ES3034166T3

ES3034166T3 - Method for the production of raav and method for the in vitro generation of genetically engineered, linear, single-stranded nucleic acid fragments containing itr sequences flanking a gene of interest

Info

Publication number: ES3034166T3
Application number: ES20767854T
Authority: ES
Inventors: Kristian Müller; Marco Radukic
Original assignee: Universitaet Bielefeld
Current assignee: Universitaet Bielefeld
Priority date: 2019-09-11
Filing date: 2020-09-11
Publication date: 2025-08-13
Anticipated expiration: 2040-09-11
Also published as: EP3792367A1; EP4028549A1; EP4028549C0; US20220380750A1; EP4640837A2; WO2021048366A1; EP4028549B1

Abstract

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para la generación in vitro de fragmentos de ácido nucleico monocatenario, lineales y modificados genéticamente, que contienen dos secuencias virales de repetición terminal invertida (ITR) que flanquean un gen de interés (GOI). El método se basa en la amplificación por círculo rodante. En otro aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico monocatenario, lineal y aislado que comprende fragmentos de ácido nucleico viral, obtenible mediante un método según la presente invención. Además, se describe un método para la producción de partículas virales recombinantes, en particular, partículas de AAV recombinantes (rAAV), basadas en los fragmentos de ácido nucleico monocatenario lineales. Asimismo, se proporciona un plásmido que comprende elementos específicos de la secuencia de ácido nucleico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para la producción de VAAr y método para la generaciónin vitrode fragmentos de ácido nucleico monocatenarios, lineales y modificados genéticamente, que contienen secuencias de ITR que flanquean un gen de interés

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para la generaciónin vitrode fragmentos de ácido nucleico monocatenarios, lineales y modificados genéticamente, que contienen dos secuencias de repetición terminales invertidas (ITR, por sus siglas en inglés) de VAA que flanquean un gen de interés (GOI, por sus siglas en inglés), estando esencialmente libres de secuencias de ácido nucleico bacteriano. El método se basa en una amplificación por círculo rodante.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado, lineal y monocatenario que comprende fragmentos de ácido nucleico vírico obtenibles mediante un método de acuerdo con la presente invención.

Por otra parte, la invención proporciona un plásmido que comprende secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción que flanquean secuencias ITR de VAA que flanquean un gen de interés (GOI).

Técnica anterior

Los virus adenoasociados (VAA), en particular, el serotipo 2, han ganado una enorme popularidad como vector para la terapia génica, pero también como plataforma para el desarrollo de vacunas y como herramienta en la investigación preclínica. Es decir, los vectores derivados de virus representan uno de los sistemas de suministro de genes más populares para células de mamífero. El interés en las partículas de vector de VAA se basa en varias características beneficiosas que incluyen la apatogenicidad, la alta estabilidad, la capacidad para transducir tanto células en división como células que no están en división, la expresión génica a largo plazo en células posmitóticas o de proliferación lenta y la baja inmunogenicidad. Además, los vectores de VAA recombinantes carecen de actividad integrasa intrínseca y, por lo tanto, se definen como sistemas de vectores no integradores. Esta es una ventaja muy importante en comparación con los vectores retro/lentivíricos, ya que reduce significativamente el riesgo de mutagénesis por inserción. Los vectores de VAA se producen normalmente a partir de cultivos de células de mamíferos o insectos siguiendo protocolos sofisticados.

La investigación y el desarrollo de vectores de virus adenoasociados recombinantes (VAAr) para aplicaciones clínicas se está centrando cada vez más en el interés de las técnicas adecuadas para producir preparaciones de VAAr con un título alto y una pureza mejorada.

El desarrollo se ve impulsado por la reciente aprobación de tres terapias génicas basadas en VAA para enfermedades huérfanas por parte de los organismos reguladores de la UE y los Estados Unidos, en concreto, Glybera, Luxturna y Zolgensma. Son objeto de ensayos clínicos en curso terapias basadas en VAA para indicaciones con mayor prevalencia, incluyendo la hemofilia. Además, la investigación básica divulga cada vez más campos de aplicación, por ejemplo, terapia génica dirigida al sitio con VAAr o terapia génica dirigida a tumores. Un inconveniente muy importante de la terapia con VAAr es el método de producción complejo que usa agentes biológicos en células vivas necesarios para imitar una infección vírica lítica. Normalmente, para producir VAAr se usan células humanas inmortalizadas derivadas de riñón. Su cultivo es caro y propenso a fracasar. Un posible riesgo surge de la posible coinfección de las células productoras con otros virus humanos o de primates. Es difícil eliminar los contaminantes víricos en el producto, en particular, cuando el producto terapéutico final es una partícula similar a un virus (VLP, por sus siglas en inglés) o un vector vírico. Otro problema es la presencia de secuencias de ácido nucleico bacteriano empaquetadas en cápsides de VAA (Chadeuf, G.,et. al.,2005,Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy,12(4), 744-753 y Lecomte, E.,et al.,2015,Molecular Therapy - Nucleic Acids,4(10), e260). Éstas provienen de los plásmidos utilizados para la producción de VAAr en cultivo celular y se empaquetan durante la producción de vectores.

Es probable que deriven del plásmido que codifica las secuencias de virus recombinantes y un gen de interés o secuencia de interés que ha de introducirse en la cápside utilizada para obtener partículas similares a virus para aplicaciones de terapia génica. Sin embargo, estas secuencias bacterianas son potencialmente inmunogénicas. Por lo tanto, para poder cumplir con la creciente demanda de VAAr y seguridad, los métodos actuales para la producción de los mismos deben mejorarse o deben desarrollarse nuevos métodos. Esto es particularmente cierto para aplicaciones terapéuticas repetidas tales como la terapia génica tumoral dirigida. En la terapia génica tumoral dirigida, un amplio espectro de enfermedades tumorales se tratará con altas dosis de VAAr, de forma diferente de las terapias terapéuticas génicas actualmente aprobadas dirigidas a enfermedades huérfanas.

El VAA de tipo silvestre sirve como plataforma para el desarrollo de VAA recombinantes también identificados en el presente documento como vectores de VAA. VAA son un miembro de la familiaParvoviridaey pertenecen al génerodependeparvovirus.Los VAA están compuestos por un genoma de ADN monocatenario de aproximadamente 4,7 kB empaquetado en una cápside de proteína no envuelta, que tiene forma icosaédrica y consiste en 60 monómeros. Los monómeros son una de las proteínas de la cápside vírica VP1, VP2 o VP3. El genoma de ADN regulador o codificante monocatenario de aproximadamente 4,5 kB (más repeticiones terminales invertidas, ITR) lleva dos casetes de genes (rep y cap) que codifican proteínas no estructurales (proteínas Rep y proteína activadora de ensamblaje) y estructurales (VP1, VP2, VP3). El genoma de VAA está flanqueado por ITR, que sirven como señales de empaquetamiento y replicación. El VAA es único por depender de un virus auxiliar como el adenovirus para la producción de progenie.

En los vectores de VAA, los marcos de lectura abiertos víricos se reemplazan por ácidos nucleicos extraños tales como un casete de expresión transgénica o partes de la secuencia de ácido nucleico de VAA únicamente. Los vectores de VAA suministran un ADN monocatenario que codifica la secuencia de interés o el gen de interés flanqueado por las estructuras de ITR víricas. Se diseñan en la conformación del genoma natural o como los denominados genomas de vector autocomplementarios. Los genomas de vector se empaquetan durante la producción de vectores en cápsides de origen naturales (serotipo/variantes) o en cápsides modificadas.

Para producir VAAr para aplicaciones terapéuticas en cultivo de células de mamíferos, el genoma de VAA normalmente se divide en dos plásmidos, donde uno lleva los dos marcos de lectura abiertos del genoma de VAA empobrecidos en ITR y el otro plásmido lleva el gen de interés flanqueado por ITR, que median su encapsidación. Un tercer plásmido proporciona funciones auxiliares adicionales del adenovirus (Matsushita, T.,et al.,1998,Gene Therapy,5(7), 938-945 y Xiao, X., Li, J., y Samulski, R. J., 1998,Journal of Virology,72(3), 2224-2232.). Los dos plásmidos que no llevan ITR pueden combinarse en un plásmido auxiliar. Hay varios serotipos de VAA caracterizados y su tropismo variable puede aprovecharse en terapia para el suministro de genes específicos de tejido. El pseudotipado (pseudoempaquetamiento), una estrategia para cambiar el tropismo de los vectores de VAA, amplía aún más su alcance terapéutico. A nivel genético, también pueden incorporarse secuencias para péptidos específicos de tejido en la cápside para alterar el tropismo.

