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ES3034679T3 - Interleukin-4-induced gene 1 (il4i1) as a biomarker and uses thereof - Google Patents

Interleukin-4-induced gene 1 (il4i1) as a biomarker and uses thereof

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Publication number
ES3034679T3
ES3034679T3 ES20716827T ES20716827T ES3034679T3 ES 3034679 T3 ES3034679 T3 ES 3034679T3 ES 20716827 T ES20716827 T ES 20716827T ES 20716827 T ES20716827 T ES 20716827T ES 3034679 T3 ES3034679 T3 ES 3034679T3
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ES
Spain
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cells
il4i1
ahr
biological
sample
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ES20716827T
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Christiane Opitz
Ahmed Sadik
Patterson Luis Felipe Somarribas
Soumya Mohapatra
Mirja Tamara Prentzell
Philipp Secker
Saskia Trump
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Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Original Assignee
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
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Publication date
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Abstract

La presente invención se refiere a una enzima activadora de AHR recientemente identificada y a sus usos como marcador en el diagnóstico y la terapia, por ejemplo para seleccionar pacientes para el tratamiento con intervenciones moduladoras de IL4I1 y para el seguimiento de la respuesta a la terapia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Gen 1 inducido por interleucina-4 (IL4I1) como biomarcador y usos del mismo
La presente invención se refiere a una enzima activadora de AHR recientemente identificada y a su uso como marcador en diagnóstico y terapia, por ejemplo, para la selección de pacientes para el tratamiento con intervenciones moduladoras de la IL4I1 y el seguimiento de la respuesta terapéutica.
Antecedentes de la invención
La IL4I1 es una L-aminoácido oxidasa que cataliza la desaminación oxidativa de L-aminoácidos a alfa-cetoácidos produciendo peróxido de hidrógeno y amoníaco (1). Descubierto inicialmente como un gen inducible por IL4 inmediatotemprano en linfocitos B (2, 3), Posteriormente, la IL4I1 se identificó también en macrófagos y células dendríticas (4). Además, la IL4I1 se expresa en las neoplasias humanas, ya sea en las propias células neoplásicas o en los macrófagos asociados al tumor (5). La IL4I1 inhibe la proliferación de linfocitos T (4, 6), lo que se ha atribuido principalmente a su producción de H2O2. Es más, La IL4I1 ha sido implicada en la diferenciación de linfocitos Th17 (7) y linfocitos T reguladores (8), que se sabe que está modulada por la activación de AHR (9-11).
En la actualidad, sólo se sabe muy poco sobre las implicaciones terapéuticas de las afecciones asociadas a la IL4I1. Esto puede ilustrarse con la presencia de una única publicación de patente, el documento WO 2016/040488, que divulga métodos para promover la formación de mielina en el tejido del sistema nervioso central (SNC) en un sujeto que lo necesite, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína IL4l1. El documento Wo 2017/189353 divulga que la actividad de la IL4I1 puede reducirse con antagonistas, incluidos, anticuerpos, aptámeros y proteínas.
El receptor de arilhidrocarburos (AHR) es un factor de transcripción activado por ligando que interviene en la regulación de diversos procesos, tales como embriogénesis, vasculogénesis, metabolismo, inmunidad y cáncer. En estudios preclínicos, la activación del AHR por metabolitos del triptófano generados a través de la indoleamina-2,3-dioxigenasa (IDO1) y/o la triptófano-2,3-dioxigenasa (TDO2) promovió la progresión tumoral al aumentar la motilidad, la resistencia a anoikis y la supervivencia clonogénica de las células tumorales, así como suprimiendo las respuestas inmunitarias antitumorales (12). La expresión de los genes diana del AHR es específica del contexto (13), por lo que se requiere la introducción de nuevos biomarcadores de la activación del AHR que detecten eficazmente la activación del AHR en diferentes células/tejidos y en respuesta a diversos ligandos del AHR. Asimismo, las implicaciones funcionales de la modulación de la IL4I1 y la modulación de la AHR comparten muchas vías comunes y se cruzan, lo que implica la importancia de considerar la IL4I1 como un biomarcador potencial para las condiciones de modulación del AHR y viceversa.
En un primer aspecto de la misma, la presente invención se refiere a un método para detectar una modulación de AHR en una célula o un sujeto, que comprende la detección de un cambio del estado biológico de la IL4I1 en dicha célula o en una muestra biológica derivada de dicho sujeto, en donde un cambio en dicho estado biológico de la IL4I1 en dicha célula o muestra, en comparación con una célula o muestra de control, por ejemplo, una muestra procedente de un sujeto sano, un paciente o grupo de pacientes, indica una modulación de AHR relacionada con la IL4Il en dicha célula o sujeto.
En un segundo aspecto de la misma, la presente invención proporciona un métodoin vitropara el cribado de al menos un modulador potencial de la expresión y/o actividad biológica de IL4I1, que comprende poner en contacto una muestra que comprende IL4I1 o una célula que expresa IL4I1 con al menos un compuesto modulador candidato, y detectar una modulación de dicha IL4I1, en donde dicha modulación identifica un modulador potencial de la expresión y/o actividad biológica de IL4I1.
Preferentemente, el método es un método de cribado de al menos un modulador del estado biológico de la IL4I1, que comprende poner en contacto al menos un compuesto modulador candidato con una muestra biológica y detectar un cambio de dicho estado biológico de IL4I1 en una muestra biológica, en donde un cambio en el estado biológico de dicha IL4I1 en presencia de dicho al menos un modulador comparado con la ausencia de dicho al menos un modulador identifica un modulador.
En un tercer aspecto de la misma, la presente invención se refiere a un método para monitorizar la modulación del estado biológico de IL4I1 en respuesta a al menos un compuesto, que comprende realizar un método según la presente invención en una muestra biológica que se puso en contacto con al menos un compuesto y en donde dicha muestra biológica se compara con una muestra de control que no se puso en contacto con dicho compuesto.
En un subaspecto de este método, la presente invención se refiere a un método para monitorizar el estado biológico de AHR en una célula, que comprende proporcionar al menos un compuesto a dicha célula y detectar el cambio en el estado biológico, tal como la expresión y/o función biológica de IL4I1 en dicha célula en respuesta a dicho al menos un compuesto, en donde un cambio en el estado biológico, tal como en la expresión o función biológica en presencia de dicho al menos un compuesto en comparación con la ausencia de dicho al menos un compuesto indica un efecto de dicho al menos un compuesto sobre dicho estado biológico del AHR en una célula.
En otro aspecto preferido de la presente invención, la invención se refiere entonces a un método para tratar y/o prevenir una enfermedad o afección relacionada con el AHR en una célula, por ejemplo en un paciente que necesite dicho tratamiento, que comprende realizar un método según la presente invención y proporcionar un tratamiento adecuado a dicho paciente, en donde dicho tratamiento se basa, al menos en parte, en los resultados del método según la presente invención, tal como proporcionar un compuesto como el identificado o supervisar un tratamiento que comprende el método o métodos descritos en el presente documento.
Otro aspecto importante de la presente invención se refiere a un kit de diagnóstico que comprende materiales para llevar a cabo un método según la presente invención en uno o varios recipientes separados, opcionalmente junto con agentes auxiliares y/o instrucciones para llevar a cabo dicho método. Otro aspecto importante de la presente invención se refiere entonces al uso de dicho kit de diagnóstico en un método según la presente invención.
Por último, la invención se refiere al uso del biomarcador IL4I1 para el cribado de moduladores según la presente invención o para la monitorización según la presente invención.
Generalmente se prefieren las variantes humanas del biomarcador IL4I1, o especies estrechamente relacionadas, como las de otros primates o mamíferos.
Otros aspectos y ventajas pueden deducirse fácilmente de la lectura de la siguiente descripción y de los ejemplos no limitativos.
Los presentes inventores, mientras investigaban el papel de las enzimas degradadoras de triptófano en la modulación de la actividad de los AHR, descubrieron que la expresión de IL4I1, una enzima degradadora de triptófano expresada en cánceres humanos (Figura 1) y aún no implicada en la activación del AHR, se correlacionaba significativamente con la expresión del gen diana de AHR. Los análisis de expresión génica (Figura 2a) y la translocación nuclear del AHR (Figura 2b) establecieron que la IL4I1 activa el AHR a través de la producción de metabolitos del triptófano, incluido ácido kinurénico (Figura 2g-i, Figura 3-4).
Como se ha mencionado anteriormente, en experimentos realizados en el contexto de la presente invención, el nuevo biomarcador IL4I1 fue identificado como un nuevo componente anterior al AHR. Esto permite un métodoin vitropara el cribado de al menos un modulador del estado biológico de IL4I1, que comprende poner en contacto al menos un compuesto modulador candidato con una muestra biológica y detectar un cambio de dicho estado biológico de IL4I1 en una muestra biológica, en donde un cambio en el estado biológico de dicha IL4I1 en presencia de dicho al menos un modulador comparado con la ausencia de dicho al menos un modulador identifica un modulador. Un modulador puede ser un activador (inductor) o inhibidor de dicho estado biológico de la IL4I1.
En una alternativa, el método de cribado de un modulador potencial de la expresión y/o actividad biológica de IL4I1 comprende poner en contacto una muestra que comprende IL4I1 o una célula que expresa IL4I1 con al menos un compuesto modulador candidato y detectar una unión de dicho modulador a dicha IL4I1, en donde dicha unión identifica un modulador potencial de la expresión y/o actividad biológica de IL4I1. Este método comprende preferentemente además la etapa de detectar la expresión y/o la actividad biológica de la IL4I1 en dicha célula o la actividad biológica de la IL4I1 en dicha muestra, en donde un cambio en la expresión o actividad biológica de la IL4I1 en presencia de dicho al menos un modulador comparado con la ausencia de dicho al menos un modulador identifica un modulador.
Se prefiere un método tal según la presente invención, en donde dicho modulador se selecciona entre un inhibidor o un inductor de dicha expresión o actividad biológica.
Otro aspecto importante de la presente invención se refiere entonces a un método para diagnosticar una enfermedad o afección relacionada con el AHR en una célula y/o un sujeto, que comprende detectar un cambio del estado biológico de IL4I1 en una muestra biológica derivada de dicha célula y/o sujeto, en donde un cambio en dicho estado biológico de la IL4I1 en dicha muestra, en comparación con una muestra de control, indica una afección fisiológica o patológica relacionada con el AHR en dicha célula y/o sujeto.
En un aspecto, dicho método comprende detectar la expresión o función biológica de IL4I1 en una célula/tejido/fluido biológico, en donde un cambio en la expresión o función biológica en dichos compartimentos, en particular la expresión o la activación, en comparación con una muestra sana u otra muestra de control adecuada, indica una enfermedad o afección relacionada con AHR. Dicho cambio puede ser de al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 % o al menos aproximadamente el 90 % o más de regulación por aumento o por disminución de la expresión o función biológica, en comparación con un control adecuado, tal como el valor en una célula sana o una muestra derivada de una persona o grupo de individuos sanos, o cuando se compara con un patrón interno, como un gen doméstico. En el contexto de la presente invención, el término "aproximadamente" significará /- 10 % del valor dado, a menos que se indique de otro modo.
