ES3033716T3 - Amplification of target sequences - Google Patents

Abstract

La presente divulgación se refiere a métodos, kits y productos para la amplificación de secuencias de ADN diana a partir de ADN genómico. Ciertas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un método para amplificar una secuencia de ADN diana a partir de ADN genómico. El método comprende la amplificación del ADN genómico con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados en presencia de uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana, amplificando así la secuencia de ADN diana. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Amplificación de secuencias diana

SECTOR

La presente invención se refiere a procedimientos, kits y productos para amplificar secuencias de ADN diana a partir de ADN genómico.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La capacidad de amplificar secuencias diana específicas presentes en el ADN genómico se utiliza en diversos sectores, tales como con fines de investigación, tecnología de ADN recombinante, cribado genético y análisis forenses.

Si bien la amplificación específica de diana se utiliza ampliamente, conlleva una serie de desventajas, en particular, en circunstancias en las que la cantidad de material genómico de partida es limitada. Por ejemplo, la amplificación específica de diana a menudo conduce a un agotamiento rápido del material genómico limitado y normalmente solo permite el análisis de secuencias amplificadas específicamente. Como consecuencia, a menudo resulta difícil obtener otra información genética importante a partir del resto del ADN genómico.

La amplificación del genoma completo (WGA,whole genome amplification)es un proceso que se desarrolló, en parte, para abordar el problema de tener ADN genómico limitado para análisis. La amplificación del genoma completo permite la amplificación de un genoma entero utilizando solo cantidades muy pequeñas de material de partida y, como tal, puede proporcionar la inmortalización de una muestra limitada para que se puedan realizar otros análisis deseados sobre la muestra.

Se han desarrollado diversos procedimientos para la amplificación del genoma completo, entre los que se incluyen la PCR de oligonucleótidos degenerados (DOP-PCR,degenerated oligonucleotide primed PCR),la preamplificación por extensión de cebadores (PEP,primer extension preamplification)y la amplificación por desplazamiento múltiple (MDA,múltiple displacement amplification).La<d>O<p>-PCR y la PEP se basan en técnicas de PCR estándar, mientras que la MDA es una técnica de amplificación sin PCR que utiliza la capacidad de desplazamiento de cadena de algunas polimerasas. A continuación, puede analizarse el ADN genómico amplificado mediante la amplificación del genoma completo, por ejemplo, mediante técnicas, tales como el análisis de hibridación genómica comparativa (CGH,comparative genomic hybridizat ion),el análisis de SNP y la secuenciación.

La Patente US9249459 da a conocer un procedimiento para analizar el ADN de una célula individual, comprendiendo dicho procedimiento: (a) llevar a cabo la WGA del genoma utilizando cebadores degenerados (DOP-PCR) (b) preamplificar el genoma amplificado utilizando una pluralidad de pares de cebadores específicos de diana para producir una mezcla de reacción de preamplificación que comprende una pluralidad de amplicones específicos para una pluralidad de ácidos nucleicos diana.

Sin embargo, aunque la amplificación del genoma completo proporciona la capacidad de amplificar ADN genómico para su análisis, la amplificación de secuencias diana específicas a partir del ADN genómico amplificado conlleva una serie de desventajas, tales como la pérdida de uno o más alelos y/o problemas de sesgo introducidos durante el proceso de WGA, la posibilidad de una cobertura de secuencia desigual, la sobrerepresentación o subrepresentación de regiones específicas, la reproducibilidad y la introducción de errores en las secuencias diana específicas.

Por consiguiente, existe la necesidad de proporcionar procedimientos y/o productos mejorados para amplificar secuencias diana específicas a partir del ADN amplificado de genoma completo.

CARACTERÍSTICAS

La presente invención se refiere a procedimientos y kits para amplificar secuencias de ADN diana a partir de ADN genómico.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento para amplificar una secuencia de ADN diana a partir de ADN genómico, comprendiendo el procedimiento amplificar el ADN genómico con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados en presencia de uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana, amplificando, de este modo, la secuencia de ADN diana.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento para amplificar una secuencia de ADN diana a partir de ADN genómico, comprendiendo el procedimiento amplificar la secuencia de ADN diana con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana durante, como mínimo, uno o más ciclos de amplificación de ADN genómico con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados, amplificando, de este modo, la secuencia de ADN diana.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento para amplificar una secuencia de ADN diana a partir de ADN genómico, comprendiendo el procedimiento:

amplificar el ADN genómico con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados; y durante, como mínimo, uno o más ciclos de la amplificación del ADN genómico, también amplificar la secuencia de ADN diana con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana,

amplificando, de este modo, la secuencia de ADN diana.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento para amplificar una secuencia de ADN diana a partir de ADN genómico, comprendiendo el procedimiento:

llevar a cabo la amplificación del genoma completo del ADN genómico con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados; y

durante, como mínimo, una parte de la amplificación del ADN genómico, amplificar también la secuencia de ADN diana con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana,

amplificando, de este modo, la secuencia de ADN diana.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer una secuencia de ADN diana amplificada mediante un procedimiento, tal como se describe en el presente documento.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento para calcular el contenido de nucleótidos de una secuencia de ADN diana amplificada a partir de ADN genómico mediante un procedimiento, tal como se describe en el presente documento.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento para calcular el contenido de nucleótidos de una secuencia de ADN diana en ADN genómico, comprendiendo el procedimiento: amplificar el ADN genómico con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados en presencia de uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

calcular el contenido de nucleótidos de la secuencia de ADN diana amplificada con el fin de calcular el contenido de nucleótidos de la secuencia de ADN diana.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento para calcular el contenido de nucleótidos de una secuencia de ADN diana en ADN genómico, comprendiendo el procedimiento amplificar la secuencia de ADN diana con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana durante, como mínimo, uno o más ciclos de amplificación de ADN genómico con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados para producir una secuencia de ADN diana amplificada, y calcular el contenido de nucleótidos de la secuencia de ADN diana amplificada.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento para calcular el contenido de nucleótidos de una secuencia de ADN diana en ADN genómico, comprendiendo el procedimiento: amplificar el ADN genómico con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados; y

durante, como mínimo, uno o más ciclos de la amplificación del ADN genómico, amplificar también la secuencia de ADN diana con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

calcular el contenido de nucleótidos de la secuencia de ADN diana amplificada con el fin de calcular el contenido de nucleótidos de la secuencia de ADN diana.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento para calcular el contenido de nucleótidos de una secuencia de ADN diana en ADN genómico, comprendiendo el procedimiento: llevar a cabo la amplificación del genoma completo del ADN genómico con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados;

durante, como mínimo, una parte de la amplificación del genoma completo, amplificar también la secuencia de ADN diana con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

calcular el contenido de nucleótidos de la secuencia de ADN diana amplificada con el fin de calcular el contenido de nucleótidos de la secuencia de ADN diana.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento para determinar la secuencia de nucleótidos de una secuencia de ADN diana en ADN genómico, comprendiendo el procedimiento: amplificar el ADN genómico con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados en presencia de uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

determinar la secuencia de nucleótidos de la secuencia de ADN diana amplificada,

determinando, de este modo, la secuencia de nucleótidos de la secuencia de ADN diana.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado genético preimplantacional de un embrión, comprendiendo el procedimiento:

amplificar el ADN genómico del embrión con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados en presencia de uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para cribar el embrión.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado genético preimplantacional de un embrión, comprendiendo el procedimiento amplificar una secuencia de ADN diana del embrión con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana durante, como mínimo, uno o más ciclos de amplificación de ADN genómico del embrión con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados para producir una secuencia de ADN diana amplificada, y evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para cribar el embrión.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado genético preimplantacional de un embrión, comprendiendo el procedimiento:

amplificar el ADN genómico del embrión con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados; durante, como mínimo, uno o más ciclos de la amplificación del ADN genómico, amplificar también una secuencia de ADN diana del embrión con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para cribar el embrión.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado genético preimplantacional de un embrión, comprendiendo el procedimiento:

llevar a cabo la amplificación del genoma completo del ADN genómico del embrión con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados;

durante, como mínimo, una parte de la amplificación del genoma completo, amplificar también una secuencia de ADN diana del embrión con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para cribar el embrión.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado genético preimplantacional de un ovocito, comprendiendo el procedimiento:

amplificar el ADN genómico de un ovocito o un cuerpo polar del mismo con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados en presencia de uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para cribar el ovocito.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado genético preimplantacional de un ovocito, comprendiendo el procedimiento amplificar una secuencia de ADN diana del ovocito o de un cuerpo polar del mismo con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana durante, como mínimo, uno o más ciclos de amplificación de ADN genómico del ovocito o del cuerpo polar con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados para producir una secuencia de ADN diana amplificada, y evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para cribar el ovocito.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado genético preimplantacional de un ovocito, comprendiendo el procedimiento:

amplificar el ADN genómico del ovocito o de un cuerpo polar del mismo con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados;

durante, como mínimo, uno o más ciclos de la amplificación del ADN genómico, amplificar también una secuencia de ADN diana del ovocito o cuerpo polar con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para cribar el ovocito.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado genético preimplantacional de un ovocito, comprendiendo el procedimiento:

llevar a cabo la amplificación del genoma completo del ADN genómico del ovocito o de un cuerpo polar del mismo con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados;

durante, como mínimo, una parte de la amplificación del genoma completo, amplificar también una secuencia de ADN diana del ovocito o cuerpo polar con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para cribar el ovocito.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado de esperma, comprendiendo el procedimiento:

amplificar el ADN genómico de uno o más espermas con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados en presencia de uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para cribar el esperma.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado de esperma, comprendiendo el procedimiento amplificar una secuencia de ADN diana de uno o más espermas con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana durante, como mínimo, uno o más ciclos de amplificación de ADN genómico del uno o más espermas con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados para producir una secuencia de ADN diana amplificada, y evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para cribar el esperma.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado de esperma, comprendiendo el procedimiento:

amplificar el ADN genómico de uno o más espermas con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados;

durante, como mínimo, uno o más ciclos de amplificación del ADN genómico, amplificar también una secuencia de ADN diana del uno o más espermas con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para cribar el esperma.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado de esperma, comprendiendo el procedimiento:

llevar a cabo la amplificación del genoma completo del ADN genómico de uno o más espermas con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados;

durante, como mínimo, una parte de la amplificación del genoma completo, amplificar también una secuencia de ADN diana del uno o más espermas con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para cribar el esperma.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado prenatal de un feto, comprendiendo el procedimiento:

amplificar el ADN genómico del feto con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados en presencia de uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para cribar el feto.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado prenatal de un feto, comprendiendo el procedimiento amplificar una secuencia de ADN diana del feto con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana durante, como mínimo, uno o más ciclos de amplificación de ADN genómico del feto con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados para producir una secuencia de ADN diana amplificada, y evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para cribar al feto.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado prenatal de un feto, comprendiendo el procedimiento:

amplificar el ADN genómico del feto con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados; durante, como mínimo, uno o más ciclos de la amplificación del ADN genómico, amplificar también una secuencia de ADN diana del feto con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para cribar al feto.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado prenatal de un feto, comprendiendo el procedimiento:

llevar a cabo la amplificación del genoma completo del ADN genómico de uno o más espermas con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados;

durante, como mínimo, una parte de la amplificación del genoma completo, amplificar también una secuencia de ADN diana del feto con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para cribar del feto.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un kit para realizar un procedimiento, tal como se describe en el presente documento.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer una utilización de una secuencia de ADN diana amplificada, tal como se describe en el presente documento, para el cribado genético preimplantacional, el diagnóstico genético preimplantacional, el cribado prenatal, el cribado de una enfermedad, el cribado de un cáncer, el cribado de un marcador genético, el cribado de un polimorfismo, una mutación, una deleción, una inserción, una translocación, una expansión, una inversión, un estado de metilación y/o un cambio epigenético y/o un cribado forense.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un producto combinado, el producto comprende los siguientes componentes:

(i) uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados para la amplificación del genoma completo;

(ii) uno o más cebadores para amplificar una secuencia de ADN diana; y

(iii) uno o más reactivos y/o instrucciones para amplificar la secuencia de ADN diana durante la amplificación del genoma completo.

En el presente documento se describen otras realizaciones.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS

Algunas realizaciones se ilustran mediante las siguientes figuras. Se debe entender que la siguiente descripción tiene el propósito de describir realizaciones particulares únicamente y no pretende ser limitante con respecto a la descripción.

La figura 1 muestra los productos de amplificación de células individuales después de la amplificación del genoma completo y la selección de genes. Los carriles 2-5 muestran productos de células individuales como resultado de la amplificación del genoma completo y la selección de genes con una concentración final de cebador de 0,25 uM. La célula del carril 5 no tuvo amplificación. Los carriles 7-10 muestran productos de células individuales como resultado de la amplificación del genoma completo y la selección de genes con una concentración final de cebador de 0,1 uM. Se observa una amplificación más débil en las células amplificadas con selección de genes en comparación con las células de control (carriles 12-15).

La figura 2 muestra productos de amplificación de células individuales y 30 pg de ADNg después de la amplificación del genoma completo. Los carriles 2-9 muestran una amplificación más débil debido a la presencia de cebadores específicos de gen con una concentración final de 0,5 uM en comparación con las muestras de control en los carriles 11-18.

La figura 3 muestra el electroforetograma de los amplicones generados en la segunda ronda de PCR después de que los productos de amplificación del genoma completo y de células individuales dirigida a gen combinadas se sembraran en dos PCR específicas de gen. El gel de PCR de D4S43 muestra una amplificación enriquecida del marcador de diana D4S43 debida a la adición de 0,25 uM de cebadores específicos de gen (carriles 2-4), en comparación con el control (carriles 9-12). De forma similar, la PCR del cromosoma Y muestra una amplificación enriquecida del gen diana debido a la adición de cebadores específicos de gen a concentraciones finales de 0,25 uM y 0,1 uM (carriles 1-3 y 4-7, respectivamente) en comparación con el control (carriles 8-11). Las muestras se sometieron a electroforesis con el patrón de peso molecular DMW-100M (Geneworks).

