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ES3035285T3 - Branched lipid compounds - Google Patents

Branched lipid compounds

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Publication number
ES3035285T3
ES3035285T3 ES21830025T ES21830025T ES3035285T3 ES 3035285 T3 ES3035285 T3 ES 3035285T3 ES 21830025 T ES21830025 T ES 21830025T ES 21830025 T ES21830025 T ES 21830025T ES 3035285 T3 ES3035285 T3 ES 3035285T3
Authority
ES
Spain
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compound
pharmaceutically acceptable
prodrug
solvate
acceptable salt
Prior art date
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Active
Application number
ES21830025T
Other languages
English (en)
Inventor
Grant Mclachlan
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ena Respiratory Pty Ltd
Original Assignee
Ena Respiratory Pty Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/AU2020/050660 external-priority patent/WO2020257870A1/en
Priority claimed from AU2020904847A external-priority patent/AU2020904847A0/en
Application filed by Ena Respiratory Pty Ltd filed Critical Ena Respiratory Pty Ltd
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Active legal-status Critical Current
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Abstract

La presente invención se refiere a compuestos agonistas de TLR2 y sus composiciones, y al uso de dichos compuestos y composiciones en la prevención y/o tratamiento de infecciones respiratorias, o enfermedades o afecciones asociadas con infecciones virales o bacterianas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Compuestos lipídicos ramificados
Campo de la invención
La presente invención se refiere a compuestos y sus composiciones, y a dichos compuestos y composiciones para su uso en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades o afecciones mejoradas por la modulación de la función de TLR2, incluyendo infecciones respiratorias, o enfermedades o afecciones respiratorias asociadas a infecciones víricas o bacterianas.
Antecedentes de la invención
Las infecciones respiratorias se encuentran entre las causas más comunes de enfermedad humana en todo el mundo y habitualmente son provocadas por virus. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), en todo el mundo, se calcula que sólo las epidemias estacionales de gripe dan como resultado aproximadamente de 3 a 5 millones de casos de enfermedad graves y aproximadamente de 250.000 a 500.000 muertes al año. Aunque existen vacunas para algunas cepas estacionales, por ejemplo, la gripe, no siempre han demostrado ser adecuadas debido a varios factores, tales como la infección entre la fase de latencia, entre la inoculación y la formación de anticuerpos, y la formación de células inmunitarias. Con frecuencia también es necesario modificar las vacunas estacionales, incluyendo la reformulación y la administración, y también pueden no proporcionar protección durante todo el tiempo deseado. Para otros casos de gripe, tales como brotes pandémicos inesperados, no siempre se conoce, se ha desarrollado o hay disponible una vacuna.
Las infecciones respiratorias víricas también pueden empeorar la gravedad de las afecciones de las vías respiratorias conduciendo a exacerbaciones (ataques). Pueden producirse exacerbaciones en afecciones tales como el asma y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Las exacerbaciones del asma y la EPOC son las formas más importantes de estas enfermedades clínica y económicamente.
La gran mayoría de las exacerbaciones, particularmente en el asma, siguen produciéndose a pesar del uso de las mejores terapias actuales disponibles. Cuando se producen exacerbaciones, las opciones de tratamiento son limitadas y han evolucionado poco en los últimos años. El tratamiento consiste en aumentar las dosis de broncodilatadores inhalados y corticoesteroides sistémicos u orales, que son los mismos fármacos que no impidieron que se produjera la exacerbación en primer lugar.
Existe una necesidad, por lo tanto, de compuestos y métodos nuevos o mejorados para el tratamiento y/o la mejora de infecciones respiratorias, o afecciones respiratorias asociadas a infecciones víricas o bacterianas. La referencia a cualquier técnica anterior en la memoria descriptiva no significa que se reconozca o sugiera que esta técnica anterior forma parte del conocimiento general común en cualquier jurisdicción o que pueda esperarse razonablemente que se comprenda esta técnica anterior, considerado pertinente, y/o junto con otros elementos de la técnica anterior por un experto en la técnica.
Compendio de la invención
La presente invención proporciona compuestos agonistas de la proteína Receptor 2 similar a Toll (TLR2) definidos en las reivindicaciones 1-13 y sus composiciones definidas en la reivindicación 14. Los agonistas de TLR2 han demostrado su potencial en el tratamiento de enfermedades respiratorias y afecciones asociadas a agentes infecciosos tales como virus y bacterias. Ventajosamente, los compuestos y composiciones de la presente solicitud pueden mostrar actividad y tener uso en áreas terapéuticas tales como el tratamiento y/o la prevención de enfermedades respiratorias o afecciones asociadas a infecciones víricas o bacterianas. Además, los compuestos y composiciones de la presente solicitud pueden demostrar una mayor estabilidad, lo que puede traducirse en tasas de aclaramiento más prolongadas después de la administración. Los compuestos de la invención demuestran una estabilidad en solución mejorada en comparación con otros compuestos relacionados. En un aspecto, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (I):
en donde:
R21 se selecciona del grupo que consiste en H, -CH<2>OH, -CH<2>CH<2>OH, -CH(CH3)OH, -CH<2>OPO(OH)<2>, -CH<2>C(=O)NH<2>, -CH<2>CH<2>C(=O)OH y -CH<2>CH<2>C(=O)OR<8>, en donde uno cualquiera de los hidrógenos de alquilo puede reemplazarse por un halógeno;
R22 es H, C<1>-C<6>alifático, un grupo protector de amino, L3-C(=O)- o A2;
L1 y L2 son cada uno independientemente C<6>-C<21>alifático o C<5>-C<20>heteroalifático;
L3 es C<1>-C<21>alifático o C<2>-C<20>heteroalifático;
A2 es un aminoácido o un péptido;
R23 es H o C<1>-C<6>alifático;
R24a y R25a se seleccionan cada uno independientemente de C<1>-C<6>alifático y C<1>-C<6>heteroalifático y R24b y R25b se seleccionan cada uno independientemente de H, C<1>-C<6>alifático y C<1>-C<6>heteroalifático; o R24a y R24b junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un grupo cicloalquilo C<3-8>o heterociclilo de 3-8 miembros, y/o
R25a y R25b junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un grupo cicloalquilo C<3-8>o heterociclilo de 3-8 miembros;
X se selecciona de -S-, -S(=O)- y -S(=O)<2>-;
v es un número entero de 1 -3
R26 y R27 se seleccionan independientemente de H y C<1>-C<6>alifático;
Z1 y Z2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -C(=O)O-, -OC(=O)-, -C(=O)NR-, -NRC(=O)-, -C(=O)S-, -SC(=O)-, -OC(=O)O-, -NRC(=O)O-, -OC(=O)NR- y -NRC(=O)NR-; en donde cada R es independientemente H o C<1>-C<6>alifático;
PEG es un polietilenglicol;
en donde cualquier, alifático, heteroalifático, cicloalquilo y heterociclilo presente en cualquiera de R21, R22, R23, R24a, R24b, R25a, R25b, R26, R27, L1, L2 y L3, está opcionalmente sustituido.
En algunas realizaciones, el compuesto de fórmula (I) se proporciona en forma de una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo.
En algunas realizaciones, el compuesto de fórmula (I) se selecciona de uno cualquiera de los compuestos B1-B16.
La presente invención también proporciona composiciones que comprenden, que consisten esencialmente en, o que consisten en, un compuesto de la invención o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
La presente invención también proporciona un compuesto de la invención o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso como se especifica en la reivindicación 15. En la presente memoria se describen métodos de tratamiento médico para ilustrar la invención, pero que no deben entenderse incluidos en la invención.
En un aspecto, la presente invención proporciona un compuesto descrito en la presente memoria para su uso en suscitar una respuesta inmunitaria innata en un sujeto.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un compuesto para su uso en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad provocada por un agente infeccioso.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un compuesto para su uso en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad o afección respiratoria asociada a una infección vírica o bacteriana.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un compuesto para su uso en el tratamiento y/o la prevención de una infección respiratoria.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un compuesto para su uso en la reducción de la inflamación de las vías respiratorias.
La presente invención también proporciona un compuesto para su uso en la mejora de la capacidad de un sujeto para controlar una enfermedad o afección respiratoria durante una infección vírica respiratoria.
La presente invención también proporciona un compuesto para su uso en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad o afección asociada al TLR2.
Aspectos adicionales de la presente invención y realizaciones adicionales de los aspectos descritos en los párrafos anteriores serán evidentes a partir de la siguiente descripción, proporcionada a modo de ejemplo, y con referencia a los dibujos adjuntos.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1.Respuesta a la dosis en TLR2 humano (densidad óptica a 650 nm frente a concentración (ng/ml)) del compuesto B<6>a partir del ensayo de luciferasa NK-<k>B descrito en el Ejemplo 9.
Figura 2.Respuesta a la dosis en TLR2 humano (densidad óptica a 650 nm frente a concentración (ng/ml)) del compuesto B12 a partir del ensayo de luciferasa NK-<k>B descrito en el Ejemplo 9.
Figura 3.Respuesta a la dosis en TLR2 humano (densidad óptica a 650 nm frente a concentración (ng/ml)) del compuesto B4, B<6>, B<8>, B12, B14 y B16 yListería monocytogenesdestruida por calor (HKLC) a partir del ensayo descrito en el Ejemplo 10.
Figura 4.Actividad de TLR2 de los compuestos 4 del documento WO2020/257870 y B12 del ensayo de luciferasa NK-<k>B descrito en el Ejemplo 11.
Figura 5.Porcentaje de recuperación de 3 o<6>semanas de almacenamiento de los compuestos 4 del documento WO2020/257870, B12, B14 y B16 a 40 °C descritos en el Ejemplo 12.
Descripción detallada de las realizaciones
La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
A continuación se hará referencia en detalle a determinadas realizaciones de la invención. Aunque la invención se describirá junto con las realizaciones, se entenderá que la intención no es limitar la invención a esas realizaciones. Por el contrario, la invención tiene por objeto cubrir todas las alternativas, modificaciones y equivalentes, que pueden incluirse dentro del alcance de la presente invención como se define en las reivindicaciones.
Un experto en la técnica reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los que se describen en la presente memoria, que podrían usarse en la práctica de la presente invención. La presente invención no se limita en modo alguno a los métodos y materiales descritos. Se entenderá que la invención descrita y definida en esta memoria descriptiva se extiende a todas las combinaciones alternativas de dos o más de las características individuales mencionadas o evidentes a partir del texto o los dibujos. Todas estas combinaciones diferentes constituyen diversos aspectos alternativos de la invención.
Como se emplea en esta memoria, excepto que el contexto exija otra cosa, el término "comprender" y variaciones del término, tales como "que comprende", "comprende" y "comprendido", no tienen por objeto excluir otros aditivos, componentes, números enteros o etapas.
Con fines de interpretación de esta memoria descriptiva, los términos utilizados en singular incluirán también el plural y viceversa.
Los términos químicos generales utilizados en las fórmulas de la presente memoria tienen su significado habitual.
El término "alifático" tiene por objeto incluir hidrocarburos saturados e insaturados, no aromáticos, de cadena lineal, ramificados, acíclicos y cíclicos. Los expertos en la técnica apreciarán que los grupos alifáticos incluyen, por ejemplo, grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo y cicloalquenilo, e híbridos de los mismos tales como grupos (cicloalquilo)alquilo, (cicloalquil)alquilo y (cicloalquil)alquenilo. En diversas realizaciones, los grupos alifáticos comprenden 1-12, 1-8, 1-6 o 1-4 átomos de carbono. En algunas realizaciones, los grupos alifáticos comprenden 5-21, de 9-21 o de 11 -21 átomos de carbono, tal como de 11, 13, 15, 17 o 19 átomos de carbono. En algunas realizaciones, el grupo alifático está saturado.
El término "heteroalifático" tiene por objeto incluir grupos alifáticos, en donde uno o más átomos de carbono de la cadena y/o del anillo se reemplazan independientemente con un heteroátomo, preferiblemente un heteroátomo seleccionado de oxígeno, nitrógeno y azufre. En algunas realizaciones, el heteroalifático está saturado. Los ejemplos de grupos heteroalifáticos incluyen grupos lineales o ramificados, heteroalquilo, heteroalquenilo y heteroalquinilo.
El término "alquilo" tiene por objeto incluir grupos hidrocarburo saturados de cadena lineal y de cadena ramificada. En algunas realizaciones, los grupos alquilo tienen de 1 a 12, de 1 a 10, de 1 a 8, de 1 a 6, o de 1 a 4 átomos de carbono. En algunas realizaciones, los grupos alquilo tienen de 5-21, de 9-21 o de 11 -21 átomos de carbono, tal como de 11, 13, 15, 17 o 19 átomos de carbono. Los ejemplos de grupos alquilo de cadena lineal incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo y n-octilo. Los ejemplos de grupos alquilo ramificados incluyen, pero no se limitan a, isopropilo, iso-butilo, sec-butilo,terc-butilo, neopentilo, isopentilo y 2,2-dimetilpropilo.
El término "alquenilo" tiene por objeto incluir grupos alquilo de cadena lineal y ramificada que tiene al menos un doble enlace entre dos átomos de carbono. En algunas realizaciones, los grupos alquenilo tienen de 2 a 12, de 2 a 10, de 2 a 8, de 2 a 6 o de 2 a 4 átomos de carbono. En algunas realizaciones, los grupos alquenilo tienen de 5-21, de 9-21 o de 11 -21 átomos de carbono, tal como de 11, 13, 15, 17 o 19 átomos de carbono. En algunas realizaciones, los grupos alquenilo tienen uno, dos o tres dobles enlaces carbono-carbono. Los ejemplos de grupos alquenilo incluyen, pero no se limitan a, vinilo, alilo, -CH=CH(CH3), -CH=C(CH3)2, -C(CH3)=CH2 y - C(CH3)=CH(CH3).
El término "alquinilo" tiene por objeto incluir grupos alquilo de cadena lineal y ramificada que tiene al menos un triple enlace entre dos átomos de carbono. En algunas realizaciones, el grupo alquilo tiene de 2 a 12, de 2 a 10, de 2 a 8, de 2 a 6 o de 2 a 4 átomos de carbono. En algunas realizaciones, los grupos alquilo tienen uno, dos o tres triples enlaces carbono-carbono. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, -C=CH, -C=CH3, -CH2C=CH3 y -C=CH2CH(CH2CH3)2.
El término "heteroalquilo" tiene por objeto incluir grupos alquilo, en donde uno o más átomos de carbono de la cadena se reemplazan por un heteroátomo, preferiblemente un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno y azufre. En algunas realizaciones, el heteroalquilo está saturado. Los grupos heteroalquilo incluyen, por ejemplo, grupos polietilenglicol y grupos polietilenglicol éter, y similares.
El término "cicloalquilo" tiene por objeto incluir grupos alquilo mono-, bi- o tricíclicos. En algunas realizaciones, los grupos cicloalquilo tienen de 3 a 12, de 3 a 10, de 3 a 8, de 3 a 6, de 3 a 5 átomos de carbono en el anillo o anillos. En algunas realizaciones, los grupos cicloalquilo tienen 5 o 6 átomos de carbono de anillo. Los ejemplos de grupos cicloalquilo monocíclicos incluyen, pero no se limitan a, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y ciclooctilo. En algunas realizaciones, el grupo cicloalquilo tiene de 3 a 8, de 3 a 7, de 3 a 6, de 4 a 6, de 3 a 5 o de 4 a 5 átomos de carbono de anillo. Los sistemas de anillos bicíclicos y tricíclicos incluyen sistemas de anillos de cicloalquilo puenteados, espiro y condensados. Los ejemplos de sistemas cicloalquilo de anillos bicíclicos y tricíclicos incluyen, pero no se limitan a, biciclo[2.1.1]hexanilo, biciclo[2.2.1]heptanilo, adamantilo y decalinilo.
El término "cicloalquenilo" tiene por objeto incluir grupos cicloalquilo no aromáticos que tienen al menos un doble enlace entre dos átomos de carbono. En algunas realizaciones, los grupos cicloalquenilo tienen uno, dos o tres dobles enlaces. En algunas realizaciones, los grupos cicloalquenilo tienen de 4 a 14, de 5 a 14, de 5 a 10, de 5 a 8 o de 5 a 6 átomos de carbono en el anillo o anillos. En algunas realizaciones, los grupos cicloalquenilo tienen 5, 6, 7 u 8 átomos de carbono de anillo. Los ejemplos de grupos cicloalquenilo incluyen ciclohexenilo, ciclopentenilo, ciclohexadienilo, butadienilo, pentadienilo y hexadienilo.
El término "arilo" tiene por objeto incluir grupos hidrocarburo aromáticos cíclicos que no contienen ningún heteroátomo de anillo. Los grupos arilo incluyen sistemas de anillo monocíclicos, bicíclicos y tricíclicos. Los ejemplos de grupos arilo incluyen, pero no se limitan a, fenilo, azulenilo, heptalenilo, bifenilo, fluorenilo, fenantrenilo, antracenilo, indenilo, indanilo, pentalenilo y naftilo. En algunas realizaciones, los grupos arilo tienen de 6 a 14, de 6 a 12 o de 6 a 10 átomos de carbono en el anillo o anillos. En algunas realizaciones, los grupos arilo son fenilo o naftilo. Los grupos arilo incluyen sistemas de anillos condensados aromáticosalifáticos. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, indanilo y tetrahidronaftilo.
El término "heterociclilo" tiene por objeto incluir sistemas de anillos no aromáticos que contengan 3 o más átomos de anillo, de los cuales uno o más son heteroátomos. En algunas realizaciones, el heteroátomo es nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, el grupo heterociclilo contiene uno, dos, tres o cuatro heteroátomos. En algunas realizaciones, los grupos heterociclilo incluyen anillos mono-, bi- y tricíclicos que tienen de 3 a 16, de 3 a 14, de 3 a 12, de 3 a 10, de 3 a 8 o de 3 a 6 átomos de anillo. Los grupos heterociclilo incluyen sistemas de anillos parcialmente insaturados y saturados, por ejemplo, imidazolinilo e imidazolidinilo. Los grupos heterociclilo incluyen sistemas de anillos condensados y unidos por puente que contienen un heteroátomo, por ejemplo, quinuclidilo. Los grupos heterociclilo incluyen, pero no se limitan a, aziridinilo, azetidinilo, azepanilo, diazepanilo, 1,3-dioxanilo, 1,3-dioxolanilo, isoxazolidinilo, morfolinilo, piperazinilo, piperidinilo, piranilo, pirazolidinilo, pirrolinilo, pirrolidinilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidrotienilo, tiadiazolidinilo y tritianilo.