En el contexto de la presente invención, se descubrió que dicha modulación de AHR en una célula o sujeto detectada mediante la detección de un cambio del estado biológico de IL4I1 es indicativa de una afección fisiológica o patológica relacionada con AHR en dicha célula o sujeto. Preferentemente, la afección fisiológica o patológica asociada al AHR que debe estratificarse y/o diagnosticarse se selecciona entre intoxicación, cáncer, trastornos autoinmunitarios, degeneración, inflamación, infección, enfermedades y afecciones metabólicas, angiogénesis, metabolismo de fármacos, hematopoyesis, metabolismo lipídico, motilidad celular, modulación inmunitaria y estados de estrés, por ejemplo, estrés biológico, mecánico y ambiental.
Se prefiere un método según la presente invención, en donde dicho estado biológico detectado se selecciona entre mutaciones, metilación de ácidos nucleicos, número de copias, expresión, cantidad de proteínas, modificaciones proteínicas, localización celular, metabolitos, en particular metabolitos producidos por IL4I1, tales como, por ejemplo, productos de degradación del triptófano, metabolitos del triptófano, incluido ácido kinurénico, y la actividad biológica de la IL4I1.
En una realización preferida, en el método según la presente invención dicho estado biológico de la IL4I1 se detecta indirectamente a través de un cambio de abundancia o actividad biológica de al menos un biomarcador metabolito según la tabla 1 como se indica a continuación, en donde un cambio en dicha expresión o actividad biológica de dicho al menos un biomarcador en comparación con una muestra de control indica un cambio del estado biológico de la IL4I1 en dicha muestra.
En el método según la presente invención, dicha muestra biológica puede seleccionarse entre una muestra adecuada que comprende fluidos biológicos, células humanas, tejidos, sangre entera, líneas celulares, sobrenadantes celulares, células primarias, IPSC, hibridomas, células recombinantes, células madre y células cancerosas, células óseas, células de cartílago, células nerviosas, células gliales, células epiteliales, células de la piel, células del cuero cabelludo, células pulmonares, células de la mucosa, miocitos, células musculoesqueléticas, células de músculo estriado, células de músculo liso, células cardíacas, células secretoras, adipocitos, células sanguíneas, eritrocitos, basófilos, eosinófilos, monocitos, linfocitos, linfocitos T, linfocitos B, neutrófilos, células NK, linfocitos T reguladores, células dendríticas, linfocitos Th17, linfocitos Th1, linfocitos Th2, células mieloides, macrófagos, células estromales derivadas de monocitos, células de médula ósea, células del bazo, células del timo, células pancreáticas, ovocitos, esperma, células renales, fibroblastos, células intestinales, células del aparato reproductor femenino o masculino, células de próstata, células de vejiga, células oculares, células corneales, células retinianas, células sensoriales, queratinocitos, células hepáticas, células cerebrales, células de riñón y células de colon, y los homólogos transformados de dichas células o tejidos.
Se prefiere un método según la presente invención, en donde dicho sujeto se selecciona entre un sujeto mamífero, en particular un sujeto humano, en particular, un paciente humano que padezca una afección fisiológica o patológica relacionada con AHR. Dicha muestra de control puede seleccionarse a partir de una muestra como la descrita anteriormente.
Otro aspecto de la invención se refiere además a un método para monitorizar la modulación del estado biológico de IL4I1 en respuesta a al menos un compuesto, que comprende realizar un método según la presente invención en una muestra biológica que se puso en contacto con una cantidad de dicho al menos un compuesto y en donde dicha muestra biológica se compara con una muestra de control que no se puso en contacto con dicha cantidad de dicho compuesto.
Se prefiere un método de este tipo para monitorizar una enfermedad o afección relacionada con el AHR en una célula, que comprende proporcionar al menos un compuesto a dicha célula y detectar el cambio en la expresión o función biológica de IL4I1 en dicha célula en respuesta a dicho al menos un compuesto, en donde un cambio en la expresión o función biológica en presencia de dicho al menos un compuesto comparado con la ausencia de dicho al menos compuesto indica un efecto de dicho al menos un compuesto sobre dicha enfermedad o afección relacionada con la IL4Il.
En el contexto de la invención, la enfermedad o afección relacionada con AHR puede seleccionarse entre al menos una de intoxicación, cáncer, trastornos autoinmunitarios, degeneración, inflamación, infección, enfermedades y afecciones metabólicas, angiogénesis, metabolismo de fármacos, hematopoyesis, metabolismo lipídico, motilidad celular, la senescencia, inmunomoduladores, afecciones de estrés, por ejemplo, estrés biológico, mecánico y ambiental, y modulación de AHR.
En algunas realizaciones, la afección es cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona entre carcinoma adrenocortical (ACC, por sus siglas en inglés), carcinoma urotelial de vejiga (BLCA, por sus siglas en inglés), carcinoma invasivo de mama (BRCA, por sus siglas en inglés), carcinoma cervical de células escamosas y adenocarcinoma endocervical (CESC, por sus siglas en inglés), colangiocarcinoma (CHOL, por sus siglas en inglés), adenocarcinoma de colon (COAD, por sus siglas en inglés), neoplasia linfoide linfoma difuso de linfocitos B grandes (DLBC, por sus siglas en inglés), carcinoma esofágico (ESCA, por sus siglas en inglés), glioblastoma multiforme (GBM, por sus siglas en inglés), carcinoma epidermoide de cabeza y cuello (HNSC, por sus siglas en inglés), cromófobo renal (KICH, por sus siglas en inglés), carcinoma renal de células transparentes renales (KIRC, por sus siglas en inglés), carcinoma de células papilares renales de riñón (KIRP. por sus siglas en inglés), Glioma cerebral de bajo grado (LGG. por sus siglas en inglés), carcinoma hepatocelular de hígado (LIHC, por sus siglas en inglés), adenocarcinoma de pulmón (LUAD, por sus siglas en inglés), carcinoma epidermoide de pulmón (LUSC, por sus siglas en inglés), mesotelioma (MESO, por sus siglas en inglés), cistadenocarcinoma seroso de ovario (OV, por sus siglas en inglés), adenocarcinoma pancreático (PAAD, por sus siglas en inglés), feocromocitoma y paraganglioma (PCPG, por sus siglas en inglés), adenocarcinoma de próstata (PRAD, por sus siglas en inglés), adenocarcinoma de recto (READ, por sus siglas en inglés), sarcoma (SARC, por sus siglas en inglés), melanoma cutáneo de la piel (SKCM, por sus siglas en inglés), adenocarcinoma de estómago (STAD, por sus siglas en inglés), tumores de células germinales testiculares (TGCT, por sus siglas en inglés), carcinoma de tiroides (THCA, por sus siglas en inglés), timoma (THYM, por sus siglas en inglés), carcinoma endometrial del cuerpo uterino (UCEC, por sus siglas en inglés), carcinosarcoma uterino (UCS, por sus siglas en inglés) y melanoma uveal (UVM, por sus siglas en inglés).
Se proporcionan métodos según la presente invención para, en un aspecto, buscar moduladores y dilucidar sus efectos sobre el biomarcador IL4I1 identificado. Ejemplos de tales compuestos a identificar pueden seleccionarse a partir de una molécula pequeña, un péptido y una biblioteca de dichos compuestos. Dicho compuesto identificado (cribado) se selecciona entre moléculas químicas pequeñas, péptidos, anticuerpos y ARN de interferencia cortos. Preferentemente, dicho compuesto puede seleccionarse entre un dominio proteináceo, una molécula pequeña, un péptido, una sustancia medioambiental, probiótico, toxina, aerosol, medicina, nutriente, composición galénica, extracto de plantas, compuesto volátil, sustancia homeopática, incienso, fármaco, vacuna, un compuesto o mezcla de compuestos derivados de organismos, por ejemplo animales, plantas, hongos, bacterias, arqueas, un compuesto químico, un compuesto utilizado en la industria alimentaria o cosmética, y una biblioteca de dichos compuestos.
La identificación y el cribado de los biomarcadores divulgados en el presente documento pueden realizarse mediante métodos conocidos en la materia, utilizando preferentemente proteínas de los biomarcadores producidas de forma recombinante y/o modelos celulares recombinantes. Para esto, se pueden marcar los biomarcadores, por ejemplo, utilizando tintes químicos o marcadores fluorescentes. Además, pueden utilizarse enzimas, opcionalmente en forma de fusiones con el biomarcador que se desea cribar. Preferentemente, dicho método también es susceptible de automatización y dicho cribado se evalúa preferentemente en un formato automatizado y/o de alto rendimiento.
Otro aspecto se refiere entonces al uso de al menos un biomarcador de IL4I1 para el cribado de moduladores según la presente invención o para la monitorización según la presente invención o para analizar la seguridad biológica según la presente invención o para un diagnóstico según la presente invención.
En otro aspecto preferido de la presente invención, la invención se refiere a un método de tratamiento y/o prevención de una enfermedad o afección relacionada con AHR en una célula de un paciente que necesita dicho tratamiento, que comprende realizar un método según la presente invención y proporcionar un tratamiento adecuado a dicho paciente, en donde dicho tratamiento se basa, al menos en parte, en los resultados del método según la presente invención, tal como el suministro de un compuesto según lo identificado o el seguimiento de un tratamiento.
En el contexto de la presente invención, puede usarse cualquier muestra biológica que comprende la proteína marcadora IL4I1 (o partes funcionalmente relevantes de la misma), o una muestra que comprende células, que comprende la proteína marcadora IL4I1 (o partes funcionalmente relevantes de la misma), por ejemplo, obtenida de un paciente con cáncer o una muestra que comprende al menos uno de los metabolitos producidos a partir de la IL4I1, por ejemplo, como se muestra en la tabla 1, siempre que contenga (o se presuma que contiene) al menos uno de los biomarcadores que se utilizarán en el análisis y/o cribado. Preferentemente, la muestra biológica se selecciona de una muestra que comprende fluidos biológicos que contienen biomarcadores, células, una muestra adecuada que comprende fluidos biológicos, células humanas, tejidos, sangre entera, líneas celulares, sobrenadantes celulares, células primarias, IPSC, hibridomas, células recombinantes, células madre y células cancerosas, células óseas, células de cartílago, células nerviosas, células gliales, células epiteliales, células de la piel, células del cuero cabelludo, células pulmonares, células de la mucosa, miocitos, células musculoesqueléticas, células de músculo estriado, células de músculo liso, células cardíacas, células secretoras, adipocitos, células sanguíneas, eritrocitos, basófilos, eosinófilos, monocitos, linfocitos, linfocitos T, linfocitos B, neutrófilos, células NK, linfocitos T reguladores, células dendríticas, linfocitos Th17, linfocitos Th1, linfocitos Th2, células mieloides, macrófagos, células estromales derivadas de monocitos, células de médula ósea, células del bazo, células del timo, células pancreáticas, ovocitos, esperma, células renales, fibroblastos, células intestinales, células del aparato reproductor femenino o masculino, células de próstata, células de vejiga, células oculares, células corneales, células retinianas, células sensoriales, queratinocitos, células hepáticas, células cerebrales, células de riñón y células de colon, y los homólogos transformados de dichas células o tejidos. La muestra también puede seleccionarse a partir de tejido tumoral (tumor o metástasis), biopsias, sangre entera, sangre periférica o fracciones de la misma, suero, capa leucocitaria, líquido linfático, orina, médula ósea, sangre entera heparinizada y muestras congeladas de la misma, tales como sangre entera heparinizada congelada. Las células a utilizar en los métodos según la presente invención pueden ser recombinantes o no recombinantes y expresar proteínas de origen celular, en función de la finalidad deseada y de las circunstancias. Pueden excluirse las células madre embrionarias humanas totipotenciales, si es necesario. La muestra también puede ser una muestra combinada de un grupo de sujetos, por ejemplo, un grupo de pacientes.