El problema del empaquetamiento de secuencias bacterianas puede sortearse usando la tecnología de minicírculos de la fábrica de plásmidos, Bielefeld, Alemania (Schnodt, M.,et al.,2016,Molecular Therapy - Nucleic Acids,5(8), e355)(véase también el documentoEP 28620935). El sistema se basa en un plásmido bacteriano que incluye el GOI que ha de empaquetarse en las cápsides, flanqueado por ITR y secuencias de reconocimiento de recombinasa. Durante la producción de minicírculos, el plásmido precursor es modificado por una recombinasa para formar un "minicírculo" bicatenario, cerrado covalentemente, que contiene sólo las ITR, una cicatriz de recombinasa y el gen de interés. El minicírculo después reemplaza el plásmido de GOI durante la producción del vector de VAA. También es posible la generación de minicírculos a partir de los plásmidos auxiliares. La tecnología de minicírculos descrita debería superar el problema de empaquetar las secuencias bacterianas que permanecen en el ADN que ha de incluirse en las cápsides.

Se ha descrito otra técnica para obtener VAAr esencialmente libres de secuencias bacterianas. Scott,et al.,2015Human Vaccines & Immunotherapeutics,11(8), 1972-1982 describen vacunas de ADN circular sintético novedosas, denominadas ADNDoggybone(hueso de perro, en inglés). Este sistema se basa en la aplicación de una amplificación por círculo rodante de un ADN que en última instancia obtiene ADN bicatenario, que se usa para la amplificación por círculo rodante nuevamente, proporcionando de este modo una amplificación exponencial. En una última etapa, una protelomerasa resuelve el producto de amplificación en fragmentos bicatenarios con extremos teloméricos cerrados covalentemente. La empresa Touchlight desarrolla y comercializa adicionalmente esta tecnología. En dicho documento, se divulga el uso de dos enzimas, en concreto, la ADN polimerasa phi 29 y una protelomerasa para generar construcciones de ADN lineales cerradas covalentemente denominadas ADNDoggyboneo ADNdb. Recientemente, se ha descrito la producción de partículas de VAA usando esta tecnología, véase Karbowniczek, K.,et. al.,2017,Cell and Gene Therapy Insights,3(9), 731-738.

Este método se basa en que la construcción de ADN cerrada covalentemente está presente en forma de una construcción de ADN circular. Las solicitudes de patente en trámite con respecto al sistemaDoggybonedescrito incluyen los documentos WO 2018/033730 A1, WO 2016/122129 A1, WO 2016/034849 A1, WO 2012/017210 A1 y WO 2010/086626 A1.

Ambas técnicas para producir VAAr esencialmente libres de secuencias bacterianas conocidas en la técnica anterior, en concreto, la tecnología de minicírculos yDoggybone,proporcionan moléculas de ADN sintéticas diferentes de las moléculas de ADN necesarias para la amplificación del genoma de VAAr y el empaquetamiento en las cápsides víricas, que son moléculas lineales monocatenarias. Por lo tanto, la producción no sigue la vía natural y en ambos casos puede ser subóptima. Por otra parte, la tecnología de minicírculos se basa en la amplificación de ADN en bacterias, donde se sabe que las secuencias de repetición ricas en GC, como las ITR, son inestables. Adicionalmente, la tecnologíaDoggybonese basa en la amplificación de ADN exponencial, posiblemente conduciendo a la acumulación de errores de amplificación en el producto, que surgen especialmente de secuencias de repetición ricas en GC como las ITR.

La producción de VAAr, ineficiente y cara, da como resultado el deseo de proporcionar un ADN monocatenario, que pueda ser un genoma de VAA o un gen de interés (GOI) o secuencias de interés (SOI, por sus siglas en inglés), para mejorar la producción de VAAr.

Se describen enfoques anteriores relacionados con construcciones de vectores de VAAbc y VAAmc en el documento WO 2008/016391 así como en Pinget al.,2015.

La amplificación por círculo rodante se describe en la técnica. En concreto, la amplificación por círculo rodante se refiere a un proceso de amplificación de ácido nucleico unidireccional a partir de un molde de ADN o ARN circular que puede sintetizar múltiples copias concatenadas, o copias de complemento inverso más específicas, de la secuencia molde, tales como plásmidos, genomas de bacteriófagos y el genoma de ARN circular de viroides. Normalmente, se usan técnicas de amplificación de ADN isotérmicas para la amplificación por círculo rodante en la que una polimerasa añade de forma continua nucleótidos individuales a un cebador hibridado con el molde, dando como resultado un ácido nucleico monocatenario con decenas a cientos de copias del molde circular. Las polimerasas útiles aplicables en la amplificación por círculo rodante son la ADN polimerasa obtenible a partir de bacteriófagos tales como la ADN polimerasa phi 29 o la BST y la ADN polimerasa vent (exo-) para la amplificación de ADN, así como la ARN polimerasa T7 para la amplificación de ARN.

Con frecuencia, la técnica de amplificación por círculo rodante se aplica para determinar y detectar dianas con baja abundancia en una muestra.

A partir de lo anterior, queda claro que existe una demanda continua para la producción de fragmentos de ácido nucleico para la introducción en partículas similares a virus o cápsides vacías, en particular, de VAA. Adicionalmente, se desea la provisión de un método para la producción eficiente de VAAr.

Breve descripción de la presente invención

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para la generaciónin vitrode fragmentos de ácido nucleico monocatenarios (ANmc), linealesy modificados genéticamente, que contienen dos secuencias de repetición terminales invertidas de virus adenoasociado (ITR de VAA) que flanquean un gen de interés (GOI), estando esencialmente libres de secuencias de ácido nucleico bacteriano, que comprende las etapas de:

a) Proporcionar un plásmido de ácido nucleico bacteriano que contiene un fragmento de ácido nucleico que contiene las dos secuencias de ITR de VAA y el GOI;

b) Digestión enzimática del plásmido con una primera enzima de restricción (1) o una combinación de al menos dos enzimas de restricción (1) y (4) que generan el fragmento de ácido nucleico bicatenario con extremos compatibles terminales;

c) Aislamiento del fragmento de ácido nucleico bicatenario lineal que contiene el fragmento de ácido nucleico con secuencias ITR de VAA y GOI;

d) Recircularización del fragmento de ácido nucleico bicatenario lineal aislado de la etapa c) para obtener un fragmento de ácido nucleico circular bicatenario unido en los extremos compatibles formados en la etapa b); e) Amplificación del fragmento bicatenario circularizado de d) que contiene dos ITR de VAA y el GOI mediante una técnica de amplificación de ácido nucleico que genera ácidos nucleicos monocatenarios que comprenden al menos dos copias unidas covalentemente (copias de complemento inverso unido) de la cadena molde;

f) Digestión enzimática del producto de amplificación obtenido en la etapa e) con una segunda enzima de restricción (2) o al menos dos enzimas de restricción diferentes (2) y (3) para obtener secuencias de ANmc lineales que comprenden dicho fragmento de ácido nucleico de las dos secuencias de ITR de VAA y el GOI; y g) Purificación de dicho fragmento de ANmc lineal obtenido en la etapa f) que comprende el fragmento de ácido nucleico de las dos secuencias de ITR de VAA y el GOI.

En un aspecto adicional, se proporciona un fragmento de ANmc lineal aislado obtenible mediante un método de acuerdo con la presente invención.

Por último, un plásmido que comprende los siguientes elementos de secuencia de ácido nucleico:

a) Una secuencia de reconocimiento para una primera enzima de restricción (1) que genera extremos, como extremos cohesivos, que son compatibles con los extremos generados de g);

b) En dirección 3', una secuencia de reconocimiento para una segunda enzima de restricción (2) y siendo dicha secuencia de reconocimiento diferente de la secuencia de reconocimiento de a) y g), por lo que la secuencia de reconocimiento se selecciona de las secuencias reconocidas por las enzimas de tipo IIS que generarían un 3'-OH hacia la ITR funcional directamente en dirección 5' o dentro de la secuencia de ITR de c);

c) En dirección 3', una secuencia de ITR de VAA funcional;

d) En dirección 3', el GOI;

e) En dirección 3', una secuencia de ITR de VAA funcional que es idéntica o diferente de la secuencia de ITR de c);

f) En dirección 3', una secuencia de reconocimiento para una tercera enzima de restricción (3) diferente de la secuencia de reconocimiento de a) y g); y la secuencia de reconocimiento es el complemento inverso de la secuencia de b);