El término "heteroarilo" tiene por objeto incluir sistemas de anillos aromáticos que contengan 5 o más átomos de anillo, de los cuales, uno o más sea un heteroátomo. En algunas realizaciones, el heteroátomo es nitrógeno, oxígeno o azufre. En algunas realizaciones, los grupos heteroarilo incluyen sistemas de anillos mono-, bi- y tricíclicos que tienen de 5 a 16, de 5 a 14, de 5 a 12, de 5 a 10, de 5 a 8 o de 5 a 6 átomos de anillo. Los grupos heteroarilo incluyen, pero no se limitan a, pirrolilo, pirazolilo, triazolilo, tetrazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, piridinilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, tiofenilo, benzotiofenilo, furanilo, benzofuranilo, indolilo, azaindolilo (pirrolopiridinilo), indazolilo, benzoimidazolilo, pirazolopiridinilo, triazolopiridinilo, benzotriazolilo, benzoxazolilo, benzotiazolilo, imidazopiridinilo, isoxazolopiridinilxantinilo, guaninilo, quinolinilo, isoquinolinilo, tetrahidroquinolinilo, quinoxalinilo y quinazolinilo. Los grupos heteroarilo incluyen sistemas de anillos condensados en los que todos los anillos son aromáticos, por ejemplo, indolilo, y sistemas de anillos condensados en los que sólo uno de los anillos es aromático, por ejemplo, 2,3-dihidroindolilo.
El término "halo" o "halógeno" tiene por objeto incluir F, CI, Br y I.
El término "heteroátomo" tiene por objeto incluir oxígeno, nitrógeno, azufre o fósforo. En algunas realizaciones, el heteroátomo se selecciona del grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno y azufre.
Como se emplea en esta memoria, el término "sustituido" tiene por objeto significar que uno o más átomos de hidrógeno en el grupo indicado se reemplazan por uno o más sustituyentes adecuados seleccionados independientemente, a condición de que no se supere la valencia normal de cada átomo al que esté unido el sustituyente o sustituyentes, y que la sustitución dé como resultado un compuesto estable. En algunas realizaciones, los sustituyentes opcionales en los compuestos descritos en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, halo, Cn , NO<2>, OH, NH<2>, NHR<100>, NR<100>R<200>, haloalquilo C<1>-<6>, haloalcoxi C<1>-<6>, C(O)NH<2>, C(O)NHR<100>, C(O)NR<100>R<200>, SO<2>R<100>, OR<100>, SR<100>, S(O)R<100>, C(O)R<100>y C<1-6>alifático; en donde R<100>y R<200>son cada uno independientemente C<1-6>alifático, por ejemplo, alquilo C<1>-<6>.
La expresión "grupo protector de carboxilo", como se emplea en esta memoria, tiene por objeto significar un grupo que puede retirarse fácilmente para proporcionar el grupo OH de un grupo carboxilo y protege al grupo carboxilo frente a reacciones no deseables durante los procedimientos de síntesis. Dichos grupos protectores se describen enProtective Groups in Organic Synthesiseditado por T. W. Greeneet al.(John Wiley & Sons, 1999) y"Amino Acid-Protecting Groups"de Fernando Albericio (con Albert Isidro-Llobet y Mercedes Álvarez)Chemical Reviews2009 (109) 2455-2504. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, grupos alquilo y sililo, por ejemplo, metilo, etilo, terc-butilo, metoximetilo, 2,2,2-tricloroetilo, bencilo, difenilmetilo, trimetilsililo y tercbutildimetilsililo, y similares.
La expresión "grupo protector de amina", como se emplea en esta memoria, tiene por objeto significar un grupo que puede retirarse fácilmente para proporcionar el grupo NH<2>de un grupo amina y protege al grupo amina frente a reacciones no deseables durante los procedimientos de síntesis. Dichos grupos protectores se describen enProtective Groups in Organic Synthesiseditado por T. W. Greeneet al.(John Wiley & Sons, 1999) y"Amino Acid-Protecting Groups"de Fernando Albericio (con Albert Isidro-Llobet y Mercedes Álvarez)Chemical Reviews2009 (109) 2455-2504. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, grupos acilo y aciloxi, por ejemplo, acetilo, cloroacetilo, tricloroacetilo, o-nitrofenilacetilo, o-nitrofenoxi-acetilo, trifluoroacetilo, acetoacetilo, 4-clorobutirilo, isobutirilo, picolinoílo, aminocaproílo, benzoílo, metoxicarbonilo, 9-fluorenilmetoxicarbonilo, 2,2,2-trifluoroetoxicarbonilo, 2-trimetilsililetoxi-carbonilo, terc-butiloxicarbonilo, benciloxicarbonilo, p-nitrobenciloxicarbonilo, 2,4-dicloro-benciloxicarbonilo y similares. Otros ejemplos incluyen Cbz (carboxibencilo), Nosilo (o- o p-nitrofenilsulfonilo), Bpoc (2-(4-bifenil)isopropoxicarbonilo) y Dde (1 -(4,4-dimetil-2,6-dioxohexilideno)etilo).
La expresión "grupo protector de carboxamida", como se emplea en esta memoria, tiene por objeto significar un grupo que puede retirarse fácilmente para proporcionar el grupo NH<2>de un grupo carboxamida y protege al grupo carboxamida frente a reacciones no deseables durante los procedimientos de síntesis. Dichos grupos protectores se describen enProtective Groups in Organic Synthesiseditado por T. W. Greeneet al.(John Wiley & Sons, 1999) y"Amino Acid-Protecting Groups"de Fernando Albericio (con Albert Isidro-Llobet y Mercedes Álvarez)Chemical Reviews2009 (109) 2455-2504. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, 9-xantenilo (Xan), tritilo (Trt), metiltritilo (Mtt), ciclopropildimetilcarbinilo (Cpd) y dimetilciclopropilmetilo (Dmcp).
Como se emplea en esta memoria, el término "y/o" significa "y" u "o", o ambos.
El término "(s)" que sigue a un sustantivo contempla la forma singular y plural, o ambas.
El término "éster" se refiere a un grupo ácido carboxílico en el que el hidrógeno del grupo hidroxilo se ha reemplazado por un grupo hidrocarburo saturado de cadena recta (lineal) o ramificado. Son ejemplos específicos de grupos alquilo metilo, etilo, propilo, iso-propilo, n-butilo, iso-butilo, sec-butilo, terc-butilo, npentilo, isopentilo, n-hexilo y 2,2-dimetilbutilo. El grupo alquilo puede ser un grupo alquilo C<1>-C<6>. Como se emplea en esta memoria una expresión que define los límites de un intervalo de longitud tal como, por ejemplo, "de 1 a 5" significa cualquier número entero de 1 a 5, es decir, 1, 2, 3, 4 y 5. En otras palabras, cualquier intervalo definido por dos números enteros explícitamente mencionados se entiende que comprende y divulga cualquier entero que defina dichos límites y cualquier número entero comprendido en dicho intervalo. El grupo alquilo puede ser un grupo alquilo ramificado.
Se prevé que la referencia a un intervalo de números descritos en la presente memoria (por ejemplo, de 1 a 10) incorpore también referencia a todos los números racionales dentro de ese intervalo (por ejemplo, 1, 1,1, 2, 3, 3,9, 4, 5, 6, 6,5, 7, 8, 9 y 10) y también cualquier intervalo de números racionales dentro de ese intervalo (por ejemplo, de 2 a 8, de 1,5 a 5,5 y de 3,1 a 4,7) y, por lo tanto, se describen por la presente expresamente todos los subintervalos de todos los intervalos expresamente descritos en la presente memoria. Estos son sólo ejemplos de lo que se pretende específicamente y todas las combinaciones posibles de valores numéricos entre el valor más bajo y el valor más alto enumerados deben considerarse expresamente indicadas en esta solicitud de manera similar.
Como se ha analizado anteriormente, los inventores han desarrollado y optimizado compuestos para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades o afecciones respiratorias, particularmente las asociadas a un agente infeccioso, tal como bacterias o virus. Específicamente, los compuestos pueden proporcionar una protección significativa contra la replicación vírica en el pulmón cuando dichos compuestos se administran en el tracto respiratorio superior. Estos compuestos pueden tener mayor eficacia que otros agonistas de TLR2 conocidos. La eficacia del agonista de TLR2 también puede producirse sin comprometer significativamente la especificidad de TLR y/o sin provocar una pérdida de peso significativa en los modelos animales descritos en la presente memoria. Además, los compuestos pueden demostrar una estabilidad favorable, p. ej., dentro de un entorno de formulación y/o matriz biológica, ya que pueden ser relativamente resistentes a la degradación por procesos hidrolíticos y/o enzimáticos. Los compuestos de la invención demuestran una estabilidad en solución mejorada en comparación con otros compuestos relacionados.
En un aspecto, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula (I):
en donde:
R21 se selecciona del grupo que consiste en H, -CH<2>OH, -CH<2>CH<2>OH, -CH(CH3)OH, -CH<2>OPO(OH)<2>, -CH<2>C(=O)NH<2>, -CH<2>CH<2>C(=O)OH y -CH<2>CH<2>C(=O)ORs, en donde uno cualquiera de los hidrógenos de alquilo puede reemplazarse por un halógeno;
R22 es H, C<1>-C<6>alifático, un grupo protector de amino, L3-C(=O)- o A2;
L1 y L2 son cada uno independientemente C<6>-C<21>alifático o C<5>-C<20>heteroalifático;
L3 es C<1>-C<21>alifático o C<2>-C<20>heteroalifático;
A2 es un aminoácido o un péptido;
R23 es H o C<1>-C<6>alifático;
R24a y R25a se seleccionan cada uno independientemente de C<1>-C<6>alifático y C<1>-C<6>heteroalifático y R24b y R25b se seleccionan cada uno independientemente de H, C<1>-C<6>alifático y C<1>-C<6>heteroalifático, o R24a y R24b junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un grupo cicloalquilo C<3-8>o heterociclilo de 3-8 miembros, y/o
R25a y R25b junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un grupo cicloalquilo C<3-8>o heterociclilo de 3-8 miembros;
X se selecciona de -S-, -S(=O)- y -S(=O)<2>-;
v es un número entero de 1 -3
R26 y R27 se seleccionan independientemente de H y C<1>-C<6>alifático;
Z1 y Z2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -C(=O)O-, -OC(=O)-, -C(=O)NR-, -NRC(=O)-, -C(=O)S-, -SC(=O)-, -OC(=O)O-, -NRC(=O)O-, -OC(=O)NR- y -NRC(=O)NR-; en donde cada R es independientemente H o C<1>-C<6>alifático;
PEG es un polietilenglicol;
en donde cualquier, alifático, heteroalifático, cicloalquilo y heterociclilo presente en cualquiera de R21, R22, R23, R24a, R24b, R25a, R25b, R26, R27, L1, L2 y L3, está opcionalmente sustituido.
R24a R24b R25a y R26b
Los compuestos de la invención poseen ramificación en el átomo de carbono unido a L1/L2 y Z1/Z2. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, se cree que la ramificación en esta posición proporciona impedimento estérico alrededor del grupo Z1/Z2 haciendo que los compuestos sean más resistentes a la degradación. Antes de la presente invención no se sabía si se toleraría la ramificación en esta posición y, sorprendentemente, se descubrió que, además de proporcionar una estabilidad aumentada de la solución, puede conservarse una actividad de TLR2 sustancial en comparación con los análogos que comprenden moléculas lipídicas de cadena lineal (es decir, no ramificadas) (p. ej., compuestos de fórmula (I) en donde R24a, R24b, R25a y R25b son cada uno H).
En algunas realizaciones, R24a y R25a se seleccionan cada uno independientemente de C<1>-C<6>alifático y C<1>-C<6>heteroalifático y R24b y R25b se seleccionan independientemente de H, C<1>-C<6>alifático y C<1>-C<6>heteroalifático. En algunas realizaciones, R24a y R24b junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un grupo cicloalquilo C<3-8>o heterociclilo de 3-8 miembros.
En algunas realizaciones, R25a y R25b junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un grupo cicloalquilo C<3-8>o heterociclilo de 3-8 miembros.
En algunas realizaciones, R24a es igual que R25a.
En algunas realizaciones, R24b es igual que R25b.
En algunas realizaciones, R24b y R25b son H.
En algunas realizaciones, R24a y R25a son cada uno independientemente C<1>-C<6>alifático. En estas realizaciones, R24a y R25a pueden ser cada uno independientemente un alquilo C<1>-C<6>. En algunas realizaciones, R24a y R25a son cada uno metilo.
En algunas realizaciones, R24a y R24b junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un cicloalquilo C<3-8>o un heterociclilo de 3-8 miembros seleccionado de: ciclohexanilo, piperidinilo, ciclopentanilo, cicloheptanilo, epóxido, ciclopropilo, ciclobutilo, oxiranilo, aziridinilo y piranilo.
En algunas realizaciones, R25a y R25b junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un cicloalquilo C<3-8>o un heterociclilo de 3-8 miembros seleccionado de: ciclohexanilo, piperidinilo, ciclopentanilo, cicloheptanilo, epóxido, ciclopropilo, ciclobutilo, oxiranilo, aziridinilo y piranilo.
R26, R27 y v
En algunas realizaciones, R26 y R27 son iguales.
En algunas realizaciones, R26 y R27 se seleccionan de H y metilo.
En algunas realizaciones, uno de R26 y R27 es H.
En algunas realizaciones, R26 es H.
En algunas realizaciones, R27 es H.
En algunas realizaciones, R26 y R27 son cada uno H.
En algunas realizaciones, v es un número entero seleccionado de 1, 2 o 3. En algunas realizaciones, v es 1 o 2. En algunas realizaciones, v es 1. En algunas realizaciones, v es 2.
X
En algunas realizaciones, X es -S-.
En algunas realizaciones, X es -S(O)- o -S(=O)<2>-. En algunas realizaciones, X es -S(O)-. En algunas realizaciones, X es -SO<2>-.
R22 y R23
En algunas realizaciones, R22 se selecciona de H, C<1>-C<6>alifático, L3-C(=O)- o A2.
En algunas realizaciones, R22 se selecciona de H, alquilo C<1-6>, un grupo protector de amino, L3-C(=O)- o A2. En algunas realizaciones, R22 es un grupo protector de amino. Preferiblemente, el grupo protector de amino es adecuado para el acoplamiento de péptidos en fase sólida.
En algunas realizaciones, R22 se selecciona de H, C<1>-C<6>alifático y L3-C(=O)-, preferiblemente H.
En algunas realizaciones, R22 se selecciona de H, alquilo C<1>-C<6>, -alquilo C(=O)C<1>-C<6>o -alquilo C(=O)Cn-C19. En algunas realizaciones, R23 es H o alquilo C<1-6>, preferiblemente R23 es H o metilo, más preferiblemente R23 es H.
R21
En algunas realizaciones, R21 es -CH<2>OH.
L1 y L2
En algunas realizaciones, L1 y L2 se seleccionan independientemente de C<5>-C<21>alifático o C<4>-C<20>heteroalifático. En algunas realizaciones, L1 y L2 se seleccionan independientemente de C<10>-C<18>alifático o C<10>-C<18>heteroalifático. En algunas realizaciones, L1 y L2 se seleccionan independientemente de alquilo C<14>y alquilo C<15>. Normalmente, L1 y L2 representan grupos alifáticos de cadena lineal de cualquiera de las longitudes especificadas descritas en la presente memoria. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la única ramificación en las moléculas lipídicas se proporciona en R24a, R24b, R25a y R25b.
Z 1 y Z2
En algunas realizaciones, Z1 y Z2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -C(=O)O-, -OC(=O)-, -C(=O)NR-, -NRC(=O)-, -C(=O)S-, -SC(=O)-, -OC(=O)O-, -NRC(=O)O-, -OC(=O)NR- y -NRC(=O)NR-, en donde cada R es independientemente H o C<1>-C<6>alifático.
En algunas realizaciones, Z1 y Z2 son iguales.
En algunas realizaciones, Z1 y Z2 se seleccionan independientemente de -C(O)O- y -OC(O)-.
En algunas realizaciones, Z1 y Z2 son cada uno -C(O)O-. En estas realizaciones, el carbono de carbonilo está unido directamente al átomo de carbono unido a L1, R24a y R24b o L2, R25a y R25b. En estas realizaciones, el compuesto puede ser de fórmula (II):
en donde cada uno de R21, R22, R23, R24a, R24b, R25a, R25b, R26, R27, v, X, L1, L2 y PEG tienen el significado definido para cualquier compuesto de la invención descrito en la presente memoria, y en donde cualquier, alifático, heteroalifático, cicloalquilo y heterociclilo presente en cualquiera de R21, R22, R23, R24a, R24b, R25a, R25b, r26, r27, l 1, l2 y L3, está opcionalmente sustituido.
PEG
En los compuestos de la invención PEG representa un polietilenglicol. El polietilenglicol incluye polímero de cualquier longitud de óxido de etileno. El polietilenglicol también puede incluir polietilenglicol sustituido ("PEG sustituido"). En algunas realizaciones, el PEG sustituido puede definirse por las fórmulas B-I o B-II como se describe en la presente memoria.
En algunas realizaciones, el PEG es un polietilenglicol sustituido según la siguiente fórmula B-I:
en donde
n es de 3 a 100;
m es 1, 2, 3 o 4;
p es 2, 3 o 4;
q es nulo o 1;
R<3>es H, -NH<2>u -OH, en donde cuando q es nulo, R<3>es H y cuando q es 1, R<3>es -NH<2>u -OH;
L es nulo o consiste en 1 a 10 unidades, en donde cada unidad es un alfa aminoácido natural o deriva de un alfa aminoácido natural, y tiene la fórmula:
en donde R<4>es H; y
R<5>es la cadena lateral o segundo hidrógeno del aminoácido.
En algunas realizaciones, el PEG es un polietilenglicol sustituido según la siguiente fórmula B-II:
en donde
p es 2, 3 o 4;
n es de 3 a 100;
m es 1, 2, 3 o 4;
t es 2, 3 o 4;
k es de 3 a 100;
h es 1, 2, 3 o 4;
q es nulo o 1;
en donde cuando q es 1, R<3>es -NH<2>u -OH;
en donde cuando q es nulo, R<3>es H;
L es nulo o consiste en 1 a 10 unidades, en donde cada unidad es un alfa aminoácido natural o deriva de un alfa aminoácido natural, y tiene la fórmula:
en donde R4 es H; y
R<5>es la cadena lateral o segundo hidrógeno del aminoácido.
En algunas realizaciones del PEG sustituido de fórmula B-I o B-II, q es 1.