Otro aspecto de la presente invención se refiere además a un método para producir un preparado farmacéutico, en donde dicho compuesto/modulador identificado (cribado) se formula además en una preparación farmacéutica mezclando dicho (al menos un) compuesto identificado (cribado) con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los preparados farmacéuticos pueden presentarse preferentemente en forma de inyectables, comprimidos, cápsulas, jarabes, elixires, pomadas, cremas, parches, implantes, aerosoles, aerosoles y supositorios (rectales, vaginales y uretrales). Otro aspecto de la presente invención se refiere además a un preparado farmacéutico tal como se prepara según la invención.
En otro aspecto de la presente invención, la invención se refiere además a un kit de diagnóstico que comprende materiales para llevar a cabo un método de acuerdo con la presente invención como en el presente documento en uno o recipientes separados, opcionalmente junto con agentes auxiliares y/o instrucciones para llevar a cabo dicho método según la presente invención.
Por "tratamiento" se entenderá la reducción y/o mejora de los síntomas de la enfermedad. Un tratamiento eficaz consigue, por ejemplo, una reducción de la masa tumoral y del número de células cancerosas. Un tratamiento también puede evitar (prevenir) y reducir la propagación del cáncer, tales como, por ejemplo, afectar a las metástasis y/o a su formación. Un tratamiento puede ser un tratamiento virgen (antes de que se haya iniciado cualquier otro tratamiento de una enfermedad), o un tratamiento posterior a la primera ronda de tratamiento (por ejemplo, después de una intervención quirúrgica o tras una recaída). El tratamiento también puede ser un tratamiento combinado, que implica, por ejemplo, quimioterapia, cirugía y/o radioterapia.
En los métodos de la presente invención, en general, los biomarcadores pueden detectarse y/o determinarse mediante cualquier ensayo adecuado. La detección suele dirigirse a la información cualitativa ("marcador sí-no"), mientras que la determinación implica el análisis de la cantidad de un marcador (por ejemplo, nivel de expresión y/o actividad). La detección también está dirigida a identificar, por ejemplo, mutaciones que causan funciones alteradas de marcadores individuales. La elección de la(s) prueba(s) depende del parámetro del marcador a determinar y/o del proceso de detección. Por tanto, la determinación y/o detección puede comprender preferentemente un método seleccionado entre hibridación sustractiva, análisis de micromatrices, secuenciación de ADN, secuenciación de ARN, qPCR, ELISA, IP, PLA, BiFC, HPLC, WB, pruebas de actividad enzimática, detección por fluorescencia, ensayos de viabilidad celular, por ejemplo, un ensayo MTT, ensayos de tirosina quinasa fosforreceptora, fosfo-MAPK y ensayos de proliferación, por ejemplo el ensayo BrdU, proteómica, matrices de citocinas y espectrometría de masas.
Preferentemente, dicho método también es susceptible de automatización y dicha actividad y expresión se evalúa preferentemente en un formato automatizado y/o de alto rendimiento. Normalmente, esto implica el uso de chips y la maquinaria correspondiente, tal como robots.
Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a métodos para determinar el estado de activación del AHR de una muestra biológica. En algunas realizaciones, la muestra biológica se toma de un sujeto. En algunas realizaciones, se determina/mide un estado biológico para el gen 1 inducido por la interleucina 4 (IL4I1).
En algunas realizaciones, el método para determinar la firma de activación de AHR para una afección comprende: (a) obtener una muestra biológica de un sujeto; (b) determinar, en la muestra biológica, un estado biológico de la IL4I1; (c) determinar, en una célula de control, el estado biológico de la IL4I1; (d) comparar el estado biológico de la etapa (b) con el estado biológico de la etapa (c); y (e) determinar el estado de activación de AHR de la muestra biológica basándose en la comparación.
En algunas realizaciones, el estado biológico detectado en la etapa (b) es la expresión de ARN. En algunas realizaciones, la detección de un estado biológico comprende la medición de los niveles del estado biológico. En algunas realizaciones, la expresión de ARN de un biomarcador se detecta mediante métodos conocidos en la técnica, entre los que se incluyen, pero sin limitación, qPCR, RT-qPCR, RNA-Seq e hibridaciónin situ.
En algunas realizaciones, el método comprende además tratar al sujeto con un modulador de la señalización de AHR (también "modulador de AHR"). En algunas realizaciones, el modulador de la señalización de AHR se administra todos los días, cada dos días, dos veces a la semana, una vez a la semana una vez al mes o dos veces al mes. En algunas realizaciones, el modulador de la señalización de AHR se administra junto con otros fármacos como parte de una terapia combinada.
Un "modulador de la señalización de AHR" o un "modulador de AHR", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un modulador que afecta a la señalización de AHR en una célula. En algunas realizaciones, un modulador de la señalización de AHR exhibe efectos directos sobre la señalización de AHR. En algunas realizaciones, el efecto directo sobre el AHR está mediado por la unión directa al AHR. En algunas realizaciones, un modulador directo exhibe efectos agonistas y/o antagonistas totales o parciales sobre el AHR. En algunas realizaciones, un modulador de AHR es un modulador indirecto.
En algunas realizaciones, un modulador de la señalización de AHR es un compuesto de molécula pequeña. La expresión "compuesto de molécula pequeña" se refiere en el presente documento a un compuesto químico orgánico pequeño, que generalmente tiene un peso molecular de menos de 2000 dalton, 1500 dalton, 1000 dalton, 800 dalton o 600 dalton.
En algunas realizaciones, un modulador de AHR comprende un compuesto de 2-fenilpirimidina-4-carboxamida, un compuesto 3-oxo-2,3-dihidropiridazina-4-carboxamida sustituido con azufre, un compuesto 3-oxo-6-heteroaril-2-fenil-2,3-dihidropiridazina-4-carboxamida, un compuesto 2-hetarilpirimidina-4-carboxamida, un compuesto 3-oxo-2,6-difenil-2,3-dihidropiridazina-4-carboxamida, un compuesto 2-heteroaril-3-oxo-2,3-dihidro-4-carboxamida, PDM 2, 1,3-dicloro-5-[(1E)-2-(4-metoxifenil)etenil]-benceno, a-naftoflavona, 6,2',4'-trimetoxiflavona, CH223191, un derivado de tetrahidropiridopirimidina, StemRegenin-1, CH223191, GNF351, CB7993113 HP163, PX-A590, PX-A548, PX-A275, PX-A758, PX-A446, PX-A24590, PX-A25548, PX-A25275, PX-A25758, PX-A26446, un inhibidor de indol AHR y un compuesto que contiene oxazol (OxC).
En algunas realizaciones, un modulador directo de AHR comprende:
(a) Fármacos: por ejemplo, omeprazol, Sulindac, leflunomida, Tranilast, laquinimod, flutamida, nimodipina, mexiletina, 4-hidroxi-tamoxifeno, vemurafenib, etc.
(b) Compuestos sintéticos: por ejemplo, 10-cloro-7H-benzimidazo[2,1-a]benz[de]isoquinolin-7-ona (10-C1-BBQ), hidrobromuro de pifitrina-a,
(c) Compuestos naturales: por ejemplo, quinurenina, ácido kinurénico, ácido cinabárico, ITE, FICZ, indoles, incluido indol-3-carbinol, indol-3-piruvato, indol-aldehído, metabolitos microbianos, componentes dietéticos, quercetina, resveratrol, curcurmina o
(d) Compuestos tóxicos: por ejemplo, TCDD, tabaquismo, 3-metilcolantreno, benzo(a)pireno, 2,3,7,8-tetraclorodibenzofurano, emisiones de combustible, hidrocarburo aromático halogenado y no halogenado, plaguicidas.
En algunas realizaciones, los moduladores indirectos del AHR afectan a la activación del AHR a través de la modulación de los niveles de agonistas o antagonistas del AHR.
En algunas realizaciones, la modulación de los niveles de agonistas o antagonistas del AHR está mediada por uno o más de los siguientes:
(a) regulación de las enzimas que modifican los ligandos de AHR, por ejemplo, las enzimas del citocromo p450, mediante, por ejemplo, inhibidores de la enzima del citocromo p450, incluida la 3'metoxi-4'nitroflavona (MNF), alfanaftoflavona (a-NF), fluoranteno (FL), fenantreno (Phe), pireno (PY) etc.
(b) regulación de enzimas productoras de ligandos de AHR, incluidos inhibidores/activadores/inductores directos e indirectos de enzimas que catabolizan el triptófano, por ejemplo, moduladores de la vía IDO1 (indoximod, NLG802), inhibidores de IDO1 (1-metil-L-triptófano, epacadostat, PX-D26116, navoximod, PF-06840003, NLG-919A, BMS-986205, INCB024360A, KHK2455, LY3381916, MK-7162, inhibidor de TD02 (680C91, LM10, 4-(4-fluoropirazol-1-il)-1,2-oxazol-5-amina, imidazo-indoles condensados, indazoles), inhibidores duales de IDO/TDO (HTI-1090/ SHR9146, DN1406131, RG70099, EPL-1410), inmunoterapia, incluida la inhibición de puntos de control inmunitarios, vacunación y terapias celulares, quimioterapia, inmunoestimulantes, radioterapia, exposición a la luz ultravioleta y terapias dirigidas como, por ejemplo, imatinib, etc.
En algunas realizaciones, los moduladores indirectos del AHR afectan a la activación del AHR a través de la modulación de la expresión del AHR, incluidos, por ejemplo, los inhibidores de la HSP 90 tal como 17-alilaminodemetoxi-geldanamicina (17-AAG), celastrol.
En algunas realizaciones, los moduladores indirectos del AHR afectan a la activación del AHR al afectar a los socios de unión/cofactores que modulan los efectos del AHR, incluido, por ejemplo, el receptor de estrógenos alfa (ESR1).
