ES3034020T3

ES3034020T3 - Chromatography method for quantifying a non-ionic surfactant in a composition comprising the non-ionic surfactant and a polypeptide

Info

Publication number: ES3034020T3
Application number: ES17755627T
Authority: ES
Inventors: Mary Montti; Richard L Beardsley; Michael S Chinn
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2016-08-15
Filing date: 2017-08-14
Publication date: 2025-08-12
Anticipated expiration: 2037-08-14
Also published as: EP3497440A1; AU2022291517B2; TWI775770B; EP3497440B1; WO2018035025A1; US20230077255A1; CN115598231B; SG11201901228QA; AU2017312540B2; US11680931B2; KR20190051977A; AU2017312540A1; JP7286536B2; PL3497440T3; HUE071741T2; AU2022291517A1; IL264582B; CN115598231A; HRP20250718T1; AR109343A1

Abstract

La invención proporciona métodos para cuantificar un tensioactivo no iónico en una composición que comprende un polipéptido y dicho tensioactivo, donde la cuantificación muestra una interferencia reducida entre el tensioactivo no iónico y el polipéptido. También se proporcionan métodos donde la composición incluye además N-acetiltriptófano, y la cuantificación muestra una interferencia reducida entre el tensioactivo no iónico, el polipéptido y el N-acetiltriptófano. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento de cromatografía para cuantificar un tensioactivo no iónico en una composición que comprende el tensioactivo no iónico y un polipéptido

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica prioridad sobre la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 62/375.373 presentada el 15 de agosto de 2016.

Campo de la invención

La presente invención proporciona procedimientos para analizar formulaciones de polipéptidos para determinar la presencia de polisorbato 20 o polisorbato 80.

Antecedentes de la invención

El polisorbato 20 (PS20) es un tensioactivo usado comúnmente en formulaciones de polipéptidos para proteger el producto del daño físico durante el procesamiento y almacenamiento (Kerwin, B., 2007,J. Pharm. Sci.,97(8): 2924-2935). Debido a su importancia para la estabilidad del producto, el PS20 se debe cuantificar con exactitud en el sistema de control de cada producto. El PS20 se puede cuantificar mediante un ensayo espectrofotométrico, un ensayo de micelas fluorescentes o un ensayo de cromatografía de líquidos de alto rendimiento con detector de dispersión de luz por evaporación (HPLC-ELSD) (véase, por ejemplo, Kim, J. y Qiu, J.,Analytica chimica acta806:144-151,2014; Hewittet al., Journal of Chromatography A,1215(1):156-160, 2008). En particular, Hewittet al.divulgan un procedimiento para la cuantificación de polisorbato 20 en soluciones de proteína.

Es preferente el ensayo de detección de dispersión de luz por evaporación (ELSD) como ensayo del sistema de control porque, en relación con el ensayo de micelas fluorescentes, no requiere largos tiempos de acondicionamiento. El procedimiento de ELSD también puede evitar el requisito de usar la misma partida de polisorbato para la preparación de la curva estándar que se usó en la producción. Adicionalmente, el ensayo de micelas fluorescentes es susceptible a interferencia de proteína no específica, en particular para proteínas hidrófobas y conjugados anticuerpo-fármaco (CAF). El conector-fármaco vcMMAE de los CAF introduce hidrofobia adicional en la proteína, lo que puede dar lugar a una interferencia de proteína incrementada al cuantificar el PS20. En algunos casos, esta interferencia de proteína no específica se puede mitigar usando el ensayo HPLC-ELSD.

Aunque el ensayo HPLC-ELSD puede reducir el grado de interferencia de proteína, esta interferencia no se elimina por completo. El problema de la interferencia de proteína se vuelve en particular problemático a bajas concentraciones de polisorbato y con proteínas más hidrófobas y/o concentradas. Adicionalmente, el efecto de la interferencia de proteína es altamente dependiente de la partida de resina de cartucho usada. Las estrategias para mitigar estos problemas incluyen a) adición de una cantidad conocida de PS20 para diluir la interferencia de proteína sin disminuir la respuesta a PS20, y b) retirada de proteína de la muestra mediante precipitación de proteínas.

El enfoque de adición de una cantidad conocida implica diluir una muestra con una solución madre de PS20 a la concentración objetivo de la formulación. Esta preparación de muestra diluye la concentración de proteína mientras mantiene una concentración de PS20 aproximadamente inalterada. A continuación, la cantidad de PS20 añadida a la muestra se resta durante el análisis de datos. Debido a que la relación entre la respuesta de ELSD y la masa analizada en el detector sigue una ley de potencia, el enriquecimiento en PS20 disminuye desproporcionadamente la contribución de la proteína a la señal de ELSD. Se ha demostrado que el enfoque de adición de una cantidad conocida mejora la exactitud de la cuantificación de PS20 en algunos casos, pero en los casos en que no sea una solución viable, se debe utilizar la precipitación de proteínas. Si bien es eficaz para retirar la interferencia de proteína, el procedimiento de precipitación por HPLC-ELSD no es ideal debido al tiempo de preparación de la muestra durante la noche, los grandes volúmenes de muestra y la variabilidad en la preparación de muestras. En contraste, la retirada de la proteína usa las mismas condiciones de HPLC-ELSD, pero sin procedimientos significativos de preparación de muestras. Lo que se necesita es una solución más consistente para eliminar la interferencia de proteína y proporcionar una cuantificación de PS20 consecuente en todas las condiciones de cromatografía.

Breve sumario

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. La invención proporciona un procedimiento para cuantificar un tensioactivo no iónico en una composición que comprende el tensioactivo no iónico y un polipéptido, en el que se reduce la interferencia entre el tensioactivo no iónico y el polipéptido durante la cuantificación, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una fase móvil A y una fase móvil B, en el que la fase móvil A comprende ácido en agua y la fase móvil B comprende ácido en metanol, en el que el polipéptido se une al material de cromatografía específica y no específicamente; b) eluir el polipéptido unido específicamente del material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto con una solución que comprende la fase móvil A y la fase móvil B, en el que la proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A se incrementa en comparación con la etapa a); c) eluir el tensioactivo no iónico y el polipéptido unido no específicamente del material de cromatografía con una solución que comprende la fase móvil A y la fase móvil B, en el que la proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A se incrementa en comparación con la etapa c); d) cuantificar el tensioactivo no iónico, en el que se reduce la interferencia entre el tensioactivo no iónico y el polipéptido durante la cuantificación, en el que el tensioactivo no iónico es polisorbato 20 o polisorbato 80.

En algunos modos de realización, la proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A en la etapa a) es de aproximadamente 10:90. En algunos modos de realización, la proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A se incrementa a aproximadamente 40:60 en la etapa b). En algunos modos de realización, la proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A se incrementa a aproximadamente 100:0 en la etapa c). En algunos modos de realización, la fase móvil A comprende aproximadamente un 2 % de ácido en agua. En algunos modos de realización, la fase móvil B comprende aproximadamente un 2 % de ácido en metanol. En algunos modos de realización, el ácido es ácido fórmico. En algunos modos de realización, el ácido es ácido acético. En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía es de aproximadamente 1,25 ml/minuto.

En algunos modos de realización, la concentración de tensioactivo no iónico en la composición está en el intervalo de aproximadamente un 0,001 % a un 1,0 % (p/v).

En algunos modos de realización, el polipéptido es un polipéptido terapéutico.

En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio aniónico fuerte de fase inversa.

La presente invención también proporciona un procedimiento para cuantificar un tensioactivo no iónico en una composición que comprende el tensioactivo no iónico y un polipéptido, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una fase móvil A y una fase móvil B, en el que la fase móvil A comprende hidróxido de amonio en agua y la fase móvil B comprende hidróxido de amonio en un disolvente orgánico; b) eluir el polipéptido unido específicamente del material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto con una solución que comprende la fase móvil A y la fase móvil B, en el que la proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A se incrementa en comparación con la etapa a); c) eluir el tensioactivo no iónico del material de cromatografía con una solución que comprende la fase móvil A y la fase móvil B, en el que la proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A se incrementa en comparación con la etapa c); d) cuantificar el tensioactivo no iónico, y en el que el tensioactivo no iónico es polisorbato 20 o polisorbato 80. En algunos modos de realización, el disolvente orgánico de la fase móvil B es metanol. En algunos modos de realización, la proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A en la etapa a) es de aproximadamente 10:90. En algunos modos de realización, la proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A se incrementa a aproximadamente 45:55 en la etapa b). En algunos modos de realización, la proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A se incrementa a aproximadamente 100:0 en la etapa c). En algunos modos de realización, la fase móvil A comprende aproximadamente un 2 % de hidróxido de amonio en agua. En algunos modos de realización, la fase móvil B comprende aproximadamente un 2 % de hidróxido de amonio en metanol. En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía es de aproximadamente 1,4 ml/minuto.

En algunos modos de realización, la concentración de polisorbato en la composición está en el intervalo de aproximadamente un 0,001 % a un 1,0 % (p/v).

En algunos modos de realización, la composición comprende además N-acetiltriptófano y/o metionina.

En algunos modos de realización, la composición es una formulación farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. En algunos modos de realización, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunos modos de realización, el polipéptido terapéutico es una proteína de fusión, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, anticuerpo glucomanipulado, fragmento de anticuerpo, un conjugado fármaco-anticuerpo, un THIOMAB™, un conjugado fármaco-THlOMAB™. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio catiónico fuerte de fase inversa.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 es una superposición del CAF A1 sin PS20 y un estándar de 0,6 mg/ml de PS20 usando el gradiente multietapa de metanol con incrementos de un 5 %. El disolvente de elución contiene ácido fórmico al 2 %.

La FIG. 2 muestra una comparación de un experimento de gradiente multietapa de metanol y un experimento de gradiente multietapa de isopropanol (ambos conteniendo ácido fórmico al 2 %) en diferentes cartuchos. Para cada superposición, hay un CAF A1 sin PS20 en un primer cartucho (trazado 1), un CAF A1 sin PS20 en un segundo cartucho (trazado 2) y un estándar de PS20 (trazado 3).

La FIG. 3 muestra los resultados del diseño de optimización del procedimiento experimental. Las líneas continuas muestran la direccionalidad de acuerdo con el modelo estadístico que el software JMP10 ajusta a los datos. Las líneas de puntos que delimitan cada línea continua indican el error asociado con el ajuste. Las pendientes de las líneas indican el efecto que tuvo cada factor en el área del pico de PS20 y la anchura del pico de PS20.

La FIG. 4 muestra una comparación de los cromatogramas del procedimiento de PS20 de la optimización del procedimiento DdE con un lavado de MeOH al 40 % y un lavado de MeOH al 50 %. Para estos experimentos, el caudal fue de 1,25 ml/min, se cargaron 12 |jg de PS20 y la duración del lavado fue de 3 minutos.

La FIG. 5 muestra 10 mg/ml de CAF A10 sin PS20 y 0,6 mg/ml de estándar de PS20 con una 0,2 % de ácido trifluoroacético en la fase móvil.

La FIG. 6 muestra 20 mg/ml de CAF A1 sin PS20 y 0,6 mg/ml de estándar de PS20 con ácido fórmico al 2 % en la fase móvil.

La FIG. 7 muestra 20 mg/ml de CAF A1 sin PS20 y 0,7 mg/ml de estándar de PS20 con un 2 % de ácido acético en la fase móvil.

La FIG. 8 muestra una comparación entre las fases móviles que contienen ácido fórmico y ácido acético usando las siguientes muestras: agua (trazado 1), 20 mg/ml de CAF A1 sin PS20 (trazado 2) y 20 mg/ml de CAF A1 enriquecida con 0,2 mg/ml de PS20 (trazado 3).

La FIG. 9 muestra varios perfiles del estándar de PS20 desarrollado en diferentes cartuchos OASIS® MAX usando elución con metanol/ácido acético. Perfil típico (trazado 1), pico con cola (trazado 2), pico que muestra separación (trazado 3) y pico con ligera cola (trazado 4). Esta variabilidad en el perfil no afecta a la cuantificación de los estándares, controles o muestras de proteína.

La FIG. 10 muestra el procedimiento con MeOH/ácido acético. Inyecciones típicas de 20 j l de agua (trazado 1), tampón de formulación de CAF A1 sin PS20 (trazado 2), CAF A1 sin PS20 (trazado 3) y el estándar de PS20 mínimo a 0,1 mg/ml (trazado 4).

Las FIGS. 11A y 11B muestran la evaluación de A16/A17 sin PS20 usando el procedimiento 1 del ejemplo 1. La FIG. 1A muestra ELSD y la FIG. 1B muestra UV (280 nm). Se evaluaron agua (trazado 1), tampón de formulación A16/A17 sin PS20 (trazado 2) y proteína A16/A17 sin P<s>20 (trazado 3) usando el procedimiento 1 del ejemplo 1.

Las FIGS. 12A y 12B muestran cromatogramas ELSD de diferentes componentes de tampón A16/A17 usando el procedimiento del ejemplo 1. La FIG. 12A muestra tampones con NAT: histidina-HCl 20 mM, NAT 1 mM, metionina 5 mM, sacarosa 240 mM (trazado 1); histidina-HCl 20 mM, NAT 1 mM, sacarosa 240 mM (trazado 2); histidina-HCl 20 mM, NAT 5 mM (trazado 3). La FIG. 12B muestra tampones sin NAT: histidina-HCl 20 mM, metionina 5 mM, sacarosa 240 mM (trazado 1); histidina-HCl 20 mM, metionina 25 mM (trazado 2); histidina-HCl 20 mM (trazado 3). Inyecciones de tampón de 50 jl.

Las FIGS. 13A y 13B muestran cromatogramas ELSD de diferentes componentes de tampón usando un procedimiento modificado (cartucho MCX e hidróxido de amonio en la fase móvil). La FIG. 13A muestra tampones con NAT: histidina-HCl 20 mM, NAT 1 mM, metionina 5 mM, sacarosa 240 mM (trazado 1); histidina-HCl 20 mM, NAT 1 mM, sacarosa 240 mM (trazado 2); histidina-HCl 20 mM, NAT 5 mM (trazado 3); y proteína sin PS20 con NAT (trazado 4). La FIG. 13B muestra tampones sin NAT: histidina-HCl 20 mM, metionina 5 mM, sacarosa 240 mM (trazado 1); histidina-HCl 20 mM, metionina 25 mM (trazado 2); histidina-HCl 20 mM (trazado 3). Inyecciones de 50 jl.

Las FIGS. 14A y 14B muestran la evaluación de la proteína A16/A17 sin PS20 con adición de hidróxido de amonio al 0,15-1,50 % a la fase móvil. La FIG. 14A muestra cromatogramas ELSD. La FIG. 14B muestra cromatogramas UV (280 nm). Inyección de 50 j l de proteína A16/A17 sin PS20 con un 0,15, 0,29, 0,73 y 1,5 % de hidróxido de amonio en la fase móvil (trazados 1, 2, 3 y 4, respectivamente) y tampón de formulación A16/A17 sin PS20 con hidróxido de amonio al 1,5 % (trazado 5).

Las FIGS. 15A y 15B muestran la evaluación de la etapa de lavado de la fase B móvil al 20-60 %. La FIG. 15A muestra cromatogramas ELSD. La FIG. 15B muestra cromatogramas UV (280 nm). Inyección de 15 j l de proteína A16/A17 sin PS20. Fase móvil B al 20, 30, 40, 50 y 60 % (etapa de lavado), que se muestran como trazados 1,2, 3, 4 y 5, respectivamente.

La FIG. 16 muestra la evaluación de los tiempos de lavado y los volúmenes de inyección para la proteína A16/A17 sin PS20 mediante cromatografía ELSD. Inyección de 25 |jl de muestra A16/A17 sin PS20: Etapa de lavado de 3,4 minutos (trazado 1). Inyección de 50 j l de muestra A16/A17 sin PS20: Etapa de lavado de 3,4 minutos (trazado 2) y etapa de lavado de 2,4 minutos (trazado 3).

Las FIGS. 17A y 17B muestran la evaluación de diferentes caudales para A18/A19 sin PS20. La FIG. 17A muestra cromatogramas ELSD. La FIG. 17B muestra cromatogramas UV (280 nm). Inyección de 25 j l de A18/A19 sin PS20 (150 mg/ml) con diferentes caudales: 1,6, 1,4, 1,25, 1,0 y 0,8 ml/min, correspondientes a los trazados 1,2, 3, 4 y 5, respectivamente.

La FIG. 18 muestra la evaluación de diferentes tiempos de elución para PS20 en agua mediante cromatografía ELSD. Inyección de 50 j l de 0,1 mg/ml de PS20 en agua, etapa de elución de 3,1 minutos (trazado 1) o etapa de elución de 1,1 minutos (trazado 2).

La FIG. 19 muestra la evaluación del procedimiento 2 finalizado mediante cromatografía ELSD. Inyección de 25 j l de agua (trazado 1), 150 mg/ml de A18/A19 sin PS20 (trazado 2), agua enriquecida con 0,2 mg/ml de PS20 (trazado 3) y A18/A19 enriquecida con 0,2 mg/ml de PS20 (trazado 4) usando los parámetros finalizados del procedimiento 2.

Las FIGS. 20A-20F muestran la evaluación de la especificidad de tres productos diferentes. Las FIGS. 20A (A18/A19), 20C (A16/A17) y 20E (A14/A20) muestran cromatogramas ELSD. Las FIGS. 20B (A18/A19), 20D (A16/A17) y 20F (A14/A20) muestran cromatogramas UV (280 nm). Formulación sin PS20 (trazado 1), proteína sin PS20 (trazado 2) y 0,1 mg/ml de PS20 en agua (trazado 3).

La FIG. 21 muestra la evaluación de la variabilidad entre cartuchos usando agua o A18/A19 sin PS20 enriquecida con PS20 mediante cromatografía ELSD. Cartucho 2, A18/A19 sin PS20 enriquecida con 0,1 mg/ml de PS20 (trazado 1); cartucho 6, A18/A19 sin PS20 enriquecida con 0,1 mg/ml de PS20 (trazado 2); cartucho 2, agua enriquecida con 0,2 mg/ml de PS20 (trazado 3); y cartucho 6, agua enriquecida con 0,2 mg/ml de PS20 (trazado 4).

La FIG. 22 muestra la evaluación de la variabilidad entre cartuchos usando agua o A18/A19 sin PS20 enriquecida con PS20 mediante cromatografía ELSD. Cartucho 4, A18/A19 sin PS20 enriquecida con 0,2 mg/ml de PS20 (trazado 1); cartucho 6, A18/A19 sin PS20 enriquecida con 0,2 mg/ml de PS20 (trazado 2); cartucho 4, agua enriquecida con 0,2 mg/ml de PS20 (trazado 3); y cartucho 6, agua enriquecida con 0,2 mg/ml de PS20 (trazado 4).

La FIG. 23 muestra cromatogramas ELSD para muestras de control usadas en una secuencia que incluye 100 inyecciones de A18/A19 en un solo cartucho. Superposición de 11 muestras de control inyectadas a lo largo de la secuencia.

La FIG. 24 muestra cromatogramas ELSD para muestras de A18/A19 usadas en una secuencia que incluye 100 inyecciones de A18/A19 en un solo cartucho. Superposición de 100 inyecciones de muestra A18/A19 a lo largo de la secuencia.

Las FIGS. 25A y 25B muestran cromatogramas de la 1.a, la 50.a y la 100.a inyección de proteína de una secuencia que incluye 100 inyecciones de A18/A19 en un solo cartucho.

Las FIGS. 26A y 26B muestran los resultados de cuantificación de 100 inyecciones de muestra A18/A19 (0,2 mg/ml de PS20 nominal) usando el cartucho 4. La FIG. 26A muestra el área de PS20 frente al número de inyección. La FIG. 26B muestra la concentración de PS20 frente al número de inyección.

Las FIGS. 27A y 27B muestran resultados de cuantificación de 100 inyecciones de tampón de formulación de A18/A19 (0,2 mg/ml de PS20 nominal) usando el cartucho 5. La FIG. 27A muestra el área de PS20 frente al número de inyección. La FIG. 27B muestra la concentración de PS20 frente al número de inyección.

Las FIGS. 28A y 28B muestran los resultados de cuantificación de 100 inyecciones de agua enriquecida con 0,2 mg/ml de PS20 usando el cartucho 3. La FIG. 28A muestra el área de PS20 frente al número de inyección. La FIG. 28B muestra la concentración de PS20 frente al número de inyección.

Las FIGS. 29A-29F muestran la evaluación de tres productos de bajo pI usando el procedimiento 1 y el procedimiento 2 mediante cromatografía ELSD. Las FIGS. 29A, 29C y 29E muestran cromatogramas para el procedimiento 1 con A21, A14/A15 y A14, respectivamente. Las FIGS. 29B, 29D y 29F muestran cromatogramas para el procedimiento 2 con A21, A14/A15 y A14, respectivamente.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona procedimientos para cuantificar un tensioactivo no iónico en una composición que comprende un polipéptido y el tensioactivo no iónico, en los que la cuantificación presenta una interferencia reducida entre el tensioactivo no iónico y el polipéptido. También se proporcionan procedimientos en los que la composición incluye además N-acetiltriptófano y la cuantificación presenta una interferencia reducida entre el tensioactivo no iónico, el polipéptido y el N-acetiltriptófano.

I. Definiciones

El término "polipéptido" o "proteína" se usan de manera intercambiable en el presente documento para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados, y se puede interrumpir por restos no aminoacídicos. Los términos también engloban un polímero de aminoácidos que se ha modificado naturalmente o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcaje o toxina. También se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Los términos "polipéptido" y "proteína", como se usan en el presente documento, engloban específicamente anticuerpos.

Polipéptido "purificado" (por ejemplo, anticuerpo o inmunoadhesina) significa que se ha incrementado la pureza del polipéptido, de modo que exista en una forma que sea más pura de la que existe en su entorno natural y/o cuando inicialmente se sintetiza y/o amplifica en condiciones de laboratorio. La pureza es un término relativo y no significa necesariamente pureza absoluta.

El término "antagonista" se usa en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que bloquee, inhiba o neutralice parcial o completamente una actividad biológica de un polipéptido natural. De forma similar, el término "agonista" se usa en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que imita una actividad biológica de un polipéptido natural. Las moléculas agonistas o antagonistas adecuadas incluyen específicamente anticuerpos o fragmentos de anticuerpo agonistas o antagonistas, fragmentos o variantes de secuencia de aminoácidos de polipéptidos naturales, etc. Los procedimientos para identificar los agonistas o antagonistas de un polipéptido pueden comprender poner en contacto un polipéptido con una molécula agonista o antagonista candidata y medir un cambio detectable en una o más actividades biológicas asociadas normalmente con el polipéptido.

Un polipéptido "que se une a" un antígeno de interés, por ejemplo, una diana de antígeno polipéptido asociado a tumor, es uno que se une al antígeno con afinidad suficiente, de modo que el polipéptido sea útil como un agente de diagnóstico y/o terapéutico en la selección como diana de una célula o tejido que exprese el antígeno, y significativamente no reacciona de forma cruzada con otros polipéptidos. En dichos modos de realización, el grado de unión del polipéptido a un polipéptido "no diana" será de menos de aproximadamente un 10 % de la unión del polipéptido a su polipéptido diana particular, como se determina mediante análisis de separación celular activada por fluorescencia (FACS) o radioinmunoprecipitación (RIA).

Con respecto a la unión de un polipéptido a una molécula diana, el término "unión específica a" o "se une específicamente a" o "específico para" un polipéptido particular o un epítopo en una diana polipeptídica particular significa que la unión es diferente de forma mensurable de una interacción no específica. Se puede medir la unión específica, por ejemplo, determinando la unión de una molécula en comparación con la unión de una molécula de control que, en general, es una molécula de estructura similar que no tiene actividad de unión. Por ejemplo, se puede determinar la unión específica por competencia con una molécula de control que sea similar a la diana, por ejemplo, un exceso de diana no marcada. En este caso, se indica la unión específica si la unión de la diana marcada a una sonda se inhibe de forma competitiva por la diana no marcada en exceso.

El término "anticuerpo" en el presente documento se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpo siempre que presenten la actividad biológica deseada. El término "inmunoglobulina" (Ig) se usa de manera intercambiable con anticuerpo en el presente documento.

Los anticuerpos son moléculas de inmunoglobulina naturales que tienen estructuras variables, todas basadas en el plegamiento de inmunoglobulina. Por ejemplo, los anticuerpos IgG tienen dos cadenas "pesadas" y dos cadenas "ligeras" que se unen por enlaces disulfuro para formar un anticuerpo funcional. Cada cadena pesada y ligera comprende por sí misma una región "constante" (C) y una "variable" (V). Las regiones V determinan la especificidad de unión a antígeno del anticuerpo, mientras que las regiones C proporcionan soporte y función estructurales en las interacciones no específicas de antígeno con efectores inmunitarios. La especificidad de unión a antígeno de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo es la capacidad de un anticuerpo de unirse específicamente a un antígeno particular.

La especificidad de unión a antígeno de un anticuerpo se determina mediante las características estructurales de la región V. La variabilidad no se distribuye uniformemente en el tramo de 110 aminoácidos de los dominios variables. En cambio, las regiones V consisten en tramos relativamente invariables llamados regiones estructurales (FR) de 15-30 aminoácidos separados por regiones más cortas de variabilidad extrema llamadas "regiones hipervariables" (HVR) que tienen cada una 9-12 aminoácidos de longitud. Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera naturales comprenden cada uno cuatro FR, que adoptan en gran medida una configuración de lámina p, conectadas mediante tres regiones hipervariables que forman bucles que conectan y, en algunos casos, forman parte de, la estructura de lámina p. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen unidas en estrecha proximidad por las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabatet al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).

Cada región V comprende típicamente tres HVR, por ejemplo, regiones determinantes de la complementariedad (“CDR”, cada una de las cuales contiene un “bucle hipervariable”) y cuatro regiones estructurales. Un sitio de unión de anticuerpo, la unidad estructural mínima necesaria para unirse con afinidad sustancial a un antígeno deseado concreto, por lo tanto, incluirá típicamente las tres CDR y al menos tres, preferentemente cuatro, regiones estructurales intercaladas entre ellas para mantener y presentar las CDR en la conformación apropiada. Los anticuerpos clásicos de cuatro cadenas tienen sitios de unión a antígeno que se definen por los dominios V<h>y V<l>en cooperación. Determinados anticuerpos, tales como anticuerpos de camello y tiburón, carecen de cadenas ligeras y se basan en sitios de unión formados únicamente por cadenas pesadas. Se pueden preparar inmunoglobulinas genomanipuladas de dominio único en las que los sitios de unión se forman por cadenas pesadas o cadenas ligeras solas, en ausencia de cooperación entre V<h>y V<l>.

El término "variable" se refiere al hecho de que determinadas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida uniformemente por los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamados regiones hipervariables, tanto en los dominios variables de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se llaman regiones estructurales (FR). Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera naturales comprenden cada uno cuatro FR, que adoptan en gran medida una configuración de lámina p, conectadas mediante tres regiones hipervariables que forman bucles que conectan y, en algunos casos, forman parte de, la estructura de lámina p. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen unidas en estrecha proximidad por las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabatet al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).

El término "región hipervariable" (HVR), cuando se usa en el presente documento, se refiere a los residuos aminoacídicos de un anticuerpo que son responsables de la unión a antígeno. La región hipervariable puede comprender residuos aminoacídicos de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, alrededor de aproximadamente los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el V<l>, y alrededor de aproximadamente 31-35B (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el V<h>(Kabatet al.,S<equences of>P<roteins of>Immunological Interest, 5.a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. 1991)) y/o los residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el V<l>, y 26-32 (H1), 52A-55 (H2) y 96-101 (H3) en el V<h>(Chothia y LeskJ. Mol. Biol.196:901-917 (1987)).

Los residuos de la "región estructural" o "FR" son los residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable, como se define en el presente documento.

Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que comprende preferentemente la región de unión a antígeno del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')<2>y Fv; diacuerpos; diacuerpos en tándem (taDb), anticuerpos lineales (por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.641.870, ejemplo 2; Zapataet al., Protein Eng.8(10): 1057-1062 (1995)); anticuerpos de un solo brazo, anticuerpos de dominio variable único, minicuerpos, moléculas de anticuerpo monocatenario; anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, incluyendo, pero sin limitarse a, Db-Fc, taDb-Fc, taDb-CH3, (scFV)4-Fc, di-scFv, bi-scFv o (di,tri)-scFv en tándem); y ligadores biespecíficos de linfocitos T (BiTE).

La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un sitio de unión a antígeno único, y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina proporciona un fragmento F(ab')<2>que tiene dos sitios de unión a antígeno y todavía puede reticular el antígeno.

"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento de antígeno y de unión a antígeno completo. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de una cadena pesada y de una cadena ligera en estrecha asociación no covalente. Es en esta configuración en la que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero V<h>-V<l>. Conjuntamente, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un dominio variable único (o la mitad de un Fv que comprenda solo tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que todo el sitio de unión.

El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxílico del dominio CH1 de la cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en el presente documento para Fab' en el que el/los residuo(s) de cisteína de los dominios constantes porta(n) al menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')<2>se producían originalmente como pares de fragmentos Fab' que tenían cisteínas de bisagra entre ellos. También son conocidos otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.

Se pueden asignar las "cadenas ligeras" de los anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa (k) y lambda (A), basados en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, se pueden asignar anticuerpos a clases diferentes. Existen cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se llaman a, 5, £, y y J, respectivamente. Son bien conocidas las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas.

Los fragmentos de anticuerpo "Fv monocatenario" o "scFv" comprenden los dominios V<h>y V<l>del anticuerpo, en los que estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. En algunos modos de realización, el polipéptido de Fv comprende además un conector polipeptídico entre los dominios V<h>y V<l>que posibilita que el scFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de los scFv, véase, por ejemplo, Plückthun, enThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994).

El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno, comprendiendo dichos fragmentos un dominio variable de la cadena pesada (V<h>) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (V<l>) en la misma cadena polipeptídica (V<h>-V<l>). Usando un conector que sea demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se obliga a que los dominios se emparejen con los dominios complementarios de otra cadena y creen dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente, por ejemplo, en el documento EP 404.097; documento WO 93/11161; y Hollingeret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90:6444-6448 (1993).

El término "anticuerpo multiespecífico" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente un anticuerpo que tiene especificidad poliepitópica. Dichos anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada (V<h>) y un dominio variable de la cadena ligera (V<l>), donde la unidad V<h>V<l>tiene especificidad poliepitópica, anticuerpos que tienen dos o más dominios V<l>y V<h>, uniéndose cada unidad V<h>V<l>a un epítopo diferente, anticuerpos que tienen dos o más dominios variables únicos, uniéndose cada dominio variable único a un epítopo diferente, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpo tales como Fab, Fv, dsFv, scFv, diacuerpos, diacuerpos biespecíficos, triacuerpos, anticuerpos trifuncionales, fragmentos de anticuerpo que se han enlazado de forma covalente o no covalente. "Especificidad poliepitópica" se refiere a la capacidad de unirse específicamente a dos o más epítopos diferentes en la(s) misma(s) o diferente(s) diana(s). "Monoespecífico" se refiere a la capacidad de unirse solo a un epítopo. De acuerdo con un modo de realización, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo IgG que se une a cada epítopo con una afinidad de 5 |<j>M a 0,001 pM, de 3 j M a 0,001 pM, de 1 j M a 0,001 pM, de 0,5 j M a 0,001 pM o de 0,1 j M a 0,001 pM.

La expresión "anticuerpos de dominio único" (sdAb) o "anticuerpos de dominio variable único (SVD)" se refiere en general a anticuerpos en los que un dominio variable único (V<h>o V<l>) puede conferir unión a antígeno. En otras palabras, el dominio variable único no necesita interactuar con otro dominio variable para reconocer el antígeno diana. Los ejemplos de anticuerpos de dominio único incluyen los derivados de camélidos (llamas y camellos) y peces cartilaginosos (por ejemplo, tiburones nodriza) y los derivados de procedimientos recombinantes de anticuerpos humanos y de ratón(Nature(1989) 341:544-546;Dev Comp Immunol(2006) 30:43-56;Trend Biochem Sci(2001) 26:230-235;Trends Biotechnol(2003):21:484-490; documento WO 2005/035572; documento WO 03/035694;FEBS Lett(1994) 339:285-290; documento WO00/29004; documento WO 02/051870).

El término "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por las posibles variantes que puedan surgir durante la producción del anticuerpo monoclonal, estando en general presentes dichas variantes en cantidades menores. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en tanto que no están contaminados por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar como que requiere la producción del anticuerpo mediante ningún procedimiento particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar de acuerdo con los procedimientos proporcionados en el presente documento se pueden preparar mediante el procedimiento de hibridoma descrito por primera vez por Kohleret al., Nature256:495 (1975), o se pueden preparar mediante procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4.816.567). Los "anticuerpos monoclonales" también se pueden aislar de colecciones de anticuerpos de fagos usando las técnicas descritas en Clacksonet al., Nature,352:624-628 (1991) y Markset al., J. Mol. Biol.,222:581-597 (1991), por ejemplo.

Los anticuerpos monoclonales en el presente documento incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (patente de EE. UU. n.° 4.816.567; Morrisonet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en el presente documento incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de unión a antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, mono del viejo mundo, tal como babuino, macaco de la India o macaco cangrejero) y secuencias de la región constante humanas (patente de EE. UU. n.° 5.693.780).

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano, que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región estructural (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Se pueden preparar estas modificaciones para refinar adicionalmente el funcionamiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana, excepto por las sustituciones en FR como se indica anteriormente. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véanse Joneset al., Nature321:522-525 (1986); Riechmannet al., Nature332:323-329 (1988); y Presta,Curr. Op. Struct. Biol.2:593-596 (1992).

Para los propósitos en el presente documento, un "anticuerpo intacto" es uno que comprende dominios variables pesados y ligeros, así como una región Fc. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia natural (por ejemplo, dominios constantes de secuencia natural humana) o una variante de secuencia de aminoácidos de los mismos. Preferentemente, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras.

Los "anticuerpos naturales" son normalmente glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se enlaza a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro covalente, aunque el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de isotipos de inmunoglobulina diferentes. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracatenarios espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene, en un extremo, un dominio variable (V<h>) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (V<l>) en un extremo y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos aminoacídicos particulares forman una interfase entre los dominios variables de la cadena ligera y de la cadena pesada.

Un "anticuerpo no marcado" es un anticuerpo (como se define en el presente documento) que no se conjuga con una molécula heteróloga, tal como un resto citotóxico o radiomarcador.

En algunos modos de realización, las "funciones efectoras" de un anticuerpo se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de secuencia natural o una región Fc de variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo y varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpos incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento; unión al receptor de Fc; citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de superficie celular.

"Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos" y "ADCC" se refieren a una reacción celular en la que células citotóxicas inespecíficas que expresan los receptores de Fc (FcR) (por ejemplo, linfocitos citolíticos naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen un anticuerpo unido en una célula diana y posteriormente provocan la lisis de la célula diana. Las células primarias para mediar en la ADCC, los linfocitos NK, expresan solo FcyRIII, mientras que los monocitos expresan F<cy>RI, F<cy>RII y F<cy>RIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet,Annu. Rev. Immunol9:457-92 (1991). Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés se puede realizar un ensayo de ADCCin vitro,tal como el descrito en la patente de EE. UU. n.° 5.500.362 o 5.821.337. Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). De forma alternativa, o adicionalmente, se puede evaluarin vivola actividad de ADCC de la molécula de interés, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clyneset al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)95:652-656 (1998).

Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. En algunos modos de realización, las células expresan al menos FcyRIII y llevan a cabo la función efectora ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que median en la ADCC incluyen leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC), linfocitos citolíticos naturales (NK), monocitos, linfocitos T citotóxicos y neutrófilos; siendo preferentes los PBMC y los linfocitos NK.

La "citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la capacidad de una molécula de lisar una diana en presencia del complemento. La vía de activación del complemento se inicia mediante la unión del primer componente del sistema del complemento (C1q) a una molécula (por ejemplo, un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo)) que forma complejos con un antígeno afín. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoroet al., J. Immunol. Methods202:163 (1996).

Los términos "receptor de Fc" o "FcR" se usan para describir un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. En algunos modos de realización, el FcR es un FcR humano de secuencia natural. Además, un FcR preferente es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII, incluyendo variantes alélicas y formas empalmadas de forma alternativa de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor de activación") y FcyRIIB (un "receptor de inhibición"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de los mismos. El receptor de activación FcyRIIA contiene un motivo tirosínico de activación del inmunorreceptor (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor de inhibición F<cy>RIIB contiene un motivo de inhibición basado en tirosina del inmunorreceptor (ITIM) en su dominio citoplásmico (véase Daeron,Annu. Rev. Immunol.15:203-234 (1997)). Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet,Annu. Rev. Immunol9:457-92 (1991); Capelet al., Immunomethods4:25-34 (1994); y de Haaset al., J. Lab. Clin. Med.126:330-41 (1995). Otros FcR, incluyendo los que se vayan a identificar en el futuro, se engloban por el término "FcR" en el presente documento. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyeret al., J. Immunol.117:587 (1976) y Kimet al., J. Immunol.24:249 (1994)).

"Impurezas" se refiere a materiales que son diferentes del producto polipeptídico deseado. En algunos modos de realización de la invención, las impurezas incluyen variantes de carga del polipéptido. En algunos modos de realización de la invención, las impurezas incluyen variantes de carga de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En otros modos de realización de la invención, la impureza incluye, sin limitación: materiales de célula huésped, tales como CHOP; proteína A lixiviada; ácido nucleico; una variante, fragmento, agregado o derivado del polipéptido deseado; otro polipéptido; endotoxina; contaminante vírico; componentes en los medios de cultivo de células, etc.

Como se usa en el presente documento, el término "inmunoadhesina" indica moléculas similares a anticuerpo que combinan la especificidad de unión de un polipéptido heterólogo con las funciones efectoras de dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de unión deseada que es distinta del sitio de reconocimiento y unión a antígeno de un anticuerpo (es decir, es "heteróloga") y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La parte de adhesina de una molécula de inmunoadhesina es típicamente una secuencia de aminoácidos contiguos que comprende al menos el sitio de unión de un receptor o un ligando. Se puede obtener la secuencia del dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina a partir de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD o IgM.

Como se usa en el presente documento, un "tensioactivo" se refiere a un agente activo en superficie, preferentemente un tensioactivo no iónico. Los ejemplos de tensioactivos en el presente documento incluyen polisorbato (por ejemplo, polisorbato 20 y polisorbato 80); poloxámero (por ejemplo, poloxámero 188); Tritón; dodecilsulfato de sodio (SDS); lauril sulfato de sodio; octil-glucósido de sodio; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil-sulfobetaína; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil-sarcosina; linoleil-, miristil- o cetil-betaína; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil- o isoestearamidopropil-betaína (por ejemplo, lauroamidopropilo); miristamidopropil-, palmidopropil- o isoestearamidopropil-dimetilamina; metil cocoil-taurato de sodio o metil oleil-taurato de disodio; y la serie MONAQUAT™ (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.); polietilglicol, polipropilglicol y copolímeros de etilen- y propilenglicol (por ejemplo, Pluronics, PF68, etc.); etc.

El término "secuencial", como se usa en el presente documento, con respecto a la cromatografía se refiere a que realizar una primera cromatografía seguida de una segunda cromatografía. Pueden incluirse etapas adicionales entre la primera cromatografía y la segunda cromatografía.

El término "continuo", como se usa en el presente documento con respecto a la cromatografía, se refiere a que presenta un primer material de cromatografía y un segundo material de cromatografía conectados directamente o algún otro mecanismo que permita un flujo continuo entre los dos materiales de cromatografía.

"Densidad de carga" se refiere a la cantidad, por ejemplo, gramos, de composición puesta en contacto con un volumen de material de cromatografía, por ejemplo, litros. En algunos ejemplos, la densidad de carga se expresa en g/l.

El término "interferencia", como se usa en el presente documento con respecto a la cuantificación de una especie (por ejemplo, tensioactivo no iónico), se refiere a la contribución a la cuantificación de algún componente distinto de la especie (por ejemplo, polipéptido). Por ejemplo, una señal ELSD para una fracción cromatográfica que contiene tanto polisorbato 20 como polipéptido tendrá contribuciones tanto del polisorbato 20 como del polipéptido, y la cuantificación del polisorbato 20 en la fracción tendrá interferencia del polipéptido.

Como se usa en el presente documento, "esencialmente el mismo" indica que no se ha alterado un valor o parámetro en un efecto significativo. Por ejemplo, una fuerza iónica de una fase móvil de cromatografía a la salida de la columna es esencialmente la misma que la fuerza iónica inicial de la fase móvil si la fuerza iónica no ha cambiado significativamente. Por ejemplo, una fuerza iónica a la salida de la columna que está dentro de un 10 %, 5 % o 1 % de la fuerza iónica inicial es esencialmente la misma que la fuerza iónica inicial.

La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) variaciones que se dirigen a ese valor o parámetroper se.Por ejemplo, la descripción en referencia a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X".

Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un/a", "o" y "el/la" incluyen las referencias plurales, a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo. Se entiende que los aspectos y variaciones de la invención descritos en el presente documento incluyen "que consisten en" y/o "que consisten esencialmente en" aspectos y variaciones.

Il. Procedimientos de cromatografía

En algunos aspectos, la invención proporciona procedimientos para analizar composiciones que comprenden un polipéptido y un tensioactivo no iónico (por ejemplo, polisorbato 20 o PS20), que comprende unir el polipéptido y el tensioactivo no iónico a un material de cromatografía de intercambio iónico de modo mixto usando un tampón de carga, y eluir el polipéptido y el tensioactivo no iónico del material de cromatografía usando tampones de modo que el polipéptido y el tensioactivo no iónico eluyan del material de cromatografía en distintas fracciones. En algunos modos de realización, los procedimientos de cromatografía son adecuados para composiciones que comprenden múltiples polipéptidos (por ejemplo, productos polipeptídicos), incluyendo polipéptidos con pl variables. Por ejemplo, se pueden usar los procedimientos para analizar composiciones que comprenden un tensioactivo no iónico y varios productos de anticuerpos diferentes, tales como productos de anticuerpos con pl que varían de 6,0 a 9,5. En otros modos de realización, los procedimientos de cromatografía incluyen el uso de condiciones óptimas (por ejemplo, material de cromatografía, tampones, gradientes, duración de etapas, caudal, carga de muestra) identificadas mediante los procedimientos descritos en el presente documento.

En algunos modos de realización de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el material de cromatografía es un material de modo mixto que comprende grupos funcionales que pueden tener una o más de las siguientes funcionalidades: intercambio aniónico, intercambio catiónico, enlace de hidrógeno e interacciones hidrófobas. En algunos modos de realización, el material de modo mixto es un material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio aniónico fuerte de fase inversa. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un resto de amina cuaternaria. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto es un material de cromatografía Oasis® MAX. En algunos modos de realización, el material de modo mixto es un material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio catiónico fuerte de fase inversa. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un resto de ácido sulfónico. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía Oasis® MCX. En algunos modos de realización, el material de modo mixto comprende un soporte sólido. En algunos modos de realización, el material de modo mixto está contenido en una columna o cartucho. En algunos modos de realización de lo anterior, el material de modo mixto es una columna o cartucho de cromatografía de modo mixto, tal como una columna o cartucho de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto o una columna o cartucho de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto. En algunos modos de realización, el material de modo mixto es un material de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC).

En algunos modos de realización de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el material de intercambio iónico puede utilizar un material de cromatografía convencional o un material de cromatografía convectivo. Los materiales de cromatografía convencionales incluyen, por ejemplo, materiales perfusivos (por ejemplo, resina de poli(estireno-divinilbenceno)) y materiales difusivos (por ejemplo, resina de agarosa reticulada). En algunos modos de realización, la resina de poli(estireno-divinilbenceno) puede ser resina Poros®. En algunos modos de realización, la resina de agarosa reticulada puede ser resina de sulfopropil-Sepharose® Fast Flow ("SPSFF"). El material de cromatografía convectiva puede ser una membrana (por ejemplo, polietersulfona) o un material monolítico (por ejemplo, polímero reticulado). La membrana de polietersulfona puede ser Mustang. El material monolítico de polímero reticulado puede ser poli(metacrilato de glicidilo-co-dimetacrilato de etileno) reticulado.

En algunos modos de realización de cualquiera de los procedimientos de la invención, el material de cromatografía está en una columna o cartucho de cromatografía; por ejemplo, una columna o cartucho de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto o una columna o cartucho de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto. En algunos modos de realización, se usa la columna o cartucho de cromatografía para cromatografía de líquidos. En algunos modos de realización, se usa la columna o cartucho de cromatografía para cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). En algunos modos de realización, la columna o cartucho de cromatografía es una columna o cartucho de cromatografía HPLC; por ejemplo, una columna o cartucho de HPLC de intercambio catiónico de modo mixto o una columna o cartucho de H<p l>C de intercambio aniónico de modo mixto.

Por ejemplo, en algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para cuantificar un tensioactivo no iónico en una composición que comprende el tensioactivo no iónico y un polipéptido, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una primera proporción entre una fase móvil B y una fase móvil A, en el que la fase móvil A comprende ácido en agua y la fase móvil B comprende ácido en metanol; b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto con una solución que comprende una segunda proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la segunda proporción es mayor que la primera proporción; c) eluir el tensioactivo no iónico del material de cromatografía con una solución que comprende una tercera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la tercera proporción es mayor que la segunda proporción; y d) cuantificar el tensioactivo no iónico en el eluido de la etapa c). En algunos modos de realización, el polipéptido se une al material de cromatografía específica y no específicamente, y al menos aproximadamente un 90 % (tal como al menos aproximadamente cualquiera de un 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %) del polipéptido eluye en la etapa b). En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende un polipéptido unido no específicamente. En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0. 01 % o menos) del polipéptido total en la composición. En algunos modos de realización, la primera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A está entre aproximadamente 0:100 y aproximadamente 20:80 (tal como aproximadamente cualquiera de 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84 y 18:82, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la segunda proporción está entre aproximadamente 30:70 y aproximadamente 50:50 (tal como aproximadamente cualquiera de 32:68, 34:66, 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54 y 48:52, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la tercera proporción está entre aproximadamente 80:20 y aproximadamente 100:0 (tal como aproximadamente cualquiera de 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4 y 98:2, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la fase móvil A comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de ácido en agua. En algunos modos de realización, la fase móvil B comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de ácido en metanol. En algunos modos de realización, el ácido es ácido fórmico. En algunos modos de realización, el ácido es ácido acético. En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía está entre aproximadamente 0,5 y 2,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 0,7, 0,9, 1,1, 1,2, 1,25, 1,3, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1 y 2,3, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) ml/minuto. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 (tal como aproximadamente cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 , 25, 30, 35, 40 y 45, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) pl. En algunos modos de realización, la etapa b) comienza al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o más) minutos después de que se inicie la etapa a) y continúa durante al menos aproximadamente 1 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4 o más) minutos. En algunos modos de realización, la etapa c) comienza al menos aproximadamente 0,05 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2 o más) minutos después de que finalice la etapa b) y continúa durante al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3 o más) minutos.

En algunos modos de realización, la concentración de tensioactivo no iónico en la composición está en el intervalo de aproximadamente un 0,001 % a un 1,0 % (p/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 y 0,9 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de proteína en la composición es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml (tal como aproximadamente cualquiera de 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 y 240 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición tiene un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además uno o más excipientes seleccionados del grupo que consiste en un estabilizador, un tampón y un agente de tonicidad. En algunos modos de realización, la composición es una formulación farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. En algunos modos de realización, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunos modos de realización, el polipéptido terapéutico es una proteína de fusión, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo glucomanipulado, un fragmento de anticuerpo, un conjugado fármaco-anticuerpo, un THIOMAB™ o un conjugado fármaco-THIOMAB™. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio aniónico fuerte de fase inversa. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un resto de amina cuaternaria. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un soporte sólido. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto está contenido en una columna o cartucho. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto es un material de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto es un material de cromatografía Oasis® MAX. En algunos modos de realización, el detergente no iónico se cuantifica mediante dispersión de luz por evaporación (ELSD) o usando un detector de aerosol cargado (CAD). En algunos modos de realización, la cuantificación del tensioactivo no iónico comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) de interferencia del polipéptido.

En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para cuantificar un tensioactivo no iónico en una composición que comprende el tensioactivo no iónico y un polipéptido, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una primera proporción entre una fase móvil B y una fase móvil A, en el que la fase móvil A comprende ácido en agua y la fase móvil B comprende ácido en metanol; b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto con una solución que comprende una segunda proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la segunda proporción es mayor que la primera proporción; c) eluir el tensioactivo no iónico del material de cromatografía con una solución que comprende una tercera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la tercera proporción es mayor que la segunda proporción; y d) cuantificar el tensioactivo no iónico en el eluido de la etapa c), en el que la cuantificación del tensioactivo no iónico comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) de interferencia del polipéptido. En algunos modos de realización, el polipéptido se une al material de cromatografía específica y no específicamente, y al menos aproximadamente un 90 % (tal como al menos aproximadamente cualquiera de un 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %) del polipéptido eluye en la etapa b). En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende un polipéptido unido no específicamente. En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del polipéptido total en la composición. En algunos modos de realización, la primera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A está entre aproximadamente 0:100 y aproximadamente 20:80 (tal como aproximadamente cualquiera de 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84 y 18:82, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la segunda proporción está entre aproximadamente 30:70 y aproximadamente 50:50 (tal como aproximadamente cualquiera de 32:68, 34:66, 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54 y 48:52, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la tercera proporción está entre aproximadamente 80:20 y aproximadamente 100:0 (tal como aproximadamente cualquiera de 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4 y 98:2, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la fase móvil A comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de ácido en agua. En algunos modos de realización, la fase móvil B comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de ácido en metanol. En algunos modos de realización, el ácido es ácido fórmico. En algunos modos de realización, el ácido es ácido acético. En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía está entre aproximadamente 0,5 y 2,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 0,7, 0,9, 1,1, 1,2, 1,25, 1,3, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1 y 2,3, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) ml/minuto. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 (tal como aproximadamente cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ,25 , 30, 35, 40 y 45, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) pl. En algunos modos de realización, la etapa b) comienza al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o más) minutos después de que se inicie la etapa a) y continúa durante al menos aproximadamente 1 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4 o más) minutos. En algunos modos de realización, la etapa c) comienza al menos aproximadamente 0,05 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2 o más) minutos después de que finalice la etapa b) y continúa durante al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3 o más) minutos.

En algunos modos de realización, la concentración de tensioactivo no iónico en la composición está en el intervalo de aproximadamente un 0,001 % a un 1,0 % (p/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 y 0,9 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de proteína en la composición es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml (tal como aproximadamente cualquiera de 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 y 240 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición tiene un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además uno o más excipientes seleccionados del grupo que consiste en un estabilizador, un tampón y un agente de tonicidad. En algunos modos de realización, la composición es una formulación farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. En algunos modos de realización, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunos modos de realización, el polipéptido terapéutico es una proteína de fusión, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo glucomanipulado, un fragmento de anticuerpo, un conjugado fármaco-anticuerpo, un THIOMAB™ o un conjugado fármaco-THlOMAB™. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio aniónico fuerte de fase inversa. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un resto de amina cuaternaria. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un soporte sólido. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto está contenido en una columna o cartucho. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto es un material de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto es un material de cromatografía Oasis® MAX. En algunos modos de realización, el detergente no iónico se cuantifica mediante dispersión de luz por evaporación (ELSD) o usando un detector de aerosol cargado (CAD).

En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para cuantificar un tensioactivo no iónico en una composición que comprende el tensioactivo no iónico y un polipéptido, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una primera proporción entre una fase móvil B y una fase móvil A, en el que la fase móvil A comprende ácido en agua y la fase móvil B comprende ácido en metanol; b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto con una solución que comprende una segunda proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la segunda proporción es mayor que la primera proporción; c) eluir el tensioactivo no iónico del material de cromatografía con una solución que comprende una tercera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la tercera proporción es mayor que la segunda proporción; y d) cuantificar el tensioactivo no iónico en el eluido de la etapa c), en el que el eluido comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del polipéptido total en la composición.. En algunos modos de realización, la primera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A está entre aproximadamente 0:100 y aproximadamente 20:80 (tal como aproximadamente cualquiera de 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84 y 18:82, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la segunda proporción está entre aproximadamente 30:70 y aproximadamente 50:50 (tal como aproximadamente cualquiera de 32:68, 34:66, 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54 y 48:52, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la tercera proporción está entre aproximadamente 80:20 y aproximadamente 100:0 (tal como aproximadamente cualquiera de 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4 y 98:2, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la fase móvil A comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de ácido en agua. En algunos modos de realización, la fase móvil B comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de ácido en metanol. En algunos modos de realización, el ácido es ácido fórmico. En algunos modos de realización, el ácido es ácido acético. En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía está entre aproximadamente 0,5 y 2,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 0,7, 0,9, 1,1, 1,2, 1,25, 1,3, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1 y 2,3, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) ml/minuto. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 (tal como aproximadamente cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ,25 , 30, 35, 40 y 45, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) pl. En algunos modos de realización, la etapa b) comienza al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o más) minutos después de que se inicie la etapa a) y continúa durante al menos aproximadamente 1 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4 o más) minutos. En algunos modos de realización, la etapa c) comienza al menos aproximadamente 0,05 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2 o más) minutos después de que finalice la etapa b) y continúa durante al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3 o más) minutos.

En algunos modos de realización, la concentración de tensioactivo no iónico en la composición está en el intervalo de aproximadamente un 0,001 % a un 1,0 % (p/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 y 0,9 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de proteína en la composición es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml (tal como aproximadamente cualquiera de 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 y 240 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición tiene un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además uno o más excipientes seleccionados del grupo que consiste en un estabilizador, un tampón y un agente de tonicidad. En algunos modos de realización, la composición es una formulación farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. En algunos modos de realización, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunos modos de realización, el polipéptido terapéutico es una proteína de fusión, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo glucomanipulado, un fragmento de anticuerpo, un conjugado fármaco-anticuerpo, un THIOMAB™ o un conjugado fármaco-THlOMAB™. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio aniónico fuerte de fase inversa. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un resto de amina cuaternaria. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un soporte sólido. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto está contenido en una columna o cartucho. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto es un material de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto es un material de cromatografía Oasis® MAX. En algunos modos de realización, el detergente no iónico se cuantifica mediante dispersión de luz por evaporación (ELSD) o usando un detector de aerosol cargado (CAD). En algunos modos de realización, la cuantificación del tensioactivo no iónico comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) de interferencia del polipéptido.

En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para cuantificar un tensioactivo no iónico en una composición que comprende el tensioactivo no iónico y un polipéptido, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una primera proporción entre una fase móvil B y una fase móvil A, en el que la fase móvil A comprende ácido acético en agua y la fase móvil B comprende ácido acético en metanol; b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto con una solución que comprende una segunda proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la segunda proporción es mayor que la primera proporción; c) eluir el tensioactivo no iónico del material de cromatografía con una solución que comprende una tercera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la tercera proporción es mayor que la segunda proporción; y d) cuantificar el tensioactivo no iónico en el eluido de la etapa c). En algunos modos de realización, el polipéptido se une al material de cromatografía específica y no específicamente, y al menos aproximadamente un 90 % (tal como al menos aproximadamente cualquiera de un 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %) del polipéptido eluye en la etapa b). En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende un polipéptido unido no específicamente. En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del polipéptido total en la composición. En algunos modos de realización, la primera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A está entre aproximadamente 0:100 y aproximadamente 20:80 (tal como aproximadamente cualquiera de 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84 y 18:82, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la segunda proporción está entre aproximadamente 30:70 y aproximadamente 50:50 (tal como aproximadamente cualquiera de 32:68, 34:66, 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54 y 48:52, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la tercera proporción está entre aproximadamente 80:20 y aproximadamente 100:0 (tal como aproximadamente cualquiera de 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4 y 98:2, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la fase móvil A comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de ácido acético en agua. En algunos modos de realización, la fase móvil B comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de ácido acético en metanol. En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía está entre aproximadamente 0,5 y 2,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 0,7, 0,9, 1,1, 1,2, 1,25, 1,3, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1 y 2,3, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) ml/minuto. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 (tal como aproximadamente cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ,25 , 30, 35, 40 y 45, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) pl. En algunos modos de realización, la etapa b) comienza al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o más) minutos después de que se inicie la etapa a) y continúa durante al menos aproximadamente 1 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4 o más) minutos. En algunos modos de realización, la etapa c) comienza al menos aproximadamente 0,05 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2 o más) minutos después de que finalice la etapa b) y continúa durante al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3 o más) minutos.

En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para cuantificar un tensioactivo no iónico en una composición que comprende el tensioactivo no iónico y un polipéptido, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una primera proporción entre una fase móvil B y una fase móvil A de entre aproximadamente 5:95 y aproximadamente 15:85, en el que la fase móvil A comprende ácido en agua y la fase móvil B comprende ácido en metanol; b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto con una solución que comprende una segunda proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A de entre aproximadamente 35:65 y aproximadamente 45:55; c) eluir el tensioactivo no iónico del material de cromatografía con una solución que comprende una tercera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A de entre aproximadamente 90:10 y aproximadamente 100:0; y d) cuantificar el tensioactivo no iónico en el eluido de la etapa c). En algunos modos de realización, la primera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A es de aproximadamente 10:90. En algunos modos de realización, la segunda proporción es de aproximadamente 40:60. En algunos modos de realización, la tercera proporción es de aproximadamente 100:0. En algunos modos de realización, el polipéptido se une al material de cromatografía específica y no específicamente, y al menos aproximadamente un 90 % (tal como al menos aproximadamente cualquiera de un 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %) del polipéptido eluye en la etapa b). En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende un polipéptido unido no específicamente. En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del polipéptido total en la composición. En algunos modos de realización, la fase móvil A comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de ácido en agua. En algunos modos de realización, la fase móvil B comprende entre aproximadamente un 0. 5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de ácido en metanol. En algunos modos de realización, el ácido es ácido fórmico. En algunos modos de realización, el ácido es ácido acético. En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía está entre aproximadamente 0,5 y 2,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 0,7, 0,9, 1,1, 1,2, 1,25, 1,3, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1 y 2,3, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) ml/minuto. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 (tal como aproximadamente cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ,25 , 30, 35, 40 y 45, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) pl. En algunos modos de realización, la etapa b) comienza al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o más) minutos después de que se inicie la etapa a) y continúa durante al menos aproximadamente 1 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4 o más) minutos. En algunos modos de realización, la etapa c) comienza al menos aproximadamente 0,05 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2 o más) minutos después de que finalice la etapa b) y continúa durante al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3 o más) minutos.

En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para cuantificar un polisorbato en una composición que comprende el polisorbato y un polipéptido, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una primera proporción entre una fase móvil B y una fase móvil A, en el que la fase móvil A comprende ácido en agua y la fase móvil B comprende ácido en metanol; b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto con una solución que comprende una segunda proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la segunda proporción es mayor que la primera proporción; c) eluir el polisorbato del material de cromatografía con una solución que comprende una tercera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la tercera proporción es mayor que la segunda proporción; y d) cuantificar el polisorbato en el eluido de la etapa c). En algunos modos de realización, el polipéptido se une al material de cromatografía específica y no específicamente, y al menos aproximadamente un 90 % (tal como al menos aproximadamente cualquiera de un 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %) del polipéptido eluye en la etapa b). En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende un polipéptido unido no específicamente. En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del polipéptido total en la composición. En algunos modos de realización, la primera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A está entre aproximadamente 0:100 y aproximadamente 20:80 (tal como aproximadamente cualquiera de 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84 y 18:82, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la segunda proporción está entre aproximadamente 30:70 y aproximadamente 50:50 (tal como aproximadamente cualquiera de 32:68, 34:66, 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54 y 48:52, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la tercera proporción está entre aproximadamente 80:20 y aproximadamente 100:0 (tal como aproximadamente cualquiera de 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4 y 98:2, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la fase móvil A comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de ácido en agua. En algunos modos de realización, la fase móvil B comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de ácido en metanol. En algunos modos de realización, el ácido es ácido fórmico. En algunos modos de realización, el ácido es ácido acético. En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía está entre aproximadamente 0,5 y 2,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 0,7, 0,9, 1,1, 1,2, 1,25, 1,3, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1 y 2,3, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) ml/minuto. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 (tal como aproximadamente cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 , 25, 30, 35, 40 y 45, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) pl. En algunos modos de realización, la etapa b) comienza al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o más) minutos después de que se inicie la etapa a) y continúa durante al menos aproximadamente 1 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4 o más) minutos. En algunos modos de realización, la etapa c) comienza al menos aproximadamente 0,05 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1,0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2 o más) minutos después de que finalice la etapa b) y continúa durante al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3 o más) minutos. En algunos modos de realización, el polisorbato es polisorbato 20 o polisorbato 80. En algunos modos de realización, la concentración de polisorbato en la composición está en el intervalo de aproximadamente un 0,001 % a un 1,0 % (p/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 y 0,9 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de proteína en la composición es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml (tal como aproximadamente cualquiera de 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 y 240 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición tiene un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además uno o más excipientes seleccionados del grupo que consiste en un estabilizador, un tampón y un agente de tonicidad. En algunos modos de realización, la composición es una formulación farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. En algunos modos de realización, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunos modos de realización, el polipéptido terapéutico es una proteína de fusión, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo glucomanipulado, un fragmento de anticuerpo, un conjugado fármaco-anticuerpo, un THIOMAB™ o un conjugado fármaco-THlOMAB™. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio aniónico fuerte de fase inversa. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un resto de amina cuaternaria. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un soporte sólido. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto está contenido en una columna o cartucho. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto es un material de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto es un material de cromatografía Oasis® MAX. En algunos modos de realización, el detergente no iónico se cuantifica mediante dispersión de luz por evaporación (ELSD) o usando un detector de aerosol cargado (CAD). En algunos modos de realización, la cuantificación del tensioactivo no iónico comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) de interferencia del polipéptido.

En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para cuantificar un polisorbato en una composición que comprende el polisorbato y un polipéptido, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una primera proporción entre una fase móvil B y una fase móvil A, en el que la fase móvil A comprende ácido en agua y la fase móvil B comprende ácido en metanol; b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto con una solución que comprende una segunda proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la segunda proporción es mayor que la primera proporción; c) eluir el polisorbato del material de cromatografía con una solución que comprende una tercera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la tercera proporción es mayor que la segunda proporción; y d) cuantificar el polisorbato en el eluido de la etapa c), en el que la cuantificación del tensioactivo no iónico comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) de interferencia del polipéptido. En algunos modos de realización, el polipéptido se une al material de cromatografía específica y no específicamente, y al menos aproximadamente un 90 % (tal como al menos aproximadamente cualquiera de un 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %) del polipéptido eluye en la etapa b). En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende un polipéptido unido no específicamente. En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0. 01 % o menos) del polipéptido total en la composición. En algunos modos de realización, la primera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A está entre aproximadamente 0:100 y aproximadamente 20:80 (tal como aproximadamente cualquiera de 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84 y 18:82, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la segunda proporción está entre aproximadamente 30:70 y aproximadamente 50:50 (tal como aproximadamente cualquiera de 32:68, 34:66, 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54 y 48:52, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la tercera proporción está entre aproximadamente 80:20 y aproximadamente 100:0 (tal como aproximadamente cualquiera de 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4 y 98:2, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la fase móvil A comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de ácido en agua. En algunos modos de realización, la fase móvil B comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de ácido en metanol. En algunos modos de realización, el ácido es ácido fórmico. En algunos modos de realización, el ácido es ácido acético. En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía está entre aproximadamente 0,5 y 2,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 0,7, 0,9, 1,1, 1,2, 1,25, 1,3, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1 y 2,3, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) ml/minuto. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 (tal como aproximadamente cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 , 25, 30, 35, 40 y 45, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) pl. En algunos modos de realización, la etapa b) comienza al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o más) minutos después de que se inicie la etapa a) y continúa durante al menos aproximadamente 1 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4 o más) minutos. En algunos modos de realización, la etapa c) comienza al menos aproximadamente 0,05 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2 o más) minutos después de que finalice la etapa b) y continúa durante al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3 o más) minutos. En algunos modos de realización, el polisorbato es polisorbato 20 o polisorbato 80. En algunos modos de realización, la concentración de polisorbato en la composición está en el intervalo de aproximadamente un 0,001 % a un 1,0 % (p/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 y 0,9 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de proteína en la composición es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml (tal como aproximadamente cualquiera de 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 y 240 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición tiene un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además uno o más excipientes seleccionados del grupo que consiste en un estabilizador, un tampón y un agente de tonicidad. En algunos modos de realización, la composición es una formulación farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. En algunos modos de realización, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunos modos de realización, el polipéptido terapéutico es una proteína de fusión, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo glucomanipulado, un fragmento de anticuerpo, un conjugado fármaco-anticuerpo, un THIOMAB™ o un conjugado fármaco-THlOMAB™. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio aniónico fuerte de fase inversa. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un resto de amina cuaternaria. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un soporte sólido. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto está contenido en una columna o cartucho. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto es un material de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto es un material de cromatografía Oasis® MAX. En algunos modos de realización, el detergente no iónico se cuantifica mediante dispersión de luz por evaporación (ELSD) o usando un detector de aerosol cargado (CAD).

En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para cuantificar un polisorbato en una composición que comprende el polisorbato y un polipéptido, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una primera proporción entre una fase móvil B y una fase móvil A, en el que la fase móvil A comprende ácido en agua y la fase móvil B comprende ácido en metanol; b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto con una solución que comprende una segunda proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la segunda proporción es mayor que la primera proporción; c) eluir el polisorbato del material de cromatografía con una solución que comprende una tercera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la tercera proporción es mayor que la segunda proporción; y d) cuantificar el polisorbato en el eluido de la etapa c), en el que el eluido comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del polipéptido total en la composición.. En algunos modos de realización, la primera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A está entre aproximadamente 0:100 y aproximadamente 20:80 (tal como aproximadamente cualquiera de 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84 y 18:82, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la segunda proporción está entre aproximadamente 30:70 y aproximadamente 50:50 (tal como aproximadamente cualquiera de 32:68, 34:66, 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54 y 48:52, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la tercera proporción está entre aproximadamente 80:20 y aproximadamente 100:0 (tal como aproximadamente cualquiera de 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4 y 98:2, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la fase móvil A comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de ácido en agua. En algunos modos de realización, la fase móvil B comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de ácido en metanol. En algunos modos de realización, el ácido es ácido fórmico. En algunos modos de realización, el ácido es ácido acético. En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía está entre aproximadamente 0,5 y 2,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 0,7, 0,9, 1,1, 1,2, 1,25, 1,3, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1 y 2,3, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) ml/minuto. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 (tal como aproximadamente cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 , 25, 30, 35, 40 y 45, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) pl. En algunos modos de realización, la etapa b) comienza al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o más) minutos después de que se inicie la etapa a) y continúa durante al menos aproximadamente 1 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4 o más) minutos. En algunos modos de realización, la etapa c) comienza al menos aproximadamente 0,05 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1,0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2 o más) minutos después de que finalice la etapa b) y continúa durante al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3 o más) minutos. En algunos modos de realización, el polisorbato es polisorbato 20 o polisorbato 80. En algunos modos de realización, la concentración de polisorbato en la composición está en el intervalo de aproximadamente un 0,001 % a un 1,0 % (p/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 y 0,9 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de proteína en la composición es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml (tal como aproximadamente cualquiera de 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 y 240 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición tiene un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además uno o más excipientes seleccionados del grupo que consiste en un estabilizador, un tampón y un agente de tonicidad. En algunos modos de realización, la composición es una formulación farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. En algunos modos de realización, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunos modos de realización, el polipéptido terapéutico es una proteína de fusión, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo glucomanipulado, un fragmento de anticuerpo, un conjugado fármaco-anticuerpo, un THIOMAB™ o un conjugado fármaco-THlOMAB™. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio aniónico fuerte de fase inversa. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un resto de amina cuaternaria. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un soporte sólido. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto está contenido en una columna o cartucho. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto es un material de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto es un material de cromatografía Oasis® MAX. En algunos modos de realización, el detergente no iónico se cuantifica mediante dispersión de luz por evaporación (ELSD) o usando un detector de aerosol cargado (CAD). En algunos modos de realización, la cuantificación del tensioactivo no iónico comprende menos de aproximadamente un 10%(tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) de interferencia del polipéptido.

En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para cuantificar un polisorbato en una composición que comprende el polisorbato y un polipéptido, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una primera proporción entre una fase móvil B y una fase móvil A, en el que la fase móvil A comprende ácido acético en agua y la fase móvil B comprende ácido acético en metanol; b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto con una solución que comprende una segunda proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la segunda proporción es mayor que la primera proporción; c) eluir el polisorbato del material de cromatografía con una solución que comprende una tercera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la tercera proporción es mayor que la segunda proporción; y d) cuantificar el polisorbato en el eluido de la etapa c). En algunos modos de realización, el polipéptido se une al material de cromatografía específica y no específicamente, y al menos aproximadamente un 90 % (tal como al menos aproximadamente cualquiera de un 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %) del polipéptido eluye en la etapa b). En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende un polipéptido unido no específicamente. En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del polipéptido total en la composición. En algunos modos de realización, la primera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A está entre aproximadamente 0:100 y aproximadamente 20:80 (tal como aproximadamente cualquiera de 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84 y 18:82, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la segunda proporción está entre aproximadamente 30:70 y aproximadamente 50:50 (tal como aproximadamente cualquiera de 32:68, 34:66, 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54 y 48:52, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la tercera proporción está entre aproximadamente 80:20 y aproximadamente 100:0 (tal como aproximadamente cualquiera de 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4 y 98:2, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la fase móvil A comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de ácido acético en agua. En algunos modos de realización, la fase móvil B comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de ácido acético en metanol. En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía está entre aproximadamente 0,5 y 2,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 0,7, 0,9, 1,1, 1,2, 1,25, 1,3, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1 y 2,3, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) ml/minuto. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 (tal como aproximadamente cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ,25 , 30, 35, 40 y 45, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) pl. En algunos modos de realización, la etapa b) comienza al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o más) minutos después de que se inicie la etapa a) y continúa durante al menos aproximadamente 1 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4 o más) minutos. En algunos modos de realización, la etapa c) comienza al menos aproximadamente 0,05 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1,0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2 o más) minutos después de que finalice la etapa b) y continúa durante al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3 o más) minutos. En algunos modos de realización, el polisorbato es polisorbato 20 o polisorbato 80. En algunos modos de realización, la concentración de polisorbato en la composición está en el intervalo de aproximadamente un 0,001 % a un 1,0 % (p/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 y 0,9 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de proteína en la composición es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml (tal como aproximadamente cualquiera de 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 y 240 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición tiene un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además uno o más excipientes seleccionados del grupo que consiste en un estabilizador, un tampón y un agente de tonicidad. En algunos modos de realización, la composición es una formulación farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. En algunos modos de realización, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunos modos de realización, el polipéptido terapéutico es una proteína de fusión, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo glucomanipulado, un fragmento de anticuerpo, un conjugado fármaco-anticuerpo, un THIOMAB™ o un conjugado fármaco-THlOMAB™. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio aniónico fuerte de fase inversa. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un resto de amina cuaternaria. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un soporte sólido. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto está contenido en una columna o cartucho. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto es un material de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto es un material de cromatografía Oasis® MAX. En algunos modos de realización, el detergente no iónico se cuantifica mediante dispersión de luz por evaporación (ELSD) o usando un detector de aerosol cargado (CAD). En algunos modos de realización, la cuantificación del tensioactivo no iónico comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) de interferencia del polipéptido.