En el PEG sustituido o de fórmula B-I o B-II, n es un número entero de 3 a 100. En algunas realizaciones, n puede ser cualquier subintervalo dentro de 3 a 100. En algunas realizaciones, n tiene un valor mínimo de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 15, 20, 24, 25, 26 o 27. En algunas realizaciones, n tiene un valor máximo de 100, 99, 98, 95, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 29, 28, 27, 25, 20, 15, 14, 13, 12 u 11. En algunas realizaciones, n puede estar comprendido entre cualquiera de estos valores mínimos y cualquiera de estos valores máximos, por ejemplo, de 4 a 100, de 5 a 100, de 10 a 100 o de 10 a 30.
En algunas realizaciones del PEG sustituido de fórmula B-I o B-II, n puede ser de 10 a 14, tal como 11, o de 24 a 30, tal como 27.
En algunas realizaciones del PEG sustituido de fórmula B-I o B-II, m es de 1 a 3, tal como 2.
En algunas realizaciones del PEG sustituido de fórmula B-I o B-II, cuando q es 1, R<3>es -NH<2>.
En algunas realizaciones del PEG sustituido de fórmula B-I o B-II, L es un resto de alfa aminoácido natural.Realizaciones adicionales
En algunas realizaciones, la invención proporciona un compuesto de fórmula (I) en donde:
X es S;
v es un número entero seleccionado de 1 y 2;
R26 y R27 son H;
Z1 y Z2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -C(=O)O-, -OC(=O)-, -C(=O)NR-, -NRC(=O)-, -C(=O)S-, -SC(=O)-, -OC(=O)O-, -NRC(=O)O-, -OC(=O)NR- y - NRC(=O)NR-; en donde cada R es independientemente H o C<1>-C<6>alifático;
R22 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo C<1>-C<6>, -alquilo C(=O)C<1>-C<6>o -alquilo C(=O)Cn-C19; y L1 y L2 se seleccionan independientemente de C<10>-C<18>alifático o C<10>-C<18>heteroalifático.
En algunas realizaciones, la invención proporciona un compuesto de fórmula (I) en donde:
R24b y R25b son H;
R24a y R25a se seleccionan de alquilo C<1-6>y heteroalquilo C<1>-<6>;
X es S;
v es un número entero seleccionado de 1 y 2;
R26 y R27 son H;
Z1 y Z2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -C(=O)O-, -OC(=O)-, -C(=O)NR-, -NRC(=O)-, -C(=O)S-, -SC(=O)-, -OC(=O)O-, -NRC(=O)O-, -OC(=O)NR- y - NRC(=O)NR-; en donde cada R es independientemente H o C<1>-C<6>alifático;
R22 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo C<1>-C<6>, -alquilo C(=O)C<1>-C<6>o -alquilo C(=O)Cn-C19; y
L1 y L2 se seleccionan independientemente de C<10>-C<18>alifático o C<10>-C<18>heteroalifático.
En algunas realizaciones, la invención proporciona un compuesto de fórmula (I) en donde:
R24b y R25b son H;
R24a y R25a se seleccionan de alquilo C<1>-<6>;
X es S;
v es un número entero seleccionado de 1 y 2;
R26 y R27 son H;
Z1 y Z2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -C(=O)O-, -OC(=O)-, -C(=O)NR-, -NRC(=O)-, -C(=O)S-, -SC(=O)-, -OC(=O)O-, -NRC(=O)O-, -OC(=O)NR- y - NRC(=O)NR-; en donde cada R es independientemente H o C<1>-C<6>alifático;
R22 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo C<1>-C<6>, -alquilo C(=O)C<1>-C<6>o -alquilo C(=O)Cn-C19; y
L1 y L2 se seleccionan independientemente de C<10>-C<18>alifático o C<10>-C<18>heteroalifático.
En algunas realizaciones, la invención proporciona un compuesto de fórmula (I) en donde:
R24b y R25b son H;
R24a y R25a son cada uno metilo;
X es S;
v es un número entero seleccionado de 1 y 2;
R26 y R27 son H;
Z1 y Z2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -C(=O)O-, -OC(=O)-, -C(=O)NR-, -NRC(=O)-, -C(=O)S-, -SC(=O)-, -OC(=O)O-, -NRC(=O)O-, -OC(=O)NR- y - NRC(=O)NR-; en donde cada R es independientemente H o C<1>-C<6>alifático;
R22 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo C<1>-C<6>, -alquilo C(=O)C<1>-C<6>o -alquilo C(=O)Cn-C19; y
L1 y L2 se seleccionan independientemente de C<10>-C<18>alifático o C<10>-C<18>heteroalifático.
En algunas realizaciones, la invención proporciona un compuesto de fórmula (I) en donde:
R24b y R25b son H;
R24a y R25a son cada uno metilo;
X es S;
v es un número entero seleccionado de 1 y 2;
R26 y R27 son H;
Z1 y Z2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -C(=O)O-, -OC(=O)-, -C(=O)NR-, -NRC(=O)-, -C(=O)S-, -SC(=O)-, -OC(=O)O-, -NRC(=O)O-, -OC(=O)NR- y - NRC(=O)NR-; en donde cada R es independientemente H o C<1>-C<6>alifático;
R22 se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo C<1>-C<6>, -alquilo C(=O)C<1>-C<6>o -alquilo C(=O)Cn-C19; y
L1 y L2 se seleccionan independientemente de alquilo C<10>-C<18>.
En algunas realizaciones, la invención proporciona un compuesto de fórmula (I) en donde:
R24b y R25b son H;
R24a y R25a son cada uno metilo;
X es S;
v es un número entero seleccionado de 1 y 2;
R26 y R27 son H;
Z1 y Z2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -C(=O)O-;
R22 y R23 son cada uno H; y
L1 y L2 se seleccionan independientemente de alquilo C<10>-C<18>.
En algunas realizaciones, la invención proporciona un compuesto de fórmula (I) en donde:
R24b y R25b son H;
R24a y R25a son cada uno metilo;
X es S;
v es un número entero seleccionado de 1 y 2;
R26 y R27 son H;
Z1 y Z2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -C(=O)O-;
R21 es -CH<2>OH;
R22 y R23 son cada uno H; y
L1 y L2 se seleccionan independientemente de alquilo C<10>-C<18>.
En algunas realizaciones, R24b y R25b son cada uno H. En estas realizaciones, el compuesto de fórmula (I) puede ser un compuesto de fórmula (III):
en donde cada uno de R21, R22, R23, R26, R27, v, X, L1, L2 y PEG tienen los significados proporcionados en cualquier realización descrita en la presente memoria y
R24 y R25 se seleccionan independientemente de C<1>-C<6>alifático y C<1>-C<6>heteroalifático, en donde cualquier alifático, heteroalifático, cicloalquilo y heterociclilo, presente en cualquiera de R21, R22, R23, R24, R25, R26, R27, L1, L2 y L3, está opcionalmente sustituido.
R24 y R25 pueden ser cualquier grupo descrito en la presente memoria para R24a y R25a, respectivamente. En algunas realizaciones, R24 y R25 son iguales.
En algunas realizaciones, R24 y R25 se seleccionan independientemente de alquilo C<1>-C<6>y C<1>-C<6>heteroalifático. En algunas realizaciones, R24 y R25 son independientemente alquilo C<1-6>.
En algunas realizaciones, R24 y R25 son independientemente alquilo C<1-4>.
En algunas realizaciones, R24 y R25 son cada uno metilo.
Formulaciones
La presente invención también proporciona composiciones que contienen un compuesto de la invención o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Cualquiera de los compuestos descritos en la presente memoria o variaciones de la misma pueden incluirse en las composiciones de la invención. Estas composiciones pueden denominarse también composiciones farmacéuticas.
Como se ha analizado anteriormente, la presente invención proporciona compuestos agonistas de la proteína Receptor 2 similar a Toll (TLR2) y sus composiciones. En seres humanos, TLR2 desempeña una función fundamental en el reconocimiento de patógenos y la activación de la respuesta inmunitaria innata. Está codificada por el gen TLR2 y se expresa en la superficie de células específicas.
Sin desear quedar ligados a teoría o modo de acción alguno, se cree que los compuestos de la invención descritos en la presente memoria son agonistas de TLR2 y muestran actividad uniéndose a TLR2 y estimulando el sistema inmunitario innato. El sistema inmunitario innato forma una defensa inmediata contra agentes patógenos tales como los que infectan y se replican en las células que revisten las vías respiratorias. Las investigaciones han demostrado que los agentes que estimulan el sistema inmunitario innato pueden ser útiles para limitar las infecciones respiratorias, que pueden proporcionar protección frente a las infecciones tanto en aislamiento como durante el período entre la inoculación y la formación de anticuerpos y células inmunitarias. Dichos agentes se consideran útiles para el tratamiento y/o la prevención de infecciones respiratorias, o afecciones respiratorias provocadas por o asociadas a agentes infecciosos tales como un virus (tales como la Gripe A) o una bacteria (tal como la neumonía) de una manera no específica de antígeno.
A este respecto, los compuestos de la invención como se describe en la presente memoria pueden tener una actividad, tanto la activación del TLR2 humano como la inhibición de la progresión vírica, que sea al menos comparable a otros agonistas de TLR2 tales como Pam2Cys-Ser-K4, Pam2Cys-Ser-Ser-PEG y Pam3Cys-Ser-PEG.
Como se emplea en esta memoria, "Ser" se refiere al aminoácido serina y "Cys" se refiere al aminoácido cisteína.
Como se emplea en esta memoria, "PEG" se refiere a una fracción que comprende o que consiste en una sección polimérica de polietilenglicol. A menos que se defina otra cosa, la referencia a "PEG" incluye polímero de cualquier longitud de óxido de etileno. La referencia a PEG incluye también PEG sustituido. En algunas realizaciones, el PEG sustituido puede definirse por las fórmulas B-I o B-II como se describe en la presente memoria.
En un aspecto, por lo tanto, la presente invención proporciona un método de tratamiento y/o prevención de una enfermedad, que comprende suscitar una respuesta inmunitaria innata en un sujeto mediante la administración de una cantidad eficaz de un compuesto de la invención como se describe en la presente memoria o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo al sujeto que lo necesite.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de tratamiento y/o prevención de una enfermedad provocada por un agente infeccioso, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un compuesto de la invención como se describe en la presente memoria o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de tratamiento y/o prevención de una enfermedad o afección respiratoria asociada a una infección vírica o bacteriana, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite un compuesto de la invención como se describe en la presente memoria o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de tratamiento y/o prevención de una infección respiratoria, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite un compuesto de la invención como se describe en la presente memoria o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo. Preferiblemente, el método comprende además una etapa de identificación de un sujeto que tiene una infección respiratoria.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para reducir la inflamación de las vías respiratorias, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite un compuesto de la invención como se describe en la presente memoria o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo.
La presente invención también proporciona un método de mejora de la capacidad de un sujeto para controlar una enfermedad o afección respiratoria durante una infección vírica respiratoria, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesite un compuesto de la invención como se describe en la presente memoria o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo. Preferiblemente, la infección no es una infección por rinovirus.
La presente invención también proporciona un método de tratamiento y/o prevención de una enfermedad o afección asociada al receptor TLR2, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesite un compuesto de la invención como se describe en la presente memoria o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo.
La presente invención también proporciona un método de agonismo de la actividad de TLR2 en una célula, comprendiendo el método poner en contacto la célula con un compuesto de la invención como se describe en la presente memoria o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas realizaciones, la célula se pone en contacto con el compuesto mediante la administración del compuesto o sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo, o una composición que comprenda el compuesto, sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo, a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, la célula se proporciona en forma de un cultivo celular.
En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de un compuesto de la invención como se describe en la presente memoria o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo en la preparación de un medicamento para suscitar una respuesta inmunitaria innata en un sujeto.
En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de un compuesto de la invención como se describe en la presente memoria o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo en la preparación de un medicamento para tratar y/o prevenir una enfermedad provocada por un agente infeccioso. En otro aspecto, la presente invención proporciona además el uso de un compuesto de la invención como se describe en la presente memoria o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo en la preparación de un medicamento para tratar y/o prevenir una enfermedad o afección respiratoria asociada a una infección vírica o bacteriana en un sujeto.
En otro aspecto, la presente invención proporciona además el uso de un compuesto de la invención como se describe en la presente memoria o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo en la preparación de un medicamento para tratar y/o prevenir una infección respiratoria en un sujeto.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona el uso de un compuesto de la invención como se describe en la presente memoria o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo en la preparación de un medicamento para tratar y/o prevenir una infección respiratoria.
En otro aspecto, la presente invención proporciona además el uso de un compuesto de la invención como se describe en la presente memoria o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo en la preparación de un medicamento para reducir la inflamación de las vías respiratorias.
En otro aspecto, la presente invención proporciona además el uso de un compuesto de la invención como se describe en la presente memoria o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo en la preparación de un medicamento para mejorar la capacidad de un sujeto para controlar una enfermedad o afección respiratoria durante una infección vírica respiratoria. Preferiblemente, la infección no es una infección por rinovirus.
En otro aspecto, la presente invención proporciona además el uso de un compuesto de la invención como se describe en la presente memoria o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo en la preparación de un medicamento para tratar y/o prevenir una enfermedad o afección asociada al receptor TLR2. En un aspecto, la presente invención proporciona el uso de un compuesto de la invención como se describe en la presente memoria o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo, para suscitar una respuesta inmunitaria innata en un sujeto.
En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de un compuesto de la invención como se describe en la presente memoria o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo, para impedir una enfermedad provocada por un agente infeccioso, en un sujeto.
En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de un compuesto de la invención como se describe en la presente memoria o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo, para tratar y/o prevenir una enfermedad o afección respiratoria asociada a una infección vírica o bacteriana en un sujeto. En un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de un compuesto de la invención como se describe en la presente memoria o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo, para (a) tratar y/o prevenir una infección respiratoria en un sujeto; (b) reducir la inflamación de las vías respiratorias en un sujeto; (c) controlar una enfermedad o afección respiratoria durante una infección vírica respiratoria en un sujeto; (d) para tratar y/o prevenir una enfermedad o afección asociada al receptor TLR2.
En cualquiera de estos aspectos, el compuesto puede administrarse en una composición. Normalmente, la composición comprende además un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición puede formularse para la administración en las vías respiratorias superiores y/o inferiores, por ejemplo, por inhalación o por vía intranasal.
En cualquiera de los aspectos de la invención, el compuesto de la invención como se describe en la presente memoria o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo puede conjugarse con otros compuestos. Otros compuestos son cualquiera de los descritos en la presente memoria.
En cualquiera de los aspectos de la invención, el compuesto de la invención como se describe en la presente memoria o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo se administra una vez al día o una vez a la semana.
En cualquiera de los aspectos de la invención, cuando se prevea o sea necesaria la prevención o profilaxis, el compuesto se administra al sujeto antes de que aparezca cualquier síntoma de infección vírica detectable clínica o bioquímicamente.
En cualquiera de los aspectos de la invención, administración del compuesto de la invención como se describe en la presente memoria o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo a un sujeto reduce la carga vírica en un sujeto. Preferiblemente, la carga vírica se reduce en las vías respiratorias, por ejemplo, las vías respiratorias superiores y/o inferiores. Preferiblemente, la carga vírica se reduce en los pulmones.
En cualquiera de los aspectos de la presente memoria, el agente infeccioso puede ser un virus. Preferiblemente, el virus es uno asociado a la infección de las vías respiratorias. Incluso más preferiblemente, el virus es la gripe. En cualquier aspecto, el virus no es un rinovirus.
La influenza (habitualmente denominada "gripe") es una enfermedad infecciosa provocada por virus ARN de la familiaOrthomyxoviridae(los virus de la gripe) que afecta a aves y mamíferos. Los síntomas más comunes de la enfermedad son escalofríos, fiebre, dolor de garganta, dolores musculares, cefalea intensa, tos, debilidad/fatiga y malestar general.
Los virus de la gripe constituyen tres de los cinco géneros de la familiaOrthomyxoviridae.Los virus de la gripe de tipo A y de tipo B cocirculan durante las epidemias estacionales y pueden provocar una infección gripal grave. La infección por el virus de la gripe de tipo C es menos frecuente, pero puede ser grave y provocar epidemias locales.
El virus de la gripe de tipo A puede subdividirse en diferentes serotipos o subtipos basándose en la respuesta de los anticuerpos a estos virus. Los virus de la gripe A se dividen en subtipos basándose en dos proteínas de la superficie del virus: la hemaglutinina (H) y la neuraminidasa (N). Existen 18 subtipos diferentes de hemaglutinina y 11 subtipos diferentes de neuraminidasa. (H1 a H18 y N1 a N11, respectivamente). Los subtipos que se han confirmado en seres humanos son H1N1, H1N2, H2N2, H3N2, H5N1, H7N2, H7N3, H7N7, H9N2 y H10N7.
La gripe tiene un enorme impacto en la salud pública, con graves repercusiones económicas además de los devastadores problemas sanitarios, incluyendo la morbilidad e incluso la mortalidad. Por consiguiente, se necesitan agentes terapéuticos que puedan prevenir la infección o reducir la gravedad de la infección en los individuos.
En cualquier aspecto o realización de la invención, la infección gripal para la que se requiere tratamiento o prevención es una infección por un virus seleccionado del grupo que consiste en los tipos de gripe A, B o C.
La expresión "enfermedad respiratoria" o "afección respiratoria" se refiere a cualquiera de las diversas dolencias que implican inflamación y afectan a un componente del sistema respiratorio, incluyendo las vías respiratorias superiores (incluyendo la cavidad nasal, la faringe y la laringe) e inferiores (incluyendo la tráquea, los bronquios y los pulmones). La inflamación de las vías respiratorias superiores e inferiores puede estar asociada a o ser provocada por una infección vírica o un alérgeno. Se espera que la actividad antiinflamatoria de los compuestos, ya sea solos o cuando se coadministran con un glucocorticoide, los haga particularmente adecuados para el tratamiento de estas enfermedades o afecciones.
Un síntoma de enfermedad respiratoria puede incluir la tos, el exceso de producción de esputo, la sensación de falta de aire o la opresión torácica con sibilancias audibles. La capacidad de ejercicio puede ser bastante limitada. En el asma, el FEV1,0 (volumen espiratorio forzado en un segundo, por sus siglas en inglés) como porcentaje del predicho nomográficamente basándose en el peso, la altura y la edad, puede disminuir, al igual que el caudal espiratorio máximo en una espiración forzada. En la EPOC, el FEV1,0 como cociente de la FVC (capacidad vital forzada, por sus siglas en inglés) se reduce normalmente a menos de 0,7. La repercusión de cada una de estas afecciones puede medirse también por días de baja laboral/escolar, sueño perturbado, necesidad de fármacos broncodilatadores, necesidad de glucocorticoides, incluyendo los glucocorticoides orales.
