ES3033810T3 - Cancer treatments using combinations of cdk and erk inhibitors - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona, entre otros, métodos, kits y composiciones farmacéuticas para tratar o aliviar los efectos del cáncer en un sujeto que lo necesite. El método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de (i) un primer agente anticanceroso, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y (ii) un segundo agente anticanceroso, que es un inhibidor de CDK o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para tratar o aliviar los efectos del cáncer. También se proporcionan métodos adicionales para inducir la muerte de células cancerosas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamientos contra el cáncer usando combinaciones de inhibidores de CDK y ERK

Campo de la invención

La presente invención proporciona, entre otras cosas, métodos, composiciones farmacéuticas y kits para tratar o mejorar los efectos de un cáncer en un sujeto usando un primer antineoplásico, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un segundo antineoplásico, que es un inhibidor de cinasa dependiente de ciclina (CDK) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el inhibidor de CDK se selecciona del grupo que consiste en palbociclib, LEE-011, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos.

Antecedentes de la invención

Dentro de las redes de señalización celular, RAS y RAF desempeñan papeles importantes en la regulación de diversos procedimientos biológicos, incluyendo crecimiento celular, proliferación, diferenciación, respuestas inflamatorias y muerte celular programada. En particular, las mutaciones en los genes RAS fueron las primeras alteraciones genéticas identificadas en el cáncer humano. Las mutaciones activadoras de HRAS, NRAS, y KRAS (“RAS”), así como de BRAF, se encuentran con frecuencia en varios tipos de cáncer.

Se han descrito inhibidores de ERK para inhibir el crecimiento de células cancerosas (documento US 7.354.939 y Cancer Discovery 2013;3:742-750).

Se ha descrito que la inhibición combinada de la ruta de Ral (a través del bloqueo de la actividad CDK5) con la inhibición de la ruta de RAF/MEK/ERK (a través del inhibidor de MEK U0126 o el inhibidor de Raf sorafenib) o de la ruta de PI3K/Akt (a través del inhibidor de PI3K LY294002) inhibe el crecimiento del cáncer de páncreas (Cancer Res. 1 de junio de 2010; 70(11): 4460-4469). Asimismo, se ha descrito que la combinación del inhibidor de CDK dinaciclib con inhibidores o bien de la ruta de PI3K/Akt (a través del inhibidor de pan-AKT MK2206) o bien de la ruta de RAF/MEK/ERK (a través del inhibidor de ERK SCH772984) inhibe el crecimiento y las metástasis del cáncer de páncreas (Mol Cancer Ther 2013; 12(11 Supl.):B263).

Hasta la fecha, el avance ha sido lento en el desarrollo de opciones de tratamiento efectivas de duración más larga para pacientes que padecen cáncer en el que están presentes una o más mutaciones de RAS y/o RAF. Por ejemplo, la resistencia a los fármacos es un problema común con muchos de los inhibidores de MAPK que se usan actualmente.

En vista de lo anterior, existe, entre otras cosas, una necesidad de nuevos métodos para tratar las neoplasias malignas asociadas con la ruta de señalización de MAPK, de la que son miembros RAS y RAF. La presente solicitud está dirigida a satisfacer estas y otras necesidades.

Sumario de la invención

Por consiguiente, la invención se refiere a un primer antineoplásico (i), que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un segundo antineoplásico (ii), que es un inhibidor de cinasa dependiente de ciclina (CDK) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos del cáncer en un sujeto, en donde el inhibidor de CDK se selecciona del grupo que consiste en palbociclib, LEE-011, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos.

La invención se refiere además a un métodoin vitropara lograr la muerte de células cancerosas que comprende poner en contacto la célula cancerosa con una cantidad eficaz de (i) un primer antineoplásico, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo antineoplásico, siendo el primer y segundo antineoplásico un inhibidor de cinasa dependiente de ciclina (CDK) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el inhibidor de CDK se selecciona del grupo que consiste en palbociclib, LEE-011, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos.

Además, la invención se refiere a un kit para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto que comprende una cantidad eficaz de (i) un primer antineoplásico, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo antineoplásico, siendo el primer y segundo antineoplásico un inhibidor de cinasa dependiente de ciclina (CDK) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, empaquetados junto con instrucciones para su uso, en donde el inhibidor de CDK se selecciona del grupo que consiste en palbociclib, LEE-011, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos.

Además, la invención también se refiere a una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto, comprendiendo la composición farmacéutica un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad eficaz de (i) un primer antineoplásico, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo antineoplásico, siendo el primer y segundo antineoplásico un inhibidor de cinasa dependiente de ciclina (CDK) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el inhibidor de CDK se selecciona del grupo que consiste en palbociclib, LEE-011, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos, y en donde la administración del primer y segundo antineoplásico proporciona un efecto sinérgico en comparación con la administración de cualquier antineoplásico solo.

La invención se refiere además a una composición que comprende BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en combinación con un inhibidor de CDK o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos del cáncer en un sujeto, en donde el inhibidor de CDK se selecciona del grupo que consiste en palbociclib, LEE-011, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos.

Además, la invención se refiere a una composición que comprende un inhibidor de CDK o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en combinación con BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos del cáncer en un sujeto, en donde el inhibidor de CDK se selecciona del grupo que consiste en palbociclib, LEE-011, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos.

Además, se da a conocer en el presente documento un método para tratar o mejorar los efectos de un cáncer en un sujeto que lo necesita. El método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de (i) un primer antineoplásico, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo antineoplásico, que es un inhibidor de CDK o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para tratar o mejorar los efectos del cáncer.

También se da a conocer un método para tratar o mejorar los efectos de un cáncer en un sujeto que lo necesita. El método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de (i) un primer antineoplásico, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo antineoplásico, que se selecciona del grupo que consiste en palbociclib, LEE-011, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos, para tratar o mejorar los efectos del cáncer.

Además, se da a conocer en el presente documento un métodoin vitropara lograr la muerte de células cancerosas. El método comprende poner en contacto la célula cancerosa con una cantidad eficaz de (i) un primer antineoplásico, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo antineoplásico, que es un inhibidor de CDK o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

También se da a conocer un kit para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto que lo necesita. El kit comprende una cantidad eficaz de (i) un primer antineoplásico, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo antineoplásico, que es un inhibidor de CDK o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, empaquetados junto con instrucciones para su uso.

Además, se da a conocer en el presente documento una composición farmacéutica para tratar o mejorar los efectos de un cáncer en un sujeto que lo necesita. La composición farmacéutica comprende un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad eficaz de (i) un primer antineoplásico, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo antineoplásico, que es un inhibidor de CDK o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde la administración del primer y segundo antineoplásico proporciona un efecto sinérgico en comparación con la administración de cualquier antineoplásico solo.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra que tanto la fosforilación directa del sustrato ERK como las rutas efectoras conocidas se modulan tras el tratamiento agudo y prolongado con BVD-523in vitro.Se realizaron inmunotransferencias de tipo Western usando una variedad de anticuerpos para detectar cambios en lisados de células completas de líneas cancerosas expuestas a BVD-523. En la línea celular mutante A375 BRAF (una línea celular de melanoma humano) y en la línea celular mutante HCT116 KRAS (una línea celular de carcinoma colorrectal humano), la fosforilación de residuos dependientes de ERK (T359/S363) en las proteínas RSK 1 y 2 se redujo después de 4 horas de tratamiento con BVD-523 a concentraciones micromolares. Tras 24 horas de tratamiento, la inhibición directa del sustrato se mantuvo en las líneas celulares mutantes BRAF y la fosfatasa de retroalimentación MAPK DUSP6 se redujo en gran medida, lo que sugiere una inhibición duradera y casi completa de la ruta de MAPK. Por último, coherente con los efectos citostáticos del BVD-523 en múltiples líneas celulares, el gen determinante del ciclo celular G1/S y efector de MAPK, ciclina-D1, se redujo en gran medida después de 24 horas de tratamiento. En la línea celular A375, aunque el efector de apoptosis y sustrato de ERK Bim-EL aumentó tras un tratamiento prolongado, no se observó un aumento de la apoptosis, lo que es coherente con una falta de escisión de PARP, así como con otras observaciones (no mostradas) de que factores adicionales influyen en la capacidad de BVD-523 para inducir la muerte celular. La figura 2 muestra los resultados de los ensayos de proliferación de agente único evaluados mediante el reactivo CellTiter-Glo o la tinción de Hoechst. Se muestran los resultados de proliferación para el tratamiento con BVD-523 (figura 2A y figura 2B), SCH772984 (figura 2C y figura 2D), trametinib (figura 2E y figura 2F), palbociclib (figura 2G y figura 2H), LEE-011 (figura 2I y figura 2J), y paclitaxel (figura 2K y figura 2L).

La figura 3 muestra los resultados de la combinación de BVD-523 y palbociclib. La figura 3A muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células A549. Las figuras 3B - 3C muestran los resultados de los ensayos de proliferación de agente único para la combinación en 3A. La figura 3D muestra el exceso de Loewe para la combinación en 3A y la figura 3E muestra el exceso de Bliss para la combinación en 3A. La figura 3F muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células H2122. Las figuras 3G - 3H muestran los resultados de los ensayos de proliferación de agente único para la combinación en 3F. La figura 3I muestra el exceso de Loewe para la combinación en 3F y la figura 3J muestra el exceso de Bliss para la combinación en 3F. La figura 3K muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células H1437. Las figuras 3L - 3M muestran los resultados de los ensayos de proliferación de agente único para la combinación en 3K. La figura 3N muestra el exceso de Loewe para la combinación en 3K y la figura 3O muestra el exceso de Bliss para la combinación en 3K. La figura 3P muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células H226. Las figuras 3Q - 3R muestran los resultados de los ensayos de proliferación de agente único para la combinación en 3P. La figura 3S muestra el exceso de Loewe para la combinación en 3P y la figura 3T muestra el exceso de Bliss para la combinación en 3P.

La figura 4 muestra los resultados de la combinación de BVD-523 y LEE-011. La figura 4A muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células A549. Las figuras 4B - 4C muestran los resultados de los ensayos de proliferación de agente único para la combinación en 4A. La figura 4D muestra el exceso de Loewe para la combinación en 4A y la figura 4E muestra el exceso de Bliss para la combinación en 4A. La figura 4F muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células H2122. Las figuras 4G - 4H muestran los resultados de los ensayos de proliferación de agente único para la combinación en 4F. La figura 4I muestra el exceso de Loewe para la combinación en 4F y la figura 4J muestra el exceso de Bliss para la combinación en 4F. La figura 4K muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células H1437. Las figuras 4L - 4M muestran los resultados de los ensayos de proliferación de agente único para la combinación en 4K. La figura 4N muestra el exceso de Loewe para la combinación en 4K y la figura 4O muestra el exceso de Bliss para la combinación en 4K. La figura 4P muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células H226. Las figuras 4Q - 4R muestran los resultados de los ensayos de proliferación de agente único para la combinación en 4P. La figura 4S muestra el exceso de Loewe para la combinación en 4P y la figura 4T muestra el exceso de Bliss para la combinación en 4P.

La figura 5 muestra los resultados de la combinación de SCH772984 y palbociclib. La figura 5A muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células A549. Las figura 5B - figura 5C muestran los resultados de los ensayos de proliferación de agente único para la combinación en 5A. La figura 5D muestra el exceso de Loewe para la combinación en 5A y la figura 5E muestra el exceso de Bliss para la combinación en 5A. La figura 5F muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células H2122. Las figura 5G - figura 5H muestran los resultados de los ensayos de proliferación de agente único para la combinación en 5F. La figura 5I muestra el exceso de Loewe para la combinación en 5F y la figura 5J muestra el exceso de Bliss para la combinación en 5F. La figura 5K muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células H1437. Las figura 5L - figura 5M muestran los resultados de los ensayos de proliferación de agente único para la combinación en 5K. La figura 5N muestra el exceso de Loewe para la combinación en 5K y la figura 5O muestra el exceso de Bliss para la combinación en 5K. La figura 5P muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células H226. Las figuras 5Q - 5R muestran los resultados de los ensayos de proliferación de agente único para la combinación en 5P. La figura 5S muestra el exceso de Loewe para la combinación en 5P y la figura 5T muestra el exceso de Bliss para la combinación en 5P.

