ES3032013T3 - Synergistic enhancement of the delivery of nucleic acids via blended formulations - Google Patents

Abstract

Se describen aquí composiciones farmacéuticas que comprenden "mezclas" de nanopartículas lipídicas y métodos relacionados para usar dichas composiciones para administrar polinucleótidos a una o más células, tejidos u órganos diana. Las composiciones se caracterizan generalmente por su capacidad para administrar eficazmente polinucleótidos a las células diana y por su capacidad para potenciar la expresión de dichos polinucleótidos y la producción de proteínas funcionales por las células diana. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Mejora sinérgica de la administración de ácidos nucleicos mediante formulaciones mezcladas homogéneamente

ANTECEDENTES

La administración eficaz de ácidos nucleicos a células y tejidos diana, así como la posterior transfección de tales ácidos nucleicos en tales células y tejidos diana, sigue siendo un desafío técnico. Por ejemplo, como resultado del tamaño y la carga de los ácidos nucleicos como el ADN y el ARN, la capacidad de administrar de manera eficaz y eficiente tales ácidos nucleicos a y/o transfectar tales células y tejidos diana es a menudo limitada.

Un enfoque para mejorar la administración de ácidos nucleicos y polinucleótidos a células y tejidos diana ha sido la encapsulación liposomal de ácido nucleico en lípidos, y en particular lípidos catiónicos. La interacción electrostática del lípido catiónico con los ácidos nucleicos facilita la formación de partículas de ácido nucleico encapsuladas en lípidos en intervalos de tamaño que pueden ser adecuados para la administración in vivo. El lípido catiónico cargado positivamente en las superficies exteriores de las partículas facilita la interacción del liposoma a base de lípidos catiónicos con las membranas celulares cargadas negativamente, promoviendo de este modo la fusión del liposoma con la membrana celular

y la administración del liposoma y/o el vaciado intracelular del contenido de ácido nucleico del liposoma. Aunque ya se han descrito varias ventajas del uso de liposomas para facilitar la administración de agentes terapéuticos a células y tejidos diana, siguen existiendo muchos problemas en las aplicaciones in vivo, ex vivo e in vitro. Por ejemplo, muchos de los lípidos catiónicos son generalmente tóxicos para las células diana y, por consiguiente, pueden tener un uso limitado. Además, los portadores liposomales pueden no ser el medio más eficaz de administrar ácidos nucleicos a las células diana o de transfectar posteriormente tales células.

El documento US 2011/244026 describe composiciones farmacéuticas para la administración de ARNm que comprenden nanopartículas lipídicas. El documento WO 2012/170930 describe composiciones y métodos para modular la producción de una proteína en una célula diana. El documento US 2006/216343 describe composiciones farmacéuticas que comprenden un oligonucleótido como agente activo. Xingfang Su et al., 240th National Meeting of the American Chemical Society, 25-26 de agosto de 2010, describe una nanopartícula biodegradable envuelta en lípidos. Yuhua Wang y otros, Mol Ther. febrero de 2013;21(2):358-6, proponen una administración sistémica de ARN mensajero (ARNm) modificado químicamente como alternativa al<a>D<n>plasmídico (ADNp) en la terapia génica del cáncer.

Siguen siendo necesarios nuevos enfoques y terapias para mejorar la eficacia de la administración y/o la transfección de polinucleótidos y ácidos nucleicos, en particular los administrados en vehículos de administración liposomales, como las formulaciones liposomales encapsuladas. El desarrollo de vehículos nuevos y mejorados de administración liposomales y de formulaciones liposomales que demuestren eficacias de administración y/o transfección mejoradas haría avanzar aún más las terapias basadas en ácidos nucleicos para el tratamiento de enfermedades, como las terapias de silenciamiento de genes y ARNm, que pueden beneficiarse de las terapias de sustitución de genes, las terapias de administración de ARNm y/u otras terapias que incluyen la administración intracelular de ácidos nucleicos para la modulación de la expresión de genes, proteínas y/o enzimas.

SUMARIO

La invención proporciona una composición farmacéutica para la administración de polinucleótidos de ARN mensajero (ARNm) a una célula, la composición comprendiendo una primera nanopartícula lipídica y una segunda nanopartícula lipídica, en donde la primera nanopartícula lipídica comprende el ARNm y en donde la segunda nanopartícula lipídica no encapsula un polinucleótido.

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento inesperado de que una mezcla homogénea de múltiples nanopartículas lipídicas no idénticas mejora sinérgicamente la expresión de ARN mensajero (ARNm) encapsulado en por lo menos una de las nanopartículas lipídicas in vivo. Este efecto sinérgico se observa en una amplia variedad de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente en varias proporciones y a través de distintas vías de administración. Por ejemplo, en algunos casos, las mejoras en la expresión de proteínas (por ejemplo, evidenciadas por la salida de luz de una luciferasa de luciérnaga) variaron de aproximadamente 1,5 veces a 30 veces de aumento en comparación con el total aditivo basado en cada nanopartícula individual. La sinergia también se observa tanto en la expresión sistémica como en la específica de tejido del ARNm. Lo que es más sorprendente, este efecto sinérgico no es específico del ácido nucleico. Por ejemplo, un ARNm no fluorescente puede mejorar sinérgicamente la producción de luz de un ARNm fluorescente. Se contempla que este descubrimiento inesperado de mejora sinérgica entre diferentes formulaciones lipídicas tenga una implicación significativa en la terapia con ARN mensajero porque permite alcanzar una eficacia terapéutica equivalente mediante la administración de una dosis significativamente menor. La capacidad de crear una producción sinérgica de proteína a través de la administración de nanopartículas a base de lípidos del ARNm también permite una ventana terapéutica mucho mayor para el tratamiento de una multitud de enfermedades y logra una eficacia igual o mayor a la vez que minimiza cualquier evento adverso o tóxico. Por tanto, la presente invención proporciona una terapia de ARN mensajero más segura y potente para varias enfermedades.

Entre otras cosas, en la presente se divulgan composiciones farmacéuticas que comprenden una mezcla homogénea de por lo menos dos nanopartículas lipídicas (por ejemplo, una mezcla homogénea de una primera nanopartícula lipídica y una segunda nanopartícula lipídica) y métodos relacionados de uso de tales composiciones de nanopartículas mezcladas homogéneamente, como se define en las reivindicaciones. Por lo menos una de las nanopartículas lipídicas constituyentes que comprende la composición de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente comprende (por ejemplo, encapsula) ARNm, como se define en las reivindicaciones. Las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente descritas en la presente se caracterizan por ser capaces de administrar eficazmente los polinucleótidos encapsulados a las células diana, y también se caracterizan por su capacidad para mejorar la transfección posterior de tales polinucleótidos encapsulados después de entrar en contacto con una o más de tales células diana. Las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente también se caracterizan por su capacidad de modular o mejorar (por ejemplo, aumentar sinérgicamente) la expresión de los polinucleótidos encapsulados en las mismas por las células diana. Las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente también pueden caracterizarse por su capacidad para mejorar la producción de polipéptidos codificados por tales polinucleótidos.

Como se usa en la presente, el término "mezcla homogénea", "mezclado homogéneamente" o equivalentes gramaticales, se refiere a una combinación de dos o más formulaciones separadas no idénticas. Típicamente, las dos o más formulaciones separadas, no idénticas, se combinan o mezclan homogéneamente en una composición, como una suspensión, como se representa, por ejemplo, en la FIG. 1. Como se usa en la presente, las formulaciones no idénticas se refieren a formulaciones que contienen por lo menos un componente lipídico distinto. En algunas realizaciones, las formulaciones no idénticas adecuadas para la mezcla homogénea contienen por lo menos un componente lipídico catiónico distinto. El término "mezcla homogénea", como se usa en la presente, se distingue del término "mezclar" o "mezcla", que se usan en la presente para definir una única formulación que contiene múltiples lípidos catiónicos/ionizables no idénticos, múltiples lípidos auxiliares no idénticos y/o múltiples lípidos PEGilados no idénticos. En algunas realizaciones, una formulación de "mezcla" contiene por lo menos dos o más lípidos catiónicos/ionizables no idénticos. Típicamente, una formulación de "mezcla" contiene una única población homogénea de nanopartículas lipídicas.

Ciertos casos divulgados se refieren a métodos de expresión de uno o más polinucleótidos en una o más células diana. Por ejemplo, cuando el ARNm codifica una proteína funcional, en la presente se divulgan métodos para mejorar la producción y/o excreción de polipéptidos codificados por tales polinucleótidos por una célula diana. Ciertos casos divulgados se refieren a métodos para modular la expresión de uno o más polinucleótidos o ácidos nucleicos (por ejemplo, un ácido nucleico diana) en una o más células diana, usando por ejemplo un oligonucleótido antisentido. Tales métodos pueden comprender poner en contacto las una o más células diana con una composición farmacéutica que comprende una mezcla homogénea de por lo menos dos nanopartículas lipídicas (por ejemplo, una primera nanopartícula lipídica y una segunda nanopartícula lipídica), en donde dichas primera y segunda nanopartículas lipídicas tienen composiciones lipídicas diferentes (por ejemplo, la primera composición lipídica comprende un lípido catiónico diferente al de la segunda composición de nanopartícula lipídica). Por lo menos una de las dos o más nanopartículas lipídicas que componen la composición de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente comprende uno o más polinucleótidos, como se define en las reivindicaciones. Por ejemplo, la primera nanopartícula lipídica encapsula uno o más polinucleótidos y la segunda nanopartícula lipídica puede no encapsular uno o más polinucleótidos, como se define por las reivindicaciones.

Como se define en las reivindicaciones, una de las dos o más nanopartículas lipídicas que componen la composición mezclada homogéneamente comprende o encapsula un polinucleótido. Por ejemplo, cuando las composiciones farmacéuticas comprenden dos nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente, sólo la primera nanopartícula lipídica comprende uno o más polinucleótidos mientras que la segunda nanopartícula lipídica no comprende un polinucleótido (es decir, el segundo polinucleótido está vacío). En tal realización, después de la administración (por ejemplo, por vía intravenosa) de las dos, la primera y la segunda, nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente que componen la composición farmacéutica al sujeto, la producción de uno o más polipéptidos o proteínas codificados por los polinucleótidos encapsulados por una célula diana se mejora con respecto a la producción de uno o más polipéptidos o proteínas observada cuando la primera nanopartícula lipídica se administra al sujeto independientemente de la segunda nanopartícula lipídica. Por ejemplo, en tal realización, la producción de los uno o más polipéptidos o proteínas por las células diana después de la administración de dicha composición farmacéutica mezclada homogéneamente a un sujeto excede la producción de uno o más polipéptidos o proteínas cuando la primera nanopartícula lipídica se administra al sujeto independientemente de la segunda nanopartícula lipídica en por lo menos aproximadamente dos-, cinco, diez, doce, quince, o veinte veces , veinticinco, treinta, cuarenta, cincuenta, cien, quinientas, mil veces o más.

Después de que una o más células diana entren en contacto con las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente divulgadas en la presente (por ejemplo, administrando por vía intravenosa la composición farmacéutica mezclada homogéneamente a un sujeto) una o más de tales células diana se transfectan con y pueden expresar los uno o más polinucleótidos y/o mejorar la producción de uno o más polipéptidos funcionales o proteínas codificadas portales uno o más polinucleótidos. En ciertas realizaciones, el contacto de tales células diana con las nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente y las composiciones farmacéuticas de tal manera que las células diana sean transfectadas por los uno o más polinucleótidos encapsulados mejora (por ejemplo, aumenta sinérgicamente) la expresión de tales polinucleótidos y/o aumenta la producción de una proteína funcional o producto polipeptídico que puede ser útil en el tratamiento de una enfermedad o afección patológica (por ejemplo, enfermedades resultantes de una deficiencia proteica o enzimática). En ciertas realizaciones, durante o después de la transfección por las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente descritas en la presente, la expresión de los polinucleótidos encapsulados y/o la producción de un polipéptido o proteína funcional por una o más células diana se aumenta sinérgicamente, y en particular se aumenta sinérgicamente con respecto a la expresión de los polinucleótidos y/o la producción de un polipéptido o proteína funcional que se observa cuando las nanopartículas lipídicas constituyentes que componen la composición mezclada homogéneamente (por ejemplo, la primera nanopartícula lipídica y la segunda nanopartícula lipídica) se administran independientemente la una de la otra. La expresión de los polinucleótidos encapsulados que componen la composición mezclada homogéneamente (y/o cuando tales polinucleótidos comprenden ARNm, la producción de los polipéptidos codificados por tales polinucleótidos encapsulados) puede aumentarse, por ejemplo, en por lo menos aproximadamente dos, tres, cuatro, cinco, seis, ocho, diez, doce, quince, veinte, veinticinco, treinta, cuarenta o cincuenta veces, o más con respecto a la expresión del polinucleótido (y/o la producción del polipéptido cuando dicho polinucleótido comprende ARNm) que se observa cuando las nanopartículas lipídicas constituyentes que componen la formulación mezclada homogéneamente se administran independientemente.