La existencia, la mejora, el tratamiento o la prevención de una enfermedad respiratoria puede determinarse mediante cualquier método clínico o bioquímico pertinente del sujeto o una biopsia del mismo. Por ejemplo, un parámetro medido puede ser la presencia o el grado de función pulmonar, signos y síntomas de obstrucción; tolerancia al ejercicio; despertares nocturnos; días perdidos en la escuela o el trabajo; uso de broncodilatadores; dosis de corticoesteroides inhalados (ICS, por sus siglas en inglés); uso de glucocorticoides orales (GC, por sus siglas en inglés); necesidad de otros medicamentos; necesidad de tratamiento médico; ingreso hospitalario.
Como se emplea en esta memoria, el término infección respiratoria significa una infección por virus o bacterias en cualquier parte de las vías respiratorias. Los ejemplos de infección respiratoria incluyen, pero no se limitan a, resfriados, sinusitis, infección de garganta, amigdalitis, laringitis, bronquitis, neumonía o bronquiolitis.
Preferiblemente, en cualquier realización de la invención la infección respiratoria es un resfriado.
Puede identificarse que un individuo tiene una infección del tracto respiratorio mediante ensayos víricos y puede presentar síntomas de picor de ojos, ojos llorosos, secreción nasal, congestión nasal, estornudos, dolor de garganta, tos, cefalea, fiebre, malestar, fatiga y debilidad. En un aspecto, un sujeto que tiene una infección respiratoria no puede tener ninguna otra afección respiratoria. La detección de la presencia o cantidad de virus puede realizarse mediante PCR/secuenciación de ARN aislado de muestras clínicas (lavado nasal, esputo, BAL (lavado broncoalveolar, por sus siglas en inglés) o serología.
La expresión "farmacéuticamente aceptable" puede usarse para describir cualquier sal, hidrato o profármaco farmacéuticamente aceptable, o cualquier otro compuesto que, tras ser administrado a un sujeto, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) un compuesto de la invención como se describe en la presente memoria, o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo, o un metabolito activo o residuo del mismo.
Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas pueden incluir, pero no se limitan a, sales de ácidos inorgánicos farmacéuticamente aceptables tales como ácidos clorhídrico, sulfúrico, fosfórico, nítrico, carbónico, bórico, sulfámico e hidrobrómico, o sales de ácidos orgánicos farmacéuticamente aceptables tales como ácidos acético, propiónico, butírico, tartárico, maleico, hidroximaleico, fumárico, málico, cítrico, láctico, múcico, glucónico, benzoico, succínico, oxálico, fenilacético, metanosulfónico, toluenosulfónico, bencenosulfónico, salicílico, sulfanílico, aspártico, glutámico, edético, esteárico, palmítico, oleico, láurico, pantoténico, tánico, ascórbico y valérico.
Las sales de bases pueden incluir, pero no se limitan a, las formadas con cationes farmacéuticamente aceptables, tales como sodio, potasio, litio, calcio, magnesio, cinc, amonio, alquilamonio tales como sales formadas a partir de trietilamina, alcoxiamonio tales como las formadas con etanolamina y sales formadas a partir de etilendiamina, colina o aminoácidos tales como arginina, lisina o histidina. La información general sobre los tipos de sales farmacéuticamente aceptables y su formación es conocida por los expertos en la técnica y se describe tal cual en textos generales tales como"Handbookof Pharmaceuticalsalts"P.H.Stahl, C. G. Wermuth, 1.a edición, 2002, Wiley-VCH.
En el caso de compuestos que son sólidos, los expertos en la técnica comprenderán que los compuestos, agentes, solvatos y sales inventivos pueden existir en diferentes formas cristalinas o polimórficas, todas ellas previstas dentro del alcance de la presente invención y de las fórmulas especificadas.
El término "polimorfo" incluye cualquier forma cristalina de compuestos de la invención como se describe en la presente memoria, tales como formas anhidras, formas hídricas, formas solvatadas y formas solvatadas mixtas.
Se entenderá que los compuestos de la invención pueden poseer un centro quiral y, por lo tanto, pueden existir en una configuraciónRo S. Los compuestos pueden presentarse en forma de racemato o en forma enatio o diastereo enriquecida. Las formas enantio y diastereo enriquecidas de los compuestos pueden obtenerse mediante síntesis asimétrica, la incorporación de materiales de agrupamiento quiral o a través de una resolución estereoselectiva. Por lo tanto, los compuestos pueden proporcionarse como enantiómero o diastereómero purificado, o como mezcla de cualquier relación de los mismos. Los isómeros pueden separarse convencionalmente mediante métodos cromatográficos o usando un agente de resolución. Como alternativa, los isómeros individuales pueden prepararse mediante síntesis asimétrica usando intermedios quirales. Cuando el compuesto tiene un doble enlace carbono-carbono, puede presentarse en formaZoEy todas las formas isoméricas de los compuestos que se incluyen en la presente invención.
Los compuestos de la invención tienen por objeto incluir, cuando corresponda, formas solvatadas y no solvatadas de los compuestos. Como se emplea en esta memoria, el término "solvato" se refiere a un complejo de estequiometría variable formado por asociación de un disolvente con un compuesto de la invención. Por lo tanto, el solvato puede comprender cantidades subestequiométricas del disolvente, cantidades equimolares del disolvente o cantidades superestequiométricas del disolvente con respecto al compuesto de la invención. Dichos disolventes para los fines de la invención no pueden interferir con la actividad biológica del soluto. Los ejemplos de disolventes adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, metanol, etanol y ácido acético. Preferiblemente, el disolvente utilizado es un disolvente farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de disolventes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, sin limitación, agua, etanol y ácido acético. Lo más preferiblemente el disolvente utilizado es agua. Los solvatos en donde el disolvente es agua pueden denominarse hidratos.
Los grupos básicos que contienen nitrógeno pueden cuarternizarse con agentes tales como haluro de alquilo inferior, tales como cloruros bromuros y yoduros de metilo, etilo, propilo y butilo; sulfatos de dialquilo tales como sulfato de dimetilo y dietilo; y otros.
Los compuestos como se describe en la presente memoria incluyen también variaciones isotópicas, tales como el reemplazo del hidrógeno por deuterio.
Los compuestos de la presente invención pueden existir y aislarse en formas ópticamente activas y racémicas. Como se entendería por un experto en la técnica, la presente invención tiene por objeto abarcar cualquier forma racémica, ópticamente activa o estereoisomérica, o mezclas de las mismas, de compuestos de la invención que poseen las propiedades útiles descritas en la presente memoria. Es bien sabido en la técnica cómo preparar dichas formas (por ejemplo, mediante resolución de mezclas racémicas por recristalización, mediante síntesis a partir de materiales de partida ópticamente activos, por síntesis quiral o por separación cromatográfica quiral). Los compuestos de fórmula (I) contienen al menos 6 centros estereogénicos potenciales basándose en la selección de sustituyentes. Estos centros se designan con un * en la fórmula (I*) a continuación.
en donde R22, R23, v, X, Z1, Z2, L1 y L1 tienen los significados indicados anteriormente, y en donde R24a es diferente de R24b, R25a es diferente de R25b, R21 no es H y R26 es diferente de R27. Cualquiera de estos estereocentros puede estar en la configuración R o S.
En algunas realizaciones, R26 y R27 son iguales (p. ej., cada uno es H). En estas realizaciones, los estereocentros potenciales restantes se indican con un * en la siguiente fórmula (I**):
En algunas realizaciones, el compuesto de fórmula (I) es quiral con las conformaciones mostradas en la fórmula (IV):
en donde cada uno de R21, R22, R23, R24a, R24b, R25a, R25b, X, Z1, Z2, v, L1, L2 y PEG tienen los significados proporcionados en cualquier compuesto de la invención, y en donde cualquier alifático, heteroalifático, cicloalquilo y heterociclilo presente en cualquiera de R21, R22, R23, R24a, R24b, R25a, R25b, R26, R27, L1, L2 y L3, está opcionalmente sustituido.
En cualquier aspecto de la presente invención, el 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más del 99 % del compuesto presente en una composición es el diastereómero R alrededor de uno o más de los centros quirales indicados * en la fórmula (I*) o (I**) del compuesto descrito en la presente memoria.
En cualquier aspecto de la presente invención, el 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más del 99 % del compuesto presente en una composición es el diastereómero S alrededor de uno o más de los centros quirales indicados * en la fórmula (I*) o (I**) del compuesto descrito en la presente memoria.
Los compuestos de la invención muestran una estabilidad mejorada en solución en condiciones de degradación acelerada con respecto a otros compuestos relacionados. La estabilidad de la solución puede evaluarse midiendo la concentración del compuesto en una solución el día 0 y comparando la concentración del compuesto después de un período de tiempo, tal como 14 días. La estabilidad de la solución puede evaluarse en condiciones ambientales, por ejemplo, 25 °C y 65 % de humedad relativa, o en condiciones aceleradas, por ejemplo, 40 °C y 75 % de humedad relativa. Normalmente, una estabilidad aceptable para un compuesto de interés para las indicaciones de la invención cuando se almacena durante 14 días en solución en condiciones aceleradas sería la retención de al menos el 80 % de concentración en la solución del compuesto con respecto a la concentración inicial del compuesto en la solución. Normalmente, la solución puede ser una solución salina (por ejemplo, NaCl al 0,9 % ac.) o una solución salina tamponada con fosfato (PBS; p. ej., pH 7,4). En algunas realizaciones, la cantidad de los compuestos de la invención después de 14 días de almacenamiento en tampón PBS pH 7,4 es al menos aproximadamente el 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 % o superior con respecto a la cantidad de compuesto detectada en la solución el día 0.
Un "profármaco" es un compuesto que puede no satisfacer totalmente los requisitos estructurales de los compuestos proporcionados en la presente memoria, pero se modificain vivo,después de su administración a un sujeto o paciente, para producir un compuesto de la invención como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, un profármaco puede ser un derivado acilado de un compuesto como se proporciona en la presente memoria. Los profármacos incluyen compuestos en donde los grupos hidroxi, carboxi, amina o sulfhidrilo están unidos a cualquier grupo que, cuando se administra a un sujeto mamífero, se escinde para formar un grupo hidroxi, carboxi, amino o sulfhidrilo libre, respectivamente. Los ejemplos de profármacos incluyen, pero no se limitan a, derivados de acetato, formiato, fosfato y benzoato de grupos funcionales de alcohol y amina dentro de los compuestos proporcionados en la presente memoria. Los profármacos de los compuestos proporcionados en la presente memoria pueden prepararse modificando grupos funcionales presentes en los compuestos de manera que las modificaciones se escindanin vivopara generar los compuestos precursores.
Los profármacos incluyen compuestos en donde un resto de aminoácido, o una cadena polipeptídica de dos o más (p. ej., dos, tres o cuatro) restos de aminoácidos unidos covalentemente a grupos amino y amido libres de compuestos de la invención. Los restos de aminoácidos incluyen los 20 aminoácidos naturales habitualmente designados por símbolos de tres letras y también incluyen, 4-hidroxiprolina, hidroxilisina, demosina, isodemosina, 3-metilhistidina, norvlina, beta-alanina, ácido gamma-aminobutírico, citrulina, homocisteína, homoserina, ornitina y metionina sulfona. Los profármacos también incluyen compuestos en donde hay carbonatos, carbamatos, amidas y ésteres alquílicos unidos covalentemente a los sustituyentes anteriores de un compuesto de la invención.
Los compuestos de la invención como se describe en la presente memoria o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable de los mismos, pueden ser agonistas covalentes irreversibles o covalentes reversibles del sitio activo de una proteína.
Cuando se hace referencia a un grupo protector (PG), un experto en la técnica comprendería fácilmente qué tipo de grupo protector sería adecuado. Los ejemplos de grupos protectores de amina adecuados para los fines descritos en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, terc-butiloxicarbonilo (t-Boc) y 9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilo (Fmoc).
Pueden formularse composiciones farmacéuticas a partir de compuestos de la invención como se describe en la presente memoria para cualquier vía de administración adecuada, incluyendo, por ejemplo, administración tópica (por ejemplo, transdérmica u ocular), oral, bucal, respiratoria (por ejemplo, nasal, inhalación, intrapulmonar), vaginal, rectal o parenteral. El término parenteral, como se emplea en esta memoria, incluye la inyección subcutánea, intradérmica, intravascular (por ejemplo, intravenosa), intramuscular, espinal, intracraneal, intratecal, intraocular, periocular, intraorbital, intrasinovial e intraperitoneal, así como cualquier técnica similar de inyección o infusión. Las formas orales adecuadas incluyen, por ejemplo, comprimidos, trociscos, pastillas para chupar, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras o blandas, o jarabes o elixires. Para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea o intraperitoneal, uno o más compuestos pueden combinarse con una solución acuosa estéril que sea preferiblemente isotónica con la sangre del receptor. Dichas formulaciones pueden prepararse disolviendo el principio activo sólido en agua que contenga sustancias fisiológicamente compatibles, tales como cloruro de sodio o glicina, y que tenga un pH tamponado compatible con las condiciones fisiológicas para producir una solución acuosa, y haciendo que dicha solución sea estéril. Las formulaciones pueden estar presentes en envases unitarios o multidosis, tales como ampollas o viales sellados. Se describen ejemplos de componentes enMartindale - The Extra Pharmacopoeia(Pharmaceutical Press, Londres 1993) y Martin (ed.),Remington's Pharmaceutical Sciences.Preferiblemente, las composiciones se formulan para la administración en las vías respiratorias, por ejemplo, mediante administración intrapulmonar (por ejemplo, inhalación) o administración intranasal. Las composiciones pueden administrarse en las vías respiratorias superiores y/o inferiores.
Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas están en una forma adecuada para la administración por vía respiratoria, y pueden estar en cualquier forma tal como un polvo, líquido o suspensión. Dichas composiciones pueden dirigirse a tejidos, incluyendo el tejido pulmonar (incluyendo el alvéolo, bronquiolo terminal, bronquiolos y bronquios) o la cavidad nasal (incluyendo la cavidad paranasal, seno frontal, seno etmoidal, seno maxilar, seno esfenoidal, cornete superior, cornete medio y cornete inferior).
En el contexto de esta memoria descriptiva, el término "administrar" y variaciones de ese término incluyendo "administra" y "administración", incluye poner contacto, aplicar, suministrar o proporcionar un compuesto o composición de la invención a un organismo, o a una superficie por cualquier medio adecuado.
La dosis del compuesto biológicamente activo según la invención puede variar dentro de amplios límites y ajustarse a las necesidades individuales. Los compuestos activos según la presente invención generalmente se administran en una cantidad terapéuticamente eficaz.
Una composición según la presente invención debe administrarse en una cantidad eficaz. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz" se refiere en general a una cantidad de un compuesto de la invención descrito en la presente memoria, una sal, polimorfo o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo de la presente invención que (i) trata la enfermedad, afección o trastorno particular, (ii) atenúa, mejora o elimina uno o más síntomas de la enfermedad, afección o trastorno particular, o (iii) retrasa el inicio de uno o más síntomas de la enfermedad, afección o trastorno particular descritos en la presente memoria. Los efectos indeseables, p. ej., los efectos secundarios, se manifiestan en ocasiones junto con el efecto terapéutico deseado; en consecuencia, un profesional sopesa los beneficios potenciales frente a los riesgos potenciales a la hora de determinar cuál es la "cantidad eficaz" adecuada.
La cantidad exacta requerida variará de sujeto a sujeto, dependiendo de la especie, la edad y el estado general del sujeto, del modo de administración y similares. Por lo tanto, puede que no sea posible especificar una "cantidad eficaz" exacta. Sin embargo, una "cantidad eficaz" adecuada en cualquier caso individual puede ser determinada por un experto habitual en la técnica usando únicamente la experimentación rutinaria. En un aspecto, la dosis administrada a un sujeto es cualquiera que reduzca la carga vírica. Preferiblemente, la dosis no aumenta significativamente la inflamación, por ejemplo, no aumenta significativamente el número absoluto de neutrófilos ni la proporción de neutrófilos del total de células de BAL en el pulmón. Las expresiones "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz" también pueden referirse a una cantidad del compuesto de la invención o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo, que dé como resultado una mejora o un remedio de los síntomas de una infección respiratoria, o de una enfermedad o afección respiratoria asociada a una infección vírica o bacteriana.
En algunas realizaciones, una cantidad eficaz para un sujeto humano está en el intervalo de 250 nmoles/kg de peso corporal/dosis a 0,005 nmoles/kg de peso corporal/dosis. Preferiblemente, el intervalo es de aproximadamente 250 nmoles/kg de peso corporal/dosis a 0,05 nmoles/kg de peso corporal/dosis. En algunas realizaciones, el intervalo de peso corporal/dosis es de aproximadamente 250 nmoles/kg, a 0,1 nmoles/kg, de aproximadamente 50 nmoles/kg a 0,1 nmoles/kg, de aproximadamente 5 nmoles/kg a 0,1 nmol/kg, de aproximadamente 2,5 nmoles/kg a 0,25 nmoles/kg o de aproximadamente 0,5 nmoles/kg a 0,1 nmoles/kg de peso corporal/dosis. En algunas realizaciones, la cantidad es de, o de aproximadamente, 250 nmoles, 50 nmoles, 5 nmoles, 2,5 nmoles, 0,5 nmoles, 0,25 nmoles, 0,1 nmoles o 0,05 nmoles/kg de peso corporal/dosis del compuesto. Las pautas de dosificación se adaptan a las exigencias de la situación y pueden ajustarse para producir la dosis terapéutica óptima.
Los compuestos de la invención descritos en la presente memoria pueden ser composiciones formuladas como formulaciones inhaladas, incluyendo polvo seco, pulverizaciones, nieblas o aerosoles. Esto puede ser particularmente preferido para el tratamiento de una infección respiratoria. Para formulaciones de inhalación, la composición o combinación proporcionada en la presente memoria puede administrarse mediante cualquier método de inhalación conocido por un experto en la técnica. Dichos métodos y dispositivos de inhalación incluyen, pero no se limitan a, inhaladores de dosis medida con propulsores tales como CFC o HFA o propulsores fisiológica y ambientalmente aceptables. Otros dispositivos adecuados son los inhaladores que funcionan con la respiración, inhaladores multidosis de polvo seco y nebulizadores en aerosol. Las formulaciones en aerosol para su uso en el método objeto normalmente incluyen propulsores, tensioactivos y cosolventes y pueden cargarse en envases de aerosol convencionales cerrados por una válvula dosificadora adecuada.
