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ES3033957T3 - Miniaturized dystrophins and uses thereof - Google Patents

Miniaturized dystrophins and uses thereof

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Publication number
ES3033957T3
ES3033957T3 ES19804968T ES19804968T ES3033957T3 ES 3033957 T3 ES3033957 T3 ES 3033957T3 ES 19804968 T ES19804968 T ES 19804968T ES 19804968 T ES19804968 T ES 19804968T ES 3033957 T3 ES3033957 T3 ES 3033957T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
domain
seq
dystrophin
aav
polypeptide
Prior art date
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Active
Application number
ES19804968T
Other languages
English (en)
Inventor
Glen Banks
Jonathan Harry Davis
Paul Charles Levesque
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bristol Myers Squibb Co
Original Assignee
Bristol Myers Squibb Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bristol Myers Squibb Co filed Critical Bristol Myers Squibb Co
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Publication of ES3033957T3 publication Critical patent/ES3033957T3/es
Active legal-status Critical Current
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Abstract

Se describen moléculas de ácido nucleico, polipéptidos, células, vectores y composiciones farmacéuticas relacionadas con la distrofina miniaturizada. También se describen métodos de producción y uso terapéutico de la distrofina miniaturizada. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Distrofinas miniaturizadas y usos de las mismas
Campo
La materia objeto de la presente divulgación se refiere generalmente a polinucleótidos, polipéptidos, células, vectores, usos y kits relacionados con la distrofina miniaturizada.
Antecedentes de la divulgación
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es un trastorno de desgaste muscular de herencia recesiva que afecta aproximadamente a 1 de cada 3.500 hombres. La DMD también es causada por mutaciones en el gen, que se encuentra en el cromosoma X. Las mutaciones en este gen llevan a la expresión aberrante o ausente de la proteína distrofina.
La distrofina es un componente clave de un complejo proteico que es responsable de regular la integridad y función de la célula muscular. Los pacientes con DMD suelen perder la capacidad de sostenerse físicamente durante la infancia y se debilitan progresivamente con el tiempo. Este desgaste progresivo de los músculos esqueléticos y la disfunción cardiaca suelen conducir a la pérdida de la deambulación y a la muerte prematura, principalmente por insuficiencia cardiaca o respiratoria.
En el pasado se han hecho algunos intentos para tratar la DMD. Sin embargo, las opciones de tratamiento disponibles eran significativamente limitadas debido al gran tamaño del ADNc de la distrofina de tipo silvestre (aproximadamente 13,9 kb) que no puede ser administrado y expresado en pacientes con DMD usando vectores virales estándar, incluido el virus adenoasociado (AAV), que no puede transferir más de aproximadamente 4,9 kb de ADN heterólogo. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar un gen de distrofina recombinante que pueda empaquetarse eficazmente en un vector para terapia génica.
Los vectores virales adenoasociados (AAV) han demostrado su utilidad en enfoques terapéuticos génicos dirigidos a corregir deficiencias genéticas que dan lugar a niveles reducidos o completamente abolidos de expresión proteica (Nathwani et al a A.M Keeler et al.), y son potencialmente útiles para la eliminación de genes ("knockdown"), la edición o modificación del genoma, y la modulación del ARN no codificante (Valdmanis et al., 2017).
El empaquetado del ADNc completo de la isoforma de distrofina específica del músculo en una sola cápside de rAAV no se puede lograr fácilmente debido al gran tamaño del ADNc de distrofina. Estudios previos se han centrado en el desarrollo de construcciones genéticas más pequeñas que expresan sólo dominios particulares de la distrofina. Véanse las patentes de Estados Unidos N.° 6.869.777 y 8.501.920. Sin embargo, estos enfoques sólo han tenido un éxito limitado.
Los documentos WO 2016/115543 A2 (Universidad de Washington) y US 2017/368198 A1 (Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill; Bamboo Therapeutics, Inc.) describen distrofinas truncadas con características estructurales específicas y que comprenden dominios particulares de la distrofina.
Banks et al (2010)PLOS GENETICS,vol. 6, n.° 5, describe análisis de estructura-función de distrofinas truncadas con bisagras modificadas y repeticiones similares a la espectrina en ratonesmdx.
Sigue existiendo la necesidad de herramientas de terapia génica más precisas y eficientes para tratar pacientes con mutaciones en el gen de la distrofina y, en particular, la necesidad de desarrollar un gen de distrofina recombinante que pueda empaquetarse eficazmente en un vector para la terapia génica.
1. Sumario de la divulgación
La invención reivindicada se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos, que codifica un polipéptido de distrofina miniaturizada que comprende desde el extremo N al extremo C dominio bisagra 1 (H1), dominio de repetición de espectrina 1 (R1), dominio de repetición de espectrina 3 (R3), dominio de bisagra 2 (H2), dominio de repetición de espectrina 16 (R16), dominio de repetición de espectrina 17 (R17), dominio de repetición de espectrina 24 (R24) y dominio bisagra 4 (H4) de la distrofina, en donde el polipéptido de distrofina miniaturizada no comprende la repetición 2 de espectrina de la distrofina, en donde el dominio R1 y el dominio R3 están fusionados por los aminoácidos ARG-VAL (RV) y en donde el dominio H2 y el dominio R16 están fusionados por la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 74-75 en combinación, y en donde (i) el dominio H1 y el dominio R1 están fusionados directamente, (ii) el dominio R3 y el dominio H2 están fusionados directamente, (iii) los dominios R16 y R17 están fusionados directamente, (iv) los dominios R17 y R24 están fusionados directamente y (v) los dominios R24 y H4 están fusionados directamente.
La invención reivindicada también se refiere a un vector que comprende la molécula de ácido nucleico; un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico; una célula hospedadora que comprende la molécula de ácido nucleico o el vector; una composición farmacéutica que comprende (a) la molécula de ácido nucleico, el vector, el polipéptido o la célula hospedadora, y (b) un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La invención reivindicada también se refiere a una partícula vectorial de virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende una cápside de AAV y una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos, que codifica un polipéptido de distrofina miniaturizada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 118.
A continuación, se resumen algunos aspectos de la presente divulgación. La invención es como se define en las reivindicaciones.
La presente divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos, que codifica un polipéptido de distrofina miniaturizada que comprende desde el extremo N al extremo C dominio bisagra 1 (H1), dominio de repetición de espectrina 1 (R1), dominio de repetición de espectrina 3 (R3), dominio de bisagra 2 (H2), dominio de repetición de espectrina 16 (R16), dominio de repetición de espectrina 17 (R17), dominio de repetición de espectrina 24 (R24) y dominio bisagra 4 (H4) de la distrofina, en donde el polipéptido de distrofina miniaturizada no comprende la repetición de espectrina 2 de la distrofina. En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada no comprende el dominio de repetición de espectrina 2 (R2), dominio de repetición de espectrina 4 (R4), dominio de repetición de espectrina 5 (R5), dominio de repetición de espectrina 6 (R6), dominio de repetición de espectrina 7 (R7), dominio de repetición de espectrina 8 (R8), dominio de repetición de espectrina 9 (R9), dominio de repetición de espectrina 10 (R10), dominio de repetición de espectrina 11 (R11), dominio de repetición de espectrina 12 (R12), dominio de repetición de espectrina 13 (R13), dominio de repetición de espectrina 14 (R14), dominio de repetición de espectrina 15 (R15), dominio de repetición de espectrina 18 (R18), dominio de repetición de espectrina 19 (R19), dominio de repetición de espectrina 20 (R20), dominio de repetición de espectrina 21 (R21), dominio de repetición de espectrina 22 (R22), o dominio de repetición de espectrina 23 (R23) o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el dominio R1 está fusionado directamente con el dominio R3 mediante un enlace peptídico. En algunas realizaciones, el dominio R1 y el dominio R3 están fusionados por los aminoácidos ARG-VAL (RV). En algunas realizaciones, el dominio H2 y el dominio R16 están fusionados por un enlazador.
En algunas realizaciones, el enlazador comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la Se Q ID NO: 75(IHTVREE TMMVMTEDMP LEI), en donde la secuencia de aminoácidos es capaz de mejorar la señalización de la nNOS.
En algunas realizaciones, en el presente documento se describe una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 75 (IHTVREE TMMVMTEDMP LEI), en donde la molécula de ácido nucleico es de al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 100(ATCCACACCGTGCGGGAAGAGACAATGATGGTCATGACAGAGGAC ATGCCCCTGGAAATC), en donde la secuencia de aminoácidos es capaz de mejorar la señalización de la nNOS. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos es un enlazador que conecta un primer dominio de la distrofina a un segundo dominio de la distrofina. En algunas realizaciones, el primer dominio de la distrofina es un dominio H2 y el segundo dominio de la distrofina es un dominio R16. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos comprende además la secuencia de SEQ ID NO: 74 en el extremo N.
En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido de distrofina miniaturizada. En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende desde el extremo N al extremo C dominio bisagra 1 (H1), dominio de repetición de espectrina 1 (R1), dominio de repetición de espectrina 3 (R3), dominio de bisagra 2 (H2), dominio de repetición de espectrina 16 (R16), dominio de repetición de espectrina 17 (R17), dominio de repetición de espectrina 24 (R24) y dominio bisagra 4 (H4) de la distrofina. En algunas realizaciones, el dominio R1 y el dominio R3 están fusionados por los aminoácidos ARG-VAL (RV) y en donde el dominio H2 y el dominio R16 están fusionados por la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 74-75 en combinación. En algunas realizaciones, (i) el dominio H1 y el dominio R1 están fusionados directamente, (ii) el dominio R3 y el dominio H2 están fusionados directamente, (iii) los dominios R16y R17 están fusionados directamente, (iv) los dominios R17 y R24 están fusionados directamente, o (v) los dominios R24 y H4 están fusionados directamente, o (vi) cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende además dominio ABD1 y/o dominio CR. En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada consiste prácticamente, o consiste en, desde el extremo N al extremo C, el dominio ABD1, el dominio H1, el dominio R1, aminoácidos RV, el dominio R3, el dominio H2, las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 74-75, el dominio R16, el dominio R17, el dominio R24, el dominio H4 y el dominio CR de la distrofina.
En algunas realizaciones, el dominio H1 es una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 69. En algunas realizaciones, el dominio R1 es una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 70. En algunas realizaciones, el dominio R3 es una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 72. En algunas realizaciones, el dominio H2 es una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 73. En algunas realizaciones, el dominio R16 es una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 76. En algunas realizaciones, el dominio R17 es una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 77. En algunas realizaciones, el dominio R24 es una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 78. En algunas realizaciones, el dominio H4 es una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 79. En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende además en el extremo N una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 68. En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende además en el extremo C una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 80. En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 118. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 133.
En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada presenta una o más propiedades seleccionadas del grupo que consiste en (i) tener una menor proliferación de CD4 en comparación con BXA-027741, (ii) tener una menor proliferación de CD8 en comparación con BXA-027741, (iii) tener una mayor expresión del polipéptido de distrofina miniaturizada que el BXA-027741, y (iv) cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos, que codifica un polipéptido de distrofina miniaturizada que comprende el dominio de repetición de espectrina 1 (R1) y el dominio de espectrina 16 (R16), en donde el dominio R1 y el dominio R16 están fusionados por un enlazador que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 84 (IHTVREETMMVMTEDMPLEI).
En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos, que codifica un polipéptido de distrofina miniaturizada que comprende desde el extremo N al extremo C un dominio bisagra 1 (H1), dominio de repetición de espectrina 1 (R1), dominio de repetición de espectrina 16 (R16), dominio de repetición de espectrina 17 (R17), un dominio bisagra 3 (H3), dominio de repetición de espectrina 23 (R23), dominio de repetición de espectrina 24 (R24) y dominio bisagra 4 (H4) de la distrofina, en donde el dominio R1 y el dominio R16 están fusionados por la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 84 (IHTVREETMMVMTEDMPLEI).
En algunas realizaciones, (i) el dominio H1 y el dominio R1 están fusionados directamente, (ii) los dominios R16 y R17 están fusionados directamente, (iii) los dominios R17 y H3 están fusionados directamente, (iv) los dominios R23 y R24 están fusionados directamente, o (v) los dominios R24 y H4 están fusionados directamente, o (vi) cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada no comprende un dominio de repetición de espectrina 2 (R2), dominio de repetición de espectrina 3 (R3), dominio de repetición de espectrina 4 (R4), dominio de repetición de espectrina 5 (R5), dominio de repetición de espectrina 6 (R6), dominio de repetición de espectrina 7 (R7), dominio de repetición de espectrina 8 (R8), dominio de repetición de espectrina 9 (R9), dominio de repetición de espectrina 10 (R10), dominio de repetición de espectrina 11 (R11), dominio de repetición de espectrina 12 (R12), dominio de repetición de espectrina 13 (R13), dominio de repetición de espectrina 14 (R14), dominio de repetición de espectrina 15 (R15), dominio de repetición de espectrina 18 (R18), dominio de repetición de espectrina 19 (R19), dominio de repetición de espectrina 20 (R20), dominio de repetición de espectrina 21 (R21) y/o dominio de repetición de espectrina 22 (R22). En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende además un dominio ABD1 y/o un dominio CR. En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada consiste prácticamente, o consiste en, desde el extremo N al extremo C, el dominio ABD1, el dominio H1, el dominio R1, la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 84, el dominio R16, el dominio R17, el dominio H3, el dominio
R23, el dominio R24, el dominio H4 y el dominio CR de la distrofina. En algunas realizaciones, el dominio H1 es una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al meno aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 82. En algunas realizaciones, el dominio R1 es una de aminoácidos de al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al meno aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 83. En algunas realizaciones, el dominio R16 es una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 85. En algunas realizaciones, el dominio R17 es una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 86. En algunas realizaciones, el dominio H3 es una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 87. En algunas realizaciones, el dominio R23 es una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 88. En algunas realizaciones, el dominio R24 es una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 89. En algunas realizaciones, el dominio H4 es una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 90.
En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende además en el extremo N una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 81. En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende además en el extremo C una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el
80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 91. En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 %, o aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID
NO: 132, o a la SEQ ID NO: 132 en donde el dominio C-terminal está sometido a deleción. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 147 o SEQ ID NO: 148 o SEQ ID NO: 149.
En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada presenta una expresión más alta del polipéptido de distrofina miniaturizada que BXA-196481.
En algunas realizaciones, la expresión del polipéptido de distrofina miniaturizada es al menos aproximadamente 1,5 veces, al menos aproximadamente 1,6 veces, al menos aproximadamente 1,7 veces, al menos aproximadamente 1,8 veces, al menos aproximadamente 1,9 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2,1 veces, al menos aproximadamente 2,2 veces, al menos aproximadamente 2,3 veces, al menos aproximadamente 2,4 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 2,6 veces, al menos aproximadamente 2,7 veces, al menos aproximadamente 2,8 veces, al menos aproximadamente 2,9 veces o al menos aproximadamente 3 veces superior a la expresión del polipéptido BXA-196481.
En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico comprende además un promotor. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor específico de tejido. En algunas realizaciones, el promotor impulsa la expresión de la proteína terapéutica en los hepatocitos, miocitos, células endoteliales, células neuronales, células sinusoidales o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el promotor se selecciona del grupo que consiste en un promotor de la tireotina de ratón (mTTR), un promotor endógeno del factor VIII humano (F8), un promotor de la alfa-1-antitripsina humana (hAAT), un promotor mínimo de albúmina humana, un promotor de albúmina de ratón, un promotor de tristetraprolina (TTP), un promotor de CASI, un promotor del gen de la sinapsina 1, un promotor de CAG, un promotor de citomegalovirus (CMV), a1-antitripsina (AAT), quinasa de creatina muscular (MCK), cadena pesada de miosina alfa (aMHC), mioglobina (Mb ), desmina (d Es ), Spc5-12, 2R5Sc5-12, dMCK, tMCK y un promotor de la fosfoglicerato quinasa (PGK).
En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico comprende además una secuencia intrónica. En algunas realizaciones, la secuencia intrónica se sitúa 5' a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de distrofina miniaturizada. En algunas realizaciones, la secuencia intrónica se sitúa a 3' del promotor. En algunas realizaciones, la secuencia intrónica comprende una secuencia intrónica sintética.
En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico comprende además un elemento regulador postranscripcional. En algunas realizaciones, el elemento regulador postranscripcional está situado 3' a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de distrofina miniaturizada. En algunas realizaciones, el elemento regulador postranscripcional comprende un elemento regulador postranscripcional mutado del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE), un sitio de unión de microARN, o una secuencia de a Dn dirigida al núcleo o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico comprende además una secuencia de cola poli(A) de 3'UTR. En algunas realizaciones, la secuencia de cola poli(A) de 3'UTR se selecciona del grupo que consiste en bGH poli(A), actina poli(A), hemoglobina poli(A) y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la secuencia de cola poli(A) de 3'UTR comprende bGH poli(A). En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico comprende además una secuencia potenciadora. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico comprende además una primera ITR y/o una segunda ITR. En algunas realizaciones, la primera ITR y la segunda ITR son idénticas. En algunas realizaciones, la primera ITR y/o la segunda ITR se derivan del virus adenoasociado. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico comprende una fracción heteróloga. En algunas realizaciones, la fracción heteróloga se selecciona del grupo que consiste en la albúmina o un fragmento de la misma, una región Fc de inmunoglobulina, el péptido C-terminal (CTP) de la subunidad p de la gonadotropina coriónica humana, una secuencia PAS, una secuencia hAp , una transferrina o un fragmento de la misma, una fracción de unión a albúmina o un derivado de la misma y cualquier combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, se proporciona un vector que comprende una molécula de ácido nucleico descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, el vector se selecciona del grupo que consiste en un vector adenoviral, un vector retroviral, vector de poxvirus, un vector de baculovirus, un vector de herpesvirus. En algunas realizaciones, el vector es un vector de virus adenoasociado (AAV). En algunas realizaciones, el vector AAV se selecciona entre AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 y AAV11. En algunas realizaciones, el vector AAV es AAV9.
En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico o el vector descrito en el presente documento se formula con un agente de administración. En algunas realizaciones, el agente de administración comprende una nanopartícula lipídica. En algunas realizaciones, el agente de administración se selecciona del grupo que consiste en liposomas, moléculas poliméricas no lipídicas, endosomas y cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico o el vector descrito en el presente documento está formulado para la administración intravenosa, transdérmica, intradérmica, subcutánea, pulmonar o administración oral, o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico o el vector descrito en el presente documento está formulado para la administración intravenosa.
En algunas realizaciones, se proporciona un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico o el vector descrito en el presente documento.
En algunas realizaciones, se proporciona una célula hospedadora que comprende la molécula de ácido nucleico descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, la célula es una célula CHO, una célula HEK293, una célula HBK, una célula COS, una célula NSO o una célula HT1080.
En algunas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende (a) el ácido nucleico descrito en el presente documento, el vector descrito en el presente documento, el polipéptido descrito en el presente documento o la célula hospedadora descrita en el presente documento; y (b) un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, se proporciona un kit, que comprende el ácido nucleico descrito en el presente documento, el vector descrito en el presente documento, el polipéptido descrito en el presente documento, la célula hospedadora descrita en el presente documento, o la composición farmacéutica descrita en el presente documento, e instrucciones para administrar la molécula de ácido nucleico a un sujeto que lo necesite.
En algunas realizaciones, se proporciona un método para producir un polipéptido de distrofina miniaturizada, que comprende: cultivar la célula hospedadora descrita en el presente documento bajo condiciones adecuadas y recuperar el polipéptido de distrofina miniaturizada.
En algunas realizaciones, se proporciona un método para expresar un polipéptido de distrofina miniaturizada en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto el ácido nucleico descrito en el presente documento, el vector descrito en el presente documento, la célula hospedadora descrita en el presente documento, o la composición farmacéutica descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, se proporciona un método para tratar un sujeto que padece una enfermedad o afección que comprende la administración al sujeto del ácido nucleico descrito en el presente documento, el vector descrito en el presente documento, el polipéptido descrito en el presente documento, la célula hospedadora descrita en el presente documento, o la composición farmacéutica descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección es una enfermedad causada por deficiencia de distrofina. En algunas realizaciones, la enfermedad es la Sarcopenia, una cardiopatía, caquexia, distrofia muscular de Duchenne (DMD), distrofia muscular de Becker (BMD), miocardiopatía dilatada ligada al cromosoma X (XLDC), distrofia muscular facioescapulohumeral, distrofia muscular miotónica, distrofia muscular de la cintura y extremidades, distrofia muscular oculofaríngea, distrofia muscular de Emery-Dreifuss, distrofia muscular distal y/o distrofia muscular congénita. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico, el vector, el polipéptido, la célula hospedadora o la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa, transdérmica, intradérmica, subcutánea, oral o pulmonar, o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico, el vector, el polipéptido, la célula hospedadora o la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa, transdérmica, intradérmica, subcutánea, oral o pulmonar, o cualquier combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, el método comprende además administrar al sujeto un segundo agente.
En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En algunas realizaciones, la administración de la molécula de ácido nucleico, el vector, el polipéptido, la célula hospedadora o la composición farmacéutica al sujeto de como resultado un aumento de la expresión de la proteína distrofina, relativa a la expresión de la proteína distrofina en el sujeto antes de la administración, en donde la expresión de la proteína distrofina se aumenta al menos 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 11 veces, al menos aproximadamente 12 veces, al menos aproximadamente 13 veces, al menos aproximadamente 14 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 25 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 35 veces, al menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 60 veces, al menos aproximadamente 70 veces, al menos aproximadamente 80 veces, al menos aproximadamente 90 veces o al menos aproximadamente 100 veces.
En algunas realizaciones, en el presente documento se describe una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos, que codifica un polipéptido de distrofina miniaturizada que comprende el dominio bisagra 2 (H2) y el dominio espectrina 16 (R16), en donde el dominio H2 y el dominio R16 están fusionados por un enlazador que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 84 (IHTVREETMMVMTEDMPLEI).
. Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 muestra un diagrama esquemático de la proteína Distrofina humana de longitud completa. ABD1: dominio 1 de unión a actina; HN.° (por ejemplo, H1): región bisagra; RN.° (por ejemplo, R1): dominios de repetición similares a la espectrina; ABD2: dominio 2 de unión a actina; CR: dominio rico en cisteína; C-term: dominio C-terminal de la proteína.
