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ES3034413T3 - Method of producing an immunoligand/payload conjugate by means of a sequence-specific transpeptidase enzyme - Google Patents

Method of producing an immunoligand/payload conjugate by means of a sequence-specific transpeptidase enzyme

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Publication number
ES3034413T3
ES3034413T3 ES14710285T ES14710285T ES3034413T3 ES 3034413 T3 ES3034413 T3 ES 3034413T3 ES 14710285 T ES14710285 T ES 14710285T ES 14710285 T ES14710285 T ES 14710285T ES 3034413 T3 ES3034413 T3 ES 3034413T3
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ES
Spain
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antibody
immunoligand
sortase
payload
fragment
Prior art date
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Active
Application number
ES14710285T
Other languages
English (en)
Inventor
Ulf Grawunder
Roger Renzo Beerli
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NBE Therapeutics AG
Original Assignee
NBE Therapeutics AG
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Filing date
Publication date
Application filed by NBE Therapeutics AG filed Critical NBE Therapeutics AG
Application granted granted Critical
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Abstract

La presente invención se refiere a un método para producir un conjugado de inmunoligando/carga útil, método que comprende conjugar una carga útil a un inmunoligando por medio de una transpeptidasa específica de secuencia, o un dominio catalítico de la misma. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Método de producción de un conjugado de inmunoligando/carga útil mediante una enzima transpeptidasa específica de secuencia
La presente invención se refiere a un método para producir un conjugado de inmunoligando/carga útil, método que comprende conjugar al menos una carga útil a un inmunoligando por medio de una transpeptidasa específica de secuencia, o un dominio catalítico de la misma. La presente invención se refiere además a un conjugado de inmunoligando/carga útil que se puede obtener con dicho método. Además, la presente invención se refiere a un uso de un compuesto citotóxico de bajo peso molecular que no excede un peso molecular de 2 500 Daltons para su conjugación por medio de una enzima sortasa a un inmunoligando seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una proteína de unión basada en anticuerpos o un mimético de anticuerpo.
Introducción
Actualmente, los métodos predominantes para etiquetar y/o conjugar moléculas a proteínas, especialmente cuando se trata de cargas útiles o etiquetas de moléculas pequeñas, involucran la conjugación química con moléculas enlazadoras específicas que unen covalentemente la carga útil a los aminoácidos libres lisina y/o cisteína de las proteínas.
Sin embargo, muchas proteínas, como por ejemplo los anticuerpos que son de particular interés para las estrategias de inmunodireccionamiento, son proteínas bastante grandes, que pueden contener varios residuos de lisina y cisteína. Debido a que la conjugación química mediada por enlazadores es un proceso estocástico, la ligadura química de cargas útiles mediada por enlazadores conduce a mezclas heterogéneas de proteínas conjugadas que pueden diferir en su eficacia terapéutica y/o utilidad diagnóstica. Obviamente, las mezclas de conjugados de proteína-carga útil también representan un desafío significativo en el proceso de aprobación regulatoria para conjugados terapéuticos, ya que las variaciones de lote a lote y/o las variaciones en el ingrediente farmacéutico activo (API) son vistas negativamente por las autoridades regulatorias debido a posibles preocupaciones de seguridad
Además, si se desea una relación definida entre carga útil y proteína, a menudo es necesario purificar el conjugado con la estequiometría de conjugación deseada. Esto no sólo es tedioso, sino que puede incrementar significativamente el costo de los bienes en el proceso de fabricación, ya que a menudo sólo una fracción de la proteína conjugada mediada por el enlazador representa la proporción deseada de conjugación de carga útil. Esto es particularmente cierto para los conjugados anticuerpo/fármaco (ADC) terapéuticamente relevantes, donde, dependiendo de la toxina empleada, de 3 a 4 moléculas de toxina parecen ser ventajosas, pero se encuentran anticuerpos sin toxina acoplada a hasta 8 toxinas por anticuerpo acoplado en reacciones típicas de conjugación química mediada por enlazadores (Panowskiet al.,(2014)).
A pesar de las limitaciones descritas anteriormente, todos los conjugados anticuerpo/fármaco actualmente en ensayos clínicos, o aprobados por las autoridades sanitarias para la terapia de enfermedades, se han generado mediante conjugación química mediada por enlazadores de fármacos tóxicos de moléculas pequeñas con anticuerpos (Lambert (2012) o Mullard (2013)).
Es ampliamente reconocido en la industria y por expertos científicos en el campo que la conjugación estequiométrica y específica del sitio de cargas útiles moleculares, incluidas toxinas o moléculas de etiqueta con inmunoligandos, tendría ventajas significativas en comparación con la conjugación química mediada por enlazadores. Esto se evidencia en los intentos de dirigir la conjugación química a aminoácidos específicos en la estructura de la proteína (Panowskiet al.(2014)).
Por un lado, esto se intenta mutando ciertas posiciones en la estructura de la proteína para eliminar sitios de conjugación no deseados y/o proporcionar sitios de conjugación deseados (es decir, residuos de lisina y/o cisteína) a los que se puede dirigir la ligadura del enlazador (McDonaghet al.(2006) o Junutulaet al.(2008)).
Por otra parte, se intenta controlar la conjugación química de las proteínas mediante la incorporación de aminoácidos no naturales en ciertas posiciones, como la selenocisteína, la p-azidofenilalanina o la acetilfenilalanina (Hoferet al.(2009), Axupet al.(2012), o Lemke (2011)).
Sin embargo, todos estos enfoques cambian la secuencia primaria de aminoácidos de la proteína que se va a conjugar y pueden generar propiedades funcionales no deseadas. Además, la incorporación de aminoácidos no naturales, como se describió anteriormente, a menudo es poco eficiente y no permite una incorporación cuantitativa de sitios de etiquetado específicos a las proteínas.
Resumen de la invención
Por lo tanto, existe una necesidad urgente en la industria de superar los problemas conocidos de los métodos de conjugación estocástica, en particular para la generación de inmunoconjugados terapéuticamente relevantes, incluidos, entre otros, los ADC.
Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar un método eficiente para conjugar inmunoligandos y cargas útiles, por ejemplo, fármacos, toxinas, citocinas, etiquetadores o similares, preferiblemente anticuerpos monoclonales de longitud completa a toxinas de pequeño peso molecular, para la generación de conjugados de anticuerpo fármaco (ADC) conjugados específicamente en el sitio.
Otro objetivo de la presente invención es crear conjugados de inmunoligando/carga útil, que tengan mejor eficacia y/o puedan producirse con mayor reproducibilidad.
Otro objetivo de la presente invención es permitir la conjugación de cargas útiles a inmunoligandos de una manera específica del sitio y/o específica de la secuencia.
Otro objetivo de la presente invención es crear conjugados de inmunoligando/carga útil que preserven los rasgos característicos de sus componentes, por ejemplo, afinidad objetivo, especificidad objetivo, sensibilidad objetivo, solubilidad, función farmacológica y similares.
Estos objetivos se consiguen mediante el objeto de las reivindicaciones independientes, mientras que las reivindicaciones dependientes, así como la memoria descriptiva divulgan otras realizaciones preferidas.
La invención se define por las características de las reivindicaciones independientes.
Definiciones
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "inmunoligando" pretende definir una entidad, un agente o una molécula que tiene afinidad por un objetivo determinado, por ejemplo, un receptor, una proteína de la superficie celular, una citocina o similar. Dicho inmunoligando puede bloquear o amortiguar opcionalmente las respuestas mediadas por agonistas, o inhibir la interacción receptor-agonista. Pero lo más importante es que el inmunoligando puede servir como una lanzadera para entregar una carga útil a un sitio específico, que está definido por el objetivo reconocido por dicho inmunoligando. Así, un inmunoligando dirigido, por ejemplo, pero no limitado a, un receptor, entrega su carga útil a un sitio que se caracteriza por la abundancia de dicho receptor. Los inmunoligandos incluyen, entre otros, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, proteínas de unión basadas en anticuerpos, miméticos de anticuerpos, receptores, receptores señuelo solubles, proteínas de andamiaje con afinidad por un objetivo determinado y ligandos de receptores.
Los "anticuerpos", también llamados sinónimamente "inmunoglobulinas" (Ig), generalmente comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L), y por lo tanto son proteínas multiméricas, o un homólogo de Ig equivalente de las mismas (por ejemplo, un nanocuerpo de camélido, que comprende solo una cadena pesada, anticuerpos de dominio único (dAb) que pueden derivarse de una cadena pesada o ligera); incluyendo mutantes funcionales de longitud completa, variantes o derivados de los mismos (incluidos, entre otros, anticuerpos murinos, quiméricos, humanizados y completamente humanos, que conservan las características esenciales de unión al epítopo de una molécula de Ig, e incluyendo inmunoglobulinas de dominio variable dual, biespecíficas, multiespecíficas y de dominio variable dual; las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier clase (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY) o subclase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) y alotipo.
Una "proteína de unión basada en anticuerpos", como se usa en el presente documento, puede representar cualquier proteína que contenga al menos un dominio de inmunoglobulina V<h>, V<l>, o C<h>derivado de anticuerpo en el contexto de otros componentes no derivados de inmunoglobulinas o anticuerpos. Dichas proteínas basadas en anticuerpos incluyen, entre otras, (i) proteínas de fusión de Fc de unión a proteínas, incluidos receptores o componentes de receptores con toda o partes de los dominios C<h>de inmunoglobulina, (ii) proteínas de unión, en las que los dominios V<h>y o V<l>están acoplados a estructuras moleculares alternativas, o (iii) moléculas, en las que los dominios V<h>, y/o V<l>, y/o C<h>de inmunoglobulina se combinan y/o ensamblan de una manera que normalmente no se encuentra en los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos naturales.
Un "conjugado anticuerpo fármaco" (ADC), como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo, o una proteína de unión basada en anticuerpos, acoplado a un ingrediente farmacéutico activo (API) de pequeño peso molecular, que incluye, pero no se limita a, una toxina (incluidos, por ejemplo, pero no se limitan a, inhibidores de tubulina, aglutinantes de actina, inhibidores de la ARN polimerasa, fármacos intercalantes y modificadores/dañinos del ADN), un inhibidor de la quinasa o cualquier API que interfiera con una vía celular particular que sea esencial para la supervivencia de una célula y/o esencial para una vía celular fisiológica particular.
Un "derivado o fragmento de anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que comprende al menos una cadena polipeptídica derivada de un anticuerpo que no es de longitud completa, incluyendo, pero no limitado a (i) un fragmento Fab, que es un fragmento monovalente que consiste en los dominios ligero variable (V<i>), pesado variable (V<h>), ligero constante (C<l>) y pesado constante 1 (C<h>1); (ii) un fragmento F(ab')2, que es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (Ni) una porción de cadena pesada de un fragmento Fab (Fd), que consiste en los dominios V<h>y C<h>1; (iv) un fragmento variable (F<v>), fragmento que consiste en los dominios V<l>y V<h>de un solo brazo de un anticuerpo, (<v>) un fragmento de anticuerpo de dominio (dAb), que comprende un solo dominio variable; (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada; (vii) un fragmento F<v>de cadena única (<sc>F<v>); (viii) un diacuerpo, que es un anticuerpo bivalente, biespecífico en el que los dominios V<h>y V<l>se expresan en una sola cadena polipeptídica, pero utilizando un enlazador demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, lo que obliga a los dominios a emparejarse con los dominios de complementariedad de otra cadena y crea dos sitios de unión al antígeno; y (ix) un anticuerpo lineal, que comprende un par de segmentos de F<v>en tándem (V<h>-C<h>1-V<h>-C<h>1) que, junto con los polipéptidos de cadena ligera de complementariedad, forman un par de regiones de unión a antígeno.
El término "formato de anticuerpo modificado", como se utiliza en el presente documento, abarca conjugados anticuerpo-fármaco, scFv modificado con óxido de polialquileno, monocuerpos, diacuerpos, anticuerpos de camélidos, anticuerpos de dominio, anticuerpos bi o triespecíficos, IgA o dos estructuras de IgG unidas por una cadena J y un componente secretor, anticuerpos de tiburón, marco de primate del nuevo mundo CDR de primate no del nuevo mundo, anticuerpos IgG4 con región bisagra eliminada, IgG con dos sitios de unión adicionales diseñados en los dominios CH3, anticuerpos con región Fc alterada para mejorar la afinidad por los receptores Fc gamma, construcciones dimerizadas que comprenden CH3 VL VH y similares.
El término "mimético de anticuerpo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a proteínas que no pertenecen a la familia de las inmunoglobulinas, e incluso a proteínas no pertenecientes a la familia de las inmunoglobulinas, e incluso no proteínas tales como aptámeros o polímeros sintéticos. Algunos tipos tienen una estructura de lámina beta similar a la de los anticuerpos. Las ventajas potenciales de los "miméticos de anticuerpos" o "estructuras alternativas" sobre los anticuerpos tiene una mejor solubilidad, una mayor penetración en los tejidos, una mayor estabilidad frente al calor y las enzimas y unos costes de producción comparativamente bajos.
Algunos miméticos de anticuerpos pueden proporcionarse en grandes bibliotecas, que ofrecen candidatos de unión específicos contra cualquier objetivo imaginable. Al igual que con los anticuerpos, los miméticos de anticuerpos específicos del objetivo se pueden desarrollar mediante el uso de tecnologías de detección de alto rendimiento (HTS), así como con tecnologías de presentación establecidas, como la presentación de fagos, la presentación en bacterias, presentación en levaduras o mamíferos. Los miméticos de anticuerpos desarrollados actualmente abarcan, por ejemplo, proteínas de repetición de anquirina (llamadas DARPins), lectinas de tipo C, proteínas de dominio A de S.aureus,transferrinas, lipocalinas, dominios tipo III del décimo tipo de fibronectina, inhibidores de la proteasa del dominio Kunitz, aglutinantes derivados de ubiquitina (llamados afilinas), aglutinantes derivados de gamma cristalina, nudos de cisteína o knottinas, aglutinantes basados en estructuras de tiorredoxina A, aptámeros de ácidos nucleicos, anticuerpos artificiales producidos por impronta molecular de polímeros, bibliotecas de péptidos de genomas bacterianos, dominios SH-3, estradocuerpos, "dominios A" de receptores de membrana estabilizados por enlaces disulfuro y Ca2+, compuestos basados en CTLA4, Fyn SH3 y aptámeros (moléculas de ácido oligonucleico o péptido que se unen a moléculas objetivo específicas).
En caso de que el inmunoligando no sea una proteína o un péptido,por ejemplo,si es un aptámero, preferiblemente debe estar provisto de una etiqueta peptídica para proporcionar un sustrato adecuado para la conjugación enzimática divulgada más adelante en el presente documento.
"Conjugación", como se utiliza en el presente documento, se relaciona con la asociación covalente de una molécula con otra molécula mediante la formación de un enlace covalente.
Una "inmunotoxina", como se usa en el presente documento, se refiere a un inmunoligando conjugado con una proteína o polipéptido que representa una toxina, incluyendo, pero no limitado a toxinas bacterianas, por ejemplo, toxina diftérica A, exotoxina de Pseudomonas, toxina botulínica o, por ejemplo, venenos proteínicos de invertebrados (por ejemplo, pero no limitados a arañas, escorpiones, moluscos, medusas) o vertebrados (por ejemplo, pero no limitados a serpientes), o fragmentos funcionales de los mismos.
El término "carga útil de bajo peso molecular", tal como se utiliza en el presente documento, representa una carga útil con un peso molecular que no excede los 2500 Dalton.
El término "carga útil", como se utiliza en el presente documento, representa cualquier molécula de origen natural o generada sintéticamente, incluidas moléculas de peso molecular pequeño o entidades químicas que pueden sintetizarse químicamente, y moléculas o entidades biológicas más grandes que deben producirse por fermentación de células huésped y que confieren una nueva funcionalidad a un inmunoligando específico para unirse a objetivos o antígenos.
El término "toxina de pequeño peso molecular", como se utiliza en el presente documento, significa un compuesto citotóxico de pequeño peso molecular que no excede un peso molecular de 2 500 Dalton que es citotóxico para las células de mamíferos.
Una "transpeptidasa", como se utiliza en el presente documento, es una enzima o un dominio catalítico de una enzima o una proteína que es capaz de catalizar la rotura de enlaces peptídicos y posteriormente, ya sea directamente o por medio de varios intermedios de reacción, la formación de nuevos enlaces peptídicos, de modo que la energía del primer enlace peptídico se conserva durante la reacción y se transfiere a un nuevo enlace peptídico. Preferiblemente, dichas transpeptidasas conectan preferiblemente el terminal C de un péptido o proteína con el terminal N de otro péptido o proteína. Debido a la formación de un nuevo enlace peptídico, estas enzimas o dominios funcionales también se denominan "ligasas de proteínas", "ligasas de péptidos" o se las apoda "grapadoras de proteínas o péptidos". Estas ligasas de proteínas incluyen, entre otras, las enzimas sortasas.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "transpeptidasa específica de secuencia" pretende definir una transpeptidasa que necesita al menos un péptido o proteína sustrato con una secuencia peptídica dada como secuencia de reconocimiento terminada en N y/o terminada en C) para conectar dicho péptido o proteína sustrato a otro péptido o proteína, o un compuesto de pequeño peso molecular que contenga un componente peptídico o proteico.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "transpeptidasa específica del sitio" pretende definir una transpeptidasa que tiene un sitio específico en al menos un péptido o proteína sustrato que utiliza para conjugarse con otro péptido o proteína, o un compuesto de pequeño peso molecular que contiene un componente peptídico o proteico.
Antecedentes y descripción general de la invención
La invención divulga métodos que utilizan transpeptidasas específicas del sitio, por ejemplo, enzimas sortasas, para conjugar de manera selectiva y específica del sitio cargas útiles, preferiblemente toxinas de pequeño peso molecular a inmunoligandos, preferiblemente anticuerpos, para la generación de cargas útiles de inmunoligandos, preferiblemente conjugados anticuerpo fármaco (ADC). Las cargas útiles preferidas son toxinas de pequeño peso molecular modificadas con una secuencia de aminoácidos sintética corta, preferiblemente de menos de 13 (trece) aminoácidos, lo que las convierte en sustratos para enzimas sortasas o en una conjugación covalente mediada por inteína dividida, ya sea en el terminal N o C de los inmunoligandos (Figuras 1 y 3). Esta conjugación se logra de manera específica del sitio y con una estequiometría definida, lo que es una característica distintiva de la conjugación química convencional de cargas útiles a inmunoligandos, donde la conjugación es un proceso estocástico, como se divulga más arriba.
La invención también divulga una transpeptidasa específica del sitio, por ejemplo, conjugación mediada por sortasa de inmunoligandos multiméricos, preferiblemente anticuerpos específicamente con dos moléculas de toxina diferentes u otras etiquetas que utilizan diferentes modificaciones de las subunidades de la proteína multimérica, por ejemplo, cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos, y diferentes cargas útiles modificadas con diferentes tramos cortos de aminoácidos específicos para diferentes transpeptidasas, con el fin de conjugar al menos dos cargas útiles funcionales diferentes con el inmunoligando multimérico (Fig. 6).
La invención también divulga métodos para agregar etiquetas de purificación y/o detección por afinidad a los terminales N o C de los inmunoligandos, que experimentan una transpeptidación mediada por enzimas, de modo que la eliminación de la etiqueta de purificación y/o detección por afinidad se puede utilizar para seleccionar inmunoligandos con conjugación completa (100%) de la carga útil a la proteína de unión modificada, por medio de resinas de afinidad que retienen inmunoligandos que no se han conjugado completamente y, por lo tanto, aún retienen la etiqueta de purificación y/o detección por afinidad adicional (Fig. 4).
La invención también divulga inmunoligandos en los que un dominio transpeptidasa catalítico se fusiona directamente al terminal N o C de la proteína que se va a conjugar, de modo que la actividad de transpeptidación es parte integral del inmunoligando que se va a conjugar y no es necesario proporcionar ninguna enzima sortasa soluble adicional en el curso de la reacción de conjugación mediada por transpeptidasa (Fig. 5).
Todas estas realizaciones mencionadas anteriormente permiten la conjugación controlada estequiométricamente y específica del sitio de cualquier carga útil, incluidas toxinas de moléculas pequeñas (entidades químicas), proteínas tóxicas o etiquetas fluorescentes, preferiblemente toxinas de peso molecular pequeño a inmunoligandos, incluidos preferiblemente anticuerpos, lo que es superior a la conjugación química estándar de cargas útiles a proteínas mediante métodos químicos de enlazador químico, que no se pueden controlar para la relación y el sitio de conjugación. Por lo tanto, para la generación de conjugados anticuerpo fármaco (ADC), la conjugación de cargas útiles tóxicas por transpeptidasas, preferiblemente enzimas sortasas, y las inteínas divididas en anticuerpos conducirán a productos más homogéneos con propiedades terapéuticas mejoradas esperadas para la terapia del cáncer (Fig. 12).
La conjugación enzimática de cargas útiles a inmunoligandos por enzimas sortasas permite una conjugación estequiométrica y específica del sitio de cargas útiles a proteínas e inmunoligandos, lo que reduce el coste de los productos y brinda conjugados de inmunoligando-carga útil homogéneos, especialmente porque la selectividad de las transpeptidasas permite la conjugación de cargas útiles a inmunoligandos en sobrenadante de cultivo celular crudo, y no requiere componentes purificados como en la conjugación química mediada por enlazadores tradicionales. Por lo tanto, el uso de transpeptidasas específicas de secuencia para la conjugación de cargas útiles a inmunoligandos podría reducir significativamente el coste de los productos en la fabricación de cargas útiles de inmunoligandos y, particularmente, de ADC.
El tipo de transpeptidasa divulgado en el presente documento, las enzimas sortasas, se ha identificado en una variedad de bacterias grampositivas, tales como las especiesStaphylococcus, StreptococcusyPneumococcusy catalizar el acoplamiento de factores de virulencia a los proteoglicanos de la pared celular, con el fin de cambiar la firma de la superficie de las bacterias para evadir una respuesta inmune eficiente por parte del huésped infectado (Mazmanian et al. (1999)). La enzima Sortasa A de la bacteria grampositivaStaphylococcus aureusse ha caracterizado por primera vez (Ton-That et al. (1999)) y posteriormente se ha caracterizado como una herramienta para muchas modificaciones de proteínas (Tsukiji (2009)). El atractivo de las enzimas sortasa es que las dos moléculas que se van a conjugar solo requieren ser modificadas o expresadas, por un lado, con una etiqueta peptídica corta de 5 aminoácidos (etiqueta de sortasa, LPXTG en el caso de Sortasa A deStaphylococcus aureus,siendo X cualquiera de los 20 aminoácidos presentes de forma natural) y un tramo de glicina corto, preferiblemente de 3 a 5 aminoácidos de longitud (Antos et al. (2009a)) (Fig. 1), que se puede agregar fácilmente a cada una de las moléculas para lograr la conjugación del terminal N o el terminal C de las proteínas. Esto permite utilizar el sistema por un lado para el acoplamiento o conjugación de dos proteínas, pero también para la conjugación de moléculas más pequeñas a proteínas.