La figura 6 muestra los resultados de la combinación de SCH772984 y LEE-011. La figura 6A muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células A549. Las figuras 6B - 6C muestran los resultados de los ensayos de proliferación de agente único para la combinación en 6A. La figura 6D muestra el exceso de Loewe para la combinación en 6A y la figura 6E muestra el exceso de Bliss para la combinación en 6A. La figura 6F muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células H2122. Las figuras 6G - 6H muestran los resultados de los ensayos de proliferación de agente único para la combinación en 6F. La figura 6I muestra el exceso de Loewe para la combinación en 6F y la figura 6J muestra el exceso de Bliss para la combinación en 6F. La figura 6K muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células H1437. Las figuras 6L - 6M muestran los resultados de los ensayos de proliferación de agente único para la combinación en 6K. La figura 6N muestra el exceso de Loewe para la combinación en 6K y la figura 6O muestra el exceso de Bliss para la combinación en 6K. La figura 6P muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células H226. Las figuras 6Q - 6R muestran los resultados de los ensayos de proliferación de agente único para la combinación en 6P. La figura 6S muestra el exceso de Loewe para la combinación en 6P y la figura 6T muestra el exceso de Bliss para la combinación en 6P.

La figura 7 muestra los resultados de la combinación de trametinib y palbociclib. La figura 7A muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células A549. Las figuras 7B - 7C muestran los resultados de los ensayos de proliferación de agente único para la combinación en 7A. La figura 7D muestra el exceso de Loewe para la combinación en 7A y la figura 7E muestra el exceso de Bliss para la combinación en 7A. La figura 7F muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células H2122. Las figuras 7G - 7H muestran los resultados de los ensayos de proliferación de agente único para la combinación en 7F. La figura 7I muestra el exceso de Loewe para la combinación en 7F y la figura 7J muestra el exceso de Bliss para la combinación en 7F. La figura 7K muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células H1437. Las figuras 7L - 7M muestran los resultados de los ensayos de proliferación de agente único para la combinación en 7K. La figura 7N muestra el exceso de Loewe para la combinación en 7K y la figura 7O muestra el exceso de Bliss para la combinación en 7K. La figura 7P muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células H226. Las figuras 7Q - 7R muestran los resultados de los ensayos de proliferación de agente único para la combinación en 7P. La figura 7S muestra el exceso de Loewe para la combinación en 7P y la figura 7T muestra el exceso de Bliss para la combinación en 7P.

La figura 8 muestra los resultados de la combinación de trametinib y LEE-011. La figura 8A muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células A549. Las figuras 8B - 8C muestran los resultados de los ensayos de proliferación de agente único para la combinación en 8A. La figura 8D muestra el exceso de Loewe para la combinación en 8A y la figura 8E muestra el exceso de Bliss para la combinación en 8A. La figura 8F muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células H2122. Las figuras 8G - 8H muestran los resultados de los ensayos de proliferación de agente único para la combinación en 8F. La figura 8I muestra el exceso de Loewe para la combinación en 8F y la figura 8J muestra el exceso de Bliss para la combinación en 8F. La figura 8K muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células H1437. Las figuras 8L - 8M muestran los resultados de los ensayos de proliferación de agente único para la combinación en 8K. La figura 8N muestra el exceso de Loewe para la combinación en 8K y la figura 8O muestra el exceso de Bliss para la combinación en 8K. La figura 8P muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células H226. Las figuras 8Q - 8R muestran los resultados de los ensayos de proliferación de agente único para la combinación en 8P. La figura 8S muestra el exceso de Loewe para la combinación en 8P y la figura 8T muestra el exceso de Bliss para la combinación en 8P.

La figura 9A muestra volúmenes de Loewe para las combinaciones de inhibidores de CDK y ERK. La figura 9B muestra los volúmenes de Bliss para las combinaciones de inhibidores de CDK y ERK. La figura 9C muestra las puntuaciones de sinergia para las combinaciones de inhibidores de CDK y ERK.

La figura 10 muestra los resultados de la combinación de BVD-523 y SCH772984. La figura 10A muestra una matriz de dosis que muestra la inhibición (%) para la combinación en células A375. Las figuras 10B - 10C muestran los resultados de los ensayos de proliferación de agente único para la combinación en 10A. La figura 10D muestra el exceso de Loewe para la combinación en 10A y la figura 10e muestra el exceso de Bliss para la combinación en 10A.

Descripción detallada de la invención

Se da a conocer en el presente documento un método para tratar o mejorar los efectos de un cáncer en un sujeto que lo necesita. El método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de (i) un primer antineoplásico, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo antineoplásico, que es un inhibidor de CDK o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para tratar o mejorar los efectos del cáncer.

Tal como se usan en el presente documento, los términos “tratar”, “que trata”, “tratamiento” y variaciones gramaticales de los mismos significan someter a un sujeto a un protocolo, régimen, procedimiento o remedio, en el que se desea obtener una respuesta o resultado fisiológico en ese sujeto, por ejemplo, un paciente. En particular, los métodos y composiciones de la presente divulgación pueden usarse para retardar el desarrollo de los síntomas de la enfermedad o retrasar la aparición de la enfermedad o afección, o detener la progresión del desarrollo de la enfermedad. Sin embargo, debido a que no todos los sujetos tratados pueden responder a un protocolo, régimen, procedimiento o remedio de tratamiento en particular, el tratamiento no requiere que se logre la respuesta o el resultado fisiológico deseado en todos y cada uno de los sujetos o poblaciones de sujetos, por ejemplo, la población de pacientes. Por consiguiente, un sujeto o una población de sujetos determinado, por ejemplo, una población de pacientes, puede no responder o responder de manera inadecuada al tratamiento.

Tal como se usan en el presente documento, los términos “mejorar”, “que mejora” y variaciones gramaticales de los mismos significan disminuir la gravedad de los síntomas de una enfermedad en un sujeto.

Tal como se usa en el presente documento, un “sujeto” es un mamífero, preferiblemente un ser humano. Además de los seres humanos, las categorías de mamíferos incluyen, por ejemplo, animales de granja, animales domésticos, animales de laboratorio, etc. Algunos ejemplos de animales de granja incluyen vacas, cerdos, caballos, cabras, etc. Algunos ejemplos de animales domésticos incluyen perros, gatos, etc. Algunos ejemplos de animales de laboratorio incluyen primates, ratas, ratones, conejos, cobayas, etc.

Los cánceres incluyen tanto cánceres sólidos como cánceres hematológicos. Los ejemplos no limitativos de cánceres sólidos incluyen carcinoma adrenocortical, cáncer anal, cáncer de vejiga, cáncer de huesos (tal como osteosarcoma), cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer carcinoide, carcinoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer de conducto biliar extrahepático, cánceres de la familia Ewing, cáncer de células germinales extracraneales, cáncer de ojo, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, tumor de células germinales, tumor trofoblástico gestacional, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hipofaríngeo, carcinoma de células de los islotes, cáncer de riñón, cáncer de intestino grueso, cáncer de laringe, leucemia, cáncer de labio y cavidad bucal, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfoma, mesotelioma maligno, carcinoma de células de Merkel, micosis fungoide, síndrome mielodisplásico, trastornos mieloproliferativos, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer bucal, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma, cáncer epitelial de ovario, cáncer de células germinales de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de seno paranasal y cavidad nasal, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de hipófisis, neoplasia de células plasmáticas, cáncer de próstata, rabdomiosarcoma, cáncer rectal, cáncer de células renales, cáncer de células transicionales de la pelvis renal y el uréter, cáncer de glándula salival, síndrome de Sezary, cánceres de piel (tales como linfoma cutáneo de células T, sarcoma de Kaposi, tumor de mastocitos y melanoma), cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de estómago, cáncer testicular, timoma, cáncer de tiroides, cáncer uretral, cáncer de útero, cáncer vaginal, cáncer vulvar, y tumor de Wilms.

Los ejemplos de cánceres hematológicos incluyen, pero no se limitan a, leucemias, tales como leucemia linfoblástica aguda en adultos/niños, leucemia mieloide aguda en adultos/niños, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica y leucemia de células pilosas; linfomas, tales como linfoma relacionado con el sida, linfoma cutáneo de células T, linfoma de Hodgkin en adultos/niños, micosis fungoide, linfoma no Hodgkin en adultos/niños, linfoma primario del sistema nervioso central, síndrome de Sézary, linfoma cutáneo de células T y macroglobulinemia de Waldenstrom, así como otros trastornos proliferativos como trastornos mieloproliferativos crónicos, histiocitosis de células de Langerhans, mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas, síndromes mielodisplásicos y neoplasias mielodisplásicas/mieloproliferativas. Un conjunto preferido de cánceres que pueden tratarse según la presente invención incluye melanoma, neuroblastoma, leucemia, linfoma, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer testicular y cáncer de tiroides. Preferiblemente el cáncer es melanoma.

En la presente invención, BVD-523 es un inhibidor de ERK1/2. BVD-523 es un compuesto según la fórmula (I):

y sales farmacéuticamente aceptables del mismo. El BVD-523 puede sintetizarse según los métodos dados a conocer, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 7.354.939. Se cree que el mecanismo de acción de BVD-523 es, entre otras cosas, único y distinto de determinados otros inhibidores de ERK1/2, tales como SCH772984. Por ejemplo, SCH772984 inhibe la autofosforilación de ERK (Morriset al.,2013), mientras que BVD-523 permite la autofosforilación de ERK mientras sigue inhibiendo a ERK. (Véase, por ejemplo, figura 1). Esto es importante, entre otras cosas, porque se cree que las propiedades de BVD-523 permiten la disociación de múltiples rutas de señalización, por ejemplo, controlando la proliferación celular sin afectar sustancialmente la muerte celular.

Tal como se usa en el presente documento, “CDK” significa una familia de proteínas cinasas que regulan el ciclo celular. Las CDK conocidas incluyen cdkl, cdk2, ckd3, ckd4, cdk5, cdk6, cdk7, cdk8, cdk9, cdk10 y cdk11. Un “inhibidor de CDK” significa aquellas sustancias que (i) interactúan directamente con CDK, por ejemplo, uniéndose a CDK y (ii) disminuyen la expresión o la actividad de CDK.

Los ejemplos no limitativos de inhibidores de CDK incluyen 2-hidroxibohemina, 3-ATA, 5-yodo-indirrubina-3'-monoxima, 9-cianopaulona, aloisina A, alsterpaulona 2-cianoetilo, alvocidib (Sanofi), AM-5992 (Amgen), aminopurvalanol A, arciriaflavina A, AT-7519 (Astex Pharmaceuticals), AZD 5438 (n.° decAs602306-29-6), BMS-265246 (n.° de CAS 582315-72-8), BS-181 (n.° de CAS 1092443-52-1), butirolactona I (n.° de CAS 87414-49-1), inhibidor de Cdk/Crk (n.° de CAS 784211-09-2), inhibidor de Cdk1/5 (n.° de CAS 40254-90-8), inhibidor de Cdk2 II (n.° de CAS 222035-13-4), inhibidor de Cdk2 IV, NU6140 (n.° de CAS 444723-13-1), inhibidor de Cdk4 (n.° de CAS 546102-60-7), inhibidor de Cdk4 III (n.° de CAS 265312-55-8), inhibidor de Cdk4/6 IV (n.° de CAS 359886-84-3), inhibidor de Cdk9 II (n.° de CAS 140651-18-9), CGP 74514A, CR8, CYC-065 (Cyclacel), dinaciclib (ligando), diclorhidrato de (R)-dRf053 (n.° de CAS 1056016-06-8), fascaplisina, flavopiridol, higrolidina, indirrubina, LEE-011 (Astex Pharmaceuticals), LY-2835219 (Eli Lilly), maleato de milciclib (Nerviano Medical Sciences), MM-D37K (Maxwell Biotech), N9-isopropil-olomoucina, NSC 625987 (n.° de CAS 141992-47-4), NU2058 (n.° de CAS 16105883-9), NU6102 (n.° de CAS 444722-95-6), olomoucina, ON-108600 (Onconova), ON-123300 (Onconova), oxindol I, P-1446-05 (Piramal), P-276-00 (Piramal), palbociclib (Pfizer), PHA-767491 (n.° de CAS 845714-00-3), PHA-793887 (n.° de CAS 718630-59-2), PHA-848125 (n.° de CAS 802539-81-7), purvalanol A, purvalanol B, R547 (n.° de CAS 741713-40-6), RO-3306 (n.° de CAS 872573-93-8), roscovitina, SB-1317 (SBIO), SCH 900776 (n.° de CAS 891494 63-6), SEL-120 (Selvita), seliciclib (Cyclacel), SNS-032 (n.° CAS 345627-80-7), SU9516 (n.° de CAS 377090-84-1), WHI-P180 (n.° de CAS 211555-08-7), sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos. Preferiblemente, el inhibidor de CDK se selecciona del grupo que consiste en dinaciclib, palbociclib, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos.