En dirección 3', una secuencia de reconocimiento para una cuarta enzima de restricción (4) que genera extremos, que son compatibles con los extremos generados en a); por lo que dicha cuarta enzima de restricción (4) puede ser idéntica o diferente de la primera enzima (1). El plásmido, el VAAr y los otros ANmc descritos en el presente documento son particularmente adecuados en métodos de terapia génica, en particular, la terapia génica basada en VAA. Las enfermedades elegibles para el tratamiento incluyen trastornos monogénicos como la anemia de células falciformes, inmunodeficiencia combinada grave (ADA-SCID/X-SCID, por sus siglas en inglés), fibrosis quística, hemofilia, distrofia muscular de Duchenne, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, hipercolesterolemia, alfa-1 antitripsina, enfermedad granulomatosa crónica, anemia de Fanconi y enfermedad de Gaucher, así como trastornos poligénicos como enfermedades cardíacas, cáncer, diabetes de tipo I y de tipo II, esquizofrenia y enfermedad de Alzhaimer. Otros posibles tratamientos incluyen enfermedades transmisibles, infecciones, enfermedades víricas, neoplasias, enfermedades del sistema inmunitario, síndromes, enfermedades del sistema digestivo, gastroenteropatías, enfermedades del sistema respiratorio, síndromes de inmunodeficiencia, enfermedades de transmisión sexual, dermatopatías, enfermedades pulmonares, enfermedades hepáticas, enfermedades hemáticas, enfermedades metabólicas, trastornos inmunoproliferativos, leucemia, enfermedades linfáticas, enfermedades del sistema endocrino, trastornos mentales, trastornos psicóticos, enfermedades genitales, enfermedades intestinales, enfermedades del cerebro, enfermedades musculoesqueléticas, enfermedades colónicas, enfermedades urológicas, manifestaciones neurológicas, enfermedades rectales, anomalías congénitas, trastornos de la coagulación sanguínea, trastornos hemostáticos, trastornos hemorrágicos, enfermedades de la médula ósea, enfermedades prostáticas y enfermedades neuromusculares.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: La Fig. 1 es un esquema que muestra las diferentes etapas de un método de acuerdo con la presente invención.

Figura 2: La Fig. 2 muestra la producción y la actividad biológica de los fragmentos de acuerdo con la presente invención (Fig. 2a y 2b) y de las partículas de virus obtenidas de acuerdo con la presente invención.

Descripción detallada

La invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

Los presentes inventores tienen como objetivo proporcionar un nuevo método para la generaciónin vitrode fragmentos de ácido nucleico monocatenarios (ANmc), lineales y modificados genéticamente que son útiles para su incorporación en vectores víricos. El método de acuerdo con la presente invención se basa en una amplificación por círculo rodante que da como resultado fragmentos de ANmc. Es decir, la presente invención se refiere a un método para la generaciónin vitrode fragmentos de ANmc, lineales y modificados genéticamente, que contienen dos secuencias de repetición terminales invertidas (ITR, por sus siglas en inglés) de VAA que flanquean un gen de interés (GOI, por sus siglas en inglés), estando esencialmente libres de secuencias de ácido nucleico bacteriano, que comprende las etapas de:

d) Recircularización del fragmento de ácido nucleico bicatenario lineal aislado de la etapa c) para obtener un fragmento de ácido nucleico circular bicatenario unido en los extremos compatibles formados en la etapa b); e) Amplificación del fragmento bicatenario circularizado de d) que contiene dos ITR de VAA y el GOI mediante una técnica de amplificación de ácido nucleico que genera ácidos nucleicos monocatenarios que comprenden al menos dos copias unidas covalentemente (copias complementarias inversas unidas) de la cadena molde; f) Digestión enzimática del producto de amplificación obtenido en la etapa e) con una segunda enzima de restricción (2) o dos enzimas de restricción diferentes (2) y (3) para obtener secuencias de ANmc lineales que comprenden dicho fragmento de ácido nucleico de las dos secuencias de ITR de VAA y el GOI; y

g) Purificación de dicho fragmento de ANmc lineal obtenido en la etapa f) que comprende el fragmento de ácido nucleico de las dos secuencias de ITR de VAA y el GOI.

También se divulga un método para la generaciónin vitrode fragmentos de ANmc, lineales y modificados genéticamente, que contienen dos secuencias de repetición terminales invertidas (ITR) víricas que flanquean un gen de interés (GOI), estando esencialmente libres de secuencias de ácido nucleico bacteriano, que comprende las etapas de:

a) Proporcionar un plásmido de ácido nucleico bacteriano que contiene el fragmento de ácido nucleico que contiene las dos secuencias de ITR víricas y el GOI,

b) Digestión enzimática del plásmido con una primera enzima de restricción (1) o una combinación de al menos dos enzimas de restricción (1) y (4) que generan extremos compatibles con el fragmento de ácido nucleico bicatenario,

c) Aislamiento de los fragmentos de ácido nucleico bicatenario lineales que contienen el fragmento de ácido nucleico con secuencias ITR de VAA y GOI;

d) Recircularización de los fragmentos de ácido nucleico bicatenario lineal aislados de la etapa c) para obtener fragmentos de ácido nucleico circular bicatenario unidos en los extremos compatibles formados en la etapa b); e) Amplificación de fragmentos de ácido nucleico monocatenario que comprenden más de un fragmento de ácido nucleico con las dos secuencias de ITR víricas y el GOI del fragmento de ácido nucleico circular bicatenario de d) como el molde por lo que más de un fragmento de ácido nucleico se une covalentemente entre sí;

f) Digestión enzimática del producto de amplificación obtenido en la etapa e) con una segunda enzima de restricción (2) o al menos dos enzimas de restricción diferentes (2) y (3) que generan extremos compatibles para obtener secuencias de ANmc lineales que comprenden dicho fragmento de ácido nucleico de la dos secuencias de ITR víricas y el GOI; y

g) Purificación de dicho fragmento de ANmc lineal obtenido en la etapa f) que comprende el fragmento de ácido nucleico de las dos secuencias de ITR víricas y el GOI.

Es decir, los presentes inventores reconocieron que aplicar la amplificación por círculo rodante a un plásmido bacteriano diseñado específicamente con las funciones específicas descritas permite obtener fragmentos de ANmc lineal que contienen secuencias de ITR víricas funcionales y un gen de interés esencialmente libre, en particular, libre de cualquier secuencia bacteriana lo que aumenta la seguridad y la apatogenicidad de las partículas víricas resultantes. Los fragmentos de ANmc lineales conservan su función biológica y son adecuados para la producción de partículas de virus recombinantes. En particular, es posible la producciónin vitrode partículas víricas a partir de partículas similares a virus y la producción de VAArin vitrocon una carga adecuada de fragmentos de ácido nucleico. Dicha carga incluye el fragmento de ANmc lineal de acuerdo con la presente invención. En concreto, el fragmento de acuerdo con la presente invención obtenible mediante el método de acuerdo con la presente invención representa un sustrato óptimo para el empaquetamientoin vitro,obteniéndose, por lo tanto, partículas víricas, como VAAr. El uso de los fragmentos de ANmc lineales de acuerdo con la presente invención permite reducir el proceso de producción y los costes de la producción, así como aumentar los aspectos de seguridad, etc.

Como se usa en el presente documento, la expresión "modificada genéticamente" se refiere a una molécula de ácido nucleico modificada artificialmente obtenida mediante tecnología de ácido nucleico recombinante.

La expresión "ácido nucleico" incluye ADN, ARN, así como variantes del mismo, tales como ARNip, miARN, así como otras variantes de ácido nucleico conocidas como PNA (por sus siglas en inglés), ácido nucleico de bloqueo (LNA, por sus siglas en inglés), así como ácido nucleico de glicol (GNA, por sus siglas en inglés) y ácido nucleico de triosa (TNA, por sus siglas en inglés) cuando sea apropiado.

La expresión "secuencia o secuencias de ITR" se refiere a que la secuencia de ácido nucleico que sirve como el origen de replicación vírica también se requiere para el empaquetamiento. Es decir, una ITR funcional incluye las señales de empaquetamiento y de replicación. Normalmente, las ITR están presentes en los extremos del genoma vírico, como en los genomas de virus adenoasociados.

De acuerdo con la presente invención, al identificar las secuencias de ITR, las secuencias de ITR se basan en secuencias víricas como se describen en la técnica o fragmentos de las mismas, por lo que dichos fragmentos de acuerdo con la presente invención son fragmentos de ITR que tienen la misma funcionalidad principal que las secuencias de ITR completas, en concreto, permitiendo el empaquetamiento y la replicación. Por ejemplo, Zhou, Q.,et. al.,2017,Scientific Reports,7(1), 5432, describe secuencias de ITR mínimas.

La expresión "sustancialmente libre de secuencias de ácido nucleico bacteriano", como se usa en el presente documento, identifica que los fragmentos de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención no contienen ninguna secuencia de ácido nucleico bacteriano, en concreto, secuencias de ácido nucleico derivadas del plásmido bacteriano o que contienen sólo muy pocas bases de ácido nucleico bacteriano, como máximo 40, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 base de ácido nucleico.

En particular, la ausencia total de secuencias bacterianas aumenta la seguridad en la producción de VAAr mediante empaquetamientoin vitro,en particular, estas partículas de virus recombinantes, como VAAr, son útiles en terapia génica.