Ejemplos de moduladores de AHR se enumeran en los documentos US9175266, US2019/225683, WO2019101647A1, WO2019101642A1, WO2019101643A1, WO2019101641A1, WO2018146010A1, AU2019280023A1, WO2020039093A1, WO2020021024A1, WO2019206800A1, WO2019185870A1, WO2019115586A1, EP3535259A1, WO2020043880A1 y EP3464248A1, incorporadas al presente documento por referencia en su totalidad.
En algunas realizaciones, una cantidad eficaz de un modulador de la señalización de AHR es de aproximadamente 0,01 mg/kg a 100 mg/kg. En otras realizaciones, la cantidad eficaz de un modulador de la señalización de AHR es de aproximadamente 0,01 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 5 mg/kg, 8 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 100 mg/kg, 150 mg/kg, 175 mg/kg o 200 mg/kg de modulador de la señalización de AHR.
Otro aspecto de la divulgación se refiere a un método de tratamiento y/o prevención de una enfermedad o afección relacionada con AHR en una célula de un paciente que necesita dicho tratamiento, que comprende realizar un método según la presente invención y proporcionar un tratamiento adecuado a dicho paciente, en donde dicho tratamiento se basa, al menos en parte, en los resultados del método según la presente invención, tal como proporcionar un compuesto como el identificado o supervisar un tratamiento que comprende el método o métodos descritos en el presente documento.
Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un kit de diagnóstico que comprende materiales para llevar a cabo un método según la presente invención en uno o varios recipientes separados, opcionalmente junto con agentes auxiliares y/o instrucciones para llevar a cabo dicho método.
Otro aspecto de la presente divulgación se dirige al cribado o identificación de compuestos que modulan la actividad de AHR. Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a métodos para determinar los efectos de un compuesto sobre el estado de activación de AHR de una célula.
En algunas realizaciones, una célula es tratada con un compuesto candidato y en la célula, se determina/mide un estado biológico de la IL4I1. En algunas realizaciones, el estado biológico de la IL4I1 en la muestra biológica se compara con el estado biológico de la IL4I1 en una muestra de control. En algunas realizaciones, el estado biológico es la expresión de ARN de IL4I1.
En algunas realizaciones, el compuesto candidato se clasifica como inhibidor de la señalización de AHR cuando el estado biológico de la IL4I1 de la muestra tratada con un compuesto candidato es menor que el estado biológico de la IL4I1 de una muestra de control y el compuesto candidato se clasifica como activador de la señalización de AHR cuando el estado biológico el estado biológico de la IL4I1 de la muestra tratada con un compuesto candidato es mayor que el estado biológico de la IL4I1 de una muestra de control.
En algunas realizaciones, un compuesto candidato se caracteriza como activador del AHR cuando produce una regulación por aumento de al menos 1,5 veces en valor absoluto en el estado biológico de la IL4I1. En algunas realizaciones, un compuesto candidato se caracteriza como activador de AHR cuando produce una regulación por aumento de al menos 2 veces en valor absoluto, al menos 2,5 veces en valor absoluto, al menos 3 veces en valor absoluto, al menos 3,5 veces en valor absoluto, al menos 4 veces en valor absoluto, al menos 4,5 veces en valor absoluto o al menos 5 veces en valor absoluto en el estado biológico de la IL4I1.
En algunas realizaciones, un compuesto candidato se caracteriza como inhibidor del AHR cuando produce una regulación por disminución de al menos 0,67 veces en valor absoluto en el estado biológico. En algunas realizaciones, un compuesto candidato se caracteriza como inhibidor de AHR cuando produce una regulación por disminución de al menos 1 vez en valor absoluto, 2 veces en valor absoluto, al menos 2,5 veces en valor absoluto, al menos 3 veces en valor absoluto, al menos 3,5 veces en valor absoluto, al menos 4 veces en valor absoluto, al menos 4,5 veces en valor absoluto o al menos 5 veces en valor absoluto en el estado biológico.
La expresión "factor de cambio" se refiere a la relación entre el valor de un biomarcador específico en dos condiciones diferentes. En algunas realizaciones, una de las dos condiciones podría ser un control. La expresión "factor de cambio absoluto" (que incluye "factor de cambio de la regulación por aumento absoluto" y "factor de cambio de la regulación por disminución absoluto") se utiliza en el presente documento en el caso de comparar el valor transformado logarítmicamente de un biomarcador específico entre dos condiciones. El factor de cambio absoluto se calcula elevando el exponente del logaritmo al valor del factor de cambio e informando a continuación del módulo del número.
Diversos aspectos de la presente divulgación pueden plasmarse en forma de programa, software o instrucciones de ordenador incorporadas o almacenadas en un medio utilizable o legible por ordenador o máquina, o un grupo de medios que hacen que el ordenador o la máquina realicen los pasos del método cuando se ejecutan en el ordenador, procesador y/o máquina. También se proporciona un dispositivo de almacenamiento de programas legible por una máquina, por ejemplo, un medio legible por ordenador, un programa de instrucciones tangible ejecutable por la máquina para llevar a cabo diversas funcionalidades y métodos descritos en la presente divulgación.
En algunas realizaciones, la presente divulgación incluye un sistema que comprende una CPU, una pantalla, una interfaz de red, una interfaz de usuario, una memoria, una memoria de programa y una memoria de trabajo (Figura 6), donde el sistema está programado para ejecutar un programa, software, o instrucciones de ordenador dirigidas a métodos o procesos de la presente divulgación. En la Figura 7 se muestra una realización ilustrativa.
El término "procesador" puede incluir un procesador de un solo núcleo, un procesador multinúcleo, múltiples procesadores ubicados en un único dispositivo, o múltiples procesadores en comunicación por cable o inalámbrica entre sí y distribuidos en una red de dispositivos, Internet o la nube. En consecuencia, como se utiliza en el presente documento, funciones, características o instrucciones ejecutadas o configuradas para ser ejecutadas por un "procesador", pueden incluir el desempeño de las funciones, características o instrucciones mediante un procesador de un solo núcleo, pueden incluir el desempeño de las funciones, características o instrucciones de forma colectiva o colaborativa por varios núcleos de un procesador multinúcleo, o puede incluir la ejecución de las funciones, características o instrucciones de forma colectiva o colaborativa por parte de varios procesadores, donde no se requiere que cada procesador o núcleo realice todas las funciones, característica o instrucción individualmente. El procesador puede ser una CPU (unidad central de procesamiento). El procesador puede incluir otros tipos de procesadores, como una GPU (unidad de procesamiento gráfico). En otros aspectos de la divulgación, en lugar de o además de una CPU que ejecuta instrucciones programadas en la memoria de programa, el procesador puede ser un ASIC (circuito integrado de aplicación específica), circuito analógico u otra lógica funcional, tal como un FPGA (matriz de puertas lógicas programable en campo), PAL (línea de fase alterna) o PLA (matriz lógica programare).
La CPU está configurada para ejecutar programas (también descritos aquí como módulos o instrucciones) almacenados en una memoria de programa para realizar la funcionalidad descrita en el presente documento. La memoria puede ser, pero sin limitación, RAM (memoria de acceso aleatorio), ROM (memoria de sólo lectura) y almacenamiento persistente. La memoria es cualquier pieza de hardware capaz de almacenar información, tales como, por ejemplo, sin limitación, datos, programas, instrucciones, código de programa y/u otra información adecuada, con carácter temporal y/o permanente.
En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a un procesador que está programado para realizar:
(a) comparar un estado biológico del gen 1 inducido por la interleucina 4 (IL4I1) de una muestra con el estado biológico de la IL4I1 de una muestra de control; y
(e) determinar el estado de activación de AHR de la muestra biológica basándose en la comparación.
En algunas realizaciones, la divulgación se refiere a un dispositivo de almacenamiento legible por ordenador que comprende instrucciones para realizar::
(a) comparar un estado biológico del gen 1 inducido por la interleucina 4 (IL4I1) de una muestra con el estado biológico de la IL4I1 de una muestra de control; y
(e) determinar el estado de activación de AHR de la muestra biológica basándose en la comparación.
La presente invención se refiere así a los siguientes puntos.
Punto 1. Un método para detectar una modulación de AHR en una célula o sujeto, que comprende detectar un cambio del estado biológico de IL4I1 en una muestra biológica derivada de dicha célula o sujeto, en donde un cambio en dicho estado biológico de la IL4I1 en dicha muestra, en comparación con una muestra de control, indica una modulación de AHR relacionada con la IL4I1 en dicha célula o sujeto.
Punto 2. El método de acuerdo con el punto 1, en donde dicha modulación se selecciona entre una activación o represión de AHR.
Punto 3. El método de acuerdo con el elemento 1 o 2, en donde dicha modulación es indicativa de una afección fisiológica o patológica relacionada con el AHR en dicha célula o sujeto.
Punto 4. El método de acuerdo con el punto 3, en donde dicha afección fisiológica o patológica se selecciona entre intoxicación, cáncer, trastornos autoinmunitarios, degeneración, inflamación, infección, enfermedades y afecciones metabólicas, angiogénesis, metabolismo de fármacos, hematopoyesis, metabolismo lipídico, motilidad celular, inmunomoduladores, afecciones de estrés, por ejemplo, estrés biológico, mecánico y ambiental.
Punto 5. El método de acuerdo con uno cualquiera de los elementos 1 a 4, en donde dicho estado biológico detectado se selecciona entre mutaciones, metilación de ácidos nucleicos, número de copias, expresión, cantidad de proteínas, modificaciones proteínicas, localización celular, metabolitos, en particular metabolitos producidos por IL4I1, tales como, por ejemplo, productos de degradación del triptófano y una actividad biológica de la IL4I1.
Punto 6. El método de acuerdo con uno cualquiera de los elementos 1 a 5, en donde dicha muestra biológica se selecciona entre una muestra adecuada que comprende fluidos biológicos, un mamífero, por ejemplo de un ser humano, células, tejidos, sangre entera, líneas celulares, sobrenadantes celulares, células primarias, IPSC, hibridomas, células recombinantes, células madre y células cancerosas, células óseas, células de cartílago, células nerviosas, células gliales, células epiteliales, células de la piel, células del cuero cabelludo, células pulmonares, células de la mucosa, miocitos, células musculoesqueléticas, células de músculo estriado, células de músculo liso, células cardíacas, células secretoras, adipocitos, células sanguíneas, eritrocitos, basófilos, eosinófilos, monocitos, linfocitos, linfocitos T, linfocitos B, neutrófilos, células NK, linfocitos T reguladores, células dendríticas, linfocitos Th17, linfocitos Th1, linfocitos Th2, células mieloides, macrófagos, células estromales derivadas de monocitos, células de médula ósea, células del bazo, células del timo, células pancreáticas, ovocitos, esperma, células renales, fibroblastos, células intestinales, células del aparato reproductor femenino o masculino, células de próstata, células de vejiga, células oculares, células corneales, células retinianas, células sensoriales, queratinocitos, células hepáticas, células cerebrales, células de riñón y células de colon, y los homólogos transformados de dichas células o tejidos.
Punto 7. El método de acuerdo con uno cualquiera de los elementos 1 a 6, en donde dicho sujeto se selecciona entre un sujeto mamífero, por ejemplo, un sujeto humano, por ejemplo, un paciente humano que padezca una afección fisiológica o patológica relacionada con AHR.
