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ES3032333T3 - The in vivo use of chondroitinase and/or hyaluronidase to enhance delivery of an agent - Google Patents

The in vivo use of chondroitinase and/or hyaluronidase to enhance delivery of an agent

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Publication number
ES3032333T3
ES3032333T3 ES17790648T ES17790648T ES3032333T3 ES 3032333 T3 ES3032333 T3 ES 3032333T3 ES 17790648 T ES17790648 T ES 17790648T ES 17790648 T ES17790648 T ES 17790648T ES 3032333 T3 ES3032333 T3 ES 3032333T3
Authority
ES
Spain
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chondroitinase
antigen
hyaluronidase
protein
administration
Prior art date
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Active
Application number
ES17790648T
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English (en)
Inventor
Trevor Smith
Nina Schommer
Kate Broderick
Bryan Yung
Katherine Schultheis
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Inovio Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Inovio Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

Se describen aquí métodos para administrar un agente a un sujeto. También se describen aquí métodos para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto. Los métodos pueden incluir la administración al sujeto de un polipéptido de condroitinasa o un polinucleótido que codifica un polipéptido de condroitinasa en una cantidad suficiente para degradar los glicosaminoglicanos, y la administración del agente al sujeto. Los métodos pueden incluir además la administración de un polipéptido de hialuronidasa o un polinucleótido que codifica una hialuronidasa. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Usoin vivode condroitinasa y/o hialuronidasa para mejorar la administración de un agente
Referencia cruzada aplicaciones relacionadas
Esta solicitud reivindica prioridad sobre la solicitud provisional estadounidense n. ° 62/329,593, presentada el 29 de abril de 2016, la solicitud provisional estadounidense n. °62/336,501, presentada el 13 de mayo de 2016, y la solicitud provisional estadounidense n. ° 62/488,605, presentada el 21 de abril de 2017.
Campo
La presente invención se refiere a un plásmido de ADN que codifica un anticuerpo monoclonal para su uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad o trastorno en un individuo, en combinación con condroitinasa AC o condroitinasa ABC, comprendiendo el procedimiento:
administrar al individuo condroitinasa AC o condroitinasa ABC antes o simultáneamente con el plásmido de ADN que codifica un anticuerpo monoclonal, y
administrar el plásmido de ADN por medio de electroporación.
Introducción
Los glicosaminoglicanos (GAG) son polisacáridos lineales complejos de la matriz extracelular (MEC). Los glicosaminoglicanos se caracterizan por repetir estructuras disacáridas de una hexosamina N-sustituida y un ácido urónico (en, por ejemplo, hialuronano (HA), condroitín sulfato (CS), condroitina (C), dermatán sulfato (DS), heparán sulfato (HS), heparina (H)) o una galactosa (en, por ejemplo, queratán sulfato (KS)). Excepto el hialuronano, todos existen unidos covalentemente a las proteínas del núcleo. Los glicosaminoglicanos con sus proteínas centrales se denominan estructuralmente proteoglicanos (PG).
Los proteoglicanos de condroitín sulfato (CSPG) son componentes principales de las matrices extracelulares y tienen diversos papeles funcionales. Por ejemplo, los CSPG suelen ser secretados por las células y son componentes estructurales de diversos tejidos humanos, incluido el cartílago, y se sabe que intervienen en determinados procesos celulares, tales como la adhesión celular, el crecimiento celular, la unión a receptores, la migración celular y la interacción con otros constituyentes de la matriz extracelular. Estos otros constituyentes de la matriz extracelular pueden ser laminina, fibronectina, tenascina y/o colágeno. El hialuronano es también uno de los principales componentes de la matriz extracelular, especialmente en los tejidos conjuntivos blandos. En el tejido conjuntivo, el agua de hidratación asociada al ácido hialurónico crea espacios entre los tejidos, para de este modo crear un entorno propicio para el movimiento y la proliferación celular. El hialuronano desempeña un papel clave en fenómenos biológicos asociados a la motilidad celular, tal como el desarrollo rápido, la regeneración, la reparación, la embriogénesis, el desarrollo embriológico, la cicatrización de heridas, la angiogénesis, la regulación celular, el desarrollo celular, la diferenciación celular y la migración celular. La producción de hialuronano aumenta en las células proliferantes y puede tener un papel en la tumorigénesis.
El documento FLINGAI SELEEKE et al., SCIENTIFIC REPORTS, vol. 5, 12616 (2015) se refiere a la protección contra la enfermedad del dengue por medio de profilaxis/inmunoterapia con anticuerpos de ácidos nucleicos sintéticos.
El documento XIA YONGZHI et al., NEUROSCI LETT, vol. 590, 74-79 (2015) se refiere al ADNc de vimentina antisentido combinado con condroitinasa ABC que puede promover la regeneración de los axones y la recuperación funcional tras una lesión de la médula espinal en ratas.
La matriz extracelular incluye proteínas y moléculas de polisacáridos, ensambladas en una red densa y organizada en el espacio extracelular de la mayoría de los tejidos. Como uno de los principales componentes de la matriz extracelular, los CSPG y el hialuronano ejercen influencia sobre las características de la matriz extracelular por medio de sus propiedades de formación de soluciones viscosas. Sigue existiendo la necesidad en la técnica de un medio para atravesar tejidos y matrices extracelulares para administrar un agente a un individuo de forma segura, rentable y eficaz.
Sumario
La invención se define en el conjunto de reivindicaciones adjunto. La descripción puede contener información técnica adicional, que aunque no forma parte de la invención reivindicada, se proporciona para situar la invención en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. Las referencias a procedimientos de tratamiento en los párrafos posteriores de esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en dichos procedimientos. Aspectos de la invención incluyen agentes para su uso en procedimientos de administración de dichos agentes a un individuo, en los que los procedimientos comprenden administrar al individuo un polipéptido de condroitinasa o un polinucleótido que codifica un polipéptido de condroitinasa en una cantidad suficiente para degradar un proteoglicano de sulfato de condroitina (CSPG), y administrar el agente al individuo. El CSPG puede ser, por ejemplo, Aggrecan (CSPG1), Versican (CsPg2), Neurocan (CSPG3), CSPG4 (proteoglicano de condroitín sulfato asociado a melanoma, NG2), CSPG5, SMC3 (CSPG6, mantenimiento estructural del cromosoma 3), Brevican (CSPG7), CD44 (CSPG8, clúster de diferenciación 44), Phosphacan, o combinaciones de los mismos. Específicamente, la invención es un plásmido de ADN que codifica un anticuerpo monoclonal para su uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad o trastorno en un individuo, en combinación con condroitinasa AC o condroitinasa ABC, comprendiendo el procedimiento:
administrar al individuo condroitinasa AC o condroitinasa ABC antes o simultáneamente con el plásmido de ADN que codifica un anticuerpo monoclonal, y
administrar el plásmido de ADN por medio de electroporación.
El agente puede provocar una respuesta inmunitaria o potenciar una respuesta inmunitaria en un individuo.
Otros aspectos de la invención incluyen agentes para su uso en procedimientos de tratamiento de una enfermedad o trastorno en un individuo, en los que los procedimientos comprenden administrar al individuo un polipéptido de condroitinasa o un polinucleótido que codifica un polipéptido de condroitinasa; y administrar al individuo el agente.
En cualquiera de los procedimientos de la divulgación descritos en el presente documento, el agente puede ser un polinucleótido, un polipéptido, una molécula pequeña o una combinación de los mismos, por ejemplo. En la invención, el agente es un plásmido de ADN. El plásmido de ADN codifica un anticuerpo monoclonal. Como parte de la divulgación, el agente puede comprender un polipéptido. El polipéptido puede comprender un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo monoclonal puede expresarsein vivo.En la invención, el agente se administra al individuo por medio de electroporación. En la invención, la condroitinasa es la condroitinasa AC o la condroitinasa ABC.
El polipéptido de condroitinasa y el anticuerpo monoclonal pueden estar codificados por el mismo polinucleótido o polinucleótidos separados. El polinucleótido que codifica el polipéptido de condroitinasa y el polinucleótido que codifica el anticuerpo monoclonal pueden estar comprendidos en el mismo vector o en vectores separados.
En cualquiera de los procedimientos descritos en la presente memoria, el polipéptido de condroitinasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de condroitinasa puede administrarse al individuo antes de la administración del agente. El polipéptido de condroitinasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de condroitinasa puede administrarse al individuo al menos entre 15 minutos y 24 horas antes de la administración del agente. El polipéptido de condroitinasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de condroitinasa y el agente pueden administrarse al individuo simultáneamente. El polipéptido de condroitinasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de condroitinasa y el agente pueden administrarse al individuo por vía subcutánea o intramuscular. El polipéptido condroitinasa o el polipéptido condroitinasa codificado por el polinucleótido hidroliza CSPG y conduce a la desorganización de una matriz extracelular del individuo.
Otros aspectos de la invención incluyen también administrar un polipéptido de hialuronidasa o un polinucleótido que codifica un polipéptido de hialuronidasa en cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento en una cantidad suficiente para degradar un glucosaminoglicano. El glicosaminoglicano puede comprender hialuronano. El polipéptido de hialuronidasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de hialuronidasa puede administrarse al mismo tiempo que la condroitinasa. El polipéptido de hialuronidasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de hialuronidasa puede administrarse al individuo antes de la administración del agente. El polipéptido de hialuronidasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de hialuronidasa puede administrarse al individuo al menos entre unos 15 minutos y unas 24 horas antes de la administración del agente. El polipéptido de hialuronidasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de hialuronidasa y el agente pueden administrarse al individuo simultáneamente. El polipéptido de hialuronidasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de hialuronidasa y el agente pueden administrarse al individuo por vía subcutánea o intramuscular.
El polipéptido de condroitinasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de condroitinasa, y el agente pueden coformularse antes de la administración. El polipéptido de condroitinasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de condroitinasa, el polipéptido de hialuronidasa o un polinucleótido que codifica un polipéptido de hialuronidasa, y el agente pueden coformularse antes de la administración.
La divulgación proporciona otros aspectos y realizaciones que serán aparentes a la luz de la siguiente descripción detallada y de las Figuras que la acompañan.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1muestra los niveles (ng/ml) de hIgG medidos por ELISA entre los días 0-7 en los grupos 1 a 4 (ratones Balb/c, 6-7 semanas). Grupo 1 (gris) PBS y pGX9214, grupo 2 pretratamiento con hialuronidasa y pGX9214 (azul), grupo 3 condroitinasa y pGX9214 (verde), grupo 4 pretratamiento con hialuronidasa/condroitinasa y pGX9214 (marrón).
Figura 2muestra los niveles (ng/ml) de hIgG medidos por ELISA entre los días 0-7 en los grupos 1 a 4 (C57BL/6, 6-7 semanas). Grupo 1 (gris) PBS y pGX9214, grupo 2 pretratamiento con hialuronidasa y pGX9214 (azul), grupo 3 condroitinasa y pGX9214 (verde), grupo 4 pretratamiento con hialuronidasa/condroitinasa y pGX9214 (marrón).
Figura 3muestra los niveles (ng/ml) de hIgG medidos por ELISA entre los días 0-21 en los grupos 1 a 4. Grupo 1 (gris) PBS y pGX9214, grupo 2 pretratamiento con hialuronidasa y pGX9214 (rojo oscuro), grupo 3 condroitinasa y pGX9214 (rojo brillante), grupo 4 pretratamiento con hialuronidasa/condroitinasa y pGX9214 (rosa - cobaya de Hartley).
Figura 4muestra los niveles (ng/ml) de hIgG medidos por ELISA entre los días 0-21 en cobayas individuales de los grupos 1 a 4. Figura 4A: Grupo 1 PBS. Figura 4B: pretratamiento con hialuronidasa del grupo 2 con 400U/ml. Figura 4C: condroitinasa del grupo 3 (0,5U/ml). Figura 4D: grupo 4 pretratamiento con hialuronidasa 400U/ml y condroitinasa 0,5U/ml.
Figura 5muestra que la condroitinasa potencia la expresión de hlgG codificada por plásmido en ratones Balb/c. (a) Los niveles de hIgG [ng/ml] medidos por ELISA entre los días 0-7 en los grupos 1 y 2 (ratones Balb/c, 6-7 semanas). Grupo 1 (gris) PBS y pGX9214, grupo 2 pretratamiento con condroitinasa y pGX9214 (negro). (b) Aumento significativo de la hIgG por la condroitinasa en el día 7. Estadística realizada mediante la prueba de Mann Whitney, P = 0,0079.
Figura 6muestra que la condroitinasa potencia la expresión de hIgG codificada por plásmido en ratones C57BL/6. (a) Los niveles de hIgG [ng/ml] medidos por ELISA entre los días 0-7 en los grupos 1 y 2 (ratones Balb/c, 6-7 semanas). Grupo 1 (gris) PBS y pGX9214, grupo 2 pretratamiento con condroitinasa y pGX9214 (negro). (b) Aumento significativo de la hIgG por la condroitinasa en el día 7. Estadística realizada mediante la prueba de Mann Whitney, P = 0,0079.
Figura 7muestra una investigación de la capacidad de diferentes versiones de condroitinasa para potenciar la expresión de DMAb. El gráfico representa los niveles de hIgG (ng/ ml) medidos por ELISA el día 7 en los grupos 1-4 (Balb/c). Los ratones fueron tratados con PBS (grupo de control 1), condroitinasa AC, condroitinasa ABC de grado clínico o la proteína recombinante GALNS. Todos los grupos recibieron una inyección de pGX9203 seguida de electroporación. Estadísticas realizadas mediante la prueba de Kruskal-Wallis, **P = 0,0026.
Figura 8muestra que el aumento de la dosis de condroitinasa ABC mejora aún más la expresión de proteínas basadas en ADN. Los ratones Balb/c fueron tratados con dosis crecientes de condroitinasa ABC 30 minutos antes de la inyección de ADNp (pGX9207) y la electroporación. Los niveles de hIgG se midieron por medio de ELISA. Estadísticas realizadas por medio de la prueba de Kruskal-Wallis, *P = 0,0357.
Figura 9muestra que la administración de condroitinasa produce una mayor expresión de la proteína fluorescente. (a) Extremidades posteriores izquierda y derecha de ratones Balb/c tratados con Condroitinasa o PBS en el músculo esquelético. La visualización de la expresión de la proteína reportera se realizó mediante un generador de imágenes de fluorescencia (Protein Simple). (b) Unidades arbitrarias de intensidad de fluorescencia paralelas a la expresión del gen informador y cuantificadas mediante el software AlphaView SA. Estadística realizada mediante la prueba de Mann Whitney, P = 0,0022.
Figura 10muestra histopatología representativa de músculo esquelético murino de miembro posterior realizada por medio de tinción H&E. Los paneles superiores muestran tejido tratado sólo con PBS (control) o sólo con Condroitinasa ABC. En las figuras inferiores se presentan los músculos pretratados (30 min) con condroitinasa o PBS (control) antes de la administración de ADNp. Los resultados se analizaron por medio de un escáner de diapositivas y el software CaseViewer (3DHISTECH). Escala = 200 pm.
Figura 11muestra que la condroitinasa ABC potencia la expresión de hIgG codificada por plásmido en conejos de Nueva Zelanda (9 semanas). (a) Se presentan los niveles de hIgG [ng/ml] medidos por ELISA entre los días 0 y 6 en el grupo 2 (tratado con condroitinasa, gris) y en el grupo 1 (control con PBS, negro). (b) El gráfico muestra los niveles de hIgG a partir del día 6 medidos por ELISA. Estadística realizada por medio de la prueba de Mann Whitney, P = 0,0043.
Figura 12muestra la coformulación de condroitinasa con ADNp (pGX9207) en ratones (Balb/c; 14 ratones por grupo). El gráfico muestra los niveles de hIgG [ng/ml] a partir del día 6 medidos por ELISA. Estadísticas realizadas por medio de la prueba de Mann Whitney, ****P < 0,0001.
Figura 13muestra que la administración de condroitinasa produce una mayor expresión de la proteína fluorescente. (a) Extremidades posteriores izquierda y derecha de ratones Balb/c tratados con Condroitinasa o PBS en el músculo esquelético. La visualización de la expresión de la proteína reportera se realizó por medio de un sistema de imágenes de fluorescencia. (b) Unidades arbitrarias de intensidad de fluorescencia paralelas a la expresión del gen informador y cuantificadas por medio del software AlphaView SA. Estadísticas realizadas por medio de la prueba de Mann Whitney, **P = 0,0004.
Figura 14muestra la coformulación de condroitinasa con ADNp (pGX9207) en conejos (conejos de Nueva Zelanda; 6 conejos por grupo). (a) El gráfico muestra los niveles séricos de hIgG [ng/ml] desde el día 0 hasta el día 5 medidos por ELISA. Comparación de los grupos 1, 2 y 4. (b) Niveles de hIgG en suero de conejo de todos los grupos medidos en el día 5. Estadísticas realizadas por medio de la prueba de Mann Whitney, ****P < 0,0001.
Figura 15muestra la electroforesis en gel de agarosa de muestras coformuladas con condroitinasa (2,5 U/ ml)/ADNp (pGX9207, 250 ng por pocillo). (a) Los carriles con números pares presentan muestras de ADNp que contienen Condroitinasa ABC, los carriles con números impares se refieren a controles negativos de PBS. Carriles 1-2: Sin incubación de la muestra antes de la electroforesis en gel, carriles 3-4: incubación a RT (210C) durante 10 min, carriles 5-6: 6°C, 120 min, carriles 7-8: RT, 120 min, carriles 9-10: 6°C, 24 h, carriles 11-12: RT, 24 h, carriles 13-14: 6°C, 10 min. M1 = marcador. (b) Escala de ADN superenrollado, 2-10 kb (New England Biolabs).
Figura 16muestra que el almacenamiento de condroitinasa/coformulación de ADNp durante 24 horas no afecta a la expresión génica mejorada en ratones Balb/c. El gráfico representa los niveles séricos de hIgG (ng/ ml) medidos mediante ELISA el día 6. Se trató a los ratones con coformulaciones en el músculo esquelético de la extremidad posterior izquierda y se realizó la electroporación tras 1 min de inyección del fármaco. Antes de los tratamientos, las muestras de coformulación se incubaron a 10 min, 120 min y 24 horas a 40C. Controles: Los ratones fueron pretratados con condroitinasa o PBS 30 minutos antes de la administración del ADNp y la electroporación. Estadísticas realizadas por medio de la prueba de Kruskal-Wallis, ****p = 0,0001.
Figura 17muestra los niveles (ng/ml de hIgG medidos por ELISA entre los días 0-28 en los grupos 1, 2 y 3. El Grupo 1 fue tratado con pDVSF-1 y pretratamiento con hialuronidasa, el Grupo 2 fue tratado sólo con pDVSF y el Grupo 3 fue tratado sólo con PBS.
Figura 18muestra los títulos de unión anti-hIgG de los grupos 1 y 2.
Figura 19muestra la respuesta media (+/- SEM) de IFN-y (puntos por millón) en PBMCs de los grupos 1-3 a las mezclas de péptidos de Influenza NP del Ejemplo 2.
Figura 20muestra los títulos de unión de IgG anti-Influenza NP para los grupos 1-3 en el Ejemplo 2.
Figura 21muestra el modelo deP. aeruginosaneumonía aguda. La electroporación de ADN plasmídico anti-PcrV o DMAb-anticuerpo 1-2 produce la expresión de IgG activa en ratones. Potente actividad protectora observada tanto para los DMAbs antipseudomonas como para el anticuerpo DMAb 1-2 IgG.
Figura 22muestra la cuantificación de IgG de la expresión de DMAb en suero. Se evaluó la expresión de DMAb en suero antes de la infección por P aeruginosa. A pesar de perfiles de supervivencia similares, la expresión de DMAb anti-PcrV fue 5 veces mayor que la de DMAb-anticuerpo1-2.
Figura 23muestra la reducción de la carga orgánica por medio de DMAbs antipseudomonas. Los anticuerpos DMAb1-2 e IgG reducen la carga en el pulmón. Los anticuerpos anti-PcrV y DMAb1-2 reducen significativamente la propagación sistémica de las bacterias. Tejidos recogidos 24 horas después de la infección. LOD = límite de detección; * = P<0,05 por Kruskal-Wallis y prueba de comparación múltiple de Dunn frente a IgG DMAb de control.
Figura 24muestra la histología de la neumonía aguda a las 48 horas postinfección (H&E). A. Los pulmones IgG de control muestran áreas de infiltrados alveolares graves compuestos por neutrófilos y macrófagos y hemorragia (10x). C. Neumonía leve y restos bronquiolares ocasionales (10x). E. DMAb-anticuerpo1-2 ADN grupo con alveolitis leve (10x). B, D, F. Recuadros a 40x de A. C. D., respectivamente.
Figura 25muestra que el DMAb-anticuerpo-2 presenta una actividad protectora dependiente de la concentración. A. Los animales recibieron ADN en 1, 2 o 3 sitios antes de la PE. B. Cuantificación de IgG en suero. * indica P<0,05 mediante la prueba Log-Rank.
Figura 26muestra que las dosis subterapéuticas de DMAb-anticuerpo1-2 y meropenem (MEM) muestran una mayor actividad frente a la neumonía por P aeruginosa. Los animales recibieron ADN en 1,2 o 3 sitios antes de la PE. B. Cuantificación de IgG en suero. * indica P<0,05 mediante la prueba Log-Rank.
Figura 27muestra la respuesta media (+/- SEM) de IFN-y (puntos por millón) en esplenocitos a los epítopos peptídicos NP55 y NP147 14 días después de la inmunización con pGX2013.
Figura 28muestra los títulos de unión de IgG anti-NP para los grupos 7 y 14 días después de la inmunización con pGX2013.
Figura 29muestra la expresiónin vitrode IgG humana anti-MERS-CoV. (a) Ilustración diagramática del ADN plasmídico pMERS del antígeno DMAb anti-MERS-CoV. Promotor del CMV situado corriente arriba de las secuencias de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, separadas por sitios de escisión furina y 2A. (b & c) Se transfectaron cultivos de células 293T con 1 pg/ml de pVax o pMERS y se recogieron los sobrenadantes de los cultivos al cabo de 48 horas. (b) Los niveles de IgG humana en el sobrenadante se analizaron por medio de ELISA. (c) La unión de IgG al antígeno del CoV MERS se midió por medio de ELISA.
Figura 30muestra una expresión in vivo mejorada de DMAb en ratones BALB/cSe administraron de 25 a 100 pg de pMERS en el músculo TA de ratones BALB/c (4-8 ratones por grupo), (a) solo por inyección (Sin EP), (b) inyección con EP (EP) y (c) inyección con EP en músculo tratado con HYA(EP HYA). (a-c) Se cuantificaron los niveles séricos de IgG humana (los puntos de datos representan la Media+/-SEM) por medio de ELISA el día 6 tras la administración de pMERS. (d) Unión al antígeno del CoV MERS de diluciones recíprocas de suero medidas por medio de ELISA el día 0 y el día 6 tras la administración de pMERS. (e) Los músculos TA de ratones BALB/c se cosecharon 72 horas después de la administración del gen reportero pRFP (25 pg) con el protocolo empleado en (a), (b) o (c) o sin tratamiento en los insertos 1-4, respectivamente. Las imágenes ilustran la expresión del gen reportero. Imágenes de inmunofluorescencia de secciones del músculo TA tratadas con pMERS o pVax (100 pg) administrado con EP HYA, y recogidas 72 horas después (f). La hIgG se detectó con IgG antihumana seguida de un anticuerpo secundario marcado con FITC (verde). Tinción DAPI en azul. Panel 1. Sin tratamiento Panel 2. pVax. Paneles 3 y 4. pMERS. Los paneles 1-3 muestran una imagen transversal perpendicular a las fibras musculares, y en el panel 4 la imagen es a lo largo de las fibras musculares.
Figura 31muestra una expresión aumentada y sostenida de DMAb en ratones Crl:Nu-Foxn1nu. Se administraron de 6,25 a 100 pg de pMERS con EP en el músculo TA pretratado con HYAde ratones Crl:Nu-Foxn1nu (8 ratones por grupo). La hIgG sérica se cuantificó por medio de ELISA en los días 0 a 160 (a). (b) Se administraron 100 pg de pMERS como en (a) al músculo 1 (TA izquierdo), 2 (TA derecho e izquierdo), 3 (TA derecho e izquierdo, y Quad izquierdo) o 4 (TA derecho e izquierdo, y Quad izquierdo y derecho). La hIgG sérica se cuantificó por medio de ELISA el día 21.
Figura 32muestra la expresiónin vivode DMAb en el conejo blanco de Nueva Zelanda. (a) Expresión del gen informador en secciones de músculo TA de conejo 72 horas después de la administración de pGFP (0,2 mg) con EP en músculo tratado con PBS- (panel superior) o HYA- (panel inferior). (b&c) Se administraron 2 mg de pMERS con EP en el músculo Quad (pretratado con PBS o HYA) de conejos (6 por grupo). Se cuantificó la hIgG sérica los días 3, 5 y 6 (a), y se midió la unión al antígeno del CoV del MERS (b) por medio de ELISA el día 6 después del parto. (c) Se administraron 2 mg de pMERS con EP a un ajuste de voltaje de 20 a 65 V en el músculo Quad (tratado con HYA) de conejos (6 por grupo), y se cuantificó la hIgG sérica el día 5 después de la administración. (c & d) Los valores se representan como media /- SEM (n = 6/grupo). ****p < 0,0001, ***p < 0,001, **p < 0,01, y ns = no significativo. Los valores P proceden de pruebas de Mann-Whitney no apareadas de dos colas.
Figura 33muestra la expresiónin vivode DMAb en los macacos rhesus. Se administraron 13,5 mg de pMERS con EP en los músculos del cuádriceps (pretratados con HYA) de macacos rhesus (5 por grupo). Se cuantificó la hIgG sérica (a) y se midió la unión al antígeno del CoV del MERS por medio de ELISA en los días 0 a 35 (b), y en la dilución sérica recíproca del día 17 (c) para cada macaco rhesus. (d) La respuesta de anticuerpos a la IgG humana (ADA) se midió por medio de ELISA directo en el suero de macacos rhesus. (e) Se representa la correlación de los niveles de DMAb y los niveles de unión de anticuerpos IgG antihumanos en el suero. Se representan los puntos de datos (hIgG (pg/ml) con el correspondiente ADA (OD450nm)) después e incluyendo el valor máximo de hIgG (pg/ml) alcanzado en cada macaco Rhesus. Valor P y coeficiente de correlación de Spearman calculados por medio del programa GraphPad Prism 6.