En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para cuantificar un polisorbato en una composición que comprende el polisorbato y un polipéptido, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una primera proporción entre una fase móvil B y una fase móvil A de entre aproximadamente 5:95 y aproximadamente 15:85, en el que la fase móvil A comprende ácido en agua y la fase móvil B comprende ácido en metanol; b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto con una solución que comprende una segunda proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A de entre aproximadamente 35:65 y aproximadamente 45:55; c) eluir el polisorbato del material de cromatografía con una solución que comprende una tercera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A de entre aproximadamente 90:10 y aproximadamente 100:0; y d) cuantificar el polisorbato en el eluido de la etapa c). En algunos modos de realización, la primera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A es de aproximadamente 10:90. En algunos modos de realización, la segunda proporción es de aproximadamente 40:60. En algunos modos de realización, la tercera proporción es de aproximadamente 100:0. En algunos modos de realización, el polipéptido se une al material de cromatografía específica y no específicamente, y al menos aproximadamente un 90 % (tal como al menos aproximadamente cualquiera de un 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %) del polipéptido eluye en la etapa b). En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende un polipéptido unido no específicamente. En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del polipéptido total en la composición. En algunos modos de realización, la fase móvil A comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de ácido en agua. En algunos modos de realización, la fase móvil B comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de ácido en metanol. En algunos modos de realización, el ácido es ácido fórmico. En algunos modos de realización, el ácido es ácido acético. En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía está entre aproximadamente 0,5 y 2,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 0,7, 0,9, 1,1, 1,2, 1,25, 1,3, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1 y 2,3, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) ml/minuto. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 (tal como aproximadamente cualquiera de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20,25, 30, 35, 40 y 45, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) pl. En algunos modos de realización, la etapa b) comienza al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o más) minutos después de que se inicie la etapa a) y continúa durante al menos aproximadamente 1 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4 o más) minutos. En algunos modos de realización, la etapa c) comienza al menos aproximadamente 0,05 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1,0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2 o más) minutos después de que finalice la etapa b) y continúa durante al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3 o más) minutos. En algunos modos de realización, el polisorbato es polisorbato 20 o polisorbato 80. En algunos modos de realización, la concentración de polisorbato en la composición está en el intervalo de aproximadamente un 0,001 % a un 1,0 % (p/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 y 0,9 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de proteína en la composición es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml (tal como aproximadamente cualquiera de 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 y 240 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición tiene un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además uno o más excipientes seleccionados del grupo que consiste en un estabilizador, un tampón y un agente de tonicidad. En algunos modos de realización, la composición es una formulación farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. En algunos modos de realización, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunos modos de realización, el polipéptido terapéutico es una proteína de fusión, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo glucomanipulado, un fragmento de anticuerpo, un conjugado fármaco-anticuerpo, un THIOMAB™ o un conjugado fármaco-THlOMAB™. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio aniónico fuerte de fase inversa. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un resto de amina cuaternaria. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un soporte sólido. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto está contenido en una columna o cartucho. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto es un material de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto es un material de cromatografía Oasis® MAX. En algunos modos de realización, el detergente no iónico se cuantifica mediante dispersión de luz por evaporación (ELSD) o usando un detector de aerosol cargado (CAD). En algunos modos de realización, la cuantificación del tensioactivo no iónico comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) de interferencia del polipéptido.

En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para cuantificar un polisorbato en una composición que comprende el polisorbato y un polipéptido, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una primera proporción entre una fase móvil B y una fase móvil A de entre aproximadamente 5:95 y aproximadamente 15:85, en el que la fase móvil A comprende ácido acético en agua y la fase móvil B comprende ácido acético en metanol; b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto con una solución que comprende una segunda proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A de entre aproximadamente 35:65 y aproximadamente 45:55; c) eluir el polisorbato del material de cromatografía con una solución que comprende una tercera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A de entre aproximadamente 90:10 y aproximadamente 100:0; y d) cuantificar el polisorbato en el eluido de la etapa c), en el que la cuantificación del tensioactivo no iónico comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) de interferencia del polipéptido. En algunos modos de realización, la primera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A es de aproximadamente 10:90. En algunos modos de realización, la segunda proporción es de aproximadamente 40:60. En algunos modos de realización, la tercera proporción es de aproximadamente 100:0. En algunos modos de realización, el polipéptido se une al material de cromatografía específica y no específicamente, y al menos aproximadamente un 90 % (tal como al menos aproximadamente cualquiera de un 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %) del polipéptido eluye en la etapa b). En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende un polipéptido unido no específicamente. En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del polipéptido total en la composición. En algunos modos de realización, la fase móvil A comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de ácido acético en agua. En algunos modos de realización, la fase móvil B comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de ácido acético en metanol. En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía está entre aproximadamente 0,5 y 2,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 0,7, 0,9, 1,1, 1,2, 1,25, 1,3, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1 y 2,3, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) ml/minuto. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 (tal como aproximadamente cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ,25 , 30, 35, 40 y 45, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) pl. En algunos modos de realización, la etapa b) comienza al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o más) minutos después de que se inicie la etapa a) y continúa durante al menos aproximadamente 1 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4 o más) minutos. En algunos modos de realización, la etapa c) comienza al menos aproximadamente 0,05 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1,0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2 o más) minutos después de que finalice la etapa b) y continúa durante al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3 o más) minutos. En algunos modos de realización, el polisorbato es polisorbato 20 o polisorbato 80. En algunos modos de realización, la concentración de polisorbato en la composición está en el intervalo de aproximadamente un 0,001 % a un 1,0 % (p/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 y 0,9 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de proteína en la composición es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml (tal como aproximadamente cualquiera de 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 y 240 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición tiene un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además uno o más excipientes seleccionados del grupo que consiste en un estabilizador, un tampón y un agente de tonicidad. En algunos modos de realización, la composición es una formulación farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. En algunos modos de realización, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunos modos de realización, el polipéptido terapéutico es una proteína de fusión, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo glucomanipulado, un fragmento de anticuerpo, un conjugado fármaco-anticuerpo, un THIOMAB™ o un conjugado fármaco-THIOMAB™. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio aniónico fuerte de fase inversa. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un resto de amina cuaternaria. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un soporte sólido. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto está contenido en una columna o cartucho. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto es un material de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto es un material de cromatografía Oasis® MAX. En algunos modos de realización, el detergente no iónico se cuantifica mediante dispersión de luz por evaporación (ELSD) o usando un detector de aerosol cargado (CAD).

En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para cuantificar un polisorbato en una composición que comprende el polisorbato y un polipéptido, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una primera proporción entre una fase móvil B y una fase móvil A de entre aproximadamente 5:95 y aproximadamente 15:85, en el que la fase móvil A comprende ácido acético en agua y la fase móvil B comprende ácido acético en metanol; b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto con una solución que comprende una segunda proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A de entre aproximadamente 35:65 y aproximadamente 45:55; c) eluir el polisorbato del material de cromatografía con una solución que comprende una tercera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A de entre aproximadamente 90:10 y aproximadamente 100:0; y d) cuantificar el polisorbato en el eluido de la etapa c), en el que el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del polipéptido total en la composición.. En algunos modos de realización, la primera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A es de aproximadamente 10:90. En algunos modos de realización, la segunda proporción es de aproximadamente 40:60. En algunos modos de realización, la tercera proporción es de aproximadamente 100:0. En algunos modos de realización, la fase móvil A comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de ácido acético en agua. En algunos modos de realización, la fase móvil B comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de ácido acético en metanol. En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía está entre aproximadamente 0,5 y 2,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 0,7, 0,9, 1,1, 1,2, 1,25, 1,3, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1 y 2,3, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) ml/minuto. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 (tal como aproximadamente cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 , 25, 30, 35, 40 y 45, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) pl. En algunos modos de realización, la etapa b) comienza al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o más) minutos después de que se inicie la etapa a) y continúa durante al menos aproximadamente 1 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4 o más) minutos. En algunos modos de realización, la etapa c) comienza al menos aproximadamente 0,05 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2 o más) minutos después de que finalice la etapa b) y continúa durante al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3 o más) minutos. En algunos modos de realización, el polisorbato es polisorbato 20 o polisorbato 80. En algunos modos de realización, la concentración de polisorbato en la composición está en el intervalo de aproximadamente un 0,001 % a un 1,0 % (p/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 y 0,9 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de proteína en la composición es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml (tal como aproximadamente cualquiera de 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 y 240 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición tiene un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además uno o más excipientes seleccionados del grupo que consiste en un estabilizador, un tampón y un agente de tonicidad. En algunos modos de realización, la composición es una formulación farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. En algunos modos de realización, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunos modos de realización, el polipéptido terapéutico es una proteína de fusión, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo glucomanipulado, un fragmento de anticuerpo, un conjugado fármaco-anticuerpo, un THIOMAB™ o un conjugado fármaco-THIOMAB™. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio aniónico fuerte de fase inversa. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un resto de amina cuaternaria. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un soporte sólido. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto está contenido en una columna o cartucho. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto es un material de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto es un material de cromatografía Oasis® MAX. En algunos modos de realización, el detergente no iónico se cuantifica mediante dispersión de luz por evaporación (ELSD) o usando un detector de aerosol cargado (CAD). En algunos modos de realización, la cuantificación del tensioactivo no iónico comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) de interferencia del polipéptido.

En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para cuantificar polisorbato 20 en una composición que comprende polisorbato 20 y un polipéptido, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una primera proporción de aproximadamente 10:90 entre una fase móvil B y una fase móvil A, en el que la fase móvil A comprende aproximadamente un 2 % de ácido acético en agua y la fase móvil B comprende aproximadamente un 2 % de ácido acético en metanol; b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto con una solución que comprende una proporción de aproximadamente 40:60 entre la fase móvil B y la fase móvil A; c) eluir el polisorbato 20 del material de cromatografía con una solución que comprende una proporción de aproximadamente 100:0 entre la fase móvil B y la fase móvil A; y d) cuantificar el polisorbato en el eluido de la etapa c). En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del polipéptido total en la composición. En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía está entre aproximadamente 0,5 y 2,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 0,7, 0,9, 1,1, 1,2, 1,25, 1,3, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1 y 2,3, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) ml/minuto. En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía es de aproximadamente 1,25 ml/min. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 (tal como aproximadamente cualquiera de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20,25, 30, 35, 40 y 45, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) pl. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía es de aproximadamente 20 pl. En algunos modos de realización, la etapa b) comienza al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o más) minutos después de que se inicie la etapa a) y continúa durante al menos aproximadamente 1 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2, 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4 o más) minutos. En algunos modos de realización, la etapa c) comienza al menos aproximadamente 0,05 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1,0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2 o más) minutos después de que finalice la etapa b) y continúa durante al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3 o más) minutos. En algunos modos de realización, la concentración de polisorbato 20 en la composición está en el intervalo de aproximadamente un 0,001 % a un 1,0 % (p/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,005, 0,01,0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 y 0,9 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de proteína en la composición es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml (tal como aproximadamente cualquiera de 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 y 240 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición tiene un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además uno o más excipientes seleccionados del grupo que consiste en un estabilizador, un tampón y un agente de tonicidad. En algunos modos de realización, la composición es una formulación farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. En algunos modos de realización, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunos modos de realización, el polipéptido terapéutico es una proteína de fusión, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo glucomanipulado, un fragmento de anticuerpo, un conjugado fármaco-anticuerpo, un THIOMAB™ o un conjugado fármaco-THlOMAB™. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio aniónico fuerte de fase inversa. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un resto de amina cuaternaria. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un soporte sólido. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto está contenido en una columna o cartucho. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto es un material de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto es un material de cromatografía Oasis® MAX. En algunos modos de realización, el detergente no iónico se cuantifica mediante dispersión de luz por evaporación (ELSD) o usando un detector de aerosol cargado (CAD). En algunos modos de realización, la cuantificación del tensioactivo no iónico comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) de interferencia del polipéptido.

En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para cuantificar un tensioactivo no iónico en una composición que comprende el tensioactivo no iónico y un polipéptido, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una primera proporción entre una fase móvil B y una fase móvil A, en el que la fase móvil A comprende hidróxido de amonio en agua y la fase móvil B comprende hidróxido de amonio en un disolvente orgánico; b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto con una solución que comprende una segunda proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la segunda proporción es mayor que la primera proporción; c) eluir el tensioactivo no iónico del material de cromatografía con una solución que comprende una tercera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la tercera proporción es mayor que la segunda proporción; y d) cuantificar el tensioactivo no iónico en el eluido de la etapa c). En algunos modos de realización, el polipéptido se une al material de cromatografía específica y no específicamente, y al menos aproximadamente un 90 % (tal como al menos aproximadamente cualquiera de un 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %) del polipéptido eluye en la etapa b). En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende un polipéptido unido no específicamente. En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del polipéptido total en la composición. En algunos modos de realización, el disolvente orgánico de la fase móvil B es metanol. En algunos modos de realización, el disolvente orgánico de la fase móvil B es acetonitrilo. En algunos modos de realización, la primera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A está entre aproximadamente 0:100 y aproximadamente 20:80 (tal como aproximadamente cualquiera de 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84 y 18:82, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la segunda proporción está entre aproximadamente 35:65 y aproximadamente 55:45 (tal como aproximadamente cualquiera de 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54, 48:52, 50:50, 52:48 y 54:46, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la tercera proporción está entre aproximadamente 80:20 y aproximadamente 100:0 (tal como aproximadamente cualquiera de 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4 y 98:2, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la fase móvil A comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en agua. En algunos modos de realización, la fase móvil B comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en el disolvente orgánico (por ejemplo, metanol o acetonitrilo). En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía está entre aproximadamente 0,5 y 2,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 0,7, 0,9, 1,1, 1,3, 1,4, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1 y 2,3, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) ml/minuto. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 (tal como aproximadamente cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 , 25, 30, 35, 40 y 45, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) pl. En algunos modos de realización, la etapa b) comienza al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1.5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o más) minutos después de que se inicie la etapa a) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4.5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, la etapa c) comienza al menos aproximadamente 0,05 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2 o más) minutos después de que finalice la etapa b) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,1, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,5, 5 o más)

En algunos modos de realización, la concentración del tensioactivo no iónico en la composición está en el intervalo de aproximadamente un 0,001 % a un 1,0 % (p/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 y 0,9 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además N-acetiltriptófano (también denominado N-acetil-DL-triptófano) y/o metionina. En algunos modos de realización, la concentración de N-acetiltriptófano en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 10 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de metionina en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 100 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de polipéptido en la composición es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml (tal como aproximadamente cualquiera de 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 y 240 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición tiene un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además uno o más excipientes seleccionados del grupo que consiste en un estabilizador, un tampón y un agente de tonicidad. En algunos modos de realización, la composición es una formulación farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. En algunos modos de realización, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunos modos de realización, la proteína terapéutica es un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, anticuerpo glucomanipulado, fragmento de anticuerpo, un conjugado fármaco-anticuerpo, un THIOMAB™, un conjugado fármaco-THIOMAB™. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio catiónico fuerte de fase inversa. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un resto de ácido sulfónico. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un soporte sólido. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto está contenido en una columna. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía Oasis® MCX. En algunos modos de realización, el detergente no iónico se cuantifica mediante dispersión de luz por evaporación (ELSD) o usando un detector de aerosol cargado (CAD). En algunos modos de realización, la cuantificación del tensioactivo no iónico comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) de interferencia del polipéptido.

En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para cuantificar un tensioactivo no iónico en una composición que comprende el tensioactivo no iónico y un polipéptido, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una primera proporción entre una fase móvil B y una fase móvil A, en el que la fase móvil A comprende hidróxido de amonio en agua y la fase móvil B comprende hidróxido de amonio en un disolvente orgánico; b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto con una solución que comprende una segunda proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la segunda proporción es mayor que la primera proporción; c) eluir el tensioactivo no iónico del material de cromatografía con una solución que comprende una tercera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la tercera proporción es mayor que la segunda proporción; y d) cuantificar el tensioactivo no iónico en el eluido de la etapa c), en el que la cuantificación del tensioactivo no iónico comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) de interferencia del polipéptido. En algunos modos de realización, el polipéptido se une al material de cromatografía específica y no específicamente, y al menos aproximadamente un 90 % (tal como al menos aproximadamente cualquiera de un 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %) del polipéptido eluye en la etapa b). En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende un polipéptido unido no específicamente. En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del polipéptido total en la composición. En algunos modos de realización, el disolvente orgánico de la fase móvil B es metanol. En algunos modos de realización, el disolvente orgánico de la fase móvil B es acetonitrilo. En algunos modos de realización, la primera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A está entre aproximadamente 0:100 y aproximadamente 20:80 (tal como aproximadamente cualquiera de 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84 y 18:82, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la segunda proporción está entre aproximadamente 35:65 y aproximadamente 55:45 (tal como aproximadamente cualquiera de 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54, 48:52, 50:50, 52:48 y 54:46, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la tercera proporción está entre aproximadamente 80:20 y aproximadamente 100:0 (tal como aproximadamente cualquiera de 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4 y 98:2, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la fase móvil A comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en agua. En algunos modos de realización, la fase móvil B comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en el disolvente orgánico (por ejemplo, metanol o acetonitrilo). En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía está entre aproximadamente 0,5 y 2,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 0,7, 0,9, 1,1, 1,3, 1,4, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1 y 2,3, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) ml/minuto. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 (tal como aproximadamente cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 , 25, 30, 35, 40 y 45, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) |jl. En algunos modos de realización, la etapa b) comienza al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o más) minutos después de que se inicie la etapa a) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, la etapa c) comienza al menos aproximadamente 0,05 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1,0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2 o más) minutos después de que finalice la etapa b) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,1, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, el tensioactivo no iónico es un polisorbato. En algunos modos de realización, el polisorbato es polisorbato 20 o polisorbato 80.

En algunos modos de realización, la concentración del tensioactivo no iónico en la composición está en el intervalo de aproximadamente un 0,001% aun 1,0%(p/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 y 0,9 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además N-acetiltriptófano y/o metionina. En algunos modos de realización, la concentración de N-acetiltriptófano en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 10 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de metionina en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 100 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de polipéptido en la composición es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml (tal como aproximadamente cualquiera de 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 y 240 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición tiene un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además uno o más excipientes seleccionados del grupo que consiste en un estabilizador, un tampón y un agente de tonicidad. En algunos modos de realización, la composición es una formulación farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. En algunos modos de realización, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunos modos de realización, la proteína terapéutica es un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, anticuerpo glucomanipulado, fragmento de anticuerpo, un conjugado fármaco-anticuerpo, un THIOMAB™, un conjugado fármaco-THIOMAB™. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio catiónico fuerte de fase inversa. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un resto de ácido sulfónico. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un soporte sólido. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto está contenido en una columna. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía Oasis® MCX. En algunos modos de realización, el detergente no iónico se cuantifica mediante dispersión de luz por evaporación (ELSD) o usando un detector de aerosol cargado (CAD).

En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para cuantificar un tensioactivo no iónico en una composición que comprende el tensioactivo no iónico y un polipéptido, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una primera proporción entre una fase móvil B y una fase móvil A, en el que la fase móvil A comprende hidróxido de amonio en agua y la fase móvil B comprende hidróxido de amonio en un disolvente orgánico; b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto con una solución que comprende una segunda proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la segunda proporción es mayor que la primera proporción; c) eluir el tensioactivo no iónico del material de cromatografía con una solución que comprende una tercera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la tercera proporción es mayor que la segunda proporción; y d) cuantificar el tensioactivo no iónico en el eluido de la etapa c), en el que el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del polipéptido total en la composición. En algunos modos de realización, el disolvente orgánico de la fase móvil B es metanol. En algunos modos de realización, el disolvente orgánico de la fase móvil B es acetonitrilo. En algunos modos de realización, la primera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A está entre aproximadamente 0:100 y aproximadamente 20:80 (tal como aproximadamente cualquiera de 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84 y 18:82, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la segunda proporción está entre aproximadamente 35:65 y aproximadamente 55:45 (tal como aproximadamente cualquiera de 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54, 48:52, 50:50, 52:48 y 54:46, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la tercera proporción está entre aproximadamente 80:20 y aproximadamente 100:0 (tal como aproximadamente cualquiera de 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4 y 98:2, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la fase móvil A comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en agua. En algunos modos de realización, la fase móvil B comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en el disolvente orgánico (por ejemplo, metanol o acetonitrilo). En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía está entre aproximadamente 0,5 y 2,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 0,7, 0,9, 1,1, 1,3, 1,4, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1 y 2,3, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) ml/minuto. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 (tal como aproximadamente cualquiera de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ,25 , 30, 35, 40 y 45, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) |jl. En algunos modos de realización, la etapa b) comienza al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1.4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o más) minutos después de que se inicie la etapa a) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4.5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, la etapa c) comienza al menos aproximadamente 0,05 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2 o más) minutos después de que finalice la etapa b) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,1, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, el tensioactivo no iónico es un polisorbato. En algunos modos de realización, el polisorbato es polisorbato 20 o polisorbato 80.

En algunos modos de realización, la concentración del tensioactivo no iónico en la composición está en el intervalo de aproximadamente un 0,001 % a un 1,0 % (p/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 y 0,9 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además N-acetiltriptófano y/o metionina. En algunos modos de realización, la concentración de N-acetiltriptófano en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 10 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de metionina en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 100 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de polipéptido en la composición es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml (tal como aproximadamente cualquiera de 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 y 240 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición tiene un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además uno o más excipientes seleccionados del grupo que consiste en un estabilizador, un tampón y un agente de tonicidad. En algunos modos de realización, la composición es una formulación farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. En algunos modos de realización, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunos modos de realización, la proteína terapéutica es un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, anticuerpo glucomanipulado, fragmento de anticuerpo, un conjugado fármaco-anticuerpo, un THIOMAB™, un conjugado fármaco-THIOMAB™. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio catiónico fuerte de fase inversa. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un resto de ácido sulfónico. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un soporte sólido. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto está contenido en una columna. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía Oasis® MCX. En algunos modos de realización, el detergente no iónico se cuantifica mediante dispersión de luz por evaporación (ELSD) o usando un detector de aerosol cargado (CAD). En algunos modos de realización, la cuantificación del tensioactivo no iónico comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) de interferencia del polipéptido.

En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para cuantificar un tensioactivo no iónico en una composición que comprende el tensioactivo no iónico y un polipéptido, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una primera proporción entre una fase móvil B y una fase móvil A, en el que la fase móvil A comprende hidróxido de amonio en agua y la fase móvil B comprende hidróxido de amonio en metanol; b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto con una solución que comprende una segunda proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la segunda proporción es mayor que la primera proporción; c) eluir el tensioactivo no iónico del material de cromatografía con una solución que comprende una tercera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la tercera proporción es mayor que la segunda proporción; y d) cuantificar el tensioactivo no iónico en el eluido de la etapa c). En algunos modos de realización, el polipéptido se une al material de cromatografía específica y no específicamente, y al menos aproximadamente un 90 % (tal como al menos aproximadamente cualquiera de un 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %) del polipéptido eluye en la etapa b). En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende un polipéptido unido no específicamente. En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del polipéptido total en la composición. En algunos modos de realización, la primera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A está entre aproximadamente 0:100 y aproximadamente 20:80 (tal como aproximadamente cualquiera de 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84 y 18:82, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la segunda proporción está entre aproximadamente 35:65 y aproximadamente 55:45 (tal como aproximadamente cualquiera de 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54, 48:52, 50:50, 52:48 y 54:46, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la tercera proporción está entre aproximadamente 80:20 y aproximadamente 100:0 (tal como aproximadamente cualquiera de 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4 y 98:2, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la fase móvil A comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en agua. En algunos modos de realización, la fase móvil B comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en metanol. En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía está entre aproximadamente 0,5 y 2,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 0,7, 0,9, 1,1, 1,3, 1,4, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1 y 2,3, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) ml/minuto. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 (tal como aproximadamente cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20,25, 30, 35, 40 y 45, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) |jl. En algunos modos de realización, la etapa b) comienza al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o más) minutos después de que se inicie la etapa a) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, la etapa c) comienza al menos aproximadamente 0,05 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1,0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2 o más) minutos después de que finalice la etapa b) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,1, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, el tensioactivo no iónico es un polisorbato. En algunos modos de realización, el polisorbato es polisorbato 20 o polisorbato 80.

En algunos modos de realización, la concentración del tensioactivo no iónico en la composición está en el intervalo de aproximadamente un 0,001 % a un 1,0 % (p/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 y 0,9 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además N-acetiltriptófano y/o metionina. En algunos modos de realización, la concentración de N-acetiltriptófano en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 10 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de metionina en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 100 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de polipéptido en la composición es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml (tal como aproximadamente cualquiera de 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 y 240 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición tiene un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además uno o más excipientes seleccionados del grupo que consiste en un estabilizador, un tampón y un agente de tonicidad. En algunos modos de realización, la composición es una formulación farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. En algunos modos de realización, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunos modos de realización, la proteína terapéutica es un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, anticuerpo glucomanipulado, fragmento de anticuerpo, un conjugado fármaco-anticuerpo, un THIOMAB™, un conjugado fármaco-THlOMAB™. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio catiónico fuerte de fase inversa. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un resto de ácido sulfónico. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un soporte sólido. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto está contenido en una columna. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía Oasis® MCX. En algunos modos de realización, el detergente no iónico se cuantifica mediante dispersión de luz por evaporación (ELSD) o usando un detector de aerosol cargado (CAD). En algunos modos de realización, la cuantificación del tensioactivo no iónico comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) de interferencia del polipéptido.

En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para cuantificar un tensioactivo no iónico en una composición que comprende el tensioactivo no iónico y un polipéptido, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una primera proporción entre una fase móvil B y una fase móvil A, en el que la fase móvil A comprende hidróxido de amonio en agua y la fase móvil B comprende hidróxido de amonio en acetonitrilo; b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto con una solución que comprende una segunda proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la segunda proporción es mayor que la primera proporción; c) eluir el tensioactivo no iónico del material de cromatografía con una solución que comprende una tercera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la tercera proporción es mayor que la segunda proporción; y d) cuantificar el tensioactivo no iónico en el eluido de la etapa c). En algunos modos de realización, el polipéptido se une al material de cromatografía específica y no específicamente, y al menos aproximadamente un 90 % (tal como al menos aproximadamente cualquiera de un 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %) del polipéptido eluye en la etapa b). En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende un polipéptido unido no específicamente. En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del polipéptido total en la composición. En algunos modos de realización, la primera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A está entre aproximadamente 0:100 y aproximadamente 20:80 (tal como aproximadamente cualquiera de 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84 y 18:82, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la segunda proporción está entre aproximadamente 35:65 y aproximadamente 55:45 (tal como aproximadamente cualquiera de 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54, 48:52, 50:50, 52:48 y 54:46, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la tercera proporción está entre aproximadamente 80:20 y aproximadamente 100:0 (tal como aproximadamente cualquiera de 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4 y 98:2, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la fase móvil A comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en agua. En algunos modos de realización, la fase móvil B comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en acetonitrilo. En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía está entre aproximadamente 0,5 y 2,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 0,7, 0,9, 1,1, 1,3, 1,4, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1 y 2,3, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) ml/minuto. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 (tal como aproximadamente cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20,25, 30, 35, 40 y 45, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) pl. En algunos modos de realización, la etapa b) comienza al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o más) minutos después de que se inicie la etapa a) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, la etapa c) comienza al menos aproximadamente 0,05 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1,0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2 o más) minutos después de que finalice la etapa b) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,1, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, el tensioactivo no iónico es un polisorbato. En algunos modos de realización, el polisorbato es polisorbato 20 o polisorbato 80.

En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para cuantificar un tensioactivo no iónico en una composición que comprende el tensioactivo no iónico y un polipéptido, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una primera proporción entre una fase móvil B y una fase móvil A de entre aproximadamente 5:95 y aproximadamente 15:85, en el que la fase móvil A comprende hidróxido de amonio en agua y la fase móvil B comprende hidróxido de amonio en un disolvente orgánico; b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto con una solución que comprende una segunda proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A de entre aproximadamente 40:60 y aproximadamente 50:50; c) eluir el tensioactivo no iónico del material de cromatografía con una solución que comprende una tercera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A de entre aproximadamente 90:10 y aproximadamente 100:0; y d) cuantificar el tensioactivo no iónico en el eluido de la etapa c). En algunos modos de realización, el polipéptido se une al material de cromatografía específica y no específicamente, y al menos aproximadamente un 90 % (tal como al menos aproximadamente cualquiera de un 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %) del polipéptido eluye en la etapa b). En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende un polipéptido unido no específicamente. En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del polipéptido total en la composición. En algunos modos de realización, el disolvente orgánico de la fase móvil B es metanol. En algunos modos de realización, el disolvente orgánico de la fase móvil B es acetonitrilo. En algunos modos de realización, la primera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A está entre aproximadamente 0:100 y aproximadamente 20:80 (tal como aproximadamente cualquiera de 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84 y 18:82, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la segunda proporción está entre aproximadamente 35:65 y aproximadamente 55:45 (tal como aproximadamente cualquiera de 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54, 48:52, 50:50, 52:48 y 54:46, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la tercera proporción está entre aproximadamente 80:20 y aproximadamente 100:0 (tal como aproximadamente cualquiera de 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4 y 98:2, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la fase móvil A comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en agua. En algunos modos de realización, la fase móvil B comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en el disolvente orgánico (por ejemplo, metanol o acetonitrilo). En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía está entre aproximadamente 0,5 y 2,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 0,7, 0,9, 1,1, 1.3, 1,4, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1 y 2,3, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) ml/minuto. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 (tal como aproximadamente cualquiera de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ,25 , 30, 35, 40 y 45, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) pl. En algunos modos de realización, la etapa b) comienza al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1.4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, o más) minutos después de que se inicie la etapa a) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4.5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, la etapa c) comienza al menos aproximadamente 0,05 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2 o más) minutos después de que finalice la etapa b) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,1, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, el tensioactivo no iónico es un polisorbato. En algunos modos de realización, el polisorbato es polisorbato 20 o polisorbato 80.

Cuando un producto que contiene N-acetiltriptófano (NAT) en la formulación se somete a prueba usando condiciones de HPLC-ELSD, se observa una interferencia significativa en la región de PS20.

Por tanto, en algunas circunstancias, se necesitan condiciones alternativas para eliminar tanto la interferencia relacionada con NAT como con proteína.

En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para cuantificar un tensioactivo no iónico en una composición que comprende el tensioactivo no iónico, un polipéptido y N-acetiltriptófano, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una primera proporción entre una fase móvil B y una fase móvil A, en el que la fase móvil A comprende hidróxido de amonio en agua y la fase móvil B comprende hidróxido de amonio en un disolvente orgánico; b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto con una solución que comprende una segunda proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la segunda proporción es mayor que la primera proporción; c) eluir el tensioactivo no iónico del material de cromatografía con una solución que comprende una tercera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la tercera proporción es mayor que la segunda proporción; y d) cuantificar el tensioactivo no iónico en el eluido de la etapa c). En algunos modos de realización, el polipéptido se une al material de cromatografía específica y no específicamente, y al menos aproximadamente un 90 % (tal como al menos aproximadamente cualquiera de un 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %) del polipéptido eluye en la etapa b). En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende un polipéptido unido no específicamente. En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del polipéptido total en la composición. En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 5 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del NAT total en la composición. En algunos modos de realización, el disolvente orgánico de la fase móvil B es metanol. En algunos modos de realización, el disolvente orgánico de la fase móvil B es acetonitrilo. En algunos modos de realización, la primera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A está entre aproximadamente 0:100 y aproximadamente 20:80 (tal como aproximadamente cualquiera de 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84 y 18:82, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la segunda proporción está entre aproximadamente 35:65 y aproximadamente 55:45 (tal como aproximadamente cualquiera de 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54, 48:52, 50:50, 52:48 y 54:46, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la tercera proporción está entre aproximadamente 80:20 y aproximadamente 100:0 (tal como aproximadamente cualquiera de 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4 y 98:2, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la fase móvil A comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en agua. En algunos modos de realización, la fase móvil B comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en el disolvente orgánico (por ejemplo, metanol o acetonitrilo). En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía está entre aproximadamente 0,5 y 2,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 0,7, 0,9, 1,1, 1,3, 1,4, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1 y 2,3, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) ml/minuto. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 (tal como aproximadamente cualquiera de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ,25 , 30, 35, 40 y 45, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) pl. En algunos modos de realización, la etapa b) comienza al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1.4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o más) minutos después de que se inicie la etapa a) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4.5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, la etapa c) comienza al menos aproximadamente 0,05 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2 o más) minutos después de que finalice la etapa b) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,1, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, el tensioactivo no iónico es un polisorbato. En algunos modos de realización, el polisorbato es polisorbato 20 o polisorbato 80.

En algunos modos de realización, la concentración del tensioactivo no iónico en la composición está en el intervalo de aproximadamente un 0,001 % a un 1,0 % (p/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 y 0,9 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de N-acetiltriptófano en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 10 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además metionina. En algunos modos de realización, la concentración de metionina en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 100 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de polipéptido en la composición es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml (tal como aproximadamente cualquiera de 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 y 240 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición tiene un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además uno o más excipientes seleccionados del grupo que consiste en un estabilizador, un tampón y un agente de tonicidad. En algunos modos de realización, la composición es una formulación farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. En algunos modos de realización, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunos modos de realización, la proteína terapéutica es un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, anticuerpo glucomanipulado, fragmento de anticuerpo, un conjugado fármaco-anticuerpo, un THIOMAB™, un conjugado fármaco-THlOMAB™. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio catiónico fuerte de fase inversa. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un resto de ácido sulfónico. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un soporte sólido. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto está contenido en una columna. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía Oasis® MCX. En algunos modos de realización, el detergente no iónico se cuantifica mediante dispersión de luz por evaporación (ELSD) o usando un detector de aerosol cargado (CAD). En algunos modos de realización, la cuantificación del detergente no iónico comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) de interferencia del polipéptido.