La FIG. 2 muestra diagramas esquemáticos de polipéptidos de distrofina miniaturizada BXA-027741, BXA-027742, BXA-027743, BXA-027744, BXA-196480 y BXA-196481 , así como, como punto de referencia, la proteína Distrofina humana de longitud completa de la FIG. 1.
La FIG. 3 muestra la proporción de expresión de polipéptido de distrofina miniaturizada en relación con la expresión de ARNm de distrofina miniaturizada en cardiomiocitos (iCM) derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) isogénicas humanas (llevando un codón de parada prematuro E2035X en el gen de la distrofina que impidió la expresión endógena de distrofina) después de la transfección de plásmidos que expresan los polipéptidos de distrofina miniaturizada indicados.
La FIG. 4 muestra un diagrama esquemático del polipéptido de distrofina miniaturizada de BXA-027743 (SEQ ID NO: 132), así como la secuencia de aminoácidos de sus uniones J1 y J7, que tienen una inmunogenicidad relativamente baja, como se indica.
La FIG. 5 muestra un diagrama esquemático del polipéptido de distrofina miniaturizada de BXA-027741 (SEQ ID NO: 129) con flechas apuntando a sus uniones J10, J 11 y J9.
La FIG. 6A muestra un histograma que indica la proporción de muestras, entre el panel de 40 muestras de células ensayado, que fueron pulsadas con diversos péptidos de unión como se indica y tenían células CD4+ proliferantes (cada cuadrado de color representa una muestra de paciente). La FIG. 6B muestra un histograma que indica la proporción de muestras, entre el panel de 40 muestras de células ensayado, que fueron pulsadas con diversos péptidos de unión como se indica y tenían células CD8+ proliferantes (cada cuadrado de color representa una muestra de paciente).
La FIG. 7 muestra un diagrama esquemático del polipéptido de distrofina miniaturizada de BXA-196473 (SEQ ID NO:119).
La FIG. 8A muestra un diagrama esquemático del polipéptido de distrofina miniaturizada de BXA-196477 (SEQ ID NO:118). RV: dipéptido de arginina-valina entre R1 y R3; SEAQ: péptido de serina-ácido glutámico-alaninaglutamina. La FIG. 8B muestra el plegamiento tridimensional alrededor de la unión original 10 entre R1 y R3 del polipéptido de distrofina miniaturizada BXA-027741 (SEQ ID NO: 129) (izquierda), y el plegamiento tridimensional alrededor de la versión 3 de la unión 10 del polipéptido de distrofina miniaturizada BxA-196477 (SEQ ID NO: 118) (derecha).
La FIG. 9 muestra la proporción de expresión del polipéptido de distrofina miniaturizada con respecto al ARNm de distrofina miniaturizada en cardiomiocitos (iCM) derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) isogénicas humanas (que llevan un codón de parada prematuro E2035X en el gen de la distrofina que impidió la expresión endógena de distrofina) después de la transfección de plásmidos que expresan los polipéptidos de distrofina miniaturizada indicados.
La FIG. 10 muestra un diagrama esquemático del polipéptido de distrofina miniaturizada de BXA-196474 (SEQ ID NO:120).
La FIG. 11 muestra un diagrama esquemático del polipéptido de distrofina miniaturizada de BXA-196475 (SEQ ID NO:121).
La FIG. 12 muestra un diagrama esquemático del polipéptido de distrofina miniaturizada de BXA-196476 (SEQ ID NO:122).
La FIG. 13 muestra un diagrama esquemático del polipéptido de distrofina miniaturizada de BXA-196478 (SEQ ID NO:124).
La FIG. 14 muestra un diagrama esquemático del polipéptido de distrofina miniaturizada de BXA-196479 (SEQ ID NO:125).
FIG. 15 Velocidad de conducción en CM de hiPSC de DMD humana infectadas con construcciones de AAV9 que expresan polipéptidos de distrofina miniaturizada de BXA-196477 y BXA-213788. La FIG. 15A muestra una fotografía de una matriz electrodos múltiples (MEA) utilizada en los experimentos (izquierda) y una fotografía de electrodos individuales de la MEA (derecha). La FIG. 15B muestra la señal de los 28 electrodos de la MEA en condiciones experimentales. La FIG. 15C muestra un gráfico que ilustra la conducción de impulsos a través de la matriz. La FIG. 15D muestra diagramas esquemáticos de los polipéptidos de distrofina miniaturizada de BXA-196477 (SEQ ID NO: 118) y BXA-213788 (SEQ ID NO:152). La FIG. 15E muestra un gráfico donde la velocidad de conducción de CM de hiPSC de DMD humana que expresa polipéptidos de distrofina miniaturizada de BXA-196477 (SEQ ID NO: 118) y BXA-213788 es trazada en función del tiempo después de la transfección. La FIG.
15F muestra un histograma que indica la expresión de polipéptidos de distrofina miniaturizada en células en las que se midió la velocidad de conducción.
La FIG. 16 muestra un esquema que resume la configuración experimental de los estudiosin vivoque se llevaron a cabo.
FIG. 17 Acoplamiento a la diana de AAV9-BXA-196477 o AAV9-BXA-213788. La FIG. 17B muestra la visualización de inmunofluorescencia de la expresión de polipéptidos de distrofina miniaturizada y aglutinina del germen de trigo (WGA) en tejido muscular de ratones tratados con AAV9-BXA-196477 o AAV9-BXA-213788. La FIG. 17A muestra histogramas que indican el número relativo de células en diversos músculos positivas para distrofina miniaturizada. Barras con patrón diagonal = % BXA-196477 de células positivas para Distrofina miniaturizada como una proporción de células positivas para WGA; barras con patrón longitudinal =%BXA-213788 de Distrofina miniaturizada como proporción de células WGA positivas.
FIG. 18 Acoplamiento a la diana de AAV9-BXA-196477 o AAV9-BXA-213788 determinado en ratones mdx407 a las 4 semanas de vida. La FIG. 18A muestra diagramas esquemáticos de los polipéptidos de distrofina miniaturizada de BXA-196477 (SEQ ID NO: 118) y BXA-213788 (SEQ ID NO:152). La FIG. 18B muestra un histograma que indica la cantidad relativa de genomas virales en tejido muscular de ratones mdx4cv tratados con AAV9-BXA-196477 o AAV9-BXA-213788.
La FIG. 18C muestra un histograma que indica la cantidad relativa de ARNm de distrofina miniaturizada en el corazón de ratonesmdx4cvtratados con AAV9-BXA-196477 o AAV9-BXA-213788. La FIG. 18D muestra un histograma que indica la cantidad relativa de proteína distrofina miniaturizada en tejido muscular de ratones tratados con AAV9-BXA-196477 o AAV9-BXA-213788. Dia = diafragma; Gas = gastrocnemio; TA = tibial anterior. Los ratones tratados se compararon con ratones no tratadosmdx4cvy tipo silvestre.
La FIG. 19A muestra un histograma que indica la cantidad de creatina quinasa en el suero de ratonesmdx4cv(4 semanas) tratados con AAV9-BXA-196477 o AAV9-BXA-213788. La FIG. 19B muestra un histograma que indica la cantidad de creatina quinasa en el suero de ratonesmdx4cv(12 semanas) tratados con AAV9-BXA-196477 o AAV9-BXA-213788. Los ratones tratados se compararon con ratones no tratadosmdx4cvy tipo silvestre.
FIG. 20 Contracción tetánica máxima a los 2 meses de vida. La FIG. 20A muestra un gráfico que indica las propiedades contráctiles (Fuerza en Newton metros; Nm) en ratonesmdx4cvtratados con AAV9-BXA-196477 o AAV9-BXA-213788. La FIG. 20B muestra un histograma que indica la contracción tetánica máxima en los ratones tratados. La FIG. 20C muestra un histograma que indica la masa de TA en los ratones tratados. La FIG. 20D muestra un histograma que indica la fuerza/masa TA en los ratones tratados. Los ratones tratados se compararon con ratones no tratadosmdx4cvy tipo silvestre.
FIG. 21 Protección frente a lesiones inducidas por contracción. La FIG. 21A muestra un gráfico de la configuración experimental. La FIG. 21B muestra un gráfico que indica las propiedades contráctiles (torque isométrico máximo) de los músculos de ratones tratados con AAV9-BXA-196477 o AAV9-BXA-213788. Los ratones tratados se compararon con ratones no tratadosmdx4cvy tipo silvestre.
La FIG. 22A muestra un diagrama esquemático de los polipéptidos de distrofina miniaturizada de BXA-027741 (SEQ ID NO: SEQ ID NO: 129). La FIG. 22B muestra un histograma que indica la inmunogenicidad de los péptidos de unión 1 a 12.
La FIG. 23A muestra un histograma que indica la respuesta inmunitaria MHC I/CD8+ a los péptidos de unión. El péptido J11v3 her es el mismo péptido que el péptido n.° 3 de la FIG. 22B.
La FIG. 23B muestra un histograma que indica la respuesta inmunitaria MHC II/CD4+ a los péptidos de unión. El péptido J11v3 es en este caso el mismo péptido que el péptido n.° 3 de la FIG. 22B.
Descripción detallada de la divulgación
Visión de conjunto
La presente divulgación se refiere a nuevas distrofinas miniaturizadas o a los genes que las codifican. Las distrofinas miniaturizadas pueden unirse operativamente a un casete regulador. La presente divulgación también se refiere a métodos de tratamiento de un sujeto que padece distrofia muscular, sarcopenia, insuficiencia cardíaca o caquexia. Además, la presente divulgación se refiere a métodos de tratamiento profiláctico de un sujeto con riesgo de desarrollar distrofia muscular, sarcopenia, insuficiencia cardíaca o caquexia. Los métodos para tratar a un sujeto que padece, o corre el riesgo de padecer, distrofia muscular, sarcopenia, insuficiencia cardiaca, o caquexia puede comprender administrar una composición farmacéutica que incluye un gen de distrofina miniaturizada y un vehículo de administración al sujeto.
Definiciones
Para que la presente divulgación pueda entenderse más fácilmente, en primer lugar, se definen algunos términos. Como se utiliza en la presente solicitud, salvo que se proporcione lo contrario en el presente documento, cada uno de los siguientes términos tendrá el significado que se expone a continuación. A lo largo de la solicitud se exponen definiciones adicionales.
La expresión "y/o" cuando se usa en el presente documento debe tomarse como divulgación específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin los otros. Por tanto, la expresión "y/o" como se utiliza en una expresión tal como "A y/o B" en el presente documento pretende incluir "A y B", "A o B", "A" (solo) y "B" (solo). Igualmente, la expresión "y/o" como se utiliza en una expresión tal como "A, B y/o C" pretende abarcar cada uno de los siguientes aspectos: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo). Se entiende que dondequiera que se describa en el presente documento aspectos con la expresión "que comprende", también se proporcionan aspectos de otro modo análogos descritos en expresiones "que consiste en" y/o "que consiste prácticamente en".
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica con la que está relacionada esta divulgación. Por ejemplo, el Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2.a ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3.a ed., 1999, Academic Press; y el Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revisado, 2000, Oxford University Press, proporcionan al experto un diccionario general de muchos de los términos y expresiones utilizados en la presente divulgación.
Las unidades, los prefijos y los símbolos se indican en su forma aceptada del Sistema Internacional de Unidades (SI). Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. Los encabezados proporcionados en el presente documento no son limitaciones de los diferentes aspectos de la divulgación, que pueden hacerse por referencia a la memoria descriptiva en su conjunto. En consecuencia, los términos definidos inmediatamente a continuación se definen con más detalle por referencia a la memoria descriptiva en su totalidad.Distrofina (DMD)es un gran gen humano ligado al cromosoma X que codifica la Distrofina. La proteína Distrofina es una proteína citoesquelética de 427 kDa que se localiza en la cara citoplasmática del sarcolema y se enriquece en los costámeros de las fibras musculares. La proteína Distrofina tiene cuatro dominios funcionales principales: un dominio aminoterminal de unión a actina (ABD1); un dominio de varilla central que comprende una serie de varillas, denominado "dominios de repetición de espectrina" y bisagras; un dominio rico en cisteína; y un extremo carboxilo.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "polipéptido de distrofina miniaturizada" o "péptido de distrofina miniaturizada" se refiere a un polipéptido que es más pequeño en tamaño que el polipéptido de distrofina de tipo silvestre de longitud completa. En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada es capaz de alterar (aumentar o disminuir, según sea el caso) un valor medible de la fisiología o anatomía muscular en un modelo animal de DMD por lo menos aproximadamente el 10 o 20 % del valor de tipo silvestre, de manera que el valor se aproxime más al valor de tipo silvestre (por ejemplo, un ratón mdx tiene un valor medible de fisiología o anatomía muscular que es el 50 % del valor de tipo silvestre, y este valor se aumenta hasta al menos el 60 % del valor de tipo silvestre; o un ratón mdx tiene un valor medible de la fisiología o anatomía muscular que es el 150 % del valor de tipo silvestre, y este valor se reduce como máximo hasta al 140 % del valor de tipo silvestre). En determinadas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada es capaz de alterar un valor medible de fisiología muscular o anatomía en un modelo animal DMD por lo menos aproximadamente el 30 % del valor de tipo silvestre. En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada es capaz de alterar un valor medible de fisiología muscular o anatomía en un modelo animal DMD a un nivel similar al valor de tipo silvestre (por ejemplo, ±4 %).
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "repeticiones de espectrina" o "repeticiones similares a la espectrina" se refiere a péptidos compuestos por aproximadamente 100 aminoácidos que son responsables de la forma de varilla de muchas proteínas estructurales que incluyen, pero no se limitan a, distrofina, en donde las repeticiones de espectrina suelen estar presentes en múltiples copias. Las repeticiones de espectrina pueden incluir mutaciones de las secuencias peptídicas naturales, tales como cambios conservativos y/o no conservativos en la secuencia de aminoácidos, así como la adición o deleción de hasta 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos al/del final de una repetición de espectrina o dentro de la repetición de espectrina. En algunas realizaciones, cada repetición de espectrina (cada una de R1 a R24) tiene al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con la repetición de espectrina natural (cada uno de los R1 a R24 naturales).
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "secuencias codificantes de repeticiones de espectrina" se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican péptidos de repeticiones de espectrina. Esta expresión incluye secuencias de ácido nucleico naturales y sintéticas que codifican las repeticiones de espectrina (por ejemplo, los péptidos de repetición de espectrina tanto naturales como mutados).
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "dominio de repetición de espectrina" se refiere a la región en un polipéptido de distrofina miniaturizada que contiene las repeticiones de espectrina del polipéptido de distrofina miniaturizada.
El término "fusionado" se refiere a una primera secuencia de aminoácidos que está unida en marco a una segunda secuencia de aminoácidos con la que normalmente no está unida en la naturaleza, formando una proteína/polipéptido de "fusión". Estas secuencias de aminoácidos fusionados que normalmente existen en proteínas separadas pueden juntarse en el polipéptido de fusión, o las secuencias de aminoácidos que normalmente existen en la misma proteína pueden colocarse en una nueva disposición en el polipéptido de fusión. Se crea una proteína de fusión, por ejemplo, por síntesis química de péptidos, o por tecnología de a Dn recombinante, mediante la cual se crea un polinucleótido y, a continuación, se traduce, en donde las regiones peptídicas están codificadas en la relación deseada. Una proteína de fusión también puede comprender una segunda secuencia de aminoácidos asociada a la primera secuencia de aminoácidos mediante un enlace covalente, no peptídico o por un enlace no covalente. En algunas realizaciones, la "fusión" entre dos polipéptidos se consigue mediante un enlazador. Los enlazadores pueden ser aminoácidos u otras estructuras químicas. En algunas realizaciones, los enlazadores pueden ser sintéticos.
En algunas realizaciones, la "fusión" entre dos polipéptidos es una fusión directa, es decir, sin enlazador intermedio. La expresión "fusionado directamente" o "fusión directa" se refiere a una unión entre dos cadenas polipeptídicas mediante un enlace peptídico. Por ejemplo, un primer aminoácido se "fusiona directamente" a un segundo aminoácido cuando el primer aminoácido se "fusiona" a un segundo aminoácido mediante un enlace peptídico.
"Heterólogo" y "fracción heteróloga" en referencia a una fracción de polipéptido o fracción de polinucleótido que forma parte de un polipéptido o polinucleótido mayor, respectivamente, describe un polipéptido o polinucleótido que se origina a partir de un polipéptido o polinucleótido diferente de la parte restante de la molécula de polipéptido o polinucleótido. El componente heterólogo adicional del polipéptido o polinucleótido puede proceder del mismo organismo que el polipéptido o polinucleótido restante, respectivamente, descritos en el presente documento, o los componentes adicionales pueden proceder de un organismo diferente. Por ejemplo, un polipéptido heterólogo puede ser sintético o derivado de una especie diferente, diferente tipo de célula de un individuo, o el mismo o diferente tipo de célula de individuos distintos. En un aspecto, una fracción heteróloga es un polipéptido fusionado con otro polipéptido para producir un polipéptido. En otro aspecto, una fracción heteróloga es un no-polipéptido tal como el PEG conjugado con un polipéptido o proteína.
Como se utiliza en el presente documento, las expresiones "célula muscular" se refieren a una célula derivada del tejido muscular, incluyendo, pero sin limitación, células derivadas del músculo esquelético, músculo liso (por ejemplo, del tubo digestivo, la vejiga urinaria y los vasos sanguíneos) y músculo cardíaco. La expresión incluye las células muscularesin vitro, ex vivoein vivo.Por tanto, por ejemplo, un cardiomiocito aislado constituiría una célula muscular, como lo haría una célula tal y como existe en el tejido muscular presente en un sujetoin vivo.Esta expresión también engloba tanto a las células musculares terminalmente diferenciadas como a las no diferenciadas, tales como miocitos, miotubos, mioblastos, cardiomiocitos y cardiomioblastos.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "específico a músculo" en referencia a un elemento regulador de un gen (por ejemplo, secuencia potenciadora, secuencia promotora) significa que el elemento regulador impulsa la actividad transcripcional principalmente en células o tejidos musculares (por ejemplo, 20:1) en comparación con la actividad transcripcional impulsada por el elemento regulador en otros tejidos. Los ensayos para determinar la especificidad a músculo de un elemento regulador son conocidos en la técnica (por ejemplo, ensayoin vitrousando células musculares murinas y células hepáticas transfectadas con un vector de expresión que comprende el elemento regulador a ensayar que impulsa la expresión de un indicador beta-galactósido).
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "virus adenoasociado" o "AAV" incluye pero no se limita a, AAV tipo 1, AAV tipo 2, AAV tipo 3 (incluidos los tipos 3A y 3B), AAV tipo 4, AAV tipo 5, AAV tipo 6, AAV tipo 7, AAV tipo 8, AAV tipo 9, AAV tipo 10, AAV tipo 11, A<a>V tipo 12, AAV tipo 13, AAV de serpiente,<a>A<v>aviar, AAV bovino, AAV canino, AAV equino, AAV ovino, AAV de cabra, AAV de camarón, AAV de primate, AAV no primates y AAV ovinos, los serotipos y clados de AAV descritos por Gao et al.(J. Virol.78:6381 (2004)) y Moris et al.(Virol.33:375 (2004)), y cualquier otro AAV conocido ahora o descubierto posteriormente. Véanse, por ejemplo, Fields et al.VIROLOGY,volumen 2, capítulo 69 (4.a ed., Lippincott-Raven Publishers). AAV hace referencia a unDependoparvovirusde la familia de los virusParvoviridae.Por ejemplo, el AAV puede ser un AAV derivado de un virus "tipo silvestre" de origen natural, un AAV derivado de un genoma de AAV recombinante (rAAV) empaquetado en una cápside derivada de proteínas de cápside codificadas por un gencapnatural y/o un genoma de rAAV empaquetado en una cápside derivada de proteínas de cápside codificadas por un gencapde cápside no natural. Como se utiliza en el presente documento, "AAV" puede utilizarse para referirse al propio virus o a sus derivados. El término abarca todos los subtipos y tanto las formas naturales como las recombinantes, salvo que se indique expresamente lo contrario. "AAV de primate" se refiere a los AAV que infectan a primates, "AAV no primate" se refiere al AAV que infecta a animales distintos de los primates, "AAV bovino" se refiere a AAV que infectan a mamíferos bovinos, etc. Véanse, por ejemplo, BERNARD N. FIELDS et al.,VIROLOGY,volumen 2, capítulo 69 (3.a ed., Lippincott-Raven Publishers). El término "rAAV" se refiere a un "AAV recombinante". En algunas realizaciones, un AAV recombinante tiene un genoma AAV en el que parte o la totalidad de los genesrepycaphan sido sustituidos por secuencias polinucleotídicas heterólogas.
Un "vector AAV" o "vector de virus adenoasociado" como se usa en el presente documento se refiere a un rAAV que comprende una secuencia polinucleotídica que no es de origen AAV (es decir, un polinucleótido heterólogo al AAV), típicamente una secuencia de interés para la transformación genética de una célula. En general, el polinucleótido heterólogo está flanqueado por al menos uno, y generalmente por dos, secuencias de repetición terminal invertida (ITR) de AAV.
Un genoma o molécula de ácido nucleico viral (por ejemplo, AAV) "sin cápside" o "libre de cápside" (o sus variaciones) se refiere a un genoma o molécula de ácido nucleico que no tiene cápside. En algunas realizaciones, el genoma o molécula de ácido nucleico sin cápside no contiene secuencias que codifiquen, por ejemplo, una proteína AAV Rep.
Un "AAV" o "partícula viral AAV" o "vector AAV" o "partícula vectorial rAAV" se refiere a una partícula viral compuesta de al menos una proteína de cápside AAV (típicamente de todas las proteínas de cápside de un AAV de tipo silvestre) y un polinucleótido encapsulado. Si la partícula comprende un polinucleótido heterólogo (es decir, un polinucleótido distinto de un genoma AAV de tipo silvestre, tal como un transgén que debe administrarse en una célula de mamífero), se denomina típicamente una "partícula vectorial de AAV" o simplemente un "vector de AAV".