Como se usan en el presente documento, las expresiones "extremos compatibles" y "extremos cohesivos" se refieren a cinco extremos primarios y tres extremos primarios de fragmentos de ácido nucleico bicatenario en donde al menos un ácido nucleico sobresale del fragmento bicatenario, en concreto, siendo un ácido nucleico no apareado de una sola cadena, por lo tanto, que representa extremos cohesivos. Estos extremos compatibles normalmente se generan mediante enzimas de restricción. Con un par de bases complementarias o pares de bases complementarias, estos salientes o extremos adhesivos representan los extremos compatibles, capaces de formar ácidos nucleicos bicatenarios. Adicionalmente, los extremos compatibles también incluyen extremos romos, en concreto, fragmentos bicatenarios en donde ambas cadenas terminan en un par de bases.

La expresión "enzima de restricción" incluye enzimas adecuadas que digieren moléculas de ácido nucleico bicatenario, que pueden ser enzimas de restricción convencionales conocidas en la técnica o enzimas de restricción de diseño que pueden basarse en enzimas CRISPR, TALEN o nucleasas con dedos de cinc y endonucleasas autodirigidas.

Las expresiones "Tipo IIS" o "Enzimas de tipo IIS" se refieren a endonucleasas de restricción que reconocen una secuencia de ADN específica y escinden de forma desplazada, fuera de la secuencia de reconocimiento, independientemente de su simetría de diana, de la complejidad de la estructura enzimática o de requisitos de cofactores.

El término "amplificación" se refiere a la duplicación repetida o síntesis mediante molde de ácidos nucleicos. La amplificación es posible mediante diversos métodos, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa, la amplificación por círculo rodante y la amplificación isotérmica (mediada por bucle).

Las expresiones "secuencia complementaria" o "complementaria" se refieren a una molécula de ácido nucleico que puede emparejarse con otra molécula de ácido nucleico dada para formar una estructura bicatenaria haciendo coincidir pares de bases.

Las expresiones "partícula de vector", o "vector" o "partícula de virus" identifican una cápside vírica que contiene ácido nucleico vírico transcripcionalmente activo, como el DNA.

Las expresiones "partícula" o "partícula similar a virus (VLP)" identifican una cápside sin ácido nucleico, como el ADN, o que contiene ácido nucleico no vírico, como el DNA.

El término "VAA" se refiere al virus adenoasociado o derivados del mismo que incluyen partículas de vector de VAA recombinantes en donde la expresión "partícula de VAA de tipo silvestre" designa la cápside del virus adenoasociado tal como se produce en la naturaleza sin ADN o que contiene ADN. La expresión "VAA recombinante" o "partícula de vector recombinante" es un VAA en donde el genoma del virus se reemplaza por un genoma de vector, en concreto, un ADN extraño para introducirlo en una célula. Dicho VAA recombinante también se denomina "VAAr". El término "VAA" o la partícula de vector de VAA recombinante respectiva y la partícula de tipo silvestre de VAA incluyen al menos 13 serotipos diferentes conocidos en la técnica. El VAA del serotipo humano 2 también se menciona como VAA 2 o partícula de VAA 2 o partícula de vector de VAA 2. VAA 2 es una realización preferida. El término VAA y sus variaciones también se refieren a cápsides pseudotipificadas, quiméricas o modificadas racionalmente.

La expresión"in vitro",como se usa en el presente documento, se refiere a un método sin células para obtener el ANmc de acuerdo con la presente invención. No se requiere incubación con, o transformación de material biológico vivo, etc. a partir del plásmido para obtener el ANmc de acuerdo con la presente invención.

Como se usa en el presente documento, la expresión "pureza monocatenaria" se refiere a la fracción de secuencias en la muestra que son monocatenarias en contraposición a las secuencias que son bicatenarias por hibridación con una contracadena.

En una realización de la presente invención, el fragmento de ANmc lineal, modificado genéticamente, de acuerdo con la presente invención, que contiene las dos secuencias de repetición víricas terminalmente invertidas que flanquean un gen de interés, está libre de secuencias de ácido nucleico bacteriano. Por lo tanto, es posible aumentar la seguridad de las partículas de virus que lo contienen, así como aumentar la viabilidad para la aprobación de fármacos.

El genoma del vector, como el ADN extraño que ha de introducirse en las células, presente en la partícula de vector recombinante o VAA recombinante, puede ser el genoma del virus natural, como el genoma de VAA natural o, en otra realización, un ADN extraño que contiene un GOI o una SOI que ha de introducirse en la célula.

Los ejemplos típicos de un gen de interés o una secuencia de interés que han de introducirse en la célula, por ejemplo, en terapia génica, incluyen genes que codifican: moléculas de adhesión, antígenos, ADN antisentido, inhibidor del ciclo celular, marcador de resistencia a fármacos, citocinas, reemplazos de enzimas, factores de crecimiento, hormonas, marcadores, reguladores de oncogenes, porinas, canales iónicos, transportadores, receptores, inhibidores de la replicación, ribozimas, ARNip, genes suicidas, factores de transcripción, supresores tumorales, secuencias derivadas de anticuerpos y miméticos de anticuerpos tales como DARPin, Aficuerpos, Anticalinas, Adenectinas, Afilinas y Nanocuerpos.

En una realización de la presente invención, el método para la generaciónin vitrode fragmentos de ácido nucleico vírico monocatenario lineal es un método que usa una enzima de restricción (1) y/o (4) que genera extremos cohesivos. Estas enzimas de restricción (1) y/o (4) incluyen enzimas de tipo II, como Pstl, endonucleasas de tipo IIS y endonucleasas de diseño.

En otra realización del método de acuerdo con la presente invención, siendo la enzima de restricción (2) y/o (3) diferente de las enzimas de restricción (1) y (4) es una enzima de restricción de corte de extremos romos, por ejemplo, de tipo II, como Pvull, o de tipo IIS o una endonucleasa de diseño. Como alternativa, la segunda enzima de restricción puede ser una enzima que genera extremos cohesivos.

En otra realización, la secuencia para la enzima de restricción (2) y (3) y las secuencias adyacentes respectivas se planifican de manera que puedan formar un ADN bicatenario cuando solo hay presente una cadena de ADN y que este sitio bicatenario sirva como un sitio de reconocimiento para una enzima de restricción y, opcionalmente, permanezca bicatenario hasta las secuencias de ITR cercanas.

En otra realización, la enzima de restricción que reconoce la parte bicatenaria formada dentro del ADN monocatenario adyacente a las ITR es una enzima de tipo IIS que corta el ADN monocatenario plegado en una doble cadena hasta la ITR de manera que se genera directamente un 3'-OH al final o dentro de una ITR. El número y la composición de nucleótidos entre el ADN plegado a una secuencia de reconocimiento y la secuencia de ITR pueden ajustarse. Este método tiene la ventaja de que pueden generarse fragmentos de ITR-GOI mediante digestión del ADNmc, por un lado, independientemente de las secuencias de ITR y, por otro lado, con diferentes longitudes de ITR hasta la longitud de ITR completa.

En una realización, pueden usarse enzimas de restricción (1) y (4) para digerir el ácido nucleico bicatenario en fragmentos con extremos compatibles. Lo mismo es posible para las enzimas de restricción (2) y (3).

En una realización de la presente invención, el método para la generaciónin vitrode fragmentos de ácido nucleico vírico modificado genéticamente monocatenario lineal es un método en donde el plásmido que contiene fragmentos de ácido nucleico vírico que contiene los elementos de secuencia:

b) En dirección 3', una secuencia de reconocimiento para una segunda enzima de restricción (2) que es capaz de complementarse con la secuencia en f) y siendo dicha secuencia de reconocimiento diferente de la secuencia de reconocimiento de a) y g);

c) En dirección 3', una secuencia deITRde VAA funcional;

d) En dirección 3', el GOI;

f) En dirección 3', una secuencia de reconocimiento para una tercera enzima de restricción (3) que es capaz de complementarse con la secuencia en b) pero diferente de la secuencia de reconocimiento de a) y g); por lo que la tercera enzima de restricción (3) puede ser idéntica o diferente de la segunda enzima de restricción (2) de b); g) En dirección 3', una secuencia de reconocimiento para una cuarta enzima de restricción (4) que genera extremos, que son compatibles con los extremos generados en a); por lo que dicha cuarta enzima de restricción (4) puede ser idéntica o diferente de la primera enzima (1); por lo que, si se usan enzimas de restricción, que pueden cortar a diferentes distancias con respecto al sitio de reconocimiento, las secuencias de reconocimiento en a) y b) así como en f) y g) pueden estar en la misma posición y hasta todas las secuencias de reconocimiento pueden ser idénticas.