En la presente también se describen métodos para modular o aumentar la expresión de uno o más polinucleótidos y métodos para aumentar la producción de uno o más polipéptidos o proteínas funcionales en una o más células diana (por ejemplo, células diana de un sujeto al que se administran las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente). Tales métodos pueden comprender el paso de administrar o poner en contacto de otro modo células o tejidos diana con una composición farmacéutica que comprende una mezcla homogénea de por lo menos una primera nanopartícula lipídica y una segunda nanopartícula lipídica, en donde la primera nanopartícula lipídica comprende uno o más polinucleótidos. Después de la administración o contacto de otro modo de las células o tejidos diana con las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente, una o más células diana se transfectan con los uno o más polinucleótidos encapsulados en una o más de las nanopartículas lipídicas constituyentes, de tal manera que se aumenta o se aumenta sinérgicamente la expresión de los uno o más polinucleótidos y/o la producción de uno o más polipéptidos o proteínas funcionales con respecto a la expresión de los uno o más polinucleótidos o la producción de uno o más polipéptidos o proteínas funcionales cuando la primera nanopartícula lipídica se administra independientemente de la segunda nanopartícula lipídica. En ciertas realizaciones, la expresión de los polinucleótidos encapsulados que componen la composición mezclada homogéneamente puede incrementarse, por ejemplo, en por lo menos aproximadamente dos, cuatro, cinco, diez, doce, quince, veinte, o veinticinco, cincuenta, setenta y cinco, cien, doscientas, quinientas, mil veces, o más con respecto a la expresión observada cuando las nanopartículas lipídicas constituyentes que componen la formulación mezclada homogéneamente se administran independientemente.

También se divulgan en la presente composiciones farmacéuticas que comprenden una mezcla homogénea de una primera nanopartícula lipídica y una segunda nanopartícula lipídica, en donde la primera nanopartícula lipídica comprende uno o más polinucleótidos, como se define en las reivindicaciones. Después de que una o más células diana entren en contacto con la composición farmacéutica, los uno o más polinucleótidos encapsulados por las nanopartículas lipídicas constituyentes transfectan las células diana y se expresan, y comprenden ARNm como se define en las reivindicaciones, produciendo de este modo un polipéptido o proteína funcional. En ciertas realizaciones, la expresión de los uno o más polinucleótidos por las células diana excede la suma relativa de la expresión de los uno o más polinucleótidos lograda por la primera nanopartícula lipídica y la segunda nanopartícula lipídica que comprenden la composición farmacéutica cuando las células diana entran en contacto con la primera nanopartícula lipídica y la segunda nanopartícula lipídica independientemente la una de la otra. En otras realizaciones, la producción de uno o más polipéptidos funcionales por las células diana excede la suma relativa de la producción de uno o más polipéptidos funcionales lograda por la primera nanopartícula lipídica y la segunda nanopartícula lipídica que componen la composición farmacéutica cuando las células diana entran en contacto con la primera nanopartícula lipídica y la segunda nanopartícula lipídica independientemente una de la otra.

En ciertas realizaciones, la primera nanopartícula lipídica o la segunda nanopartícula lipídica comprende uno o más lípidos catiónicos. Por ejemplo, una o ambas de la primera y la segunda nanopartículas lipídicas pueden incluir uno o más de C12-200, DOTAP (1,2-dioleil-3-trimetilamonio propano), DODAP (1,2-dioleil-3-dimetilamonio propano), DOTMA (1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano), DLinDMA, DLin-KC2-DMA, HGT4003 e ICE.

En ciertas realizaciones, la primera nanopartícula lipídica o la segunda nanopartícula lipídica comprenden uno o más lípidos auxiliares. Por ejemplo, una o ambas de la primera y la segunda nanopartículas lipídicas que componen las composiciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente pueden incluir uno o más de los lípidos auxiliares seleccionados del grupo que consiste en DSPC (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DPPC (1,2dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DOPE (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DPPE (1,2-dipalmitoyl-snglicero-3-fosfoetanolamina), DMPE (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPG (,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(l'-rac-glicerol)) y colesterol.

De manera similar, en ciertas realizaciones, la primera nanopartícula lipídica o la segunda nanopartícula lipídica pueden comprender uno o más lípidos modificados con PEG. Por ejemplo, una o ambas de la primera y la segunda nanopartículas lipídicas pueden comprender uno o más lípidos modificados con PEG que comprenden una cadena de poli(etilenglicol) de hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lípido que comprende una o más cadenas alquílicas de C6-C20 de longitud.

En ciertas realizaciones, una o más de las por lo menos dos nanopartículas lipídicas que componen las composiciones mezcladas homogéneamente de la invención se preparan combinando o comprenden múltiples componentes lipídicos, no lipídicos y/o poliméricos. Por ejemplo, la primera nanopartícula lipídica o la segunda nanopartícula lipídica pueden comprender DLinDMA, CHOL, DOPE y DMG-PEG-2000. En algunas realizaciones, la primera nanopartícula lipídica o la segunda nanopartícula lipídica comprende C12-200, CHOL, DOPE y DMG-PEG-2000. En algunas realizaciones, la primera nanopartícula lipídica o la segunda nanopartícula lipídica comprende DLinKC2, CHOL, DOPE y DMG-PEG-2000. De manera similar, una o más de la primera nanopartícula lipídica y la segunda nanopartícula lipídica pueden comprender uno o más lípidos seleccionados del grupo que consiste en ICE, DSPC, CHOL, DODAP, DOT<a>P y C8-PEG-2000. En otra realización, la primera nanopartícula lipídica o la segunda nanopartícula lipídica comprende ICE, DOPE y DMG-PEG-2000. En otra realización más, la primera nanopartícula lipídica o la segunda nanopartícula lipídica comprende HGT4003, DOPE, CHOL y DMG-PEG-2000.

En ciertas realizaciones, las composiciones lipídicas de las dos o más nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente son diferentes (por ejemplo, tienen composiciones lipídicas diferentes). Por ejemplo, en la presente se contemplan composiciones mezcladas homogéneamente en donde la primera nanopartícula lipídica comprende un lípido catiónico, y en donde la segunda nanopartícula lipídica comprende un lípido catiónico que es diferente del lípido catiónico que comprende la primera nanopartícula lipídica.

También se describen en la presente métodos para mejorar o aumentar de otro modo (por ejemplo, aumentar sinérgicamente) la administración o la tasa de administración de uno o más polinucleótidos a una o más células diana, así como métodos para mejorar el tiempo de residencia de uno o más polinucleótidos dentro de una célula diana. Tales métodos comprenden generalmente poner en contacto una o más células diana con una composición farmacéutica que comprende una mezcla homogénea de por lo menos dos nanopartículas lipídicas, cada una teniendo una composición lipídica diferente, de tal manera que se mejora la administración de los polinucleótidos (por ejemplo, a una o más células, tejidos u órganos diana). Tras la administración de tales uno o más polinucleótidos a o en las células diana, dicho polinucleótido puede ejercer su función prevista. En ciertas realizaciones, después de la administración de los polinucleótidos a las células diana, se aumenta o se aumenta sinérgicamente la producción de un péptido o proteína funcional codificada por dicho polinucleótido.

Las composiciones mezcladas homogéneamente y los métodos de uso descritos en la presente pueden formularse para dirigirse específicamente y transfectar una o más células, tejidos y órganos diana. Por ejemplo, las células diana contempladas pueden comprender una o más células seleccionadas del grupo que consiste en hepatocitos, células epiteliales, células hematopoyéticas, células epiteliales, células endoteliales, células pulmonares, células óseas, células madre, células mesenquimales, células neurales, células cardíacas, adipocitos, células vasculares del músculo liso, cardiomiocitos, células musculares esqueléticas, células beta, células hipofisarias, células de revestimiento sinovial, células ováricas, células testiculares, fibroblastos, células B, células T, reticulocitos, leucocitos, granulocitos y células tumorales.

Las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente y los métodos de uso de tales composiciones mezcladas homogéneamente comprenden uno o más ARNm, como se define en las reivindicaciones. Tales polinucleótidos pueden codificar, por ejemplo, un polipéptido, proteína o enzima funcionales, y tras ser expresados (por ejemplo, traducidos) por una o más células diana se produce un producto polipeptídico funcional (por ejemplo, una proteína o enzima), y en algunos casos es secretado por la célula diana a la circulación periférica. En ciertas realizaciones, los uno o más de los polinucleótidos que comprenden o están encapsulados de otro modo por una o más de las nanopartículas lipídicas constituyentes que componen las composiciones mezcladas homogéneamente codifican un polipéptido que es expresado de manera aberrante por el sujeto. En ciertas realizaciones, los uno o más polinucleótidos encapsulados que comprenden las formulaciones de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente codifican una enzima funcional como una enzima del ciclo de la urea (por ejemplo, omitina transcarbamilasa (OTC), carbamoil fosfato sintetasa 1 (CPS1), argininosuccinato sintetasa (ASS1), argininosuccinato liasa (ASL) o arginasa 1 (ARG1)). En ciertas realizaciones, los uno o más ARNm encapsulados codifican una enzima asociada con un trastorno de almacenamiento lisosomal (por ejemplo, el polinucleótido encapsulado es ARNm que codifica una o más de las enzimas agalsidasa alfa, alfa-L-iduronidasa, iduronato-2-sulfatasa, N-acetilglucosamina-1-fosfato transferasa, N-acetilglucosaminidasa, alfa-glucosaminida acetiltransferasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa, beta-glucosidasa, galactosa-6-sulfato sulfatasa, beta-galactosidasa, beta-glucuronidasa, glucocerebrosidasa, heparán sulfamidasa, hialuronidasa y galactocerebrosidasa). Alternativamente, en algunas realizaciones, uno o más de los polinucleótidos encapsulados que comprenden las formulaciones de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente comprende la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3.

También se contempla en la presente el uso de ARNm que comprende una o más modificaciones químicas. En ciertas realizaciones, tales modificaciones químicas hacen que el ARNm sea más estable y pueden comprender, por ejemplo, una modificación de bloqueo del extremo de una región no traducida 5' o 3' del ARNm. En ciertas realizaciones, la modificación química comprende la inclusión de una secuencia parcial de un gen de CMV inmediatotemprano 1 (IE1) en la región 5' no traducida del ARNm. En otras realizaciones, la modificación química comprende la inclusión de una cola poli A en la región 3' no traducida del ARNm. También se contemplan modificaciones químicas que comprenden la inclusión de una estructura Cap1 en la región 5' no traducida del ARNm. En otras realizaciones más, la modificación química comprende la inclusión de una secuencia que codifica la hormona del crecimiento humano (hGH) en la región 3' no traducida del ARNm.