La figura 4 muestra el electroforetograma de los amplicones generados en la segunda ronda de PCR después de que se sembraran los productos de amplificación del genoma completo y de células individuales dirigida a gen combinadas en dos PCR específicas de gen. El gel de PCR de D4S43 muestra una amplificación enriquecida del marcador de diana D4S43 debido a la adición de 0,5 uM de cebadores específicos de gen (carriles 2-5) en comparación con el control (carriles 6-9). De forma similar, la PCR del cromosoma Y muestra una amplificación enriquecida del gen diana debido a la adición de cebadores específicos de gen a una concentración final de 0,5 uM (carriles 1 a 4) en comparación con el control (carriles 5-8). Las muestras se sometieron a electroforesis con el patrón de peso molecular DMW-100M (Geneworks). La figura 5 muestra la amplitud de cobertura de HBB después de la amplificación del genoma completo y la amplificación dirigida a gen combinadas, en comparación con la amplificación del genoma completo únicamente utilizando secuenciación de próxima generación. A continuación, se sembraron los productos de amplificación del genoma completo y de amplificación dirigida a gen combinadas en dos PCR específicas de gen. Los amplicones de la segunda ronda de PCR se agruparon para generar una dilución final de 1:20 con el ADN amplificado del genoma completo con amplificación dirigida a gen. Se secuenciaron los productos de PCR de amplificación del genoma completo (WGA) única, los productos de amplificación del genoma completo y de amplificación dirigida a gen combinadas (WGA TSE) y el grupo diluido 1:20. El gráfico muestra que se consiguió una cobertura del 100 % de ambas secuencias diana de HBB (exón 1 y 2 y exón 3) cuando los productos de la dilución 1:20 de la segunda ronda de PCR de HBB se agruparon con las muestras amplificadas del genoma completo con amplificación dirigida a gen combinadas. Se representaron gráficamente los valores medios.

La figura 6 muestra la profundidad de cobertura para los exones 1 y 2 y el exón 3 de HBB después de la amplificación del genoma completo y la amplificación dirigida a gen combinadas con agrupación de producto de PCR de HBB adicional en comparación con la amplificación del genoma completo y la amplificación dirigida a gen utilizando secuenciación de próxima generación. Después de la amplificación del genoma completo y la amplificación dirigida a gen combinadas se sembraron los productos en dos PCR específicas de HBB. Los amplicones de la segunda ronda de PCR de HBB se agruparon para generar una dilución final de 1:20 con el ADN amplificado del genoma completo con amplificación dirigida a gen. Se secuenciaron los productos de amplificación del genoma completo y amplificación dirigida a gen combinadas (WGA TSE) y el ADN agrupado diluido 1:20. Se consiguió una profundidad de cobertura media de la secuencia de HBB > 60x cuando se secuenció el ADN agrupado diluido 1:20.

La figura 7 muestra la amplitud de cobertura del gen diana; HLA después de la amplificación del genoma completo y la amplificación dirigida a gen combinadas, en comparación con la amplificación del genoma completo sola utilizando secuenciación de próxima generación. Después de la amplificación del genoma completo y la amplificación dirigida a gen combinadas, los productos se sembraron en una PCR específica de HLA. El amplicón de la segunda ronda de PCR de HLA se agrupó para generar una dilución final de 1:20 y 1:10 con el ADN amplificado del genoma completo con amplificación dirigida a gen. Se secuenciaron los productos de PCR de amplificación del genoma completo (WGA) sola, los productos de amplificación del genoma completo y amplificación dirigida a gen combinadas (WGA TSE), el ADN agrupado diluido 1:20 y 1:10 y el amplicón de la segunda ronda de PCR de HLA (amplicón). El gráfico muestra que se consiguió una amplitud de cobertura del 100 % de HLA cuando la dilución 1:20 y 1:10 del producto de la segunda ronda de PCR de HLA se volvió a agrupar con las muestras amplificadas del genoma completo con amplificación dirigida a gen combinadas y el producto de PCR de HLA solo. Se representaron gráficamente los valores medios.

La figura 8 muestra la profundidad de cobertura de HLA después de la amplificación del genoma completo y la amplificación dirigida a gen combinadas utilizando secuenciación de próxima generación. Después de la amplificación del genoma completo y la amplificación dirigida a gen combinadas, los productos se sembraron en una PCR específica de HLA. El amplicón de la segunda ronda de PCR de HLA se agrupó para generar una dilución final de 1:20 y 1:10 con el ADN amplificado del genoma completo con amplificación dirigida a gen. Se secuenciaron los productos de amplificación del genoma completo y amplificación dirigida a gen combinadas (WGA TSE), el ADN agrupado diluido 1:20 y 1:10 y el amplicón de la segunda ronda de PCR de HLA (amplicón). Se consiguió una profundidad de cobertura media de HLA > 60x cuando se secuenciaron el ADN agrupado diluido 1:20 y 1:10 y el amplicón de la segunda ronda de PCR de HLA.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente invención se refiere a procedimientos, kits y productos para amplificar secuencias de ADN diana a partir de ADN genómico.

La presente invención se basa en la determinación de que es posible amplificar secuencias de ADN diana específicas durante la amplificación del genoma completo.

Algunas realizaciones de la presente invención están dirigidas a procedimientos y productos que tienen una o más combinaciones de ventajas. Por ejemplo, algunas de las ventajas de algunas de las realizaciones que se dan a conocer en el presente documento incluyen una o más de las siguientes: una reducción de la posibilidad de pérdida de alelos cuando se amplifica una secuencia de ADN diana a partir de ADN amplificado del genoma completo; capacidad mejorada para analizar una secuencia de ADN diana amplificada a partir de ADN amplificado del genoma completo; reducción del sesgo asociado con la amplificación de una secuencia de ADN diana amplificada a partir de ADN amplificado del genoma completo; reducción del número de ciclos de PCR para amplificar una secuencia de ADN diana a partir de ADN amplificado del genoma completo; una mejora en el tiempo para amplificar una secuencia de ADN diana específica a partir de ADN amplificado del genoma completo; utilización reducida de consumibles y/o recursos humanos; costes reducidos; y/o proporcionar una alternativa comercial.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento para amplificar una secuencia de ADN diana a partir de ADN genómico.

El término “amplificar”, o variantes, tales como “amplificación” y “amplificado”, se refiere al proceso de copiar un ácido nucleico para producir copias adicionales de todo o parte del ácido nucleico. Por ejemplo, la amplificación de un ácido nucleico se puede conseguir enzimáticamente utilizando una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), un procedimiento isotérmico, tal como la amplificación por desplazamiento múltiple utilizando una polimerasa adecuada o la amplificación por círculo rodante. Se contemplan otros tipos de procedimientos de amplificación. En el presente documento se describen procedimientos para llevar a cabo la amplificación.

El término “ADN genómico” se refiere a todo o parte del ADN derivado de un organismo e incluye ADN cromosómico, ADN celular, ADN mitocondrial y ADN vírico. El ADN genómico se puede, por ejemplo, aislar, procesar o extraer de ADN celular procariota o eucariota, ADN vírico, ADN de células somáticas, ADN de células germinales, ADN de gametos, ADN de corpúsculos polares, ADN de células embrionarias o ADN fetal. El término incluye ADN derivado de ADN exónico, ADN intrónico, ADN no codificante, ADN codificante de ARN, ADN no repetitivo, ADN repetitivo, ADN de transposón, ADN extracromosómico, ADN de orgánulos, ADN mitocondrial, A<d>N de cloroplastos, ADN vírico, ADN plasmídico, ADN nuclear, ADN extranuclear, ADN citoplasmático, ADNc y ADN libre de células. Se contemplan otros tipos de ADN.

El término “secuencia de ADN diana” se refiere a una región o parte específica del ADN que se va a amplificar. Por ejemplo, la secuencia de ADN diana puede ser todo o parte de un gen, un locus, una región codificante, uno o más exones y/o uno o más intrones, un SNP, una región que se evaluará para una mutación, una región alélica o todo o parte de un ADN que codifica un ARN. Se contemplan otros tipos de secuencias de ADN diana.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento para amplificar una secuencia de ADN diana a partir de ADN genómico, comprendiendo el procedimiento amplificar el ADN genómico con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados en presencia de uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana, amplificando, de este modo, la secuencia de ADN diana.

En algunas realizaciones, la amplificación comprende una reacción en cadena de la polimerasa. Los procedimientos para utilizar una reacción en cadena de la polimerasa son tal como se describen en el presente documento. Los procedimientos para llevar a cabo la amplificación se describen, por ejemplo, en Fakruddinet al.(2013)J Pharm Bioallied Sci5(4): 245-252.

En algunas realizaciones, la amplificación comprende una reacción de amplificación isotérmica. En la técnica se conocen procedimientos para llevar a cabo la amplificación isotérmica, tales como la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP,loop-mediated isotermal amplification),la amplificación por desplazamiento de cadena (SDA,stranddisplacement amplification),la amplificación dependiente de helicasa (HDA,helicase-dependent amplification)y la reacción de amplificación con enzima de mellado (NEAR,nicking enzyme amplification reaction).En algunas realizaciones, la amplificación comprende una reacción que utiliza amplificación por desplazamiento múltiple. En la técnica se conocen procedimientos para llevar a cabo la amplificación por desplazamiento múltiple WGA, por ejemplo, tal como se describe en Deanet al.(2002)Proc Nati. Acad. Sci Ee. UU.99: 5261. En algunas realizaciones, la amplificación comprende una reacción que utiliza amplificación por círculo rodante. Se contemplan otros tipos de amplificación. Los procedimientos de amplificación se describen, por ejemplo, en Walkeret al.(1992)Nucleic Acids Res.

20:1691-1696, Walkeret al.(1993)PCR Methods Appl.3:1-6, Notomiet al.(2000)Nucleic Acids Res.28:e63, Tomita Net al.(2008)Nat. Protoc.3:877-882, Lizardiet al.(1998)Nat. Genet.19:225-232, Blancoet al.(1989)J. Biol. Chem.264:8935-8940, y Deanet al.(2001)Genome Res.11:1095-1099, y Fakruddinet al.(2013)J Pharm Bioallied Sci5£4): 245-252.

En algunas realizaciones, la secuencia de ADN diana comprende todo o parte de un gen, un locus, una región codificante, uno o más exones y/o uno o más intrones, una región para evaluar una mutación, una región alélica, una región que tiene un SNP u otro tipo de polimorfismo, o la totalidad o parte de un ADN que codifica un ARN, una región para evaluar la presencia o ausencia de una mutación, un ADN marcador y/o una región utilizada para identificar la presencia o el tipo de ADN. Se contemplan otros tipos de secuencias de ADN diana.

En algunas realizaciones, el ADN genómico comprende ADN de una o más células embrionarias, ADN de un ovocito o un cuerpo polar del mismo, ADN de esperma, ADN de una o más células germinales, ADN de una o más células somáticas, ADN de una o más células humanas o animales, ADN de una o más células vegetales, ADN de una o más células de un microorganismo, ADN de una o más células para el cribado de una enfermedad, ADN de una o más células cancerosas, ADN para pruebas forenses, ADN mitocondrial, ADN extracromosómico, ADN libre de células, ADN de una muestra que comprende una o más células, ADN de una muestra que comprende ADN libre de células, ADN de un lisado de células, ADN de una biopsia, ADN de una muestra de tejido, ADN de una muestra de células, ADN de un fluido corporal, ADN de una muestra de sangre, ADN fetal, ADN libre de células, ADN de líquido amniótico, ADN de una muestra fijada con formalina, ADN de una muestra incluida en parafina y ADN de un hisopo. Se contemplan otros tipos de ADN. En la técnica se conocen procedimientos para obtener o utilizar ADN en una reacción de amplificación.

En algunas realizaciones, el ADN genómico comprende ADN de una o más células lisadas. En algunas realizaciones, el ADN genómico comprende ADN no purificado. En algunas realizaciones, el ADN genómico comprende ADN extraído. En algunas realizaciones, el ADN genómico comprende ADN procesado. En algunas realizaciones, el ADN genómico comprende ADN purificado o parcialmente purificado. En algunas realizaciones, el ADN genómico comprende a Dn libre de células.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende una cantidad de ADN genómico a amplificar inferior a 0,5 pg, inferior a 1 pg, inferior a 2,5 pg, inferior a 5 pg, inferior a 10 pg, inferior a 25 pg, inferior a 50 pg, inferior a 100 pg, inferior a 250 pg, inferior a 500 pg, inferior a 1 ng, inferior a 2,5 ng, inferior a 5 ng o inferior a 10 ng. Se contemplan otras cantidades.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende una cantidad de ADN genómico a amplificar de, como mínimo, 0,5 pg, como mínimo, 1 pg, como mínimo, 2,5 pg, como mínimo, 5 pg, como mínimo, 10 pg, como mínimo, 25 pg, como mínimo, 50 pg, como mínimo, 100 pg, como mínimo, 250 pg, como mínimo, 500 pg, como mínimo, 1 ng, como mínimo, 2,5 ng, como mínimo, 5 ng o, como mínimo, 10 ng. Se contemplan otras cantidades.