Las enzimas sortasas se han descrito ampliamente en la técnica anterior para ligaduras proteína-proteína o proteína-péptido (Mao et al. (2004), Parthasarathy et al. (2007) o el documento WO2011/133704A2), incluyendo incluso la circularización de proteínas (Antos et al. (2009b)). Las aplicaciones de la ligadura de la proteína o péptido sortasa también incluyen la ligadura de proteínas o péptidos utilizando fragmentos de anticuerpos, como fragmentos Fab y scFv con etiquetas de proteínas o péptidos (Mohlmann et al. (2011), Madej et al. (2012), o los documentos US2010/0055761A1 y WO2012/142659A1). Incluso se han publicado dos documentos de la técnica anterior en los que se han ligado mediante sortasa anticuerpos de longitud completa a proteínas (Levary et al. (2011), por ejemplo, EGFP, albúmina, gelonina se conjugaron con la cadena ligera de un anticuerpo), o en los que los anticuerpos de longitud completa se ligaron mediante sortasa a péptidos cortos (Swee et al. (2013)). Sin embargo, no se pudo identificar ningún documento de la técnica anterior que demuestre la conjugación mediada por sortasa de toxinas de pequeño peso molecular, como por ejemplo auristatinas o maytansinas y similares, con anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos. En particular, no se pudo identificar ningún documento de la técnica anterior en el que se haya descrito la generación de ADC con toxinas de pequeño peso molecular que den como resultado ADC con toxinas de pequeño peso molecular conjugadas homogéneamente con cadenas de IgH o IgL (relación fármaco a anticuerpo 2), o con cadenas de IgH e IgL (relación fármaco a anticuerpo 4), como se divulga en el presente documento.
Si bien la técnica anterior también divulga la modificación de sustratos no proteicos con residuos de glicina de modo que podrían usarse para la modificación con sortasa de proteínas o péptidos simples de una sola subunidad (Tsukiji (2009), o el documento WO2007/108013A3, respectivamente), la conjugación homogénea más desafiante de sustratos no proteicos, preferiblemente toxinas de pequeño peso molecular, a proteínas multiméricas, preferiblemente anticuerpos, no se ha descrito antes, a pesar del hecho de que la ligadura de proteínas o péptidos mediada por enzimas sortasa ha estado en la técnica anterior durante muchos años.
Además, la conjugación de proteínas multiméricas, particularmente anticuerpos monoclonales de longitud completa con dos cargas útiles diferentes, preferiblemente dos toxinas de peso molecular pequeño diferentes como se divulga en el presente documento, no se ha descrito antes en el estado de la técnica, a pesar del hecho de que la ligadura de proteínas o péptidos mediada por enzima sortasa ha estado en la técnica anterior durante muchos años (Panowski et al. (2014)).
Se sabe por la técnica anterior que las enzimas sortasas pueden aceptar sustratos que contienen un mínimo de 3 aminoácidos de glicina (Parthasarathy et al. (2007), por lo tanto, la invención puede incluir cargas útiles que contengan al menos tres (3) residuos de aminoácidos de glicina agregados a la molécula de carga útil de interés, aunque incluso uno o dos residuos de glicina pueden ser suficientes y deben estar comprendidos por el método divulgado en el presente documento. En el caso de cargas útiles de pequeño peso molecular, la adición de unos pocos residuos de aminoácidos de glicina se puede lograr mediante la química de péptidos sintéticos convencional, como se describe en el presente documento. En el caso de las proteínas, se pueden agregar residuos de glicina agregando codones para una cantidad de residuos de glicina, preferiblemente al menos tres residuos de glicina, en marco al marco de lectura abierto de la proteína, o mediante química de péptidos sintéticos convencional de modo que la proteína recombinante contenga al menos tres residuos de aminoácidos de glicina en el terminal N.
Se sabe por la literatura que diferentes enzimas Sortasa, por ejemplo, la Sortasa B deStaphylococcus aureus,o las sortasas de otras bacterias grampositivas reconocen diferentes motivos pentapeptídicos, que difieren del motivo de reconocimiento de la Sortasa A LPXTG (X = cualquier aminoácido) deStaphylococcus aureus(Spirig et al. (2011)). Por lo tanto, la invención también incluirá el concepto de añadir otros motivos de reconocimiento de sortasa a proteínas e inmunoligandos, incluyendo preferiblemente anticuerpos, que difieran de la Sortasa A deStaphylococcus aureusLPXTG, con el fin de prepararlos para la conjugación de sortasa con diferentes enzimas sortasa afines de diferentes especies bacterianas grampositivas. Por lo tanto, las proteínas y los inmunoligandos, preferiblemente los anticuerpos, también se pueden expresar con un motivo de reconocimiento de sortasa diferente, por ejemplo, un motivo pentapeptídico NPQTN específico para la sortasa B deStaphylococcus aureusque luego pueden conjugarse con cargas útiles modificadas con glicina.
En otro aspecto de la invención, los inmunoligandos multiméricos, preferiblemente pero no limitados a anticuerpos, que están compuestos de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, permiten la utilización de dichas diferentes secuencias de reconocimiento de sortasa añadidas a los diferentes polipéptidos de dichas proteínas multiméricas (en el caso de anticuerpos que añaden diferentes secuencias de reconocimiento de sortasa a las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo), con el fin de permitir la conjugación de diferentes cargas útiles a dichos diferentes polipéptidos realizando conjugaciones secuenciales con cargas útiles etiquetadas con Glyn (n > 2) en presencia de la enzima sortasa respectiva (Fig. 6b). Para ello, es necesario expresar un anticuerpo con diferentes modificaciones del terminal C en cadenas pesadas y ligeras que comprendan diferentes motivos de reconocimiento de sortasa para diferentes enzimas sortasa. Luego, dicho anticuerpo se puede conjugar secuencialmente con dos cargas útiles diferentes que contienen una modificación de glicina como se describe más arriba.
Este formato puede tener la ventaja de que los ADC se cargan específicamente con dos toxinas diferentes, preferiblemente interfiriendo con una vía celular diferente, y serán más potentes en la eliminación de células cancerosas, porque es más difícil para una célula cancerosa objetivo evadir el ataque de dos toxinas comprendidas en los ADC.
Para una persona experta en la materia resulta evidente que un motivo de reconocimiento de pentapéptido sortasa, como el motivo LPXTG de Sortasa A deStaphylococcus aureuspuede agregarse selectivamente a polipéptidos individuales de inmunoligandos multiméricos, con el fin de proporcionar los sitios de conjugación deseados. Por ejemplo, en el caso de los anticuerpos, esto permite la generación de anticuerpos modificados, ya sea que solo contengan motivos de reconocimiento de sortasa agregados a las cadenas pesadas (lo que resulta en dos cargas útiles por conjugación de anticuerpos), o solo contengan motivos de reconocimiento de sortasa agregados a las cadenas ligeras (lo que resulta en dos cargas útiles por conjugación de anticuerpos), o que contengan motivos de reconocimiento de sortasa agregados a las cadenas pesadas y ligeras (lo que resulta en cuatro cargas útiles por conjugación de anticuerpos). Estas variaciones diseñadas permitirán la conjugación específica de cargas útiles a anticuerpos por enzimas sortasas ya sea solo a las cadenas pesadas (generando ADC con una relación fármaco a anticuerpo de 2,es decir,DAR2), o a las cadenas ligeras solas (generando ADC con una relación fármaco a anticuerpo de 2,es decir,DAR2), o simultáneamente a las cadenas pesadas y ligeras (generando ADC con una relación fármaco a anticuerpo de 4,es decir,DAR4). De esta manera, los sitios de conjugación y las estequiometrías de los anticuerpos se pueden variar de manera controlada, ya sea generando dos conjugaciones de carga útil por cadena pesada o ligera de anticuerpo, o generando cuatro conjugaciones de carga útil por anticuerpo mediante la adición de la carga útil a las cadenas pesada y ligera.
De manera similar a las variaciones descritas anteriormente en los sitios de conjugación y estequiometrías que utilizan diferentes motivos de reconocimiento de sortasa y enzimas sortasa en proteínas multiméricas o inmunoligandos, un aspecto adicional de la invención es conjugar diferentes cargas útiles con diferentes cadenas polipeptídicas de proteínas multiméricas combinando la conjugación mediada por sortasa y mediada por inteína dividida. Este concepto permite la conjugación simultánea de diferentes cargas útiles a diferentes cadenas polipeptídicas de proteínas multiméricas e inmunoconjugados en un solo paso, porque se emplean diferentes transpeptidasas y sustratos (Fig. 6a).
Se debe entender que la conjugación mencionada anteriormente de dos cargas útiles diferentes a una proteína multimérica, preferiblemente un anticuerpo, que se compone de dos cadenas pesadas y ligeras unidas por disulfuro, se puede lograr mediante conjugación mediada por enzima sortasa, pero que también es posible conjugar dos cargas útiles diferentes a una proteína multimérica, preferiblemente un anticuerpo, utilizando dos enzimas sortasa diferentes, que reconocen diferentes motivos peptídicos de sortasa, por ejemplo, Sortasa A y sortasa B deStaphylococcus aureus,como se mencionó más arriba (Fig. 6b). Sin embargo, esto también puede incluir enzimas sortasas de otras clases de sortasas (por ejemplo, sortasas C, D, E, F) o enzimas sortasas de otras especies bacterianas, que difieren en su especificidad de motivo sortasa.
La conjugación mediada por sortasa de cargas útiles a proteínas e inmunoligandos se puede lograr proporcionando proteínas etiquetadas con motivos de reconocimiento de sortasa y al menos cargas útiles etiquetadas con triglicina y agregando la enzima sortasa enzimáticamente activa o un fragmento funcional de la misma como enzima soluble. En otro aspecto de la invención, el dominio enzimáticamente activo de la enzima sortasa también puede proporcionarse como un dominio fusionado al terminal N o C de la proteína. En esta variación, es ventajoso, pero no obligatorio, agregar el dominio enzimático sortasa ya sea en el terminal N a un motivo de reconocimiento de sortasa del terminal N, o del terminal C a un motivo de reconocimiento de sortasa del terminal C. Ambas posibilidades garantizan que después de la reacción con una carga útil etiquetada con glicina, el dominio sortasa enzimático se elimine de la proteína en el curso de la reacción (Fig. 5).
La conjugación de cargas útiles mediada por sortasa se puede realizar en los terminales N o C de las proteínas e inmunoligandos. Esto sólo depende de cómo se posicionan el motivo de sortasa/glicina en la proteína y la carga útil (Fig. 1).
En el caso de los anticuerpos, que son los inmunoligandos preferidos, se prefiere conjugar las cargas útiles a los terminales C de los anticuerpos, porque esto posiciona las cargas útiles más distalmente a los sitios de unión al antígeno del anticuerpo. Sin embargo, esta preferencia no debe interpretarse como una limitación, y puede ser ventajoso conjugar cargas útiles al terminal N de otras moléculas de inmunoligandos, como por ejemplo miméticos de anticuerpos, en los que los dominios de unión funcionales no están ubicados en el terminal N de la molécula.
Otro aspecto de la invención es mejorar la eficiencia de la conjugación de la sortasa de las cargas útiles a proteínas e inmunoligandos mediante la adición de etiquetas de purificación o detección por afinidad, como por ejemplo, pero sin limitarse a ellas, pequeñas etiquetas de péptidos (por ejemplo, etiquetas de histidina, etiqueta de estreptomicina, etiqueta de MYC o etiqueta de HA) o etiquetas de purificación por afinidad de proteínas más grandes (por ejemplo, etiqueta de proteína de unión a maltosa (MBP), etiqueta de glutatión-S-transferasa (GST) o etiqueta de unión a quitina) distales al motivo de reconocimiento de la sortasa.
Con este aspecto de la invención, la etiqueta de purificación por afinidad se eliminará del inmunoligando que se conjugará como parte de la reacción de transpeptidación. Esto se puede aprovechar para enriquecer inmunoligandos conjugados con carga útil completa, ya que las proteínas e inmunoligandos que no reaccionaron, que aún contienen la etiqueta de purificación por afinidad, se pueden eliminar mediante la unión a una resina por afinidad adecuada, mientras que las proteínas e inmunoligandos conjugados con carga útil completa ya no contendrán la etiqueta de purificación por afinidad y, por lo tanto, se pueden separar específicamente de los sustratos de inmunoligandos que no reaccionaron. Este aspecto de la invención es particularmente poderoso en el contexto de proteínas multiméricas e inmunoligandos, como los anticuerpos preferidos, en los que es necesario conjugar varias cargas útiles. El uso de etiquetas de purificación por afinidad ubicadas distalmente al sitio de conjugación de la transpeptidasa sortasa garantiza que se puedan eliminar proteínas e inmunoligandos en los que la etiqueta de purificación por afinidad aún está presente debido a una conjugación de carga útil incompleta (Fig. 5).
En comparación con la conjugación química, esto proporciona una ventaja significativa en el proceso para obtener conjugados inmunoligando/carga útil homogéneos y, preferiblemente, ADC en los que las toxinas de pequeño peso molecular se conjugan específicamente en el sitio con los terminales C de las cadenas pesadas y/o ligeras del anticuerpo.
En general, el método divulgado proporciona un método novedoso y eficiente para conjugar de manera estequiométrica y específica del sitio cargas útiles, preferiblemente toxinas de pequeño peso molecular a inmunoligandos, preferiblemente anticuerpos, mediante lo cual se generan conjugados de inmunoligando/carga útil definidos, preferiblemente ADC, que son útiles para la terapia de enfermedades, preferiblemente del cáncer. El método también puede utilizarse para la generación de conjugados de inmunoligando/carga útil útiles para el diagnóstico de enfermedades, preferentemente enfermedades oncológicas. El nuevo método permite la generación de conjugados covalentes de inmunoligando/carga útil mediante la utilización de enzimas formadoras y rompedoras de enlaces peptídicos (transpeptidasas), incluidas las enzimas sortasas o fragmentos catalíticamente activos de las mismas. Dichas enzimas pueden catalizar la conjugación covalente y específica del sitio de cargas útiles que contienen tramos cortos de aminoácidos (preferiblemente más cortos que 13 aminoácidos) ya sea a los terminales N o C de inmunoligandos que están modificados adecuadamente permitiendo que la sortasa se rompa y forme enlaces peptídicos en el curso de la reacción. Los inmunoligandos son preferiblemente anticuerpos, para la conjugación específica del sitio de toxinas de pequeño peso molecular, con el fin de generar conjugados de anticuerpo fármaco (ADC) con una carga útil de anticuerpos definida o proporciones de fármaco a anticuerpo.
Realizaciones de la invención
De acuerdo con la invención, se divulga un método para producir un conjugado de inmunoligando/carga útil, método que comprende conjugar al menos una carga útil con un inmunoligando por medio de una transpeptidasa específica de secuencia, o un dominio catalítico de la misma, en donde el inmunoligando comprendido en el conjugado de inmunoligando/carga útil es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una proteína de unión basada en anticuerpos o un mimético de anticuerpos, en donde
a) el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en (i) un fragmento Fab, (ii) un fragmento F(ab')2; (iii) una porción de cadena pesada de un fragmento Fab(Fd), que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento variable (Fv); (v) un fragmento de anticuerpo de dominio (dAb), que comprende un único dominio variable; (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada; (vii) un fragmento Fv de cadena única (scFv); (viii) un diacuerpo; y (ix) un anticuerpo lineal, que comprende un par de segmentos Fv en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto con polipéptidos de cadena ligera de complementariedad, forman un par de regiones de unión a antígeno;
b) la proteína de unión basada en anticuerpos es una proteína que contiene al menos un dominio de inmunoglobulina VH, VL o CH derivado de anticuerpos,
c) el mimético de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en proteínas de repetición de anquirina, lectinas de tipo C, transferrinas, lipocalinas, dominios de tipo III del décimo tipo de fibronectina, nudos de cisteína o knottinas, dominios SH-3 y Fyn SH3,
en donde la transpeptidasa específica de secuencia es una enzima sortasa que reconoce un motivo de reconocimiento de pentapéptido, añadido a un extremo terminal C del inmunoligando,
en donde la carga útil es un compuesto citotóxico que no excede un peso molecular de 2500 Daltons que es citotóxico para las células de mamíferos y daña y destruye las células cancerosas,
y en donde el inmunoligando comprende un motivo de reconocimiento de sortasa y el compuesto citotóxico está modificado con una modificación de Glyn, donde n>1, y
donde el motivo de reconocimiento de la sortasa es un pentapéptido unido al terminal C del inmunoligando.
En el presente documento, pero no como parte de la invención, se divulga que la carga útil y/o el inmunoligando
a) consiste, enteramente, en una proteína o péptido
b) comprende al menos un dominio proteico o peptídico, o
c) comprende al menos una cadena peptídica
y, además, la proteína o péptido o dominio comprende, preferiblemente, una secuencia de aminoácidos que puede ser detectada por la transpeptidasa específica de secuencia, o un dominio catalítico de la misma.
Esto significa, por ejemplo, que, en caso de que la carga útil y/o el inmunoligando sea una proteína, significa que dicha proteína comprende, en su terminal N o C, una secuencia de aminoácidos que puede ser detectada por la transpeptidasa específica de secuencia. Si dicha secuencia de aminoácidos falta en la proteína no modificada, se puede fusionar al terminal No C de dicha proteína mediante métodos recombinantes conocidos en la técnica.
En caso de que la carga útil y/o el inmunoligando no sea una proteína, dicha secuencia de aminoácidos que puede ser detectada por la transpeptidasa específica de secuencia, debe conjugarse con la anterior mediante métodos de entrecruzamiento químico convencionales conocidos en la técnica.
Se pueden incorporar funciones adicionales entre la secuencia de reconocimiento de una transpeptidasa específica y la carga útil. Esto se puede lograr mediante estructuras químicas que se clasifican según sean escindibles (por ejemplo, que contienen hidrazona, o química de disulfuro o secuencias de péptidos específicos para proteasas intracelulares) o no escindibles (por ejemplo, que contienen química de tioéter) después de la internalización en las células.
Las estructuras químicas que contienen la química de la hidrazona se pueden escindir selectivamente dentro del compartimento intracelular de los lisosomas (pH más bajo en comparación con la circulación sanguínea sistémica).
Los enlazadores peptídicos tienen el potencial de ser escindidos selectivamente por proteasas lisosomales (por ejemplo, catepsina B) y han demostrado una mayor estabilidad en suero y mejores efectos antitumorales en comparación con los enlazadores de hidrazona. Los pares valina-citrulina (Val-Cit) son los enlaces peptídicos más comúnmente utilizados y son ideales para trabajar con la familia de fármacos auristatina, como la monometil auristatina E (MMAE).
Los enlazadores no escindibles se han pasado por alto durante mucho tiempo porque los investigadores estaban convencidos de que la escisión del enlazador era la forma más razonable de liberar el fármaco. Sin embargo, los conjugados pueden, al unirse a un receptor de membrana, internalizarse rápidamente y una vez internalizado, el inmunoligando puede degradarse hasta el punto en que la carga útil, por ejemplo, el fármaco está expuesto. Como ejemplo destacado, los enlazadores tioéter utilizan el enlazador SMCC (N-succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-l-carboxilato) (véase la figura 14a, estructura 2).
Todos estos enfoques tienen en común que no existe una verdadera especificidad de sitio de la reacción de acoplamiento. Debido a que la conjugación química mediada por enlazadores es un proceso estocástico, la ligadura química de cargas útiles mediada por enlazadores conduce a mezclas heterogéneas de proteínas conjugadas que pueden diferir en su eficacia terapéutica y/o potencial diagnóstico. Obviamente, las mezclas de conjugados de proteína-carga útil también representan un desafío significativo en el proceso de aprobación regulatoria para conjugados terapéuticos, ya que las autoridades regulatorias ven negativamente la variación de lote a lote y/o las variaciones en el ingrediente farmacéutico activo (API) debido a posibles preocupaciones de seguridad.
Preferiblemente, en esta realización, una pequeña carga molecular se utiliza como sustrato para la transpeptidasa específica de secuencia mediante el acoplamiento de un péptido de menos de 13 aminoácidos a la pequeña carga molecular, de modo que pueda ser conjugada por una transpeptidasa a los terminales C de un anticuerpo monoclonal que contiene modificaciones del terminal C reconocidas por dichas transpeptidasas. Estas modificaciones del terminal C pueden estar contenidas en ambas cadenas pesadas, o en ambas cadenas ligeras, o en las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo de longitud completa, permitiendo así la generación de un ADC conjugado específicamente del sitio con una relación fármaco a anticuerpo de 2 o 4 (DAR2 o DAR4).
En el presente documento se divulga, pero no como parte de la invención, se proporciona que el inmunoligando se une al menos a una entidad seleccionada del grupo que consiste en
• un receptor
• un antígeno,
• un factor de crecimiento
• una citocina, y/o
• una hormona
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "receptor" significa una molécula de superficie celular, preferiblemente una molécula de superficie celular que (i) se une a moléculas de señalización específicas o grupos de moléculas específicas (es decir, un receptor, como, por ejemplo, el receptor VEGF), y/o (ii) no tiene ligando conocido (es decir, un receptor huérfano, como, por ejemplo, HER2/neu). Los receptores naturales se expresan en la superficie de una población de células, o simplemente representan el dominio extracelular de dicha molécula (ya sea que dicha forma exista naturalmente o no), o una molécula soluble que realiza una función de unión natural en el plasma, o dentro de una célula u órgano. Preferiblemente, dicho receptor es un miembro de una cascada de señalización que está involucrada en un proceso patogénico particular (por ejemplo, un receptor que pertenece a una cascada de señalización de un factor de crecimiento), o se expresa en la superficie de una célula o partícula que está involucrada en un proceso patológico, por ejemplo, una célula cancerosa.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "antígeno" significa una sustancia que tiene la capacidad de inducir una respuesta inmune específica y puede incluir proteínas de superficie o complejos de proteínas (por ejemplo, canales iónicos). A menudo, los antígenos se asocian a entidades patógenas, por ejemplo, una célula cancerosa.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "citocina" se refiere a pequeñas moléculas de proteína de señalización celular que son secretadas por numerosas células y son una categoría de moléculas de señalización ampliamente utilizadas en la comunicación intercelular. Las citocinas se pueden clasificar como proteínas, péptidos o glicoproteínas; el término "citocina" abarca una familia grande y diversa de reguladores producidos en todo el cuerpo por células de diverso origen embriológico.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "factor de crecimiento" se refiere a sustancias naturales capaces de estimular el crecimiento celular, la proliferación y la diferenciación celular. Generalmente, un factor de crecimiento es una proteína o una hormona esteroide. Los factores de crecimiento son importantes para regular una variedad de procesos celulares.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "hormona" se relaciona con una sustancia química liberada por una célula, una glándula o un órgano en una parte del cuerpo que envía mensajes que afectan a las células en otras partes del organismo. El término abarca hormonas peptídicas, hormonas derivadas de lípidos y fosfolípidos, incluidas las hormonas esteroides y las monoaminas.
En caso de que el inmunoligando se una a un receptor o un antígeno, el conjugado inmunoligando-carga útil puede, por ejemplo, dirigirse a un sitio específico,por ejemplo,a una entidad patógena, por ejemplo, una célula cancerosa, donde la carga útil,por ejemplo,se administra una toxina o un agente quimioterapéutico. De esta forma se reduce la toxicidad sistémica de la toxina o del agente quimioterapéutico, mientras que aumenta la concentración local de este último en el sitio de acción, proporcionando así una mejor eficacia a la vez que se reducen los efectos secundarios. Además, una cascada de señalización respectiva puede inhibirse mediante la unión del inmunoligando. En caso de que la carga útil sea un etiquetador, este puede utilizarse para marcar un sitio específico,por ejemplo,una célula cancerosa caracterizada por un antígeno de superficie determinado detectado por el inmunoligando, para el diagnóstico.