Un "virus ayudante" para AAV se refiere a un virus que permite que AAV (por ejemplo, AAV de tipo silvestre) sea replicado y empaquetado por una célula de mamífero. Se conocen en la técnica diversos virus ayudantes de AAV, incluyendo adenovirus, herpesvirus y poxvirus tales como la vaccinia. Los adenovirus abarcan varios subgrupos diferentes, aunque el Adenovirus tipo 5 del subgrupo C es el más utilizado. Numerosos adenovirus de origen humano, de origen aviar y de mamíferos no humanos están disponibles en depósitos tales como el ATCC. Los virus de la familia del herpes incluyen, por ejemplo, virus del herpes simple (HSV) y virus de Epstein-Barr (EBV), así como los citomegalovirus (CMV) y los virus de la pseudorrabia (PRV), todos ellos también disponibles en depositarios como ATCC.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "repetición terminal invertida" (o "ITR") se refiere a una secuencia monocatenaria de nucleótidos seguida aguas abajo por su complemento inverso. La secuencia intermedia de nucleótidos entre la secuencia inicial y el complemento inverso puede tener cualquier longitud, incluso cero. El genoma del AAV suele incluir repeticiones terminales invertidas (ITR) en ambos extremos, donde cada extremo es típicamente palindrómico y puede formar una horquilla.
El término "polinucleótido" y la expresión "ácido nucleico" se utilizan indistintamente en el presente documento y se refieren a un biopolímero compuesto por una pluralidad de monómeros de nucleótidos unidos covalentemente en una cadena
El término "tropismo" como se utiliza en el presente documento se refiere a la capacidad de un virus (por ejemplo, AAV) para infectar sólo uno o más tipos de células particulares y su capacidad para interactuar sólo con partes específicas de la superficie celular para lograr la entrada en la célula, opcional y preferentemente seguido de expresión (por ejemplo, transcripción y, opcionalmente, traducción) de secuencias transportadas por el virus (por ejemplo, AAV) a la célula (por ejemplo, para un virus recombinante, la expresión de la(s) secuencia(s) de nucleótidos heteróloga(s).
Como se utiliza en el presente documento, el término "transducción" se refiere a la entrada del virus (por ejemplo, AAV) en la célula y la transferencia del material genético contenido en el virus a la célula para obtener la expresión del genoma del virus. Típicamente, un virus (por ejemplo, AAV) entra en las células de acuerdo con su tropismo.
"Administración" se refiere a la introducción física de un agente terapéutico a un sujeto, utilizando cualquiera de los diversos métodos y sistemas de administración conocidos por los expertos en la técnica. Vías de administración ilustrativas, por ejemplo, para una terapia con AAV, incluyen la administración intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intralinfática, intralesional, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural, intrasternal, oral, rectal, tópica, epidérmica, mucosa, intranasal, vaginal, rectal y sublingual. La administración también se puede realizar, por ejemplo, una vez, una pluralidad de veces y/o durante uno o más períodos prolongados.
El "tratamiento" o "terapia" de un sujeto se refiere a cualquier tipo de intervención o proceso realizado en, o la administración de un agente activo a, un sujeto con el objetivo de revertir, aliviar, mejorar, inhibir, ralentizar o prevenir la aparición, la progresión, el desarrollo, la gravedad o la recidiva de un síntoma, la complicación, la afección o los indicios bioquímicos asociados con una enfermedad.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz", "dosis terapéutica", "dosis eficaz", o "dosificación efectiva", como se utiliza en el presente documento, significa una cantidad o una dosis que permite alcanzar un objetivo terapéutico, como se describe en el presente documento. Un experto en la técnica comprenderá además que una cantidad terapéuticamente eficaz, etc., puede administrarse en una dosis única, o puede conseguirse mediante la administración de dosis múltiples (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más dosis). Puede evaluarse la capacidad de un agente terapéutico para promover la regresión de la enfermedad o inhibir el desarrollo o la recurrencia de la enfermedad usando una diversidad de métodos conocidos para el experto en la técnica, tal como en sujetos humanos durante ensayos clínicos, en sistemas de modelos animales que predicen la eficacia en seres humanos o ensayando la actividad del agente en ensayosin vitro.
Un "sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano. La expresión "animal no humano" incluye, pero no se limita a, vertebrados, tales como primates no humanos, ovejas, perros y roedores tales como ratones, ratas, y cobayas. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano. Los términos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente en el presente documento.
Como se utiliza en el presente documento, los términos "ug" y "uM" se usan indistintamente con "|jg" y "|jM", respectivamente.
Debe entenderse que el uso de la alternativa (por ejemplo, "o") significa una u otra, ambas o cualquier combinación de las alternativas. Como se utiliza en el presente documento, debe entenderse que los artículos indefinidos "un" o "una" se refieren a "uno o más" de cualquier componente citado o enumerado o por completo.
Más o menos: Como se utiliza en el presente documento, la expresión "alrededor de" o el término "aproximadamente", como se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia declarado y dentro de un intervalo de valores que no superan el 25 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o menos en cualquier dirección (mayor o menor que) del valor de referencia indicado, a menos que se indique de otro modo o resulte evidente de otro modo a partir del contexto (excepto cuando dicho número exceda el 100 % de un posible valor). Cuando la expresión "alrededor de" o el término "aproximadamente" se aplica en el presente documento a un valor particular, el valor sin la expresión "alrededor de" o el término "aproximadamente" también se describe en el presente documento.
Como se describe en el presente documento, cualquier intervalo de concentración, intervalo de porcentaje, intervalo de proporción o intervalo de números enteros, se entiende que incluye el valor de cualquier número entero dentro del intervalo citado y, cuando sea adecuado, fracciones del mismo (tal como una décima y una centésima de un número entero), a menos que se indique lo contrario.
En las siguientes subsecciones se describen con más detalle diversos aspectos de la divulgación.
Polinucleótidos y polipéptidos
Distrofina miniaturizada
La presente divulgación está dirigida a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos, que codifica un polipéptido de distrofina miniaturizada. En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende al menos tres dominios bisagra de distrofina y al menos cinco dominios de repetición de espectrina.
La distrofina es una proteína citoplasmática en forma de varilla que conecta el citoesqueleto de una fibra muscular a la matriz extracelular circundante a través de la membrana celular. Esta proteína se localiza principalmente en los músculos utilizados para el movimiento (músculos esqueléticos) y en el músculo del corazón (cardíaco). Pequeñas cantidades de distrofina están presentes en las células nerviosas del cerebro. En los músculos esqueléticos y cardíacos, la distrofina es parte de un grupo de proteínas (un complejo proteico) que trabajan juntas para fortalecer las fibras musculares y protegerlas de lesiones cuando los músculos se contraen y relajan. El complejo distrofina actúa como un ancla, que conecta el armazón estructural de cada célula muscular (citoesqueleto) con el entramado de proteínas y otras moléculas del exterior de la célula (matriz extracelular). El complejo distrofina también puede desempeñar un papel en la señalización celular mediante la interacción con proteínas que envían y reciben señales químicas.
El genDMD,que codifica la proteína distrofina de longitud completa, es uno de los genes humanos más largos conocidos, que abarca 2,3 megabases (0,08 % del genoma humano) en el locus Xp21. La transcripción primaria en el músculo mide unas 2.100 kilobases y tarda 16 horas en transcribirse; el ARNm maduro mide 14,0 kilobases. El transcrito muscular de 79 exones codifica una proteína de 3.685 residuos de aminoácidos.
En el presente documento se describen secuencias de aminoácidos y nucleótidos para la distrofina. La secuencia de aminoácidos que constituye la distrofina de tipo silvestre humana, isoforma Dp427m, se conoce como identificador UniProt N.° n P_003997.1 y se muestra en la Tabla 1.
continuación
Diversas otras isotermas de distrofina son conocidas en la técnica que resultan del corte y empalme alternativo. En algunas realizaciones, las construcciones comprenden las secuencias de nucleótidos que se citan en la Tabla 2.
En el presente documento también se describe una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína distrofina de longitud completa.
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El tipo silvestre, la proteína distrofina de longitud completa (isoterma Dp427m) contiene 24 repeticiones similares a la espectrina, al menos cuatro regiones bisagra, dominio de unión a actina (ABD1), dominio rico en cisteína (CR) y dominio terminal C (C-term.). La secuencia polipeptídica de cada dominio se muestra en la Tabla 3, y la secuencia nucleotídica de cada dominio se muestra en la Tabla 4.
Tabla 3. Secuencias de aminoácidos de los dominios de la distrofina
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Tabla 4. Secuencias nucleotídicas de los dominios de la distrofina
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La presente divulgación está dirigida a un polipéptido de distrofina miniaturizada que es más pequeño que la proteína distrofina de longitud completa, es decir, isoforma Dp427m, y que no es idéntica a las isotermas de proteína distrofina que se dan en la naturaleza, o una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de distrofina miniaturizada. Cuando la presente divulgación describe polipéptidos de distrofina miniaturizada, la presente divulgación también describe una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el correspondiente polipéptido de distrofina miniaturizada descrito, y viceversa. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de distrofina miniaturizada es adecuada para la terapia génica. En consecuencia, la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de distrofina miniaturizada se construye no sólo para encajar en un vector de terapia génica, por ejemplo, vector AAV, o ser adecuado para la expresión recombinante, sino también para reducir cualquier respuesta inmunitaria no deseada (por ejemplo, respuesta inmunitaria humoral y/o respuesta inmunitaria celular, por ejemplo, CD4 y/o CD8) contra el polipéptido de distrofina miniaturizada cuando es administrado o expresadoin vivo.En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada de la presente divulgación comprende desde el extremo N al extremo C dominio bisagra 1 (H1), dominio de repetición de espectrina 1 (R1), dominio de repetición de espectrina 3 (R3), dominio de bisagra 2 (H2), dominio de repetición de espectrina 16 (R16), dominio de repetición de espectrina 17 (R17), dominio de repetición de espectrina 24 (R24) y dominio bisagra 4 (H4) de la distrofina. En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada no comprende el dominio de repetición de espectrina 2 (R2) de la distrofina. En otras realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada no comprende el dominio de repetición de espectrina 2 (R2) ni el (1) dominio de repetición de espectrina 4 (R4), (2) dominio de repetición de espectrina 5 (R5), (3) dominio de repetición de espectrina 6 (R6 ), (4) dominio de repetición de espectrina 7 (R7), (5) dominio de repetición de espectrina 8 (R8 ), (6 ) dominio de repetición de espectrina 9 (R9),(7)dominio de repetición de espectrina 10 (R10), (8) dominio de repetición de espectrina 11 (R11), (9) dominio de repetición de espectrina 12 (R12), (10) dominio de repetición de espectrina 13 (R13), (11) dominio de repetición de espectrina 14 (R14), (12) dominio de repetición de espectrina 15 (R15), (13) dominio de repetición de espectrina 18 (R18), (14) dominio de repetición de espectrina 19 (R19), (15) dominio de repetición de espectrina 20 (R20), (16) dominio de repetición de espectrina 21 (R21 ), (17) dominio de repetición de espectrina 22 (R22), o (18) dominio de repetición de espectrina 23 (R23), o (19) cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada no comprende el dominio de repetición de espectrina 2 (R2), dominio de repetición de espectrina 4 (R4), dominio de repetición de espectrina 5 (R5), dominio de repetición de espectrina 6 (R6 ), dominio de repetición de espectrina 7 (R7), dominio de repetición de espectrina 8 (R8), dominio de repetición de espectrina 9 (R9), dominio de repetición de espectrina 10 (R10), dominio de repetición de espectrina 11 (R11), dominio de repetición de espectrina 12 (R12), dominio de repetición de espectrina 13 (R13), dominio de repetición de espectrina 14 (R14), dominio de repetición de espectrina 15 (R15), dominio de repetición de espectrina 18 (R18), dominio de repetición de espectrina 19 (R19), dominio de repetición de espectrina 20 (R20), dominio de repetición de espectrina 21 (R21), dominio de repetición de espectrina 22 (R22), ni dominio de repetición de espectrina 23 (R23).
En determinadas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada de la presente divulgación comprende desde el extremo N al extremo C dominio bisagra 1 (H1), dominio de repetición de espectrina 1 (R1), dominio de repetición de espectrina 3 (R3), dominio de bisagra 2 (H2), dominio de repetición de espectrina 16 (R16), dominio de repetición de espectrina 17 (R17), dominio de repetición de espectrina 24 (R24) y dominio bisagra 4 (H4) de la distrofina, en donde el dominio R1 se fusiona directamente con el dominio R3 mediante un enlace peptídico, por ejemplo, Véase el polipéptido de distrofina miniaturizada BXA-027741.
En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada de la presente divulgación comprende desde el extremo N al extremo C dominio bisagra 1 (H1), dominio de repetición de espectrina 1 (R1), dominio de repetición de espectrina 3 (R3), dominio de bisagra 2 (H2), dominio de repetición de espectrina 16 (R16), dominio de repetición de espectrina 17 (R17), dominio de repetición de espectrina 24 (R24) y dominio bisagra 4 (H4) de la distrofina, en donde el dominio R1 y el dominio R3 están fusionados por los aminoácidos ARG-VAL (RV).
En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada de la presente divulgación comprende desde el extremo N al extremo C dominio bisagra 1 (H1), dominio de repetición de espectrina 1 (R1), dominio de repetición de espectrina 3 (R3), dominio de bisagra 2 (H2), dominio de repetición de espectrina 16 (R16), dominio de repetición de espectrina 17 (R17), dominio de repetición de espectrina 24 (R24) y dominio bisagra 4 (H4) de la distrofina, en donde el dominio H2 y el dominio R16 están fusionados por un enlazador. El enlazador puede ser cualquier enlazador conocido en la técnica. En otras realizaciones, el enlazador puede seleccionarse entre cualquier enlazador descrito en el presente documento. En otras realizaciones, el enlazador puede ser un enlazador de la Sección 5.3.2. En algunas realizaciones, el enlazador puede comprender una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 75 (IHTVREE TMMVMTEDMP LEI).
En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada de la presente divulgación comprende desde el extremo N al extremo C dominio bisagra 1 (H1), dominio de repetición de espectrina 1 (R1), dominio de repetición de espectrina 3 (R3), dominio de bisagra 2 (H2), dominio de repetición de espectrina 16 (R16), dominio de repetición de espectrina 17 (R17), dominio de repetición de espectrina 24 (R24) y dominio bisagra 4 (H4) de la distrofina, en donde el dominio H2 y el dominio R16 están fusionados por un enlazador. En algunas realizaciones, el enlazador puede comprender una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 74-75 en combinación (SEAQ IHTVREE TMMVMTEDMP LEI).
En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada de la presente divulgación comprende desde el extremo N al extremo C dominio bisagra 1 (H1), dominio de repetición de espectrina 1 (R1), dominio de repetición de espectrina 3 (R3), dominio de bisagra 2 (H2), dominio de repetición de espectrina 16 (R16), dominio de repetición de espectrina 17 (R17), dominio de repetición de espectrina 24 (R24) y dominio bisagra 4 (H4) de la distrofina, en donde el dominio H2 y el dominio R16 están fusionados por un enlazador. En algunas realizaciones, el enlazador puede comprender una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 74 (SEAQ).
En otras realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada de la presente divulgación comprende desde el extremo N al extremo C dominio bisagra 1 (H1), dominio de repetición de espectrina 1 (R1), dominio de repetición de espectrina 3 (R3), dominio de bisagra 2 (H2), dominio de repetición de espectrina 16 (R16), dominio de repetición de espectrina 17 (R17), dominio de repetición de espectrina 24 (R24) y dominio bisagra 4 (H4) de la distrofina, en donde el dominio R1 y el dominio R3 están fusionados por los aminoácidos ARG-VAL y en donde el dominio H2 y el dominio R16 están fusionados por un enlazador, por ejemplo, SEQ ID NO: 74-75 en combinación.
En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada de la presente divulgación comprende desde el extremo N al extremo C dominio bisagra 1 (H1), dominio de repetición de espectrina 1 (R1), dominio de repetición de espectrina 3 (R3), dominio de bisagra 2 (H2), dominio de repetición de espectrina 16 (R16), dominio de repetición de espectrina 17 (R17), dominio de repetición de espectrina 24 (R24) y dominio bisagra 4 (H4) de la distrofina, en donde el dominio R1 y el dominio R3 están fusionados por los aminoácidos ARG-VAL, en donde el dominio H2 y el dominio R16 están fusionados por un enlazador, por ejemplo, SEQ ID NO: 74-75 en combinación, y en donde (i) el dominio H1 y el dominio R1 están fusionados directamente, (ii) el dominio R3 y el dominio H2 están fusionados directamente, (iii) los dominios R16 y R17 están fusionados directamente, (iv) los dominios R17 y R24 están fusionados directamente, o (v) los dominios R24 y H4 están fusionados directamente, o (vi) cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada útil para la presente divulgación comprende desde el extremo N al extremo C: dominio de bisagra 1 (H1), dominio de repetición de espectrina 1 (R1), dominio de repetición de espectrina 3 (R3), dominio de bisagra 2 (H2), dominio de repetición de espectrina 16 (R16), dominio de repetición de espectrina 17 (R17), dominio de repetición de espectrina 24 (R24) y dominio bisagra 4 (H4) de la distrofina, en donde el dominio R1 y el dominio R3 están fusionados por los aminoácidos ARG-VAL, en donde el dominio H2 y el dominio R16 están fusionados por un enlazador, por ejemplo, SEQ ID NO: 74-75 en combinación, y en donde (i) el dominio H1 y el dominio R1 están fusionados directamente, (ii) el dominio R3 y el dominio H2 están fusionados directamente, (iii) los dominios R16 y R17 están fusionados directamente, (iv) los dominios R17 y R24 están fusionados directamente y (v) los dominios R24 y H4 están fusionados directamente. En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada útil para la presente divulgación comprende además un dominio ABD1 (opcionalmente en el extremo N) y/o un dominio CR (opcionalmente en el extremo N). En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada consiste prácticamente, o consiste en, desde el extremo N al extremo C, un dominio ABD1, un dominio H1, un dominio R1, aminoácidos RV, un dominio R3, un dominio H2, las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 74-75 en combinación, un dominio R16, un dominio R17, un dominio R24, un dominio H4 y un dominio CR de la distrofina.
Cada dominio en los polipéptidos de distrofina miniaturizada puede tener uno o más cambios del correspondiente dominio de tipo silvestre.
Por ejemplo, la distrofina miniaturizada BXA-196477 consiste en los siguientes dominios de proteína en orden:
Tabla 5A. Secuencia de aminoácidos y estructura de dominio del polipéptido de distrofina miniaturizada BXA-
196477.
continuación
En algunas realizaciones, el dominio H1 en el polipéptido de distrofina miniaturizada es una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 69. En algunas realizaciones, el dominio R1 es una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 70. En algunas realizaciones, el dominio R3 es una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 72. En algunas realizaciones, el dominio H2 es una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el menos aproximadamente el 95 aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 73. En algunas realizaciones, el dominio R16 es una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 76. En algunas realizaciones, el dominio R17 es una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 77. En algunas realizaciones, el dominio R24 es una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 78. En algunas realizaciones, el dominio H4 es una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 79. En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende además en el extremo N una secuencia polipeptídica de al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 68. En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende además en el extremo C una secuencia polipeptídica de al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 80.
Tabla 5B. Secuencia de aminoácidos y estructura de dominio del polipéptido de distrofina miniaturizada BXA-
027743.
continuación
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un polipéptido de distrofina miniaturizada que comprende el dominio de repetición de espectrina 1 (R1) y el dominio de espectrina 16 (R16), en donde el dominio R1 y el dominio R16 están fusionados por un enlazador que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 84 (IHTVREETMMVMTEDMPLEI). En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un polipéptido de distrofina miniaturizada que comprende desde el extremo N al extremo C dominio bisagra 1 (H1), dominio de repetición de espectrina 1 (R1 ), dominio de repetición de espectrina 16 (R16), dominio de repetición de espectrina 17 (R17), un dominio bisagra 3 (H3), dominio de repetición de espectrina 23 (R23), dominio de repetición de espectrina 24 (R24) y dominio bisagra 4 (H4) de la distrofina, en donde el dominio R1 y el dominio R16 están fusionados por la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 84 (IHTVREETMMVMTEDMPLEI).
En algunas realizaciones, la presente divulgación incluye una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos, que codifica un polipéptido de distrofina miniaturizada que comprende el dominio de repetición de espectrina 1 (R1) y el dominio de espectrina 16 (R16), en donde el dominio R1 y el dominio R16 están fusionados por un enlazador que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 84 (IHTVREETMMVMTEDMPLEI). En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos, que codifica un polipéptido de distrofina miniaturizada que comprende desde el extremo N al extremo C un dominio bisagra 1 (H1), dominio de repetición de espectrina 1 (R1), dominio de repetición de espectrina 16 (R16), dominio de repetición de espectrina 17 (R17), un dominio bisagra 3 (H3), dominio de repetición de espectrina 23 (R23), dominio de repetición de espectrina 24 (R24) y dominio bisagra 4 (H4) de la distrofina, en donde el dominio R1 y el dominio R16 están fusionados por la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 84 (IHTVREETMMVMTEDMPLEI).
En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada de la presente divulgación tiene las siguientes características: (i) el dominio H1 y el dominio R1 están fusionados directamente, (ii) los dominios R16 y R17 están fusionados directamente, (iii) los dominios R17 y H3 están fusionados directamente, (iv) los dominios R23 y R24 están fusionados directamente, o (v) los dominios R24 y H4 están fusionados directamente, o (vi) cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada para la presente divulgación no comprende un dominio de repetición de espectrina 2 (R2), dominio de repetición de espectrina 3 (R3), dominio de repetición de espectrina 4 (R4), dominio de repetición de espectrina 5 (R5), dominio de repetición de espectrina 6 (R6 ), dominio de repetición de espectrina 7 (R7), dominio de repetición de espectrina 8 (R8), dominio de repetición de espectrina 9 (R9), dominio de repetición de espectrina 10 (R10 ), dominio de repetición de espectrina 11 (R11 ), dominio de repetición de espectrina 12 (R12), dominio de repetición de espectrina 13 (R13), dominio de repetición de espectrina 14 (R14), dominio de repetición de espectrina 15 (R15), dominio de repetición de espectrina 18 (R18), dominio de repetición de espectrina 19 (R19), dominio de repetición de espectrina 20 (R20), dominio de repetición de espectrina 21 (R21) y/o dominio de repetición de espectrina 22 (R22). En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende además un dominio ABD1 y/o un dominio CR.
