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ES3035137T3 - Cl and/or ch1 mutated antibodies for drug conjugation - Google Patents

Cl and/or ch1 mutated antibodies for drug conjugation

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Publication number
ES3035137T3
ES3035137T3 ES20212421T ES20212421T ES3035137T3 ES 3035137 T3 ES3035137 T3 ES 3035137T3 ES 20212421 T ES20212421 T ES 20212421T ES 20212421 T ES20212421 T ES 20212421T ES 3035137 T3 ES3035137 T3 ES 3035137T3
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ES
Spain
Prior art keywords
combination
antibody
seq
amino acid
mutations
Prior art date
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Active
Application number
ES20212421T
Other languages
English (en)
Inventor
De La Cuesta Ramon Gomez
Jesús Zurdo
Lars Arne Andreas Arnell
Laurent Ducry
Laurence Bonnafoux
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lonza AG
Original Assignee
Lonza AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority claimed from GBGB1504858.0A external-priority patent/GB201504858D0/en
Application filed by Lonza AG filed Critical Lonza AG
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Abstract

Se describen anticuerpos con regiones constantes modificadas que permiten su conjugación con una carga útil, como un agente terapéutico. Los anticuerpos preferidos incluyen una mutación en la posición 180 de la cadena ligera (numeración posicional); preferiblemente, la mutación se produce en un residuo seleccionado entre C, K, Q o un aminoácido no natural. También se pueden combinar mutaciones adicionales con una mutación en la posición 180, incluyendo una o más de las siguientes: cadena ligera (LC) S208, LC S171, LC S182, LC A184, LC V191, LC S202, LC S203, LC T206, cadena pesada (HC) S160, HC T190, HC S443, HC S447, HC S139, HC S168, HC V170, HC V176, HC T200 y HC S445, según una convención de numeración posicional. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos mutados CL y/o CH1 para conjugación de fármacos
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un anticuerpo o un fragmento del mismo, que tiene una región variable que se une a una molécula diana, y una región constante, donde la región constante comprende una o más mutaciones que introducen un sitio de conjugación específico del sitio seleccionado de manera que permita la conjugación del anticuerpo o fragmento a una carga útil, donde una o más mutaciones incluyen una mutación en la posición de cadena ligera 208, donde el residuo mutado en la posición de cadena ligera 208 es cisteína, donde el anticuerpo se selecciona del grupo que comprende lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4, y donde el fragmento conserva las propiedades de unión específicas del anticuerpo. Preferiblemente, los anticuerpos conjugados producen una relación deseada entre carga útil y anticuerpo.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC, por sus siglas en inglés) son una clase de terapias dirigidas que combinan la especificidad de los anticuerpos con la citotoxicidad de las terapias citotóxicas. Los ADC se consideran principalmente candidatos para el tratamiento de diversos tipos de cáncer. Los ADC comprenden un anticuerpo unido a un fármaco terapéutico.
Un problema con el desarrollo de ADC es la tecnología de conjugación utilizada; si los medicamentos se conjugan de forma no selectiva con residuos de cisteína o lisina en el anticuerpo, esto puede dar lugar a una mezcla heterogénea de ADC. Este enfoque conduce a propiedades de seguridad y eficacia subóptimas y dificulta la optimización de las propiedades biológicas, físicas y farmacológicas de un ADC. En particular, la heterogeneidad puede ser un problema con respecto a la distribución de citotoxinas (es decir, el sitio de unión) y la carga de citotoxinas (es decir, el número de moléculas de fármaco por anticuerpo).
La heterogeneidad presenta problemas de seguridad debido a que las especies de alta proporción de fármacoIanticuerpo (DAR, por sus siglas en inglés) pueden tener una unión deficiente con su objetivo y aumentar los riesgos de toxicidad fuera del objetivo. Las especies con baja carga de fármaco son menos activas (DAR 1) o inactivas (DAR 0). A medida que disminuye el número de fármacos por mAb, las propiedades farmacocinéticas del ADC mejoran (Hamblett, Clin. Cancer Res. 2004, 10, 7063-7070). Además, la heterogeneidad de los ADC genera desafíos asociados con la fabricación consistente y las pruebas analíticas.
Se presume que la conjugación selectiva del sitio (SSC, por sus siglas en inglés) mejoraría la seguridad y eficacia de los ADC y, por lo tanto, daría como resultado una mayor calidad de los mismos. Junutula et al., Nature Biotech 2008, informan que se logra la misma actividad con la mitad de la dosis de ADC en un SSC-ADC en comparación con el control. Por tanto, la homogeneidad del ADC mejorará el índice terapéutico (Tl, por sus siglas en inglés, es la relación entre la dosis máxima tolerada y la dosis efectiva. (Tl = TD50/DE50)). Además, una mayor homogeneidad del DAR daría como resultado:
- Caracterización más sencilla del producto para presentaciones reglamentarias, especificaciones del producto mejor definidas y
- Reducción de la toxicidad fuera del objetivo o de los transeúntes
- Farmacología potencialmente más controlada (menos especies a tener en cuenta)
- Reducir potencialmente los requisitos de dosis (por gramo) para lograr un efecto farmacológico similar - Reducir la incidencia potencial de efectos secundarios (por ejemplo, inmunogenicidad, toxicidad, etc.)
- Reducir los costos debido a mayores rendimientos de conjugación y dosis reducidas (cantidad requerida de ADC a administrar).
El documento US 2014/370020 describe anticuerpos en los que se regula la asociación de las cadenas pesadas y las cadenas ligeras, y específicamente anticuerpos biespecíficos en los que se regula la asociación en la interfaz de CH1 y CL.
El documento US 2014/112914 describe complejos polipeptídicos que permiten el tratamiento del cáncer al tener células T cerca de las células cancerosas objetivo y utilizar la citotoxicidad de las células T contra las células cancerosas objetivo.
Junutula et al. 2008 (“La conjugación específica del sitio de un fármaco citotóxico con un anticuerpo mejora el índice terapéutico”. Nature biotechnology, vol. 26(8): 925-932 (2008)) describe el uso de pistas de métodos basados en presentación de fagos descritos previamente para predecir sitios de conjugación adecuados y la ingeniería de sustituciones de cisteína en posiciones en cadenas ligeras y pesadas que proporcionan grupos tiol reactivos y no perturban el plegamiento y ensamblaje de inmunoglobulina, ni alteran la unión del antígeno. Junutula et al. muestran que cuando se conjuga con monometil auristatina E, un anticuerpo contra el antígeno del cáncer de ovario MUC16 es tan eficaz como un conjugado convencional en modelos de xenoinjerto de ratón.
Panowski et al 2014 (“Conjugados de anticuerpos y fármacos específicos del sitio para la terapia del cáncer”. mAbs, vol.
6(1): 34-45 (2014)) describe varias estrategias de conjugación de sitio específico que se utilizan actualmente para la producción de ADC, incluido el uso de residuos de cisteína diseñados, aminoácidos no naturales y conjugación enzimática a través de glicotransferasas y transglutaminasas.
Bhat et al. 2014 (“El siguiente paso en el desarrollo de bioconjugados homogéneos optimizando la colocación de la carga útil y la composición del conjugado”. BioProcess International, 12(9):10-25 (2014)) analiza las tecnologías de ADC y la vinculación de la carga útil mediante un residuo de lisina o cisteína. Bhat et al. también analizan la tecnología THIOMAB, un método para diseñar residuos de cisteína reactivos en posiciones específicas de un anticuerpo y usarlos para la conjugación sin afectar los enlaces disulfuro intercadena nativos.
El documento WO 2013/093809 describe un polipéptido de dominio constante de anticuerpo diseñado, o una porción del mismo, donde el dominio constante diseñado comprende al menos una sustitución de aminoácido para introducir un residuo de cisteína útil para la conjugación.
El documento WO 2016/141285 describe compuestos que comprenden anticuerpos específicos del sitio o fragmentos inmunorreactivos de los mismos que tienen uno o más residuos de cisteína desapareados conjugados con citotoxinas y el uso de estos compuestos para el tratamiento o profilaxis del cáncer y cualquier recurrencia o metástasis del mismo.
Zurdo et al. 2015 (“ Implementación temprana de QbD en el desarrollo biofarmacéutico: un ejemplo práctico”. BioMed research international, vol. 2015: 1-19 (2015)) analiza cómo la evaluación temprana de riesgos, utilizando metodologías de desarrollo y métodos computacionales en particular, puede ayudar a reducir los riesgos durante el desarrollo de fármacos de una manera rentable.
Sin embargo, la simple producción de anticuerpos con residuos modificados puede dar lugar a efectos imprevistos, como cambios en la propensión a la agregación de los anticuerpos, su solubilidad o su eficacia. Por lo tanto, los presentes solicitantes desarrollaron un proceso de selección racional para determinar qué residuos pueden modificarse. En realizaciones seleccionadas, la modificación logra un anticuerpo adecuado para la conjugación con una carga útil (como un fármaco) para dar un DAR de alrededor de 2.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
Según un primer aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo o un fragmento del mismo, que tiene una región variable que se une a una molécula diana, y una región constante, donde la región constante comprende una o más mutaciones que introducen un sitio específico de un sitio de conjugación seleccionado de manera que permita la conjugación del anticuerpo o fragmento a una carga útil, donde una o más mutaciones incluyen una mutación en la posición de cadena ligera 208, donde el residuo mutado en la posición de cadena ligera 208 es cisteína, donde el anticuerpo se selecciona del grupo que comprende lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4.
La invención queda definida por las reivindicaciones adjuntas. Otras realizaciones descritas en este documento son sólo para fines ilustrativos.
Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).
El anticuerpo puede comprender dos sitios de conjugación específicos del sitio introducidos.
En realizaciones preferidas, el residuo de tipo salvaje en la posición 208 es S.
En ciertas realizaciones, el anticuerpo puede comprender además una o más mutaciones seleccionadas entre cadena ligera (LC) T180, LC S171, LC S182, LC A184, LC V191, LC S202, LC S203, LC T206, cadena pesada (HC) S160, HC T190, HC S443, HC S447, HC S139, HC S168, HC V170, HC V176, HC T200, HC S445 de acuerdo con una convención de numeración posicional. Aunque no están abarcadas por el texto de las reivindicaciones, otras mutaciones están en una o más posiciones seleccionadas entre los residuos 206 (cadena ligera), 160, 190, 443 y 447 (cadena pesada) (numeración posicional). Los residuos mutados se seleccionan preferiblemente de forma independiente entre cisteína, lisina, glutamina o un aminoácido no natural, y lo más preferiblemente es cisteína. Por ejemplo, la modificación de anticuerpos con aminoácidos no naturales se describe en WO2013/185115.
En una realización adicional, el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 40; donde X es C. El anticuerpo puede comprender además una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID No 22-39; donde cada X es cisteína.
Aunque no está abarcado por el texto de las reivindicaciones, también se proporciona un anticuerpo, o un fragmento o derivado del mismo, que tiene una región variable que se une a una molécula objetivo, y una región constante, donde la región constante comprende una o más mutaciones que introducen un sitio de conjugación específico del sitio seleccionado para permitir la conjugación del anticuerpo, fragmento o derivado a una carga útil, donde una o más mutaciones incluyen una mutación en la posición de cadena ligera 180 (numeración posicional).
El anticuerpo puede comprender dos sitios de conjugación específicos del sitio introducidos.
Nuevamente, no de acuerdo con la invención reivindicada, el residuo de tipo salvaje en la posición 180 es T. El residuo mutado en la posición 180 se selecciona preferiblemente entre cisteína, lisina, glutamina o un aminoácido no natural, y es más preferiblemente cisteína.
Además, no de acuerdo con la invención reivindicada, el anticuerpo puede comprender además una o más mutaciones seleccionadas entre cadena ligera (LC) S208, LC S171, LC S182, LC A184, LC V191, LC S202, LC S203, LC T206, cadena pesada (HC) S160, HC T190, HC S443, HC S447, HC S139, HC S168, HC V170, HC V176, HC T200, HC S445 de acuerdo con una convención de numeración posicional. Las mutaciones preferidas están en una o más posiciones seleccionadas entre los residuos 206 (cadena ligera), 160, 190, 443 y 447 (cadena pesada) (numeración posicional). Los residuos mutados se seleccionan preferiblemente de forma independiente entre cisteína, lisina, glutamina o un aminoácido no natural, y lo más preferiblemente es cisteína. Por ejemplo, la modificación de anticuerpos con aminoácidos no naturales se describe en WO2013/185115.