Punto 8. El método de acuerdo con uno cualquiera de los elementos 1 a 7, en donde dicha muestra de control se selecciona, por ejemplo, entre una muestra de un sujeto o grupo de sujetos sanos.
Punto 9. Un método de cribado de al menos un modulador del estado biológico de la IL4I1, que comprende poner en contacto al menos un compuesto modulador candidato con una muestra biológica y detectar la modulación del estado biológico de IL4I1 o de un gen que codifica para IL4I1, en donde dicha modulación o actividad identifica un modulador de dicho estado biológico.
Punto 10. El método de acuerdo con el punto 9, en donde dicho método comprende además detectar un cambio de un estado biológico de IL4I1 en una muestra biológica, en donde un cambio en el estado biológico de dicha IL4I1 en presencia de dicho al menos un modulador comparado con la ausencia de dicho al menos un modulador identifica un modulador.
Punto 11. El método de acuerdo con el elemento 9 o 10, en donde dicho estado biológico detectado se selecciona entre mutaciones, metilación de ácidos nucleicos, número de copias, expresión, cantidad de proteínas, modificaciones proteínicas, localización celular, metabolitos, en particular metabolitos modulados por IL4I1, tales como, por ejemplo, productos de degradación del triptófano y la actividad biológica de la IL4I1.
Punto 12. El método de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 9 a 11, en donde dicho modulador se selecciona entre un inhibidor o un inductor de dicho estado biológico de IL4I1.
Punto 13. El método de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 9 a 12, en donde dicho método comprende además la detección de una modulación de AHR.
Punto 14. El método de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 9 a 13, en donde dicho compuesto se selecciona entre un dominio proteináceo, una molécula pequeña, un péptido, anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales que se unen a IL4I1, una sustancia medioambiental, probiótico, toxina, aerosol, medicina, nutriente, composición galénica, extracto de plantas, compuesto volátil, sustancia homeopática, incienso, fármaco, vacuna, un compuesto o mezcla de compuestos derivados de organismos, por ejemplo animales, plantas, hongos, bacterias, arqueas, un compuesto químico, un compuesto utilizado en la industria alimentaria o cosmética, y una biblioteca de dichos compuestos.
Punto 15. Un método para monitorizar la modulación del estado biológico de AHR en respuesta a al menos un compuesto, que comprende realizar un método según uno cualquiera de los puntos 1 a 8 en una muestra biológica que se puso en contacto con una cantidad de dicho al menos un compuesto y en donde dicha muestra biológica se compara con una muestra de control que no se puso en contacto con dicha cantidad de dicho compuesto.
Punto 16. El método de acuerdo con el punto 15, en donde dichas muestras biológicas se obtienen a lo largo del curso de un tratamiento y/o se comparan con una muestra de control adecuada o una muestra derivada de un grupo de sujetos o pacientes, como se describe en el presente documento.
Punto 17. El método de acuerdo con uno cualquiera de los elementos 1 a 16, en donde dicho método comprende además la etapa de utilizar dicha comparación para la agrupación no supervisada o la clasificación supervisada de dichas muestras en subgrupos de modulación de IL4I1 y opcionalmente para la agrupación no supervisada o la clasificación supervisada de dichas muestras en diferentes subgrupos de modulación de AHR.
Punto 18. El método de acuerdo con uno cualquiera de los elementos 1 a 16, comprendiendo además una estratificación de dicho sujeto en un grupo particular de sujetos o grupos de pacientes.
Punto 19. El método de acuerdo con uno cualquiera de los elementos 1 a 18, en donde dicho método comprende el uso de un método de alto rendimiento.
Punto 20. Un kit de diagnóstico que comprende materiales para llevar a cabo un método según uno cualquiera de los puntos 1 a 19 en uno o varios recipientes separados, opcionalmente junto con agentes auxiliares y/o instrucciones para llevar a cabo dicho método.
Punto 21. Uso de un kit de diagnóstico según el punto 20 para un método según uno cualquiera de los puntos 1 a 19.
Punto 22. Un método para tratar y/o prevenir una enfermedad o afección relacionada con el AHR en una célula, por ejemplo en un paciente que necesite dicho tratamiento, que comprende realizar un método según uno cualquiera de los puntos 1 a 19, y proporcionar un tratamiento adecuado a dicho paciente, en donde dicho tratamiento se basa, al menos en parte, sobre los resultados de dicho método.
Tabla 1 - Aminoá i m li m l r l IL4I1
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La invención se describirá ahora con más detalle en los siguientes ejemplos con referencia a las figuras adjuntas, no obstante, sin limitarse a los mismos. Para los fines de la presente invención, todas las referencias citadas en este documento se incorporan como referencia en su totalidad.
La figura 1 muestra que la IL4I1 se expresa en diversas entidades tumorales,a,representación de mapa de calor de la mediana log2 de transcrito por millón (log2 TPM) de la expresión de IDO1, IDO2, TD02 e IL4I1 en el conjunto de datos Genotipo-Expresión Tisular (GTEX) que comprende 30 tejidos no enfermos. Las celdas vacías indican que no se ha detectado expresión. El tamaño del punto y los colores del sombreado corresponden al nivel de expresión, el gris claro denota baja expresión y el gris oscuro denota altos niveles de expresión,b,representación de mapa de calor de la mediana log2 de transcrito por millón (log2 TPM) de IDO1, IDO2, Expresión de TDO2 e IL4I1 en 32 tumores TCGA.
La figura 2 muestra que la IL4I1 activa el AHR.a,expresión de ARNm de genes diana de AHR seleccionados en células U-87MG shCtrl y shAHR que expresan IL4I1, en relación con las células U-87MG shCtrl sin expresión de IL4I1 (línea discontinua), cultivadas durante 120 h(n= 3 paraEGR1, IL1B, MMP1; n= 4 para todos los demás genes),b,Inmunotransferencia (izquierda) y cuantificación (derecha) de la relación nuclear/citoplasmática de la expresión de la proteína AHR, en células LN-229 tras 4 horas de tratamiento con sobrenadantes de células Ctrl y células U-251MG que expresan IL4I1 cultivadas durante 120 h (n = 3).c,Expresión de ARNmdeTIPARPen células CAS-1 tratadas con ARNsi dirigido aIL4IPen relación con células tratadas con siCtrl, cultivadas durante 72 h (n = 4).d,Concentración de Phe, Tyr y Trp en sobrenadantes de células U-87MG que expresan Ctrl e IL4I1, cultivadas durante 120 h (n = 3).e,Actividad de IL4I1 en lisados de células U-87MG que expresan IL4I1 en presencia de Phe, Tyr o Trp (n = 3).f,Valores de Km de IL4I1 para Phe y Trp (n = 5).g,Gráficos de volcán que muestran la regulación diferencial de los genes diana AHR en los datos de micromatrices de células U-87MG expuestas a 40 pM de PP (izquierda), HPP (centro) o I3P (derecha) durante 24 h en comparación con el vehículo (n = 5). Los puntos de datos en gris oscuro representan genes diana de AHR regulados seleccionados. Los puntos de datos en gris claro representan todos los demás genes. Las líneas punteadas verticales denotan un log2FC de /- 0,58 y la línea punteada horizontal está en un corte de valor p de 0,01.h,Expresión de ARNm de TIPARPen U-87MG tratadas con PP, HPP, I3P o vehículo (línea discontinua) durante 24 h (n = 3).i,Imágenes representativas de células tao BpRc1c que expresan GFP-Ahr tratadas con 25 pM de PP, HPP, I3P o vehículo durante 4 h.nvalores representan experimentos independientes. Los datos se presentan como la media ± E.S.M. y se analizaron mediante la prueba de Student pareada de dos colas(c, d, e),prueba de Student no apareada de dos colas(f, h),ANOVA de una vía con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey(g)o ANOVA de medidas repetidas con la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett(j).*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001, ****P <0,0001. n.s., no significativo. * shCtrl en comparación con IL4Il-shCtrl; # IL4Il-shCtrl en comparación con IL4I1-shAHR.
La Figura 3 muestra que la IL4I1 degrada aminoácidos aromáticos y produce ligandos de AHR,a,Fenilpiruvato (PP), ácido fenilacético (PAA), hidroxifenilpiruvato (HPP), hidroxibenzaldehído (HBA) y ácido hidroxifenilacético (HPAA) en el sobrenadante de células U87-ctrl y U87-IL4I1 (120 h).b,HBA, HPAA, HPP, PAA y PP en el sobrenadante de las células U251-ctrl y U251-IL4I1 (120 h).c,kinurenina (Kyn), ácido kinurénico (KynA), indol-3-piruvato (I3P), ácido indolacético (IAA), indol-3-carboxaldehído (I3CA) y ácido indol-3-láctico (ILA) en el sobrenadante de células U87-ctrl y U87-IL4I1 (120 h).d,KynA, Kyn, I3P, AAI, I3CA e ILA en el sobrenadante de las células U251-ctrl y U251-IL4I1 (120 h).*P < 0,05, **p < 0,01, ***P < 0,001, ****P <0,0001. Prueba t de una muestra.
La figura 4 muestra los metabolitos de Trp derivados de IL4Il y su efecto sobre la actividad del AHR,a,Abundancia relativa de Kyn, KynA, IAA y 13CA en sobrenadantes de células U-87MG tratadas con I3P o vehículo durante 24 h(n= 4).b,Cromatograma representativo de KynA medido por HPLC con superposición de un estándar de KynA (negro, pico más alto, 20 pmol en columna). Negro, pico más bajo: 3,33 mg/ml de I3P en solución salina tamponada con fosfato (PBS) incubada durante 24 h. Pico gris: 3,33 mg/ml de I3P incubados en PBS en presencia de H2O2 1 mM durante 24 h (n=2).c-e, Expresión de ARNm deTIPARPen células U-87MG tratadas con IAA (c), ILA (d), GCA (e) o vehículo durante 24 h (n = 3).f,Expresión de ARNm deTIPARPen células U-87MG shCtrl y shAHR tratadas con 50 |jM de KynA o vehículo durante 24 h (n = 3).g,Imágenes representativas de células tao BpRc1c que expresan GFP-Ahr tratadas con vehículo o con 50<j>M de KynA durante 1 h.nvalores representan experimentos independientes. Los datos se presentan como la media ± S.E.M. y se analizaron mediante la prueba de Student pareada de dos colas(a,b, h) o ANOVA de medidas repetidas con la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett (c, e-g).*P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001, ****P <0,0001. n.s., no significativo.
La Figura 5 muestra que la expresión de IL4I1 está regulada por AHR
Expresión de ARNmdeIL4I1en células CAS-1 tratadas con ARNsi dirigido aAHR,en relación con las células tratadas con siCtrl.
La figura 6 muestra un diagrama de bloques del sistema de acuerdo con los aspectos de la divulgación. CPU: Unidad Central de Procesamiento ("procesador").