Figura 34muestra la cinética de expresión in vivo de DMAb en ratones BALB/c. (a-c) Se administraron de 6,25 a 100 pg de pMERS en el músculo TA de ratones BALB/c (4-8 ratones por grupo), (a) sólo por inyección (No EP), (b) inyección con EP (EP) y (c) inyección con EP en músculo tratado con HYA (EP HYA). (a-c) Se cuantificaron los niveles séricos de IgG humana (los puntos de datos representan la Media+/-SEM) por medio de ELISA en los días 0 a 14 tras la administración de pMERS.
Figura 35muestra la respuesta de anticuerpos frente a IgG humana en ratones BALB/c tratados con pMERS. La respuesta de anticuerpos frente a IgG humana (ADA) se midió por medio de ELISA directo en el suero de ratones BALB/c los días 0 a 14 tras la administración de pMERS con PE.
Figura 36muestra un cribado de reactivos de liberación de ADNp que, según se ha informado, potencian la expresión génica. Se administraron 100 pg de pMERS en el músculo TAde ratones BALB/c (5 ratones por grupo). El músculo TA diana se pretrató 30 min antes de la administración de pMERS con PBS, HYA, sacarosa al 7%, colagenasa D, elastasa o MMP7 en los grupos 1, 2, 5, 7, 8 y 9 respectivamente. El pMERS se coformuló con ácido poli-L-glutámico (grupo 3) o Tempol (grupo 4) o (OH)3D3 (grupo 6), y no hubo pretratamiento. Se cuantificaron los niveles séricos de IgG humana (los puntos de datos representan la media /- SEM) por medio de ELISA el día 6 tras la administración de pMERS.
Figura 37muestra la expresión de DMAb en conejos. (a y b) Se administraron 2 mg de pGX9207 con EP en el músculo Quad (pretratado con HYA) de conejos blancos de Nueva Zelanda (6 por grupo). La hIgG sérica (a) y la unión anti-IgG humana (ADA) (b) se ensayaron por medio de ELISA en los días 0 a 10.
Figura 38muestra el estudio de coformulación de HYA con ADNp en conejos. Seis conejos blancos de Nueva Zelanda por grupo. 2 mg de pGX9207 en el músculo del cuádriceps izquierdo. Dos sitios.<h>Y<a>(Intropharma) 200U por sitio. CELLECTRA®-5P pDNA/HYA coformulado 5 minutos antes de la administración. Se tomaron muestras de sangre el día 5. Número de experimento INO-16-158b.
Figura 39muestra la coformulación de HYA con ADNp en conejos con retraso de PE. Seis conejos blancos de Nueva Zelanda por grupo. 2 mg de pGX9207 en el músculo del cuádriceps izquierdo. Dos sitios. HYA (Intropharma) 200 U por sitio. CELLECTRA®-5P pDNA/HYA coformulado 5 minutos antes de la administración. Se tomaron muestras de sangre el día 5. Número de experimento INO-16-158a.
Figura 40muestra la coformulación de HYA con ADNp en macacos rhesus. pGX9207 (pMERS) administrado en el músculo cuádriceps con CELLECTRA®-5P. 4 sitios. 1 mg de ADNp por sitio. Intropharma (HYA purificada de testículos bovinos). ADNp /HYA coformulado 5 minutos antes de la administración. Número de experimento INO-16-194.
Figura 41muestra la optimización del retraso EP con Hylenex (hialuronidasa recombinante humana). pGX9207 HYA co-formulación. Dos Tx en el cuádriceps izquierdo. Se muestran los niveles séricos de hlgG en el día 5. Número de experimento INO-16-279.
Figura 42muestra el efecto ahorrador de dosis de vacuna de ADN de la coformulación con HYA. Ratones BALB/c. Día 0 influenza pNP IM CELLECTRA-3P, día 7 y 14 ELISA. Número de experimento INO-16-218.
Figura 43muestra el aumento de la respuesta inmunitaria frente al antígeno tumoral con la formulación HYA de la vacuna de ADN. Ratones B6. Día 0 y 14 pmTERT IM CELLECTRA®-3P, día 21 IFN-gamma ELISpot frente a grupos de péptidos TERT nativos de ratón. Número de experimento INO-17-018.
Descripción detallada
La presente invención se refiere a composiciones para y procedimientos de administración de un plásmido de ADN que codifica un anticuerpo monoclonal a un individuo. Los procedimientos pueden incluir la administración al individuo de un plásmido de ADN que codifica un anticuerpo monoclonal, y un polipéptido de condroitinasa o un polinucleótido que codifica un polipéptido de condroitinasa en una cantidad suficiente para hidrolizar grupos sulfato de CSPGs. En la invención, la condroitinasa es la condroitinasa AC o la condroitinasa ABC. La condroitinasa puede hidrolizar los grupos sulfato de los CSPG en el individuo. Esta desorganización puede provocar la desorganización de la matriz extracelular y facilitar así la administración del agente. Los procedimientos pueden incluir además la administración al individuo de un polipéptido de hialuronidasa o un polinucleótido que codifica un polipéptido de hialuronidasa.
La presente invención también se refiere a la administración de hialuronidasa junto con un agente a un individuo. La hialuronidasa puede administrarse como un polipéptido o como un ácido nucleico que codifica la hialuronidasa o un fragmento o variante de la misma. La hialuronidasa puede facilitar la administración del agente al individuo. Como resultado, la hialuronidasa puede potenciar una respuesta inmunitaria en el individuo y/o potenciar la expresión del agente en el individuo.
1) Definiciones
A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la técnica. En caso de conflicto, prevalecerá el presente documento, incluidas las definiciones. A continuación se describen los procedimientos y materiales preferentes, aunque en la práctica o en los ensayos de la presente invención se pueden utilizar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria. Los materiales, procedimientos y ejemplos divulgados en la presente memoria son sólo ilustrativos y no pretenden ser limitativos.
Los términos "comprende", "incluye", "tiene", "puede", "contiene" y sus variantes, como se utilizan en la presente memoria, pretenden ser expresiones, términos o palabras transitorias abiertas que no excluyen la posibilidad de actos o estructuras adicionales. Las formas singulares "un", "y" y "el, la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. La presente divulgación también contempla otras realizaciones "que comprenden", "que consisten en" y "que consisten esencialmente en" las realizaciones o los elementos presentados en la presente memoria, tanto si se exponen explícitamente como si no.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “aproximadamente”, según se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia establecido. En ciertos aspectos, el término “aproximadamente” se refiere a un intervalo de valores que se encuentran dentro del 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos en cualquier dirección (mayor o menor que) del valor de referencia establecido a menos que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto (excepto cuando dicho número exceda el 100% de un valor posible).
El término "anticuerpo" puede significar un anticuerpo de las clases IgG, IgM, IgA, IgD, o IgE, o fragmentos, o derivados de los mismos, que incluyen Fab, F(ab')2, Fd, y anticuerpos de cadena simple, y derivados de los mismos. El anticuerpo puede ser un anticuerpo aislado de la muestra de suero de un mamífero, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo purificado por afinidad, o cualquier mezcla de los mismos que presente suficiente especificidad de unión a un epitopo deseado o a una secuencia derivada del mismo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo sintético como se describe en la presente memoria.
"Fragmento de anticuerpo" o "fragmento de un anticuerpo", tal como se utilizan indistintamente en la presente memoria, se refiere a una porción de un anticuerpo intacto que comprende el sitio de unión al antígeno o la región variable. La porción no incluye los dominios constantes de cadena pesada (es decir, CH2, CH3 o CH4, dependiendo del isotipo del anticuerpo) de la región Fe del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos Fab'-SH, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fd, fragmentos Fv, diabodies, moléculas Fv de cadena única (scFv), polipéptidos de cadena única que contienen sólo un dominio variable de cadena ligera, polipéptidos de cadena única que contengan las tres CDR del dominio variable de cadena ligera, polipéptidos de cadena única que contengan sólo una región variable de cadena pesada y polipéptidos de cadena única que contengan las tres CDR de la región variable de cadena pesada.
El término "fragmento" como se utiliza en la presente memoria, significa una secuencia de ácido nucleico o una porción de la misma que codifica un polipéptido capaz de provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero. Los fragmentos pueden ser fragmentos de Ad N seleccionados entre al menos una de las diversas secuencias de nucleótidos que codifican fragmentos de proteínas que se exponen a continuación. El término "fragmento" también puede hacer referencia a una secuencia polipeptídica o una porción de la misma que es capaz de provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero.
Por "respuesta inmunitaria", como se utiliza en la presente memoria, se entiende la activación del sistema inmunitario de un huésped, por ejemplo, el de un mamífero, en respuesta a la introducción de un antígeno. La respuesta inmunitaria puede ser en forma de respuesta celular o humoral, o ambas.
"Unido operativamente", como se utiliza en la presente memoria, significa que la expresión de un gen está bajo el control de un promotor con el que está conectado espacialmente. Un promotor puede situarse a 5' (corriente arriba) o a 3' (corriente abajo) de un gen bajo su control. La distancia entre el promotor y un gen puede ser aproximadamente la misma que la distancia entre ese promotor y el gen que controla en el gen del que deriva el promotor. Como se sabe en la técnica, la variación de esta distancia se puede acomodar sin pérdida de la función del promotor.
Un "péptido", "proteína" o "polipéptido", como se utiliza en la presente memoria, puede significar una secuencia enlazada de aminoácidos y puede ser natural, sintético o una modificación o combinación de natural y sintético.
Los términos "polinucleótido" u "oligonucleótido" o "ácido nucleico", como se utiliza en la presente memoria, significa al menos dos nucleótidos unidos covalentemente. Un polinucleótido puede ser monocatenario o bicatenario, o puede contener porciones de secuencia bicatenario y monocatenario. El polinucleótido puede ser ADN, tanto genómico como ADNc, a Rn o un híbrido. El polinucleótido puede contener combinaciones de desoxirribo y ribo-nucleótidos, y combinaciones de bases que incluyen uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina hipoxantina, isocitosina, isoguanina, y nucleótidos y nucleósidos sintéticos o no naturales. Los polinucleótidos se pueden obtener por procedimientos de síntesis química o por procedimientos recombinantes.
Por "promotor", como se utiliza en la presente memoria, se entiende una molécula sintética o de origen natural que es capaz de conferir, activar o potenciar la expresión de un ácido nucleico en una célula. Un promotor puede comprender una o más secuencias reguladoras transcripcionales específicas para mejorar aún más la expresión y/o alterar la expresión espacial y/o temporal de la misma. Un promotor también puede incluir elementos distales potenciadores o represores, que pueden estar situados a varios miles de pares de bases del sitio de inicio de la transcripción. Un promotor puede provenir de fuentes tales como virus, bacterias, hongos, plantas, insectos y animales. Un promotor puede regular la expresión de un componente génico de forma constitutiva o diferencial con respecto a la célula, el tejido u órgano en el que se produce la expresión o, con respecto a la etapa de desarrollo en la que se produce la expresión, o en respuesta a estímulos externos tales como tensiones fisiológicas, patógenos, iones metálicos o agentes inductores. Ejemplos representativos de promotores incluyen el promotor del bacteriófago T7, el promotor del bacteriófago T3, el promotor SP6, el operador-promotor lac, el promotor tac, el promotor tardío del SV40, el promotor temprano del SV40, el promotor RSV-LTR, el promotor IE del CMV, el promotor temprano del SV40 o el promotor tardío del SV40 y el promotor IE del CMV.
"Individuo", como se utiliza en la presente memoria, puede significar un mamífero. El mamífero puede ser un humano, un chimpancé, un perro, un gato, un caballo, una vaca, un cerdo, un pollo, un ratón o una rata.
"Tratamiento" o "tratar", tal como se utiliza en la presente memoria, puede significar la protección de un animal de una enfermedad a través de medios de prevención, supresión, represión o eliminación completa de la enfermedad. La prevención de la enfermedad puede incluir la administración de una composición de la presente invención a un animal antes de la aparición de la enfermedad. La supresión de la enfermedad implica la administración de una composición de la presente invención a un animal después de la inducción de la enfermedad pero antes de su aparición clínica. Reprimir la enfermedad implica administrar una composición de la presente invención a un animal después de la aparición clínica de la enfermedad.
"Variante" utilizado en la presente memoria con respecto a un ácido nucleico significa (i) una porción o fragmento de una secuencia de nucleótidos de referencia; (ii) el complemento de una secuencia de nucleótidos de referencia o una porción de la misma; (iii) un ácido nucleico que es sustancialmente idéntico a un ácido nucleico de referencia o al complemento del mismo; o (iv) un ácido nucleico que hibrida en condiciones estrictas con el ácido nucleico de referencia, el complemento del mismo, o una secuencia sustancialmente idéntica.
La variante puede definirse además como un péptido o polipéptido que difiere en la secuencia de aminoácidos por la inserción, supresión o sustitución conservadora de aminoácidos, pero que conserva al menos una actividad biológica. Ejemplos representativos de "actividad biológica" incluyen la capacidad de unirse a un anticuerpo específico o de promover una respuesta inmunitaria. Variante también puede significar una proteína con una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a una proteína de referencia con una secuencia de aminoácidos que conserva al menos una actividad biológica. Una sustitución conservadora de un aminoácido, es decir, la sustitución de un aminoácido por otro de propiedades similares (por ejemplo, hidrofilicidad, grado y distribución de las regiones cargadas) se reconoce en la técnica como algo que típicamente implica un cambio menor. Estos cambios menores pueden identificarse, en parte, considerando el índice hidropático de los aminoácidos, tal como se entiende en la técnica (Kyte et al., J. Mol. Biol. 1982, 157, 105-132). El índice hidropático de un aminoácido se basa en la consideración de su hidrofobicidad y su carga. Se sabe en la técnica que los aminoácidos de índices hidropáticos similares pueden ser sustituidos y seguir conservando la función proteica. En un aspecto, se sustituyen aminoácidos que tienen índices hidropáticos de ±2. La hidrofilicidad de los aminoácidos también puede utilizarse para revelar las sustituciones que harían que las proteínas conservaran su función biológica. La consideración de la hidrofilicidad de los aminoácidos en el contexto de un péptido permite calcular la mayor hidrofilicidad media local de ese péptido, una medida útil que, según se ha informado, se correlaciona bien con la antigenicidad y la inmunogenicidad. La sustitución de aminoácidos con valores de hidrofilicidad similares puede dar lugar a que los péptidos conserven la actividad biológica, por ejemplo la inmunogenicidad, como se entiende en la técnica. Las sustituciones pueden realizarse con aminoácidos que tengan valores de hidrofilicidad dentro de un margen de ±2. Tanto el índice de hidrofobicidad como el valor de hidrofilicidad de los aminoácidos están influidos por la cadena lateral concreta de ese aminoácido. En consonancia con esa observación, se entiende que las sustituciones de aminoácidos que son compatibles con la función biológica dependen de la similitud relativa de los aminoácidos y, en particular, de las cadenas laterales de esos aminoácidos, tal y como revelan la hidrofobicidad, la hidrofilicidad, la carga, el tamaño y otras propiedades.
Una variante puede ser una secuencia de ácido nucleico que es sustancialmente idéntica en toda la longitud de la secuencia genética completa o en un fragmento de la misma. La secuencia de ácido nucleico puede ser 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica en toda la longitud de la secuencia genética o de un fragmento de la misma. Una variante puede ser una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica en toda la longitud de la secuencia de aminoácidos o en un fragmento de la misma. La secuencia de aminoácidos puede ser 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntica en toda la longitud de la secuencia de aminoácidos o en un fragmento de la misma
El término "vector", como se utiliza en la presente memoria, significa una secuencia de ácido nucleico que contiene un origen de replicación. Un vector puede ser un vector viral, un bacteriófago, un cromosoma artificial bacteriano o un cromosoma artificial de levadura. Un vector puede ser de ADN o de ARN. Un vector puede ser un vector extracromosómico autorreplicante y, preferentemente, es un plásmido de ADN.
Para la citación de intervalos numéricos en el presente documento, se contempla explícitamente cada número intermedio con el mismo grado de precisión. Por ejemplo, para el intervalo de 6-9, se contemplan los números 7 y 8 además de 6 y 9, y para el intervalo 6,0-7,0, se contemplan explícitamente los números 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 y 7,0.
2) Uso de condroitinasa para mejorar la administración de agentes
La presente invención se refiere a la administración de condroitinasa junto con un agente a un individuo. La condroitinasa puede administrarse como un polipéptido o como un ácido nucleico que codifica la condroitinasa o un fragmento o variante de la misma. La condroitinasa puede facilitar la administración del agente al individuo. Como resultado, la condroitinasa puede potenciar una respuesta inmunitaria en el individuo y/o potenciar la expresión del agente en el individuo.
a) Condroitinasa
Una condroitinasa o fragmento de la misma puede administrarse a un individuo. En la invención, la condroitinasa es la condroitinasa AC o la condroitinasa ABC. Como parte de la divulgación, pero no parte de la invención, la condroitinasa puede ser cualquier condroitinasa. Por ejemplo, la condroitinasa puede ser una N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa, una N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa o una condroitina ABC liasa. La condroitinasa puede ser condroitinasa AC. La condroitinasa puede ser condroitinasa recombinante. La condroitinasa puede catalizar la hidrólisis de un proteoglicano de condroitín sulfato (CSPG). La condroitinasa puede hidrolizar los grupos 4-sulfato de las unidades N-acetil-D-galactosamina 4-sulfato del condroitín sulfato y/o dermatán sulfato. La condroitinasa puede hidrolizar los grupos 4-sulfato del N-acetil glucosamina 4-sulfato. La condroitinasa puede hidrolizar los grupos 6-sulfato de las unidades 6-sulfato de N-acetil-D-galactosamina del sulfato de condroitina y de las unidades 6-sulfato de D-galactosa del sulfato de queratina. La condroitina ABC liasa puede catalizar la degradación de polisacáridos que contienen enlaces 1,4-beta-D-hexosaminilo y 1,3-beta-D-glucuronosilo o 1,3-alfa-L-iduronosilo a disacáridos que contienen grupos 4-deoxi-beta-D-gluc-4-enuronosilo. La condroitina ABC liasa puede actuar sobre la condroitina 4-sulfato, la condroitina 6-sulfato y el dermatán sulfato.
El CSPG puede ser Aggrecan (CSPG1), Versican (CSPG2), Neurocan (CSPG3), CSPG4 (proteoglicano de condroitín sulfato asociado a melanoma, NG2), CSPG5, SMC3 (CSPG6, mantenimiento estructural del cromosoma 3), Brevican (CSPG7), CD44 (CSPG8, clúster de diferenciación 44), Phosphacan, y combinaciones de los mismos.
Al catalizar la hidrólisis de los CSPGs, constituyentes de la matriz extracelular (ECM), la condroitinasa disminuye la viscosidad de los CSPGs y de la matriz extracelular, para de este modo aumentar la permeabilidad tisular. La administración de condroitinasa, o de un polinucleótido que codifica la condroitinasa, puede provocar la hidrólisis de los CSPG, lo que conduce a la desorganización de una matriz extracelular del individuo. La desorganización de la matriz extracelular del individuo puede facilitar la administración de un agente.
La condroitinasa puede ser una condroitinasa derivada de una bacteria. La bacteria puede serFlavobacterium heparinum,por ejemplo. La condroitinasa puede producirse recombinantemente en una bacteria.
En algunas realizaciones, puede administrarse un polipéptido de condroitinasa o un fragmento del mismo.
En algunas realizaciones, puede administrarse un polinucleótido que codifica un polipéptido de condroitinasa o un fragmento del mismo. El polipéptido de condroitinasa puede expresarse a partir del polinucleótido que codifica el polipéptido de condroitinasain vivo..
3) Uso de hialuronidasa
Los procedimientos también pueden comprender administrar adicionalmente al individuo un polipéptido de hialuronidasa o un polinucleótido que codifica un polipéptido de hialuronidasa en una cantidad para degradar un glucosaminoglicano, tal como hialuronano. La administración de condroitinasa e hialuronidasa puede producir un efecto aditivo o sinérgico sobre la expresión del agente, la respuesta inmunitaria o la concentración del agente en el suero del individuo, por ejemplo. La concentración de agente detectada en el suero de un individuo expuesto a un tratamiento combinado de condroitinasa e hialuronidasa puede ser mayor en comparación con los niveles séricos del agente en un individuo tratado con una sola enzima condroitinasa o hialuronidasa, por ejemplo.
La presente invención también se refiere a la administración de hialuronidasa junto con un agente a un individuo. La hialuronidasa puede administrarse como un polipéptido o como un ácido nucleico que codifica la hialuronidasa o un fragmento o variante de la misma. La hialuronidasa puede facilitar la administración del agente al individuo. Como resultado, la hialuronidasa puede potenciar una respuesta inmunitaria en el individuo y/o potenciar la expresión del agente en el individuo. El procedimiento de administración de hialuronidasa a un individuo puede o no incluir la administración de condroitinasa. El agente puede ser cualquier agente según se describe en este documento. El uso de hialuronidasa puede realizarse junto con cualquier agente, momento de administración descrito, modo de administración, procedimiento de tratamiento o procedimiento de administración, como se describe en el presente documento.
El polipéptido de hialuronidasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de hialuronidasa y el agente pueden administrarse al individuo concurrentemente. El polipéptido de hialuronidasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de hialuronidasa puede administrarse simultáneamente con el polipéptido de condroitinasa, o el polinucleótido que codifica el polipéptido de condroitinasa, y el agente. Los procedimientos de administración y los tiempos de administración pueden ser los mismos o similares a los descritos en el presente documento. Véase la sección 4 b), por ejemplo.
El polipéptido de hialuronidasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de hialuronidasa y el agente pueden administrarse al individuo consecutivamente. El polipéptido de hialuronidasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de hialuronidasa y el polipéptido de condroitinasa, o el polinucleótido que codifica el polipéptido de condroitinasa, y el agente pueden administrarse al individuo consecutivamente. Los procedimientos de administración y los tiempos de administración pueden ser los mismos o similares a los descritos en el presente documento. Véase la sección 4 b), por ejemplo. El polipéptido de condroitinasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de condroitinasa, el polipéptido de hialuronidasa o un polinucleótido que codifica un polipéptido de hialuronidasa, y el agente pueden coformularse antes de la administración. El polipéptido de condroitinasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de condroitinasa, y el polipéptido de hialuronidasa o un polinucleótido que codifica un polipéptido de hialuronidasa, pueden coformularse antes de la administración. Puede producirse cualquier coformulación del polipéptido de condroitinasa o del polinucleótido que codifica el polipéptido de condroitinasa, del polipéptido de hialuronidasa o de un polinucleótido que codifica un polipéptido de hialuronidasa, y del agconente, por ejemplo, 1 minuto, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 45 minutos, 1 hora, 5 horas, 10 horas, 24 horas, 5 días, 7 días, 20 días, 30 días, 40 días, 50 días, 100 días, 200 días, 300 días, 1 año, 400 días, 1.5 años o 2 años antes de la administración. Cualquier coformulación del polipéptido de condroitinasa, o del polinucleótido que codifica el polipéptido de condroitinasa, y el agente puede producirse, por ejemplo, 1 minuto, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 45 minutos, 1 hora, 5 horas, 10 horas, 24 horas, 5 días, 7 días, 20 días, 30 días, 40 días, 50 días, 100 días, 200 días, 300 días, 1 año, 400 días, 1,5 años o 2 años antes de la administración. Cualquier coformulación de polipéptido de hialuronidasa, o un polinucleótido que codifique un polipéptido de hialuronidasa, y el agente puede producirse, por ejemplo, 1 minuto, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 45 minutos, 1 hora, 5 horas, 10 horas, 24 horas, 5 días, 7 días, 20 días, 30 días, 40 días, 50 días, 100 días, 200 días, 300 días, 1 año, 400 días, 1,5 años o 2 años antes de la administración. Puede producirse cualquier coformulación del polipéptido de condroitinasa o del polinucleótido que codifica el polipéptido de condroitinasa, y del polipéptido de hialuronidasa o de un polinucleótido que codifica un polipéptido de hialuronidasa, por ejemplo, 1 minuto, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 45 minutos, 1 hora, 5 horas, 10 horas, 24 horas, 5 días, 7 días, 20 días, 30 días, 40 días, 50 días, 100 días, 200 días, 300 días, 1 año, 400 días, 1.5 años, o 2 años antes de la administración días antes de la administración.
La condroitinasa y/o hialuronidasa y/o el agente se pueden administrar por medio de electroporación (EP), tal como mediante un procedimiento descrito en la patente de EE. UU. N. ° 7.664.545. En la invención, el plásmido de ADN se administra por medio de electroporación. La electroporación puede ser por un procedimiento y/o aparato descrito en la Patente de EE.UU. n° 6.302.874, 5,676,646, 6,241,701, 6,233,482, 6,216,034, 6,208,893, 6,192,270, 6,181,964, 6,150,148, 6,120,493, 6,0 96,020, 6,068,650,y 5,702,359.. La electroporación puede llevarse a cabo mediante un dispositivo mínimamente invasivo. La electroporación puede tener lugar antes o después de la administración de la condroitinasa y/o hialuronidasa y/o agente, por ejemplo. La electroporación puede tener lugar concomitantemente con la administración de la condroitinasa y/o hialuronidasa y/o agente, por ejemplo. Puede haber un retraso entre la administración de la condroitinasa, la hialuronidasa, el agente, o cualquier coformulación de los mismos, y la PE. Por ejemplo, la EP puede administrarse 5 segundos, 10 segundos, 20 segundos, 30 segundos, 45 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos o 5 minutos después de la administración de condroitinasa, hialuronidasa, agente, antígeno o cualquier coformulación de los mismos.
Hialuronidasa puede referirse a un polipéptido que degrada el ácido hialurónico. "Ácido hialurónico" e "hialuronano" se utilizan en la presente memoria indistintamente. El hialuronano es un glicosaminoglicano aniónico no sulfatado. El hialuronano es un polímero de disacáridos, cada disacárido compuesto por ácido D-glucurónico y D-N-acetilglucosamina, unidos por medio de enlaces p -1,4 y p -1,3 glucosídicos alternos. El hialuronano puede contener miles de repeticiones de disacáridos. El hialuronano puede tener un peso molecular de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 5.000 kDa o más.
Las hialuronidasas son una familia de endoglucosaminidasas de glicosaminoglicanos, en las que un residuo de glutamato en la hialuronidasa hidroliza los enlaces p-1,4 del hialuronano y los condroitín sulfatos a través de un mecanismo catalítico ácido-base.
Al catalizar la hidrólisis del hialuronano, un constituyente de la matriz extracelular (MEC), la hialuronidasa disminuye la viscosidad del hialuronano y de la matriz extracelular, aumentando así la permeabilidad tisular. La administración de hialuronidasa, o de un polinucleótido que codifica la hialuronidasa, puede conducir a la hidrólisis del hialuronano, para de este modo provocar la desorganización de una matriz extracelular del individuo. La desorganización de la matriz extracelular del individuo puede facilitar la administración de un agente.