Además, no de acuerdo con la invención reivindicada, se proporciona un anticuerpo, o un fragmento o derivado del mismo, que tiene una región variable que se une a una molécula diana, y una región constante, donde la región constante comprende una o más mutaciones que introducen un sitio de conjugación específico del sitio seleccionado de manera que permita la conjugación del anticuerpo, fragmento o derivado a una carga útil, donde el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 33; donde X se selecciona entre C, K, Q o un aminoácido no natural. El anticuerpo puede comprender además una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID No 22-32 y s Eq ID No 34-40; donde cada X se selecciona independientemente entre C, K, Q o un aminoácido no natural, y es más preferiblemente cisteína.
Además, no de acuerdo con la invención reivindicada, se proporciona un anticuerpo aislado o diseñado, o un fragmento o derivado del mismo, que tiene una región variable que se une a una molécula objetivo, y una región constante, donde la región constante comprende una o más mutaciones que introducen un sitio de conjugación específico del sitio mediante:
a) sustituir un residuo seleccionado del grupo que consiste en cadena ligera (LC) T180, LC S208, LC S171, LC S182, LC A184, LC V191, LC S202, LC S203, LC T206, cadena pesada (HC) S160, HC T190, HC S443, HC S447, HC S139, HC S168, HC V170, HC V176, HC T200, HC S445 de acuerdo con una convención de numeración posicional con un residuo de cisteína, un residuo de lisina, un residuo de glutamina o un aminoácido no natural; o
b) introducir una sustitución de cisteína en un residuo seleccionado del grupo que consiste en LC T180C, LC S208C, LC S171C, LC S182C, LC A184C, LC V191C, LC S202C, LC S203C, LC T206C, HC S160C, HC T190C, HC S443C, HC S447C, HC S139C, HC S168C, HC V170C, HC V176C, HC T200C, HC S445C de acuerdo con una convención de numeración posicional; o
c) que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID No 22 a 40, donde X es un residuo de cisteína, un residuo de lisina, un residuo de glutamina o un aminoácido no natural; o d) que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID No 22 a 40, donde X es un residuo de cisteína.
Además, no de acuerdo con la invención reivindicada, se proporciona un anticuerpo, o un fragmento o derivado del mismo, que tiene una región variable que se une a una molécula diana, y una región constante, donde la región constante comprende una o más mutaciones que introducen un sitio de conjugación específico del sitio seleccionado de manera que permita la conjugación del anticuerpo, fragmento o derivado a una carga útil, donde el anticuerpo incluye una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 109-214 de SEQ ID No 14.
Además, no de acuerdo con la invención reivindicada, se proporciona un anticuerpo, o un fragmento o derivado del mismo, que tiene una región variable que se une a una molécula diana, y una región constante, donde la región constante comprende una o más mutaciones que introducen un sitio de conjugación específico del sitio seleccionado de manera que permita la conjugación del anticuerpo, fragmento o derivado a una carga útil, donde el anticuerpo incluye una región constante de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 109-214 de SEQ ID No 21.
Las siguientes características pueden aplicarse a todos los aspectos de la invención. El anticuerpo se selecciona preferiblemente del grupo que comprende lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4. La cadena ligera puede ser kappa o lambda, y la región constante de la cadena ligera puede ser C kappa (Ck) o C lambda (CA). La región constante puede comprender al menos una porción de una región constante lgG1, preferiblemente uno o más, preferiblemente todos, los dominios Ck, CH1 y CH3 de la región constante lgG1. El anticuerpo puede seleccionarse del grupo que consiste en Fabs, fragmentos de anticuerpos biespecíficos (scFv-Fc en tándem, scFv-Fc con protuberancias en agujeros, scFv-Fc-scFv, F(ab')2, FabscFv, (Fab'scFv)2, scDiacuerpo-Fc o scDiacuerpo-CH3), anticuerpos biespecíficos basados en IgG (hibridoma híbrido, protuberancias en agujeros con cadena ligera común, IgG dos en uno, IgG de dominio V dual, IgG-scFv, scFv-IgG, IgG-V, V- IgG) y di-diacuerpo. El anticuerpo puede ser humano, humanizado o quimérico.
Nuevamente, no de acuerdo con la invención reivindicada, los anticuerpos pueden seleccionarse entre Abciximab; Rituximab; Basiliximab;Dadizumab; Palivizumab; Infliximab; Trastuzumab; Alemtuzumab; Adalimumab; Efalizumab; Cetuximab; Ibritumumab; Omalizumab; Bevacizumab; Ranibizumab; Golimumab; Canakinumab; Ustekinumab; Tocilizumab; Ofatumumab; belimumab; Ipilimumab; brentuximab; pertuzumab; Raxibacumab; Vedolizumab; Ramucirumab; Obinutuzumab; Siltuximab; Secukinumab; Dinutuximab.
Nuevamente, no de acuerdo con la invención reivindicada, el anticuerpo puede carecer de una o más funciones efectoras de Fc; puede carecer de actividad ADCC; o puede tener una actividad ADCC aumentada.
Además, no de acuerdo con la invención reivindicada, se proporciona un anticuerpo, o un fragmento o derivado del mismo, que tiene una región variable que se une a una molécula diana, y una región constante, donde la región constante comprende una o más mutaciones que introducen un sitio de conjugación específico del sitio seleccionado de manera que permita la conjugación del anticuerpo, fragmento o derivado a una carga útil, donde el anticuerpo incluye una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 14. El anticuerpo puede incluir una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID No 2 a SEQ ID No 12.
Además, no de acuerdo con la invención reivindicada, se proporciona un anticuerpo, o un fragmento o derivado del mismo, que tiene una región variable que se une a una molécula diana, y una región constante, donde la región constante comprende una o más mutaciones que introducen un sitio de conjugación específico del sitio seleccionado de manera que permita la conjugación del anticuerpo, fragmento o derivado a una carga útil, donde el anticuerpo incluye una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 21. El anticuerpo puede incluir una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID No 2 a SEQ ID No 12.
La invención proporciona además un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo según cualquiera de los aspectos anteriores de la invención, una carga útil y un enlazador que une la carga útil al anticuerpo. El enlazador puede seleccionarse entre 6-maleimidocaproilo (MC), maleimidopropanoilo (MP), valina-citrulina (val-cit), alanina-fenilalanina (ala-phe), p-aminobenciloxicarbonilo (PAB), N-succinimidilo 4-(2-piridiltio) pentanoato (SPP), N-succinimidilo 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1 carboxilato (SMCC), N-succinimidilo, (4-yodo-acetil) aminobenzoato (SIAB) y 6-maleimidocaproil-valina-citrulina-p-aminobenciloxicarbonilo (MC-vc-PAB); o es un enlazador ramificado que comprende una cadena peptídica y se deriva del alcohol p-amino bencílico o-hidroxi, donde la cadena peptídica está conectada al anillo de fenilo a través del grupo p-amino, la carga útil está conectada al anillo de fenilo a través de la fracción de alcohol bencílico y el anticuerpo está conectado al anillo de fenilo a través del grupo o-hidroxi.
La carga útil se puede seleccionar del grupo que consiste en 90Y, 1311, 67Cu, 177Lu, 213Bi, 211At, dolastatina, vedotina, monometil auristatina F, maitansinoides incluyendo DM1 y DM4, análogos de duocarmicina, caliqueamicina, pirrolobenzodiazepinas, centanamicina, irinotecán y doxorrubicina, exotoxina A de Pseudomonas, toxina de difteria, ricina, polietilenglicol, hidroxietil almidón y un residuo de manosilo. La carga útil puede ser un agente disruptor de microtúbulos o un agente modificador del ADN.
Además, no de acuerdo con la invención reivindicada, la carga útil puede seleccionarse entre un radionúclido, un agente quimioterapéutico, un agente citotóxico, una toxina microbiana, una toxina vegetal, un polímero, un carbohidrato, una citocina, una etiqueta fluorescente, una etiqueta luminiscente, una etiqueta enzima-sustrato, una enzima, un péptido, un peptidomimético, un nucleótido, un ARNi, un microARN, un ARN mimético y un aptámero. Un polímero preferido es una molécula de PEG.
La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un inmunoconjugado según cualquiera de los aspectos anteriores, y un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Además, no de acuerdo con la invención reivindicada, se proporciona un método para generar un inmunoconjugado, comprendiendo el método conjugar un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores a una carga útil.
Además, no de acuerdo con la invención reivindicada, se proporciona un proceso para preparar un anticuerpo que comprende:
(i) mutagenizar una secuencia de ácido nucleico de un anticuerpo parental reemplazando uno o más residuos de aminoácidos con un residuo mutante para codificar el anticuerpo;
(ii) expresar el anticuerpo mutante; y
(iii) aislar el anticuerpo mutante.
El anticuerpo puede expresarse en una célula procariota (como E. coli o Bacillus) o eucariota (como levadura (Pichia, Saccharomyces, Hansenula, Yarrowia) o células de mamíferos (células CHO, células NSO, células SP2/0, células 293) o células de insecto (células SF9).
El proceso puede comprender además:
(i) hacer reaccionar el anticuerpo mutante con un reactivo de afinidad reactivo al tiol para generar un anticuerpo marcado por afinidad; y
(ii) medir la unión del anticuerpo marcado por afinidad a un medio de captura.
Además, no de acuerdo con la invención reivindicada, se proporciona un anticuerpo, o un fragmento o derivado del mismo, que tiene una región variable que se une a una molécula diana, y una región constante, donde la región constante comprende una o más mutaciones que introducen un sitio de conjugación específico del sitio seleccionado de manera que permita la conjugación del anticuerpo, fragmento o derivado a una carga útil, de modo que entre el 85 % y el 110 % de los sitios de conjugación específicos del sitio por anticuerpo están conjugados a una carga útil. En una realización preferida, al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 100 % de los sitios de conjugación específicos del sitio por anticuerpo están conjugados a una carga útil. Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, el anticuerpo puede comprender dos sitios de conjugación específicos del sitio (es decir, uno en la cadena pesada o ligera, y dos de dichas cadenas por anticuerpo). Para dicho anticuerpo, una conjugación del 85-110 % produce una relación fármaco-anticuerpo (DAR) de entre 1,7 y 2,2. En ciertas realizaciones, la DAR es preferiblemente de 1,8 a 2,1, más preferiblemente de 1,9 a 2,1 y lo más preferiblemente alrededor de 2,0.
Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, el anticuerpo comprende cuatro sitios de conjugación específicos del sitio (es decir, uno en la cadena pesada y uno en la cadena ligera, o dos en la cadena pesada y ninguno en la cadena ligera, o ninguno en la cadena pesada y dos en la cadena ligera, y dos de dichas cadenas por anticuerpo). Para dicho anticuerpo, una conjugación del 85-110 % produce una relación fármaco-anticuerpo (DAR) de 2x (1,7-2,2), es decir, 3,4 -4,4. En ciertas realizaciones, la DAR es preferiblemente de 2x1,8-2,1, es decir, 3,6-4,2, más preferiblemente de 2x1,9-2,1, es decir, 3,8-4,2, y lo más preferiblemente alrededor de 2x2,0, es decir, 4.
El anticuerpo, fragmento o derivado puede conjugarse directa o indirectamente a la carga útil; la conjugación indirecta puede tener lugar a través de un enlazador. El anticuerpo puede comprender además un enlazador. Los enlazadores adecuados incluyen enlazadores de maleimida, que permiten la conjugación con una carga útil a través de la conjugación con succinimida. El enlazador puede ser escindible o no escindible. Otros enlazadores adecuados se describen en la solicitud de patente internacional WO2012/113847, que describe un enlazador ramificado que comprende una cadena peptídica y se deriva del alcohol bencílico p-amino o-hidroxi, donde la cadena peptídica está conectada al anillo de fenilo a través del grupo p-amino, el fármaco está conectado al anillo de fenilo a través de la fracción de alcohol bencílico y el anticuerpo está conectado al anillo de fenilo a través del grupo o-hidroxi.
La región constante comprende preferiblemente al menos una porción de una región constante de IgG, IgA, IgD, IgE o IgM, más preferiblemente una región constante de IgG humana. En realizaciones preferidas, la región constante es una región constante de IgG de longitud completa, aunque en otras realizaciones se pueden utilizar regiones constantes truncadas o solo regiones constantes de cadena ligera o pesada. Por ejemplo, la región constante puede comprender uno o más, preferiblemente todos, los dominios Ck, CH1 y CH3 de la región constante de IgG. Una IgG preferida es IgG1, otras IgG incluyen IgG2, IgG3 y IgG4.