En la presente también se describen métodos de manipulación de la expresión mejorada (por ejemplo, aumentada sinérgicamente) de los uno o más polinucleótidos que están encapsulados en las una o más de la primera o la segunda nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones mezcladas homogéneamente y métodos de manipulación de la producción mejorada de los polipéptidos codificados por tales uno o más polinucleótidos encapsulados. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la proporción relativa de la primera y la segunda nanopartículas lipídicas puede ajustarse (por ejemplo, basándose en la masa del polinucleótido encapsulado) para mejorar la expresión de uno o más de los polinucleótidos encapsulados y/o para mejorar la producción de los uno o más polipéptidos encapsulados por tales polinucleótidos encapsulados. De manera similar, la expresión mejorada (por ejemplo, aumentada sinérgicamente) de los uno o más polinucleótidos que están encapsulados en la primera nanopartícula lipídica que comprende las composiciones mezcladas homogéneamente puede manipularse variando el contenido y las concentraciones relativas de uno o más de los lípidos, no lípidos, lípidos auxiliares y lípidos modificados con PEG que comprenden tales nanopartículas lipídicas. Además, la producción mejorada (por ejemplo, aumentada sinérgicamente) por las células diana de uno o más polipéptidos o proteínas funcionales codificados por polinucleótidos encapsulados en la primera nanopartícula lipídica que comprende las composiciones mezcladas homogéneamente puede manipularse variando el contenido y las concentraciones relativas de uno o más de los lípidos, no lípidos, lípidos auxiliares y lípidos modificados con PEG que comprenden tales nanopartículas lipídicas.

Las mejoras sinérgicas en la expresión de polinucleótidos encapsulados que caracterizan a las formulaciones de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente de la presente invención y/o la producción sinérgica de polipéptidos codificados de este modo por una o más células diana permiten lograr concentraciones terapéuticamente eficaces de los polinucleótidos producidos (por ejemplo, una proteína o enzima terapéutica) en los tejidos diana (o suero si el producto polipeptídico es excretado por la célula diana) usando una dosis significativamente menor de polinucleótido que la prevista con anterioridad. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, la cantidad eficaz de un polinucleótido necesaria para lograr un efecto terapéutico deseado puede reducirse encapsulando dicho polinucleótido en una o más nanopartículas lipídicas y mezclando homogéneamente por lo menos dos nanopartículas lipídicas. Tales métodos comprenden un paso de administrar una composición farmacéutica al sujeto, en donde la composición farmacéutica comprende una primera nanopartícula lipídica mezclada homogéneamente con una segunda nanopartícula lipídica, y en donde la primera nanopartícula lipídica comprende el polinucleótido, seguido de la transfección de una o más células diana del sujeto con tales polinucleótidos, de tal manera que se reduce la cantidad del polinucleótido necesaria para efectuar un efecto terapéutico (por ejemplo, se reduce con respecto a la cantidad de polinucleótido necesaria para efectuar un efecto terapéutico usando una composición no mezclada homogéneamente u otras técnicas estándar). En ciertas realizaciones, la cantidad de polinucleótido necesaria para producir un efecto terapéutico se reduce en por lo menos aproximadamente un 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, 95% o 99% con respecto a la cantidad de polinucleótido necesaria para producir un efecto terapéutico usando una composición no mezclada homogéneamente u otras técnicas estándar. En ciertas realizaciones, la cantidad de polinucleótido necesaria para producir un efecto terapéutico se reduce en por lo menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, diez, doce, quince, veinte, veinticinco, treinta, cuarenta o cincuenta veces o más con respecto a la cantidad de polinucleótido necesaria para producir un efecto terapéutico usando una composición no mezclada homogéneamente u otras técnicas estándar.

Lo analizado con anterioridad y muchas otras características y ventajas relacionadas de la presente invención se entenderán mejor por referencia a la siguiente descripción detallada de la invención cuando se tome junto con los ejemplos acompañantes. Las varias realizaciones descritas en la presente son complementarias y pueden combinarse o usarse juntas de una manera comprendida por los expertos en la técnica a la vista de las enseñanzas contenidas en la presente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. es un esquema que representa una "mezcla homogénea" de formulación, que se define generalmente como una combinación de dos o más formulaciones separadas, no idénticas en una sola.

Figura 2. ilustra la producción de luminiscencia de la proteína luciferasa de luciérnaga en hígados de ratones después del tratamiento con nanopartículas lipídicas encapsuladas de ARNm de luciferasa de luciérnaga (FFL) a base de varios lípidos catiónicos. Las dosis de ARNm de FFL encapsulado evaluadas fueron C12-200 (30 |jg), DLin-KC2-DMA (90 jg), HGT4003 (200 jg), ICE (200 jg ) y DODAP (200 jg). Los dos controles incluían una nanopartícula lipídica catiónica basada en C12-200 que encapsulaba un ARNm no fluorescente (dosis de 30 jg ) y el vehículo de PBS. Los valores se representan como mediana de RLU/mg de proteína total en el hígado cuatro horas después de la administración.

Figura 3.ilustra la producción de luminiscencia de la proteína luciferasa de luciérnaga en hígados de ratones cuatro horas después del tratamiento con nanopartículas lipídicas encapsuladas con ARNm de FFL. Las formulaciones comparadas fueron una formulación a base de C12-200 (dosis de 30 jg), una formulación a base de DLin-KC2-DMA (dosis de 90 jg), una formulación única mixta de C12-200/DLin-Kc2-DMA (dosis de 30 jg ) y una mezcla homogénea de dos formulaciones separadas a base de C12-200 y DLin-KC2-DMA. Como se representa en la Figura 3, la formulación mezclada homogéneamente (dosis de 120 jg , proporción 1:3 de ARNm de FFL encapsulado con C12-200:ARNm de FFL encapsulado con DLin-KC2-DMA, respectivamente) demostró una mejora sinérgica de la luminiscencia.

Figura 4. ilustra una comparación de la producción de luminiscencia de la proteína luciferasa de luciérnaga en hígados de ratón sobre la base de dos proporciones de formulaciones mezcladas homogéneamente. Las formulaciones individuales HGT4003 e ICE se dosificaron a 100 jg de ARNm de luciferasa de luciérnaga (FFL) encapsulado cada una. Las dos formulaciones mezcladas homogéneamente se administraron a una dosis total de 200 jg de ARNm de FFL encapsulado. Los valores se representan como mediana de RLU/mg de proteína total en el hígado cuatro horas después de la administración.

Figura 5.ilustra la comparación de luminiscencia al mezclar homogéneamente formulaciones que encapsulan ARNm fluorescente (FFL) y no fluorescente (GALT). Las formulaciones a base de C12-200 evaluadas se dosificaron a 30 jg , mientras que las formulaciones a base de DLin-KC2-DMA se dosificaron a 90 jg de ARNm. Las formulaciones mezcladas homogéneamente se dosificaron a 120 jg de ARNm total. Los valores se representan como mediana de RLU/mg de proteína total en el hígado cuatro horas después de la administración.

Figura 6. ilustra la comparación de luminiscencia de hígados tratados al mezclar formulaciones que encapsulan fluorescente (FFL) con nanopartículas lipídicas vacías (sin ARNm). Todas las nanopartículas lipídicas a base de C12-200 se dosificaron a 30 jg de ARNm (o equivalente), mientras que las formulaciones a base de DLin-KC2-DMA se dosificaron a 90 jg de ARNm (o equivalente). Las formulaciones mezcladas homogéneamente se dosificaron a 120 jg de ARNm equivalente. Los valores se representan como mediana de RLU/mg de proteína total en el hígado cuatro horas después de la administración.

Figura 7. ilustra la producción de luminiscencia de la proteína luciferasa de luciérnaga en los tejidos cerebrales de ratones después de la administración intracerebroventricular (ICV) de nanopartículas lipídicas encapsuladas con ARNm de luciferasa de luciérnaga (FFL). Las formulaciones comparadas fueron las formulaciones a base de C12-200 (dosis de 0,96 jg ) y las formulaciones a base de DLin-KC2-DMA (dosis de 2,87 jg ) tanto individualmente como con respecto a una mezcla homogénea de estas dos formulaciones en una proporción de 1:3 (dosis de 3,83 jg). Los valores se representan como mediana de RLU/mg de proteína total en el cerebro cuatro horas después de la administración.

Figura 8. ilustra una comparación de la proteína eritropoyetina humana (EPO) secretada después de la administración intravenosa de nanopartículas lipídicas encapsuladas con ARNm de EPO. Se tomaron muestras de sangre cuatro horas después de la inyección. Como se ilustra en la FIG. 8, todas las formulaciones demostraron una secreción de EPO humana con éxito por las células diana. Cada formulación mezclada homogéneamente demostró una mejora sinérgica de la producción de proteínas. Las dosis se representan en la FIG. 8 (entre paréntesis) como microgramos de ARNm de EPO humana encapsulada.

Figura 9. Ilustra el aumento sinérgico de la producción de proteínas cuando se analiza mediante transferencia western. Una mezcla homogénea de una nanopartícula lipídica a base de C12-200 cargada con ARNm de EPO humana con una nanopartícula lipídica análoga cargada con DLin-KC2-DMA muestra una banda fuerte (Carril 4) significativa de proteína de EPO humana aislada del suero cuatro horas después de la administración. El carril correspondiente a una formulación individual de C12- 200 (Carril 2) produce una banda moderadamente detectada, mientras que la de la formulación a base de DLin-KC2-DMA (Carril 3) es indetectable.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

En la presente se divulgan composiciones farmacéuticas que comprenden una mezcla homogénea de por lo menos dos nanopartículas lipídicas, por lo menos una de las cuales comprende un polinucleótido como se define en las reivindicaciones, y a métodos relacionados de uso de tales composiciones farmacéuticas como un medio altamente eficiente de aumentar la expresión de dicho polinucleótido. También se proporcionan composiciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente que comprenden uno o más polinucleótidos que codifican ARNm y métodos relacionados para aumentar la producción del polipéptido funcional o proteína codificada por dicho polinucleótido. Como se usan en la presente, los términos "mezcla homogénea" y "mezclado homogéneamente" se refieren a composiciones farmacéuticas que comprenden dos o más nanopartículas lipídicas heterogéneas distintas. Típicamente, las dos o más nanopartículas lipídicas heterogéneas distintas se combinan en una única composición o formulación farmacéutica. Por ejemplo, una composición farmacéutica mezclada homogéneamente puede comprender una primera nanopartícula lipídica que comprende el lípido catiónico DOTAP y una segunda nanopartícula lipídica que comprende el lípido catiónico ICE. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica mezclada homogéneamente puede comprender una primera nanopartícula lipídica que comprende el lípido catiónico C12-200 y una segunda nanopartícula lipídica que comprende el lípido catiónico DLinKC2DMA. En la FIG. 1 se representa una ilustración de dicha formulación mezclada homogéneamente.

Cabe señalar que los términos "mezcla homogénea" y "mezclado homogéneamente", como se usan en la presente para describir las composiciones y formulaciones farmacéuticas de la presente invención, se distinguen de los términos "mezclar" o "mezcla", que se usan en la presente para describir una formulación o composición farmacéutica que incluye solamente una única nanopartícula lipídica en la formulación. Por ejemplo, los términos mezclar y mezcla se usan en la presente para referirse a una composición farmacéutica que comprende solamente una única población de nanopartículas lipídicas, todas las cuales tienen generalmente la misma o sustancialmente la misma composición lipídica. Esto contrasta con una formulación mezclada homogéneamente que comprende dos o más nanopartículas lipídicas diferentes. En particular, los términos "mezclar" y "mezcla" se usan de manera general para describir una composición o formulación farmacéutica que incluye una población única, homogénea de nanopartículas lipídicas, todas las cuales están sintetizadas a partir de una solución orgánica que contiene los mismos lípidos catiónicos y, por ejemplo, cualquier lípido auxiliar adicional o lípidos modificados con PEG.