La hialuronidasa puede ser una hialuronidasa derivada de un origen mamífero, una hialuronato glicanohidrolasa de reptil o himenóptero, una hialuronato glicanohidrolasa de la glándula salival de la sanguijuela, o un origen bacteriano. Las hialuronidasas bacterianas pueden incluir, por ejemplo, hialuronidasas estreptocócicas, neumocócicas y clostridiales.
4) Agente
Puede administrarse un agente al individuo. Como parte de la divulgación, el agente puede comprender un polipéptido, un polinucleótido, una molécula pequeña, un antígeno o cualquier combinación de los mismos. El agente puede comprender una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica un anticuerpo, un fragmento del mismo, una variante del mismo o una combinación de los mismos, como se detalla, por ejemplo, en PCT/US2014/070188. En la invención, el agente es un anticuerpo monoclonal codificador de ADN (DMAb).
i) Polipéptido
En algunas realizaciones de la divulgación, el agente comprende un polipéptido. El polipéptido puede comprender un anticuerpo, un antígeno, una enzima u otra proteína, o cualquier combinación de los mismos. El polipéptido puede ser de origen mamífero, animal, bacteriano o vírico. El polipéptido puede ser un polipéptido heterólogo, es decir, derivado de diferentes fuentes u organismos. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende un anticuerpo. En algunas realizaciones de la divulgación, pero no de la invención, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal. En la invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal codificado por el plásmido de ADN.
(1) Anticuerpo
Como se describió anteriormente, el polipéptido puede comprender un anticuerpo, un fragmento del mismo, una variante del mismo o una combinación de los mismos. El anticuerpo puede unirse o reaccionar con una molécula diana deseada, que puede ser el antígeno, que se describe con más detalle a continuación, un ligando, incluido un ligando para un receptor, un receptor, incluido un sitio de unión al ligando en el receptor, un complejo ligando-receptor, y un marcador, incluido un marcador de cáncer.
El anticuerpo puede comprender un conjunto de regiones determinantes de la complementariedad ("CDR") de la cadena pesada y de la cadena ligera, respectivamente interpuestas entre un conjunto de marco ("FR") de la cadena pesada y de la cadena ligera que proporcionan soporte a las CDR y definen la relación espacial de las CDR entre sí. El conjunto de CDR puede contener tres regiones hipervariables de una región V de la cadena pesada o ligera. Partiendo del extremo N de una cadena pesada o ligera, estas regiones se denominan "CDR1", "CDR2" y "CDR3", respectivamente. Un sitio de unión a antígeno, por lo tanto, puede incluir seis CDRs, comprendiendo el conjunto de CDRs de cada una de las regiones V de la cadena pesada y ligera.
La enzima proteolítica papaína escinde preferentemente las moléculas de IgG para producir varios fragmentos, dos de los cuales (los fragmentos F(ab)) comprenden cada uno un heterodímero covalente que incluye un sitio de unión al antígeno intacto. La enzima pepsina es capaz de escindir las moléculas de IgG para proporcionar varios fragmentos, incluido el fragmento F(ab')2 , que comprende los dos sitios de unión al antígeno. En consecuencia, el anticuerpo puede ser el Fab o el F(ab')2. El Fab puede incluir el polipéptido de cadena pesada y el polipéptido de cadena ligera. El polipéptido de cadena pesada del Fab puede incluir la región VH y la región CH1. La cadena ligera del Fab puede incluir la región VL y la región CL.
El anticuerpo puede ser una inmunoglobulina (Ig). Las Ig pueden ser, por ejemplo, IgA, IgM, IgD, IgE e IgG. La inmunoglobulina puede incluir el polipéptido de cadena pesada y el polipéptido de cadena ligera. El polipéptido de cadena pesada de la inmunoglobulina puede incluir una región VH, una región CH1, una región bisagra, una región CH2 y una región CH3. El polipéptido de cadena ligera de la inmunoglobulina puede incluir una región VL y una región CL.
El anticuerpo de la divulgación puede ser un anticuerpo policlonal. El anticuerpo de la invención es un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico, un anticuerpo de cadena única, un anticuerpo madurado por afinidad, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo totalmente humano. El anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo de una especie no humana que se une al antígeno deseado con una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la especie no humana y regiones marco de una molécula de inmunoglobulina humana.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo biespecífico, un fragmento del mismo, una variante del mismo o una combinación de los mismos. El anticuerpo biespecífico puede unirse o reaccionar con dos antígenos, por ejemplo, dos de los antígenos descritos a continuación con más detalle. El anticuerpo biespecífico puede estar compuesto por fragmentos de dos de los anticuerpos descritos en el presente documento, permitiendo así que el anticuerpo biespecífico se una o reaccione con dos moléculas diana deseadas, que pueden incluir el antígeno, que se describe más adelante con más detalle, un ligando, incluido un ligando para un receptor, un receptor, incluido un sitio de unión al ligando en el receptor, un complejo ligando-receptor, y un marcador, incluido un marcador de cáncer.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo bifuncional, un fragmento del mismo, una variante del mismo o una combinación de los mismos. El anticuerpo bifuncional puede unirse o reaccionar con el antígeno descrito a continuación. El anticuerpo bifuncional también puede modificarse para impartir una funcionalidad adicional al anticuerpo más allá del reconocimiento y la unión al antígeno. Dicha modificación puede incluir, entre otras cosas, el acoplamiento al factor H o a un fragmento del mismo. El factor H es un regulador soluble de la activación del complemento y, por tanto, puede contribuir a una respuesta inmunitaria a través de la lisis mediada por complemento (LMC).
Como se ha descrito anteriormente, el anticuerpo puede generarse en el individuo tras la administración de la composición al individuo. El anticuerpo puede tener una vida media dentro del individuo. En algunas realizaciones, el anticuerpo puede modificarse para prolongar o acortar su semivida en el individuo. A continuación se describen estas modificaciones con más detalle.
ii) Polinucleótido
En algunas realizaciones, el agente comprende un polinucleótido. En algunas realizaciones, el agente es un polipéptido codificado por un polinucleótido, como se ha detallado anteriormente. El polinucleótido codifica un anticuerpo. El anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. El polinucleótido que codifica un anticuerpo monoclonal puede facilitar la expresiónin vivoy la formación del anticuerpo monoclonal.
En algunas realizaciones, el polipéptido de condroitinasa y el anticuerpo monoclonal están codificados por el mismo polinucleótido. En algunas realizaciones, el polipéptido de condroitinasa y el anticuerpo monoclonal están codificados por polinucleótidos separados.
(1) Vector
Uno o más vectores pueden incluir un polinucleótido. En algunas realizaciones, el polinucleótido que codifica el polipéptido de condroitinasa y el polinucleótido que codifica el agente están comprendidos en el mismo vector. En algunas realizaciones, el polinucleótido que codifica el polipéptido de condroitinasa y el polinucleótido que codifica el agente están comprendidos en vectores separados. El uno o más vectores pueden ser capaces de expresar el agente. Uno o más vectores pueden ser una construcción de expresión, que generalmente es un plásmido que se utiliza para introducir un gen específico en una célula objetivo. Una vez que el vector de expresión está dentro de la célula, el polipéptido codificado por el gen es producido por los complejos ribosómicos de la maquinaria de transcripción y traducción celular. El plásmido suele estar diseñado para contener secuencias reguladoras que actúan como regiones potenciadoras y promotoras y que conducen a la transcripción eficiente del gen transportado en el vector de expresión. En una realización, los vectores de la presente invención pueden expresar grandes cantidades de ARN mensajero estable y, por lo tanto, polipéptidos.
(a) Vectores de expresión
El vector puede ser un plásmido circular o un ácido nucleico lineal. El plásmido circular y el ácido nucleico lineal son capaces de dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos particular en una célula sujeta apropiada. El vector puede tener un promotor unido de forma operable a la secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno, o a la secuencia de nucleótidos que codifica el adyuvante, que puede estar unido de forma operable a señales de terminación. El vector también puede contener las secuencias necesarias para la correcta traducción de la secuencia de nucleótidos. El vector que comprende la secuencia de nucleótidos de interés puede ser quimérico, lo que significa que al menos uno de sus componentes es heterólogo con respecto a al menos uno de sus otros componentes. La expresión de la secuencia de nucleótidos en el casete de expresión puede estar bajo el control de un promotor constitutivo o de un promotor inducible, que inicia la transcripción sólo cuando la célula huésped está expuesta a algún estímulo externo particular. En el caso de un organismo multicelular, el promotor también puede ser específico de un tejido u órgano concreto o de una fase de desarrollo.
(b) Vectores circulares y lineales
El vector puede ser un plásmido circular, que puede transformar una célula diana por integración en el genoma celular o existir de forma extracromosómica (por ejemplo, plásmido de replicación autónoma con un origen de replicación).
El vector puede ser pVAX, pcDNA3.0 o provax, o cualquier otro vector de expresión capaz de expresar ADN que codifique el agente y permitir que una célula traduzca la secuencia a un agente.
También se proporciona en la presente memoria un ácido nucleico lineal, o casete de expresión lineal ("LEC"), que puede administrarse de manera eficiente a un sujeto a través de electroporación y expresar uno o más agentes deseados. El LEC puede ser cualquier ADN lineal desprovisto de cualquier columna vertebral de fosfato. El ADN puede codificar uno o más agentes. El LEC puede contener un promotor, un intrón, un codón de parada y/o una señal de poliadenilación. La expresión del agente puede ser controlada por el promotor. El LEC no puede contener ningún gen de resistencia a los antibióticos y/o una columna vertebral de fosfato. El LEC no puede contener otras secuencias de ácidos nucleicos no relacionadas con la expresión génica del agente deseado.
El LEC puede derivarse de cualquier plásmido capaz de ser linealizado. El plásmido puede ser capaz de expresar el agente. El plásmido puede ser pNP (Puerto Rico/34) o pM2 (Nueva Caledonia/99). El plásmido puede ser WLV009, pVAX, pcDNA3.0 o provax, o cualquier otro vector de expresión capaz de expresar ADN que codifique el agente y permitir que una célula traduzca la secuencia a un agente.
El LEC puede ser pcrM2. El LEC puede ser pcrNP pcrNP y pcrMR pueden derivarse de pNP (Puerto Rico/34) y pM2 (Nueva Caledonia/99), respectivamente.
(c) Promotor, intrón, codón de parada y señal de poliadenilación
El vector puede tener un promotor. Un promotor puede ser cualquier promotor que sea capaz de impulsar la expresión del gen y regular la expresión del ácido nucleico aislado. Dicho promotor es un elemento de secuencia de acción cis necesario para la transcripción a través de una ARN polimerasa dependiente del ADN, que transcribe la secuencia del antígeno descrita en la presente memoria. La selección del promotor utilizado para dirigir la expresión de un ácido nucleico heterólogo depende de la aplicación concreta. El promotor puede situarse aproximadamente a la misma distancia del inicio de la transcripción en el vector que del sitio de inicio de la transcripción en su entorno natural. Sin embargo, la variación de esta distancia puede acomodarse sin pérdida de la función del promotor.
El promotor puede estar unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica el antígeno y a las señales necesarias para la poliadenilación eficiente del transcrito, los sitios de unión al ribosoma y la terminación de la traducción. El promotor puede estar unido de forma operativa a la secuencia de ácido nucleico que codifica el adyuvante y a las señales necesarias para la poliadenilación eficiente del transcrito, los sitios de unión a los ribosomas y la terminación de la traducción.
El promotor puede ser un promotor del CMV, un promotor temprano del SV40, un promotor tardío del SV40, un promotor de la metalotioneína, un promotor del virus del tumor mamario murino, un promotor del virus del sarcoma de Rous, un promotor de la polihedrina u otro promotor que haya demostrado ser eficaz para la expresión en células eucariotas.
El vector puede incluir un potenciador y un intrón con sitios donantes y aceptores de empalme funcionales. El vector puede contener una región de terminación de la transcripción a continuación del gen estructural para permitir una terminación eficiente. La región de terminación puede obtenerse del mismo gen que la secuencia promotora o puede obtenerse de genes diferentes.
Mi) Molécula pequeña
Como parte de la divulgación, el agente puede comprender una molécula pequeña. Las moléculas pequeñas pueden incluir, por ejemplo, fármacos o drogas, compuestos orgánicos, compuestos organometálicos, antígenos, hormonas, vitaminas, antibióticos, cofactores, citoquinas, esteroides, hidratos de carbono, azúcares, alcoholes, polienos, alcaloides, glucósidos, flavonoides, carboxilatos, pirroles, fenazinas, ácidos grasos, aminas, nucleobases y sus derivados (p. ej., nucleótidos y nucleósidos), aminoácidos y metabolitos celulares.
iv) Antígeno
Puede administrarse un antígeno al individuo. "Antígeno" puede ser cualquier cosa que tenga la capacidad de generar una respuesta inmune en un individuo. Un antígeno puede ser un polinucleótido, un polipéptido o una combinación de los mismos. El polinucleótido también puede incluir secuencias adicionales que codifican secuencias de enlace o etiqueta que están unidas al antígeno por medio de un enlace peptídico. Un antígeno puede comprender una molécula pequeña, como se ha detallado anteriormente.
Un antígeno puede estar contenido en un polinucleótido, un polipéptido o un fragmento del mismo, o una variante del mismo, o una combinación de los mismos de cualquier número de organismos, por ejemplo, un virus, un parásito, una bacteria, un hongo o un mamífero. El antígeno puede estar asociado a una enfermedad autoinmune, una alergia o un asma. En otras realizaciones, el antígeno puede estar asociado con el cáncer, el herpes, la gripe, la hepatitis B, la hepatitis C, el virus del papiloma humano (VPH) o el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
Un antígeno puede ser reconocido y unido por un anticuerpo. Algunos antígenos pueden inducir una fuerte respuesta inmune. Otros antígenos pueden inducir una respuesta inmunitaria débil. Un antígeno puede proceder del interior del organismo o del entorno exterior. Un antígeno puede ser un antígeno extraño o un antígeno propio.
En algunas realizaciones, el anticuerpo, como se ha descrito anteriormente, puede unirse o reaccionar con el antígeno.
En algunas realizaciones, el polipéptido de condroitinasa y el agente que comprende un polinucleótido están codificados por el mismo polinucleótido o polinucleótidos separados. En algunas realizaciones, el polipéptido de condroitinasa, el agente que comprende un polinucleótido y el antígeno están comprendidos en el mismo vector o en vectores separados.
El antígeno puede ser cualquier cosa que induzca una respuesta inmunitaria en un individuo. Los antígenos purificados no suelen ser fuertemente inmunogénicos por sí solos, por lo que se combinan con el adyuvante como se ha descrito anteriormente. La respuesta inmunitaria inducida por el antígeno puede potenciarse o aumentarse cuando se combina con el adyuvante. Dicha respuesta inmunitaria puede ser una respuesta inmunitaria humoral y/o una respuesta inmunitaria celular. En algunas realizaciones, la combinación del adyuvante y el antígeno puede potenciar o aumentar una respuesta inmunitaria celular en el individuo.
El antígeno puede ser una secuencia de ácido nucleico, una secuencia de aminoácidos o una combinación de ellas. La secuencia de ácido nucleico puede ser ADN, ARN, ADNc, una variante del mismo, un fragmento del mismo o una combinación de los mismos. La secuencia de ácido nucleico también puede incluir secuencias adicionales que codifican secuencias enlazadoras o de etiqueta que se unen al antígeno mediante un enlace peptídico. La secuencia de aminoácidos puede ser una proteína, un péptido, una variante del mismo, un fragmento del mismo o una combinación de los mismos.
El antígeno puede estar contenido en una proteína, un ácido nucleico, o un fragmento del mismo, o una variante del mismo, o una combinación de los mismos de cualquier número de organismos, por ejemplo, un virus, un parásito, una bacteria, un hongo o un mamífero. El antígeno puede estar asociado a una enfermedad autoinmune, una alergia o un asma. En otras realizaciones, el antígeno puede estar asociado con el cáncer, el herpes, la gripe, la hepatitis B, la hepatitis C, el virus del papiloma humano (VPH) o el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Preferentemente, el antígeno puede estar asociado a la gripe o al VIH.
Algunos antígenos pueden inducir una fuerte respuesta inmunitaria. Otros antígenos pueden inducir una respuesta inmunitaria débil. El antígeno puede provocar una mayor respuesta inmunitaria cuando se combina con un adyuvante.
(1) Antígenos virales
El antígeno puede ser un antígeno viral, o un fragmento del mismo, o una variante del mismo. El antígeno vírico puede proceder de un virus de una de las siguientes familias:Adenoviridae, Arenaviridae, Bunyaviridae, Caliciviridae, Coronaviridae, Filoviridae, Hepadnaviridae, Herpesviridae, Orthomyxoviridae, Papovaviridae, Paramyxoviridae, Parvoviridae, Picornaviridae, Poxviridae, Reoviridae, Retroviridae, RhabdoviridaeoTogaviridae.El antígeno vírico puede ser de los virus del papiloma, por ejemplo, el virus del papiloma humano (VPH), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de la poliomielitis, el virus de la hepatitis B, el virus de la hepatitis C, el virus de la viruela (Variola mayor y menor), el virus vaccinia, el virus de la gripe, los rinovirus, el virus del dengue, los virus de la encefalitis equina, el virus de la rubéola, el virus de la fiebre amarilla, el virus Norwalk, virus de la hepatitis A, virus de la leucemia humana de células T (HTLV-I), virus de la leucemia de células pilosas (HTLV-II), virus de la encefalitis de California, virus Hanta (fiebre hemorrágica), virus de la rabia, virus de la fiebre de Ébola, virus de Marburgo, virus del sarampión, virus de las paperas, virus sincitial respiratorio (VSR), herpes simple 1 (herpes oral), herpes simple 2 (herpes genital), herpes zóster (varicelazoster, a.también conocido como varicela), citomegalovirus (CMV), por ejemplo c Mv humano, virus de Epstein-Barr (EBV), flavivirus, virus de la fiebre aftosa, virus chikungunya, virus lassa, arenavirus, virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) o virus causantes de cáncer.
(a) Antígeno de la hepatitis
El antígeno puede ser un antígeno del virus de la hepatitis (es decir, antígeno de la hepatitis), o un fragmento del mismo, o una variante del mismo. El antígeno de la hepatitis puede ser un antígeno o inmunógeno del virus de la hepatitis A (VHA), del virus de la hepatitis B (VHB), del virus de la hepatitis C (VHC), del virus de la hepatitis D (VHD) y/o del virus de la hepatitis E (VHE). En algunas realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser una o más moléculas de ácido nucleico heterólogo, como un plásmido, que codifica uno o más de los antígenos de VHA, VHB, VHC, VHD y VHE. El antígeno de la hepatitis puede ser de longitud completa o fragmentos inmunogénicos de proteínas de longitud completa.
El antígeno de la hepatitis puede comprender secuencias de consenso y/o una o más modificaciones para una mejor expresión. Las modificaciones genéticas que incluyen la optimización de codones, la optimización del ARN y la adición de una secuencia líder de inmunoglobulina de alta eficiencia para aumentar la inmunogenicidad de los constructos pueden incluirse en las secuencias consenso modificadas. El antígeno de consenso de la hepatitis puede comprender un péptido señal, como un péptido señal de inmunoglobulina, como un péptido señal de IgE o IgG, y en algunas realizaciones, puede comprender una etiqueta HA. Los inmunógenos pueden diseñarse para provocar respuestas inmunitarias celulares más fuertes y amplias que los correspondientes inmunógenos optimizados por el codón.
El antígeno de la hepatitis puede ser un antígeno del VHC. El antígeno de la hepatitis puede ser una proteína de la cápside del VHA, una proteína no estructural del VHA, un fragmento de la misma, una variante de la misma o una combinación de las mismas.
El antígeno de la hepatitis puede ser un antígeno del VHC. El antígeno de la hepatitis puede ser una proteína de la nucleocápside del v Hc (es decir, la proteína del núcleo), una proteína de la envoltura del VHC (por ejemplo, E1 y E2), una proteína no estructural del VHC (por ejemplo, NS1, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a y NS5b), un fragmento de la misma, una variante de la misma o una combinación de las mismas.
El antígeno de la hepatitis puede ser un antígeno del VHC. El antígeno de la hepatitis puede ser un antígeno delta del VHD, un fragmento del mismo o una variante del mismo.
El antígeno de la hepatitis puede ser un antígeno del VHC. El antígeno de la hepatitis puede ser una proteína de la cápside del VHE, un fragmento del mismo o una variante del mismo.
El antígeno de la hepatitis puede ser un antígeno del VHB. El antígeno de la hepatitis puede ser una proteína del núcleo del VHB, una proteína de superficie del VHB, una ADN polimerasa del VHB, una proteína del VHB codificada por el gen X, un fragmento del mismo, una variante del mismo o una combinación de los mismos. El antígeno de la hepatitis puede ser una proteína del núcleo del VHB del genotipo A, una proteína del núcleo del VHB del genotipo B, una proteína del núcleo del VHB del genotipo C, una proteína del núcleo del VHB del genotipo D, una proteína del núcleo del VHB del genotipo E, una proteína del núcleo del VHB del genotipo F, una proteína del núcleo del VHB del genotipo H, una proteína de superficie del VHB del genotipo A, una proteína de superficie del VHB del genotipo B, una proteína de superficie del VHB del genotipo C, una proteína de superficie del v Hb del genotipo D, una proteína de superficie del VHB del genotipo E, una proteína de superficie del VHB del genotipo F, una proteína de superficie del VHB del genotipo G, una proteína de superficie del VHB del genotipo H, un fragmento de la misma, una variante de la misma o una combinación de las mismas. El antígeno de la hepatitis puede ser una proteína del núcleo del VHB de consenso, o una proteína de superficie del VHB de consenso.
En algunas realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser un constructo de secuencia de ADN de núcleo consenso del genotipo A del VHB, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia de consenso de la proteína de núcleo del genotipo A del VHB o una secuencia de proteína de núcleo de consenso del genotipo A del VHB.
En otras realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser un constructo de secuencia de ADN de núcleo consenso del genotipo B del VHB, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso de la proteína central del genotipo B del VHB o una secuencia de proteína central consenso del genotipo B del VHB.
En todavía otras realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser un constructo de secuencia de ADN de núcleo consenso del genotipo C del VHB, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso de la proteína central del genotipo C del VHB, o una secuencia de proteína central consenso del genotipo C del VHB.
En algunas realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser un constructo de secuencia de ADN de núcleo consenso del genotipo D del VHB, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso de la proteína de núcleo del genotipo D del VHB o una secuencia de proteína de núcleo consenso del genotipo D del VHB.
En otras realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser un constructo de secuencia de ADN de núcleo consenso del genotipo E del VHB, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso de la proteína de núcleo del genotipo E del VHB, o una secuencia de proteína de núcleo consenso del genotipo E del VHB.
En algunas realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser un constructo de secuencia de ADN de núcleo consenso del genotipo F del VHB, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso de la proteína de núcleo del genotipo F del VHB o una secuencia de proteína de núcleo consenso del genotipo F del VHB.
En otras realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser un constructo de secuencia de ADN de núcleo consenso del genotipo G del VHB, una secuencia líder de IgE unida a una secuencia consenso de la proteína de núcleo del genotipo G del VHB o una secuencia de proteína de núcleo consenso del genotipo G del VHB.
En algunas realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser un constructo de secuencia de ADN de núcleo consenso del genotipo H del VHB, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso de la proteína de núcleo del genotipo H del VHB, o una secuencia de proteína de núcleo consenso del genotipo H del VHB.
En todavíía otras realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser un constructo de secuencia de ADN de superficie consenso del genotipo A del VHB, una secuencia líder de IgE unida a una secuencia consenso de la proteína de superficie del genotipo A del VHB, o una secuencia de proteína de superficie consenso del genotipo A del VHB.
En algunas realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser un constructo de secuencia de ADN de superficie consenso del VHB del genotipo B, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso de la proteína de superficie del VHB del genotipo B, o una secuencia de proteína de superficie consenso del VHB del genotipo B.
En otras realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser un constructo de secuencia de ADN de superficie consenso del VHB del genotipo C, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso de la proteína de superficie del VHB del genotipo C, o una secuencia de proteína de superficie consenso del VHB del genotipo C.
En todavía otras realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser un constructo de secuencia de ADN de superficie consenso del genotipo D del VHB, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso de la proteína de superficie del genotipo D del VHB o una secuencia de proteína de superficie consenso del genotipo D del VHB.
En algunas realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser un constructo de secuencia de ADN de superficie consenso del genotipo E del VHB, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso de la proteína de superficie del genotipo E del VHB o una secuencia de proteína de superficie consenso del genotipo E del VHB.
En otras realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser un constructo de secuencia de ADN de superficie consenso del genotipo F del VHB, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso de la proteína de superficie del genotipo F del VHB o una secuencia de proteína de superficie consenso del genotipo F del VHB.
En todavía otras realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser un constructo de secuencia de ADN de superficie consenso del genotipo G del VHB, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso de la proteína de superficie del genotipo G del VHB o una secuencia de proteína de superficie consenso del genotipo G del VHB.
En otras realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser un constructo de secuencia de ADN de superficie consenso del genotipo H del VHB, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso de la proteína de superficie del genotipo H del VHB o una secuencia de proteína de superficie consenso del genotipo H del VHB.
(b) Antígeno del virus del papiloma humano (VPH)
El antígeno puede ser un antígeno del virus del papiloma humano (VPH), o un fragmento del mismo, o una variante del mismo. El antígeno del VPH puede ser de los tipos de VPH 16, 18, 31, 33, 35, 45, 52 y 58, que causan cáncer de cuello uterino, cáncer de recto y/u otros cánceres. El antígeno del VPH puede ser de los tipos 6 y 11 del VPH, que causan verrugas genitales, y se sabe que son causas de cáncer de cabeza y cuello.
Los antígenos del VPH pueden ser los dominios E6 o E7 de cada tipo de VPH. Por ejemplo, para el VPH tipo 16 (VPH16), el antígeno del VPH16 puede incluir el antígeno E6 del v Ph 16, el antígeno E7 del VPH16, fragmentos, variantes o combinaciones de los mismos. Del mismo modo, el antígeno del VPH puede ser el VPH 6 E6 y/o E7, el VPH 11 E6 y/o E7, el VPH 18 E6 y/o E7, el VPH 31 E6 y/o E7, el VPH 33 E6 y/o E7, el VPH 52 E6 y/o E7, o el VPH 58 E6 y/o E7, fragmentos, variantes o combinaciones de los mismos.