En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende, consiste esencialmente en, o consiste en, desde el extremo N al extremo C, el dominio ABD1, el dominio H1, el dominio R1, la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 84 (IHTVREETMMVMTEDMPLEI), el dominio R16, el dominio R17, el dominio H3, el dominio R23, el dominio R24, el dominio H4 y el dominio CR de la distrofina.
En algunas realizaciones, el dominio H1 útil para el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 82. En otras realizaciones, el dominio R1 útil para el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 83.
En algunas realizaciones, el dominio R16 útil para el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 85.
En algunas realizaciones, el dominio R17 útil para el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 86.
En otras realizaciones, el dominio H3 útil para el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 87.
En algunas realizaciones, el dominio R23 útil para el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 88.
En otras realizaciones, el dominio R24 útil para el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 89.
En algunas realizaciones, el dominio H4 útil para el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 90.
En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende además en el extremo N una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 81. En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende además en el extremo C una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 91.
En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico que codifica cada dominio puede ser la siguiente: Tabla 6A: Secuencia de nucleótidos (y estructura de dominio) que codifica el polipéptido de distrofina miniaturizada
BXA-196477.
(continuación)
(continuación)
En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio H1 en el poMpéptido de distrofina miniaturizada es una secuencia de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 94. En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio R1 es una secuencia de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 95. En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio R3 es una secuencia de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 97. En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio H2 es una secuencia de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 98. En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio R16 es una secuencia de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 101. En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio R17 es una secuencia de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 102. En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio R24 es una secuencia de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 103. En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio H4 es una secuencia de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 104. En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio ABD1 en el polipéptido de distrofina miniaturizada es una secuencia de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 93. En algunas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido CR/C-term. es una secuencia de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 105.
Tabla 6 B: Secuencia de nucleótidos (y estructura de dominio) que codifica el polipéptido de distrofina miniaturizada
BXA-027743.
(continuación)
(continuación)
(continuación)
Los diversos polipéptidos de distrofina miniaturizada de la presente divulgación se muestran en la Tabla 7.
��
��
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��
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En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 118-132, en donde la secuencia de aminoácidos cuando se expresa tiene al menos una actividad distrofina. En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a una de SEQ ID NO: 118 (BXA-196477), SEQ ID NO: 119 (BXA-196473), SEQ ID NO: 120 (BXA-196474), SEQ ID NO: 121 (BXA-196475), SEQ ID NO: 122 (BXA-196476), SEQ ID NO: 124 (BXA-196478) o SEQ ID NO: 125 (BXA-196479). En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 118, en donde la secuencia de aminoácidos cuando se expresa tiene al menos una actividad distrofina. En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 119, en donde la secuencia de aminoácidos cuando se expresa tiene al menos una actividad distrofina. En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 120, en donde la secuencia de aminoácidos cuando se expresa tiene al menos una actividad distrofina. En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 121, en donde la secuencia de aminoácidos cuando se expresa tiene al menos una actividad distrofina. En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 122, en donde la secuencia de aminoácidos cuando se expresa tiene al menos una actividad distrofina. En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 123, en donde la secuencia de aminoácidos cuando se expresa tiene al menos una actividad distrofina. En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 124, en donde la secuencia de aminoácidos cuando se expresa tiene al menos una actividad distrofina. En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 125, en donde la secuencia de aminoácidos cuando se expresa tiene al menos una actividad distrofina.
En determinadas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 126, en donde la secuencia de aminoácidos cuando se expresa tiene al menos una actividad distrofina. En determinadas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 127, en donde la secuencia de aminoácidos cuando se expresa tiene al menos una actividad distrofina. En determinadas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 128, en donde la secuencia de aminoácidos cuando se expresa tiene al menos una actividad distrofina. En determinadas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 129, en donde la secuencia de aminoácidos cuando se expresa tiene al menos una actividad distrofina. En determinadas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 130, en donde la secuencia de aminoácidos cuando se expresa tiene al menos una actividad distrofina. En determinadas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 131, en donde la secuencia de aminoácidos cuando se expresa tiene al menos una actividad distrofina. En determinadas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 132, en donde la secuencia de aminoácidos cuando se expresa tiene al menos una actividad distrofina.
En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada codificado por la molécula de ácido nucleico tiene la fórmula (I):
H1-R1-L1-R3-H2-L2-L3-R16-R17-R24-H4 (I)
en donde: H1 es un dominio bisagra 1 de la distrofina; R1 es un dominio de repetición de espectrina 1 de la distrofina; L1 son los aminoácidos Arg-Val (RV); R3 es un dominio de repetición de espectrina 3 de la distrofina; H2 es un dominio bisagra 2 de la distrofina; L2 es la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:74 (SEAQ); L3 es la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:75 (IHTVREE TMMVMTEDMP LEI); R16 es una repetición de espectrina 16 de la distrofina; R17 es una repetición de espectrina 17 de la distrofina; R24 es una repetición de espectrina 24 de la distrofina; H4 es un dominio bisagra 4 de la distrofina; y (-) es un enlace peptídico.
En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada codificado por la molécula de ácido nucleico presenta una o más propiedades seleccionadas del grupo que consiste en (i) tener una menor proliferación de CD4 en comparación con BXA-027741, (ii) tener una menor proliferación de CD8 en comparación con BXA-027741, y (iv) cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada codificado por la molécula de ácido nucleico tiene la fórmula (II):
H1-R1-L-R16-R17-H3-R23-R24-H4 (II)
en donde: H1 es un dominio bisagra 1 de la distrofina; R1 es un dominio de repetición de espectrina 1 de la distrofina; L son los aminoácidos de SEQ ID NO:84 (IHTVREETMMVMTEDMPLEI); R16 es una repetición de espectrina 16 de la distrofina; R17 es una repetición de espectrina 17 de la distrofina; H3 es un dominio bisagra 3 de la distrofina; R23 es una repetición de espectrina 23 de la distrofina; R24 es una repetición de espectrina 24 de la distrofina; H4 es un dominio bisagra 4 de la distrofina; y (-) es un enlace peptídico.
En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada codificado por la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99%o al menos aproximadamente el 100%idéntica a la SEQ ID NO: 132.
En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 65 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 147.
En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada presenta una expresión más alta del polipéptido de distrofina miniaturizada que BXA-196481. En algunas otras realizaciones, la expresión del polipéptido de distrofina miniaturizada es al menos aproximadamente 1,5 veces, al menos aproximadamente 1,6 veces, al menos aproximadamente 1,7 veces, al menos aproximadamente 1,8 veces, al menos aproximadamente 1,9 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2,1 veces, al menos aproximadamente 2,2 veces, al menos aproximadamente 2,3 veces, al menos aproximadamente 2,4 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 2,6 veces, al menos aproximadamente 2,7 veces, al menos aproximadamente 2,8 veces, al menos aproximadamente 2,9 veces o al menos aproximadamente 3 veces superior a la expresión del polipéptido BXA-196481.
En algunas realizaciones, los polipéptidos de distrofina miniaturizada pueden ser codificados por secuencias de nucleótidos. En la Tabla 8 se muestran algunos ejemplos de las secuencias de nucleótidos.
Tabla 8. Secuencias de nucleótidos de construcciones de distrofina.
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SEQ ID NO: 148 codifica la construcción BXA-212371, que es la misma que la construcción BXA-027743, salvo que se el extremo C está delecionado.
SEQ ID NO: 149 codifica la construcción BXA-212372, que es la misma que BXA-212371, pero con una 3'UTR más corta.
En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende o es la construcción mostrada en la Tabla 9.
T l . n i m in i l li i i r fin m in i riz B X A -21 7 .
En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 152, en donde la secuencia de aminoácidos cuando se expresa tiene al menos una actividad distrofina.
En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende o es la construcción mostrada en la Tabla 10.
T l ^ 1 . n i m in i l li i i r fin m in i riz B X A -21 7 11V .
SEQ ID NO:153 codifica la construcción BXA-213780J11V3, que es la misma que la construcción BXA-196477, excepto que los aminoácidos A y Q del enlazador SEAQ interno (SEQ ID NO. 74), así como los tres últimos aminoácidos del extremo C, se someten a deleción en BXA-213780J11V3.
En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 153, en donde la secuencia de aminoácidos cuando se expresa tiene al menos una actividad distrofina.
En algunas realizaciones, la distrofina miniaturizada BXA-213780J11V3 puede ser codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en la Tabla 11.
T l 11. n i n l i l li i i r fin m in i riz B X A -21 7 11V .
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En algunas realizaciones, el polipéptido de distrofina miniaturizada tiene una unión entre el dominio bisagra 2 (H2) y el dominio de repetición de espectrina 16 R16 (R16) que comprende una secuencia de aminoácidos enumerada en la Tabla 12.
Tabla 12. Secuencias de aminoácidos de las uniones
En otras realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 133-149, en donde el polipéptido de distrofina miniaturizada cuando es expresado a partir de la secuencia de nucleótidos tiene al menos una actividad de distrofina. En otras realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 133 (BXA-196477), SEQ ID NO: 134 (BXA-196473), SEQ ID NO: 135 (BXA-196474), SEQ ID NO: 136 (BXA-196475), SEQ ID NO: 137 (BXA-196476), SEQ ID NO: 139 (BXA-196478),
SEQ ID NO: 140 (BXA-196479), SEQ ID NO:148 (BXA-212371) o SEQ ID NO:149 (BXA-212372). En algunas realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO:
133, en donde el polipéptido de distrofina miniaturizada cuando es expresado a partir de la secuencia de nucleótidos tiene al menos una actividad de distrofina. En algunas realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente el
60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %,
al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 134, en donde el polipéptido de distrofina miniaturizada cuando es expresado a partir de la secuencia de nucleótidos tiene al menos una actividad de distrofina. En algunas realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 135. En determinadas realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 136. En determinadas realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o al menos aproximadamente el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 137. En determinadas realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 138, en donde el polipéptido de distrofina miniaturizada cuando es expresado a partir de la secuencia de nucleótidos tiene al menos una actividad de distrofina. En determinadas realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 139, en donde el polipéptido de distrofina miniaturizada cuando es expresado a partir de la secuencia de nucleótidos tiene al menos una actividad de distrofina. En determinadas realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 140, en donde el polipéptido de distrofina miniaturizada cuando es expresado a partir de la secuencia de nucleótidos tiene al menos una actividad de distrofina. En determinadas realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 141, en donde el polipéptido de distrofina miniaturizada cuando es expresado a partir de la secuencia de nucleótidos tiene al menos una actividad de distrofina. En determinadas realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 142, en donde el polipéptido de distrofina miniaturizada cuando es expresado a partir de la secuencia de nucleótidos tiene al menos una actividad de distrofina. En determinadas realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 143, en donde el polipéptido de distrofina miniaturizada cuando es expresado a partir de la secuencia de nucleótidos tiene al menos una actividad de distrofina. En determinadas realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 144, en donde el polipéptido de distrofina miniaturizada cuando es expresado a partir de la secuencia de nucleótidos tiene al menos una actividad de distrofina. En determinadas realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 145, en donde el polipéptido de distrofina miniaturizada cuando es expresado a partir de la secuencia de nucleótidos tiene al menos una actividad de distrofina. En determinadas realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 146, en donde el polipéptido de distrofina miniaturizada cuando es expresado a partir de la secuencia de nucleótidos tiene al menos una actividad de distrofina. En determinadas realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 147, en donde el polipéptido de distrofina miniaturizada cuando es expresado a partir de la secuencia de nucleótidos tiene al menos una actividad de distrofina.Endeterminadas realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 148, en donde el polipéptido de distrofina miniaturizada cuando es expresado a partir de la secuencia de nucleótidos tiene al menos una actividad de distrofina.Endeterminadas realizaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de ácido nucleico de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 149, en donde el polipéptido de distrofina miniaturizada cuando es expresado a partir de la secuencia de nucleótidos tiene al menos una actividad de distrofina.
Enlazador
En el presente documento también se proporciona una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos. En algunas realizaciones, la presente divulgación está dirigida a una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 100, en donde la secuencia de aminoácidos comprende SEQ ID NO:75 (IHTVREE TMMVMTEDMP LEI). En algunas realizaciones, la presente divulgación está dirigida a una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 99-100 en combinación, en donde la secuencia de aminoácidos comprende SEQ ID NO: 74-75 en combinación (SEAQIHTVREE TMMVMTEDMP LEI). En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 75 (I<h>T<v>REE TMMVMTEDMP LEI), en donde la molécula de ácido nucleico es de al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO: 100.
(A TC C A C A C C G T G C G G G A A G A G A C A A TG A TG G TC A TG A C A G A G G A C A TG C C C
CTGGA AA TC).
En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos puede utilizarse como un enlazador conectando uno o más dominios de distrofina. En algunas realizaciones, el enlazador conecta un primer dominio de distrofina y un segundo dominio de distrofina. En algunas realizaciones, el primer dominio y el segundo dominio de distrofina que pueden ser conectados son un dominio R1 y un dominio R16. En otras realizaciones, el primer dominio y el segundo dominio de distrofina que pueden ser conectados son un dominio R3 y un dominio R16. En otras realizaciones, el primer dominio y el segundo dominio de distrofina que pueden ser conectados son un dominio H2 y un dominio R16.
En algunas realizaciones, la divulgación incluye una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente el 60 %, al menos el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO 99 (AGTGAAGCTCAG).
En algunas realizaciones, la divulgación incluye una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente el 60 %, al menos el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO 100
(A TC C A C A C C G TG C G G G A A G A G A C A A TG A TG G TC A TG A C A G A G G A C A TG C C C
CTGGA AA TC).
En algunas realizaciones, la divulgación incluye una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de al menos el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a SEQ ID NO 99 y 100 en combinación,
(A G TG A A G C TC A G A TC C A C A C C G TG C G G G A A G A G A C A A TG A TG G TC A TG A C A
G A G G A C A TG CCC CTG G A A A TC).
En algunas realizaciones, el enlazador se coloca en un polipéptido de distrofina miniaturizada descrito en el presente documento conectando dos dominios del polipéptido de distrofina miniaturizada (por ejemplo, dominios H2 y R16). En algunas realizaciones, el enlazador está situado entre los dominios H2 y R16 en el polipéptido de distrofina miniaturizada que comprende el ABD1-H1-R1-R3-H2-L-R16-R17-R24-H4-CR-C-term, en donde ABD1 es el dominio de unión a actina 1, H1 es un dominio bisagra 1, R1 es un dominio de repetición de espectrina 1, R3 es un dominio de repetición de espectrina 3, H2 es un dominio bisagra 2, L es el enlazador, por ejemplo, SEQ ID NO: 74 o SEQ ID NO: 75 (o ambas en combinación) (o una secuencia que sea al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a estas secuencias), R16 es un dominio de repetición de espectrina 16, R17 es un dominio de repetición de espectrina 17, R24 es un dominio de espectrina 24, H4 es un dominio bisagra 4, CR es un dominio rico en cisteína y C-term es un dominio C-terminal opcional (o parte del mismo).
La presente divulgación también proporciona un enlazador que comprende IHTVREETMMVMTEDMPLEI (SEQ ID NO: 84). En algunas realizaciones, el enlazador que comprende la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 75 (IHTVREETMMVMTEDMPLEI) (o una secuencia que es al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % idéntica a la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 84 (IHTVREETMMVMTEDMPLEI)) se sitúa en un polipéptido de distrofina miniaturizada descrito en el presente documento mediante la conexión de dos dominios del polipéptido de distrofina miniaturizada (por ejemplo, los dominios R1 y R16). En algunas realizaciones, el enlazador está situado entre los dominios R1 y R16 en el polipéptido de distrofina miniaturizada que comprende el ABD1-H1-R1-L-R16-R17-H3-R23-R24-H4-CR-C-term, en donde ABD1 es el dominio de unión a actina 1, H1 es un dominio bisagra 1, R1 es un dominio de repetición de espectrina 1, L es el enlazador, por ejemplo, SEQ ID NO: 84, R16 es un dominio de repetición de espectrina 16, R17 es un dominio de repetición de espectrina 17, H3 es un dominio bisagra 3, R23 es un dominio de espectrina 23, R24 es un dominio de espectrina 24, H4 es un dominio bisagra 4, CR es un dominio rico en cisteína y C-term es un dominio C-terminal (o parte del mismo).
Polinucleótidos no codificantes
En algunos aspectos, en el presente documento se proporcionan moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, ADN o ARN, que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de distrofina miniaturizada.
En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento comprenden componentes no codificantes. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento comprenden promotores. Determinadas secuencias reguladoras ilustrativas para la expresión en células hospedadoras de mamífero incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteína en células de mamífero, tales como promotores y/o potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV), virus del Simio 40 (SV40), adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)) y polioma. Como alternativa, pueden utilizarse secuencias reguladoras no virales, tales como el promotor de la ubiquitina o el promotor de la globina p. Aún más, pueden utilizarse elementos reguladores compuestos por secuencias de distintas fuentes, tales como el sistema promotor SRa, que contienen secuencias del promotor temprano SV40 y la repetición terminal larga del virus de la leucemia humana de linfocitos T tipo 1 (Takebe, Y. et al. (1988)Mol. Cell. Biol.8:466-472). En determinadas realizaciones, la secuencia reguladora comprende un promotor específico de tejido. En algunas realizaciones, el promotor específico de tejido impulsa la expresión del gen de interés en un tejido seleccionado del grupo que consiste en corazón, hígado, pulmones, ojos, sistema nervioso, sistema linfático, sistema nervioso central, células neuronales, músculo y células madre.
En algunas realizaciones, los promotores descritos en el presente documento son promotores específicos de tejido. En algunas realizaciones, el promotor impulsa la expresión de la proteína terapéutica en los hepatocitos, miocitos, células endoteliales, células sinusoidales o células neuronales, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el promotor se selecciona del grupo que consiste en un promotor del gen de la sinapsina 1, un promotor de tirretina de ratón (mTTR), un promotor endógeno del factor VIII humano (F8), un promotor de la alfa-1-antitripsina humana (hAAT), un promotor mínimo de albúmina humana, un promotor de albúmina de ratón, un promotor de tristetraprolina (TTP), un promotor de CASI, un promotor de CAG, un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de la a1-antitripsina (AAT), un promotor de creatina cinasa muscular (MCK), un promotor de la cadena pesada de miosina alfa (aMHC), un promotor de mioglobina (MB), un promotor de la desmina (DES), un promotor Spc5-12, un promotor 2R5Sc5-12, un promotor dMCK, un promotor tMCK, un promotor de a-sinucleína y un promotor de fosfoglicerato quinasa (PGK).
En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento comprenden una secuencia intrónica. En algunas realizaciones, la secuencia intrónica se sitúa 5' a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de distrofina miniaturizada. En algunas realizaciones, la secuencia intrónica se sitúa a 3' del promotor. En algunas realizaciones, la secuencia intrónica comprende una secuencia intrónica sintética.
En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento comprenden un elemento regulador postranscripcional. En algunas realizaciones, el elemento regulador postranscripcional está situado 3' a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de distrofina miniaturizada. En algunas realizaciones, el elemento regulador postranscripcional comprende un elemento regulador postranscripcional mutado del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE), un sitio de unión de microARN, o una secuencia de ADN dirigida al núcleo o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento comprenden una secuencia de cola poli(A) de 3' UTR. En algunas realizaciones, la secuencia de cola poli(A) de 3'UTR se selecciona del grupo que consiste en bGH poli(A), actina poli(A), hemoglobina poli(A) y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la secuencia de cola poli(A) de 3'UTR comprende bGH poli(A).
En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento comprenden una secuencia potenciadora. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento comprenden una primera repetición terminal invertida (ITR) y/o una segunda ITR. En algunas realizaciones, la primera ITR y la segunda ITR son idénticas. En algunas realizaciones, la primera ITR y/o la segunda ITR se derivan del virus adenoasociado. En algunas realizaciones, la primera ITR se deriva del virus adenoasociado, y la segunda ITR se deriva del virus adenoasociado. Se reconoce además que la molécula de ácido nucleico puede comprender elementos adicionales que ayuden a la traducción del polipéptido. Dichas secuencias incluyen, por ejemplo, secuencias Kozak unidas al extremo 5' del polinucleótido que codifica el polipéptido. La secuencia consenso de Kozak es una secuencia que aparece en el ARNm eucariota que desempeña un papel en la iniciación del proceso de traducción y tiene el consenso (gee)gccRccAUGG (SEQ ID NO:150); en donde (1) una letra minúscula indica la base más común en una posición en la que, no obstante, la base puede variar; (2) las letras mayúsculas indican bases altamente conservadas, es decir, la secuencia "AUGG" es constante o poco frecuente, o nunca, cambia, con la excepción del código de ambigüedad "R" de la IUPAC, que indica que en esta posición se observa normalmente una purina (adenina o guanina); y (3) la secuencia entre paréntesis ((gee)) es de significado incierto.
En una realización no limitativa, la molécula de ácido nucleico comprende una variante funcional o un fragmento de la misma de una secuencia Kozak. Una variante funcional o fragmento de la misma de una secuencia Kozak conservará la capacidad de aumentar la traducción de la proteína en comparación con el nivel de traducción de una secuencia que carece del líder. Dicho fragmento funcional puede comprender al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40 nucleótidos continuos de una secuencia Kozak o la secuencia establecida en SEQ ID NO: 150 o SEQ ID NO:151 (gccaccATGG). Como alternativa, una variante funcional puede comprender al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia Kozak o la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 150 o SEQ ID NO: 151.