En otro aspecto de esta realización, el sujeto con cáncer tiene una mutación somática en un nodo de la ruta de MAPK, que incluye RAS, RAF, MEK y ERK. Tal como se usa en el presente documento, “mutación somática” significa un cambio que se produce en cualquier célula que no esté destinada a convertirse en una célula germinal. La mutación puede ser una sustitución, deleción, inserción, o una fusión. Preferiblemente, la mutación somática es una mutación en H-RAS, N-RAS o K-RAS. Más preferiblemente, el cáncer tiene una mutación somática en N-RAS. La tabla 1 muestra los números de identificación de secuencia (SEQ ID NO) de secuencias representativas de ácidos nucleicos y aminoácidos de N-RAS de tipo natural de diversos animales. Estas secuencias pueden usarse en métodos para identificar sujetos con un genotipo N-RAS mutante (tal como en los métodos expuestos a continuación).

Tabla 1. Secuencias de N-RAS

Se conocen en la técnica métodos para identificar mutaciones en ácidos nucleicos, tales como los genes RAS identificados anteriormente. Los ácidos nucleicos pueden obtenerse de muestras biológicas. Las muestras biológicas incluyen, pero no se limitan a, sangre, plasma, orina, piel, saliva, y biopsias. Las muestras biológicas se obtienen de un sujeto mediante procedimientos y métodos rutinarios que se conocen en la técnica.

Los ejemplos no limitativos de métodos para identificar mutaciones incluyen PCR, secuenciación, captura híbrida, captura en disolución, sondas de inversión molecular, ensayos de hibridaciónin situfluorescente (FISH), y combinaciones de los mismos.

Se conocen diversos métodos de secuenciación en la técnica. Estos incluyen, pero no se limitan a, secuenciación de Sanger (también denominada secuenciación de didesoxilo) y diversos métodos de secuenciación por síntesis (SBS) tal como se da a conocer, por ejemplo, en Metzker 2005, secuenciación por hibridación, por ligamiento (por ejemplo, documento WO 2005021786), por degradación (por ejemplo, patentes estadounidenses n.os 5.622.824 y 6.140.053) y secuenciación de nanoporos (que está disponible comercialmente de Oxford Nanopore Technologies, RU). En las técnicas de secuenciación profunda, un nucleótido determinado de la secuencia se lee más de una vez durante el procedimiento de secuenciación. Las técnicas de secuenciación profunda se dan a conocer, por ejemplo, en la publicación de patente estadounidense n.° 20120264632 y en la publicación de patente internacional n.° WO2012125848.

Los métodos basados en PCR para detectar mutaciones se conocen en la técnica y emplean amplificación por PCR, donde cada secuencia objetivo en la muestra tiene un par correspondiente de cebadores únicos y específicos de la secuencia. Por ejemplo, el método de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción por reacción en cadena de la polimerasa (PCR-RFLP) permite la detección rápida de mutaciones después de que las secuencias genómicas se amplifican por PCR. La mutación se discrimina mediante digestión con endonucleasas de restricción específicas y se identifica mediante electroforesis. Véase, por ejemplo, Otaet al.,2007. Las mutaciones también pueden detectarse mediante PCR en tiempo real. Véase, por ejemplo, la publicación de solicitud internacional n.° WO2012046981.

Los métodos de captura híbridos se conocen en la técnica y se dan a conocer, por ejemplo, en la publicación de patente estadounidense n.° 20130203632 y en las patentes estadounidenses n.os 8389219 y 8288520. Estos métodos se basan en la hibridación selectiva de las regiones genómicas diana con oligonucleótidos diseñados por el usuario. La hibridación puede ser con oligonucleótidos inmovilizados en micromatrices de alta o baja densidad (captura en matriz), o hibridación en fase en disolución con oligonucleótidos modificados con un ligando (por ejemplo, biotina) que posteriormente puede inmovilizarse en una superficie sólida, tal como una perla (captura en disolución).

Las técnicas de sonda de inversión molecular (MIP) se conocen en la técnica y se dan a conocer, por ejemplo, en Absalanet al.,2008. Este método usa moléculas MIP, que son sondas especiales tipo “candado” (Nilssonet al.,1994) para el genotipado. Una molécula MIP es un oligonucleótido lineal que contiene regiones específicas, secuencias universales, sitios de restricción y una secuencia Tag (índice) (16-22 pb). Una MIP se hibrida directamente alrededor del marcador genético/SNP de interés. El método de MIP también puede usar varios conjuntos de sondas de tipo “candado” que se hibridan con el ADN genómico en paralelo (Hardenbolet al.,2003). En caso de una coincidencia perfecta, las regiones de homología genómica se ligan experimentando una inversión en la configuración (tal como sugiere el nombre de la técnica) y creando una molécula circular. Después de la primera restricción, todas las moléculas se amplifican con cebadores universales. Los amplicones se restringen nuevamente para garantizar fragmentos cortos para la hibridación en una micromatriz. Los fragmentos cortos generados se marcan y, a través de una secuencia Tag, se hibridan con una cTag (cadena complementaria para el índice) en una matriz. Después de la formación del dúplex Tag-cTag, se detecta una señal.

En otro aspecto de esta realización, va a administrarse al sujeto al menos un agente terapéutico adicional eficaz para tratar o mejorar los efectos del cáncer. El agente terapéutico adicional puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo o fragmento del mismo, un agente citotóxico, una toxina, un radionúclido, un inmunomodulador, un agente terapéutico fotoactivo, un agente radiosensibilizante, una hormona, un agente antiangiogénico, y combinaciones de los mismos.

Tal como se usa en el presente documento, un “anticuerpo” abarca inmunoglobulinas que se producen de manera natural, así como inmunoglobulinas que se producen de manera no natural, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos quiméricos (por ejemplo, anticuerpos murinos humanizados) y anticuerpos heteroconjugados (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos). Los fragmentos de anticuerpos incluyen aquellos que se unen al antígeno (por ejemplo, Fab', F(ab')<2>, Fab, Fv y rlgG). Véase también, por ejemplo, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, III.); Kuby, J., Immunology, 3.a ed., W.H. Freeman & Co., Nueva York (1998). El término anticuerpo también incluye moléculas bivalentes o biespecíficas, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos. El término “anticuerpo” incluye además anticuerpos tanto policlonales como monoclonales.

Los ejemplos de anticuerpos terapéuticos que pueden usarse incluyen rituximab (Rituxan), cetuximab (Erbitux), bevacizumab (Avastin), e ibritumomab (Zevalin).

Los agentes citotóxicos incluyen agentes que dañan el ADN, antimetabolitos, agentes antimicrotúbulos, agentes antibióticos, etc. Los agentes que dañan el ADN incluyen agentes alquilantes, agentes a base de platino, agentes intercalantes e inhibidores de la replicación del ADN. Los ejemplos no limitativos de agentes alquilantes de ADN incluyen ciclofosfamida, mecloretamina, uramustina, melfalano, clorambucilo, ifosfamida, carmustina, lomustina, estreptozocina, busulfano, temozolomida, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, profármacos y combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitativos de agentes basados en platino incluyen cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, nedaplatino, satraplatino, tetranitrato de triplatino, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, profármacos, y combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitativos de agentes intercalantes incluyen doxorrubicina, daunorrubicina, idarrubicina, mitoxantrona, sales farmacéuticamente aceptables de las mismas, profármacos, y combinaciones de las mismas. Los ejemplos no limitativos de inhibidores de la replicación de ADN incluyen irinotecán, topotecán, amsacrina, etopósido, fosfato de etopósido, tenipósido, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, profármacos y combinaciones de los mismos. Los antimetabolitos incluyen antagonistas de folato tales como metotrexato y premetrexed, antagonistas de purina tales como 6-mercaptopurina, dacarbazina y fludarabina, y antagonistas de pirimidina tales como 5-fluorouracilo, arabinosilcitosina, capecitabina, gemcitabina, decitabina, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, profármacos y combinaciones de los mismos. Los agentes antimicrotúbulos incluyen, sin limitación, alcaloides de vinca, paclitaxel (Taxol®), docetaxel (Taxotere®) e ixabepilona (Ixempra®). Los agentes antibióticos incluyen, sin limitación, actinomicina, antraciclinas, valrubicina, epirubicina, bleomicina, plicamicina, mitomicina, sales farmacéuticamente aceptables de las mismas, profármacos y combinaciones de las mismas.

Los agentes citotóxicos también incluyen un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt. Los ejemplos no limitativos de un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt incluyen A-674563 (n.° de CAS 552325-73-2), AGL 2263, AMG-319 (Amgen, Thousand Oaks, CA), AS-041164 (5-benzo[1,3]dioxol-5-ilmetilen-tiazolidin-2,4-diona), AS-604850 (5-(2,2-difluorobenzo[1,3]dioxol-5-ilmetilen)-tiazolidin-2,4-diona), AS-605240 (5-quinoxilin-6-metilen-1,3-tiazolidin-2,4-diona), AT7867 (n.° de CAS 857531-00-1), serie de benzimidazol, Genentech (Roche Holdings Inc., South San Francisco, CA), BML-257 (n.° de CAS 32387-96-5), CAL-120 (Gilead Sciences, Foster City, CA), CAL-129 (Gilead Sciences), CAL-130 (Gilead Sciences), CAL-253 (Gilead Sciences), CAL-263 (Gilead Sciences), n.° de CAS 612847-09-3, n.° de CAS 681281-88-9, n.° de CAS 75747-14-7, n.° de CAS 925681-41-0, n.° de CAS 98510-80-6, CCT128930 (n.° de CAS 885499-61-6), CH5132799 (n.° de CAS 1007207-67-1), CHR-4432 (Chroma Therapeutics, Ltd., Abingdon, RU), FPA 124 (n.° de CAS 902779-59-3), GS-1101 (CAL-101) (Gilead Sciences), GSK 690693 (n.° de CAS 937174-76-0), H-89 (n.° de CAS 127243-85-0), Honokiol, IC87114 (Gilead Science), IPI-145 (Intellikine Inc.), KAR-4139 (Karus Therapeutics, Chilworth, RU), KAR-4141 (Karus Therapeutics), KIN-1 (Karus Therapeutics),kT 5720 (n.° de CAS 108068-98-0), miltefosina, diclorhidrato de MK-2206 (n.° de CAS 1032350-13-2), ML-9 (n.° CAS 105637-50-1), clorhidrato de naltrindol, OXY-111A (NormOxys Inc., Brighton, MA), perifosina, PHT-427 (n.° de CAS 1191951-57-1), inhibidor de PI3 cinasa delta, Merck KGaA (Merck & Co., Whitehouse Station, NJ), inhibidores de PI3 cinasa delta, Genentech (Roche Holdings Inc.), inhibidores de PI3 cinasa delta, Incozen (Incozen Therapeutics, Pvt. Ltd., Hydrabad, India), inhibidores de PI3 cinasa delta-2, Incozen (Incozen Therapeutics), inhibidor de PI3 cinasa, Roche-4 (Roche Holdings Inc.), inhibidores de PI3 cinasa, Roche (Roche Holdings Inc.), inhibidores de PI3 cinasa, Roche-5 (Roche Holdings Inc.), inhibidores de PI3-alfa/delta, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd., South San Francisco, CA), inhibidores de PI3-delta, Cellzome (Cellzome AG, Heidelberg, Alemania), inhibidores de PI3-delta, Intellikine (Intellikine Inc., La Jolla, CA), inhibidores de PI3-delta, Pathway Therapeutics-1 (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidores de PI3-delta, Pathway Therapeutics-2 (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidores de PI3-delta/gamma, Cellzome (Cellzome AG), inhibidores de PI3-delta/gamma, Cellzome (Cellzome AG), inhibidores de PI3-delta/gamma, Intellikine (Intellikine Inc.), inhibidores de PI3-delta/gamma, Intellikine (Intellikine Inc.), inhibidores de PI3-delta/gamma, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidores de PI3-delta/gamma, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidor de PI3-gamma Evotec (Evotec), inhibidor de PI3-gamma, Cellzome (CellzomeaG), inhibidores de PI3-gamma, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidores de PI3K delta/gamma, Intellikine-1 (Intellikine Inc.), inhibidores de PI3K delta/gamma, Intellikine-1 (Intellikine Inc.), pictilisib (Roche Holdings Inc.), PIK-90 (n.° de CAS 677338-12-4), SC-103980 (Pfizer, Nueva York, NY), SF-1126 (Semafore Pharmaceuticals, Indianápolis, IN), SH-5, SH-6, tetrahidro curcumina, TG100-115 (Targegen Inc., San Diego, CA), triciribina, X-339 (Xcovery, West Palm Beach, FL), XL-499 (Evotech, Hamburgo, Alemania), sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “toxina” significa un veneno antigénico o veneno de origen vegetal o animal. Un ejemplo es la toxina diftérica o partes de la misma.

Tal como se usa en el presente documento, el término “radionúclido” significa una sustancia radiactiva administrada al paciente, por ejemplo, por vía intravenosa u oral, después de lo cual penetra a través del metabolismo normal del paciente en el órgano o tejido objetivo, donde administra radiación local durante un breve periodo de tiempo. Los ejemplos de radionúclidos incluyen, pero no se limitan a, I-125, At-211, Lu-177, Cu-67, I-131, Sm-153, Re-186, P-32, Re-188, In-114m, e Y-90.