(c) Antígeno del VRS
El antígeno puede ser un antígeno del VRS o un fragmento del mismo, o una variante del mismo. El antígeno del VRS puede ser una proteína de fusión del VRS humano (también denominada en el presente documento "VRS F", "proteína F del VRS" y "proteína F"), o un fragmento o variante del mismo. La proteína de fusión del VRS humano puede estar conservada entre los subtipos A y B del VRS. El antígeno del VRS puede ser una proteína F del VRS, o un fragmento o variante del mismo, de la cepa Long del VRS (GenBank AAX23994.1). El antígeno del VRS puede ser una proteína F del VRS de la cepa A2 del VRS (GenBank AAB59858.1), o un fragmento o variante del mismo. El antígeno del VRS puede ser un monómero, un dímero o un trímero de la proteína F del VRS, o un fragmento o variante del mismo. El antígeno del VRS puede ser una secuencia optimizada de aminoácidos del VRS F, o un fragmento o variante del mismo.
La forma de postfusión del VRS F provoca anticuerpos neutralizantes de alto título en los animales inmunizados y protege a los animales de la exposición al VRS. La presente invención utiliza esta inmunorespuesta en las vacunas reivindicadas. Según la invención, la proteína RSV F puede estar en una forma de prefusión o forma de postfusión.
El antígeno del VRS también puede ser la glicoproteína de fijación del VRS humano (también denominada aquí "VRS G", "proteína G del VRS" y "proteína G"), o un fragmento o variante de la misma. La proteína G del VRS humano difiere entre los subtipos A y B del VRS. El antígeno puede ser la proteína G del VRS, o un fragmento o variante del mismo, de la cepa Long del VRS (GenBank AAX23993). El antígeno del VRS puede ser la proteína G del VRS del subtipo B aislado H5601, del subtipo B aislado H1068, del subtipo B aislado H5598, del subtipo B aislado HI 123, o un fragmento o variante del mismo. El antígeno del VRS puede ser una secuencia de aminoácidos optimizada del VRS G, o un fragmento o variante del mismo.
En otras realizaciones, el antígeno del VRS puede ser la proteína no estructural 1 del VRS humano ("proteína NS1"), o un fragmento o variante de la misma. Por ejemplo, el antígeno del VRS puede ser la proteína NS1 del VRS, o un fragmento o variante del mismo, de la cepa Long del VRS (GenBank AAX23987.1). El antígeno humano del VRS también puede ser la proteína no estructural 2 del VRS ("proteína NS2"), o un fragmento o variante de la misma. Por ejemplo, el antígeno del VRS puede ser la proteína NS2 del VRS, o un fragmento o variante del mismo, de la cepa Long del VRS (GenBank AAX23988.1). El antígeno del VRS puede ser además la proteína de la nucleocápside ("N") del VRS humano, o un fragmento o variante del mismo. Por ejemplo, el antígeno del VRS puede ser la proteína N del VRS, o un fragmento o variante del mismo, de la cepa Long del VRS (GenBank AAX23989.1). El antígeno del VRS puede ser la proteína fosfoproteína ("P") del VRS humano, o un fragmento o variante del mismo. Por ejemplo, el antígeno del VRS puede ser la proteína P del VRS, o un fragmento o variante del mismo, de la cepa Long del VRS (GenBank AAX23990.1). El antígeno del VRS también puede ser la proteína de la matriz ("M") del VRS humano, o un fragmento o variante del mismo. Por ejemplo, el antígeno del VRS puede ser la proteína M del VRS, o un fragmento o variante del mismo, de la cepa Long del VRS (GenBank AAX23991.1).
En todavía otras realizaciones, el antígeno del VRS puede ser la proteína hidrófoba pequeña ("SH") del VRS humano, o un fragmento o variante del mismo. Por ejemplo, el antígeno del VRS puede ser la proteína SH del VRS, o un fragmento o variante del mismo, de la cepa Long del VRS (GenBank AAX23992.1). El antígeno del VRS también puede ser la proteína de la matriz 2-1 ("M2-1") del VRS humano, o un fragmento o variante del mismo. Por ejemplo, el antígeno del VRS puede ser la proteína RSV M2-1, o un fragmento o variante de la misma, de la cepa RSV Long (GenBank AAX23995.1). El antígeno del VRS puede ser además la proteína de la matriz 2-2 ("M2-2") del VRS humano, o un fragmento o variante de la misma. Por ejemplo, el antígeno del VRS puede ser la proteína M2-2 del VRS, o un fragmento o variante del mismo, de la cepa Long del VRS (GenBank AAX23997.1). El antígeno humano del VRS puede ser la proteína Polimerasa L ("L") del VRS, o un fragmento o variante de la misma. Por ejemplo, el antígeno del VRS puede ser la proteína L del VRS, o un fragmento o variante del mismo, de la cepa Long del VRS (GenBank AAX23996.1).
En otras realizaciones, el antígeno del VRS puede tener una secuencia de aminoácidos optimizada de las proteínas NS1, NS2, N, P, M, SH, M2-1, M2-2 o L. El antígeno del VRS puede ser una proteína humana del VRS o un antígeno recombinante, como cualquiera de las proteínas codificadas por el genoma del VRS humano.
En otras realizaciones, el antígeno RSV puede ser, pero no se limita a, la proteína RSV F de la cepa RSV Long, la proteína RSV G de la cepa RSV Long, la secuencia de aminoácidos RSV G optimizada, el genoma RSV humano de la cepa RSV Long, la secuencia de aminoácidos optimizada de RSV F, la proteína RSV NS1 de la cepa RSV Long, la proteína RSV NS2 de la cepa RSV Long, la proteína RSV N de la cepa rSv Long, la proteína RSV P de la cepa RSV Long, la proteína M del VRS de la cepa larga del VRS, la proteína SH del VRS de la cepa larga del VRS, la proteína M2-1 del VRS de la cepa larga del v Rs , la proteína M2-2 del VRS de la cepa larga del VRS, la proteína L del VRS de la cepa larga del VRS, la proteína G del VRS de la cepa aislada H5601 del subtipo B del VRS, la proteína G del VRS de la cepa aislada H1068 del subtipo B del VRS, la proteína G del VRS de la cepa aislada H5598 del subtipo B del VRS, la proteína G del VRS de la cepa aislada H1123 del subtipo B del VRS, o sus fragmentos o variantes.
(d) Antígeno de la gripe
El antígeno puede ser un antígeno de influenza o un fragmento del mismo, o una variante del mismo. Los antígenos de la gripe son aquellos capaces de provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero contra uno o más serotipos de la gripe. El antígeno puede comprender el producto de traducción de longitud completa HA0, la subunidad HA1, la subunidad HA2, una variante del mismo, un fragmento del mismo o una combinación de los mismos. El antígeno de la hemaglutinina de la gripe puede ser una secuencia consenso derivada de múltiples cepas del serotipo H1 de la gripe A, una secuencia consenso derivada de múltiples cepas del serotipo H2 de la gripe A, una secuencia híbrida que contenga porciones de dos secuencias consenso diferentes derivadas de conjuntos diferentes de múltiples cepas del serotipo HI de la gripe A o una secuencia consenso derivada de múltiples cepas de la gripe B.
El antígeno de la gripe también puede contener al menos un epítopo antigénico que puede ser eficaz contra determinados inmunógenos de la gripe contra los que se puede inducir una respuesta inmunitaria. El antígeno puede proporcionar un repertorio completo de sitios inmunogénicos y epítopos presentes en un virus de la gripe intacto. El antígeno puede ser una secuencia de antígeno de hemaglutinina de consenso que puede derivarse de secuencias de antígeno de hemaglutinina de una pluralidad de cepas del virus de la gripe A de un serotipo, como una pluralidad de cepas del virus de la gripe A del serotipo HI o del serotipo H2. El antígeno puede ser una secuencia híbrida de antígeno de hemaglutinina de consenso que puede derivarse de la combinación de dos secuencias diferentes de antígeno de hemaglutinina de consenso o de porciones de las mismas. Cada una de las dos secuencias de antígeno de hemaglutinina consenso diferentes puede derivarse de un conjunto diferente de una pluralidad de cepas del virus de la gripe A de un serotipo, como una pluralidad de cepas del virus de la gripe A del serotipo HI. El antígeno puede ser una secuencia de antígeno de hemaglutinina de consenso que puede derivarse de secuencias de antígeno de hemaglutinina de una pluralidad de cepas del virus de la gripe B.
En algunas realizaciones, el antígeno de la gripe puede ser H1 HA, H2 HA, H3 HA, H5 HA o un antígeno BHA. Alternativamente, el antígeno de la gripe puede ser un antígeno de hemaglutinina consenso que comprende una secuencia de aminoácidos consenso HI o una secuencia de aminoácidos consenso H2. El antígeno de hemaglutinina de consenso puede ser una secuencia de consenso H1 híbrida sintética que comprende porciones de dos secuencias de consenso H1 diferentes, cada una derivada de un conjunto diferente de secuencias de la otra. Un ejemplo de antígeno consenso de HA que es una proteína híbrida sintética consenso de H1 es una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos U2. El antígeno de hemaglutinina consenso puede ser una proteína de hemaglutinina consenso derivada de secuencias de hemaglutinina de cepas de gripe B, como una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos consenso BHA.
El antígeno de hemaglutinina consenso puede comprender además uno o más elementos de secuencia de aminoácidos adicionales. El antígeno de hemaglutinina de consenso puede comprender además en su extremo N una secuencia de aminoácidos líder IgE o IgG. El antígeno hemaglutinina consenso puede comprender además una etiqueta inmunogénica que es un epítopo inmunogénico único que puede ser detectado por anticuerpos fácilmente disponibles. Un ejemplo de tal etiqueta inmunogénica es la etiqueta Ha de la gripe de 9 aminoácidos que puede estar unida en el extremo C de la hemaglutinina de consenso. En algunas realizaciones, el antígeno hemaglutinina de consenso puede comprender además en su N-terminal una secuencia de aminoácidos líder de IgE o IgG y en su C-terminal una etiqueta HA.
El antígeno de hemaglutinina de consenso puede ser una proteína de hemaglutinina de consenso que consiste en secuencias de aminoácidos de gripe consensuadas o fragmentos y variantes de las mismas. El antígeno de hemaglutinina de consenso puede ser una proteína de hemaglutinina de consenso que comprenda secuencias de proteínas no relacionadas con la gripe y secuencias de proteínas de la gripe o fragmentos y variantes de las mismas.
Entre los ejemplos de una proteína HI de consenso se incluyen los que pueden consistir en la secuencia de aminoácidos H1 de consenso o los que comprenden además elementos adicionales como una secuencia líder de IgE, o una etiqueta HA o tanto una secuencia líder de IgE como una etiqueta HA.
Entre los ejemplos de proteínas H2 consensuadas se incluyen las que pueden consistir en la secuencia de aminoácidos H2 de consenso o las que comprenden además una secuencia líder de IgE, o una etiqueta de HA, o tanto una secuencia líder de IgE como una etiqueta de HA.
Los ejemplos de proteínas híbridas consenso H1 incluyen las que pueden consistir en la secuencia de aminoácidos consenso U2 o las que comprenden además una secuencia líder IgE, o una etiqueta HA, o ambas, una secuencia líder IgE y una etiqueta HA.
Entre los ejemplos de proteínas híbridas de hemaglutinina de la gripe B de consenso se incluyen las que pueden consistir en la secuencia de aminoácidos de BHA de consenso o pueden comprender una secuencia líder de IgE, o una etiqueta de HA, o tanto una secuencia líder de IgE como una etiqueta de HA.
La proteína hemaglutinina consenso puede ser codificada por un ácido nucleico de hemaglutinina consenso, una variante del mismo o un fragmento del mismo. A diferencia de la proteína hemaglutinina de consenso, que puede ser una secuencia de consenso derivada de una pluralidad de diferentes secuencias de hemaglutinina de diferentes cepas y variantes, el ácido nucleico de la hemaglutinina de consenso se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de proteína de consenso y las secuencias de codificación utilizadas pueden diferir de las utilizadas para codificar las secuencias de aminoácidos particulares en la pluralidad de diferentes secuencias de hemaglutinina de las que se deriva la secuencia de proteína de hemaglutinina de consenso. La secuencia de ácido nucleico consenso puede estar optimizada en cuanto a codones y/o ARN. La secuencia de ácido nucleico de hemaglutinina de consenso puede comprender una secuencia de Kozak en la región no traducida 5'. La secuencia de ácido nucleico consenso de la hemaglutinina puede comprender secuencias de ácido nucleico que codifican una secuencia líder. La secuencia codificadora de una secuencia líder terminal N está a 5' de la secuencia codificadora de la hemaglutinina. El líder N-terminal puede facilitar la secreción. El líder N-terminal puede ser un líder IgE o un líder IgG. La secuencia de ácido nucleico consenso de la hemaglutinina puede comprender secuencias de ácido nucleico que codifican una etiqueta inmunogénica. La etiqueta inmunogénica puede estar en el extremo C de la proteína y la secuencia que la codifica está a 3' de la secuencia codificadora de la HA. La etiqueta inmunogénica proporciona un epítopo único para el que existen anticuerpos fácilmente disponibles, de modo que dichos anticuerpos pueden utilizarse en ensayos para detectar y confirmar la expresión de la proteína. La etiqueta inmunogénica puede ser una etiqueta HA en el extremo C de la proteína.
(e) Antígeno del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
El antígeno puede ser un antígeno del VIH o un fragmento del mismo, o una variante del mismo. Los antígenos del VIH pueden incluir secuencias de consenso modificadas para los inmunógenos. Las modificaciones genéticas que incluyen la optimización de codones, la optimización del ARN y la adición de una secuencia líder de inmunoglobina de alta eficiencia para aumentar la inmunogenicidad de los constructos pueden incluirse en las secuencias consenso modificadas. Los nuevos inmunógenos pueden diseñarse para provocar respuestas inmunitarias celulares más fuertes y amplias que los correspondientes inmunógenos optimizados por codones.
En algunas realizaciones, el antígeno del VIH puede ser un constructo de secuencia de ADN de la envoltura consenso del subtipo A, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso de la proteína de la envoltura del subtipo A, o una secuencia de proteína de la envoltura consenso del subtipo A.
En otras realizaciones, el antígeno del VIH puede ser un constructo de secuencia de ADN de la envoltura consenso del subtipo B, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso de la proteína de la envoltura del subtipo B, o una secuencia de proteína de la envoltura consenso del subtipo B.
En todavía otras realizaciones, el antígeno del VIH puede ser un constructo de secuencia de ADN de la envoltura consenso del subtipo C, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso para la proteína de la envoltura del subtipo C, o una secuencia de proteína de la envoltura consenso del subtipo C.
En otras realizaciones, el antígeno del VIH puede ser un constructo de secuencia de ADN de envoltura consenso del subtipo D, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso para la proteína de envoltura del subtipo D, o una secuencia de proteína de envoltura consenso del subtipo D.
En algunas realizaciones, el antígeno del VIH puede ser un constructo de secuencia de ADN de envoltura consenso del subtipo B Nef-Rev, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso para la proteína del subtipo B Nef-Rev, o una secuencia de proteína consenso del subtipo B Nef-Rev.
En otras realizaciones, el antígeno del VIH puede ser un constructo de secuencia de ADN consenso de Gag del subtipo A, B, C y D, una secuencia líder de IgE vinculada a una secuencia consenso de la proteína del subtipo A, B, C y D de Gag, o una secuencia de proteína consenso de Gag del subtipo A, B, C y D.
En todavía otras realizaciones, el antígeno del VIH puede ser una secuencia de ADN MPol o una secuencia de proteína MPol. El antígeno del VIH puede ser ácido nucleico o secuencias de aminoácidos de Env A, Env B, Env C, Env D, B Nef-Rev, Gag, o cualquier combinación de ellos.
(f) Antígeno del virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV)
El antígeno puede ser un antígeno LCMV o un fragmento del mismo, o una variante del mismo. El antígeno LCMV puede comprender secuencias de consenso y/o una o más modificaciones para una mejor expresión. Se pueden incluir modificaciones genéticas en las secuencias modificadas, incluida la optimización de codones, la optimización del ARN y la adición de una secuencia líder de inmunoglobulina altamente eficiente para aumentar la inmunogenicidad de las construcciones. El antígeno LCMV puede comprender un péptido señal tal como un péptido señal de inmunoglobulina (por ejemplo, péptido señal IgE o IgG) y, en algunas realizaciones, puede comprender una etiqueta HA. Los inmunógenos pueden diseñarse para provocar respuestas inmunes celulares más fuertes y más amplias que un inmunógeno optimizado con codones correspondiente.
El antígeno LCMV puede ser un antígeno de LCMV Armstron. El antígeno LCMV puede ser un antígeno del clon 13 de LCMV. El antígeno de LCMV puede ser una nucleoproteína (NP) de LCMV, una glicoproteína (GP; por ejemplo, GP-1, GP-2 y GP-C) de LCMV, una proteína L de Lc Mv , un polipéptido Z de LCMV, un fragmento del mismo, una variante del mismo o una combinación de los mismos.
(2) Antígenos de parásitos
El antígeno puede ser un antígeno del parásito o un fragmento o variante del mismo. El parásito puede ser un protozoo, un helminto o un ectoparásito. El helminto (es decir, el gusano) puede ser un gusano plano (por ejemplo, las lombrices y las tenias), un gusano con cabeza de espina o un gusano redondo (por ejemplo, los oxiuros). Los ectoparásitos pueden ser piojos, pulgas, garrapatas y ácaros.
El parásito puede ser cualquier parásito que cause las siguientes enfermedades: Queratitis por Acanthamoeba, Amebiasis, Ascariasis, Babesiosis, Balantidiasis, Baylisascariasis, Enfermedad de Chagas, Clonorquiasis, Cochliomyia, Criptosporidiosis, Difilobotriasis, Dracunculiasis, Equinococosis, Elefantiasis, Enterobiasis, Fascioliasis, Fasciolopsiasis, Filariasis, Giardiasis, Gnatostomiasis, Himenolepiasis, Isosporiasis, Fiebre de Katayama, Leishmaniasis, Enfermedad de Lyme, Paludismo, Metagonimiasis, Miasis, Oncocercosis, Pediculosis, Sarna, Esquistosomiasis, Enfermedad del sueño, Estrongiloidiasis, Taeniasis, Toxocariasis, Toxoplasmosis, Triquinosis y Triquuriasis.
El parásito puede ser Acanthamoeba, Anisakis, Ascaris lumbricoides, Botfly, Balantidium coli, Bedbug, Cestoda (tenia), Chiggers, Cochliomyia hominivorax, Entamoeba histolytica, Fasciola hepatica, Giardia lamblia, Hookworm, Leishmania, Linguatula serrata, Tenia del hígado, Loa, Paragonimus - Tenia del pulmón, Oxiuros, Plasmodium falciparum, Schistosoma, Strongyloides stercoralis, Ácaros, Tenia, Toxoplasma gondii, Tripanosoma, Látigo o Wuchereria bancrofti.
(a) Antígeno de la malaria
El antígeno puede ser un antígeno de paludismo (es decir, antígeno PF o inmunógeno PF), o un fragmento del mismo, o una variante del mismo. El antígeno puede proceder de un parásito causante de la malaria. El parásito causante del paludismo puede ser el Plasmodium falciparum. El antígeno de Plasmodium falciparum puede incluir el antígeno del circunsporozoito (CS).
En algunas realizaciones, el antígeno del paludismo puede ser moléculas de ácido nucleico tales como plásmidos que codifican uno o más de los inmunógenos de PfalciparumCS; LSA1; TRAP; CelTOS; y Amal. Los inmunógenos pueden ser de longitud completa o fragmentos inmunogénicos de proteínas de longitud completa. Los inmunógenos comprenden secuencias de consenso y/o modificaciones para mejorar la expresión.
En otras realizaciones, el antígeno de la paludismo puede ser una secuencia consenso de TRAP, que también se denomina SSP2, diseñada a partir de una compilación de todas las secuencias de longitud completa dePlasmodium falciparumTRAP/SSP2 en la base de datos GenBank (28 secuencias en total).Los inmunógenos TRAP de consenso (es decir, Los inmunógenos TRAP de consenso (es decir, inmunógeno ConTRAP) pueden comprender un péptido señal, como un péptido señal de inmunoglobulina, como un péptido señal de IgE o IgG y, en algunas realizaciones, pueden comprender una etiqueta HA.
En otras realizaciones, el antígeno de la malaria puede ser CelTOS, que también se denomina Ag2 y es un antígenode Plasmodiumaltamente conservado. Los antígenos CelTOS de consenso (es decir, el inmunógeno ConCelTOS) pueden comprender un péptido señal como un péptido señal de inmunoglobulina como un péptido señal de IgE o IgG y, en algunas realizaciones, pueden comprender una etiqueta HA.
En otras realizaciones, el antígeno de la malaria puede ser Ama1, que es un antígenode Plasmodiumaltamente conservado. El antígeno de la paludismo también puede ser una secuencia consenso de Ama1 (es decir, el inmunógeno ConAmaI) que comprende, en algunos casos, un péptido señal como un péptido señal de inmunoglobulina como un péptido señal de IgE o IgG y, en algunas realizaciones, puede comprender una etiqueta HA.
En algunas realizaciones, el antígeno de la paludismo puede ser un antígeno CS de consenso (es decir, inmunógeno CS de consenso) que comprende en algunos casos, un péptido señal como un péptido señal de inmunoglobulina como un péptido señal de IgE o IgG y en algunas realizaciones, puede comprender una etiqueta HA.
En otras realizaciones, el antígeno de la malaria puede ser una proteína de fusión que comprende una combinación de dos o más de las proteínas PF establecidas en el presente documento. Por ejemplo, las proteínas de fusión pueden comprender dos o más del inmunógeno Consenso CS, el inmunógeno ConLSA1, el inmunógeno ConTRAP, el inmunógeno ConCelTOS y el inmunógeno ConAma1 unidos directamente adyacentes entre sí o unidos con un espaciador o uno o más aminoácidos entre ellos. En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende dos inmunógenos PF; en algunas realizaciones la proteína de fusión comprende tres inmunógenos PF, en algunas realizaciones la proteína de fusión comprende cuatro inmunógenos PF, y en algunas realizaciones la proteína de fusión comprende cinco inmunógenos PF. Las proteínas de fusión con dos inmunógenos de Consenso PF pueden comprender: CS y LSA1; CS y TRAP; CS y CelTOS; CS y Amal; LSA1 y TRAP; LSA1 y CelTOS; LSA1 y Amal; TRAP y CelTOS; TRAP y Amal; o CelTOS y Ama1. Las proteínas de fusión con tres inmunógenos de Consenso PF pueden comprender: CS, LSA1 y TRAP; CS, LSA1 y CelTOS; CS, LSA1 y Amal; LSA1, TRAP y CelTOS; LSA1, TRAP y Amal; o TRAP, CelTOS y Ama1. Las proteínas de fusión con cuatro inmunógenos de Consenso PF pueden comprender: CS, LSA1, TRAP y CelTOS; CS, LSA1, TRAP y Amal; CS, LSA1, CelTOS y Amal; CS, TRAP, CelTOS y Amal; o LSA1, TRAP, CelTOS y Ama1. Las proteínas de fusión con cinco inmunógenos de consenso PF pueden incluir CS o CS-alt, LSA1, TRAP, CelTOS y Ama1.
En algunas realizaciones, las proteínas de fusión comprenden un péptido señal unido al extremo N. En algunas realizaciones, las proteínas de fusión comprenden múltiples péptidos señal unidos al terminal N de cada inmunógeno de Consenso PF. En algunas realizaciones, puede incluirse un espaciador entre los inmunógenos PF de una proteína de fusión. En algunas realizaciones, el espaciador entre los inmunógenos PF de una proteína de fusión puede ser un sitio de escisión proteolítica. En algunas realizaciones, el espaciador puede ser un sitio de corte proteolítico reconocido por una proteasa que se encuentra en las células a las que se pretende administrar y/o absorber la vacuna. En algunas realizaciones, puede incluirse un espaciador entre los inmunógenos PF de una proteína de fusión, en la que el espaciador es un sitio de escisión proteolítica reconocido por una proteasa que se encuentra en las células a las que se pretende administrar y/o absorber la vacuna, y las proteínas de fusión comprenden múltiples péptidos señal unidos al terminal N de cada inmunógeno PF de consenso, de manera que al escindirse el péptido señal de cada inmunógeno PF de consenso transloca el inmunógeno PF de consenso al exterior de la célula.
(3) Antígenos bacterianos
El antígeno puede ser un antígeno bacteriano o un fragmento o variante del mismo. La bacteria puede ser de cualquiera de los siguientes filos: Acidobacterias, Actinobacterias, Aquificae, Bacteroidetes, Caldiserica, Chlamydiae, Chlorobi, Chloroflexi, Chrysiogenetes, Cyanobacteria, Deferribacteres, Deinococcus-Thermus, Dictyoglomi, Elusimicrobia, Fibrobacteres, Firmicutes, Fusobacterias, Gemmatimonadetes, Lentisphaerae, Nitrospira, Planctomycetes, Proteobacterias, Spirochaetes, Synergistetes, Tenericutes, Thermodesulfobacteria, Thermotogae y Verrucomicrobia.
La bacteria puede ser una bacteria grampositiva o una bacteria gramnegativa. La bacteria puede ser una bacteria aeróbica o una bacteria aneróbica. La bacteria puede ser una bacteria autótrofa o una bacteria heterótrofa. La bacteria puede ser mesófila, neutrófila, extremófila, acidófila, alcalófila, termófila, psicófila, halófila u osmófila.
La bacteria puede ser una bacteria de ántrax, una bacteria resistente a los antibióticos, una bacteria causante de enfermedades, una bacteria de intoxicación alimentaria, una bacteria infecciosa, una bacteria de Salmonella, una bacteria de Staphylococcus, una bacteria de Streptococcus o una bacteria de tétanos. La bacteria puede ser una micobacteria,Clostridium tetani, Yersinia pestis, Bacillus anthracis, Staphylococcus aureusresistente a la meticilina (MRSA) oClostridium difficile.La bacteria puede serMycobacterium tuberculosis.
(a) Antígenos de Mycobacterium tuberculosis
El antígeno puede ser un antígeno deMycobacterium tuberculosis(es decir, antígeno de TB o inmunógeno de TB), o un fragmento del mismo, o una variante del mismo. El antígeno de la tuberculosis puede ser de la familia de antígenos de la tuberculosis Ag85, por ejemplo, Ag85A y Ag85B. El antígeno de la tuberculosis puede ser de la familia Esx de antígenos de la tuberculosis, por ejemplo, EsxA, EsxB, EsxC, EsxD, EsxE, EsxF, EsxH, EsxO, EsxQ, EsxR, EsxS, EsxT, EsxU, EsxV y EsxW.
En algunas realizaciones, el antígeno de latuberculosispuede ser moléculas de ácido nucleico tales como plásmidos que codifican uno o más de los inmunógenos deMycobacterium tuberculosisde la familia Ag85 y de la familia Esx. Los inmunógenos pueden ser de longitud completa o fragmentos inmunogénicos de proteínas de longitud completa. Los inmunógenos pueden incluir secuencias de consenso y/o modificaciones para mejorar la expresión. Los inmunógenos de consenso pueden comprender un péptido señal, como un péptido señal de inmunoglobulina, como un péptido señal de IgE o IgG y, en algunas realizaciones, pueden comprender una etiqueta HA.