En caso de que el inmunoligando se una a un factor de crecimiento, una citocina y/o una hormona, el conjugado inmunoligando/carga útil puede dirigirse, por ejemplo, al sitio al que habitualmente se une la citocina o la hormona del factor de crecimiento, para entregar la carga útil de una manera específica del sitio. Además, una cascada de señalización respectiva puede inhibirse mediante la unión del inmunoligando.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "unir" significa la interacción bien comprendida u otra asociación no aleatoria entre inmunoligandos, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, y sus objetivos. Preferiblemente, dicha reacción de unión se caracteriza por una alta especificidad y/o sensibilidad al objetivo. Preferiblemente, la reacción de unión se caracteriza por una constante de disociación (Kd) < 10-3 M, preferiblemente < 10-4 M, < 10-5 M, < 10-6 M, < 10-7 M, < 10-8 M, < 10-9 M, y lo más preferido < 10-10
De acuerdo con una realización preferida de la invención, se prevé que al menos un dominio catalítico de la transpeptidasa específica de secuencia esté fusionado al terminal C del inmunoligando.
Esta fusión puede tener lugar mediante ingeniería recombinante o por acoplamiento químico. En esta realización, la actividad enzimática que conduce a la conjugación específica del sitio del inmunoligando a la carga útil no necesita agregarse a la reacción como una enzima recombinante separada, sino que es parte del sustrato proteico que se va a conjugar.
En este documento se divulga, pero no como parte de la invención, que cuando la transpeptidasa es una sortasa, la carga útil, por ejemplo, una toxina, se convierte preferiblemente en sustrato para la conjugación de la sortasa mediante la adición de una pequeña cantidad de residuos de aminoácidos de glicina, preferiblemente 3 o 5 residuos de glicina.
El uso de transpeptidasas, preferiblemente enzimas sortasas para la generación de conjugados de anticuerpo fármaco, en los que se conjugan toxinas de pequeño peso molecular con anticuerpos de longitud completa, aún no se ha descrito en la técnica anterior (Panowskiet al.(2014)).
Se han identificado enzimas sortasas en una variedad de bacterias grampositivas, como las especiesStaphylococcus, StreptococcusyPneumococcusy catalizan,in vivo,el acoplamiento de factores de virulencia a los proteoglicanos de la pared celular, con el fin de cambiar la firma de la superficie de las bacterias para evadir una respuesta inmune eficiente por parte del huésped infectado (Mazmanian et al. (1999)).
La enzima Sortasa A de la bacteria grampositivaStaphylococcus aureusse ha caracterizado primero (Ton-Thatet al.(1999)) y posteriormente se ha caracterizado como una herramienta para muchas modificaciones de proteínas (Tsukiji (2009)).
Una característica beneficiosa de las enzimas sortasa es que las dos moléculas que se van a conjugar solo requieren etiquetas peptídicas cortas ("etiquetas sortasa"), que en caso de Sortasa A deStaphylococcus aureuses, por ejemplo, LPXTG en el terminal C de una molécula (por ejemplo, la carga útil) y un tramo corto de glicina de 3 a 5 aminoácidos en el terminal N de la otra molécula (por ejemplo,el inmunoligando, ver Figura 1). Estas etiquetas peptídicas pueden fusionarse a las moléculas o conjugarse con ellas mediante química de entrecruzamiento convencional. Esto permite utilizar el sistema por un lado para la ligadura de dos proteínas, pero también para la conjugación de compuestos de pequeño peso molecular, preferiblemente toxinas de pequeño peso molecular a proteínas. En caso de sortasa B deStaphylococcus aureus,el motivo de sortasa respectivo es NPQTN.
En el caso de las enzimas sortasa, la adición de un tramo corto de glicina (> 2 residuos de glicina) a una molécula de elección es suficiente para permitir que la molécula se conjugue con inmunoligandos que contienen un motivo de reconocimiento de sortasa pentapeptídica, como por ejemplo LPXTG en el caso de la Sortasa A deS. aureus.
Aparte de la conjugación química, la conjugación mediada por transpeptidasa ocurre en condiciones de tampón acuoso fisiológico y temperaturas fisiológicas, lo que afecta mínimamente la integridad de la proteína o del anticuerpo en la reacción de conjugación. Esta característica garantiza una funcionalidad óptima del conjugado resultante
En este documento se divulga, pero no como parte de la invención, que la carga útil comprendida en el conjugado inmunoligando/carga útil es al menos una seleccionada del grupo que consiste en
• un etiquetador
• una etiqueta de procesamiento, y/o
• un fármaco.
El término "etiquetador" (también llamado "etiqueta de detección"), como se utiliza en el presente documento, puede referirse a cualquier molécula o fracción que comprende una o más sustancias químicas o enzimas apropiadas, que generan directa o indirectamente un compuesto o señal detectable en una reacción química, física o enzimática.
El término "etiqueta de procesamiento", tal como se utiliza en el presente documento, puede abarcar etiquetas de afinidad, etiquetas de solubilización, etiquetas de cromatografía y etiquetas de epítopos. Las etiquetas de afinidad (también utilizadas como etiquetas de purificación) se añaden a las proteínas para permitir la purificación de la molécula etiquetada de su fuente biológica cruda utilizando una técnica de afinidad. Estos incluyen la proteína de unión a quitina (CBP), la proteína de unión a maltosa (MBP) y la glutatión-S-transferasa (GST). La etiqueta poli(His), preferiblemente una etiqueta 6xHis, es una etiqueta de procesamiento ampliamente utilizada; se une a matrices metálicas. Las etiquetas de solubilización se utilizan, especialmente para proteínas recombinantes expresadas en especies deficientes en chaperonas comoE. coli,para ayudar en el plegamiento adecuado de las proteínas y evitar que precipiten. Estos incluyen tiorredoxina (TRX) y poli(NANP). Algunas etiquetas de afinidad tienen una doble función como agente de solubilización, como MBP y GST.
Las etiquetas cromatográficas se utilizan para alterar las propiedades cromatográficas de la proteína y proporcionar una resolución diferente en una técnica de separación particular. A menudo, estos consisten en aminoácidos polianiónicos, como la etiqueta FLAG.
Las etiquetas de epítopos son secuencias de péptidos cortas que se eligen porque se pueden producir de manera confiable anticuerpos de alta afinidad en muchas especies diferentes. Las etiquetas de epítopos generalmente se derivan de genes virales, lo que explica su alta inmunorreactividad. Las etiquetas de epítopos incluyen, por ejemplo, la etiqueta V5, la etiqueta MYC y la etiqueta HA. Estas etiquetas son particularmente útiles para experimentos de transferencia Western, inmunofluorescencia e inmunoprecipitación, aunque también se utilizan en la purificación de proteínas.
Las etiquetas de procesamiento encuentran muchos otros usos, como la modificación enzimática específica (como las etiquetas de ligasa de biotina) y la etiqueta de modificación química (FlAsH). A menudo, las etiquetas se combinan para producir modificaciones multifuncionales de la proteína.
En el presente documento, pero no como parte de la invención, se divulga que dicho etiquetador es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en
un radioetiquetador, preferiblemente un péptido o proteína etiquetado radiactivamente
una etiqueta fluorescente, preferiblemente un péptido o proteína fluorescente, y/o
una etiqueta enzimática, preferiblemente una peroxidasa.
Esta enumeración de posibles cargas útiles de etiquetadores no es en absoluto restrictiva. En el presente documento, pero no como parte de la invención, se divulga que dicho fármaco es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en
una citocina
un agente radiactivo
un fármaco antiinflamatorio
una toxina, y/o
un agente quimioterapéutico.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "citocina" se refiere a pequeñas moléculas de proteína de señalización celular que son secretadas por numerosas células y son una categoría de moléculas de señalización ampliamente utilizadas en la comunicación intercelular. Las citocinas se pueden clasificar como proteínas, péptidos o glicoproteínas; el término "citocina" abarca una familia grande y diversa de reguladores producidos en todo el cuerpo por células de diverso origen embriológico. En el presente contexto, las citocinas tienen por objeto, por ejemplo, dañar o incluso matar entidades patógenas, por ejemplo, una célula cancerosa.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "agente radiactivo" se refiere a una entidad que tiene al menos un átomo con un núcleo inestable y que, por lo tanto, es propenso a sufrir desintegración radiactiva, lo que resulta en la emisión de rayos gamma y/o partículas subatómicas, como partículas alfa o beta, que tienen un efecto destructor de células. En el presente contexto, los agentes radiactivos tienen como objetivo dañar o incluso matar una entidad patógena, por ejemplo, una célula cancerosa.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "fármaco antiinflamatorio" se refiere a compuestos que reducen la inflamación. Estos pueden ser, por ejemplo, esteroides, al igual que glucocorticoides específicos (a menudo llamados corticosteroides), que reducen la inflamación o la hinchazón al unirse a los receptores de glucocorticoides. El término también abarca los fármacos antiinflamatorios no esteroides (NSAlD), que contrarrestan la enzima ciclooxigenasa (COX). La enzima COX por sí sola sintetiza prostaglandinas, creando inflamación. En conjunto, los NSAID impiden que las prostaglandinas se sinteticen, reduciendo o eliminando el dolor. El término también abarca los derivados antiinflamatorios inmunoselectivos (ImSAID), que son una clase de péptidos que alteran la activación y migración de las células inflamatorias, que son células inmunes responsables de amplificar la respuesta inflamatoria.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "toxina" se refiere a una molécula que es tóxica para una célula u organismo vivo. Las toxinas pueden ser péptidos, proteínas o, preferiblemente, compuestos de pequeño peso molecular, cuyo objetivo es dañar o incluso matar una entidad patógena, por ejemplo, una célula cancerosa. Las toxinas, tal como se entienden en el presente documento, abarcan, en particular, las toxinas celulares. Preferiblemente, dicha toxina es una toxina de tamaño molecular pequeño, es decir, que tiene un peso molecular de < 2500 Da.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "agente quimioterapéutico" se refiere a moléculas que tienen la propiedad funcional de inhibir el desarrollo o progresión de una neoplasia, particularmente una lesión maligna (cancerosa), tal como un carcinoma, sarcoma, linfoma o leucemia. La inhibición de la metástasis o la angiogénesis es frecuentemente una propiedad de los agentes anticancerígenos o quimioterapéuticos. Un agente quimioterapéutico puede ser un agente citotóxico o quimioterapéutico. Preferiblemente, dicho agente quimioterapéutico es un agente citostático de pequeño peso molecular, que inhibe o suprime el crecimiento y/o multiplicación de células cancerosas.
La conjugación de citocinas, agentes radiactivos, toxinas o agentes quimioterapéuticos con un inmunoligando puede ayudar a reducir los efectos secundarios y los riesgos relacionados con su administración, porque
a) el inmunoligando dirige el conjugado a un sitio específico, por ejemplo, a una entidad patógena, por ejemplo, una célula cancerosa donde la carga útil efectúa su función tóxica. De esta manera se reduce la toxicidad sistémica de la carga útil, mientras que aumenta la concentración local de ésta en el sitio de acción, proporcionando así una mejor eficacia a la vez que se reducen los efectos secundarios,
b) se puede prever que el conjugado sea internalizado por la entidad patógena, de tal manera que después de la internalización, la carga útil se libere y sólo entonces desarrolle su función citotóxica deseada,es decir,sin afectar las células o tejidos circundantes.
La siguiente tabla es una lista no restrictiva de posibles objetivos/antígenos (primera columna) y ejemplos de inmunoligandos existentes dirigidos al primero (segunda columna). La tercera columna muestra una lista no restrictiva de posibles toxinas, citocinas o agentes quimioterapéuticos. Téngase en cuenta que los ejemplos de la primera y tercera columnas se pueden combinar entre sí a voluntad, mientras tanto, existen cientos de otros objetivos y cargas útiles. Las combinaciones de objetivo/carga útil respectivas no mencionadas explícitamente en la tabla quedan comprendidas dentro del alcance de la presente invención.
De acuerdo con una realización preferida de la invención, se proporciona que dicho inmunoligando comprenda al menos dos subunidades cada una de las cuales está conjugada con un compuesto citotóxico que no excede un peso molecular de 2 500 Daltons que es citotóxico para las células de mamíferos y daña y destruye las células cancerosas.
Preferiblemente, se pueden conjugar al menos dos cargas útiles diferentes a las al menos dos subunidades. Esta opción proporciona una caja de herramientas versátil con la que se pueden crear una gran variedad de diferentes construcciones de carga útil de inmunoligando. Por ejemplo, un inmunoligando de dominio dual biespecífico se puede conjugar con dos cargas útiles diferentes, por ejemplo, un etiquetador y una toxina.
Preferiblemente, las al menos dos cargas útiles diferentes son cargas útiles tóxicas que interfieren con una o más vías celulares.
Tal realización puede lograrse, por ejemplo, conjugando las dos cargas útiles diferentes con cada una de las 2 cadenas ligeras de un anticuerpo de longitud completa y con las 2 cadenas pesadas de un anticuerpo de longitud completa, respectivamente, utilizando dos enzimas sortasa diferentes, que reconocen diferentes motivos de reconocimiento de sortasa, más un anticuerpo que contiene diferentes modificaciones del terminal C en las cadenas pesadas y ligeras que comprenden los respectivos motivos de reconocimiento para dichas enzimas sortasa diferentes.
De esta manera, se puede crear un conjugado de anticuerpo fármaco que está compuesto por dos cadenas ligeras de Ig de longitud completa y dos cadenas pesadas de Ig, que contienen diferentes cargas útiles unidas covalentemente a dichas cadenas pesadas y ligeras.
Tal realización da como resultado, preferiblemente, la conjugación sincrónica de las al menos dos subunidades para la generación de cargas útiles de inmunoligando con igual conjugación de carga útil a cada una de dichas subunidades.
En este documento se divulga, pero no como parte de la invención, que dicho inmunoligando con al menos dos subunidades se conjuga con al menos un 80 % de eficiencia por sitio de conjugación.
La presente invención se refiere además a dicho inmunoligando con al menos dos subunidades que contiene una secuencia espaciadora peptídica de al menos dos aminoácidos, preferiblemente 2-5 aminoácidos, anexa a los terminales C de al menos una de las dos subunidades.
Este enfoque da como resultado, ventajosamente, una conjugación sincrónica de las al menos dos subunidades para la generación de cargas útiles de inmunoligandos con igual conjugación de carga útil a cada una de dichas subunidades.
De acuerdo con una realización preferida de la invención, el método permite una relación definida estequiométricamente entre inmunoligando y carga útil.
En este documento se divulga, pero no como parte de la invención, que se puede proporcionar una relación cuantitativa estricta entre inmunoligando y carga útil, mejorando así la reproducibilidad y el rendimiento general del respectivo conjugado de inmunoligando/carga útil, particularmente para aplicaciones clínicas y/o terapéuticas. Esto se explica por la especificidad de secuencia y/o sitio de la transpeptidasa utilizada.
De acuerdo con una realización particularmente preferida, dicha relación estequiométricamente definida entre inmunoligando y carga útil se logra mediante la eliminación del sustrato de inmunoligando modificado en el extremo C que ha reaccionado parcialmente.
Esta eliminación puede realizarse, por ejemplo, mediante purificación por afinidad. Dicho enfoque da como resultado, preferentemente, una relación fármaco-inmunoligando homogénea.
De acuerdo con una realización particularmente preferida de la invención, el inmunoligando tiene una etiqueta de purificación por afinidad distal al motivo de reconocimiento de sortasa fusionado a la proteína o inmunoligando, preferiblemente en donde la etiqueta de purificación por afinidad se elimina del inmunoligando como parte de la reacción de transpeptidasa.
Preferiblemente, dicha eliminación se lleva a cabo mediante purificación por afinidad utilizando una etiqueta de afinidad posicionada en el terminal C del motivo o dominio de reconocimiento de la transpeptidasa. Para este propósito se pueden utilizar métodos estándar conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, la etiqueta HIS, la etiqueta CBP, la etiqueta CYD (péptido NorpD covalente pero disociable), la etiqueta Strep II, la etiqueta FLAG, la etiqueta HPC (cadena pesada de proteína C) y las etiquetas de fusión de proteínas<g>S<t>y MBP
De acuerdo con otra realización de la presente invención, el método permite una conjugación específica del sitio de una carga útil al inmunoligando.
En este documento se divulga, pero no forma parte de la invención, que se proporciona que el proceso de conjugación no interfiere con la actividad del inmunoligando o la carga útil en sí, mejorando así la reproducibilidad y el rendimiento general del respectivo conjugado de inmunoligando/carga útil, particularmente para aplicaciones clínicas y/o terapéuticas. Esto se explica por la especificidad de secuencia y/o sitio de la transpeptidasa utilizada. A diferencia de la química de unión convencional, que en la mayoría de los casos no es específica del sitio o tiene una especificidad de sitio limitada (por ejemplo, cuando la carga útil se conjuga con un grupo amino libre, como en Arg, Lys, Asn o Gln), el sitio de unión se puede determinar con exactitud, de modo que se puedan identificar las características del inmunoligando (por ejemplo, especificidad del objetivo) o la carga útil (por ejemplo, toxicidad) no se ven afectados.
La presente invención se refiere además a un conjugado de inmunoligando/carga útil que se puede obtener con dicho método como se describió anteriormente, en donde dicho conjugado comprende un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una proteína de unión basada en anticuerpos o un mimético de anticuerpos, en donde
a) el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en (i) un fragmento Fab, (ii) un fragmento F(ab')2; (iii) una porción de cadena pesada de un fragmento Fab(Fd), que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento variable (Fv); (v) un fragmento de anticuerpo de dominio (dAb), que comprende un único dominio variable; (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada; (vii) un fragmento Fv de cadena única (scFv); (viii) un diacuerpo; y (ix) un anticuerpo lineal, que comprende un par de segmentos Fv en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto con polipéptidos de cadena ligera de complementariedad, forman un par de regiones de unión a antígeno;
b) la proteína de unión basada en anticuerpos es una proteína que contiene al menos un dominio de inmunoglobulina VH, VL o CH derivado de anticuerpos,
c) el mimético de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en proteínas de repetición de anquirina, lectinas de tipo C, transferrinas, lipocalinas, dominios de tipo III del décimo tipo de fibronectina, nudos de cisteína o knottinas, dominios SH-3 y Fyn SH3,
y una carga útil que es un compuesto citotóxico que no excede un peso molecular de 2 500 Daltons que es citotóxico para las células de mamíferos y daña y destruye las células cancerosas,
y en donde la transpeptidasa específica de secuencia es una enzima sortasa que reconoce un motivo de reconocimiento de pentapéptido, añadido a un extremo terminal C del inmunoligando,
en donde el inmunoligando comprende un motivo de reconocimiento de sortasa y el compuesto citotóxico está modificado con una modificación de Glyn, donde n>1, y
donde el motivo de reconocimiento de la sortasa es un pentapéptido unido al terminal C del inmunoligando.
La presente invención se refiere además a un conjugado de inmunoligando/carga útil que se puede obtener con dicho método para su uso en el tratamiento de un sujeto humano o animal que padece una enfermedad neoplásica.
En todos estos casos, el conjugado inmunoligando/carga útil de acuerdo con la invención puede tener efectos beneficiosos, por ejemplo, dirigiéndolo a un sitio específico, por ejemplo, una célula cancerosa, un sitio de neuropatología o un sitio de una reacción autoinmune.
La carga útil, por ejemplo, se administra en dicho sitio una toxina, un agente quimioterapéutico, una citocina o un fármaco, por ejemplo, para agotar una célula cancerosa, para actuar antiproliferativamente sobre una célula cancerosa y similares.
En todos estos casos, el conjugado inmunoligando/carga útil de acuerdo con la invención puede tener efectos beneficiosos, por ejemplo, dirigiéndolo a un sitio específico, por ejemplo, una célula cancerosa, donde la carga útil, por ejemplo, se administra una toxina o un agente quimioterapéutico, por ejemplo, para agotar una célula cancerosa, para actuar antiproliferativamente sobre una célula cancerosa.
De esta forma se reduce la toxicidad sistémica de la toxina o del agente quimioterapéutico, mientras que aumenta la local de éste en el sitio de acción, proporcionando así una mejor eficacia a la vez que se reducen los efectos secundarios. Además, una cascada de señalización respectiva puede inhibirse mediante la unión del inmunoligando. En el caso de que la carga útil sea un etiquetador, este puede utilizarse para marcar un sitio específico, por ejemplo, una célula cancerosa caracterizada por un antígeno de superficie determinado detectado por el inmunoligando, para diagnóstico.
La especificidad del sitio del proceso de conjugación garantiza una alta reproducibilidad y un rendimiento general del respectivo conjugado inmunoligando/carga útil, particularmente para aplicaciones clínicas y/o terapéuticas.
El término "enfermedad neoplásica", como se utiliza en el presente documento, se refiere a un estado o condición anormal de células o tejido caracterizado por un crecimiento celular proliferante rápido o neoplasia. En un significado más específico, el término se relaciona con procesos cancerosos, por ejemplo, tumores y/o leucemias.
El término "enfermedades neuropatológicas" engloba, entre otras, las enfermedades neurodegenerativas, las enfermedades neuroinflamatorias o los trastornos convulsivos.
Las enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por la pérdida progresiva de la estructura o función de las neuronas, incluida la muerte de las neuronas. Muchas enfermedades neurodegenerativas, incluidas el Parkinson, el Alzheimer, la enfermedad de Huntington, la esclerosis lateral amiotrófica y la esclerosis múltiple, se producen como resultado de procesos neurodegenerativos. Existen muchos paralelismos entre diferentes trastornos neurodegenerativos, incluidos los conjuntos de proteínas atípicos y la muerte celular inducida. La neurodegeneración también se puede encontrar en muchos niveles diferentes de circuitos neuronales, desde el molecular hasta el sistémico.
Los términos "enfermedades neurodegenerativas" y "enfermedades neuroinflamatorias" tienen un alcance parcialmente superpuesto. Las respuestas inflamatorias son un sello distintivo de la enfermedad neurodegenerativa y participan o contribuyen, a través de diferentes mecanismos, a la muerte de las células neuronales. El catabolismo del triptófano a lo largo de la vía de la quinurenina (KP) representa uno de estos mecanismos.
Los trastornos convulsivos son trastornos cerebrales que se caracterizan por una señalización anormal entre las células cerebrales. Los trastornos convulsivos pueden afectar parte del cerebro (convulsiones parciales) o todo el cerebro (convulsiones generalizadas). El trastorno convulsivo más destacado es la epilepsia.
El término "enfermedad autoinmune", como se utiliza en el presente documento, abarca enfermedades autoinmunes específicas de órganos, en las que una respuesta autoinmune se dirige contra un solo tejido, como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, la diabetes mellitus tipo I, la miastenia gravis, el vitíligo, la enfermedad de Graves, la enfermedad de Hashimoto, la enfermedad de Addison y la gastritis autoinmune y la hepatitis autoinmune. El término también abarca enfermedades autoinmunes no específicas de órganos, en las que una respuesta autoinmune se dirige contra un componente presente en varios o muchos órganos de todo el cuerpo.