Es decir, el método para la generaciónin vitrode fragmentos de ácido nucleico vírico modificado genéticamente monocatenario lineal es un método en donde el plásmido que contiene fragmentos de ácido nucleico vírico que contiene los elementos de secuencia:

a) Una secuencia de reconocimiento para una enzima de restricción (1) que genera extremos, como extremos cohesivos, que son compatibles con los extremos generados de g);

b) En dirección 3', una secuencia de reconocimiento para una enzima de restricción (2) que genera extremos, como extremos cohesivos, que son compatibles con los extremos generados de f), y siendo dicha secuencia de reconocimiento diferente de la secuencia de reconocimiento de a) y g);

c) En dirección 3', una secuencia de ITR de VAA funcional;

d) En dirección 3', el GOI;

e) En dirección 3', una secuencia de ITR de VAA funcional que es idéntica o diferente de la secuencia de ITR funcional de c);

f) En dirección 3', una secuencia de reconocimiento para una enzima de restricción (3) que genera extremos que son extremos generados compatibles de b) pero diferentes de los extremos de a) y g), por lo que la enzima de restricción (3) puede ser idéntica o diferente de la enzima de restricción (2) de b);

g) En dirección 3', una secuencia de reconocimiento para una enzima de restricción (4) que genera extremos, que son compatibles con los extremos generados en a.), por lo que dicha enzima de restricción (4) puede ser idéntica o diferente de la enzima de restricción (1); por lo que si se usan enzimas de restricción, que pueden cortar a diferentes distancias con respecto al sitio de reconocimiento, las secuencias de reconocimiento en a) y b) así como en f) y g) pueden estar en la misma posición y hasta todas las secuencias de reconocimiento pueden ser idénticas.

En otra realización, la etapa de recircularización del fragmento de ácido nucleico en la etapa b) puede realizarse mediante una ligasa, en particular, una ligasa T4. El experto en la materia es muy consciente de las enzimas y condiciones adecuadas para la recircularización del fragmento de ácido nucleico bicatenario en los extremos compatibles obtenidos después de la digestión con las enzimas de restricción.

En otra realización, el método incluye la etapa de proporcionar un oligonucleótido, que es un oligonucleótido de ADN o ARN con extremos 5' libres o modificados, al ácido nucleico aislado recircularizado obtenido en la etapa d) e hibridar dicho oligonucleótido específicamente con una única cadena de ácido nucleico de dicho ácido nucleico. Como alternativa, el ácido nucleico obtenido en la etapa d) contiene un sitio de mella que permite cortar específicamente una cadena de dicho ácido nucleico. El experto conoce bien las enzimas de mella adecuadas, como la endonucleasa de mella, por ejemplo, Nt.BspQI.

En otra realización, el ácido nucleico obtenido en la etapa d) se mella en una cadena mediante una enzima de corte adecuada y después se somete a una exonucleasa como la T5 exonucleasa, dejando atrás un molde circular monocatenario a la que se le proporciona un oligonucleótido que es un oligonucleótido de ADN o ARN con extremos 5' libres o modificados.

Otra realización de la presente invención se refiere a un método en donde la hibridación del oligonucleótido se realiza mediante desnaturalización térmica del ácido nucleico obtenido en la etapa d) y posterior enfriamiento de la mezcla de reacción.

En otra realización, el método que incluye las etapas de i) aislamiento del ácido nucleico bicatenario obtenido en la etapa d) y/o ii) purificación del ácido nucleico monocatenario lineal en la etapa h), se realiza mediante electroforesis o cromatografía de intercambio iónico o cromatografía de adsorción de sílice.

En otra realización, la presente invención se refiere a un método en donde la etapa de amplificación e) se realiza enzimáticamente mediante una polimerasa. La polimerasa es, en una realización preferida, la polimerasa phi29. La etapa de amplificación puede ser una reacción isotérmica, lo que evita los ciclos térmicos.

Es decir, una realización preferida se refiere a un método en donde la etapa de amplificación e) se realiza en presencia de la polimerasa phi29 como amplificación de ácido nucleico isotérmica, en particular, amplificación de ADN isotérmica.

En otra realización, durante la amplificación hay presente una proteína de unión monocatenaria (SSB, por sus siglas en inglés). El experto conoce bien las SSB adecuadas, como la Proteína del gen 32 similar a T4.

Adicionalmente, la presente invención se refiere a un método en donde en la etapa e) el producto obtenido mediante amplificación del fragmento de ADN circular monocatenario se desnaturaliza por calor y se enfría para facilitar la hibridación de secuencias de sitios de restricción y repeticiones terminales invertidas adyacentes para formar una horquilla bicatenaria que contiene un sitio de restricción funcional. Esta horquilla bicatenaria que contiene el sitio de restricción funcional es particularmente útil para el procesamiento adicional.

En una realización adicional, la hibridación del producto obtenido mediante la amplificación del fragmento de ADN circular monocatenario da como resultado la formación de una desoxirribozima autohidrolizante útil para el procesamiento adicional.

En una realización adicional, se proporciona un ANmc lineal aislado que comprende fragmentos de ácido nucleico vírico obtenibles mediante un método de acuerdo con la presente invención. Dicho ácido nucleico monocatenario lineal aislado, en particular, un genoma de ADN, es útil para la preparación de virus recombinantes, en particular, VAAr, para aplicaciones médicas, en particular, la terapia génica.

El ANmc lineal aislado tiene una pureza monocatenaria de al menos el 80 %, como al menos el 85 %, el 88 %, el 90 % o más. La pureza puede estar por encima del 92 % como el 95 %.

Adicionalmente, la presente divulgación proporciona un método para la producción de partículas de virus recombinantes, en particular, partícula de VAA recombinante (VAAr) que comprende la etapa de empaquetamiento del ANmc lineal que comprende fragmentos de ácido nucleico vírico de acuerdo con la reivindicación 10, o la etapa de empaquetamiento del fragmento de ANmc lineal que comprende fragmentos de ácido nucleico vírico, como fragmentos de ADN, obtenibles mediante un método de acuerdo con la presente invención en una partícula similar a un virus, i) transfectando dicho ANmc en células que contienen los genes y moléculas adicionales para obtener la partícula de virus recombinante, en particular, VAAr, ii) transfectando dicho ANmc y plásmidos adicionales que contienen funciones auxiliares o iii) transfectando dicho ANmc y coinfectando con virus que proporcionan funciones auxiliares. Adicionalmente, pueden producirse partículas de virus recombinantes, como el VAAr, sin células, es decir, sin ninguna célula eucariota, introduciendo el ANmc de acuerdo con la presente invención en VLP, como cápsides de VAA, producido en células procariotas o mediante síntesis química.

El método para la producción de partículas de virus recombinantes, en particular, VAAr, puede realizarse por medios conocidos. Por ejemplo, el fragmento de ANmc lineal modificado genéticamente aislado de acuerdo con la presente invención u obtenible mediante un método de acuerdo con la presente invención se incluye en una partícula similar a un virus. Se prefiere particularmente que el método sea un métodoin vitropara obtener VAAr útil en terapia génica. La generaciónin vitroy el empaquetamientoin vitroaumentan la seguridad del producto obtenido. Por ejemplo, las cápsides víricas que no contienen ningún ADN pueden producirse en células adecuadas y el fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención se introduce en dichas cápsides víricas vacías en un punto temporal posterior. Las células adecuadas para producir cápsides vacías incluyen células derivadas de riñón humano, otras células humanas, células de ovario de hámster, otras células de mamíferos, levadura, células de insecto, arqueas y células bacterianas, células de algas y otras células vegetales. En una realización del método de acuerdo con la presente invención para la producción de partículas de virus recombinantes, dicho método es una producción libre de células de virus, en particular, VAA. En otro aspecto, el propio VAA recombinante se divulga obtenible mediante un método de acuerdo con la presente invención para producir partículas de virus recombinantes. Dichos VAAr contienen el ANmc lineal modificado genéticamente aislado de acuerdo con la presente invención.

Adicionalmente, la presente invención proporciona un plásmido que comprende los siguientes elementos de secuencia de ácido nucleico:

c) En dirección 3', una secuencia de ITR de VAA funcional;

d) En dirección 3', el GOI;

f) En dirección 3', una secuencia de reconocimiento para una tercera enzima de restricción (3) diferente de la secuencia de reconocimiento de a) y g), y la secuencia de reconocimiento es el complemento inverso de la secuencia de b);

g) En dirección 3', una secuencia de reconocimiento para una cuarta enzima de restricción (4) que genera extremos, que son compatibles con los extremos generados en a); por lo que dicha cuarta enzima de restricción (4) puede ser idéntica o diferente de la primera enzima (1).

Es decir, la presente divulgación proporciona además un plásmido que comprende los siguientes elementos de secuencia de ácido nucleico:

b) En dirección 3', una secuencia de reconocimiento para una segunda enzima de restricción (2) que genera extremos, como extremos cohesivos, que son compatibles con el extremo generado de f) y siendo dicha secuencia de reconocimiento diferente de la secuencia de reconocimiento de a) y g);

c) En dirección 3', una secuencia de ITR funcional;

d) En dirección 3', el GOI;

e) En dirección 3', una secuencia de ITR funcional que es idéntica o diferente de la secuencia de ITR funcional de c);

f) En dirección 3', una secuencia de reconocimiento para una tercera enzima de restricción (3) que genera extremos que son compatibles con los extremos generados en b) pero diferentes de la secuencia de reconocimiento de a) y g); por lo que la tercera enzima de restricción (3) puede ser idéntica o diferente de la segunda enzima de restricción (2) de b);

g) En dirección 3', una secuencia de reconocimiento para una cuarta enzima de restricción (4) que genera extremos, que son compatibles con los generados en a), por lo que dicha cuarta enzima de restricción (4) puede ser idéntica o diferente de la primera enzima (1), por lo que si se usan enzimas de restricción, que pueden cortar a diferentes distancias con respecto al sitio de reconocimiento, las secuencias de reconocimiento en a) y b) así como f) y g) pueden estar en la misma posición y hasta todas las secuencias de reconocimiento pueden ser idénticas.