(4) Antígenos fúngicos
El antígeno puede ser un antígeno fúngico o un fragmento o variante del mismo. El hongo puede ser especies deAspergillus, Blastomyces dermatitidis,levadurasCandida(p. ej.,Candida albicans), Coccidioides, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii, dermatofito,especies deFusarium, Histoplasma capsulatum, Mucoromycotina, Pneumocystis jirovecii, Sporothrix schenckii, Exserohilum o Cladosporium.
b) Administración
La condroitinasa y el agente pueden formularse de acuerdo con técnicas estándar bien conocidas por aquellos expertos en la técnica farmacéutica. La condroitinasa y el agente pueden estar incluidos en la misma composición o en composiciones separadas. La hialuronidasa y el agente pueden formularse de acuerdo con técnicas estándar bien conocidas por aquellos expertos en la técnica farmacéutica. La hialuronidasa y el agente pueden estar incluidos en la misma composición o en composiciones separadas. Dichas composiciones pueden administrarse en dosis y mediante técnicas bien conocidas por los expertos en las artes médicas, teniendo en cuenta factores como la edad, el sexo, el peso y la condición del sujeto en particular, y la vía de administración.
La condroitinasa y el agente pueden administrarse de forma profiláctica o terapéutica. En la administración profiláctica, la condroitinasa y el agente pueden administrarse en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmune. En aplicaciones terapéuticas, la condroitinasa y el agente se administran a un individuo que los necesita en una cantidad suficiente para producir un efecto terapéutico. La hialuronidasa y el agente pueden administrarse profiláctica o terapéuticamente. En la administración profiláctica, la hialuronidasa y el agente pueden administrarse en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmune. En aplicaciones terapéuticas, la hialuronidasa y el agente se administran a un individuo que los necesita en una cantidad suficiente para producir un efecto terapéutico. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como "dosis terapéuticamente efectiva" Las cantidades efectivas para este uso dependerán, por ejemplo, de la composición particular del régimen de vacunas administrado, la forma de administración, la etapa y la gravedad de la enfermedad, el estado general de salud del paciente y el juicio del médico que prescribe.
La condroitinasa y el agente, o la hialuronidasa y el agente, por ejemplo, se pueden administrar por medio de procedimientos bien conocidos en la técnica como se describe en Donnelly et al. (Ann. Rev. Immunol. 1997, 15, 617 648); Patente de EE. UU. N. ° 5.580.859; Patente de EE. UU. N. ° 5.703.055; y Patente de EE. UU. N. ° 5.679.647. El polinucleótido se puede combinar para formar partículas o perlas que se pueden administrar a un individuo, por ejemplo, mediante el uso de una pistola de vacunas. Un experto en la materia sabrá que la elección de un portador farmacéuticamente aceptable, incluyendo un compuesto fisiológicamente aceptable, depende, por ejemplo, de la vía de administración del vector de expresión.
La condroitinasa y el agente pueden administrarse por diversas vías. La hialuronidasa y el agente pueden administrarse por diversas vías. Las vías de administración típicas incluyen la administración parenteral, por ejemplo, intradérmica, intramuscular, a través del tejido adiposo o subcutánea. Otras vías son la administración oral, la intranasal y la intravaginal. Para un polinucleótido en particular, la condroitinasa y el agente, o la hialuronidasa y el agente, pueden administrarse a los espacios intersticiales de los tejidos de un individuo (Patente de EE.S. Patent Nos.
5,580,859 y 5,703,055). La condroitinasa y el agente, o la hialuronidasa y el agente, también pueden administrarse al músculo, o pueden administrarse mediante inyecciones intradérmicas o subcutáneas, o por vía transdérmica, como por iontoforesis. También puede emplearse la administración epidérmica. La administración epidérmica puede implicar la irritación mecánica o química de la capa más externa de la epidermis para estimular una respuesta inmunitaria al irritante (Patente de EE. UU. n.° 5.679.647).
La condroitinasa y el agente pueden ser una preparación líquida, como una suspensión, un jarabe o un elixir. La condroitinasa y el agente también pueden ser una preparación para administración parenteral, subcutánea, en tejido adiposo, intradérmica, intramuscular o intravenosa (p. ej., administración inyectable), como una suspensión o emulsión estéril. La hialuronidasa y el agente pueden presentarse en forma líquida, como una suspensión, un jarabe o un elixir. La hialuronidasa y el agente también pueden presentarse en forma de preparación para administración parenteral, subcutánea, en tejido adiposo, intradérmica, intramuscular o intravenosa (p. ej., administración inyectable), como una suspensión o emulsión estéril.
La condroitinasa y el agente, o la hialuronidasa y el agente, pueden incorporarse en liposomas, microesferas u otras matrices poliméricas (U.S. Patent No. 5,703,055; Gregoriadis, Liposome Technology, Vols. I to III, 2nd ed. 1993). Los liposomas pueden estar formados por fosfolípidos u otros lípidos, y pueden ser portadores no tóxicos, fisiológicamente aceptables y metabolizables que son relativamente sencillos de fabricar y administrar.
La condroitinasa y el agente, o la hialuronidasa y el agente, se pueden administrar mediante electroporación, tal como por medio de un procedimiento descrito en la patente de EE. UU. N.° 7.664.545. En la invención, el plásmido de ADN se administra por medio de electroporación. La electroporación puede ser por un procedimiento y/o aparato descrito en la Patente de EE.UU. n° 6.302.874, 5,676,646, 6,241,701, 6,233,482, 6,216,034, 6,208,893, 6,192,270, 6,181,964, 6,150,148, 6,120,493, 6,0 96,020, 6,068,650,y 5,702,359.. La electroporación puede llevarse a cabo mediante un dispositivo mínimamente invasivo.
El dispositivo de electroporación mínimamente invasiva ("MID") puede ser un aparato para inyectar la condroitinasa y el agente descrito anteriormente y el fluido asociado en el tejido corporal. El dispositivo puede comprender una aguja hueca, un casete de ADN y medios de suministro de fluidos, en los que el dispositivo está adaptado para accionar los medios de suministro de fluidos en uso para inyectar simultáneamente (por ejemplo, automáticamente) el ADN en el tejido corporal durante la inserción de la aguja en dicho tejido corporal. Esto tiene la ventaja de que la capacidad de inyectar el ADN y el fluido asociado gradualmente mientras se inserta la aguja conduce a una distribución más uniforme del fluido a través del tejido corporal. El dolor experimentado durante la inyección puede reducirse debido a la distribución del ADN que se inyecta en una zona más amplia.
El MID puede inyectar la condroitinasa y el agente en el tejido sin el uso de una aguja. El MID puede inyectar la vacuna en forma de una pequeña corriente o chorro con tal fuerza que la vacuna atraviesa la superficie del tejido y entra en el tejido y/o músculo subyacente. La fuerza detrás de la pequeña corriente o chorro puede ser proporcionada por la expansión de un gas comprimido, como el dióxido de carbono a través de un micro-orificio en una fracción de segundo. Se describen ejemplos de dispositivos de electroporación mínimamente invasivos y procedimientos para utilizarlos en la solicitud de patente estadounidense publicada n.° 20080234655; la patente estadounidense n.° 6.520.950; la patente estadounidense n.° 7.171.264; la patente estadounidense n.° 6.208.893; la patente estadounidense n.° 6.009.347; la patente estadounidense n.° 6.120.493; la patente estadounidense n.° 7.245.963; la patente estadounidense n.° 7.328.064; y la patente estadounidense n.° 6.763.264.
El MID puede comprender un inyector que crea un chorro de líquido de alta velocidad que perfora el tejido sin dolor. Estos inyectores sin aguja están disponibles en el mercado. Entre los ejemplos de inyectores sin aguja que pueden utilizarse en el presente documento figuran los descritos en la Patente de EE.UU. n° 3.805.783; 4,447,223; 5,505,697; y 4,342,310.
Se puede introducir (por ejemplo, inyectar) una condroitinasa y un agente deseados, una hialuronidasa y un agente, en una forma adecuada para el electrotransporte directo o indirecto, mediante el uso de un inyector sin aguja en el tejido que se va a tratar, generalmente poniendo en contacto la superficie del tejido con el inyector para activar la administración de un chorro del agente, con fuerza suficiente para provocar la penetración en el tejido. Por ejemplo, si el tejido a tratar es la mucosa, la piel o el músculo, el agente se proyecta hacia la superficie de la mucosa o de la piel con la fuerza suficiente para hacer que el agente penetre a través del estrato córneo y en las capas dérmicas, o en el tejido subyacente y el músculo, respectivamente.
Los inyectores sin aguja son adecuados para administrar medicamentos a todo tipo de tejidos, especialmente a la piel y a las mucosas. En algunas realizaciones, se puede utilizar un inyector sin aguja para impulsar un líquido que contiene la condroitinasa y el agente hacia la superficie y hacia la piel o mucosa del individuo. Ejemplos representativos de los diversos tipos de tejidos que pueden tratarse con los procedimientos de la invención incluyen el páncreas, la laringe, la nasofaringe, la hipofaringe, la orofaringe, el labio, la garganta, el pulmón, el corazón, el riñón, el músculo, la mama, el colon, la próstata, el timo, el testículo, la piel, el tejido mucoso, el ovario, los vasos sanguíneos o cualquier combinación de los mismos.
El MID puede tener electrodos de aguja que electroporan el tejido. La pulsación entre varios pares de electrodos en una matriz de electrodos múltiple, por ejemplo, dispuesta en patrones rectangulares o cuadrados, proporciona mejores resultados que la pulsación entre un par de electrodos. Divulgado, por ejemplo, en la Patente estadounidense n° 5.702.359 titulada "Needle Electrodes for Mediated Delivery of Drugs and Genes" es una matriz de agujas en la que una pluralidad de pares de agujas pueden ser pulsadas durante el tratamiento terapéutico. En esa aplicación, las agujas estaban dispuestas en un conjunto circular, pero tenían conectores y aparatos de conmutación que permitían una pulsación entre pares opuestos de electrodos de aguja. Se puede utilizar un par de electrodos de aguja para suministrar vectores de expresión recombinantes a las células. Dicho dispositivo y sistema se describe en la Patente de EE.UU. n° 6.763.264. Alternativamente, se puede utilizar un dispositivo de una sola aguja que permita la inyección del ADN y la electroporación con una sola aguja parecida a una aguja de inyección normal y que aplique pulsos de menor voltaje que los suministrados por los dispositivos utilizados actualmente, reduciendo así la sensación eléctrica experimentada por el paciente.
El MID puede comprender uno o más conjuntos de electrodos. Las matrices pueden comprender dos o más agujas del mismo diámetro o de diámetros diferentes. Las agujas pueden estar separadas de manera uniforme o irregular. Las agujas pueden tener entre 0,0127 centímetros y 0,0762 centímetros, entre 0,0254 centímetros y 0,0635 centímetros; o entre 0,0381 centímetros y 0,0508 centímetros. La aguja puede tener un diámetro de 0,0175 centímetros. Las agujas pueden ser de 0,5 mm, 1,0 mm, 1,5 mm, 2,0 mm, 2,5 mm, 3,0 mm, 3,5 mm, 4,0 mm, o más espaciadas.
El MID puede consistir en un generador de pulsos y un inyector de vacunas de dos o más agujas que administran la vacuna y los pulsos de electroporación en una sola etapa. El generador de pulsos puede permitir la programación flexible de los parámetros de pulsos e inyecciones a través de un ordenador personal operado por una tarjeta flash, así como el registro y almacenamiento exhaustivo de los datos de electroporación y del paciente. El generador de pulsos puede suministrar una variedad de pulsos de voltios durante períodos cortos de tiempo. Por ejemplo, el generador de pulsos puede suministrar tres pulsos de 15 voltios de 100 ms de duración. Un ejemplo de este tipo de MID es el sistema Elgen 1000 de Inovio Biomedical Corporation, que se describe en laPatente estadounidense n° 7.328.064.
El MID puede ser un dispositivo y sistema CELLECTRA (Inovio Pharmaceuticals, Plymouth Meeting, PA), que es un sistema modular de electrodos, que facilita la introducción de una macromolécula, como un ADN, en las células de un tejido seleccionado en un cuerpo o planta. El sistema modular de electrodos puede comprender una pluralidad de electrodos de aguja; una aguja hipodérmica; un conector eléctrico que proporciona un enlace conductor desde un controlador de impulsos de corriente constante programable a la pluralidad de electrodos de aguja; y una fuente de energía. Un operador puede agarrar la pluralidad de electrodos de aguja que están montados en una estructura de soporte e insertarlos firmemente en el tejido seleccionado en un cuerpo o planta. A continuación, las macromoléculas se introducen a través de la aguja hipodérmica en el tejido seleccionado. El controlador de impulsos de corriente constante programable se activa y se aplica un impulso eléctrico de corriente constante a la pluralidad de electrodos de aguja. El impulso eléctrico de corriente constante aplicado facilita la introducción de la macromolécula en la célula entre la pluralidad de electrodos. La muerte celular debida al sobrecalentamiento de las células se minimiza limitando la disipación de energía en el tejido en virtud de los pulsos de corriente constante. El dispositivo y el sistema de Cellectra se describen en la Patente de EE.UU. n° 7.245.963.
El MID puede ser un sistema Elgen 1000 (Inovio Pharmaceuticals). El sistema Elgen 1000 puede comprender un aparato que proporciona una aguja hueca; y medios de suministro de fluidos, en los que el aparato está adaptado para accionar los medios de suministro de fluidos en uso para inyectar simultáneamente (por ejemplo, automáticamente) el fluido, la vacuna descrita en el presente documento, en el tejido corporal durante la inserción de la aguja en dicho tejido corporal. La ventaja es que la capacidad de inyectar el fluido gradualmente mientras se inserta la aguja conduce a una distribución más uniforme del fluido a través del tejido corporal. También se cree que el dolor que se experimenta durante la inyección se reduce debido a la distribución del volumen de líquido que se inyecta en una zona más amplia.
Además, la inyección automática de fluido facilita la monitorización y el registro automáticos de una dosis real de fluido inyectado. Estos datos pueden ser almacenados por una unidad de control para fines de documentación si se desea.
Se apreciará que la tasa de inyección podría ser lineal o no lineal y que la inyección puede llevarse a cabo después de que las agujas se hayan insertado a través de la piel del individuo a tratar y mientras se insertan más en el tejido corporal.
Los tejidos adecuados en los que se puede inyectar fluido incluyen tejido tumoral, piel o tejido hepático, pero también puede ser tejido muscular.
Un aparato de administración puede comprender además un medio de inserción de aguja para guiar la inserción de la aguja en el tejido corporal. La tasa de inyección de líquido se controla mediante la tasa de inserción de la aguja. Esto tiene la ventaja de que tanto la inserción de la aguja como la inyección del fluido pueden ser controladas de tal manera que la tasa de inserción puede ajustarse a la tasa de inyección según se desee. También hace que el aparato sea más fácil de manejar para el usuario. Si se desea, se pueden proporcionar medios para insertar automáticamente la aguja en el tejido corporal.
Un usuario podría elegir cuándo iniciar la inyección del fluido. Sin embargo, lo ideal es que la inyección comience cuando la punta de la aguja haya alcanzado el tejido muscular y el aparato puede incluir medios para detectar cuándo la aguja se ha insertado a una profundidad suficiente para que comience la inyección del fluido. Esto significa que la inyección de fluido puede iniciarse automáticamente cuando la aguja haya alcanzado la profundidad deseada (que normalmente será la profundidad a la que comienza el tejido muscular). La profundidad a la que comienza el tejido muscular podría tomarse, por ejemplo, como una profundidad de inserción de la aguja preestablecida, como un valor de 4 mm que se consideraría suficiente para que la aguja atravesara la capa de piel.
Los medios de detección pueden comprender una sonda de ultrasonido. Los medios de detección pueden comprender un medio para detectar un cambio de impedancia o resistencia. En este caso, los medios pueden no registrar como tales la profundidad de la aguja en el tejido corporal, sino que se adaptarán para detectar un cambio de impedancia o resistencia a medida que la aguja se desplaza desde un tipo diferente de tejido corporal hacia el músculo. Cualquiera de estas alternativas proporciona un medio relativamente preciso y sencillo de operar para detectar que la inyección puede comenzar. La profundidad de la inserción de la aguja puede registrarse además si se desea y podría utilizarse para controlar la inyección de fluido de forma que el volumen de fluido a inyectar se determine mientras se registra la profundidad de la inserción de la aguja.
El aparato puede comprender además: una base para soportar la aguja; y una carcasa para recibir la base dentro de la misma, en la que la base es movible con respecto a la carcasa de forma que la aguja se retrae dentro de la carcasa cuando la base está en una primera posición hacia atrás con respecto a la carcasa y la aguja se extiende fuera de la carcasa cuando la base está en una segunda posición hacia adelante dentro de la carcasa. Esto es ventajoso para un usuario, ya que la carcasa puede alinearse en la piel de un paciente, y las agujas pueden entonces insertarse en la piel del paciente moviendo la carcasa con respecto a la base.
Como se ha indicado anteriormente, es deseable lograr una tasa controlada de inyección de fluido, de manera que el fluido se distribuya uniformemente a lo largo de la aguja cuando se inserta en la piel. Los medios de suministro de fluido pueden comprender medios de accionamiento de pistón adaptados para inyectar fluido a un ritmo controlado. El medio de accionamiento del pistón podría, por ejemplo, ser activado por un servomotor. Sin embargo, los medios de accionamiento del pistón pueden ser accionados por la base que se mueve en la dirección axial con respecto a la carcasa. Se apreciará que podrían proporcionarse medios alternativos para el suministro de fluidos. Así, por ejemplo, en lugar de un sistema de jeringa y pistón, podría proporcionarse un recipiente cerrado que pueda apretarse para el suministro de fluidos a una tasa controlada o no controlada.
Puede utilizarse cualquier tipo de inyección. Sin embargo, se prevé que sea particularmente útil en el campo de la electroporación, por lo que puede comprender además medios para aplicar un voltaje a la aguja. Esto permite utilizar la aguja no sólo para la inyección, sino también como electrodo durante la electroporación. Esto es particularmente ventajoso, ya que significa que el campo eléctrico se aplica a la misma zona que el fluido inyectado. Tradicionalmente ha habido un problema con la electroporación en el sentido de que es muy difícil alinear con precisión un electrodo con el fluido previamente inyectado, por lo que los usuarios han tendido a inyectar un volumen mayor de fluido que el requerido sobre un área mayor y a aplicar un campo eléctrico sobre un área mayor para intentar garantizar un solapamiento entre la sustancia inyectada y el campo eléctrico. Utilizando la presente invención, tanto el volumen de fluido inyectado como el tamaño del campo eléctrico aplicado pueden reducirse al tiempo que se consigue un buen ajuste entre el campo eléctrico y el fluido.
La administración del polipéptido de condroitinasa o del polinucleótido que codifica el polipéptido de condroitinasa y el agente puede ser concurrente o consecutiva.
i) Administración concurrente
El polipéptido de condroitinasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de condroitinasa y el agente pueden administrarse al individuo concurrentemente. En el presente documento, los términos "simultáneamente" y "simultáneamente" se utilizan indistintamente. Por ejemplo, el polipéptido de condroitinasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de condroitinasa y el agente pueden coformularse. Cuando se coformulan, el polipéptido de condroitinasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de condroitinasa y el agente pueden administrarse a un individuo en un solo paso. Cuando se coformulan, el polipéptido de condroitinasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de condroitinasa y el agente pueden administrarse a un individuo en un único paso de inyección, por ejemplo.
El polipéptido de hialuronidasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de hialuronidasa y el agente pueden administrarse al individuo concurrentemente. En el presente documento, los términos "simultáneamente" y "simultáneamente" se utilizan indistintamente. Por ejemplo, el polipéptido de hialuronidasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de hialuronidasa y el agente pueden coformularse. Cuando se coformulan, el polipéptido de hialuronidasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de hialuronidasa y el agente pueden administrarse a un individuo en un solo paso. Cuando se coformulan, el polipéptido de hialuronidasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de hialuronidasa y el agente pueden administrarse a un individuo en un único paso de inyección, por ejemplo.
ii) Administración consecutiva
El polipéptido de condroitinasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de condroitinasa y el agente pueden administrarse al individuo consecutivamente. En el presente documento, "consecutivamente" y "escalonados en el tiempo" se utilizan indistintamente. En algunas realizaciones, el polipéptido de condroitinasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de condroitinasa se administra al individuo antes de la administración del agente. El polipéptido de hialuronidasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de hialuronidasa y el agente pueden administrarse al individuo consecutivamente. En el presente documento, "consecutivamente" y "escalonados en el tiempo" se utilizan indistintamente. En algunas realizaciones, el polipéptido de hialuronidasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de hialuronidasa se administra al individuo antes de la administración del agente. El polipéptido de hialuronidasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de hialuronidasa y/o el polipéptido de condroitinasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de condroitinasa pueden administrarse al individuo al menos en unos 3 minutos, 5 minutos, 15 minutos, al menos aproximadamente 20 minutos, al menos aproximadamente 25 minutos, al menos aproximadamente 30 minutos, al menos aproximadamente 35 minutos, al menos aproximadamente 40 minutos, al menos aproximadamente 45 minutos, al menos aproximadamente 50 minutos, al menos aproximadamente 55 minutos, al menos aproximadamente 1 hora, al menos aproximadamente 1 .5 horas, al menos 2 horas, al menos 2,5 horas, al menos 3 horas, al menos 3,5 horas, al menos 4 horas, al menos 4,5 horas, al menos 5 horas, al menos 5 horas, al menos 6 horas.5 horas, al menos unas 6 horas, al menos unas 7 horas, al menos unas 8 horas, al menos unas 9 horas, al menos unas 10 horas, al menos unas 11 horas, al menos unas 12 horas, al menos unas 15 horas, al menos unas 18 horas, al menos unas 21 horas o al menos unas 24 horas antes de la administración del agente. El polipéptido de hialuronidasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de hialuronidasa y/o el polipéptido de condroitinasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de condroitinasa pueden administrarse al individuo en menos de unas 24 horas, menos de 21 horas aproximadamente, menos de 18 horas aproximadamente, menos de 15 horas aproximadamente, menos de 12 horas aproximadamente, menos de 11 horas aproximadamente, menos de 10 horas aproximadamente, menos de 9 horas aproximadamente, menos de 8 horas aproximadamente, menos de 7 horas aproximadamente, menos de 6 horas aproximadamente, menos de 5...5 horas, menos de 5 horas, menos de 4 horas.5 horas, menos de 4 horas, menos de 3,5 horas, menos de 3 horas, menos de 2,5 horas, menos de 2 horas, menos de 1,5 horas, menos de 1 hora, menos de 55 minutos, menos de 50 minutos, menos de 45 minutos, menos de 40 minutos, menos de 35 minutos, menos de 30 minutos, menos de 25 minutos, menos de 20 minutos, menos de 10 minutos, menos de 5 minutos o menos de 15 minutos antes de la administración del agente. El polipéptido de hialuronidasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de hialuronidasa y/o el polipéptido de condroitinasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido de condroitinasa pueden administrarse al individuo al menos entre unos 5 minutos y unas 24 horas antes de la administración del agente.
c) Procedimientos
i) Procedimiento de entrega de un agente
La presente invención también se dirige a un procedimiento para aumentar una respuesta inmunitaria en un individuo. Los procedimientos pueden comprender administrar al individuo un polipéptido de condroitinasa o un polinucleótido que codifica un polipéptido de condroitinasa en una cantidad suficiente para degradar los glucosaminoglicanos, y administrar al individuo el agente. Los procedimientos pueden comprender además la administración al individuo de un polinucleótido que codifica un antígeno.
La presente invención también se dirige a un procedimiento para aumentar una respuesta inmunitaria en un individuo. Los procedimientos pueden comprender administrar al individuo un polipéptido de hialuronidasa o un polinucleótido que codifica un polipéptido de hialuronidasa en una cantidad suficiente para degradar glicosaminoglicanos, y administrar al individuo el agente. Los procedimientos pueden comprender además la administración al individuo de un polinucleótido que codifica un antígeno.
ii) Procedimiento de tratamiento de una enfermedad o trastorno
La presente invención también se dirige a un procedimiento para aumentar una respuesta inmunitaria en un individuo. Los procedimientos pueden comprender administrar al individuo un polipéptido de condroitinasa o un polinucleótido que codifica un polipéptido de condroitinasa, y administrar al individuo un agente. Los procedimientos pueden comprender administrar al individuo un polipéptido de hialuronidasa o un polinucleótido que codifica un polipéptido de hialuronidasa, y administrar al individuo un agente.
Las enfermedades pueden incluir, entre otras, enfermedades cardiovasculares como la enfermedad coronaria, la aterosclerosis, la hipertensión, la hipertrofia cardíaca, el infarto de miocardio, la fibrilación ventricular o auricular y la cardiomiopatía; enfermedades neurológicas como la neuropatía o la enfermedad neurodegenerativa; enfermedades metabólicas como la diabetes; trastornos inflamatorios, incluida la enfermedad inflamatoria intestinal, como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa; trastornos dermatológicos; enfermedades autoinmunes, como la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis múltiple, la psoriasis, la dermatomiositis sistémica, el deterioro de la respuesta inmunitaria a los antígenos, la aterosclerosis, la artritis reumatoide y el lupus eritematoso; osteoporosis; osteoartritis; enfermedades causadas por infecciones víricas, bacterianas, parasitarias o fúngicas; y cáncer. La enfermedad vírica puede ser el síndrome respiratorio de Oriente Medio, por ejemplo. El individuo al que se le administra la vacuna puede tener una respuesta inmunitaria aumentada o potenciada en comparación con un individuo al que se le administra el antígeno solo. El aumento de la respuesta inmunitaria puede utilizarse para tratar y/o prevenir enfermedades en el individuo.