Las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente se caracterizan por ser capaces de administrar eficazmente los polinucleótidos encapsulados a las células diana, y también se caracterizan por su capacidad de mejorar la transfección posterior de tales polinucleótidos encapsulados después de entrar en contacto con una o más células diana. Las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente también se caracterizan por su capacidad para mejorar (por ejemplo, aumentar) la expresión de los polinucleótidos encapsulados en las mismas por las células diana. Las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente descritas en la presente también se caracterizan por su capacidad para mejorar (por ejemplo, aumentar) la producción de uno o más polipéptidos o proteínas (por ejemplo, por las células diana) codificados por uno o más polinucleótidos encapsulados en tales composiciones de nanopartículas. Por consiguiente, tales composiciones farmacéuticas de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente también son útiles para el tratamiento de enfermedades, y en particular el tratamiento de enfermedades que resultan de la expresión aberrante de genes o productos génicos (por ejemplo, enfermedades asociadas con la producción deficiente de una proteína). Por ejemplo, las enfermedades en las que pueden usarse para el tratamiento las nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente y las composiciones farmacéuticas incluyen aquellas en las que una mutación genética de un gen particular hace que las células afectadas no expresen, tengan una expresión reducida o expresen un producto no funcional de ese gen. El contacto de dichas células diana con las nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente y las composiciones farmacéuticas de manera que las células diana sean transfectadas por los polinucleótidos encapsulados aumenta la expresión de tales polinucleótidos e incrementa la producción de un producto proteico o polipeptídico funcional que puede ser útil en el tratamiento de la enfermedad (por ejemplo, enfermedades que resultan de una deficiencia proteica o enzimática).

En ciertas realizaciones, las nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente y las composiciones farmacéuticas descritas en la presente presentan una capacidad aumentada para transfectar una o más células diana. Como se usan en la presente, los términos "transfectar" o "transfección" se refieren a la introducción intracelular de un polinucleótido en una célula, o preferiblemente en una célula diana. El polinucleótido introducido puede mantenerse de manera estable o transitoria en la célula diana. El término "eficacia de transfección" se refiere a la cantidad relativa de polinucleótido captado o introducido por la célula diana sometida a transfección. En la práctica, la eficacia de la transfección se estima por la cantidad de un producto polinucleótido informador expresado por las células diana tras la transfección. Las nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente y las composiciones farmacéuticas descritas en la presente demuestran elevadas eficiencias de transfección y, en particular, dichas mezclas homogéneas demuestran eficiencias de transfección elevadas con respecto a las eficiencias de transfección de las nanopartículas lipídicas constituyentes individuales que comprenden tales composiciones mezcladas homogéneamente. Las altas eficiencias de transfección observadas por las nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente y las composiciones farmacéuticas pueden minimizar los efectos adversos asociados tanto con los lípidos que comprenden las nanopartículas como con los polinucleótidos encapsulados por dichos lípidos. Por consiguiente, las nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente de la presente invención demuestran altas eficacias de transfección, mejorando de este modo la probabilidad de que se administren dosificaciones adecuadas del polinucleótido en el lugar de la patología, a la vez que se minimizan los posibles efectos adversos sistémicos.

Como se usan en la presente, los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan indistintamente para referirse al material genético (por ejemplo, ADN o ARN), y cuando dichos términos se usan con respecto a las nanopartículas lipídicas se refieren de manera general al material genético encapsulado por tales nanopartículas lipídicas. El polinucleótido definido en las reivindicaciones es ARNm. Los ARN adecuados divulgados en la presente incluyen ARNm, ARNsi, miARN, ARNsn y ARNsno. Los polinucleótidos contemplados también incluyen ARN no codificantes intergénicos grandes (ARNlinc), que generalmente no codifican proteínas, sino que funcionan, por ejemplo, en la señalización inmunitaria, la biología de células madre y el desarrollo de enfermedades. (Véanse, por ejemplo, Guttman, et al., 458: 223-227 (2009); y Ng, et al., Nature Genetics 42: 1035-1036 (2010)). Los polinucleótidos de la invención son ARNm o ARNm estabilizado que codifica una proteína o enzima (por ejemplo, ARNm que codifica eritropoyetina humana, como se representa por la SEQ ID NO: 3). La presente invención contempla el uso de tales polinucleótidos como un agente terapéutico que es capaz de ser expresado por células diana para facilitar de este modo la producción (y en ciertos casos la excreción) de una enzima o proteína funcional portales células diana, como se divulga, por ejemplo, en la Solicitud Internacional N° PCT/US2010/058457 y en la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° PCT/US2012/041724 presentada el 8 de junio de 2012. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, tras la expresión de uno o más polinucleótidos por células diana puede observarse la producción de una enzima o proteína funcional de la que un sujeto es deficiente (por ejemplo, una enzima del ciclo de la urea o una enzima asociada con un trastorno de almacenamiento lisosomal). El término "funcional", como se usa en la presente para calificar una proteína o enzima, significa que la proteína o enzima tiene actividad biológica, o alternativamente es capaz de realizar la misma función, o una similar, que la proteína o enzima nativa o que funciona de manera normal.

También se proporcionan en la presente nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente, composiciones farmacéuticas y métodos relacionados para modular la expresión de un polinucleótido y/o para modular (por ejemplo, aumentar) la producción de un polipéptido o proteína funcional (por ejemplo, una enzima) codificado por dicho polinucleótido en una o más células y tejidos diana. En el contexto de la presente invención, el término "expresión" se usa en su sentido más amplio para referirse o a la transcripción de un gen o polinucleótido específico en por lo menos un transcrito de ARNm, o a la traducción de por lo menos un ARNm o polinucleótido en un polipéptido (por ejemplo, una proteína o enzima funcional). Por ejemplo, en ciertas realizaciones las nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente comprenden por lo menos una primera y una segunda nanopartícula lipídica, por lo menos una de las cuales comprende ARNm que codifica una proteína o enzima funcional, como se define en las reivindicaciones. El término expresión se refiere a la traducción de dicho ARNm (por ejemplo, por las células diana) para producir el polipéptido o proteína codificado de este modo. En el contexto de un oligonucleótido antisentido encapsulado en una o más de las composiciones de nanopartículas lipídicas descritas en la presente, el término "expresión" puede usarse con referencia a uno o más genes o ácidos nucleicos diana (por ejemplo, ARNm). Por ejemplo, cuando un oligonucleótido en antisentido encapsulado se ha preparado para que sea complementario de un fragmento de un ARNm endógeno diana expresado por una célula, el término "expresión" puede usarse con referencia a dicho ARNm endógeno (por ejemplo, el oligonucleótido en antisentido encapsulado puede reducir la expresión de dicho ARNm diana).

También se proporcionan nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente y composiciones farmacéuticas para modular la expresión de ácidos nucleicos y polinucleótidos expresados aberrantemente en una o más células y tejidos diana. En ciertas realizaciones, tales nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente comprenden por lo menos una primera nanopartícula lipídica y una segunda nanopartícula lipídica, una de las cuales puede encapsular un polinucleótido. Las nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente pueden comprender, por ejemplo, uno o más polinucleótidos encapsulados en una primera nanopartícula lipídica que se mezcla homogéneamente con una o más nanopartículas lipídicas diferentes (es decir, una segunda o tercera nanopartícula lipídica) que no encapsulan uno o más polinucleótidos, como se define en las reivindicaciones. Tales formulaciones de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente demuestran una expresión mejorada de uno o más polinucleótidos encapsulados de este modo con respecto a la expresión de los mismos polinucleótidos observada después de la administración de una única nanopartícula lipídica (por ejemplo, la primera nanopartícula lipídica). De manera similar, tales formulaciones de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente pueden demostrar una producción mejorada de uno o más polipéptidos (por ejemplo, una enzima funcional) codificados por un polinucleótido encapsulado con respecto a la producción de los mismos polipéptidos observada después de la administración de una única nanopartícula lipídica (por ejemplo, la primera nanopartícula lipídica). Por ejemplo, en ciertas realizaciones, las nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente y las composiciones farmacéuticas son capaces de aumentar la expresión de polinucleótidos encapsulados, y/o la producción de los polipéptidos codificados por tales polinucleótidos encapsulados, en una célula diana en por lo menos aproximadamente diez veces, veinte veces, treinta veces, cuarenta veces, cincuenta veces, sesenta veces, setenta veces, cien veces, quinientas veces, mil veces, o más con respecto a la expresión del polinucleótido o la producción del polipéptido observada cuando la célula diana entra en contacto con dichos polinucleótidos encapsulados en una única nanopartícula lipídica.

También se describen métodos para mejorar (por ejemplo, aumentar) la expresión de un polinucleótido y métodos para aumentar la producción y secreción de un producto polipeptídico funcional en células y tejidos diana (por ejemplo, hepatocitos). Las células o tejidos diana pueden expresar de manera aberrante el polinucleótido encapsulado por una o más de las nanopartículas lipídicas que comprenden la composición farmacéutica mezclada homogéneamente. También se describen en la presente métodos para aumentar la expresión de uno o más polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) y métodos para aumentar la producción y/o secreción de uno o más polipéptidos (por ejemplo, una enzima funcional) en una o más células, tejidos y órganos diana. En general, tales métodos comprenden poner en contacto las células diana con una composición farmacéutica que comprende una mezcla homogénea de por lo menos dos nanopartículas a base de lípidos (por ejemplo, una primera y una segunda nanopartícula lipídica), en donde por lo menos una de tales nanopartículas a base de lípidos comprende o encapsula de otro modo los uno o más polinucleótidos como se define en las reivindicaciones.

También se describen en la presente métodos y composiciones para mejorar (por ejemplo, aumentar) o modular de otro modo la expresión de uno o más polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) y/o mejorar (por ejemplo, aumentar) o modular de otro modo la producción y secreción de los polipéptidos o proteínas codificados de este modo en las células diana de un sujeto. Tales métodos comprenden de manera general el paso de administrar (por ejemplo, administrar por vía intravenosa) una composición farmacéutica mezclada homogéneamente a un sujeto en donde dicha composición farmacéutica comprende por lo menos dos nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente (por ejemplo, una primera y una segunda nanopartícula lipídica), por lo menos una de las cuales encapsula o comprende de otro modo uno o más polinucleótidos. El paso de administrar la composición farmacéutica mezclada homogéneamente a un sujeto puede facilitar el contacto de las nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente con las células y tejidos diana, el resultado de lo cual es una expresión mejorada (por ejemplo, aumentada) de los polinucleótidos encapsulados y un producto mejorado (por ejemplo, aumentado) del polipéptido codificado portales polinucleótidos encapsulados por las células y tejidos diana que han entrado en contacto. Como el término "mejorado" se usa en la presente para describir la actividad de las nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente, debe tenerse en cuenta que dicha mejora se determina generalmente con respecto a la suma del efecto observado o producido por los miembros constituyentes que comprenden la formulación de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente. Por ejemplo, la expresión mejorada de un polinucleótido y/o la producción o secreción mejorada de un polipéptido que se observa después de la administración de una formulación de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente que comprende dos nanopartículas lipídicas diferentes designadas "A" y "B", en donde solo la nanopartícula lipídica "A" encapsula el polinucleótido, está mejorada con respecto a la suma de la expresión del polinucleótido y/o la producción o secreción del polipéptido observada tanto por "A" como por "B" cuando se administran independientemente una de la otra.