En determinadas realizaciones, el procedimiento comprende una cantidad de ADN genómico a amplificar de 0,5 pg a 10 ng, de 1 pg a 10 ng, de 2,5 pg a 10 ng, de 5 pg a 10 ng, de 10 pg a 10 ng, de 25 pg a 10 ng, de 50 pg a 10 ng, de 100 pg a 10 ng, de 250 pg a 10 ng, de 500 pg a 10 ng, de 1 ng a 10 ng, de 2,5 ng a 10 ng, de 5 ng a 10 ng, de 0,5 pg a 5 ng, de 1 pg a 5 ng, de 2,5 pg a 5 ng, de 5 pg a 5 ng, de 10 pg a 5 ng, de 25 pg a 5 ng, de 50 pg a 5 ng, de 100 pg a 5 ng, de 250 pg a 5 ng, de 500 pg a 5 ng, de 1 ng a 5 ng, de 2,5 ng a 5 ng, de 0,5 pg a 2,5 ng, de 1 pg a 2,5 ng, de 2,5 pg a 2,5 ng, de 5 pg a 2,5 ng, de 10 pg a 2,5 ng, de 25 pg a 2.5 ng, de 50 pg a 2,5 ng, de 100 pg a 2,5 ng, de 250 pg a 2,5 ng, de 500 pg a 2,5 ng, de 1 ng a 2,5 ng, de 0,5 pg a 1 ng, de 1 pg a 1 ng, de 2,5 pg a 1 ng, de 5 pg a 1 ng, de 10 pg a 1 ng, de 25 pg a 1 ng, de 50 pg a 1 ng, de 100 pg a 1 ng, de 250 pg a 1 ng, de 500 pg a 1 ng, de 0,5 pg a 500 pg, de 1 pg a 500 pg, de 2,5 pg a 500 pg, de 5 pg a 500 pg, de 10 pg a 500 pg, de 25 pg a 500 pg, de 50 pg a 500 pg, de 100 pg a 500 pg, de 250 pg a 500 pg, de 0,5 pg a 250 pg, de 1 pg a 250 pg, de 2,5 pg a 250 pg, de 5 pg a 250 pg, de 10 pg a 250 pg, de 25 pg a 250 pg, de 50 pg a 250 pg, de 100 pg a 250 pg, de 0,5 pg a 100 pg, de 1 pg a 100 pg, de 2,5 pg a 100 pg, de 5 pg a 100 pg, de 10 pg a 100 pg, de 25 pg a 100 pg, de 50 pg a 100 pg, de 0,5 pg a 50 pg, de 1 pg a 50 pg, de 2,5 pg a 50 pg, de 5 pg a 50 pg, de 10 pg a 50 pg, de 25 pg a 50 pg, de 0,5 pg a 25 pg, de 1 pg a 25 pg, de 2,5 pg a 25 pg, de 5 pg a 25 pg, de 10 pg a 25 pg, de 0,5 pg a 10 pg, de 1 pg a 10 pg, de 2.5 pg a 10 pg, de 5 pg a 10 pg, de 0,5 pg a 5 ng, de 1 pg a 5 ng, de 2,5 pg a 5 pg, de 0,5 pg a 2,5 pg, de 1 pg a 2,5 pg o de 0,5 pg a 1 pg. Se contemplan otras cantidades.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende una cantidad de ADN genómico a amplificar de 1 pg a 6 ng.

En algunas realizaciones, el ADN genómico comprende ADN de 1 a 50 células. En algunas realizaciones, el ADN genómico comprende ADN de una célula individual, de 1 a 10 células, de 1 a 20 células, de 1 a 50 células, más de 10 células, menos de 10 células, más de 50 células, menos de 50 células, más de 100 células o menos de 100 células. Se contempla el ADN de otros números de células.

Entre los ejemplos de tipos de células se incluyen una o más células embrionarias, un ovocito o un cuerpo polar del mismo, esperma, una o más células germinales, una o más células somáticas, una o más células humanas o animales, una o más células vegetales, una o más células de un microorganismo, una o más células para el cribado de una enfermedad, afección o estado, una o más células cancerosas o precancerosas, células de una biopsia, una o más células fetales, células de una muestra de tejido, células en/de un fluido corporal, células en/de una muestra de sangre, células en/de líquido amniótico, células en/de una muestra fijada con formalina, células en/de una muestra incluida en parafina y células en/de un hisopo. Se contemplan otros tipos de células y fuentes de células. En la técnica se conocen procedimientos para obtener células.

El término “cebador oligonucleotídico degenerado” se refiere a un oligonucleótido cuya secuencia de nucleótidos, toda o parte de la misma, es una secuencia parcialmente degenerada. Dichos cebadores se

pueden unir potencialmente a muchas secuencias. Normalmente, dichos oligonucleótidos tienen una parte de

su secuencia de nucleótidos que tiene la posibilidad de más de una base en una posición particular, y/o el oligonucleótido tiene una parte de su secuencia de nucleótidos con bases que pueden formar pares de bases

con una o más bases adicionales. En la técnica se conocen procedimientos y programas para diseñar cebadores, incluidos cebadores oligonucleotídicos degenerados.

En algunas realizaciones, la amplificación del ADN genómico utilizando cebadores oligonucleotídicos degenerados da como resultado la amplificación del genoma completo (WGA) del ADN genómico.

El cebador oligonucleotídico degenerado puede incluir ADN, ARN, una variante de ADN o ARN, una variante

de la cadena principal de azúcar-fosfato y/o una variante de una o más bases, tal como una base modificada

o una base metilada. Se contemplan otros tipos de variantes.

Entre los ejemplos de bases degeneradas con capacidad para unirse a más de una base se incluyen la 2-aminopurina, la 5-metil isodesoxicitosina (Me isodC), el 5-nitroindol, la inosina desoxi, la inosina ribo y la iso desoxiguanosina dG. Se contemplan otras bases.

En la técnica se conocen procedimientos para diseñar cebadores degenerados, e incluyen programas como iCODEHOP (Cebadores oligonucleotídicos híbridos consenso-degenerados,COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primers),NCBI Primer-BLAST y HYDEN (Cebadores altamente degenerados,HighlY DEgeNerate primers).En la técnica se conocen procedimientos para producir cebadores oligonucleotídicos degenerados, entre los que se incluyen la síntesis química.

En algunas realizaciones, el uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados comprenden una

secuencia de uno o más nucleótidos definidos/fijos en su extremo 3'. En algunas realizaciones, el cebador oligonucleotídico degenerado comprende una secuencia de uno o más nucleótidos definidos/fijos en su

extremo 3' y en su extremo 5'.

En algunas realizaciones, el uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados comprenden una

secuencia de nucleótidos que comprende de 6 a 12 nucleótidos aleatorios contiguos. Por ejemplo, un

cebador oligonucleotídico degenerado para su utilización en la WGA es un cebador con la secuencia 5'-CTCGAGNNNNATGTGG-3' (SEQ ID NO. 5) (en la que N = A, C, G o T), un cebador con la secuencia 5'-CGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3' (SEQ ID NO. 6) (en la que N = A, C, G o T), o un cebador con la secuencia 5'-CCGACCGAGNNNNNNATGTGG-3' (SEQ ID NO. 7) (en la que N = A, C, G o T). Se contemplan cebadores con otras secuencias.

En algunas realizaciones, el cebador oligonucleotídico degenerado tiene un tamaño de, como mínimo, 12

bases, como mínimo, 13 bases, como mínimo, 14 bases, como mínimo, 15 bases, como mínimo, 16 bases,

como mínimo, 17 bases, como mínimo, 18 bases, como mínimo, 19 bases, como mínimo, 20 bases o, como

mínimo, 25 bases. Se contemplan otros tamaños.

En algunas realizaciones, el cebador oligonucleotídico degenerado tiene un tamaño inferior a 25 bases,

inferior a 20 bases, inferior a 19 bases, inferior a 18 bases, inferior a 17 bases, inferior a 16 bases, inferior a

15 bases, inferior a 14 bases, inferior a 13 bases o inferior a 12 bases. Se contemplan otros tamaños.

En algunas realizaciones, el cebador oligonucleotídico degenerado tiene un tamaño de 12 a 25 bases, de 13

a 25 bases, de 14 a 25 bases, de 15 a 25 bases, de 16 a 25 bases, de 17 a 25 bases, de 18 a 25 b 19 a 25 bases, de 20 a 25 bases, de 21 a 25 bases, de 22 a 25 bases, de 23 a 25 bases, de 24 a 25 bases,

de 12 a 24 bases, de 13 a 24 bases, de 14 a 24 bases, de 15 a 24 bases, de 16 a 24 bases, de 17 a 24

bases, de 18 a 24 bases, de 19 a 24 bases, de 20 a 24 bases, de 21 a 24 bases, de 22 a 24 bases, de 23 a

24 bases, de 12 a 23 bases, de 13 a 23 bases, de 14 a 23 bases, de 15 a 23 bases, de 16 a 23 bases, de 17

a 23 bases, de 18 a 23 bases, de 19 a 23 bases, de 20 a 23 bases, de 21 a 23 bases, de 22 a 23 b 12 a 22 bases, de 13 a 22 bases, de 14 a 22 bases, de 15 a 22 bases, de 16 a 22 bases, de 17 a 2 de 18 a 22 bases, de 19 a 22 bases, de 20 a 22 bases, de 21 a 22 bases, de 12 a 20 bases, de 13 a 20

bases, de 14 a 20 bases, de 15 a 20 bases, de 16 a 20 bases, de 17 a 20 bases, de 18 a 20 bases, de 19 a

20 bases, de 12 a 19 bases, de 13 a 19 bases, de 14 a 19 bases, de 15 a 19 bases, de 16 a 19 bases, de 17

a 19 bases, de 18 a 19 bases, de 12 a 18 bases, de 13 a 18 bases, de 14 a 18 bases, de 15 a 18 b 16 a 18 bases, de 17 a 18 bases, de 12 a 17 bases, de 13 a 17 bases, de 14 a 17 bases, de 15 a 1 de 16 a 17 bases, de 12 a 16 bases, de 13 a 16 bases, de 14 a 16 bases, de 15 a 16 bases, de 12 a 15

bases, de 13 a 15 bases, de 14 a 15 bases, de 12 a 14 bases, de 13 a 14 bases o de 12 a 13 bases. Se contemplan otros tamaños.

En la técnica se conocen procedimientos para utilizar cebadores oligonucleotídicos degenerados, por

ejemplo, tal como se describe en Telenius, H., Carter, N.P., Bebb, C.E.,et al.(1992) “Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer"Genomics13: 718.

En algunas realizaciones, el uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados comprenden un conjunto de cebadores con la misma secuencia de nucleótidos general. En algunas realizaciones, el uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados comprenden una secuencia de nucleótidos de la misma fórmula general. En algunas realizaciones, el uno o más cebadores degenerados comprenden un conjunto de cebadores con una secuencia de nucleótidos general diferente. En algunas realizaciones, el uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados son diferentes.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende una concentración del uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados de, como mínimo, 0,1 pMI, como mínimo, 0,25 pMI, como mínimo, 0,5 pMI, como mínimo, 1 pMI, como mínimo, 2,5 pMI o, como mínimo, 5 pMI. Se contemplan otras concentraciones. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende una concentración del uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados inferior a 0,1 pMI, inferior a 0,25 pMI, inferior a 0,5 pMI, inferior a 1 pMI, inferior a 2,5 pMI o inferior a 5 pMI. Se contemplan otras concentraciones.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende una concentración del uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados de 0,05 a 5 pMI, de 0,1 a 5 pMI, de 0,25 a 5 pMI, de 0,5 a 5 pMI, de 1 a 5 pMI, de 2,5 a 5 pMI, de 0,05 a 4 pMI, de 0,1 a 4 pMI, de 0,25 a 4 pMI, de 0,5 a 4 pMI, de 1 a 4 pMI, de 2,5 a 4 pMI, de 0,05 a 2,5 pMI, de 0,1 a 2,5 pMI, de 0,25 a 2,5 pMI, de 0,5 a 2,5 pMI, de 1 a 2,5 pMI, de 0,05 a 1 pMI, de 0,1 a 1 pMI, de 0,25 a 1 pMI, de 0,5 a 1 pMI, de 0,05 a 0,5 pMI, de 0,1 a 0,5 pMI, de 0,25 a 0,5 pMI, de 0,05 a 0,25 pMI, de 0,1 a 0,25 pMI, o de 0,05 a 0,1 pMI. Se contemplan otras concentraciones.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende una concentración del uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados de 0,1 a 4 pMI.

En algunas realizaciones, el uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana tienen un tamaño de, como mínimo, 12 bases, como mínimo, 13 bases, como mínimo, 14 bases, como mínimo, 15 bases, como mínimo, 16 bases, como mínimo, 17 bases, como mínimo, 18 bases, como mínimo, 19 bases, como mínimo, 20 bases o, como mínimo, 25 bases. Se contemplan otros tamaños.

En algunas realizaciones, el uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana tienen un tamaño inferior a 25 bases, inferior a 20 bases, inferior a 19 bases, inferior a 18 bases, inferior a 17 bases, inferior a 16 bases, inferior a 15 bases, inferior a 14 bases, inferior a 13 bases o inferior a 12 bases. Se contemplan otros tamaños.

En algunas realizaciones, el uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana tienen un tamaño de 12 a 25 bases, de 13 a 25 bases, de 14 a 25 bases, de 15 a 25 bases, de 16 a 25 bases, de 17 a 25 bases, de 18 a 25 bases, de 19 a 25 bases, de 20 a 25 bases, de 21 a 25 bases, de 22 a 25 bases, de 23 a 25 bases, de 24 a 25 bases, de 12 a 24 bases, de 13 a 24 bases, de 14 a 24 bases, de 15 a 24 bases, de 16 a 24 bases, de 17 a 24 bases, de 18 a 24 bases, de 19 a 24 bases, de 20 a 24 bases, de 21 a 24 bases, de 22 a 24 bases, de 23 a 24 bases, de 12 a 23 bases, de 13 a 23 bases, de 14 a 23 bases, de 15 a 23 bases, de 16 a 23 bases, de 17 a 23 bases, de 18 a 23 bases, de 19 a 23 bases, de 20 a 23 bases, de 21 a 23 bases, de 22 a 23 bases, de 12 a 22 bases, de 13 a 22 bases, de 14 a 22 bases, de 15 a 22 bases, de 16 a 22 bases, de 17 a 22 bases, de 18 a 22 bases, de 19 a 22 bases, de 20 a 22 bases, de 21 a 22 bases, de 12 a 20 bases, de 13 a 20 bases, de 14 a 20 bases, de 15 a 20 bases, de 16 a 20 bases, de 17 a 20 bases, de 18 a 20 bases, de 19 a 20 bases, de 12 a 19 bases, de 13 a 19 bases, de 14 a 19 bases, de 15 a 19 bases, de 16 a 19 bases, de 17 a 19 bases, de 18 a 19 bases, de 12 a 18 bases, de 13 a 18 bases, de 14 a 18 bases, de 15 a 18 bases, de 16 a 18 bases, de 17 a 18 bases, de 12 a 17 bases, de 13 a 17 bases, de 14 a 17 bases, de 15 a 17 bases, de 16 a 17 bases, de 12 a 16 bases, de 13 a 16 bases, de 14 a 16 bases, de 15 a 16 bases, de 12 a 15 bases, de 13 a 15 bases, de 14 a 15 bases, de 12 a 14 bases, de 13 a 14 bases o de 12 a 13 bases. Se contemplan otros tamaños.