En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para cuantificar un polisorbato en una composición que comprende el polisorbato y un polipéptido, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una primera proporción entre una fase móvil B y una fase móvil A, en el que la fase móvil A comprende hidróxido de amonio en agua y la fase móvil B comprende hidróxido de amonio en un disolvente orgánico; b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto con una solución que comprende una segunda proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la segunda proporción es mayor que la primera proporción; c) eluir el polisorbato del material de cromatografía con una solución que comprende una tercera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la tercera proporción es mayor que la segunda proporción; y d) cuantificar el polisorbato en el eluido de la etapa c). En algunos modos de realización, el polipéptido se une al material de cromatografía específica y no específicamente, y al menos aproximadamente un 90 % (tal como al menos aproximadamente cualquiera de un 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %) del polipéptido eluye en la etapa b). En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende un polipéptido unido no específicamente. En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del polipéptido total en la composición. En algunos modos de realización, el disolvente orgánico de la fase móvil B es metanol. En algunos modos de realización, el disolvente orgánico de la fase móvil B es acetonitrilo. En algunos modos de realización, la primera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A está entre aproximadamente 0:100 y aproximadamente 20:80 (tal como aproximadamente cualquiera de 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84 y 18:82, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la segunda proporción está entre aproximadamente 35:65 y aproximadamente 55:45 (tal como aproximadamente cualquiera de 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54, 48:52, 50:50, 52:48 y 54:46, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la tercera proporción está entre aproximadamente 80:20 y aproximadamente 100:0 (tal como aproximadamente cualquiera de 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4 y 98:2, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la fase móvil A comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en agua. En algunos modos de realización, la fase móvil B comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en el disolvente orgánico (por ejemplo, metanol o acetonitrilo). En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía está entre aproximadamente 0,5 y 2,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 0,7, 0,9, 1,1, 1,3, 1,4, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1 y 2,3, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) ml/minuto. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 (tal como aproximadamente cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 , 25, 30, 35, 40 y 45, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) pl. En algunos modos de realización, la etapa b) comienza al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o más) minutos después de que se inicie la etapa a) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, la etapa c) comienza al menos aproximadamente 0,05 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2 o más) minutos después de la etapa. b) termina y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2.8, 3, 3,1, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, el polisorbato es polisorbato 20 o polisorbato 80. En algunos modos de realización, la concentración del polisorbato en la composición está en el intervalo de aproximadamente un 0,001 % a un 1,0 % (p/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 y 0,9 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además N-acetiltriptófano y/o metionina. En algunos modos de realización, la concentración de N-acetiltriptófano en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 10 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de metionina en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 100 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de polipéptido en la composición es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml (tal como aproximadamente cualquiera de 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 y 240 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición tiene un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5.8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además uno o más excipientes seleccionados del grupo que consiste en un estabilizador, un tampón y un agente de tonicidad. En algunos modos de realización, la composición es una formulación farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. En algunos modos de realización, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunos modos de realización, la proteína terapéutica es un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, anticuerpo glucomanipulado, fragmento de anticuerpo, un conjugado fármaco-anticuerpo, un THIOMAB™, un conjugado fármaco-THlOMAB™. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio catiónico fuerte de fase inversa. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un resto de ácido sulfónico. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un soporte sólido. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto está contenido en una columna. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía Oasis® MCX. En algunos modos de realización, el detergente no iónico se cuantifica mediante dispersión de luz por evaporación (ELSD) o usando un detector de aerosol cargado (CAD). En algunos modos de realización, la cuantificación del polisorbato comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) de interferencia del polipéptido.

En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para cuantificar un polisorbato en una composición que comprende el polisorbato, un polipéptido y N-acetiltriptófano, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una primera proporción entre una fase móvil B y una fase móvil A, en el que la fase móvil A comprende hidróxido de amonio en agua y la fase móvil B comprende hidróxido de amonio en un disolvente orgánico; b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto con una solución que comprende una segunda proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la segunda proporción es mayor que la primera proporción; c) eluir el polisorbato del material de cromatografía con una solución que comprende una tercera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la tercera proporción es mayor que la segunda proporción; y d) cuantificar el polisorbato en el eluido de la etapa c), en el que la cuantificación del polisorbato comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) de interferencia del polipéptido y del NAT. En algunos modos de realización, el polipéptido se une al material de cromatografía específica y no específicamente, y al menos aproximadamente un 90 % (tal como al menos aproximadamente cualquiera de un 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %) del polipéptido eluye en la etapa b). En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende un polipéptido unido no específicamente. En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del polipéptido total en la composición. En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 5 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del NAT total en la composición. En algunos modos de realización, el disolvente orgánico de la fase móvil B es metanol. En algunos modos de realización, el disolvente orgánico de la fase móvil B es acetonitrilo. En algunos modos de realización, la primera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A está entre aproximadamente 0:100 y aproximadamente 20:80 (tal como aproximadamente cualquiera de 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84 y 18:82, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la segunda proporción está entre aproximadamente 35:65 y aproximadamente 55:45 (tal como aproximadamente cualquiera de 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54, 48:52, 50:50, 52:48 y 54:46, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la tercera proporción está entre aproximadamente 80:20 y aproximadamente 100:0 (tal como aproximadamente cualquiera de 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4 y 98:2, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la fase móvil A comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en agua. En algunos modos de realización, la fase móvil B comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en el disolvente orgánico (por ejemplo, metanol o acetonitrilo). En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía está entre aproximadamente 0,5 y 2,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 0,7, 0,9, 1,1, 1.3, 1,4, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1 y 2,3, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) ml/minuto. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 (tal como aproximadamente cualquiera de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ,25 , 30, 35, 40 y 45, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) |jl. En algunos modos de realización, la etapa b) comienza al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1.4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o más) minutos después de que se inicie la etapa a) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4.5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, la etapa c) comienza al menos aproximadamente 0,05 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2 o más) minutos después de la etapa. b) termina y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,1, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, el polisorbato es polisorbato 20 o polisorbato 80. En algunos modos de realización, la concentración del polisorbato en la composición está en el intervalo de aproximadamente un 0,001 % a un 1,0 % (p/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 y 0,9 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de N-acetiltriptófano en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 10 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además metionina. En algunos modos de realización, la concentración de metionina en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 100 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de polipéptido en la composición es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml (tal como aproximadamente cualquiera de 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 y 240 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición tiene un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5.6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además uno o más excipientes seleccionados del grupo que consiste en un estabilizador, un tampón y un agente de tonicidad. En algunos modos de realización, la composición es una formulación farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. En algunos modos de realización, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunos modos de realización, la proteína terapéutica es un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, anticuerpo glucomanipulado, fragmento de anticuerpo, un conjugado fármaco-anticuerpo, un THIOMAB™, un conjugado fármaco-THlOMAB™. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio catiónico fuerte de fase inversa. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un resto de ácido sulfónico. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un soporte sólido. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto está contenido en una columna. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía Oasis® MCX. En algunos modos de realización, el detergente no iónico se cuantifica mediante dispersión de luz por evaporación (ELSD) o usando un detector de aerosol cargado (CAD).

En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para cuantificar un polisorbato en una composición que comprende el polisorbato, un polipéptido y N-acetiltriptófano, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una primera proporción entre una fase móvil B y una fase móvil A, en el que la fase móvil A comprende hidróxido de amonio en agua y la fase móvil B comprende hidróxido de amonio en un disolvente orgánico; b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto con una solución que comprende una segunda proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la segunda proporción es mayor que la primera proporción; c) eluir el polisorbato del material de cromatografía con una solución que comprende una tercera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la tercera proporción es mayor que la segunda proporción; y d) cuantificar el polisorbato en el eluido de la etapa c), en el que el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del polipéptido total en la composición y menos de aproximadamente un 5 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del NAT total en la composición. En algunos modos de realización, el disolvente orgánico de la fase móvil B es metanol. En algunos modos de realización, el disolvente orgánico de la fase móvil B es acetonitrilo. En algunos modos de realización, la primera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A está entre aproximadamente 0:100 y aproximadamente 20:80 (tal como aproximadamente cualquiera de 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84 y 18:82, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la segunda proporción está entre aproximadamente 35:65 y aproximadamente 55:45 (tal como aproximadamente cualquiera de 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54, 48:52, 50:50, 52:48 y 54:46, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la tercera proporción está entre aproximadamente 80:20 y aproximadamente 100:0 (tal como aproximadamente cualquiera de 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4 y 98:2, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la fase móvil A comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en agua. En algunos modos de realización, la fase móvil B comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en el disolvente orgánico (por ejemplo, metanol o acetonitrilo). En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía está entre aproximadamente 0,5 y 2,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 0,7, 0,9, 1,1, 1,3, 1,4, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1 y 2,3, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) ml/minuto. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 (tal como aproximadamente cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 , 25, 30, 35, 40 y 45, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) |jl. En algunos modos de realización, la etapa b) comienza al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o más) minutos después de que se inicie la etapa a) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, la etapa c) comienza al menos aproximadamente 0,05 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2 o más) minutos después de la etapa. b) termina y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,1, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, el polisorbato es polisorbato 20 o polisorbato 80. En algunos modos de realización, la concentración del polisorbato en la composición está en el intervalo de aproximadamente un 0,001 % a un 1,0 % (p/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 y 0,9 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de N-acetiltriptófano en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 10 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además metionina. En algunos modos de realización, la concentración de metionina en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 100 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de polipéptido en la composición es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml (tal como aproximadamente cualquiera de 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 y 240 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición tiene un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además uno 0 más excipientes seleccionados del grupo que consiste en un estabilizador, un tampón y un agente de tonicidad. En algunos modos de realización, la composición es una formulación farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. En algunos modos de realización, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunos modos de realización, la proteína terapéutica es un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, anticuerpo glucomanipulado, fragmento de anticuerpo, un conjugado fármaco-anticuerpo, un THIOMAB™, un conjugado fármaco-THIOMAB™. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio catiónico fuerte de fase inversa. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un resto de ácido sulfónico. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un soporte sólido. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto está contenido en una columna. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía Oasis® MCX. En algunos modos de realización, el detergente no iónico se cuantifica mediante dispersión de luz por evaporación (ELSD) o usando un detector de aerosol cargado (CAD). En algunos modos de realización, la cuantificación del polisorbato comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) de interferencia del polipéptido y del NAT.

En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para cuantificar un polisorbato en una composición que comprende el polisorbato, un polipéptido y N-acetiltriptófano, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una primera proporción entre una fase móvil B y una fase móvil A, en el que la fase móvil A comprende hidróxido de amonio en agua y la fase móvil B comprende hidróxido de amonio en metanol; b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto con una solución que comprende una segunda proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la segunda proporción es mayor que la primera proporción; c) eluir el polisorbato del material de cromatografía con una solución que comprende una tercera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la tercera proporción es mayor que la segunda proporción; y d) cuantificar el polisorbato en el eluido de la etapa c). En algunos modos de realización, el polipéptido se une al material de cromatografía específica y no específicamente, y al menos aproximadamente un 90 % (tal como al menos aproximadamente cualquiera de un 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %) del polipéptido eluye en la etapa b). En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende un polipéptido unido no específicamente. En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del polipéptido total en la composición. En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 5 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del NAT total en la composición. En algunos modos de realización, la primera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A está entre aproximadamente 0:100 y aproximadamente 20:80 (tal como aproximadamente cualquiera de 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84 y 18:82, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la segunda proporción está entre aproximadamente 35:65 y aproximadamente 55:45 (tal como aproximadamente cualquiera de 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54, 48:52, 50:50, 52:48 y 54:46, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la tercera proporción está entre aproximadamente 80:20 y aproximadamente 100:0 (tal como aproximadamente cualquiera de 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4 y 98:2, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la fase móvil A comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en agua. En algunos modos de realización, la fase móvil B comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en metanol. En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía está entre aproximadamente 0,5 y 2,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 0,7, 0,9, 1,1, 1,3, 1,4, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1 y 2,3, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) ml/minuto. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 (tal como aproximadamente cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 , 25, 30, 35, 40 y 45, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) pl. En algunos modos de realización, la etapa b) comienza al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1.5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o más) minutos después de que se inicie la etapa a) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4.5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, la etapa c) comienza al menos aproximadamente 0,05 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2 o más) minutos después de la etapa. b) termina y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,1, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,5, 5 o más) minutos En algunos modos de realización, el polisorbato es polisorbato 20 o polisorbato 80. En algunos modos de realización, la concentración del polisorbato en la composición está en el intervalo de aproximadamente un 0,001 % a un 1,0 % (p/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 y 0,9 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de N-acetiltriptófano en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 10 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además metionina. En algunos modos de realización, la concentración de metionina en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 100 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de polipéptido en la composición es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml (tal como aproximadamente cualquiera de 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 y 240 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición tiene un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además uno o más excipientes seleccionados del grupo que consiste en un estabilizador, un tampón y un agente de tonicidad. En algunos modos de realización, la composición es una formulación farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. En algunos modos de realización, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunos modos de realización, la proteína terapéutica es un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, anticuerpo glucomanipulado, fragmento de anticuerpo, un conjugado fármaco-anticuerpo, un THIOMAB™, un conjugado fármaco-THIOMAB™. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio catiónico fuerte de fase inversa. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un resto de ácido sulfónico. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un soporte sólido. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto está contenido en una columna. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía Oasis® MCX. En algunos modos de realización, el detergente no iónico se cuantifica mediante dispersión de luz por evaporación (ELSD) o usando un detector de aerosol cargado (CAD). En algunos modos de realización, la cuantificación del polisorbato comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) de interferencia del polipéptido y del NAT.

En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para cuantificar un polisorbato en una composición que comprende el polisorbato, un polipéptido y N-acetiltriptófano, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una primera proporción entre una fase móvil B y una fase móvil A, en el que la fase móvil A comprende hidróxido de amonio en agua y la fase móvil B comprende hidróxido de amonio en acetonitrilo; b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto con una solución que comprende una segunda proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la segunda proporción es mayor que la primera proporción; c) eluir el polisorbato del material de cromatografía con una solución que comprende una tercera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A, en el que la tercera proporción es mayor que la segunda proporción; y d) cuantificar el polisorbato en el eluido de la etapa c). En algunos modos de realización, el polipéptido se une al material de cromatografía específica y no específicamente, y al menos aproximadamente un 90 % (tal como al menos aproximadamente cualquiera de un 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %) del polipéptido eluye en la etapa b). En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende un polipéptido unido no específicamente. En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del polipéptido total en la composición. En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 5 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del NAT total en la composición. En algunos modos de realización, la primera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A está entre aproximadamente 0:100 y aproximadamente 20:80 (tal como aproximadamente cualquiera de 2:98, 4:96, 6:94, 8:92, 10:90, 12:88, 14:86, 16:84 y 18:82, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la segunda proporción está entre aproximadamente 35:65 y aproximadamente 55:45 (tal como aproximadamente cualquiera de 36:64, 38:62, 40:60, 42:58, 44:56, 46:54, 48:52, 50:50, 52:48 y 54:46, incluyendo cualquier intervalo entre estas proporciones). En algunos modos de realización, la tercera proporción está entre aproximadamente 80:20 y aproximadamente 100:0 (tal como aproximadamente cualquiera de 82:18, 84:16, 86:14, 88:12, 90:10, 92:8, 94:6, 96:4 y 98:2, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la fase móvil A comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en agua. En algunos modos de realización, la fase móvil B comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en acetonitrilo. En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía está entre aproximadamente 0,5 y 2,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 0,7, 0,9, 1,1, 1,3, 1.4, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1 y 2,3, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) ml/minuto. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 (tal como aproximadamente cualquiera de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20,25, 30, 35, 40 y 45, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) pl. En algunos modos de realización, la etapa b) comienza al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1.4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o más) minutos después de que se inicie la etapa a) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4.5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, la etapa c) comienza al menos aproximadamente 0,05 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2 o más) minutos después de que finalice la etapa b) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,1, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, el polisorbato es polisorbato 20 o polisorbato 80. En algunos modos de realización, la concentración del polisorbato en la composición está en el intervalo de aproximadamente un 0,001 % a un 1,0 % (p/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 y 0,9 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de N-acetiltriptófano en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 10 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además metionina. En algunos modos de realización, la concentración de metionina en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 100 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de polipéptido en la composición es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml (tal como aproximadamente cualquiera de 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 y 240 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición tiene un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5.6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además uno o más excipientes seleccionados del grupo que consiste en un estabilizador, un tampón y un agente de tonicidad. En algunos modos de realización, la composición es una formulación farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. En algunos modos de realización, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunos modos de realización, la proteína terapéutica es un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, anticuerpo glucomanipulado, fragmento de anticuerpo, un conjugado fármaco-anticuerpo, un THIOMAB™, un conjugado fármaco-THlOMAB™. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio catiónico fuerte de fase inversa. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un resto de ácido sulfónico. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un soporte sólido. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto está contenido en una columna. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía Oasis® MCX. En algunos modos de realización, el detergente no iónico se cuantifica mediante dispersión de luz por evaporación (ELSD) o usando un detector de aerosol cargado (CAD). En algunos modos de realización, la cuantificación del polisorbato comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) de interferencia del polipéptido y del NAT.

En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para cuantificar un polisorbato en una composición que comprende el polisorbato, un polipéptido y N-acetiltriptófano, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una primera proporción entre una fase móvil B y una fase móvil A de entre aproximadamente 5:95 y aproximadamente 15:85, en el que la fase móvil A comprende hidróxido de amonio en agua y la fase móvil B comprende hidróxido de amonio en un disolvente orgánico; b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto con una solución que comprende una segunda proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A de entre aproximadamente 40:60 y aproximadamente 50:50; c) eluir el polisorbato del material de cromatografía con una solución que comprende una tercera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A de entre aproximadamente 90:10 y aproximadamente 100:0; y d) cuantificar el polisorbato en el eluido de la etapa c). En algunos modos de realización, el polipéptido se une al material de cromatografía específica y no específicamente, y al menos aproximadamente un 90 % (tal como al menos aproximadamente cualquiera de un 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %) del polipéptido eluye en la etapa b). En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende un polipéptido unido no específicamente. En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del polipéptido total en la composición. En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 5 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del NAT total en la composición. En algunos modos de realización, el disolvente orgánico de la fase móvil B es metanol. En algunos modos de realización, el disolvente orgánico de la fase móvil B es acetonitrilo. En algunos modos de realización, la primera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A es de aproximadamente 10:90. En algunos modos de realización, la segunda proporción es de aproximadamente 45:55. En algunos modos de realización, la tercera proporción es de aproximadamente 100:0. En algunos modos de realización, la fase móvil A comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en agua. En algunos modos de realización, la fase móvil B comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en el disolvente orgánico (por ejemplo, metanol o acetonitrilo). En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía está entre aproximadamente 0,5 y 2,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 0,7, 0,9, 1,1, 1.3, 1,4, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1 y 2,3, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) ml/minuto. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 (tal como aproximadamente cualquiera de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20,25, 30, 35, 40 y 45, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) pl. En algunos modos de realización, la etapa b) comienza al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1.4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o más) minutos después de que se inicie la etapa a) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4.5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, la etapa c) comienza al menos aproximadamente 0,05 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2 o más) minutos después de que finalice la etapa b) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,1, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, el polisorbato es polisorbato 20 o polisorbato 80. En algunos modos de realización, la concentración del polisorbato en la composición está en el intervalo de aproximadamente un 0,001 % a un 1,0 % (p/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 y 0,9 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de N-acetiltriptófano en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 10 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además metionina. En algunos modos de realización, la concentración de metionina en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 100 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de polipéptido en la composición es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml (tal como aproximadamente cualquiera de 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 y 240 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición tiene un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5.6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además uno o más excipientes seleccionados del grupo que consiste en un estabilizador, un tampón y un agente de tonicidad. En algunos modos de realización, la composición es una formulación farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. En algunos modos de realización, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunos modos de realización, la proteína terapéutica es un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, anticuerpo glucomanipulado, fragmento de anticuerpo, un conjugado fármaco-anticuerpo, un THIOMAB™, un conjugado fármaco-THlOMAB™. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio catiónico fuerte de fase inversa. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un resto de ácido sulfónico. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un soporte sólido. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto está contenido en una columna. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía Oasis® MCX. En algunos modos de realización, el detergente no iónico se cuantifica mediante dispersión de luz por evaporación (ELSD) o usando un detector de aerosol cargado (CAD). En algunos modos de realización, la cuantificación del polisorbato comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) de interferencia del polipéptido y del NAT. En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para cuantificar un polisorbato en una composición que comprende el polisorbato, un polipéptido y N-acetiltriptófano, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una primera proporción entre una fase móvil B y una fase móvil A de entre aproximadamente 5:95 y aproximadamente 15:85, en el que la fase móvil A comprende hidróxido de amonio en agua y la fase móvil B comprende hidróxido de amonio en metanol; b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto con una solución que comprende una segunda proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A de entre aproximadamente 40:60 y aproximadamente 50:50; c) eluir el polisorbato del material de cromatografía con una solución que comprende una tercera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A de entre aproximadamente 90:10 y aproximadamente 100:0; y d) cuantificar el polisorbato en el eluido de la etapa c), en el que la cuantificación del polisorbato comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) de interferencia del polipéptido y del NAT. En algunos modos de realización, el polipéptido se une al material de cromatografía específica y no específicamente, y al menos aproximadamente un 90 % (tal como al menos aproximadamente cualquiera de un 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %) del polipéptido eluye en la etapa b). En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende un polipéptido unido no específicamente. En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del polipéptido total en la composición. En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 5 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del NAT total en la composición. En algunos modos de realización, la primera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A es de aproximadamente 10:90. En algunos modos de realización, la segunda proporción es de aproximadamente 45:55. En algunos modos de realización, la tercera proporción es de aproximadamente 100:0. En algunos modos de realización, la fase móvil A comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en agua. En algunos modos de realización, la fase móvil B comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en metanol. En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía está entre aproximadamente 0,5 y 2,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 0,7, 0,9, 1,1, 1,3, 1,4, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1 y 2,3, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) ml/minuto. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 (tal como aproximadamente cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 , 25, 30, 35, 40 y 45, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) pl. En algunos modos de realización, la etapa b) comienza al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1.5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o más) minutos después de que se inicie la etapa a) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4.5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, la etapa c) comienza al menos aproximadamente 0,05 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2 o más) minutos después de que finalice la etapa b) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,1, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, el polisorbato es polisorbato 20 o polisorbato 80. En algunos modos de realización, la concentración del polisorbato en la composición está en el intervalo de aproximadamente un 0,001 % a un 1,0 % (p/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 y 0,9 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de N-acetiltriptófano en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 10 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además metionina. En algunos modos de realización, la concentración de metionina en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 100 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de polipéptido en la composición es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml (tal como aproximadamente cualquiera de 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 y 240 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición tiene un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5.6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además uno o más excipientes seleccionados del grupo que consiste en un estabilizador, un tampón y un agente de tonicidad. En algunos modos de realización, la composición es una formulación farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. En algunos modos de realización, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunos modos de realización, la proteína terapéutica es un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, anticuerpo glucomanipulado, fragmento de anticuerpo, un conjugado fármaco-anticuerpo, un THIOMAB™, un conjugado fármaco-THlOMAB™. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio catiónico fuerte de fase inversa. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un resto de ácido sulfónico. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un soporte sólido. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto está contenido en una columna. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía Oasis® MCX. En algunos modos de realización, el detergente no iónico se cuantifica mediante dispersión de luz por evaporación (ELSD) o usando un detector de aerosol cargado (CAD).

En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para cuantificar un polisorbato en una composición que comprende el polisorbato, un polipéptido y N-acetiltriptófano, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una primera proporción entre una fase móvil B y una fase móvil A de entre aproximadamente 5:95 y aproximadamente 15:85, en el que la fase móvil A comprende hidróxido de amonio en agua y la fase móvil B comprende hidróxido de amonio en metanol; b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto con una solución que comprende una segunda proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A de entre aproximadamente 40:60 y aproximadamente 50:50; c) eluir el polisorbato del material de cromatografía con una solución que comprende una tercera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A de entre aproximadamente 90:10 y aproximadamente 100:0; y d) cuantificar el polisorbato en el eluido de la etapa c), en el que el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del polipéptido total en la composición y menos de aproximadamente un 5 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del NAT total en la composición. En algunos modos de realización, la primera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A es de aproximadamente 10:90. En algunos modos de realización, la segunda proporción es de aproximadamente 45:55. En algunos modos de realización, la tercera proporción es de aproximadamente 100:0. En algunos modos de realización, la fase móvil A comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en agua. En algunos modos de realización, la fase móvil B comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en metanol. En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía está entre aproximadamente 0,5 y 2,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 0,7, 0,9, 1,1, 1,3, 1,4, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1 y 2,3, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) ml/minuto. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 (tal como aproximadamente cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 , 25, 30, 35, 40 y 45, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) pl. En algunos modos de realización, la etapa b) comienza al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1.5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o más) minutos después de que se inicie la etapa a) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4.5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, la etapa c) comienza al menos aproximadamente 0,05 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2 o más) minutos después de que finalice la etapa b) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,1, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, el polisorbato es polisorbato 20 o polisorbato 80. En algunos modos de realización, la concentración del polisorbato en la composición está en el intervalo de aproximadamente un 0,001 % a un 1,0 % (p/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 y 0,9 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de N-acetiltriptófano en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 10 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además metionina. En algunos modos de realización, la concentración de metionina en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 100 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de polipéptido en la composición es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml (tal como aproximadamente cualquiera de 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 y 240 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición tiene un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5.6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además uno o más excipientes seleccionados del grupo que consiste en un estabilizador, un tampón y un agente de tonicidad. En algunos modos de realización, la composición es una formulación farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. En algunos modos de realización, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunos modos de realización, la proteína terapéutica es un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, anticuerpo glucomanipulado, fragmento de anticuerpo, un conjugado fármaco-anticuerpo, un THIOMAB™, un conjugado fármaco-THlOMAB™. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio catiónico fuerte de fase inversa. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un resto de ácido sulfónico. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un soporte sólido. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto está contenido en una columna. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía Oasis® MCX. En algunos modos de realización, el detergente no iónico se cuantifica mediante dispersión de luz por evaporación (ELSD) o usando un detector de aerosol cargado (CAD). En algunos modos de realización, la cuantificación del polisorbato comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) de interferencia del polipéptido.

En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para cuantificar un polisorbato en una composición que comprende el polisorbato, un polipéptido y N-acetiltriptófano, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una primera proporción entre una fase móvil B y una fase móvil A de entre aproximadamente 5:95 y aproximadamente 15:85, en el que la fase móvil A comprende hidróxido de amonio en agua y la fase móvil B comprende hidróxido de amonio en acetonitrilo; b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto con una solución que comprende una segunda proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A de entre aproximadamente 40:60 y aproximadamente 50:50; c) eluir el polisorbato del material de cromatografía con una solución que comprende una tercera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A de entre aproximadamente 90:10 y aproximadamente 100:0; y d) cuantificar el polisorbato en el eluido de la etapa c), en el que la cuantificación del polisorbato comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) de interferencia del polipéptido y del NAT. En algunos modos de realización, el polipéptido se une al material de cromatografía específica y no específicamente, y al menos aproximadamente un 90 % (tal como al menos aproximadamente cualquiera de un 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %) del polipéptido eluye en la etapa b). En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende un polipéptido unido no específicamente. En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del polipéptido total en la composición. En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 5 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del NAT total en la composición. En algunos modos de realización, la primera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A es de aproximadamente 10:90. En algunos modos de realización, la segunda proporción es de aproximadamente 45:55. En algunos modos de realización, la tercera proporción es de aproximadamente 100:0. En algunos modos de realización, la fase móvil A comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en agua. En algunos modos de realización, la fase móvil B comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en acetonitrilo. En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía está entre aproximadamente 0,5 y 2,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 0,7, 0,9, 1,1, 1,3, 1,4, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1 y 2,3, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) ml/minuto. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 (tal como aproximadamente cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 , 25, 30, 35, 40 y 45, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) pl. En algunos modos de realización, la etapa b) comienza al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1.5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o más) minutos después de que se inicie la etapa a) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4.5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, la etapa c) comienza al menos aproximadamente 0,05 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2 o más) minutos después de que finalice la etapa b) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,1, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, el polisorbato es polisorbato 20 o polisorbato 80. En algunos modos de realización, la concentración del polisorbato en la composición está en el intervalo de aproximadamente un 0,001 % a un 1,0 % (p/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 y 0,9 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de N-acetiltriptófano en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 10 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además metionina. En algunos modos de realización, la concentración de metionina en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 100 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de polipéptido en la composición es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml (tal como aproximadamente cualquiera de 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 y 240 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición tiene un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además uno o más excipientes seleccionados del grupo que consiste en un estabilizador, un tampón y un agente de tonicidad. En algunos modos de realización, la composición es una formulación farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. En algunos modos de realización, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunos modos de realización, la proteína terapéutica es un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, anticuerpo glucomanipulado, fragmento de anticuerpo, un conjugado fármaco-anticuerpo, un THIOMAB™, un conjugado fármaco-THIOMAB™. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio catiónico fuerte de fase inversa. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un resto de ácido sulfónico. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un soporte sólido. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto está contenido en una columna. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía Oasis® MCX. En algunos modos de realización, el detergente no iónico se cuantifica mediante dispersión de luz por evaporación (ELSD) o usando un detector de aerosol cargado (CAD).

En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para cuantificar un polisorbato en una composición que comprende el polisorbato, un polipéptido y N-acetiltriptófano, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una primera proporción entre una fase móvil B y una fase móvil A de entre aproximadamente 5:95 y aproximadamente 15:85, en el que la fase móvil A comprende hidróxido de amonio en agua y la fase móvil B comprende hidróxido de amonio en acetonitrilo; b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto con una solución que comprende una segunda proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A de entre aproximadamente 40:60 y aproximadamente 50:50; c) eluir el polisorbato del material de cromatografía con una solución que comprende una tercera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A de entre aproximadamente 90:10 y aproximadamente 100:0; y d) cuantificar el polisorbato en el eluido de la etapa c), en el que el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del polipéptido total en la composición y menos de aproximadamente un 5 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del NAT total en la composición. En algunos modos de realización, la primera proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A es de aproximadamente 10:90. En algunos modos de realización, la segunda proporción es de aproximadamente 45:55. En algunos modos de realización, la tercera proporción es de aproximadamente 100:0. En algunos modos de realización, la fase móvil A comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en agua. En algunos modos de realización, la fase móvil B comprende entre aproximadamente un 0,5 % y aproximadamente un 5 % (v/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,75 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %, 3,5 %, 4 % y 4,5 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) de hidróxido de amonio en acetonitrilo. En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía está entre aproximadamente 0,5 y 2,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 0,7, 0,9, 1,1, 1,3, 1,4, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1 y 2,3, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) ml/minuto. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 (tal como aproximadamente cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 , 25, 30, 35, 40 y 45, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) pl. En algunos modos de realización, la etapa b) comienza al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1.5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o más) minutos después de que se inicie la etapa a) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4.5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, la etapa c) comienza al menos aproximadamente 0,05 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2 o más) minutos después de que finalice la etapa b) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,1, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, el polisorbato es polisorbato 20 o polisorbato 80. En algunos modos de realización, la concentración del polisorbato en la composición está en el intervalo de aproximadamente un 0,001 % a un 1,0 % (p/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 y 0,9 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de N-acetiltriptófano en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 10 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además metionina. En algunos modos de realización, la concentración de metionina en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 100 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de polipéptido en la composición es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml (tal como aproximadamente cualquiera de 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 y 240 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición tiene un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5.6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además uno o más excipientes seleccionados del grupo que consiste en un estabilizador, un tampón y un agente de tonicidad. En algunos modos de realización, la composición es una formulación farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. En algunos modos de realización, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunos modos de realización, la proteína terapéutica es un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, anticuerpo glucomanipulado, fragmento de anticuerpo, un conjugado fármaco-anticuerpo, un THIOMAB™, un conjugado fármaco-THIOMAB™. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio catiónico fuerte de fase inversa. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un resto de ácido sulfónico. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un soporte sólido. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto está contenido en una columna. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía Oasis® MCX. En algunos modos de realización, el detergente no iónico se cuantifica mediante dispersión de luz por evaporación (ELSD) o usando un detector de aerosol cargado (CAD). En algunos modos de realización, la cuantificación del polisorbato comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) de interferencia del polipéptido.

En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para cuantificar polisorbato 20 en una composición que comprende polisorbato 20, un polipéptido y N-acetiltriptófano, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una primera proporción de aproximadamente 10:90 entre una fase móvil B y una fase móvil A, en el que la fase móvil A comprende aproximadamente un 1,5 % de hidróxido de amonio en agua y la fase móvil B comprende aproximadamente un 1,5 % de hidróxido de amonio en metanol; b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto con una solución que comprende una proporción de aproximadamente 45:55 entre la fase móvil B y la fase móvil A; c) eluir el polisorbato 20 del material de cromatografía con una solución que comprende una proporción de aproximadamente 100:0 entre la fase móvil B y la fase móvil A; y d) cuantificar el polisorbato 20 en el eluido de la etapa c). En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del polipéptido total en la composición. En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 5 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del NAT total en la composición. En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía está entre aproximadamente 0,5 y 2,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 0,7, 0,9, 1,1, 1,3, 1,4, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1 y 2,3, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) ml/minuto. En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía es de aproximadamente 1,40 ml/min. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 (tal como aproximadamente cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 , 25, 30, 35, 40 y 45, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) pl. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía es de aproximadamente 25 pl. En algunos modos de realización, la etapa b) comienza al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o más) minutos después de que se inicie la etapa a) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, la etapa c) comienza al menos aproximadamente 0,05 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1,0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2 o más) minutos después de que finalice la etapa b) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2.6, 2,8, 3, 3,1, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, la concentración de polisorbato 20 en la composición está en el intervalo de aproximadamente un 0,001 % a un 1,0 % (p/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 y 0,9 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de N-acetiltriptófano en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 10 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además metionina. En algunos modos de realización, la concentración de metionina en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 100 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de polipéptido en la composición es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml (tal como aproximadamente cualquiera de 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 y 240 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición tiene un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además uno o más excipientes seleccionados del grupo que consiste en un estabilizador, un tampón y un agente de tonicidad. En algunos modos de realización, la composición es una formulación farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. En algunos modos de realización, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunos modos de realización, la proteína terapéutica es un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, anticuerpo glucomanipulado, fragmento de anticuerpo, un conjugado fármaco-anticuerpo, un THIOMAB™, un conjugado fármaco-THIOMAB™. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio catiónico fuerte de fase inversa. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un resto de ácido sulfónico. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un soporte sólido. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto está contenido en una columna. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía Oasis® MCX. En algunos modos de realización, el detergente no iónico se cuantifica mediante dispersión de luz por evaporación (ELSD) o usando un detector de aerosol cargado (CAD). En algunos modos de realización, la cuantificación del polisorbato comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) de interferencia del polipéptido y del NAT.

En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para cuantificar polisorbato 20 en una composición que comprende polisorbato 20, un polipéptido y N-acetiltriptófano, en el que el procedimiento comprende las etapas de a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una primera proporción de aproximadamente 10:90 entre una fase móvil B y una fase móvil A, en el que la fase móvil A comprende aproximadamente un 1,5 % de hidróxido de amonio en agua y la fase móvil B comprende aproximadamente un 1,5 % de hidróxido de amonio en acetonitrilo; b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto con una solución que comprende una proporción de aproximadamente 45:55 entre la fase móvil B y la fase móvil A; c) eluir el polisorbato 20 del material de cromatografía con una solución que comprende una proporción de aproximadamente 100:0 entre la fase móvil B y la fase móvil A; y d) cuantificar el polisorbato 20 en el eluido de la etapa c). En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del polipéptido total en la composición. En algunos modos de realización, el eluido de la etapa c) comprende menos de aproximadamente un 5 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) del NAT total en la composición. En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía está entre aproximadamente 0,5 y 2,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 0,7, 0,9, 1,1, 1,3, 1,4, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1 y 2,3, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) ml/minuto. En algunos modos de realización, el caudal de la cromatografía es de aproximadamente 1,40 ml/min. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 (tal como aproximadamente cualquiera de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20,25, 30, 35, 40 y 45, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores) pl. En algunos modos de realización, el volumen de la composición aplicada al material de cromatografía es de aproximadamente 25 pl. En algunos modos de realización, la etapa b) comienza al menos aproximadamente 0,5 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 o más) minutos después de que se inicie la etapa a) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, la etapa c) comienza al menos aproximadamente 0,05 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2 o más) minutos después de que finalice la etapa b) y continúa durante al menos aproximadamente 2 (tal como al menos aproximadamente cualquiera de 2,2, 2,4, 2,6, 2,8, 3, 3,1, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4, 4,5, 5 o más) minutos. En algunos modos de realización, la concentración de polisorbato 20 en la composición está en el intervalo de aproximadamente un 0,001 % a un 1,0 % (p/v) (tal como aproximadamente cualquiera de un 0,005, 0,01,0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 y 0,9 %, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de N-acetiltriptófano en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 10 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además metionina. En algunos modos de realización, la concentración de metionina en la composición varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 100 mM (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 mM, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la concentración de polipéptido en la composición es de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml (tal como aproximadamente cualquiera de 2, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220 y 240 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición tiene un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5 (tal como aproximadamente cualquiera de 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores). En algunos modos de realización, la composición comprende además uno o más excipientes seleccionados del grupo que consiste en un estabilizador, un tampón y un agente de tonicidad. En algunos modos de realización, la composición es una formulación farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. En algunos modos de realización, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunos modos de realización, la proteína terapéutica es un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, anticuerpo glucomanipulado, fragmento de anticuerpo, un conjugado fármaco-anticuerpo, un THIOMAB™, un conjugado fármaco-THIOMAB™. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio catiónico fuerte de fase inversa. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un resto de ácido sulfónico. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un soporte sólido. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto está contenido en una columna. En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). En algunos modos de realización, el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto es un material de cromatografía Oasis® MCX. En algunos modos de realización, el detergente no iónico se cuantifica mediante dispersión de luz por evaporación (ELSD) o usando un detector de aerosol cargado (CAD). En algunos modos de realización, la cuantificación del polisorbato comprende menos de aproximadamente un 10 % (tal como menos de aproximadamente cualquiera de un 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,01 % o menos) de interferencia del polipéptido y del NAT.