En una realización, el plásmido comprende los siguientes elementos de secuencia de ácido nucleico:

c) En dirección 3', una secuencia de ITR funcional;

d) En dirección 3', el GOI;

f) En dirección 3' de una secuencia de reconocimiento para una tercera enzima de restricción (3) diferente de las secuencias de reconocimiento de a) y g); y la secuencia de reconocimiento es el complemento inverso de la secuencia de b);

g) En dirección 3', una secuencia de reconocimiento para una cuarta enzima de restricción (4) que genera extremos, que son compatibles con los extremos generados en a), por lo que dicha cuarta enzima de restricción (4) puede ser idéntica o diferente de la primera enzima (1).

El plásmido de acuerdo con la presente invención es, por ejemplo, un plásmido en donde la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción (2) y (3) se selecciona del conjunto de secuencias de enzimas de Tipo IIS seleccionadas de Aarl, Acc36I, AcIWI, Acul, Alw261, AlwI, AsuHPI, BbsI, BbvI, BccI, BceAI, BciVI, BcoDI, BfuAI, Bful, Bmrl, BmsI, Bmul, Bpil, Bpml, BpuEI, Bsal, Bse3DI, BseGI, BseMII, BseRI, BseXI, BsgI, BsIFI, BsmBI, BsmFI, Bso31I, BspCNI, BspMI, BspPI, BspQI, BspTNI, BsrDI, Bst6l, BstF5I, BstMAI, BstV11, BstV2I, Bsul, BtgZI, BtsCI, BtsIMutI, BtsaI, Bvel, Csel, Eam1104I, Earl, Ecil, Eco57I, Esp3l, FaqI, Faul, Fokl, Gsul, Hgal, Hphl, HpyAV, Lgul, Lsp1109I, Lwel, Mboll, Mfel, Mlyl, Mmel, NmeAIII, PciSI, Plel, PpsI, Sapl, Schl, SfaNI, TaqII, TspDTI o TspGWI. El plásmido puede contener adicionalmente una secuencia para una enzima de mella, como una endonucleasa de mella. Dicha secuencia de reconocimiento puede estar presente preferentemente en la secuencia de GOI. Lo mismo es cierto para el plásmido descrito en el método de acuerdo con la presente invención.

El plásmido puede contener adicionalmente una secuencia para una desoxirribozima autohidrolizante. Dicha secuencia de desoxirribozima puede estar presente preferentemente en dirección 3' de la primera secuencia de reconocimiento para la enzima de restricción (1) y también puede estar presente en dirección 5' de la secuencia de reconocimiento para una cuarta enzima de restricción (4) donde su secuencia puede invertirse o no en comparación con su primera aparición. Cuando la secuencia o secuencias para una desoxirribozima autohidrolizante están presentes, pueden omitirse las secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción para una segunda (2) y tercera (3) enzimas de restricción. Las secuencias para la desoxirribozima autohidrolizante presente en el plásmido pueden ser idénticas o diferentes. Lo mismo es cierto para el plásmido descrito en el método de acuerdo con la presente invención.

En una realización adicional, el plásmido contiene la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción (2) y (3) que se ubica para cortar directamente en dirección 5' o en dirección 3', respectivamente, del primer o último nucleótido respectivo de las secuencias de ITR.

La composición de secuencia del plásmido de acuerdo con la presente invención permite generar un fragmento de ANmc lineal que no contiene o que está esencialmente libre de secuencias de ácido nucleico bacteriano. En particular, el plásmido de acuerdo con la presente invención es particularmente adecuado para la generaciónin vitrode dicho ANmc que contiene dos secuencias de ITR víricas que flanquean un GOI de acuerdo con la presente invención.

En una realización adicional, los elementos de secuencia proporcionados por la estructura del plásmido de acuerdo con la presente invención libres de ácido nucleico bacteriano pueden prepararse mediante síntesis química en fase sólida, dando como resultado un ADNmc lineal. Adicionalmente, el ADNmc lineal puede circularizarse mediante una ligasa de ADNmc adecuada como CircLigase (Lucigen), que sirve como molde para la amplificación por círculo rodante de acuerdo con la presente invención.

La invención se describirá con más detalle haciendo referencia a la figura 1.

La Figura 1 proporciona una descripción general del plásmido de vector y las diversas etapas del método para la generaciónin vitrode fragmentos de ANmc lineales y modificados genéticamente, que contienen dos secuencias de repetición terminales invertidas (ITR) víricas que flanquean un gen de interés (GOI) de acuerdo con la presente invención. El esquema (A) representa el plásmido de vector útil para la producción de genoma sintético. Contiene ITR de tipo silvestre de VAA 2 mostradas en negro. Este tipo de ITR está presente en la mayoría de los plásmidos de vector de VAA utilizados actualmente. Las dos secuencias de ITR están flanqueando el GOI, en este caso, un promotor (sombreado), seguido de la secuencia codificante de una proteína indicadora de fluorescencia (discontinua), seguido además de una secuencia de señal de poliadenilación (cuadriculada). Los sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción Pstl y Pvull se proporcionan como un prefijo o sufijo de ITR para la escisión y la recircularización, así como la resolución del producto por círculo rodante.

En este caso, el prefijo de ITR contiene un sitio Pstl, por lo tanto, permitiendo la digestión enzimática de acuerdo con la etapa b) del método de acuerdo con la presente invención. El esquema (B) muestra el resultado de la digestión con Pstl, que genera dos fragmentos, de los que sólo se procesa adicionalmente el fragmento que contiene el GOI. Después del aislamiento del fragmento que contiene el GOI, la recircularización se logra con los extremos cohesivos generados por Pstl, por lo tanto, obteniendo un molde circular bicatenario para la amplificación por círculo rodante como se muestra en el esquema (C) de la figura 1. Es decir, la digestión con la primera enzima de restricción (1) y la cuarta enzima de restricción (4), en este caso ambas Pstl, produce un fragmento de cadena principal compuesto por secuencias bacterianas que se descartan y el fragmento de GOI. El fragmento de GOI se recirculariza en la etapa d) del método de acuerdo con la presente invención mediante autoligadura para producir un fragmento de ácido nucleico bicatenario mostrado en el esquema (C). Este molde contiene dos ITR adyacentes en una configuración complementaria inversa cabeza a cabeza. Se conservan un sitio de Pstl y los dos sitios de Pvull. Los dos sitios de Pvull corresponden a los sitios de restricción para la segunda enzima de restricción (2) y la tercera enzima de restricción (3).

La amplificación por círculo rodante de la etapa e) del molde circular representada en el esquema (C) con un cebador único produce multímeros de alto peso molecular monocatenarios del genoma sintético de VAA con una única polaridad mostrada en (D). Los multímeros están presentes como monómeros unidos covalentemente del ANmc que contiene las dos secuencias de ITR víricas que flanquean el GOI.

La naturaleza de cabeza a cabeza del amplicón conduce probablemente a la formación de horquilla en la cicatriz de recircularización en la que la secuencia planificada deliberadamente de las cadenas adyacentes se complementa entre sí para generar un sitio de restricción bicatenario, en este caso, Pvull, que se usa para liberar el monómero de genoma con la enzima de restricción respectiva. El esquema (E) ilustra un recorte de esta estructura de horquilla mostrada junto con la horquilla de Pstl y el sitio de restricción de Pvull. Incluso si las dos ITR forman una estructura en forma de Y como se muestra en el esquema (F), probablemente se forma una horquilla lateral de reconocimiento de enzimas de restricción corta entre dos ITR y es suficiente para la escisión. Se observa que la estructura secundaria del ADN obtenido después de la amplificación por círculo rodante adecuada para cortar por las enzimas de restricción como se describe es distinta de la estructura en forma de Y propuesta para las ITRin vivo.La digestión enzimática del producto de amplificación da como resultado fragmentos de ácido nucleico lineales monocatenarios. En particular, las secuencias de ITR complementarias inversas pueden permanecer bicatenarias después de la escisión del monómero hasta su procesamiento adicional.

Por lo tanto, el método de acuerdo con la presente invención es diferente de los métodos descritos hasta ahora. El fragmento de ANmc lineal obtenido después de la segunda digestión se purifica adicionalmente, por ejemplo, por medio de cromatografía de intercambio iónico. Por lo tanto, es posible obtener un fragmento de ANmc lineal que está listo para empaquetarse en partículas similares a virus o cápsides. La invención se describirá con más detalle a continuación por medio de ejemplos. Está claro que los ejemplos no restringen la materia objeto de la presente invención.