Los presentes inventores han descubierto que en ciertas realizaciones se mejora la expresión de los polinucleótidos (y la correspondiente producción y/o secreción de un polipéptido codificado por polinucleótidos que comprenden ARNm) observada cuando se administran tales polinucleótidos en una composición de nanopartículas a base de lípidos mezclados homogéneamente y en muchos casos excede (por ejemplo, en aproximadamente dos, tres, cuatro, cinco, diez, veinte, veinticinco, treinta, cuarenta, cincuenta, sesenta, setenta, ochenta, noventa, cien , doscientas veces o más) la expresión (y la correspondiente producción y/o secreción de un polipéptido cuando tales polinucleótidos comprenden ARNm) observada cuando tales polinucleótidos se administran usando cada una de las dos o más nanopartículas lipídicas constituyentes independientes que comprenden las composiciones farmacéuticas de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente. Por consiguiente, las composiciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente (por ejemplo, una única composición farmacéutica que comprende dos nanopartículas lipídicas separadas y no idénticas) demuestran un aumento sinérgico (es decir, no aditivo) en la expresión de los polinucleótidos encapsulados en nanopartículas lipídicas que comprenden la composición farmacéutica, como se define en las reivindicaciones, y un aumento sinérgico (es decir, no aditivo) en la producción y/o secreción de los polipéptidos codificados por dicho ARNm encapsulado. El aumento sinérgico es evidente con respecto a la expresión total aditiva de dicho ARNm (o la producción total aditiva de polipéptidos codificados por el ARNm), que se observa cuando se administra individualmente cada una de las nanopartículas lipídicas constituyentes que comprenden la composición farmacéutica mezclada homogéneamente. Los aumentos sinérgicos observados en la expresión de polinucleótidos encapsulados (y/o producción de polipéptido codificado por polinucleótidos que comprenden ARNm) son evidentes en una variedad de nanopartículas lipídicas y en varias proporciones de tales nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente. Además, la expresión mejorada observada de polinucleótidos encapsulados en por lo menos una de las nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente (y la producción correspondiente de los polipéptidos codificados por polinucleótidos encapsulados que comprenden ARNm) puede variar de aproximadamente 1,5 a 25 veces, o más en comparación con la suma de la expresión (o en su caso la producción y/o secreción) observada en las nanopartículas lipídicas constituyentes que comprenden tales composiciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente, demostrando de este modo que el mezclado homogéneo de dos o más nanopartículas lipídicas separadas (por lo menos una de las cuales encapsula un polinucleótido) permite mecanísticamente una mayor expresión de tales polinucleótidos, que a su vez corresponde a una mayor producción del producto codificado de este modo, en comparación con las nanopartículas lipídicas separadas que comprenden tal composición farmacéutica mezclada homogéneamente.

Todavía no se ha dilucidado el mecanismo de este aumento sinérgico en la producción de proteínas. Sin querer estar limitados por ninguna teoría en particular, las posibles explicaciones incluyen, por ejemplo, vías o mecanismos no competitivos de entrada celular por cada una de las formulaciones de nanopartículas lipídicas que comprenden la composición farmacéutica mezclada homogéneamente, la combinación de diferentes mecanismos de tráfico intracelular (por ejemplo, protones-esponja frente a fusogenicidad), la combinación de propiedades de liberación de fármacos con propiedades de liberación endosomal y/o la modulación de vías inhibidoras activas que permiten una mayor captación de nanopartículas.

Las composiciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente, y en particular las nanopartículas lipídicas constituyentes que comprenden tales composiciones mezcladas homogéneamente, son capaces de administrar polinucleótidos de varios tamaños a sus células o tejidos diana. En ciertas realizaciones, las nanopartículas lipídicas de la presente invención son capaces de administrar secuencias de polinucleótidos grandes (por ejemplo, polinucleótidos de por lo menos 1 kb, 1,5kb, 2 kb, 2,5kb, 3kb, 3,5kb, 4kb, 4,5kb, 5kb, 6kb, 7kb, 8kb, 9kb, 10kb, 12kb, 15kb, 20kb, 25kb, 30kb, o más).

En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente y los polinucleótidos encapsulados comprendidos en las mismas pueden formularse con uno o más excipientes o reactivos aceptables para facilitar la administración de dichos polinucleótidos a las células, tejidos y órganos previstos o diana. Los reactivos y excipientes adecuados pueden seleccionarse generalmente en función de una serie de factores, que incluyen, entre otras cosas, las propiedades biológicas o químicas de los polinucleótidos (por ejemplo, la carga), la vía de administración prevista, el entorno biológico previsto al que se expondrán dichos polinucleótidos y las propiedades específicas de las células y tejidos diana previstos. En algunas realizaciones, una o más de las nanopartículas lipídicas que comprenden la composición farmacéutica mezclada homogéneamente demuestran una unión preferente y/o sustancial a una célula diana con respecto a células no diana. En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que comprenden la formulación farmacéutica mezclada homogéneamente, y en particular las nanopartículas lipídicas que encapsulan uno o más polinucleótidos, como se define en las reivindicaciones, administran su contenido a la célula diana de tal manera que los polinucleótidos se administran al compartimento subcelular apropiado, como el citoplasma, y pueden expresarse en consecuencia, de tal manera que, en ciertas realizaciones se produzcan y/o excreten uno o más polipéptidos funcionales (por ejemplo, una proteína funcional) por la célula diana.

En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente comprenden dos o más nanopartículas lipídicas separadas (por ejemplo, una primera nanopartícula lipídica que comprende HGT4003, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K mezclada homogéneamente con una segunda nanopartícula lipídica que comprende ICE, DOPE y DMG-PEG2K). La primera nanopartícula lipídica y la segunda nanopartícula lipídica que comprenden la composición farmacéutica mezclada homogéneamente pueden encapsular cada una el mismo polinucleótido o más polinucleótidos. Un aumento sinérgico en la expresión de los uno o más polinucleótidos por las células diana después de la administración de la composición farmacéutica mezclada homogéneamente a un sujeto excede la suma relativa de la expresión de los uno o más polinucleótidos lograda por la primera nanopartícula lipídica y la expresión de los uno o más polinucleótidos lograda por la segunda nanopartícula lipídica cuando la primera nanopartícula lipídica y la segunda nanopartícula lipídica se administran al sujeto independientemente. De manera similar, en ciertas realizaciones, un aumento sinérgico en la producción de uno o más polipéptidos funcionales codificados por uno o más polinucleótidos encapsulados por las células diana después de la administración de la composición farmacéutica mezclada homogéneamente a un sujeto excede la suma relativa de la producción de los uno o más polipéptidos funcionales lograda por la primera nanopartícula lipídica cuando la primera nanopartícula lipídica y la segunda nanopartícula lipídica se administran al sujeto independientemente. Como se define en las reivindicaciones, sólo una de las nanopartículas lipídicas (por ejemplo, la primera nanopartícula lipídica) que comprende la composición farmacéutica mezclada homogéneamente encapsula uno o más polinucleótidos.

En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente y las composiciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente son capaces de potenciar la expresión de uno o más polinucleótidos independientemente de si algunas o todas las nanopartículas lipídicas que comprenden la composición farmacéutica mezclada homogéneamente encapsulan uno o más polinucleótidos, como se define en las reivindicaciones. En particular, las nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente que comprenden una primera nanopartícula lipídica que encapsula un polinucleótido y una segunda nanopartícula lipídica vacía (es decir, que no encapsula un polinucleótido) son capaces de mejorar sinérgicamente la expresión de tales polinucleótidos (por ejemplo, aumentar la expresión aproximadamente dos, cuatro, cinco, diez, veinte, veinticinco, treinta, cuarenta, cincuenta, cien, doscientas, quinientas, mil veces o más). Por consiguiente, en el contexto de la presente invención, por lo menos uno de los componentes de nanopartículas lipídicas liposomales de la formulación mezclada homogéneamente sirve para transportar el polinucleótido a la célula diana. En algunas realizaciones, dos de los por lo menos dos componentes de nanopartículas lipídicas de la formulación mezclada homogéneamente sirven para transportar uno o más polinucleótidos a la célula diana. Tras entrar en contacto con las células diana, tales composiciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente demuestran un aumento en la expresión del polinucleótido encapsulado (por ejemplo, por lo menos aproximadamente dos, cinco, diez o veinte veces) y, en ciertas realizaciones, aumenta de este modo la producción de un polipéptido funcional codificado por dicho polinucleótido encapsulado.

Como se usa en la presente, la frase "nanopartícula lipídica" se refiere a una vesícula o portador que comprende uno o más lípidos (por ejemplo, lípidos catiónicos y/o no catiónicos). Los ejemplos de lípidos adecuados incluyen, por ejemplo, los lípidos catiónicos como C12-200, ICE, DLin-KC2-DMA, DOPE, DMG-PEG-2000, HGT4003, lípidos no catiónicos, lípidos basados en colesterol, lípidos auxiliares, lípidos modificados con PEG, así como los compuestos de fosfatidil (por ejemplo, fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos y gangliósidos) y combinaciones o mezclas de los anteriores. Las composiciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente descritas en la presente comprenden por lo menos dos o más nanopartículas lipídicas, cada una de las cuales tiene una composición lipídica diferente. Tales dos o más nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones mezcladas homogéneamente se denominan en la presente "primera nanopartícula lipídica", "segunda nanopartícula lipídica", "tercera nanopartícula lipídica", y así sucesivamente. Las designaciones de, por ejemplo, la primera y la segunda nanopartículas lipídicas se hacen con el propósito de distinguir las diferentes nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente y no se pretende que limiten el número de diferentes nanopartículas lipídicas que comprenden tales composiciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente.

Las presentes invenciones también contemplan el uso de composiciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente que comprenden una o más nanopartículas lipídicas que comprenden uno o más lípidos catiónicos. Como se usa en la presente, la frase "lípido catiónico" se refiere a cualquiera de una serie de especies lipídicas que llevan una carga neta positiva a un pH seleccionado, como el pH fisiológico. Las nanopartículas lipídicas contempladas pueden prepararse incluyendo mezclas lipídicas de múltiples componentes de proporciones variables que empleen uno o más lípidos catiónicos, lípidos no catiónicos y lípidos modificados con PEG. En ciertas realizaciones, cada una de la primera y la segunda nanopartículas lipídicas que comprenden las formulaciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente comprende uno o más lípidos catiónicos. De manera similar, también se contemplan composiciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente que comprenden dos o más nanopartículas lipídicas separadas, en donde tales nanopartículas lipídicas comprenden lípidos catiónicos que tienen cada uno diferentes composiciones lipídicas. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la primera y la segunda nanopartículas lipídicas comprenden cada una un lípido catiónico diferente (por ejemplo, la primera nanopartícula lipídica comprende ICE y la segunda nanopartícula lipídica comprende DLin-KC2-DMA).

En la bibliografía se han descrito varios lípidos catiónicos, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Los lípidos catiónicos pueden incluir, pero no se limitan a, ALNY-100 ((3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienil)tetrahidro-3aH-ciclopenta[d][1,3]dioxol-5-amina)), DODAP (1,2-dioleil-3-dimetilamonio propano), HGT4003 (WO 2012/170889), HGT5000 (Solicitud de Patente. Provisional de Estados Unidos N° 61/617.468) o HGt 5o01 (cis o trans) (Solicitud de Patente Provisional N° 61/617,468), lipidoides aminoalcohólicos como los divulgados en el documento WO2010/053572, DOTAP (1,2-dioleil-3-trimetilamonio propano), DOTMA (1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano), DLinDMA (1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano) (Heyes, et al., J. Contr. Rel. 107:276-287(2005)), DLin-KC2-DMA (Semple, etal., Nature Biotech. 28: 172- 176(2010)), C12-200 (Love, et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 107:1864-1869(2010)), cloruro de N[1-(2,3-dioleyloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio. (Felgner et al. (Proc. Nat'l Acad. Sci. 84, 7413 (1987); Patente de Estados Unidos N° 4.897.355). El DOTMA puede formularse sola o puede combinarse con dioleoilfosfatidiletanolamina o "DOPE" u otros lípidos catiónicos o no catiónicos en una nanopartícula lipídica. Otros lípidos catiónicos adecuados son, por ejemplo, 5-carboxispermilglicinedioctadecilamida o "DOGS", 2,3-dioleiloxi-N-[2(espermina carboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio o "DOSPA" (Behr et al. Proc. Nat.'l Acad. Sci. 86, 6982 (1989); Patente de Estados Unidos N° 5,171,678; Patente de Estados Unidos N° 5,334,761), 1,2-Dioleoil-3-dimetilamonio-propano o "DODAP", 1,2-Dioleoil-3-trimetilamonio-propano o "DOTAP". Los lípidos catiónicos contemplados también incluyen 1,2-disteariloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DSDMA", 1,2- dioleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DODMA", 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DLinDMA", 1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano o "DLenDMA", N-dioleil-N,N-dimetilamonio o "DODAC", bromuro de N,N-distearil-N,N-dimetilamonio o "DDAB", bromuro de N-(1,2-dimetiriloxiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroxietil amonio o "DMRIE", 3-dimetilamino-2-(colest-5-en-3-beta-oxibutan-4-oxi)-1-(cis,cis-9,12-octadecadienoxi)propano o "CLinDMA", 2-[5'-(colest-5-en-3-beta-oxi)-3'-oxapentoxi)-3-dimetil 1-1-(cis,cis-9', 1-2'-octadecadienoxi)propano o "CpLinDMA", N,N-dimetil-3,4-dioleiloxibencilamina o "DMOBA", 1,2-N,N'-dioleilcarbamil-3-dimetilaminopropano o "DOcarbDAP", 2,3-dilinoleoiloxi-N,N-dimetilpropilamina o "DLinDAP", 1,2-N,N'-dilinoleilcarbamil-3-dimetilaminopropano o "DLincarbDAP", 1,2-dilinoleilcarbamil-3-dimetilaminopropano o "DLinCDAP", 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano o "DLin-K-DMA", 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]dioxolano o "DLin-K-XTC2-DMA", o mezclas de los mismos. (Heyes, J., et al., J Controlled Release 107: 276-287 (2005); Morrissey, DV., etal., Nat. Biotechnol. 23(8): 1003-1007 (2005); Publicación de PCTO02005/121348Al).