En algunos modos de realización de cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente, el tensioactivo no iónico se cuantifica en la composición que comprende el tensioactivo no iónico antes de añadir el polipéptido a la composición. En algunos modos de realización, la concentración de tensioactivo no iónico en la composición será mayor antes de añadir el polipéptido (por ejemplo, el tensioactivo no iónico en la composición se diluye tras la adición del polipéptido). En algunos modos de realización de cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente, el tensioactivo no iónico se cuantifica en la composición que comprende el tensioactivo no iónico antes pero sin el polipéptido a la composición. Dichas cuantificaciones se pueden usar como controles o comparadores de las composiciones que comprenden el tensioactivo no iónico y el polipéptido.

En algunos modos de realización de cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente, se añaden muestras de las composiciones que se van a analizar a un inyector automático de un instrumento de cromatografía (por ejemplo, instrumento de HPLC). En algunos modos de realización, las muestras en el inyector automático se refrigeran (por ejemplo, 5 ± 3 °C). En algunos modos de realización, una o más columnas que comprenden el material de cromatografía se colocan en un compartimento para columnas del instrumento de cromatografía. En algunos modos de realización se puede emplear un rasgo característico de control de temperatura para mantener la temperatura del compartimento para columnas dentro de un intervalo reducido (por ejemplo, ±1 °C) del punto de ajuste durante el análisis. En algunos modos de realización, el efluente de columna se monitoriza a 280 nm.

En algunos modos de realización de cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente, las muestras de las composiciones que se van a analizar se diluyen con un tampón de carga a una concentración de polipéptido objetivo de entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 75 mg/ml (tal como aproximadamente cualquiera de 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40,45, 50, 55, 60, 65 o 70 mg/ml, incluyendo cualquier intervalo entre estos valores).

En algunos modos de realización de cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente, el instrumento de cromatografía incluye una bomba de gradiente (por ejemplo, una bomba de gradiente cuaternario de baja presión), un inyector automático (por ejemplo, un inyector automático con capacidad de control de temperatura), un compartimento para columnas (por ejemplo, un compartimento para columnas con control térmico), un detector UV (por ejemplo, un detector UV de matriz de diodos) y un detector de dispersión de luz por evaporación (ELSD). En algunos modos de realización, el instrumento de cromatografía comprende además un monitor de pH y conductividad (por ejemplo, PCM-3000) para recopilar datos de pH y conductividad de forma ultrarrápida. El control del instrumento, la adquisición de datos y el análisis de datos se realizan usando el software apropiado (por ejemplo, JMP10).

En algunos modos de realización de la invención, la fuerza iónica de la fase móvil, por ejemplo, el tampón de elución, se mide mediante la conductividad de la fase móvil. Conductividad se refiere a la capacidad de una solución acuosa de conducir una corriente eléctrica entre dos electrodos. En solución, la corriente fluye mediante transporte iónico. Por lo tanto, con una cantidad creciente de iones presentes en la solución acuosa, la solución tendrá una conductividad mayor. La unidad de medida básica para la conductividad es el siemensio (o mho), mho (mS/cm), y se puede medir usando un conductímetro, tal como diversos modelos de conductímetros Orion. Puesto que la conductividad electrolítica es la capacidad de los iones en una solución de transportar corriente eléctrica, se puede alterar la conductividad de una solución cambiando la concentración de iones en la misma. Por ejemplo, se pueden alterar la concentración de un agente de tamponamiento y/o la concentración de una sal (por ejemplo, cloruro de sodio, acetato de sodio o cloruro de potasio) en la solución para lograr la conductividad deseada. Preferentemente, se modifica la concentración de sal de los diversos tampones para lograr la conductividad deseada.

En algunos modos de realización, la fase móvil de la cromatografía tiene una conductividad inicial de más de aproximadamente cualquiera de 0,0 mS/cm, 0,5 mS/cm, 1,0 mS/cm, 1,5 mS/cm, 2,0 mS/cm, 2,5 mS/cm, 3.0 mS/cm, 3,5 mS/cm, 4,0 mS/cm, 4,5 mS/cm, 5,0 mS/cm, 5,5 mS/cm, 6,0 mS/cm, 6,5 mS/cm, 7,0 mS/cm, 7.5 mS/cm, 8,0 mS/cm, 8,5 mS/cm, 9,0 mS/cm, 9,5 mS/cm, 10 mS/cm, 11 mS/cm, 12 mS/cm, 13 mS/cm, 14 mS/cm, 15 mS/cm, 16 mS/cm, 17,0 mS/cm, 18,0 mS/cm, 19,0 mS/cm o 20,0 mS/cm. En algunos modos de realización, la conductividad de la fase móvil se incrementa durante el curso de la cromatografía, por ejemplo, mediante un gradiente de fuerza iónica. En algunos modos de realización, la conductividad de la fase móvil al finalizar la elución es más de aproximadamente cualquiera de 1,0 mS/cm, 1,5 mS/cm, 2,0 mS/cm, 2,5 mS/cm, 3.0 mS/cm, 3,5 mS/cm, 4,0 mS/cm, 4,5 mS/cm, 5,0 mS/cm, 5,5 mS/cm, 6,0 mS/cm, 6,5 mS/cm, 7,0 mS/cm, 7.5 mS/cm, 8,0 mS/cm, 8,5 mS/cm, 9,0 mS/cm, 9,5 mS/cm, 10 mS/cm, 11 mS/cm, 12 mS/cm, 13 mS/cm, 14 mS/cm, 15 mS/cm, 16 mS/cm, 17,0 mS/cm, 18,0 mS/cm, 19,0 mS/cm o 20,0 mS/cm. En algunos modos de realización, la conductividad de la fase móvil se incrementa mediante un gradiente lineal. En algunos modos de realización, la conductividad de la fase móvil se incrementa mediante un gradiente escalonado que comprende una de más etapas.

En algunos modos de realización de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, la composición que comprende un polipéptido y un tensioactivo no iónico se carga en el material de cromatografía en una cantidad del polipéptido de más de una cualquiera de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000 , 8000, 9000 o 10.000 |jg. En algunos modos de realización, la composición se carga en el material de cromatografía a una concentración de más de una cualquiera de aproximadamente 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 o 150 mg/ml. En algunos modos de realización, la composición se diluye antes de su carga en el material de cromatografía; por ejemplo, se diluye 1:1, 1:2, 1:5, 1:10 o más de 1:10. En algunos modos de realización, la composición se diluye en la fase móvil de la cromatografía. En algunos modos de realización, la composición se diluye en un tampón de carga.

En algunos modos de realización de los procedimientos descritos en el presente documento, el material de cromatografía está en una columna o cartucho. En algunos modos de realización, la columna es una columna o cartucho de HPLC. La columna o cartucho puede tener cualquier dimensión compatible con el instrumento de cromatografía. Por ejemplo, en algunos modos de realización, la columna o cartucho tiene una de las siguientes dimensiones: 2,1 x 20 mm, 4 x 50 mm, 4 x 100 mm, 4 x 150 mm, 4 x 200 mm, 4 x 250 mm o 2 x 250 mm.

III. Polipéptidos

Se proporcionan polipéptidos para su uso en cualquiera de los procedimientos de cromatografía de intercambio iónico, en los que se optimizan las condiciones de separación como se describe en el presente documento. En algunos modos de realización de la invención, se analizan las composiciones de un polipéptido mediante cromatografía de intercambio iónico. Dichos procedimientos son útiles en la identificación de variantes de carga del polipéptido dentro de la composición. En algunos modos de realización, el polipéptido es un anticuerpo o fragmento del mismo. En algunos modos de realización, los polipéptidos tienen un pl que varía de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 9,5. En algunos modos de realización, el polipéptido es un anticuerpo que tiene un pl que varía de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 9,5. En algunos modos de realización, se proporciona el punto de inflexión (Pl) en una curva de carga frente al pH del polipéptido mediante los procedimientos de la invención. En algunos modos de realización, se proporciona el cambio en el Pl con un cambio en la temperatura (dPI/dT) mediante los procedimientos de la invención.

En algunos modos de realización, el polipéptido es un polipéptido terapéutico. En algunos modos de realización, el polipéptido es un anticuerpo. En algunos modos de realización, el polipéptido es una inmunoadhesina.

En algunos modos de realización, el polipéptido tiene un peso molecular de más de aproximadamente cualquiera de 5000 dalton, 10.000 dalton, 15.000 dalton, 25.000 dalton, 50.000 dalton, 75.000 dalton, 100.000 dalton, 125.000 dalton o 150.000 dalton. El polipéptido puede tener un peso molecular entre aproximadamente cualquiera de 50.000 dalton a 200.000 dalton o 100.000 dalton a 200.000 dalton. De forma alternativa, el polipéptido para su uso en el presente documento puede tener un peso molecular de aproximadamente 120.000 dalton o aproximadamente 25.000 dalton.

El pl es el punto isoeléctrico y es el pH al que una molécula o superficie particular no lleva carga eléctrica neta. En algunos modos de realización, se puede usar el procedimiento de la invención para una pluralidad de composiciones que comprenden un polipéptido, donde el pl del polipéptido en la composición, por ejemplo, un anticuerpo, varía de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 9,5. En algunos modos de realización, el polipéptido tiene un pl mayor de aproximadamente 9,5; por ejemplo, de aproximadamente 9,5 a aproximadamente 12. En algunos modos de realización de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el pl del polipéptido, por ejemplo, un anticuerpo, puede ser menos de aproximadamente 7; por ejemplo, de aproximadamente 4 a aproximadamente 7.

En modos de realización de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el uno o más contaminantes en una composición que comprende un polipéptido y uno o más contaminantes son variantes de carga del polipéptido. En algunos modos de realización, la variante de carga de polipéptido es un polipéptido que se ha modificado desde su estado natural de modo que se altere la carga del polipéptido. En algunos modos de realización, las variantes de carga son más ácidas que el polipéptido original; es decir, tienen un pI menor que el polipéptido original. En otros modos de realización, las variantes de carga son más básicas que el polipéptido original; es decir, tienen un pI mayor que el polipéptido original. En algunos modos de realización, se genomanipulan las variantes de carga del polipéptido. En algunos modos de realización, la variante de carga del polipéptido es el resultado de procesos naturales; por ejemplo, oxidación, desamidación, procesamiento C terminal de residuos de lisina, formación de piroglutamato N terminal y glucación. En algunos modos de realización, la variante de carga del polipéptido es una glucoproteína donde se modifica el glucano acoplado a la proteína de modo que se altere la carga de la glucoproteína en comparación con la glucoproteína original; por ejemplo, mediante adición de ácido siálico o sus derivados. En algunos modos de realización, la variante de carga del polipéptido es una variante de carga de anticuerpo.

Los polipéptidos que se van a analizar usando los procedimientos descritos en el presente documento se producen, en general, usando técnicas recombinantes. Los procedimientos para producir proteínas recombinantes se describen, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.° 5.534.615 y 4.816.567.

En algunos modos de realización, se produce la proteína de interés en una célula de CHO (véase, por ejemplo, el documento WO 94/11026). En algunos modos de realización, se produce el polipéptido de interés en una célula deE. coli.Véanse, por ejemplo, la pat. de EE. UU. n.° 5.648.237; la pat. de EE. UU. n.° 5.789.199 y la pat. de EE. UU. n.° 5.840.523, que describen las secuencias de la región de iniciación de la traducción (TIR) y las secuencias señal para optimizar la expresión y la secreción. Véase también Charlton, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpo enE. coli.Cuando se usan técnicas recombinantes, los polipéptidos se pueden producir intracelularmente, en el espacio periplásmico, o segregar directamente al medio.

Los polipéptidos se pueden recuperar del medio de cultivo o de lisados de células huésped. Las células empleadas en la expresión de los polipéptidos se pueden romper por diversos medios físicos o químicos, tales como ciclos de congelación-descongelación, sonicación, ruptura mecánica o agentes de lisis celular. Si el polipéptido se produce intracelularmente, como primera etapa, los restos de partículas, bien células huésped o bien fragmentos lisados, se eliminan, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Carteret al., Bio/Technology10: 163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar polipéptidos que se segregan al espacio periplásmico deE. coli.En resumen, se descongela la pasta celular en presencia de acetato de sodio (pH 3,5), EDTA y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Los restos celulares se pueden retirar mediante centrifugación. Cuando el polipéptido se segrega al medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión en primer lugar se concentran, en general, usando un filtro de concentración de polipéptidos disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Se puede incluir un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes casuales.

En algunos modos de realización, el polipéptido en la composición que comprende el polipéptido y uno o más contaminantes se ha purificado o purificado parcialmente antes del análisis por los procedimientos de la invención. Por ejemplo, el polipéptido de los procedimientos está en un eluyente de una cromatografía de afinidad, una cromatografía de intercambio catiónico, una cromatografía de intercambio aniónico, una cromatografía de modo mixto y una cromatografía de interacción hidrófoba. En algunos modos de realización, el polipéptido está en un eluyente de una cromatografía con proteína A.

Los ejemplos de polipéptidos que se pueden analizar por los procedimientos de la invención incluyen, pero no se limitan a, inmunoglobulinas, inmunoadhesinas, anticuerpos, enzimas, hormonas, proteínas de fusión, proteínas que contienen Fc, inmunoconjugados, citocinas e interleucinas.(A) Anticuerpos

En algunos modos de realización de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el polipéptido para su uso en cualquiera de los procedimientos de análisis de polipéptidos y formulaciones que comprenden los polipéptidos por los procedimientos descritos en el presente documento es un anticuerpo.

Las dianas moleculares para anticuerpos incluyen (i) proteínas CD y sus ligandos, tales como, pero sin limitarse a: CD3, CD4, CD8, CD19, CD11a, CD20, CD22, CD27, CD28, CD34, CD40, CD79a (CD79a), CD79p (CD79b), CD122 y CD137; (ii) citocinas tales como, pero sin limitarse a: IL-13, IL-17, IL-22 e IL-33; (iii) miembros de la familia de receptores ErbB tales como el receptor de EGF, el receptor HER2, HER3 o HER4; (iv) moléculas de adhesión celular tales como LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM e integrina av/p3, incluyendo las subunidades alfa o bien beta de la misma (por ejemplo, anticuerpos anti-CD11a, anti-CD18 o anti-CD11b); (v) factores de crecimiento, tales como VEGF; TGFp, IgE; antígenos de grupos sanguíneos; receptor flk2/flt3; receptor de obesidad (OB); receptormpl;CTLA-4; proteína C, BR3, c-met, factor tisular, p7, etc.; (vi) proteínas inmunomoduladoras tales como OX40, GIt R, ICOS, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG3, TIM-3 y VISTA; y (vii) antígenos asociados a tumor (TAA) de superficie celular y transmembranarios, tales como los descritos en la patente de EE. UU. n.° 7.521.54 l, incluyendo, sin limitación, NaPi2b.

Otros anticuerpos ejemplares incluyen los seleccionados de, y sin limitación, anticuerpo antirreceptor de estrógeno, anticuerpo antirreceptor de progesterona, anticuerpo anti-p53, anticuerpo anti-HER-2/neu, anticuerpo anti-EGFR, anticuerpo anti-TGFp, anticuerpo anti-OX40, anticuerpo anti-GITR, anticuerpo anti-ICOS, anticuerpo anti-CTLA-4, anticuerpo anti-PD-1, anticuerpo anti-PD-LI, anticuerpo anti-PD-L2, anticuerpo anti-TIM-3, anticuerpo anti-VISTA, anticuerpo anti-catepsina D, anticuerpo anti-Bcl-2, anticuerpo anti-cadherina E, anticuerpo anti-CA125, anticuerpo anti-CA15-3, anticuerpo anti-CA19-9, anticuerpo anti-c-erbB-2, anticuerpo anti-glucoproteína P, anticuerpo anti-CEA, anticuerpo anti-proteína del retinoblastoma, anticuerpo anti-oncoproteína ras, anticuerpo anti-Lewis X, anticuerpo anti-Ki-67, anticuerpo anti-PCNA, anticuerpo anti-CD3, anticuerpo anti-CD4, anticuerpo anti-CD5, anticuerpo anti-CD7, anticuerpo anti-CD8, anticuerpo anti-CD9/p24, anticuerpo anti-CD10, anticuerpo anti-CD11a, anticuerpo anti-CD11c, anticuerpo anti-CD13, anticuerpo anti-CD14, anticuerpo anti-CD15, anticuerpo anti-CD19, anticuerpo anti-CD20, anticuerpo anti-CD22, anticuerpo anti-CD23, anticuerpo anti-CD27, anticuerpo anti-CD28, anticuerpo anti-CD30, anticuerpo anti-CD31, anticuerpo anti-CD33, anticuerpo anti-CD34, anticuerpo anti-CD35, anticuerpo anti-CD38, anticuerpo anti-CD40, anticuerpo anti-CD41, anticuerpo anti-LCA/CD45, anticuerpo anti-CD45RO, anticuerpo anti-CD45RA, anticuerpo anti-CD39, anticuerpo anti-CD100, anticuerpo anti-CD95/Fas, anticuerpo anti-CD99, anticuerpo anti-CD106, anticuerpo anti-CD122, anticuerpo anti-CD137, anticuerpo anti-ubiquitina, anticuerpo anti-CD71, anticuerpo anti-StaphA, anticuerpo anti-FcRH5, anticuerpo anti-Ly6E, anticuerpo anti-STEAP, anticuerpo anti-FluB, anticuerpo anti-VEGF, anticuerpo anti-Ang2, anticuerpo anti-FGFR1, anticuerpo anti-KLB, anticuerpo anti-c-myc, anticuerpo anti-citoqueratinas, anticuerpo anti-vimentinas, anticuerpo anti-proteínas del VPH, anticuerpo anti-cadenas ligeras kappa, anticuerpo anti-cadenas ligeras lambda, anticuerpo anti-melanosomas, anticuerpo anti-antígeno prostético específico, anticuerpo anti-S100, anticuerpo anti-antígeno tau, anticuerpo anti-fibrina, anticuerpo anti-queratinas, anticuerpo anti-antígeno Tn y MetMab.

(i) Anticuerpos monoclonales

En algunos modos de realización, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales. Se obtienen anticuerpos monoclonales de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles variantes que surgen durante la producción del anticuerpo monoclonal, estando presentes, en general, dichas variantes en cantidades menores. Por tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que no es una mezcla de anticuerpos discretos o policlonales.

Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando el procedimiento de hibridoma descrito por primera vez por Kohleret al., Nature,256:495 (1975) o se pueden preparar por procedimientos de ADN recombinante (patente de EE. UU. n.° 4.816.567).

En el procedimiento de hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster, se inmuniza como se describe en el presente documento para inducir linfocitos que producen o pueden producir anticuerpos que se unirán específicamente al polipéptido usado para la inmunización. De forma alternativa, los linfocitos se pueden inmunizarin vitro.A continuación, se fusionan los linfocitos con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding,Monoclonal Antibodies: Principies and Practice,pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).

Las células de hibridoma preparadas de este modo se siembran y cultivan en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o més sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma originales no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma originales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluiré típicamente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), evitando dichas sustancias el crecimiento de células carentes de HGPRT.

En algunos modos de realización, las células de mieloma son aquellas que se fusionan eficazmente, soportan una producción estable de alto nivel de anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Entre estas, en algunos modos de realización, las líneas celulares de mieloma son líneas de mieloma murino, tales como las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California EE. UU., y células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EE. UU. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor,J. Immunol.,133:3001 (1984); Brodeuret al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).

El medio de cultivo en el que se cultivan las células de hibridoma se somete a ensayo para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. En algunos modos de realización se determina la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de uniónin vitro,tal como radioinmunoanálisis (RIA) o ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA).

La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal se puede determinar, por ejemplo, por el análisis de Scatchard de Munsonet al., Anal. Biochem.107:220 (1980).

Después de que se identifiquen células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones se pueden subclonar mediante procedimientos de dilución limitante y cultivar mediante procedimientos estándar (Goding,Monoclonal Antibodies: Principies and Practicepp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma se pueden cultivarin vivocomo tumores ascíticos en un animal.

Los anticuerpos monoclonales segregados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, líquido ascítico o suero por procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas, tales como, por ejemplo, polipéptido A-Sepharose®, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que se pueden unir específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). En algunos modos de realización, las células de hibridoma sirven como una fuente de dicho ADN. Una vez aislado, se puede disponer el ADN en vectores de expresión que, a continuación, se transfectan en células huésped, tales como células deE. coli,células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma, que de otro modo no producen polipéptido de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Los artículos de revisión sobre la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifica el anticuerpo incluyen Skerraet al., Curr. Opinion in Immunol.5:256-262 (1993) y Plükthun,Immunol. Revs.,130:151-188 (1992).

En otro modo de realización, se pueden aislar anticuerpos o fragmentos de anticuerpo a partir de colecciones de fagos con anticuerpos generadas usando las técnicas descritas en McCaffertyet al., Nature348:552-554 (1990). Clacksonet al., Nature352:624-628 (1991) y Markset al., J. Mol. Biol.222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando colecciones de fagos. Las publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo nM) por barajado de cadenas (Markset al., Bio/Technology,10:779-783 (1992)), así como la infección combinatoria y la recombinaciónin vivocomo una estrategia para construir colecciones de fagos muy grandes (Waterhouseet al., Nuc. Acids. Res.,21:2265-2266 (1993)). Por tanto, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales de hibridoma de anticuerpos monoclonales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

También se puede modificar el ADN, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante para los dominios constantes de la cadena pesada y ligera humana en lugar de las secuencias murinas homólogas (patente de EE. UU. n.° 4.816.567; Morrison,et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA,81:6851 [1984]), o uniendo de forma covalente a la secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante para un polipéptido no inmunoglobulínico.

Típicamente, dichos polipéptidos no inmunoglobulínicos se sustituyen con los dominios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen con los dominios variables de un sitio de combinación con antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprenda un sitio de combinación con antígeno que tenga especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación con antígeno que tenga especificidad por un antígeno diferente.

En algunos modos de realización de cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, el anticuerpo es IgA, IgD, IgE, IgG o IgM. En algunos modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal IgG.

(ii) Anticuerpos humanizados

En algunos modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos se han descrito en la técnica. En algunos modos de realización, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoacídicos introducidos en el mismo desde una fuente que es no humana. Estos residuos aminoacídicos no humanos se denominan a menudo residuos de "importación", que se toman típicamente de un dominio variable de "importación". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores (Joneset al., Nature321:522-525 (1986), Riechmannet al., Nature332:323-327 (1988), Verhoeyenet al., Science239:1534-1536 (1988)), sustituyendo las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano por las secuencias de la región hipervariable. En consecuencia, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de EE. UU. n.° 4.816.567) en los que se ha sustituido sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de la región hipervariable y posiblemente algunos residuos de FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor.

La elección de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que se van a usar en la preparación de los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el llamado procedimiento de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba frente a toda la colección de secuencias del dominio variable humanas conocidas. A continuación, se acepta la secuencia humana que es la más cercana a la del roedor como la región estructural (FR) humana para el anticuerpo humanizado (Simset al., J. Immunol.151:2296 (1993); Chothiaet al., J. Mol. Biol.196:901 (1987)). Otro procedimiento usa una región estructural particular derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de la cadena ligera o pesada. Se puede usar la misma región estructural para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carteret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:4285 (1992); Prestaet al., J. Immunol.151:2623 (1993)).

Es importante además que los anticuerpos se humanicen con retención de alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, en algunos modos de realización de los procedimientos, se preparan los anticuerpos humanizados mediante un procedimiento de análisis de las secuencias originales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias originales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están disponibles comúnmente y son conocidos por los expertos en la técnica. Están disponibles programas informáticos que ilustran y presentan estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del probable papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata de unirse a su antígeno. De esta manera, se pueden seleccionar y combinar residuos de FR a partir de las secuencias receptoras y de importación de modo que se logre la característica de anticuerpo deseada, tal como una afinidad incrementada por el/los antígeno(s) diana. En general, los residuos de la región hipervariable están directamente y lo más sustancialmente implicados en la influencia en la unión a antígeno.

(iii) Anticuerpos humanos

En algunos modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo humano. Como alternativa a la humanización, se pueden generar anticuerpos humanos. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que, tras su inmunización, pueden producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica del gen de la región de unión de la cadena pesada de anticuerpo (J<h>) en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal da como resultado la inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la matriz génica de inmunoglobulina de línea germinal humana a dichos ratones mutantes de línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición a antígeno. Véase, por ejemplo, Jakobovitset al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:2551 (1993); Jakobovitset al., Nature362:255-258 (1993); Bruggermannet al., Year in Immuno.7:33 (1993) y las patentes de EE. UU. n.° 5.591.669; 5.589.369 y 5.545.807.

De forma alternativa, se puede usar la tecnología de presentación en fagos (McCaffertyet al., Nature348:552-553 (1990)) para producir anticuerpos y fragmentos de anticuerpo humanosin vitroa partir de repertorios de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, los genes de dominio V de anticuerpo se clonan sin cambio de pauta de lectura en un gen de polipéptido de la cápside mayor o bien menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se presentan como fragmentos de anticuerpo funcionales en la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenario del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que codifica el anticuerpo que presenta esas propiedades. Por tanto, el fago imita algunas de las propiedades del linfocito B. La presentación en fagos se puede realizar en una variedad de formatos; para su revisión véase, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J.,Current Opinion in Structural Biology3:564-571 (1993). Se pueden usar varias fuentes de segmentos de genes V para la presentación en fagos. Clacksonet al., Nature352:624-628 (1991) aislaron una matriz diversa de anticuerpos anti-oxazolona a partir de una pequeña colección combinatoria aleatoria de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Se puede construir un repertorio de genes V de donantes humanos no inmunizados y se pueden aislar anticuerpos con respecto a una matriz diversa de antígenos (incluyendo autoantígenos) siguiendo esencialmente las técnicas descritas por Markset al., J. Mol. Biol.222:581-597 (1991) o Griffithet al., EMBO J.

12:725-734 (1993). Véanse también las patentes de EE. UU. n.° 5.565.332 y 5.573.905.

Los anticuerpos humanos también se pueden generar por linfocitos B activadosin vitro(véanse las patentes de EE. UU. 5.567.610 y 5.229.275).

(iv) Fragmentos de anticuerpo

En algunos modos de realización, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaban por medio de digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véanse, por ejemplo, Morimotoet al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods24:107-117 (1992) y Brennanet al., Science229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos se pueden producir ahora directamente por células huésped recombinantes. Por ejemplo, se pueden aislar los fragmentos de anticuerpo de las colecciones de fagos de anticuerpos analizadas anteriormente. De forma alternativa, se pueden recuperar directamente los fragmentos Fab'-SH deE. co liy acoplar químicamente para formar fragmentos F(ab')<2>(Carteret al., Bio/Technology10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro enfoque, se pueden aislar fragmentos F(ab')<2>directamente del cultivo de células huésped recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para el profesional experto. En otros modos de realización, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv monocatenario (scFv). Véanse el documento WO 93/16185; la patente de EE. UU. n.° 5.571.894 y la patente de EE. UU. n.° 5.587.458. El fragmento de anticuerpo puede ser también un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. 5.641.870, por ejemplo. Dichos fragmentos de anticuerpo lineal pueden ser monoespecíficos o biespecíficos.

En algunos modos de realización se proporcionan fragmentos de los anticuerpos descritos en el presente documento. En algunos modos de realización, el fragmento de anticuerpo es un fragmento de unión a antígeno. En algunos modos de realización, el fragmento de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')<2>, un scFv, un Fv y un diacuerpo.

(v) Anticuerpos biespecíficos

En algunos modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión por al menos dos epítopos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos ejemplares se pueden unir a dos epítopos diferentes. De forma alternativa, se puede combinar un brazo de unión de anticuerpo biespecífico con un brazo que se una a una molécula desencadenante en un leucocito, tal como una molécula receptora de linfocitos T (por ejemplo, CD2 o CD3) o receptores de Fc para IgG (FcyR), tales como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16) para centrar los mecanismos de defensa celular en la célula. Se pueden preparar anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')<2>).

En la técnica se conocen procedimientos para preparar anticuerpos biespecíficos. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen especificidades diferentes (Millsteinet al., Nature305:537-539 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las que solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que se realiza normalmente por etapas de cromatografía de afinidad, es bastante engorrosa y los rendimientos de producto son bajos. Se divulgan procedimientos similares en el documento WO 93/08829, y en Trauneckeret al., EMBOJ., 10:3655-3659 (1991).

De acuerdo con un enfoque diferente, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. En algunos modos de realización, la fusión es con un dominio constante de la cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. En algunos modos de realización, la primera región constante de la cadena pesada (CH1), que contiene el sitio necesario para la unión a la cadena ligera, está presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones con la cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad al ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en modos de realización en los que proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las proporciones no son de especial importancia.

En algunos modos de realización de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos se componen de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (proporcionando una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se descubrió que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo una mitad de la molécula biespecífica proporciona una forma de separación fácil. Este enfoque se divulga en el documento WO 94/04690. Para otros detalles de generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Sureshet al., Methods in Enzymology,121:210 (1986).

De acuerdo con otro enfoque descrito en la patente de EE. UU. n.° 5.731.168, se puede genomanipular la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células recombinantes. En algunos modos de realización, la superficie de contacto comprende al menos una parte del dominio C<h>3 de un dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfase de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena(s) lateral(es) grande(s) en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando las cadenas laterales de aminoácido grandes por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero frente a otros productos finales no deseados, tales como homodímeros.

Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede acoplar a avidina, el otro, a biotina. Por ejemplo, se han propuesto dichos anticuerpos para dirigir células del sistema inmunitario a células no deseadas (patente de e E. Uu . n.° 4.676.980) y para el tratamiento de la infección por el VIH (documentos WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089). Se pueden preparar anticuerpos heteroconjugados usando cualquier procedimiento de reticulación conveniente. Los agentes de reticulación adecuados son bien conocidos en la técnica y se divulgan en la patente de EE. UU. n.° 4.676.980, junto con varias técnicas de reticulación.

En la literatura también se han descrito técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespecíficos usando un enlace químico. Brennanet al., Science,229: 81 (1985) describen un procedimiento en el que se escinden proteolíticamente anticuerpos intactos para generar fragmentos F(ab')<2>. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente arsenito de sodio de formación de complejos con ditiol para estabilizar los ditioles vecinos y evitar la formación de disulfuro intermolecular. A continuación, los fragmentos Fab' generados se convierten en derivados de tionitrobenzoato (TNB). A continuación, uno de los derivados Fab'-TNB se reconvierte en Fab'-tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden usar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

También se han descrito diversas técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpo biespecífico directamente del cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucinas. Kostelnyet al., J. Immunol.148(5):1547-1553 (1992). Los péptidos de cremalleras de leucinas de las proteínas Fos y Jun se enlazaron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y, a continuación, se volvieron a oxidar para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este procedimiento también se puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpos" descrita por Hollingeret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico. Los fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (V<h>) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (V<l>) por un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena. En consecuencia, se fuerza a que los dominios V<h>y V<l>de un fragmento se emparejen con los dominios V<l>y V<h>complementarios de otro fragmento, formando de este modo dos sitios de unión a antígeno. También se ha informado de otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico mediante el uso de dímeros de Fv monocatenario (sFv). Véase Gruberet al., J. Immunol,152:5368 (1994).

Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tuttet al., J. Immunol.147: 60 (1991).

(vi) Anticuerpos multivalentes

En algunos modos de realización, los anticuerpos son anticuerpos multivalentes. Un anticuerpo multivalente se puede internalizar (y/o catabolizar) más rápido que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antígeno al que se unen los anticuerpos. Los anticuerpos proporcionados en el presente documento pueden ser anticuerpos multivalentes (que son distintos de la clase IgM) con tres o más sitios de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos tetravalentes), que se pueden producir fácilmente por expresión recombinante de ácido nucleico que codifica las cadenas polipeptídicas del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de unión a antígeno. El dominio de dimerización preferente comprende (o consiste en) una región Fc o una región bisagra. En esta situación, el anticuerpo comprende una región Fc y tres o más sitios de unión a antígeno en el extremo amínico con respecto a la región Fc. El anticuerpo multivalente preferente en el presente documento comprende (o consiste en) de tres hasta aproximadamente ocho, pero preferentemente cuatro, sitios de unión a antígeno. El anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena de polipéptido (y preferentemente dos cadenas de polipéptido), en el que la(s) cadena(s) de polipéptido comprende(n) dos o más dominios variables. Por ejemplo, la(s) cadena(s) de polipéptido puede(n) comprender VD1-(X1)n-VD2-(X2) n-Fc, en el que VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fc es una cadena de polipéptido de una región Fc, X1 y X2 representan un aminoácido o polipéptido, y n es 0 o 1. Por ejemplo, la(s) cadena(s) de polipéptido puede(n) comprender: VH-CHI-conector flexible-VH-CHI-cadena de región Fc; o VH-CH1-VH-CH1-cadena de región Fc. El anticuerpo multivalente en el presente documento preferentemente comprende además al menos dos (y preferentemente cuatro) polipéptidos de dominio variable de la cadena ligera. El anticuerpo multivalente en el presente documento puede comprender, por ejemplo, de aproximadamente dos a aproximadamente ocho polipéptidos de dominio variable de la cadena ligera. Los polipéptidos de dominio variable de la cadena ligera contemplados aquí comprenden un dominio variable de la cadena ligera y, opcionalmente, comprenden además un dominio CL.