Por “anticuerpo” se entiende cualquier molécula de inmunoglobulina que se une al antígeno. El anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo mamífero completo (que comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, cada una de las cuales incluye una región constante y una región variable), pero se pueden utilizar otras formas de anticuerpo y derivado. Por ejemplo, Fabs, fragmentos de anticuerpos biespecíficos (scFv-Fc en tándem, scFv-Fc con protuberancias en agujeros, scFv-Fc-scFv, F(ab')<2>, Fab-scFv, (Fab'scFv)<2>, scDiacuerpo-Fc o scDiacuerpo-C<H>3), anticuerpos biespecíficos basados en IgG (hibridoma híbrido, protuberancias en agujeros con cadena ligera común, IgG dos en uno, IgG de dominio V dual, IgG-scFv, scFv-IgG, IgG-V, V-IgG) y di-diacuerpo. Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, el anticuerpo puede ser un minicuerpo, tribi-minicuerpo, nanocuerpos,
El anticuerpo puede ser humano, humanizado o quimérico.
Las una o más mutaciones comprenden preferiblemente una mutación de un aminoácido no cisteína a un aminoácido cisteína. Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, el aminoácido no cisteína también puede seleccionarse entre serina, valina, treonina o alanina; más preferiblemente serina o treonina. Alternativamente, la mutación puede ser de lisina, glutamina o un aminoácido no natural.
Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, la una o más mutaciones se seleccionan entre S160C, T190C, S443C, S447C (en la cadena pesada), T180C o T206C (en la cadena ligera). La numeración aquí citada es una numeración posicional basada en la secuencia completa de trastuzumab. Otras convenciones de numeración se resumen en la siguiente tabla:
Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, los anticuerpos incluyen la mutación de la cadena ligera T180. Esta puede ser la única mutación o puede combinarse con cualquiera de las otras mutaciones descritas en este documento.
Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, los anticuerpos comprenden combinaciones de 2 mutaciones que se seleccionan del grupo de
LC T180 en combinación con LC S208,
LC T180 en combinación con LC S171,
LC T180 en combinación con LC S182,
LC T180 en combinación con LC A184,
LC T180 en combinación con LC V191,
LC T180 en combinación con LC S202,
LC T180 en combinación con LC S203,
LC T180 en combinación con LC T206,
LC T180 en combinación con HC S160,
LC T180 en combinación con HC T190
LC T180 en combinación con HC S443,
LC T180 en combinación con HC S447,
LC T180 en combinación con HC S139,
LC T180 en combinación con HC S168,
LC T180 en combinación con HC V170,
LC T180 en combinación con HC V176,
LC T180 en combinación con HC T200,
LC T180 en combinación con HC S445.
Las mutaciones son preferiblemente mutaciones de cisteína, lisina, glutamina o un aminoácido no natural.
Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, otros anticuerpos comprenden combinaciones de 2 mutaciones seleccionadas del grupo de
LC T180C en combinación con LC S208C,
LC T180C en combinación con LC S171C,
LC T180C en combinación con LC S182C,
LC T180C en combinación con LC A184C,
LC T180C en combinación con LC V191C,
LC T180C en combinación con LC S202C,
LC T180C en combinación con LC S203C,
LC T180C en combinación con LC T206C,
LC T180C en combinación con HC S160C,
LC T180C en combinación con HC T190C,
LC T180C en combinación con HC S443C,
LC T180C en combinación con HC S447C,
LC T180C en combinación con HC S139C,
LC T180C en combinación con HC S168C,
LC T180C en combinación con HC V170C,
LC T180C en combinación con HC V176C,
LC T180C en combinación con HC T200C,
LC T180C en combinación con HC S445C.
Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, los anticuerpos más preferidos comprenden LC T180C en combinación con HC S160C.
Además, no de acuerdo con la invención reivindicada, los anticuerpos preferidos comprenden combinaciones de las 2 secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo de:
SEQ ID No. 33 y SEQ ID No. 22
SEQ ID No. 33 y SEQ ID No. 23
SEQ ID No. 33 y SEQ ID No. 24
SEQ ID No. 33 y SEQ ID No. 25
SEQ ID No. 33 y SEQ ID No. 26
SEQ ID No. 33 y SEQ ID No. 27
SEQ ID No. 33 y SEQ ID No. 28
SEQ ID No. 33 y SEQ ID No. 29
SEQ ID No. 33 y SEQ ID No. 30
SEQ ID No. 33 y SEQ ID No. 31
SEQ ID No. 33 y SEQ ID No. 32
SEQ ID No. 33 y SEQ ID No. 34
SEQ ID No. 33 y SEQ ID No. 35
SEQ ID No. 33 y SEQ ID No. 36
SEQ ID No. 33 y SEQ ID No. 37
SEQ ID No. 33 y SEQ ID No. 38
SEQ ID No. 33 y SEQ ID No. 39
SEQ ID No. 33 y SEQ ID No. 40
En los anticuerpos preferidos, X es cisteína. Alternativamente, X puede seleccionarse independientemente entre lisina, glutamina, cisteína o un aminoácido no natural, y lo más preferiblemente es cisteína.
Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, los anticuerpos preferidos comprenden SEQ ID No. 33 y SEQ ID No. 23.
Las mutaciones adicionales que pueden combinarse con cualquiera de los aspectos descritos en este documento incluyen:
En la tabla anterior, los residuos mutados se indican como X. X es preferiblemente cisteína, pero se pueden usar otros residuos mutantes, en particular lisina, glutamina o un aminoácido no natural. Téngase en cuenta que V191 puede ser L191 en ciertos anticuerpos parentales, en particular los alotipos Kappa Km1 y Km2; cuando en este documento se hace referencia a mutaciones V191, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entiende que esto también se refiere a mutaciones L191.
Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, otros anticuerpos preferidos incluyen la mutación de cadena ligera T206 en combinación con una o más mutaciones adicionales. En realizaciones preferidas, la mutación de la cadena ligera T206 se combina con otra mutación descrita en este documento. Las siguientes son combinaciones preferidas de dos mutaciones; los anticuerpos según la invención pueden comprender estas mutaciones junto con una o más mutaciones adicionales.
LC T206 en combinación con LC S208,
LC T206 en combinación con LC S171,
LC T206 en combinación con LC S182,
LC T206 en combinación con LC A184,
LC T206 en combinación con LC V191,
LC T206 en combinación con LC S202,
LC T206 en combinación con LC S203,
LC T206 en combinación con LC T180,
LC T206 en combinación con HC S160,
LC T206 en combinación con HC T190
LC T206 en combinación con HC S443,
LC T206 en combinación con HC S447,
LC T206 en combinación con HC S139,
LC T206 en combinación con HC S168,
LC T206 en combinación con HC V170,
LC T206 en combinación con HC V176,
LC T206 en combinación con HC T200,
LC T206 en combinación con HC S445.
De los cuales son los preferidos
LC T206 en combinación con LC T180,
LC T206 en combinación con HC S160,
LC T206 en combinación con HC T190
LC T206 en combinación con HC S443,
LC T206 en combinación con HC S447,
De los cuales son los más preferidos
LC T206C en combinación con LC T180C,
LC T206C en combinación con HC S160C,
LC T206C en combinación con HC T190C
LC T206C en combinación con HC S443C,
LC T206C en combinación con HC S447C.
Por tanto, los anticuerpos preferidos pueden comprender combinaciones de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 39 junto con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID No 22 a 38 o 40. En los anticuerpos preferidos, X es cisteína. Alternativamente, X puede seleccionarse independientemente entre lisina, glutamina, cisteína o un aminoácido no natural, y lo más preferiblemente es cisteína.
Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, los anticuerpos preferidos también incluyen la mutación de cadena pesada S160 en combinación con una o más mutaciones adicionales. En realizaciones preferidas, la mutación de la cadena pesada S160 se combina con otra mutación descrita en este documento. Las siguientes son combinaciones preferidas de dos mutaciones; los anticuerpos según la invención pueden comprender estas mutaciones junto con una o más mutaciones adicionales.
HC S160 en combinación con LC S208,
HC S160 en combinación con LC S171,
HC S160 en combinación con LC S182,
HC S160 en combinación con LC A184,
HC S160 en combinación con LC V191,
HC S160 en combinación con LC S202,
HC S160 en combinación con LC S203,
HC S160 en combinación con LC T180,
HC S160 en combinación con LC T206,
HC S160 en combinación con HC T190,
HC S160 en combinación con HC S443,
HC S160 en combinación con HC S447,
HC S160 en combinación con HC S139,
HC S160 en combinación con HC S168,
HC S160 en combinación con HC V170,
HC S160 en combinación con HC V176,
HC S160 en combinación con HC T200,
HC S160 en combinación con HC S445.
De los cuales son los preferidos
HC S160 en combinación con LC T180,
HC S160 en combinación con LC T206,
HC S160 en combinación con HC T190,
HC S160 en combinación con HC S443,
HC S160 en combinación con HC S447,
De los cuales son los más preferidos
HC S160C en combinación con LC T180C,
HC S160C en combinación con LC T206C,
HC S160C en combinación con HC T190C,
HC S160C en combinación con HC S443C,
HC S160C en combinación con HC S447C,
Por tanto, los anticuerpos preferidos pueden comprender combinaciones de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 23 junto con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID No 22 o 24 a 40. En los anticuerpos preferidos, X es cisteína. Alternativamente, X puede seleccionarse independientemente entre lisina, glutamina, cisteína o un aminoácido no natural, y lo más preferiblemente es cisteína.
Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, otros anticuerpos preferidos incluyen la mutación de cadena pesada T190 en combinación con una o más mutaciones adicionales. En realizaciones preferidas, la mutación de la cadena pesada T190 se combina con otra mutación descrita en este documento. Las siguientes son combinaciones preferidas de dos mutaciones; los anticuerpos según la invención pueden comprender estas mutaciones junto con una o más mutaciones adicionales.
HC T190 en combinación con LC S208,
HC T190 en combinación con LC S171,
HC T190 en combinación con LC S182,
HC T190 en combinación con LC A184,
HC T190 en combinación con LC V191,
HC T190 en combinación con LC S202,
HC T190 en combinación con LC S203,
HC T190 en combinación con LC T180,
HC T190 en combinación con LC T206,
HC T190 en combinación con HC S160,
HC T190 en combinación con HC S443,
HC T190 en combinación con HC S447,
HC T190 en combinación con HC S139,
HC T190 en combinación con HC S168,
HC T190 en combinación con HC V170,
HC T190 en combinación con HC V176,
HC T190 en combinación con HC T200,
HC T190 en combinación con HC S445.
De los cuales son los preferidos
HC T190 en combinación con LC T180,
HC T190 en combinación con LC T206,
HC T190 en combinación con HC S160,
HC T190 en combinación con HC S443,
HC T190 en combinación con HC S447,
De los cuales son los más preferidos
HC T190C en combinación con LC T180C,
HC T190C en combinación con LC T206C,
HC T190C en combinación con HC S160C,
HC T190C en combinación con HC S443C,
HC T190C en combinación con HC S447C.
Por tanto, los anticuerpos preferidos pueden comprender combinaciones de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 27 junto con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID No 22 a 26 o 28 a 40. En los anticuerpos preferidos, X es cisteína. Alternativamente, X puede seleccionarse independientemente entre lisina, glutamina, cisteína o un aminoácido no natural, y lo más preferiblemente es cisteína.
Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, otros anticuerpos preferidos incluyen la mutación de cadena pesada S443 en combinación con una o más mutaciones adicionales. En realizaciones preferidas, la mutación de la cadena pesada S443 se combina con otra mutación descrita en este documento. Las siguientes son combinaciones preferidas de dos mutaciones; los anticuerpos según la invención pueden comprender estas mutaciones junto con una o más mutaciones adicionales.
HC S443 en combinación con LC S208,
HC S443 en combinación con LC S171,
HC S443 en combinación con LC S182,
HC S443 en combinación con LC A184,
HC S443 en combinación con LC V191,
HC S443 en combinación con LC S202,
HC S443 en combinación con LC S203,
HC S443 en combinación con LC T180,
HC S443 en combinación con LC T206,
HC S443 en combinación con HC S160,
HC S443 en combinación con HC T190,
HC S443 en combinación con HC S447,
HC S443 en combinación con HC S139,
HC S443 en combinación con HC S168,
HC S443 en combinación con HC V170,
HC S443 en combinación con HC V176,
HC S443 en combinación con HC T200,
HC S443 en combinación con HC S445.
De los cuales son los preferidos
HC S443 en combinación con LC T180,
HC S443 en combinación con LC T206,
HC S443 en combinación con HC S160,
HC S443 en combinación con HC T190,
HC S443 en combinación con HC S447,
De los cuales son los más preferidos
HC S443C en combinación con LC T180C,
HC S443C en combinación con LC T206C,
HC S443C en combinación con HC S160C,
HC S443C en combinación con HC T190C,
HC S443C en combinación con HC S447C.
Por tanto, los anticuerpos preferidos pueden comprender combinaciones de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 29 junto con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID No 22 a 28 o 30 a 40. En los anticuerpos preferidos, X es cisteína. Alternativamente, X puede seleccionarse independientemente entre lisina, glutamina, cisteína o un aminoácido no natural, y lo más preferiblemente es cisteína.
Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, otros anticuerpos preferidos incluyen la mutación de cadena pesada S447 en combinación con una o más mutaciones adicionales. En realizaciones preferidas, la mutación de la cadena pesada S447 se combina con otra mutación descrita en este documento. Las siguientes son combinaciones preferidas de dos mutaciones; los anticuerpos según la invención pueden comprender estas mutaciones junto con una o más mutaciones adicionales.
HC S447 en combinación con LC S208,
HC S447 en combinación con LC S171,
HC S447 en combinación con LC S182,
HC S447 en combinación con LC A184,
HC S447 en combinación con LC V191,
HC S447 en combinación con LC S202,
HC S447 en combinación con LC S203,
HC S447 en combinación con LC T180,
HC S447 en combinación con LC T206,
HC S447 en combinación con HC S160,
HC S447 en combinación con HC T190,
HC S447 en combinación con HC S443,
HC S447 en combinación con HC S139,
HC S447 en combinación con HC S168,
HC S447 en combinación con HC V170,
HC S447 en combinación con HC V176,
HC S447 en combinación con HC T200,
HC S447 en combinación con HC S445.
De los cuales son los preferidos
HC S447 en combinación con LC T180,
HC S447 en combinación con LC T206,
HC S447 en combinación con HC S160,
HC S447 en combinación con HC T190,
HC S447 en combinación con HC S443,
De los cuales son los más preferidos
HC S447C en combinación con LC T180C,
HC S447C en combinación con LC T206C,
HC S447C en combinación con HC S160C,
HC S447C en combinación con HC T190C,
HC S447C en combinación con HC S443C.
Por tanto, los anticuerpos preferidos pueden comprender combinaciones de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 31 junto con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID No 22 a 30 o 32 a 40. En los anticuerpos preferidos, X es cisteína. Alternativamente, X puede seleccionarse independientemente entre lisina, glutamina, cisteína o un aminoácido no natural, y lo más preferiblemente es cisteína.
Otros anticuerpos preferidos incluyen la mutación de la cadena ligera S208 en combinación con una o más mutaciones adicionales. En realizaciones preferidas, la mutación de la cadena ligera S208 se combina con otra mutación descrita en este documento. Las siguientes son combinaciones preferidas de dos mutaciones; los anticuerpos según la invención pueden comprender estas mutaciones junto con una o más mutaciones adicionales.
LC S208 en combinación con LC S171,
LC S208 en combinación con LC S182,
LC S208 en combinación con LC A184,
LC S208 en combinación con LC V191,
LC S208 en combinación con LC S202,
LC S208 en combinación con LC S203,
LC S208 en combinación con LC T180,
LC S208 en combinación con LC T206,
LC S208 en combinación con HC S160,
LC S208 en combinación con HC T190,
LC S208 en combinación con HC S443,
LC S208 en combinación con HC S447,
LC S208 en combinación con HC S139,
LC S208 en combinación con HC S168,
LC S208 en combinación con HC V170,
LC S208 en combinación con HC V176,
LC S208 en combinación con HC T200,
LC S208 en combinación con HC S445.
De los cuales son los preferidos
LC S208 en combinación con LC T180,
LC S208 en combinación con LC T206,
LC S208 en combinación con HC S160,
LC S208 en combinación con HC T190,
LC S208 en combinación con HC S443,
LC S208 en combinación con HC S447,
De los cuales son los más preferidos
LC S208C en combinación con LC T180C,
LC S208C en combinación con LC T206C,
LC S208C en combinación con HC S160C,
LC S208C en combinación con HC T190C,
LC S208C en combinación con HC S443C,
LC S208C en combinación con HC S447C.
Por tanto, los anticuerpos preferidos pueden comprender combinaciones de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 40 junto con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID No 22 a 39. En los anticuerpos preferidos, X es cisteína. Alternativamente, X puede seleccionarse independientemente entre lisina, glutamina, cisteína o un aminoácido no natural, y lo más preferiblemente es cisteína.
Por consiguiente, los anticuerpos preferidos comprenden combinaciones de las 2 secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo de:
SEQ ID No. 40 y SEQ ID No. 22
SEQ ID No. 40 y SEQ ID No. 23
SEQ ID No. 40 y SEQ ID No. 24
SEQ ID No. 40 y SEQ ID No. 25
SEQ ID No. 40 y SEQ ID No. 26
SEQ ID No. 40 y SEQ ID No. 27
SEQ ID No. 40 y SEQ ID No. 28
SEQ ID No. 40 y SEQ ID No. 29
SEQ ID No. 40 y SEQ ID No. 30
SEQ ID No. 40 y SEQ ID No. 31
SEQ ID No. 40 y SEQ ID No. 32
SEQ ID No. 40 y SEQ ID No. 33
SEQ ID No. 40 y SEQ ID No. 34
SEQ ID No. 40 y SEQ ID No. 35
SEQ ID No. 40 y SEQ ID No. 36
SEQ ID No. 40 y SEQ ID No. 37
SEQ ID No. 40 y SEQ ID No. 38
SEQ ID No. 40 y SEQ ID No. 39
En los anticuerpos preferidos, X es cisteína. Alternativamente, X puede seleccionarse independientemente entre lisina, glutamina, cisteína o un aminoácido no natural, y lo más preferiblemente es cisteína.
Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, otros anticuerpos preferidos incluyen la mutación de cadena ligera S171 en combinación con una o más mutaciones adicionales. En realizaciones preferidas, la mutación de la cadena ligera S171 se combina con otra mutación descrita en este documento. Las siguientes son combinaciones preferidas de dos mutaciones; los anticuerpos según la invención pueden comprender estas mutaciones junto con una o más mutaciones adicionales.
LC S171 en combinación con LC S208,
LC S171 en combinación con LC S182,
LC S171 en combinación con LC A184,
LC S171 en combinación con LC V191,
LC S171 en combinación con LC S202,
LC S171 en combinación con LC S203,
LC S171 en combinación con LC T180,
LC S171 en combinación con LC T206,
LC S171 en combinación con HC S160,
LC S171 en combinación con HC T190,
LC S171 en combinación con HC S443,
LC S171 en combinación con HC S447,
LC S171 en combinación con HC S139,
LC S171 en combinación con HC S168,
LC S171 en combinación con HC V170,
LC S171 en combinación con HC V176,
LC S171 en combinación con HC T200,
LC S171 en combinación con HC S445.
De los cuales son los preferidos
LC S171 en combinación con LC T180,
LC S171 en combinación con LC T206,
LC S171 en combinación con HC S160,
LC S171 en combinación con HC T190,
LC S171 en combinación con HC S443,
LC S171 en combinación con HC S447,
De los cuales son los más preferidos
LC S171C en combinación con LC T180C,
LC S171C en combinación con LC T206C,
LC S171C en combinación con HC S160C,
LC S171C en combinación con HC T190C,
LC S171C en combinación con HC S443C,
LC S171C en combinación con HC S447C.
Por tanto, los anticuerpos preferidos pueden comprender combinaciones de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 32 junto con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID No 22 a 31 o 33 a 40. En los anticuerpos preferidos, X es cisteína. Alternativamente, X puede seleccionarse independientemente entre lisina, glutamina, cisteína o un aminoácido no natural, y lo más preferiblemente es cisteína.
Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, otros anticuerpos preferidos incluyen la mutación de cadena ligera S182 en combinación con una o más mutaciones adicionales. En realizaciones preferidas, la mutación de la cadena ligera S182 se combina con otra mutación descrita en este documento. Las siguientes son combinaciones preferidas de dos mutaciones; los anticuerpos según la invención pueden comprender estas mutaciones junto con una o más mutaciones adicionales.
LC S182 en combinación con LC S208,
LC S182 en combinación con LC S171,
LC S182 en combinación con LC A184,
LC S182 en combinación con LC V191,
LC S182 en combinación con LC S202,
LC S182 en combinación con LC S203,
LC S182 en combinación con LC T180,
LC S182 en combinación con LC T206,
LC S182 en combinación con HC S160,
LC S182 en combinación con HC T190,
LC S182 en combinación con HC S443,
LC S182 en combinación con HC S447,
LC S182 en combinación con HC S139,
LC S182 en combinación con HC S168,
LC S182 en combinación con HC V170,
LC S182 en combinación con HC V176,
LC S182 en combinación con HC T200,
LC S182 en combinación con HC S445.
De los cuales son los preferidos
LC S182 en combinación con LC T180,
LC S182 en combinación con LC T206,
LC S182 en combinación con HC S160,
LC S182 en combinación con HC T190,
LC S182 en combinación con HC S443,
LC S182 en combinación con HC S447,
De los cuales son los más preferidos
LC S182C en combinación con LC T180C,
LC S182C en combinación con LC T206C,
LC S182C en combinación con HC S160C,
LC S182C en combinación con HC T190C,
LC S182C en combinación con HC S443C,
LC S182C en combinación con HC S447C.
Por tanto, los anticuerpos preferidos pueden comprender combinaciones de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 34 junto con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID No 22 a 33 o 35 a 40. En los anticuerpos preferidos, X es cisteína. Alternativamente, X puede seleccionarse independientemente entre lisina, glutamina, cisteína o un aminoácido no natural, y lo más preferiblemente es cisteína.
Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, otros anticuerpos preferidos incluyen la mutación de cadena ligera A184 en combinación con una o más mutaciones adicionales. En realizaciones preferidas, la mutación de la cadena ligera A184 se combina con otra mutación descrita en este documento. Las siguientes son combinaciones preferidas de dos mutaciones; los anticuerpos según la invención pueden comprender estas mutaciones junto con una o más mutaciones adicionales.
LC A184 en combinación con LC S208,
LC A184 en combinación con LC S171,
LC A184 en combinación con LC S182,
LC A184 en combinación con LC V191,
LC A184 en combinación con LC S202,
LC A184 en combinación con LC S203,
LC A184 en combinación con LC T180,
LC A184 en combinación con LC T206,
LC A184 en combinación con HC S160,
LC A184 en combinación con HC T190,
LC A184 en combinación con HC S443,
LC A184 en combinación con HC S447,
LC A184 en combinación con HC S139,
LC A184 en combinación con HC S168,
LC A184 en combinación con HC V170,
LC A184 en combinación con HC V176,
LC A184 en combinación con HC T200,
LC A184 en combinación con HC S445.
De los cuales son los preferidos
LC A184 en combinación con LC T180,
LC A184 en combinación con LC T206,
LC A184 en combinación con HC S160,
LC A184 en combinación con HC T190,
LC A184 en combinación con HC S443,
LC A184 en combinación con HC S447,
De los cuales son los más preferidos
LC A184C en combinación con LC T180C,
LC A184C en combinación con LC T206C,
LC A184C en combinación con HC S160C,
LC A184C en combinación con HC T190C,
LC A184C en combinación con HC S443C,
LC A184C en combinación con HC S447C.
Por tanto, los anticuerpos preferidos pueden comprender combinaciones de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 35 junto con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID No 22 a 34 o 36 a 40. En los anticuerpos preferidos, X es cisteína. Alternativamente, X puede seleccionarse independientemente entre lisina, glutamina, cisteína o un aminoácido no natural, y lo más preferiblemente es cisteína.
Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, otros anticuerpos preferidos incluyen la mutación de cadena ligera V191 en combinación con una o más mutaciones adicionales. En realizaciones preferidas, la mutación de la cadena ligera V191 se combina con otra mutación descrita en este documento. Las siguientes son combinaciones preferidas de dos mutaciones; los anticuerpos según la invención pueden comprender estas mutaciones junto con una o más mutaciones adicionales.
LC V191 en combinación con LC S208,
LC V191 en combinación con LC S171,
LC V191 en combinación con LC S182,
LC V191 en combinación con LC A184,
LC V191 en combinación con LC S202,
LC V191 en combinación con LC S203,
LC V191 en combinación con LC T180,
LC V191 en combinación con LC T206,
LC V191 en combinación con HC S160,
LC V191 en combinación con HC T190,
LC V191 en combinación con HC S443,
LC V191 en combinación con HC S447,
LC V191 en combinación con HC S139,
LC V191 en combinación con HC S168,
LC V191 en combinación con HC V170,
LC V191 en combinación con HC V176,
LC V191 en combinación con HC T200,
LC V191 en combinación con HC S445.
De los cuales son los preferidos
LC V191 en combinación con LCT180,
LC V191 en combinación con LC T206,
LC V191 en combinación con HC S160,
LC V191 en combinación con HC T190,
LC V191 en combinación con HC S443,
LC V191 en combinación con HC S447,
De los cuales son los más preferidos
LC V191C en combinación con LC T180C,
LC V191C en combinación con LC T206C,
LC V191C en combinación con HC S160C,
LC V191C en combinación con HC T190C,
LC V191C en combinación con HC S443C,
LC V191C en combinación con HC S447C.