Tal como se usa en el presente documento, el término “inmunomodulador” significa una sustancia que altera la respuesta inmunitaria aumentando o reduciendo la capacidad del sistema inmunitario para producir anticuerpos o células sensibilizadas que reconocen y reaccionan con el antígeno que inició su producción. Los inmunomoduladores pueden ser preparaciones recombinantes, sintéticas o naturales e incluyen citocinas, corticosteroides, agentes citotóxicos, timosina, e inmunoglobulinas. Algunos inmunomoduladores están presentes de manera natural en el organismo y algunos de ellos están disponibles en preparaciones farmacológicas. Los ejemplos de inmunomoduladores incluyen, pero no se limitan a, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), interferones, imiquimod y fracciones de membrana celular de bacterias, IL-2, IL-7, IL-12, CCL3, CCL26, CXCL7, y fosfato de citosina-guanosina (CpG) sintético.

Tal como se usa en el presente documento, el término “agente terapéutico fotoactivo” significa compuestos y composiciones que se vuelven activos tras la exposición a la luz. Se dan a conocer determinados ejemplos de agentes terapéuticos fotoactivos, por ejemplo, en la solicitud de patente estadounidense con número de serie 2011/0152230 A1, “Photoactive Metal Nitrosyls For Blood Pressure Regulation And Cancer Therapy”.

Tal como se usa en el presente documento, el término “agente radiosensibilizante” significa un compuesto que hace que las células tumorales sean más sensibles a la radioterapia. Los ejemplos de agentes radiosensibilizadores incluyen misonidazol, metronidazol, tirapazamina, y crocetinato de sodio trans.

Tal como se usa en el presente documento, el término “hormona” significa una sustancia liberada por las células en una parte del cuerpo que afecta a las células en otra parte del cuerpo. Los ejemplos de hormonas incluyen, pero no se limitan a, prostaglandinas, leucotrienos, prostaciclina, tromboxano, amilina, hormona antimulleriana, adiponectina, hormona adrenocorticotrópica, angiotensinógeno, angiotensina, vasopresina, atriopeptina, péptido natriurético cerebral, calcitonina, colecistoquinina, hormona liberadora de corticotropina, encefalina, endotelina, eritropoyetina, hormona estimulante del folículo, galanina, gastrina, grelina, glucagón, hormona liberadora de gonadotropina, hormona liberadora de hormona del crecimiento, gonadotropina coriónica humana, lactógeno placentario humano, hormona del crecimiento, inhibina, insulina, somatomedina, leptina, liptropina, hormona luteinizante, hormona estimulante de melanocitos, motilina, orexina, oxitocina, polipéptido pancreático, hormona paratiroidea, prolactina, hormona liberadora de prolactina, relaxina, renina, secretina, somatostatina, trombopoyetina, hormona estimulante de la tiroides, testosterona, dehidroepiandrosterona, androstenediona, dihidrotestosterona, aldosterona, estradiol, estrona, estriol, cortisol, progesterona, calcitriol y calcidiol.

Algunos compuestos interfieren con la actividad de determinadas hormonas o detienen la producción de determinadas hormonas. Estos compuestos que interfieren con las hormonas incluyen, pero no se limitan a, tamoxifeno (Nolvadex®), anastrozol (Arimidex®), letrozol (Femara®) y fulvestrant (FasIodex®). Tales compuestos también se encuentran dentro del significado de hormona tal como se usa en el presente documento.

Tal como se usa en el presente documento, un agente “antiangiogénico” significa una sustancia que reduce o inhibe el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos, tal como, por ejemplo, un inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y un inhibidor de la migración de células endoteliales. Los agentes antiangiogénicos incluyen, sin limitación, 2-metoxiestradiol, angiostatina, bevacizumab, factor inhibidor de la angiogénesis derivado del cartílago, endostatina, IFN-a, IL-12, itraconazol, linomida, factor plaquetario-4, prolactina, SU5416, suramina, tasquinimod, tecogalán, tetratiomolibdato, talidomida, trombospondina, trombospondina, TNP-470, ziv-aflibercept, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, profármacos y combinaciones de los mismos.

En un aspecto adicional de esta realización, la administración del primer y segundo antineoplásico proporciona un efecto sinérgico en comparación con la administración de cualquier antineoplásico solo. Tal como se usa en el presente documento, “sinérgico” significa más que aditivo. Los efectos sinérgicos pueden medirse mediante diversos ensayos conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, los dados a conocer en el presente documento, tal como el ensayo de exceso sobre Bliss.

También se da a conocer un método para tratar o mejorar los efectos de un cáncer en un sujeto que lo necesita. El método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de (i) un primer antineoplásico, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo antineoplásico, que se selecciona del grupo que consiste en dinaciclib, palbociclib, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, para tratar o mejorar los efectos del cáncer.

Los sujetos adecuados y preferidos son los que se dan a conocer en el presente documento. En esta realización, los métodos pueden usarse para tratar los cánceres dados a conocer anteriormente, incluyendo aquellos cánceres con los antecedentes mutacionales identificados anteriormente. Los métodos para identificar tales mutaciones también son tal como se expusieron anteriormente.

En un aspecto de esta realización, el BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administra en forma de composición farmacéutica que comprende además un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. En un aspecto adicional de esta realización, el dinaciclib, palbociclib o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos se administra en forma de composición farmacéutica que comprende además un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto de esta realización, se administrará al sujeto al menos un agente terapéutico adicional, preferiblemente un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt, tal como se da a conocer en el presente documento.

En otro aspecto de esta realización, la administración del primer y segundo antineoplásico proporciona un efecto sinérgico en comparación con la administración de cualquier antineoplásico solo.

También se da a conocer un método para lograr la muerte de células cancerosas. El método comprende poner en contacto la célula cancerosa con una cantidad eficaz de (i) un primer antineoplásico, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo antineoplásico, que es un inhibidor de CDK o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En esta realización, “poner en contacto” significa poner BVD-523, los inhibidores de CDK y, opcionalmente, uno o más agentes terapéuticos adicionales en estrecha proximidad con las células cancerosas. Esto puede lograrse usando técnicas convencionales de administración de fármacos a mamíferos o en la situaciónin vitro,por ejemplo, proporcionando BVD-523, los inhibidores de CDK, y opcionalmente otros agentes terapéuticos a un medio de cultivo en el que se encuentran las células cancerosas.

Los inhibidores de CDK adecuados y preferidos son tal como se dan a conocer en el presente documento. En esta realización, la muerte de células cancerosas puede lograrse en células cancerosas que tienen diversos antecedentes mutacionales y/o que se caracterizan tal como se da a conocer anteriormente. Los métodos para identificar tales mutaciones también son tal como se expusieron anteriormente.

Los métodos de esta realización, que pueden llevarse a caboin vitro o in vivo,pueden usarse para lograr la muerte de células cancerosas, por ejemplo, destruyendo células cancerosas, en células de los tipos de cáncer dados a conocer en el presente documento.

En un aspecto de esta realización, la célula cancerosa es una célula cancerosa de mamífero. Preferiblemente, la célula cancerosa de mamífero se obtiene de un mamífero seleccionado del grupo que consiste en seres humanos, primates, animales de granja, y animales domésticos. Más preferiblemente, la célula cancerosa de mamífero es una célula cancerosa humana.

En otro aspecto de esta realización, el método comprende además poner en contacto la célula cancerosa con al menos un agente terapéutico adicional, preferiblemente un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt, tal como se da a conocer en el presente documento.

En un aspecto adicional de esta realización, la puesta en contacto de la célula cancerosa con el primer y segundo antineoplásico proporciona un efecto sinérgico en comparación con la puesta en contacto de la célula cancerosa con cualquier antineoplásico solo.

También se da a conocer un kit para tratar o mejorar los efectos de un cáncer en un sujeto que lo necesita. El kit comprende una cantidad eficaz de (i) un primer antineoplásico, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo antineoplásico, que es un inhibidor de CDK o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, empaquetados junto con instrucciones para su uso.

Los kits también pueden incluir recipientes de almacenamiento adecuados, por ejemplo, ampollas, viales, tubos, etc., para cada composición farmacéutica y otros reactivos, por ejemplo, tampones, soluciones salinas equilibradas, etc., para su uso en la administración de las composiciones farmacéuticas a los sujetos. Las composiciones farmacéuticas y otros reactivos pueden estar presentes en los kits en cualquier forma conveniente, tal como, por ejemplo, en una disolución o en forma de polvo. Los kits pueden incluir además instrucciones para el uso de las composiciones farmacéuticas. Los kits pueden incluir además un recipiente de envasado, que opcionalmente tiene una o más particiones para albergar la composición farmacéutica y otros reactivos opcionales.

Para su uso en los kits de la invención, los inhibidores de CDK y sujetos adecuados y preferidos son tal como se dan a conocer en el presente documento. En esta realización, el kit puede usarse para tratar los cánceres dados a conocer anteriormente, incluyendo aquellos cánceres con los antecedentes mutacionales identificados en el presente documento. Los métodos para identificar tales mutaciones son tal como se expusieron anteriormente. En un aspecto adicional de esta realización, el kit comprende además al menos un agente terapéutico adicional, preferiblemente un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt, tal como se da a conocer en el presente documento.

En otro aspecto de esta realización, la administración del primer y segundo antineoplásico proporciona un efecto sinérgico en comparación con la administración de cualquier antineoplásico solo.

También se da a conocer una composición farmacéutica para tratar o mejorar los efectos de un cáncer en un sujeto que lo necesita. La composición farmacéutica comprende un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad eficaz de (i) un primer antineoplásico, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y (ii) un segundo antineoplásico, que es un inhibidor de CDK o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde la administración del primer y segundo antineoplásico proporciona un efecto sinérgico en comparación con la administración de cualquier antineoplásico solo.

Los inhibidores de CDK y sujetos adecuados y preferidos son tal como se dan a conocer en el presente documento. Las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en el presente documento pueden usarse para tratar los cánceres dados a conocer anteriormente, incluyendo aquellos cánceres con los antecedentes mutacionales identificados en el presente documento. Los métodos para identificar tales mutaciones también son tal como se expusieron anteriormente.

En otro aspecto de esta realización, la composición farmacéutica comprende además al menos un agente terapéutico adicional, preferiblemente un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt, tal como se da a conocer en el presente documento.

Las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en el presente documento pueden estar en una forma de dosificación unitaria que comprende ambos antineoplásicos. En otro aspecto de esta realización, el primer antineoplásico está en una primera forma de dosificación unitaria y el segundo antineoplásico está en una segunda forma de dosificación unitaria, separada de la primera.

El primer y segundo antineoplásico pueden administrarse conjuntamente al sujeto, o bien simultáneamente o bien en momentos diferentes, según lo considere más apropiado el médico. Si el primer y segundo antineoplásico se administran en momentos diferentes, por ejemplo, mediante administración en serie, el primer antineoplásico puede administrarse al sujeto antes que el segundo antineoplásico. Alternativamente, el segundo antineoplásico puede administrarse al sujeto antes que el primer antineoplásico.

Tal como se usa en el presente documento, una “cantidad eficaz” o una “cantidad terapéuticamente eficaz” de un antineoplásico dado a conocer en el presente documento, incluyendo las composiciones farmacéuticas que contienen el mismo, es una cantidad de tal agente o composición que es suficiente para producir resultados beneficiosos o deseados tal como se describe en el presente documento cuando se administra a un sujeto. Las formas de dosificación, los modos de administración, y las cantidades de dosificación eficaces pueden determinarse empíricamente, y realizar tales determinaciones está dentro del conocimiento de la técnica. Los expertos en la técnica entienden que la cantidad de dosificación variará según la vía de administración, la tasa de excreción, la duración del tratamiento, la identidad de cualquier otro fármaco que se administre, la edad, el tamaño, y la especie del mamífero, por ejemplo, paciente humano, y factores similares bien conocidos en la técnica de la medicina y la medicina veterinaria. En general, una dosis adecuada de un agente o composición dados a conocer en el presente documento será aquella cantidad del agente o composición que sea la dosis más baja eficaz para producir el efecto deseado. La dosis eficaz de un agente o composición de la presente invención puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis, administradas por separado a intervalos apropiados a lo largo del día.