En algunos modos de realización, el anticuerpo es un anticuerpo multiespecífico. Ejemplos de anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo que comprende un dominio variable de la cadena pesada (V<h>) y un dominio variable de la cadena ligera (V<l>), donde la unidad V<h>V<l>tiene especificidad poliepitópica, anticuerpos que tienen dos o más dominios V<l>y V<h>, uniéndose cada unidad V<h>V<l>a un epítopo diferente, anticuerpos que tienen dos o más dominios variables únicos, uniéndose cada dominio variable único a un epítopo diferente, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpo tales como Fab, Fv, dsFv, scFv, diacuerpos, diacuerpos biespecíficos, triacuerpos, anticuerpos trifuncionales, fragmentos de anticuerpo que se han enlazado de forma covalente o no covalente. En algunos modos de realización, ese anticuerpo tiene especificidad poliepitópica; por ejemplo, la capacidad de unirse específicamente a dos o más epítopos diferentes en la(s) misma(s) o diferente(s) diana(s). En algunos modos de realización, los anticuerpos son monoespecíficos; por ejemplo, un anticuerpo que solo se une a un epítopo. De acuerdo con un modo de realización, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo IgG que se une a cada epítopo con una afinidad de 5 |<j>M a 0,001 pM, de 3 |<j>M a 0,001 pM, de 1<j>M a 0,001 pM, de 0,5<j>M a 0,001 pM o de 0,1<j>M a 0,001 pM.

(vii) Otras modificaciones de anticuerpos

Puede ser deseable modificar el anticuerpo proporcionado en el presente documento con respecto a la función efectora, por ejemplo, para potenciar la citotoxicidad celular dependiente de antígenos (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto se puede lograr introduciendo una o más sustituciones aminoacídicas en una región Fc del anticuerpo. De forma alternativa o adicional, se puede(n) introducir (un) residuo(s) de cisteína en la región Fc, permitiendo de este modo la formación de enlaces disulfuro intercatenarios en esta región. Por tanto, el anticuerpo homodimérico generado puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o una destrucción celular mediada por el complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) incrementadas. Véase Caronet al., J. Exp Med.176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J.,Immunol.148:2918-2922 (1992). También se pueden preparar anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral potenciada usando agentes de reticulación heterobifuncionales como se describe en Wolffet al., Cancer Research53:2560-2565 (1993). De forma alternativa, se puede genomanipular un anticuerpo que tiene regiones Fc dobles y, de este modo, puede tener capacidades de lisis mediada por el complemento y ADCC potenciadas. Véase Stevensonet al., Anti-Cancer Drug Design3:219-230 (1989).

Para incrementar la semivida en suero del anticuerpo, se pueden realizar alteraciones de aminoácido en el anticuerpo como se describe en el documento US2006/0067930.

(B) Variantes y modificaciones de polipéptidos

La(s) modificación/modificaciones de secuencia de aminoácidos de los polipéptidos, incluyendo anticuerpos, descrita(s) en el presente documento se puede(n) usar en los procedimientos de purificación de polipéptidos (por ejemplo, anticuerpos) descritos en el presente documento.

(i) Polipéptidos variantes

"Variante de polipéptido" significa un polipéptido, preferentemente un polipéptido activo, como se define en el presente documento, que tiene al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia natural de longitud completa del polipéptido, una secuencia de polipéptido que carece del péptido señal, un dominio extracelular de un polipéptido, con o sin el péptido señal. Dichas variantes de polipéptido incluyen, por ejemplo, polipéptidos en los que se añaden o delecionan uno o más residuos aminoacídicos en el extremo N o C de la secuencia de aminoácidos natural de longitud completa. Habitualmente, una variante de polipéptido TAT tendrá al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, de forma alternativa al menos aproximadamente cualquiera de un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos, con respecto a una secuencia de polipéptido de secuencia natural de longitud completa, una secuencia de polipéptido que carece del péptido señal, un dominio extracelular de un polipéptido, con o sin el péptido señal. Opcionalmente, los polipéptidos variantes no tendrán más de una sustitución aminoacídica conservadora en comparación con la secuencia de polipéptido natural, de forma alternativa, no más de aproximadamente cualquiera de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones aminoacídicas conservadoras en comparación con la secuencia de polipéptido natural.

El polipéptido variante se puede truncar en el extremo N o en el extremo C, o puede carecer de residuos internos, por ejemplo, cuando se compara con un polipéptido natural de longitud completa. Determinados polipéptidos variantes pueden carecer de residuos aminoacídicos que no sean esenciales para una actividad biológica deseada. Estos polipéptidos variantes con truncamientos, deleciones e inserciones se pueden preparar mediante cualquiera de varias técnicas convencionales. Los polipéptidos variantes deseados se pueden sintetizar químicamente. Otra técnica adecuada implica aislar y amplificar un fragmento de ácido nucleico que codifica un polipéptido variante deseado, mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se emplean oligonucleótidos que definen los extremos deseados del fragmento de ácido nucleico en los cebadores 5' y 3' en la PCR. Preferentemente, los polipéptidos variantes comparten al menos una actividad biológica y/o inmunitaria con el polipéptido natural divulgado en el presente documento.

Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxiterminales que varían en longitud desde un residuo hasta polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuenciales de residuos aminoacídicos individuales o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N terminal o el anticuerpo fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión en el extremo N o C del anticuerpo a una enzima o un polipéptido que incrementa la semivida en suero del anticuerpo.

Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del polipéptido. Las variantes de secuencia de aminoácidos del polipéptido se preparan introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ácido nucleico del anticuerpo o por síntesis de péptidos. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos en las secuencias de aminoácidos del polipéptido. Se prepara cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios aminoacídicos también pueden alterar los procesos postraduccionales del polipéptido (por ejemplo, anticuerpo), tales como el cambio del número o posición de los sitios de glucosilación.

Se pueden encontrar directrices para determinar qué residuo aminoacídico se puede insertar, sustituir o delecionar sin afectar negativamente a la actividad deseada comparando la secuencia del polipéptido con la de moléculas de polipéptido conocidas homólogas y minimizando el número de cambios en la secuencia de aminoácidos realizados en regiones de homología alta.

Un procedimiento útil para la identificación de determinados residuos o regiones del polipéptido (por ejemplo, anticuerpo) que sean localizaciones preferentes para la mutagénesis se llama "mutagénesis por barrido de alanina" como se describe por Cunningham y Wells,Science244:1081-1085 (1989). Aquí, un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados, tales como Arg, Asp, His, Lys y Glu) se identifica y reemplaza por un aminoácido neutro o cargado negativamente (lo más preferentemente alanina o polialanina) para que afecten a la interacción de los aminoácidos con el antígeno. Esas localizaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan, a continuación, introduciendo variantes adicionales u otras en, o para, los sitios de sustitución. Por tanto, aunque el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácidos está predeterminado, no es necesario que la naturaleza de la mutaciónper seesté predeterminada. Por ejemplo, para analizar el funcionamiento de una mutación en un sitio dado, se realiza una mutagénesis aleatoria o por barrido de Ala en el codón o región diana y se criban las variantes de anticuerpo expresadas para determinar la actividad deseada.

Otro tipo de variante es una variante de sustitución aminoacídica. Estas variantes tienen al menos un residuo aminoacídico en la molécula de anticuerpo reemplazado por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis por sustitución incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones en FR. En la tabla 1 a continuación se muestran sustituciones conservadoras bajo el encabezado de "sustituciones conservadoras". Si dichas sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, entonces se pueden introducir cambios más sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la tabla 1, o como se describe adicionalmente más adelante con referencia a las clases de aminoácidos, y se criban los productos.

Tabla 1

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Se consiguen modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del polipéptido seleccionando sustituciones que difieran significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal del polipéptido en el área de sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o hélice, (b) la carga o hidrofobia de la molécula en el sitio diana o (c) el volumen de la cadena lateral. Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con las similitudes en las propiedades de sus cadenas laterales (en A. L. Lehninger, Biochemistry segunda ed., pp. 73-75, Worth Publishers, Nueva York (1975)):

(1) no polares: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)

(2) polares no cargados: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)

(3) ácidos: Asp (D), Glu (E)

(4) básicos: Lys (K), Arg (R), His(H)

De forma alternativa, los residuos naturales se pueden dividir en grupos basados en propiedades de cadena lateral comunes:

(1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) ácidos: Asp, Glu;

(4) básicos: His, Lys, Arg;

(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;

(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservadoras supondrán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Cualquier residuo de cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación apropiada del anticuerpo también se puede sustituir, en general, por serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar la reticulación anómala. Por el contrario, se puede(n) añadir (un) enlace(s) de cisteína al polipéptido para mejorar su estabilidad (en particular, si el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fv).

Un tipo de variante de sustitución preferente en particular implica la sustitución de uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo original (por ejemplo, un anticuerpo humanizado). En general, la(s) variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para su desarrollo adicional tendrá(n) propiedades biológicas mejoradas en relación con el anticuerpo original a partir del que se generan. Una manera conveniente de generar dichas variantes de sustitución implica la maduración en afinidad usando presentación en fagos. En resumen, se mutan varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) para generar todas las posibles sustituciones aminoacídicas en cada sitio. Las variantes de anticuerpo así generadas se presentan de una forma monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones con el producto del gen III de M13 empaquetadas dentro de cada partícula. A continuación, las variantes presentadas en fagos se criban para determinar su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) como se divulga en el presente documento. Para identificar los sitios de la región hipervariable candidatos para la modificación, se puede realizar mutagénesis por barrido de alanina para identificar los residuos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión a antígeno. De forma alternativa, o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y la diana. Dichos residuos de contacto y residuos cercanos son candidatos para la sustitución de acuerdo con las técnicas detalladas en el presente documento. Una vez que se generan dichas variantes, el panel de variantes se somete a cribado como se describe en el presente documento y se pueden seleccionar los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos pertinentes para su desarrollo adicional.

Otro tipo de variante de aminoácidos del polipéptido altera el patrón de glucosilación original del anticuerpo. El polipéptido puede comprender restos no aminoacídicos. Por ejemplo, se puede glucosilar el polipéptido. Dicha glucosilación se puede producir de forma natural durante la expresión del polipéptido en la célula huésped u organismo huésped, o puede ser una modificación intencionada surgida de la intervención humana. Por alteración se entiende delecionar uno o más restos glucídicos encontrados en el polipéptido y/o añadir uno o más sitios de glucosilación que no están presentes en el polipéptido.

La glucosilación del polipéptido es típicamente unida a N o bien unida a O. Unido a N se refiere a la fijación del resto glucídico a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la fijación enzimática del resto glucídico a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glucosilación potencial. La glucosilación unida a O se refiere al acoplamiento de uno de los glúcidos N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, lo más comúnmente serina o treonina, aunque también se puede usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glucosilación al polipéptido se consigue convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para sitios de glucosilación unidos a N). La alteración también se puede preparar mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina con respecto a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glucosilación unidos a O).

Se puede conseguir la retirada de los restos glucídicos presentes en el polipéptido química o enzimáticamente o mediante sustitución por mutación de codones que codifican residuos aminoacídicos que sirven como dianas para la glucosilación. Se puede lograr la escisión enzimática de restos glucídicos en polipéptidos mediante el uso de una variedad de endo- y exoglucosidasas.

Otras modificaciones incluyen la desamidación de residuos de glutaminilo y asparaginilo con respecto a los residuos de glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente, la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, la metilación de los grupos a-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina, la acetilación de la amina N terminal y la amidación de cualquier grupo carboxilo C terminal.

(ii) Polipéptidos quiméricos

El polipéptido descrito en el presente documento se puede modificar de manera que forme moléculas quiméricas que comprendan el polipéptido fusionado a otro polipéptido heterólogo o secuencia de aminoácidos. En algunos modos de realización, una molécula quimérica comprende una fusión del polipéptido con un polipéptido de marca que proporciona un epítopo al que se puede unir selectivamente un anticuerpo anti-marca. La marca de epítopo se dispone, en general, en el extremo amínico o carboxílico del polipéptido. La presencia de dichas formas con marca de epítopo del polipéptido se puede detectar usando un anticuerpo frente al polipéptido de marca. Además, la provisión de la marca de epítopo posibilita que el polipéptido se purifique fácilmente mediante purificación por afinidad usando un anticuerpo anti-marca u otro tipo de matriz de afinidad que se una a la marca de epítopo.

En un modo de realización alternativo, la molécula quimérica puede comprender una fusión del polipéptido con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Una forma bivalente de la molécula quimérica se denomina "inmunoadhesina".

Como se usa en el presente documento, el término "inmunoadhesina" indica moléculas similares a anticuerpo que combinan la especificidad de unión de un polipéptido heterólogo con las funciones efectoras de dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de unión deseada, que es deseada que es distinta del sitio de reconocimiento y unión a antígeno de un anticuerpo (es decir, es "heteróloga"), y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La parte de adhesina de una molécula de inmunoadhesina es típicamente una secuencia de aminoácidos contiguos que comprende al menos el sitio de unión de un receptor o un ligando. Se puede obtener la secuencia del dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina a partir de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD o IgM.

Las fusiones con Ig incluyen preferentemente la sustitución de una forma soluble (dominio transmembranario delecionado o inactivado) de un polipéptido en lugar de al menos una región variable dentro de una molécula de Ig. En un modo de realización preferente en particular, la fusión con inmunoglobulina incluye las regiones bisagra, CH<2>y CH<3>, o bisagra, CH<1>, CH<2>y CH<3>de una molécula de IgG1.

(iii) Conjugados de polipéptido

El polipéptido para su uso en formulaciones de polipéptido se puede conjugar con un agente citotóxico, tal como un agente quimioterápico, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma) o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado).

Se pueden usar agentes quimioterápicos útiles en la generación de dichos conjugados. Además, las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que se pueden usar incluyen cadena A de difteria, fragmentos activos que no se unen de la toxina diftérica, cadena A de exotoxina (dePseudomonas aeruginosa),cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteínas deAleurites fordii,proteínas de diantina, proteínas dePhytolaca americana(PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor deMomordica charanda,curcina, crotina, inhibidor deSaponaria officinalis,gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Una variedad de radionúclidos está disponible para la producción de polipéptidos radioconjugados. Los ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y y 186Re. Se preparan conjugados del polipéptido y del agente citotóxico usando una variedad de agentes bifuncionales de acoplamiento de proteínas tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como clorhidrato de adipimidato de dimetilo), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis-(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolueno) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina, como se describe en Vitettaet al., Science238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionúclido al polipéptido.

Los conjugados de un polipéptido y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como calicheamicina, maitansinoides, un tricoteno y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina, también se contemplan en el presente documento.

Los maitansinoides son inhibidores mitóticos que actúan inhibiendo la polimerización de tubulina. La maitansina se aisló por primera vez del arbusto de África orientalMaytenus serrata.Posteriormente, se descubrió que determinados microbios también producen maitansinoides, tales como maitansinol y ésteres C-3 de maitansinol. También se contemplan maitansinol sintético y derivados y análogos del mismo. Existen muchos grupos de enlace conocidos en la técnica para preparar conjugados polipéptido-maitansinoide, incluyendo, por ejemplo, los divulgados en la pat. de e E. UU. n.° 5.208.020. Los grupos de enlace incluyen grupos disulfuro, grupos tioéter, grupos lábiles en ácido, grupos fotolábiles, grupos lábiles en peptidasas o grupos lábiles en esterasas, como se divulgan en las patentes identificadas anteriormente, siendo preferentes los grupos disulfuro y tioéter.

El conector se puede acoplar a la molécula de maitansinoide en diversas posiciones, dependiendo del tipo de enlace. Por ejemplo, se puede formar un enlace éster por reacción con un grupo hidroxilo usando técnicas de acoplamiento convencionales. La reacción se puede producir en la posición C-3 que tiene un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo y la posición C-20 que tiene un grupo hidroxilo. En un modo de realización preferente, el enlace se forma en la posición C-3 de maitansinol o un análogo de maitansinol.

Otro conjugado de interés comprende un polipéptido conjugado con una o más moléculas de calicheamicina. Los antibióticos de la familia de calicheamicina pueden producir roturas en el ADN bicatenario en concentraciones subpicomolares. Para la preparación de conjugados de la familia de calicheamicina, véase, por ejemplo, la pat. de EE. UU. n.° 5.712.374. Los análogos estructurales de calicheamicina que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, Y<1>1, a<2>I, a3I, N-acetil-YA PSAG y 011. Otro fármaco antitumoral con el que se puede conjugar el anticuerpo es QFA, que es un antifolato. Tanto calicheamicina como QFA tienen sitios de acción intracelulares y no atraviesan fácilmente la membrana plasmática. Por lo tanto, la captación celular de estos agentes a través de la internalización mediada por el polipéptido (por ejemplo, anticuerpo) potencia en gran medida sus efectos citotóxicos.

Otros agentes antitumorales que se pueden conjugar con los polipéptidos descritos en el presente documento incluyen BCNU, estreptozoicina, vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocidos conjuntamente como complejo LL-E33288, así como esperamicinas.

En algunos modos de realización, el polipéptido puede ser un conjugado entre un polipéptido y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo, una ribonucleasa o una ADN endonucleasa, tal como una desoxirribonucleasa, DNasa).

Aún en otro modo de realización, el polipéptido (por ejemplo, anticuerpo) se puede conjugar con un "receptor" (tal como estreptavidina) para utilizarse en la preselección de un tumor, en el que el conjugado polipéptido-receptor se administra al paciente, seguido de la retirada del conjugado no unido de la circulación usando un agente de aclaramiento y, a continuación, la administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que se conjuga con un agente citotóxico (por ejemplo, un radionúclido).

En algunos modos de realización, el polipéptido se puede conjugar con una enzima activadora de profármacos que convierte un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterápico peptidílico) en un fármaco antineoplásico activo. El componente enzimático del inmunoconjugado incluye cualquier enzima que pueda actuar sobre un profármaco de tal manera que lo convierta en su forma citotóxica más activa.

Las enzimas que son útiles incluyen, pero no se limitan a, fosfatasa alcalina, útil para convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasa, útil para convertir profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citosina desaminasa, útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en el antineoplásico 5-fluorouracilo; proteasas, tales como proteasa deSerratia,termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L), que son útiles para convertir profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes de D-aminoácidos; enzimas que escinden glúcidos, tales como p-galactosidasa y neuraminidasa, útiles para convertir profármacos glucosilados en fármacos libres; p-lactamasa, útil para convertir fármacos derivatizados con p-lactamas en fármacos libres; y penicilina amidasas, tales como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, útiles para convertir fármacos derivatizados en sus nitrógenos amínicos con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. De forma alternativa, se pueden usar anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la técnica como "aczimas", para convertir los profármacos en fármacos activos libres.

(iv) Otros

Otro tipo de modificación covalente del polipéptido comprende enlazar el polipéptido a uno de una variedad de polímeros no proteínicos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxialquilenos o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol. El polipéptido también se puede atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización en interfase (por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente), en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se divulgan en Remington's PharmaceuticalSciences,18.a edición, Gennaro, A.R., Ed., (1990).

IV. Obtención de polipéptidos para su uso en las formulaciones y procedimientos

Los polipéptidos usados en los procedimientos de análisis descritos en el presente documento se pueden obtener usando procedimientos bien conocidos en la técnica, incluyendo los procedimientos de recombinación. Las siguientes secciones proporcionan directrices sobre estos procedimientos.

(A) Polinucleótidos

"Polinucleótido" o "ácido nucleico", como se usa de manera intercambiable en el presente documento, se refiere a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud e incluyen ADN y ARN.

Se pueden obtener polinucleótidos que codifican polipéptidos de cualquier fuente incluyendo, pero sin limitarse a, una colección de ADNc preparada a partir de tejido que se cree que posee el ARNm del polipéptido y lo expresa a un nivel detectable. En consecuencia, se pueden obtener convenientemente polinucleótidos que codifican polipéptidos de una colección de ADNc preparada a partir de tejido humano. También se puede obtener el gen que codifica el polipéptido a partir de una colección genómica o por procedimientos sintéticos conocidos (por ejemplo, síntesis de ácidos nucleicos automatizada).

Por ejemplo, el polinucleótido puede codificar toda una cadena de molécula de inmunoglobulina, tal como una cadena ligera o una cadena pesada. Una cadena pesada completa no solo incluye una región variable de cadena pesada (V<h>), sino también una región constante de cadena pesada (C<h>), que típicamente comprenderá tres dominios constantes: C<h>1, C<h>2 y C<h>3 y una región "bisagra". En algunas situaciones, es deseable la presencia de una región constante.

Otros polipéptidos que se pueden codificar por el polinucleótido incluyen fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno, tales como anticuerpos de dominio único ("dAb"), Fv, scFv, Fab' y F(ab')2 y "minicuerpos". Los minicuerpos son (típicamente) fragmentos de anticuerpo bivalente a partir de los que se ha escindido el dominio C<h>1 y C<k>o C<l>. Como los minicuerpos son más pequeños que los anticuerpos convencionales, deberían lograr una mejor penetración en el tejido en el uso clínico/diagnóstico, aunque al ser bivalentes deberían retener una afinidad de unión mayor que los fragmentos de anticuerpo monovalentes, tales como dAb. En consecuencia, a menos que el contexto lo indique de otro modo, el término “anticuerpo” como se usa en el presente documento no solo engloba moléculas de anticuerpo entero, sino también fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno del tipo analizado anteriormente. Preferentemente, cada región estructural presente en el polipéptido codificado comprenderá al menos una sustitución aminoacídica con respecto a la región estructural aceptadora humana correspondiente. Por tanto, por ejemplo, las regiones estructurales pueden comprender, en total, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o quince sustituciones aminoacídicas con respecto a las regiones estructurales aceptadoras.

Ejemplos

Los ejemplos a continuación pretenden ser puramente ejemplares de aplicaciones potenciales de la invención y, por lo tanto, no se debe considerar que limitan la invención de ningún modo. Los siguientes ejemplos y descripción detallada se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación, y solo se consideran parte de la invención cuando la materia objeto a la que se hace referencia en dichos ejemplos y pasos de descripción está dentro del alcance de las reivindicaciones.

Materiales y procedimientos para los ejemplos

Se usaron los siguientes materiales y procedimientos para los ejemplos, a menos que se señale de otro modo.

Materiales

Todos los mAb (A1-A20) se fabricaron usando líneas de células de ovario de hámster chino (CHO) o células deEscherichia coliestables.

Se adquirieron cartuchos Waters Oasis® MAX (2,1 x 20 mm, tamaño de partícula de 30 |jm, PN# 186002052) y cartuchos Waters Oasis® MCX (2,1 x 20 mm, tamaño de partícula de 30 jm , PN# 186002051) de Waters. El polisorbato 20 se obtuvo de Sigma (P/N T2700-100ML). El ácido fórmico se obtuvo de Fluka (P/N 94318-250ML-F). El ácido acético glacial de calidad HPLC se obtuvo de JT Baker (P/N 9515-03). El isopropanol de calidad HPLC (P/N PX1834-1) y el metanol (P/N MX0488-1) se obtuvieron de OmniSolv. El agua de calidad HPLC se obtuvo de HoneyWell (n.° cat. 365-4). La solución de amoníaco al 27-31%se obtuvo de Spectrum Chemicals (P/N AM180).

Ejemplo 1. Optimización

Se necesita una solución más consistente para eliminar la interferencia de proteína y proporcionar una cuantificación consecuente de PS20 en todas las partidas de cartuchos de HPLC. Como punto de partida se usó una formulación de conjugado fármaco-anticuerpo (CAF) para evaluar la eficacia de las modificaciones de los procedimientos previos antes de evaluar otras moléculas con los procedimientos de la presente invención. Los objetivos de los experimentos fueron desarrollar un ensayo de PS para permitir una cuantificación consistente del PS20 en múltiples formulaciones de productos minimizando o retirando por completo la interferencia de las proteínas, para demostrar que el ensayo de la invención mejora la precisión y la reproducibilidad de la cuantificación de PS20 en comparación con ensayos previos, incluyendo la consistencia entre múltiples partidas de cartuchos, y realizar estudios de cualificación para evaluar la exactitud, precisión, especificidad, repetibilidad y precisión intermedia de PS20 en formulaciones de productos seleccionadas.

Procedimientos

Se usaron las siguientes configuraciones de ELSD para todos los experimentos:

La intensidad de la fuente de luz (LED) se configuró en un 75 %

La ganancia del detector (PMT) se configuró en 1

En el ensayo de HPLC, los ésteres de PS20 se retienen en el cartucho mientras que otros excipientes, proteína y especies de PS20 no esterificadas eluyen en las etapas de flujo o lavado. Después de la etapa de lavado, el detector de dispersión de luz por evaporación (ELSD) se coloca en línea usando una válvula de desvío y las especies de polisorbato esterificado eluyen con un gradiente escalonado con un % creciente de fase orgánica. Las especies de PS20 no esterificadas constituyen aproximadamente un 20 % de la composición de PS20 total (Hewitt, D.et al.,2011,J. Chromatography A,1218: 2138-2145). El ensayo de HPLC-ELSD cuantifica solo ésteres de PS20, lo cual es suficiente, siempre que la partida de PS20 usada para la preparación de estándares contenga cantidades similares de ésteres de PS20 en comparación con el PS20 de la muestra. Una composición similar de ésteres PS20 de los estándares se puede garantizar mediante un protocolo de equivalencia (Hewitt, D.et al.,2011,J. Chromatography A,1215:156-160), o haciendo coincidir la partida de PS20 usada para preparar los estándares con la partida usada en la muestra.

Las condiciones de HPLC-ELSD para el procedimiento original, también denominado procedimiento 0, fueron como sigue: HPLC Agilent 1200 y ELSD Varian 380; el cartucho era un cartucho Waters Oasis MAX en línea; la fase móvil A era ácido fórmico al 2 % en agua; la fase móvil B era ácido fórmico al 2 % en isopropanol; el caudal era de 1 ml/min; y el volumen de inyección era de 20 jl. El gradiente usado se muestra en la tabla 2.

Tabla 2: Gradiente del procedimiento 0

El procedimiento final, también denominado procedimiento 1, con las modificaciones con respecto al original en negrita/subrayadas, se resume a continuación. La tabla 3 muestra el gradiente de LC y la tabla 4 muestra una secuencia típica de inyecciones para este ensayo. Las condiciones de HPLC-ELSD fueron como sigue: HPLC Agilent 1200 y ELSD Varian 380; el cartucho era un cartucho Waters Oasis MAX en línea; la fase móvil A era ácido fórmico al 2 % en agua o ácido acético al 2 % en agua; la fase móvil B era ácido fórmico al 2 % en isopropanol o ácido acético al 2 % en metanol; el caudal fue de 1,25 ml/min; y el volumen de inyección fue de 20 |jl (dependiente del intervalo de concentración de PS20). Aunque finalmente se eligió el ácido acético para las condiciones finales, inicialmente se realizó algún trabajo de cualificación y consistencia usando un 2 % de ácido fórmico en la fase móvil.

Tabla 3: Gradiente del procedimiento 1

Tabla 4: Secuencia típica

Optimización del procedimiento

1. Condiciones inicialmente intentadas:

Durante el transcurso del desarrollo del procedimiento 1, se evaluaron diferentes condiciones experimentales antes de seleccionar la fase móvil final a base de metanol, con el objetivo de minimizar el impacto de la interferencia de proteína. Estos experimentos se resumen en la tabla 5.

Tabla 5: Breve visión general de otras soluciones intentadas (ácido fórmico en la fase móvil a menos que se establezca de otro modo)

Experimentos de consistencia del procedimiento

La tabla 6 y la tabla 7 describen los productos y cartuchos usados para probar someter a prueba la consistencia del procedimiento entre múltiples productos.

Tabla 6: Productos sometidos a prueba al comparar la exactitud del procedimiento en nueve cartuchos

Tabla 7: Lotes de sorbente y partidas usadas para someter a prueba la consistencia del procedimiento

1. Consistencia del procedimiento entre cartuchos:

La tabla 8 describe los cartuchos usados para evaluar la consistencia del procedimiento en 12 estándares de referencia (mostrados en la tabla 9) usando dos cartuchos diferentes: uno que proporcionó una especificidad aceptable en el procedimiento 0 y otro que proporcionó una especificidad inaceptable en el procedimiento 0. Los números de cartucho proporcionados en la tabla 8 corresponden a los números proporcionados en la tabla 7.

Tabla 8: Cartuchos usados para ilustrar la consistencia del procedimiento en múltiples productos

Tabla 9: Panel de estándares de referencia (inyecciones de 20 ^l)

Cualificación del procedimiento

Se completó una cualificación del procedimiento evaluando la linealidad, exactitud, precisión (incluyendo precisión intermedia) y especificidad. La tabla 10 describe los instrumentos y cartuchos usados para evaluar la precisión intermedia.

Tabla 10: Condiciones para evaluar la precisión intermedia

RESULTADOS:

Optimización del procedimiento

Experimentos de gradiente multietapa:

Durante la evaluación de diferentes fases móviles, se necesitaba un procedimiento para determinar si el polisorbato se podía separar completamente de los otros constituyentes de una formulación proteica típica. Para realizar este análisis, se realizaron experimentos de gradiente multietapa (FIG. 1). Estos experimentos implicaron equilibrar el cartucho con una fase móvil que consistía en un 2 % de ácido volátil (ya sea ácido fórmico, trifluoroacético o acético) en un 10 % de disolvente orgánico, incrementar la concentración de disolvente orgánico en la fase móvil en etapas de un 5 % y mantener cada concentración durante 1 minuto para simular la etapa de lavado del procedimiento de cuantificación de PS20. Estas etapas de un 5 % se repitieron hasta alcanzar un 98 % de componentes orgánicos en fase móvil (+2 % de ácido volátil). Durante este procedimiento se mantuvo un caudal constante de 1 ml/min. Estos experimentos se realizaron tanto con una muestra de proteína sin PS20 para determinar la composición de la fase móvil que eluyó completamente todos los constituyentes de la formulación distintos de PS20, como con un estándar de PS20 en agua para determinar la composición de la fase móvil que comenzó a eluir especies de ésteres de PS20. Estas dos concentraciones de disolvente orgánico en la fase móvil se compararon para determinar si se podía encontrar una composición de fase móvil óptima que separara completamente los constituyentes de la matriz proteica y los ésteres de polisorbato. Esta composición óptima de fase móvil se usaría durante la etapa de lavado del procedimiento analítico para retirar cualquier proteína que pudiera haber quedado retenida en el cartucho. El gradiente multietapa era deseable con respecto a un gradiente lineal por dos motivos. En primer lugar, un gradiente lineal no simula la etapa de lavado del procedimiento y, en segundo lugar, es difícil determinar la composición discreta de la fase móvil que provoca la elución de cada constituyente durante un gradiente lineal.

Los experimentos de gradiente multietapa revelaron que la concentración óptima de metanol para lavar la proteína del cartucho, pero retener las especies de ésteres de PS20, era de entre un 40 % y un 50 % (FIG. 1 y FIG. 2). Cabe señalar que el 2 % de ácido fórmico todavía estaba en la fase móvil. Se sometieron a prueba ambas etapas de lavado con metanol al 40%y al 50%y ambas eliminaron la interferencia de proteína del CAF A1. El área del pico de PS20 con lavado con metanol al 40 % fue, en promedio, un 38 % mayor (n = 8) que el pico de PS20 con lavado con metanol al 50 %. Por lo tanto, se eligió metanol al 40 % para mejorar la sensibilidad a PS20. El área del pico menor con el lavado al 50 % puede indicar que algunos de los ésteres de PS20 menos hidrófobos eluyeron durante la etapa de lavado de proteína, pero esta posibilidad no se investigó adicionalmente.

La FIG. 1 muestra un ejemplo de una superposición de gradiente escalonado típica (producto sin PS20 y estándar de PS20). Esta superposición ilustra que toda la proteína eluye con metanol al 40 % - 50 % y que los ésteres de PS20 comienzan a eluir con metanol al 50 %. Cabe señalar que la válvula entre el HPLC y el ELSD está en modo desviado durante el primer minuto de la muestra de proteína para evitar la saturación del detector. Los múltiples picos mostrados en el estándar de PS20 se pueden atribuir muy probablemente a las diferentes especies de polisorbato que eluyen del cartucho para incrementar la hidrofobia. No se han caracterizado los diferentes picos de proteína que eluyen en cada cambio de etapa. Esta superposición proporciona una manera rápida de encontrar la concentración óptima de metanol para lavar la proteína del cartucho mientras se retienen los ésteres de PS20.

El experimento de gradiente multietapa se repitió usando isopropanol para comparar la elución de la proteína y las regiones de PS20 con respecto al metanol. La FIG. 2 ilustra los diferentes perfiles de elución multietapa de metanol e isopropanol para CAF A1 sin PS20 y estándar de PS20 en dos cartuchos diferentes. El primer cartucho (trazado 1) había sido evaluado previamente; el primer cartucho funcionó normalmente con el procedimiento 0 (trazado 1); sin embargo, el segundo cartucho no fue óptimo (trazado 2). El experimento de gradiente multietapa con isopropanol mostró que la concentración óptima de isopropanol en la etapa de lavado eta de un 20 %. Esto es consecuente con el procedimiento 0, que usa un lavado con isopropanol al 20 % entre 1 y 3,4 minutos. Sin embargo, la separación de la proteína y los ésteres de PS20 con un lavado con isopropanol no fue consecuente en los diferentes cartuchos e ilustra la variabilidad de la interferencia de proteína entre cartuchos. En determinados cartuchos (por ejemplo, el cartucho usado en la FIG. 2), una porción de la proteína eluyó a la misma concentración de isopropanol que los ésteres de PS20. Este comportamiento indicó que estos cartuchos en particular presentarían una cantidad significativa de interferencia de proteína al cuantificar el PS20 con el procedimiento de isopropanol y este efecto se confirmó experimentalmente.

A diferencia del panel inferior de la FIG. 2, el panel superior demostró que el gradiente multietapa de metanol en diferentes cartuchos eluyó consecuentemente toda la proteína en la etapa de metanol al 40 %, y los ésteres de PS20 comenzaron a eluir con metanol al 50 %, lo que ilustra una ventana de separación más amplia de la región de proteína con respecto a la región de PS20 en comparación con el gradiente escalonado de isopropanol. Este resultado indicó que el uso de un lavado con metanol al 40 % separaría consecuentemente la proteína de los ésteres de PS20 y, por tanto, disminuiría la variabilidad de la cuantificación de PS20 entre cartuchos.

Los experimentos de gradiente multietapa se usaron para evaluar rápidamente la separación de PS20 y proteína en diferentes cartuchos y composiciones de fase móvil (FIG. 1 y FIG. 2).

Este enfoque determinó con éxito las condiciones de lavado para el ensayo de PS20 y se podría usar potencialmente para evaluar la eficacia de una etapa de lavado para la separación de otros analitos usando diferentes cartuchos y fases móviles.

Diseño de experimento:

Se usó un diseño de experimento (DdE) factorial completo de 2 niveles para optimizar el procedimiento de PS20 modificado que contiene ácido fórmico. Los parámetros examinados fueron como sigue:

Concentración de metanol durante la etapa de lavado (40 %, 50 %)

Duración del lavado (1,8 min, 3,0 min)

Caudal (0,75 ml/min, 1,25 ml/min)

Masa de PS20 cargado (4 |jg, 12 |jg)

Cabe señalar que la etapa "Lavado" se refiere a una parte del procedimiento de HPLC donde se mantiene constante la concentración de componentes orgánicos para lavar cualquier proteína residual del cartucho. Además de las permutaciones factoriales completas de 2 niveles, se sometieron a prueba valores intermedios (lavado con 45 % de componentes orgánicos, duración del lavado de 2,4 min, caudal de 1 ml/min, carga de PS20 de 8 jg ) al principio y al final de la secuencia. Este experimento se realizó por separado para tres muestras: PS20 en agua, CAF A<1>sin PS20 y CAF A1 sin PS20 enriquecida con PS20. Para la muestra de CAF A1 sin PS20, no se aplicó el parámetro de carga de PS20.

Los criterios usados para la optimización fueron como sigue:

Minimizar la interferencia de proteína en el tiempo de retención de PS20 (solo para muestra de CAF A1 sin PS20)

Maximizar la resolución entre el pico de proteína y de PS20 (para la muestra de CAF A1 PS20)

Minimizar la anchura del pico de PS20 a una altura de pico del 10 % (muestra de PS20 en agua)

Maximizar el área del pico de PS20 (muestra de PS20 en agua)

Los resultados del DdE mostraron que todas las condiciones sometidas a prueba eliminaron la interferencia de proteína. No se observó interferencia de proteína al inyectar CAF A1 sin PS20.