La enfermedad puede ser cáncer, por ejemplo, un cáncer asociado a VPH, cáncer asociado a VHB, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer cerebral, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de garganta, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de riñón, cáncer óseo, melanoma, cáncer metastásico, cáncer asociado a hTERT, cáncer asociado a antígeno FAP, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de sangre, carcinoma esofágico de células escamosas, cáncer de cuello uterino, cáncer de vejiga, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer anal, carcinoma sinovial, cáncer de testículo, papilomatosis respiratoria recurrente, cáncer de piel, glioblastoma, hepatocarcinoma, cáncer de estómago, leucemia mieloide aguda, cáncer de mama triple negativo y linfoma cutáneo primario de células T
El procedimiento puede incluir además reducir el tamaño de un tumor o lesión establecido en el individuo. El tamaño del tumor puede reducirse entre un 50% y un 100%, entre un 60% y un 100%, entre un 70% y un 100%, entre un 80% y un 100%, entre un 90% y un 100%, entre un 50% y un 95%, entre un 60% y un 95%, entre un 70% y un 95%, entre un 80% y un 95%, entre un 90% y un 95%, entre un 50% y un 90%, entre un 60% y un 90%, entre un 70% y un 90%, o entre un 80% y un 90%, en comparación con la administración del agente sin condroitinasa y/o hialuronidasa, por ejemplo. El tumor puede reducirse en tamaño en un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, en aproximadamente 93%, en aproximadamente 94%, en aproximadamente 95%, en aproximadamente 96%, en aproximadamente 97%, en aproximadamente 98%, en aproximadamente 99%, o en aproximadamente 100%, en comparación con la administración del agente sin condroitinasa y/o hialuronidasa, por ejemplo.
El procedimiento puede incluir además aumentar la regresión tumoral en el individuo en comparación con el individuo al que se le administra el agente sin condroitinasa y/o hialuronidasa. La administración del agente con condroitinasa y/o hialuronidasa puede aumentar la regresión tumoral entre un 40% y un 60%, entre un 45% y un 55%, o entre un 50%, en comparación con la administración del agente sin condroitinasa y/o hialuronidasa, por ejemplo. La administración del agente con condroitinasa y/o hialuridasa también puede aumentar la tasa de regresión tumoral. La administración del agente con condroitinasa y/o hialuronidasa puede lograr además una regresión tumoral en el individuo de alrededor del 80% a alrededor del 100%, alrededor del 85% a alrededor del 100%, alrededor del 90% a alrededor del 100%, alrededor del 95% a alrededor del 100%, alrededor del 80% a alrededor del 95%, alrededor del 85% a alrededor del 95%, alrededor del 90% a alrededor del 95%, alrededor del 80% a alrededor del 90%, o alrededor del 85% a alrededor del 90%, en comparación con la administración del agente sin condroitinasa y/o hialuronidasa. La regresión tumoral puede ser de alrededor del 80%, alrededor del 81%, alrededor del 82%, alrededor del 83%, alrededor del 84%, alrededor del 85%, alrededor del 86%, alrededor del 87%, alrededor del 88%, alrededor del 89%, alrededor del 90%, alrededor del 91%, alrededor del 92%, alrededor del 93%, alrededor del 94%, alrededor del 95%, alrededor del 96%, alrededor del 97%, alrededor del 98%, alrededor del 99% o alrededor del 100% en el individuo al que se administra el agente con condroitinasa y/o hialuronidasa, en comparación con la administración del agente solo. La regresión tumoral en el individuo al que se administra el agente con condroitinasa y/o hialuronidasa puede ser además de aproximadamente el 90% o aproximadamente el 100%.
El procedimiento puede incluir además prevenir el cáncer o el crecimiento tumoral en el individuo administrado el individuo administrado el agente con condroitinasa. Esta prevención puede permitir que el individuo al que se administra el agente con condroitinasa sobreviva a un futuro cáncer. En otras palabras, el agente con condroitinasa proporciona protección contra el cáncer al individuo al que se le administra el agente con condroitinasa. El individuo al que se le administra el agente con condroitinasa puede tener entre un 90% y un 100% de supervivencia del cáncer, en comparación con la administración del agente solo. El individuo al que se administra el agente con condroitinasa puede tener una supervivencia del cáncer de alrededor del 90%, alrededor del 91%, alrededor del 92%, alrededor del 93%, alrededor del 94%, alrededor del 95%, alrededor del 96%, alrededor del 97%, alrededor del 98%, alrededor del 99% o alrededor del 100%, en comparación con la administración del agente solo.
La presente invención tiene múltiples aspectos, ilustrados por los siguientes ejemplos no limitantes.
5) Ejemplos
Ejemplo 1
Procedimientos para los ejemplos 2 y 3
Un total de 20 ratones para el estudio INO-16-056 (Balb/c) o INO-16-057 (C57BL/6) se dividieron en cuatro grupos de 5 ratones hembra (6-7 semanas de edad) y se inmunizaron con pGX9214, un plásmido de ADN que codifica anticuerpo humano (DMAb) reactivo a Pseudomonas aeruginosa.
El músculo TA izquierdo de cada ratón del grupo experimental 2 (véase la tabla 1) se pretrató con 30 pl de hialuronidasa (400 Unidades/ml; purificada de testículos bovinos) 30 min antes de la administración de pGX9214. Los ratones del grupo 3 recibieron pretratamientos con 30 pl de condroitinasa AC de Flavibacterium heparinum y los ratones del grupo 4 recibieron pretratamientos que contenían una combinación de hialuronidasa y condroitinasa a las mismas concentraciones en el músculo TA izquierdo, seguidos de pGX9214 más PE después de 30 min. A los ratones del grupo de control (grupo 1) se les inyectó PBS antes de la administración de ADN y EP
El ADN plasmídico se administró a una concentración de 0,1 mg en 30 pl de SSC por vía intramuscular en los sitios que recibieron pretratamiento enzimático (grupos 2, 3 y 4) o sitios no tratados (grupo 1), y la electroporación se realizó inmediatamente después de la inyección. La electroporación se aplicó en el lugar de la inyección mediante el uso del dispositivo CELLECTRA®-3P (electrodos de 2 mm) (Inovio Pharmaceuticals, Inc.). Los parámetros eran:
• Número de impulsos = 2 series de 2 impulsos (2x2),
• Intensidad de corriente = 0,1 Amp,
• Tensión máxima = 200 V,
• Duración del pulso de electroporación = 52 milisegundos,
• Intervalo que separa los pulsos = 0,2 segundos entre pulsos, y 3 segundos entre cada serie de pulsos.
En los días 0, 3, 7 se sangraron ratones (50 pl) y se midieron los niveles de IgG kappa humana (DMAb PseudoV2L2MD) en el suero mediante ELISA.
Para el análisis de las respuestas humorales frente a hIgG, se realizó un ELISA frente a la proteína estándar hIgG kappa.
Ejemplo 2
Tratamiento del músculo con condroitinasa antes de la administración de la vacuna pMAb - Balb/c
Se determinó el nivel de expresión del anticuerpo monoclonal codificado por ADN en el suero de ratones Balb/c tratados con pGX9214 (Pseudo V2L2MD). El pretratamiento del lugar de administración muscular con condroitinasa AC de Flavobacterium heparinum, similar a la hialuronidasa derivada del testículo bovino, aumenta significativamente los niveles séricos de hIgG detectados.
Tabla 1: Detalles experimentales del ejemplo 2
El tratamiento de las enzimas se realizó 30 minutos antes de la administración de DMAb.
Tabla 2: Detalles del plásmido del ejemplo 2
Ejemplo 3
Tratamiento del músculo con condroitinasa antes de la administración de la vacuna de ADNp - C57BL/6De forma similar a los ratones Balb/c, los ratones C57BL/6 tratados con condroitinasa y pGX9214 muestran un mayor nivel de expresión del anticuerpo monoclonal codificado por ADN en su suero en comparación con los ratones que recibieron pGX9214 más PBS solamente. Los niveles de hIgG fueron comparables a los de los ratones pretratados con hialuronidasa antes de la inyección de ADN y de la PE, lo que demuestra que el pretratamiento del sitio de administración del músculo TA del ratón con condroitinasa aumenta significativamente los niveles séricos sistémicos de hIgG. Véase la figura 2.
Tabla 3: Detalles experimentales del ejemplo 3
El tratamiento de las enzimas se realizó 30 minutos antes de la administración de DMAb.
Tabla 4: Detalles del plásmido del ejemplo 2
Resumen de los Ejemplos 2 y 3 - Estos estudios demuestran que la administración de condroitinasa en el músculo TA de ratones Balb/c, así como de ratones C57BL/6, antes de la administración de un DMAb más EP aumenta la expresión de hIgG en el suero. La figura 1 muestra que hubo un aumento de 13,5 veces en la expresión sérica de hIgG en ratones Balb/c en el punto de tiempo máximo (día 7) en el grupo 3 pretratado con condroitinasa (media de 2904,53 ng/ml) en comparación con el grupo 1 (media de 214,86 ng/ ml). Los C57BL/6 que recibieron el mismo tratamiento (estudio INO-16-057) mostraron un aumento de 8,8 veces en la expresión sérica de hIgG en el día 7 en el grupo 3 pretratado con condroitinasa (media de 5428,49 ng/ml) en comparación con el grupo de control 1 (media de 618,21 ng/ml). Los niveles de expresión sérica de hIgG de los grupos pretratados con condroitinasa fueron comparables a los niveles de expresión sérica de hIgG mostrados en los grupos pretratados con hialuronidasa en ambas cepas murinas.
El pretratamiento con condroitinasa del músculo puede utilizarse para potenciar la expresión de DMAb en suero de ratón.
Ejemplo 4
Procedimientos para el ejemplo 5
Se administraron pGX9207, un plásmido de ADN que codifica anticuerpos humanos (DMAb) reactivos al virus corona del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-coV), a cuatro grupos de cobayas hembras que contenían cinco animales cada uno. La inyección de ADN seguida de electroporación se realizó en ambos músculos cuádriceps en todos los grupos.
Los cobayas del grupo 3 fueron tratados con 200 pl de Condroitinasa AC (0,5 Unidades/ml) en cada músculo 90 minutos antes de la administración de DMAb. Los grupos de control fueron pretratados con PBS (grupo 1) o hialuronidasa (grupo 2; 400 unidades/ml; purificada de testículos bovinos). A fin de probar si la condroitinasa muestra un efecto aditivo para degradar la matriz extracelular cava de los músculos cuádriceps tras la administración con hialuronidasa, los animales fueron pretratados con ambas enzimas, hialuronidasa y condroitinasa, 90 minutos antes de la administración de DMAb y EP en el grupo 4.
Se inyectó PGX 9207 a una concentración de 0,45 mg en 200 pl de SSC por vía intramuscular en los sitios que recibieron pretratamiento enzimático (Grupo 2, 3 y 4) o en sitios no pretratados (Grupo 1), y se realizó PE inmediatamente después de la inyección. La electroporación se aplicó en el lugar de la inyección mediante el uso del dispositivo CELLECTRA®-3P (electrodos de 8 mm) (Inovio Pharmaceuticals, Inc.).
Los parámetros eran:
Número de impulsos: 2 series de 2 pulsaciones (2x2);
Fuerza actual: 0,2 Amp;
Tensión máxima: 200V;
Duración del pulso de electroporación: 52 milisegundos;
Intervalo que separa los pulsos: 0,2 segundos entre pulsaciones y 3 segundos entre cada serie de pulsaciones. Los días 0, 3, 7, 10, 14, 17 y 21, se sangraron cobayas (200 pl) y se midieron los niveles de IgG kappa humana (DMAb MERS-hIgG) en el suero por medio de ELISA.
Tabla 5: Detalles experimentales del ejemplo 5
El tratamiento de las enzimas se realizó 90 minutos antes de la administración de DMAb.
Tabla 4: Detalles del plásmido del ejemplo 2
Ejemplo 5
El tratamiento con condroitinasa mejora la expresión sistémica de anticuerpos basados en ADN
La acción de la condroitinasa AC derivada de la bacteriaFlavobacterium heparanumaumenta los niveles séricos sistémicos de hIgG en cobayas tras la administración de pGX9207 por inyección y electroporación (EP).
La cinética de los niveles séricos de hIgG en cobayas Hartley se muestra en la Figura 3. En cada grupo, la expresión máxima se observa el día 7. Las cobayas Hartley tratadas con 0,5 unidades/ml de condroitinasa AC en 200 j l en ambos músculos cuádriceps 90 minutos antes de la administración de DMAb y EP tenían niveles 8,6 veces superiores de hIgG en su suero (media el día 7 de 485,39 ng/ml) que las cobayas pretratadas con el reactivo de control PBS (media el día 7 de 98,79 ng/ml; véase la figura 3). Los pretratamientos con condroitinasa dieron lugar a niveles de hIgG 1,74 veces superiores a los del pretratamiento con hialuronidasa (media el día 7 de 278,41 ng/ml) utilizado como control positivo. La aplicación simultánea de ambas enzimas 90 minutos antes de la administración de DMAb y EP (media de 849,57 ng/ml) sugiere un efecto aditivo (aumento de 3 veces en comparación con la hialuronidasa y de 1,75 veces en comparación con la condroitinasa).
Las concentraciones de IgG detectadas en el suero de cobayas de animales expuestos a una combinación de enzimas hialuronidasa y condroitinasa fueron superiores en comparación con los niveles en cobayas pretratadas con una sola enzima. La Figura 4 muestra ejemplos de la cinética de expresión de pGX9207.
Ejemplo 6
La condroitinasa potencia la expresión de proteínas codificadas por plásmidos en ratones (INO-16-056 e INO-16-057)
Un total de 10 ratones para el INO-16-056 (Balb/c) o el INO-16-057 (C57BL/6) se dividieron en dos grupos de 5 ratones hembra (6-7 semanas de edad) y recibieron una inyección de pGX9214 (PseudoV2L2MD (Lote # D150827)), un plásmido de ADN que codifica anticuerpo humano (DMAb) reactivo a Pseudomonas aeruginosa.
El músculo esquelético izquierdo de cada ratón del grupo experimental 2 (Tabla 6) se pretrató con 30 j l de condroitinasa AC (purificada de Flavibacterium heparinum; Sigma Aldrich) 30 min antes de la administración de pGX9214. A los ratones del grupo de control (grupo 1) se les inyectó PBS antes de la administración del ADN y la PE.
Tabla 6: Detalles experimentales del ejemplo 6
Tabla 7: Detalles experimentales adicionales del ejemplo 6
El ADN plasmídico se administró a una concentración de 0,1 mg en 30 |jl de SSC por vía intramuscular en los sitios que recibieron pretratamiento enzimático (Grupo 2) o en sitios no pretratados (Grupo 1), y la electroporación se realizó inmediatamente después de la inyección. La electroporación se aplicó en el lugar de la inyección mediante el uso del dispositivo CELLECTRA®-3P (electrodos de 2 mm) (Inovio Pharmaceuticals, Inc.).
Los parámetros en ratones para todos los experimentos de este informe fueron:
Número de impulsos = 2 series de 2 impulsos (2x2),
Intensidad de corriente = 0,1 Amp,
Tensión máxima = 200 V,
Duración del pulso de electroporación = 52 milisegundos,
Intervalo que separa los pulsos = 0,2 segundos entre pulsos, y 3 segundos entre cada serie de pulsos.
En los días 0, 3, 7 se sangraron ratones (50 j l ) y se midieron los niveles de IgG kappa humana (DMAb PseudoV2L2MD) en el suero mediante ELISA.
Resultados INO-16-056:
En la presente memoria se informa del nivel de expresión del anticuerpo monoclonal codificado por ADN en el suero de ratones Balb/c tratados con pGX9214 (PseudoV2L2MD). El pretratamiento de la zona de administración muscular con condroitinasa AC de Flavobacterium heparinum, mejora significativamente los niveles séricos de hIgG detectados (Figura 5).
Resultados INO-16-057:
De forma similar a los ratones Balb/c, los ratones C57BL/6 tratados con condroitinasa y pGX9214 muestran un mayor nivel de expresión del anticuerpo monoclonal codificado por ADN en su suero en comparación con los ratones que recibieron pGX9214 más PBS solamente (Figura 6).
Conclusión para los estudios INO-16-056 e INO-16-057:
Estos estudios demuestran que la administración de condroitinasa en el músculo esquelético de ratones Balb/c así como de ratones C57BL/6 antes de la administración de un DMAb más EP aumenta la expresión de hIgG en el suero. La figura 5 muestra que hubo un aumento de 13,5 veces en la expresión sérica de hIgG en ratones Balb/c en el punto de tiempo máximo (día 7) en el grupo 2 pretratado con condroitinasa (media de 2904,53 ng/ml) en comparación con el grupo 1 (media de 214,86 ng/ ml). Los C57BL/6 que recibieron el mismo tratamiento (estudio INO-16-057) mostraron un aumento de 8,8 veces en la expresión sérica de hIgG en el día 7 en el grupo 2 pretratado con condroitinasa (media de 5428,49 ng/ml) en comparación con el grupo de control 1 (media de 618,21 ng/ml).
En vista de lo anterior, el pretratamiento con condroitinasa del músculo puede utilizarse para potenciar la expresión de ADNp.
Ejemplo 7
La Cho-ABC de grado clínico provoca un aumento de los niveles de proteínas codificadas por plásmidos (INO-16-083B e INO-16-097)
A fin de trasladar finalmente la investigación preclínica básica de la condroitinasa a la clínica, se probó una condroitinasa ABC de grado clínico. De acuerdo con el fabricante, este producto se purifica a partir deProteus vulgarismediante cromatografía de intercambio catiónico, tiene bajos niveles de endotoxinas y no presenta contaminantes como condrosulfatasas, proteasas, heparinasas y heparitinasas. La enzima muestra una actividad similar a la Condroitinasa ABC (Condoliase) de Seikagaku. Además, añadimos GALNS, una condroitinasa recombinante humana (R&D system) a nuestro ensayo. Esta enzima, también conocida como N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa lisosomal (GalNAc6S), hidroliza los grupos 6-sulfato de las unidades N-acetil-D-galactosamina 6-sulfato del condroitín sulfato y de las unidades D-galactosa 6-sulfato del queratán sulfato. En la clínica, esta enzima se aplica para el tratamiento del síndrome de Morquio A o mucopolisacaridosis 4A, un trastorno por almacenamiento lisosómico. La enfermedad se caracteriza por la acumulación intracelular de queratán sulfato y condroitín-6-sulfato debido a la falta de GalNAc6S. La fuente de esta proteína es la derivada de Spodoptera frugiperda, Sf 21 (baculovirus) Ala27-His522, con una etiqueta N-terminal 6-His.
El objetivo era determinar la capacidad de la condroitinasa AC (F. heparinum, Sigma Aldrich) condroitinasa ABC de grado clínico (P vulgaris, Amsbio) y GALNS (condroitinasa recombinante humana, R&D systems) para potenciar la expresión de ADNp. Posteriormente, se examinó el efecto de diversas dosis de condroitinasa ABC.
INO-16-083B: A fin de evaluar la eficacia de los tres tipos diferentes de condroitinasas, se dividió a los ratones Balb/c en 4 grupos con 5 ratones por grupo. Cada ratón recibió una inyección de 0,1 mg de ADN plasmídico pGX9203 que codifica para un anticuerpo monoclonal específico del virus del dengue hIgG-DVSF-1 (lote n° D160222A) en el músculo esquelético izquierdo seguida de electroporación. Los parámetros de los procedimientos se realizaron según lo descrito para el estudio 1. Los ratones fueron tratados con las enzimas respectivas o con PBS como control 30 minutos antes de la administración del ADN, como se muestra en la tabla 2.1. Se recogieron muestras de sangre los días 0, 3 y 7 y se midieron los niveles séricos de IgG lambda humana por medio de ELISA.
Los datos sugieren que tanto la condroitinasa AC como la condroitinasa ABC potencian la expresión génica (Figura 7). Sin embargo, la proteína recombinante GALNS no lo hace.
INO-16-083B: A fin de decidir una concentración óptima para los siguientes experimentos, se probó el efecto de varias dosis de Condroitinasa ABC de grado clínico. La estrategia experimental detallada se describe en la tabla 2.3. Se aplicaron cuatro dosis diferentes de condroitinasa ABC que oscilaban entre 0,1 U/ml y 5 U/ml en ratones Balb/c (grupo 2-5) antes de la transferencia génica de pGX9207 en el músculo esquelético izquierdo y se compararon con el grupo 1 de control PBS.
El aumento de las concentraciones de condroitinasa ABC mejoró aún más la expresión del transgén con 2,5 U/ml como dosis óptima para nuestros modelos animales (Figura 8).
Para los estudios INO-16-083B e INO-16-097: Cuando los animales fueron pretratados con las condroitinasas respectivas, la enzima de grado clínico produjo un aumento similar de la expresión génica que la condroitinasa AC, lo que se demostró con éxito en experimentos anteriores. Al aplicar una concentración de 2,5 U/ml antes de la inyección de pGX9207 encontramos un aumento de 4 veces en los niveles de IgG en suero humano en comparación con el grupo de control PBS. Esta observación confirmó que la condroitinasa ABC conduce a una elevación significativa de los niveles de proteína codificada por el plásmido y proporcionó un excelente punto de partida para pruebas posteriores.
Tabla 8: Detalles experimentales del ejemplo 7.
Protocolo INO-16-083B. *Condroitinasa AC (F. heparinum); Sigma Aldrich; catálogo # C2780; 0,5U/ml; Condroitinasa ABC (P vulgaris); Amsbio, catálogo # AMS.E1028-10; 0,5U/ml, proteína humana recombinante GALNS, R&D systems, catálogo #8269-SU-050; 20jg/ml. Los tratamientos enzimáticos se realizaron 30 minutos antes de la administración de ADNp; cepa de ratón: Balb/c.
Tabla 9: Detalles experimentales adicionales para el ejemplo 7.
Protocolo INO-16-097 Condroitinasa ABC (Pvulgaris);Amsbio, catálogo n° AMS.E1028-10; los tratamientos enzimáticos se realizaron 30min antes de la administración de ADNp; cepa de ratón: Balb/c. pGX9207 (MERS IgG) -Lote n° 63682.
Ejemplo 8
La administración de Cho-ABC aumenta la expresión de proteínas (INO-16-188)
Experimentos anteriores indicaron que la condroitinasa ABC de grado clínico es aplicable para potenciar la expresión génica dependiente de plásmido en ratones. Para confirmar este hallazgo, el siguiente paso consistió en proporcionar imágenes visuales de esta mayor expresión génica en el músculo esquelético de ratón tratado con condroitinasa. Por lo tanto, un gen reportero y la expresión de proteínas medido basado en la fluorescencia.
Para la cuantificación de la expresión del gen reportero se administraron enzimas (2,5 U/ ml; 30 min de pretratamiento estándar), PBS (control) y ADNp (; pGX9902, dosis de 50 |jg por pata) en el músculo esquelético murino izquierdo y derecho por medio de electroporación (tabla 10). Transcurridas 72 horas, se disecaron los miembros posteriores murinos y se retiró la piel. La intensidad de la fluorescencia en los músculos de los ratones tratados se midió con un sistema de imágenes de fluorescencia (ProteinSimple) y se cuantificó con AlphaView SA.
Los datos revelan que la expresión del gen informador en los músculos de ratón tras el tratamiento (30 min) con condroitinasa ABC aumentó (Figura 9).
Se generaron pruebas que demuestran que la condroitinasa mejoró significativamente la expresión génica mediante la visualización de la proteína tras 72 horas de los tratamientos. Logramos una mejora de 6,7 veces al aplicar la enzima antes del tratamiento con el ADNp reportero en comparación con nuestro grupo de control. Este hallazgo de los experimentos preclínicos con ratones aseguró aún más que la condroitinasa ABC podría suponer un avance potencial en las inmunoterapias basadas en el ADN.
Tabla 10: Detalles experimentales del ejemplo 8.
Protocolo INO-16-188. Los ratones fueron pretratados con condroitinasa ABC (2,5 U/ ml) o PBS (control) en el músculo esquelético del lado izquierdo y derecho 30 min antes de la inyección de ADNp (pGX9902). Cepa de ratón: Balb/c.
Ejemplo 9
Análisis histológico de los músculos tratados con condroitinasa ABC (INO-16-195)
Para comprobar si la condroitinasa ABC produce cambios morfológicos en el tejido muscular murino, se examinó la histopatología de las extremidades posteriores tratadas en el lugar de la inyección.
Cuatro grupos de ratones recibieron un tratamiento con condroitinasa (grupo 2 y grupo 3) o con PBS (grupo 1 y grupo 4) en sus músculos esqueléticos izquierdo y derecho de la extremidad posterior (tabla 11). El ADN plasmídico (pGX9207 - MERS IgG (Lot# 163682)) se administró por medio de electroporación en los músculos de ratones pertenecientes a los grupos 1 y 2. Tras 72 horas, se diseccionaron los miembros posteriores murinos y se aislaron los músculos esqueléticos para la tinción con hemotoxilina y eosina (H&E). La tinción con H&E y el escaneado de los portaobjetos fueron realizados por una organización de investigación contratada (Reveal Biosciences). Tras obtener las imágenes de todo el músculo, se seleccionaron ejemplos representativos de la histopatología muscular mediante el software Case Viewer.
Los animales experimentales no mostraron signos de cambios en su comportamiento y parecían sanos durante y después de los procedimientos de tratamiento experimental. Tras completar el análisis, no se observaron indicios de inflamación espontánea ni daños tisulares u otros cambios histológicos aparentes cuando los músculos de los ratones se trataron únicamente con condroitinasa en comparación con el control de PBS (figura 10). Cuando el ADNp se administró adicionalmente mediante electroporación, se observó la infiltración de células inmunitarias tanto en los ratones tratados con condroitinasa como en los tratados con PBS.
Estos datos muestran que la electroporación, pero no la enzima provoca cambios reversibles en la morfología del tejido, lo que indica que la administración de la enzima no es mediadora de acontecimientos adversos graves (SAE).
Es probable que un número ligeramente superior de células infiltrantes en el grupo de condroitinasa más ADNp/EP se deba a la mayor eficacia de transfección del ADNp.
Tabla 11: Detalles experimentales adicionales para el ejemplo 9.
Ejemplo 10
Cho-ABC mejora la expresión de proteínas codificadas por plásmidos en conejos de Nueva Zelanda (INO-16-157)
Para seguir estudiando los efectos de la condroitinasa en la inmunoterapia basada en ADN, se investigó si el pretratamiento intramuscular con condroitinasa ABC era potente para potenciar la expresión de proteínas en el conejo. Se administraron 2 mg de pGX9207 (MERS IgG (Lot# 63682)) a 12 conejos de Nueva Zelanda (grupo 1 y grupo 2, edad de los animales: 9 semanas, tabla 12). La electroporación se aplicó en el lugar de las inyecciones en el músculo esquelético mediante el uso del dispositivo CELLECTRA®.
Los parámetros en conejos fueron para todos los experimentos de este informe:
Número de impulsos = 3 impulsos
Intensidad de corriente = 0,5 Amp,
Duración del pulso de electroporación = 52 milisegundos,
Intervalo que separa los pulsos = 1 segundo entre pulsos
Los animales del grupo 2 fueron pretratados con condroitinasa en el mismo sitio que la entrega de ADNp y los animales del grupo 1 sirvieron como controles de PBS. Se realizaron sangrías los días 0, 3, 5 y 6. Los niveles de IgG humana se midieron mediante ELISA.
Los datos demostraron un aumento significativo de los niveles séricos de hIgG en los grupos cuyos músculos fueron pretratados con la enzima en comparación con el tratamiento con PBS.