En la técnica se conocen procedimientos para diseñar y producir cebadores. Normalmente, los cebadores/oligonucleótidos se producen utilizando síntesis química a partir de fosforoamiditas de nucleósidos, pero se contemplan otros procedimientos de síntesis química.

En algunas realizaciones, el uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana tienen una temperatura de fusión de, como mínimo, 50 oC, como mínimo, 55 oC, como mínimo, 60 oC o, como mínimo, 65 oC. Se contemplan otras temperaturas de fusión.

En la técnica se conocen procedimientos para determinar las temperaturas de fusión. Las temperaturas de fusión citadas en el presente documento se proporcionan como una temperatura determinada (Tm) en las condiciones de amplificación que se utilizan. Se apreciará que el valor de Tm depende de varios factores,

entre los que se incluyen la concentración de sal y la concentración de Mg2+, y se conocen diversos tipos de

cálculos diferentes en la técnica para determinar Tm.

En algunas realizaciones, el uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana tienen una temperatura de fusión inferior a 50 oC, inferior a 55 oC, inferior a 60 oC o inferior a 65 oC. Se contemplan otras temperaturas de fusión.

En algunas realizaciones, el uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana tienen una temperatura de fusión en el intervalo de 45 oC a 65 oC, de 50 oC a 65 oC, de 55 oC a 65 oC, de 60 oC a 65 oC,

de 45 oC a 60 oC, de 50 oC a 60 oC, de 55 oC a 60 oC, de 45 oC a 55 oC, de 50 oC a 55 oC o de 45 oC a Se contemplan otras temperaturas de fusión.

En algunas realizaciones, el uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana comprenden un

contenido de GC de, como mínimo, el 18 %, como mínimo, el 20 %, como mínimo, el 25 %, como mínimo, el

30 %, como mínimo, el 40 %, como mínimo, el 45 %, como mínimo, el 50 %, como mínimo, el 55 %, como

mínimo, el 60 % o, como mínimo, el 65 %. Se contemplan otros niveles de contenido de GC. En la técnica se

conocen procedimientos para determinar el contenido de GC.

En algunas realizaciones, el uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana comprenden un

contenido de GC inferior al 18 %, inferior al 20 %, inferior al 25 %, inferior al 30 %, inferior al 40 %, inferior al

45 %, inferior al 50 %, inferior al 55 %, inferior al 60 % o inferior al 65 %. Se contemplan otros niveles de

contenido de GC.

En algunas realizaciones, el uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana comprenden un

contenido de GC del 18 % al 65 %, del 20 % al 65 %, del 25 % al 65 %, del 25 % al 65 %, del 30 % al 65 %,

del 35 % al 65 %, del 40 % al 65 %, del 45 % al 65 %, del 50 % al 65 %, del 55 % al 65 %, del 60 % al 65 %,

del 18 % al 60 %, del 20 % al 60 %, del 25 % al 60 %, del 25 % al 60 %, del 30 % al 60 %, del 35 % al 60 %,

del 40 % al 60 %, del 45 % al 60 %, del 50 % al 60 %, del 55 % al 60 %, del 18 % al 55 %, del 20 % al 55 %,

del 25 % al 55 %, del 25 % al 55 %, del 30 % al 55 %, del 35 % al 55 %, del 40 % al 55 %, del 45 % al 55 %,

del 50 % al 55 %, del 18 % al 50 %, del 20 % al 50 %, del 25 % al 50 %, del 30 % al 50 %, del 35 % al 50 %,

del 40 % al 50 %, del 45 % al 50 %, del 18 % al 45 %, del 20 % al 45 %, del 25 % al 45 %, del 30 % al 45 %,

del 35 % al 45 %, del 40 % al 45 %, del 18 % al 40 %, del 20 % al 40 %, del 25 % al 40 %, del 30 % al 40 %,

del 35 % al 40 %, del 18 % al 35 %, del 20 % al 35 %, del 25 % al 35 %, del 30 % al 35 %, del 18 % al 30 %,

del 20 % al 30 %, del 25 % al 30 %, del 18 % al 25 %, del 20 % al 25 % o del 18 % al 20 %. Se contemplan

otros niveles de contenido de GC.

En algunas realizaciones, el uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana comprenden

una temperatura de fusión de 50 oC a 64 oC y un contenido de GC del 18 % al 65 %.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende una concentración del uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana de, como mínimo, 0,05 pMI, como mínimo, 0,1 pMI, como mínimo,

0,25 pMI, como mínimo, 0,5 pMI, como mínimo, 1 pMI, como mínimo, 2,5 pMI o, como mínimo, contemplan otras concentraciones.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende una concentración del uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana inferior a 0,05 pMI, inferior a 0,1 pMI, inferior a 0,25 pMI, inferior a

0,5 pMI, inferior a 1 pMI, inferior a 2,5 pMI o inferior a 5 pMI. Se contemplan otras concentraciones.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende una concentración del uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana de 0,05 a 5 pMI, de 0,1 a 5 pMI, de 0,25 a 5 pMI, de 0,5 a 5 pMI, de

1 a 5 pMI, de 2,5 a 5 pMI, de 0,05 a 4 pMI, de 0,1 a 4 pMI, de 0,25 a 4 pMI, de 0,5 a 4 pMI, de 1 a 4 pMI, de 2,5 a

4 pMI, de 0,05 a 2,5 pMI, de 0,1 a 2,5 pMI, de 0,25 a 2,5 pMI, de 0,5 a 2,5 pMI, de 1 a 2,5 pMI, de 0,05 a 1 pMI,

de 0,1 a 1 pMI, de 0,25 a 1 pMI, de 0,5 a 1 pMI, de 0,05 a 0,5 pMI, de 0,1 a 0,5 pMI, de 0,25 a 0,5 pMI, de 0,05 a

0,25 pMI, de 0,1 a 0,25 pMI, o de 0,05 a 0,1 pMI. Se contemplan otras concentraciones.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende una concentración del uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana de 0,05 a 4 pMI.

En algunas realizaciones, se proporciona ADN genómico para amplificación. En algunas realizaciones, el

ADN genómico se proporciona a través de una célula que contiene el ADN para su amplificación. En algunas realizaciones, el ADN genómico se libera a partir de una célula para su amplificación.

En algunas realizaciones, el ADN genómico es ADN sustancialmente sin purificar. En algunas realizaciones,

el ADN genómico es ADN genómico celular lisado. En algunas realizaciones, el ADN genómico proviene de

una célula lisada. En algunas realizaciones, el ADN genómico es ADN sustancialmente sin purificar. En algunas realizaciones, el ADN genómico está parcial o sustancialmente purificado.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende una etapa de lisis de una célula. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende una etapa de lisis de una célula antes de la amplificación. En la técnica se conocen procedimientos para la lisis de células.

En algunas realizaciones, el procedimiento no comprende una etapa de lisis separada. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende la lisis de una célula y la amplificación del ADN genómico de forma simultánea. En algunas realizaciones, la amplificación del ADN genómico de una célula ocurre sin una etapa de lisis separada. En algunas realizaciones, se facilita el ADN genómico de una célula para su amplificación sin una etapa de lisis separada.

En algunas realizaciones, el ADN genómico de una célula se facilita para su amplificación como parte del procedimiento de amplificación.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende amplificar el ADN genómico con el uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados durante, como mínimo, uno o más ciclos de la amplificación con los cebadores específicos del ADN diana.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende amplificar con el uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana durante la duración de la amplificación del ADN genómico con el uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende la adición del uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados y los cebadores específicos de la secuencia de ADN diana antes de la amplificación del ADN genómico.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende la adición del uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados y los cebadores específicos de la secuencia de ADN diana al mismo tiempo.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende la adición del uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados y, posteriormente, la adición de los cebadores específicos de la secuencia de ADN diana. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende amplificar el ADN genómico con el uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados y, posteriormente, amplificar el ADN genómico con el uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados y el uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende la adición del uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana al ADN genómico amplificado con el uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados y, posteriormente, amplificar con el uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana y el uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende una reacción en cadena de la polimerasa que comprende uno o más ciclos de una amplificación de baja rigurosidad y uno o más ciclos adicionales de amplificación de mayor rigurosidad.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende amplificar con el uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados durante uno o más ciclos de una amplificación de baja rigurosidad.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende amplificar con el uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados y los cebadores específicos de las secuencias de ADN diana durante uno o más ciclos de una amplificación de mayor rigurosidad.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende amplificar con el uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados durante el uno o más ciclos de amplificación de baja rigurosidad y amplificar con el uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados y los cebadores específicos de las secuencias de ADN diana durante el uno o más ciclos de amplificación de mayor rigurosidad.

En algunas realizaciones, la amplificación comprende una reacción en cadena de la polimerasa que comprende uno o más ciclos con una temperatura de hibridación por debajo de 35 oC.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende amplificar con el uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados durante el uno o más ciclos con una temperatura de hibridación por debajo de 35 oC.

En algunas realizaciones, la amplificación comprende una reacción en cadena de la polimerasa que comprende de 1 a 8 ciclos con una temperatura de hibridación por debajo de 35 oC.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende amplificar con el uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados durante los 1 a 8 ciclos con una temperatura de hibridación por debajo de 35 oC.

Se contemplan otras temperaturas y condiciones de ciclado.

En algunas realizaciones, la amplificación comprende una reacción en cadena de la polimerasa que comprende uno o más ciclos con una temperatura de hibridación de 20 oC a 35 oC.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende amplificar con el uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados durante uno o más ciclos con una temperatura de hibridación de 20 oC a 35 oC.

En algunas realizaciones, la amplificación comprende una reacción en cadena de la polimerasa que comprende de 1 a 8 ciclos con una temperatura de hibridación de 20 oC a 35 oC. Se contemplan otras temperaturas y condiciones de ciclado.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende amplificar con el uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados durante 1 a 8 ciclos con una temperatura de hibridación de 20 oC a 35 oC. En algunas realizaciones, la amplificación comprende una reacción en cadena de la polimerasa que comprende uno o más ciclos con una temperatura de hibridación por encima de 48 oC o 50 oC.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende amplificar con el uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados y el uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana durante uno o más ciclos con una temperatura de hibridación por encima de 48 oC o 50 oC.

En algunas realizaciones, la amplificación comprende una reacción en cadena de la polimerasa que comprende de 5 a 25 ciclos con una hibridación por encima de 48 oC o 50 oC. Se contemplan otras temperaturas y condiciones de ciclado.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende amplificar con el uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados y el uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana durante 5 a 25 ciclos con una temperatura de hibridación por encima de 48 oC o 50 oC.

En algunas realizaciones, la amplificación comprende una reacción en cadena de la polimerasa que comprende uno o más ciclos con una temperatura de hibridación de una de 48 oC a 68 oC, de 52 oC a 65 oC o de 52 oC a 62 oC.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende amplificar con el uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados y el uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana durante uno o más ciclos con una temperatura de hibridación de una de 48 oC a 68 oC, de 52 oC a 65 oC o de 52 oC a 62 oC.

En algunas realizaciones, la amplificación comprende una reacción en cadena de la polimerasa que comprende de 5 a 25 ciclos con una temperatura de hibridación de una de 48 oC a 68 oC, de 52 oC a 65 oC o de 52 oC a 62 oC. Se contemplan otras temperaturas y condiciones de ciclado.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende amplificar con el uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados y el uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana durante 5 a 25 ciclos con una temperatura de hibridación de una de 48 oC a 68 oC, de 52 oC a 65 oC o de 52 oC a 62 oC.

En algunas realizaciones, la amplificación comprende una reacción en cadena de la polimerasa que comprende uno o más ciclos con una temperatura de hibridación por debajo de 35 oC y uno o más ciclos adicionales con una temperatura de hibridación por encima de 50 oC. Se contemplan otras temperaturas y condiciones de ciclado.

En algunas realizaciones, la amplificación comprende una reacción en cadena de la polimerasa que comprende uno o más ciclos con una temperatura de hibridación por debajo de 35 oC con el uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados y uno o más ciclos adicionales con una temperatura de hibridación por encima de 48 oC o 50 oC con el uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados y el uno o más cebadores específicos de DNS diana. Se contemplan otras temperaturas y condiciones de ciclado.

En algunas realizaciones, la amplificación comprende una reacción en cadena de la polimerasa que comprende uno o más ciclos con una temperatura de hibridación de 20 oC a 35 oC y uno o más ciclos adicionales con una temperatura de hibridación de una de 48 oC a 68 oC, de 52 oC a 65 oC o de 52 oC a 62 oC. Se contemplan otras temperaturas.

En algunas realizaciones, la amplificación comprende una reacción en cadena de la polimerasa que comprende uno o más ciclos con una temperatura de hibridación de 20 oC a 35 oC con el uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados y uno o más ciclos adicionales con una temperatura de hibridación de una de 48 oC a 68 oC, de 52 oC a 65 oC o de 52 oC a 62 oC con el uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados y el uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana. Se contemplan otras temperaturas.

En algunas realizaciones, la amplificación comprende una reacción en cadena de la polimerasa que comprende de 1 a 8 ciclos con una temperatura de hibridación de 20 oC a 35 oC y de 5 a 25 ciclos con una temperatura de hibridación de una de 48 oC a 68 oC, de 52 oC a 65 oC o de 52 oC a 62 oC durante 5 a 25 ciclos. Se contemplan otras temperaturas y condiciones de ciclado.