Entre estas enfermedades autoinmunes se incluyen, por ejemplo, la artritis reumatoide, la enfermedad del lupus eritematoso sistémico, la esclerosis sistémica progresiva y variantes, la polimiositis y la dermatomiositis.
Otras enfermedades autoinmunes incluyen la anemia perniciosa, incluidas algunas gastritis autoinmunes, cirrosis biliar primaria, trombocitopenia autoinmune, síndrome de Sjogren, esclerosis múltiple y psoriasis. Un experto en la materia entiende que los métodos de la invención pueden aplicarse a estas u otras enfermedades autoinmunes, según se desee.
El término "enfermedad infecciosa", tal como se utiliza en el presente documento, incluye, pero no se limita a, cualquier enfermedad causada por un organismo infeccioso. Los organismos infecciosos pueden incluir virus (por ejemplo, virus de ARN monocatenario, virus de ADN monocatenario, virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus de hepatitis A, B y C, virus del herpes simple (VHS), citomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr (VEB), virus del papiloma humano (VPH)), parásitos (por ejemplo, patógenos protozoarios y metazoarios como especies de Plasmodio, especies de Leishmania, especies de Schistosoma, especies de Trypanosoma), bacterias (por ejemplo, Micobacterias, en particular, M. tuberculosis, Salmonella, Streptococci, E. coli, Staphylococci), hongos (por ejemplo, especies de Candida, especies de Aspergillus),Pneumocystis carinii,y priones.
La presente invención se refiere además a un uso de un compuesto citotóxico de bajo peso molecular que no excede un peso molecular de 2 500 Daltons para su conjugación por medio de una enzima sortasa a un inmunoligando seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una proteína de unión basada en anticuerpos o un mimético de anticuerpos, en donde
a) el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en (i) un fragmento Fab, (ii) un fragmento F(ab')2; (iii) una porción de cadena pesada de un fragmento Fab(Fd), que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento variable (Fv); (v) un fragmento de anticuerpo de dominio (dAb), que comprende un único dominio variable; (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada; (vii) un fragmento Fv de cadena única (scFv); (viii) un diacuerpo; y (ix) un anticuerpo lineal, que comprende un par de segmentos Fv en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto con polipéptidos de cadena ligera de complementariedad, forman un par de regiones de unión a antígeno;
b) la proteína de unión basada en anticuerpos es una proteína que contiene al menos un dominio de inmunoglobulina VH, VL o CH derivado de anticuerpos,
c) el mimético de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en proteínas de repetición de anquirina, lectinas de tipo C, transferrinas, lipocalinas, dominios de tipo III del décimo tipo de fibronectina, nudos de cisteína o knottinas, dominios SH-3 y Fyn SH3,
en donde el inmunoligando comprende un motivo de reconocimiento de sortasa y el compuesto citotóxico de bajo peso molecular está modificado con una modificación de Glyn, donde n>1,
en donde el motivo de reconocimiento de la sortasa es un pentapéptido unido al terminal C del inmunoligando,
y en donde el compuesto citotóxico no excede un peso molecular de 2 500 Daltons, es citotóxico para las células de mamíferos y daña y destruye las células cancerosas.
La presente invención también se refiere además a dicho método de producción de un conjugado de inmunoligando/carga útil como se describió anteriormente, en donde la conjugación de inmunoligando-carga útil se realiza en sobrenadante de cultivo celular crudo.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "modificación de Glyn" significa que se ha añadido a dicha carga útil un oligopéptido o polipéptido que consta de n residuos de glicina. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "compuesto de carga útil de bajo peso molecular" abarcará cargas útiles que tengan un peso molecular de 2500 Da o menos.
Dicha carga útil es, preferentemente, al menos una seleccionada del grupo que consiste en
• un etiquetador,
• una etiqueta de procesamiento, y/o
• un fármaco.
Dicho etiquetador es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en
• un radioetiquetador, preferiblemente un péptido o proteína etiquetado radiactivamente
• una etiqueta fluorescente, preferiblemente un péptido o proteína fluorescente, y/o
• una etiqueta enzimática, preferiblemente una peroxidasa.
Dicho fármaco es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en
• una citocina
• un agente radiactivo
• una toxina, y/o
• un agente quimioterapéutico.
Como ya se ha comentado anteriormente, dicha toxina es preferiblemente una toxina de pequeño peso molecular, es decir, que tiene un peso molecular de < 2500 Da. Preferiblemente, dicha toxina es al menos una seleccionada del grupo que consiste en
• Maytansina
• Monometil auristatina y/o
• Alfa-amanitina
o derivados del anterior. Ejemplos de tales toxinas modificadas con Glyn se muestran en las estructuras 1 a 9 de la Fig. 14A - 14C
Preferiblemente, y como se mencionó anteriormente, la conjugación es una conjugación mediada por transpeptidasa, preferiblemente con una sortasa. De manera igualmente preferente, el inmunoligando es un anticuerpo.
Preferiblemente, dicho inmunoligando es un anticuerpo. De esta manera se puede proporcionar un conjugado anticuerpo fármaco (ADC).
Preferiblemente, la reacción de conjugación del inmunoligando-carga útil se realiza en el sobrenadante del cultivo celular crudo. Esto significa que, preferiblemente, la reacción de conjugación puede tener lugar con componentes no purificados o sólo parcialmente purificados.
Experimentos y Figuras
La invención se ha ilustrado y descrito en detalle en los dibujos y la descripción anterior. Otras variaciones a las realizaciones divulgadas pueden ser entendidas y efectuadas por aquellos expertos en la materia al practicar la invención reivindicada, a partir de un estudio de los dibujos, la divulgación y las reivindicaciones adjuntas. En las reivindicaciones, la palabra "que comprende" no excluye otros elementos o pasos, y el artículo indefinido "un" o "uno, una" no excluye una pluralidad. El mero hecho de que determinadas medidas se mencionen en reivindicaciones dependientes mutuamente diferentes no indica que no pueda utilizarse ventajosamente una combinación de esas medidas.
Todas las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento se muestran desde el terminal N al terminal C; todas las secuencias de ácidos nucleicos divulgadas en el presente documento se muestran 5'->3'.
Ejemplo 1:Clonación de vectores de expresión y expresión de un anticuerpo monoclonal CD19 con etiqueta de sortasa LPETG del terminal C y etiquetas de purificación por afinidad 6x-His y streplI adicionales Para realizar la conjugación al terminal C de una carga útil a un anticuerpo, primero se debe expresar un anticuerpo recombinante que contenga modificaciones del terminal C, incluido un motivo de reconocimiento, por ejemplo, para la Sortasa A deStaphylococcus aureus.
Para ello, los primeros ORF para cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo específico anti-CD19 humano se pueden sintetizar genéticamente, por ejemplo, en organizaciones de investigación por contrato (CRO) que ofrecen dichos servicios de síntesis genética, como por ejemplo Genscript (www.genscript.com, Piscataway, NJ, EE. UU.). Como ejemplo, las secuencias de cadena pesada y ligera de un anticuerpo anti-CD19 humano humanizado hBU12 se pueden encontrar en la patente US 8,242,252 B2 bajo la Seq 53 (variante HF) y la Seq 58 (variante LG). Las regiones V<h>y V<l>de este anticuerpo anti-CD19 humano son las siguientes:
SEQ ID NO 1 (región codificante Vh del anticuerpo anti-CD19 humano humanizado hBU12):
ATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTTTTCCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCATTGTCAGGTTCAGCTGCAAGA
GTCTGGCCCTGGGTTGGTTAAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTACTGTGTCTGGGGGTTCAATCAGCA
CTTCTGGTATGGGTGTAGGCTGGATTAGGCAGCACCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGATTGGACACATTTGGTGG
GATGATGACAAGAGATATAACCCAGCCCTGAAGAGCAGAGTGACAATCTCTGTGGATACCTCCAAGAACCAGTT
TAGCCTCAAGCTGTCCAGTGTGACAGCTGCAGATACTGCTGTCTACTACTGTGCTAGAATGGAACTTTGGTCCT
ACTATTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCCTTGTCACAGTCTCCTCA
Esto se traduce a la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO 2):
MGWSWIFLFLLSGTAGVHCQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISTSGMGVGWIRQHPGKGLEWIGHIWW
DDDKRYNPALKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARMELWSYYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO 3 (región codificante Vl del anticuerpo anti-CD19 humano humanizado hBU12)
ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGAAATTGTTCTCACCCA
GTCTCCAGCAACCCTGTCTCTCTCTCCAGGGGAAAGGGCTACCCTGAGCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTT
ACATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGCAGGCTCCCAGACTCCTGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCT
GGTATTCCAGCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTTTACACTCACAATCAGCAGCCTGGAGCCAGA
GGATGTTGCTGTCTATTACTGTTTTCAGGGGAGTGTATACCCATTCACTTTTGGCCAAGGGACAAAGTTGGAAA
TCAAA
Esto se traduce a la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO 4):
MKLPVRLLVLMFWI PA SSSEIV LTQ S PATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYDTSKLAS
G IPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPED VAVYYCFQGSVYPFTFGQGTKLEIK
Estas secuencias se pueden fusionar a las regiones de cadena pesada constante y cadena ligera constante IgG<1>humana que contienen etiquetas del terminal C adicionales, con el fin de realizar el método divulgado en el presente documento.
Para realizar la invención, la región de la cadena pesada de IgG1 constante humana se puede sintetizar con codones 3' adicionales, que codifican una etiqueta de reconocimiento de Sortasa A deStaphylococcus aureusLPETG, seguida de una etiqueta 6xHis (HHHHHH), una etiqueta MYC (EQKLISEEDL) y una etiqueta strep II (WSHPQFEK) dando como resultado una secuencia, que es la siguiente:
SEQ ID NO 5 (región codificante constante de cadena pesada de IgG1 humana con extensión 3' en marco que codifica una etiqueta de sortasa LPETG, una etiqueta 6xHis y una etiqueta strepII):
AGCACCAAGGGCCCATCTGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCTGCCCTGGG
CTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCTGAACCTGTGACAGTGTCCTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGC
ACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGC
TTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCC
CAAAT CTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCC
TCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTG
AGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCC
GCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATG
GCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAA
GGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCT
GACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACA
ACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAG
AGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAA
GAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAACTGCCCGAGACCGGCCACCACCACCACCACCACGGCGAGCAGAAGCTGA
TCAGCGAGGAGGACCTGGGCTGGAGCCACCCCCAGTTCGAGAAGTAG
Esto se traduce en la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO 6, los aminoácidos de las etiquetas están subrayados):
ST K G P SV FP L A P S S K S T S GGTA ALGCLVKD YFPEPVTVSVIN SGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLS S W T V P S S S
LGTQTYICNVNHKP SN TK V D KK V EPK SC D K TH TC PPC PA PELLG G PSV FLFPPK PK D TLM ISRT PEV TC W V D V
SHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRW SVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
GQ PREPQ VYTLPPSRD ELTKN Q VSLTCLVKG FYPSD IA VEW ESN G Q PEN N YKTTPPVLD SD G SFFLYSKLTVD K
SRW QQGHVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKLPETGHHHHHHGEQKLISEEDLGWSHPQFEK»
Además, la región de la cadena ligera kappa de IgG1 constante humana se puede sintetizar con codones 3' adicionales, que codifican una etiqueta de reconocimiento de Sortasa A deStaphylococcus aureusLPETG, seguida de una etiqueta 6xHis y una etiqueta strep II (WSHPQFEK) dando como resultado una secuencia, que es la siguiente:
SEQ ID NO 7 (región codificante constante de cadena ligera kappa de IgG1 humana con extensión 3' en marco que codifica una etiqueta de sortasa LPETG, una etiqueta 6xHis, una etiqueta Myc y una etiqueta strepII):
A C G G T G G C T G C A C C A T C T G T C T T C A T C T T C C C G C C A T C T G A T G A G C A G T T G A A A T C T G G A A C T G C C T C T G T T G T
G T G C C T G C T G A A T A A C T T C T A T C C C A G A G A G G C C A A A G T A C A G T G G A A G G T G G A T A A C G C C C T C C A A T C G G G T A
A C T C C C A G G A G A G T G T C A C A G A G C A G G A C A G C A A G G A C A G C A C C T A C A G C C T C A G C A G C A C C C T G A C G C T G A G C
A A A G C A G A C T A C G A G A A A C A C A A A G T C T A C G C C T G C G A A G T C A C C C A T C A G G G C C T G A G C T C G C C C G T C A C A A A
G A G C T T C A A C A G G G G A G A G T G T C T G C C C G A G A C C G G C C A C C A C C A C C A C C A C C A C G G C G A G C A G A A G C T G A T C A
G C G A G G A G G A C C T G G G C T G G A G C C A C C C C C A G T T C G A G A A G T A G
Esto se traduce en la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO 8, los aminoácidos de las etiquetas están subrayados):
T V A A PSV FI FPPSD EQ LK SG TA SW CLLN N FYPREA KV Q ÍJKVD N A LQ SG N SQ ESVTEQ D SKD STYSLS S T L T L S
KADYE KHKVYACEVTHQGL S S PVTKS FMRGECLPETGHHHHHHGEQKLISEEDLGW SHPQFEK•
Las regiones de codificación completas para la etiqueta de sortasa LPETG, 6xHis y las cadenas pesadas y ligeras etiquetadas con strepII del anticuerpo humanizado anti-CD19 humano hBU12 son las siguientes:
SEQ ID NO 9 (región codificante de cadena pesada Vh-Ch de IgG1 humana completa para hBU12 con la etiqueta de sortasa LPETG del terminal C, etiqueta 6xHis, etiqueta Myc y una etiqueta strepII):
ATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTTTTCCTCCTGTCAGGñACTGCñGGTGTCCATTGTCAGGTTCAGCTGCAAGñ
GTCTGGCCCTGGGTTGGTTAAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTACTGTGTCTGGGGGTTCAATCAGCA
CTTCTGGTATGGGTGTAGGCTGGATTAGGCAGCACCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGATTGGACACATTTGGTGG
GATGATGACAfiGAGATATAACCCAGCCCTGAAGAGCfiGAGTGACAATCTCTGTGGATACCTCCAAGAACCAGTT
TAGCCTCAAGCTGTCCAGTGTGACAGCTGCAGATACTGCT GTCTACTACTGTGCTAGAATGGAACTTTGGTCCT
ACTATTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCCTTGTCACAGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCTGTCTTC
CCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCTGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCC
TGAACCTGTGACAGTGTCCTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGT
CCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGC
AACGT GAATCACAAGCCCAGCAACAC CAAGGT GGACAAGAAAGT T GAG C C CAAAT C T T GTGACAAAACT CACAC
ATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACA
CCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAG
TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCñGTACAACAGCAC
GTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCT
CCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCñTCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTG
TACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTA
TCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGC
TGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTC
TTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAfi
ACTGCCCGAGACCGGCCACCACCACCACCACCACGGCGAGCAGAAGCTGATCAGCGAGGAGGACCTGGGCTGGA
GCCACCCCCAGTTCGAGAAGTAG
Esto se traduce en la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO 10, los aminoácidos de las etiquetas están subrayados):
MGWSWIFLFLLSGTAGVHCQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISESGMGVGWIRQHPGKGLEWIGHIWW
DDDKRYNPALKSRVTISVDTSKNQFSLKLS SVTAADTAVYYCAKMELWSYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVF
PLA PSSKSTSG G TA A LG CLVK D YFPEPVTVSW N SGA LTSG VH TFPA VLQ SSG LYSLSSW TVPSSSLGTQ TYIC
NVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHE'CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD^LM ISRTPEVTCW VDVSHEDPEVK
FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSFYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV
YTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNV
FSCSVMHEALHMHYTQKSLSLSPGKLPETGHHHHHHGEQKLISEEDLGWSHPQFEK»
SEQ ID NO 11 (Región codificante de cadena kappa de V<l>-C<l>de IgG1 humana completa para hBU12 con la etiqueta de sortasa LPETG del terminal C, etiqueta 6xHis, etiqueta Myc y una etiqueta strepII):
ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGAAATTGTTCTCACCCA
GTCTCCAGCAACCCTGTCTCTCTCTCCAGGGGAAAGGGCTACCCTGAGCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTT
ACATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGCAGGCTCCCAGACTCCTGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCT
GGTATTCCAGCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTTTACACTCACAATCAGCAGCCTGGAGCCAGA
G G A T G T T G C T G T C T A T T A C T G T T T T C A G G G G A G T G T A T A C C C A T T C A C T T T T G G C C A A G G G A C A A A G T T G G A A A
TCAAAAGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCC
TCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCA
ATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGA
CGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCC
GTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTCTGCCCGAGACCGGCCACCACCACCACCACCACGGCGAGCAGAA
GCTGATCAGCGAGGAGGACCTGGGCTGGAGCCACCCCCAGTTCGAGAAGTAG
Esto se traduce en la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO 12, los aminoácidos de las etiquetas están subrayados):
M KLPVRLLVLM FW IPASSSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYM HW YQQKPGQAPRLLIYDTSKLAS
GIPA RFSG SG SG TD FTLTISSLEPED VA VYYC FQ GSVYPFTFG Q G TK LEIK RTVA A PSVFIFPPSD EQ LKSG TA
SWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP
VTK5FHRGECLPETGHHHHHHGEQKLISEEDLGWSHPQFEK»
Las regiones codificantes para las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo específico anti-CD19 humano, como se divulga en las SEQ ID NOs 9 y 11, respectivamente, se pueden sintetizar luego con sitios de enzimas de restricción flanqueantes (por ejemplo, HindIII y NotI) de modo que se puedan clonar en un vector de expresión de mamíferos estándar, tal como pCDNA3.1-hygro (+) (Invitrogen), mediante métodos de biología molecular estándar conocidos en la técnica.
La secuencia de ADN completa del vector de expresión de la cadena pCDNA3.1-hygro (+)-IgH para el anticuerpo anti-CD19 humano hBU12 etiquetado será la siguiente:
SEQ ID NO 13 (región codificante de la cadena pesada V<h>-C<h>de IgG1 humana para hBU12 con etiqueta de sortasa LPETG del terminal C, etiqueta 6xHis y una etiqueta strepII subrayadas, y sitios de clonación HindIII y NotI sombreados):
GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGC
CAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCA
AGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCA
GATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCA
TATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATT
GACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATT
TACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGAC
GGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGT
ATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCAC
GGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCA
AAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAG
AGCTCTCTGGC TAAC TAGAGAAC C CACT G C T TACT G G C T TAT C GAAAT TAATAC GAC T CACTATAG G GAGAC C C
AAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTCCATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTTTTCCTCCTGTCAGGAACTGC
AGGTGTCCATTGTCAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGCCCTGGGTTGGTTAAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGA
CTTGTACTGTGTCTGGGGGTTCAATCAGCACTTCTGGTATGGGTGTAGGCTGGATTAGGCAGCACCCAGGGAAG
GGTCTGGAGTGGATTGGACACATTTGGTGGGATGATGACAAGAGATATAACCCAGCCCTGAAGAGCAGAGTGAC
AATCTCTGTGGATACCTCCAAGAACCAGTTTAGCCTCAAGCTGTCCAGTGTGACAGCTGCAGATACTGCTGTCT
ACTACTGTGCTAGAATGGAACTTTGGTCCTACTATTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCCTTGTCACAGTCTCC
TCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCTGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCTGC
CCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCTGAACCTGTGACAGTGTCCTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCG
GCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCC
AG C AG CT T G G G C AC C C AGAC CT AC AT CT G CAAC GT GAAT G ACAAG C G CAG CAACAC CAAG GT G GACAAGAAAGT
TGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAG
TCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTG
GACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGAC
AAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGC
TGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAA
GCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGT
CAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGG
AGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTG
GACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACAC
ACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAACTGCCCGAGACCGGCCACCACCACCACCACCACGGCGAGCAGA
AGCTGATCAGCGAGGAGGACCTGGGCTGGAGCCACCCCCAGTTCGAGAAGTAGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGG
GCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCG
TGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGT
CTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAG
CAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATC
CCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCC
AGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGC
TCTAAATCGGGGCATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGG
GTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTT
AATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGAT
TTTGGGGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAA
TGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAAT
T A G TC A G C A A C C A G G TG TG G A A A G TC C C C A G G C TC C C C A G C A G G C A G A A G TA TG C A A A G C A TG C A TC TC A A TTA
G TC A G C A A C C A T A G T C C C G C C C C T A A C T C C G C C C A T C C C G C C C C T A A C T C C G C C C A G T T C C G C C C A T T C T C C G C
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G C G A TC G C TG C G G C C G A TC TTA G C C A G A C G A G C G G G TTC G G C C C A TTC G G A C C G C A A G G A A TC G G TC A A TA C A C
T A C A T G G C G T G A T T T C A T A T G C G C G A T T G C T G A T C C C C A T G T G T A T C A C T G G C A A A C T G TG A TGG ACG ACACCG
T C A G TG C G T C C G TC G C G C A G G C T C TC G A T G A G C T G A TG C T TT G G G C C G A G G A C T G C C C C G A A G T C C G G C A C C TC
G TG C A C G C G G A T TT C G G C T C C A A C A A T G TC C T G A C G G A C A A T G G C C G C A TA A C A G C G G T C A T TG A C T G G A G C G A
G G C G A T G T T C G G G G A T T C C C A A T A C G A G G T C G C C A A C A T C T T C T T C T G G A G G C C G T G G T T G G C T T G T A T G G A G C
A G C A G A C G C G C TA C TT C G A G C G G A G G C A T C C G G A G C T TG C A G G A TC G C C G C G G C T C C G G G C G T A T A TG C T C C G C
A T T G G T C T T G A C C A A C T C T A T C A G A G C T T G G T T G A C G G C A A T T T C G A T G A T G C A G C T T G G G C G C A G G G T C G A T G
CG A C G C A A TC G TC C G A TC C G G A G C C G G G A C TG TC G G G C G TA C A C A A A TC G C C C G C A G A A G C G C G G C C G TC TG G A
C C G A T G G C TG TG TA G A A G TA C TC G C C G A TA G TG G A A A C C G A C G C C C C A G C A C TC G TC C G A G G G C A A A G G A A TA G
C A C G T G C T A C G A G A T T T C G A T T C C A C C G C C G C C T T C T A T G A A A G G T T G G G C T T C G G A A T C G T T T T C C G G G A C G C
C G G C T G G A T G A T C C T C C A G C G C G G G G A T C T C A T G C T G G A G T T C T T C G C C C A C C C C A A C T T G T T T A T T G C A G C T T
A T A A T G G T T A C A A A T A A A G C A A T A G C A T C A C A A A T T T C A C A A A T A A A G C A T T T T T T T C A C T G C A T T C T A G T T G T
G G T T T G T C C A A A C T C A T C A A T G T A T C T T A T C A T G T C T G T A T A C C G T C G A C C T C T A G C T A G A G C T T G G C G T A A T C
A T G G T C A T A G C T G T T T C C T G T G T G A A A T T G T T A T C C G C T C A C A A T T C C A C A C A A C A T A C G A G C C G G A A G C A T A A
A G TG T A A A G C C T G G G G T G C C T A A TG A G TG A G C TA A C T C A C A T T A A T T G C G T T G C G C T C A C T G C C C G C T T TC C A G
TC G G G A A A C C TG TC G TG C C A G C T G C A TT A A T G A A T C G G C C A A C G C G C G G G G A G A G G C G G T TT G C G T A TT G G G C G
C T C T T C C G C T T C C T C G C T C A C T G A C T C G C T G C G C T C G G T C G T T C G G C T G C G G C G A G C G G T A T C A G C T C A C T C A A
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La secuencia de ADN completa del vector de expresión de la cadena pCDNA3.1-hygro (+)-IgL para el anticuerpo anti-CD19 humano hBU12 etiquetado será la siguiente:
SEQ ID NO 14 (región codificante de la cadena ligera kappa V<l>-C<l>de IgG1 humana para hBU12 con la etiqueta de sortasa LPETG del terminal C, etiqueta 6xHis, etiqueta Myc y una etiqueta strepII subrayada, y sitios de clonación HindIII y NotI sombreados):
GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGC CAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCA AGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCA GATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCA TATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATT GACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATT TACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGAC GGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGT ATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCAC GGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCA AAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAG AGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCC AAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTl^AgCTfCCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCC TGCTTCCAGCAGTGAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAACCCTGTCTCTCTCTCCAGGGGAAAGGGCTACCC TGAGCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGCAGGCTCCCAGACTC CTGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGTATTCCAGCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTT TACACTCACAATCAGCAGCCTGGAGCCAGAGGATGTTGCTGTCTATTACTGTTTTCAGGGGAGTGTATACCCAT TCACTTTTGGCCAAGGGACAAAGTTGGAAATCAAAAGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCA TCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAA AGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGG ACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGC GAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTCTGCCCGAGACCGG CCACCACCACCACCACCACGGCGAGCAGAAGCTGATCAGCGAGGAGGACCTGGGCTGGAGCCACCCCCAGTTCG AGAAGTAGGCGGCCGQTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTG CCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCT AATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGAC AGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGA AAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGG TTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTC GCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGCATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACG GCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTC GCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATC TCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGGGGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACA AAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGGCAG GCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGC AGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCT AACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCG CCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCG GGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAGCACGTGATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGA GAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTT TCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGT TATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAG CCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTG TTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCA TTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTA TCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGG CCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGC CGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTT CTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGAT CGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTC GATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACA AATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCC CCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGCACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGG TTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTT CGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATA
AAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCG
TCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAAT
TCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAA
TTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGC
GCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCG
GCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAA
AGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGG
CTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAG
ATAGCñGGGGTTTCCCC.GTGGAñGCTCCCTCGTGCGCTC.TCGTGTTGGGAGCGTGCCGC.TTAGGGGñTAGCTGT
CCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTC
GTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCG
TCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGA
GGTATGTAGGGGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTAGACTAGAAGGACAGTATTTGGT
ATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGC
TGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGA
TCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAA
AGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTG
GTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTG
CCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCG
GGAGAGCr.AGGCTCACCGGGTr.r.AGATTTATGAGCAATAAAGr.AGr.r.AGCr.GGAAGGGCr.GAGGGr.AGAAGTGG
TCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTA
ATAGTTTGCGr.AAr.GTTGTTGCCATTGCTACAGGr.ATCGTGGTGTCAGGCTOGTGGTTTGGTATGGCTTCATTC
AGCTCCGGTTCGCAACGATCAAGGCGAGTTAGATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGG
TCCTCCGATGGTTGTGAGAAGTAAGTTGGGGGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGGAGCACTGCATAATTGTC
TTACTGTCATGGCATGCGTAAGATGGTTTTGTGTGAGTGGTGAGTACTr.AAGGAAGTGATTCTGAGAATAGTGT ATGCGGCGAGCGAGTTGCTCTTGCCCGGr.GTGAATAGGGGATAATACCGCGr.CACATAGCAGAAr.TTTAAAAGT GGTGATCATTGGAAAAr.GTTGTTCGGGGCGAAAACTGTr.AAGGATGTTACCGGTGTTGAGATCCAGTTCGATGT AACGGACTGGTGGAGGr.AACTGATGTTCAGCATr.TTTTAGTTTCACGAGCGTTTr.TGGGTGAGGAAAAACAGGA
AGGCAAAATGGGGGAAAAAAGGGAATAAGGGGGAGAGGGAAATGTTGAATAGTGATAGTGTTCCTTTTTCAATA
TTATTGAAGGATTTATGAGGGTTATTGTGTGATGAGGGGATAGATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAAGAAA
TAGGGGTTGCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGGCACCTGACGTC
Estas construcciones permiten, tras la transfección en células de mamíferos, como, por ejemplo -pero sin limitarse a- las células CHO, que normalmente se utilizan para la expresión de anticuerpos recombinantes, la expresión del anticuerpo humanizado específico anti-CD19 humano hBU12 con adiciones en el terminal C de una etiqueta Sortasa A, una etiqueta 6xHis, una etiqueta Myc y una etiqueta strepII en las cadenas IgH e IgL.