Para formular las nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente la presente invención también contempla el uso de lípidos catiónicos a base de colesterol. Tales lípidos catiónicos a base de colesterol pueden usarse solos o en combinación con otros lípidos catiónicos o no catiónicos. Los lípidos catiónicos a base de colesterol adecuados incluyen, por ejemplo, DC-Col (N,N-dimetil-N-etilcarboxamidocolesterol), 1,4-bis(3-N-oleilamino propil)piperazina (Gao, et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280 (1991); Wolf et al. BioTechniques 23, 139 (1997); Patente de Estados Unidos N° 5.744.335).

Además, hay varios reactivos disponibles comercialmente para mejorar la eficacia de la transfección. Ejemplos adecuados incluyen LIPOFECTIN (DOTMA:DOPE) (Invitrogen, Carlsbad, Calif.), LIPOFECTAMINE (DOSPA:DOPE) (Invitrogen), LIPOFECTAMINE2000. (Invitrogen), FUGENE, TRANSFECTAM (DOGS) y EFFECTENE.

También se contemplan los lípidos catiónicos como los lípidos a base de dialquilamino, a base de imidazol y a base de guanidinio. Por ejemplo, ciertas realizaciones están dirigidas a una composición que comprende uno o más lípidos catiónicos a base de imidazol, por ejemplo, el lípido de éster de colesterol de imidazol o "ICE" (3S, 10R, 13R, 17R)-10, 13-dimetil-17-((R)-6-metilheptano-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-il 3-(1H-imidazol-4-il)propanoato, como se representa por la estructura (I) a continuación. En ciertas realizaciones, una nanopartícula lipídica para la administración de ARNm que codifica una proteína funcional puede comprender uno o más lípidos catiónicos a base de imidazol, por ejemplo, el lípido de éster de colesterol de imidazol o "ICE" (3S,10,13R,17R)-10,13-dimetil-17-((R)-6-metilheptano-2-il)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-il 3-(lH-imidazol-4-il)propanoato, como se representa por la estructura (I).

Sin querer estar limitados por ninguna teoría en particular, se cree que la fusogenicidad del lípido catiónico a base de imidazol ICE está relacionada con la alteración endosomal facilitada por el grupo imidazol, que tiene un pKa más bajo con respecto a los lípidos catiónicos tradicionales. A su vez, la alteración endosomal promueve la hinchazón osmótica y la alteración de la membrana liposomal, seguido de la transfección o liberación intracelular del contenido de polinucleótidos cargado o encapsulado en la misma en la célula diana.

Los lípidos catiónicos a base de imidazol también se caracterizan por su toxicidad reducida con respecto a otros lípidos catiónicos. En algunas realizaciones, una o más de las nanopartículas lipídicas que comprenden la composición farmacéutica mezclada homogéneamente comprenden un lípido catiónico a base de imidazol, como ICE, para reducir la concentración relativa de otros lípidos catiónicos más tóxicos en tal composición farmacéutica mezclada homogéneamente. Los lípidos catiónicos a base de imidazol (por ejemplo, ICE) pueden usarse como el único lípido catiónico en una o más de las nanopartículas lipídicas que componen las formulaciones mezcladas homogéneamente, o alternativamente pueden combinarse con lípidos catiónicos tradicionales (por ejemplo, DOPE, DC-Chol), lípidos no catiónicos, lípidos modificados con PEG y/o lípidos auxiliares. El lípido catiónico puede comprender una proporción molar de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 90%, de aproximadamente el 2% a aproximadamente el 70%, de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 50%, de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 40% del lípido total presente en la nanopartícula lipídica, o preferiblemente de aproximadamente el 20% a aproximadamente el 70% del lípido total presente en la nanopartícula lipídica.

De manera similar, ciertas realizaciones están dirigidas a nanopartículas lipídicas que comprenden el lípido catiónico HGT4003 2-((2,3-Bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)propil)disulfanil)-N,N-dimetiletanamina, como se representa por la estructura (II) a continuación, y como se describe con más detalle en la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° PCT/US2012/041663, presentada el 8 de junio de 2012:

En otras realizaciones, las composiciones y métodos descritos en la presente están dirigidos a nanopartículas lipídicas que comprenden uno o más lípidos escindibles como, por ejemplo, uno o más lípidos catiónicos o compuestos que comprenden un grupo funcional disulfuro (S-S) escindible (por ejemplo, HGT4001, HGT4002, HGT4003, HGT4004 y HGT4005), como se describe adicionalmente en la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° PCT/US2012/041663.

En las formulaciones de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente de la presente invención también se contempla el uso y la inclusión de fosfolípidos modificados con polietilenglicol (PEG) y lípidos derivados, como ceramidas derivadas (PEG-CER), incluyendo la N-octanoil-esfingosina-1-[succinil(metoxi polietilenglicol)-2000] (ceramida C8 PEG-2000), ya sea sola o preferiblemente en combinación con otras formulaciones lipídicas que comprenden una o más de las nanopartículas lipídicas que comprenden una composición farmacéutica mezclada homogéneamente. Los lípidos modificados con PEG contemplados incluyen, entre otros, una cadena de polietilenglicol de hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lípido con cadena o cadenas alquílicas de C6-C20 de longitud. La adición de tales componentes puede evitar la agregación del complejo y también puede proporcionar un medio para aumentar la vida útil en circulación y aumentar la administración de la composición lípido-polinucleótido a los tejidos diana, (Klibanov et al. (1990) FEBS Letters, 268 (1): 235- 237), o pueden seleccionarse para que se intercambien rápidamente fuera de la formulación in vivo (véase la Patente de Estados Unidos N° 5.885.613). Los lípidos intercambiables particularmente útiles son las PEG-ceramidas que tienen cadenas acilo más cortas (por ejemplo, C14 o C18). El fosfolípido modificado con PEG y los lípidos derivados de las composiciones de la presente invención pueden comprender una proporción molar de aproximadamente el 0% a aproximadamente el 20%, de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 20%, de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 15%, de aproximadamente el 4% a aproximadamente el 10%, o de aproximadamente el 2% del lípido total presente en una nanopartícula lipídica liposomal.

Aunque los vehículos a base de lípidos y sus lípidos componentes presentan medios prometedores para administrar intracelularmente su contenido de polinucleótidos, la utilidad de muchos lípidos (y en particular de los lípidos catiónicos) puede verse limitada por su citotoxicidad asociada. Esto es especialmente cierto en el caso de la LIPOFECTINA, cuyo componente DOTMA no se degrada fácilmente in vivo y es tóxico para las células y los tejidos. Las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente de la presente invención proporcionan medios para reducir las toxicidades asociadas a los lípidos, y en particular la toxicidad asociada a los lípidos catiónicos. En ciertas realizaciones, la mejora sinérgica en la expresión de polinucleótidos encapsulados observada con el uso de las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente de la presente invención puede corresponder a cantidades reducidas de lípidos (y en particular lípidos tóxicos) necesarios para efectuar la transfección de una cantidad eficaz de tales polinucleótidos a una o más células diana. Por consiguiente, en la presente también se contemplan métodos para mediar, reducir o eliminar la toxicidad asociada con uno o más lípidos, y en particular uno o más lípidos catiónicos. Por ejemplo, la cantidad de lípido catiónico necesaria para efectuar la transfección de una cantidad eficaz de uno o más polinucleótidos en una o más células diana puede reducirse incorporando dicho lípido catiónico en una primera composición de nanopartículas lipídicas y mezclando homogéneamente dicha primera composición de nanopartículas lipídicas con una segunda nanopartícula lipídica, como se define en las reivindicaciones. La expresión mejorada del polinucleótido observada con el uso de dicha composición de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente puede permitir una reducción correspondiente en la cantidad de dicho lípido necesaria para efectuar la transfección de una cantidad eficaz de dichos uno o más polinucleótidos en dichas una o más células diana. En ciertas cantidades, la toxicidad de los uno o más lípidos se reduce en por lo menos aproximadamente un 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, 95%, 99% o, alternativamente, se elimina.

La presente invención también contempla el uso de lípidos no catiónicos en una o más de las nanopartículas lipídicas que comprenden las formulaciones mezcladas homogéneamente. Como se usa en la presente, la frase "lípido no catiónico" se refiere a cualquier lípido neutro, zwitteriónico o aniónico. Como se usa en la presente, la expresión "lípido aniónico" se refiere a cualquiera de una serie de especies lipídicas que tienen una carga neta negativa a un pH seleccionado, como el pH fisiológico. Los lípidos no catiónicos incluyen, pero no se limitan a, diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina (POPE), 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE-mal), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE), 16-O-monometil PE, 16-O-dimetil PE, 18-1-trans PE, 1-estearoil-2-oleoilfosfatidiletanolamina (SOPE), colesterol, o una mezcla de los mismos. Tales lípidos no catiónicos pueden usarse solos, pero preferiblemente se usan en combinación con otros excipientes, por ejemplo, lípidos catiónicos. Cuando se usan en combinación con un lípido catiónico, el lípido no catiónico puede comprender una proporción molar del 5% a aproximadamente el 90%, o preferiblemente de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 70% del lípido total presente en la nanopartícula lipídica.

También se contempla la inclusión de polímeros en las nanopartículas lipídicas que componen la formulación farmacéutica mezclada. Los polímeros adecuados pueden incluir, por ejemplo, poliacrilatos, polialquilcianoacrilatos, polilactida, copolímeros de polilactida-poliglicolida, policaprolactonas, dextrano, albúmina, gelatina, alginato, colágeno, quitosano, ciclodextrinas y polietilenimina.

En ciertas realizaciones, las nanopartículas lipídicas se formulan basándose en parte en su capacidad para facilitar la transfección de un polinucleótido a una célula diana. En otra realización, las nanopartículas lipídicas pueden seleccionarse y/o prepararse para optimizar la administración de polinucleótidos a una célula, tejido u órgano diana. Por ejemplo, si la célula diana es un hepatocito, las propiedades de la nanopartícula lipídica (por ejemplo, tamaño, carga y/o pH) pueden optimizarse para administrar eficazmente dicha nanopartícula lipídica a la célula u órgano diana, reducir la depuración inmunitaria y/o promover la retención en ese órgano diana. Alternativamente, si el tejido diana es el sistema nervioso central, la selección y preparación de la nanopartícula lipídica debe tener en cuenta la penetración y retención dentro de la barrera hematoencefálica y/o el uso de medios alternativos para administrar directamente tales nanopartículas lipídicas a dicho tejido diana (por ejemplo, administración intracerebrovascular). En ciertas realizaciones, las composiciones mezcladas homogéneamente o sus nanopartículas lipídicas constituyentes pueden combinarse con agentes que facilitan la transferencia de polinucleótidos encapsulados (por ejemplo, agentes que alteran o mejoran la permeabilidad de la barrera hematoencefálica y mejoran de este modo la transferencia de tales polinucleótidos encapsulados a las células diana). Aunque las nanopartículas lipídicas pueden facilitar la introducción de polinucleótidos en las células diana, la adición de policationes (por ejemplo, poli L-lisina y protamina) a las nanopartículas lipídicas o a las composiciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente como copolímero también puede facilitar, y en algunos casos mejorar notablemente, la eficacia de transfección de varios tipos de liposomas catiónicos en 2-28 veces en una serie de líneas celulares tanto in vitro como in vivo. (Véase NJ. Caplen, et al., Gene Ther. 1995; 2: 603; S. Li, et al., Gene Ther. 1997; 4, 891).