Por tanto, los anticuerpos preferidos pueden comprender combinaciones de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 36 junto con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID No 22 a 35 o 37 a 40. En los anticuerpos preferidos, X es cisteína. Alternativamente, X puede seleccionarse independientemente entre lisina, glutamina, cisteína o un aminoácido no natural, y lo más preferiblemente es cisteína.
Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, otros anticuerpos preferidos incluyen la mutación de cadena ligera S202 en combinación con una o más mutaciones adicionales. En realizaciones preferidas, la mutación de la cadena ligera S202 se combina con otra mutación descrita en este documento. Las siguientes son combinaciones preferidas de dos mutaciones; los anticuerpos según la invención pueden comprender estas mutaciones junto con una o más mutaciones adicionales.
LC S202 en combinación con LC S208,
LC S202 en combinación con LC S171,
LC S202 en combinación con LC S182,
LC S202 en combinación con LC A184,
LC S202 en combinación con LC V191,
LC S202 en combinación con LC S203,
LC S202 en combinación con LC T180,
LC S202 en combinación con LC T206,
LC S202 en combinación con HC S160,
LC S202 en combinación con HC T190,
LC S202 en combinación con HC S443,
LC S202 en combinación con HC S447,
LC S202 en combinación con HC S139,
LC S202 en combinación con HC S168,
LC S202 en combinación con HC V170,
LC S202 en combinación con HC V176,
LC S202 en combinación con HC T200,
LC S202 en combinación con HC S445.
De los cuales son los preferidos
LC S202 en combinación con LC T180,
LC S202 en combinación con LC T206,
LC S202 en combinación con HC S160,
LC S202 en combinación con HC T190,
LC S202 en combinación con HC S443,
LC S202 en combinación con HC S447,
De los cuales son los más preferidos
LC S202C en combinación con LC T180C,
LC S202C en combinación con LC T206C,
LC S202C en combinación con HC S160C,
LC S202C en combinación con HC T190C,
LC S202C en combinación con HC S443C,
LC S202C en combinación con HC S447C.
Por lo tanto, los anticuerpos preferidos pueden comprender combinaciones de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 37 junto con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID No 22 a 36 o 38 a 40. En los anticuerpos preferidos, X es cisteína. Alternativamente, X puede seleccionarse independientemente entre lisina, glutamina, cisteína o un aminoácido no natural, y lo más preferiblemente es cisteína.
Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, otros anticuerpos preferidos incluyen la mutación de cadena ligera S203 en combinación con una o más mutaciones adicionales. En realizaciones preferidas, la mutación de la cadena ligera S203 se combina con otra mutación descrita en este documento. Las siguientes son combinaciones preferidas de dos mutaciones; los anticuerpos según la invención pueden comprender estas mutaciones junto con una o más mutaciones adicionales.
LC S203 en combinación con LC S208,
LC S203 en combinación con LC S171,
LC S203 en combinación con LC S182,
LC S203 en combinación con LC A184,
LC S203 en combinación con LC V191,
LC S203 en combinación con LC S202,
LC S203 en combinación con LC T180,
LC S203 en combinación con LC T206,
LC S203 en combinación con HC S160,
LC S203 en combinación con HC T190,
LC S203 en combinación con HC S443,
LC S203 en combinación con HC S447,
LC S203 en combinación con HC S139,
LC S203 en combinación con HC S168,
LC S203 en combinación con HC V170,
LC S203 en combinación con HC V176,
LC S203 en combinación con HC T200,
LC S203 en combinación con HC S445.
De los cuales son los preferidos
LC S203 en combinación con LC T180,
LC S203 en combinación con LC T206,
LC S203 en combinación con HC S160,
LC S203 en combinación con HC T190,
LC S203 en combinación con HC S443,
LC S203 en combinación con HC S447,
De los cuales son los más preferidos
LC S203C en combinación con LC T180C,
LC S203C en combinación con LC T206C,
LC S203C en combinación con HC S160C,
LC S203C en combinación con HC T190C,
LC S203C en combinación con HC S443C,
LC S203C en combinación con HC S447C.
Por tanto, los anticuerpos preferidos pueden comprender combinaciones de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 38 junto con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID No 22 a 37 o 39 a 40. En los anticuerpos preferidos, X es cisteína. Alternativamente, X puede seleccionarse independientemente entre lisina, glutamina, cisteína o un aminoácido no natural, y lo más preferiblemente es cisteína.
Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, otros anticuerpos preferidos incluyen la mutación de cadena pesada S139 en combinación con una o más mutaciones adicionales. En realizaciones preferidas, la mutación de la cadena pesada S139 se combina con otra mutación descrita en este documento. Las siguientes son combinaciones preferidas de dos mutaciones; los anticuerpos según la invención pueden comprender estas mutaciones junto con una o más mutaciones adicionales.
HC S139 en combinación con LC S208,
HC S139 en combinación con LC S171,
HC S139 en combinación con LC S182,
HC S139 en combinación con LC A184,
HC S139 en combinación con LC V191,
HC S139 en combinación con LC S202,
HC S139 en combinación con LC S203,
HC S139 en combinación con LC T180,
HC S139 en combinación con LC T206,
HC S139 en combinación con HC S160,
HC S139 en combinación con HC T190,
HC S139 en combinación con HC S443,
HC S139 en combinación con HC S447,
HC S139 en combinación con HC S168,
HC S139 en combinación con HC V170,
HC S139 en combinación con HC V176,
HC S139 en combinación con HC T200,
HC S139 en combinación con HC S445.
De los cuales son los preferidos
HC S139 en combinación con LC T180,
HC S139 en combinación con LC T206,
HC S139 en combinación con HC S160,
HC S139 en combinación con HC T190,
HC S139 en combinación con HC S443,
HC S139 en combinación con HC S447,
De los cuales son los más preferidos
HC S139C en combinación con LC T180C,
HC S139C en combinación con LC T206C,
HC S139C en combinación con HC S160C,
HC S139C en combinación con HC T190C,
HC S139C en combinación con HC S443C,
HC S139C en combinación con HC S447C.
Por tanto, los anticuerpos preferidos pueden comprender combinaciones de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 22 junto con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID No 23 a 40. En los anticuerpos preferidos, X es cisteína. Alternativamente, X puede seleccionarse independientemente entre lisina, glutamina, cisteína o un aminoácido no natural, y lo más preferiblemente es cisteína.
Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, otros anticuerpos preferidos incluyen la mutación de cadena pesada S168 en combinación con una o más mutaciones adicionales. En realizaciones preferidas, la mutación de la cadena pesada S168 se combina con otra mutación descrita en este documento. Las siguientes son combinaciones preferidas de dos mutaciones; anticuerpos según la invención pueden comprender estas mutaciones junto con una o más mutaciones adicionales.
HC S168 en combinación con LC S208,
HC S168 en combinación con LC S171,
HC S168 en combinación con LC S182,
HC S168 en combinación con LC A184,
HC S168 en combinación con LC V191,
HC S168 en combinación con LC S202,
HC S168 en combinación con LC S203,
HC S168 en combinación con LC T180,
HC S168 en combinación con LC T206,
HC S168 en combinación con HC S160,
HC S168 en combinación con HC T190,
HC S168 en combinación con HC S443,
HC S168 en combinación con HC S447,
HC S168 en combinación con HC S139,
HC S168 en combinación con HC V170,
HC S168 en combinación con HC V176,
HC S168 en combinación con HC T200,
HC S168 en combinación con HC S445.
De los cuales son los preferidos
HC S168 en combinación con LC T180,
HC S168 en combinación con LC T206,
HC S168 en combinación con HC S160,
HC S168 en combinación con HC T190,
HC S168 en combinación con HC S443,
HC S168 en combinación con HC S447,
De los cuales son los más preferidos
HC S168C en combinación con LC T180C,
HC S168C en combinación con LC T206C,
HC S168C en combinación con HC S160C,
HC S168C en combinación con HC T190C,
HC S168C en combinación con HC S443C,
HC S168C en combinación con HC S447C.
Por tanto, los anticuerpos preferidos pueden comprender combinaciones de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 24 junto con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID No 22, 23 o 25 a 40. En los anticuerpos preferidos, X es cisteína. Alternativamente, X puede seleccionarse independientemente entre lisina, glutamina, cisteína o un aminoácido no natural, y lo más preferiblemente es cisteína.
Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, otros anticuerpos preferidos incluyen la mutación de cadena pesada V170 en combinación con una o más mutaciones adicionales. En realizaciones preferidas, la mutación de la cadena pesada V170 se combina con otra mutación descrita en este documento. Las siguientes son combinaciones preferidas de dos mutaciones; los anticuerpos según la invención pueden comprender estas mutaciones junto con una o más mutaciones adicionales.
HC V170 en combinación con LC S208,
HC V170 en combinación con LC S171,
HC V170 en combinación con LC S182,
HC V170 en combinación con LC A184,
HC V170 en combinación con LC V191,
HC V170 en combinación con LC S202,
HC V170 en combinación con LC S203,
HC V170 en combinación con LC T180,
HC V170 en combinación con LC T206,
HC V170 en combinación con HC S160
HC V170 en combinación con HC T190,
HC V170 en combinación con HC S443
HC V170 en combinación con HC S447
HC V170 en combinación con HC S139
HC V170 en combinación con HC S168,
HC V170 en combinación con HC V176,
HC V170 en combinación con HC T200,
HC V170 en combinación con HC S445.
De los cuales son los preferidos
HC V170 en combinación con LC T180,
HC V170 en combinación con LC T206,
HC V170 en combinación con HC S160,
HC V170 en combinación con HC T190,
HC V170 en combinación con HC S443,
HC V170 en combinación con HC S447,
De los cuales son los más preferidos
HC V170C en combinación con LC T180C,
HC V170C en combinación con LC T206C,
HC V170C en combinación con HC S160C,
HC V170C en combinación con HC T190C,
HC V170C en combinación con HC S443C,
HC V170C en combinación con HC S447C.
Por tanto, los anticuerpos preferidos pueden comprender combinaciones de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 25 junto con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID No 22 a 24 o 26 a 40. En los anticuerpos preferidos, X es cisteína. Alternativamente, X puede seleccionarse independientemente entre lisina, glutamina, cisteína o un aminoácido no natural, y lo más preferiblemente es cisteína.
Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, otros anticuerpos preferidos incluyen la mutación de cadena pesada V176 en combinación con una o más mutaciones adicionales. En realizaciones preferidas, la mutación de la cadena pesada V176 se combina con otra mutación descrita en este documento. Las siguientes son combinaciones preferidas de dos mutaciones; los anticuerpos según la invención pueden comprender estas mutaciones junto con una o más mutaciones adicionales.
HC V176 en combinación con LC S208,
HC V176 en combinación con LC S171,
HC V176 en combinación con LC S182,
HC V176 en combinación con LC A184,
HC V176 en combinación con LC V191,
HC V176 en combinación con LC S202,
HC V176 en combinación con LC S203,
HC V176 en combinación con LC T180,
HC V176 en combinación con LC T206,
HC V176 en combinación con HC S160,
HC V176 en combinación con HC T190,
HC V176 en combinación con HC S443,
HC V176 en combinación con HC S447,
HC V176 en combinación con HC S139,
HC V176 en combinación con HC S168,
HC V176 en combinación con HC V170,
HC V176 en combinación con HC T200,
HC V176 en combinación con HC S445.
De los cuales son los preferidos
HC V176 en combinación con LC T180,
HC V176 en combinación con LC T206,
HC V176 en combinación con HC S160,
HC V176 en combinación con HC T190,
HC V176 en combinación con HC S443,
HC V176 en combinación con HC S447,
De los cuales son los más preferidos
HC V176C en combinación con LC T180C,
HC V176C en combinación con LC T206C,
HC V176C en combinación con HC S160C,
HC V176C en combinación con HC T190C,
HC V176C en combinación con HC S443C,
HC V176C en combinación con HC S447C.
Por tanto, los anticuerpos preferidos pueden comprender combinaciones de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 26 junto con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID No 22 a 25 o 27 a 40. En los anticuerpos preferidos, X es cisteína. Alternativamente, X puede seleccionarse independientemente entre lisina, glutamina, cisteína o un aminoácido no natural, y lo más preferiblemente es cisteína.
Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, otros anticuerpos preferidos incluyen la mutación de cadena pesada T200 en combinación con una o más mutaciones adicionales. En realizaciones preferidas, la mutación de la cadena pesada T200 se combina con otra mutación descrita en este documento. Las siguientes son combinaciones preferidas de dos mutaciones; los anticuerpos según la invención pueden comprender estas mutaciones junto con una o más mutaciones adicionales.