Ejemplo 2:Clonación de vectores de expresión para anticuerpo monoclonal con dominio N-inteína del terminal C de inteína dividida Ssp GyrB 11 con etiquetas de purificación por afinidad 6xHis y strepII del terminal C adicionales (ejemplo no de acuerdo con la presente invención)
Similar al diseño de casetes de expresión y vectores de cadenas pesadas y ligeras de IgG1 etiquetadas con Sortasa A deStaphylococcus aureus,las regiones codificantes para una fusión en el terminal C del dominio N-inteína de la inteína dividida Ssp GyrB 11 a la cadena IgH o IgL se pueden diseñar de la siguiente manera, para sintetizar los genes mediante una CRO calificada (por ejemplo, Genscript (www.genscript.com, Piscataway, NJ, EE. UU.), con los mismos elementos para el anticuerpo anti-CD19 humano como se divulga más arriba.
La secuencia de 150 aminoácidos del dominio N-inteína de la inteína dividida Ssp GyrB 11 se puede encontrar en una publicación de Appleby et al. (2009), y es la siguiente:
SEQ ID NO 15 (dominio N-inteína de inteína dividida Ssp GyrB 11):
CFSGD TLVALTD GRSVSFEQLVEEEKQ GKQN FCYTIRH DGSIGVEKIIN ARKTKTN AKVIKVTLDN GESIICTP
DHKFMLRDGSYKCAMDLTLDDSLMPLHRKISTTEDSGHMEAVLNYNHRIVNIEAVSETIDVYDIEVPHTHNFAL
AS
La traducción inversa de esa secuencia de aminoácidos con el uso de codones de mamíferos dará como resultado la secuencia codificante para el dominio N-inteína de la inteína dividida Ssp GyrB 11 de la siguiente manera:
SEQ ID NO 16 (secuencia codificante para el dominio N-inteína de inteína dividida Ssp GyrB 11):
TGCTTCAGCGGCGACACCCTGGTGGCCCTGACCGACGGCAGAAGCGTGAGCTTCGAGCAGCTGGTGGAGGAGGA
GAAGCAGGGCAAGCAGAACTTCTGCTACACCATCAGACACGACGGCAGCATCGGCGTGGAGAAGATCATCAACG
CCAGAAAGACCAAGACCAACGCCAAGGTGATCAAGGTGACCCTGGACAACGGCGAGAGCATCATCTGCACCCCC
GACCACAAGTTCATGCTGAGAGACGGCAGCTACAAGTGCGCCATGGACCTGACCCTGGACGACAGCCTGATGCC
CCTGCACAGAAAGATCAGCACCACCGAGGACAGCGGCCACATGGAGGCCGTGCTGAACTACAACCACAGAATCG
TGAACATCGAGGCCGTGAGCGAGACCATCGACGTGTACGACATCGAGGTGCCCCACACCCACAACTTCGCCCTG
GCCAGC
Con esta información de secuencia a mano, la región codificante de cadena pesada de IgG1 completa para el anticuerpo anti-CD19 humano hBU12 con extensión del terminal C, que comprende el dominio N-inteína de la inteína dividida Ssp GyrB 11, seguido de una etiqueta 6xHis y una etiqueta strepII, se puede diseñar como se divulga en la SEQ ID N<o>17 a continuación:
ATGAATTTTGGACTGAGGCTGATTTTCCTGGTGCTGACCCTGAAAGGCGTCCAGTGTCAGGTTCAGCTGCAAGA
GTCTGGCCCTGGGTTGGTTAAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTACTGTGTCTGGGGGTTCAATCAGCA
CTTCTGGTATGGGTGTAGGCTGGATTAGGCAGCACCCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGATTGGACACATTTGGTGG
GAT GAT GAC AAGAGAT AT AAC C CAG C C C T GAAGAG CAGAGT GACAAT CTCT GT GGATAC CTCCAAGAACCAGTT
TAGCCTCAAGCTGTCCAGTGTGACAGCTGCAGATACTGCTGTCTACTACTGTGCTAGAATGGAACTTTGGTCCT
ACTATTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCCTTGTCACAGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCTGTCTTC
CCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCTGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCC
TGAACCTGTGACAGTGTCCTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGT
CCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGC
AACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACAC
ATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAfiGGACA
CCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAG
TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCAC
GTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCT
CCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTG
TACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTA
TCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGC
TGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTC
TTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAA
ATGCTTCAGCGGCGACACCCTGGTGGCCCTGACCGACGGCAGAAGCGTGAGCTTCGAGCAGCTGGTGGAGGAGG
AGAAGCAGGGCAAGCAGAACTTCTGCTACACCATCAGACACGACGGCAGCATCGGCGTGGAGAAGAT CATCAAC
GCCAGAAAGACCAAGACCAACGCCAAGGTGATCAAGGTGACCCTGGACAACGGCGAGAGCATCATCTGCACCCC
CGACCACAAGTTCATGCTGAGAGACGGCAGCTACAAGTGCGCCATGGACCTGACCCTGGACGACAGCCTGATGC
CCCTGCACAGAAAGATCAGCACCACCGAGGACAGCGGCCACATGGAGGCCGTGCTGAACTACAACCACAGAATC
GTGAACATCGAGGCCGTGAGCGAGACCATCGACGTGTACGACATCGAGGTGCCCCACACCCACAACTTCGCCCT
GGCCAGCCACCATCACCATCACCATGGCTGGAGCCACCCCCAGTTCGAGAAGTAG
Esto se traduce en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 18 (los aminoácidos del dominio N-inteína están subrayados, la etiqueta 6xHis y la etiqueta strepII están sombreadas):
MNFGLRLIFLVLTLKGVQCQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISTSGMGVGWIRQHPGKGLEWIGHIWW
DDDKRYNPALKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARMELWSYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVF
PLA PSSKSTSG G TA A LG CLVKD YFPEPVTVSW N SGA LTSG VH TFPA VLQ SSG LYSLSSW TVPSSSLGTQ TYIC
NVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDPEVK
FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV
YTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV
FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKCFSGDTLVALTDGRSVSFEQLVEEEKQ GKQNFCYTIRH DGSIGVEKIIN
ARKTKTNAKVIKVTLDNGESIICTPDHKFMLRDGSYKCAMDLTLDDSLMPLHRKISTTEDSGHMEAVLNYNHRI
VMIEAVSETIDVYDIEVPHTHNFALASHHHHHHGWSHPQFEK •
De igual manera, se puede diseñar una región codificante de cadena ligera kappa de IgG1 completa para el anticuerpo anti-CD19 humano hBU12 con extensión del terminal C, que comprende el dominio N-inteína de la inteína dividida Ssp GyrB 11, seguido de una etiqueta 6xHis y una etiqueta strepII, como se divulga en la SEQ ID NO 19 a continuación:
ATGAATTTTGGACTGAGGCTGATTTTCCTGGTGCTGACCCTGAAAGGCGTCCAGTGTGACATTGTGCTGACCCA
ATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATT
TTGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAAGTCCTCATCTATGCTGCA
TCCAATCTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCA
TCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCGTGGACGTTCGGTGGAG
GCACCAAGCTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTG
AAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGT
GGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCC
TCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAG
GGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGCTTCAGCGGCGACACCCTGGTGGCCCTGAC
CGACGGCAGAAGCGTGAGCTTCGAGCAGCTGGTGGAGGAGGAGAAGCAGGGCAAGCAGAACTTCTGCTACACCA
TCAGACACGACGGCAGCATCGGCGTGGAGAAGATCATCAACGCCAGAAAGACCAAGACCAACGCCAAGGTGATC
AAGGTGACCCTGGACAACGGCGAGAGCATCATCTGCACCCCCGACCACAAGTTCATGCTGAGAGACGGCAGCTA
CAAGTGCGCCATGGACCTGACCCTGGACGACAGCCTGATGCCCCTGCACAGAAAGATCAGCACCACCGAGGACA
GCGGCCACATGGAGGCCGTGCTGAACTACAACCACAGAATCGTGAACATCGAGGCCGTGAGCGAGACCATCGAC
GTGTACGACATCGAGGTGCCCCACACCCACAACTTCGCCCTGGCCAGCCACCATCACCATCACCATGGCTGGAG
CCACCCCCAGTTCGAGAAGTAG
Esto se traduce en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 20 (los aminoácidos del dominio N-inteína están subrayados, la etiqueta 6xHis y la etiqueta strepII están sombreadas):
MNFGLRLIFLVLTLKGVQCDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAA
SN LESG IPARFSGSGSGTDFTLN IH PVEEEDAATYYCQQSN EDPW TFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQL
KSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ
GLSSPVTKSFNRGECFSGDTLVALTDGRSVSFEQLVEEEKQGKQNFCYTIRHDGSIGVEKIIN ARKTKTNAKVI
KVTLDNGESIICTPDHKFMLRDGSYKCAMDLTLDDSLMPLHRKISTTEDSGHMEAVLNYNHRIVNIEAVSETID
VYDIEVPHTHNFALASHHHHHHGWSHPQFEK»
Las regiones codificantes para las cadenas pesadas y ligeras modificadas con N-inteína del anticuerpo específico anti-CD19 humano, como se divulga en las SEQ ID NOs 17 y 19, respectivamente, se pueden sintetizar entonces con sitios de enzimas de restricción flanqueantes (por ejemplo, HindIII y NotI) de modo que se puedan clonar en un vector de expresión de mamíferos estándar, tal como pCDNA3.1-hygro (+) (Invitrogen), mediante métodos de biología molecular estándar conocidos en la técnica.
La secuencia de ADN completa del vector de expresión de la cadena pCDNA3.1-hygro (+)-IgH para el anticuerpo anti-CD19 humano hBU12 etiquetado con N-inteína es la siguiente:
SEQ ID NO 21 (región codificante de la cadena pesada V<h>-C<h>de IgG1 humana para hBU12 con el dominio N-inteína del terminal C de la inteína dividida Ssp GyrB S11, seguida de la etiqueta 6xHis, etiqueta strepII (subrayada) y sitios de clonación HindIII y NotI (sombreados)):
GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGC
CAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCA
AGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCA
GATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCA
TATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATT
GACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATT
TACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGAC
GGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGT
ATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCAC
GGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCA
AAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAG
AGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCC
AAGCTGGCTAGCGTTTAAACTT%&GffffgCCATGAATTTTGGACTGAGGCTGATTTTCCTGGTGCTGACCCTGAA
AGGCGTCCAGTGTCAGGTTCAGCTGCAAGAGTCTGGCCCTGGGTTGGTTAAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGA
CTTGTACTGTGTCTGGGGGTTCAATCAGCACTTCTGGTATGGGTGTAGGCTGGATTAGGCAGCACCCAGGGAAG
GGTCTGGAGTGGATTGGACACATTTGGTGGGATGATGACAAGAGATATAACCCAGCCCTGAAGAGCAGAGTGAC
AATCTCTGTGGATACCTCCAAGAACCAGTTTAGCCTCAAGCTGTCCAGTGTGACAGCTGCAGATACTGCTGTCT
ACTACTGTGCTAGAATGGAACTTTGGTCCTACTATTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCCTTGTCACAGTCTCC
TCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCTGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCTGC
CCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCTGAACCTGTGACAGTGTCCTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCG
GCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCC
AGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGT
TGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAG
TCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTG
GACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGAC
AAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGC
TGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAA
GCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGT
CAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGG
AGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTG
GACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACAC
ACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGCTTCAGCGGCGACACCCTGGTGGCCCTGACCGACGGCAGAA
GCGTGAGCTTCGAGCAGCTGGTGGAGGAGGAGAAGCAGGGCAAGCAGAACTTCTGCTACACCATCAGACACGAC
G G CAG CAT C G G C GT G GAGAAGAT CAT CAAC GC CAGAAAGAC CAAGAC CAAC G C CAAG GT GAT CAAG GT GAC C C T
GGACAACGGCGAGAGCATCATCTGCACCCCCGACCACAAGTTCATGCTGAGAGACGGCAGCTACAAGTGCGCCA
TGGACCTGACCCTGGACGACAGCCTGATGCCCCTGCACAGAAAGATCAGCACCACCGAGGACAGCGGCCACATG
GAGGCCGTGCTGAACTACAACCACAGAATCGTGAACATCGAGGCCGTGAGCGAGACCATCGACGTGTACGACAT
CGAGGTGCCCCACACCCACAACTTCGCCCTGGCCAGCCACCATCACCATCACCATGGCTGGAGCCACCCCCAGT
TCGAGAAGTAGGGGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAG
TTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTT
CCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAG
GACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGC
GGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGG
TGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTT
CTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGCATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTT
ACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTT
TTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCT
ATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGGGGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTA
ACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGG
CAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCA
GGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCC
CCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGG
CCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTC
CCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAGCACGTGATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGT
CGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTG
CTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGAT
CGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGA
GAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCG
CTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGC
CCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGT
GTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTT
GGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAAT
GGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTT
CTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAG
GATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAAT
TTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTAC
ACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGAC
GCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGCACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAA
AGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTT
CTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAA
ATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATA
CCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCAC
AATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACAT
TAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAA
CGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGT
TCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAG
GAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCAT
AGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATA
AAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACC
TGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAG
GTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTA
TCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAG
CGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTT
GGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCAC
CGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTT
TGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCA
AAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAAC
TTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAG
TTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATA
CCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAG
TGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAG
TTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCA
TTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTT
CGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATT
CTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAG
TGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAA
AGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGA
TGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACA
GGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCA
ATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAAC
AAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC
La secuencia de ADN completa del vector de expresión de la cadena pCDNA3.1-hygro (+)-IgL para el anticuerpo anti-CD19 humano hBU12 etiquetado con el dominio N-inteína Ssp GyrB S11 será la siguiente: SEQ ID NO 22 (región codificante de la cadena ligera kappa V<l>-C<l>de IgG1 humana para hBU12 con dominio N-inteína Ssp GyrB S11 del terminal C, etiqueta 6xHis y una etiqueta strepII subrayadas, y sitios de clonación HindIII y NotI sombreados):
GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGC
CAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCA
AGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCA
GATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCA
TATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATT
GACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATT
T AC G GT AAAC T G C C CAC T T GGCAGTACAT CAAGT GT AT CAT AT G C CAAGT AC G C C C C C TAT T GAC GT CAAT GAC
GGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGT
ATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCAC
GGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCA
AAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAG
AGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCC
<a a g c t g g c t a g c g t t t a a a c t t>&<a g c t>T<c c a t g a a t t t t g g a c t g a g g c t g a t t t t c c t g g t g c t g a c c c t g a a>
AGGCGTCCAGTGTGACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCA
TCTCCTGCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTTTGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTACCAACAGAAACCAGGA
CAGCCACCCAAAGTCCTCATCTATGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAGTGG
GTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAA
GTAATGAGGATCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTC
TTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTA
TCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAG
AGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACAC
AAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTG
CTTCAGCGGCGACACCCTGGTGGCCCTGACCGACGGCAGAAGCGTGAGCTTCGAGCAGCTGGTGGAGGAGGAGA
AGCAGGGCAAGCAGAACTTCTGCTACACCATCAGACACGACGGCAGCATCGGCGTGGAGAAGATCATCAACGCC
AGAAAGACCAAGACCAACGCCAAGGTGATCAAGGTGACCCTGGACAACGGCGAGAGCATCATCTGCACCCCCGA
CCACAAGTTCATGCTGAGAGACGGCAGCTACAAGTGCGCCATGGACCTGACCCTGGACGACAGCCTGATGCCCC
TGCACAGAAAGATCAGCACCACCGAGGACAGCGGCCACATGGAGGCCGTGCTGAACTACAACCACAGAATCGTG
AACATCGAGGCCGTGAGCGAGACCATCGACGTGTACGACATCGAGGTGCCCCACACCCACAACTTCGCCCTGGC
CAGCCACCATCACCATCACCATGGCTGGAGCCACCCCCAGTTCGAGAAGTAGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGG
CCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGT
GCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTC
TGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGC
AGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCC
CCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCA
GCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCT
CTAAATCGGGGCATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGG
TGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTA
ATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATT
TTGGGGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAAT
GTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATT
AGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAG
TCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCC
CCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGT
GAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGAT
CAGCACGTGATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGT
CTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATG
TCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCG
CTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACA
GGGTGTCACGTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATG
CGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACT
ACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGT
CAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCG
TGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAG
GCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCA
GCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCA
TTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGC
GACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGAC
CGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGC
ACGTGCTACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCC
GGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTA
TAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTG
GTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCA
TGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAA
GTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGT
CGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGC
TCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAA
GGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGG
CCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAAT
CGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCT
CGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGC
TTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAA
CCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTT
ATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGA
AGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTC
GGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCA
GCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGA
ACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAA
AAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGA
GGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGA
TACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTA
TCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTC
TATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTA
CAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTT
ACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGC
CGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTT
CTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCG
TCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCG
AAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAG
CATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGG
GCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCT
CAT GAG C G GAT ACAT AT T T GAAT GT AT T T AGAAAAATAAACAAATAG G G GT T C C GC GCACAT T T C C C C GAAAAG
TGCCACCTGACGTC
Estos vectores de expresión basados en pcDNA3.1-hygro(+) divulgados en las SEQ ID NOs 21 y 22 permiten, tras la transfección en células de mamíferos, tal como, por ejemplo, pero sin limitarse a, células CHO, que normalmente se utilizan para la expresión de anticuerpos recombinantes, la expresión del anticuerpo humanizado hBU12 específico anti-CD19 humano con el dominio N-inteína del terminal C fusionado, seguido de una etiqueta 6xHis y una etiqueta strepII en las cadenas IgH e IgL.
Ejemplo 3:Clonación y expresión de la enzima Sortasa A recombinante deStaphylococcus aureus.