De forma similar, se descubrió que la resolución entre los picos de proteína y de PS20 era mayor de 3 para todos los casos, donde la resolución se calculó mediante la siguiente ecuación (Ecuación 1):

Ecuación 1: Resolución

R = 1,18

donde t es el tiempo de retención de cada pico y W<50>% es la anchura del pico a una altura del 50 %.

Debido a que no se observó ningún efecto sobre la interferencia de proteína o la resolución en todas las condiciones sometidas a prueba, el área y la anchura del pico de PS20 se optimizaron para la sensibilidad y la conformación del pico. En la FIG. 3 se ilustra un resumen del efecto del caudal, la concentración de metanol de lavado y el tiempo de lavado sobre el área y la anchura del pico de PS20. El incremento del caudal disminuyó la anchura del pico de PS20 y la disminución de la concentración de metanol del 50 % al 40 % en la etapa de lavado incrementó el área del pico de PS20 en un 38 %. Con un lavado con metanol al 50 %, eluyó un pico adicional de PS20 durante la etapa de lavado, con un tiempo de retención posterior al de las especies de PS20 no esterificadas, y se sospecha que este pico adicional se debe a la elución más temprana de los ésteres de PS20 menos hidrófobos. Los hallazgos más relevantes fueron que el área del pico de PS20 disminuye al incrementar la concentración de MeOH en la fase de lavado, y que el incremento del caudal disminuye la anchura del pico.

En la FIG. 4 se ilustra una comparación del lavado con metanol al 40 % y 50 %. Este pico adicional de aproximadamente 1,8-3,5 minutos no estuvo presente con un lavado con metanol al 45 %. Se descubrió que las cargas de PS20 sometidas a prueba no tuvieron efecto en ninguno de los criterios de evaluación. Se eligieron la concentración mínima de metanol de lavado (40 %), el caudal máximo (1,25 ml/min) y el tiempo de lavado de valor intermedio (2,4 min) como los parámetros optimizados para el procedimiento 1. Las condiciones finales elegidas se muestran en la tabla 3.

Experimentos de consistencia del procedimiento

Una vez que se determinó la concentración óptima de metanol de lavado usando los experimentos de gradiente multietapa, se sometió a prueba el procedimiento 1 (ácido fórmico metanol) para detectar mejoras en relación con el procedimiento 0 (ácido fórmico isopropanol).

Consistencia del procedimiento entre productos

Para comparar adicionalmente el impacto de la interferencia de proteína entre el procedimiento 1 (ácido fórmico metanol) y el procedimiento 0 (ácido fórmico isopropanol), se cuantificó el PS20 en 12 estándares de referencia diferentes usando 2 cartuchos. Los cartuchos se eligieron de modo que un cartucho (cartucho 1) se considerara aceptable, proporcionando resultados exactos con el procedimiento 0, y un cartucho (cartucho 5) se considerara inaceptable debido a los altos niveles de interferencia de proteína con el procedimiento 0. El objetivo de este experimento era demostrar en qué medida el procedimiento 1 disminuyó la variabilidad entre cartuchos "aceptables" e "inaceptables" para múltiples productos. Se comparó la coherencia de la cuantificación de PS20 usando cada procedimiento en los cartuchos y los estándares de referencia descritos en los procedimientos de la tabla 8 y la tabla 9, respectivamente.

Los estándares de referencia y sus concentraciones medidas de PS20 para cada procedimiento se enumeran en la tabla 11. No se calculó exactitud de cada procedimiento porque la concentración de PS20 enumerada en el C de A para cada estándar de referencia no se puede tratar como un valor teórico como se hace en el caso de las muestras enriquecidas. Por tanto, no se puede evaluar la exactitud de cada procedimiento para estos estándares de referencia.

Tabla 11: Comparación de procedimientos: Diferencias entre cartuchos en las concentraciones medidas de PS20 para diversos estándares de referencia

* FA = ácido fórmico

** El%de diferencia absoluta en la cuantificación de PS20 para cada procedimiento se calcula mediante la Ecuación 2

Los datos de la tabla 11 muestran que la diferencia en la cuantificación de PS20 entre los dos cartuchos que usan metanol en la fase móvil es consecuentemente inferior al 5 %. Por el contrario, las diferencias en la cuantificación de PS20 cuando se usa isopropanol en la fase móvil muestran un grado mucho mayor de variabilidad entre cartuchos. El procedimiento 0 (ácido fórmico isopropanol) es más sensible a la variación del cartucho. Los datos de la tabla 11 muestran que el uso de ácido fórmico metanol en la fase móvil proporciona una cuantificación de PS20 más consecuente en diferentes cartuchos para todos los productos, independientemente del desempeño del cartucho en el procedimiento 0. El % de diferencia absoluta en la cuantificación de PS20 se calculó usando la Ecuación 2:

Ecuación 2: % de diferencia absoluta en la cuantificación de PS20

| 100*([Concentración del cartucho 5] - [Concentración del cartucho 1]) / [Concentración del cartucho 1] |

Consistencia del procedimiento entre cartuchos

Se compararon el procedimiento 0 y el procedimiento 1 (ácido fórmico metanol) sometiendo a prueba ambas condiciones en nueve cartuchos con cuatro productos. Se enriqueció con PS20 una matriz proteica sin PS20 al 50 % de la concentración de formulación objetivo de cada producto. Este enfoque representó la concentración de PS20 mínima que el ensayo necesitaría cuantificar para cada producto en base al criterio de aceptación del certificado de análisis. Se prepararon estándares y controles enriqueciendo agua con PS20. Para las pruebas se usaron dos sistemas HPLC/e Ls D (Agilent 1200/Agilent 380 y Waters 2695/Varian 380). Los productos y cartuchos sometidos a prueba se describen en detalle en la sección de procedimientos, tabla 6 y tabla 7, respectivamente. Los cartuchos sometidos a prueba se eligieron a propósito para cubrir una amplia gama de partidas, antigüedades y rendimientos históricos.

Se sometieron a prueba una muestra de producto sin PS20 y una muestra enriquecida con PS20 para evaluar la interferencia de proteína con el ensayo de PS20 y la exactitud de la cuantificación de PS20, respectivamente. Las muestras de CAF A1, A2, A3 y A4 se sometieron a prueba en 9 cartuchos tanto con ácido fórmico metanol como con ácido fórmico isopropanol (Procedimiento 0). Las recuperaciones promedio, las desviaciones estándar relativas (DER) y los intervalos en todos los cartuchos usando ambos procedimientos se muestran en la tabla 12.

Tabla 12: Recuperación y % de DER de proteína sin PS20 enriquecida con PS20 en nueve cartuchos Waters Oasis® MAX.

La tabla 12 ilustra que el uso de metanol en la fase móvil mejora la exactitud de la cuantificación de PS20 (las recuperaciones promedio están más cerca del 100 %) y reduce la variabilidad entre cartuchos (los % de DER disminuyen). Estos datos muestran que el uso de metanol en lugar de isopropanol en la fase móvil funciona particularmente bien para la cuantificación de PS20 en formulaciones de c A f A1 y de A2. Las recuperaciones excesivas sesgadas de PS20 en la formulación A4 se pueden deber a una disminución de la proporción de señal con respecto a ruido con solo 1 |jg de PS20 cargado en el cartucho (inyección de 20 jl, concentración de 0,05 mg/ml de PS20). Se usaron cargas incrementadas de PS20 (inyección de 50 j l) durante la cualificación del procedimiento de I+D (ácido fórmico metanol) y no se observó una recuperación excesiva.

Se observó una recuperación excesiva de A3 cuando se usó metanol en la fase móvil; sin embargo, esto aún fue una mejora con respecto a la fase móvil de isopropanol. Se plantea la hipótesis de que el bajo pl de esta molécula, que se debe, en parte, a la incrementada abundancia de grupos de ácido siálico en sus glucanos, provoca la retención de la proteína por atracción electrostática sobre el grupo amino cuaternario cargado positivamente de la fase estacionaria.

Optimización adicional del procedimiento

Selección del ácido de la fase móvil

Los experimentos se realizaron usando gradientes escalonados con la fase móvil a base de metanol y diferentes ácidos orgánicos en la fase móvil para determinar el mejor aditivo para el procedimiento con respecto a la minimización de la interferencia de proteína. Se realizaron experimentos de gradiente escalonado de metanol con CAF A1 sin PS20 y CAF A10 sin PS20 usando ácido fórmico, acético o trifluoroacético con detección por ELSD para monitorizar el impacto del ácido en la elución de la proteína. Se usaron estándares de PS20 en agua para monitorizar la retención de PS20.

La modificación del aditivo de la fase móvil ha permitido comprender cómo se retiene la proteína en el cartucho. Las FIGS. 5, 6 y 7 muestran superposiciones de gradientes multietapa de metanol de CAF sin PS20 y estándares de PS20 con ácido trifluoroacético, ácido fórmico y ácido acético, respectivamente, en la fase móvil. Para todos los aditivos de fase móvil, los ésteres de PS20 comienzan a eluir con metanol al 50 %. La FIG. 5 muestra el CAF A10 sin PS20 y el estándar de PS20 con ácido trifluoroacético en la fase móvil. La elución de proteína se completó con metanol a aproximadamente un 80 %. Por tanto, gran parte de la proteína coeluirá con los ésteres de PS20 e interferirá en la cuantificación de PS20. La FIG. 6 muestra el CAF A1 sin PS20 y el estándar de PS20 con ácido fórmico en la fase móvil. La proteína eluyó completamente con metanol aproximadamente al 40 %, lo que indica que un lavado con metanol al 40 % separaría la proteína del polisorbato. Este resultado fue consecuente con el procedimiento 1 que se había desarrollado. La FIG. 7 muestra el CAF A1 sin PS20 y el estándar de PS20 con ácido acético en la fase móvil. En este caso, la proteína eluyó completamente con metanol al 15 %. Este hallazgo indica que la proteína se podría separar de los ésteres de PS20 mediante cualquier lavado con metanol en el intervalo del 15 % al 50 %. La fuerza de apareamiento iónico de estos aditivos de fase móvil fue como sigue: ácido trifluoroacético > ácido fórmico > ácido acético. Correspondientemente, la proteína se retuvo más fuertemente al incrementar la fuerza del agente de emparejamiento iónico en la fase móvil, como se esperaría si la proteína se uniera por medio de interacciones hidrófobas con la fase estacionaria de fase reversa.

Sin estar ligado a ninguna teoría, el bajo pH de la fase móvil ácida crea una carga neta positiva en la proteína. La interacción de la proteína cargada positivamente con la fase estacionaria Oasis® MAX cargada positivamente debería ser culómbicamente desfavorable, dando lugar a que la fase estacionaria no retuviera la proteína. Por el contrario, el aditivo de fase móvil de emparejamiento iónico puede interactuar con la proteína para hacerla eficazmente más hidrófoba (Xindu, G. y Regnier, FEJournal of ChromatographyA, 296:15-30, 1984). Esta interacción causaría que la proteína se retuviera en el cartucho mediante un mecanismo de interacción hidrófoba con un agente de emparejamiento iónico suficientemente fuerte (por ejemplo, tal como TFA). Reducir la fuerza del agente de apareamiento iónico en la fase móvil reduciría posteriormente la interacción entre la proteína y la fase estacionaria. Como el agente de emparejamiento iónico más débil de los tres sometidos a prueba, el ácido acético en la fase móvil parece reducir significativamente la retención de proteína en el cartucho. Por tanto, como aditivo de la fase móvil, el ácido acético permitió una mejor separación entre la proteína y los ésteres de PS20 que los otros aditivos sometidos a prueba.

La FIG. 8 muestra una comparación del rendimiento del procedimiento analítico entre el ácido acético y el fórmico como aditivos de la fase móvil. Como se muestra en la FIG. 8, se observa un incremento muy pequeño (~3 mV) en la línea base para las inyecciones de proteína en comparación con la inyección de agua con ácido fórmico como aditivo de la fase móvil. Aunque esta interferencia se considera mínima, se observa que una inyección de matriz proteica no incrementa la línea base de ELSD cuando el ácido acético es el aditivo en la fase móvil. Además, se monitorizó la absorbancia a 280 nm con propósitos de diagnóstico para observar la retención y eliminación de proteína. Cuando se usa ácido acético en la fase móvil, la proteína se elimina casi por completo en el volumen en vacío, mientras que la proteína se retiene débilmente en el cartucho cuando se usa ácido fórmico como aditivo y eluye con un tiempo de retención de entre 1 y 2 minutos. Debido a que el flujo de LC se desvía hacia el ELSD a los 2,4 minutos, existe una probabilidad incrementada de que la proteína no se elimine por completo cuando el ácido fórmico es el aditivo, lo que permite una cierta interferencia de proteína.

En la FIG. 9 se muestran cromatogramas representativos usando diferentes cartuchos (consulte la tabla 7 para los detalles específicos de las partidas) de las condiciones de elución de ácido acético metanol. Aunque la conformación del pico del cartucho 1 es típica (trazado 1), estos datos demuestran que los perfiles de picos de PS20 pueden variar entre los diferentes cartuchos. En determinados cartuchos, tal como el cartucho 4 (trazado 2), el pico de PS20 tiende a tener una cola; con el uso adicional de este cartucho, la cola se puede finalmente convertir en desdoblamiento de picos de PS20 (trazado 3). Este comportamiento no ha sido común, ya que los cartuchos 2 (datos no mostrados) y 4 son los únicos cartuchos sometidos a prueba que han presentado desdoblamiento de picos durante el desarrollo del procedimiento. En otros casos, tal como en el cartucho 5 (trazado 4), se observa una ligera cola de pico. Por otra parte, los cartuchos que muestran un incremento de la cola de pico y desdoblamiento de picos con la fase móvil de metanol también están sometidos a niveles incrementados de interferencia de proteína cuando se usa isopropanol en la fase móvil. Este hallazgo puede indicar que los cartuchos que muestran una cola de pico incrementada retienen las moléculas hidrófobas más fuertemente. Independientemente de la conformación del pico, los procedimientos de procesamiento de integración y cuantificación de PS20 no se vieron afectados.

Se implementará un procedimiento 1 final para la cuantificación de PS20 con un 2 % de ácido acético en la fase móvil, ya que se demostró que mejora la separación de la proteína y del PS20 en relación con el ácido fórmico en el cartucho Oasis® MAX (FIG. 9).

Cualificación del procedimiento

Después de utilizar experimentos de gradiente escalonado para optimizar la etapa de lavado y realizar experimentos de consistencia del procedimiento, se descubrió que el uso de un 2 % de ácido acético en lugar de un 2 % de ácido fórmico en la fase móvil mejoraba la separación de la proteína y de los ésteres de PS20. Por lo tanto, este ejemplo describe experimentos de cualificación realizados tanto con una fase móvil de ácido fórmico/metanol (del desarrollo del procedimiento inicial) como con una fase móvil de ácido acético/metanol (procedimiento final).

El procedimiento usado para cualificar el ensayo fue consecuente con el ensayo de HPLC-ELSD en el procedimiento 0, excepto por los siguientes parámetros:

Caudal = 1,25 ml/min

Fase móvil A = ácido fórmico al 2 % en agua O ácido acético al 2 % en agua

Fase móvil B = ácido fórmico al 2 % en metanol O ácido acético al 2 % en metanol

Se usó el gradiente de la tabla 3.

Se ajustó el volumen de inyección dependiendo de la concentración de PS20 en la formulación para dar como resultado cargas similares en el cartucho. Véase la tabla 13.

El estudio de cualificación se realizó con CAF A1 sin PS20, A1 sin PS20, A4 sin PS20, A5 sin PS20 y A11 sin PS20. Se enriqueció cada muestra con una cantidad conocida de PS20 para determinar la exactitud del ensayo. Se evaluó la exactitud, precisión, especificidad, repetibilidad y precisión intermedia del ensayo (consulte la tabla 13 para ver los aditivos usados para cada producto).

Exactitud y precisión:

Se enriquecieron con PS20 (partida MKBL2646V) muestras de proteína sin PS20 con concentraciones conocidas (dependientes del producto; consulte la tabla 13) para determinar la exactitud del ensayo. Este experimento se realizó usando una solución madre de PS20 a alta concentración (25 mg/ml), de modo que se minimizó la dilución de la proteína por enriquecimiento. Para cada concentración, se inyectaron muestras enriquecidas con PS20 por triplicado, a menos que se indique de otro modo. Se usó la recuperación de PS20 para determinar la exactitud de la cuantificación de PS20. Se usó el intervalo de recuperaciones promedio para determinar la precisión. También se determinó la linealidad en el intervalo especificado (Tabla 13). La tabla 13 muestra las concentraciones de PS20 con las que se enriqueció cada producto. Cabe señalar que se usaron 2 intervalos de DNIB0600S para cubrir el peor caso de (es decir, la mínima) concentración de PS20 (0,4 mg/ml) y una concentración mayor (0,7 mg/ml) antes del bloqueo de la formulación de la Fase III. Se usaron dos intervalos separados porque sería necesario modificar la configuración de ELSD para cuantificar con exactitud el PS20 en un intervalo de 0,2 mg/ml a 1 mg/ml de PS20. Para cada intervalo, se modificó el volumen de inyección en lugar de cambiar la configuración del detector. Después del bloqueo de la formulación, se realizó otra evaluación para la formulación final (1,2 mg/ml de PS20) y la concentración de proteína mayor (40 mg/ml) usando un único intervalo.

Tabla 13: Productos evaluados durante la cualificación del procedimiento

* Inyecciones duplicadas a tres concentraciones de PS20

Los estándares para cada conjunto de concentraciones se prepararon a partir de PS20 en agua. Los estándares se inyectaron por duplicado antes de las muestras de proteína. Cada 6 inyecciones del artículo de prueba se agruparon con una muestra de control de PS20 en agua. El control de PS20 se preparó por separado de los estándares (a partir de la partida MKBJ7237V de PS20). Se eligieron concentraciones de estándares para cubrir el intervalo de concentraciones de PS20 con las que se enriqueció cada producto de proteína sin PS20.

Las concentraciones de los controles de PS20 se eligieron en base a las concentraciones de PS20 posibles o reales para la formulación de sustancia farmacéutica de cada producto. La tabla 14 muestra las concentraciones de las muestras de estándar y control de PS20 usadas para el análisis en cada intervalo de concentración.

Tabla 14: Concentraciones de PS20 usadas para la curva estándar y el control de cada producto

La exactitud y precisión del procedimiento 1 se sometieron a prueba para múltiples productos. Unos resultados aceptables de exactitud deberían mostrar que la recuperación promedio a cada concentración enriquecida es del 80 % al 120 %. En la tabla 15 se muestran los resultados para cada producto.

Tabla 15: % de recuperación promedio e intervalo

Como se muestra en la tabla 15, el % de recuperación promedio para todos los productos sometidos a prueba, a todas las concentraciones, cumplió con los criterios de aceptación (80 % - 120 %) y varió de un 82,4 % a un 114,8 %. Por lo tanto, este ensayo demostró una exactitud y precisión aceptables para todos los productos en los intervalos de PS20 sometidos a prueba.

Debido a que los volúmenes de inyección variaron, el intervalo del ensayo también se puede expresar en términos de masa de PS20 (en lugar de concentración de PS20 en la formulación). Estos resultados mostraron que se pueden cargar 1,25 (0,025*|jg/|jl x 50 |jl) - 16 |jg (1,60 |jg/|jl x 10 |jl) de PS20 en el cartucho y cuantificarlos con exactitud.

Linealidad

La linealidad se evaluó determinando el coeficiente de correlación de Pearson (r) >0,99. Estos valores se muestran en la tabla 16 para cada intervalo de concentraciones de PS20.

Tabla 16: Coeficiente de correlación de Pearson en los intervalos de concentración de PS20

Todos los valores del coeficiente de correlación de Pearson fueron >0,99 para los intervalos de PS20 sometidos a prueba. Por lo tanto, la linealidad para este ensayo fue aceptable en múltiples productos.

Especificidad:

La especificidad se determinó para nueve productos confirmando que las inyecciones de tampón de formulación sin PS20 y de producto sin PS20 no contribuirían al pico de PS20. Las inyecciones para el tampón de formulación y la muestra de proteína sin PS20 se realizaron por duplicado. Las áreas de pico en el tampón de formulación sin PS20 y las matrices de proteína sin PS20 se compararon con la respuesta de un estándar al 50 % de la concentración objetivo de PS20 de cada producto. Los criterios de aceptación se cumplen si las áreas de pico en las muestras sin PS20 son <10 % del área de pico en el estándar mínimo. Cuando hubo alguna interferencia de proteína visible en la región de PS20, se usó la siguiente ecuación para derivar una estimación numérica de la especificidad:

Ecuación 3: Cálculo de especificidad

Especificidad = (Área de proteína sin PS20/Área del 50 % de la especificación de PS20)*100

Como se muestra en la FIG. 10 (con CAF A1), ni el tampón de formulación sin PS20 ni la muestra de proteína sin PS20 interfieren con el pico de PS20. Los valores de especificidad para todos los demás productos se proporcionan en la tabla 17. Debido a que se eligió la concentración objetivo de PS20 para el CAF A1 después de los experimentos de cualificación del procedimiento con ácido fórmico, se usó una concentración objetivo de PS20 menor para calcular la especificidad de las muestras (indicada con un asterisco). El uso de una concentración objetivo de PS20 menor dará como resultado un valor de especificidad mayor, pero todos los valores informados siguen estando muy por debajo del 10 %.

Tabla 17: Especificidad

N/A: La inyección de proteína sin PS20 es la misma que la inyección de agua.

Repetibilidad:

Se inyectaron 6 veces muestras que contenían 20 mg/ml de CAF A1 sin PS20 enriquecida con 0,4 mg/ml de PS20 y 150 mg/ml de A14/A15 sin PS20 enriquecida con 0,3 mg/ml de PS20. En la tabla 18 se muestran las áreas de pico de PS20 para estas inyecciones y las concentraciones correspondientes. El % de DER para el área y las concentraciones para las inyecciones repetidas demostraron una repetibilidad de inyección aceptable.

Tabla 18: Repetibilidad de inyección

El % de DER para el área y las concentraciones para las inyecciones repetidas demostraron la repetibilidad del ensayo.

Precisión intermedia:

Se determinó la precisión intermedia (solo ácido fórmico metanol) para tres cartuchos, en dos sistemas de HPLC-ELSD diferentes, con 3 preparaciones de tampón y estándar de PS20 diferentes y por 2 analistas diferentes. En la tabla 19 se informa de la media de 2 inyecciones para cada muestra de cada día. La media y la desviación estándar de todas las inyecciones se informan en la parte inferior de la tabla 19. Las muestras inyectadas fueron de 20 mg/ml de CAF A1 sin PS20 enriquecida con 0,4 mg/ml de PS20, A1 sin PS20 enriquecida con 0,1 mg/ml de PS20 y A4 sin PS20 enriquecida con 0,1 mg/ml de PS20. Las condiciones para cada día se muestran en la tabla 10, en la sección de procedimientos. La precisión intermedia se determinó usando ácido fórmico antes de finalizar el ácido acético como modificador para el procedimiento 1. La determinación de la precisión intermedia no se repitió con ácido acético en la fase móvil, ya que todos los demás parámetros de la cualificación fueron comparables entre los dos modificadores y porque la preparación de la muestra fue idéntica para ambas condiciones.

El % de DER para las tres muestras durante los 3 días en los que se sometió a prueba la precisión intermedia fue inferior a un 10 %. Estos resultados muestran que el ensayo fue consecuente para diversos cartuchos, preparaciones de muestras, sistemas de HPLC-ELSD y analistas. Se observó una tendencia ligeramente menor para las concentraciones del día 2.

Tabla 19: Precisión intermedia (todos los experimentos realizados con ácido fórmico)

CONCLUSIONES:

Durante el desarrollo de la nueva versión del procedimiento, se prepararon las siguientes modificaciones al ensayo de ELSD del procedimiento 0:

La fase móvil B cambió de isopropanol a metanol

El aditivo cambió de ácido fórmico al 2 % a ácido acético al 2 %

La concentración de componentes orgánicos en la etapa de lavado de 1-3,4 minutos cambió del 20 % al 40 % de la fase móvil B

El caudal cambió de 1,00 ml/min a 1,25 ml/min

Conjuntamente, estas modificaciones redujeron significativamente tanto la interferencia de proteína como la variabilidad del rendimiento entre cartuchos. El cambio de componente orgánico en la fase móvil B de isopropanol a metanol (FIG. 2) mejoró la separación de proteína y PS20 en comparación con las condiciones previas. Los resultados de ambos experimentos de comparación de metanol/FA e isopropanol/FA (Tabla 11 y tabla 12) mostraron que el procedimiento 1 mejoró significativamente la cuantificación de PS20 y la reproducibilidad entre cartuchos. Reemplazar el ácido fórmico por ácido acético (FIG. 8) como aditivo de la fase móvil redujo adicionalmente la retención de proteína en el cartucho. Además, cambiar la etapa de lavado del 20 % al 40 % de componentes orgánicos minimizó significativamente la interferencia de proteína.

Los resultados de la cualificación de este ensayo modificado para múltiples productos mostraron que este ensayo era adecuado para cuantificar PS20 en una variedad de formatos de moléculas, concentraciones de proteína y concentraciones de PS20, indicando por tanto que el procedimiento 1 es un candidato para un ensayo de cuantificación de PS20 de plataforma.

Ejemplo 2. Desarrollo de un procedimiento de cuantificación de polisorbato 20 por HPLC-ELSD para formulaciones que contienen N-acetiltriptófano

Durante el transcurso de la evaluación del procedimiento de PS20 descrito anteriormente (Procedimiento 1), se descubrió que el N-acetiltriptófano (NAT) interfiere significativamente con el polisorbato 20 (PS20) cuando está presente como excipiente adicional en la formulación. Aunque el procedimiento 1 del ejemplo 1 mostró una interferencia de proteína minimizada, así como una variabilidad disminuida entre cartuchos para la mayoría de las formulaciones que se han sometido a prueba, el N-acetiltriptófano se retuvo en el cartucho bajo las condiciones de este procedimiento y eluyó con el mismo tiempo de retención que el PS20. Sin estar ligado a ninguna teoría, el NAT puede quedar retenido en el cartucho debido a la presencia de un grupo carboxilato en la molécula que interactúa con el cartucho de resina de intercambio aniónico de modo mixto (MAX) usado en el procedimiento 1.

Como se describe a continuación, el procedimiento 1 se modificó para eliminar la interferencia de NAT:

1) cambiando el cartucho de la resina MAX a una resina de intercambio catiónico de modo mixto (MCX) 2) cambiando el aditivo de la fase móvil de ácido acético a hidróxido de amonio

Adicionalmente, se realizó una optimización adicional del procedimiento, también denominado procedimiento 2, incrementando el porcentaje de componentes orgánicos de lavado del 40 % B al 45 % B e incrementando el tiempo de la etapa de lavado y el tiempo de la etapa de elución en 1 minuto y 2 minutos, respectivamente. En este ejemplo se describe el desarrollo de las condiciones para permitir la cuantificación de PS20 para proyectos formulados con NAT. Las nuevas condiciones se evaluaron usando tres productos que contenían NAT en la formulación, evaluando el procedimiento 2 en cuanto a exactitud, precisión, linealidad, especificidad, repetibilidad y consistencia.

Ensayos de LC-ELSD previos que usaban el cartucho MAX observaron una mayor interferencia de proteína con moléculas de pl bajo. Por lo tanto, se realizó una evaluación de moléculas de pl bajo tanto en el procedimiento 1 como en el procedimiento 2 para determinar qué procedimiento es más adecuado para la cuantificación correcta de PS20.

MATERIALES

Sistema de HPLC/ELSD: por ejemplo, HPLC Agilent 1200 - ELSD Varian 380

Polisorbato 20: Sigma, P/N: T2700-100ML

Ácido acético glacial de calidad HPLC: JT Baker

Solución fuerte de amoníaco, 27-31 %: Spectrum Chemicals

Agua de calidad HPLC: HoneyWell

Metanol de calidad HPLC: OmniSolv

Cartucho Waters Oasis® MAX 2,1 x 20 mm, tamaño de partícula de 30 |jm

Cartucho Waters Oasis® MCX 2,1 x 20 mm, tamaño de partícula de 30 jm (Tabla 20)

Productos que contienen NAT (Tabla 21)

Tabla 20: Cartuchos MCX usados durante el desarrollo del procedimiento 2

Tabla 21: Información del producto

Procedimientos:

La intensidad de la fuente de luz (LED) de ELSD se configuró en un 75%y la ganancia del detector (PMT) se configuró en 1 para todos los experimentos. Un resumen de las modificaciones finales del procedimiento para hacer que el ensayo sea compatible con formulaciones que contienen NAT es como sigue:

HPLC Agilent 1200 (o equivalente) y ELSD Varian 380 (o equivalente)

Cartucho: Cartucho Waters Oasis® MCX en línea

Fase móvil A: 1,5 % de hidróxido de amonio en agua

Fase móvil B: 1,5 % de hidróxido de amonio en metanol

Caudal: 1,40 ml/min

Programación de la válvula de desvío: Flujo a ELSD a los 4:00 min.

Volumen de inyección: 25 |jl* (*depende del producto)

Tabla 22: Gradiente del procedimiento de PS20 modificado (Procedimiento 2)

Resultados:

Determinación de la interferencia

El objetivo inicial del desarrollo del procedimiento fue determinar si el NAT era la fuente de la interferencia observada en ensayos previos. Este trabajo se llevó a cabo estudiando una serie de tampones que contenían NAT o lo excluían (los detalles de los tampones se proporcionan en la sección Materiales (Tabla 21) y en la sección Resultados (Tabla 23)).

Inicialmente se evaluaron un tampón de formulación A16/A17 sin PS20 (histidina-HCl 20 mM, NAT 1 mM, metionina 5 mM, sacarosa 240 mM, pH 5,5) y A16/A17 sin PS20 a la concentración objetivo (nominal = 80 mg/ml) usando el procedimiento 1 del ejemplo 1. A continuación se proporciona la composición de cada muestra:

Tampón de formulación sin PS20: histidina-HCl 20 mM, NAT 1 mM, metionina 5 mM, sacarosa 240 mM, pH 5,5. Muestra de A16/A17 sin PS20: 80 mg/ml (nominal) en histidina-HCl 20 mM, NAT 1 mM, metionina 5 mM, sacarosa 240 mM, pH 5,5.

La FIG. 11A muestra los resultados de ELSD de esta evaluación, en la que se observó una interferencia significativa en el ELSD en el tiempo de retención de PS20 (~4,5 minutos) para ambas muestras. Se muestran las inyecciones de agua (trazado 1), tampón de formulación sin PS20 (trazado 2) y muestra de proteína sin PS20 (trazado 3). Adicionalmente, la FIG. 11b muestra la señal UV (280 nm) para cada muestra, donde se detecta un componente en el tiempo de retención aproximado de PS20. Debido a que la magnitud de la interferencia observada cuando se inyectó la formulación sin PS20 fue aproximadamente la misma que la de la muestra de proteína, era evidente que la fuente de no podía ser únicamente la proteína y eso dio lugar a la hipótesis de que había un excipiente en el tampón que estaba siendo retenido por el cartucho.

Los autores determinaron que el n-acetiltriptófano (NAT) era el interferente observado en las FIGS. 11A y 11B por los siguientes motivos: 1) las formulaciones que contienen NAT no se habían sometido a prueba previamente con el procedimiento 1, por lo tanto, esto destacó como una diferencia clave con respecto a evaluaciones previas; 2) el NAT tiene un pKa aparente de 4,1 y posee un grupo carboxilato que podría hacer que quede retenido en la resina catiónica de amonio del cartucho MAX en su forma aniónica desprotonada; y 3) el máximo de absorbancia de NAT está cerca de 280 nm (H. Edelhoch,Biochemistry,vol. 6, núm. 7, julio de 1967), y se observó absorbancia a 280 nm en el tiempo de retención de PS20 (~4,3 minutos) con muestras de formulación NAT (FIG. 11B).

Para confirmar que el NAT estaba interfiriendo con el PS20, como se describe anteriormente, se sometieron a prueba una serie de tampones de formulación A16/A17, con o sin NAT. Las FIGS. 12A y 12B muestran los resultados de HPLC-ELSD de esta evaluación con tampones que contienen NAT mostrados en la FIG. 12A y aquellos sin NAT mostrados en la FIG. 12B. Cada tampón que contiene NAT en la FIG. 12A también presenta un pico en el tiempo de retención de PS20. Por el contrario, ninguno de los tampones en los que se excluyó el NAT mostró un pico de interferencia. En conjunto, los datos mostrados en las FIGS. 11A, 11B, 12A y 12B indican que el NAT quedó retenido en el cartucho Oasis® MAX, y coeluyó con PS20, en lugar de que la interferencia fuera causada por proteína u otros excipientes.

Tabla 23: Tampones sometidos a prueba con el procedimiento 1 y el procedimiento 2

El NAT contiene un grupo carboxilato y puede quedar retenido por medio de intercambio aniónico en la resina que se encuentra en el cartucho. Los autores exploraron el uso de un cartucho Oasis® alternativo (Oasis® MCX) para separar mejor el NAT del PS20. A diferencia del cartucho Oasis® MAX, que contiene una resina catiónica basada en amonio, el cartucho Oasis® MCX contiene una resina aniónica de sulfito. Inicialmente, se evaluó el cartucho MCX usando la misma fase móvil (metanol ácido acético) usada en el procedimiento 1. Sin embargo, en estas condiciones, se encontró que la interferencia de proteína se elevaba hasta niveles inaceptables (datos no mostrados). El procedimiento de extracción de muestras Oasis® de Waters recomienda el uso de hidróxido de amonio como aditivo de la fase móvil en procedimientos de extracción en fase sólida en el formato de placa de la resina MCX (Waters, "Oasis Sample Extraction Products”, 2011). Por lo tanto, se modificó la fase móvil reemplazando el 2 % de ácido acético por un 1,5 % de hidróxido de amonio para imitar mejor las condiciones recomendadas por el fabricante. Con estas modificaciones del procedimiento, se evaluaron los diferentes derivados de los tampones A16/A17 usando el cartucho MCX y los datos se muestran en las FIGS. 13A y 13B.

A diferencia de los resultados obtenidos con el procedimiento 1, no se observó interferencia en el tiempo de retención de PS20, con o sin NAT, y todos los excipientes eluyeron del cartucho antes de 1 minuto (FIGS. 13A y 13B). Adicionalmente, no se observó interferencia en la región del PS20 en ELSD cuando se inyectaron 50 |jl de proteína A16/A17 sin PS20 (FIG. 13A, trazado 4), lo que indica que el procedimiento tiene el potencial de separar la proteína del PS20. El cartucho MCX, junto con el hidróxido de amonio como aditivo de la fase móvil, se seleccionó para su uso para evaluar la cuantificación de PS20 para formulaciones que contienen NAT.

Modificación del procedimiento

Una vez que se establecieron las condiciones preliminares para analizar las formulaciones que contienen NAT, como se describe anteriormente, se examinaron con más detalle los siguientes parámetros:

% de hidróxido de amonio en la fase móvil

% de B usado en la etapa de lavado (se sometió a prueba de 20 a 60 % de B)

Tiempo de lavado (2,4 min y 3,4 min) y volúmenes de inyección (volúmenes de inyección de 25 y 50 jl)

Caudal (de 0,8 ml/min a 1,6 ml/min)

Tiempo de elución (1,1 min, 3,1 min)

% de hidróxido de amonio en la fase móvil

El procedimiento de extracción de muestras Oasis® de Waters recomienda el uso de hidróxido de amonio como aditivo de la fase móvil en procedimientos de extracción en fase sólida en el formato de placa de la resina MCX (Waters, "Oasis Sample Extraction Products”, 2011). El experimento se realizó con detección tanto por ELSD (FIG.