Un ejemplo adecuado, no limitativo, de una dosificación de un antineoplásico dado a conocer en el presente documento es de desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 2400 mg/kg por día, tal como de desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 1200 mg/kg por día, desde 75 mg/kg por día hasta aproximadamente 300 mg/kg por día, incluyendo de desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg por día. Otras dosificaciones representativas de tales agentes incluyen aproximadamente 1 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 75 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 100 mg/kg, 125 mg/kg, 150 mg/kg, 175 mg/kg, 200 mg/kg, 250 mg/kg, 300 mg/kg, 400 mg/kg, 500 mg/kg, 600 mg/kg, 700 mg/kg, 800 mg/kg, 900 mg/kg, 1000 mg/kg, 1100 mg/kg, 1200 mg/kg, 1300 mg/kg, 1400 mg/kg, 1500 mg/kg, 1600 mg/kg, 1700 mg/kg, 1800 mg/kg, 1900 mg/kg, 2000 mg/kg, 2100 mg/kg, 2200 mg/kg, y 2300 mg/kg por día. La dosis eficaz de los antineoplásicos dados a conocer en el presente documento, por ejemplo, BVD-523 e inhibidores de CDK, puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis, administradas por separado a intervalos apropiados a lo largo del día.

Los antineoplásicos o composiciones farmacéuticas que contienen los mismos dados a conocer en el presente documento pueden administrarse de cualquier manera deseada y eficaz: para ingestión oral, o como ungüento o gota para administración local en los ojos, o para administración parenteral u otra administración de cualquier manera apropiada tal como intraperitoneal, subcutánea, tópica, intradérmica, inhalación, intrapulmonar, rectal, vaginal, sublingual, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intratecal, o intralinfática. Además, los antineoplásicos o las composiciones farmacéuticas que contienen los mismos dados a conocer en el presente documento pueden administrarse junto con otros tratamientos. Los antineoplásicos o las composiciones farmacéuticas dados a conocer en el presente documento pueden encapsularse o protegerse de otro modo contra secreciones gástricas o de otro tipo, si se desea.

Las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en el presente documento pueden comprender uno o más principios activos, por ejemplo, antineoplásicos, mezclados con uno o más diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, uno o más de otros compuestos, fármacos, componentes y/o materiales. Independientemente de la vía de administración seleccionada, los agentes/compuestos dados a conocer en el presente documento se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington, The Science and Practice of Pharmacy (21a edición, Lippincott Williams y Wilkins, Filadelfia, PA).

Los diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Remington, The Science and Practice of Pharmacy (21a edición, Lippincott Williams and Wilkins, Filadelfia, PA) y The National Formulary (American Pharmaceutical Association, Washington, D.C.)) e incluyen azúcares (por ejemplo, lactosa, sacarosa, manitol, y sorbitol), almidones, preparaciones de celulosa, fosfatos de calcio (por ejemplo, fosfato de dicalcio, fosfato de tricalcio e hidrogenofosfato de calcio), citrato de sodio, agua, disoluciones acuosas (por ejemplo, solución salina, inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de dextrosa, inyección de dextrosa y cloruro de sodio, inyección de Ringer lactato), alcoholes (por ejemplo, alcohol etílico, alcohol propílico, y alcohol bencílico), polioles (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol), ésteres orgánicos (por ejemplo, oleato de etilo y triglicéridos), polímeros biodegradables (por ejemplo, polilactida-poliglicólido, poli(ortoésteres), y poli(anhídridos)), matrices elastoméricas, liposomas, microesferas, aceites (por ejemplo, maíz, germen de trigo, oliva, ricino, sésamo, semilla de algodón, y cacahuete), manteca de cacao, ceras (por ejemplo, ceras para supositorios), parafinas, siliconas, talco, silicilato, etc. Cada diluyente o portador farmacéuticamente aceptable usado en una composición farmacéutica dada a conocer en el presente documento debe ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con los demás componentes de la formulación y no ser perjudicial para el sujeto. Los diluyentes o portadores adecuados para una forma de dosificación seleccionada y una vía de administración prevista se conocen bien en la técnica, y los diluyentes o portadores aceptables para una forma de dosificación y un método de administración elegidos pueden determinarse usando conocimientos habituales en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en el presente documento pueden contener opcionalmente componentes y/o materiales adicionales habitualmente usados en composiciones farmacéuticas. Estos componentes y materiales se conocen bien en la técnica e incluyen (1) cargas o extensores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, y ácido silícico; (2) aglutinantes, tales como carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa, sacarosa y goma arábiga; (3) humectantes, tales como glicerol; (4) agentes disgregantes, tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, determinados silicatos, glicolato de almidón de sodio, carboximetilcelulosa de sodio reticulada y carbonato de sodio; (5) agentes retardantes de la disolución, tales como parafina; (6) aceleradores de la absorción, tales como compuestos de amonio cuaternario; (7) agentes humectantes, tales como alcohol cetílico y monoestearato de glicerol; (8) absorbentes, tales como caolín y arcilla bentonita; (9) lubricantes, tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos y lauril sulfato de sodio; (10) agentes de suspensión, tales como alcoholes isoestearílicos etoxilados, polioxietilensorbitol y ésteres de sorbitano, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto; (11) agentes tampón; (12) excipientes, tales como lactosa, azúcares de leche, polietilenglicoles, grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, manteca de cacao, almidones, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicol, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco, salicilato, óxido de cinc, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y polvo de poliamida; (13) diluyentes inertes, tales como agua u otros disolventes; (14) conservantes; (15) agentes tensioactivos; (16) agentes dispersantes; (17) agentes de liberación controlada o retardantes de absorción, tales como hidroxipropilmetilcelulosa, otras matrices poliméricas, polímeros biodegradables, liposomas, microesferas, monoestearato de aluminio, gelatina y ceras; (18) agentes opacificantes; (19) adyuvantes; (20) agentes humectantes; (21) agentes emulsionantes y de suspensión; (22), agentes solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen de trigo, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitano; (23) propelentes, tales como clorofluorohidrocarburos e hidrocarburos volátiles no sustituidos, tales como butano y propano; (24) antioxidantes; (25) agentes que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto, como azúcares y cloruro de sodio; (26) agentes espesantes; (27) materiales de recubrimiento, como lecitina; y (28) agentes edulcorantes, aromatizantes, colorantes, perfumantes y conservantes. Cada uno de estos componentes o materiales debe ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con los demás componentes de la formulación y no ser perjudicial para el sujeto. Los componentes y materiales adecuados para una forma de dosificación seleccionada y una vía de administración prevista se conocen bien en la técnica, y los componentes y materiales aceptables para una forma de dosificación y un método de administración elegidos pueden determinarse usando conocimientos habituales en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en el presente documento adecuadas para administración oral pueden estar en forma de cápsulas, catchets, píldoras, comprimidos, polvos, gránulos, una disolución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, una emulsión líquida de aceite en agua o agua en aceite, un elixir o jarabe, una pastilla, un bolo, un electuario o una pasta. Estas formulaciones pueden prepararse mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante procedimientos convencionales de recubrimiento en bandeja, mezclado, granulación o liofilización.

Las formas de dosificación sólidas para administración oral (cápsulas, comprimidos, píldoras, grageas, polvos, gránulos y similares) pueden prepararse, por ejemplo, mezclando el o los principios activos con uno o más diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables y, opcionalmente, una o más cargas, extensores, aglutinantes, humectantes, agentes disgregantes, agentes retardantes de la disolución, aceleradores de absorción, agentes humectantes, absorbentes, lubricantes y/o agentes colorantes. Pueden emplearse composiciones sólidas de un tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina blandas y duras usando un excipiente adecuado. Puede fabricarse un comprimido por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más componentes auxiliares. Los comprimidos fabricados por compresión pueden prepararse usando un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, conservante, disgregante, agente tensioactivo o dispersante adecuado. Los comprimidos fabricados por moldeo pueden prepararse mediante moldeo en una máquina adecuada. Los comprimidos y otras formas de dosificación sólidas, tales como grageas, cápsulas, píldoras y gránulos, pueden opcionalmente ranurarse o prepararse con recubrimientos y cubiertas, tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. También pueden formularse de manera que proporcionen una liberación lenta o controlada del principio activo en los mismos. Pueden esterilizarse, por ejemplo, filtrándolos a través de un filtro que retiene bacterias. Estas composiciones también pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y pueden ser de una composición tal que liberen el principio activo sólo, o preferentemente, en una determinada porción del tracto gastrointestinal, opcionalmente, de manera retardada. El principio activo también puede estar en forma microencapsulada.

Las formas de dosificación líquidas para administración oral incluyen emulsiones, microemulsiones, disoluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Las formas de dosificación líquidas pueden contener diluyentes inertes adecuados habitualmente usados en la técnica. Además de diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, aromatizantes, colorantes, perfumantes y conservantes. Las suspensiones pueden contener agentes de suspensión.

Las composiciones farmacéuticas dadas a conocer para administración rectal o vaginal pueden presentarse como un supositorio, que puede prepararse mezclando uno o más principios activos con uno o más diluyentes o portadores no irritantes adecuados que son sólidos a temperatura ambiente, pero líquidos a temperatura corporal y, por tanto, se derretirán en el recto o la cavidad vaginal y liberarán el compuesto activo. Las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en el presente documento que son adecuadas para administración vaginal también incluyen óvulos vaginales, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones en aerosol que contienen tales diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables que se sabe en la técnica que son apropiados.

Las formas de dosificación para administración tópica o transdérmica incluyen polvos, aerosoles, ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, disoluciones, parches, gotas y medicamentos inhalatorios. El agente(s)/compuesto(s) activo(s) puede(n) mezclarse en condiciones estériles con un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable adecuado. Los ungüentos, pastas, cremas y geles pueden contener excipientes. Los polvos y aerosoles pueden contener excipientes y propelentes.

Las composiciones farmacéuticas dadas a conocer en el presente documento adecuadas para administraciones parenterales pueden comprender uno o más agentes/compuestos en combinación con una o más disoluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables, o polvos estériles que pueden reconstituirse en disoluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes de su uso, que pueden contener antioxidantes adecuados, tampones, solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto, o agentes de suspensión o espesantes. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. Estas composiciones farmacéuticas también pueden contener adyuvantes adecuados, tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede lograrse mediante la inclusión de agentes que retrasan la absorción.

En algunos casos, para prolongar el efecto de un fármaco (por ejemplo, una formulación farmacéutica), es deseable retardar su absorción a partir de la inyección subcutánea o intramuscular. Esto puede lograrse mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo que tenga escasa solubilidad en agua.

La velocidad de absorción del agente activo/fármaco depende entonces de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y de la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de un agente/fármaco administrado por vía parenteral puede lograrse disolviendo o suspendiendo el agente activo/fármaco en un vehículo oleoso. Las formas de depósito inyectables pueden elaborarse formando matrices de microcápsulas del principio activo en polímeros biodegradables. Dependiendo de la razón del principio activo con respecto al polímero, y la naturaleza del polímero particular empleado, puede controlarse la velocidad de liberación del principio activo. Las formulaciones de depósito inyectables también se preparan atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con el tejido corporal. Los materiales inyectables pueden esterilizarse, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro que retiene bacterias.

Las formulaciones pueden estar presentes en recipientes sellados de dosis unitaria o multidosis, por ejemplo, ampollas y viales, y pueden almacenarse en estado liofilizado que requiere únicamente la adición del diluyente o portador líquido estéril, por ejemplo, agua para inyección, inmediatamente antes de su uso. Pueden prepararse disoluciones y suspensiones inyectables extemporáneas a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles del tipo descrito anteriormente.

La presente invención proporciona combinaciones que han demostrado potenciar los efectos de BVD-523. En el presente documento, los solicitantes también han demostrado que la combinación de BVD-523 con diferentes inhibidores de CDK (es decir, palbociclib, LEE-011, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos) es sinérgica.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar adicionalmente la presente invención.

Ejemplos

Ejemplo 1

BVD-523 alteró los marcadores de la actividad de la cinasa MAPK y la función efectora

Para los estudios de inmunotransferencia de tipo Western, se sembraron células HCT116 (5 x 106) en placas de 10 cm en medio de McCoy 5A más FBS al 10 %. Se sembraron células A375 (2,5 x 106) en placas de 10 cm en DMEM más FBS al 10 %. Se dejó que las células se adhirieran durante la noche antes de añadir la cantidad indicada de compuesto de prueba (BVD-523) o control de vehículo. Se trataron las células durante o bien 4 o bien 24 horas antes del aislamiento de los lisados de proteínas de células completas, tal como se especifica a continuación. Se recogieron las células mediante tripsinización, se sedimentaron y se congelaron rápidamente. Los lisados se prepararon con tampón RIPA (ensayo de radioinmunoprecipitación), se clarificaron por centrifugación y se cuantificaron mediante el ensayo de ácido bicinconínico (BCA). Se resolvieron 20-50 |ig de proteína mediante electroforesis SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de PVDF y se analizaron usando los anticuerpos detallados en la tabla 2 (para el tratamiento de 4 horas) y la tabla 3 (para el tratamiento de 24 horas) a continuación. Tabla 2 - Detalles de los anticuerpos

Antígeno Tamaño Proveedor N.° de Dilución Condiciones de Anticuerpo

Tabla 3 - Detalles de los anticuerpos

La figura 1 muestra análisis de inmunotransferencia de tipo Western de células tratadas con BVD-523 en diversas concentraciones para lo siguiente: 1) componentes de señalización de MAPK en células A375 después de 4 horas; 2) señalización del ciclo celular y de apoptosis en A375 tratadas durante 24 horas con varias cantidades de BVD-523; y 3) señalización de MAPK en células HCT-116 tratadas durante 4 horas. Los resultados muestran que el tratamiento agudo y prolongado con BVD-523 en células cancerosas mutantes RAF y RASin vitroafecta tanto la fosforilación del sustrato como a las dianas efectoras de las cinasas ERK. Las concentraciones de BVD-523 requeridas para inducir estos cambios están normalmente en el intervalo micromolar bajo.