Fracciones heterólogas
En algunas realizaciones, los polipéptidos de la presente divulgación pueden comprender además un elemento adicional, por ejemplo, fracción heteróloga. Dichos elementos pueden ayudar a la expresión del polipéptido, ayudar a la secreción del polipéptido, mejorar la estabilidad del polipéptido, permitir una purificación más eficaz del polipéptido, y/o modular la actividad del polipéptido. En algunas realizaciones, la fracción heteróloga es una fracción polipeptídica. En otras realizaciones, la fracción heteróloga es una fracción no polipeptídica.
En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una fracción heteróloga fusionada al polipéptido.
En algunas realizaciones, el polipéptido descrito en el presente documento comprende una o más fracciones heterólogas adicionales. En algunas realizaciones, las fracciones heterólogas son fracciones que prolongan la semivida. En algunas realizaciones, la fracción heteróloga comprende albúmina o un fragmento de la misma, una región Fc de inmunoglobulina, el péptido C-terminal (CTP) de la subunidad p de la gonadotropina coriónica humana, una secuencia PAS, una secuencia HAP, una transferrina o un fragmento de la misma, o una fracción de unión a albúmina o un derivado de la misma, o cualquier combinación de las mismas.
En algunas realizaciones, los polipéptidos descritos en el presente documento comprenden una o más moléculas heterólogas adicionales. En algunas realizaciones, las fracciones heterólogas son fracciones que prolongan la semivida. En algunas realizaciones, la fracción heteróloga comprende albúmina, una región constante de inmunoglobulina o una porción de la misma, un polipéptido de unión a inmunoglobulina, una inmunoglobulina G (IgG), polipéptido de unión a la albúmina (ABP), una fracción de PASilación, una fracción de HESilación, XTEN, una fracción de PEGilación, o una región Fc, o cualquier combinación de los mismos.
Células
En determinados aspectos, se proporcionan en el presente documento células (por ejemplo, células hospedadoras) que expresan (por ejemplo, de manera recombinante) proteínas descritas en el presente documento y vectores de expresión que comprenden nucleótidos que codifican proteínas descritas en el presente documento.
En algunas realizaciones, la célula hospedadora comprende las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, la célula hospedadora comprende los vectores como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula eucariota. En algunas realizaciones, la célula hospedadora se selecciona del grupo que consiste en una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula de levadura, una célula transgénica de mamífero y una célula vegetal. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula procariota. En algunas realizaciones, la célula procariota es una célula bacteriana.
En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula de mamífero. Dichas células hospedadoras de mamífero incluyen, pero sin limitación, células CHO, VERO, BHK, HeLa, MDCK, HEK 293, NIH 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2<o>y T47D, NS0 (una línea celular de mieloma murino que no produce de manera endógena ninguna cadena de inmunoglobulina), CRL7O3O, COS (por ejemplo, COSI o COS), p Er .C6, VERO, HsS78Bst, HEK-293T, HepG2, SP210, R1.1, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB/20, BMT10, HBK, NSO, HT1080 y HsS78Bst.
Vectores
Virus adenoasociado (AAV)
Visión de conjunto
En el presente documento se proporcionan vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una proteína distrofina miniaturizada para la expresión recombinante en células hospedadoras y células dirigidas para intervención terapéutica. El término "vector", como se utiliza en el presente documento, pretende hacer referencia a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido; o una entidad que comprenda dicha molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle circular de ADN bicatenario en el que pueden ligarse segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde se pueden ligar segmentos de ADN adicionales al genoma viral. Determinados vectores, o polinucleótidos que forman parte de vectores, son capaces de realizar una replicación autónoma en una célula hospedadora en la cual se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episómicos de mamífero) se pueden integrar en el genoma de una célula hospedadora después de su introducción en la célula hospedadora, y de este modo se replican junto con el genoma del hospedador. Por otra parte, determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente "vectores de expresión").
En general, los vectores de expresión útiles en las técnicas de ADN recombinante están con frecuencia en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, el "plásmido" y el "vector" pueden utilizarse a veces indistintamente, dependiendo del contexto, ya que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de vector. Sin embargo, también se describen en el presente documento otras formas de vectores de expresión, tales como vectores viral (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adenoasociados), que tienen funciones equivalentes.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos descritos en el presente documento se expresan utilizando un virus adenoasociado (AAV). El AAV es un virus no envuelto, de ADN monocatenario de la familiaParvoviridae.A diferencia de la mayoría de los demás miembros de la familiaParvoviridae,el AAV es de replicación defectuosa y sólo es capaz de replicarse eficazmente en presencia de un virus ayudante, como el adenovirus o el herpesvirus.
El AAV se descubrió por primera vez a mediados de la década de 1960 como contaminante de preparaciones virales de adenovirus. Véase Atchison R W, Casto B C, HAMMON W M. Science. 149(3685), 754-756 (1965). Desde entonces, se han desarrollado métodos cada vez más seguros y eficaces para utilizar el AAV como vector de ADN recombinante. Véanse, por ejemplo, Hermonat P.L. y MuzyczkaN. Proc Natl Acad SciUSA. 81(20), 6466-6470 (1984).
3. Laughlin C.A., et al.Gene,23(1), 65-73 (1983). Matsushita T., et al.Gene Ther.5(7), 938-945 (1998). Xiao X., et al.Journal of Virology.72(3), 2224-2232 (1998). Se ha demostrado que un bajo número de genomas AAV se integran en el cromosoma del hospedador. Véase Cheung AK, Hoggan MD, Hauswirth WW, et al. Integration of the adenoassociated virus genome into cellular DNA in latently infected human detroit 6 cells.J Virol1980;33:739-748. El AAV es inmunológicamente distinto de cualquier antígeno adenovírico conocido. La cápside del AAV contiene un genoma de ADN monocatenario (ADNmc). Véase Rose JA, Berns KI, Hoggan MD, et al.Proc Natl Acad SciUSA 1969;64:863-869.
El AAV tiene un genoma de ADN de 4,7 kb monocatenario que codifica un gen de replicación (rep) y un gen de cápside (cap) flanqueados por dos repeticiones terminales invertidas (ITR). Es predominantemente no integrador y forma episomas estables en tejidos que no se dividen. A pesar de su elevada seroprevalencia en la población humana adulta, AAV no se ha asociado a ninguna enfermedad humana. Véase Gongalves,M. Virol. J.2, 43, (2005). La expresión estable del AAV en los tejidos, su falta de patogenicidad y su facilidad para producir títulos elevados lo han convertido en un vector muy atractivo y en una popular plataforma de transferencia de genes.
Un AAV recombinante (rAAV) es un AAV manipulado genéticamente en el que normalmente parte o todos los genesrepycaphan sido sustituidos por secuencias transgénicas heterólogas. Los AAV recombinantes también pueden desencadenar la expresión de transgenes a largo plazo en células posmitóticas, lo más probablemente debido a que el genoma AAV recombinante persiste como episomas en gran parte circular dentro del núcleo. El único elemento de ADNcisde rAAV necesario para la producción de rAAV son las repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV, mientras querep, capy los genes ayudantes adenovirales pueden proporcionarse entrans.Por tanto, en algunas realizaciones descritas en el presente documento, los rAAV contienen únicamente ADN transgénico heterólogo flanqueado por las ITR, y este genoma está encapsulado dentro de una cápside AAV específica del serotipo.
El AAV posee características únicas que lo hacen atractivo como sistema vectorial para administrar ADN extraño en las células. La infección por AAV de células en cultivo ha sido generalmente no citopática, y la infección natural de humanos y otros animales es silenciosa y asintomática. Por otra parte, AAV infecta muchos tipos diferentes de células de mamíferos, lo que permite dirigirse a muchos tejidos diferentesin vivo.El AAV también posee ventajas adicionales que lo convierten en un sistema viral especialmente atractivo para la liberación de genes, incluyendo la promoción de una respuesta inmunitaria que es relativamente leve en comparación con otras formas de administración de genes, y la expresión persistente tanto en células en división como quiescentes basada en el ADN del vector episómico, no integrante. También, AAV resiste las condiciones utilizadas para inactivar el adenovirus (56° a 65 °C durante varias horas), haciendo menos crítica la conservación en frío de las vacunas basadas en rAAV.
La replicación del ADN viral no es necesaria para la integración en el genoma de la célula hospedadora, por lo que el virus ayudante no es necesario para este proceso. El genoma proviral del AAV es infeccioso como ADN clonado en plásmidos, lo que hace factible la construcción de genomas recombinantes. Asimismo, debido a que las señales que dirigen la replicación del AAV, la encapsidación y la integración del genoma se encuentran en las ITR del genoma del AAV, las aproximadamente 4,7 kb internas del genoma (que codifican las proteínas de replicación y estructurales de la cápside,rep-cap)pueden, por tanto, sustituirse por ADN extraño, como un casete genético que contenga un promotor, un ADN de interés y una señal de poliadenilación.
Los vectores AAV pueden incluir elementos adicionales que funcionan enciso entrans.En realizaciones particulares, un vector AAV que incluye un genoma vectorial que también tiene una o más secuencias de repetición terminal invertida (ITR) que flanquean el extremo 5' o 3' de la secuencia donante; un elemento de control de la expresión que impulsa la transcripción (por ejemplo, un promotor o potenciador) de la secuencia donante, tal como un elemento de control constitutivo o regulable, o un elemento de control de expresión específico de un tejido; una secuencia intrónica, una secuencia polinucleotídica de relleno; y/o una secuencia de poli-Adenina situada a 3' de la secuencia donante.
En algunas realizaciones, el AAV se replica utilizando un virus auxiliar. Se conocen en la técnica diversos virus ayudantes de AAV, incluyendo adenovirus, herpesvirus y poxvirus tales como la vaccinia. Los adenovirus abarcan varios subgrupos diferentes, aunque el Adenovirus tipo 5 del subgrupo C es el más utilizado. Numerosos adenovirus de origen humano, de origen aviar y de mamíferos no humanos están disponibles en depósitos tales como el ATCC. Los virus de la familia del herpes incluyen, por ejemplo, virus del herpes simple (HSV) y virus de Epstein-Barr (EBV), así como los citomegalovirus (CMV) y los virus de la pseudorrabia (PRV); que también están disponibles en depositarios tales como ATCC.
Los vectores AAV ilustrativos incluyen secuencias de cápside de cualquiera de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 o AAV-2i8, o una variante de la cápside de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 o AAV-2i8. Los vectores de AAV recombinantes de la divulgación también incluyen AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 o AAV-2i8 y sus variantes. Las variantes particulares de la cápside incluyen variantes de la cápside de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 o AAV-2i8, tal como una secuencia de cápside con una sustitución de aminoácidos, deleción o inserción/adición. En una realización, el vector AAV es AAV9.
En algunos aspectos, la divulgación se refiere a AAV que tienen distintas capacidades que se dirigen al tejido (por ejemplo, tropismos tisulares). En algunas realizaciones, los polipéptidos de cápside de AAV variantes presentan además una mayor transducción o tropismo en uno o más tipos de células madre humanas en comparación con los polipéptidos de cápside parentales no variantes. En algunas realizaciones, los tipos de células madre humanas incluyen, entre otras, las células madre embrionarias, células madre de tejidos adultos (es decir, células madre somáticas), células madre de la médula ósea, células progenitoras, células madre pluripotentes inducidas y células madre reprogramadas. En algunas realizaciones, las células madre adultas pueden incluir células madre organoides (es decir, células madre derivadas de cualquier órgano o sistema de órganos de interés dentro del cuerpo). En algunas realizaciones, el tejido diana de un AAV es gónada, diafragma, corazón, estómago, hígado, bazo, páncreas, músculo o riñón. En algunas realizaciones, el AAV se dirige a órganos del cuerpo que incluyen, pero no se limitan a, piel, pelo, uñas, receptores sensoriales, glándulas sudoríparas, glándulas sebáceas, huesos, músculos, cerebro, médula espinal, nervios, glándula pituitaria, glándula pineal, hipotálamo, glándula tiroidea, glándula paratiroidea, timo, glándula suprarrenal, páncreas (tejido de los islotes), corazón, vasos sanguíneos, ganglios linfáticos, vasos linfáticos, timo, bazo, amígdalas, nariz, faringe, laringe, tráquea, bronquios, pulmones, boca, faringe, esófago, estómago, intestino delgado, intestino grueso, recto, canal anal, dientes, glándulas salivales, lengua, hígado, vesícula biliar, páncreas, apéndice, riñones, uréteres, vejiga urinaria, uretra, testículos, conducto deferente, uretra, próstata, pene, escroto, ovarios, útero, trompas uterinas (de Falopio), vagina, vulva y glándulas mamarias (pechos). Los sistemas de órganos del cuerpo incluyen, pero no se limitan a, el sistema tegumentario, sistema esquelético, sistema muscular, sistema nervioso, sistema endocrino, sistema cardiovascular, sistema linfático, sistema respiratorio, sistema digestivo, sistema urinario y reproductor. En algunas realizaciones, la transducción y/o el tropismo de un AAV con polipéptidos de cápside variantes se incrementa en aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 60 %, 65 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 %, en comparación con un AAV que tenga polipéptidos de cápside no variantes. En algunas realizaciones, la transducción y/o el tropismo se incrementa en aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 80 %, de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 70 %, de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 60 % o de aproximadamente el 30 % a aproximadamente el 60 %.
Genes de AAV de replicación, cápside y ensamblaje
El genoma monocatenario del AAV comprende tres genes,rep(replicación),cap(cápside), yaap(ensamblaje). Estos tres genes dan lugar al menos a nueve productos génicos mediante el uso de tres promotores, sitios alternativos de inicio de la traducción y corte y empalme diferencial.
El genrepcodifica cuatro proteínas (Rep78, Rep68, Rep52 y Rep40), necesarias para la replicación y el empaquetado del genoma viral.
La expresión del gen decapda lugar a las proteínas de la cápside viral (VP1; VP2; VP3), que forman la cubierta exterior de la cápside que protege el genoma viral, así como está implicado activamente en la unión e internalización celular. Se estima que la cubierta viral está compuesta por 60 proteínas dispuestas en una estructura icosaédrica.
El genaapcodifica la proteína activadora del ensamblaje (AAP) en un marco de lectura alternativo que se solapa con el gencap.Se cree que esta proteína nuclear cumple una función de andamiaje para el ensamblaje de la cápside y desempeña un papel en la localización nucleolar de las proteínas VP en algunos serotipos de AAV.
En algunas realizaciones, uno o más de los genesrep, cap,oaapson de origen natural, por ejemplo, los genesrep, cap,oappcomprenden la totalidad o una parte de los genesrep, cap,oaapdel parvovirus. En algunas realizaciones, el uno o más de los genesrep, cap,oaapcomprenden una secuencia sintética.
En una realización, el genrepcomprende una secuencia sintética. En una realización, el gencapcomprende una secuencia sintética. En una realización, el genaapcomprende una secuencia sintética. En una realización, los genesrepycapcomprenden una secuencia sintética. En una realización, los genesrepyaapcomprenden una secuencia sintética. En una realización, los genescapyaapcomprenden una secuencia sintética. En una realización, los genesrep, cap,yaapcomprenden una secuencia sintética.
En algunas realizaciones,repes de un genoma de AAV seleccionado entre AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 y cualquier combinación de los mismos. En una realización particular,repes del genoma de AAV1. En una realización particular,repes del genoma de AAV2. En una realización particular,repes del genoma de AAV3. En una realización particular,repes del genoma de AAV4. En una realización particular,repes del genoma de AAV5. En una realización particular,repes del genoma de AAV6. En una realización particular,repes del genoma de AAV7. En una realización particular,repes del genoma de AAV8. En una realización particular,repes del genoma de AAV9. En una realización particular,repes del genoma de AAV10. En una realización particular,repes del genoma de AAV11.
En algunas realizaciones,capes de un genoma de AAV seleccionado entre AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 y cualquier combinación de los mismos. En una realización particular,capes del genoma de AAV1. En una realización particular,capes del genoma de AAV2. En una realización particular,capes del genoma de AAV3. En una realización particular,capes del genoma de AAV4. En una realización particular,capes del genoma de AAV5. En una realización particular,capes del genoma de AAV6. En una realización particular,capes del genoma de AAV7. En una realización particular,capes del genoma de AAV8. En una realización particular,capes del genoma de AAV9. En una realización particular,capes del genoma de AAV10. En una realización particular,capes del genoma de AAV11.
En algunas realizaciones,aapes de un genoma de AAV seleccionado entre AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 y cualquier combinación de los mismos. En una realización particular,aapes del genoma de AAV1. En una realización particular,aapes del genoma de AAV2. En una realización particular,aapes del genoma de AAV3. En una realización particular,aapes del genoma de AAV4. En una realización particular,aapes del genoma de AAV5. En una realización particular,aapes del genoma de AAV6. En una realización particular,aapes del genoma de AAV7. En una realización particular,aapes del genoma de AAV8. En una realización particular,aapes del genoma de AAV9. En una realización particular,aapes del genoma de AAV10. En una realización particular,aapes del genoma de AAV11.
Debe entenderse que un genoma de AAV particular descrito en el presente documento podría tener genes derivados de diferentes genomas de AAV (por ejemplo, genomas de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 y AAV11). Por tanto, en el presente documento se describen AAV que comprenden cualquier permutación/combinación posible derep, capoaap.
En algunas realizaciones descritas en el presente documento, el AAV es AAV recombinante (rAAV). En algunas realizaciones, el rAAV carece de uno o más del genrep,el gencapy el gen aap. En algunas realizaciones, el rAAV carece de un genrep.En algunas realizaciones, el rAAV carece de un gencap.En algunas realizaciones, el rAAV carece de un genaap.En algunas realizaciones, el rAAV carece de un genrepy carece de un gencap.En algunas realizaciones, el rAAV carece de un genrepy de un genaap.En algunas realizaciones, el rAAV carece de un gencapy de un gen aap. En algunas realizaciones, el rAAV carece de un genrep,un gencapy un genaap.
En algunas realizaciones descritas en el presente documento, el rAAV se modifica de modo que uno o más de los genesrep,el gencapy el genaapestá mutado de modo que se modifica la expresión de uno o más de los genes AAV. En algunas realizaciones, el genrepestá mutado. En algunas realizaciones, el gencapestá mutado. En algunas realizaciones, el genaapestá mutado. En algunas realizaciones, el genrepy el gencapestán mutados. En algunas realizaciones, el genrepy el genaapestán mutados. En algunas realizaciones, el gencapy el genaapestán mutados. En algunas realizaciones, el gencap,el genrepy el genaapestán mutados.
Repeticiones terminales invertidas
En determinadas realizaciones, el AAV comprende una primera ITR, por ejemplo, una 5' ITR, y una segunda ITR, por ejemplo, una 3' ITR. Típicamente, las ITR están implicadas en la replicación y rescate del ADN de parvovirus (por ejemplo, AAV), o en la escisión, a partir de plásmidos procariotas (Samulski et al., 1983, 1987; Senapathy et al., 1984; Gottlieb y Muzyczka, 1988). Adicionalmente, se ha informado de que las ITR son las secuencias mínimas necesarias para la integración proviral del AAV y para el empaquetado del ADN del AAV en viriones (McLaughlin et al., 1988; Samulski et al. 1989). Estos elementos son esenciales para la multiplicación eficaz del genoma de un parvovirus.
En algunas realizaciones, la ITR comprende una ITR natural, por ejemplo, la ITR comprende todo o parte de una ITR de parvovirus. En algunas realizaciones, la ITR comprende una secuencia sintética. En una realización, la primera ITR o la segunda ITR comprende una secuencia sintética. En otra realización, cada una de la primera ITR y la segunda ITR comprende una secuencia sintética. En algunas realizaciones, la primera ITR o la segunda ITR comprende una secuencia de origen natural. En otra realización, cada una de la primera ITR y la segunda ITR comprende una secuencia de origen natural.
En algunas realizaciones, la ITR comprende una ITR de un genoma de AAV. En algunas realizaciones, la ITR es una ITR de un genoma de AAV seleccionado entre AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 y cualquier combinación de los mismos. En una realización particular, la ITR es una ITR del genoma de AAV2. En otra realización, la ITR es una secuencia sintética modificada genéticamente para incluir en sus extremos 5' y 3' ITR derivadas de uno o más de los genomas de AAV. En algunas realizaciones, las ITR proceden del mismo genoma, por ejemplo, del genoma del mismo virus, o de genomas diferentes, por ejemplo, de los genomas de dos o más genomas de AAV diferentes. En determinadas realizaciones, las ITR se derivan del mismo genoma de AAV. En una realización específica, las dos ITR presentes en la molécula de ácido nucleico de la invención son las mismas, y en particular pueden ser ITR de AAV2. En una realización particular, la primera ITR y la segunda ITR son idénticas.
En algunas realizaciones, las ITR forman estructuras de bucle de horquilla. En una realización, la primera ITR forma una estructura de horquilla. En otra realización, la segunda ITR forma una estructura de horquilla. Aún en otra realización, tanto la primera ITR como la segunda ITR forman estructuras en horquilla.
En algunas realizaciones, una ITR en una molécula de ácido nucleico descrita en el presente documento es una ITR activada transcripcionalmente. Una ITR activada transcripcionalmente puede comprender toda o una parte de una ITR de tipo silvestre que ha sido activada transcripcionalmente mediante la inclusión de al menos un elemento transcripcionalmente activo. Diversos tipos de elementos transcripcionalmente activos son adecuados para su uso en este contexto. En algunas realizaciones, el elemento transcripcionalmente activo es un elemento transcripcionalmente activo constitutivo. Los elementos constitutivos transcripcionalmente activos proporcionan un nivel continuo de transcripción génica y pueden utilizarse cuando se desea que el transgén se exprese de forma continua. En otras realizaciones, el elemento transcripcionalmente activo es un elemento transcripcionalmente activo inducible. Los elementos transcripcionalmente activos inducibles suelen mostrar una baja actividad en ausencia de un inductor (o condición inductora), y se regulan al alza en presencia del inductor (o al pasar a una condición inductora). Los elementos transcripcionalmente activos inducibles pueden utilizarse cuando se desea la expresión sólo en determinados momentos o en determinados lugares, o cuando se desea titular el nivel de expresión utilizando un agente inductor. Los elementos transcripcionalmente activos también pueden ser específicos de tejido; es decir, presentan actividad sólo en determinados tejidos o tipos celulares. Los elementos transcripcionalmente activos, pueden incorporarse a una ITR de diversas maneras. En algunas realizaciones, un elemento transcripcionalmente activo se incorpora 5' a cualquier porción de una ITR o 3' a cualquier porción de una ITR. En otras realizaciones, un elemento transcripcionalmente activo de una ITR transcripcionalmente activada se encuentra entre dos secuencias ITR. Si el elemento transcripcionalmente activo comprende dos o más elementos que deben estar espaciados, esos elementos pueden alternarse con partes de la ITR. En algunas realizaciones, una estructura en horquilla de una ITR se somete a deleción y se sustituye por repeticiones invertidas de un elemento transcripcional. Esta última disposición crearía una horquilla que imitaría la estructura de la porción delecionada. En una ITR activada transcripcionalmente también pueden estar presentes múltiples elementos transcripcionalmente activos en tándem, y éstos pueden ser adyacentes o estar espaciados. Adicionalmente, se pueden introducir sitios de unión a proteínas (por ejemplo, sitios de unión a Rep) en elementos transcripcionalmente activos de las ITR activadas transcripcionalmente. Un elemento transcripcionalmente activo puede comprender cualquier secuencia que permita la transcripción controlada del ADN por la ARN polimerasa para formar ARN, y puede comprender, por ejemplo, un elemento transcripcionalmente activo, como se define a continuación.