En algunas realizaciones, la amplificación comprende una reacción en cadena de la polimerasa que comprende de 1 a 8 ciclos con una temperatura de hibridación de 20 oC a 35 oC con los cebadores oligonucleotídicos degenerados y de 5 a 25 ciclos con una temperatura de hibridación de una de 48 oC a 68 oC, de 52 oC a 65 oC o de 52 oC a 62 oC durante 5 a 25 ciclos con el uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados y el uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana.

En el presente documento se describen ejemplos de polimerasas.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende la utilización de una o más de polimerasa Taq (disponible, por ejemplo, de New England Biolabs), una polimerasa Phi29 (disponible, por ejemplo, de New England Biolabs), a Dn polimerasa Pfu (disponible, por ejemplo, de Promega), una ADN polimerasa Bst (disponible, por ejemplo, de New England Biolabs), a Dn polimerasas VentR™ y Deep VentR™ (disponibles, por ejemplo, de New England Biolabs), ADN polimerasa 9°Nm (disponible, por ejemplo, de New England Biolabs), ADN polimerasas Herculase II Fusion (disponibles, por ejemplo, de Agilent Technologies), KAPA HiFi (disponible, por ejemplo, de Kapa Biosystems), KAPA2G Robust (disponible, por ejemplo, de Kapa Biosystems), fragmento Klenow de ADN polimerasa I (disponible, por ejemplo, de New England Biolabs), ADN polimerasa PhiPRDl (Junget al.(1987),Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU.84:8287), ADN polimerasa del fago M2 (Matsumotoet al.(1989)Gene84:247), ADN polimerasa T4 (disponible, por ejemplo, de New England Biolabs) y ADN polimerasa T5 (Chatterjeeet al.,(1991)Gene97:13-19). Se contemplan otros tipos de polimerasas y están disponibles en el mercado. Se pueden seleccionar condiciones de reacción adecuadas para una polimerasa específica.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende la utilización de polimerasa con una capacidad de procesamiento de 1 a 50 nucleótidos por segundo a 72 oC. Las polimerasas con la capacidad de procesamiento requerida son conocidas en la técnica.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende la utilización de una polimerasa con una fidelidad de, como mínimo, 285 x 10-6 errores por nucleótido plantilla. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende la utilización de una polimerasa con una fidelidad superior a 285 x 10-6 errores por nucleótido plantilla. En la técnica se conocen polimerasas con una fidelidad requerida.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende una o más rondas adicionales de amplificación de la secuencia de ADN diana amplificada.

En algunas realizaciones, la una o más rondas adicionales de amplificación comprenden de 10 a 40 ciclos. En algunas realizaciones, la una o más rondas adicionales de amplificación comprenden ciclos con una temperatura de hibridación de una de 48 oC a 68 oC, de 52 oC a 65 oC o de 52 oC a 62 oC. En algunas realizaciones, la una o más rondas adicionales de amplificación comprenden de 10 a 40 ciclos con una temperatura de hibridación de una de 48 oC a 68 oC, de 52 oC a 65 oC o de 52 oC a 62 oC.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende una o más rondas adicionales de amplificación de la secuencia de ADN diana amplificada con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana. En algunas realizaciones, los cebadores específicos de la secuencia de ADN diana adicionales son los mismos que el uno o más cebadores de la secuencia de ADN diana.

En algunas realizaciones, los cebadores específicos de la secuencia de ADN diana adicionales son diferentes del uno o más cebadores de la secuencia de ADN diana.

En algunas realizaciones, los cebadores de la secuencia de ADN diana adicionales son cebadores anidados. En la técnica se conocen procedimientos para diseñar y producir cebadores adicionales, entre los que se incluyen cebadores anidados.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende amplificar dos o más secuencias de ADN diana. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende amplificar dos o más secuencias de ADN diana a partir del ADN genómico, amplificando el ADN genómico con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados en presencia de cebadores específicos para las dos o más secuencias de ADN diana.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende amplificar una secuencia de ADN diana a partir de ADN genómico amplificando el ADN genómico con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados en presencia de uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana y, posteriormente, amplificar una o más de otras secuencias de ADN diana.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende, además, calcular el contenido de nucleótidos de la secuencia de ADN diana amplificada. En la técnica se conocen procedimientos para calcular el contenido de nucleótidos.

En algunas realizaciones, el cálculo del contenido de nucleótidos comprende detectar la presencia o ausencia de un polimorfismo, una mutación, una deleción, una inserción, una translocación, un estado de metilación y/o un cambio epigenético. Se contemplan otros procedimientos para calcular el contenido de nucleótidos. En algunas realizaciones, el cálculo del contenido de nucleótidos comprende la secuenciación de toda o parte de la secuencia de ADN diana amplificada.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende, además, calcular el contenido de nucleótidos mediante uno o más de secuenciación de toda o parte de la secuencia de ADN diana amplificada, hibridación de una cadena de la secuencia de ADN diana amplificada con uno o más oligonucleótidos, PCR en tiempo real y análisis de fusión de alta resolución. Se contemplan otros procedimientos.

En algunas realizaciones, el procedimiento se puede utilizar para cribado genético, cribado genético preimplantacional, diagnóstico genético preimplantacional, cribado prenatal, cribado de una enfermedad, cribado de un cáncer, cribado de marcadores genéticos y/o cribado forense. Se contemplan otras utilizaciones.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento para amplificar una secuencia de ADN diana a partir de ADN genómico, tal como se describe en el presente documento, amplificando la secuencia de ADN diana con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana durante, como mínimo, uno o más ciclos de amplificación de ADN genómico con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento para amplificar una secuencia de ADN diana a partir de ADN genómico, comprendiendo el procedimiento amplificar la secuencia de ADN diana con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana durante, como mínimo, uno o más ciclos de amplificación de ADN genómico con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados, amplificando, de este modo, la secuencia de ADN diana.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento para amplificar una secuencia de ADN diana a partir de ADN genómico, comprendiendo el procedimiento:

amplificar el ADN genómico con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados; y

durante, como mínimo, uno o más ciclos de amplificación del ADN genómico, amplificar también la secuencia de ADN diana con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana,

amplificando, de este modo, la secuencia de ADN diana.

Los procedimientos de amplificación son tal como se ha descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la amplificación comprende una reacción en cadena de la polimerasa, tal como se describe en el presente documento.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento para amplificar una secuencia de ADN diana a partir de ADN genómico utilizando la amplificación del genoma completo, tal como se describe en el presente documento.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento para amplificar una secuencia de ADN diana a partir de ADN genómico, llevando a cabo una amplificación del genoma completo del ADN genómico con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados; y durante, como mínimo, una parte de la amplificación del genoma completo amplificar también la secuencia de ADN diana con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento para amplificar una secuencia de ADN diana a partir de ADN genómico, comprendiendo el procedimiento:

llevar a cabo la amplificación del genoma completo del ADN genómico con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados; y

durante, como mínimo, una parte de la amplificación del genoma completo, amplificar también la secuencia de ADN diana con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana,

amplificando, de este modo, la secuencia de ADN diana.

En algunas realizaciones, la amplificación del genoma completo comprende la amplificación mediante una reacción en cadena de la polimerasa.

Los procedimientos para la amplificación del genoma completo son tal como se describen en el presente documento. Por ejemplo, la aplicación del genoma completo se puede llevar a cabo tal como se describe en Arneson N., Hughes S., Houlston R. y Done S. (2007) “PCR-Based Whole Genome Amplification”, Capítulo 18,PCR(eds. Hughes y Moody). Scion Publishing Ltd., Oxfordshire, Reino Unido, 2007.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer una secuencia de ADN diana amplificada mediante un procedimiento, tal como se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones, una secuencia de ADN diana se puede amplificar de forma adicional. En algunas realizaciones, la secuencia de ADN diana se puede amplificar de forma adicional con los mismos cebadores. En algunas realizaciones, la secuencia de ADN diana se puede amplificar de forma adicional con uno o más de otros cebadores específicos de la secuencia de ADN diana. Los procedimientos para la amplificación con uno o más de otros cebadores específicos de la secuencia de ADN diana o adicionales son tal como se describen en el presente documento.

Algunas realizaciones dan a conocer la utilización de una secuencia de ADN diana amplificada tal como se describe en el presente documento.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer la utilización de una secuencia de ADN diana para el cribado genético, diagnóstico genético, cribado genético preimplantacional, diagnóstico genético preimplantacional, cribado prenatal, cribado de una enfermedad, cribado de un cáncer, cribado de un marcador genético, cribado de un polimorfismo, una mutación, una deleción, una inserción, una translocación, una expansión, una inversión, un estado de metilación y/o un cambio epigenético y/o cribado forense. Se contemplan otras utilizaciones.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento para calcular el contenido de nucleótidos de una secuencia de ADN diana amplificada a partir de ADN genómico mediante un procedimiento, tal como se describe en el presente documento. Los procedimientos para calcular el contenido de nucleótidos son tal como se describen en el presente documento.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento para calcular el contenido de nucleótidos de una secuencia de ADN diana mediante el cálculo del contenido de nucleótidos de una secuencia de ADN diana amplificada mediante un procedimiento, tal como se describe en el presente documento.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento para calcular el contenido de nucleótidos de una secuencia de ADN diana en ADN genómico, comprendiendo el procedimiento: amplificar el ADN genómico con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados en presencia de uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

calcular el contenido de nucleótidos de la secuencia de ADN diana amplificada con el fin de calcular el contenido de nucleótidos de la secuencia de ADN diana.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento para calcular el contenido de nucleótidos de una secuencia de ADN diana en ADN genómico, comprendiendo el procedimiento amplificar la secuencia de ADN diana con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana durante, como mínimo, uno o más ciclos de amplificación de ADN genómico con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados para producir una secuencia de ADN diana amplificada, y calcular el contenido de nucleótidos de la secuencia de ADN diana amplificada con el fin de calcular el contenido de nucleótidos de la secuencia de ADN diana.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento para calcular el contenido de nucleótidos de una secuencia de ADN diana en ADN genómico, comprendiendo el procedimiento: amplificar el ADN genómico con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados; y

durante, como mínimo, uno o más ciclos de la amplificación del ADN genómico, amplificar también la secuencia de ADN diana con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

calcular el contenido de nucleótidos de la secuencia de ADN diana amplificada con el fin de calcular el contenido de nucleótidos de la secuencia de ADN diana.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento para calcular el contenido de nucleótidos de una secuencia de ADN diana en ADN genómico, comprendiendo el procedimiento: llevar a cabo la amplificación del genoma completo del ADN genómico con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados;

durante, como mínimo, una parte de la amplificación del genoma completo, amplificar también la secuencia de ADN diana con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

calcular el contenido de nucleótidos de la secuencia de ADN diana amplificada con el fin de calcular el contenido de nucleótidos de la secuencia de ADN diana.

Los procedimientos para calcular el contenido de nucleótidos son tal como se describen en el presente documento. En algunas realizaciones, el cálculo del contenido de nucleótidos comprende determinar la secuencia de nucleótidos de todo o parte del ADN diana amplificado.

En algunas realizaciones, los procedimientos para calcular el contenido de nucleótidos comprenden detectar la presencia o ausencia de un polimorfismo, una mutación, una deleción, una inserción, una translocación, un estado de metilación y/o un cambio epigenético.

En algunas realizaciones, los procedimientos para calcular el contenido de nucleótidos comprenden uno o más de secuenciación de toda o parte de la secuencia de ADN diana amplificada, hibridación de una cadena de la secuencia de ADN diana amplificada con uno o más oligonucleótidos, PCR en tiempo real y análisis de fusión de alta resolución. Se contemplan otros procedimientos.

En algunas realizaciones, los procedimientos para calcular el contenido de nucleótidos se utilizan para el cribado genético, diagnóstico genético, cribado genético preimplantacional, diagnóstico genético preimplantacional, cribado prenatal, cribado de una enfermedad, cribado de un cáncer, cribado de marcadores genéticos y/o cribado forense. Se contemplan otras utilizaciones.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento para determinar la secuencia de toda o parte de una secuencia de ADN diana en ADN genómico, amplificando la secuencia de ADN diana tal como se describe en el presente documento y determinando la secuencia de nucleótidos de toda o parte de la secuencia de ADN diana amplificada.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento para determinar la secuencia de nucleótidos de una secuencia de ADN diana en ADN genómico, comprendiendo el procedimiento: amplificar el ADN genómico con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados en presencia de uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

determinar la secuencia de nucleótidos de la secuencia de ADN diana amplificada,

determinando, de este modo, la secuencia de nucleótidos de la secuencia de ADN diana.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende determinar la secuencia de nucleótidos de sustancialmente todos los nucleótidos en la secuencia de ADN diana amplificada. En algunas realizaciones, el procedimiento comprende determinar la secuencia de nucleótidos de uno o más nucleótidos en la secuencia de ADN diana amplificada.

En la técnica se conocen procedimientos para determinar la secuencia de nucleótidos de un ADN. Entre los ejemplos se incluyen técnicas basadas en la terminación de la cadena didesoxi, procedimientos de secuenciación de próxima generación, secuenciación “shotgun”, hibridación con uno o más oligonucleótidos, PCR en tiempo real y análisis de fusión de alta resolución. Se contemplan otros procedimientos.

En algunas realizaciones, los procedimientos, tal como se describen en el presente documento, se utilizan para el cribado o el diagnóstico genético.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado o diagnóstico genético, mediante la amplificación de una secuencia de ADN diana, tal como se describe en el presente documento y la evaluación de la secuencia de ADN diana amplificada para el cribado o el diagnóstico.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado o diagnóstico genético de un embrión. En el presente documento se contempla y describe el cribado o diagnóstico genético de otras células.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado genético de un embrión, comprendiendo el procedimiento:

amplificar el ADN genómico del embrión con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados en presencia de uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para cribar el embrión.

En la técnica se conocen procedimientos para obtener una o más células de un embrión para su análisis. Los procedimientos para amplificar el ADN genómico de un embrión con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados en presencia de uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada son tal como se describen en el presente documento.