HC T200 en combinación con LC S208,
HC T200 en combinación con LC S171,
HC T200 en combinación con LC S182,
HC T200 en combinación con LC A184,
HC T200 en combinación con LC V191,
HC T200 en combinación con LC S202,
HC T200 en combinación con LC S203,
HC T200 en combinación con LC T180,
HC T200 en combinación con LC T206,
HC T200 en combinación con HC S160,
HC T200 en combinación con HC T190,
HC T200 en combinación con HC S443,
HC T200 en combinación con HC S447,
HC T200 en combinación con HC S139,
HC T200 en combinación con HC S168,
HC T200 en combinación con HC V170,
HC T200 en combinación con HC V176,
HC T200 en combinación con HC S445.
De los cuales son los preferidos
HC T200 en combinación con LC T180,
HC T200 en combinación con LC T206,
HC T200 en combinación con HC S160,
HC T200 en combinación con HC T190,
HC T200 en combinación con HC S443,
HC T200 en combinación con HC S447,
De los cuales son los más preferidos
HC T200C en combinación con LC T180C,
HC T200C en combinación con LC T206C,
HC T200C en combinación con HC S160C,
HC T200C en combinación con HC T190C,
HC T200C en combinación con HC S443C,
HC T200C en combinación con HC S447C.
Por tanto, los anticuerpos preferidos pueden comprender combinaciones de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 28 junto con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID No 22 a 27 o 29 a 40. En los anticuerpos preferidos, X es cisteína. Alternativamente, X puede seleccionarse independientemente entre lisina, glutamina, cisteína o un aminoácido no natural, y lo más preferiblemente es cisteína.
Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, otros anticuerpos preferidos incluyen la mutación de cadena pesada S445 en combinación con una o más mutaciones adicionales. En realizaciones preferidas, la mutación de la cadena pesada S445 se combina con otra mutación descrita en este documento. Las siguientes son combinaciones preferidas de dos mutaciones; los anticuerpos según la invención pueden comprender estas mutaciones junto con una o más mutaciones adicionales.
HC S445 en combinación con LC S208,
HC S445 en combinación con LC S171,
HC S445 en combinación con LC S182,
HC S445 en combinación con LC A184,
HC S445 en combinación con LC V191,
HC S445 en combinación con LC S202,
HC S445 en combinación con LC S203,
HC S445 en combinación con LC T180,
HC S445 en combinación con LC T206,
HC S445 en combinación con HC S160,
HC S445 en combinación con HC T190,
HC S445 en combinación con HC S443,
HC S445 en combinación con HC S447,
HC S445 en combinación con HC S139,
HC S445 en combinación con HC S168,
HC S445 en combinación con HC V170,
HC S445 en combinación con HC V176,
HC S445 en combinación con HC T200.
De los cuales son los preferidos
HC S445 en combinación con LC T180,
HC S445 en combinación con LC T206,
HC S445 en combinación con HC S160,
HC S445 en combinación con HC T190,
HC S445 en combinación con HC S443,
HC S445 en combinación con HC S447,
De los cuales son los más preferidos
HC S445C en combinación con LC T180C,
HC S445C en combinación con LC T206C,
HC S445C en combinación con HC S160C,
HC S445C en combinación con HC T190C,
HC S445C en combinación con HC S443C,
HC S445C en combinación con HC S447C.
Por tanto, los anticuerpos preferidos pueden comprender combinaciones de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 30 junto con una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID No 22 a 29 o 31 a 40. En los anticuerpos preferidos, X es cisteína. Alternativamente, X puede seleccionarse independientemente entre lisina, glutamina, cisteína o un aminoácido no natural, y lo más preferiblemente es cisteína.
Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, el anticuerpo puede seleccionarse entre Abciximab; Rituximab; Basiliximab;Daclizumab; Palivizumab; Infliximab; Trastuzumab; Alemtuzumab; Adalimumab; Efalizumab; Cetuximab; Ibritumumab; Omalizumab; Bevacizumab; Ranibizumab; Golimumab; Canakinumab; Ustekinumab; Tocilizumab; Ofatumumab; belimumab; Ipilimumab; brentuximab; pertuzumab; Raxibacumab; Vedolizumab; Ramucirumab; Obinutuzumab; Siltuximab; Secukinumab; Dinutuximab.
Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, se proporciona un anticuerpo que tiene una cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 1, y una cadena pesada que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO 3 a 12. Alternativamente, el anticuerpo tiene una cadena ligera que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEQ ID NO 13 a 21, y una cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 2. El anticuerpo tiene preferiblemente dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas.
Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, se proporciona un anticuerpo que tiene una región variable que proporciona especificidad de unión a un objetivo, y una región constante, donde la región constante comprende una región constante de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos 109 a 214 de SEQ ID NO 1, y una región constante de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos 121 a 450 de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO 3 a 12. Alternativamente, la región constante comprende una región constante de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos 109 a 214 de SEQ ID NO 13 a 21, y una región constante de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos 121 a 450 de SEQ ID NO 2. Preferiblemente, el anticuerpo comprende una región constante de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos 109 a 214 de SEQ ID NO 14, y una región constante de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos 121 a 450 de SEQ ID NO 2; o el anticuerpo comprende una región constante de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos 109 a 214 de SEQ ID NO 14, y una región constante de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos 121 a 450 de SEQ ID NO 4; o el anticuerpo comprende una región constante de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos 109 a 214 de SEQ ID NO 21, y una región constante de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos 121 a 450 de SEQ ID NO 2.
Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, se proporciona un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC), que comprende un anticuerpo de acuerdo con el primer aspecto de la invención, conjugado con una carga útil, preferiblemente una carga útil de fármaco, de modo que la DAR es de 1,7-2,2 en caso de una mutación en la cadena pesada o ligera y una DAR de 3,4-4,4 en caso de 2 mutaciones en la cadena ligera o pesada o una en la cadena ligera y una en la cadena pesada.
La carga útil del fármaco puede ser un agente disruptor de microtúbulos o un agente modificador del ADN. Entre los ejemplos de cargas útiles de fármacos adecuados se incluyen dolastatina, vedotina, monometil auristatina F, maytansinoides incluidos DM1 y DM4, análogos de duocarmicina, caliqueamicina, pirrolobenzodiazepinas, duocarmicina, centanamicina, irinotecán y doxorrubicina. Se podrán utilizar otras cargas útiles de drogas.
Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, se proporciona un anticuerpo o un ADC como se describe en este documento, para su uso como agente terapéutico. La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un ADC como se describe en este documento. Aunque no está de acuerdo con la invención reivindicada, también se proporciona un método para generar un ADC, comprendiendo el método conjugar un anticuerpo como se describe en este documento con una carga útil de fármaco.
Aunque no de acuerdo con la invención reivindicada, se proporciona un método para mejorar una característica seleccionada de un anticuerpo parental después de la conjugación del anticuerpo con una carga útil, donde la mejora se selecciona entre una reducción en la pérdida de monómeros, reducción en la fragmentación del anticuerpo y/o reducción en la agregación del anticuerpo después de la conjugación, donde el método comprende preparar un anticuerpo modificado que tiene la secuencia de aminoácidos del anticuerpo parental con una o más sustituciones en residuos seleccionados entre HC T200, HC V170, HC V176, HC T190, HC S139, HC S160, HC S168, HC S443 HC S445, HC S447, LC S171C, LC T180, LC T206, LC V191, LC S202, LC S203 o LC S208. La sustitución es preferiblemente cisteína, pero se pueden utilizar otros residuos mutantes, en particular lisina, glutamina o un aminoácido no natural.
Definiciones
Los siguientes términos utilizados en este documento tienen las siguientes definiciones:
Por “fragmento” se entiende una porción del anticuerpo de tamaño completo que conserva las propiedades de unión específicas del anticuerpo. Por “derivado” se entiende un anticuerpo modificado o un fragmento de anticuerpo que tiene uno o más cambios en la secuencia peptídica y/o que lleva uno o más grupos funcionales o una o más fracciones unidas a la misma, que conserva las propiedades de unión específicas del anticuerpo. Un “derivado” puede incluir anticuerpos modificados postraduccionalmente.
Por “numeración posicional”, “numeración secuencial” y términos similares se entiende la numeración de la secuencia de aminoácidos del péptido donde el primer residuo en el extremo N se designa como residuo número 1, y los residuos subsiguientes se numeran secuencialmente como residuo 2, 3, 4, etc. Esto contrasta con los sistemas de numeración de Kabat o EU para anticuerpos.
Por “sitios de conjugación específicos del sitio” se entiende residuos de aminoácidos dentro de un anticuerpo que se modifican específicamente para permitir la conjugación de una carga útil.
Por “tipo salvaje” se entiende una secuencia de péptidos o ácidos nucleicos de origen natural y no modificada.
Por “anticuerpo parental” se entiende un anticuerpo que se utiliza como base para preparar anticuerpos modificados.
Por “aminoácido no natural” se entiende un aminoácido que no es un aminoácido proteinogénico, o una variante modificada postraduccionalmente del mismo. En particular, el término se refiere a un aminoácido que no es uno de los 20 aminoácidos comunes.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra los niveles de expresión de anticuerpos candidatos en cultivos de CHOK1SV de 25 mL.
La Figura 2 muestra los resultados del análisis SEC-HPLC para el % de monómero de anticuerpos variantes conjugados y no conjugados, y el % de agregación y fragmentación para variantes conjugadas.
La Figura 3 muestra el grado de conjugación de biotina-maleimida con cadenas ligeras de variantes de anticuerpos. Las barras abiertas representan productos no conjugados, las barras rayadas representan productos con una única carga útil conjugada y las barras sólidas representan productos con dos cargas útiles conjugadas.
La Figura 4 muestra el grado de conjugación de biotina-maleimida con cadenas pesadas de variantes de anticuerpos. Las barras abiertas representan productos no conjugados, las barras rayadas representan productos con una única carga útil conjugada y las barras sólidas representan productos con dos cargas útiles conjugadas.
La Figura 5 muestra la relación fármaco-anticuerpo calculada para las variantes de anticuerpos de las figuras 3 y 4.
La Figura 6 muestra la disminución porcentual de biotina a lo largo del tiempo para el subconjunto de variantes de anticuerpos.
La Figura 7 muestra la relación fármaco-anticuerpo calculada de algunas de las variantes seleccionadas conjugadas con MMAE.
La Figura 8 muestra la disminución de la viabilidad celular para diferentes líneas celulares que han estado expuestas a diferentes concentraciones del ADC seleccionado durante un período de 72 h. PBS = solución salina tamponada con fosfato; vc-MMAE = valina-citrulina-MMAE.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Los presentes inventores han desarrollado un proceso para el diseño racional de anticuerpos modificados para permitir la selección de anticuerpos que tengan las propiedades deseadas para la producción de anticuerpos conjugados con cargas útiles tales como, por ejemplo, ADC (variantes de ADC). El proceso de diseño incorpora pasos de detecciónin silicoein vitro.Por tanto, los anticuerpos comparten una serie de propiedades, como se verá.
Para incorporar residuos para la conjugación específica del sitio, se decidió reemplazar los residuos nativos con otros residuos, como los residuos de cisteína, en posiciones seleccionadas de las estructuras de los anticuerpos. Las variantes candidatas se analizaron(in silicoein vitro)para propiedades deseables que incluyen título y agregación, y opcionalmente inmunogenicidad(solo in silico).Como prueba de concepto inicial, se eligió Herceptin (trastuzumab) como anticuerpo modelo y se realizó una optimización y análisis de la conjugación con biotina maleimida.
Los criterios para seleccionar los sitios de mutación incluyeron:
• Los residuos que se van a mutar a cisteína (cys) deben tener propiedades fisicoquímicas similares o ser un residuo pequeño no hidrófobo y sin carga (ser, val, thr, ala).
• Los residuos susceptibles de mutación a cisteína deben estar en regiones constantes de la cadena ligera (C<k>, CA,) o cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) de un anticuerpo o un fragmento del mismo.
• En los casos en que se utiliza un anticuerpo o un andamiaje modificado, la cis introducida debe estar a una distancia >5Á de cualquier interfaz o dominio de unión al objetivo para minimizar el riesgo de interferir con la actividad biológica de la molécula.
• Las mutaciones en cys no deberían crear enlaces de hidrógeno intracadena que conduzcan a la alteración del entorno local y las propiedades de la proteína.
• Las mutaciones en cys no deben ubicarse en las interfaces entre cadenas o dominios del anticuerpo (o andamiaje). Como regla general, las modificaciones deben realizarse a una distancia >5Á de los residuos involucrados en interfaces cadena-cadena o dominio-dominio.
• Las mutaciones en cys deben estar a una distancia >5Á de cualquier anticuerpo cys nativo y no deben interferir con el sitio de glicosilación de Fc (es decir, deben ubicarse a una distancia >5Á del residuo Asn295 donde ocurre la glicosilación).