Las composiciones inhalantes pueden comprender composiciones líquidas o en polvo que contengan el principio activo y que sean adecuadas para su uso en nebulización e intrabronquialmente, o composiciones en aerosol administradas a través de una unidad de aerosol que dispense dosis medidas. Las composiciones líquidas adecuadas comprenden el principio activo en una solución acuosa, disolvente inhalante farmacéuticamente aceptable tal como solución salina isotónica o agua bacteriostática. Las soluciones se administran por medio de una bomba o un pulverizador nebulizado accionado por presión, o por cualquiera de los medios convencionales para provocar o permitir la inhalación de la cantidad necesaria de la composición líquida en los pulmones del paciente. Las formulaciones adecuadas, en donde el portador es un líquido, para la administración, en forma de, por ejemplo, una pulverización nasal o gotas nasales, incluyen soluciones acuosas u oleosas del principio activo. Como alternativa, la composición puede ser un polvo seco y administrarse a las vías respiratorias como se define en la presente memoria.
Se entenderá, que el nivel de dosis específico para cualquier paciente particular dependerá de diversos factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la vía de administración y la velocidad de excreción, la combinación de fármacos (es decir, otros fármacos que se estén usando para tratar al paciente) y la gravedad del trastorno particular que se esté tratando.
Se entenderá, sin embargo, que el nivel de dosis específico para cualquier sujeto particular dependerá de diversos factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la vía de administración y la velocidad de excreción, la combinación de fármacos (es decir, otros fármacos que se estén usando para tratar al sujeto) y la gravedad del trastorno particular que se esté tratando. Por lo general, la dosis será menor si los compuestos se administran por vía local en lugar de por vía sistémica, y para la prevención más que para el tratamiento. Dichos tratamientos pueden administrarse con la frecuencia necesaria y durante el período de tiempo que el médico tratante considere necesario. Un experto en la técnica apreciará que la pauta de dosificación o la cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto de la invención, o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo, que ha de administrarse puede tener que optimizarse para cada individuo. Las composiciones farmacéuticas pueden contener principio activo en el intervalo de aproximadamente 0,1 a 2000 mg, preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 0,5 a 500 mg y lo más preferiblemente entre aproximadamente 1 y 200 mg. Puede ser adecuada una dosis diaria de aproximadamente 0,01 a 100 mg/kg de peso corporal, preferiblemente entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal. La dosis diaria puede administrarse en una o múltiples dosis al día.
Se apreciará también que pueden ser necesarias dosis diferentes para tratar trastornos diferentes.
Como se emplea en esta memoria, los términos "tratamiento" o "tratar" a un sujeto incluyen la aplicación o administración de un compuesto o composición de la invención a un sujeto (o la aplicación o administración de un compuesto de la invención a una célula o tejido de un sujeto) con el fin de retrasar, ralentizar, estabilizar, curar, sanar, aliviar, calmar, alterar, remediar, empeorar menos, mejorar, atenuar o afectar a la enfermedad o afección, el síntoma de la enfermedad o afección, o el riesgo de (o la susceptibilidad a) la enfermedad o afección. El término "tratar" se refiere a cualquier indicación de éxito en el tratamiento o la mejora de una lesión, patología o afección, incluyendo cualquier parámetro objetivo o subjetivo tal como la atenuación; la remisión; la reducción de la velocidad de empeoramiento; la reducción de la gravedad de la enfermedad; la estabilización, la disminución de los síntomas o hacer la lesión, patología o afección más tolerable para el sujeto; la ralentización de la velocidad de degeneración o declive; hacer que el punto final de la degeneración sea menos debilitante; o la mejora del bienestar físico o mental del sujeto.
Como se emplea en esta memoria, "prevenir" o "prevención" tiene por objeto referirse a al menos de la probabilidad del riesgo de (o susceptibilidad a) adquirir una enfermedad o trastorno (es decir, hacer que al menos uno de los síntomas clínicos de la enfermedad no se desarrolle en un paciente que puede estar expuesto o predispuesto a la enfermedad pero que aún no experimenta o muestra síntomas de la enfermedad). En la presente memoria se proporcionan parámetros biológicos y fisiológicos para identificar a dichos pacientes, que también son bien conocidos por los médicos.
"Sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano. Por lo tanto, además de ser útiles para el tratamiento humano, los compuestos de la presente invención también pueden ser útiles para el tratamiento veterinario de mamíferos, incluyendo animales de compañía y de granja, tales como, pero sin limitación, perros, gatos, caballos, vacas, ovejas y cerdos.
Los compuestos de la presente invención pueden administrarse junto con un portador, diluyente o excipiente farmacéutico como se ha descrito anteriormente.
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��Ejemplo 1 - Síntesis de compuestos
Ejemplo 1.1 - síntesis de A usando química en fase sólida de Fmoc
Los compuestos de la invención, incluyendo aquellos según la Fórmula (I), pueden proporcionarse acoplando un compuesto de fórmula A-I:
en donde R21, R22, R24a, R24b, R25a, R25b, R26, R27, X, Z1, Z2, v, L1 y L2 tienen los significados como se definen para cualquier compuesto de la invención definido en la presente memoria y R22 es un grupo protector de amino
con un compuesto de fórmula YB-I:
en donde
Y' es
en donde R21 se selecciona del grupo que consiste en H, -CH<2>OH, -CH<2>CH<2>OH, -CH(CH3)OH, -CH<2>OPO(OH)<2>, -CH<2>C(=O)NH<2>, -CH<2>CH<2>C(=O)OH y -CH<2>CH<2>C(=O)OR<8>, en donde uno cualquiera de los hidrógenos de alquilo puede reemplazarse por un halógeno;
R8 se selecciona del grupo que consiste en H y un alquilo C<1>-C<6>lineal o ramificado;
B' es un radical de PEG como se define para cualquier compuesto de la invención; y
O es una resina de soporte sólida.
En algunas realizaciones, B' comprende un PEG sustituido de Fórmula B-I. En estas realizaciones, puede emplearse la siguiente secuencia de reacciones en fase sólida:
a) Opcionalmente acoplar de 1 a 10 alfa aminoácidos o compuestos derivados de un alfa aminoácido natural, que constituye L, a una resina en fase sólida usando la química de Fmoc
b) Acoplar PG-NH-(CH2)p-O-(CH2CH2O)n-(CH2)m-COOH a una resina en fase sólida o resina sustituida si L está presente, en donde PG representa un grupo protector (por sus siglas en inglés) de amino compatible con la química de Fmoc;
c) Retirar el PG;
d) Acoplar PG-NH-CR<13>R<14>-COOH, en donde PG' representa un grupo protector (por sus siglas en inglés) de amino compatible con la química de Fmoc;
e) Retirar el PG';
f) Acoplar un ácido de fórmula (A-I);
g) Opcionalmente, retirar R22 y opcionalmente acilar y/o alquilar para introducir R22 y/o R22; y
h) Retirar el compuesto del soporte en fase sólida
En algunas realizaciones, B' comprende un PEG sustituido según la fórmula (B-II) y puede emplearse la siguiente secuencia de reacciones en fase sólida:
a) Opcionalmente acoplar de 1 a 10 alfa aminoácidos o compuestos derivados de un alfa aminoácido natural, que constituyen L, a una resina en fase sólida usando la química de Fmoc
b) Acoplar PG-NH-(CH<2>)t-O-(CH<2>CH<2>O)k-(CH<2>)h-COOH a una resina en fase sólida o resina sustituida si L está presente, en donde PG representa un grupo protector (por sus siglas en inglés) de amino compatible con la química de Fmoc;
c) Retirar el PG;
d) Acoplar PG'-NH-(CH2)p-O-(CH2CH2O)n-(CH2)m-COOH, en donde PG' representa un grupo protector (por sus siglas en inglés) de amino compatible con la química de Fmoc;
e) Retirar el PG';
f) Acoplar PG"-NH-CR13R14-COOH, en donde PG" representa un grupo protector (por sus siglas en inglés) de amino compatible con la química de Fmoc;
g) Retirar el PG'';
h) Acoplar un ácido de fórmula (A-I);
i) Opcionalmente, retirar R22 y opcionalmente acilar y/o alquilar para incorporar R22 y/o R22; y
j) Retirar el compuesto de la resina en fase sólida.
Se apreciará que la secuencia exacta de acontecimientos puede variar con respecto a la esbozada y que pueden añadirse etapas adicionales cuando sea necesario y sintéticamente conveniente, por ejemplo, la oxidación del azufre de la cisteína al sulfóxido.
Ejemplo 1.2 - síntesis de intermedio para su uso en el acoplamiento en fase sólida A
Algunas realizaciones del ácido intermedio de fórmula A-II:
en donde R22, R23, R24a, R24b, R25a, R25b, L1, L2 y v son como se definieron anteriormente para el compuesto de fórmula A-I; pueden prepararse mediante la síntesis mostrada en el Esquema 1.
Esquema 1
En el esquema 1, PG representa un grupo protector (por sus siglas en inglés) de alcohol, PG2 representa un grupo protector (por sus siglas en inglés) de ácido carboxílico, PG3 representa un grupo protector (por sus siglas en inglés) amida (y corresponde a R23) y E representa:
Rbs Ra
en donde Lx es como se define para L1 y L2, Ra es como se define para R24a y R25a y Rb es como se define para R24b y R25b.
La reacción de alcoholes alquénicos protegidos de fórmula (V'), donde PG es un grupo protector adecuado, por ejemplo, un grupo sililo tal como TBDMS, forma un epóxido de fórmula (VI'). Se apreciará que la formación de epóxido puede realizarse para proporcionar el producto racémicamente o para proporcionar material enantioenriquecido. Si se produce una mezcla racémica o escalémica de enantiómeros, se emplea la cromatografía quiral preparativa para separar los enantiómeros si es necesario.
Los epóxidos de fórmula (VI') se hacen reaccionar con análogos de cistina convenientemente protegidos, por ejemplo, W-(((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)-S-(((R)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-3-(fercbutoxi)-3-oxopropil)tio)-D-cisteinato de ferc-butilo, donde PG2 es un éster ferc-butílico y PG3 es Fmoc, en condiciones reductoras para proporcionar alcoholes de fórmula (VII'). Se apreciará que los alcoholes de fórmula (VII') pueden estar comprendidos por más de un estereoisómero y cuando estén presentes los estereoisómeros, éstos pueden separarse mediante cromatografía preparativa quiral según se requiera.
Los alcoholes de fórmula (VII') pueden acilarse para proporcionar aductos que contengan carbonilo de fórmula (VIII') usando reactivos adecuados, por ejemplo, con un cloruro de ácido convenientemente sustituido reaccionado en presencia de bases y disolventes adecuados. Los aductos que contienen carbonilo de fórmula (VIII') pueden a continuación desprotegerse para revelar ácidos carboxílicos de fórmula (IX') usando reactivos adecuados, por ejemplo, donde PG2 es ferc-butilo, puede usarse ácido trifluoroacético para retirar preferiblemente el grupo ferc-butilo.
Los ácidos de fórmula (IX') pueden a continuación usarse como reactivos en síntesis en fase sólida tales como los descritos en la presente memoria.
Ejemplo 1.3 - síntesis de B usando la química en fase sólida de Fmoc
Los compuestos de la invención, incluyendo aquellos según la Fórmula (I) pueden proporcionarse preparando un péptido unido a resina de la siguiente fórmula:
H
H2N -C -Y '-B '-C J
PGSS ^
en donde
Y' es
en donde R21 se selecciona del grupo que consiste en H, -CH<2>OH, -CH<2>CH<2>OH, -CH(CH3)OH, - CH<2>OPO(OH)<2>, -CH<2>C(=O)NH<2>, -CH<2>CH<2>C(=O)OH y -CH<2>CH<2>C(=O)OR<8>, en donde uno cualquiera de los hidrógenos de alquilo puede reemplazarse por un halógeno;
R8 se selecciona del grupo que consiste en H y un alquilo C<1>-C<6>lineal o ramificado;
B' es un polietilenglicol (PEG);
PGS es H o un grupo protector de azufre, tal como ferc-butilo; y
O es una resina de soporte sólida.
Después de la desprotección de azufre opcional, este péptido unido a resina puede hacerse reaccionar con un 1,2-epoxi-alcanol de la siguiente fórmula:
en donde Rx, Ry y v tienen los significados dados para la Fórmula (I)
para proporcionar un tiol alquilado de fórmula S-1:
en donde Y' y B' tienen el significado proporcionado anteriormente, y v tiene el significado proporcionado para el compuesto de fórmula (I), o una sulfona o sulfóxido del mismo.
Las moléculas de diol del compuesto S-1 unido a resina pueden hacerse reaccionar además con un ácido carboxílico adecuadamente sustituido (normalmente en forma activada tal como cloruro de ácido, anhídrido mixto, etc. o en presencia de un reactivo de acoplamiento, tal como diisopropilcarbodiimida (DIC), diciclohexil carbodiimida (DCC), Hidroxibenzotiazol (HOBt, disponible como Oxyma Pure), etc., opcionalmente junto con un catalizador tal como 4-dimetilaminopiridina (DMAP)) para proporcionar un compuesto de la invención.
Ejemplo 1.4 - Síntesis y caracterización de los compuestos B4, B6, B8, B12, B14 y B16
Síntesis del compuesto B12.El compuesto B12 se sintetizó mediante Síntesis peptídica en fase sólida de Fmoc convencional, comenzando con la resina Fmoc-RINK MBHA PS. La retirada del grupo Fmoc después de cada acoplamiento se consiguió usando piperidina al 20 % en DMF. Se realizaron acoplamientos de Fmoc-Gly-OH (exceso de 2 veces), Fmoc-NH-PEG<28>-CH<2>CH<2>COOH (exceso de 1,4 veces), Fmoc-Ser(tBu)-OH (exceso de 2 veces) y N-(Boc)-S-((R)-2,3-dihidroxibutil)-L-cisteína (exceso de 1,5 veces) en dimetilformamida (DMF) usando excesos equivalentes de Oxyma Pure y DIC como agentes de acoplamiento. El acoplamiento de ácido 2-metil-palmítico se realizó usando ácido 2-metil-palmítico (20 eq. frente a moles de resina), DIC (20 eq.), DMAP (2 eq.) en diclorometano (DCM)/tetrahidrofurano (THF) (85/15) (v/v) durante ~20 horas a temperatura ambiente (~25 °C). Opcionalmente, tras cada etapa de acoplamiento, cualquiera de los fragmentos peptídicos que no hayan reaccionado se protegen terminalmente con un grupo acetilo mediante reacción con anhídrido acético, lo que puede ayudar en la purificación del compuesto de los productos de supresión.
La escisión del péptido de la resina, la retirada del grupo Boc N-terminal y la desprotección de la cadena lateral de serina se lograron mediante la exposición de la resina a una solución de TFA al 93 %, H<2>O al 5 %, TIPS al 3 % durante 1,5 horas. Después de la reacción de escisión, la mezcla se evaporó y el residuo resultante se redisolvió en acetonitrilo al 30 %/agua y se liofilizó.
Esquema 2 - síntesis de los compuestos B4, B6, B8, B14 y B16
1.ACN, DMF, DIC, TMSE-OH, piridina.2.DCM, polvo fino de Zn, MeOH, HCI, H<2>SO<4>, epóxido.3.Ácido 2-metilpalmitico, DIC, DMAP, THF.4.TBAF 1 M THF.5.(i) Rink-Gly-PEG<28>-Ser(OtBu)-NH<2>, PyBOP, colidina, DCM (ii) TFA
Procedimientos para los etapas de síntesis del Esquema 2
Síntesis de Rink-Gly-PEG<28>-Ser(OtBu)-NH2
1. Amida p-[(R,S)-a-[1-(9H-Fluoren-9-il)-metoxiformamido]- 2,4-dimetoxibencil]- fenoxiacética (Fmoc-Rink) AM resina 0,47 meq/g, 5 g, 2,35 mmol). La resina se hinchó en dimetilformamida (DMF; 30 ml) durante 15 minutos (min) y a continuación el disolvente se separó por filtración.
2. A continuación, la resina se trató con 20 ml de piperidina al 20 %/DMF dos veces (1 X 5 min y después 1 X 10 min)
3. La resina se lavó con DMF X 2 y a continuación con DCM X 2. Ensayo de azul de bromofenol (BPB) positivo 4. A Fmoc-Gly-OH (3equivalentes (eq), 7,05 mmol, 2,1 g) en DMF 15 ml se le añadió PyBOP (7,05 mmol, 3,67 g) y a continuación diisopropiletil amina (DIPEA; 4 eq, 9,4 mmol, 1,64 ml), y se mezclaron y se dejaron reposar durante 5-10 min.
5. La mezcla se añadió a la resina y la resina/mezcla se agitó durante 2 horas (h). Después de 2 h, el ensayo de BPB fue negativo.
6. La resina se filtró y a continuación se lavó con DMF X 2 y después con diclorometano (DCM) X 2 y finalmente con DMF.
7. A continuación, la resina se trató con 20 ml de piperidina al 20 %/DMF dos veces (1 X 5 min y después 1 X 10 min)
8. La resina se lavó con DMF X 2 y a continuación con DCM X 2. Ensayo de BPB positivo
9. Se hincharon 200 mg de la resina NH2-Gly-Rink (suponer 0,47 meq/g, 0,094 mmol) en DCM, a continuación se filtraron y se lavaron varias veces con DCM.
10. Se recogió Fmoc-NH-PEG28-(CH2)2-CO2H (PM = 1544,75, 1,5 eq, 0,141 mmol 145 mg) en 4 ml de DCM y se añadió PyBOP (1<, 6>eq, 0,150 mmol, 78 mg) seguido de DIPEA (4 eq, 0,376 mmol, 0,065 ml) y se agitaron durante varios minutos añadiéndose a continuación a la resina, que se agitó durante la noche.
11. El ensayo de BPB fue negativo. La resina se lavó con DMF X 2 y a continuación con DCM X 2 y finalmente con DMF.
12. A continuación, la resina se trató con 1 ml de piperidina al 20 %/DMF dos veces (1 X 5 min y después 1 X<10>min).
13. La resina se lavó con DMF X 2 y a continuación con DCM X 2. Ensayo de BPB positivo
14. Se recogió Fmoc-Ser(OtBu)OH (PM = 383,4, 1,5 eq, 0,141 mmol 54 mg) en 4 ml de DMF y se añadió PyBOP (1,6 eq, 0,150 mmol,<78>mg) seguido de D<i>P<e>A (4 eq, 0,376 mmol, 0,065 ml) y se agitaron durante varios minutos añadiéndose a continuación a la resina, que se agitó durante la noche.