En algunas realizaciones, la evaluación de la secuencia de ADN diana amplificada comprende determinar el contenido de nucleótidos de la secuencia de ADN diana amplificada.

En algunas realizaciones, la evaluación de la secuencia de ADN diana amplificada comprende detectar la presencia o ausencia de un polimorfismo, una mutación, una deleción, una inserción, una translocación, un estado de metilación y/o un cambio epigenético.

En algunas realizaciones, la evaluación comprende una o más de secuenciación de toda o parte de la secuencia de ADN diana amplificada, la hibridación de una cadena de la secuencia de ADN diana amplificada con uno o más oligonucleótidos, la PCR en tiempo real y el análisis de fusión de alta resolución. Se contemplan otros procedimientos.

En algunas realizaciones, los procedimientos, tal como se describen en el presente documento, se utilizan para el cribado de un embrión, tal como el cribado genético preimplantacional.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado genético preimplantacional de un embrión, por ejemplo, para determinar la idoneidad de la implantación, para determinar la presencia o ausencia de una enfermedad genética y/o para determinar la presencia o ausencia de mutaciones deseadas y/o no deseadas. Se contemplan otros tipos de cribado.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado genético preimplantacional de un embrión, comprendiendo el procedimiento:

amplificar el ADN genómico del embrión con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados en presencia de uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para cribar el embrión.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado genético preimplantacional de un embrión, comprendiendo el procedimiento amplificar una secuencia de ADN diana del embrión con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana durante, como mínimo, uno o más ciclos de amplificación de ADN genómico del embrión con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados para producir una secuencia de ADN diana amplificada, y evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para cribar el embrión.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado genético preimplantacional de un embrión, comprendiendo el procedimiento:

amplificar el ADN genómico del embrión con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados; durante, como mínimo, uno o más ciclos de amplificación del ADN genómico, amplificar también una secuencia de ADN diana del embrión con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para cribar el embrión.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado genético preimplantacional de un embrión, comprendiendo el procedimiento:

llevar a cabo la amplificación del genoma completo del ADN genómico del embrión con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados;

durante, como mínimo, una parte de la amplificación del genoma completo, amplificar también una secuencia de ADN diana del embrión con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para cribar el embrión.

En algunas realizaciones, los procedimientos, tal como se describen en el presente documento, se utilizan para el cribado de un ovocito, tal como el cribado genético. Por ejemplo, se puede cribar un ovocito para determinar su idoneidad para la fertilización, su idoneidad para la implantación, la presencia o ausencia de una enfermedad genética, su contenido mitocondrial o genoma, y/o la presencia o ausencia de mutaciones deseadas y/o no deseadas. Se contemplan otros tipos de cribado.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado genético de un ovocito.

En la técnica se conocen procedimientos para obtener un ovocito o un cuerpo polar del mismo para su análisis. En el presente documento se describen procedimientos para amplificar el ADN genómico de un ovocito (o un cuerpo polar del mismo) con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados en presencia de uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada, tal como se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones, la evaluación de la secuencia de ADN diana amplificada comprende determinar el contenido de nucleótidos de la secuencia de ADN diana amplificada.

En algunas realizaciones, la evaluación de la secuencia de ADN diana amplificada comprende detectar la presencia o ausencia de un polimorfismo, una mutación, una deleción, una inserción, una translocación, un estado de metilación y/o un cambio epigenético.

En algunas realizaciones, la evaluación comprende una o más de secuenciación de toda o parte de la secuencia de ADN diana amplificada, hibridación de una cadena de la secuencia de ADN diana amplificada con uno o más oligonucleótidos, PCR en tiempo real y análisis de fusión de alta resolución. Se contemplan otros procedimientos.

En algunas realizaciones, los procedimientos, tal como se describen en el presente documento, se utilizan para el cribado genético preimplantacional de un ovocito.

En algunas realizaciones, el procedimiento se utiliza para cribar la idoneidad de un ovocito para la fertilización.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado genético preimplantacional de un ovocito.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado genético preimplantacional de un ovocito, comprendiendo el procedimiento:

amplificar el ADN genómico de un ovocito o un cuerpo polar del mismo con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados en presencia de uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para cribar el ovocito.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado genético preimplantacional de un ovocito, comprendiendo el procedimiento amplificar una secuencia de ADN diana del ovocito o de un cuerpo polar del mismo con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana durante, como mínimo, uno o más ciclos de amplificación de ADN genómico del ovocito o del cuerpo polar con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados para producir una secuencia de ADN diana amplificada, y evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para cribar el ovocito.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado genético preimplantacional de un ovocito, comprendiendo el procedimiento:

amplificar el ADN genómico del ovocito o de un cuerpo polar del mismo con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados;

durante, como mínimo, uno o más ciclos de la amplificación del ADN genómico, amplificar también una secuencia de ADN diana del ovocito o del cuerpo polar con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para cribar el ovocito.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado genético preimplantacional de un ovocito, comprendiendo el procedimiento:

llevar a cabo la amplificación del genoma completo del ADN genómico del ovocito o de un cuerpo polar del mismo con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados;

durante, como mínimo, una parte de la amplificación del genoma completo, amplificar también una secuencia de ADN diana del ovocito o de un cuerpo polar con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para cribar el ovocito.

Los procedimientos para llevar a cabo la amplificación del genoma completo son tal como se describen en el presente documento.

En algunas realizaciones, los procedimientos, tal como se describen en el presente documento, se utilizan para el cribado de esperma, tal como el cribado genético. Por ejemplo, se puede cribar un esperma para determinar su idoneidad para la utilización en fertilización, la presencia o ausencia de una enfermedad genética y/o la presencia o ausencia de mutaciones deseadas y/o no deseadas. Se contemplan otros tipos de cribado.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado genético de esperma.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado genético de esperma, comprendiendo el procedimiento:

amplificar el ADN genómico de uno o más espermas con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados en presencia de uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para cribar el esperma.

En la técnica se conocen procedimientos para obtener esperma para análisis. Los procedimientos para amplificar el ADN genómico del esperma con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados en presencia de uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada son tal como se describen en el presente documento.

En algunas realizaciones, la evaluación de la secuencia de ADN diana amplificada comprende determinar el contenido de nucleótidos de la secuencia de ADN diana amplificada.

En algunas realizaciones, la evaluación de la secuencia de ADN diana amplificada comprende detectar presencia o ausencia de un polimorfismo, una mutación, una deleción, una inserción, una translocación, un estado de metilación y/o un cambio epigenético.

En algunas realizaciones, la evaluación comprende una o más de secuenciación de toda o parte de la secuencia de ADN diana amplificada, hibridación de una cadena de la secuencia de ADN diana amplificada con uno o más oligonucleótidos, PCR en tiempo real y análisis de fusión de alta resolución.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado genético de esperma, comprendiendo el procedimiento amplificar una secuencia de ADN diana de uno o más espermas con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana durante, como mínimo, uno o más ciclos de amplificación de ADN genómico del uno o más espermas con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados para producir una secuencia de ADN diana amplificada, y evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para cribar el esperma.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado genético de esperma, comprendiendo el procedimiento:

amplificar el ADN genómico de uno o más espermas con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados;

durante, como mínimo, uno o más ciclos de la amplificación del ADN genómico, amplificar también una secuencia de ADN diana del uno o más espermas con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para cribar el esperma.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado de esperma, comprendiendo el procedimiento:

llevar a cabo la amplificación del genoma completo del ADN genómico de uno o más espermas con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados;

durante, como mínimo, una parte de la amplificación del genoma completo, amplificar también una secuencia de ADN diana del uno o más espermas con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para cribar el esperma.

En algunas realizaciones, los procedimientos, tal como se describen en el presente documento, se utilizan para cribar la idoneidad del esperma para la fertilización.

En algunas realizaciones, los procedimientos, tal como se describen en el presente documento, se utilizan para cribar un feto, tal como, un cribado genético. Por ejemplo, se puede cribar un ovocito de feto para la presencia o ausencia de una enfermedad genética, la presencia o ausencia de marcadores genéticos, la presencia o ausencia de contenido cromosómico y/o la presencia o ausencia de mutaciones deseadas y/o no deseadas. Se contemplan otros tipos de cribado.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado de un feto.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado prenatal de un feto.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado prenatal de un feto, comprendiendo el procedimiento:

amplificar el ADN genómico del feto con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados en presencia de uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para realizar el cribado del feto.

Los procedimientos para obtener ADN genómico de un feto son conocidos en la técnica, e incluyen la toma de muestras de líquido amniótico, la toma de muestras de vellosidades coriónicas y la obtención de ADN libre de células. Los procedimientos para amplificar el ADN genómico con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados en presencia de uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada, son tal como se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones, la evaluación de la secuencia de ADN diana amplificada comprende determinar el contenido de nucleótidos de la secuencia de ADN diana amplificada.

En algunas realizaciones, la evaluación de la secuencia de ADN diana amplificada comprende detectar la presencia o ausencia de un polimorfismo, una mutación, una deleción, una inserción, una translocación, un estado de metilación y/o un cambio epigenético.

En algunas realizaciones, la evaluación comprende una o más de secuenciación de toda o parte de la secuencia de ADN diana amplificada, hibridación de una cadena de la secuencia de ADN diana amplificada con uno o más oligonucleótidos, PCR en tiempo real y análisis de fusión de alta resolución.

En algunas realizaciones, los procedimientos, tal como se describen en el presente documento, se utilizan para cribar un trastorno genético en el feto.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado prenatal de un feto, comprendiendo el procedimiento amplificar una secuencia de ADN diana del feto con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana durante, como mínimo, uno o más ciclos de amplificación de ADN genómico del feto con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados para producir una secuencia de ADN diana amplificada, y evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para cribar el feto.

Algunas realizaciones de una presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado prenatal de un feto, comprendiendo el procedimiento:

amplificar ADN genómico del feto con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados;

durante, como mínimo, uno o más ciclos de la amplificación del ADN genómico, amplificar también una secuencia de ADN diana del feto con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para cribar el feto.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un procedimiento de cribado prenatal de un feto, comprendiendo el procedimiento:

llevar a cabo la amplificación del genoma completo del ADN genómico de uno o más espermas con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados;

durante, como mínimo, una parte de la amplificación del genoma completo, amplificar también una secuencia de ADN diana del feto con uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana para producir una secuencia de ADN diana amplificada; y

evaluar la secuencia de ADN diana amplificada para cribar el feto.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un kit para llevar a cabo un procedimiento, tal como se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones, el kit comprende uno o más componentes, tal como se describe en el presente documento, tales como uno o más de tampones, reactivos, enzimas, soluciones, dNTP, controles y/o instrucciones.

Por ejemplo, un kit para su utilización para amplificar una secuencia de ADN diana puede contener uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados para la amplificación del genoma completo, uno o más cebadores para amplificar una secuencia de ADN diana y, de forma opcional, uno o más reactivos y/o instrucciones para amplificar la secuencia de ADN diana durante la amplificación del genoma completo.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un producto combinado que comprende uno o más componentes, tal como se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones, se utiliza un producto combinado para llevar a cabo un procedimiento, tal como se describe en el presente documento.

Algunas realizaciones de la presente invención dan a conocer un producto combinado, el producto comprende los siguientes componentes:

(i) uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados para la amplificación del genoma completo;

(ii) uno o más cebadores para amplificar una secuencia de ADN diana; y

(iii) uno o más reactivos y/o instrucciones para amplificar la secuencia de ADN diana durante la amplificación del genoma completo.

En algunas realizaciones, el producto combinado comprende, de forma opcional, además, uno o más de otros componentes, tal como se describe en el presente documento, tales como uno o más de tampones, reactivos, enzimas, soluciones, dNTP, controles y/o instrucciones.

Se pueden utilizar técnicas y equipos estándar para la tecnología de ADN recombinante, la síntesis de oligonucleótidos, la biología molecular y las reacciones enzimáticas. Las técnicas y procedimientos anteriores se pueden llevar a cabo, en general, según procedimientos conocidos en la técnica y/o disponibles en el mercado, y se describen, por ejemplo, en Sambrooket al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)) y Ausubelet al.,Current Protocols in Molecular Biology (2003), John Wiley & Sons.

La presente invención se describe, de forma adicional, mediante los siguientes ejemplos. Se debe entender que la siguiente descripción tiene como finalidad describir realizaciones particulares únicamente y no pretende ser limitante con respecto a la descripción anterior.

EJEMPLO 1 - Protocolo de amplificación del genoma completo y selección de genes

El siguiente protocolo se utilizó para los estudios de amplificación del genoma completo (WGA) y de selección de genes, descritos en el presente documento.

1. Materiales y procedimientos

Protocolo de amplificación del genoma completo y selección de genes de primera ronda:

(i) Añadir 1 pl de enzima de lisis celular (proteasa termoestable; kit EmbryoCellect™, RHS; número de catálogo RHS1001) a 6,5 pl de H<2>O de calidad PCR; esto se denomina enzima de lisis celular dil 1.

(ii) Crear una mezcla de lisis celular combinando los reactivos de la tabla 1:

Tabla 1

(iii) Añadir 3 pl de mezcla de lisis celular al tubo de células o de ADN. Golpear suavemente la solución hasta el fondo del tubo o centrifugar brevemente. No agitar en vórtice.

En este sentido, una célula individual contiene normalmente aproximadamente 6 pg de ADN.

(iv) Incubar la muestra en el termociclador con los parámetros de la tabla 2:

Tabla 2

(v) Preparar una mezcla maestra para la cantidad requerida de muestras, tal como se describe en la tabla 3, utilizando los reactivos comerciales enumerados:

Tabla 3

(vi) Otras ADN polimerasas de WGA adecuadas son tal como se describen en el presente documento. Por ejemplo, Cat. # 600675, KAPA HiFi; Kapa Biosystems Cat # KK2101, kits de P<c>R robusta KAPA2G; Kapa Biosystems Cat. # KK5004, ADN polimerasas Herculase II Fusion (Cat # 600675) y ADN polimerasa AmpliTaq ThermoFisher Scientific Cat. # N8080171.