A efectos de la presente invención, por lo menos una de las nanopartículas lipídicas (por ejemplo, la primera nanopartícula lipídica) que componen la composición farmacéutica mezclada homogéneamente se prepara para encapsular el polinucleótido o polinucleótidos deseados. En la presente, el proceso de incorporación de un ARNm deseado en un liposoma o una nanopartícula lipídica se denomina "carga" o "encapsulación" (Lasic, et al., FEBS Lett., 312: 255-258, 1992). Los polinucleótidos encapsulados o cargados con nanopartículas lipídicas pueden estar situados total o parcialmente en el espacio interior de la nanopartícula lipídica, dentro de la membrana bicapa de la nanopartícula lipídica, o asociados con la superficie exterior de la nanopartícula lipídica.

Cargar o encapsular un polinucleótido en una nanopartícula lipídica puede servir para proteger el polinucleótido de un entorno que puede contener enzimas o sustancias químicas (por ejemplo, suero) que degradan los polinucleótidos y/o sistemas o receptores que provocan la excreción rápida de los polinucleótidos. Por consiguiente, en algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas seleccionadas que componen las composiciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente son capaces de mejorar la estabilidad del polinucleótido o polinucleótidos encapsulados de este modo, en particular con respecto a los entornos a los que estarán expuestos tales polinucleótidos. La encapsulación de los polinucleótidos en una o más de las nanopartículas lipídicas que componen las composiciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente, como se define en las reivindicaciones, también facilita la administración de tales polinucleótidos a las células y tejidos diana. Por ejemplo, las nanopartículas lipídicas pueden permitir que el polinucleótido encapsulado alcance la célula diana o pueden permitir preferentemente que el polinucleótido encapsulado alcance las células u órganos diana de forma discriminatoria (por ejemplo, las nanopartículas lipídicas pueden concentrarse en el hígado o el bazo de un sujeto al que se administra la composición mezclada homogéneamente). Alternativamente, las nanopartículas lipídicas pueden limitar la administración de polinucleótidos encapsulados a otras células u órganos no diana en los que la presencia de los polinucleótidos encapsulados puede ser indeseable o de utilidad limitada.

Preferiblemente, las nanopartículas lipídicas se preparan combinando múltiples componentes lipídicos y/o poliméricos. Por ejemplo, una nanopartícula lipídica puede prepararse usando ceramida DSPC/CHOL/DODAP/C8-PEG-5000 en una proporción molar de aproximadamente 1 a 50: 5 a 65: 5 a 90: 1 a 25, respectivamente. Una nanopartícula lipídica puede estar compuesta de combinaciones lipídicas adicionales en varias proporciones, incluyendo, por ejemplo, DSPC/CHOL/DODAP/mPEG-5000 (por ejemplo, combinada en una proporción molar de aproximadamente 33:40:25:2), DSPC/CHOL/DODAP/C8 PEG-2000-Cer (por ejemplo, combinada en una proporción molar de aproximadamente 31:40:25:4), POPC/DODAP/C8-PEG-2000-Cer (por ejemplo, combinada en una proporción molar de aproximadamente 75-87:3-14:10) o DSPC/CHOL/DOTAP/C8 PEG-2000-Cer (por ejemplo, combinada en una proporción molar de aproximadamente 31:40:25:4). La selección de lípidos catiónicos, lípidos no catiónicos y/o lípidos modificados con PEG que comprenden las nanopartículas lipídicas, así como la proporción molar relativa de dichos lípidos entre sí, se basa en las características del lípido o lípidos seleccionados, la naturaleza de las células o tejidos diana previstos y las características de los polinucleótidos que van a ser administrados por la nanopartícula lipídica. Consideraciones adicionales incluyen, por ejemplo, la saturación de la cadena alquílica, así como el tamaño, la carga, el pH, el pKa, la fusogenicidad y la toxicidad del lípido o lípidos seleccionados.

Las nanopartículas lipídicas para su uso en la presente invención pueden prepararse mediante varias técnicas que se conocen actualmente en la técnica. Las vesículas multilamelares (MLV) pueden prepararse mediante técnicas convencionales, por ejemplo, depositando un lípido seleccionado en la pared interior de un contenedor o recipiente adecuado disolviendo el lípido en un solvente apropiado y evaporando después el solvente para dejar una película fina en el interior del recipiente o mediante secado por pulverización. A continuación, puede añadirse una fase acuosa al recipiente con un movimiento de agitación en vórtice que da como resultado la formación de MLV. A continuación, pueden formarse vesículas unilamelares (ULV) mediante homogeneización, sonicación o extrusión de las vesículas multilamelares. Además, pueden formarse vesículas unilamelares mediante técnicas de eliminación de detergentes.

En ciertas realizaciones, las composiciones mezcladas homogéneamente de la presente invención comprenden una nanopartícula lipídica en la que el ARNm (por ejemplo, ARNm que codifica OTC) está asociado tanto en la superficie de la nanopartícula lipídica (por ejemplo, un liposoma) como encapsulado dentro de la misma nanopartícula lipídica. Por ejemplo, durante la preparación de las composiciones de la presente invención, los lípidos catiónicos que comprenden las nanopartículas lipídicas pueden asociarse con el ARNm a través de interacciones electrostáticas con dicho ARNm terapéutico.

En ciertas realizaciones, las composiciones mezcladas homogéneamente de la presente invención pueden cargarse con radionúclidos de diagnóstico, materiales fluorescentes u otros materiales que sean detectables en aplicaciones in vitro e in vivo. Por ejemplo, los materiales de diagnóstico adecuados para su uso en la presente invención pueden incluir Dioleoilfosfatidiletanolamina de Rodamina (Rh-PE), ARNm de la proteína fluorescente verde (ARNm de GFP), ARNm de la luciferasa deRenillay ARNm de la luciferasa de luciérnaga.

Durante la preparación de nanopartículas lipídicas liposomales, los agentes portadores solubles en agua también pueden encapsularse en el interior acuoso incluyéndolos en la solución hidratante, y las moléculas lipófilas pueden incorporarse a la bicapa lipídica mediante su inclusión en la formulación lipídica. En el caso de ciertas moléculas (por ejemplo, polinucleótidos lipófilos catiónicos o aniónicos), la carga del polinucleótido en nanopartículas lipídicas o liposomas preformados puede lograrse, por ejemplo, mediante los métodos descritos en la Patente de Estados Unidos N° 4,946,683. Después de la encapsulación del polinucleótido, las nanopartículas lipídicas pueden procesarse para eliminar el ARNm no encapsulado mediante procesos como la cromatografía en gel, la diafiltración o la ultrafiltración. Por ejemplo, si se desea eliminar el polinucleótido unido externamente de la superficie de las nanopartículas lipídicas que componen las composiciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente, tales nanopartículas lipídicas pueden someterse a una columna de dietilaminoetil SEPHACEL.

Además del polinucleótido encapsulado, en la nanopartícula lipídica pueden incluirse o encapsularse uno o más agentes terapéuticos o de diagnóstico. Por ejemplo, tales agentes terapéuticos adicionales pueden asociarse a la superficie de la nanopartícula lipídica, pueden incorporarse a la bicapa lipídica de la nanopartícula lipídica mediante su inclusión en la formulación lipídica o cargarse en nanopartículas lipídicas preformadas (véanse las Patentes de Estados Unidos N° 5.194.654 y N° 5.223.263).

Hay varios métodos para reducir el tamaño, o "dimensionamiento", de las nanopartículas lipídicas, y cuando se usa dimensionamiento generalmente puede emplearse cualquiera de estos métodos. El método de extrusión es un método de dimensionamiento de liposomas (Hope, M J et al. Reduction of Liposome Size and Preparation of Unilamellar Vesicles by Extrusion Techniques. En:Liposome Technology(G. Gregoriadis, Ed.) Vol. 1. p 123 (1993). El método consiste en extruir liposomas a través de una membrana de policarbonato de poro pequeño o una membrana cerámica asimétrica para reducir el tamaño de los liposomas a una distribución de tamaños relativamente bien definida. Típicamente, la suspensión se hace pasar por la membrana una o más veces hasta que se logra la distribución de tamaños de liposomas deseada. Los liposomas pueden extruirse a través de membranas con poros sucesivamente más pequeños para lograr una reducción gradual del tamaño de los liposomas.

Hay disponibles una variedad de métodos alternativos conocidos en la técnica para dimensionar una población de nanopartículas lipídicas. Uno de tales métodos de dimensionamiento se describe en la Patente de Estados Unidos N° 4.737.323. La sonicación de una suspensión de liposomas o nanopartículas lipídicas, ya sea por sonicación en baño o con sonda, produce una reducción progresiva del tamaño hasta ULV pequeñas de menos de 0,05 micras de diámetro aproximadamente. La homogeneización es otro método que se basa en la energía de cizallamiento para fragmentar los liposomas grandes en otros más pequeños. En un procedimiento de homogeneización típico, las MLV se hacen recircular a través de un homogeneizador de emulsión estándar hasta que se observan los tamaños de liposomas seleccionados, típicamente entre aproximadamente 0,1 y 0,5 micras. El tamaño de las nanopartículas lipídicas puede determinarse mediante dispersión de luz cuasieléctrica (QELS), como se describe en Bloomfield, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 10:421-450 (1981). El diámetro medio de las nanopartículas lipídicas puede reducirse por sonicación de las nanopartículas lipídicas formadas. Pueden alternarse ciclos intermitentes de sonicación con evaluación QELS para orientar la síntesis eficiente de liposomas.

La selección del tamaño adecuado de una nanopartícula lipídica debe tener en consideración el lugar de la célula o tejido diana y, en cierta medida, la aplicación para la que se está elaborando la nanopartícula lipídica. Como se usa en la presente, la expresión "célula diana" se refiere a las células a las que se dirigen una o más de las nanopartículas lipídicas que comprenden la composición mezclada homogéneamente. En algunas realizaciones, las células diana comprenden un tejido u órgano particular. En algunas realizaciones, las células diana son deficientes en una proteína o enzima de interés. Por ejemplo, cuando se desea administrar un polinucleótido a un hepatocito, el hepatocito representa la célula diana. En algunas realizaciones, los polinucleótidos y composiciones mezcladas homogéneamente de la presente invención transfectan las células diana de manera discriminatoria (es decir, no transfectan células no diana). Las composiciones de la presente invención pueden prepararse para que se dirijan preferentemente a una variedad de células diana, que incluyen, pero no se limitan a, hepatocitos, células epiteliales, células hematopoyéticas, células epiteliales, células endoteliales, células pulmonares, células óseas, células madre, células mesenquimales, células neurales (por ejemplo, meninges, astrocitos, neuronas motoras, células de los ganglios de la raíz dorsal y neuronas motoras del asta anterior), células fotorreceptoras (por ejemplo, bastones y conos), células epiteliales pigmentadas de la retina, células secretoras, células cardíacas, adipocitos, células vasculares del músculo liso, cardiomiocitos, células musculares esqueléticas, células beta, células hipofisarias, células de revestimiento sinovial, células ováricas, células testiculares, fibroblastos, células B, células T, reticulocitos, leucocitos, granulocitos y células tumorales.