La figura 7 muestra el diagrama de flujo de una realización ilustrativa.
Las SEQ ID NO: 1 a 26 muestran secuencias de oligómeros tal como se utilizan en la presente invención.
Ejemplos
Material y métodos
Análisis de datos de micromatrices y RNA-seq
Conjuntos de datos de matrices - Los chips de micromatrices affymetrix "human gene 2.0 ST" se analizaron con el paquete oligo y se anotaron con NetAffx (14). Los archivos CEL sin procesar se normalizaron y resumieron mediante RMA. La expresión génica diferencial se realizó utilizando la metodologíalimmapara micromatrices (15).
Conjuntos de datos de ARN-seq - Los datos FPKM armonizados de los conjuntos de datos de tumores de The Cancer Genome Atlas (TCGA) se descargaron mediante TCGAbiolinks (16) desde GDC (https://gdc.cancer.gov), y solo se retuvieron los pacientes con el identificador "tumor sólido primario". Los valores FPKM se convirtieron en transcritos por millón (TPM) (17), los datos TPM de los tejidos normales se descargaron del conjunto de datos Genotipo-Expresión Tisular (GTEX - https://gtexportal.org/home/). Todos los valores de TPM se transformaron log2.
Cultivo celular
HEK293T, LN-229, Tao BpRc1 y U-87MG se obtuvieron de ATCC. CAS-1 y U-251MG procedían de ICLC y ECACC, respectivamente. CAS-1, HEK293T, LN-229, U-87MG y U-251MG se cultivaron en medio DMEM con alto contenido en glucosa y sin fenol (Gibco, 31053028) suplementado con un 10 % de FBS (Gibco, 10270106), L-glutamina 2 mM (Gibco 25030-024), piruvato sódico 1 mM (Gibco, 11360-039), 100 U/ml de penicilina y 100 jg/m l de estreptomicina (Gibco, 15140-122) (en adelante, DMEM completo). Las células Tao BpRcl se cultivaron como se ha indicado anteriormente, pero con DMEM completo sin rojo de fenol y 5 jg/m l de tetraciclina (Sigma-Aldrich, T3383). Para los ensayos de translocación se utilizó un medio con un 10 % de FBS aprobado por el sistema Tet (Clontech, 631107). Las células se incubaron a 37 °C y CO2 al 5 %.
Generación de líneas celulares transgénicas
El clon de ADNc de IL4I1 humano flanqueado por sitios de recombinación compatibles con Gateway se adquirió en MyBiosource (MBS1270935). El clon de ADNc se recombinó en el vector de expresión Gateway compatible con lentivirus pLX301 (regalo de D. Root, plásmido Addgene 25895)18 La producción de lentivirus se consiguió transfectando HEK293T con pMD2.G (regalo de D. Trono, plásmido Addgene 12259), psPAX2 (regalo de D. Trono, plásmido Addgene 12260) y plásmido lentiviral, utilizando FuGENE HD (Promega, E2311), según el protocolo del fabricante. Los sobrenadantes virales se recogieron a las 48 h y a las 72 h, se mezclaron y filtraron a través de un filtro de poro de 0,45 pm. Se generaron líneas celulares estables de sobreexpresión de IL4I1 (pLX301-IL4Il) y de control (pLX301) infectando células U-87MG y U-251MG durante 24 horas con los respectivos sobrenadantes virales en presencia de 8 pg/ml de polibreno (Merck Millipore, TR-1003-G), seguido de selección con medio que contenía 1 pg/ml de puromicina (AppliChem, A2856). La sobreexpresión estable de IL4I1 se confirmó mediante qRT-PCR,western bloty actividad enzimática de IL4I1.
El silenciamiento estable de AHR en células U-87MG se consiguió utilizando shERWOOD UltramiR Lentiviral shRNA dirigido a AHR (transOMIC Technologies, TLHSU1400-196-GVO-TRI). Las células de glioma se infectaron con sobrenadantes virales que contenían secuencias shAHR o shControl (shC) para generar líneas celulares estables. Las secuencias de ARNhc shERWOOD UltramiR son:
shAHR (ULTRA-3234821): 5'-TGCTGTTGACAGTGAGCGCAGGAAGAATTGTTT TAGGATATAGTGAAGCCACAGATGTATATCCTAAAACAATTCTTCCTTTGCC TACTGCCTCGGA-3' (SEQ ID NO: 1);
shC (ULTRA-NT#4): 5'-TGCTGTTGACAGTGA GCG AAGGCAGAAGTATGCAAAGCATTAGTGAAGCCACAGATGTAATGCTTTGCA TACTTCTGCCTGTGCCTACTGCCTCGG A-3 (SEQ ID NO: 2)'.
El silenciamiento génico mediado por ARNsi deIL4I1se llevó a cabo utilizando el reactivo ON-TARGETplus Human SMARTpool siRNA (Dharmacon, L-008109-00-0005). El silenciamiento génico mediado por ARNsi deAHRse llevó a cabo utilizando el reactivo ON-TARGETplus Human SMARTpool siRNA (Dharmacon, L-004990-00-0005). Las transfecciones de siRNA se realizaron con Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific, 13778100), siguiendo el protocolo del fabricante. Como control se utilizó ON-TARGETplus Non-targeting Pool siRNA (Dharmacon, D-001810-10-05).
Se usaron células tao BpRc1c transfectadas de forma estable, expresando unaAhrmarcada con GFP bajo control de tetraciclina, para visualizar la translocación nuclear de Ahr. ElAhrmurino se clonó en el vector pEGFP-C1 (CLONTECH, Palo Alto, CA) que incluye un sistema de expresión tet-off (pRevTRE, CLONTECH). La línea de empaquetado Phoenix se utilizó para la transfección retroviral en células de hepatoma murino tao BpRc1 deficientes en la expresión endógena de Ahr.
Condiciones de tratamiento de los cultivos celulares
Para el tratamiento de células adherentes con ligandos AHR establecidos e hipotéticos, se sembraron 4 x 105 células por pocillo en placas de seis pocillos y se incubaron durante 24 h antes del tratamiento. Las células no adherentes se sembraron en placas de 24 pocillos a 5 x 105 células en 1 ml y se trataron inmediatamente. Para verificar la firma de AHR generada, las células se trataron con el agonista de AHR establecido Kyn (50 pM, SigmaAldrich, K8625) durante 24 h. Para investigar el potencial de los metabolitos directos y descendentes de la IL4I1 para activar el AHR, las células se trataron con I3P (3,125 pM a 100 pM, Sigma-Aldrich, 17017), HPP (8 pM a 1000 pM, Sigma-Aldrich, 114286), PP (8 pM a 1000 pM, Alfa Aesar, L11934), ácido kinurénico (50 pM, Sigma-Aldrich, K3375), ácido indol-3-láctico (25 pM a 100 pM, Sigma-Aldrich, 15508), 3-indolacético (25 pM a 100 pM, Sigma-Aldrich, 12886), indol-3-carboxaldehído (6,25 pM a 100 pM, Sigma-Aldrich, 129445) y sobrenadantes de células U-87MG o U-251MG de control y de células que expresan IL4I1 durante 24 h. Cuando se utilizó el antagonista del AHR SR1 (1pM, Merck Millipore, 182706), las células se trataron durante 24 h solas o en combinación con ligandos de AHR. Se utilizó DMSO para disolver todos los compuestos de forma que su concentración final en el medio de cultivo no superara el 0,2 %.
Para experimentos de expresión de genes y proteínas con células U-87MG y U-251MG de control y que expresan IL4I1, se sembraron 4 x 105 células por pocillo en 2 ml en placas de seis pocillos, y se incubaron durante 72 o 120 h. Para los experimentos de metabolómica, las células se sembraron a una densidad de 4 x 105 células por pocillo en 2 ml de DMEM completo en placas de seis pocillos y se incubaron durante 24 h. En los casos en que se necesitaron más células y sobrenadante, se sembraron 2,6 x 106 células por pocillo en 13,3 ml de DMEM completo en placas de 10 cm y se incubaron durante 24 h. Tras 24 h, las células se lavaron una vez con PBS, se añadieron 2 o 13,3 ml de DMEM fresco sin FBS (dependiendo del tamaño del pocillo y de la densidad celular utilizada) y se incubaron las células durante 120 h. La preparación de las muestras se adaptó de estudios anteriores1920. En resumen, los sobrenadantes se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta la medición de los metabolitos. Las placas que contenían células se lavaron rápidamente una vez con agua de cultivo celular precalentada a 37 °C, se enfriaron con nitrógeno líquido y se almacenaron a - 80 °C hasta la medición de metabolitos.
Para experimentos en los que se eliminóIL4I1en células CAS-1, se sembraron 4 x 105 células por pocillo en placas de seis pocillos y se incubaron durante 24 h. Las células se transfectaron con el ARNsi de control o de diana respectivo. El DMEM completo se sustituyó por 1,5 ml de DMEM sin FBS 24 h después de la transfección y las células se incubaron durante 72 h.
Aislamiento de ARN y PCR en tiempo real
Se recogió el ARN total de las células cultivadas utilizando el RNeasy Mini Kit (Qiagen, 80204) seguido de la síntesis de ADNc utilizando el kit de transcriptasa inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems, 4368813). Se utilizó un sistema de PCR en tiempo real StepOne Plus (Applied Biosystems) para realizar la PCR en tiempo real de las muestras de ADNc utilizando la mezcla maestra SYBR Select (Thermo Scientific, 4309155). Los datos se procesaron y analizaron con el software StepOne v 2.3. La cuantificación relativa de los genes diana se realizó frente alARN18Scomo gen de referencia utilizando el método 2ññCt. Las secuencias de cebadores humanos se enumeran en la tabla 2 como sigue.