(vii) Repartir alícuotas de mezcla maestra, 22 pl, en tubos de PCR que contienen ADN genómico o células lisadas.

(viii) Ejecutar las muestras a través del programa de la tabla 4:

Tabla 4

(ix) La temperatura mantenida a 4 oC es para permitir la adición de los cebadores específicos de gen a la PCR.

(x) Diluir los cebadores específicos de gen (tabla 8) a las concentraciones de trabajo requeridas (10 uM, 5 uM, 2 uM) con H<2>O de calidad PCR.

(xi) Durante temperatura mantenida a 4 oC, mientras las muestras están en hielo: añadir 1,4 ul de cebador directo específico de gen a cada tubo, añadir 1,4 ul de cebador inverso específico de gen a cada tubo. Centrifugar brevemente el tubo de muestra y colocarlo nuevamente en el termociclador.

(xii) Ejecutar las muestras a través del programa que se muestra en la tabla 5

Tabla 5

(xiii) Visualizar los productos de amplificación ejecutándolos en un gel de agarosa al 1 % a 100 v durante 30 minutos.

Protocolo de PCR específica de gen de segunda ronda:

(i) Diluir los productos de PCR generados a partir de la primera ronda de PCR 1/50 con agua de calidad PCR hasta una concentración aproximada de 1 ng/ul.

(ii) Preparar la mezcla maestra, tal como se describe en la tabla 6:

Tabla 6

(iii) Se utilizó el kit KAPA2G Robust con dNTP (Kapa Biosystems, EE. UU., MA; número de catálogo KK5004 o KK5005) para amplificar de forma específica el ADN diana.

(iv) Repartir alícuotas de la mezcla maestra (24 p.l) a cada tubo de PCR.

(v) Añadir 1 ul de ADN plantilla diluido 1/50.

(vi) Ejecutar las muestras a través del programa de PCR que se muestra en la tabla 7:

Tabla 7

(vii) Visualizar los productos de amplificación ejecutándolos sobre un gel de agarosa al 2 % a 100 v durante 30 minutos.

T l . r ífi n iliz :

(viii) Concentración final de la mezcla maestra de cada cebador directo e inverso en 25 ul de solución 2,8 ul adicionales (volumen total 27,8 ul):

(ix) Solución de trabajo 10 uM: 0,5035 uM; solución de trabajo 5 uM: 0,2518 uM; solución de trabajo 2 uM: 0,1007 uM.

Si se desea, se puede determinar la secuencia de ADN de los productos de amplificación.

Uno o más de los reactivos anteriores se pueden incorporar en un kit o un producto combinado, que también puede incluir instrucciones.

La amplificación de una secuencia de ADN diana, tal como se ha descrito anteriormente, tiene una variedad de utilizaciones, por ejemplo, en el cribado genético preimplantacional, el diagnóstico genético preimplantacional, el cribado prenatal, el cribado genético, el cribado de una enfermedad, el cribado de un cáncer, el cribado de marcadores genéticos y/o el cribado forense.

EJEMPLO 2 - Validación del enriquecimiento de genes diana en PCR de WGA utilizando células individuales Se llevaron a cabo estudios para validar el protocolo de enriquecimiento de genes diana.

Se añadieron dos conjuntos de cebadores específicos de gen (P) (concentraciones de 0,5 uM, 0,25 uM o 0,1 M) a la WGA (PCR multiplex; figura 1 y figura 2) y se realizó la primera ronda de amplificación del genoma completo y la selección de genes, tal como se describe en el ejemplo 1, utilizando células individuales clasificadas manualmente de una línea celular disponible en el mercado (Coriell; 47,XY,+15 o 48,XXY,+21). Tal como se puede observar, el proceso de amplificación dio como resultado la amplificación del genoma completo del ADN genómico y la amplificación específica del gen diana, observándose la amplificación del gen diana a las concentraciones probadas del cebador seleccionado. Se observó que la amplificación WGA en presencia de cebadores específicos de gen (P) fue ligeramente menor que la de la WGA de control. Estos resultados confirman la capacidad de amplificar un gen diana utilizando la superposición de WGA y la amplificación específica de gen de una célula individual.

Estos datos también confirmaron que se puede utilizar una concentración de cebador de, como mínimo, 0,1 |j.M para amplificar un gen diana de una célula individual.

Para evaluar la amplificación del genoma completo, las muestras de WGA se hibridaron para confirmar el cariotipo de la célula individual utilizando la matriz EmbryoCellectTM de acuerdo con el protocolo EmbryoCellect™ TDS. Se obtuvieron resultados de aneuploidía correctos para todas las células individuales probadas (tabla 9).

Tabla 9: Resultados de la matriz EmbryoCellectTM para muestras de células individuales después de la

A continuación, los productos de WGA se analizaron para detectar la presencia de los genes diana en PCR específicas de gen. Se observó enriquecimiento de genes cuando se produjeron bandas del tamaño correcto, en comparación con la ausencia de bandas en el control (figura 3 y figura 4).

Estos resultados confirman la capacidad de amplificar una secuencia diana de interés durante una amplificación del genoma completo.

La capacidad de amplificar una secuencia diana de interés durante la amplificación del genoma completo proporciona una serie de ventajas. Por ejemplo, la capacidad de amplificar una secuencia diana proporciona ventajas, tales como una o más de (i) reducción de la posibilidad de pérdida de alelos cuando se utiliza la amplificación del genoma completo, (ii) capacidad mejorada de analizar una secuencia de ADN diana amplificada a partir de ADN amplificado del genoma completo, (iii) reducción del sesgo asociado con la amplificación de una secuencia de ADN diana amplificada a partir de ADN amplificado del genoma completo, (iv) reducción del número de ciclos de PCR para amplificar una secuencia de ADN diana a partir de ADN genómico, (v) una mejora en el tiempo para amplificar una secuencia de ADN diana específica a partir de ADN amplificado del genoma completo, y (vi) utilización reducida de consumibles y/o recursos humanos y/o costes reducidos.

EJEMPLO 3 - Enriquecimiento de la secuencia diana (TSE,taraetedsequence enrichment) del gen HBB Se realizó el análisis del enriquecimiento de la secuencia diana del gen HBB que codifica la beta-globina utilizando el protocolo, con el fin de confirmar, de forma adicional, la capacidad del protocolo para amplificar de forma eficaz otras secuencias diana, y también con el fin de evaluar el protocolo para su utilización en el cribado y/o diagnóstico genético, tal como la utilización del protocolo para el diagnóstico genético preimplantacional y el cribado genético preimplantacional.

Se llevó a cabo una amplificación del genoma completo y la amplificación dirigida al gen HBB combinadas utilizando dos conjuntos de cebadores utilizando muestras de múltiples células (5 células). A continuación, los productos de PCR se sembraron en dos PCR de HBB específicas; amplificando principalmente el exón 1 y 2, y amplificando el exón 3. Los amplicones de la segunda ronda de PCR de H<b>B se agruparon para generar una dilución final de 1:20 con el ADN del genoma completo amplificado con amplificación dirigida al gen HBB. Los productos de PCR solo de WGA, los productos de amplificación del genoma completo y de amplificación dirigida al gen HBB combinadas y el ADN agrupado diluido 1:20 se secuenciaron como muestras indexadas individualmente en una ejecución de MiSeq multiplex de 40 muestras; longitud de lectura de 2 x 75 pb. Los datos de secuenciación de próxima generación se alinearon bioinformáticamente con hg19. Se calculó la amplitud y profundidad del HBB para cada una de las muestras y se compararon. Se consiguió una profundidad de cobertura media de > 60x cuando se secuenció el ADN agrupado diluido 1:20.

La figura 5 muestra la amplitud de cobertura de HBB después de la amplificación del genoma completo y la amplificación dirigida a gen combinadas, en comparación con la amplificación del genoma completo sola utilizando secuenciación de próxima generación. Después de la amplificación del genoma completo y la amplificación dirigida a gen combinadas, los productos se sembraron en dos PCR de HBB específicas para el gen. Los amplicones de la segunda ronda de PCR se combinaron para generar una dilución final de 1:20 con el ADN amplificado del genoma completo con amplificación dirigida a gen. Se secuenciaron los productos de amplificación del genoma completo y amplificación dirigida a gen combinadas (WGA TSE) y el grupo diluido 1:20. Los datos de secuenciación de próxima generación se alinearon bioinformáticamente con hg19 y la cobertura se determinó a una profundidad de 1x para cada una de las muestras. El gráfico muestra que se consiguió amplitud de cobertura del 100 % del<h>B<b>cuando la dilución 1:20 de los productos específicos del gen de la segunda ronda de PCR de HBB se agruparon con las muestras amplificadas del genoma completo combinadas con amplificación dirigida a gen. Se representaron gráficamente los valores medios.

La figura 6 muestra un análisis de la profundidad de cobertura del gen HBB. Se consiguió una profundidad de cobertura media de HBB > 60x cuando se secuenció el ADN agrupado diluido 1:20. Esta es una profundidad adecuada para el análisis genético para la determinación de SNP.

La amplificación del genoma completo y la amplificación específica de secuencia combinadas se puede utilizar para conseguir una amplitud de cobertura del 100 % de la secuencia de ADN diana y aumentar la profundidad de cobertura adecuada para el análisis genético para la detección de SNP.

Además, también se ha demostrado en experimentos relacionados la multiplexación exitosa con hasta 4 conjuntos de cebadores.

EJEMPLO 4 - Enriquecimiento de la secuencia diana del gen para el complejo mayor de histocompatibilidad, Clase I, A

Se llevó a cabo el análisis del enriquecimiento de la secuencia diana que codifica la proteína del complejo mayor de histocompatibilidad, clase I, A, utilizando el protocolo, con el fin de evaluar más a fondo el protocolo para amplificar de manera eficaz otras secuencias diana y también con el fin de evaluar más a fondo el protocolo para su utilización en el cribado y/o diagnóstico genético, tal como el diagnóstico genético preimplantacional y el cribado genético preimplantacional.

Se realizó una amplificación del genoma completo y la amplificación dirigida al gen del antígeno leucocitario humano (HLA) combinadas utilizando muestras de múltiples células (5 células). A continuación, los productos de PCR se sembraron en una PCR de HLA específica de gen. Los amplicones de la segunda ronda de PCR de HLA se agruparon para generar una dilución final de 1:20 y 1:10 con el ADN del genoma completo amplificado mediante amplificación dirigida al gen HLA. Los productos de PCR solo de WGA, los productos de amplificación del genoma completo y de amplificación dirigida al gen HLA combinadas, el ADN agrupado diluido 1:20 y 1:10 y el amplicón de PCR de HLA de segunda ronda se secuenciaron como muestras indexadas individualmente en una ejecución de MiSeq multiplex de 40 muestras; longitud de lectura de 2 x 75 pb. Los datos de secuenciación de próxima generación se alinearon bioinformáticamente con hg19. Se calculó la amplitud y profundidad del HLA para cada una de las muestras y se compararon. Se consiguió una profundidad de cobertura media de HLA > 60x cuando se secuenciaron el ADN agrupado diluido 1:20 y 1:10 y el amplicón de la segunda ronda de PCR.

La figura 7 muestra la amplitud de cobertura para HLA después de la amplificación del genoma completo y la amplificación dirigida a gen combinadas, en comparación con la amplificación del genoma completo sola utilizando secuenciación de próxima generación. Después la amplificación del genoma completo y la amplificación dirigida a gen combinadas, los productos se sembraron en una PCR específica de HLA. Los amplicones de la segunda ronda de PCR se combinaron para generar una dilución final de 1:20 y 1:10 con el ADN amplificado del genoma completo mediante amplificación dirigida a gen. Se secuenciaron los productos de PCR solo de WGA, los productos de amplificación del genoma completo y de amplificación dirigida a gen combinadas, el ADN agrupado diluido 1:20 y 1:10 y el amplicón de la segunda ronda de PCR. Los datos de secuenciación de próxima generación se alinearon bioinformáticamente a hg19 y la cobertura del exón 2 y el exón 3 se determinó a una profundidad de 1x para cada una de las muestras. Se consiguió una profundidad de cobertura media de > 60x cuando se secuenciaron el ADN agrupado diluido 1:20 y 1:10 y el amplicón de la segunda ronda de PCR.

La figura 8 muestra un análisis de la profundidad de cobertura del gen HLA.

Se consiguió una profundidad de cobertura media de > 60x cuando se secuenciaron el ADN agrupado diluido 1:20 y 1:10 y el amplicón de la segunda ronda de PCR de HLA. Esta es una profundidad adecuada para el análisis genético para la detección de SNP.

EJEMPLO 5 - PGS de embriones

Una utilización del protocolo de enriquecimiento de genes diana descrito en el presente documento es el cribado genético preimplantacional de un embrión antes de su transferencia al útero.

El cribado requiere la extracción de una o varias células del embrión mediante biopsia. En la técnica se conocen procedimientos para extraer células de un embrión. A continuación, esta célula o células se colocan en un tubo y, debido a la cantidad limitada de ADN en el material de la biopsia, es necesario amplificar el ADN para generar suficiente ADN para la tecnología posterior.

El protocolo de enriquecimiento de la secuencia diana se puede utilizar, a continuación, para determinar el complemento cromosómico del embrión. Además, el protocolo de enriquecimiento de la secuencia diana se puede utilizar para el cribado genético preimplantacional del embrión de genes específicos y/u otros loci de interés.

EJEMPLO 6 - Protocolo generalizado, kits y productos

Un protocolo generalizado, que utiliza diversos kits, componentes e instrucciones, para llevar a cabo un enriquecimiento de la secuencia diana es el siguiente:

1. Contenido del kit

Un kit para llevar a cabo un enriquecimiento de la secuencia diana puede contener los siguientes componentes:

•H<2>O de calidad PCR

• Enzima de lisis celular

• Tampón de lisis celular

• Polimerasa

• Tampón de PCR

• Cebador DOP

2. Descripción general del protocolo

La amplificación del genoma completo (WGA) basada en PCR con cebadores oligonucleotídicos degenerados (DOP-PCR) genera una amplificación representativa del ADN total de células individuales o su equivalente de ADN. La WGA basada en DOP-PCR amplifica de forma reproducible el ADN total de células individuales para producir cantidades de microgramos de ADN amplificado en menos de 3 horas. El protocolo se puede utilizar con éxito tanto en entradas de ADN celular como de ADN genómico purificado.