14A) como por UV (FIG. 14B). La proteína A16/A17 sin PS20 fue la muestra usada para evaluar la elución tanto de proteína como de NAT del cartucho usando un 0,15, 0,29, 0,73 o 1,5 % de hidróxido de amonio en la fase móvil (FIGS. 14A y 14B, trazados 1,2, 3 y 4, respectivamente). Dado que el detector UV está en línea antes de la válvula de desvío, se pueden detectar analitos con un cromóforo (por ejemplo, NAT y proteína) que eluyan antes que PS20. Para evaluar la capacidad de eliminar NAT, también se inyectó tampón de formulación sin PS20 A16/A17 (FIGS. 14A y 14B, trazado 5).

Cuando se introdujo el efluente del cartucho en el ELSD a los 2,4 minutos mediante conmutación de la válvula de desvío, se observó una ligera interferencia con un 0,15 % de hidróxido de amonio (FIG. 14A, trazado 1) en la fase móvil, como lo prueba la línea de base ligeramente más alta; el trazado UV también muestra que la proteína y/o NAT eluyeron en su mayor parte del cartucho antes de que se introdujera el efluente en el ELSD. La mayoría de estos posibles interferentes eluyeron en el volumen en vacío. A medida que se incrementó el porcentaje de aditivo de hidróxido de amonio (de un 0,29 a un 1,5 %), hubo una diferencia mínima en el grado de interferencia de proteína o NAT observada por ELSD (FIG. 14A, trazados 2-4). Adicionalmente, el trazado UV muestra que el procedimiento eliminó suficientemente la proteína y el NAT en todos los niveles de hidróxido de amonio sometidos a prueba (FIG. 14B, trazados 2-4). Cuando se inyectó proteína sin PS20 con un 1,5 % de hidróxido de amonio en la fase móvil (FIG. 14A, trazado 4), pareció haber menos interferencia de proteína si el efluente se introdujo a los 2,4 minutos en la región de PS20 (4,0-5,5 minutos), en comparación con la misma proteína inyectada con porcentajes menores de hidróxido de amonio. El trazado UV del tampón de formulación sin PS20 (FIG. 14B trazado 5) muestra que NAT se elimina eficazmente con un 1,5 % de hidróxido de amonio en la fase móvil. Por lo tanto, se seleccionó este porcentaje de aditivo para su uso en el procedimiento.

La absorbancia a 280 nm (FIG. 14B) muestra que la proteína y el NAT se eliminaron suficientemente cuando se usó un 0,15-1,5 % de hidróxido de amonio en la fase móvil con algunas colas de estos interferentes presentes a ~2,5 min. Debido a este hallazgo, se cambió el procedimiento de metanol hidróxido de amonio para desviar el flujo al ELSD a los 3,0 min, en lugar de a los 2,4 min, para evitar que el detector se contaminara y garantizar una interferencia mínima de proteína y de NAT en el ELSD. Dado que la elución del PS20 se produce a aproximadamente 4,5 minutos, este cambio no debería afectar a ese pico.

% de B usado en la etapa de lavado (se sometió a prueba de 20 a 60 %)

Previamente, para el desarrollo del procedimiento 1 en formulaciones sin NAT, se optimizó el % de metanol usado durante la etapa de lavado para separar la proteína del PS20 usando un enfoque de gradiente escalonado. El % de metanol usado en el desarrollo del procedimiento 2 se reconsideró debido al impacto desconocido sobre la retención de proteína de varios cambios clave en el procedimiento; se cambió la fase estacionaria a una resina MCX y se modificó el aditivo de la fase móvil a hidróxido de amonio. En este experimento, se sometieron a prueba cuatro niveles diferentes de % de B en incrementos del 10 % (v/v) (metanol hidróxido de amonio al 1,5 %) en un intervalo de concentraciones del 20 al 60 %. Se usaron tanto detección ELSD como UV para monitorizar la elución de proteína en cada condición sometida a prueba. Para la evaluación se usó una muestra A16/A17 sin polisorbato, y los datos de ELSD y UV se muestran en la FIG. 15A y 15B, respectivamente.

En la FIG. 15B, el cromatograma de absorbancia a 280 nm presenta un pico bien definido en el tiempo de retención de PS2- (~4,5 minutos), lo que sugiere que hubo retención de proteína y/o NAT en el cartucho con un lavado con 20 % de B (trazado 1) cuando se inyectaron 15 |jl de proteína A16/A17 sin PS20. También se observó un pico mucho mayor en el volumen en vacío, que probablemente sea una mezcla de proteína y NAT. También se detectó un pico bien definido en ELSD como interferencia en la región de PS20 (FIG. 15A) para esta misma condición. Cuando el % de B para la etapa de lavado se incrementó al 30 %, se mejoró la eliminación del NAT y de la proteína (trazado 2), como lo prueba la disminución del pico en la región de PS20 tanto en el trazado de UV como en el de ELSD. El NAT y la proteína se eliminaron más eficazmente con 40 % de B; sin embargo, todavía había una ligera interferencia presente en la región de PS20 en ELSD (FIG. 15A). El NAT y la proteína se eliminaron lo más eficazmente con un lavado con 50 y 60 % de B (trazados 4 y 5, respectivamente), con una mínima interferencia presente. Se seleccionó un 45 % de B en la etapa de lavado para su uso en el procedimiento. Durante el desarrollo previo del procedimiento 1, los autores también habían sometido a prueba hasta un 50 % de metanol como condición de lavado, pero se observó que una pequeña porción del PS20 eluiría antes en estas condiciones (este pequeño pico no se observó con un 45 % de metanol). Estos picos pueden haber sido los ésteres de longitud de cadena más corta, que son menos hidrófobos, y eran indicativos de que la condición de 50 % de metanol era aproximadamente el punto en el que eluirían las especies esterificadas. Debido a esta observación previa, y al resultado actual que muestra que el 40 % de B era suficiente para eliminar la proteína, los autores decidieron usar la condición del 45 % de B para la etapa de lavado para lograr un equilibrio entre una eliminación consistente de proteína y la retención del PS20. Además, los datos de UV en la FIG. 15B muestran que la proteína eluyó ligeramente antes en la condición de lavado con 50 % de B.Tiempo de lavado (2,4 min y 3,4 min) y volúmenes de inyección (volúmenes de inyección de 25 y 50 yl)

Para minimizar adicionalmente la interferencia en la región de PS20, se evaluaron etapas de lavado de 2,4 minutos y 3,4 minutos. Como se muestra en la FIG. 16, la región de PS20 es similar con los lavados de 2,4 o 3,4 minutos (trazado 3 y trazado 2, respectivamente). Debido a que la especificidad mejoró ligeramente y a que no hubo impactos negativos aparentes con el tiempo de lavado más largo, se seleccionó un lavado de 3,4 minutos para su uso en el procedimiento. Adicionalmente, se seleccionó que el caudal se desviara al ELSD a los 4,0 minutos en lugar de a los 2,4 minutos.

También se evaluó el impacto del volumen de inyección en la línea base disminuyendo el volumen de muestra de 50 |jl a 25 |jl (FIG. 16, trazado 2 y trazado 1, respectivamente). La línea base del trazado de la inyección de 25 |jl parece ligeramente más limpia, algo que era de esperar ya que hay menos proteína y excipientes que eliminar del cartucho. En última instancia, el volumen de inyección no impactó significativamente en el rendimiento con respecto a la especificidad.

Caudal (de 0,8 ml/min a 1,6 ml/min)

Se evaluó el caudal para garantizar que la proteína y el NAT se eliminaran eficazmente. El caudal se varió entre 0,8 y 1,6 ml/min. Las FIGS. 17A y 17B muestran inyecciones de muestra de 25 jil de proteína A18/A19 sin PS20 a 150 mg/ml usando caudales de 1,60, 1,40, 1,25, 1,00 y 0,80 ml/min (trazados 1,2, 3, 4 y 5, respectivamente).

Al caudal más lento, 0,8 ml/min (trazado 5), todavía había proteína y excipientes eluyendo en la región de PS20, como lo indica el pico en ELSD (FIG. 17A). La trazado UV (FIG. 17B) de esta condición también presentó un incremento de los interferentes que eluyen más tarde que con los caudales mayores. Cuando se incrementó el caudal a 1,00 ml/min (trazado 4), la interferencia disminuyó y se volvió casi insignificante una vez que se incrementó el caudal a 1,25 ml/min (trazado 3). Cuando se incrementó el caudal a 1,40 y 1,60 ml/min (trazados 2 y 1, respectivamente), el trazado UV muestra que la mayor parte de la proteína y los excipientes eluyeron del cartucho en 2,0 minutos de manera más completa que con los caudales menores, y se seleccionó un caudal de 1,40 ml/min para su uso en el procedimiento. Los autores no lo incrementaron a 1,6 ml/min porque el rendimiento era casi equivalente a 1,4 ml/min y porque querían minimizar el riesgo de fugas debidas a la mayor contrapresión a 1,6 ml/min.

Tiempo de elución (1,1 min, 3,1 min)

La etapa de elución al 100 % de B en el procedimiento 1 se mantuvo durante 1,1 minutos. En cada inyección se observó que hay un pico de identidad desconocida que eluye a ~6,5 minutos, independientemente de la muestra e incluyendo los blancos de agua. El pico desconocido parece eluir después de que el % de B en la fase móvil vuelva a las condiciones de reequilibrado. Para someter a prueba si el pico se podría separar mejor de PS20, se amplió el tiempo de elución. La FIG. 18 ilustra la integración del pico de PS20, que comienza a ~5,2 minutos y finaliza aproximadamente cuando comienza este pico desconocido (trazado 2). Aunque esto no afectó significativamente a la cuantificación, para evitar una interferencia potencial de este pico en el futuro, la etapa de elución se incrementó a un tiempo de mantenimiento de 3,1 minutos (trazado 1), lo que permitió una mejor separación e integración de la región de PS20. La FIG. 19 ilustra los resultados para agua, 150 mg/ml de A18/A19 sin PS20, agua enriquecida con 0,2 mg/ml de PS20 y A18/A19 enriquecida con 0,2 mg/ml de PS20 (trazados 1, 2, 3 y 4, respectivamente) usando el procedimiento 2 con los parámetros finales.

Experimentos de cualificación del procedimiento

Especificidad

Se determinó la especificidad confirmando que las inyecciones de tampón de formulación sin PS20 y producto sin PS20 no contribuyen a ningún pico que pueda interferir en la región de PS20; estos se compararon con el estándar de calibración de PS20 mínimo, que típicamente es el 50 % de la concentración objetivo de PS20.

En las FIGS. 20A-20F se muestran cromatogramas típicos de tampón de formulación sin PS20, proteína sin PS20 y agua enriquecida con 0,1 mg/ml de PS20 (50 % del objetivo). Se evaluaron tres productos sin PS20 diferentes. A18/A19 (FIGS. 20A y 20B), A16/A17 (FIGS. 20C y 20D) y A14/A20 (FIGS. 20E y 20F) tienen concentraciones de proteína de 150, 80 y 150 mg/ml, respectivamente. En la tabla 21 se proporcionan más detalles sobre estos productos. Visualmente, todos los productos tuvieron alguna interferencia en la región de PS20 en ELSD cuando se inyectó la muestra de proteína sin PS20 (FIGS. 20A, 20C y 20E, trazado 2). Sin embargo, el tampón de formulación sin PS20 no mostró interferencia visual en la región de PS20 (FIGS. 20A, 20C y 20E, trazado 1), lo que indica que la interferencia procedía principalmente de la proteína.

Los criterios de aceptación del procedimiento se cumplen si las áreas de pico en las muestras sin PS20 son <10 % del área de pico en el estándar mínimo. Debido a que hubo cierta interferencia de proteína visible en la región de PS20, la especificidad se debe determinar mediante una ecuación. Para determinar la especificidad se usan diferentes enfoques. Para este estudio, se usó la siguiente ecuación para derivar una estimación numérica de la especificidad:

Ecuación 1: Especificidad

Interferencia (%) = (Área de proteína sin PS20/Área del 50%de la especificación de PS20)*100

Usando esta ecuación, se calculó el % de interferencia para los tres productos (Tabla 24). Se determinó que A16/A17 sin PS20 (80 mg/ml) (FIG. 20C) tenía una especificidad del 7 % en comparación con 0,1 mg/ml de PS20 en agua (50 % del objetivo). A18/A19 sin PS20 (150 mg/ml) (FIG. 20A) tuvo solo un 4 % de interferencia, mientras que A14/A20 (150 mg/ml) (FIG. 20E) tuvo una interferencia del 13 % en comparación con 0,1 mg/ml de PS20 en agua (50 % del objetivo).

Los trazados de UV a 280 nm (FIGS. 20B, 20D y 20F) para todos los productos muestran que la proteína y el NAT se eliminaron eficazmente en el momento en que el caudal se desvió hacia el ELSD a los 4,0 minutos. Aunque A14/A20 tuvo una interferencia del 13 %, la repetibilidad, exactitud y linealidad en las evaluaciones posteriores para este producto fueron aceptables.

Tabla 24: Especificidad de los tres productos

Exactitud

Para determinar la exactitud del ensayo, se enriqueció proteína sin PS20 con una cantidad conocida de PS20 y se determinaron las recuperaciones para cada concentración (Tabla 25). Los criterios de aceptación de validación típicos requieren que el % de recuperación esté dentro del 80-120 %.

Se evaluaron A18/A19 sin PS20 (150 mg/ml) y A16/A17 sin PS20 (80 mg/ml) mediante enriquecimiento con PS20 en un intervalo de 0,1-0,6 mg/ml. Los datos de exactitud se resumen en la tabla 25. A las concentraciones de PS20 sometidas a prueba, el intervalo de recuperaciones para A16/A17 y A18/A19 fue de un 94-100 % y un 78-100 %, respectivamente. La muestra con una recuperación del 78 % se obtuvo con un enriquecimiento de A18/A19 sin PS20 de 0,4 mg/ml de PS20. Las recuperaciones de las concentraciones de PS20 acotadas (0,2 y 0,6 mg/ml) estuvieron dentro de las especificaciones, lo que sugiere un error en la preparación de la muestra o en la inyección para esta muestra. Si se excluye la muestra de 0,4 mg/ml, el intervalo de recuperaciones es del 88-100 % para A18/A19.

La exactitud de A14/A20 sin PS20 (150 mg/ml) se evaluó mediante enriquecimiento con PS20 en un intervalo de 0,1-0,3 mg/ml. Las recuperaciones de PS20 para A14/A20 variaron de un 92 % a un 109 %. En conjunto, los datos de los experimentos de recuperación con enriquecimiento para los tres productos sometidos a prueba demuestran que el procedimiento es exacto. Además, estos resultados demuestran que se pueden cargar de 2,5 |jg (0,1 |jg/|jl * 25 jil) a 15 jig (0,6 jig/jil * 25 jil) de PS20 en el cartucho y cuantificarlos con exactitud.

Tabla 25: Exactitud

Linealidad

Se evaluó la linealidad determinando el coeficiente de correlación de Pearson (r) >0,99 en los intervalos sometidos a prueba para los tres productos. Estos valores se muestran en la tabla 26 para cada intervalo de concentraciones de PS20 para cada producto. Todos los valores del coeficiente de correlación de Pearson fueron mayores de 0,99 para los intervalos de PS20 sometidos a prueba. Por lo tanto, la linealidad para este ensayo fue aceptable en los tres productos sometidos a prueba.

Tabla 26: Linealidad: Coeficiente de correlación de Pearson

Repetibilidad

Se evaluó la repetibilidad con seis inyecciones repetidas de la muestra A18/A19 (0,2 mg/ml de PS20 nominal) y seis inyecciones repetidas de la muestra A16/A17 (0,2 mg/ml de PS20 nominal) y midiendo el % de DER de las áreas de pico de PS20. Los resultados de esta evaluación se muestran en la tabla 27 y muestran que la precisión del ensayo fue aceptable para ambos productos.

Tabla 27: Repetibilidad de A18/A19 y A16/A17

La repetibilidad también se evaluó sometiendo a prueba tres réplicas de cinco concentraciones y midiendo el % de DER de las áreas de pico de PS20. Este experimento se realizó en A14/A20 sin PS20 enriquecida con 0,10-0,30 mg/ml de PS20. Los resultados de esta evaluación se muestran en la tabla 28 y muestran que la precisión del ensayo es aceptable para A14/A20.

Tabla 28: Repetibilidad de A14/A20

Experimentos de consistencia del procedimiento

Entre cartuchos

Trabajos previos realizados con el procedimiento 1 del ejemplo 1 han demostrado que, incluso cuando el lote de sorbente del cartucho es el mismo, los cartuchos pueden presentar un comportamiento diferente con respecto a la eliminación de proteína y la especificidad. Se evaluaron tres cartuchos MCX para determinar la variabilidad entre cartuchos. De estos, los cartuchos MCX 2 y 4 tenían el mismo lote de sorbente (0093), mientras que el 6 era diferente (0103) (Tabla 20).

Los tres cartuchos MCX se evaluaron con en agua enriquecida con 0,2 mg/ml de PS20 y productos que contenían PS20. Las FIGS. 21 y 22 muestran los cromatogramas de estas evaluaciones, y la tabla 29 muestra un resumen de los resultados. Las trazados 3 y 4 en la FIG. 21 y el trazado 3 en la FIG. 22 ilustran las diferencias en las alturas y anchuras de los picos para muestras de 0,2 mg/ml de PS20 en agua inyectadas en los tres cartuchos. Lo más notable es que las alturas y áreas de los picos son variables de un cartucho a otro, observándose la mayor diferencia entre el cartucho 2 (FIG. 21 trazados 1 y 3) y el cartucho 6 (FIG. 21 trazados 2 y 4). El área del pico con el cartucho 2 fue aproximadamente un 60 % del área del pico con el cartucho 6 en ambos tipos de muestras sometidas a prueba (es decir, PS20 en agua y PS20 en A18/A19). Dado que se observó que la diferencia en las áreas de los picos era independiente del tipo de muestra (por ejemplo, con o sin proteína), es probable que la variabilidad no esté causada por la interferencia de proteína. Aunque los valores de área fueron muy diferentes entre dos de los cartuchos sometidos a prueba, la diferencia entre el cartucho 4 y 6 fue más pequeña, siendo el área del cartucho 4 aproximadamente un 85 % de la del cartucho 6. La variabilidad en el área de pico de PS20 entre cartuchos no parece depender únicamente del lote de resina, ya que tanto el cartucho 2 como el 4 compartieron el mismo lote de resina y también proporcionaron áreas de pico diferentes.

Aunque esta variabilidad no es ideal, las concentraciones de PS20 determinadas a partir de la curva de calibración analizada en la misma columna fueron exactas en comparación con las concentraciones teóricas en todos los cartuchos una vez que se implementaron los estándares para obtener la cantidad calculada de PS20. En base a estos datos, será importante utilizar cantidades de inyección de PS20 que proporcionen una respuesta que esté dentro del intervalo lineal del detector ELSD. Por ejemplo, en general se recomienda una respuesta máxima del detector de un 80 % de la escala completa (por ejemplo, 800 mV) para los procedimientos de HPLC-ELSD, pero, dada la variabilidad observada entre cartuchos, puede ser aconsejable reducir esta respuesta objetivo para el procedimiento de MCX para proporcionar una seguridad adicional de que el detector no se saturará para determinados cartuchos. En conjunto, la variabilidad entre cartuchos fue mínima con respecto a la cantidad de PS20 informada para este procedimiento para las muestras y los cartuchos sometidos a prueba.

Tabla 29: Variabilidad entre cartuchos

100 inyecciones de muestra A18/A19

Aunque los experimentos descritos anteriormente demuestran que el cartucho OASIS® MCX puede cuantificar PS20 de manera consistente y con exactitud; los autores querían someter a prueba la durabilidad del cartucho ejecutando secuencias largas con muestras que contienen proteína. Uno de los productos para los que se desarrolló inicialmente este procedimiento tiene una concentración de proteína objetivo muy alta de 150 mg/ml y puede dar lugar a fallos o sobrepresión del cartucho debido a la acumulación de proteína en el cartucho. Típicamente, durante la ejecución del procedimiento, la presión era de ~25-45 bar. Si la presión se incrementa por encima de este intervalo, es probable que el cartucho haya acumulado proteína y/o excipientes y se debe monitorizar de cerca o reemplazar el cartucho. Si el cartucho comienza a tener fugas, se debe desechar y reemplazar de inmediato.

La repetibilidad de los cartuchos y su capacidad para eliminar consecuentemente la proteína y el NAT se evaluaron inyectando proteína (150 mg/ml) cien veces (véase la secuencia en la tabla 30) usando un cartucho nuevo. Los controles (n = 11) se agruparon cada diez inyecciones de proteína y se analizaron en primer lugar para garantizar que la secuencia fuera válida. La FIG. 23 muestra la superposición de los controles. Aunque hubo un incremento (hasta 5 mV) al comienzo de la línea base (a los 4,0-5,0 min y después de 8,5 min) y al final de la línea base, estos cambios no afectaron a la integración o la cuantificación final de PS20 (Tabla 31) con una cantidad promedio de PS20 calculada de 0,2 ± 0,005 (2,8 % de DER) mg/ml.

Tabla 30: Secuencia (todas las inyecciones de 25 pl)

Tabla 31: Cuantificación de controles usados en 100 secuencias de proteína

Dado que los controles fueron cualitativa y cuantitativamente consecuentes durante todo el experimento, se integraron (FIG. 24) y se cuantificaron (FIG. 26B, tabla 32) las cien muestras A18/A19 (150 mg/ml) con 0,2 mg/ml de PS20 nominales. La FIG. 24 ilustra la misma tendencia que los controles, con una línea base creciente (~5 mV) antes de la región de PS20, a los 4,0-5,0 min y después de 8,5 min. Al trazar el área frente al número de inyección y la cantidad frente al número de inyección, la cuantificación de la proteína tuvo una desviación mínima, aunque hubo una ligera tendencia descendente para las áreas y cantidades calculadas para las primeras veinte inyecciones, algo que se puede deber al equilibrado del cartucho (FIGS. 26A y 26B). En última instancia, las áreas y cantidades promedio de PS20 cuantificadas para las cien inyecciones de la muestra A18/A19 fueron de 18,3 ± 0,76 (4,2 % de DER) mV*min y de 0,2 ± 0,005 (2,6 % de DER) mg/ml, respectivamente (Tabla 32). Cabe señalar que se habían cargado 375 mg de proteína en el cartucho con la centésima inyección. El procedimiento eliminó suficientemente la proteína y los excipientes de forma consecuente antes de que se introdujera el efluente en el ELSD a los 4,0 minutos (FIG. 25A) a lo largo de la secuencia, como se representa en el trazado UV (FIG. 25B).

Debido a la tendencia descendente, se evaluaron cien inyecciones de tampón de formulación A18/A19 con 0,2 mg/ml de PS20 nominales con un nuevo cartucho MCX (cartucho 5) para determinar si este efecto se debe a la proteína, a la formulación o a ambas. De forma interesante, hubo una tendencia descendente similar en los valores de área [n = 100, media de 31,3 ± 1,3 (4,1 % de DER) mV*min] para las primeras 49 inyecciones (FIG. 27A). Este comportamiento no tuvo un impacto importante en la cuantificación [n = 100, media de 0,22 ± 0,005 (2,1 % de DER)] (FIG. 27B y tabla 32).

Cuando también se evaluó agua enriquecida con 0,2 mg/ml de PS20 en un cartucho nuevo (cartucho 3), no se produjo dicha tendencia descendente. Para esta muestra, los valores de área [n = 100, media de 20,7 ± 0,3 (1,5 % de d Er ) mV*min] (FIG. 28A) se mantuvieron consecuentes, junto con la cuantificación [n = 100, media de 0,20 ± 0,002 (0,9 % de DER)] (FIG. 28B, tabla 32). Este resultado de la muestra de agua PS20 puede indicar que la tendencia descendente observada previamente (FIGS. 26A y 27A) está relacionada con los demás excipientes en la formulación o con la presencia de la proteína. Otra posibilidad es que haya sido un efecto relacionado con el cartucho específico usado y que no dependa de los demás componentes de la formulación.

Tabla 32: Cuantificación de 100 inyecciones de agua enriquecida con PS20, tampón de formulación A18/A19, muestra A18/A19

En conjunto, cada uno de los tres cartuchos pudo funcionar eficazmente después de 100 inyecciones de PS20, lo que ilustra que la reproducibilidad y robustez del cartucho MCX es adecuada para el uso rutinario en un entorno de control de calidad. Más importante, los perfiles de absorbancia de cien inyecciones de proteína muestran claramente una eliminación similar tanto de proteína como de NAT en toda la secuencia (FIG. 25B). La cuantificación de PS20 se mantuvo estadísticamente constante en toda la secuencia.

Evaluación de la cuantificación de PS20 de tres productos de pI bajo

Se evaluaron tres productos diferentes de pI bajo, A21, A14/A15 y A14 (Tabla 33) con el procedimiento 1 (descrito en el ejemplo 1) y el procedimiento 2. Los cartuchos usados para esta evaluación se enumeran en la tabla 34. Las características de rendimiento del procedimiento sometida a prueba fueron la especificidad, la exactitud, la linealidad y la repetibilidad.

Tabla 33. Moléculas evaluadas

* pI determinado mediante el procedimiento de enfoque de acotamiento (curva de calibración)

** pI determinado mediante el ensayo del sistema de control icIEF

Tabla 34. Cartuchos usados durante el desarrollo del procedimiento

Especificidad

La especificidad calculada para las tres moléculas se muestra en la tabla 35. Los cromatogramas correspondientes se muestran en las FIGS. 29A-29F. A21 (150 mg/ml) tuvo un 16 % de interferencia cuando se evaluó con el procedimiento 1 (Oasis® MAX con metanol y ácido acético) y un 7 % de interferencia cuando se evaluó con el procedimiento 2 (Oasis® MCX con metanol e hidróxido de amonio), en comparación con 0,1 mg/ml de PS20 en agua (50 % del objetivo). Esto se puede deber a una interacción más débil del producto de bajo pI con la resina de intercambio catiónico (grupo anión sulfito), minimizando la interferencia de proteína. A14/A15 (192 mg/ml) tuvo un 3 % de interferencia cuando se evaluó con el procedimiento 1 y un 2 % de interferencia cuando se evaluó con el procedimiento 2, en comparación con 0,15 mg/ml de PS20 en agua (50 % del objetivo). A14 (161 mg/ml) tuvo ~1 % de interferencia cuando se evaluó con ambos procedimientos, en comparación con 0,15 mg/ml de PS20 en agua (50 % del objetivo). La especificidad de estos productos no se vio significativamente impactada por el procedimiento.

Tabla 35. Especificidad de tres moléculas de pI bajo

Exactitud

Para determinar la exactitud del ensayo, se enriqueció proteína sin PS20 con una cantidad conocida de PS20 y se determinaron las recuperaciones para cada concentración (Tabla 36). Los criterios de aceptación de validación típicos requieren que el % de recuperación esté dentro del 80-120 %.

Se evaluó A21 sin PS20 mediante enriquecimiento con PS20 en un intervalo de 0,10-0,30 mg/ml. Los datos de exactitud se resumen en la tabla 36. A las concentraciones de PS20 sometidas a prueba, el intervalo de recuperaciones cuando las muestras se analizaron usando el procedimiento 1 y el procedimiento 2 fueron del 99-108 % y del 101-110 %, respectivamente. Las exactitudes de A14/A15 y A14 sin PS20 se evaluaron mediante enriquecimiento con PS20 en un intervalo de 0,15-0,45 mg/ml. Las recuperaciones de PS20 para A14/A15 cuando las muestras se analizaron utilizando el procedimiento 1 y el procedimiento 2 variaron de 97 a 101 % y de 92 a 99 %, respectivamente. Las recuperaciones de PS20 para A14 cuando las muestras se analizaron usando el procedimiento 1 y el procedimiento 2 variaron de 102 a 108 % y de 102 a 110 %, respectivamente. En conjunto, los datos de los experimentos de recuperación con enriquecimiento para los tres productos sometidos a prueba demostraron que ambos procedimientos son exactos.

Tabla 36. Recuperación de tres productos de pI bajo

Triplicado, inyecciones de 20 |jl

Linealidad

Se evaluó la linealidad determinando el coeficiente de correlación de Pearson (r) >0,99 en los intervalos sometidos a prueba para los tres productos de bajo pI evaluados con el procedimiento 1 y el procedimiento 2. Estos valores se muestran en la tabla 37 para cada intervalo de concentraciones de PS20 para cada producto. Todos los valores del coeficiente de correlación de Pearson fueron mayores de 0,99 para los intervalos de PS20 sometidos a prueba. Por lo tanto, la linealidad para el procedimiento 1 y el procedimiento 2 fue aceptable en los tres productos sometidos a prueba.

Tabla 37. Linealidad de tres productos de pI bajo

Repetibilidad

Se evaluó la repetibilidad sometiendo a prueba tres réplicas de cinco concentraciones y midiendo el % de DER de las áreas de pico de PS20. Este experimento se realizó con A21 sin PS20 enriquecida con 0,10-0,30 mg/ml de PS20 y A14/A15 y A14 sin PS20 enriquecidas con 0,15-0,45 mg/ml de PS20. Los resultados de esta evaluación se muestran en la tabla 38 y muestran que la precisión del ensayo fue aceptable tanto para el procedimiento 1 como para el procedimiento 2 en los tres productos sometidos a prueba.

Tabla 38. Repetibilidad de tres productos de pI bajo

Triplicado, inyecciones de 20 |jl

CONCLUSIONES:

Se realizaron las siguientes modificaciones del procedimiento 1 del ejemplo 1 al actual

ensayo de ELSD, procedimiento 2:

El aditivo de la fase móvil cambió de 2 % de ácido acético a 1,5 % de hidróxido de amonio

El caudal cambió de 1,25 ml/min a 1,40 ml/min

El caudal de LC que pasa de residuos al ELSD a partir de 2,4 minutos cambió a 4,0 minutos

La concentración de B% en la etapa de lavado cambió de 40 % a 45 % de la fase móvil B

El tiempo de la etapa de lavado orgánico cambió de 1,0-3,4 minutos a 1,0-4,4 minutos

El tiempo de la etapa de elución cambió de 3,5-4,6 minutos a 4,5-7,6 minutos

El tiempo de la etapa de equilibrado cambió de 4,7-6,6 minutos a 7,7-9,6 minutos

Estas modificaciones eliminaron tanto la interferencia de NAT como de proteína y tuvieron una variabilidad mínima en la cuantificación entre cartuchos. Los resultados de la cualificación de este ensayo modificado para tres productos que contienen NAT mostraron que este ensayo era adecuado para cuantificar el polisorbato 20 en estas formulaciones.

Se evaluaron tres moléculas de pI bajo tanto con el procedimiento 1 como con el procedimiento 2. El único caso en el que no se cumplieron los criterios de aceptación fue para la especificidad cuando se usó el procedimiento 1 con A21. Aparte de esto, ambos procedimientos superaron los criterios de exactitud, linealidad y repetibilidad para los tres productos de bajo pI. Estos resultados indican además que el procedimiento 2 también puede cuantificar PS20 y es en particular útil para productos que no contienen NAT.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para cuantificar un tensioactivo no iónico en una composición que comprende el tensioactivo no iónico y un polipéptido, en el que se reduce la interferencia entre el tensioactivo no iónico y el polipéptido durante la cuantificación, en el que el procedimiento comprende las etapas de

a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una fase móvil A y una fase móvil B, en el que la fase móvil A comprende ácido en agua y la fase móvil B comprende ácido en metanol, en el que el polipéptido se une al material de cromatografía específica y no específicamente;

b) eluir el polipéptido unido específicamente del material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto con una solución que comprende la fase móvil A y la fase móvil B, en el que la proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A se incrementa en comparación con la etapa a);

c) eluir el tensioactivo no iónico y el polipéptido unido no específicamente del material de cromatografía con una solución que comprende la fase móvil A y la fase móvil B, en el que la proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A se incrementa en comparación con la etapa b);

d) cuantificar el tensioactivo no iónico, en el que se reduce la interferencia entre el tensioactivo no iónico y el polipéptido durante la cuantificación, en el que el tensioactivo no iónico es polisorbato 20 o polisorbato 80.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A en la etapa a) es de aproximadamente 10:90.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que la proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A se incrementa a aproximadamente 40:60 en la etapa b).

4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A se incrementa a aproximadamente 100:0 en la etapa c).

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la fase móvil A comprende aproximadamente un 2 % de ácido en agua.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la fase móvil B comprende aproximadamente un 2 % de ácido en metanol.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el ácido es ácido fórmico.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el ácido es ácido acético.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el caudal de la cromatografía es de aproximadamente 1,25 ml/minuto.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que la concentración de tensioactivo no iónico en la composición está en el intervalo de aproximadamente un 0,001 % a un 1,0 % (p/v).

11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el polipéptido es un polipéptido terapéutico.

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que el material de cromatografía de intercambio aniónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio aniónico fuerte de fase inversa.

13. Un procedimiento para cuantificar un tensioactivo no iónico en una composición que comprende el tensioactivo no iónico y un polipéptido, en el que el procedimiento comprende las etapas de

a) aplicar la composición a un material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto, en el que la composición se carga en el material de cromatografía en una solución que comprende una fase móvil B y una fase móvil A, en el que la fase móvil A comprende hidróxido de amonio en agua y la fase móvil B comprende hidróxido de amonio en un disolvente orgánico;

b) eluir el polipéptido del material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto con una solución que comprende la fase móvil A y la fase móvil B, en el que la proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A se incrementa en comparación con la etapa a);

c) eluir el tensioactivo no iónico del material de cromatografía con una solución que comprende la fase móvil A y la fase móvil B, en el que la proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A se incrementa en comparación con la etapa b);

d) cuantificar el tensioactivo no iónico; y en el que el tensioactivo no iónico es polisorbato 20 o polisorbato 80.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que el disolvente orgánico de la fase móvil B es metanol.

15. El procedimiento de la reivindicación 13 o 14, en el que la proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A en la etapa a) es de aproximadamente 10:90.

16. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en el que la proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A se incrementa a aproximadamente 45:55 en la etapa b).

17. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 13-16, en el que la proporción entre la fase móvil B y la fase móvil A se incrementa a aproximadamente 100:0 en la etapa c).

18. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13-17, en el que la fase móvil A comprende aproximadamente un 2 % de hidróxido de amonio en agua.

19. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13-18, en el que la fase móvil B comprende aproximadamente un 2 % de hidróxido de amonio en metanol.

20. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13-19, en el que el caudal de la cromatografía es de aproximadamente 1,4 ml/minuto.

21. El procedimiento de las reivindicaciones 13-20, en el que la concentración de polisorbato en la composición está en el intervalo de aproximadamente un 0,001 % a un 1,0 % (p/v).

22. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13-21, en el que la composición comprende además N-acetiltriptófano y/o metionina.

23. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13-22, en el que la composición es una formulación farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto.

24. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13-23, en el que el polipéptido es un polipéptido terapéutico.

25. El procedimiento de la reivindicación 24, en el que el polipéptido terapéutico es una proteína de fusión, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, anticuerpo glucomanipulado, fragmento de anticuerpo, un conjugado fármaco-anticuerpo.

26. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13-25, en el que el material de cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto comprende un polímero de intercambio catiónico fuerte de fase inversa.