Tabla 2 Secuencias de cebadores humanos
Gen Cebador directo (5’->3’) Cebador inverso (5’->3’)
ABCG2TTCCACGATATGGATTTACGG (SEQ ID NO: 3) GTTTCCTGTTGCATTGAGTCC (SEQ ID NO:
4)
AHRRCCCTCCTCAGGTGGTGTTTG (SEQ ID NO: 5) CGACAAATGAAGCAGCGTGT (SEQ ID NO: 6)
CYP1B1GACGCCTTTATCCTCTCTGCG (SEQ ID NO: 7) ACGACCTGATCCAATTCTGCC (SEQ ID NO:
8)
EGR1CTGACCGCAGAGTCTTTTCCT (SEQ ID NO: 9) GAGTGGTTTGGCTGGGGTAA (SEQ ID NO:
10)
EREGCTGCCTGGGTTTCCATCTTCT (SEQ ID NO: 11) GCCATTCATGTCAGAGCTACACT (SEQ ID NO: 12)
IL1BCTCGCCAGTGAAATGATGGCT (SEQ ID NO: 13) GTCGGAGATTCGTAGCTGGAT (SEQ ID NO:
14)
IL4I1CGCCCGAAGACATCTACCAG (SEQ ID NO: 15) GATATTCCAAGAGCGTGTGCC (SEQ ID NO:
16)
MMP1GCTAACCTTTGATGCTATAACTACGA (SEQ ID TTTGTGCGCATGTAGAATCTG (SEQ ID NO:
NO: 17) 18)
NPTX1CATCAATGACAAGGTGGCCAAG (SEQ ID NO: 19) GGGCTTGATGGGGTGATAGG (SEQ ID NO:
20)
RNA18SGATGGGCGGCGGAAAATAG (SEQ ID NO: 21) GCGTGGATTCTGCATAATGGT (SEQ ID NO:
22)
SERPINB2ACCCCCATGACTCCAGAGAA (SEQ ID NO: 23) CTTGTG CCTGCAAAATCGCAT (SEQ ID NO:
24)
TIPARPCACCCTCTAGCAATGTCAACTC (SEQ ID NO: 25) CAGACTCGGGATACTCTCTCC (SEQ ID NO:
26)
Aislamiento de proteínas y Western Blot
Para ensayos de translocación de AHR, en las fracciones nuclear y citoplasmática de las células de glioma LN-229 mediante inmunotransferencia. Las células LN-229 se trataron con sobrenadantes de células U-251MG de control o que expresaban IL4I1 (120 h) durante 4 h. Los lisados se congelaron en nitrógeno líquido y se descongelaron tres veces tras 10 ciclos de ultrasonidos después de cada ciclo de congelación-descongelación. Para aislar las proteínas de las dos fracciones celulares diferentes se utilizaron los reactivos NE-PER™ Nuclear y Cytoplasmic Extraction Reagents (Thermo Fisher Scientific Inc.). La extracción se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante. La Lamina A específica nuclear sirvió como control para el fraccionamiento apropiado y se detectó utilizando anti-Lamina A policlonal de conejo (1:500, BioLegend), respectivamente. El AHR se detectó utilizando el anticuerpo primario monoclonal de ratón anti-AHR clon RPT1 (Abeam, Berlín, Alemania).
Ensayo de translocación nuclear de AHR
Para la inducción de la expresión de GFP-Ahr en las células tao BpRc1c transgénicas, se retiró la tetraciclina a las células 24 h antes de los ensayos de translocación. Los ensayos se realizaron en placas de 96 pocillos de fondo negro transparente (BD, #353219) con 7500 células/pocillo en 150 pl/pocillo. Los metabolitos se añadieron en 50 pl/pocillo de medio de inducción. Las células se expusieron durante 4 h a 25 pM de PP, HPP e I3P, respectivamente. Se desechó el medio y las células se fijaron con formaldehído al 3,7 % precalentado en PBS (10 minutos a temperatura ambiente). Tras la fijación, las células se lavaron con tampón detergente (DB, 0,01 % de Tween20 en<p>B<s>, Sigma Aldrich), seguido de permeabilización con Triton X-100 al 0,1 % en PBS (Sigma Aldrich) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron dos veces con DB y se incubaron con 0,4 ng/ml de Hoechst 33342 (Sigma Aldrich) durante 30 min a temperatura ambiente protegidas de la luz. Tras lavarlas con DB y PBS, las células se almacenaron en PBS a 4 °C hasta el análisis de translocación. La translocación por KynA se monitorizó mediante imágenes de células vivas tras 3 h de exposición incluyendo el control negativo apropiado del medio. La translocación de Ahr por los diferentes metabolitos se monitorizó en un BD Pathway Imager 855.
Análisis metabolómicos
El consumo de fenilalanina, tirosina y Trp por las células U-87MG y U-251MG que expresan y que no expresan IL4I1 se evaluó mediante la cuantificación de los aminoácidos en los sobrenadantes del cultivo celular tras 120 h de incubación. Para la detección de fenilalanina y tirosina, los aminoácidos se marcaron con el colorante fluorescente AccQ-Tag™ (Waters) según el protocolo del fabricante. El producto de derivatización se separó a 42 °C en una columna Acquity BEH C18 (Waters) utilizando un sistema UPLC Acquity clase H (Waters) acoplado a un detector de fluorescencia Acquity (FLR) (Waters). Las muestras se analizaron en el UPLC como han descrito anteriormente Yang et. al., 201521. Para los análisis del consumo de Trp, los sobrenadantes se mezclaron con un volumen igual de ácido perclórico al 12% y se incubaron en hielo durante 10 minutos. Antes del análisis, las muestras se centrifugaron durante 10 minutos a 4 °C y 16.400 g para precipitar las proteínas y eliminar los restos celulares restantes. A continuación, los metabolitos se separaron mediante cromatografía de fase inversa en una columna Acquity HSS T3 (100 mm x 2,1 mm, 1,7 |jm, Waters) conectada a un sistema Acquity H-class UPLC (Waters). La columna se calentó a 37 °C y se equilibró con 5 volúmenes de columna de disolvente A al 100 % (acetato sódico 20 mM, acetato de cinc 3 mM), pH 6) a un caudal de 0,55 ml/min. Se consiguió una separación clara del Trp aumentando la concentración del disolvente B (acetonitrilo) en el disolvente A de la siguiente manera: 4 min B al 0 %, 10 min B al 5 %, 13 min B al 15 %, 15 min B al 25 % y vuelta a B al 0 % en 3 min. El Trp se detectó por fluorescencia (detector Acquity FLR, Waters, excitación: 254 nm, emisión: 401 nm). Para la cuantificación se utilizaron patrones (Sigma). La adquisición y el procesamiento de los datos se realizaron con el paquete de software Empower3 (Waters). Se adoptó un enfoque metabolómico no dirigido para identificar los metabolitos que eran diferencialmente abundantes en los sobrenadantes de las células U-87MG y U-251MG que expresaban IL4I1 frente a las que no la expresaban, cultivadas durante 120 h. Para ello, se mezclaron 50 j l de sobrenadantes de cultivos celulares con 200 j l de acetonitrilo enfriado en hielo mediante agitación en vórtex, tras lo cual se incubaron a -20 °C durante 1 h. Las muestras se centrifugaron durante 15 min a 4 °C y se transfirieron a viales TruView UPLC-MS (Waters). Se preparó una muestra conjunta mezclando volúmenes iguales de todas las muestras. Las muestras se midieron utilizando un sistema UPLC de clase I acoplado a un Vion IMS QTof MS (Waters). Los metabolitos se separaron utilizando una columna Cogent Diamond Hydride 2.0 (150x2,1 mm, 2,2 jm ; MicroSolv USA) o una columna HSS T3 (100x2,1 mm, 1,8 jm ; Waters). Para el control del instrumento y la adquisición de datos de EM se utilizó UNIFI 1.8.2 (Waters). Los análisis de los datos de seguimiento se realizaron con Progenesis QI (Waters). Se detectó ILA a 204,0662 Da (modo neg; masa monoisotópica esperada: 205,0739 Da; desviación -2 ppm) e identificados por los iones fragmento esperados a 116,0495, 128,0495, 130,0652 y 204,0655 Da. Determinados metabolitos derivados de Trp, fenilalanina y tirosina abundantes de forma diferencial (IAA, 13CA, KynA, PP, HPP, HBA) y otros productos de transformación posteriores (Kyn, PAA, HPAA) se identificaron comparando sus patrones de fragmentación resultantes de mediciones LC-MS sospechosas utilizando un HPLC (Agilent 1290) acoplado a un MS triple quad (Agilent 6460) con patrones externos.
Para la cuantificación dirigida de los metabolitos, se utilizó el modo MRM. Para todos los compuestos de ensayo se prepararon soluciones madre de 10 mM añadiendo gravimétricamente la cantidad necesaria en tubos Eppendorf de cierre seguro de 1,5 ml y disolviendo el compuesto de ensayo en 1 ml de DMSO. Para cada compuesto, las soluciones madre cubrían una gama de concentraciones de 10 mM a 0,039 mM. Para la cuantificación de los metabolitos, se añadieron 300 j l de cada sobrenadante de bioensayo en tubos Eppendorf de cierre seguro. Las muestras de calibración asociadas se prepararon añadiendo 300 j l de medio de cultivo celular y 1 j l de solución madre del compuesto de ensayo en tubos Eppendorf de cierre seguro. Posteriormente, se añadieron 300 j l de acetonitrilo para provocar la precipitación de los componentes del medio. Todas las muestras se centrifugaron a 8000 rpm durante 4 minutos y 150 j l de los sobrenadantes se transfirieron a viales de vidrio de 1,5 ml equipados con insertos de vidrio de 200 j l para el análisis por HPLC. Se inyectaron 5 j l de la muestra para el análisis. Como eluyentes A y B se utilizaron agua y acetonitrilo con 0,1 % de ácido fórmico, respectivamente para la separación por HPLC durante 5 min con un caudal de 0,5 ml/min. La separación se realizó con una columna Poroshell 120 EC-C18 de 2,7 micrómetros (Agilent) y 50 mm de longitud. La fuente ESI Agilent Jetstream se ajustó a una temperatura de gas y vaina de gas de 300 °C, con un flujo de gas de 10 l/min y un flujo de gas de vaina de 11 l/min. La presión del nebulizador se fijó en 0,38 MPa (55 psi) y el voltaje capilar en 2000 V durante todo el recorrido. Para el control del instrumento y la adquisición de datos se utilizó el paquete de software MassHunter (Agilent).
Ensayo de actividad de IL4I1
Las células U-87MG y U-251MG que expresan IL4I1 de forma estable y las células transducidas de control se lisaron en Tritón X-100/PBS al 0,1 %. El tejido humano obtenido de la resección de un melanoma metastásico se lisó en Triton X-100/PBS al 1 % mediante agitación con perlas de acero inoxidable en un Mixer Mill MM 301 durante dos ciclos de 1 min a 40 Hz. La actividad de IL4I1 se determinó midiendo la producción de H2O2 mediante fluorescencia Amplex® Red (excitación a 530 nm y emisión a 590 nm) cada minuto durante 60 minutos en placas negras de 96 pocillos utilizando un lector de placas CLARIOstar® (BMG LABTECH). Las reacciones se prepararon en PBS y contenían 50 jM de Amplex® Red (Cayman Chemicals, #Cay 10010469), 0,1 U/ml HRP (Merck Millipore, #516531) y aminoácidos como sustratos de IL4I1 según se indica en las leyendas de las figuras. La producción de H2O2 independiente de IL4I1 se evaluó en ausencia de aminoácidos y se restó de la actividad obtenida en presencia de sustrato. La producción de H2O2 mediada por IL4I1 se calculó utilizando una curva de calibración de H2O2 (0-10 jM final) y se normalizó con el contenido proteico de la muestra cuantificado mediante el ensayo de Bradford.
Programas informáticos y estadísticas
Análisis gráfico y estadístico de los datos de expresión génica (PCR en tiempo real) y proteica, así como los datos de metabolitos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism versiones 6.0 y 8.0. Salvo que se indique lo contrario, los datos representan la media ± S.E.M. de al menos 3 experimentos independientes. En los casos en que los datos se expresaron como pliegues de cambio, estos valores se transformaron en Log 10 y los valores resultantes se utilizaron para el análisis estadístico. En función de los datos, se aplicaron los siguientes análisis estadísticos: prueba t de Student de dos colas (emparejada o no emparejada), ANOVA de una vía con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey o ANOVA de medidas repetidas con la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. Las diferencias significativas se indicaron como *p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001. n.s. indica que no hay diferencias significativas.