15. El ensayo de BPB fue negativo. La resina se lavó con DMF X 2 y a continuación con DCM X 2 y finalmente con DMF.
16. A continuación, la resina se trató con 1 ml de piperidina al 20 %/DMF dos veces (1 X 5 min y después 1 X<10>min).
17. La resina se lavó con DMF X 2 y a continuación con DCM X 2. Ensayo de BPB positivo.
Etapa 1
Se disolvió N'N"-Bis-Boc-L-cistina 1 (6,61 g, 15 mmol) en ACN (30 ml) y DMF (11,25 ml) en un matraz de dos bocas de 100 ml en atm de N<2>y se enfriaron en un baño de hielo. A esta mezcla se le añadieron 2-(trimetilsilil)etanol (5,11 ml, 35,63 mmol) y piridina (4,80 ml, 59,33 mmol) y se dejaron agitar en un baño de hielo durante diez minutos, a continuación se añadió DCC (6,75 g, 32,70 mmol) y se agitó en un baño de hielo durante 16 h sin recargar el baño de hielo. A la mezcla se le añadió ácido cítrico sólido y se agitó 1-2 h más. La mezcla se diluyó con éter y se filtró a través de un tapón de sílice. La capa orgánica se lavó con ácido cítrico al 5 %, agua, bicarbonato y a continuación salmuera, se secó y se concentró hasta obtener una resina transparente que se usó sin purificación adicional 10,3 g RMN 1H (401 MHz, CDCl3) 55,38 (d, J = 7,1 Hz, 1H), 4,56 (d, J = 7,1 Hz, 1 H), 4,33 - 4,16 (m, 3H), 3,16 (s, 2H), 1,46 (d, J = 5,2 Hz, 14H), 1,03 (dd, J = 9,0, 8,4 Hz, 3H), 0,11 - 0,02 (m, 13H).
Etapa 2
El producto de la etapa 1 (10,3 g, 15 mmol basado en la reacción del intermedio 1) se recogió en DCM (80 ml) y se añadió polvo fino de Zn (8,12 g, 124,15 mmol). La mezcla se enfrió en un baño de hielo. A la mezcla se le añadió metanol recién preparado (MeOH):cHCl:cH<2>SO<4>(100:7:1) (32 ml) y se agitó en hielo durante 0,5 h y después se retiró el baño de hielo, se añadió (R)-(+)-oxirano-2-metanol y la mezcla se agitó a 40 °C durante la noche. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente (ta), se diluyó con diclorometano (DCM) y se filtró a través de celite. La fase orgánica se lavó con agua y a continuación con salmuera. Las fases acuosas combinadas se retroextrajeron con dietil éter. Los extractos orgánicos combinados se secaron, se filtraron y se concentraron para proporcionar el compuesto intermedio2como una resina incolora transparente de 11,52 g de rendimiento del 98 % y se usó sin purificación adicional.
El compuesto intermedio3se preparó por una vía similar a la seguida para la preparación del compuesto intermedio2, excepto por que se usó (fí)-(+)-Oxirano-2-etanol en lugar de (fí)-(+)-Oxirano-2-metanol). RMN 1H (400 MHz, CDCla) 54,62 - 4,36 (m, 1H), 4,32 - 4,18 (m, 2H), 3,97 - 3,79 (m, 3H), 3,02 (dt, J = 18,4, 9,2 Hz, 1H), 2,94 - 2,70 (m, 2H), 2,65 - 2,46 (m, 2H), 1,85 - 1<, 66>(m, 2H), 1,45 (s, 9H), 1,12 - 0,95 (m, 2H), 0,07 - 0,02 (m, 9H).
Etapas 3-5
Síntesis del compuesto B6(R, R).Una porción del compuesto intermedio2(100 mg, 0,253 mmol) se recogió en THF anhidro (1,5 ml) en una atmósfera de N<2>y a esta mezcla se le añadieron ácido (R)-2-metilpalmítico (205 mg, 0,758 mmol), N-dimetilaminopiridina (DMAP; 12 mg, 0,101 mmol) y finalmente diisopropil carbodiimida (DIC; 118 gl, 0,758 mmol) a ta en una atmósfera de N<2>y la mezcla se agitó a ta durante la noche. A continuación se diluyó en éter y se filtró. La capa orgánica se lavó con HCl 1 M, agua, bicarbonato, agua y después salmuera, se secó (MgSO<4>), se filtró y se concentró hasta un residuo que se solidificó en un sólido ceroso. El material en bruto se recogió en un complejo de fluroruro de íerc-butilamonio 1 M con tetrahidrofurano (TBAF THF); 1,4 ml) y se agitó a ta durante 3 h. La mezcla se diluyó en éter y se lavó con HCl 1 M, a continuación, agua X 4 y, finalmente, salmuera. La capa orgánica se secó (MgSO<4>), se filtró y se concentró hasta un residuo (89 mg). El material en bruto se recogió en DCM (1 ml) y se añadió hexafluorofosfonato de benzotriazol-1-il-oxitripirrolidinofosfonio (PyBOP) (65 mg), seguido de colidina (27 gl) agitando durante 1 min, a continuación se añadió a la resina Rink-Gly-PEG28-Ser(OtBu)-NH2 (100 mg) en DCM (2 ml). Después de 2 h, el ensayo de BPB fue negativo. La resina se lavó minuciosamente con DMF X 2 y a continuación con DCM X4, MeOH y a continuación dietil éter X 4. A continuación, se deja al vacío durante la noche. La resina se trató con ácido trifluoroacético (TFA) al 95 % y tiisopropilsilano (TIPS) al 5 % durante 2 h. A continuación se filtró y el TFA se retiró bajo flujo de N<2>. El residuo restante se recogió en agua y se liofilizó. El material liofilizado se purificó mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) de flujo isocrático A:B 80:20 (A = acetonitrilo (ACN):MeOH 50:50, B = A al 1 % en agua) para proporcionar, después de la liofilización, 35,2 mg de sólido amorfo con un rendimiento del 6,5 %. CLEMRf(min) = 6,73. EM m/z 1074,4,0 (M 2H)/2, 722,4 (M 3H H2O)/3. HR-IEN calculado para C<104>H<203>N<5>O<37>S (M 2H)/2, 1074,7028; encontrado, 1074,7030.
Síntesis del compuesto B8 (S, S).Una porción del compuesto intermedio2(100 mg, 0,253 mmol) se recogió en THF anhidro (1,5 ml) en una atmósfera de N<2>y a esta mezcla se le añadieron ácido (S)-2-metilpalmítico (205 mg, 0,758 mmol), DMAP (12 mg, 0,101 mmol) y finalmente DIC (118 gl, 0,758 mmol) a ta en una atmósfera de N<2>y la mezcla se agitó a ta durante la noche. A continuación se diluyó en dietil éter y se filtró. La capa orgánica se lavó con HCl 1 M, agua, bicarbonato de sodio (ac.), agua y después salmuera, se secó (MgSO4), se filtró y se concentró hasta un residuo que se solidificó en un sólido ceroso. El material en bruto se recogió en TBAF 1 M THF (1,5 ml) y se agitó a ta durante 3 h. La mezcla se diluyó en dietil éter y se lavó con HCl 1 M, a continuación, agua X 4 y, finalmente, salmuera. La capa orgánica se secó (MgSO4), se filtró y se concentró hasta un residuo de 104 mg. El material en bruto se recogió en DCM (1 ml) y se añadió PyBOP (76 mg), seguido de colidina (32 gl) y la mezcla se agitó durante 1 min, a continuación se añadió a la resina Rink-Gly-PEG28-Ser(OtBu)-NH2 (117 mg) en DCM (2 ml). Después de 2 h, el ensayo de BPB fue negativo. La resina se lavó minuciosamente con DMF X 2 y a continuación con DCM X4, MeOH y a continuación dietil éter X 4. A continuación, se deja al vacío durante la noche. La resina se trató con TFA al 95 % TIPS al 5 % durante 2 h. A continuación se filtró y el TFA se retiró bajo flujo de N<2>. El residuo restante se recogió en agua y se liofilizó. El material liofilizado se purificó mediante HPLC de flujo isocrático A:B 80:20 (A = ACN:MeOH 50:50, B = A al 1 % en agua) para proporcionar, después de la liofilización, 44,2 mg de sólido amorfo con un rendimiento del 8,1 %. CLEMRf(min) = 6,64. EM m/z 1074,4,0 (M 2H)/2, 722,4 (M 3H H2O)/3. HR-IEN calculado para C<104>H<203>N<5>O<37>S (M 2H)/2, 1074,7028; encontrado, 1074,7038.
Síntesis del compuesto B14(R, R).Una porción del compuesto intermedio3(104 mg, 0,253 mmol) se recogió en THF anhidro (1,5 ml) en una atmósfera de N<2>y a esta mezcla se le añadieron ácido (R)-2-metilpalmítico (205 mg, 0,758 mmol), DMAP (12 mg, 0,101 mmol) y finalmente DIC (118 gl, 0,758 mmol) a ta en una atmósfera de N<2>y la mezcla se agitó a ta durante la noche. A continuación se diluyó en dietil éter y se filtró. La capa orgánica se lavó con HCl 1 M, agua, bicarbonato de sodio (ac.), agua y después salmuera, se secó (MgSO4), se filtró y se concentró hasta un residuo que se solidificó en un sólido ceroso. El material en bruto se recogió en TBAF 1 M THF (1,4 ml) y se agitó a ta durante 3 h. La mezcla se diluyó en dietil éter y se lavó con HCl 1 M, a continuación, agua X 4 y, finalmente, salmuera. La capa orgánica se secó (MgSO4), se filtró y se concentró hasta un residuo (150 mg). El material en bruto se recogió en DCM (1ml) y se añadió PyBOP (110mg), seguido de colidina (46gl) agitando durante 1min, a continuación se añadió a la resina Rink-Gly-PEG<28>-Ser(OtBu)-NH<2>(168 mg) en DCM (2 ml). Después de 2 h, el ensayo de BPB fue negativo. La resina se lavó minuciosamente con DMF X 2 y a continuación con DCM X4, MeOH y a continuación dietil éter X 4. A continuación, se deja al vacío durante la noche. La resina se trató con TFA al 95 % TIPS al 5 % durante 2 h. A continuación se filtró y el TFA se retiró bajo flujo de N<2>. El residuo restante se recogió en agua y se liofilizó. El material liofilizado se purificó mediante HPLC de flujo isocrático A:B 80:20 (A = ACN:MeOH 50:50, B = A al 1 % en agua) para proporcionar, después de la liofilización, 70 mg de sólido amorfo con un rendimiento del 12,8 %. CLEMRf(min) = 6,25. EM m/z 1081,7 (M 2H)/2, 727,1 (M 3H H2O)/3. HR-IEN calculado para C<105>H<205>N<5>O<37>S (M 2H)/2, 1081,7107; encontrado, 1081,7108.
Síntesis del compuesto B16 (S, S).Una porción del compuesto intermedio3(104 mg, 0,253 mmol) se recogió en THF anhidro (1,5 ml) en una atmósfera de N<2>y a esta mezcla se le añadieron ácido (S)-2-metilpalmítico (205 mg, 0,758 mmol), DMAP (12 mg, 0,101 mmol) y finalmente DIC (118 gl, 0,758 mmol) a ta en una atmósfera de N<2>y la mezcla se agitó a ta durante la noche. A continuación se diluyó en éter y se filtró. La capa orgánica se lavó con HCl 1 M, agua, bicarbonato de sodio (ac.), agua y después salmuera, se secó (MgSO4), se filtró y se concentró hasta un residuo que se solidificó en un sólido ceroso. El material en bruto se recogió en TBAF 1 M THF (1,4 ml) y se agitó a ta durante 3 h. La mezcla se diluyó en dietil éter y se lavó con HCl 1 M, a continuación, agua X 4 y, finalmente, salmuera. La capa orgánica se secó (MgSO4), se filtró y se concentró hasta un residuo (77 mg). El material en bruto se recogió en DCM (1ml) y se añadió PyBOP (56mg), seguido de colidina (23gl) agitando durante 1min, a continuación se añadió a la resina Rink-Gly-PEG<28>-Ser(OtBu)-NH<2>(87 mg) en DCM (2 ml). Después de 2 h, el ensayo de BPB fue negativo. La resina se lavó minuciosamente con DMF X 2 y a continuación con DCM X4, MeOH y a continuación dietil éter X 4. A continuación, se deja al vacío durante la noche. La resina se trató con TFA al 95 % TIPS al 5 % durante 2 h. A continuación se filtró y el TFA se retiró bajo flujo de N<2>. El residuo restante se recogió en agua y se liofilizó. El material liofilizado se purificó mediante H<p>LC de flujo isocrático A:B 80:20 (A = ACN:MeOH 50:50, B = A al 1 % en agua) para proporcionar, después de la liofilización, 47,7 mg de sólido amorfo con un rendimiento del 8,7 %. CLEMRf(min) = 6,35. EM m/z 1081,7 (M 2H)/2, 727,1 (M 3H H2O)/3. HR-IEN calculado para C<105>H<205>N<5>O<37>S (M 2H)/2, 1081,7107; encontrado, 1081,7132.
Síntesis del compuesto B4.Una porción del compuesto intermedio 2 (100 mg, 0,253 mmol) mostrado en el esquema 2 se recogió en THF anhidro (1,5 ml) en una atmósfera de N<2>y a esta mezcla se le añadieron ácido 2-metilpalmítico (205 mg, 0,758 mmol), DMAP (12 mg, 0,101 mmol) y finalmente DIC (118 gl, 0,758 mmol) a ta en una atm de N<2>y la mezcla se agitó a ta durante la noche. A continuación se diluyó en éter y se filtró. La capa orgánica se lavó con HCl 1 M, agua, bicarbonato, agua y después salmuera, se secó (MgSÜ4), se filtró y se concentró hasta un residuo que se solidificó en un sólido ceroso. El material en bruto se recogió en TBAF 1 M THF (1,5 ml) y se agitó a ta durante 3 h. La mezcla se diluyó en éter y se lavó con HCl 1 M, a continuación, agua X 4 y, finalmente, salmuera. La capa orgánica se secó (MgSÜ4), se filtró y se concentró hasta un residuo (75 mg). El material en bruto se recogió en DCM (1ml) y se añadió PyBOP (55mg), seguido de colidina (23gl) agitando durante 1min, a continuación se añadió a la resina Rink-Gly-PEG28-Ser(OtBu)-NH2 (84 mg) en DCM (2 ml). Después de 2 h, el ensayo de BPB fue negativo. La resina se lavó minuciosamente con DMF X 2 y a continuación con DCM X4, MeOH y a continuación Éter X 4. A continuación, se dejó a alto vacío toda la noche. La resina se trató con TFA al 95 % TIPS al 5 % durante 2 h. A continuación se filtró y el TFA se retiró bajo flujo de N2. El residuo restante se recogió en agua y se liofilizó. El material liofilizado se purificó mediante HPLC de flujo isocrático A:B 80:20 (A = ACN:MeOH 50:50, B = A al 1 % en agua) para proporcionar, después de la liofilización, 9,2 mg de sólido amorfo con un rendimiento del 1,7 %. HR-IEN calculado para C<104>H<203>N<5>O<37>S (M 2H)/2, 1074,7028; encontrado, 1074,7058.
Purificación y caracterización
Purificación y caracterización:Después de la separación del soporte sólido, cada uno de los análogos se purificó mediante HPLC de fase inversa realizada con una columna de compresión axial Novasep (5 cm de diámetro) cargada con medio de ciano (Daisogel SP-120-CN-P), con un gradiente de acetonitrilo en [TFA al 0,1 %/agua]. Después de la liofilización del intermedio, se realizó un intercambio iónico en resina de intercambio iónico Dowex para obtener el péptido como sal de acetato.
La identificación y la determinación de la pureza de los materiales objetivo se realizaron usando una HPLC analítica de fase inversa en línea con una columna de ciano (Daiso Fine Chem, SP-120-3-CN-P, 150 x 4,6 mm, 3 gm, 120Á). El péptido también se analizó mediante IEN CL-EM en modo de iones positivos, usando un Finnigan LCQ Deca XPMax.
Los compuestos B4, B6, B8, B12, B14 y B16 preparados y purificados como se ha descrito anteriormente, tenían una pureza superior al 95 %.
Las masas experimentales(m/z)coinciden con los pesos moleculares calculados para cada compuesto.
Cuantificación de péptidos
La cuantificación de los compuestos se realizó mediante hidrólisis al vacío a 110 °C de muestras en viales de vidrio sellados en presencia de HCl 6 N que contenía fenol al 0,1 %. A continuación, la derivatización de los aminoácidos se realizó usando los reactivos AccQTag de Waters según las instrucciones del fabricante, seguido de un análisis en un sistema Waters Acquity UPLC (Waters Millipore) usando una columna AccQTag ultra (2,1 mm x 100 mm; Waters Millipore).
1.5 - Síntesis de análogos de sulfona y sulfóxido de los compuestos
Se puede acceder a los derivados de sulfona y sulfóxido de los compuestos de esta invención por vías de síntesis similares como se ha descrito anteriormente, con omisión del eliminador de etilmetilsulfuro y omisión opcional de la pulverización de nitrógeno, de la etapa de formación del carbamato. Esta reacción puede dar lugar a una mezcla de derivados de tiol, sulfona y sulfóxido, que puede separarse y purificarse mediante HPLC.
Como alternativa, los derivados de sulfona o sulfóxido pueden prepararse por oxidación del sulfuro correspondiente con un oxidante tal como ácido metacloroperoxibenzoico (MCPBA) o hidroperóxido deterc-butilo (t-BuOOH) en condiciones adecuadas.
Ejemplo 2 - Activación de TLR2 humano
La potencia de los compuestos como activadores de TLR-2 humano y de ratón se somete a ensayo en un ensayoin vitro.El ensayo evalúa la activación de NF-kB en la estirpe celular HEKBlue-mTLR-2. Estas células se han transfectado de forma estable con TLR-2 de ratón y expresan TLR-1 y TLR-6 de forma endógena a niveles suficientes para permitir la activación totalmente funcional de TLR-1/2 y TLR-2/6.
La estimulación del receptor 2 similar a Toll (TLR2) se somete a ensayo evaluando la activación de NF-kB en la estirpe celular HEKBlue-hTLR2. Estas células se han transfectado de forma estable con TLR2 humano y expresan TLR1 y TLR6 de forma endógena a un nivel suficiente para permitir la activación totalmente funcional de TLR1/2 y TLR2/6. La actividad de los artículos de ensayo se somete a ensayo en TLR2 humano como agonistas potenciales. Los artículos de ensayo se evalúan en siete concentraciones y se comparan con los ligandos de control. Estas etapas se realizan por triplicado.