La mejora significativa de la expresión génica basada en ADN en el conejo mediante la inyección de la enzima degradadora de matriz (4,9 veces en comparación con el control) es coherente con los datos de ratón y consolida aún más la potencia del uso de condroitinasa ABC en la terapia génica basada en ADN plasmídico.
Ejemplo 11
Coformulación de Cho ABC con ADNp en ratones (INO-16-99B, INO-16-201, INO-16-188)
Experimentos anteriores mostraron que el momento preciso del pretratamiento con condroitinasa no es esencial para una expresión génica óptima. No se observaron diferencias significativas en los ratones cuando los pretratamos 5 min, 15 min, 30 min, 2 h, 24 h o 48 h antes de la administración de ADNp y EP Esto planteó la cuestión de si es posible coformular la condroitinasa ABC con ADNp sin afectar negativamente a la expresión génica.
Para ello se trataron 14 ratones con la enzima (2,5 U/ ml) y ADNp (pGX9702, MERS IgG (Lot #s: 63682 y 72883)) en una sola inyección (grupo 3). La PE se realizó 1 min después de la inyección debido al tiempo de reacción necesario de la condroitinasa. En este experimento se incluyeron dos grupos de control: los ratones del grupo 1 fueron pretratados con PBS y los ratones del grupo recibieron una inyección de la enzima (grupo 2). La administración del ADNp por electroporación se realizó en ambos grupos después de 30 min.
Los parámetros en ratones para todos los experimentos de coformulación en este informe fueron:
• Número de impulsos = 2 series de 2 impulsos (2x2),
• Intensidad de corriente = 0,1 Amp,
• Tensión máxima = 200 V,
• Duración del pulso de electroporación = 52 milisegundos,
• Intervalo que separa los pulsos = 0,2 segundos entre pulsos, y 3 segundos entre cada serie de pulsos.
En los días 0, 3, 6 se sangraron ratones (50 j l ) y se midieron los niveles de IgG kappa humana (DMAb PseudoV2L2MD) en el suero mediante ELISA.
Los animales que recibieron el fármaco coformulado, mostraron un alto aumento significativo de hIgG en su suero en comparación con el grupo control PBS (grupo 1). En particular, no hubo diferencias significativas en la producción de proteínas entre los animales que se sometieron al procedimiento estándar (30 min de pretratamiento; grupo 2) y los animales que recibieron el novedoso procedimiento de transferencia génica (grupo 3).
Los resultados muestran que es factible una coformulación de condroitinasa con ADNp. La expresión génica en los animales que recibieron la inyección única (enzima/ADNp) fue 5,6 veces superior a los niveles de expresión en el grupo de control PBS. Los niveles de expresión proteica mejorados fueron equivalentes a los del procedimiento original de pretratamiento tisular. Las técnicas y procedimientos de coformulación pueden ser menos complicados, menos exigentes técnicamente y ahorrar tiempo.
Ejemplo 12
La coformulación de condroitinasa con ADNp mejora la expresión de la proteína fluorescente (INO-16-188)La siguiente etapa posterior fue validar las observaciones con un plásmido reportero de fluorescencia.
Para visualizar la expresión del gen informador, se administraron condroitinasa (2,5 U/ml), PBS (control) y ADNp (pGX9902) en una única inyección en el músculo esquelético murino izquierdo y derecho mediante electroporación (tabla 14). La disección de los miembros posteriores se realizó 72 horas después de los tratamientos. La intensidad de la fluorescencia en los músculos de los ratones tratados se midió con un generador de imágenes (sistema FluorChem M, ProteinSimple) y se cuantificó con AlphaView SA.
En consonancia con los datos anteriores, la coformulación de condroitinasa ABC y ADNp conduce a una mayor expresión génica en comparación con el control PBS. No se observaron diferencias significativas en la expresión génica entre el grupo 3 (coformulación) y el grupo 2 (30 min de pretratamiento estándar).
La visualización de la expresión génica mediante el uso de un plásmido reportero confirma que la coformulación de enzima y ADNp en una única inyección es beneficiosa en el modelo de ratón.
Protocolo INO-16-188. Los ratones del grupo 3 recibieron una única inyección de condroitinasa ABC (2,5 U/ml) y ADNp (pGX9902) en el músculo esquelético del lado izquierdo y derecho 1 min antes de la PE. Los ratones de los grupos de control fueron tratados según el protocolo estándar: fueron pretratados con condroitinasa o PBS 30 min antes de la administración de ADNp y PE. Cepa de ratón: Balb/c. CoF = coformulación.
Ejemplo 13
Co-formulación de Cho ABC con ADNp en conejo (INO-16-180)
A fin de evaluar el efecto de la condroitinasa ABC/ADNp coformulada sobre la expresión génica de los músculos grandes, se realizó un experimento en el músculo esquelético de conejo. Además, se probó si un retraso de la electroporación es ventajoso en este modelo. Por último, se estudió si una incubación de 1 hora de la enzima con el ADNp repercute en la expresión génica in vivo.
Para ello se inyectaron 3 grupos de conejos (conejos de Nueva Zelanda, 6 animales por grupo, edad 12 semanas) con la coformulación enzima/ADNp (pGX9207) en el músculo esquelético izquierdo (dos inyecciones; tabla 15). La PE se realizó inmediatamente después de la administración de enzimas/ADNp en el grupo 3. En los grupos 4 y 5 la electroporación se retrasó y se realizó 1 min después de la administración de la enzima/ADNp. Los animales del grupo 5 recibieron una mezcla de condroitinasa y ADNp que se incubó en hielo 1 hora antes de los tratamientos. Los animales del grupo 1 sirvieron como controles p Bs y los animales del grupo 2 fueron pretratados según nuestro protocolo estándar de 30 min. La electroporación se aplicó en el lugar de las inyecciones en el músculo esquelético mediante el uso del dispositivo CELLECTRA®. Se realizaron sangrías los días 0, 4 y 5. Los niveles de IgG humana se midieron mediante ELISA.
Al medir los niveles de IgG humana en el suero del conejo, la producción de proteínas aumentó significativamente en los conejos a los que se administró la coformulación en comparación con el control (figura 14). Además, el retraso de 1 min del PE se asoció con un aumento de los niveles séricos de IgG humana, y se demostró una expresión equivalente tras la coformulación 1 hora antes del parto con la coformulación varios minutos antes del parto.
Los resultados demuestran la capacidad de coformular condroitinasa con ADNp para potenciar la expresión génica. El perfeccionamiento de este nuevo protocolo mediante la adición de un retraso EP de 1 min condujo a un aumento de la expresión de 6,41 veces en comparación con el control. Tras una incubación de la coformulación enzima/ADNp durante 1 hora, se alcanzaron niveles de expresión génica equivalentes en comparación con la inyección inmediata tras la formulación.
La enzima coformulante y el ADNp mejoraron la producción de proteínas en este estudio preclínico.
Ejemplo 14
Coformulación de Cho ABC con ADNp - ensayo de estabilidad in vitro del ADNp (INO-16-252A)
Para probar aún más la posibilidad de combinar condroitinasa y ADNp en una toma, se evaluó la estabilidad del ADNp tras la coformulación en diferentes condiciones. La finalidad de las pruebas de estabilidad es aportar pruebas sobre cómo varía la calidad del producto con el tiempo bajo la influencia de factores ambientales, como la temperatura, y establecer una vida útil para el futuro medicamento y las condiciones de almacenamiento recomendadas.
Para comprobar la estabilidad y la calidad del ADNp cuando se incuba con condroitinasa, se examinó el peso molecular y la conformación del ADNp mediante electroforesis en gel de agarosa. Siete muestras contenían ADNp (pGX9207, 250 ng) con condroitinasa ABC (2,5 U/ ml, tabla 9.1). Otras siete muestras sirvieron de control y consistieron en pADN y PBS. Las muestras de los grupos 1-2 se analizaron mediante electroforesis en gel (TAE, agarosa al 1 %, EmbiTec) después de la formulación, los grupos 3-4 se incubaron a temperatura ambiente (RT, definida como 21°C) durante 10 min. La incubación a RT se realizó en un ciclo PCR. Las incubaciones posteriores se realizaron como se indica a continuación: 5-6: 6°C, 120 min, 7-8: RT, 120 min, 9-10: 6°C, 24 horas, 11-12: RT, 24 horas y13-14: 6°C, 10 min. Tras la electroforesis en gel, el gel se analizó con el software Gene Sys (sin binning, EDR, exposición de 120 ms).
La construcción pGX9207 tiene una conformación superenrollada y un peso molecular de 5171 pb. Todas las muestras de ADN (las que contienen enzimas y las de control) en la conformación original con el peso original. No se observaron diferencias entre las bandas y las muestras, respectivamente (figura 15).
Dado que las bandas de todas las muestras representan un ADN superenrollado con el peso molecular original, esta aproximación inicial a la estabilidad del ADNp indica que la condroitinasa no tiene ningún impacto en la estructura del plásmido ni en la calidad del fármaco, respectivamente.
Tabla 16: Detalle experimental del ejemplo 14.
Ejemplo 15
Co-formulación de Cho ABC con ADNp - estudio de estabilidad in vivo del ADNp (INO-16-237)
Se investigó si la coformulación de condroitinasa con ADNp puede prepararse hasta 24 horas antes de la administración in vivo. Por lo tanto, se probó el efecto que las coformulaciones realizadas 10, 120 minutos o 24 horas antes del parto tenían sobre la expresión génica en ratones.
Se prepararon coformulaciones de enzima (2,5 U/ ml) y ADNp (pGX9207, 0,1 mg), 10 min, 120 min y 24 horas antes de la inyección del fármaco (intramuscular) y la electroporación (1 min retardada, tabla 10.1). Como controles, dos grupos de ratones recibieron condroitinasa (grupo 2) o PBS (grupo 1) 30 min antes del tratamiento. Se extrajo sangre los días 0, 3 y 6 y se determinaron los niveles séricos de hIgG por medio de ELISA.
No se produjo disminución de la expresión génica en ratones cuando las coformulaciones de enzima/ADNp se almacenaron durante 24 horas.
Estos datos demuestran que nuestros reactivos que contienen tanto Condroitinasa ABC como ADNp pueden almacenarse durante al menos 24 horas. Véase la Tabla 16.
Tabla 17: Detalle experimental del ejemplo 15.
Ejemplo 16
Procedimientos para los ejemplos 17 y 18
Tratamiento con hialuronidasa en la expresión sistémica de anticuerpos monoclonales
Nueve cobayas se dividieron en dos grupos de 3 cobayas Hartley hembras (6 semanas de edad) y se inmunizaron con pGX9203, un plásmido de ADN que codifica anticuerpos humanos ((DMAb) reactivos al virus del dengue, mientras que el grupo de control recibió únicamente PBS.
Los músculos de las piernas del grupo experimental I (véase la tabla siguiente) se pretrataron con 0,2 ml de hialuronidasa ((0,4 Unites/ml) purificada de testículos bovinos) en 6 sitios distintos tres horas antes de la administración de pGX9203. La administración de pGX 9203 se realizó mediante inyección intramuscular de 0,33 mg de plásmido en 200 |jl de SSC en los sitios que recibieron pretratamiento con hialuronidasa (Grupo 1) o en sitios no pretratados (Grupo 2), y la electroporación se realizó inmediatamente después de la inyección. La electroporación se aplicó en el lugar de la inyección utilizando el dispositivo CELLECTRA®-3P (electrodos de 5 mm) (Inovio Pharmaceuticals, Inc.). Los parámetros eran:
• Número de impulsos = 2 series de 2 impulsos (2x2),
• Intensidad de corriente = 0,1 Amp,
• Tensión máxima = 200 V,
• Duración del pulso de electroporación = 52 milisegundos, y
• Intervalo que separa los pulsos = 0,2 segundos entre pulsos, y 3 segundos entre cada serie de pulsos.
Los días 0, 7, 10, 14, 17, 21 y 24, se sangraron cobayas (250 j l ) y se midieron los niveles de IgG lambda humana (DMAb DVSF-1) en el suero mediante ELISA.
Para el análisis de las respuestas humorales frente a hIgG, se realizó un ELISA frente a la proteína estándar hIgG kappa.
Tabla 1
Tabla 2
Se informa del nivel de expresión del anticuerpo monoclonal codificado por ADN en el suero de cobayas tratadas con pGX9203 (pDVSF-1). El pretratamiento del lugar de administración muscular con hialuronidasa aumenta significativamente los niveles séricos de hIgG detectados. Véanse las figuras 17 y 18. La adición del pretratamiento con hialuronidasa (HYA) del músculo de la pata de cobayas a un régimen de inmunización con dNAb más EP aumenta la expresión de hIgG en el suero. La Figura 17 muestra que hubo un aumento de 18 veces en la expresión sérica de hIgG en el punto de tiempo pico (día 14) en el Grupo 1 pretratado con HYA (media de 1.700 ng/ml) comparado con el Grupo 2 (media de 92 ng/ml). La respuesta humoral del huésped frente a hIgG lambda fue mínima tanto en el Grupo 1 (título de unión de 16,66) como en el 2 (título de unión de 216,66 detectado el día 28). El pretratamiento del músculo con hialuronidasa puede utilizarse para aumentar la expresión de DMAb en el suero.
Ejemplo 17
Tratamiento con hialuronidasa del músculo antes de la administración de la vacuna de ADNp
Dos grupos de 4 cobayas Hartley hembra (10 semanas de edad) fueron inmunizados con pGX2013, un plásmido de ADN que codifica Influenza NP PR8, mientras que el grupo de control recibió únicamente PBS. El músculo TA izquierdo del grupo experimental 1 (ver tabla 3 más abajo) fue pretratado con aproximadamente 0,2 ml de hialuronidasa ((unas 0,4 Unidades/ml) purificada de testículos bovinos) unas 2 horas antes de la administración de la vacuna. Las inmunizaciones se realizaron los días 1 y 15. La administración de la vacuna se realizó por medio de la inyección de unos 20 |jg de plásmido en aproximadamente 200 j l de CSE por vía intramuscular en AT, y la electroporación se realizó inmediatamente después de la inyección. La electroporación se aplicó en el lugar de la inyección mediante el uso del dispositivo CELLECTRA®-3P (electrodos de 5 mm) (Inovio Pharmaceuticals, Inc.). Los parámetros eran:
- Número de impulsos = 2 series de 2 impulsos (2x2),
- Intensidad de corriente = 0,1 Amp,
- Tensión máxima = 200 V,
- Duración del pulso de electroporación = 52 milisegundos, y
- Intervalo que separa los pulsos = 0,2 segundos entre pulsos, y 3 segundos entre cada serie de pulsos.
14 días después de la primera y 7 días después de la segunda inmunización se sangraron cobayas (aproximadamente 3 ml), y se midieron las respuestas celulares específicas de antígeno en las poblaciones PBMC cosechadas por medio de un IFNy ELISpot, que utilizó péptidos superpuestos que abarcaban el antígeno Influenza NP PR8. El ensayo se realizó según un protocolo ELISpot modificado.
Brevemente, el protocoloELISpot utilizado es el siguiente: Se extrajeron 3 ml de sangre periférica y se transfirieron inmediatamente a tubos EDTA+ (tapón lavanda) en hielo. La sangre se diluyó 1: 1 con solución de sales equilibradas. La sangre se colocó lentamente en capas sobre 4,5 ml de gradiente de densidad de Ficoll en un tubo de 15 ml. Las células se centrifugaron a 2000 rpm, 30 minutos, a temperatura ambiente, sin freno. Se recogió la capa de Buffy y se diluyó en R10 hasta 15 ml. A continuación, se centrifugaron las células a 1500 rpm durante 5 minutos a 4 °C. Se lavaron dos veces y se pasaron por otro tamiz de 70 pm. Las células se lavaron dos veces y se pasaron por otro tamiz de 70 pm, se contaron y se diluyeron a 1 * 106 células viables por ml en medio RPMI con 10% (v/v) de FBS y 2xantibiótico-antimicótico. La viabilidad se determinó por medio de tinción con azul tripán. Los pocillos de las placas Millipore IP de 2 x 96 pocillos (Millipore, Billerica, MA) se recubrieron con 100 pl de solución primaria de anticuerpo anti-IFN-y (5 pg/ml en PBS, pH 7,4, X-D11 (Stock a 1,78 mg/ml) durante 24 h a 4 °C. La unión no específica se bloqueó con 200 pl de tampón de bloqueo 2 h a temperatura ambiente. Tras el bloqueo y el lavado, se mezclaron por triplicado 1 * 105 esplenocitos en 100 pl de RPMI con 50 pl de estimulante. Tras la incubación en CO2 humidificado al 5% a 37 °C durante 18 h, se eliminaron las células mediante lavado y se añadieron a cada pocillo 100 pl de anticuerpo secundario anti-IFN-y biotinilado (2 pg/ml, N-G3) en tampón de bloqueo. Tras 2 h de incubación y lavado, se diluyó 1:100 en tampón de bloqueo una estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina (SEL002, R&D Systems Inc., Minneapolis, M<n>) y se incubaron los pocillos con 100 pl durante 1 h a temperatura ambiente. Tras los lavados, los pocillos se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente con 100 pl de reactivo de detección BCIP/NBT (SEL002, R & D Systems). El pool de péptidos NP utilizado es la proteína nucleocápside de la gripe (virus de la gripe A (A/Puerto Rico/8.34(H1N1)), que se dividió en pools de aproximadamente 40 15-mers. Cada pool de péptidos Np (1-3) se diluyó 1 en 66 en Guinea Pig R10, 30 ul en 2 ml. Las unidades formadoras de manchas (SFU) se contaron y analizaron mediante analizadores ImmunoSpot (Cellular Technology Ltd. en Shaker Heights, OH).
Se calcularon las SFU por millón de esplenocitos para cada cobaya individual y la media /-SEM de cada grupo de ratones. La diferencia estadística entre un par de grupos inmunizados se evaluó mediante una prueba t no apareada de dos colas que generó un valor P específico. Se consideraron valores p < 0,05 como estadísticamente diferentes y, por tanto, significativos.
Para el análisis de las respuestas humorales se recogió la fracción plasmática de las preparaciones de sangre total. Se realizó una prueba ELISA frente al antígeno NP de la gripe y se determinaron los títulos de unión.
Tabla 3: Detalles experimentales del ejemplo 2
Tabla 4: Detalles del plásmido del ejemplo 2
La Figura 19 muestra las respuestas de IFN-y en PBMCs tras la estimulación con grupos de péptidos superpuestos que abarcan las longitudes del antígeno Influenza NP PR8, tal como se detectó por medio de análisis ELISpot 14 días después de la primera (prime) o 7 días después de la segunda inmunización (boost). Los títulos de unión de IgG plasmática frente al antígeno Influenza NP (IMR-274) se determinaron por medio de ELISA y se muestran en la Figura 20.
Este Ejemplo demuestra que la adición de pretratamiento con hialuronidasa (HYA) del músculo TAa un régimen de inmunización con ADNp más EP mejora la respuesta inmunitaria del huésped elicitada. La figura 19 muestra que hubo un aumento de aproximadamente 3,5 veces en puntos de IFN-y por millón en el grupo de vacuna pNP pretratado con HYA (aproximadamente 922 SFU/millón) en comparación con el grupo de vacuna pNP no pretratado (aproximadamente 258 SFU/millón); estas respuestas se midieron 14 días después de la inmunización primaria. Este aumento se triplicó aproximadamente 7 días después del refuerzo (unas 3012 frente a unas 1032 UFC/millón). La figura 20 demuestra que la respuesta humoral también aumentó en el grupo de vacuna pNP pretratado con HYA en comparación con el grupo de vacuna pNP no pretratado con HYA.
Ejemplo 18
La administración de ADN de anticuerpos monoclonales monoespecíficos y biespecíficos contra Pseudomonas aeruginosa protege a ratones de la neumonía letal
El patógeno bacteriano oportunista Pseudomonas aeruginosa es a menudo multirresistente y se asocia a malos resultados clínicos. La creciente resistencia a los fármacos y la falta de antibióticos de mecanismo novedoso en desarrollo exigen estrategias antimicrobianas alternativas, entre ellas los anticuerpos monoclonales (mAbs) específicos contra patógenos. Los MAbs dirigidos a la proteína de secreción tipo III PcrV (V2L2-MD) de Paeruginosay al exopolisacárido Psl (EPS), cada uno de los cuales confiere potentes actividades protectoras individuales y combinadas sinérgicas en modelos preclínicos de infección, son componentes del anticuerpo candidato clínico biespecífico1-1. La administración de ADN de tales mAbs podría tener importantes ventajas en las aplicaciones clínicas. Se exploró el uso de estas secuencias de ADN mAb para determinar la viabilidad de una estrategia alternativa de administración de mAb mediante la administración de ADN plasmídico (DMAb) por electroporación, que se diseñó para expresar in vivo las cadenas pesada y ligera de anticuerpos de IgG1 humana de longitud completa.
Los lugares de inyección intramuscular (IM) consistieron en ambos músculos tibial anterior y el músculo bíceps femoral derecho. Las inyecciones se administraron paralelas a la musculatura. Una hora antes de la electroporación, se administró hialuronidasa por medio de inyecciones IM, a razón de 8U en 30<|j>L por sitio. Se administraron 100 |jg en 30<|j>L de cada DMAb por medio de inyecciones IM en los tres sitios exactos previamente inyectados con hialuronidasa, y luego se electroporaron inmediatamente. Los ratones fueron desafiados intranasalmente con Paeruginosa5 días después del procedimiento de electroporación. El nivel de expresión de IgGin vivode DMAb se evaluó antes de la infección.
Se clonaron secuencias monoespecíficas V2L2-MD anti-PcrV y secuencias de cadena pesada y ligera del anticuerpo biespecífico 1-1 en el plásmido pGX001, dando lugar a DMAb-V2L2-MD y DMAb-anticuerpo1-2. Se confirmó la expresión de cada candidato en células HEK293T antes de la inyección intramuscular seguida de electroporación (IM-EP) en ratones BALB/c. Se monitorizóla expresión de anticuerpos in vivohasta 7 días después de la IM-EP, así como la actividad funcional de los mAbs expresados (actividad anticitotóxica anti-PcrV). También se evaluaron DMAb-V2L2MD y DMAb-anticuerpo 1-2 en un modelo de neumonía aguda porP aeruginosa.
Las concentraciones séricas de anticuerpos tanto de los animales tratados con DMAb-V2L2-MD como con DMAbanticuerpo 1-2 en el día 7 post IM-EP se correlacionaron con la actividad anticitotóxica ex vivo medida, lo que indica que tanto V2L2-MD como anticuerpo1-1 se expresaron y fueron funcionales. Además, en un modelo de infección pulmonar aguda murina por P. aeruginosa, tanto el DMAb-V2L2MD como el DMAb-anticuerpo 1-2 mostraron una actividad protectora in vivo significativa en comparación con un DMAb IgG de control (90% y 100% de supervivencia frente a 0%, respectivamente; P<0,0001).
Se demuestra que DMAb-V2L2-MD y DMAb-anticuerpo1-2in vivoprevienen la letalidad en un modelo murino de infección pulmonar. Además, nuestros resultados sugieren que la administración de ADN de mAbs IgG de longitud completa puede ser una estrategia de plataforma factible para prevenir infecciones bacterianas graves, y posiblemente adaptable para la profilaxis contra otros agentes infecciosos para los que se han identificado y caracterizado mAbs altamente potentes.
Ejemplo 19
Efecto de ahorro de dosis asociado a la incorporación de hialuronidasa en la formulación de vacunas
Para determinar si una coformulación de una vacuna de ADNp con hialuronidasa tiene un efecto de ahorro de dosis en la respuesta inmunitaria del huésped provocada, se trataron un total de 12 grupos de ratones BALB/c (6 por grupo) con dosis entre 10 y 0,125 ug de pGX2013 (ADNp que codifica para la nucleoproteína (NP) de la gripe). Los grupos 1-6 recibieron pGX2013 coformulado con hialuronidasa (200U/ml), y los grupos 7-12 sólo con tampón SSC. El grupo 13 sólo recibió CSS (sin vacuna). Los detalles se presentan en la tabla 1. La inmunización se realizó el día 0. La administración de la vacuna se realizó por medio de la inyección de 30 j l de formulación por vía intramuscular (músculo de la pata TA), y la electroporación se realizó inmediatamente o 60 segundos después de la inyección en los grupos sin HYA y con HYA, respectivamente. La electroporación se aplicó en el lugar de la inyección mediante el uso del dispositivo CELLECTRA®-3P (electrodos de 3 mm) (Inovio Pharmaceuticals, Inc.). Los parámetros eran:
Número de impulsos = 2 series de 2 impulsos (2x2),
Intensidad de corriente = 0,1 Amp,
Tensión máxima = 200 V,
Duración del pulso de electroporación = 52 milisegundos,
Intervalo que separa los pulsos = 0,2 segundos entre pulsos, y 3 segundos entre cada serie de pulsos.
En los días 7 y 14 se sangraron los ratones y se recogió el suero. Las respuestas humorales se detectaron mediante una prueba ELISA frente al antígeno recombinante de la nucleoproteína del virus de la gripe A/PR8/34 (H1N1). Se trazaron los títulos de unión en el punto final.
El día 14 se sacrificaron los ratones y se cosecharon los bazos. Se midieron las respuestas celulares específicas de antígeno a los epítopos NP55-69 (clase II) y NP147-155 (clase I) restringidos a la nucleoproteína H2d del virus de la gripe A/PR8/34 (H1N1) mediante un IFNy ELISpot. Las unidades formadoras de manchas (SFU) se contaron y analizaron mediante analizadores ImmunoSpot (Cellular Technology Ltd. en Shaker Heights, OH). Se calcularon y graficaron las SFU por millón de esplenocitos para cada ratón individual y la media /- SEM de cada grupo de ratones. La diferencia estadística entre un par de grupos inmunizados se evaluó mediante una prueba t no apareada de dos colas que generó un valor P específico. Se consideraron valores p < 0,05 como estadísticamente diferentes y, por tanto, significativos.
TABLA 5
Tabla 6: Detalles del plásmido del ejemplo 4
Las respuestas de IFN-y en ELISpot en poblaciones de esplenocitos se enumeraron después de la estimulación con la nucleoproteína PR8 N<p>55 (célula T CD4+) y NP147 (célula T CD8+) epítopos peptídicos (Fig. 27). Los títulos de unión de IgG sérica contra el antígeno recombinante de la nucleoproteína PR8 se determinaron por medio de ELISA (Fig. 28).