• Las mutaciones en cys no deberían aumentar el riesgo de degradación químicaINo debe introducir modificaciones postraduccionales no deseadas
Luego se realizó una selección de la secuencia de trastuzumab para identificar sitios adecuados para la mutación a otro residuo, como por ejemplo la cisteína.
La secuencia de la cadena ligera no modificada es:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSG SRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:1)
La secuencia de la cadena pesada sin modificar es:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSV KGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSV FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
GK (SEQ ID NO: 2)
Se exploraron los residuos de Ser, Thr, Val y Ala en CH1, CH3 y CL. Esto dio lugar a una serie de candidatos:
Ligera: SER171, VAL191, SER208, SER182, THR180, THR206, ALA184, SER203, SER202
Pesada: VAL170, VAL176, THR190, SER445, SER443, SER139, SER160, SER447, THR200, SER168.
Luego se analizaron estas mutaciones para determinar las propiedades deseables. El modelado de la superficie de accesibilidad al disolvente se realizóin silico.Discovery Studio (Accelrys Software Inc., entorno de modelado Discovery Studio, versión 4.0, San Diego: Se utilizó Accelrys Software Inc., 2013.) para calcular la superficie de accesibilidad al solvente de la cadena lateral de los residuos elegidos. La accesibilidad del disolvente debe ser mayor al 15 % (> 15 %) o mayor al 17 % (> 17 %) para facilitar la “conjugabilidad” de la molécula. El porcentaje de superficie de accesibilidad al solvente de la cadena lateral se calcula como 100 veces la accesibilidad al solvente de la cadena lateral dividida por la accesibilidad al solvente de la cadena lateral del residuo de aminoácido completamente expuesto calculado utilizando el tripéptido Ala-X-Ala extendido, donde X es el residuo de interés. Las cadenas laterales con índices de accesibilidad al disolvente iguales o inferiores al 15 % (<= 15 %) o iguales o inferiores al 17 % (<= 17 %) se consideran enterradas y no se tienen en cuenta. Los resultados del modelado SAS se muestran a continuación:
También se realizó un modelado de la propensión a la agregaciónin silico.La propensión a la agregación no debería aumentar significativamente con la introducción de la Cys diseñada prevista de cualquiera de estas variantes (potenciales) de ADC. Esta propensión se calculará basándose en una comparación de la puntuación Z de la molécula de referencia y cualquiera de las variantes (potenciales) de ADC descritas anteriormente con la distribución de valores de un conjunto de referencia del dominio funcional más pequeño del anticuerpo o proteína donde se introduce la mutación a Cys. Se determina una media y una desviación estándar para el conjunto de referencia. Luego, la puntuación Z se calcula restando la media de referencia de la puntuación de las proteínas objetivo y dividiéndola por la desviación estándar. El resultado es una puntuación centrada en cero (0), donde los valores positivos indican que el objetivo es más propenso a la agregación (en este caso) que la media. Los objetivos con una puntuación Z dentro de (-1, 1) están dentro de la desviación estándar de la puntuación dentro del conjunto de referencia.
La plataforma in silico AggreSolve™ (Lonza, Basilea, Suiza) comprende una colección de algoritmos que, basándose en parámetros secuenciales y estructurales, pueden calcular predictores que reflejan la propensión a la agregación de un polipéptido determinado. Estos predictores reflejan propensiones de agregación globales y locales (específicas de cada residuo), así como flexibilidad y estabilidad locales.
La puntuación Z de AggreSolve se ha calculado para la cadena pesada y ligera de Trastuzumab de longitud completa, así como para los dominios CH1, CH3 y CL en los que se encuentran las sustituciones de ADC (los dominios funcionales mínimos).
Los límites de los dominios CH1, CH3 y CL son según la definición IMGT en M. P. Lefranc, C. Pommie, Q. Kaas, E. Duprat, N. Bosc, D. Guiraudou, C. Jean, M. Ruiz, I. Da Piedade, M. Rouard, E. Foulquier, V. Thouvenin y G. Lefranc. Numeración única IMGT para dominios constantes de receptores de inmunoglobulina y células T y dominios similares a C de la superfamilia Ig. Inmunología del desarrollo y comparada 29 (3), 2005.
Siguiendo estos pasos de selecciónin silico,se realizaron pruebasin vitroen las variantes para determinar el rendimiento proteico (in vitro), la agregación/fragmentación y la cinética de unión.
• El rendimiento proteico, estimado por el título del producto en el sobrenadante y después de la purificación de la proteína A, debe ser al menos el 70 % o más de la molécula parental.
• El porcentaje de monómero perdido después de la conjugación medido mediante cromatografía de exclusión por tamaño (HPLC) es preferiblemente < 35 %, más preferiblemente < 5 %, <10 %, < 15 %, < 20 %, < 25 % o <30 %. • El porcentaje de agregación de la molécula conjugada es preferiblemente <5 %, <10 %, <15 % o <20 %.
• El porcentaje de fragmentación del anticuerpo conjugado es preferiblemente <5 %, <10 %, <15 %, <20 %, <25 %, <30 %, <32 %, <35 % o <40 %.
• La constante de disociación (KD) de las variantes conjugadas debe ser igual o menor que 2 (<2) órdenes de magnitud que la KD del estándar de referencia de un anticuerpo no mutado u original. Para los anticuerpos descritos en este documento, el estándar de referencia es herceptina (trastuzumab), aunque se apreciará que cuando se utiliza un anticuerpo parental diferente, entonces ese parental puede usarse como estándar de referencia.
Son bien conocidos los sistemas de clonación y expresión de anticuerpos en una variedad de células huésped diferentes. Las células huésped adecuadas incluyen bacterias, células de mamíferos, levaduras y sistemas de baculovirus. Las líneas de células de mamíferos disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino, células HeLa, células de riñón de hámster bebé, células de melanoma de ratón NSO y muchas otras. Un huésped bacteriano común y preferido para las moléculas de inmunoglobulina pequeñas es E. coli. La expresión de inmunoglobulinas, como anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, en células procariotas como E. coli está bien establecida en la técnica. La expresión en células eucariotas en cultivo también está disponible para los expertos en la materia como una opción para la producción de una inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas, como los anticuerpos y los fragmentos de anticuerpos, también pueden expresarse en sistemas libres de células.
Se pueden elegir o construir vectores adecuados para la expresión de inmunoglobulinas, que contengan secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias según corresponda. Los vectores pueden ser plásmidos, virus, por ejemplo, fagos o fagémidos, según corresponda. Para más detalles véase, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2da edición, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de ácidos nucleicos, por ejemplo, en la preparación de construcciones de ácidos nucleicos, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión genética, y análisis de proteínas, se describen en detalle en Current Protocols in Molecular Biology, segunda edición, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992. El ácido nucleico que codifica una inmunoglobulina variante o un dominio CH1, VH y/o VL de la misma puede estar contenido en una célula huésped.
Los anticuerpos variantes se generaron como se describe, por ejemplo, en WO2011021009A1. En detalle: El ADN que codifica las variantes de anticuerpos como se describe en este documento se sintetizó químicamente y se clonó en un vector de expresión de mamífero adecuado. Para los experimentos de expresión transitoria, las cadenas pesadas y ligeras se clonaron en vectores de expresión separados. Para la generación de líneas celulares que expresen de forma estable una variante, las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos se clonaron en un único vector de expresión. Cada vector de expresión comprende un ADN que codifica una secuencia señal aguas arriba de las regiones codificantes de la cadena pesada y de la cadena ligera para permitir la secreción de la cadena pesada y ligera de las células de mamíferos.
Para la expresión transitoria, las células CHOK1SV se transfectaron utilizando, por ejemplo, Lipofectamina con los vectores de expresión que codifican las variantes como se describe en este documento. Por ejemplo, en el caso de variantes que comprenden al menos una mutación en la cadena ligera, un vector de expresión que comprende dicha(s) mutación(es) se cotransfectó con un vector que codifica la cadena pesada no modificada; en el caso de variantes que comprenden al menos una mutación en la cadena pesada, un vector de expresión que comprende dicha(s) mutación(es) se cotransfectó con un vector que codifica la cadena ligera no modificada. 72 h después de la transfección, se recolectaron sobrenadantes de las células transfectadas, se centrifugaron y se almacenaron a 4 °C antes de la purificación.
Para la producción a gran escala, las células CHOK1SV se transfectan como se describió anteriormente con un solo vector que comprende una cadena ligera y pesada modificada o no modificada. Se utilizan grupos de células transfectadas de forma estable para experimentos posteriores o se realiza una selección clonal. Los sobrenadantes de dichas células transfectadas estables que expresan una variante de la presente invención se recolectaron y almacenaron a 4 °C antes de la purificación.
Los sobrenadantes del cultivo celular se purificaron con proteína A utilizando columnas HiTrap (GE) y se almacenaron a 4 °C antes de la concentración y el intercambio del tampón. Las muestras se concentraron mediante centrifugación a 2000 g durante 15-20 minutos. El material se intercambió de tampón 4 a 5 veces utilizando un tampón de formulación (fosfato 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4). Una vez intercambiado el tampón, las muestras se diluyeron en el tampón de formulación hasta obtener una concentración de trabajo adecuada.
Evaluación del rendimiento proteico(in vitro)
El rendimiento del anticuerpo o de la variante del anticuerpo se estima mediante el título del producto en el sobrenadante y después de la purificación de la proteína A (por ejemplo, mediante ELISA sándwich, con absorbancia a 280 nm, o mediante cuantificación de la proteína A por HPLc ).
La Fig. 1 muestra los niveles de expresión de cada anticuerpo candidato en cultivos de CHOK1SV de 25 mL. Todas las variantes muestran niveles similares de expresión.
Conjugación
La conjugación se llevó a cabo mediante conjugación de biotina-maleimida para liberar grupos tiol mediante técnicas estándar Junutula J R et al, Nature Biotechnology 2008, 8, 925-932; Jeffrey S C et al, Bioconjugate Chem. 2013, 24, 1256 1263.
Para la conjugación con una toxina, los anticuerpos diseñados se reducen, por ejemplo, con una tris(2-carboxietil)fosfina (12,5 eq.) durante 2 h a 35 °C y pH 7,7. La mezcla se intercambia con 50 mM de Tris, 5 mM de EDTA, pH 7,7. Se añade ácido deshidroascórbico (15 eq.) y se deja que la reacción de oxidación se lleve a cabo durante 3 h a 24 °C. Se añade N,N-dimetilacetamida para alcanzar una concentración típicamente entre 1 y 5 %. Se añade maleimidocaproil-valinacitrulina-p-aminobenciloxicarbonil-monometilauristatina E (5 eq.) y se deja que la reacción de conjugación transcurra durante 1 h a 22 °C. La reacción se detiene mediante la adición de N-acetil-cisteína (5 eq.). Después de 0,5 h de incubación a 22 °C, la mezcla se intercambia en PBS 1x.
Evaluación de la propensión a la agregación/fragmentación (in vitro)
Antes y después de la conjugación, el porcentaje de monómero perdido debido a la agregación y/o fragmentación de anticuerpos se midió cuantitativamente utilizando cromatografía de exclusión por tamaño HPLC (SEC-HPLC) y cualitativamente utilizando SDS PAGE. Para este último, cada anticuerpo variante se trató con beta mercaptoetanol, o no se le administró ningún tratamiento, y se fraccionó por tamaño en una SDS PAGE. No se observó agregación ni fragmentación aparente de las variantes visibles.
Los resultados del análisis SEC-HPLC de muestras conjugadas y no conjugadas se muestran en la Fig. 2, utilizando muestras a 1 mg/mL en una columna Zorbax-250GF. Sorprendentemente, algunos de los anticuerpos de la invención, como por ejemplo HC S139C, HC V170C, HC S160C, HC T200C, LC V191C, LC T206C y LC T180C mostraron una menor pérdida de monómero y/o una menor cantidad de agregación o fragmentación de anticuerpos en comparación con el anticuerpo originalIanticuerpo no mutado.
Evaluación de la cinética de unión(in vitro)
También se analizó la cinética de unión de las variantes utilizando una microbalanza de cristal de cuarzo. Las quimeras Fc ERB2/HER2 se inmovilizaron en un chip carboxilo y se probaron tres concentraciones diferentes de cada variante (conjugada y no conjugada). La siguiente tabla resume el Kd para cada variante:
Evaluación de la relación fármaco-anticuerpo (DAR)(in vitro)
Finalmente, se determinó la DAR para cada una de las variantes, mediante cromatografía líquida-ionización por electrospray-espectrometría de masas en tándem (LC-ESI-MS/MS o LC-ESI-MS). Los valores de DAR para las diferentes variantes deben ser >1,7 y <2,2, ya que hay dos sitios de conjugación específicos por anticuerpo.