El ORF de la Sortasa A deStaphylococcus aureusse publica en el GenBank y se puede encontrar en la entrada: AF162687.1. La secuencia de aa en ese registro de lecturas se muestra como la SEQ ID NO 23 (secuencia de aminoácidos de la Sortasa A deStaphylococcus aureus):
MKKWTNRLMTIAGWLILVAAYLFAKPHIDNYLHDKDKDEKIEQYDKNVKEQASKDKKQQAKPQIPKDKSKVAG
Y I E I PDADI KEPVYPGPATPEQLNRGVS FAEENESLDDQNISIAGHTFIDRPNYQFTNLKAAKKGSMVYFKVGN
ETRKYKMTSIRDVKPTDVGVLDEQKGKDKQLTLITCDDYNEKTGVWEKRKIFVATEVK
La secuencia de nucleótidos correspondiente en esta entrada del GenBank se proporciona como la SEQ ID NO 24:
A T G A A A A A A T G G A C A A A T C G A T T A A T G A C A A T C G C T G G T G T G G T A C T T A T C C T A G T G G C A G C A T A T T T G T T T G C
TAAA C C A C A TA T C G A TA A T T A T C T T C A C G A TA A A G A TA A A G A T G A A A A G A TT G A A C A A TA T GATA AAA AT GT AA
A A G A A C A G G C G A G TA A A G A TA A A A A G C A G C A A G C TA A A C C TC A A A TTC C G A A A G A TA A A TC G A A A G TG G C A G G C
T A T A T T G A A A T T C C A G A T G C T G A T A T T A A A G A A C C A G T A T A T C C A G G A C C A G C A A C A C C T G A A C A A T T A A A T A G
A G G T G T A A G C T T T G C A G A A G A A A A T G A A T C A C T A G A T G A T C A A A A T A T T T C A A T T G C A G G A C A C A C T T T C A T T G
A C C G T C C G A A C T A T C A A TT T A C A A A T C T TA A A G C A G C C A A A A A A G G T A G T A T G G T G T A C T T T A A A G T T G G TA A T
G A A A C A C G TA A G T A T A A A A T G A C A A G T A TA A G A G A T G T TA A G C C TA C A G A TG TA G G A G TT C T A G A TG A A C A A A A
A G G T A A A G A T A A A C A A T T A A C A T T A A T T A C T T G T G A T G A T T A C A A T G A A A A G A C A G G C G T T T G G G A A A A A C G T A
A A A T C T T T G TA G C T A CA G A A G T C A A A TA A
La información técnica con respecto a la expresión de un fragmento enzimáticamente activo de la Sortasa A recombinante en E. coli, que comprende los aminoácidos 60-205 con etiqueta 6xHis, se divulga en la referencia WO2007/108013A2. La región codificante para una versión etiquetada 6xHis de Sortasa A deStaphylococcus aureus(aa60-205) se proporciona a continuación como la SEQ ID NO 25:
A T G C A A G C T A A A C C T C A A A T T C C G A A A G A T A A A T C G A A A G T G G C A G G C T A T A T T G A A A T T C C A G A T G C T G A T A T
TA A A G A A C C A G TA TA TC C A G G A C C A G C A A C A C C TG A A C A A T TA A A T A G A G G T G T A A G C T TT G C A G A A G A A A A T G
A A T C A C T A G A T G A T C A A A A T A T T T C A A T T G C A G G A C A C A C T T T C A T T G A C C G T C C G A A C T A T C A A T T T A C A A A T
C T T A A A G C A G C C A A A A A A G G T A G TA T G G T G T A C T TT A A A G T TG G TA A TG A A A C A C G T A A G TA TA A A A TG A C A A G
T A T A A G A G A T G T T A A G C C TA C A G A TG TA G G A G TT C T A G A TG A A C A A A A A G G TA A A G A T A A A C A A T TA A C A T T A A
T T A C T T G T G A T G A T T A C A A T G A A A A G A C A G G C G T T T G G G A A A A A C G T A A A A T C T T T G T A G C T A C A G A A G T C A A A
C A C C A T C A C C A T C A C C A T T A A
Esto se traduce a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO 26:
MQAKPQIPKDKSKVAGYIEIPDADIKEPVYPGPATPEQLNRGVSFAEEN ESLDDQNISIAGHTFIDRPN YQFTN
LKAAKKGSMVYFKVGNETRKYKMTSIRDVKPTDVGVLDEQKGKDKQLTLITCDDYNEKTGVWEKRKIFVATEVK
HHHHHH•
La región codificante para el fragmento de Sortasa A etiquetada con 6xHis deStaphylococcus aureus,como se proporciona en la SEQ ID NO 25, se puede clonar en un vector de expresión bacteriano estándar, como por ejemplo pET29 (Novagen), para transformar la cepa BL21(DE3) deE. coli(Novagen) y generar un clon deE. colique puede utilizarse para la producción bacteriana de Sortasa A recombinante de acuerdo con métodos estándar conocidos en la técnica. En breve,E. coliBL21(DE3) transformada con plásmidos de expresión pET29 para Sortasa A se puede cultivar a 37 °C en medio LB con 50 pg/mL de kanamicina hasta alcanzar una OD<600>= 0.5-0.8. A continuación, se puede añadir IPTG a una concentración final de 0.4 mM y se puede inducir la expresión de la proteína durante tres horas a 30 °C. Las células se pueden recolectar por centrifugación y resuspender en tampón de lisis (Tris 50 mM pH 8.0, NaCl 300 mM suplementado con MgCl2 1 mM, 2 unidades/ml de ADNasa I (NEB), aprotinina 260 nM, leupeptina 1.2 pM y PMSF 1 mM). Luego, las células pueden lisarse mediante sonicación y el sobrenadante clarificado puede purificarse en agarosa Ni-NTA siguiendo las instrucciones del fabricante.
Las fracciones con una pureza >90 %, de acuerdo con lo determinado por SDS-PAGE, pueden luego consolidarse y dializarse contra solución salina tamponada con Tris (Tris 25 mM pH 7.5, NaCl 150 mM), y la concentración de enzima puede calcularse a partir de la A<280>medida utilizando el coeficiente de extinción publicado de 17,420 M'1 cm-1. Se ha seguido el protocolo mencionado anteriormente y se han obtenido aproximadamente 20 mg de un fragmento enzimáticamente activo recombinante > 90 % puro (de aproximadamente 17 kD) de Sortasa A deStaphylococcus aureusy el análisis de la proteína recombinante por SDS-PAGE y transferencia Western se describe en la Figura 7.
Ejemplo 4:Expresión y purificación de anticuerpos recombinantes etiquetados con sortasa o N-inteína en células CHO (ejemplo no de acuerdo con la presente invención)
a.) Expresión de células CHO: La expresión de anticuerpos IgG1 recombinantes a partir de las construcciones de expresión divulgadas en los Ejemplos 2 y 3 se puede lograr mediante transfección transitoria utilizando, por ejemplo, sistemas de expresión de CHO disponibles comercialmente, como el sistema de CHO FreeStyle de Invitrogen siguiendo las instrucciones del manual de CHO FreeStyle. En resumen, aproximadamente 1 día antes de la transfección, se sembrarán células CHO a razón de 5-6 x 106 células/ml en medio de CHO FreeStyle en matraces agitadores para expandirlas a 120 rpm en un agitador orbital a 37 °C en una incubadora humidificada con una atmósfera al 7.5 % de CO<2>. Al día siguiente se pueden transfectar las células, cuando alcancen una densidad de 1.2-1.5x106/ml. Luego, las células deben diluirse a 1*10® células/ml. Luego se deben agregar 30 ml de dicha suspensión celular a un matraz de agitación de 125 ml y se agregan 40 pg de ADN plasmídico de expresión de IgH e IgL mixto 1:1 a 600 pl de medio OptiPro SF (Invitrogen). Al mismo tiempo, se deben agregar 40 pl de reactivo de transfección FreeStyle MAX a 600 pl de medio OptiPro SF, y ambas muestras deben mezclarse suavemente e incubarse durante 10 minutos a temperatura ambiente para permitir que se formen complejos de reactivo de transfección de ADN. Luego, la mezcla de reactivo de transfección de ADN se puede agregar lentamente al cultivo anterior de 125 ml de células CHO y las células transfectadas se cultivan durante hasta 6 días a 120 rpm en un agitador orbital a 37 °C en una incubadora humidificada con una atmósfera al 7.5 % de CO<2>. Posteriormente, se puede recolectar el sobrenadante del cultivo celular y analizarlo para determinar el título de expresión de anticuerpos mediante métodos apropiados conocidos en la técnica (ELISA, Luminex, etc.).
b.) Purificación de la proteína A: La purificación de la proteína A de los anticuerpos recombinantes del sobrenadante de células CHO se puede realizar con columnas de sefarosa de proteína A disponibles comercialmente (Thermo Fisher, Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
En resumen, el sobrenadante del cultivo celular aclarado se pasa por una columna de proteína A de tamaño y capacidad adecuados equilibrada con PBS. El medio residual se lava con PBS y la IgG finalmente unida se puede eluir con un tampón de pH bajo, como ácido cítrico 0.1 M-NaOH, pH 3.0. La IgG eluida debe neutralizarse inmediatamente con 1/10 del volumen de Tris/Cl 1 mM, pH 7.4. Las fracciones combinadas que contienen IgG pueden luego dializarse contra PBS durante la noche a 4 °C.
Los protocolos proporcionados en el Ejemplo 4 proporcionan al experto en la materia la instrucción para producir cantidades suficientes de anticuerpos recombinantes purificados a partir de las construcciones divulgadas en los Ejemplos 1 y 2.
Ejemplo 5:Generación de anticuerpos monoclonales conjugados con carga útil tóxica MMAE en el extremo terminal C, específicamente en el sitio, mediante transpeptidación mediada por sortasa e inteína dividida
La toxina monometil auristatina A acoplada a un tramo de glicina de 5 aminoácidos y un péptido de inteína dividido SSp GyrB S11 C-int de 6 aminoácidos de acuerdo con las fórmulas proporcionadas a continuación, se puede solicitar de manera personalizada a CRO de química calificadas.
Me = grupo metilo (-CH<3>)
G = residuo de aminoácido glicina
Fórmula 2: MMAE con enlazador vcPAB, modificada con dominio de C-inteína de 6 aminoácidos GVFVHN y péptido C-exteína SAGSGK de 6 aminoácidos
Me = grupo metilo (-CH<3>)
GVFVHNSAGSGK = tramo de Gly-Val-Phe-Val-His-Asn-Ser-Ala-Gly-Ser-Gly-Lys
a.) Conjugación de carga útil de MMAE tóxica de anticuerpos IgG recombinantes etiquetados con el motivo de Sortasa A LPETG
La conjugación de la carga tóxica de MMAE modificada con 5 aminoácidos de glicina con el anticuerpo IgG1 etiquetado con Sortasa A LPETG (que se puede producir siguiendo los Ejemplos 1 y 4) se puede lograr mezclando proporciones apropiadas del anticuerpo IgG1 etiquetado con LPETG con la toxina MMAE modificada con glicina divulgada en la Fórmula 1 (por ejemplo, en una proporción de 1:1 y una concentración de 50|jM) y con Sortasa A recombinante (producción descrita en el Ejemplo 3) (por ejemplo, a una concentración de 5<j>M), y utilizando un tampón de incubación fisiológico, como por ejemplo; Tris/Cl 5 mM, NaCl 15 mM, CaCl<2>6 mM, pH 8.0 e incubando a 37 °C a 40 °C durante un mínimo de 2 horas.
La eficacia de la conjugación se puede controlar analizando la ausencia de la etiqueta 6xHis y/o la etiqueta strepII después de detener la reacción, por ejemplo, mediante análisis de transferencia Western o ELISA con anticuerpos anti-etiqueta His y/o anti-etiqueta strepII.
El producto completamente conjugado se puede enriquecer mediante columnas de níquel-NTA o mediante la unión de columnas de estreptactina, que se unen a la etiqueta 6xHis o a la etiqueta strepII, respectivamente, que solo pueden estar presentes en el sustrato de IgG1 que no ha reaccionado completamente. El conjugado final de carga útil de IgG puede eventualmente purificarse usando la purificación de proteína A como se describió anteriormente.
b.) Conjugación de carga útil de MMAE tóxica de anticuerpos IgG recombinantes etiquetados con N-inteína SSp GyrB S11 (no de acuerdo con la presente invención)
La conjugación de la carga tóxica de MMAE modificada con el aminoácido C-inteína Ssp GyrB S11 con el anticuerpo IgG1 etiquetado con N-inteína (que se puede producir siguiendo los Ejemplos 2 y 4) se puede lograr mezclando proporciones apropiadas de anticuerpo IgG1 etiquetado con N-inteína con la toxina MMAE modificada con el aminoácido C-inteína divulgada en la Fórmula 2 (por ejemplo, en una proporción de 1:10 o 1:25 a una concentración de 5 pM del anticuerpo IgG) utilizando un tampón de incubación fisiológico, como por ejemplo; Tris/Cl 20 mM, NaCl 250 mM, EDTA 1 mM, pH 8.5 e incubando a temperatura ambiente o a 37 °C durante un mínimo de 4 horas.
La eficacia de la conjugación se puede controlar analizando la ausencia de la etiqueta 6xHis y/o la etiqueta strepII después de detener la reacción, por ejemplo, mediante análisis de transferencia Western o ELISA con anticuerpos anti-etiqueta His y/o anti-etiqueta strepII.
El producto completamente conjugado se puede enriquecer mediante columnas de níquel-NTA o mediante la unión de columnas de estreptactina, que se unen a la etiqueta 6xHis o a la etiqueta strepII, respectivamente, que solo pueden estar presentes en el sustrato de IgG1 que no ha reaccionado completamente. El conjugado final de carga útil de IgG puede eventualmente purificarse usando la purificación de proteína A como se describió anteriormente.
En resumen, los Ejemplos 1-5 divulgados anteriormente permiten a una persona experta en la materia practicar la invención de conjugar enzimáticamente una carga útil tóxica específicamente en el sitio en el terminal C ya sea usando transpeptidación mediada por Sortasa A o mediada por inteína dividida.
Ejemplo 6:Producción de Trastuzumab con enlazador GS (glicina-serina) del terminal C, motivo de Sortasa LPETG y etiquetas de purificación por afinidad 6x-His y Strep II adicionales en la cadena pesada o ligera
Las construcciones de expresión de anticuerpos que codifican cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo monoclonal Trastuzumab (Tras), ya sea sin etiquetar (SEQ ID NOs: 31-34) o etiquetadas en el terminal C con un enlazador GS (glicina-serina), una etiqueta de Sortasa LPETG, una etiqueta 6xHis y una etiqueta Strep II (SEQ ID NOs: 35-38) se generaron esencialmente como se describe en el Ejemplo 1. Utilizando estas construcciones de expresión, se produjeron Tras-HC-GS-LHS y Tras-LC-GS-LHS (HC=cadena pesada, LC=cadena ligera, GS=glicina-serina, LHS= etiqueta LPETG etiqueta 6xHis etiqueta strepII) en células CHO mediante cotransfección de las construcciones de expresión correspondientes. Tras-HC-GS-LHS es una variante de Trastuzumab con una cadena ligera no modificada (SEQ ID NOs: 35 - 36) y una cadena pesada etiquetada en el terminal C con un enlazador GS (glicina-serina), un motivo de Sortasa LPETG, una etiqueta 6xHis y una etiqueta strepII (SEQ ID NOs: 33 - 34). Tras-LC-GS-LHS es una variante de Trastuzumab con una cadena pesada no modificada (SEQ ID NOs: 31 - 32) y una cadena ligera etiquetada en el terminal C con un enlazador GS, un motivo de Sortasa LPETG, una etiqueta 6xHis y una etiqueta strepII (SEQ ID NOs: 37 - 38). La transfección de células CHO y la purificación por afinidad de anticuerpos mediante cromatografía de proteína A-sefarosa se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo 4.
Ejemplo 7:Conjugación mediada por Sortasa A de la cadena pesada o ligera de trastuzumab con la toxina DM1 modificada con Gly5
Las reacciones de conjugación que contienen toxina DM1 modificada con Gly<5>(ordenada a Concortis, San Diego, CA, EE. UU., estructura: ver Figura 14 a.) y un fragmento de Sortasa A recombinante de 17 kD deStaphylococcus aureus(ver Ejemplo 3) se llevaron a cabo con 10.5 mg de cada anticuerpo monoclonal (mAb) (ver Ejemplo 6) en tampón Sortasa 1x (Tris-HCl 25 mM, pH 8.2; NaCl 150 mM; CaCh 7.5 mM), como se muestra en la Tabla II, a continuación. La reacción de conjugación Tras-HC-GS-LHS se incubó a 25 °C durante 2 h; la reacción de conjugación Tras-LC-GS-LHS se incubó a 25 °C durante 18 h. Cada mezcla de reacción se pasó luego por columnas de sefarosa Strep-Tactin® (IBA Life-Sciences, Gottingen, Alemania). Para ello, se empacó por gravedad 1 ml de agarosa Strep-Tactin en una columna con frita y se equilibró con 2 volúmenes de columna de tampón de equilibrio (Tris-HCl 100 mM, pH 8.0; NaCl 150 mM; EDTA 1 mM). Cada mezcla de conjugación se pasó dos veces por la misma columna utilizando flujo por gravedad (para aumentar el tiempo de residencia en la resina). La resina se lavó con un volumen de columna adicional de tampón de equilibrio para maximizar el rendimiento del conjugado y luego el conjunto se aplicó inmediatamente a una columna de proteína A. Para ello, se equilibró una columna HiTrap de Proteína A de 1 ml con 10 volúmenes de columna de tampón (fosfato de sodio 25 mM, pH 7.5). Luego, cada reacción de conjugación se aplicó a una columna equilibrada y la columna se lavó con otros 5 volúmenes de tampón. El conjugado unido se eluyó con 5 volúmenes de columna de tampón de elución (ácido succínico 0.1 M, pH 2.8) y se recolectaron fracciones de 1 volumen de columna (en tubos que contenían 25 % v/v de base Tris 1 M para neutralizar el ácido) y se analizaron para determinar el contenido de proteínas. Las fracciones que contenían proteínas se agruparon y formularon mediante cromatografía en columna G25. Para ello se utilizaron columnas NAP 25 de tamaño apropiado para cada escala de fabricación para formular los conjugados para almacenamiento a largo plazo. Las columnas se equilibraron, cargaron y eluyeron con de succinato de sodio 10 mM pH 5.0, 100 mg/ml de trehalosa, 0.1 % p/v de polisorbato 20 (tampón de formulación para Kadcyla® (T-DM1), comercializado por Roche/Genentech) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los rendimientos del conjugado de DM1 Tras-HC-GS-LHS y Tras-LC-GS-LHS fueron, respectivamente, 8.0 mg (76.2 %) y 5.9 mg (56.2 %). Las mayores pérdidas de proceso ocurrieron durante la purificación por proteína A y G25, probablemente como resultado del corte máximo para asegurar la máxima concentración del producto para cada paso o almacenamiento posterior.
Tabla 2: Condiciones de conjugación para Tras-HC-GS-LHS y Tras-LC-GS-LHS:
La carga del fármaco se evaluó mediante cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) y se realizó en una columna TOSOH Butil-NPR de 4.6 mm x 3.5 cm, 2.5 pm que funcionó a 0.8 ml/min con un gradiente lineal de 12 minutos entre A - (N H ^S O<4>1.5 M, NaPi 25 mM, pH = 6.95 ± 0.05 y B - NaPi 25 mM al 75 %, pH = 6.95 ± 0.05, IPAal 25 %. Los perfiles de HIC revelaron que tanto para Tras-HC-GS-LHS como para Tras-LC-GS-LHS no quedaba ningún mAb no conjugado detectable y una fracción importante de cada mAb estaba cargada con 2 fármacos (ver la Figura 8).
Ejemplo 8:Ensayo de toxicidadin vitrocon conjugados de Trastuzumab-DM1 mediado por Sortasa A
Se investigó la citotoxicidad de Tras-HC-GS-LHS conjugado con DM1-Sortasa A y Tras-LC-GS-LHS conjugado con DM1-Sortasa Ay se comparó con Kadcyla® (Roche/Genentech) utilizando células SKBR3, una línea celular de cáncer de mama humano que sobreexpresa el antígeno afín de trastuzumab (Tras) HER-2/neu, y células T47D-5R, una línea celular de cáncer de mama que expresa naturalmente niveles bajos de HER-2/neu, diseñada para estar desprovista de HER-2/neu en la superficie celular (Graus-Porta et al. (1995)). Las células se sembraron en placas de 96 pocillos en 100 pl de DMEM completo (10000 células por pocillo). Después de un día de incubación, se extrajeron cuidadosamente 50 pl de medio de cada pocillo y se reemplazaron por 50 pl de diluciones seriadas de 3.5 veces de cada ADC en DMEM completo, lo que dio como resultado concentraciones de ADC que variaron de 20 pg/ml a 0.25 ng/ml. Cada dilución se realizó por duplicado o triplicado. Después de 3 días adicionales de incubación a 37 °C en una incubadora humidificada con atmósfera al 5 % de CO<2>, las placas se retiraron de la incubadora y se equilibraron a temperatura ambiente. Después de aproximadamente 30 minutos, se añadieron 100 pl de CellTiter-Glo® solución luminiscente (Promega, Cat. No. G7570) a cada pocillo y, después de agitar las placas a 450 rpm durante 5 minutos seguido de una incubación de 10 minutos sin agitación, se midió la luminiscencia en un Tecan Infinity F200 con un tiempo de integración de 1 segundo por pocillo. Los tres ADC fueron altamente citotóxicos para la línea celular de cáncer de mama SKBR3 con sobreexpresión de HER-2/neu, pero no para la línea celular de cáncer de mama T47D-5R negativa para HER-2/neu (ver la Figura 9). Los valores de EC<50>para la línea celular de cáncer de mama SKBR3 positiva para Her-2/neu fueron: Kadcyla®, 32.4 ng/ml; Tras-HC-GS-LHS conjugado con DM1, 45.6 ng/ml; Tras-LC-GS-LHS, 51.4 ng/ml y, por lo tanto, se encuentran dentro de un rango similar de potencia en el Experimento de muerte de células tumoralesin vitro. Por el contrario, no se detectó toxicidad celular específica con la línea celular de cáncer de mama T47D-5R negativa para Her-2/neu, lo que demuestra la equivalencia funcional de Sortasa A, ADC conjugado enzimáticamente versus ADC conjugado químicamente tradicional, cuando la comparación implica el mismo anticuerpo dirigido y la misma toxina (DM1) (Fig. 9). Sin embargo, parece que la proporción fármaco a anticuerpo más baja de aproximadamente 1.80 (deducida de la integración de los picos DAR1 y DAR2 en la Fig.<8>) para los ADC conjugados con Sortasa A Tras-HC-GS-LHS y Tras-LC-GS-LHS, en comparación con la DAR de aproximadamente 3-4, informada para Kadcyla® no se traduce en una citotoxicidad celular proporcionalmente diferente en ensayosin vitrode muerte de células tumorales (Fig. 9). Este hallazgo inesperado puede ser el resultado de una conjugación toxina-anticuerpo más definida y específica del sitio mediada por la Sortasa A en comparación con la Kadcyla® menos definida, conjugada químicamente de forma estocástica.