Son dignos de mención los cambios en varios marcadores de actividad específicos. En primer lugar, la abundancia de isoformas de migración lenta de la cinasa ERK aumenta después del tratamiento con BVD-523; pueden observarse cambios modestos de forma aguda y aumentan después de un tratamiento prolongado. Si bien esto podría indicar un aumento en las formas fosforiladas y enzimáticamente activas de ERK, cabe destacar que múltiples proteínas sujetas a regulación directa e indirecta por ERK permanecen “desactivadas” tras el tratamiento con BVD-523. En primer lugar, las proteínas RSK1/2 exhiben una fosforilación reducida en residuos que dependen estrictamente de ERK para la modificación de proteínas (T359/S363). En segundo lugar, el tratamiento con BVD-523 induce cambios complejos en la fosfatasa de retroalimentación MAPK, DUSP6: las isoformas de proteína que migran lentamente se reducen después del tratamiento agudo, mientras que los niveles de proteína total se reducen en gran medida después del tratamiento prolongado con BVD-523. Ambos de estos hallazgos son coherentes con una actividad reducida de las cinasas ERK, que controlan la función de DUSP6 a través de mecanismos tanto postraduccionales como transcripcionales. En general, a pesar de los aumentos en las formas celulares de ERK que generalmente se consideran activas, parece probable que la actividad de la enzima ERK celular se inhiba por completo después del tratamiento agudo o prolongado con BVD-523.

Coherente con estas observaciones, los genes efectores que requieren la señalización de la ruta de MAPK se alteran tras el tratamiento con BVD-523. El aparato del ciclo celular G1/S está regulado tanto a nivel postraduccional como transcripcional por la señalización MAPK, y los niveles de proteína ciclina-D1 se reducen en gran medida después de un tratamiento prolongado con BVD-523. De manera similar, la expresión génica y la abundancia de proteínas de los efectores de la apoptosis a menudo requieren una señalización MAPK intacta, y los niveles totales de Bim-EL aumentan después de un tratamiento prolongado con BVD-523. Sin embargo, tal como se señaló anteriormente, no se observaron escisión de la proteína PARP ni aumento de la apoptosis en el fondo de células A375; esto sugiere que factores adicionales pueden influir en si los cambios en la señalización efectora dependiente de BVD-523/ERK se traducen en acontecimientos definitivos tales como muerte celular y detención del ciclo celular. Coherente con la actividad celular de BVD-523, el análisis de marcadores sugiere que la inhibición de ERK altera una variedad de acontecimientos de señalización molecular en las células cancerosas, haciéndolas susceptibles tanto a una disminución de la proliferación celular como de la supervivencia.

En resumen, la figura 1 muestra que BVD-523 inhibe la ruta de señalización MAPK y puede ser más favorable en comparación con la inhibición de RAF o MEK en este contexto.

Finalmente, las propiedades de BVD-523 pueden hacer que éste sea un agente preferido para su uso como inhibidor de ERK, en comparación con otros agentes con una actividad similar. Se sabe que los fármacos inhibidores de cinasa muestran interacciones únicas y específicas con sus dianas enzimáticas, y que la eficacia del fármaco está fuertemente influenciada tanto por el modo de inhibición directa como por la susceptibilidad a los cambios adaptativos que se producen después del tratamiento. Por ejemplo, los inhibidores de las cinasas ABL, KIT, EGFR y ALK son eficaces sólo cuando su diana homóloga se encuentra en configuraciones activas o inactivas. Asimismo, determinados de estos inhibidores son excepcionalmente sensibles a la mutación genética secundaria o a los cambios adaptativos postraduccionales de la diana proteica. Finalmente, los inhibidores de RAF muestran una potencia diferencial frente a las cinasas RAF presentes en determinados complejos proteicos y/o localizaciones subcelulares. En resumen, como también se sabe que las cinasas ERK existen en estados bioquímicos diversos, variables, y complejos, parece probable que BVD-523 pueda interactuar con estas dianas e inhibirlas de una manera distinta y altamente preferible a otros agentes.

Ejemplo 2

Las combinaciones de inhibidores de BVD-523/CDK son eficaces para inhibir el crecimiento de líneas de células cancerosasin vitro

Las líneas de células cancerosas se mantienen en cultivo celular en medios y condiciones de suero convencionales. Para todos los estudios de combinación, las células MM415 (células de melanoma humano mutantes N-RAS) se siembran en placas de 96 pocillos por triplicado a una densidad celular de 1500 células/pocillo en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal (<f>B<s>) al 10 % (vol/vol). Las células HCT 116 (células de carcinoma colorrectal humano mutantes K-RAS) se siembran en placas de 96 pocillos por triplicado a una densidad celular de 1500 células/pocillo en medio McCoy 5A más FBS al 10 %. Las células a 375 (melanoma maligno humano BRAF V600 E) se siembran a una densidad de 3000 células/pocillo en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) más FBS al 10 %. Se deja que las células se adhieran durante la noche antes de añadir el compuesto de prueba o el control del vehículo.

Para los estudios con dinaciclib, se someten a prueba las siguientes combinaciones usando una matriz de dosis de 10 x 8: dinaciclib (que oscila entre 1 - 50 nM) con BVD-0523 (que oscila entre 0 -10 |iM), dinaciclib (que oscila entre 1 - 50 nM) con dabrafenib (que oscila entre 0 - 1 |iM) y dinaciclib (que oscila entre 1 - 50 nM) con trametinib (que oscila entre 0 - 0,010 |iM). La concentración final de DMSO es del 0,2 %. Los compuestos se incuban con las células durante 96 horas.

Para los estudios con palbociclib, se someten a prueba las siguientes combinaciones usando una matriz de dosis de 10 x 8: palbociclib (que oscila entre 10 nM - 500 nM) con BVD-0523 (0 a 10 |iM), palbociclib (que oscila entre 10 nM - 500 nM) con dabrafenib (que oscila entre 0 - 1 |iM) y palbociclib (que oscila entre 10 nM - 500 nM) con trametinib (que oscila entre 0 - 0,1 |iM). La concentración final de DMSO es del 0,2 %. Los compuestos se incuban con las células durante 96 horas.

A continuación, se añade Alamar Blue 10 % (v/v) y se incuba con las células durante 4 horas antes de leerlas en un lector de placas fluorescentes. Después de leer Alamar Blue, se retira la mezcla de medio/Alamar Blue, se añaden 100 |il de CellTiter-Glo/PBS (1:1) y las placas se procesan según las instrucciones del fabricante (Promega, Madison, WI). Los valores de fondo de los medios únicamente se restan antes de analizar los datos.

Ensayos de Caspase-Glo 3/7

En resumen, las células MM415 se siembran por triplicado en placas blancas de 96 pocillos a una densidad celular de 5000 células/pocillo en RPMI 1640 más FBS al 10 %. Las células A375 se siembran a una densidad de 5000 células/pocillo en DMEM más FBS al 10 %. Las células HCT 116 se siembran a una densidad celular de 5000 células/pocillo en medio McCoy 5A más FBS al 10 %. Se deja que las células se adhieran durante la noche antes de añadir el compuesto de prueba o el control del vehículo. La concentración final de DMSO es del 0,2 % y se incluye estaurosporina 800 nM como control positivo. Se usan periodos de incubación del ensayo de 24 y 48 horas. Luego, se añade Caspase-Glo® 3/7 al 50 % (v/v), las placas se mezclan durante 5 minutos en un agitador orbital y se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente antes de leerlas en un lector de placas luminiscentes. Los valores de fondo de los medios únicamente se restan antes de analizar los datos.

Análisis de datos

Los datos de combinación pueden presentarse como curvas dosis-respuesta generadas en GraphPad Prism (representadas gráficamente usando el % de viabilidad relativo a los controles tratados sólo con DMSO).

Los valores de inhibición fraccionaria previstos para la inhibición combinada se calculan usando la ecuación Cbliss =A B - (A x B) donde A y B son las inhibiciones fraccionarias obtenidas por el fármaco A solo o el fármaco B solo a concentraciones específicas. Cbliss es la inhibición fraccionaria que se esperaría si la combinación de los dos fármacos fuera exactamente aditiva. Los valores de Cbliss se restan de los valores de inhibición fraccionaria observados experimentalmente para obtener un valor de “exceso sobre Bliss”. Los valores de exceso sobre Bliss mayores que 0 indican sinergia, mientras que los valores menores que 0 indican antagonismo. Los valores de exceso sobre Bliss pueden representarse gráficamente como mapas de calor ± DE.

Se espera que las combinaciones de dinaciclib o palbociclib con BVD-523 sean eficaces para inhibir el crecimiento de las células A375, MM415 y HCT116. Se obtendrán curvas dosis-respuesta. Se espera que la CI<50>de BVD-523 en estas líneas celulares sea de aproximadamente 150 nM. También se espera que la CI<50>de dinaciclib y palbociclib en estas líneas celulares sea de aproximadamente 13 nM (Parryet al.,2010) y 130 nM (Fryet al.,2004), respectivamente.

Ejemplo 3

Las combinaciones de inhibidores de BVD-523/CDK son eficaces para inhibir el crecimiento de líneas de células cancerosasin vivo

Ratones

Los ratones desnudos atímicos hembras (Crl:NU(Ncr)-Foxn/nu, Charles River) tienen nueve semanas de edad y un peso corporal (PC) que oscila entre aproximadamente 15 y 30 gramos el primer día del estudio. Los animales se alimentan con aguaad libitum(ósmosis inversa, Cl 1 ppm) y Lab Diet® irradiada y modificada con NIH 31 que consiste en el 18,0 % de proteína bruta, el 5,0 % de grasa bruta, y el 5,0 % de fibra bruta. Los ratones se alojan en lecho para animales de laboratorio Enrich-o'cobsTM irradiado en microaisladores estáticos con un ciclo de luz de 12 horas a 20-22 °C (68-72 °F) y el 40-60 % de humedad. Se cumplen las recomendaciones de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio con respecto a la sujeción, el manejo, los procedimientos quirúrgicos, la regulación de alimentos y líquidos y la atención veterinaria.

Implantaciónin vivoy crecimiento tumoral

Las células de melanoma humano mutantes N-RAS MM415 se cultivan en medio RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10 %, glutamina 2 mM, 100 unidades/ml de penicilina G sódica, 100 |ig/ml de sulfato de estreptomicina, y 25 |ig/ml de gentamicina. Las células tumorales se hacen crecer en matraces de cultivo de tejidos en una incubadora humidificada a 37 °C, en una atmósfera del 5 % de CO<2>y el 95 % de aire.

Las células MM415 usadas para la implantación se recogen durante el crecimiento exponencial y se resuspenden en Matrigel al 50 % (BD Biosciences): solución salina tamponada con fosfato al 50 % a una concentración de 2,5 x 107 células/ml. El día de la implantación del tumor, se inyectan por vía subcutánea en el flanco derecho de cada ratón de prueba 5 x 106 células (0,2 ml de suspensión celular) y se controla el crecimiento del tumor a medida que el tamaño promedio se acerca al intervalo objetivo de 100 a 150 mm3. Los tumores se miden en dos dimensiones usando calibradores y el volumen se calcula usando la fórmula:

Volumen tumoral (mm3) =(w2* l) / 2

dondew= ancho yl= largo, en mm, del tumor. El peso del tumor puede estimarse suponiendo que 1 mg equivale a 1 mm3 de volumen tumoral.

Diez días después de la implantación del tumor, denominado día 1 del estudio, los animales se dividen en dieciséis grupos, cada uno de los cuales se describe a continuación.