Al comparar los niveles de expresión de las enzimas degradadoras de Trp en tejido normal (GTEX) y tumoral, los inventores descubrieron que la expresión de IL4I1 aumentaba en los tejidos cancerosos en comparación con los tejidos normales, similar a IDO1 y TDO2, otras enzimas degradadoras de triptófano implicadas en la activación del AHR, (Figura 1a,b). Los inventores muestran que la qRT-PCR de los genes diana del AHR confirmó la activación del AHR mediada por la IL4I1 (Figura 2a). Confirmando aún más la activación AHR mediada por IL4I1, se detectó un aumento de la localización nuclear/citoplasmática del AHR en las células de glioblastoma tratadas con sobrenadantes de las células que expresaban IL4I1 (Figura 2b). Por el contrario, el silenciamiento de IL4I1 en células de glioblastoma, que expresan IL4I1 de forma constitutiva, disminuyó la expresión del TIPARP del gen diana de AHR (Figura 2c). En conjunto, los resultados de los inventores revelan que la IL4I1 efectivamente activa el AHR.
A continuación, los inventores se propusieron investigar cómo la IL4I1 activa el AHR. En consonancia con informes anteriores, la expresión de IL4I1 redujo los niveles de fenilalanina, tirosina y triptófano (Figura 2d), siendo la fenilalanina la más catabolizada (Figura 2e,f). La IL4I1 convierte la fenilalanina, tirosina y triptófano en ácido fenilpirúvico (PP), ácido hidroxifenilpirúvico (HPP) y ácido indol-3-pirúvico (I3P), respectivamente (1). Por ello, los inventores expusieron células de glioblastoma con expresión funcional de AHR a estos metabolitos para investigar si activan el AHR. Mientras que PP y HPP no provocaron una modulación relevante de los genes diana del AHR, los análisis de expresión génica revelaron una regulación significativa de los genes de la firma de activación AHR en respuesta al I3P (Figura 2g,h), que era dependiente de AHR. En consonancia, la translocación nuclear del AHR sólo se observó en respuesta al I3P (Figura 2i). En resumen, los resultados de los inventores indican que la IL4I1 activa el AHR principalmente a través de la generación de I3P, lo que concuerda con los descubrimientos sobre el I3P derivado de la microbiota y el I3P generado por la D-aminoácido oxidasa y la aspartato aminotransferasa (22-25).
Las células que expresaban IL4I1 mostraron niveles elevados de PP y HPP, así como de sus metabolitos derivados, el ácido fenilacético (PAA), 4-hidroxibenzaldehído (HBA) y ácido hidroxifenilacético (HPAA) (Figura 3a,b). Para sorpresa de los inventores, éstos fueron incapaces de detectar I3P (Figura 3c,d). Sin embargo, los inventores detectaron un aumento de los niveles de compuestos derivados del I3P, incluido el ácido indol acético (IAA), indol-3-carboxaldehído (I3CA) y ácido indol-3-láctico (ILA) (Figura 3c,d), lo que sugiere que el flujo metabólico a través del I3P es muy rápido. Es más, los niveles de ácido kinurénico eran elevados en los sobrenadantes de las células que expresaban IL4I1 (Figura 3c,d). El tratamiento de células de glioblastoma con concentraciones crecientes de I3P produjo un aumento dependiente de la dosis de IAA, I3CA y ácido kinurénico en los sobrenadantes celulares (Figura 4a). Una reacción a través de la cual la IL4I1 podría aumentar los niveles de ácido kinurénico es por transaminación de la cinurenina (producida por IDO1 y/o TDO2), ya que la cinurenina aminotransferasa puede utilizar I3P, PP o HPP como aceptores de grupos amino (26). Sin embargo, las concentraciones de kinurenina no se redujeron en las células que expresaban IL4I1, lo que hace poco probable esta hipótesis (Figura 3c,d). El ácido kinurénico se forma espontáneamente a partir de I3P, que aumentó en presencia de H2O2 (Figura 4b), lo que sugiere que el H2O2 producido por IL4I1 concomitantemente con I3P promueve su conversión a ácido kinurénico. De hecho, la generación de ácido kinurénico a partir del I3P producido por transaminación del triptófano en tejidos de rata se describió previamente (27). Mientras que los inventores no observaron una inducción relevante de TIPARP del gen diana de AHR en respuesta a IAA o I3L (Figura 4c, d), I3CA (Figura 4e) y ácido kinurénico (Figura 41) indujeron los transcritos de TIPARP. La activación del AHR mediada por ácido kinurénico fue confirmada por la translocación nuclear del AHR (Figura 4g). En resumen, los datos de los inventores sugieren que la IL4I1 activa el AHR a través de productos derivados del I3P, incluidos ácido kinurénico e I3CA, produciendo una mezcla de compuestos activadores del AHR.
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Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un método para detectar una modulación de AHR en una célula o un sujeto, que comprende detectar un cambio del estado biológico de IL4I1 en una muestra biológica derivada de dicha célula o dicho sujeto, en donde un cambio en dicho estado biológico de la IL4I1 en dicha muestra, en comparación con una muestra de control sana o un patrón interno, indica una modulación de AHR relacionada con la IL4I1 en dicha célula o dicho sujeto, en donde, preferentemente, dicha modulación se selecciona entre una activación o una represión de AHR.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha modulación es indicativa de una afección fisiológica o patológica relacionada con el AHR en dicha célula o dicho sujeto, preferentemente en donde dicha afección fisiológica o patológica se selecciona entre intoxicación, cáncer, trastornos autoinmunitarios, degeneración, inflamación, infección, enfermedades y afecciones metabólicas, angiogénesis, metabolismo de fármacos, hematopoyesis, metabolismo lipídico, motilidad celular, inmunomoduladores, afecciones de estrés, por ejemplo, estrés biológico, mecánico y ambiental.
3. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicho estado biológico detectado se selecciona entre mutaciones, metilación de ácidos nucleicos, número de copias, expresión, cantidad de proteínas, modificaciones proteínicas, localización celular, metabolitos, en particular metabolitos producidos por IL4I1, tales como, por ejemplo, productos de degradación del triptófano y una actividad biológica de la IL4I1.
4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha muestra biológica se selecciona entre una muestra adecuada que comprende fluidos biológicos, un mamífero, por ejemplo de un ser humano, células, tejidos, sangre entera, líneas celulares, sobrenadantes celulares, células primarias, IPSC, hibridomas, células recombinantes, células madre y células cancerosas, células óseas, células de cartílago, células nerviosas, células gliales, células epiteliales, células de la piel, células del cuero cabelludo, células pulmonares, células de la mucosa, miocitos, células musculoesqueléticas, células de músculo estriado, células de músculo liso, células cardíacas, células secretoras, adipocitos, células sanguíneas, eritrocitos, basófilos, eosinófilos, monocitos, linfocitos, linfocitos T, linfocitos B, neutrófilos, células NK, linfocitos T reguladores, células dendríticas, linfocitos Th17, linfocitos Th1, linfocitos Th2, células mieloides, macrófagos, células estromales derivadas de monocitos, células de médula ósea, células del bazo, células del timo, células pancreáticas, ovocitos, esperma, células renales, fibroblastos, células intestinales, células del aparato reproductor femenino o masculino, células de próstata, células de vejiga, células oculares, células corneales, células retinianas, células sensoriales, queratinocitos, células hepáticas, células cerebrales, células de riñón y células de colon, y los homólogos transformados de dichas células o tejidos.
5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho sujeto se selecciona entre un sujeto mamífero, por ejemplo, un sujeto humano, por ejemplo, un paciente humano que padezca una afección fisiológica o patológica relacionada con AHR.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho estado biológico de IL4I1 en dicha muestra se compara con dicha muestra de control sana, que se selecciona a partir de una muestra de un sujeto o grupo de sujetos sanos.
7. Un método de cribado de al menos un modulador del estado biológico de la IL4I1, que comprende poner en contacto al menos un compuesto modulador candidato con una muestra biológica y detectar la modulación del estado biológico de IL4I1 o de un gen que codifica para IL4I1, en donde dichas modulación o actividad identifican un modulador de dicho estado biológico, en donde dicho método preferentemente comprende además detectar un cambio de un estado biológico de IL4I1 en una muestra biológica, en donde un cambio en el estado biológico de dicha IL4I1 en presencia de dicho al menos un modulador comparado con la ausencia de dicho al menos un modulador identifica un modulador, y donde dicho método comprende además detectar una modulación de AHR.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho estado biológico detectado se selecciona entre mutaciones, metilación de ácidos nucleicos, número de copias, expresión, cantidad de proteínas, modificaciones proteínicas, localización celular, metabolitos, en particular metabolitos modulados por IL4I1, tales como, por ejemplo, productos de degradación del triptófano y la actividad biológica de la IL4I1.
9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, en donde dicho modulador se selecciona entre un inhibidor o un inductor de dicho estado biológico de IL4I1.
10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde dicho compuesto se selecciona entre un dominio proteináceo, una molécula pequeña, un péptido, anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales que se unen a IL4I1, una sustancia medioambiental, probiótico, toxina, aerosol, medicina, nutriente, composición galénica, extracto de plantas, compuesto volátil, sustancia homeopática, incienso, fármaco, vacuna, un compuesto o mezcla de compuestos derivados de organismos, por ejemplo animales, plantas, hongos, bacterias, arqueas, un compuesto químico, un compuesto utilizado en la industria alimentaria o cosmética, y una biblioteca de dichos compuestos.
11. Un método para monitorizar la modulación del estado biológico de AHR en respuesta a al menos un compuesto, que comprende realizar un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en una muestra biológica que se puso en contacto con una cantidad de dicho al menos un compuesto y en donde dicha muestra biológica se compara con una muestra de control que no se puso en contacto con dicha cantidad de dicho compuesto, en donde dichas muestras biológicas se obtienen, preferentemente, a lo largo del curso de un tratamiento y/o se comparan con una muestra de control adecuada o una muestra derivada de un grupo de sujetos o pacientes, como se describe en el presente documento.
12. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicho método comprende además la etapa de utilizar dicha comparación para la agrupación no supervisada o la clasificación supervisada de dichas muestras en subgrupos de modulación de IL4I1 y opcionalmente para una agrupación no supervisada o clasificación supervisada adicional de dichas muestras en diferentes subgrupos de modulación de AHR y opcionalmente comprende además una estratificación de dicho sujeto en un grupo particular de sujetos o grupos de pacientes.
13. Un kit de diagnóstico que comprende materiales para llevar a cabo un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en uno o varios recipientes separados, opcionalmente junto con agentes auxiliares y/o instrucciones para llevar a cabo dicho método.
14. Uso de un kit de diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 13 para un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
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