El protocolo implica las siguientes etapas generales:

(i) Recolección de muestras

• Colocar la muestra en un tubo de PCR en <2 pl de tampón

• Marcar la posición de la muestra en el tubo

(ii) Lisis

• Añadir 3 pl de solución de lisis por encima de la muestra.

• Golpear suavemente el tubo de PCR para permitir que la solución de lisis se extienda sobre la muestra.

• Incubar durante 15 minutos de acuerdo con el programa de lisis

Se apreciará que en algunas circunstancias se puede omitir la etapa de lisis celular, lo que permite, por ejemplo, la utilización del protocolo en ADN libre de células, o que el protocolo se puede conseguir ingresando directamente al protocolo de amplificación utilizando una o más células y no teniendo una etapa de lisis discreta antes de la amplificación.

(iii) Amplificación del genoma completo y enriquecimiento de la secuencia diana

• Añadir 22 pl de mezcla maestra de PCR a la muestra lisada

• Llevar a cabo la PCR utilizando el programa de PCR de WGA y cebadores específicos de secuencia • Evaluar la WGA mediante electroforesis en gel de agarosa

3. Especificaciones de entrada

(i) Número de células

El protocolo descrito en el presente documento es adecuado para células individuales o su equivalente de ADN, así como para pequeñas cantidades de células (por ejemplo, <10 células).

(ii) Procedimiento de recolección de células

La clasificación por flujo, la dilución y la micromanipulación son procedimientos de recolección compatibles con el protocolo. Las células individuales deben transferirse a un tubo de PCR con un tampón de transferencia mínimo (<2 pl). La posición de la célula en el tubo debe marcarse con un punto en el exterior del tubo utilizando un marcador permanente para permitir una localización fácil de la célula para la etapa de lisis. (iii) Dilución del ADN

Se recomienda diluir el ADN a una concentración final de 30 pg/pl en Tris-HCl (pH 8,0) 10 mM (sin EDTA). (iv) Tampones compatibles

Los tampones de transferencia de células recomendados incluyen Tris-HCl (pH 8,0) 10 mM (sin EDTA) y PBS (libre de Mg2+, Ca2+ y libre de BSA).

4. Protocolos: Amplificación del genoma completo mediante DOP-PCR

(i) Lisis celular

En esta etapa opcional, las células se lisan y el ADN se vuelve soluble con la adición de una mezcla de lisis celular y una incubación corta en un termociclador de PCR.

Consumibles:

• Tubos de PCR estériles de 0,2 ml o 0,5 ml

• H<2>O de calidad PCR

• Enzima de lisis celular

• Tampón de lisis celular

• Muestras de células o ADN

Preparación:

• Retirar el H<2>O de calidad PCR y el tampón de lisis celular del almacenamiento y descongelarlos hasta temperatura ambiente.

• Retirar la enzima de lisis celular del almacenamiento y almacenarla en un bloque frío a 4 oC

• Mezclar bien los reactivos y, a continuación, centrifugar brevemente para recoger el contenido en el fondo del tubo.

• Calcular los volúmenes de reactivos necesarios para la mezcla de lisis celular.

Procedimiento:

Preparar la de la enzima de lisis celular dilución 1en un bloque frío a 4 oC combinando los siguientes reactivos:

Mezclar bien y, a continuación, centrifugar brevemente.

Preparar la mezcla de lisis celular en un bloque frío a 4 oC para la cantidad requerida de reacciones combinando los siguientes reactivos:

Etapas para la lisis de muestras de células individuales o múltiples:

(a) Añadir 3 |j.l de mezcla de lisis celular por encima de la muestra de células situada en un tubo de PCR. Asegurarse de que la mezcla de lisis se deslice sobre la posición de la muestra, tal como está marcado en el tubo, golpeando suavemente el tubo sobre la mesa. No mezclar ni agitar en vórtice.

(b) Centrifugar brevemente en una minicentrífuga si es necesario para recoger el contenido en el fondo del tubo.

(c) Repetir con otras muestras.

Etapas para la preparación del control sin plantilla (NTC,no témplate control):

(a) Añadir 3 |j.l de mezcla de lisis celular a 1 tubo de PCR estéril marcado como NTC.

(b) Añadir 1 |j.l de H<2>O de calidad PCR al tubo etiquetado como NTC.

Etapas para la preparación de la muestra de ADN antes de la PCR de WGA (si se requiere):

(a) Añadir 3 |j.l de mezcla de lisis celular a la cantidad necesaria de tubos de PCR vacíos estériles.

(b) Añadir 1 |j.l de muestra de ADN 30 pg/^l a cada tubo que contenga mezcla de lisis celular. Proceder a la siguiente etapa.

Incubar todas las muestras y NTC en un termociclador programado de la siguiente manera:

Colocar las muestras lisadas en un bloque frío.

(ii) Amplificación del genoma completo y enriquecimiento de la secuencia diana

En esta etapa se crea una mezcla maestra y se añade a las muestras lisadas antes de la amplificación del genoma completo (WGA) basada en PCR de cebadores oligonucleotídicos degenerados (DOP-PCR). Esto genera una amplificación representativa del ADN total de las células o su equivalente de ADN.

Consumibles:

• Tubo de 1,5 ml

• H<2>O de calidad PCR

• Tampón de PCR de WGA

• Cebador DOP

• Polimerasa de WGA

• Muestras lisadas y NTC (de lisis celular)

• Cebadores específicos de secuencia

Es posible utilizar una variedad de diferentes cebadores DOP. Entre los ejemplos de cebadores DOP se incluyen cebadores DOP que tienen una parte de su secuencia de nucleótidos que permite la posibilidad de más de una base en una posición particular, y también se pueden utilizar cebadores DOP que pueden formar pares de bases con una o más bases adicionales.

Preparación:

• Diluir los cebadores específicos de secuencia a la concentración requerida en el H<2>O de calidad PCR suministrado por el usuario.

• Retirar el H<2>O de calidad PCR, el tampón de PCR de WGA y el cebador del almacenamiento y descongelar hasta temperatura ambiente.

• Retirar la polimerasa de WGA del almacenamiento y guardarla en un bloque frío a 4 oC.

• Mezclar bien los reactivos y, a continuación, centrifugar brevemente para recoger el contenido en el fondo del tubo.

• Calcular los volúmenes de reactivos necesarios para la mezcla maestra de WGA.

Procedimiento:

• Preparar la mezcla maestra de WGA para la cantidad requerida de reacciones combinando los siguientes reactivos en un tubo de 1,5 ml en el orden en que se enumeran a continuación:

• Mezclar bien y, a continuación, centrifugar brevemente en una minicentrífuga.

• Transferir 22 pl de mezcla maestra de PCR a tubos individuales que contengan la plantilla lisada (muestra o NTC en mezcla de lisis celular). Para evitar la eliminación de ADN de la muestra, no insertar la punta de la pipeta en la mezcla de muestra lisada. No mezclar ni agitar con vórtice los tubos de PCR. Centrifugar brevemente o girar en una minicentrífuga para recoger el contenido en el fondo del tubo.

• Transferir 22 pl de mezcla maestra de PCR a los tubos individuales que contienen la plantilla de ADN en la mezcla de lisis celular. Para evitar la eliminación de ADN de la muestra, no insertar la punta de la pipeta en la mezcla de muestra lisada. Mezclar bien y, a continuación, centrifugar brevemente para recoger el contenido en el fondo del tubo.

• Incubar todas las muestras y NTC en un termociclador programado de la siguiente manera:

(iii)) Etapas para diluir cebadores específicos de secuencia antes de la WGA con PCR de TSE

Procedimiento:

•Se recomienda que cada conjunto de cebadores esté optimizado para su utilización en la PCR de WGA utilizando una plantilla de ADNg de 30 pg.

• Diluir los cebadores específicos de secuencia a la concentración de solución de trabajo requerida con H<2>O de calidad PCR.

• Como guía, titular la concentración del cebador utilizando concentraciones de solución de trabajo de 2 uM, 5 uM y 10 uM. Confirmar el enriquecimiento de la secuencia mediante PCR semicuantitativa (un número bajo de ciclos de PCR, en la que la banda diana es solo visible en un gel. No ejecutar la PCR hasta la fase de meseta) o un procedimiento alternativo, para finalizar la concentración óptima de cebador en la solución de trabajo.

• A modo de ejemplo, se puede utilizar una PCR anidada dirigida a las regiones diana para confirmar que se ha producido el enriquecimiento de la secuencia diana.

• La confirmación de que se ha utilizado la concentración óptima de cebador también se proporciona ejecutando los productos de WGA sobre un gel de agarosa para garantizar que los amplicones de PCR tengan el tamaño y la cantidad típicos para la WGA DOPlifyTM.

• En la etapa de mantenimiento “hold” durante el programa PCR, transferir 1,4 pl de cebador 5' (directo) y 1,4 pl de cebador 3' (inverso) a cada tubo que contenga la plantilla de ADN en la mezcla de WGA. El volumen de todos los cebadores de un conjunto multiplexado añadido a la muestra no debería superar los 2,8 pl en total. Para evitar la eliminación de cualquier muestra de ADN, no insertar la punta de la pipeta en la mezcla de muestra. En su lugar, pipetear los cebadores en el lateral del tubo de PCR, justo por encima del nivel de la mezcla maestra de muestra.

• Centrifugar brevemente para recoger el contenido en el fondo del tubo.

• Reanudar el programa de PCR de WGA.

• Una vez finalizada la PCR, almacenar el ADN a 4 oC a corto plazo o bien a -20 oC a largo plazo.

• La calidad del ADN de WGA se puede evaluar, por ejemplo, mediante electroforesis en gel. Los productos de ADN de WGA deberían aparecer como una mancha de productos, en un intervalo de entre 200 pb y 2.000 pb. El NTC debe verse limpio, con presencia de dímeros de cebadores.

• Una amplificación WGA que ha fallado se indica por la presencia de dímeros de cebadores, pero no hay evidencia de productos de amplificación más grandes.

• Una amplificación deficiente de WGA se indica mediante frotis con menor intensidad o con productos de PCR que son notablemente más grandes o más pequeños que el intervalo de tamaños esperado observado para las otras muestras en el mismo gel de agarosa.

• Confirmación del enriquecimiento de la secuencia diana utilizando PCR específica de secuencia y ADN del genoma completo amplificado como plantilla de PCR. Un gel de agarosa mostrará una amplificación enriquecida de la secuencia diana debido a la adición de cebadores específicos de gen a la PCR de WGA en comparación con el control.

Además, se debe tener en cuenta que, tal como se utilizan en el presente documento, las formas singulares “un”, “una” y “el”, “la” incluyen aspectos plurales a menos que el contexto ya indique lo contrario.

A lo largo de la presente memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra “comprender”, o variaciones, tales como “comprende” o “que comprende”, se entenderá que implican la inclusión de un elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros indicados, pero no la exclusión de cualquier otro elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros.

La referencia al estado de la técnica anterior en la presente memoria descriptiva no es, y no debe tomarse como, un reconocimiento o cualquier forma de sugerencia de que esta técnica anterior forma parte del conocimiento general común en cualquier país.

Todos los procedimientos descritos en el presente documento se pueden llevar a cabo en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o el contexto lo contradiga claramente.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para amplificar una secuencia de ADN diana a partir de ADN genómico, comprendiendo el procedimiento amplificar el ADN genómico mediante la reacción en cadena de la polimerasa con uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados y, posteriormente, amplificar el ADN genómico amplificado con el uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados en presencia de uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana, en el que la amplificación con el uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados comprende la amplificación con el uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados durante 1 a 8 ciclos con una temperatura de hibridación de 20 oC a 35 oC, y la posterior amplificación comprende la amplificación durante 5 a 25 ciclos con una temperatura de hibridación de 52 oC a 65 oC, amplificando, de este modo, la secuencia de ADN diana.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados comprenden una secuencia de nucleótidos que comprende de 6 a 12 nucleótidos aleatorios contiguos.

3. Procedimiento, según las reivindicaciones 1 o 2, en el que el procedimiento comprende una concentración del uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados de 0,1 a 4 pMI.

4. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el procedimiento comprende una concentración del uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana de 0,05 a 4 pMI.

5. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el uno o más cebadores específicos de la secuencia de ADN diana comprenden una temperatura de fusión de 50 oC a 64 oC y un contenido de GC del 18 % al 65 %.

6. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el procedimiento comprende una cantidad de ADN genómico a amplificar de 1 pg a 6 ng.

7. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el procedimiento comprende una o más rondas adicionales de amplificación de la secuencia de ADN diana amplificada con cebadores específicos de la secuencia de ADN diana adicionales.

8. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el ADN genómico comprende ADN de una o más células embrionarias, ADN de un ovocito o un cuerpo polar del mismo, ADN de esperma, ADN de una o más células germinales, ADN de una o más células somáticas, ADN de una o más células humanas o animales, ADN de una o más células vegetales, ADN de una o más células de un microorganismo, ADN de una o más células para el cribado de una enfermedad, ADN de una o más células cancerosas, ADN para pruebas forenses, a Dn mitocondrial, ADN extracromosómico, ADN libre de células, ADN de una muestra que comprende una o más células, ADN de una muestra que comprende ADN libre de células, ADN de un lisado de células, ADN de una biopsia, ADN de una muestra de tejido, ADN de una muestra de células, ADN de un fluido corporal, ADN de una muestra de sangre, ADN de líquido amniótico, ADN de una muestra fijada con formalina, ADN de una muestra incluida en parafina y ADN de un hisopo.

9. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el ADN genómico comprende ADN de una célula individual.

10. Utilización de un kit para llevar a cabo un procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, comprendiendo el kit uno o más cebadores oligonucleotídicos degenerados, uno o más cebadores para amplificar una secuencia de ADN diana y, de forma opcional, uno o más reactivos y/o instrucciones para amplificar la secuencia de ADN diana durante la amplificación del genoma completo.