Tratamiento

El día 1 del estudio, los ratones se dividen en grupos de quince ratones cada uno y en un grupo de diez ratones, y se inicia la dosificación. Todas las dosis se administran por vía oral (p.o.) excepto la dacarbazina (DTIC), que se administra por vía intravenosa (i.v.). Para cada agente, el volumen de dosificación de 10 ml/kg (0,2 ml por 20 gramos de peso corporal) se ajusta al peso corporal del animal individual. Las dosis de dinaciclib/palbociclib van a administrarse una vez al día (qd) hasta el final del estudio (qd hasta el final), mientras que las dosis del vehículo y BVD-523 van a administrarse dos veces al día (bid) hasta el final del estudio (bid hasta el final). Para la dosificación bid, la dosificación se inicia en la tarde del día 1, de modo que se administra una dosis el primer día (“dosis del primer día 1”).

Controles

Un grupo recibe el 1% de vehículo CMC p.o. bid hasta el final y sirve como grupo de control para el cálculo del % de TGD. Otro grupo recibe DTIC i.v. a 80 mg/kg una vez cada dos días (qod) durante cinco dosis (qod x 5) y sirve como control positivo para el modelo.

Tratamientos de monoterapia

Cuatro grupos reciben o bien dinaciclib a 5 o 60 mg/kg o bien palbociclib a 100 o 150 mg/kg. Dos grupos reciben 50 o 100 mg/kg de BVD-523 p.o bid hasta el final.

Tratamientos de combinación

Cada uno de los dos grupos recibe una combinación de 50 mg/kg de BVD-523 con 5 o 60 mg/kg de dinaciclib. Otros dos grupos reciben 100 mg/kg de BVD-523 con 5 o 60 mg/kg de dinaciclib. Dos grupos adicionales recibirán 50 mg/kg de BVD-523 con 100 o 150 mg/kg de palbociclib, y otros dos grupos recibirán 100 mg/kg de BVD-523 con 100 o 150 mg/kg de palbociclib.

Análisis de punto final de retraso del crecimiento tumoral (TGD)

Los tumores se miden usando calibradores dos veces por semana y cada animal es sacrificado cuando su tumor alcanza el punto final de volumen tumoral predeterminado de 2000 mm3 o en el último día, lo que ocurra primero. Los animales que salen del estudio debido al punto final del volumen tumoral se documentan como sacrificados por progresión tumoral (TP), con la fecha de eutanasia. El tiempo hasta el punto final (TTE) para el análisis se calcula para cada ratón mediante la siguiente ecuación:

TTE = [logio(volumen del punto final) - b] / m

donde TTE se expresa en días, el volumen del punto final se expresa en mm3, b es la ordenada en el origen, y m es la pendiente de la línea obtenida por regresión lineal de un conjunto de datos de crecimiento tumoral transformado en logaritmo. El conjunto de datos consiste en la primera observación que excede el volumen del punto final usado en el análisis y las tres observaciones consecutivas que preceden inmediatamente a la consecución de este volumen del punto final. El TTE calculado es habitualmente menor que la fecha TP, el día en el que se sacrifica al animal debido al tamaño del tumor. A los animales con tumores que no alcanzan el volumen final se les asigna un valor de TTE igual al último día del estudio. Cualquier animal clasificado como muerto por causas NTR (no relacionadas con el tratamiento) debido a un accidente (NTRa) o debido a una etiología desconocida (NTRu) se excluye de los cálculos de TTE (y de todos los análisis posteriores). A los animales clasificados como muertes TR (relacionadas con el tratamiento) o NTRm (muerte no relacionada con el tratamiento debido a metástasis) se les asigna un valor de TTE igual al día de la muerte.

El resultado del tratamiento se evalúa a partir de TGD, definido como el aumento de la mediana de TTE en un grupo de tratamiento en comparación con el grupo de control:

TGD = T - C,

expresado en días, o como porcentaje de la mediana de TTE del grupo de control:

% de TGD = [(T - C) / C] * 100

donde:

T = mediana de TTE para un grupo de tratamiento, y

C = mediana de TTE para el grupo de control designado.

Criterios para las respuestas de regresión

La eficacia del tratamiento puede determinarse a partir de la incidencia y magnitud de las respuestas de regresión observadas durante el estudio. El tratamiento puede provocar una regresión parcial (PR) o una regresión completa (CR) del tumor en un animal. En una respuesta de PR, el volumen tumoral es del 50 % o menos de su volumen del día 1 durante tres mediciones consecutivas en el transcurso del estudio, e igual o mayor que 13,5 mm3 para una o más de estas tres mediciones. En una respuesta de CR, el volumen tumoral es inferior a 13,5 mm3 durante tres mediciones consecutivas durante el transcurso del estudio. Un animal con una respuesta de CR al finalizar el estudio se clasifica adicionalmente como un superviviente libre de tumores (TFS). Se monitorizan los animales para detectar respuestas de regresión.

Toxicidad

Los animales se pesan diariamente los días 1-5, luego dos veces por semana hasta completar el estudio. Se observan los ratones con frecuencia para detectar signos evidentes de cualquier efecto secundario adverso de TR, y se registran los signos clínicos cuando se observan. La pérdida de PC individual se controla según el protocolo y cualquier animal cuyo peso exceda los límites de pérdida de PC aceptable es sacrificado. La pérdida media de PC del grupo también se controla según el protocolo. La dosificación debe suspenderse en cualquier grupo que exceda los límites de pérdida de PC media aceptable. Si el PC medio se recupera, se reanudará la dosificación en ese grupo, pero con una dosis más baja o con una pauta de dosificación menos frecuente. La toxicidad aceptable para la dosis máxima tolerada (MTD) se define como una pérdida media de PC del grupo de menos del 20 % durante el estudio y no más del 10 % de muertes por TR. Una muerte se clasifica como TR si es atribuible a efectos secundarios del tratamiento evidenciados por signos clínicos y/o necropsia, o también puede clasificarse como TR si se debe a causas desconocidas durante el periodo de dosificación o en el plazo de 14 días desde la última dosis. Una muerte se clasifica como NTR si no hay evidencia de que la muerte esté relacionada con los efectos secundarios del tratamiento. Las muertes por NTR pueden caracterizarse adicionalmente según la causa de muerte. Una muerte se clasifica como NTRa si es resultado de un accidente o error humano. Una muerte se clasifica como NTRm si la necropsia indica que puede ser resultado de la diseminación del tumor por invasión y/o metástasis. Una muerte se clasifica como NTRu si se desconoce la causa de muerte y no hay evidencia disponible de muerte relacionada con efectos secundarios del tratamiento, metástasis, accidente o error humano, aunque no puede excluirse la muerte debido a efectos secundarios del tratamiento.

Análisis estadísticos y gráficos

Se usa Prism (GraphPad) para Windows 3.03 para presentaciones gráficas y análisis estadísticos.

La prueba del rango logarítmico, que evalúa la experiencia de supervivencia general, se usa para analizar la significancia de las diferencias entre los valores de<t>T<e>de dos grupos. El análisis del rango logarítmico incluye los datos de todos los animales de un grupo, excepto aquellos evaluados como muertes NTR. Se realizan análisis estadísticos bilaterales con un nivel de significación P = 0,05. Las pruebas estadísticas no están ajustadas para comparaciones múltiples. Prism resume los resultados de la prueba como no significativo (ns) a P > 0,05, significativo (simbolizado por “*”) a 0,01 < P < 0,05, muy significativo (“**”) a 0,001 < P < 0,01 y extremadamente significativo (“***”) a P < 0,001. Los grupos con regímenes superiores a la MTD no se evalúan estadísticamente. Se construye un diagrama de dispersión para mostrar los valores de TTE para ratones individuales, por grupo. Los volúmenes tumorales medios del grupo se representan gráficamente en función del tiempo. Cuando un animal abandona el estudio debido al tamaño del tumor, el volumen final del tumor registrado para el animal se incluye con los datos utilizados para calcular el volumen medio en puntos de tiempo posteriores. Las barras de error (cuando están presentes) indican un error estándar de la media (EEM). Los gráficos de crecimiento tumoral excluyen los datos de muertes por NTR y se truncan después de que el 50 % de los animales evaluables en un grupo abandonan el estudio o después de la segunda muerte por TR en un grupo, lo que ocurra primero. Los gráficos de Kaplan-Meier muestran el porcentaje de animales de cada grupo que permanecen en el estudio en función del tiempo. El gráfico de Kaplan-Meier y la prueba del rango logarítmico comparten los mismos conjuntos de datos de TTE. Se calculan los cambios porcentuales medios del PC a partir del día 1 para cada grupo para cada día de medición del peso corporal y se representan gráficamente en función del tiempo. Los gráficos de PC excluyen los datos de muertes por NTR y se truncan después de que el 50 % de los animales evaluables de un grupo abandonan el estudio.

Resultados

Se espera que las combinaciones de dinaciclib o palbociclib con BVD-523 sean eficaces contra los tumores derivados de células MM415 y que los resultados sean estadísticamente significativos. También se espera que los efectos secundarios asociados con el tratamiento con el inhibidor de BVD-523/CDK sean mínimos.

Ejemplo 4

Estudios de cultivos celulares de inhibidores de CDK y ERK

Ensayo de proliferación de agente único

Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a las densidades indicadas en la Tabla 4 en RPMI que contenía FBS al 10 % y se dejaron adherir durante la noche antes de agregar el compuesto o el control del vehículo. Los compuestos se prepararon a partir de existencias de DMSO para obtener las concentraciones finales deseadas. La concentración final de DMSO se mantuvo constante en 0,1%. Los compuestos de prueba se incubaron con las células durante 72 h a 37 °C, 5 % de CO<2>en una atmósfera humidificada. Se añadió el reactivo CellTiter-Glo® (Promega, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante y se detectó la luminiscencia usando el lector de placas BMG FLUOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Alemania). Se incubó un conjunto duplicado de placas de ensayo con 10 |ig/ml de tinción Hoechst 33342 (Invitrogen, Grant Island, NY) en medio de crecimiento completo durante 1 h a 37 °C, el 5 % de CO<2>en una atmósfera humidificada. Luego se retiró el medio y se reemplazó con PBS y se detectó la fluorescencia usando un lector de placas BMG FLUOstar Omega (BMG labtech, Ortenberg, Alemania). Se dedujo el valor de fondo promedio de los medios solamente y los datos se analizaron usando una ecuación logística de 4 parámetros en GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Ensayo de proliferación de combinación

Las células se sembraron en placas triplicadas de 96 pocillos a las densidades indicadas en la tabla 4 en medio RPMI que contenía FBS al 10 % y se dejaron adherir durante la noche antes de añadir el compuesto de prueba o el control del vehículo. Las combinaciones se sometieron a prueba usando una matriz de dosis de 10x8. La concentración final de DMSO se mantuvo constante al 0,2 %.

Los compuestos de prueba se incubaron con las células durante 72 h a 37 °C, el 5 % de CO<2>en una atmósfera humidificada. Las células se tiñeron con tinción de Hoechst y se detectó la fluorescencia tal como se describió anteriormente. Se dedujo el valor de fondo promedio de los medios solamente y se analizaron los datos.

Las interacciones de combinación a través de la matriz de dosis se determinaron mediante los modelos de aditividad de Loewe y de independencia de Bliss usando el software de análisis de combinación Chalice™ (Horizon Discovery Group, Cambridge, MA), tal como se describe en el manual del usuario (disponible en chalice.horizondiscovery.com/chalice-portal/documentation/analyzer/home.jsp). La sinergia se determina comparando el nivel de inhibición observado experimentalmente en cada punto de combinación con el valor esperado para la aditividad, que se deriva de las respuestas del agente único a lo largo de los bordes de la matriz. Las interacciones sinérgicas potenciales se identificaron mostrando el exceso de inhibición calculado sobre el previsto como aditivo en toda la matriz de dosis como un mapa de calor, y reportando una “puntuación de sinergia” cuantitativa basándose en el modelo de Loewe. Los datos de agente único derivados de las placas de ensayo de combinación se presentaron como curvas dosis-respuesta generadas en Chalice™.

Tabla 4 - Densidad de siembra de líneas celulares

Este estudio evaluó los efectos de la combinación de los inhibidores de ERK BVD-523 y SCH772984 con dos inhibidores diferentes de CDK4/6 (palbociclib y LEE-011) en un panel de cuatro líneas celulares de cáncer de pulmón, dos mutantes para KRas y dos de tipo natural.

Los efectos de BVD-523, los inhibidores de CDK4/6, otro inhibidor de ERK (SCH772984) y un inhibidor de MEK de referencia (trametinib), como agentes únicos sobre la viabilidad celular se evaluaron después de 72 h usando dos métodos (figura 2). El primer método fue cuantificar los niveles de ATP celular usando CellTiter-Glo® (Promega, Madison, Wl). El segundo método fue cuantificar la cantidad total de ADN en un pocillo de ensayo después de teñir el ADN con la tinción de Hoechst.