Protocolo de ensayo del gen indicador NF-kB:Este ensayo se realiza como se describió anteriormente (Jacksonet al.2004; Lauet al.2006; Sandoretal.2003; Zenget al.2010). Se cultivaron células HEK293T en placas de 96 pocillos a 4 x 104 células/pocillo y se transfectaron 24 h después con 100 ng del gen indicador de luciferasa NF-kB [50 ng del plásmido que expresa la luciferasa TK-Renilla (Promega corporation, Madison, EE. UU.)] con o sin 5 ng de plásmido que expresa TLR2 en presencia de 0,8 pl de Fugene 6 (Roche Diagnostic). Los compuestos se añaden a los pocillos 24 horas después a las concentraciones indicadas en los histogramas. Los lisados celulares se preparan 5 h después de la estimulación usando tampón de lisis indicador (Promega Corporation, Madison, EE. UU.). Las actividades de luciferasa en los lisados celulares se determinaron usando un kit de reactivos (Promega Corporation, Madison, EE. UU.) y usando un lector de microplacas FLUOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Alemania). La actividad de la luciferasa de luciérnaga dependiente de NF-kB se normaliza con la actividad de la luciferasa de renilla independiente de NF-kB. La estimulación relativa se calcula como la relación entre las muestras estimuladas y las no estimuladas.
Ejemplo 3 - Exposición al virus en VRS
En estos ejemplos, se utiliza en ratones un modelo de exposición al virus de la gripe en las vías respiratorias superiores (VRS), usando una dosis de virus infeccioso que se replica en las VRS y a continuación progresa a los pulmones. El modelo de VRS se usa para determinar qué compuestos pueden impedir la replicación y diseminación del virus de la gripe desde la VRS a los pulmones.
También se miden los perfiles de citocinas y quimiocinas en los cornetes nasales, la tráquea, los pulmones y el suero de los animales tras el tratamiento de las VRS con tres dosis o una dosis única de los compuestos.
También se miden los perfiles de citocinas de ratones que fueron pretratados con tres dosis de compuestos de la invención seguidas de una exposición al virus Udorn.
Animales de experimentación
Para todos los estudios se usan grupos de ratones C57BL/6 machos o hembras de edad similar (p. ej., de aproximadamente 6-8 semanas de edad). Después de la administración de solución salina, el compuesto o la exposición vírica, los ratones se controlan diariamente para detectar cambios de peso y cambios físicos o de comportamiento.
Administración de los compuestos en las VRS
Los ratones se anestesian mediante inhalación de isoflurano y se les administran por vía intranasal, usando una pipeta, solución salina o diversas dosis de los compuestos diluidos en solución salina. Para los experimentos multitratamiento, los ratones reciben 3 dosis de los compuestos de la invención cada dos días durante un período de 5 días.
Preparación del virus de la gripe
El virus de la gripe A/Udorn/307/72 (H3N2) (es decir, el virus Udorn) se propaga en la cavidad alantoidea de huevos embrionados de gallina de 10 días. Los huevos se inoculan con aproximadamente 103 ufp de virus en 0,1 ml de solución salina. Después de 2 días de incubación a 35 °C, los huevos se enfrían a 4 °C y se recoge el líquido alantoideo, que se clarifica por centrifugación. El título de infectividad vírica (ufp/ml) se determina mediante ensayo en placa como se describe a continuación y las alícuotas del líquido alantoideo se almacenaron a -80 °C hasta su uso.
Exposición al virus en VRS
Los ratones se anestesian con isofluorano y se inoculan por vía intranasal con 500 ufp de virusUdornen 10 pl de solución salina, usando un pipeteador. El día 5 posterior a la exposición, se recogen los cornetes nasales, la tráquea y el pulmón para evaluar las cargas víricas.
Extracción y preparación de homogeneizados de cornetes nasales, tráquea y pulmón
Los ratones se sacrifican por asfixia con CO<2>24 horas después del tratamiento o 5 días después de la exposición a la gripe. Se recogieron los cornetes nasales, la tráquea y los pulmones de cada ratón en 1,5 ml de medio RPMI-1640 con antibióticos (100 ug/ml de penicilina, 180 ug/ml de estreptomicina y 24 ug/ml de gentamicina) y se mantuvieron en hielo hasta que se procesaron. Los tejidos se homogeneizaron con un homogeneizador de tejidos y los homogeneizados de órganos resultantes se centrifugaron a 2.000 rpm durante 5 minutos para eliminar los residuos celulares. Los sobrenadantes se recogieron y se almacenaron a -80 °C para mediciones posteriores.
Evaluación de los títulos víricos
Los títulos de virusUdorninfeccioso se determinan mediante ensayo de placa en monocapas confluentes de células de riñón canino Madin Darby (MDCK). Se sembraron placas de cultivo tisular de seis pocillos con 1,2x106 células MDCK por pocillo en 3 ml de r P10 (medio RPMI-1640 suplementado con un 10 % (v/v) de FCS inactivado por calor, 260 ug/ml de glutamina, 200 ug/ml de piruvato de sodio y antibióticos). Tras una incubación de una noche a 37 °C en 5 % de CO2, las monocapas confluentes se lavaron con RPMI. Se añaden sobrenadantes de ensayo, diluidos en serie en RPMI con antibióticos, a pocillos duplicados de monocapas. T ras una incubación a 37 °C en 5 % de CO2 durante 45 min, las monocapas se recubren con 3 ml de medio de recubrimiento de agarosa que contiene 0,9 % de agarosa y 2 ug/ml de tripsina-TPCK tratada en medio Leibovitz L15 pH6,8 con glutamina y antibióticos. Las placas se incuban durante 3 días a 37 °C en 5 % de CO2 y la lisis celular mediada por el virus se cuenta a continuación como placas en la capa celular. Se calculan los títulos víricos totales del órgano (unidades formadoras de placas, UFP) de cada animal.
Determinación de los niveles de citocinas en cornetes nasales, tráquea, pulmones y sueros
Se midieron IFN-y, IL-2, IL-4, TNF, IL-10, IL-6, KC, MCP-1, RANTES, IL-12/IL-23p40 e IL-17A presentes en homogeneizados de cornetes nasales, tráquea, pulmón y muestras de suero usando un kit BD Cytometric Bead Array (CBA) Flex según las instrucciones del fabricante, con la excepción de que en cada muestra de 50 pl se usa un total de 0,15 pl de cada suspensión de microesferas de captura y 0,15 pl de cada reactivo de detección de PE. Las muestras se analizaron con un citómetro de flujo FACSCanto II de Bection Dickinson y los datos se analizaron con el software FCAP Array multiplex.
Análisis estadísticos
Puede usarse un análisis de varianza de una vía (ANOVA) con comparación de Tukey de todas los ensayos de columna. Puede usarse un ANOVA de dos vías con el ensayo de Bonferroni para comparar los mismos grupos de tratamiento en las pautas de dosis única y de 3 dosis repetidas. Un valor p< 0,0322 se consideró estadísticamente significativo. Los análisis estadísticos se realizan con programas informáticos adecuados, tales como GraphPad Prism, versión 7.0.
Ejemplo 4 - Evaluación del efecto del pretratamiento con diferentes dosis de compuestos de la invención sobre el resultado de la exposición de VRS con el virus Udorn
Este experimento se realiza para determinar el efecto antivírico del pretratamiento VRS con diversas dosis de los compuestos de la invención.
El día 0 los ratones (5 animales/grupo) reciben o bien solución salina, 5 nmoles, 0,1 nmoles o 0,005 nmoles del compuesto de la invención, administrados por vía intranasal en 10 pl tras ser anestesiados con isoflurano. El día 1 tras la administración del compuesto de la invención, los ratones se exponen intranasalmente con 500 ufp del virus Udorn en un volumen de 10 pl después de ser anestesiados con isoflurano. Los ratones se sacrifican el día 5 y se extrajeron los cornetes nasales, la tráquea y los pulmones, se homogeneizaron y se congelaron para análisis posteriores.
El diseño experimental se resume en el esquema a continuación
Exposición a Udorn
Sacrificar ratones, extirpar órganos,
determ inar los títulos víricos
Ejemplo 5 - Activación de TLR2 por diversos compuestos
Se comparan las capacidades de diversos compuestos para estimular la actividad de la luciferasa en un sistema indicador basado en células NF-kB. Se exponen células HEK293T, cotransfectadas transitoriamente con un plásmido de TLR2 humano y un sistema indicador de plásmido de luciferasa-NF-KB, a diversas diluciones de cada compuesto. El éxito de la unión al receptor y los posteriores eventos de transducción de señales se determinan mediante la medición de la luminiscencia debida a la actividad de la luciferasa
Ejemplo 6 - Unión a TLR y especificidad
El compuesto de la invención se evalúa para determinar su capacidad para activar una serie de otros receptores de reconocimiento de patrones de TLR. Estas evaluaciones se realizan usando paneles de TLR humanos y de ratón. Estos ensayos detectan un indicador de fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP) bajo el control de un promotor que es inducible por la activación de NF-<k>B en células HEK293.
El indicador de la fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP) está bajo el control de un promotor inducible por el factor de transcripción NF-<k>B. Este gen indicador permite controlar la señalización a través del TLR, basada en la activación de NF-<k>B. En una placa de 96 pocillos (200 pl de volumen total) que contiene las células adecuadas (50.000 - 75.000 células/pocillo), se añaden 20 pl del artículo de ensayo o del ligando de control positivo a los pocillos. El medio añadido a los pocillos se diseña para la detección de la expresión de SEAP inducida por NF-<k>B. Después de 16-24 horas de incubación, la densidad óptica (DO) se lee a 650 nm en un detector de absorbancia Molecular Devices SpectraMax 340PC.
Ligandos de control
hTLR2: HKLM(Listeria monocytogenesdestruida por calor) a 1x108 células/ml
hTLR3: Poli(I:C) HMW a 1 pg/ml
hTLR4: LPS deE. coliK12 a 100 ng/ml
hTLR5: Flagelina de S.typhimuriuma 100 ng/ml
hTLR7: CL307 a 1 pg/ml
hTLR8: CL075 a 1 pg/ml
hTLR9: CpG ODN2006 a 1 pg/ml.
Ejemplo 7 - Estabilidad I
La estabilidad se evalúa comparando los cambios en el área de pico absoluta y el % de área de pico del compuesto sometido a las siguientes condiciones con el área de pico y el % de área de pico obtenidos a partir de soluciones recién preparadas del compuesto en cuestión. El compuesto se presenta en cada una de las siguientes formulaciones:
1. Solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4. Por ejemplo, el tampón PBS puede comprender 8 g de NaCl, 0,2 g de KCI, 1,15 g de hidrogenofosfato disódico y 0,2 g de dihidrogenofosfato de potasio en 1 litro de agua MilliQ.
2. Solución salina al 0,9 % p/p (pH 5,8). Por ejemplo, puede prepararse solución salina disolviendo cloruro de sodio (1,855 g) en 200 ml de agua Milli-Q.
La estabilidad de cada formulación se evalúa en las siguientes condiciones:
1.25 °C/60 % de humedad relativa (ICH ambiental)
2. 40 °C/75 % de humedad relativa (ICH acelerado)
Preparación de las muestras
Se preparan con precisión soluciones de aproximadamente 1 mg/ml de cada compuesto (2 ml) en los sistemas de diluyente PBS y salino.
Todos los compuestos se calientan a aproximadamente 60 °C bajo agua corriente caliente durante aproximadamente 30 segundos, seguido de mezcla con formación de vórtice durante 30 segundos más, y a continuación se subidividen en alícuotas en 3 viales de HPLC separados que se almacenan a 4-8 °C (nevera), 25 °C/65 % de HR y 40 °C/75 % humedad relativa (HR) durante 2 semanas. Los viales se envuelven en papel de aluminio para protegerlos de la luz durante el período de almacenamiento.
Equipos y parámetros operativos
Se usa un UHPLC Nexera de Shimadzu con detector de matriz de diodos para controlar los cambios del área de los picos en t=0 y t=2 semanas.
Se usa un sistema CLEM-8030 de Shimadzu para identificar picos de impurezas y degradantes, y para verificar la selectividad de los métodos de HPLC comprobando a través del pico de HPLC principal posibles componentes coeluyentes. A continuación se describen parámetros de ejemplo de cromatografía de líquidos de ultra alto rendimiento (UHPLC).
Parámetros de UHPLC
Columna - Phenomenex Kinetex Biphenyl, 50 x 2,1 mm, 2,6 pm, N.° de pieza 00B-4622-AN
Viales - Vidrio transparente Agilent, 2 ml con septos multi-inyección, N.° de pieza 226-50512-00
Fase móvil A - formiato de amonio 5 mM en agua Milli-Q
Fase móvil B - acetonitrilo, Merck Grado CL-EM
Solución de aclarado de agujas - agua:metanol 1:1
Volumen de inyección: 1 pl
Temperatura de la Columna:
Temp. del automuestreador:
Caudal total: 0,5 ml/min
Tiempo total de funcionamiento: 10 min
Longitud de onda UV-vis: 205 nm
Tabla 1:Gradiente 1
Tabla 2:Gradiente 2
Parámetros de CLEM
Volumen de inyección de CL: 0,1 pl
Interfaz: IEN
Temperatura de la interfaz: 350 °C
Temperatura de desolvatación: 250 °C
Flujo del nebulizador: 3 l/min
Bloque térmico: 400 °C
Flujo de gas de secado: 15 l/min
Modo de barrido Q3: Positivo
Hora de inicio: 1 min
Hora de final: 8 min
m/z de inicio: 400
m/z final 2000 (INNA-011)
Velocidad de barrido: 15000 g/s
Ejemplo 8 - Estabilidad II
Las estabilidades relativas del compuesto B12 y la del compuesto (8) del documento WO2019/119067 se evaluaron en condiciones aceleradas (40 °C/75 % de HR) durante 9 días. Cada compuesto se preparó a una concentración de 1 mg/ml en una formulación acuosa de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,1 % p/v/solución salina al 0,9 % p/v tamponada a pH 5.
La estructura del compuesto (8) del documento WO2019/119067 es:
La estabilidad se midió mediante HPLC de fase inversa con un detector UV de longitud de onda analítica de 205 nm. Las áreas de los picos de cada compuesto en el punto temporal de 9 días se compararon con las áreas a tiempo cero. La estabilidad del compuesto en el día 9 se calculó como porcentaje de los datos del área del pico del tiempo cero.
La estabilidad del compuesto se evaluó además por comparación con una muestra de referencia del mismo compuesto. Las muestras de referencia se prepararon a una concentración de 1 mg/ml en una formulación acuosa de EDTA al 0,1% p/v/solución salina al 0,9% p/v tamponada a pH 5 y se congelaron durante el período de ensayo. Las muestras descongeladas se sometieron a tratamiento con ultrasonidos y se midieron mediante HPLC. Los resultados se resumen en la Tabla 3.
Tabla 3
Se ha demostrado que el compuesto B12 posee una estabilidad sustancial durante el período de ensayo de 9 días. El compuesto B12 también posee una estabilidad en condiciones aceleradas superior a la del compuesto de comparación.
Ejemplo 9 - Activación de TLR2 II humano
La potencia de los compuestos como activadores de TLR-2 humanos se somete a ensayo en un ensayoin vitroen células HEK-BLUE-hTLR2.
Cultivo de células HEK-BLUE-hTLR2
Las células HEK-BLUE-hTLR2 se diseñan para estudiar la estimulación de TLR2 humano (hTLR2) mediante el seguimiento de la activación de NF-kB. Las células HEK-BLUE-hTLR2 se obtienen por cotransfección de los genes indicadores hTLR2 y SEAP (fosfatasa alcalina embrionaria secretada) en células HEK293. La estimulación con un ligando TLR2 activa NF-kB que induce la producción de SEAP.
Las células HEK-BLUE-hTLR2 se adquirieron en InvivoGen (San Diego, CA, EE. UU.). Las células se cultivaron en DMEM suplementado con un FCS al 10 %, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 ug/ml y L-glutamina 2 mM, Normocin 100 pg/ml en presencia de antibiótico de selección adquirido en InvivoGen y se hicieron pases cuando se alcanzó el 70 % de confluencia según la recomendación del fabricante. Las células se desprendieron y se resuspendieron en los medios de ensayo sugeridos por el fabricante para los ensayos.
Ensayos de compuestos
i) Se preparó una dilución en serie de los compuestos respectivos en solución salina y se añadieron 20 ml de cada dilución por triplicado por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo plano y se colocaron en la incubadora a la espera de las células.
ii) Retirar de la incubadora las células HEK-BLUE-hTLR2 en un matraz T-75 y desechar el medio de cultivo. iii) Aclarar suavemente las células con 10 ml de PBS precalentado
iv) Añadir 5 ml de PBS precalentado y colocar las células a 37 °C durante 2 minutos y, a continuación, desprender las células pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo el PBS en la superficie donde se adhieren las células.
v) La suspensión de células a una densidad de 280.000 células/ml se prepara en un medio de detección HEK-Blue™ adquirido en InvivoGen y preparado según las instrucciones del fabricante,
vi) Añadir inmediatamente 180 ml de la suspensión celular por pocillo de la placa que contiene la solución de los compuestos. A continuación, la placa se vuelve a colocar en la incubadora a 37 °C durante 16 horas y se lee a 620 nm usando un lector de ELISA.
Los resultados de este ensayo para los compuestos B4 y B12 se esbozan en las Tablas 4 (B4) y 5 (B12) y se muestran en la Figura 1 (B4) y en la Figura 2 (B12). Estos datos muestran que los compuestos B4 y B12 presentan una actividad significativa en TLR2, donde la CE<50>del compuesto<b>4 es de 1,3 ng/ml y la CE<50>del compuesto B12 es de 1,6 ng/ml.
Tabla 4.Respuesta a la dosis de TLR2 humano para el compuesto B4.
Notas: Los resultados se presentan como valores de densidad óptica (650 nm)
* Relación entre el valor inducido promedio y el valor no inducido promedio
Tabla 5.Respuesta a la dosis de TLR2 humano para el compuesto B12.
Notas: Los resultados se presentan como valores de densidad óptica (650 nm)
* Relación entre el valor inducido promedio y el valor no inducido promedio
Ejemplo 9 - Activación de TLR2 III humano
La estimulación de los receptores similares a Toll (TLR) se somete a ensayo evaluando la activación de NF-KB en las estirpes celulares que expresan TLR. Se han transfectado células HEK-Blue h/mTLR2 de forma estable con TLR2 y CD14 humanos o de ratón. La actividad de los artículos de ensayo se somete a ensayo en TLR2 humano y de ratón, como agonistas potenciales. Los artículos de ensayo se evalúan en siete concentraciones y se comparan con ligandos de control (véase la lista a continuación). Estas etapas se realizan por triplicado.