Se muestra el efecto aditivo sobre la respuesta inmunitaria del hospedador provocada en ratones BALB/c mediante la coformulación de la vacuna de ADNp con hialuronidasa. En la presente memoria se demuestra el efecto de ahorro de dosis de esta estrategia de administración. Se inmunizaron grupos de ratones BALB/c con 0,125 a 10 |jg de vacuna pNP administrada con o sin hialuronidasa. La Figura 27 muestra respuestas inmunitarias celulares equivalentes en los grupos inmunizados con dosis de pNP superiores a 0,5 jg ; sin embargo, a dosis más bajas se produjo una disminución significativa de las respuestas de células T CD8+ a NP147 a dosis de 0,25 y 0,125 ug y de las respuestas de células T CD4+ a NP55 a 0,125 ug en los grupos inmunizados sin hialuronidasa. El efecto de ahorro de dosis de la coformulación con hialuronidasa también se observó en las respuestas humorales a la vacuna pNP en el día 14 (Fig. 28). Además, el día 7 después de la inmunización pudimos detectar títulos significativos de unión al antígeno anti-NP en el suero de los ratones tratados con dosis más altas de pNP con hialuronidasa, pero no en los ratones sin hialuronidasa.
Un efecto de ahorro de dosis se asocia con la incorporación de hialuronidasa en la formulación de la vacuna de ADNp. Además, esta coformulación puede asociarse a una respuesta inmunitaria acelerada a dosis más elevadas. Véase tambien la figura 42.
Ejemplo 20
Materiales y Procedimientos para los Ejemplos 21-24
Construcción de anticuerpos monoclonales codificados por ADN y expresiónin vitro.Las construcciones de anticuerpos monoclonales codificados con ADN plasmídico (DMAb) se diseñaron como se ha descrito previamente14, 15. El pMERS se generó mediante el uso de oligonucleótidos sintéticos con varias modificaciones que codificaban las cadenas ligera (VL) y pesada (VH) para el anticuerpo monoclonal de glicoproteína de envoltura anti-MERS de longitud completa, y la secuencia final se clonó en un sistema de expresión con promotor impulsado por CMV humano. Los inmunógenos modificados y mejorados resultantes se sometieron a una optimización de codones y ARN, seguida de la clonación en el vector de expresión pVax1 por GenScript (Picastaway, NJ) con la subsiguiente producción a gran escala de estas construcciones. Los genes VH y VL se insertaron entre los sitios de restricción BamH1 y Xho1. A fin de confirmar la expresión in vitro de DMAb, se transfectaron células 293T de riñón embrionario humano (ATCC) con 3 jg por 1 x 106 células de pMERS utilizando el reactivo de transfección Lipofectamine® 3000 (Invitrogen, Carlsbad, CA).
48 horas después, se recogieron los sobrenadantes de los cultivos y se midieron los niveles de anticuerpos de unión al MERS-CoV y de hIgG mediante ELISA (descrito a continuación).
Animales. Se adquirieron ratones hembra BALB/c y Crl:Nu-Foxn1 nu (7-8 semanas de edad) a Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Las hembras de conejo blanco de Nueva Zelanda (10-12 semanas de edad, de 2 a 2,5 kg) se adquirieron en Charles River Laboratories. Se compraron macacos Rhesus de 2,35 a 4,20 kg a WWP, Inc. (Miami, FL), y se pusieron en cuarentena durante 33 días antes del inicio del estudio. Los ratones se alojaron en grupo, y los conejos y macacos rhesus se alojaron individualmente con acceso ad libitum a comida y agua. Todos los animales fueron alojados y manipulados en BTS Research (San Diego, CA) de acuerdo con las normas del Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC).
Administración intramuscular de ADNp. El ADN plasmídico purificado se formuló en citrato salino-sódico (SSC) para su posterior administración a los animales. Para los pretratamientos, los animales recibieron una preinyección intramuscular de 200U/ml de hialuronidasa purificada de testículos bovinos (Sigma) en 1xDPBS (Thermofisher, MA). Los ratones recibieron 30 pl en el músculo TA, el conejo y el macaco rhesus recibieron 1 ml en el músculo cuádriceps. Transcurridos 30 minutos, se inyectó ADN plasmídico en el mismo lugar, seguido de un tratamiento inmediato de electroporación IM. La administración de ADNp en el músculo TA de ratón se asistió con el CELLECTRA® 3P, y el CELLECTRA® 5P se utilizó para los tratamientos de conejos y macacos rhesus.
ELISA de cuantificación de IgG humana. Las placas de ensayo de 96 pocillos (Thermo Scientific™ Nunc™) se recubrieron con 100 pl/pocillo de 10 pg/ml de anticuerpo anti-huIgG fragmento Fc de cabra (Bethyl, TX) en 1x DPBS (Thermofischer, MA) durante una noche a 4°C. Al día siguiente, las placas se lavaron con TWEEn al 0,2% (v/v) en tampón de lavado IxPBS y se bloquearon con FBS al 10%(v/v) en IxDPBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Las muestras de suero se diluyeron en FBS al 1% (v/v) en TWEEN-1xPBS al 0,2% (v/v) y se añadieron 100 pl de esta mezcla a la placa de ensayo tras otro paso de lavado. Además, se prepararon diluciones estándar de cadena ligera kappa humana purificada (Bethyl, TX) como diluciones seriadas 1:2 comenzando en 500 ng/ml en tampón de dilución y se añadieron por duplicado a cada placa de ensayo. Las muestras y el estándar se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Tras el lavado, las placas se incubaron con una dilución 1:10.000 de anti-IgG kappa cadena ligera HRP de cabra (Bethyl, TX) durante 1 h a temperatura ambiente. Para la detección, se añadieron 100 pl/pocillo de solución de sustrato SureBlue (KPL, MD) a las placas lavadas. La reacción se detuvo añadiendo a las placas de ensayo 100 pl/pocillo de solución de parada de TMB (KPL, MD) al cabo de 6 minutos. Las D.O. se leyeron a 450 nm. La expresión a nivel sérico se interpoló a partir de la curva estándar utilizando un ajuste de curva logística sigmoidal de cuatro parámetros para el logaritmo de la concentración.
ELISA de unión a antígeno. Las placas de ensayo se recubrieron con 100 pl/pocillo de 1 pg/ml de proteína de espiga S1 de MERS-CoV (SinoBiological, China) en 1xDPBS (Thermofisher,<m>A) durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron con tampón 1xPBS con 0,05% de TWEEN. Las placas se lavaron con tampón 1xPBS con TWEEN al 0,05%. Se añadieron 250ul/pocillo de BSA al 3% (p/v) en 1xPBS con TWEEN al 0,05% y se incubaron durante 1hr a temperatura ambiente. Las muestras de suero se diluyeron en BSA al 1% (p/v) en 1xPBS con TWEEN al 0,05%. Tras el lavado, las placas de ensayo se llenaron con 100 pl/pocillo de tampón PBS/TWEEN 1%BSA. Para la unión al antígeno de diluciones recíprocas de suero 1:3 se realizaron diluciones seriadas de 50 pl con muestras de suero prediluidas en placas de ensayo. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras el lavado, se añadieron 100 pl de anticuerpo anti-cadenas ligeras y pesadas IgG de cabra diluido al 1:10000 (bethyl, TX) y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Para el revelado se utilizó la solución de parada SureBlue/TMB (KPL, MD) y se registró la D.O. a 450 nm.
ADA ELISA. Las placas de ensayo se recubrieron durante la noche a 4°C con 100 pl/pocillo de 0,3 pg/ml de DMAb de MERS purificado a partir de sobrenadante de cultivo celular transfectadoin vitro.Las placas se lavaron con tampón de lavado 1xPBS 0,05% TWEEN y se añadieron 250pl/pocillo de tampón de bloqueo 3%BSA/PBS/TWEEN y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Las muestras de suero se diluyeron previamente 1:25 en tampón de dilución 1%BSA/PBS/TWEEN. Tras lavar las placas de ensayo, se añadieron 100ul/pocillo de muestras prediluidas y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. Para la detección de respuestas ADA en macacos rhesus 100 pl/pocillo 1: Se añadió un anticuerpo HRP anti cadena ligera lambda humana de cabra 10000 (Bethyl, TX) y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Antes se confirmó la suficiente reactividad cruzada de este anticuerpo de detección con la IgG del macaco rhesus y la baja reactividad cruzada con la proteína de recubrimiento pMERS (datos no mostrados). Para la detección de ADA en muestras de ratón se diluyó 1 IgG Peroxidasa de cabra anti-ratón (Sigma), para conejo IgG de cabra anti-conejo (Sigma): 10000. Se utilizó SureBlue/TMB Stop Solution para el revelado de la placa y se registraron los valores de D.O. a 450 nm.
Ejemplo 21
Diseño, caracterización in vitro e in vivo de DMAbs y estrategias de mejora de la administración
Los DMAbs se definen como plásmidos de ADN que codifican las cadenas de inmunoglobulina (Ig) ligera y pesada de un anticuerpo monoclonal. En concreto, los casetes de ADN contienen ADNc para las secuencias codificantes de las cadenas Ig ligeras (VL) y pesadas (VH) variables de los mAbs de longitud completa que se han optimizado para su expresión y clonado en el vector de expresión para mamíferos pVax1. Para una separación eficiente de la cadena pesada y ligera que permita la formación de un anticuerpo de longitud completa a partir de un único marco de lectura abierta, se incluyeron en el diseño un sitio de escisión de furina y un péptido de autoprocesamiento 2A (Fig. 29a).
Para estos estudios de optimización de la administración se seleccionó una construcción de ADN plasmídico (pMERS) que codifica un mAb humano anti-síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS)-coronavirus (CoV). El pMERS se generó utilizando oligonucleótidos sintéticos con varias modificaciones que codificaban las cadenas ligera (VL) y pesada (VH) del anticuerpo monoclonal anti-MERS de longitud completa; la secuencia final se clonó en un sistema de expresión con promotor CMV humano. Se incorporaron secuencias líderes de cadenas pesadas y ligeras de inmunogloubulina para mejorar la expresión. Los inmunógenos modificados y mejorados resultantes se optimizaron mediante codón y ARN, y se clonaron en el vector de expresión pVax1 (Fig. 29a).
La producción de mAbs a partir de células transfectadas con pMERS se confirmó inicialmentein vitro.Se transfectaron células 293T humanas con el plásmido pMERS o el pVax vacío. Los niveles de anticuerpo secretado se cuantificaron en el sobrenadante 48 horas después de la transfección por medio de un ensayo inmunoenzimático (ELISA), Fig. 29b. Para confirmar la producción de anticuerpos funcionales, se midieron los niveles de unión de anticuerpos anti-MERS frente al antígeno MERS-CoV por medio de ELISA en los sobrenadantes cosechados (Fig. 29c). En resumen, los datos demostraron que las células transfectadasin vitrosecretaban anticuerpos funcionales contra el antígeno del MERS-CoV.
Se investigó la expresión in vivo del DMAb anti-MERS tras la administración intramuscular en el ratón BALB/c. La administración de dosis de ADNp desnudo de entre 6,25 y 100 |jg en el músculo tibial anterior (TA) no consiguió producir niveles séricos de IgG humana (hIgG) superiores a los de fondo (Fig. 30a). Con el objetivo de aumentar los niveles sistémicos de hIgG en el suero, se estudiaron estrategias de administración génica que han demostrado mejorar la transferencia génica in vivo. Estudios previos de DMAb demostraron una mayor expresión con el empleo de EP in vivo como auxiliar de administración. La electroporación (EP) es un procedimiento establecido de administración in vivo de ADNp, que multiplica por más de 100 la expresión génica en comparación con la administración de ADNp desnudo. La teoría en la que se basa la PE es que aumenta la permeabilidad de la membrana celular para permitir el paso eficaz de moléculas grandes (por ejemplo, ADNp) al interior de la célula. Con los bajos parámetros eléctricos empleados, el efecto EP en la célula es transitorio, y la célula sigue siendo totalmente funcional. En la presente memoria, el CELLECTRA®-3P EP se utilizó para dirigirse al músculo TAdel ratón BALB/c. La aplicación de EP en el lugar de administración del músculo TA inmediatamente después de la inyección del DMAb provocó un aumento de los niveles séricos de hIgG (media de 670 ng/ml para la dosis de 50 jg de pMERS en el día 6 después de la administración, Fig. 30b). El análisis farmacocinético de los niveles séricos de hIgG reveló un pico de expresión en el día 6 post-tratamiento (Fig. 34). Los niveles de hIgG disminuyeron rápidamente después del día 6, lo que coincidió con la elicitación de una respuesta inmunitaria del huésped dirigida contra la proteína IgG humana extraña (Fig. 35).
Se ha demostrado previamente que el uso de hialuronidasa (HYA) en protocolos de administración in vivo de ADNp EP potencia la expresión génica. La HYA cataliza la hidrólisis del hialuronano en la MEC, lo que permite un aumento transitorio de la permeabilidad tisular. Esto permite una mayor dispersión del ADNp inyectado en el tejido muscular y un aumento del número de miocitos accesibles para la transfección. Por lo tanto, se añadió HYA al protocolo de administración con el objetivo de aumentar aún más la concentración sérica de hIgG. El pretratamiento del músculo TA con 200U/ml de HYA 30 minutos antes de la administración del gen con electroporación resultó en niveles significativamente más altos (media de 2160 ng/ml (dosis de 100 jg de pMERS el día 6 después de la administración)) de hIgG en suero (Fig. 30c). La administración de pMERS por medio de pretratamiento con HYA en ausencia de EP no se asoció a un aumento de la concentración sérica de hIgG (datos no mostrados). Se realizó la producción in vivo de anticuerpo funcional (unión del suero al antígeno del CoV MERS) mediante ELISA. La unión recíproca por dilución en suero se trazó el día 6 después de la administración de pMERS (Fig. 30d). Además, se estudiaron otros reactivos para determinar si mejoraban la administración intracelular de genes, como la vitamina D, la sacarosa y los polímeros, o poseían capacidades modificadoras de la estructura de la ECM, como la elastasa y la colagenasa, y se determinó si su inclusión en el protocolo de administración de DMAb podía mejorar significativamente los niveles de hIgG. La adición de estos reactivos al protocolo de administración EP pMERS no consiguió aumentar significativamente los niveles séricos de hIgG (Fig. 36). Además, no se produjo un aumento de los niveles séricos de hIgG al añadir cualquiera de estos reactivos al protocolo de administración de EP HYA pMERS (datos no mostrados).
El sorprendente efecto del pretratamiento con HYA del músculo de entrega sobre la expresión génica se observó visualmente tras la entrega del gen reportero (pRFP) al músculo TA de ratón (Fig. 30e). Además, se observó una fuerte señal de inmunofluorescencia al ensayar la expresión de hIgG en los miocitos en el lugar del tratamiento (Fig. 30f), confirmando la producción del anticuerpo por las células musculares en el lugar de la administración de pMERS. En resumen, los datos presentados anteriormente delinean un protocolo de administración de DMAb que incluye EP y HYA que puede adoptarse para mejorar la expresión de hIgG funcional en el modelo de ratón BALB/c.
Ejemplo 22
Expresión sostenida de DMAb en ratones inmunodeficientes
Los estudios en ratones BALB/c o B6 demostraron con éxito la expresiónin vivode DMAb y la importancia de los auxiliares de administración para mejorar la transfección tisular y, en consecuencia, los niveles sistémicos de hIgG. Sin embargo, la reacción del sistema inmunitario del huésped contra la proteína hIgG extraña afectó negativamente a la cinética de expresión (Figs. 34 y 35). A fin de evitar el efecto negativo de la respuesta inmunitaria del huésped sobre la expresión de DMAb, investigamos la PK de los niveles séricos de hIgG en ratones BALB/c nude inmunodeficientes. En ausencia de un sistema inmune adaptativo funcional, los niveles séricos de hIgG no se redujeron después del día 6, sino que continuaron aumentando y estabilizándose entre los días 21 y 35 (Fig. 31a). Esto dio lugar a concentraciones más elevadas de hIgG sérica observadas en ratones nude que en ratones BALB/c (12,5 |jg/ml frente a 2,2 jg/m l de pico medio en a dosis de 100 jg de pMERS). La expresión de DMAb también se mantuvo. El análisis de la duración de la expresión reveló niveles séricos de hIgG de entre 0,77 jg/m l (grupo de dosis de 12,5 jg ) y 3,84 jg/m l (grupo de dosis de 100 jg ) a los 160 días después del parto (Fig. 31a).
Se planteó la hipótesis de que el aumento del número de miocitos transfectados daría lugar a mayores niveles sistémicos de hIgG. De este modo, sería ventajoso dirigirse a múltiples localizaciones musculares. Se administraron 100 jg por sitio de pMERS a 1, 2, 3 o 4 músculos. La Fig. 31b demuestra que es ventajoso aumentar el número de zonas del tejido muscular a las que se dirige el tratamiento. La administración de pMERS en los músculos TA y Quad izquierdo y derecho (4 sitios en total) dio lugar a la detección de 28,8 jg/m l de hIgG en el suero el día 21. La administración de dosis superiores a 100 jg en un único músculo TA no consiguió aumentar aún más los niveles séricos de hIgG. En resumen, los datos de esta sección indican que, en ausencia de una respuesta anti-hIgG, los niveles sistémicos de anticuerpos monoclonales codificados por ADN aumentan y se mantienen. Además, la selección de múltiples puntos de administración es más ventajosa que el aumento de la dosis local.
Ejemplo 23
Expresión sostenida de DMAb en ratones inmunodeficientes
Una primera etapa en el proceso de ampliación fue del ratón (aproximadamente 20 g de peso con un volumen total de sangre periférica de 2 ml) al conejo (aproximadamente 2,5 kg de peso con un volumen total de sangre periférica de 140 ml), una especie filogenéticamente más cercana a los primates que a los roedores. Además, el gran tamaño del músculo cuádriceps del conejo es compatible con el CELLECTRA®-5P, el dispositivo de PE intramuscular humano que se está utilizando actualmente en ensayos clínicos.
La cinética de expresión de pMERS se determinó en términos de IgG humana sérica en el conejo blanco de Nueva Zelanda. Los conejos fueron tratados con un total de 2 mg de pMERS administrados con CELLECTRA®-5P EP en el músculo cuádriceps tratado con HYA. Los niveles séricos de hIgG alcanzaron su máximo el día 6 (Fig. 37a), antes de descender rápidamente al nivel de fondo al séptimo día. Esta rápida pérdida de hIgG sérica coincidió con un fuerte desarrollo de anticuerpos antidroga (ADA) entre los días 6 y 7 (Fig. 37b). Sin embargo, se obtuvo una expresión sistémica robusta y consistente en este punto temporal temprano (día 6) en este modelo utilizando el sistema de administración CELl ECTRA® 5P. A continuación, se demostró el efecto del pretratamiento con hialuronidasa de la zona de liberación muscular sobre la expresión de la hIgG. El aumento de los niveles de hIgG en suero se asoció con el pretratamiento del músculo con HYA en comparación con el pretratamiento con PBS (Fig. 32a), 770 frente a 122 ng/ml (p < 0,0001) en el día 6, respectivamente (Fig. 32b). Además, la hIgG resultante era funcional según lo determinado por la unión al antígeno MERS CoV (Fig. 32c).
Los ajustes eléctricos del dispositivo CELLECTRA® 5P IM EP se optimizaron previamente para la administración e inmunogenicidad de vacunas de ADN, no de plásmido DMAb. Se investigaron los parámetros eléctricos óptimos del EP en términos de voltaje para la administración de DMAb en el contexto del pretratamiento con HYA. Se analizaron los niveles séricos de hIgG asociados a la administración de IM pMERS a 20, 35, 50 y 65 voltios. A fin de realizar este curso de tensión, se transfirieron las configuraciones de la matriz 5P y del patrón de impulsos a la caja BTS-12, un dispositivo capaz de suministrar una amplia gama de tensiones. El ajuste de 65 voltios era comparable al voltaje suministrado por el dispositivo CELLECTRA®-5P en el músculo cuádriceps de conejo. Los resultados demostraron claramente una pérdida significativa de los niveles séricos de hIgG asociada a una disminución de la tensión (Fig. 32d). Debido a la posibilidad de un aumento del daño tisular y una disminución de la tolerabilidad del tratamiento, no se investigaron voltajes más altos.
En conclusión, la presencia de niveles séricos robustos de hIgG funcional en un punto de tiempo temprano (día 6) después de la administración de pMERS con nuestro protocolo de administración optimizado apoyó el avance de la plataforma DMAb a animales más grandes.
Ejemplo 24
Aplicación de las optimizaciones de la administración de DMAb a primates no humanos
Con una fisiología y un sistema inmunitario comparables a los del ser humano, el primate no humano proporciona un modelo excepcional para estudiar el potencial traslacional de un candidato a fármaco anticuerpo a la clínica. Aplicando las optimizaciones de administración de DMAb delineadas en modelos animales más pequeños, se evaluaron los niveles de hIgG en el suero de macacos Rhesus (Maccaca mulatto). Se administró pMERS con CELLECTRA® 5P EP en músculos de cuádriceps tratados con HYA de 5 macacos Rhesus. Se detectaron niveles sistémicos de hIgG en el suero de todos los PSN (Fig. 33a). Los niveles séricos de hIgG alcanzaron su máximo entre los días 11 y 21 con un intervalo de 1,30 a 4,97 jg/ml. A fin de confirmar la producción de anticuerpos funcionales, se confirmó por medio de ELISA la unión de anticuerpos séricos al antígeno del CoV MERS. Los valores de unión al antígeno MER<s>mostraron un perfil cinético comparable a los niveles de hIgG en el suero (Fig. 33b), y se trazó la unión recíproca por dilución sérica para cada macaco rhesus el día 17 (Fig. 33c). En conjunto, estos resultados confirmaron la producción de niveles robustos de anticuerpos humanos anti-MERS-CoV en NHPs.
A fin de determinar si la elicitación de una respuesta ADA a la hIgG extraña impactaba en la farmacocinética de la expresión de DMAb en NHPs, se ensayó la unión de anticuerpos séricos a la proteína hIgG purificada codificada por pMERS mediante ELISA. Se detectó una respuesta ADA a la hIgG en otros modelos animales experimentales (Fig. 35 y 37b). En todos los NHPs detectamos la elicitación de anticuerpos contra DMAb (Fig. 33d), sin embargo, en cuatro de los cinco NHPs estos ADA se retrasaron en comparación con observaciones previas en otros animales. La magnitud de la ADA se correlacionó inversamente con los niveles séricos de hIgG (Spearman r = - 0,5811 (p = 0,0072), Fig. 33e). Esto sugiere claramente que la respuesta inmunitaria del huésped contra la IgG humana "no propia" afecta negativamente a los niveles de expresión de DMAb en macacos rhesus.
En resumen, se delinea el desarrollo de un protocolo de administración que puede aplicarse para mejorar significativamente la expresión sistémica de anticuerpos monoclonales basados en a Dn administrados al músculo de modelos animales preclínicos pequeños y grandes. Como se muestra aquí, el uso combinado de EP e hialuronidasa en el lugar de administración permite alcanzar niveles séricos de hIgG en el intervalo de pg/ml en primates no humanos.
Ejemplo 25
Coformulación de hialuronidasa con ADNp en conejos y macacos Rhesus
Los datos muestran que una coformulación de ADNp/hialuronidasa (HYA) puede administrarse en el músculo de conejo sin pérdida de expresión en comparación con el protocolo estándar de pretratamiento con HYA. Véase la figura 38. Un retraso de PE de 60 segundos tras la inyección de pDNA/HYA se asocia con una mayor expresión de DMAb. Véase la figura 39.
Los datos también muestran que una coformulación de ADNp /HY A puede administrarse en el músculo de NHP sin pérdida de expresión en comparación con el protocolo estándar de pretratamiento con HYA. Un retraso de PE de 60 segundos tras la inyección de pDNA/HYA se asocia con una mayor expresión de DMAb. Véase la Figura 40.
Ejemplo 26
Optimización del retraso del PE
Se realizaron experimentos para optimizar el retraso del PE tras la coformulación. Los datos muestran que un retraso de 20 segundos del PE tras la inyección de la coformulación puede ser óptimo. Véase la Figura 41. En consecuencia, la expresión génica aumentó significativamente tras la incorporación de un tiempo de retardo entre la administración del fármaco y la PE en comparación con el pretratamiento del tejido con protocolos HYA. Se observaron niveles equivalentes de expresión génica sin el retraso temporal en comparación con el pretratamiento tisular con protocolos HYA.
Ejemplo 27
Aumento de la respuesta inmunitaria al antígeno tumoral con la formulación HYA de la vacuna de ADN
Se planteó la hipótesis de que la inclusión de HYA a la formulación de la vacuna mejorará la respuesta inmunitaria del huésped provocada a una vacuna que codifica un autoantígeno asociado a tumor. Los resultados experimentales se muestran en la figura 43.
Para los expertos en la técnica serán evidentes diversos cambios y modificaciones en las realizaciones descritas. Dichos cambios y modificaciones, incluyendo sin limitación los relativos a las estructuras químicas, sustituyentes, derivados, intermedios, síntesis, composiciones, formulaciones o procedimientos de uso de la invención, pueden realizarse sin apartarse del alcance de la misma.
Se entiende que la descripción detallada precedente y los ejemplos que la acompañan son meramente ilustrativos y no deben tomarse como limitaciones al alcance de la invención, que se define únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Un plásmido de ADN que codifica un anticuerpo monoclonal para su uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad o trastorno en un individuo, en combinación con condroitinasa AC o condroitinasa ABC, comprendiendo el procedimiento:
administrar al individuo condroitinasa AC o condroitinasa ABC antes o simultáneamente con el plásmido de ADN que codifica un anticuerpo monoclonal, y
administrar el plásmido de a Dn por medio de electroporación.
2. El plásmido de ADN que codifica un anticuerpo monoclonal para su uso según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo monoclonal se expresain vivo.
3. El plásmido de ADN que codifica un anticuerpo monoclonal para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que la condroitinasa AC o la condroitinasa ABC se administra al individuo antes de la administración del plásmido de ADN que codifica un anticuerpo monoclonal.
4. El plásmido de ADN que codifica un anticuerpo monoclonal para uso de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la condroitinasa AC o la condroitinasa ABC se administra al individuo al menos entre unos 15 minutos y unas 24 horas antes de la administración del plásmido de ADN que codifica un anticuerpo monoclonal.
5. El plásmido de ADN que codifica un anticuerpo monoclonal para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que la condroitinasa AC o la condroitinasa ABC y el plásmido de ADN que codifica un anticuerpo monoclonal se administran al individuo simultáneamente.
6. El plásmido de ADN que codifica un anticuerpo monoclonal para uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la condroitinasa AC o la condroitinasa ABC y el plásmido de ADN que codifica un anticuerpo monoclonal se administran al individuo por vía subcutánea o intramuscular.
7. El plásmido de ADN que codifica un anticuerpo monoclonal para uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la condroitinasa AC o la condroitinasa a Bc y el plásmido de ADN que codifica un anticuerpo monoclonal se coformulan antes de la administración.
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