Ejemplo:

Se proporcionó un plásmido como se muestra en la figura 1 que contiene: De 5' a 3': un sitio de restricción de Pstl seguido de un sitio de restricción de Pvull, seguido directamente de una secuencia de ITR de VAA2 funcional como está presente en plásmidos de vector de VAA comunes, seguido además de un promotor de citomegalovirus, seguido de la secuencia codificante para la proteína indicadora de fluorescencia mKate2, seguida de la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento humana como se muestra en la SEQ ID NO: 1. La secuencia va seguida además de un complemento inverso de la secuencia de ITR 5' que alberga una supresión de las nucleobases de ITR 5'-TTT-Gc CCGGGC (SEQ ID NO: 2), y de los sitios de restricción de Pvull y Pstl. Son elementos de secuencia 3' adicionales un origen de replicación de pBR322, un gen de resistencia a ampicilina y un origen de replicación f1.

En una primera etapa, la digestión enzimática del plásmido se realizó usando Pstl de la siguiente manera: se digirieron 10 pg del plásmido descrito anteriormente con 2 pl de Pstl-HF disponible en el mercado (New England Biolabs) de acuerdo con las instrucciones del fabricante en un volumen final de 50 pl y en el tampón sugerido por el fabricante durante al menos 2 horas a 37 °C.

Los fragmentos obtenidos se separaron mediante electroforesis, aislando de este modo el fragmento de ácido nucleico bicatenario que contiene el fragmento de ácido nucleico con secuencias de ITR víricas y el GOI. La separación se realizó en un gel de agarosa en tampón de Tris-Acetato-EDTA. La extracción en gel se realizó con un kit disponible en el mercado (NucleoSpin Gel y<p>C<r>Clean-up, Macherey-Nagel). El fragmento aislado después se recircularizó usando ligasa T4 disponible en el mercado (Thermo Scientific). Se preparó una mezcla de reacción de 200 pl que contenía 300 ng de fragmento aislado, 10 pl de ligasa T4 y tampón de reacción de polimerasa phi29 disponible en el mercado (New England Biolabs) suplementados a una concentración final de ATP 1 mM y DTT 10 mM. La mezcla se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente.

Los fragmentos de ácido nucleico bicatenario circulares obtenidos de este modo unidos en los extremos compatibles formados por digestión con PstI después se hibridaron con un cebador 5-GGCGGAGTTGTTACGACA (SEQ ID. NO: 3) añadiendo el cebador a una concentración final de 180 nM e incubando la mezcla de reacción a 95 °C durante dos minutos y enfriándola de nuevo a temperatura ambiente. Se añadió una polimerasa con alta procesabilidad y fuerte actividad de desplazamiento de cadena, en este caso polimerasa phi29, a los fragmentos de ADN circulares para iniciar la amplificación. Para la amplificación, la mezcla se llevó a un volumen final de 300 pl incluyendo dNTP 0,7 mM, BSA 0,3 mg/ml y 5 pl de polimerasa phi29 comercial (New England Biolabs). Se realizó una segunda amplificación en presencia de SSB 25 ng/pl de T4gp32 (NEB). Mediante amplificación por círculo rodante a 30 °C durante dos días, se obtuvieron multímeros monocatenarios de los fragmentos de ADN por lo que las ITR flanqueantes están presentes como cadenas sencillas unidas covalentemente entre sí a corta distancia. A continuación, mediante calentamiento y enfriamiento lento, se formaron horquillas de ADN con un sitio de reconocimiento para la segunda enzima de restricción, en este caso, Pvull. El producto multimérico obtenido después de la amplificación por círculo rodante se digirió con Pvull llevando la mezcla de reacción a un volumen final de 600 pl, incluyendo 15 pl de la enzima de restricción Pvull-HF (New England Biolabs) y el tampón recomendado por el fabricante. La mezcla se incubó a 37 °C durante 300 minutos para obtener un fragmento de ANmc lineal que contenía las dos secuencias de ITR que flanqueaban el GOI. Estos fragmentos se purificaron mediante un kit de limpieza de PCR basado en sílice (Macherey Nagel). El producto multimérico obtenido de la segunda amplificación se digirió adicionalmente con Ndel (NEB).

Los fragmentos obtenidos mediante el método del ejemplo se analizaron posteriormente mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante. Las muestras se desnaturalizaron calentando en solución de urea 8 M y se separaron en un gel de acrilamida al 8 % que contenía urea 8 M en tampón de Tris-borato EDTA a 6 V/cm durante seis horas. Se usó tinción de gel RotiSafe (Carl Roth) para visualizar los fragmentos en una mesa de luz azul. El segundo producto de amplificación digerido se analizó en un gel de agarosa en tampón de Tris-acetato-EDTA a 120 V durante 50 minutos y se visualizó con SYBR Gold (Thermo).

La actividad biológica del fragmento de ANmc lineal que contenía las dos secuencias de ITR que flanqueaban el gen indicador de fluorescencia en términos de transfección y producción de virus se sometió a ensayo en experimentos de cultivo celular. Se cultivaron células HEK293 adherentes en medios de cultivo de DMEM comerciales que contenían suero de ternera fetal al 10 %. Las células se sembraron a 52.000 células por cm2 superficie de cultivo un día antes de los experimentos de transfección. Al día siguiente, las células se transfectaron mediante el método de transfección con fosfato de calcio. Para la transfección de 3 x 106 células sembradas, se diluyeron un total de 15 pg de ADN en 0,25 ml de solución 0,3 M de CaCh. La solución de ADN se añadió gota a gota a un volumen igual de solución salina tamponada con HEPES que contenía fosfato disódico (HEPES 50 mM, fosfato disódico 1,5 mM, cloruro de sodio 280 mM, pH 7,05). La mezcla resultante se añadió lentamente y gota a gota a las células. O bien solo se usó el fragmento de ADN obtenido mediante el método descrito en el ejemplo para la transfección, o bien una relación molar 1:1:1 del fragmento del ejemplo, un plásmido que codificaba las proteínas de la cápside de virus adenoasociado y sus genes auxiliares (pRepCap, por ejemplo, de acuerdo con la SEQ ID NO: 5) y un plásmido auxiliar de adenovirus (pHelper, Agilent technologies VAA helper free system) para producir partículas de virus. pRepCap y pHelper son bien conocidos en la técnica anterior.

Se realizó un análisis adicional de las células transfectadas después de tres días de cultivo posterior, ya sea mediante formación de imágenes de fluorescencia usando un microscopio de fluorescencia con un conjunto de filtros adecuado para el indicador de fluorescencia mKate2, o mediante PCR cuantitativa para determinar el título de las partículas de virus producidas. Se prepararon muestras para PCR cuantitativa mediante lisis de células transfectadas. Para esto, las células se recogieron mediante raspado y se sedimentaron mediante centrifugación. El sedimento se resuspendió en solución salina tamponada con Tris y se sometió a tres ciclos de congelacióndescongelación. Los residuos celulares se sedimentaron mediante centrifugación y el sobrenadante que contenía las partículas de virus se recogió y se esterilizó por filtración. Una muestra de 2,5 pl de este lisado se incubó con un volumen igual de DNasel (New England Biolabs) en un volumen de reacción de 25 pl como describe el fabricante, para digerir todo el ADN no empaquetado en las cápsides de virus. Después, la mezcla se diluyó 5 veces con agua destilada y se usaron 5 pl de la dilución en una reacción de qPCR de 20 pl con los cebadores 5'-GGGACTTTCCTACTTGGCA (SEQ ID. NO. 4) y 5-GGCGGAGTTGTTAC-GACA (SEQ ID. NO. 3).

Resultados:

Los resultados del ejemplo se describen con referencia a la figura 2.

El esquema (A) de la figura 2 muestra una PAGE de desnaturalización de los fragmentos de ADN resultantes y las etapas intermedias del proceso de ejemplo para generar fragmentos de ANmc lineales que contienen dos secuencias de repetición terminales invertidas víricas que flanquean un gen de interés de acuerdo con la presente invención. El carril d) del gel muestra la digestión por Pstl del plásmido de acuerdo con la etapa b) de la presente invención. Hay dos bandas claramente visibles, de las cuales la más pequeña es el fragmento que contiene ITR con un tamaño de 2,2 kb y siendo el fragmento más grande la cadena principal del plásmido. El carril a) muestra el resultado de la amplificación por círculo rodante presente como fragmentos de alto peso molecular incapaces de migrar al gel. El carril b) muestra la muestra del carril a), pero digerida con Pvull, que conduce a la liberación del fragmento monocatenario deseado. El carril c) muestra el producto final purificado mediante un método de purificación basado en sílice.