Los valores de CI<50>del agente único se muestran en la tabla 5. Las dos líneas celulares que portan una mutación KRas son más sensibles a BVD-523 en relación con las líneas celulares de tipo natural. Esto puede indicar que la presencia de una mutación KRas puede ser un biomarcador predictivo de la sensibilidad a BVD-523 como agente único. El patrón de respuesta al inhibidor de ERK SCH772984 fue ampliamente similar al de BVD-523.

Los resultados del agente único para los inhibidores de CDK4/6 dependieron de la lectura de viabilidad celular usada, y las células parecieron ser marcadamente más sensibles a la inhibición cuando se evaluaron usando la tinción de Hoechst. Esto sugiere que la medición de los niveles de ATP no es un indicador adecuado del número de células viables en respuesta a la inhibición de CDK4/6 y, por tanto, sólo se usó la lectura de la tinción de Hoechst en los ensayos de combinación.

Se evaluaron las interacciones de combinación entre dos compuestos a través de una matriz de concentraciones usando los modelos de aditividad de Loewe y de independencia de Bliss con el software de bioinformática Chalice™ (Horizon Discovery Group, Cambridge, MA). Chalice™ permite identificar posibles interacciones sinérgicas al mostrar el exceso de inhibición calculado sobre el previsto como aditivo en la matriz de dosis como un mapa de calor y al informar una “puntuación de sinergia” cuantitativa basándose en el modelo de Loewe.

Las interacciones de combinación entre BVD-523 y los dos inhibidores de CDK4/6 se muestran en la figura 3 y la figura 4, respectivamente. Las interacciones de combinación entre SCH772984 y los dos inhibidores de CDK4/6 se muestran en la figura 5 y la figura 6, respectivamente. Las interacciones de combinación entre trametinib y los dos inhibidores de CDK4/6 se muestran en la figura 7 y la figura 8, respectivamente.

La visualización de los mapas de calor de “exceso de inhibición” de Loewe sugirió que la combinación de BVD-523 con cualquiera de los dos inhibidores de CDK4/6 fue principalmente aditiva en las células A549 y H226, y aditiva con ventanas de sinergia potencial en H1437 y H2122. Estas ventanas de sinergia parecían más amplias y más fuertes en las células H1437 en relación con las H2122. Se obtuvieron resultados similares con el inhibidor de ERK SCH772984.

La actividad sobre la aditividad de Loewe puede cuantificarse en Chalice™ usando una puntuación de volumen simple, que calcula efectivamente un volumen entre las superficies de respuesta aditiva medidas y de Loewe, y enfatiza el efecto sinérgico general (valores positivos) o antagónico (valores negativos) de la combinación. Las puntuaciones de volumen para las combinaciones de BVD-523 y SCH772984 con cualquiera de los dos inhibidores de CDK4/6 se muestran en la figura 9 y las tablas 6-8 y son coherentes con las conclusiones extraídas de los mapas de calor.

Tabla 6 - Volúmenes de Loewe

Tabla 7 - Volúmenes de Bliss

Tabla 8 - Puntuaciones de sinergia

En resumen, estos resultados sugieren que las interacciones entre BVD-523 y los inhibidores de CDK4/6 son al menos aditivas, y en algunos casos sinérgicas, en líneas celulares de cáncer de pulmón de tipo natural o mutadas para KRas.

Ejemplo 5

Interacciones combinadas entre inhibidores de ERK

Las células de la línea celular de melanoma mutante RAF A375 se cultivaron en DMEM con FBS al 10%y se sembraron en placas triplicadas de 96 pocillos a una densidad inicial de 2000 células por pocillo. Las interacciones de combinación entre los inhibidores de ERK BVD-523 y SCH772984 se analizaron después de 72 horas tal como se describió anteriormente en el ejemplo 4 y la viabilidad se determinó usando el reactivo CellTiter-Glo® (Promega) tal como se describió anteriormente en el ejemplo 4.

La visualización de los mapas de calor de "inhibición excesiva” de Loewe y Bliss sugirió que la combinación de BVD-523 y SCH772984 fue principalmente aditiva con ventanas de sinergia potencial en dosis de intervalo medio (figura 10).

En resumen, estos resultados sugieren que las interacciones entre BVD-523 y SCH772984 son al menos aditivas y, en algunos casos, sinérgicas.

Documentos

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Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   i.Un primer antineoplásico (i), que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un segundo antineoplásico (ii), que es un inhibidor de cinasa dependiente de ciclina (CDK) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos del cáncer en un sujeto, en donde el inhibidor decDkse selecciona del grupo que consiste en palbociclib, LEE-011, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos.
2. 2. Un métodoin vitropara lograr la muerte de células cancerosas que comprende poner en contacto la célula cancerosa con una cantidad eficaz del primer y segundo antineoplásico según la reivindicación 1.
3. 3. Un kit para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto que comprende una cantidad eficaz del primer y segundo antineoplásico según la reivindicación 1, empaquetados junto con instrucciones para su uso.
4. 4. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos de un cáncer en un sujeto, comprendiendo la composición farmacéutica un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad eficaz del primer y segundo antineoplásico según la reivindicación 1, en donde la administración del primer y segundo antineoplásico proporciona un efecto sinérgico en comparación con la administración de cualquier antineoplásico solo.
5. 5. El primer y segundo antineoplásico para su uso según la reivindicación 1, el métodoin vitrosegún la reivindicación 2, el kit para su uso según la reivindicación 3, o la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 4, en donde

   (i) el sujeto es un mamífero, o en donde la célula cancerosa se ha obtenido de un sujeto, que es un mamífero; y en donde el mamífero puede seleccionarse del grupo que consiste en seres humanos, primates, animales de granja, y animales domésticos; y/o

   (ii) el sujeto con cáncer, o el sujeto del que se ha obtenido la célula cancerosa, tiene una mutación somática de NRAS.
6. 6. El primer y segundo antineoplásico para su uso según la reivindicación 1o 5, el métodoin vitrosegún la reivindicación 2 o 5, el kit para su uso según la reivindicación 3 o 5, o la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 4 o 5, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de piel tal como melanoma, neuroblastoma, leucemia, linfoma, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer testicular, y cáncer de tiroides.
7. 7. El primer y segundo antineoplásico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 5 y 6, el métodoin vitrosegún una cualquiera de las reivindicaciones 2, 5 y 6, el kit para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3, 5 y 6, o la composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en donde al menos un agente terapéutico adicional va a administrarse al sujeto o a la célula cancerosa, o en donde el kit comprende al menos un agente terapéutico adicional; en donde el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo o fragmento del mismo, un agente citotóxico, un fármaco, una toxina, un radionúclido, un inmunomodulador, un agente terapéutico fotoactivo, un agente radiosensibilizante, una hormona, un agente antiangiogénico, y combinaciones de los mismos; en donde el agente terapéutico adicional puede ser un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt, tal como un inhibidor de la ruta de PI3K/Akt que se selecciona del grupo que consiste en A-674563 (n.° de CAS 552325 73-2), AGL 2263, AMG-319 (Amgen, Thousand Oaks,cA), AS-041164 (5-benzo[1,3]dioxol-5-ilmetilentiazolidin-2,4-diona), AS-604850 (5-(2,2-difluoro-benzo[1,3]dioxol-5-ilmetilen)-tiazolidin-2,4-diona), AS-605240 (5-quinoxilin-6-metilen-1,3-tiazolidin-2,4-diona), At7867 (n.° de CAS 857531-00-1), serie de benzimidazol, Genentech (Roche Holdings Inc., South San Francisco, CA), BML-257 (n.° de CAS 32387-96 5), CAL-120 (Gilead Sciences, Foster City, CA), CAL-129 (Gilead Sciences), CAL-130 (Gilead Sciences), CAL-253 (Gilead Sciences), CAL-263 (Gilead Sciences), n.° de CAS 612847-09-3, n.° de CAS 681281-88-9, n.° de CAS 75747-14-7, n.° de CAS 925681-41-0, n.° de CAS 98510-80-6, CCT128930 (n.° de CAS 885499-61-6), CH5132799 (n.° de CAS 1007207-67-1), CHR-4432 (Chroma Therapeutics, Ltd., Abingdon, RU), FPA 124 (n.° de CAS 902779-59-3), GS-1101 (CAL-101) (Gilead Sciences), GSK 690693 (n.° de CAS 937174-76-0), H-89 (n.° de CAS 127243-85-0), Honokiol, IC87114 (Gilead Science), IPI-145 (Intellikine Inc.), KAR-4139 (Karus Therapeutics, Chilworth, RU), KAR-4141 (Karus Therapeutics), KIN-1 (Karus Therapeutics), KT 5720 (n.° de CAS 108068-98-0), miltefosina, diclorhidrato de MK-2206 (n.° de CAS 1032350-13-2), ML-9 (n.° de CAS 105637-50-1), clorhidrato de naltrindol, OXY-111A (NormOxys Inc., Brighton, MA), perifosina, PHT-427 (n.° de CAS 1191951-57-1), inhibidor de PI3 cinasa delta, Merck KGaA (Merck & Co., Whitehouse Station, NJ), inhibidores de PI3 cinasa delta, Genentech (Roche Holdings Inc.), inhibidores de PI3 cinasa delta, Incozen (Incozen Therapeutics, Pvt. Ltd., Hydrabad, India), inhibidores de PI3 cinasa delta-2, Incozen (Incozen Therapeutics), inhibidor de PI3 cinasa, Roche-4 (Roche Holdings Inc.), inhibidores de PI3 cinasa, Roche (Roche Holdings Inc.), inhibidores de PI3 cinasa, Roche-5 (Roche Holdings Inc.), inhibidores de PI3-alfa/delta, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd., South San Francisco, CA), inhibidores de PI3-delta, Cellzome (Cellzome AG, Heidelberg, Alemania), inhibidores de PI3-delta, Intellikine (Intellikine Inc., La Jolla, CA), inhibidores de PI3-delta, Pathway Therapeutics-1 (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidores de PI3-delta, Pathway Therapeutics-2 (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidores de P13-delta/gamma, Cellzome (Cellzome AG), inhibidores de PI3-delta/gamma, Intellikine (Intellikine Inc.), inhibidores de P13-delta/gamma, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidor de PI3-gamma Evotec (Evotec), inhibidor de PI3-gamma, Cellzome (Cellzome AG), inhibidores de PI3-gamma, Pathway Therapeutics (Pathway Therapeutics Ltd.), inhibidores de PI3K delta/gamma, Intellikine-1 (Intellikine Inc.), pictilisib (Roche Holdings Inc.), PIK-90 (n.° de CAS 677338-12-4), SC-103980 (Pfizer, Nueva York, NY), SF-1126 (Semafore Pharmaceuticals, Indianápolis, IN), SH-5, SH-6, tetrahidro curcumina, TG100-115 (Targegen Inc., San Diego, CA), triciribina, X-339 (Xcovery, West Palm Beach, FL), XL-499 (Evotech, Hamburgo, Alemania), sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos.
8. 8. El primer y segundo antineoplásico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 5-7, el métodoin vitrosegún una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 5-7, o el kit para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3 y 5-7, en donde la administración del primer y segundo antineoplásico proporciona un efecto sinérgico en comparación con la administración de cualquier antineoplásico solo; o en donde la puesta en contacto de la célula cancerosa con el primer y segundo antineoplásico proporciona un efecto sinérgico en comparación con la puesta en contacto de la célula cancerosa con cualquier antineoplásico solo.
9. 9. El primer y segundo antineoplásico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 5-8, en donde el segundo antineoplásico es palbociclib o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y en donde

   (i) el primer antineoplásico, que es BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y/o (ii) el segundo antineoplásico, que es palbociclib o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo va a administrarse en forma de composición farmacéutica.
10. 10. La composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en donde (i) la composición farmacéutica está en una forma de dosificación unitaria que comprende ambos antineoplásicos; o

    (ii) el primer antineoplásico está en una primera forma de dosificación unitaria y el segundo antineoplásico está en una segunda forma de dosificación unitaria, separada de la primera.
11. 11. La composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en donde (i) el primer y segundo antineoplásico van a administrarse conjuntamente al sujeto; o

    (ii) el primer y segundo antineoplásico van a administrarse al sujeto en serie; en donde el primer antineoplásico puede administrarse al sujeto antes que el segundo antineoplásico; o el segundo antineoplásico puede administrarse al sujeto antes que el primer antineoplásico.
12. 12. Una composición que comprende BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en combinación con un inhibidor de CDK o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos del cáncer en un sujeto, en donde el inhibidor de CDK se selecciona del grupo que consiste en palbociclib, LEE-011, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos.
13. 13. Una composición que comprende un inhibidor de CDK o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en combinación con BVD-523 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento o la mejora de los efectos del cáncer en un sujeto, en donde el inhibidor de CDK se selecciona del grupo que consiste en palbociclib, LEE-011, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y combinaciones de los mismos.