Para determinar el DAR, las muestras a 1 mg/mL se trataron con PNGaseF. Se analizaron muestras reducidas y no reducidas mediante cromatografía RP, electrospray y espectrometría de masas.
El grado de conjugación de biotina-maleimida con las cadenas ligeras y pesadas de las variantes se muestra en las figuras 3 y 4 respectivamente, y el DAR calculado para cada variante se muestra en la Fig. 5.
Evaluación de la conjugación y desconjugación(in vitro)
Cuando se analiza la estabilidad del ADC in vitro, el porcentaje de pérdida promedio de molécula conjugada durante un período de 8 días debe ser <39 %.
Se seleccionaron seis variantes preferidas y luego se analizó más a fondo cada una de ellas. Se determinó la estabilidad del conjugado (niveles de desconjugación) para cuatro concentraciones diferentes (150 ng/mL; 300 ng/mL; 1000 ng/mL y 2000 ng/mL) de cada una de las variantes finales en suero humano a 37 °C durante 8 días. Se tomaron muestras los días 0, 2, 4 y 8 y se analizaron mediante ELISA.
La disminución porcentual de biotina a lo largo de 8 días se muestra en la Fig. 6.
Cada una de las seis variantes finales se clasificó luego según características deseables (pureza, DAR, desconjugación y ambiente positivo) y se le asignó una puntuación de 6 (=mejor) a 1 (=peor). Luego se sumaron los puntajes para obtener una puntuación general de 4 a 24. Esto da una indicación de la conveniencia de cada anticuerpo para un mayor desarrollo. Las puntuaciones se muestran en la siguiente tabla.
Aunque las variantes de anticuerpos se pueden clasificar de esta manera, como cada una de las seis finales ha pasado por el proceso de selección inicial, se puede decir que todas tienen características deseables para el desarrollo como ADC. En particular, no todos los anticuerpos sobrevivirán a los procesos de desarrollo de fármacos posteriores y pruebasin vivo,por lo que es beneficioso poder generar una selección de candidatos. Además, otras variantes no seleccionadas para las seis finales, como las variantes restantes divulgadas en este documento, también pueden tener propiedades beneficiosas y, por lo tanto, pueden considerarse útiles para futuras investigaciones.
Las seis variantes finales fueron: cuatro variantes de cadena pesada (S160C, T190C, S443C, S447C) y dos variantes de cadena ligera (T180C o T206C). Como resultado del método secuencial de selección, se puede esperar que todas las variantes finales compartan una serie de propiedades específicas (o criterios de diseño): Estabilidad; baja agregación; bajo riesgo de degradación química; bajas modificaciones postraduccionales no deseadas; estabilidad estructural preservada; productividad; idoneidad para ser conjugado; y actividad biológica.
Los valores de cada variante probada se muestran en la siguiente tabla; las seis variantes finales seleccionadas están resaltadas.
_ _ _ Posteriormente, las seis variantes finales se conjugaron con Monometil Auristatina E (MMAE) mediante técnicas estándar. El método de conjugación sigue en líneas generales los métodos descritos anteriormente. La DAR para las variantes seleccionadas se determinó como se describe anteriormente. Un ejemplo de los resultados se muestra en la figura 7. Las condiciones 1-3 representan variantes menores en el procedimiento de conjugación con parámetros variados para intentar optimizar el DAR; el tiempo de reducción y la temperatura de los anticuerpos antes de la conjugación se variaron en cada una de las condiciones 1-3:
Condición 1: reducción a 35 °C durante 2 h (como se describe anteriormente)
Condición 2: reducción a 25 °C durante 2 h
Condición 3: reducción a 35 °C durante 1 h.
También se probó un mutante doble (DM) que combina LC T180C y HC S160C para determinar la propensión a la agregación y los datos DAR, utilizando las mismas técnicas descritas anteriormente. Los resultados se muestran en las siguientes tablas:
Datos de agregación de DM de las transfecciones transitorias
utilizando cromatografía de exclusión por tamaño SEC
Datos DM DAR de las transfecciones transitorias
utilizando HPLC PLRP
o métodos ESI-MS
Pruebas de toxicidad in vitro
Después de la conjugación con MMAE, las variantes de ADC se probaron para citotoxicidadin vitro.El análisis se realizó mediante técnicas estándar (Andreotti, P.E. et al. Cancer Res 1995.55, 5276-82; Gerhardt, R.T. et al. Am. J. Obstet. Gynecol 1991 165, 245-55). Las células elegidas para el ensayo se basaron en Neve R.M. et al. Cancer Cell 2006 10, 515- 527.
Esquemas de ensayo:
Día 1: Sembrar tres placas de 96 pocillos con cada una de las células SKBR3 (5k/pocillo) en medio (McCoy5A 10 % FBS 1XPen/Strep), células BT474 (8k/pocillo) en medio (DMEM/F12 10 % FBS 1XPen/Strep) y células MCF7 (4k/pocillo) en medio (RPMI 10 % Fb S 1XPen/Strep). Incubar en una incubadora con CO2 humidificado a 37 °C durante 18 horas.
Día 2: Preparar diluciones de muestras de variantes de ADC. Preparar las reservas de trabajo iniciales de 667 nM de estas muestras en medio RPMI con 10 % FBS. Luego preparar una dilución seriada de 1/3 de 667 nM a 11 pM en medio. Añadir 5 uL de la dilución en cada pocillo de ~100 uL de células. Las concentraciones finales de la muestra varían de 33,3 nM a 0,56 pM (como diluciones seriadas de 1/3). Incubar a 37 °C en una incubadora de CO2 humidificada durante 72 horas.
Día 4: Evaluar las placas bajo el microscopio.
Día 5: Determinar la viabilidad celular utilizando el reactivo Cell-Titer Glo:
-Aspirar el medio de la placa de 96 pocillos.
-Añadir 100 uL de reactivo Cell-Titer Glo (Promega Inc.) en cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
- Determinar la luminiscencia utilizando el lector de placas Tecan Ultra.
- Analizar y graficar datos como porcentaje de viabilidad vs. concentración (nM) o como luminiscencia aleatoria.
Un ejemplo de los resultados se muestra en la figura 8. Como se puede observar en la Figura 8, las variantes de ADC HC S443<c>y LC T180C reducen la viabilidad de las células SKBR3 y BT474 en un 50 % en concentraciones muy bajas, mientras que estas variantes de ADC no muestran un efecto durante 72 horas en células menos sensibles como MCF7.
A continuación, se muestran las secuencias completas de la cadena variante de cada una de las variantes descritas en este documento. Estos muestran solo la cadena variante; la otra cadena será la misma que la secuencia de trastuzumab no modificada (es decir, SEQ ID No 1 (LC) o 2 (HC)).
Cadenas pesadas:
>HCherS139C (SEQ ID No 3)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWV ARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC SRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTCGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK
>HCherS160C (SEQ ID No 4)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWV ARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC SRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVCWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK
>HCherS168C (SEQ ID No 5)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWV ARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC SRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTCGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK
>HCherV170C (SEQ ID No 6)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWV ARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC SRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGCHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK
>HCherV176C (SEQ ID No 7)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWV ARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC SRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPACLQSSGLYSLSSVVTVP
SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK
>HCherT190C (SEQ ID No 8) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWV ARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC SRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVCVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK
>HCherT200C (SEQ ID No 9) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWV ARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC SRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQCYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK
>HCherS443C (SEQ ID No 10) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWV ARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC SRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKCLSLSPGK
>HCherS445C (SEQ ID No 11) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWV ARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC SRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLCLSPGK
>HCherS447C (SEQ ID No 12) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWV ARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC SRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLCPGK
Cadenas ligeras:
>LCherS171C (SEQ ID No 13) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLI YSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPP TFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDCTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>LCherT180C (SEQ ID No 14) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLI YSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPP TFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLCLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>LCherS182C (SEQ ID No 15) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLI YSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPP TFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLCKADYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>LCherA184C (SEQ ID No 16) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLI YSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPP TFGQGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKCDYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>LCherV191C (SEQ ID No 17) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLI YSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPP TFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKCY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>LCherS202C (SEQ ID No 18) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLI YSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPP TFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLCSPVTKSFNRGEC
>LCherS203C (SEQ ID No 19) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLI YSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPP TFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLSCPVTKSFNRGEC
>LCherT206C (SEQ ID No 20) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLI YSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPP TFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVCKSFNRGEC
>LCherS208C (SEQ ID No 21) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLI YSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPP TFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKCFNRGEC
Se apreciará que se puede utilizar un proceso de selección y cribado similar para desarrollar otros anticuerpos variantes, no solo aquellos basados en trastuzumab, y además que se puede esperar que las variantes de estos otros anticuerpos que tienen las mismas mutaciones de la región constante identificadas en este documento también tengan propiedades deseables similares.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo o un fragmento del mismo, que tiene una región variable que se une a una molécula objetivo, y una región constante, donde la región constante comprende una o más mutaciones que introducen un sitio de conjugación específico del sitio seleccionado para permitir la conjugación del anticuerpo o fragmento a una carga útil, donde las una o más mutaciones incluyen una mutación en la posición de cadena ligera 208, donde el residuo mutado en la posición de cadena ligera 208 es cisteína, donde el anticuerpo se selecciona del grupo que comprende IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.
2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 donde el residuo de tipo salvaje en la posición 208 es S.
3. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende además una o más mutaciones en una o más posiciones seleccionadas entre los residuos 160 de la cadena pesada, 190 de la cadena pesada, 168 de la cadena pesada, 170 de la cadena pesada, 176 de la cadena pesada y 200 de la cadena pesada, donde los residuos mutados se seleccionan independientemente entre cisteína, lisina, glutamina o un aminoácido no natural.
4. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende además una o más mutaciones seleccionadas entre cadena ligera (LC) T180, LC S171, LC S182, LC A184, LC V191, LC S202, LC S203, LC T206, cadena pesada (HC) S160, HC T190, HC S443, HC S447, HC S139, HC S168, HC V170, HC V176, HC T200, HC S445 de acuerdo con una convención de numeración posicional.
5. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; donde X es C.
6. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 5, que comprende además una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 22 a 39; donde cada X es C.
7. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el anticuerpo es humano, humanizado o quimérico.
8. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la región constante comprende al menos una porción de una región constante lgG1 que comprende uno o más de los dominios C<k>, CH1 y CH3 de la región constante lgG1.
9. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en Fabs, fragmentos de anticuerpos biespecíficos (scFv-Fc en tándem, scFv-Fc con protuberancias en agujeros, scFv-Fc-scFv, F(ab')2, Fab-scFv, (Fab'scFv)2, scDiacuerpo-Fc o scDiacuerpo-C<H>3), anticuerpos biespecíficos basados en IgG (hibridoma híbrido, protuberancias en agujeros con cadena ligera común, IgG dos en uno, IgG de dominio V dual, IgG-scFv, scFv-IgG, IgG-V, V-IgG) y di-diacuerpo.
10. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un enlazador.
11. Un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, una carga útil y un enlazador que une la carga útil al anticuerpo.
12. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, o el inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 11, donde el enlazador se selecciona de 6-maleimidocaproilo (MC), maleimidopropanoilo (MP), valina-citrulina (val-cit), alanina-fenilalanina (ala-phe), p-aminobenciloxicarbonilo (PAB), N-succinimidilo 4-(2-piridiltio) pentanoato (SPP), N-succinimidilo 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1 carboxilato (SMCC), N-succinimidilo, (4-yodo-acetil) aminobenzoato (SLAB), SPDB, hidrazona, maleimidocaproilo y 6-maleimidocaproil-valina-citrulina-p-aminobenciloxicarbonilo (MC-vc-PAB); o es un enlazador ramificado que comprende una cadena peptídica y se deriva del alcohol p-amino bencílico ohidroxi, donde la cadena peptídica está conectada al anillo de fenilo a través del grupo p-amino, la carga útil está conectada al anillo de fenilo a través de la fracción de alcohol bencílico y el anticuerpo está conectado al anillo de fenilo a través del grupo o-hidroxi.
13. El inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 11 ó 12, donde la carga útil se selecciona del grupo que consiste en 90Y; 1311; 67Cu; 177Lu; 213Bi; 211At; dolastatina; vedotina; monometil auristatina F (MMAF); monometil auristatina E (MMAE); maitansinoides que incluyen DM1 y DM4; duocarmicina; análogos de duocarmicina; caliqueamicina; pirrolobenzodiazepinas (PBD); centanamicina; irinotecán y doxorrubicina; alfa-amanitina; melatonina; péptido disruptor de membrana; exotoxina A de Pseudomonas; toxina de difteria; ricina; polietilenglicol; hidroxietil almidón; y un residuo manosilo; o donde la carga útil es un agente disruptor de microtúbulos; o un agente modificador de ADN.
14. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un inmunoconjugado conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
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