Ejemplo 9:Optimización de la sincronización de la conjugación de la carga útil de la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo mediada por Sortasa A mediante la variación de la longitud del espaciador peptídico insertado entre el extremo terminal C de la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo y el motivo de reconocimiento de Sortasa A
Se investigó la influencia de la longitud del espaciador peptídico ubicado entre el terminal C de la cadena pesada o ligera del anticuerpo y el motivo de reconocimiento de la Sortasa A LPETG. Para ello, se utilizan construcciones de expresión de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpos que codifican cadenas pesadas y ligeras del mAb Ac10 quimérico específico de CD30 (secuencia de HC derivada del documento US 2008213289A1, Seq1, secuencia LC derivada del documento US 2008213289A1, Seq9), modificado en el terminal C con secuencias que comprenden o no un espaciador GS (glicina-serina) de 2 aminoácidos, y que comprende un motivo de reconocimiento de Sortasa A LPETG y una etiqueta de purificación de strep-II (s Eq ID NOs: 39 - 46), se han clonado esencialmente de acuerdo con las instrucciones divulgadas en el Ejemplo 1. Utilizando estas construcciones de expresión, se produjeron los mAb Ac10-HC-GS-LHS/LC-GS-LHS y Ac10-HC-LS/LC-LS en células CHO mediante cotransfección de los plásmidos correspondientes. Ac10-HC-GS-LHS/LC-GS-LHS es una variante de Ac10 con cadenas pesadas y ligeras modificadas en los terminales C de cada HC y LC con un espaciador de péptido GS, un motivo de Sortasa A LPETG, una etiqueta<6>xHis y una etiqueta strep-II (SEQ ID NOs: 39-42; Tabla 3). Ac10-HC-LS/LC-LS es una variante de Ac10 con cadenas pesadas y ligeras modificadas en los terminales C con motivo de Sortasa LPETG y etiqueta strep-II sin el enlazador GS de 2 péptidos (SEQ ID NOs: 43 - 46; Tabla 3). La transfección de células CHO y la purificación por afinidad de anticuerpos mediante cromatografía de proteína A-sefarosa se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo 4.
Para investigar la eficiencia de la conjugación, se utilizaron diluciones seriadas de Sortasa A para conjugar FITC modificado con pentaglicina (Gly<5>-FITC, ver la Fórmula 3 a continuación).
Fórmula 3: FITC modificado con pentaglicina (Gly<5>-FITC)
G = residuo de glicina
Para esto, Gly<5>-FITC se conjugó con Sortasa A con dos variantes de Ac10 en tampón de Sortasa 1x (Tris-HCl 25 mM, pH 8.2; NaCl 150 mM; CaCh 7.5 mM), como se muestra en la Tabla 4. Después de 4 horas a 42 °C, los productos de reacción se analizaron mediante electroforesis en gel SDS-PAGE desnaturalizante y reductor, y se visualizó el FITC colocando los geles en una caja de UV (Fig. 10). Se descubrió que la conjugación con la cadena pesada era altamente eficiente independientemente de la presencia o ausencia del enlazador GS entre el terminal C de cadena pesada y el motivo de reconocimiento de la Sortasa LPETG. Inesperadamente, la conjugación mediada por Sortasa A con la cadena ligera fue significativamente menos eficiente en comparación con la conjugación de la cadena pesada mediada por Sortasa A. Además, se descubrió sorprendentemente que la eficiencia del acoplamiento se vio afectada dramáticamente por la presencia o ausencia del espaciador de 2 péptidos GS (glicina-serina) ubicado entre el terminal C de las cadenas ligeras del anticuerpo y el motivo de reconocimiento de Sortasa A LPETG. Mientras que en presencia del enlazador GS la conjugación con la cadena ligera se produjo con una eficiencia aproximadamente 5-10x menor que con la cadena pesada, fue aproximadamente 50-100x menos eficiente en ausencia de un enlazador. Por lo tanto, se concluyó que aumentar la longitud del espaciador peptídico entre la cadena ligera y el motivo de reconocimiento de la Sortasa LPETG podría mejorar aún más la eficiencia de la conjugación.
Por lo tanto, a continuación, se investigó la influencia del aumento de la longitud del espaciador peptídico entre la cadena ligera y el motivo de reconocimiento de Sortasa A LPETG en la eficacia de la conjugación. Construcciones de expresión que codifican cadenas ligeras de mAb Ac10, etiquetadas en el terminal C con un motivo de reconocimiento de Sortasa LPETG y una etiqueta de purificación de strep-II, con un enlazador de 2 a 5 aminoácidos (SEQ ID NOs: 47 - 54), se generaron esencialmente como se describe en el Ejemplo 1. Utilizando estas construcciones de expresión, se produjeron los mAb Ac10-HC-LS/LC-GS-LS, Ac10-HC-LS/LC-GGS-LS, Ac10-HC-LS/LC-GGGS-LS y Ac10-HC-LS/lC-GGGGS-LS en células CHO mediante cotransfección de las construcciones de expresión correspondientes. En cada uno de estos anticuerpos, la cadena pesada está modificada en el terminal C con un motivo de reconocimiento de Sortasa LPETG y una etiqueta de purificación de strep-II (SEQ ID NOs: 43 - 44; Tabla 3). La cadena ligera está modificada en el terminal C con una etiqueta de Sortasa LPETG y una etiqueta strep-II que contiene un espaciador peptídico GS, GGS, GGGS o GGGGS (SEQ ID NOs: 47 - 54; Tabla 3) delante del motivo LPETG. La transfección de células CHO y la purificación por afinidad de anticuerpos mediante cromatografía de proteína A-sefarosa se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo 4.
Para investigar la eficiencia de la conjugación, se utilizaron diluciones seriadas de Sortasa A para conjugar FITC modificado con pentaglicina (Gly<5>-FITC, ver la Fórmula 3, arriba) a las cuatro variantes diferentes de mAb Ac10 en tampón Sortasa 1x (Tris-HCl 25 mM, pH 8.2; NaCl 150 mM; CaCh7.5 mM), como se muestra en la Tabla 5. Después de 4 horas a 42 °C, los productos de reacción se analizaron mediante electroforesis en gel SDS-PAGE desnaturalizante y reductor, y el FITC se visualizó colocando los geles en una caja de UV (Figura 11). Como se esperaba, la conjugación con la cadena pesada fue igualmente eficiente en las cuatro variantes de anticuerpos. Por el contrario, la conjugación con la cadena ligera mejoró significativamente al aumentar la longitud del espaciador peptídico. Significativamente, con el espaciador peptídico más largo analizado (GGGGS), la eficiencia de conjugación de la cadena ligera fue igualmente eficiente en comparación con la conjugación de la cadena pesada, permitiendo así la conjugación sincrónica de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo modificado en el terminal C tanto en la cadena pesada como en la ligera. Se concluye que este formato de anticuerpo facilitará la producción mediada por Sortasa A de ADC homogéneos cargados con 4 fármacos por anticuerpo (DAR4).
Tabla 3: Se produjeron variantes del anticuerpo monoclonal Ac10 modificado en el terminal C
Tabla 4: Condiciones de conjugación para los mAb Ac10-HC-GS-LHS/LC-GS-LHS y Ac10-HC-LS/LC-LS
Tabla 5: Condiciones de conjugación para los mAb Ac10-HC-LS/LC-GS-LS, Ac10-HC-LS/LC-GGS-LS, Ac10-HC-LS/LC-GGGS-LS y Ac10-HC-LS/LC-GGGGS-LS.
Ejemplo 10:Generación de ADC homogéneo mediante purificación por afinidad con etiqueta strepII
La conjugación mediada por Sortasa A con vc-PAB-MMAE etiquetado con Gly<5>(ver la Fórmula 1, Ejemplo 5) se realizó con el anticuerpo anti-CD30 Ac10 modificado en los terminales C de las cadenas pesadas o de las cadenas ligeras con secuencias que comprendían un motivo de Sortasa ALPETG y una etiqueta de purificación por afinidad strepII como se proporciona en la Tabla<6>a continuación:
Tabla<6>: Anticuerpo Ac10 modificado en el terminal C con modificación de HC o LC
Los vectores de expresión que codifican las secuencias de cadena pesada o ligera de Ac10 de la Tabla 4 se han construido esencialmente como se divulga en el Ejemplo 1. La transfección de células CHO y la purificación por afinidad de anticuerpos mediante cromatografía de proteína A-sefarosa se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo 4.
La conjugación mediada por Sortasa A de anticuerpos anti-CD30 etiquetados con motivos de sortasa de cadena pesada o ligera con vc-PAB-MMAE etiquetado con Gly<5>(ver la Fórmula 1, Ejemplo 5) se realizó esencialmente de acuerdo con el protocolo proporcionado en el Ejemplo 7.
Como se describe más arriba en la descripción detallada de la invención, el anticuerpo que no ha reaccionado retendrá la etiqueta de purificación por afinidad strep-II del terminal C, que se puede aprovechar para enriquecer el ADC completamente reaccionado con DAR2. El análisis de la conjugación de la Sortasa A de la cadena pesada con la toxina vc-PAB-MMAE mediante cromatografía de interacción de hidrofobicidad (HIC) (Fig. 12, panel A), muestra que la mayoría de las cadenas pesadas modificadas con el motivo de la sortasa se han conjugado, pero un cierto porcentaje de sustrato sin reaccionar (DAR0 = relación fármaco a anticuerpo = cero) o sustrato parcialmente reaccionado (DAR1 = relación fármaco a anticuerpo = 1) todavía era detectable mediante HIC (Fig. 12, Panel A).
Por lo tanto, el conjugado vc-PAB-MMAE purificado de proteína A se pasó 4 veces sobre una columna de afinidad StrepTactin® (IBA Sciences, Gottingen, Alemania), esencialmente como se describe en el Ejemplo 7, para eliminar el anticuerpo modificado con Sortasa A que no reaccionó o que reaccionó parcialmente. La Fig. 12, Panel B muestra que después de varios pases del conjugado anticuerpo fármaco vc-PAB-MMAE heterogéneo, los ADC<d>AR2 reaccionaron completamente (DAR2 = relación fármaco a anticuerpo = 2) podrían enriquecerse altamente. Este experimento demuestra la viabilidad de utilizar etiquetas de purificación por afinidad adicionales agregadas en el terminal C del motivo de reconocimiento LPETG de la Sortasa A para generar ADC homogéneo con una proporción definida de fármacos por anticuerpo (aquí DAR2).
Ejemplo 11:Síntesis de toxinas maitansina y alfa-amanitina modificadas con 5xglicina
Para permitir la conjugación de dos cargas útiles diferentes, preferiblemente cargas útiles tóxicas a un solo anticuerpo, modificado con diferentes motivos de sortasa en los terminales C de la cadena pesada y ligera, se requiere modificar dos toxinas diferentes con residuos de glicina, preferiblemente toxinas con diferentes modos de acción, de tal manera que una célula cancerosa dirigida con un ADC conjugado con carga útil dual, sea atacada a través de dos rutas diferentes, potencialmente sinérgicas. Se ha realizado la síntesis de dos cargas útiles tóxicas diferentes modificadas con glicina (en este caso, maitansina y alfa-amanitina) que satisfacen este requisito y se describe en el presente documento.
11.1 Síntesis de alfa-amanitina modificada con glicina:
Se disolvieron 30 mg de alfa-amanitina (Estructura 1) (Sigma-Aldrich, orden # A2263) en 1 ml de DMSO anhidro. A esta solución se añadieron 19 mg de bromuro de NH-Boc-amino-hexilo, seguido de tert-butóxido de potasio (solución 1 M en THF, 35 jl). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante<6>h y se añadió más tert-butóxido de potasio (solución 1 M en THF, 20 jl). La reacción se mantuvo a temperatura ambiente durante 16 h. Se añadió ácido acético (10 j l ) y la mezcla cruda se purificó directamente mediante RP-HPLC (columna Sunfire C18 de 5 j , 3 cm x 10 cm, 5o ml/min, gradiente de acetonitrilo/agua al 5-50 % durante 15 min). La fracción deseada se recogió y se liofilizó para obtener la Estructura 2 como un polvo blanco (15 mg), que se trató con solución de TFA/DCM (1/1, v/v, 1 ml) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los volátiles se eliminaron a presión reducida para obtener la Estructura 3 como una goma ligeramente amarillenta, que se utilizó en el siguiente paso sin purificación adicional.
Se disolvió Fmoc-Gly5-OH<( 8>mg) en DMF anhidro (0.5 ml). Se añadió HATU (Sigma-Aldrich, orden #445460)<( 6>mg), seguido de DIEA (10 ml) (Sigma-Aldrich, orden # 496219). La mezcla se agitó suavemente a temperatura ambiente durante 30 segundos y luego se transfirió a una solución de compuesto 3 en DMF (0.5 ml). Después de 30 minutos, el análisis por LC/MS mostró que todo el compuesto 3 fue consumido. Se añadió piperidina (30 j l ) y se controló el progreso de la reacción mediante LC/MS. Se añadió ácido acético para neutralizar la reacción después de 1 h y la mezcla se purificó por RP-HPLC (columna Sunfire C18 5 j 3 cm x 25 cm, 50 mL/min, gradiente de 2-40 % acetonitrilo/agua 30 min). Las fracciones se agruparon y se liofilizaron para obtener la estructura 5 como un polvo blanco (12 mg). Los datos analíticos del compuesto 5 se proporcionan en la Fig. 13, panel A).
Esquema 1: Síntesis de alfa-amanitina modificada con glicina
11.2. Síntesis de maitansina modificada con glicina:
Se disolvió maitansinol (0.6 g, 1.1 mmol) (Clearsynth Labs, Mumbai, India) en THF anhidro<( 6>ml) y DMF anhidro (3 ml) después de lo cual se añadió 1.2 ml de DIEA (Sigma-Aldrich, orden # 496219). La solución se colocó bajo atmósfera de argón. Se añadieron triflato de zinc (1.2 g) y NMeAla NCA (0.7 g) en una sola porción. La mezcla se sonicó hasta que se disolvió el sólido. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 días y luego se diluyó con acetato de etilo (100 ml). Se lavó con NaHCO<3>saturado (solución acuosa, 2 x 50 ml) y salmuera (50 ml). La capa orgánica se secó (sobre MgSO<4>) y se concentró para producir el 3-(S)-alfa-N-metilaminopropionato de maitansinol (<8>) crudo que se utilizó directamente en el siguiente paso sin purificación adicional.
Se disolvió Fmoc-Gly5-OH (26 mg) en DMF anhidro (1 ml). Se añadió HATU (Sigma-Aldrich, orden # 445460) (19 mg), seguido de DIEA (18 pL). La mezcla se agitó suavemente a temperatura ambiente durante 30 segundos y luego se transfirió a una solución de compuesto<8>en THF (1 ml). Después de 30 minutos, el análisis por LC/m S mostró que todos el compuesto<8>fue consumido. Se añadió piperidina (40 pl) y se controló el progreso de la reacción mediante LC/MS. Se añadió éter (40 ml) a la reacción después de 2 h y el sólido precipitado se recogió y se lavó con éter. El compuesto crudo se purificó por RP-HPLC (columna Sunfire C18 5p 3 cm x 10 cm, 50 ml/min, gradiente de acetonitrilo/agua al 10-60 % durante 20 min). Las fracciones se agruparon y se liofilizaron para obtener el compuesto 10 como un polvo blanco (33 mg). Los datos analíticos del compuesto 10 se proporcionan en la Figura 13, Panel B.
Esquema 2: Síntesis de maitansina modificada con glicina
Es importante señalar que, en principio, cualquier toxina puede funcionalizarse para la conjugación enzimática mediada por sortasa, si 5 glicinas (como se muestra aquí) o cualquier número de residuos de glicina mayor o igual a una glicina se unen a las toxinas (ver Figura 14).
Ejemplo 12:Inhibición tumoralin vivode Trastuzumab-DM1 conjugado con Sortasa A en modelos de xenoinjerto de carcinoma ovárico SKOV3.
Se implantaron 5x10<6>células tumorales SKOV3 en 200 pl de PBS/Matrigel (relación 1:1) por vía subcutánea en los flancos izquierdos de ratones desnudos NMRI hembras de 5-6 semanas de edad. Los volúmenes de los tumores primarios se controlaron mediante calibrador. Después de que se alcanzó un volumen tumoral medio de<100 - 200>mm3, los animales con tumores se dividieron aleatoriamente en tres grupos de acuerdo con el tamaño del tumor (10 animales por grupo). El día de la distribución aleatoria (día 0) y el día 21, a los animales de los grupos 1, 2 y 3 se les inyectó por vía intravenosa, respectivamente, 5 ml/kg de PBS, 15 mg/kg de Kadcyla®, o 15 mg/kg de Trastuzumab-DM1 conjugado con Sortasa A. Los volúmenes tumorales se midieron quincenalmente mediante calibrador (Fig. 15). El estudio finalizó después de 39 días y los animales fueron sacrificados de acuerdo con las pautas aceptadas de experimentación animal.
Durante el estudio, los tumores en animales de control inyectados simuladamente con PBS crecieron de manera constante hasta alcanzar un volumen de aproximadamente 600 mm3. Por el contrario, los tumores en animales tratados con Kadcyla® se encogieron y fueron esencialmente indetectables el día 39. La actividad antitumoral de Trastuzumab-DM1 conjugado con Sortasa A no difirió significativamente de la de Kadcyla® disponible comercialmente, a pesar del hecho de que el T-DM1 conjugado con sortasa exhibió una relación fármaco a anticuerpo menor de aproximadamente 2, en comparación con una DAR informada de 3.5 de Kadcyla®. En combinación con los datos del Ejemplo<8>, los resultados demuestran que los ADC conjugados con sortasa, que utilizan un anticuerpo y una fracción de toxina idénticos, tienen una actividad de eliminación de tumores comparable en comparación con Kadcyla® conjugado químicamente disponible comercialmentein vitroein vivo,aunque con una proporción fármaco a anticuerpo más baja.
Ejemplo 13:Conjugación mediada por Sortasa A en sobrenadante crudo de células CHO.
La variante de Trastuzumab Tras-HC-LS/LC-GGGGS-LS, que consta de cadenas pesadas etiquetadas en el terminal C con el motivo Sortasa LPETG y la etiqueta de purificación Strep II (SEQ iD NOs: 055-056) y cadenas ligeras etiquetadas en el terminal C con espaciador Gly<4>-Ser de 5 aminoácidos (GGGGS), motivo de Sortasa LPETG y etiqueta Strep II (SEQ ID NOs: 057-058), se produjo en células CHO esencialmente como se describe en el Ejemplo 4. El sobrenadante de células crudas sin suero resultante contenía aproximadamente 157 mg/L de Tras-HC-LS/LC-GGGGS-LS y se utilizó directamente para la conjugación esencialmente como se describe en el Ejemplo 9, agregando tampón de Sortasa, Gly<5>-FITC y diluciones seriadas de Sortasa A directamente al sobrenadante. Paralelamente, el Tras-HC-LS/LC-GGGGS-LS purificado por cromatografía de afinidad de proteína A también se conjugó en condiciones por lo demás idénticas. Después de 4 horas a 42°C, las reacciones se analizaron mediante electroforesis en gel SDS-PAGE desnaturalizante y reductora. Después de visualizar FITC colocando el gel en una caja de UV, la proteína se tiñó con azul brillante de Coomassie (Fig. 16). Los datos muestran el hallazgo inesperado de que la conjugación de anticuerpos mediada por Sortasa A en el sobrenadante del cultivo celular crudo fue tan eficiente como la del anticuerpo purificado. Además, la reacción de conjugación fue altamente específica y ninguno de los contaminantes proteicos presentes en el sobrenadante de células CHO crudas se conjugaron de forma no específica. En conjunto, estos datos sugieren que la robustez de la reacción de Sortasa puede ayudar a facilitar la fabricación de ADC al permitir realizar la conjugación del fármaco directamente después de la producción en células CHO antes de la purificación y el procesamiento posterior.
Leyenda de las figuras
Figura 1: Esta figura ilustra el principio de la conjugación de la carga útil específica del sitio mediada por la sortasa A a un inmunoligando (o proteína de unión), que puede realizarse en el terminal N de una proteína (a) o en el terminal C de la proteína (b). Para lograr la conjugación en el terminal N, la carga útil debe contener un motivo de reconocimiento de pentapéptido de sortasa (aquí LPXTG, el motivo de reconocimiento de la sortasa A deStaphylococcus aureus (Xque representa cualquiera de los 20 aminoácidos naturales), mientras que el terminal N del inmunoligando/proteína de unión que se va a etiquetar debe expresarse con una extensión en el terminal N de al menos 3 residuos de glicina, aquí indicados como Gn, (con n>2), que tiene un grupo amino en el terminal N libre (aquí indicado por el símbolo de H<2>N más pequeño). Normalmente se utilizan 3-5 glicinas para modificar un sustrato para la conjugación mediada por sortasa. La adición de enzima sortasa A recombinante deStaphylococcus aureus,como se indica en el presente documento, luego cataliza la ruptura del enlace peptídico entre el residuo T y G del terminal C en el motivo pentapeptídico LPXTGy forma un nuevo enlace peptídico entre la glicina del terminal N del tramo Gn (n>2) y el residuo T. El residuo G del terminal C del motivo LPXTG(aquí resaltado en negrita) se elimina en la reacción de transpeptidación. (b) Por el contrario, para lograr la conjugación en el terminal C de una carga útil a una proteína, que es el método preferido para la conjugación de cargas útiles, particularmente toxinas, a anticuerpos (ver la Fig.<6>), el motivo pentapeptídico de reconocimiento de sortasa LPXTGdebe agregarse al extremo terminal C del inmunoligando/proteína de unión (por ejemplo, mediante tecnología de expresión de proteína recombinante, como se describe en los Ejemplos), y la carga útil debe modificarse con un tramo corto de glicina (Gn, con n>2, típicamente 3-5 glicinas). Como se describe en (a), la adición de Sortasa A deStaphylococcus aureusluego catalizará la transpeptidación del tramo Gn al motivo LPXTG, con lo cual se eliminará el residuo G terminal del motivo LPXTG (en negrita).
Figura 2: Esta figura ilustra el principio de transpeptidación mediada por inteína (a) e inteína dividida (b). (a) Las inteínas pueden presentarse como los llamados "intrones de proteína" en las proteínas precursoras, donde separan las partes del terminal N y del terminal C de una proteína madura, que generalmente se denominan N-exteína y C-exteína. La inteína de "intrón-proteína" puede catalizar la ruptura del enlace peptídico entre la inteína y la C-exteína y la formación de un nuevo enlace peptídico entre la N-exteína y la C-exteína transfiriendo el aminoácido del terminal N de la C-exteína al aminoácido del terminal C de la N-exteína en una reacción de transpeptidación. El resultado de la reacción es la eliminación de la inteína de "intrón de proteína" de la proteína precursora y la generación de una proteína madura con un enlace peptídico recién creado entre los dominios de N-exteína y C-inteína. (b) También se ha descrito que la actividad de la inteína se puede separar en dominios distintos, que se pueden unir a diferentes proteínas, por lo que esta variación de la inteína se ha denominado inteína dividida. Los dominios de N-int y C-int de la inteína dividida forman un complejo estructural no covalente, que puede realizar la misma reacción de transpeptidación que una inteína contigua, en los dominios de N-exteína y C-exteína unidos, que luego están en proximidad espacial y forman parte del complejo. El resultado de la transpeptidación de la reacción de inteína dividida N-int y C-int es entonces un "empalme trans de proteína", o esencialmente una ligadura de proteína entre los dominios de N-exteína y C-exteína, mediante la formación de un nuevo enlace peptídico.