Las ITR activadas transcripcionalmente proporcionan tanto la activación transcripcional como las funciones de ITR a la molécula de ácido nucleico en una longitud de secuencia de nucleótidos relativamente limitada que maximiza eficazmente la longitud de un transgén que puede ser transportado y expresado a partir de la molécula de ácido nucleico. La incorporación de un elemento transcripcionalmente activo en una ITR puede realizarse de varias maneras. Una comparación de la secuencia de la ITR y los requisitos de secuencia del elemento transcripcionalmente activo puede proporcionar información sobre las formas de codificar el elemento dentro de una ITR. Por ejemplo, se puede añadir actividad transcripcional a una ITR mediante la introducción de cambios específicos en la secuencia de la ITR que replica los elementos funcionales del elemento transcripcionalmente activo. Existen varias técnicas en la técnica para eficazmente añadir, someter a deleción y/o modificar determinadas secuencias de nucleótidos en sitios específicos (véase, por ejemplo, Deng y Nickoloff (1992)Anal. Biochem.200:81-88). Otra forma de crear ITR activadas transcripcionalmente implica la introducción de un sitio de restricción en un lugar deseado de la ITR. Adicionalmente, múltiples elementos de activación transcripcional pueden incorporarse a una ITR de activación transcripcional, utilizando métodos conocidos en la técnica.
A modo de ilustración, las ITR activadas transcripcionalmente pueden generarse mediante la inclusión de uno o más elementos transcripcionalmente activos, tales como: caja TATA, caja GC, caja CCAAT, sitio Sp1, región de Inr, sitio CRE (elemento regulador del AMPc), sitio ATF-1/CRE, caja APBp, caja APBa, caja CArG, caja C<c>AC o cualquier otro elemento implicado en la transcripción conocido en la técnica.
Genes de interés y otras secuencias
Determinados aspectos de la presente divulgación se dirigen a métodos de administración a un sujeto de una terapia con AAV. En algunas realizaciones, el AAV comprende un gen de interés (GDI). En algunas realizaciones, el GDI es una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos como se describe en el presente documento, que codifica un polipéptido de distrofina miniaturizada como se describe en el presente documento.
El GDI que se expresa puede ser un segmento de ADN que codifica una proteína, con los elementos de control necesarios (por ejemplo, promotores, operadores) deseados por el usuario, o un segmento de ADN no codificante, cuya transcripción produce total o parcialmente alguna molécula que contiene ARN, tal como una ribozima o una molécula antisentido.
En algunas realizaciones, el AAV comprende más de un GDI. En los AAV con más de un GDI, algunas realizaciones incluyen elementos como IRES o 2A, para coexpresarlos desde un promotor. En algunas realizaciones, el AAV comprende dos genes de interés separados por un elemento IRES. En algunas realizaciones, el AAV comprende dos genes de interés separados por un elemento 2A. En algunas realizaciones, el AAV comprende tres genes de interés separados por un elemento IRES entre los genes de interés (por ejemplo, GDI-IRES-GDI-IRES-GDI). En algunas realizaciones, el AAV comprende tres genes de interés separados por elementos 2A entre los genes de interés.
En algunas realizaciones, el AAV comprende una secuencia reguladora. En algunas realizaciones, el AAV comprende ADN regulador no codificante. En algunas realizaciones, el genoma de AAV comprende secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de la cadena de anticuerpos en una célula hospedadora. La expresión "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o la traducción de los genes de cadenas de anticuerpos. Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del AAV, incluida la selección de las secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora que se va a transformar, el nivel de expresión deseado de la proteína, etc. En algunas realizaciones, el genoma del AAV comprende sitios donantes/aceptores de corte y empalme de ARNm. Determinadas secuencias reguladoras preferidas para la expresión en células hospedadoras de mamífero incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteína en células de mamífero, tales como promotores y/o potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV), virus del Simio 40 (SV40), adenovirus, (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)) y polioma. Como alternativa, pueden utilizarse secuencias reguladoras no virales, tales como el promotor de la ubiquitina o el promotor de la globina p. Aún más, los elementos reguladores compuestos por secuencias de diferentes fuentes, tales como el sistema promotor SRa, que contienen secuencias del promotor temprano SV40 y la repetición terminal larga del virus de la leucemia humana de linfocitos T tipo 1 (Takebe, Y. et al. (1988)Mol. Cell. Biol.8:466-472). En determinadas realizaciones, la secuencia reguladora comprende un promotor específico de tejido. En algunas realizaciones, el promotor específico de tejido impulsa la expresión del gen de interés en un tejido seleccionado del grupo que consiste en corazón, hígado, pulmones, ojos, sistema nervioso, sistema linfático, músculo y células madre.
Formulaciones AAV
En algunas realizaciones, el vector AAV se formula con un agente de administración. En algunas realizaciones, el agente de administración comprende una nanopartícula lipídica. En algunas realizaciones, el agente de administración se selecciona del grupo que consiste en liposomas, moléculas poliméricas no lipídicas, endosomas y cualquier combinación de los mismos.
Vectores no AAV
En el presente documento también se proporciona un vector que comprende los polinucleótidos descritos anteriormente enlazados operativamente a un promotor. Una secuencia de nucleótidos está "operativamente enlazada" a una secuencia de control de expresión (por ejemplo, un promotor) cuando la secuencia de control de expresión controla y regula la transcripción y traducción de dicha secuencia. La expresión "operativamente enlazado" cuando se refiere a una secuencia de nucleótidos incluye tener una señal de inicio apropiada (por ejemplo, ATG) delante de la secuencia de nucleótidos que se va a expresar y mantener el marco de lectura correcto para permitir la expresión de la secuencia bajo el control de la secuencia de control de expresión y la producción del producto deseado codificado por la secuencia. Si un gen que se desea insertar en una molécula de ácido nucleico recombinante no contiene una señal de inicio adecuada, dicha señal de inicio puede insertarse delante del gen. Un "vector" es un replicón, tal como un plásmido, fago o cósmido, al que se puede unir otro segmento de ácido nucleico para provocar la replicación del segmento unido. El promotor puede ser, o es idéntico a, un promotor de bacteria, levadura, insecto o mamífero.
En algunas realizaciones, el vector puede ser un plásmido, cósmido, cromosoma artificial de levadura (YAC), bacteriófago o ADN viral eucariota. Pueden emplearse otras numerosas cadenas principales vectoriales conocidas en la técnica por su utilidad para expresar proteínas. Dichos vectores incluyen, pero no se limitan a:
vector adenoviral, un vector retroviral, vector de poxvirus, un vector de baculovirus, un vector viral de herpes, virus de simio 40 (SV40), citomegalovirus (CMV), virus del tumor mamario de ratón (MMTV) y virus de la leucemia murina de Moloney. Además, una clase de vectores comprende elementos de ADN derivados de virus como el virus del papiloma bovino, virus del polioma, baculovirus, retrovirus o el virus del bosque de Semliki. Dichos vectores pueden obtenerse comercialmente o ensamblarse a partir de las secuencias descritas mediante métodos bien conocidos en la técnica.
En algunas realizaciones, el vector descrito en el presente documento se formula con un agente de administración. En algunas realizaciones, el agente de administración comprende una nanopartícula lipídica. En algunas realizaciones, el agente de administración se selecciona del grupo que consiste en liposomas, moléculas poliméricas no lipídicas, endosomas y cualquier combinación de los mismos.
Composiciones farmacéuticas
Los diversos polipéptidos y polinucleótidos descritos en el presente documento (también denominados en el presente documento "compuestos activos") pueden incorporarse a composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración. Dichas composiciones comprenden típicamente el polipéptido, o los polinucleótidos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende incluir cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de dichos medios y agentes para compuestos farmacéuticamente activos se conoce bien en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier agente o medio convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones. También pueden incorporarse compuestos activos complementarios en las composiciones.
En algunas realizaciones, se describe una composición farmacéutica que comprende (a) un polipéptido como se describe en el presente documento y (b) un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, se describe una composición farmacéutica que comprende (a) una composición que comprende un polipéptido como se describe en el presente documento y (b) un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, se describe una composición farmacéutica que comprende (a) un polinucleótido como se describe en el presente documento y (b) un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, se describe una composición farmacéutica que comprende (a) un vector (por ejemplo, rAAV) como se describe en el presente documento y (b) un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, se describe una composición farmacéutica que comprende (a) una célula hospedadora como se describe en el presente documento y (b) un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Una composición farmacéutica de la divulgación se formula para que sea compatible con su vía de administración prevista. Los ejemplos de las vías de administración incluyen parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral, transdérmica (tópica) y transmucosa, y cualquier combinación de las mismas. Otra vía de administración incluye la administración pulmonar. Adicionalmente, puede ser deseable administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica localmente a una zona que necesite tratamiento. Esto puede conseguirse mediante, por ejemplo, infusión o perfusión local o regional durante la cirugía, aplicación tópica, inyección, catéter, supositorio o implante (por ejemplo, implantes formados por materiales porosos, no porosos o gelatinosos, incluyendo membranas, tales como membranas o fibras sialásticas), y similares. En otra realización, la cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica se administra en una vesícula, tal como los liposomas (véase, por ejemplo, Langer,Science249:1527-33, 1990 y Treat et al., en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein y Fidler (eds.), Liss, N.Y., págs. 353-65, 1989).
En otra realización más, la cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica puede administrarse en un sistema de liberación controlada. En un ejemplo, puede usarse una bomba (véanse, por ejemplo,Langer,Science249:1527-33, 1990; Sefton,Crit. Rev. Biomed. Eng.14:201-40 (1987); Buchwald et al.,Surgeiy88:507-16, 1980; Saudek et al.,N. Engl. J. Med.321:574-79, 1989). En otro ejemplo, pueden utilizarse materiales poliméricos (véase, por ejemplo, Levy et al.,Science228:190-92, 1985; During et al.,Ann. Neural.25:351-56, 1989; Howard et al.,J. Neurosurg.71:105-12, 1989). Se pueden utilizar otros sistemas de liberación controlada, tales como los analizados por Langer(Science249:1527-33, 1990).
Los vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos, tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos, tales como TWEEN™, PLURo N iCS™ o polietilenglicol (p Eg ).
Los vehículos farmacéuticamente aceptables utilizados en las preparaciones parenterales incluyen vehículos acuosos, vehículos no acuosos, agentes antimicrobianos, agentes isotónicos, tampones, antioxidantes, anestésicos locales, agentes de suspensión y dispersión, agentes emulsionantes, agentes secuestrantes o quelantes y otras sustancias farmacéuticamente aceptables. Ejemplos de vehículos acuosos incluyen inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección isotónica de dextrosa, inyección de agua estéril, inyección de Ringer de dextrosa y lactada. Los vehículos parenterales no acuosos incluyen aceites no volátiles de origen vegetal, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz, aceite de sésamo y aceite de cacahuete. Pueden añadirse agentes antimicrobianos en concentraciones bacteriostáticas o fungistáticas a las preparaciones parenterales envasadas en recipientes multidosis, que incluyen fenoles o cresoles, mercuriales, alcohol bencílico, clorobutanol, metil y propil ésteres del ácido p-hidroxibenzoico, timerosal, cloruro de benzalconio y cloruro de bencetonio. Los agentes isotónicos incluyen cloruro de sodio y dextrosa. Los tampones incluyen fosfato y citrato. Los antioxidantes incluyen bisulfato sódico. Los anestésicos locales incluyen clorhidrato de procaína. Los agentes de suspensión y dispersión incluyen carboximetilcelulosa de sodio, hidroxipropil metilcelulosa y polivinilpirrolidona. Entre los agentes emulsionantes se incluye el polisorbato 80 (TWEEN® 80). Un agente secuestrante o quelante de iones metálicos incluye EDTA. Los vehículos farmacéuticos también incluyen alcohol etílico, polietilenglicol y propilenglicol para los vehículos miscibles en agua; e hidróxido sódico, ácido clorhídrico, ácido cítrico o ácido láctico para el ajuste del pH.
Las soluciones o suspensiones usadas para la aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites no volátiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos, tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes, tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad, tales como cloruro sódico o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede estar contenida en ampollas, jeringuillas desechables o viales multidosis hechos de vidrio o plástico.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles (cuando son hidrosolubles) y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor ELS (BASF; Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición ha de ser estéril y debe ser fluida hasta el punto de que pueda inyectarse fácilmente. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y ha de preservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. Puede lograrse la prevención de la acción de microorganismos mediante diferentes agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio, en la composición. Se puede conseguir una absorción prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse mediante la incorporación del compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente adecuado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, se preparan dispersiones mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación pueden ser el secado al vacío y la liofilización, lo que proporciona un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución esterilizada por filtración de los mismos.
Para la administración por inhalación, los péptidos se administración en forma de una pulverización de aerosol a partir de un recipiente o dispensador a presión que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas, tal como dióxido de carbono, o un nebulizador. La administración sistémica también puede ser por medios transmucosos o transdérmicos.
Para la administración transmucosa o transdérmica, se usan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera a permear. Dichos penetrantes se conocen generalmente en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados del ácido fusídico. La administración transmucosa puede realizarse mediante el uso de pulverizaciones nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en pomadas, bálsamos, geles o cremas, como se conoce generalmente en la técnica. Los compuestos también pueden prepararse en forma de supositorios (por ejemplo, con bases para supositorios convencionales, tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para administración rectal.
En una realización, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegerán al compuesto contra su rápida eliminación del organismo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de dichas formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también se pueden adquirir en el mercado de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. También pueden usarse suspensiones liposómicas como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos para los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos N.° 4.522.811.
Es especialmente ventajoso formular las composiciones orales o parenterales en forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosis. La forma de unidad de dosificación, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto a tratar, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosis unitaria de la divulgación está dictada por y depende directamente de las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico particular que se vaya a lograr y de las limitaciones inherentes en la técnica de formar compuestos de dicho compuesto activo para el tratamiento de individuos. Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un recipiente, paquete o dispensador junto con las instrucciones para su administración.
Usos y Métodos
Métodos de producción de distrofinas miniaturizadas
En el presente documento también se describen métodos para producir un polipéptido de distrofina miniaturizada, que comprende: cultivar una célula hospedadora descrita en el presente documento bajo condiciones adecuadas y recupera el polipéptido de distrofina miniaturizada.
Como se utiliza en el presente documento, un polinucleótido o molécula de ácido nucleico "aislada" es una que se separa de otras moléculas de ácidos nucleicos que están presentes en la fuente natural (por ejemplo, en un ratón o un ser humano) de la molécula de ácido nucleico. Por otra parte, una molécula de ácido nucleico "aislada", tal como una molécula de ADNc, puede estar sustancialmente exenta de otro material celular o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes o estar sustancialmente exenta de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetiza químicamente. Por ejemplo, la expresión "sustancialmente exento" incluye preparaciones de una molécula de polinucleótido o de ácido nucleico que tiene menos de aproximadamente el 15 %, 10 %, 5 %, 2 %, 1 %, 0,5 % o 0,1 % (en particular menos de aproximadamente el 10 %) de otro material, por ejemplo, material celular, medio de cultivo, otras moléculas de ácidos nucleicos, precursores químicos y/u otras sustancias químicas. En una realización específica, se aísla o purifica una o varias moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido descrito en el presente documento.
Pueden obtenerse los polinucleótidos y puede determinarse la secuencia de nucleótidos de los polinucleótidos, mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos descritos en el presente documento, por ejemplo, los polipéptidos descritos en las Tablas 3 y 4, y las versiones modificadas de estos polipéptidos pueden determinarse utilizando métodos bien conocidos en la técnica, es decir, los codones de nucleótidos conocidos para codificar aminoácidos particulares se ensamblan de tal forma que generan un ácido nucleico que codifica los polipéptidos. Dicho polinucleótido que codifica el polipéptido puede ensamblarse a partir de oligonucleótidos sintetizados químicamente (por ejemplo, como se describe en Kutmeier G et al., (1994),BioTechniques17: 242-6), en resumen, implica la síntesis de oligonucleótidos solapantes que contienen porciones de la secuencia que codifica el polipéptido, la hibridación y la ligación de esos oligonucleótidos y, a continuación, la amplificación de los oligonucleótidos ligados mediante una PCR.
Como alternativa, un polinucleótido que codifica un polipéptido descrito en el presente documento puede generarse a partir de ácido nucleico de una fuente adecuada (por ejemplo, un hibridoma) utilizando métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, PCR y otros métodos de clonación molecular). Por ejemplo, la amplificación por PCR utilizando cebadores sintéticos hibridables a los extremos 3' y 5' de una secuencia conocida puede realizarse utilizando ADN genómico obtenido a partir de células de hibridoma productoras del polipéptido de interés. Dichos métodos de amplificación por PCR pueden utilizarse para obtener ácidos nucleicos que comprenden la secuencia que codifica, por ejemplo, IL2, una secuencia enlazadora, o IL2-Ra. Los ácidos nucleicos amplificados pueden clonarse en vectores para su expresión en células hospedadora y para su posterior clonación, por ejemplo, para generar polipéptidos.
Si no está disponible un clon que contiene un ácido nucleico que codifica el polipéptido particular, pero se conoce la secuencia de la molécula polipeptídica, un ácido nucleico que codifica el polipéptido puede sintetizarse químicamente u obtenerse de una fuente adecuada (por ejemplo, una biblioteca de ADNc o una biblioteca de ADNc generada a partir de, o ácido nucleico, preferentemente ARN poli A+, aislada de, cualquier tejido o célula que exprese las proteínas de interés, tales como células de hibridoma seleccionadas para expresar un polipéptido descrito en el presente documento) mediante amplificación por PCR utilizando cebadores sintéticos hibridables con los extremos 3' y 5' de la secuencia o mediante clonación utilizando una sonda oligonucleotídica específica para la secuencia génica particular que se desea identificar, por ejemplo, un clon de ADNc de una colección de ADNc que codifica los polipéptidos. Los ácidos nucleicos amplificados generados mediante la PCR pueden ser clonados, a continuación, en vectores de clonación replicables utilizando cualquier método bien conocido en la técnica.
El ADN que codifica los polipéptidos descritos en el presente documento puede aislarse y secuenciarse fácilmente mediante procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos capaces de unirse específicamente a los genes que codifican los polipéptidos descritos en el presente documento). Las células de hibridoma pueden servir como fuente de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que después se transfectan en células hospedadoras, tales como células deE. coli,células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) (por ejemplo, células CHO del CHO GS SYSTEM™ (Lonza)), o células de mieloma que de otro modo no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de polipéptidos en las células hospedadoras recombinantes.
Usos y métodos terapéuticos
Los polipéptidos de distrofina miniaturizada, los polinucleótidos que codifican polipéptidos de distrofina miniaturizada, los vectores (por ejemplo, rAAV) que albergan polinucleótidos que codifican polipéptidos de distrofina miniaturizada y los métodos descritos en el presente documento tienen numerosas utilidadesin vitroein vivo.Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de distrofina miniaturizada, por ejemplo, un vector, por ejemplo, un vector AAV o los polipéptidos descritos en el presente documento pueden administrarse a células en cultivo,in vitrooex vivo,o a sujetos humanos, por ejemplo,in vivo,para tratar enfermedades.
En consecuencia, en el presente documento se describen métodos terapéuticos que usan cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de distrofina miniaturizada como se describen en el presente documento, polipéptidos como se describen en el presente documento, células hospedadoras como se describen en el presente documento, vectores como se describen en el presente documento, o composiciones farmacéuticas como se describen en el presente documento, o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, en el presente documento se describe un método para expresar un polipéptido de distrofina miniaturizada en un sujeto que lo necesita, que comprende la administración al sujeto de un ácido nucleico tal como se describe en el presente documento, un vector como se describe en el presente documento, una célula hospedadora como se describe en el presente documento, o una composición farmacéutica como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, en el presente documento se describe un método para tratar un sujeto que padece una enfermedad o afección que comprende la administración al sujeto de un ácido nucleico como se describe en el presente documento, un vector como se describe en el presente documento, un polipéptido como se describe en el presente documento, una célula hospedadora como se describe en el presente documento, o una composición farmacéutica como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección es causada por deficiencia de distrofina. En algunas realizaciones, la enfermedad es la distrofia muscular de Duchene (DMD), distrofia muscular de Becker (BMD), miocardiopatía dilatada ligada al cromosoma X (XLDC), distrofia muscular facioescapulohumeral, distrofia muscular miotónica, distrofia muscular de la cintura y extremidades, distrofia muscular oculofaríngea, distrofia muscular de Emery-Dreifuss, distrofia muscular distal y/o distrofia muscular congénita. En otras realizaciones, la enfermedad que se va a tratar es Sarcopenia, cardiopatía, caquexia.