Ligandos de control
Respuesta a la dosis de hTLR2 de HEK-Blue:
HKLM(Listería monocytogenesdestruida por calor) a 1,0 x 108, 2,5 x 107, 6,25 x 106, 1.56 x 106, 3,91 x 105, 9.76 x 104 y 2,44 x 104 células/ml
Respuesta a la dosis de mTLR2 de HEK-Blue:
HKLM(Listería monocytogenesdestruida por calor) a 1,0 x 108, 2,5 x 107, 6,25 x 106, 1.56 x 106, 3,91 x 105, 9.76 x 104 y 2,44 x 104 células/ml
TLR - Estirpes celulares de control
Respuesta a la dosis de Null1 de HEK-Blue:
TNFa a 100, 25, 6,25, 1,56, 0,39, 0,098 y 0,024 ng/ml
Control para TLR2 humano
Respuesta a la dosis de Null2 de HEK-Blue:
TNFa a 100, 25, 6,25, 1,56, 0,39, 0,098 y 0,024 ng/ml
Control para TLR2 de ratón
Artículos y materiales de ensayo
Artículo 4: B14
Preparación de artículos de ensayo
Se prepara una serie de dos diluciones seriadas 1:10 en PBS estéril partiendo de la solución madre de 2 mg/ml de cada uno de los compuestos B4, B6, B8, B12, B14 y B16 y terminando con 20 pg/ml. A continuación, se preparó una solución madre de trabajo de 5 pg/ml para cada compuesto a partir de la dilución de 20 pg/ml en PBS estéril. Partiendo de la solución madre de trabajo de 5 pg/ml, se realizó una serie de seis diluciones seriadas 1:4 mezclando 100 pl de la dilución más alta anterior con 300 pl de PBS estéril.
Procedimiento general
El indicador de la fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP) está bajo el control de un promotor inducible por el factor de transcripción NF-<k>B. Este gen indicador permite controlar la señalización a través del TLR, basada en la activación de NF-<k>B. En una placa de 96 pocillos (200 pl de volumen total) que contiene las células adecuadas (50.000 - 75.000 células/pocillo), Se añaden 20 pl del artículo de ensayo o del ligando de control positivo (HKLC) a los pocillos. El medio añadido a los pocillos se diseña para la detección de la expresión de SEAP inducida por NF-<k>B. Después de 16-24 horas de incubación, la densidad óptica (DO) se lee a 650 nm en un detector de absorbancia Molecular Devices SpectraMax 340PC.
Resultados
Todos los artículos de ensayo mostraron actividad agonista de TLR2 tanto para TLR2 humano (hTLR2) como para TLR2 de ratón (mTLR2). Los resultados para el agonista de hTLR se muestran en las Tablas 6 a 12 y en la Figura 3.
Tabla 6.Respuesta a la dosis de hTLR2 de HEK-Blue para el compuesto B4. Los resultados se presentan como valores de densidad óptica (650 nm)
36,3 * Relación entre el valor inducido promedio y el valor no inducido promedio.
Tabla 7.Respuesta a la dosis de hTLR2 de HEK-Blue para el compuesto B6. Los resultados se presentan como valores de densidad óptica (650 nm)
* Relación entre el valor inducido promedio y el valor no inducido promedio.
Tabla 8.Respuesta a la dosis de hTLR2 de HEK-Blue para el compuesto B8. Los resultados se presentan como valores de densidad óptica (650 nm)
* Relación entre el valor inducido promedio y el valor no inducido promedio.
Tabla 9.Respuesta a la dosis de hTLR2 de HEK-Blue para el compuesto B12. Los resultados se presentan como valores de densidad óptica (650 nm)
Concentración (pg/ml)
Cribado 0 0,12 0,49 1,95 7,81 31,25 125 500
1 0,071 1,443 1,892 2,149 2,420 2,492 2,608 2,584
2 0,072 1,313 1,785 2,008 2,446 2,500 2,541 2,404
3 0,077 1,329 1,902 1,979 2,366 2,380 2,555 2,426
Promedio 0,073 1,362 1,860 2,045 2,411 2,457 2,568 2,471
* Relación entre el valor inducido promedio y el valor no inducido promedio.
Tabla 10.Respuesta a la dosis de hTLR2 de HEK-Blue para el compuesto B14. Los resultados se presentan como valores de densidad óptica (650 nm)
Concentración (pg/ml)
Cribado 0 0,12 0,49 1,95 7,81 31,25 125 500
1 0,073 0,826 1,256 1,994 2,569 2,820 2,928 2,722
2 0,073 0,869 1,364 2,061 2,545 2,720 2,800 2,765
3 0,072 0,774 1,406 2,000 2,571 2,691 2,713 2,791
Promedio 0,073 0,823 1,342 2,018 2,562 2,744 2,814 2,759
Factor de inducción*
33,9 * Relación entre el valor inducido promedio y el valor no inducido promedio.
Tabla 11.Respuesta a la dosis de hTLR2 de HEK-Blue para el compuesto B16. Los resultados se presentan como valores de densidad óptica (650 nm)
Concentración (pg/ml)
Cribado 0 0,12 0,49 1,95 7,81 31,25 125 500
1 0,071 0,688 1,080 1,478 1,903 2,093 2,531 2,466
2 0,074 0,591 1,097 1,513 1,897 2,297 2,544 2,488
3 0,072 0,718 1,121 1,573 2,133 2,367 2,545 2,472
Promedio 0,072 0,666 1,099 1,521 1,978 2,252 2,540 2,475
* Relación entre el valor inducido promedio y el valor no inducido promedio.
Tabla 12.Respuesta a la dosis de hTLR2 de HEK-Blue para HKLM. Los resultados se presentan como valores de densidad óptica (650 nm)
Concentración (pg/ml)
Cribado0 24400 97700 391000 1560000 6200000 25000000 100000000
1 0,079 0,124 0,260 0,826 1,809 2,574 2,777 2,607
2 0,081 0,124 0,253 0,769 1,866 2,605 2,747 2,574
3 0,079 0,118 0,271 0,783 1,653 2,382 2,681 2,715
Promedio 0,080 0,122 0,261 0,793 1,776 2,520 2,735 2,632
* Relación entre el valor inducido promedio y el valor no inducido promedio.
Tabla 13.Valores de CE<50>para el agonismo de hTLR2
n.d. = El valor de CE<50>no pudo calcularse por falta de confianza en la extrapolación de la curva de respuesta sigmoidal debido a la elevada actividad a la concentración más baja sometida a ensayo.
Conclusiones
Cada uno de los compuestos B4, B6, B8, B12, B14 y B16 poseen actividad estimuladora para hTLR2 y mTLR2 en el ensayo de HEK-Blue descrito. La respuesta estimuladora no se observó en células HEK-Blue Null1 (humanas) ni HEK-Blue Null2 (de ratón), confirmando que la eficacia de los compuestos está mediada por hTLR2 o mTLR2.
Ejemplo 10 - Activación de TLR2 IV humano
La potencia del compuesto 4 del documento WO2020/257870 y del compuesto B12 como activadores de TLR-2 humanos se somete a ensayo en un ensayoin vitroen células HEK-BLUE-hTLR2.
La estructura del compuesto 4 del documento WO2020/257870 es:
Cultivo de células HEK-BLUE-hTLR2
Las células HEK-BLUE-hTLR2 se diseñan para estudiar la estimulación de TLR2 humano (hTLR2) mediante el seguimiento de la activación de NF-kB. Las células HEK-BLUE-hTLR2 se obtienen por cotransfección de los genes indicadores hTLR2 y SEAP (fosfatasa alcalina embrionaria secretada) en células HEK293. La estimulación con un ligando TLR2 activa NF-kB que induce la producción de SEAP.
Las células HEK-BLUE-hTLR2 se adquirieron en InvivoGen (San Diego, CA, EE. UU.). Las células se cultivaron en DMEM suplementado con un FCS al 10 %, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 ug/ml y L-glutamina 2 mM, Normocin 100 pg/ml en presencia de antibiótico de selección adquirido en InvivoGen y se hicieron pases cuando se alcanzó el 70 % de confluencia según la recomendación del fabricante. Las células se desprendieron y se resuspendieron en los medios de ensayo sugeridos por el fabricante para los ensayos.
Ensayos de compuestos
vii) Se preparó una dilución en serie de los compuestos respectivos en solución salina y se añadieron 20 ml de cada dilución por triplicado por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo plano y se colocaron en la incubadora a la espera de las células.
viii) Retirar de la incubadora las células HEK-BLUE-hTLR2 en un matraz T-75 y desechar el medio de cultivo.
ix) Aclarar suavemente las células con 10 ml de PBS precalentado
x) Añadir 5 ml de PBS precalentado y colocar las células a 37 °C durante 2 minutos y, a continuación, desprender las células pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo el PBS en la superficie donde se adhieren las células.
xi) La suspensión de células a una densidad de 280.000 células/ml se prepara en un medio de detección HEK-Blue™ adquirido en InvivoGen y preparado según las instrucciones del fabricante,
xii) Añadir inmediatamente 180 ml de la suspensión celular por pocillo de la placa que contiene la solución de los compuestos. A continuación, la placa se vuelve a colocar en la incubadora a 37 °C durante 16 horas y se lee a 620 nm usando un lector de ELISA.
Los resultados de este ensayo para el compuesto 4 del documento WO2020/257870 y el compuesto B12 se muestran en la Figura 4. Estos datos muestran que estos compuestos presentan una actividad significativa en TLR2.
Ejemplo 11 - Estabilidad III
Siguiendo un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 8, los compuestos B12, B14, B16 y el compuesto 4 del documento WO2020/257870 se sometieron a condiciones de envejecimiento acelerado a 40 °C durante 3 o 6 semanas. La recuperación del compuesto diana se evaluó mediante HPLC, y los valores como porcentaje de la muestra de referencia se indican en la Tabla 14 y en la Figura 5.
Tabla 14.Resultados de porcentaje de recuperación a 40 °C
B16 89,97 % 88,35 %
Estos datos muestran que cada uno de los compuestos B12, B14 y B16 poseen una excelente estabilidad en condiciones de almacenamiento acelerado. Además, cada uno de los compuestos B12, B14 y B16 demostraron una mejora de la estabilidad en el almacenamiento en comparación con el compuesto 4 del documento WO2020/257870.
Ejemplo 12 - Estabilidad IV
Siguiendo un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 8, el compuesto 8 del documento WO2019/119067, el compuesto 4 del documento WO2020/257870 y los compuestos B4 y B12 se evaluaron en cuanto a su estabilidad en el almacenamiento en condiciones aceleradas durante un período de 28 días. Cada compuesto se formuló en solución salina al 0,9 % en peso con adición de EDTA al 0,1 % en peso a aproximadamente pH 5. Las formulaciones se almacenaron en la oscuridad en condiciones aceleradas (40 °C/75 % de HR) y las formulaciones de referencia se almacenaron a -80 °C. Los días 0, 9 y 28, las muestras se analizaron mediante UHPLC y se midió el pH.
Este experimento demuestra que tras el almacenamiento en condiciones aceleradas después de 28 días, B4 y B12 son los compuestos más estables.
Preparación de las muestras
Se pesaron aproximadamente 1,5 mg de cada compuesto en viales de vidrio para HPLC y se añadieron 1,5 ml de formulación de solución salina/EDTA ajustada a pH 5,0. Los viales se mezclaron con formación de vórtice y a continuación se calentaron bajo el chorro de agua caliente hasta que se observó una disolución completa. Los pesos reales y las concentraciones de los compuestos se presentan en la Tabla 15.
Tabla 15.Pesos y concentraciones del compuesto formulado
Se transfirieron alícuotas de 4 x 100 ul de cada solución a viales de HPLC Agilent de polipropileno de 200 pl para su almacenamiento en condiciones aceleradas y de referencia (dos alícuotas en cada condición). Estos viales se retiraron en cada punto temporal para el análisis mediante HPLC. Las soluciones de referencia congeladas el día 9 y el día 28 se calentaron suavemente con agua caliente corriente, se mezclaron con formación de vórtice durante ~ 10 segundos y se sometieron a tratamiento con ultrasonidos durante 10 minutos para favorecer su disolución completa.
Los ~ 1 ml restantes de solución en los viales de vidrio transparente para HPLC se almacenaron a 40 °C/75 % de HR y se usaron para medir el pH en cada punto temporal.
Análisis por UHPLC
El análisis por UHPLC del compuesto 8 del documento WO2019/119067, el compuesto 4 del documento WO2020/257870, B4 y B12, se realizó usando las siguientes condiciones:
Columna: Phenomenex Kinetex Biphenyl, 50 mm x 2,1 mm, 2,6 pm, N.° de pieza 00B-4622-AN
Fase móvil A: Formiato de amonio 5 mM en agua Milli-Q, pH no ajustado
Fase móvil B: acetonitrilo, Merck Grado CL-EM
Solución de aclarado de agujas: agua:metanol 1:1
Volumen de inyección: 5 pl
Temperatura de la Columna: 40 °C
Temp. del automuestreador: 20 °C
Caudal total: 0,5 ml/min
Tiempo total de funcionamiento: 10 min
Longitud de onda UV-vis: 205 nm
El compuesto 8 del documento WO2019/119067 y el compuesto 4 del documento WO2020/257870 se analizaron según el Gradiente 1:
Tabla 16.Gradiente 1
Los compuestos B4 y B12 se analizaron según el Gradiente 2:
Tabla 17.Gradiente 2
Resultados de la UHPLC
Los resultados de la UHPLC se analizaron de manera similar a la descrita en el Ejemplo 8. Los resultados se presentan como porcentaje de recuperación del área del pico principal (Tabla 18).
El porcentaje de recuperación del área del pico principal se calcula según la siguiente ecuación (1):
Á r e a de l p ico p r i n c i p a l ( a c e le ra d o )
P o r c e n t a j e d e r e c u p e r a c i ó n = j
Á r e a de l p ico p r i n c i p a l ( c o n g e la d o )x 100 (1)
Tabla 18.Resultados de estabilidad calculados como porcentaje de recuperación del área del pico principal
La mayor diferenciación en la estabilidad de los compuestos se observó en el punto temporal de 28 días (Tabla 18). El día 9 se había producido muy poca degradación como para que pudieran observarse distinciones claras entre los compuestos. Sobre la base de los datos de 28 días de la Tabla 18, los compuestos B4 y B12 son los más estables.
Resultados de pH
Los datos de pH de la formulación registrados en cada punto temporal se recopilan en la Tabla 19. Hubo una tendencia general a que el pH aumentara con el tiempo, pero el efecto no fue pronunciado. Esto indica que no se ha producido una degradación grave.
Tabla 19. Resultados de pH en los días 0, 9 y 28
Conclusiones
Estos datos de estabilidad por UHPLC y pH sugieren que los compuestos de esta invención demuestran una mayor estabilidad en comparación con otros agonistas de TLR2 estructuralmente relacionados.

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un compuesto de fórmula (I):
    en donde: R21 se selecciona del grupo que consiste en H, -CH<2>OH, -CH<2>CH<2>OH, -CH(CH3)OH, -CH<2>OPO(OH)<2>, -CH<2>C(=O)NH<2>, -CH<2>CH<2>C(=O)OH y -CH<2>CH<2>C(=O)OR<8>, en donde uno cualquiera de los hidrógenos de alquilo puede reemplazarse por un halógeno; R22 es H, C<1>-C<6>alifático, un grupo protector de amino, L3-C(=O)- o A2; L1 y L2 son cada uno independientemente C<6>-C<21>alifático o C<5>-C<20>heteroalifático; L3 es C<1>-C<21>alifático o C<2>-C<20>heteroalifático; A2 es un aminoácido o un péptido; R23 es H o C<1>-C<6>alifático; R24a y R25a se seleccionan cada uno independientemente de C<1>-C<6>alifático y C<1>-C<6>heteroalifático y R24b y R25b se seleccionan independientemente de H, C<1>-C<6>alifático y C<1>-C<6>heteroalifático, o R24a y R24b junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un grupo cicloalquilo C<3-8>o heterocíclico de 3-8 miembros, y/o R25a y R25b junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un grupo cicloalquilo C<3-8>o heterociclilo de 3-8 miembros; X se selecciona de -S-, -S(=O)- y -S(=O)<2>-; v es un número entero de 1 -3 R26 y R27 se seleccionan independientemente de H y C<1>-C<6>alifático; Z1 y Z2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en -C(=O)O-, -OC(=O)-, -C(=O)NR-, -NRC(=O)-, -C(=O)S-, -SC(=O)-, -OC(=O)O-, -NRC(=O)O-, -OC(=O)NR- y -NRC(=O)NR-; PEG es un polietilenglicol; en donde cualquier alifático, heteroalifático, cicloalquilo y heterociclilo presente en cualquiera de R21, R22, R23, R24a, R24b, R25a, R25b, R26, R27, L1, L2 y L3 está opcionalmente sustituido o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo.
  2. 2. El compuesto de la reivindicación 1, o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el PEG es un polietilenglicol sustituido de fórmula B-I:
    en donde n es de 3 a 100; m es 1,2, 3 o 4; p es 2, 3 o 4; q es nulo o 1; R<3>es H, -NH<2>u -OH, en donde cuando q es nulo, R<3>es H y cuando q es 1, R<3>es -NH<2>u -OH; L es nulo o consiste en 1 a 10 unidades, en donde cada unidad es un alfa aminoácido natural o deriva de un alfa aminoácido natural, y tiene la fórmula:
    en donde R<4>es H; y R<5>es la cadena lateral o segundo hidrógeno del aminoácido.
  3. 3. El compuesto de la reivindicación 1 o 2, o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R24b y R25b son H.
  4. 4. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R24a y R25a son independientemente un C<1>-C<6>alifático, preferiblemente en donde R24a y R25a son independientemente un alquilo C<1>-C<6>, más preferiblemente en donde R24a y R25a son cada uno metilo.
  5. 5. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde v es 1 o 2.
  6. 6. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde X es -S-.
  7. 7. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R22 es H.
  8. 8. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R23 es H.
  9. 9. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R26 es H.
  10. 10. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R27 es H.
  11. 11. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R21 es -CH<2>OH.
  12. 12. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde Z1 y Z2 son cada uno -C(=O)-O-.
  13. 13. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes seleccionado de uno cualquiera de los siguientes compuestos:
    o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo.
  14. 14. Una composición que comprende un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo, y opcionalmente un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
  15. 15. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, o una sal, solvato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en cualquiera de: • suscitar una respuesta inmunitaria innata; y/o • tratar y/o prevenir una enfermedad provocada por un agente infeccioso; y/o • tratar y/o prevenir una enfermedad o afección respiratoria asociada a una infección vírica o bacteriana; y/o • tratar y/o prevenir una infección respiratoria; y/o • reducir la inflamación de las vías respiratorias; y/o • mejorar la capacidad de un sujeto para controlar una enfermedad o afección respiratoria durante una infección vírica respiratoria; y/o • tratar y/o prevenir una enfermedad o afección asociada al receptor TLR2.
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