Se analizaron fragmentos de la digestión por Pvull-/Ndel en un gel de agarosa en busca de bandas atribuibles a la doble digestión como una pista sobre los productos bicatenarios de la RCA. Esto se debe a que Pvull siempre debería liberar los fragmentos de acuerdo con la presente invención, pero Ndel que corta dentro del GOI solo debería cortar cuando su secuencia de reconocimiento está presente como una doble cadena. De hecho, no se observaron signos de doble digestión en el gel, demostrando la pureza monocatenaria del producto.

El fragmento de ácido nucleico lineal monocatenario de acuerdo con la presente invención obtenido anteriormente tenía actividad biológica en células HEK293. El esquema (B) de la figura 2 muestra el resultado del experimento de transfección en el que HEK293 no se transfectaron como control (dos paneles superiores), se transfectaron con el plásmido de acuerdo con la presente invención (dos paneles centrales) o se transfectaron con una cantidad molar igual de los fragmentos monocatenarios lineales de acuerdo con la presente invención (dos paneles inferiores). La producción de la proteína indicadora mKate2 se determinó en los tres casos mediante formación de imágenes de fluorescencia (paneles a la derecha). Como es evidente a partir de las imágenes presentadas, la emisión de fluorescencia como medida de la producción de proteína recombinante es comparable entre las dos transfecciones, demostrando que la actividad biológica del fragmento monocatenario lineal en términos de transfectabilidad y expresión de proteína es igual a la de su plásmido progenitor, mientras que al mismo tiempo evita la transfección de ADN procariota.

Para identificar adicionalmente si los fragmentos de ANmc lineales que contienen las dos secuencias de ITR víricas que flanquean el gen de interés son adecuados para la producción de partículas de virus, se realizó un ensayo basado en un sistema de tres plásmidos como se describe por Matsushita T.et al.y por Xiao X.et al.,véase anteriormente. Se usó como referencia el plásmido progenitor de acuerdo con la presente invención. Después de una producción de tres días en células HEK293, se determinó la cantidad de partículas resistentes a DNasel como una medida del ciclo de cuantificación por qPCR (Cc). Como se muestra en el esquema (C) de la figura 2, hay cantidades comparables presentes en el control, así como en la muestra de virus producida con el fragmento de ANmc de acuerdo con la presente invención. Es decir, las funciones biológicas del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, en concreto, la competencia en la producción de partículas de virus y expresión génica, así como la transfectabilidad son similares a las de los plásmidos utilizados actualmente para producir VAA recombinante, mientras que al mismo tiempo evita la transfección de ADN procariota.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para la generaciónin vitrode fragmentos de ácido nucleico monocatenarios (ANmc), lineales y modificados genéticamente, que contienen dos secuencias de repetición terminales invertidas de virus adenoasociado (ITR de VAA) que flanquean un gen de interés (GOI), estando esencialmente libres de secuencias de ácido nucleico bacteriano, que comprende las etapas de:

d) Recircularización del fragmento de ácido nucleico bicatenario lineal aislado de la etapa c) para obtener un fragmento de ácido nucleico circular bicatenario unido en los extremos compatibles formados en la etapa b); e) Amplificación del fragmento bicatenario circularizado de d) que contiene dos ITR de VAA y el GOI mediante una técnica de amplificación de ácido nucleico que genera ácidos nucleicos monocatenarios que comprenden al menos dos copias unidas covalentemente, copias de complemento inverso, de la cadena molde;

f) Digestión enzimática del producto de amplificación obtenido en la etapa e) con una segunda enzima de restricción (2) o dos enzimas de restricción diferentes (2) y (3) para obtener secuencias de ANmc lineales que comprenden dicho fragmento de ácido nucleico de las dos secuencias de ITR de VAA y el GOI; y

2. El método para la generaciónin vitrode fragmentos de ácido nucleico vírico monocatenarios, lineales y modificados genéticamente de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la primera enzima de restricción (1) y la cuarta enzima de restricción (4) son una enzima generadora de extremos cohesivos, como Pstl.

3. El método para la generaciónin vitrode fragmentos de ácido nucleico vírico monocatenarios, lineales y modificados genéticamente de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde la segunda enzima de restricción (2) y la tercera enzima de restricción (3) son una enzima de restricción de corte de extremo romo, como Pvull.

4. El método para la generaciónin vitrode fragmentos de ácido nucleico vírico monocatenarios, lineales y modificados genéticamente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el plásmido que contiene fragmentos de ácido nucleico vírico contiene los elementos de secuencia:

a) Una secuencia de reconocimiento para una enzima de restricción (1) que genera extremos, tal como extremos cohesivos, que son compatibles con los extremos generados de g);

b) En dirección 3', una secuencia de reconocimiento para una enzima de restricción (2) que genera extremos, tal como extremos cohesivos, que son compatibles con los extremos generados de f), y siendo dicha secuencia de reconocimiento diferente de la secuencia de reconocimiento de a) y g);

c) En dirección 3', una secuencia de ITR de VAA funcional;

d) En dirección 3', el GOI;

g) En dirección 3', una secuencia de reconocimiento para una enzima de restricción (4) que genera extremos, que son compatibles con los extremos generados en a), por lo que dicha enzima de restricción (4) puede ser idéntica o diferente de la enzima de restricción (1); por lo que si se usan enzimas de restricción, que pueden cortar a diferentes distancias con respecto al sitio de reconocimiento, las secuencias de reconocimiento en a) y b) así como en f) y g) pueden estar en la misma posición y hasta todas las secuencias de reconocimiento pueden ser idénticas.

5. El método para la generaciónin vitrode fragmentos de ácido nucleico vírico monocatenarios, lineales y modificados genéticamente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde i) el aislamiento del fragmento de ácido nucleico bicatenario obtenido en la etapa d) que contiene el fragmento de ácido nucleico vírico y/o ii) la purificación del fragmento de ANmc lineal que comprende fragmentos de ácido nucleico vírico en la etapa g), se realizan mediante electroforesis o cromatografía de intercambio iónico o cromatografía de adsorción de sílice.

6. El método para la generaciónin vitrode fragmentos de ácido nucleico vírico monocatenarios, lineales y modificados genéticamente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la recircularización del fragmento de ácido nucleico en la etapa d) se realiza mediante una ligasa, en particular, una T4 ligasa.

7. El método para la generaciónin vitrode fragmentos de ácido nucleico vírico monocatenarios, lineales y modificados genéticamente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la etapa de amplificación e) se realiza enzimáticamente mediante una polimerasa; preferentemente, la polimerasa es la polimerasa phi29; y/o preferentemente la amplificación es una reacción isotérmica.

8. El método para la generaciónin vitrode fragmentos de ácido nucleico vírico monocatenarios, lineales y modificados genéticamente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la hibridación de un oligonucleótido para la amplificación en la etapa e) se realiza mediante la desnaturalización térmica de dicho fragmento de ácido nucleico bicatenario circular y el posterior enfriamiento de la mezcla de reacción.

9. El método para la generaciónin vitrode fragmentos de ácido nucleico vírico monocatenarios, lineales y modificados genéticamente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde en la etapa e) el producto de amplificación obtenido mediante amplificación del fragmento de ácido nucleico circular monocatenario, en particular, el fragmento de ADN, se desnaturaliza por calor y se enfría para permitir la hibridación de secuencias de sitio de restricción y de repeticiones terminales invertidas adyacentes para formar una horquilla bicatenaria que contiene un sitio de restricción funcional.

10. Un plásmido que comprende los siguientes elementos de secuencia de ácido nucleico:

a) Una secuencia de reconocimiento para una primera enzima de restricción (1) que genera extremos, tales como extremos cohesivos, que son compatibles con los extremos generados de g);

c) En dirección 3', una secuencia de ITR de VAA funcional;

d) En dirección 3', el GOI;

11. El plásmido de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la secuencia de reconocimiento de las enzimas de restricción (2) y (3) se selecciona del conjunto de secuencias de enzimas de Tipo IIS seleccionadas de Aarl, Acc361, AcIWI, Acul, Alw261, AIwI, AsuHPI, Bbsl, Bbvl, Bccl, BceAI, BciVI, BcoDI, BfuAI, Bful, Bmrl, Bmsl, Bmul, Bpil, Bpml, BpuEI, Bsal, Bse3DI, BseGI, BseMII, BseRI, BseXI, Bsgl, BsIFI, BsmBI, BsmFI, Bso31I, BspCNI, BspMI, BspPI, BspQI, BspTNI, BsrDI, Bst61, BstF51, BstMAI, BstV1I, BstV2I, Bsul, BtgZI, BtsCI, BtsiIMutI, Btsal, Bvel, Csel, Eam1104I, Earl, Ecil, Eco57I, Esp3I, Faql, Faul, Fokl, Gsul, Hgal, Hphl, HpyAV, Lgul, Lsp1109I, LweI, Mboll, Mfel, Mlyl, Mmel, NmeAIII, PciSI, Plel, Ppsl, Sapl, Schl, SfaNI, Taqll, TspDTI o TspGWI.