En algunas realizaciones, se administra por vía intravenosa un ácido nucleico como se describe en el presente documento, un polipéptido como se describe en el presente documento, un vector (por ejemplo, rAAV) como se describe en el presente documento, una célula hospedadora como se describe en el presente documento, o una composición farmacéutica como se describe en el presente documento, se administra por vía intravenosa, transdérmica, intradérmica, subcutánea, oral o pulmonar, o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico como se describe en el presente documento, el polipéptido como se describe en el presente documento, el vector como se describe en el presente documento, la célula hospedadora, como se describe en el presente documento, o la composición farmacéutica, como se describe en el presente documento, se administra por vía tópica, mucosa epidérmica, intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual, tópica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intratecal, intralinfática, intralesional, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural o intraesternal. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico, el vector (por ejemplo, rAAV), la célula hospedadora como se describe en el presente documento, o el polipéptido se administra por vía intravenosa.
En a lg u n a s rea liza c io nes , los m é tod os de tra ta m ie n to c o m p re n d e n ad e m á s a d m in is tra r al su je to un se g u n d o agen te .
Como se utiliza en el presente documento, el término "sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano. Por ejemplo, los métodos y composiciones descritos en el presente documento se pueden utilizar para tratar a un sujeto que tiene cáncer. La expresión "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano.
En algunas realizaciones, la administración de la molécula de ácido nucleico, el vector (por ejemplo, rAAV), el polipéptido, la célula hospedadora o la composición farmacéutica al sujeto de como resultado un aumento de la expresión de la proteína distrofina, relativa a la expresión de la proteína distrofina en el sujeto antes de la administración, en donde la expresión de la proteína distrofina se aumenta al menos 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 11 veces, al menos aproximadamente 12 veces, al menos aproximadamente 13 veces, al menos aproximadamente 14 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 25 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 35 veces, al menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 60 veces, al menos aproximadamente 70 veces, al menos aproximadamente 80 veces, al menos aproximadamente 90 veces o al menos aproximadamente 100 veces.
En determinados aspectos de la divulgación, el método comprende, o comprende además, administrar una terapia con AAV al sujeto. En algunas realizaciones, la terapia con AAV comprende la administración de un AAV recombinante. En los métodos de la presente divulgación puede utilizarse cualquier AAV recombinante conocido en la técnica y/o descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la terapia con AAV comprende la administración de un AAV seleccionado del grupo que consiste en AAV tipo 1, AAV tipo 2, AAV tipo 3 (incluidos los tipos 3A y 3B), AAV tipo 4, AAV tipo 5, AAV tipo 6, AAV tipo 7, AAV tipo 8, AAV tipo 9, AAV tipo 10, AAV tipo 11, AAV tipo 12, AAV tipo 13, AAV de serpiente, AAV aviar, AAV bovino, AAV canino, AAV equino, AAV ovino, AAV de cabra, AAV de camarón y cualquier combinación de los mismos. En determinadas realizaciones, la terapia con AAV comprende la administración de un AAV tipo 1. En determinadas realizaciones, la terapia con AAV comprende la administración de un AAV tipo 2. En determinadas realizaciones, la terapia con AAV comprende la administración de un AAV tipo 3. En determinadas realizaciones, la terapia con AAV comprende la administración de un AAV tipo 4. En determinadas realizaciones, la terapia con AAV comprende la administración de un AAV tipo 5. En determinadas realizaciones, la terapia con AAV comprende la administración de un AAV tipo 6. En determinadas realizaciones, la terapia con AAV comprende la administración de un AAV tipo 7. En determinadas realizaciones, la terapia con AAV comprende la administración de un AAV tipo 8. En determinadas realizaciones, la terapia con AAV comprende la administración de un AAV tipo 9. En determinadas realizaciones, la terapia con AAV comprende la administración de un AAV tipo 10. En determinadas realizaciones, la terapia con AAV comprende la administración de un AAV tipo 11. En determinadas realizaciones, la terapia con AAV comprende la administración de un AAV tipo 12. En determinadas realizaciones, la terapia con AAV comprende la administración de un AAV tipo 13.
En algunas realizaciones, el tratamiento de un sujeto con las moléculas de ácido nucleico de distrofina miniaturizada como se describe en el presente documento, polipéptidos como se describen en el presente documento, células hospedadoras como se describen en el presente documento, vectores como se describen en el presente documento, o composiciones farmacéuticas como se describen en el presente documento, o cualquier combinación de los mismos, no provoca reacciones inflamatorias significativas, por ejemplo, neumonitis inmunomediada, colitis inmunomediada, hepatitis inmunomediada, nefritis inmunomediada o disfunción renal, hipofisitis inmunomediada, hipotiroidismo e hipertiroidismo inmunomediados u otras reacciones adversas inmunomediadas. En algunas realizaciones, el tratamiento de un sujeto con las moléculas de ácido nucleico de distrofina miniaturizada como se describe en el presente documento, polipéptidos como se describen en el presente documento, células hospedadoras como se describen en el presente documento, vectores como se describen en el presente documento, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento, o cualquier combinación de las mismas, no causan trastornos cardíacos significativos, por ejemplo, arritmia ventricular; trastornos oculares, por ejemplo, iridociclitis; reacciones relacionadas con la infusión; aumento de la amilasa, aumento de la lipasa; trastornos del sistema nervioso, por ejemplo,mareo, neuropatía periférica y sensorial; trastornos del tejido cutáneo y subcutáneo, por ejemplo,erupción cutánea, prurito, dermatitis exfoliativa, eritema multiforme, vitíligo o psoriasis; trastornos respiratorios, torácicos y mediastínicos, por ejemplo, tos; fatiga; náuseas; disminución del apetito; estreñimiento; artralgia; o diarrea.
Kits
También se describen en el presente documento kits que comprenden una o más moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento, uno o más vectores (por ejemplo, rAAV) como se describe en el presente documento, uno o más polipéptidos como los descritos en el presente documento, o una o más células hospedadoras como se describen en el presente documento, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el kit también incluye instrucciones para administrar cualquiera de los anteriores, o una combinación de los mismos, a un sujeto que lo necesita.
Los términos "kit" y "sistema", como se utilizan en el presente documento, se refieren al menos a una o más moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento, uno o más vectores (por ejemplo, rAAV) como se describe en el presente documento, uno o más polipéptidos como se describe en el presente documento, o una o más células hospedadoras como se describe en el presente documento, o cualquier combinación de los mismos, que, en realizaciones específicas, están en combinación con otro u otros tipos más de elementos o componentes (por ejemplo, otros tipos de reactivos bioquímicos, recipientes, envases, tales como los envases para la venta comercial, instrucciones de uso y similares).
En algunas realizaciones, se describe un kit que comprende (a) uno o más de un polipéptido de distrofina miniaturizada como se describe en el presente documento, una composición que comprende un polipéptido de distrofina miniaturizada como se describe en el presente documento, un ácido nucleico que codifica un polipéptido de distrofina miniaturizada como se describe en el presente documento, un vector (por ejemplo, rAAV), y/o una célula hospedadora; y (b) e instrucciones para administrar cualquiera de anteriores a un sujeto que los necesite. En algunas realizaciones, se describe un kit que comprende (a) un polipéptido de distrofina miniaturizada como se describe en el presente documento y (b) e instrucciones para administrar el polipéptido de distrofina miniaturizada a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se describe un kit que comprende (a) una composición que comprende un polipéptido de distrofina miniaturizada como se describe en el presente documento y (b) e instrucciones para administrar la composición a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se describe un kit que comprende (a) un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de distrofina miniaturizada como se describe en el presente documento y (b) e instrucciones para administrar el nucleico a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se describe un kit que comprende (a) un vector como se describe en el presente documento y (b) e instrucciones para administrar el vector a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se describe un kit que comprende (a) un vector AAV como se describe en el presente documento y (b) e instrucciones para administrar el vector a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se describe un kit que comprende (a) una célula hospedadora como se describe en el presente documento y (b) e instrucciones para administrar la célula hospedadora a un sujeto que lo necesite.
En una realización específica, en el presente documento se proporciona un envase o un kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento, tal como uno o más péptidos de distrofina miniaturizada proporcionados en el presente documento. En algunas realizaciones, los kits contienen una composición farmacéutica descrita en el presente documento y un agente profiláctico o terapéutico, tal como aquellos descritos en el presente documento. En determinadas realizaciones, los kits pueden contener un mitógeno de linfocitos T, tales como, por ejemplo, fitohemaglutinina (PHA) y/o acetato de forbol miristato (PMA), o un anticuerpo estimulante del complejo TCR, tal como un anticuerpo anti-CD3 y anti-CD28. Opcionalmente, asociado a dicho(s) recipiente(s), puede haber un aviso en la forma prescrita por un organismo estatal que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, que refleje la aprobación por parte de la agencia para su fabricación, uso o venta para administración a seres humanos.
También se proporcionan en el presente documento kits que pueden usarse en los métodos anteriores. En una realización, un kit comprende un polipéptido de distrofina miniaturizada descrito en el presente documento, preferentemente un polipéptido de distrofina miniaturizada purificado, en uno o más recipientes. En una realización específica, los kits descritos en el presente documento contienen un polipéptido de distrofina miniaturizada sustancialmente aislado como control. En otra realización específica, los kits descritos en el presente documento comprenden además una proteína de control que no reacciona con un antígeno polipeptídico de distrofina miniaturizada. En otra realización específica, los kits descritos en el presente documento contienen uno o más elementos para detectar la unión del polipéptido de distrofina miniaturizada a un antígeno de distrofina (por ejemplo, el polipéptido de distrofina miniaturizada puede ser conjugado a un sustrato detectable tal como un compuesto fluorescente, un sustrato enzimático, un compuesto radiactivo o un compuesto luminiscente, o un segundo anticuerpo que reconoce al primer anticuerpo puede conjugarse con un sustrato detectable). En realizaciones específicas, un kit proporcionado en el presente documento puede incluir un polipéptido de distrofina miniaturizada producido de manera recombinante o sintetizado químicamente. El antígeno de un polipéptido de distrofina miniaturizada descrito en el presente documento proporcionado en el kit también puede ser unido a un soporte sólido. En una realización más específica, los medios de detección del kit descrito anteriormente incluyen un soporte sólido al cual se adhiere un antígeno del polipéptido de distrofina miniaturizada. Dicho kit también puede incluir un anticuerpo anti-humano o un anticuerpo anti-ratón/rata marcado con el indicador. En esta realización, la unión del polipéptido de distrofina miniaturizada a un antígeno puede ser detectada por la unión de dicho anticuerpo marcado con indicador.
La práctica de la presente divulgación empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están incluidas en las habilidades de la técnica. Dichas técnicas se explican por completo en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2.a ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DnA Cloning, Volúmenes I y II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. patente de los Estados Unidos N.° 4.683.195; Hames y Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames y Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; el tratado, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vol. 154 y 155; Mayer y Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, Londres); Weir y Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); ); Crooks, Antisense drug Technology: Principles, strategies and applications, 2.a Ed. CRC Press (2007) y en Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley and Sons, Baltimore Md.).
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.
Ejemplos
Ejemplo 1: Nuevas distrofinas miniaturizadas con inmunogenicidad reducida y mayor estabilidad
Las mutaciones en el gen de la distrofina a menudo dan como resultado un deterioro de la estabilidad de la proteína distrofina correspondiente, que a su vez conduce a la degradación proteosómica de la proteína distrofina inestable, y la fisiopatología distrófica. De forma similar, miniaturizar el ADN codificador de distrofina para acomodar la limitada capacidad de empaquetado del AAV puede perjudicar la estabilidad de la correspondiente proteína distrofina miniaturizada.
La estabilidad de diversas proteínas distrofina miniaturizada fue examinada comparando las proporciones de proteína de distrofina:ARNm en células transfectadas con los correspondientes vectores de expresión de distrofina. Se generaron cardiomiocitos masculinos humanos isogénicos derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) que llevan un codón de parada prematuro E2035X en el gen de la distrofina que impidió la expresión endógena de la distrofina. Estas células fueron transfectadas con diversos casetes miniaturizados que expresaban proteínas distrofina miniaturizada y las proporciones de proteína distrofina:ARNm fueron examinadas después de que las células transfectadas habían sido cultivadasin vitrodurante 24 días. Los niveles de proteína se examinaron mediante un ensayo ELISA Meso Scale Discovery (MSD), y los niveles de ARNm mediante qrtPCR.
Las distrofinas miniaturizadas ensayadas y los resultados de los ensayos se muestran en las FIG. 2 y FIG. 3, respectivamente. Los datos indicaron que los péptidos de distrofina miniaturizada BXA-027741 (SEQ ID NO: 129) y B<x>A-027743 (SEQ ID NO: 132) proporcionan la mejor estabilidad de la proteína.
Posteriormente, la inmunogenicidad de las nuevas uniones creadas dentro de estos dos diseños más estables se ensayó utilizando una herramienta de predicción de inmunogenicidadin silico.Las nuevas uniones del diseño BXA-027743 (R1/vinculadorR16 (unión J1), R17/H3 y H3/R23 (unión J7)) (véase la FIG. 4 y no se muestra) se determinó que tenían un riesgo inmunogénico mínimo, basándose en el citado enfoquein silico.
Las nuevas uniones del diseño BXA-027741 (R1/R3 (unión J10), H2/enlazador R16 (unión J11) y R17/R24 (unión J9)) (véase la FIG. 5) se analizaron de forma similar. Se determinó que la unión J9 presentaba un riesgo inmunogénico mínimo, mientras que las uniones J10 y J11 podrían mejorarse.
El potencial inmunogénico de las citadas uniones del diseño BXA-027741, y sus variantes de unión, se ensayaron mediante un ensayo de proliferación de linfocitos Tin vitrocomo se describe a continuación. En resumen, se aislaron muestras de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sujetos humanos voluntarios sanos mediante centrifugación en gradiente de Ficoll (GE Healthcare) y se caracterizaron, en relación con la expresión de los antígenos linfocitarios humanos (HLA) de clase I y II, mediante una combinación de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) e hibridación con sondas de oligonucleótidos (ProImmune, Sarasota, FL).
Un panel de muestras de PBMC de 40 donantes, que tenían un perfil de expresión HLA muy parecido a las frecuencias de la población mundial, se utilizó para los análisis posteriores. Las muestras de PBMC se marcaron con CFSE (Invitrogen, Carlsbad, CA) para controlar la proliferación y se sembraron en placas de 96 pocillos en seis réplicas a 200.000 células por pocillo en RPMI (Lonza, Basilea, Suiza) con un 10 % de AB humano (Bioreclamation, Westbury, NY), aminoácidos no esenciales y pen-strep (ambos Gibco/Fisher Scientific).
Los péptidos de unión BXA-027741, variantes de los mismos, y péptidos de control se cultivaron cada uno con el panel de 40 muestras de PBMC a 1 pM durante 7 días, tras lo cual se lavó el medio y se marcaron las células con un anticuerpo monoclonal anti-CD4 y un anticuerpo monoclonal anti CD8 APC (BD Biosciences, Franklin Lake, NJ). Tras eliminar los anticuerpos no unidos mediante lavado, las células se fijaron con formalina al 3,7 % (Sigma, Louis, MO) en PBS y se analizaron mediante citometría de flujo para determinar el porcentaje de células CD4+ o CD8+ proliferantes. En la FIG. 6A (CD4+) y en la FIG. 6B (CD8+) se muestra el porcentaje de muestras (entre las 40 muestras de donantes) que mostraron una respuesta positiva tras siete días en cultivo con los diferentes péptidos de unión BXA-027741 y sus variantes, definida como un aumento significativo del número de células T CD4+ o CD8+ proliferantes en comparación con las PBMC incubadas en medios sin péptidos de unión o péptidos de control. Los péptidos de control utilizados fueron: (1) Péptido Framework Avastin; (2) Péptido VL6-VL c Dr 3; y (3) péptido PADr E-61309. Se descubrió que la versión 3 de la unión J10 (J10v3) era superior a la unión J10, y a otras versiones probadas de la misma, y que la versión 12 de la unión J11 (J11v12) era globalmente superior con respecto al riesgo inmunogénico a la unión J11.
El dominio C-terminal de la distrofina miniaturizada BXA-027741 fue entonces sometido a deleción para generar la distrofina miniaturizada BXA-196473 (SEQ ID NO:119) (FIG. 7) para acomodar mejor la limitada capacidad de empaquetado del AAV. A continuación, se utilizó J10v3 para sustituir a J10, y J11v12 para sustituir a J11, en distrofina miniaturizada BXA-196473, dando como resultado distrofina miniaturizada Bx A-196477 (SEQ ID NO:118) (FIG. 8A y 8B). Para crear J10v3 y J11v12, los aminoácidos RV se insertaron entre los aminoácidos 446 y 447, y los aminoácidos SEAQ se insertaron entre los aminoácidos 606 y 607, respectivamente, en BXA-196473 (S<e>Q ID NO:119) (FIG. 8A y 8B).
BXA-196473 (SEQ ID NO:119) se modificó adicionalmente con las otras versiones de unión ensayadas de la siguiente manera:
BXA-196474 (SEQ ID NO:120): Unión 9 versión 2 (J9v2) y Unión 11 versión 12 (J11v12)
BXA-196475 (SEQ ID NO:121): Unión 9 versión 5 (J9v5) y Unión 11 versión 12 (J11v12)
BXA-196476 (SEQ ID NO:122): Unión 9 versión 6 (J9v6) y Unión 11 versión 12 (J11v12)
BXA-196478 (SEQ ID NO:124): Unión 10 versión 6 (J10v6) y Unión 11 versión 12 (J11v12)
BXA-196479 (SEQ ID NO:125): Unión 11 Versión 12 (J11v12)
J9v2 es una sustitución de los aminoácidos LER por KNI entre el dominio R17 y el dominio R24, es decir, los aminoácidos 843 a 845 en BXA-196473.
J9v5 es una inserción de K entre el dominio R17 y el dominio R24, es decir, entre los aminoácidos 842 y 843 en BXA-196473.
J9v6 es una inserción de KNI entre el dominio R17 y el dominio R24, es decir, entre los aminoácidos 842 y 843 en BXA-196473.
J10v3 es una inserción de RV entre el dominio R1 y R3, es decir, entre los aminoácidos 446 y 447 en BXA-196473.
J10v6 es una inserción de RVLLQDI entre el dominio R1 y R3, es decir, entre los aminoácidos 446 y 447 en BXA-196473.
J11v12 es una inserción de SEAQ entre el dominio H2 y el enlazador antes del dominio R16, es decir, entre los aminoácidos 606 y 607 en BXA-196473.
A continuación, se ensayó la estabilidad de las distrofinas miniaturizadas resultantes como se ha descrito anteriormente (FIG. 9). Los resultados indicaron que el diseño de distrofina miniaturizada BXA-196477 (que contenía J10V3 y J11V12) no sólo tenía el riesgo inmunogénico más bajo, pero también era el más estable.
Adicionalmente, el diseño del polipéptido de distrofina miniaturizada BXA-212371 fue modificado sometiendo a deleción los últimos tres aminoácidos C-terminales, e insertando la secuencia variante de unión de aminoácidos KNDL (J2V10; entre el dominio de repetición de espectrina 17 (R17) y el dominio bisagra 3 (H3)) después de la posición de aminoácido 682 del BXA-212371 (dando como resultado la distrofina miniaturizada BXA-213788, SEQ ID NO:152), que resultó tener menor riesgo inmunogénico.
Ejemplo 2: Fisiologíain Vitro
Los iCM de DMD tienen una amplitud de canal Na+ más baja, cFPD (intervalo Q-T) prolongado y mayor variabilidad de la frecuencia de latido, cuando se comparan con iCM isogénicos de tipo silvestre utilizando matrices de electrodos múltiples. Los iCM de DMD también tienen una mayor transducción de Ca2+ y una menor impedancia que los iCM de tipo silvestre, con cada método confirmando la variabilidad de la frecuencia de latido en células no marcadas.
Se examina si la expresión de distrofina miniaturizada BXA-196477 en iCM de DMD que llevan la mutación E2035X puede mitigar el fenotipo DMD y mejorar los rasgos fisiológicos de las células. Se utilizan matrices multielectrodo, ensayo de contracción de impedancia y transitorios de Ca2+ para medir el efecto de la expresión miniaturizada de distrofina. También se sometieron a deleción el dominio C-terminal del BXA-027743 para generar el BXA-212371 y adaptarlo mejor a la limitada capacidad de empaquetado del AAV. La capacidad funcional de BXA-212371 para mitigar el fenotipo DMD y mejorar los rasgos fisiológicos de las mismas células se examina utilizando los mismos ensayos propuestos para BXA196477.
Los CM de hiPSC utilizadas en este estudio fueron células inducidas de DMD (E2035X) iCells adquiridas de Cellular Dynamics International, Madison, Wisconsin. Los fibroblastos ventriculares humanos se adquirieron de Lonza, Walkersville, Maryland. Se ha observado que las CM de hiPSC iCell tienen propiedades electrofisiológicas similares a las de los cardiomiocitos adultos primarios y responden de forma similar a una serie de inhibidores de los canales iónicos cardíacos, así como a agonistas y antagonistas de los receptores adrenérgicos y muscarínicos. Nuestro propio trabajo demostró que el cocultivo de CM de hiPSC con fibroblastos proporcionaba una preparación más estable para estudios electrofisiológicos en matrices de electrodos múltiples (MEA). Los CM de hiPSC se cultivan con CO2 al 7 % en placas de cultivo de 6 pocillos tratadas con gelatina al 0,1 % durante 7 días, a continuación, se tripsinizaron y diluyeron con fibroblastos cardíacos adultos humanos en una proporción aproximada de 5:1. A continuación, las suspensiones de CM de hiPSC y fibroblastos se cocultivaron en placas matriz multielectrodo (MEA) de 9 pocillos recubiertas de laminina (256-9wellMEA300/30iR-ITO-mq; Multichannel Systems). Los CM de hiPSC se infectaron con construcciones de expresión AAV9-mDys (que expresaban distrofinas miniaturizadas BXA-196477 y BXA-213788, FIG. 15D) a MOI de 1*106 durante 48 h y, a continuación, se evaluaron los efectos de los CM de hiPSC sobre los potenciales de campo extracelulares (FP) 7 y 9 días después de la infección. Tanto el BXA-196477 como el BXA-213788 mejoraron significativamente la velocidad de conducción en aproximadamente el 80 % en comparación con los CM de DMD (ANOVA de dos vías ***P<0,001 con prueba de Tukey posterior n = 6)(FIG. 15E). Un ELISA de distrofina confirmó la expresión de distrofina en las células (FIG. 15F).
