen la longitud inferior a aproximadamente 200 pb y un segundo grupo que tiene la longitud superior a aproximadamente 200 pb;

xii) introducir el índice de secuenciación y las secuencias adaptadoras, y secuenciar las bibliotecas, opcionalmente en los grupos obtenidos en la etapa xi);

xiii) identificar los productos de ARNm de una célula individual analizando los datos de secuenciación, preferiblemente comparando las combinaciones de las secuencias de código de barras específicas de una característica y/o entidad visualmente detectable o combinación de las mismas derivadas del primer oligonucleótido y la secuencia de código de barras específica de la perla magnética derivada del segundo oligonucleótido y/u opcionalmente la secuencia de código de barras molecular único derivada del segundo oligonucleótido, presente en el mismo producto de PCR secuenciado, con un producto de PCR secuenciado que comprende una combinación de una secuencia de ARNm y la secuencia de código de barras específica de la perla derivada del segundo oligonucleótido y/u opcionalmente la secuencia de código de barras molecular único derivada del segundo oligonucleótido;

xiv) opcionalmente localizar la ubicación de una célula individual o tejido comparando las combinaciones de las secuencias de código de barras específicas de una característica y/o entidad visualmente detectable o de una combinación de las mismas, derivadas del primer oligonucleótido y de la fotografía o escaneo del sustrato cargado tomada con un microscopio de fluorescencia o un microscopio óptico en la etapa iii).

21. El método según la reivindicación 17, en donde el método comprende las etapas de:

i) proporcionar múltiples construcciones según la reivindicación 8, en donde dichas construcciones comprenden una pluralidad de primeras perlas, en donde dicha primera perla tiene una combinación específica de características y/o entidades visualmente detectables tales como color, etiquetas, un tamaño o forma de perla específica, y en donde dicha primera perla está acoplada a un primer oligonucleótido mediante un enlazador fotoescindible, comprendiendo dicho primer oligonucleótido a) una secuencia handle de amplificación, b) una secuencia de código de barras específica para una o varias de dichas características y/o entidades visualmente detectables y c) una secuencia terminal que comprende una secuencia poli-A, y en donde dicha primera perla comprende además una pluralidad de segundos oligonucleótidos acoplados a dicha perla, comprendiendo dicho segundo oligonucleótido a) una segunda secuencia handle de amplificación complementaria a un cebador de PCR que comprende una secuencia adaptadora compatible con la secuenciación de próxima generación, b) una secuencia de código de barras específica para una o varias de características y/o entidades visualmente detectables de la perla, c) una secuencia de código de barras específica para la perla, d) una secuencia de código de barras molecular único opcional, y e) una secuencia poli-T terminal;

ii) cargar aleatoriamente múltiples construcciones obtenidas en la etapa i) en pocilios y una muestra biológica que comprende células individuales o alternativamente colocar células o una sección de tejido sobre un portaobjetos de vidrio sobre un sustrato que comprende pocillos; y

iii) fotografiar o escanear el sustrato cargado con un microscopio de fluorescencia o un microscopio óptico.