Figura 3: Esta figura ilustra cómo inteínas divididas particulares que se caracterizan por un dominio de C-int extremadamente corto o un dominio de N-int extremadamente corto pueden usarse para conjugar cualquier carga útil a un inmunoligando (o proteína de unión), incluidas entidades moleculares pequeñas, porque los tramos cortos de aminoácidos pueden sintetizarse químicamente y pueden unirse fácilmente a entidades moleculares pequeñas mediante acoplamiento químico convencional. (a) Esta parte de la ilustración muestra el uso de la inteína dividida Ssp GyrB S11 (descrita en Appleby et al. (2009)) para la conjugación del terminal C de una carga útil a un inmunoligando/proteína de unión. En este documento el dominio de C-int tiene solo<6>aminoácidos de longitud y comprende la secuencia de aminoácidos GVFVHN, como se indica. Sin embargo, como es necesario que haya algunos péptidos que sean equivalentes a un dominio de C-exteína, se deben agregar aminoácidos adicionales, de los cuales el primero debe ser un residuo de aminoácido serina o cisteína, mientras que los aminoácidos restantes pueden elegirse. Esto lo indica el símbolo SXn, que significa que un tramo corto de aminoácidos comienza en el lado del terminal N con serina y es seguido por n aminoácidos (n>2, preferiblemente 5), que pueden ser cualquiera de los 20 aminoácidos naturales (por lo tanto, se indican como X). Por lo tanto, como se describe en el Ejemplo, un tramo corto de 12 aminoácidos que comprende un dominio mini de C-int de<6>aminoácidos y un tramo de aminoácidos de C-ext de<6>aminoácidos son suficientes para permitir que el complejo N-int/C-int catalice la transpeptidación a partir del enlace peptídico asparaginaserina en el GVFVHN-SXn (X cualquier aminoácido, n><2>, preferiblemente 5) al enlace peptídico entre la transición de N-exteína y N-int. Esto dará como resultado un inmunoligando/proteína de unión conjugado en el terminal C con la carga útil unida a través del tramo corto del aminoácido de C-exteína. (b) Esta parte de la ilustración muestra el uso de la inteína dividida Ssp DnaX (descrita en Song et al. (2012)), que se puede separar en un dominio de N-int muy corto de 11 aminoácidos y un dominio de C-int de 139 aa para la conjugación en el terminal N de una carga útil a un inmunoligando/proteína de unión. Como se indica en el presente documento, esto solo requiere la síntesis y el acoplamiento de un dominio de N-int corto de 11 aminoácidos a cualquier carga útil (o la adición mediante tecnología de proteínas recombinantes), lo que luego permite la conjugación específica de la carga útil al terminal N de cualquier inmunoligando o proteína que tenga un dominio de C-int de Ssp DnaX de 139 aminoácidos de largo fusionado al terminal N. El resultado de esta reacción es entonces un inmunoligando/proteína de unión conjugado en el terminal N. Por lo tanto, como en el caso de la transpeptidación de la sortasa, donde la conjugación del terminal N o C solo depende de la disposición de los motivos peptídicos LPXTG y Gn con respecto a la proteína y la carga útil, las inteínas divididas también pueden mediar la conjugación en el terminal N y C específica del sitio de proteínas con cargas útiles modificadas con péptidos cortos, y explotar dominios peptídicos mini C-int o mini N-int cortos, como los de las inteínas divididas Ssp GyrB y Ssp DnaX, respectivamente.
Figura 4: (a) Esta figura ilustra la utilidad de agregar etiquetas de purificación y/o detección de afinidad adicionales además de una etiqueta sortasa en la conjugación de cargas útiles a inmunoligandos. (a) esta parte de la Figura muestra cómo se eliminan aminoácidos adicionales añadidos que representan una etiqueta de purificación<6>xHis (HHHHHH), una etiqueta de detección Myc (EQKLISEEDL) y una etiqueta de purificación por afinidad strepII (WSHPQFEK), como se describe en los Ejemplos, en el curso de la conjugación de la carga útil del terminal C mediante una transpeptidasa sortasa A deStaphylococcus aureus.Esto permite seleccionar el producto conjugado, si se emplean resinas de afinidad Ni-NTA (para la etiqueta<6>xHis) o resinas de afinidad de estreptactina (para la etiqueta strep II) para separar el sustrato no conjugado del producto conjugado. Esta combinación de etiquetas sólo se proporciona a modo de ejemplo.
(b) Esta figura ilustra que el uso de etiquetas de purificación por afinidad es particularmente útil para seleccionar/purificar un producto completamente conjugado en el caso de proteínas multiméricas, como los anticuerpos ilustrados en el presente documento. Como también se proporciona en los ejemplos, los anticuerpos pueden modificarse con sitios de conjugación específicos en cadenas pesadas y ligeras, y si la modificación está dirigida a los terminales C de las cadenas IgH e IgL, entonces se pueden conjugar hasta cuatro cargas útiles al anticuerpo. La adición de (a) etiqueta(s) de purificación por afinidad adicionales, por ejemplo, como se describe en la Figura 4 (a), permite unir un producto conjugado de forma incompleta, que puede tener solo una, dos o tres (como se ilustra en el presente documento) cargas útiles conjugadas al anticuerpo, aún unirse a la resina de purificación por afinidad respectiva y, por lo tanto, puede separarse fácilmente del producto con carga útil completamente conjugada. Este paradigma, por supuesto, también es aplicable a los inmunoligandos modificados con inteína, y no sólo a los inmunoligandos modificados con motivos de sortasa, como se muestra en el presente documento.
Figura 5: Esta figura ilustra una variación de la conjugación mediada por sortasa que también se puede aplicar, en la que la enzima sortasa no se agrega como una proteína recombinante separada al inmunoligando etiquetado con sortasa y la carga útil modificada con un tramo de glicina, sino que el dominio enzimático de sortasa se expresa como una proteína de fusión del terminal C a la etiqueta de sortasa LPXTG. El dominio de la enzima sortasa estará inactivo mientras no se incube con una carga útil (o sustrato) modificada con un tramo de glicina. Tan pronto como se agrega el sustrato modificado con un tramo de glicina (o en el presente documento, carga útil) a dicha construcción, el dominio de sortasa fusionado catalizará la transpeptidación del sustrato de carga útil de glicina a la etiqueta sortasa LPXTG, escindiendo la proteína entre la posición treonina-4 y glicina-5 de la etiqueta LPXTG, y eliminando así el dominio de enzima sortasa con etiquetas de purificación de afinidad adicionales, que se pueden agregar opcionalmente, como se muestra en el presente documento. Este procedimiento tiene la ventaja de que, de manera similar a la adición de dominios de inteína dividida catalíticamente activos, el dominio de la enzima sortasa puede expresarse mediante tecnología de proteína recombinante como un componente integral del inmunoligando a conjugar.
Figura<6>: (a) Esta figura ilustra el uso de diferentes transpeptidasas (en el presente documento sortasa e inteína dividida), para conjugar simultáneamente diferentes cargas útiles a diferentes subunidades de una proteína multimérica, como, por ejemplo, se muestra en el presente documento, las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo. En este ejemplo seleccionado, los terminales C de las cadenas pesadas se modifican con el dominio de N-int de Ssp GyrB (como se proporciona en el Ejemplo 2), mientras que las cadenas ligeras se modifican con el motivo pentapeptídico de la Sortasa A LPXT<g>(como se proporciona en el Ejemplo 1, las etiquetas adicionales se omiten para simplificar). La incubación con una carga útil A modificada con un tramo de glicina y con una carga útil B modificada con el dominio de C-int y la enzima sortasa permitirá la conjugación simultánea y selectiva de la carga útil B a las cadenas pesadas y de la carga útil A a las cadenas ligeras. Si las cargas útiles A y B son toxinas que se dirigen a diferentes vías celulares, esta estrategia podría generar fármacos anticancerígenos más potentes, como los ADC convencionales, que solo contienen una única fracción de toxina. (b) Esta figura ilustra el uso de diferentes enzimas sortasas (en el presente documento sortasa A y sortasa B deStaphylococcus aureus),con el fin de conjugar simultáneamente diferentes cargas útiles a diferentes subunidades de una proteína multimérica como, por ejemplo, se muestra en el presente documento, las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo. En este ejemplo seleccionado, los terminales C de las cadenas pesadas están modificados con el motivo de reconocimiento pentapeptídico para la sortasa B, NPQTN, mientras que las cadenas ligeras están modificadas con el motivo pentapeptídico de la Sortasa A, LPXTG. La conjugación secuencial de las cargas útiles A y B modificadas con un tramo de glicina con la sortasa A y la sortasa B permitirá la conjugación simultánea y selectiva de la carga útil B a las cadenas pesadas y la carga útil A a las cadenas ligeras (las secuencias de péptidos restantes de LPXTG y NPQTN se omiten en la estructura conjugada para simplificar). Si las cargas A y B son toxinas que se dirigen a diferentes vías celulares, esta estrategia podría generar fármacos anticancerígenos más potentes, como los ADC convencionales, que solo contienen una única fracción de toxina.
Figura 7: Análisis SDS-PAGE (a.) y transferencia Western (b.) del fragmento de sortasa A enzimáticamente activo recombinante deStaphylococcus aureus.(a.) El carril 1 en la SDS-PAGE contiene BSA (aproximadamente 66.4 kD), carril M<1>contiene el estándar de peso molecular de proteína de Genscript (Cat. No.: MO0505), el carril 2 contiene un fragmento de sortasa A recombinante purificado con etiqueta His deStaphylococcus aureus.Las proteínas en la SDS-PAGE están teñidas con azul de Commassie. (b.) La transferencia Western se desarrolló con un anticuerpo anti-His (Genscript Cat. No.: AO0186). El carril 3 contiene el fragmento de la sortasa A recombinante purificada con etiqueta His deStaphylococcus aureus.El carril M<2>contiene el estándar de peso molecular de Genscript (Cat. No.: MM0908).
Figura<8>: Análisis de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) de Tras-HC-GS-LHS (A) y Tras-LC-GS-LHS (B) conjugados con toxina DM1. DAR1 indica una relación fármaco a anticuerpo de 1; DAR2 indica una relación de fármaco a anticuerpo de<2>.
Figura 9: Respuesta a la dosis de los efectos citotóxicos de los ADC indicados en células SKBR3 (A) con sobreexpresión de HER2 y T47D-5R (B) negativas para HER2. Las células se incubaron con diluciones seriadas de ADC durante 3 días, después de lo cual se detectó la viabilidad celular mediante solución luminiscente CellTiter-Glo® (Promega). L<c>: Tras-LC-GS-LHS conjugado con DM1-sortasaA; HC: Tras-HC-GS-LHS conjugado con DM1-sortasaA.
Figura 10: Conjugación de Gly<5>-FITC mediada por Sortasa A con variantes de mAb Ac10 con o sin espaciador de péptidos<g>S. Se utilizaron diluciones seriadas de Sortasa A para conjugar Gly<5>-FITC a mAb Ac10-HC-GS-L<h>S/L<c>-GS-LHS (A) y mAb Ac10-HC-LS/LC-LS (B) en condiciones por lo demás idénticas. Los productos de reacción se separaron por tamaño en geles SDS-PAGE desnaturalizantes y reductores. La FITC se visualizó colocando los geles en una caja de UV. Las concentraciones de Sortasa A utilizadas fueron: carriles 1, 9: 50 |jM; carriles 2, 10: 25 jM ; carriles 3, 11: 12.5 jM ; carriles 4, 12: 6.25 jM ; carriles 5, 13: 3.13 jM ; carriles<6>, 14: 1.56 jM ; carriles 7, 15: 0.78 jM ; carriles<8>,<16>: 0.39 jM .
Figura 11: Influencia de la longitud del espaciador peptídico en la eficiencia de conjugación de la cadena ligera. Se utilizaron diluciones seriadas de Sortasa A para conjugar Gly<5>-FITC a los mAb Ac10-HC-LS/LC-GS-LS (A, izquierda), Ac10-HC-LS/LC-GGS-LS (A, derecha), Ac10-HC-LS/LC-GGGS-LS (B, izquierda) y Ac10-HC-LS/LC-GGGGS-LS (B, derecha) en condiciones por lo demás idénticas. Los productos de reacción se separaron por tamaño en geles SDS-PAGE desnaturalizantes y reductores. La FITC se visualizó colocando los geles en una caja de UV. Las concentraciones de Sortasa A utilizadas fueron: carriles 1,<8>, 15, 22: 25 jM ; carriles 2, 9, 16, 23: 12.5 jM ; carriles 3, 10, 17, 24: 6.25 jM ; carriles 4, 11, 18, 25: 3.13 jM ; carriles 5, 12, 19, 26: 1.56 jM ; carriles<6>, 13, 20, 27: 0.78 jM ; carriles 7, 14, 21, 28: 0.39 jM
Figura 12: Análisis de ADC conjugado de cadena pesada de la toxina sortasa A vc-PAB-MMAE de mAb Ac10 mediante cromatografía de interacción de hidrofobicidad (HIC), que es capaz de diferenciar el sustrato no reaccionado (DAR0 = relación fármaco a anticuerpo 0), el sustrato en el que se ha conjugado una de las dos cadenas pesadas (DAR1 = relación fármaco a anticuerpo 1) y el sustrato en el que se han conjugado ambas cadenas pesadas modificadas (DAR2 = relación fármacos a anticuerpo 2), como se indica. El panel A muestra el perfil de HIC después de una conjugación mediada por sortasa Aestándar de mAb Ac10 modificado con HC, en el que aún se pueden detectar especies DAR0 y DAR1, junto al producto DAR2 deseado. El panel B muestra el perfil de HIC después de 4 pases de la preparación de ADC analizada en el panel A sobre una columna de purificación por afinidad StrepTactin®.
Figura 13: Análisis de toxina alfa-amanitina modificada con Gly<5>sintetizada (a.) y toxina maitansina modificada con Gly<5>(b.). En cada uno de los paneles a.) y b.) se proporciona en la parte superior la estructura sintetizada, con las cinco glicinas resaltadas mediante un recuadro. A continuación, se proporciona el análisis de cada compuesto por espectrometría de masas y HPLC de fase inversa. a.) La masa esperada de la toxina alfaamanitina modificada con Gly<5>es 1302.07 D, la masa observada es 1325.38 D, correspondiente a Ms Na+. El perfil de RP-HPLC indica una pureza de > 95 %. b.) La masa esperada de la toxina maitansina modificada con Gly<5>es 991.41 D, la masa observada es 957.69 D, correspondiente a Ms Na+. El perfil RP-HPLC indica una pureza de > 95 %.
Figura 14: Estructuras de toxinas modificadas con glicina 5x (Glys) que han sido sintetizadas por Concortis, San Diego, CA, EE. UU. (estructuras 1-6 y 9), o que pueden sintetizarse (estructuras 7 y<8>), lo que demuestra que cualquier toxina puede funcionalizarse para la conjugación enzimática mediada por sortasa, si se unen 5 glicinas a las toxinas (como se muestra en el presente documento), o cualquier número de residuos de glicina mayor o igual a una glicina. Las toxinas modificadas con glicina se pueden sintetizar conteniendo estructuras enlazadoras/espaciadoras validadas adicionales, como se proporciona en las estructuras 1-3 de la Fig. 14 a.), agregando potencialmente cierta funcionalidad adicional (por ejemplo, capacidad de escisión en ciertos compartimentos subcelulares) o sin enlazadores adicionales, como se muestra en las estructuras 4-6 de la Fig. 14 b.). Si hay varios grupos reactivos disponibles en una toxina dada, como por ejemplo en el caso de la toxina alfa-amanitina, se pueden agregar residuos de glicina a estos diferentes grupos tal como se ejemplifica en las estructuras 7-9 en la Fig. 14c).
Figura 15: Volúmenes tumorales determinados en el Ejemplo 12. Los resultados demuestran que los ADC conjugados con sortasa, que utilizan un anticuerpo y una fracción de toxina idénticos, tienen una actividad comparable de eliminación de tumores en comparación con la del Kadcyla® conjugado químicamente disponible comercialmente.
Figura 16: Geles teñidos con azul de Coomassie como se describe en el ejemplo 13. Los datos muestran el hallazgo inesperado de que la conjugación de anticuerpos mediada por Sortasa A en el sobrenadante de cultivo celular crudo fue tan eficiente como la del anticuerpo purificado.
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Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un método para producir un conjugado de inmunoligando/carga útil, cuyo método comprende conjugar al menos una carga útil con un inmunoligando por medio de una transpeptidasa específica de secuencia, o un dominio catalítico de la misma,
en donde el inmunoligando comprendido en el conjugado de inmunoligando/carga útil es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una proteína de unión basada en anticuerpos o un mimético de anticuerpos, en donde
a) el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en (i) un fragmento Fab, (ii) un fragmento F(ab')2; (iii) una porción de cadena pesada de un fragmento Fab(Fd), que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento variable (Fv); (v) un fragmento de anticuerpo de dominio (dAb), que comprende un único dominio variable; (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada; (vii) un fragmento Fv de cadena única (scFv); (viii) un diacuerpo; y (ix) un anticuerpo lineal, que comprende un par de segmentos Fv en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto con polipéptidos de cadena ligera de complementariedad, forman un par de regiones de unión a antígeno;
b) la proteína de unión basada en anticuerpos es una proteína que contiene al menos un dominio de inmunoglobulina VH, VL o CH derivado de anticuerpos,
c) el mimético de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en proteínas de repetición de anquirina, lectinas de tipo C, transferrinas, lipocalinas, dominios de tipo III del décimo tipo de fibronectina, nudos de cisteína o knottinas, dominios SH-3 y Fyn SH3,
en donde la transpeptidasa específica de secuencia es una enzima sortasa que reconoce un motivo de reconocimiento de pentapéptido, añadido a un extremo terminal C del inmunoligando,
en donde la carga útil es un compuesto citotóxico que no excede un peso molecular de 2500 Daltons que es citotóxico para las células de mamíferos y daña y destruye las células cancerosas,
y en donde el inmunoligando comprende un motivo de reconocimiento de sortasa y el compuesto citotóxico está modificado con una modificación de Glyn, donde n><1>, y
donde el motivo de reconocimiento de la sortasa es un pentapéptido unido al terminal C del inmunoligando.
2. El método de acuerdo con la reivindicación mencionada anteriormente, en el que al menos un dominio catalítico de la transpeptidasa específica de secuencia se fusiona al terminal C del inmunoligando.
3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho inmunoligando comprende al menos dos subunidades, cada una de las cuales está conjugada con un compuesto citotóxico que no excede un peso molecular de 2500 Daltons que es citotóxico para las células de mamíferos y daña y mata las células cancerosas.
4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3, en el que dicho inmunoligando con al menos dos subunidades contiene una secuencia espaciadora peptídica de al menos dos aminoácidos, preferiblemente 2 - 5 aminoácidos, anexa al terminal C de al menos una de las dos subunidades.
5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones mencionadas anteriormente, método que permite una relación definida estequiométricamente entre inmunoligando y carga útil.
<6>. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en cuyo método dicha relación definida estequiométricamente entre inmunoligando y carga útil se logra mediante la eliminación del sustrato de inmunoligando modificado en el terminal C que ha reaccionado parcialmente.
7. El método de acuerdo con la reivindicación<6>, en el que el inmunoligando tiene una etiqueta de purificación por afinidad distal al motivo de reconocimiento de sortasa fusionado a la proteína o inmunoligando, preferiblemente en el que la etiqueta de purificación por afinidad se elimina del inmunoligando como parte de la reacción de transpeptidasa.
<8>. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones mencionadas anteriormente, método que permite una conjugación específica del sitio de la carga útil al inmunoligando.
9. Un conjugado de inmunoligando/carga útil obtenible con un método de acuerdo con las reivindicaciones anteriores, cuyo conjugado comprende un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una proteína de unión basada en anticuerpos o un mimético de anticuerpos, en donde
a) el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en (i) un fragmento Fab, (ii) un fragmento F(ab')2; (iii) una porción de cadena pesada de un fragmento Fab(Fd), que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento variable (Fv); (v) un fragmento de anticuerpo de dominio (dAb), que comprende un único dominio variable; (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada; (vii) un fragmento Fv de cadena única (scFv); (viii) un diacuerpo; y (ix) un anticuerpo lineal, que comprende un par de segmentos Fv en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto con polipéptidos de cadena ligera de complementariedad, forman un par de regiones de unión a antígeno;
b) la proteína de unión basada en anticuerpos es una proteína que contiene al menos un dominio de inmunoglobulina VH, VL o CH derivado de anticuerpos,
c) el mimético de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en proteínas de repetición de anquirina, lectinas de tipo C, transferrinas, lipocalinas, dominios de tipo III del décimo tipo de fibronectina, nudos de cisteína o knottinas, dominios SH-3 y Fyn SH3,
y una carga útil que es un compuesto citotóxico que no excede un peso molecular de 2 500 Daltons que es citotóxico para las células de mamíferos y daña y destruye las células cancerosas,
y en donde la transpeptidasa específica de secuencia es una enzima sortasa que reconoce un motivo de reconocimiento de pentapéptido, añadido a un extremo terminal C del inmunoligando,
en donde el inmunoligando comprende un motivo de reconocimiento de sortasa y el compuesto citotóxico está modificado con una modificación de Glyn, donde n><1>, y
donde el motivo de reconocimiento de la sortasa es un pentapéptido unido al terminal C del inmunoligando.
10. Un conjugado de inmunoligando/carga útil que se puede obtener con un método de acuerdo con la reivindicación<1>para su uso en el tratamiento de un sujeto humano o animal que padece una enfermedad neoplásica.
11. Uso de un compuesto citotóxico de bajo peso molecular que no exceda un peso molecular de 2500 Daltons para su conjugación por medio de una enzima sortasa con un inmunoligando seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una proteína de unión basada en anticuerpos o un mimético de anticuerpos, en donde
a) el fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en (i) un fragmento Fab, (ii) un fragmento F(ab')2; (iii) una porción de cadena pesada de un fragmento Fab(Fd), que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento variable (Fv); (v) un fragmento de anticuerpo de dominio (dAb), que comprende un único dominio variable; (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada; (vii) un fragmento Fv de cadena única (scFv); (viii) un diacuerpo; y (ix) un anticuerpo lineal, que comprende un par de segmentos Fv en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto con polipéptidos de cadena ligera de complementariedad, forman un par de regiones de unión a antígeno;
b) la proteína de unión basada en anticuerpos es una proteína que contiene al menos un dominio de inmunoglobulina VH, VL o CH derivado de anticuerpos,
c) el mimético de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en proteínas de repetición de anquirina, lectinas de tipo C, transferrinas, lipocalinas, dominios de tipo III del décimo tipo de fibronectina, nudos de cisteína o knottinas, dominios SH-3 y Fyn SH3,
en donde el inmunoligando comprende un motivo de reconocimiento de sortasa y el compuesto citotóxico de bajo peso molecular está modificado con una modificación de Glyn, donde n><1>,
en donde el motivo de reconocimiento de la sortasa es un pentapéptido unido al terminal C del inmunoligando, y en donde el compuesto citotóxico no excede un peso molecular de 2 500 Daltons, es citotóxico para las células de mamíferos y daña y destruye las células cancerosas.
12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la conjugación de inmunoligando-carga útil se realiza en sobrenadante de cultivo celular crudo.
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