La tecnología MEA permite realizar análisis espaciotemporales de alto contenido de células o tejidos excitables a partir de una matriz de electrodos extracelulares integrados en sustratos sobre los que se pueden cultivar células o colocar tejidos. Los potenciales de campo (FP) extracelulares son registrados por cada electrodo y corresponden a potenciales de acción celulares. Evaluación de la morfología de FP, y la velocidad de conducción proporciona una imagen de las actividades de los canales iónicos de un tratamiento, así como de los efectos sobre la repolarización y la conducción. Tras 7 días de cultivo de CM de hiPSC en placas MEA, formaron una monocapa que latía espontáneamente sobre los electrodos de registro incrustados en cada pocillo. Los FP espontáneos se registraron a partir de 28 electrodos/pocillo (30 um de diámetro, 300 um de separación entre centros) a una frecuencia de muestreo de 10 kHz utilizando un sistema USB-MEA256 y el programa informático de adquisición MC Rack (Multi Channel Systems). Tras un período de equilibrio de 20 minutos en un entorno humidificado a 37 °C con un suministro constante de CO2 al 5 % y O2 al 95 %, cada pocillo se transfectó con construcciones de expresión AAV9-mDys en 300 pl de medio de mantenimiento. Se monitorizaron y registraron los efectos de la expresión de distrofinas miniaturizadas en los intervalos entre impulsos (IPI) de los FP. Los datos se analizaron con el programa informático personalizado escrito en MatLab (Mathworks). La frecuencia de latidos (latidos/minuto), un sustituto de la frecuencia cardíaca, se calculó utilizando BR=60000/IPI, donde el IPI es el promedio de IPI (ms) de 100 segundos de registro en estado estacionario bajo cada condición. Los parámetros electrofisiológicos que deben medirse son la duración del potencial de campo, un sustituto de la repolarización, y la velocidad de conducción del potencial de campo. La duración del potencial de campo se corrigió para tener en cuenta los cambios en la frecuencia de los latidos (FPDc). Todos los tratamientos tenían al menos 3 réplicas. La velocidad de conducción se cuantificó midiendo los tiempos de activación del potencial de campo para cada electrodo incrustado en un pocillo de MEA durante un latido único propagado sincronizado. Los registros digitalizados de los potenciales de campo de cada electrodo se suavizaron utilizando un polinomio de suavizado de mínimos cuadrados de 21 puntos (Savitsky & Golay, 1964) con una ventana de 2,1 ms. El tiempo de activación es el valor del máximo en la derivada negativa de cada forma de onda del potencial de campo. El tiempo entre dos de los tiempos de activación más tempranos y más tardíos es el tiempo de conducción para la propagación del potencial de campo a través de una monocapa de cardiomiocitos y la distancia entre estos dos electrodos es la distancia de conducción. El tiempo de conducción dividido por la distancia de conducción de cada propagación es la velocidad de conducción de cada latido de los cardiomiocitos monocapa en un pocillo MEA (FIG. 15).
Los datos muestran que ambos diseños de distrofina miniaturizada mejoraron significativamente la velocidad de conducción (FIG. 15).
Ejemplo 3: Restablecimientoin vivode la fisiología del músculo esquelético
Los músculos esqueléticos deficientes en distrofina producen menos fuerza específica (fuerza por área) y son altamente susceptibles a lesión inducida por contracción. La restauración de la expresión de distrofina puede mitigar estos trastornos. Los ratones mdx distróficos son tratados sistémicamente con 2e14vg/kg de AAV9-C5-12-BXA-196477 o AAV9-C5-12-BXA-212371 a las 2 semanas de vida mediante inyección retro-orbital. La fisiología muscular de las extremidades se examina a las 8 semanas de vida. En resumen, se sujeta la rodilla del ratón y se coloca el pie en un estribo, y se mueve el estribo mientras se contraen al máximo los músculos con un electrodo de aguja. Este ensayo mide la producción de fuerza muscular tetánica y de contracción máxima y la lesión inducida por la contracción.
Ejemplo 4: Prevenciónin vivode la patología distrófica
Los músculos esqueléticos en el modelo de ratón mdx de DMD típicamente sufren necrosis y regeneración a partir de aproximadamente 3-4 semanas de vida. Los músculos regenerados suelen tener un tamaño más variable y contienen núcleos situados en el centro en secciones transversales congeladas. También, la fibrosis se hace más prevalente en los músculos regenerados. El tamaño de la fibra muscular, la proporción de núcleos localizados centralmente, y fibrosis en músculos mdx no tratados y músculos mdx tratados con<a>A<v>9-C5-12-BXA-196477 o AAV9-C5-12-BXA-212371. También se cuantifica la proporción de fibras musculares que expresan las distrofinas miniaturizadas. El diafragma, el gastrocnemio, el tibial anterior y los músculos cardíacos se examinan utilizando los programas informáticos de imágenes HALO y Columbus.
Ejemplo 5: Estudioin vivo
Esquema del estudio
Ratonesmdx4cvse trataron con 2e14vg/kg de AAV9-BXA-196477 o AAV9-BXA-213788 a las 2 semanas de vida. Dos semanas después de la administración, n = 3 ratones se sacrificaron para examinar el acoplamiento a diana de la distrofina miniaturizada (biodistribución y niveles de expresión). A los 2 meses de vida se examinó la fuerza y la resistencia del músculo tibial anterior derecho a lesiones inducidas por contracción (n = 10) de forma similar a la descrita previamente (Khairallah et. al., 2012). Los ratones se sacrificaron a los 3 meses de vida y se examinaron para determinar la participación de la diana y la prevención de la distrofia (FIG. 16).
Acoplamiento a diana
Inmunofluorescencia - Los músculos se congelaron en OCT en 2-metilbutaína en N2 líquido. Se sometieron a inmunotinción secciones congeladas de 10 um con anticuerpos para distrofina (Mandys106; DSHB; 1:200) y aglutinina de germen de trigo conjugada con Alexa-647. Se usó el anticuerpo Alexa-488 IgG2a para marcar el anticuerpo primario de distrofina. Las secciones se visualizaron con el microscopio confocal de cribado Phoenix Opera High Content (Perkin-Elmer) y se cuantificaron con el programa informático Columbus. En resumen, se invirtieron las imágenes Alexa-647, se utilizó el modo M para encontrar las células y calcular la morfología en una población selecta de células en secciones transversales <2.000 um2. A continuación, se calculó la intensidad del Alexa-488 y se seleccionó la población con intensidad superior a músculos de control demdx4cv.Más del 90 % de los músculos eran positivos para distrofina miniaturizada en ratones de 4 semanas y 12 semanas (FIG. 17).
ARNm - Para el aislamiento del ARN total, el tejido se homogeneizó utilizando Qiagen Tissuelyzer y el ARN se aisló utilizando un kit de tejido Qiagen RNeasy 96 Universal (número de catálogo Qiagen 74881). El tejido (aproximadamente 15) se colocó en microtubos de recogida del kit RNeasy que contenían 750 ul de reactivo Qiazol y una perla de acero de 5 mm, se homogeneizaron utilizando Tissuelyzer a 30 hz durante 2 min y se repitió esta etapa hasta la homogeneización, seguido de una centrifugación a 6000xg durante 1 min a 4 °C. A cada tubo se añadieron 150 ml de cloroformo y las muestras se agitaron en vórtex enérgicamente durante 15 segundos. Después de una incubación de 3 min a temperatura ambiente, las muestras se centrifugaron a 6000xg durante 15 min a 4 °C. Se extrajo la fase acuosa (aproximadamente 360 ul) y se transfirió a un nuevo tubo que contenía 1 volumen de EtOH al 70 % sin ARNasa. Todas las muestras se transfirieron a una placa RNeasy 96 de 96 pocillos y las placas se sellaron con cinta AirPore y se centrifugaron a 5600xg durante 4 min a temperatura ambiente. Se añadieron 400 ul de tampón RW1 por pocillo, se volvió a cerrar la placa y se centrifugó durante 4 min a 5600xg. Durante el centrifugado se preparó una solución madre de DNasaI añadiendo 550 ul de agua libre de ARNasa por vial de DNasa. Se diluyeron 670 ul de la solución madre de DNasa I en 7,3 ml de tampón RDD, se mezclaron y se almacenaron a 4 °C. Una vez finalizado el centrifugado, se desechó el flujo y se añadieron 80 ul de mezcla de DNasa I directamente al centro de cada pocillo y se incubó la placa a temperatura ambiente durante 15 min. Tras la incubación, se añadieron 400 ul de RW1 a cada pocillo y la placa se selló y se centrifugó durante 4 min a 5600xg. Se desechó el flujo pasante y se añadieron 800 ul de tampón RPE por pocillo, se volvió a sellar la placa y se centrifugó durante 4 minutos a 5600xg. Se repitió este proceso y se centrifugó la placa durante 10 min a 5600xg. A continuación, cada muestra se eluyó en un tubo nuevo añadiendo 60 ul de agua libre de ARNasa al centro de cada pocillo y centrifugando durante 4 min a 5600xg. Para mejorar la recuperación, los 60 ul se volvieron a aplicar en la placa y se centrifugaron durante 4 minutos más a 5600xg. La producción de ARN se cuantificó utilizando nanodrop 8000.
RT-PCR - Para la síntesis de ADNc y la posterior PCR, se añadió 1 ug de ARN a 1 pocillo de una placa de 96 pocillos en 10 ul de H2O (Plate-Axygen, PCR-96-C-S). A cada pocillo se añadieron 10 ul de mezcla maestra (High Capacity cDNA Reverse Transcription kit, Applied Biosystem) y la placa se centrifugó a 1000 rpm. La síntesis del ADNc se llevó a cabo a 25 °C durante 10 min, 37 °C durante 120 min, 85 °C durante 5 min seguido de un mantenimiento a 4 °C. Para qPCR, cada muestra se analizó por duplicado con conjuntos de cebadores/sondas (cebador directo 5'-TGGAAGATTGCTACGAGCGC-3'; cebador inverso 5'-CAGGTCGCTGAACAGGTTCT-3'; sonda-6FAM-GCAAGTTCGGCAAGCAGCACA-MGBNFG) en placas de reacción transparentes de 384 pocillos (applied biosystem; número de catálogo 4483285) A cada reacción se añadieron 2 ul de ADNc y 8 ul de mezcla maestra (5 ul de mezcla maestra fast advanced, 0,5 ul de mezcla de sonda cebadora 20X FAM y 2,5 ul de agua) y las placas se centrifugaron durante 1 min a 1000 rpm. Las muestras se incubaron a 95 °C durante 20 segundos seguidos de 40 ciclos a 95 °C durante 1 segundo y 60 °C durante 20 segundos utilizando el sistema ViiA7 y el programa informático Quant Studio de PCR en tiempo real para el análisis de datos (Applied Biosystem).
Aislamiento del genoma del vector/ADN genómico y qPCR - Para el aislamiento del ADN genómico, el tejido se homogeneizó utilizando Qiagen Tissuelyzer y el ADN genómico se aisló utilizando un kit Qiagen DNeasy 96 para sangre y tejidos (número de catálogo 69581 de Qiagen). El tejido (aproximadamente 10 mg) se colocó en una placa de 96 pocillos (bloque de ensayo costar de 1 ml, número de catálogo 3958) que contenía 200 ul de tampón de proteinasa K ATL y una perla de acero de 5 mm, homogeneizado utilizando Tissuelyzer 30hz, 2 min, repetir hasta homogeneizar. Aislamiento del ADN genómico siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la qPCR, cada muestra se analizó por duplicado con conjuntos de cebadores/sondas (cebador directo 5'-TGGAAGATTGCTACGAGCGC-3'; cebador inverso 5'-CAGGTCGCTGAACAGGTTCT-3'; sonda-6FAM-GCAAGTTCGGCAAGCAGCACA-MGBNFG) en placas de reacción transparentes de 384 pocilios (applied biosystem; número de catálogo 4483285). A cada reacción se añadieron 2 ul de ADN genómico (80 ng) y 8 ul de mezcla maestra (5 ul de mezcla maestra fast advanced 0,5 ul de mezcla sonda cebador 20X FAM y 2,5 ul de agua) y las placas se centrifugaron durante 1 min a 1000 rpm. Las muestras se incubaron a 95 °C durante 20 segundos, seguidos de 40 ciclos a 95 °C durante 1 segundo y 60 °C durante 20 segundos, utilizando el sistema ViiA7 y el programa informático de PCR en tiempo real Quant Studio para el análisis de datos (Applied Biosystem).
MSD-ELISA - La expresión de proteínas se determinó mediante ensayo Elisa. Las placas multiensayo de 384 pocillos (Meso Scale Discovery, número de catálogo L21XB-4) se recubrieron previamente con el anticuerpo monoclonal Manex 1011b a una concentración de 2 ug/ml en tampón de bicarbonato durante toda la noche. A continuación, las placas se bloquearon con tampón de bloqueo (BSA al 5 % en PBS) durante 4 h agitándolas a temperatura ambiente. Los tejidos (aproximadamente 20 mg) se homogeneizaron en tampón ripa a una concentración de 1 mg de tejido/10 ul de tampón de lisis (Sigma, número de catálogo R0278) con un comprimido de cóctel inhibidor de proteasas (Roche, número de catálogo 04693 159001) utilizando el Qiagen Tissuelyzer a 30 hz durante 5 min y repitiendo esta etapa hasta la homogeneización. El lisado de ripa tisular se diluyeron 1 a 3 en tampón de unión (b Sa al 1 %, tween 20 al 0,05 %, 20 mM Tris pH 7,5 en PBS). Se añadieron lisados tisulares y Mandys 106 sulfoconjugado (0,2 ug/ml) a las placas de 384 pocillos prerecubiertas y se incubaron a 40 °C con agitación durante la noche. Las placas se lavaron con PBS con tween 20 al 0,05 % y se añadieron 40 ul de tampón de lectura MSD T con tensioactivo (número de catálogo R92TC-1). A continuación, las placas se leyeron en la máquina MSD Sector 6000.
Los datos mostraron que se administró suficiente virus para lograr la expresión (ARNm y proteína) en >90 % de las células musculares estriadas a las 4 semanas de vida (FIG. 18).
Creatina quinasa - La creatina quinasa como indicador del daño muscular se midió en suero utilizando kits disponibles en el mercado. La CK se midió a las 4 semanas de vida (2 semanas después de la administración). También, la CK se midió a los 3 meses de vida, 1 mes después del protocolo de lesión inducida por contracción (véase más adelante). ****p < 0,001 ANOVA de una vía con prueba de Tukey posterior, n = 10 en comparación conmdx4cv. Los datos mostraron que en ratones tratados con BXA-196477 o BXA-213788, se redujeron significativamente los niveles de creatina quinasa y, por tanto, el daño muscular (FIG. 19).
Estudios funcionales
Las propiedades contráctiles del músculo tibial anterior (TA) se ensayaron mediante un aparatoin vivo(placa de pie) según las instrucciones del fabricante (Aurora Scientific). En resumen, la contracción tetánica máxima se alcanzó a 150 Hz en la curva de frecuencia de la fuerza (la fuerza se mide en Torque como Newton Metros). La contracción tetánica máxima fue la misma en los ratones mdx4cv tipo silvestre y mdx4cv tratados con BXA-196477 o BXA-213788. Sin embargo, la masa muscular TA es mayor en mdx4cv ****p < 0,001 ANOVA de una vía con prueba de Tukey posterior, n = 10), de modo que la normalización de la fuerza tetánica máxima a la masa de TA se redujo en los ratones mdx4cv y a niveles de tipo silvestre en los ratones tratados ***P < 0,001 en comparación con mdx4cv; ANOVA de una vía con prueba de Tukey posterior, n = 10) (FIG. 20).
La lesión del músculo tibial anterior (TA) se midió con un aparatoin vivo(placa de pie) según las instrucciones del fabricante (Aurora Scientific). Durante la contracción tetánica máxima a 150 Hz (torque isométrico máximo), la placa del pie se giró de 90° a 135° grados para forzar los músculos. Esta contracción se repitió cada minuto durante 20 contracciones como se ha descrito previamente (Khairallah et al., 2012). El torque isométrico máximo inmediatamente antes de la distensión se redujo significativamente con cada contracción en ratonesmdx4™ (P <0,0001 en comparación con los de tipo silvestre; AN<o>V<a>de dos vías; n = 9-10). Por el contrario, tanto BXA-196477 como BXA-213788 evitaron la lesión inducida por la contracción de forma similar a los niveles de tipo silvestre (****P<0,0001 BXA-213788 y **P<0,01 BXA-196477 en comparación conmdx4™con prueba de Tukey posterior n = 9-10). Los datos muestran que ambos diseños de distrofinas miniaturizadas protegen a los músculos TA de las lesiones inducidas por la contracción (FIG. 21).
Expresiónin vitroein vivode las construcciones de distrofina miniaturizada descritas en los Ejemplos en el presente documento estaban bajo el control de un promotor C5-12 (véase el documento US 2004/0175727) en donde los primeros siete y últimos trece nucleótidos se eliminaron. El AAV utilizado fue el AAV9, en donde las ITR eran AAV2.
Ejemplo 6: Otros estudios de inmunogenicidad
La inmunogenicidad de las nuevas uniones (véase la Tabla 12: SEQ ID NO: 156 a 166; SEQ ID NO:155 fue la secuencia original) creada entre el dominio bisagra 2 (H2) y la repetición de espectrina 16 R16 (R16) dentro del polipéptido de distrofina miniaturizada BXA-027741 se ensayaron utilizando una herramienta de predicción de inmunogenicidadin silico.Se determinó que la nueva unión SEQ ID NO: 157 (véase la FIG. 22) tenía un riesgo inmunogénico mínimo, basándose en el citado enfoquein silico.Las secuencias de unión ensayadas están numeradas del siguiente modo: SEQ ID NO:155 (1), SEQ ID NO:156 (2), SEQ ID NO:157 (3), SEQ ID NO:158 (4), SEQ ID NO:159 (5), SEQ ID NO:160 (6), SEQ ID NO:161 (7), SEQ ID NO:162 (8), SEQ ID NO:163 (9), SEQ ID NO:164 (10), SEQ ID NO:165 (11), SEQ ID NO:166 (12) (véase la FIG. 22B).
El potencial inmunogénico de las citadas uniones del diseño BXA-027741, y sus variantes de unión, se ensayaron utilizando un ensayo de proliferación de linfocitos Tin vitrocomo se ha descrito anteriormente. Los datos indican que la unión J11v3 (SEQ ID N<o>:157, N.° 3 en la FIG. 22B) provocó una proliferación de linfocitos CD8+ (FIG. 23A) y CD4+ (FIG. 23B) significativamente menor en comparación con otras uniones ensayadas y, por lo tanto, es superior (FIG.
23). El polipéptido de distrofina miniaturizada BXA-196477 fue modificado para llevar la unión J11v3, se sometieron a deleción los tres últimos aminoácidos del extremo C y se acortó la 3'UTR, dando como resultado el polipéptido de distrofina miniaturizada BXA-213780 (SEQ ID NO:153) y la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:154.

Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos, que codifica un polipéptido de distrofina miniaturizada que comprende desde el extremo N al extremo C dominio bisagra 1 (H1), dominio de repetición de espectrina 1 (R1), dominio de repetición de espectrina 3 (R3), dominio de bisagra 2 (H2), dominio de repetición de espectrina 16 (R16), dominio de repetición de espectrina 17 (R17), dominio de repetición de espectrina 24 (R24) y dominio bisagra 4 (H4) de la distrofina, en donde el polipéptido de distrofina miniaturizada no comprende la repetición 2 de espectrina de la distrofina, en donde el dominio R1 y el dominio R3 están fusionados por los aminoácidos ARG-VAL (RV) y en donde el dominio H2 y el dominio R16 están fusionados por la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 74-75 en combinación, y en donde (i) el dominio H1 y el dominio R1 están fusionados directamente, (ii) el dominio R3 y el dominio H2 están fusionados directamente, (iii) los dominios R16 y R17 están fusionados directamente, (iv) los dominios R17 y R24 están fusionados directamente y (v) los dominios R24 y H4 están fusionados directamente.
2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende además el dominio ABD1 y/o el dominio CR.
3. La molécula de ácido nucleico de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el polipéptido de distrofina miniaturizada consiste en, desde el extremo N al extremo C, el dominio ABD1, el dominio H1, el dominio R1, aminoácidos RV, el dominio R3, el dominio H2, las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 74-75, el dominio R16, el dominio R17, el dominio R24, el dominio H4 y el dominio CR de la distrofina.
4. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el polipéptido de distrofina miniaturizada comprende una secuencia de aminoácidos de al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 118.
5. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4, en donde la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia de al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 133.
6. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el primer polipéptido de distrofina miniaturizada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 118.
7. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. El vector de la reivindicación 7, que es un vector de virus adenoasociado (AAV), en donde el vector de AAV se selecciona entre AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 y AAV11.
9. El vector de la reivindicación 8, en donde el vector AAV es AAV9.
10. El vector de la reivindicación 8, en donde el vector AAV es AAV8.
11. Un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
12. Una célula hospedadora que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10.
13. Una composición farmacéutica que comprende (a) el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, el polipéptido de la reivindicación 11 o la célula hospedadora de la reivindicación 12; y (b) un excipiente farmacéuticamente aceptable.
14. Una partícula vectorial de virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende una cápside de AAV y una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos, que codifica un polipéptido de distrofina miniaturizada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 118.
15. La partícula vectorial de rAAV de la reivindicación 14, que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 133.
16. La partícula vectorial de rAAV de las reivindicaciones 14 o 15, en donde la molécula de ácido nucleico comprende además una primera repetición terminal invertida (ITR) y una segunda repetición terminal invertida (ITR), ambas del virus adenoasociado (a Av ).
17. La partícula vectorial de rAAV de la reivindicación 16, en donde la primera ITR y la segunda ITR proceden del genoma de AAV2.
18. La partícula vectorial de rAAV de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en donde la cápside de AAV es de AAV9.
19. La partícula vectorial de rAAV de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en donde la cápside de AAV es de AAV8.
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