Después de la transfección de una o más células diana por los polinucleótidos encapsulados en una o más nanopartículas lipídicas que comprenden la composición mezclada homogéneamente, puede estimularse preferiblemente la producción del producto (por ejemplo, un polipéptido o proteína funcional) codificado por dicho polinucleótido y se mejora la capacidad de dichas células diana para expresar el polinucleótido y producir, por ejemplo, un polipéptido o proteína de interés. Por ejemplo, la transfección de una célula diana por las composiciones mezcladas homogéneamente que encapsulan ARNm de OTC mejorará (es decir, aumentará) la expresión del ARNm de OTC y producirá una enzima de OTC funcional.

En algunas realizaciones, puede ser deseable limitar la transfección de los polinucleótidos a ciertas células o tejidos. Por ejemplo, el hígado representa un órgano diana importante para las composiciones de la presente invención debido, en parte, a su papel central en el metabolismo y la producción de proteínas y, por consiguiente, las enfermedades que son provocadas por defectos en productos génicos específicos del hígado (por ejemplo, trastornos del ciclo de la urea) pueden beneficiarse de la selección específica de células (por ejemplo, hepatocitos). Por consiguiente, en ciertas realizaciones de la presente invención, las características estructurales del tejido diana pueden explotarse para dirigir la distribución de las nanopartículas lipídicas a tales tejidos diana. Por ejemplo, para dirigirse a los hepatocitos, una o más de las nanopartículas lipídicas que comprenden la composición farmacéutica mezclada homogéneamente pueden dimensionarse de tal manera que sus dimensiones sean menores que las fenestraciones de la capa endotelial que recubre los sinusoides hepáticos en el hígado; por consiguiente, las una o más de tales nanopartículas lipídicas pueden penetrar fácilmente en tales fenestraciones endoteliales para alcanzar los hepatocitos diana. Alternativamente, una nanopartícula lipídica puede estar dimensionada de tal manera que las dimensiones del liposoma tengan un diámetro suficiente para limitar o evitar expresamente la distribución en ciertas células o tejidos. Por ejemplo, una o ambas de la primera y la segunda nanopartículas lipídicas que comprenden la composición farmacéutica mezclada homogéneamente, pueden estar dimensionadas de tal manera que sus dimensiones sean mayores que las fenestraciones de la capa endotelial que recubre los sinusoides hepáticos para limitar de este modo la distribución de la nanopartícula lipídica liposomal a los hepatocitos. En tal realización, las nanopartículas lipídicas liposomales grandes no penetrarán fácilmente en las fenestraciones endoteliales y en su lugar serán depuradas por los macrófagos de Kupffer que recubren los sinusoides hepáticos. El dimensionamiento de, por ejemplo, la primera y segunda nanopartículas lipídicas que comprenden la composición mezclada homogéneamente puede, por lo tanto, proporcionar una oportunidad para manipular adicionalmente y controlar con precisión el grado en el que puede mejorarse en una o más células diana la expresión de los polinucleótidos encapsulados. Generalmente, el tamaño de por lo menos una de las nanopartículas lipídicas que comprenden la composición farmacéutica mezclada homogéneamente está dentro del intervalo de aproximadamente 25 a 250 nm, preferiblemente menos de aproximadamente 250 nm, 175 nm, 150 nm, 125 nm, 100nm, 75 nm, 50 nm, 25 nm o 10nm.

De manera similar, las composiciones de la presente invención pueden prepararse para que se distribuyan preferentemente a otros tejidos, células u órganos diana, como el corazón, los pulmones, los riñones o el bazo. Por ejemplo, las nanopartículas lipídicas de las composiciones de la presente invención pueden prepararse para lograr una distribución mejorada a las células y tejidos diana. Por consiguiente, las composiciones de la presente invención pueden enriquecerse con lípidos catiónicos, no catiónicos y modificados con PEG adicionales para dirigirse aún más a los tejidos o células diana.

En algunas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones mezcladas homogéneamente se distribuyen a las células y tejidos del hígado para mejorar la administración, la transfección y la posterior expresión de los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) encapsulados en las mismas por las células y tejidos del hígado (por ejemplo, hepatocitos) para, en ciertas realizaciones, mejorar de este modo la producción de un polipéptido funcional codificado por dicho polinucleótido encapsulado. Aunque tales composiciones pueden distribuirse preferentemente en las células y tejidos del hígado, los efectos terapéuticos de los polinucleótidos expresados y/o los polipéptidos producidos no tienen por qué limitarse a las células y tejidos diana. Por ejemplo, los hepatocitos diana pueden funcionar como un "reservorio" o "depósito" capaz de expresar y/o producir, y excretar sistémica o periféricamente una proteína o enzima funcional. Por consiguiente, en ciertas realizaciones de la presente invención, las una o más nanopartículas lipídicas que comprenden la composición mezclada homogéneamente pueden dirigirse a los hepatocitos y/o distribuirse preferentemente a las células y tejidos del hígado tras su administración. Después de la transfección de los hepatocitos diana por el polinucleótido encapsulado en una o más de las nanopartículas lipídicas que comprenden la composición mezclada homogéneamente, dichos polinucleótidos se expresan (por ejemplo, se traducen) y se excreta y distribuye sistémicamente un producto funcional (por ejemplo, un polipéptido o proteína), donde dicho producto funcional puede ejercer un efecto terapéutico deseado.

Los polinucleótidos encapsulados en una o más de las nanopartículas lipídicas que comprenden la composición mezclada homogéneamente pueden administrarse y/o transfectar células o tejidos diana. En algunas realizaciones, los polinucleótidos encapsulados son capaces de ser expresados y de producir productos polipeptídicos funcionales (y en algunos casos excretados) por la célula diana, confiriendo de este modo una propiedad beneficiosa a, por ejemplo, las células o tejidos diana. Tales polinucleótidos encapsulados pueden codificar, por ejemplo, una hormona, enzima, receptor, polipéptido, péptido u otra proteína de interés. En ciertas realizaciones, tales polinucleótidos encapsulados pueden codificar también un a Rn interferente pequeño (ARNsi) o un ARN antisentido con el propósito de disminuir o eliminar la expresión de un ácido nucleico o gen endógeno. En ciertas realizaciones, dichos polinucleótidos encapsulados pueden ser naturales o de naturaleza recombinante y pueden ejercer su actividad terapéutica usando mecanismos de acción en sentido o antisentido.

Debe entenderse que aunque ciertas realizaciones descritas en la presente pueden provocar una expresión mejorada o modulada de uno o más polinucleótidos encapsulados por una célula diana, la utilidad de las composiciones mezcladas homogéneamente descritas en la presente no se limita a aumentos en la expresión de polinucleótidos encapsulados. Más bien, en ciertas realizaciones, las composiciones mezcladas homogéneamente descritas en la presente pueden modular o provocar de otro modo una reducción sinérgica en la expresión de uno o más genes o ácidos nucleicos en una célula diana. Por ejemplo, en ciertas realizaciones en donde uno o más de los polinucleótidos encapsulados que comprenden las formulaciones mezcladas homogéneamente de la presente son oligonucleótidos antisentido, tales formulaciones mezcladas homogéneamente pueden mejorar (por ejemplo, aumentar) sinérgicamente la administración de tales oligonucleótidos antisentido encapsulados a una o más células diana, modulando o mejorando de este modo la interferencia o inhibición de la expresión o producción de un gen o ácido nucleico diana. Por consiguiente, cuando los polinucleótidos encapsulados son, por ejemplo, oligonucleótidos antisentido o ARNsi, las formulaciones mezcladas homogéneamente que comprenden tales polinucleótidos pueden mejorar sinérgicamente la administración de polinucleótidos encapsulados a las células diana (por ejemplo, mejorada en aproximadamente una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, ocho, diez, doce, quince, veinte, veinticinco, cincuenta, cien, quinientas, mil veces o más). Tal administración mejorada de, por ejemplo, los polinucleótidos antisentido o ARNsi, usando las formulaciones mezcladas homogéneamente descritas en la presente, reduciría de este modo sinérgicamente la expresión de los ácidos nucleicos diana (por ejemplo, de tal manera que se redujese o eliminase la producción de un ácido nucleico o proteína correspondiente a dichos ácidos nucleicos diana). En tal realización, la administración de los polinucleótidos encapsulados a las células diana puede mejorarse sinérgicamente (por ejemplo, aumentarse) y, por consiguiente, también se mejora la función de los polinucleótidos encapsulados, provocando de este modo una reducción correspondiente en la expresión de los genes o ácidos nucleicos diana.

De manera similar, en ciertas realizaciones, las invenciones descritas en la presente pueden provocar una producción sinérgicamente mejorada (por ejemplo, aumentada) de uno o más polipéptidos o proteínas que están codificados por los polinucleótidos encapsulados. En ciertas realizaciones en donde tales polipéptidos o proteínas se excretan en la circulación periférica de un sujeto, se esperaría que dicha producción mejorada de polipéptidos o proteínas codificados por el polinucleótido de ARNm encapsulado, usando las formulaciones mezcladas homogéneamente descritas en la presente, provocase una secreción mejorada (por ejemplo, aumentada) correspondiente de tales polipéptidos periféricamente.

En algunas realizaciones, el ARNm encapsulado (por ejemplo, el ARNm que codifica una proteína deficiente) puede incluir opcionalmente modificaciones químicas o biológicas que, por ejemplo, mejoran la estabilidad y/o la vida media de dicho polinucleótido o que mejoran o facilitan de otro modo la traducción de dicho polinucleótido.

También se contempla en la presente invención la coadministración de uno o más polinucleótidos únicos a las células diana mediante las nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones mezcladas homogéneamente, como se define en las reivindicaciones, por ejemplo, combinando dos polinucleótidos únicos en una única nanopartícula lipídica. En ciertas realizaciones, un primer polinucleótido, como el ARNm que codifica la galactosa-1-fosfato uridiltransferasa (GALT) representada por la SEQ ID NO: 2, y un segundo polinucleótido, como el ARNm que codifica la galatoquinasa (GALK), pueden encapsularse en una única nanopartícula lipídica de base liposomal (por ejemplo, una primera nanopartícula lipídica) y mezclarse homogéneamente con una segunda nanopartícula lipídica, como se define en las reivindicaciones, y administrarse a un sujeto que la necesite (por ejemplo, para el tratamiento de la galactosemia). También se contempla la coadministración de un primer polinucleótido y un segundo polinucleótido en una composición farmacéutica mezclada homogéneamente, como se define en las reivindicaciones. En ciertas realizaciones, el primer polinucleótido encapsulado por la primera nanopartícula lipídica facilita la administración o mejora sinérgicamente la expresión de un segundo polinucleótido. Como se define por las reivindicaciones, un polinucleótido puede encapsularse en una primera nanopartícula lipídica y mezclarse homogéneamente posteriormente con una segunda nanopartícula lipídica vacía (es decir, una nanopartícula lipídica que no encapsula un polinucleótido). La expresión del polinucleótido puede mejorarse (por ejemplo, aumentarse) con respecto a la expresión de los polinucleótidos observada cuando la primera nanopartícula lipídica se administra independientemente de la segunda nanopartícula lipídica (por ejemplo, la expresión del polinucleótido puede aumentarse sinérgicamente aproximadamente dos, cuatro, cinco, diez, doce, quince o veinte veces o más).

También se contempla la administración de uno o más polinucleótidos encapsulados a una o más células diana para tratar un único trastorno o deficiencia, en donde cada polinucleótido funciona mediante un mecanismo de acción diferente. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente de la presente invención comprenden un primer polinucleótido que, está encapsulado en una primera nanopartícula lipídica y está destinado a corregir una proteína endógena o deficiencia enzimática, como se define en las reivindicaciones. Como se define en las reivindicaciones, los polinucleótidos pueden encapsularse en la misma nanopartícula lipídica y mezclarse homogéneamente con una nanopartícula lipídica vacía. En tales realizaciones, la expresión de los polinucleótidos encapsulados puede mejorarse (por ejemplo, aumentarse) sinérgicamente con respecto a la expresión de los polinucleótidos observada cuando tales primeras nanopartículas lipídicas se administran independientemente de las segundas nanopartículas lipídicas. Por ejemplo, la expresión del polinucleótido encapsulado puede aumentarse sinérgicamente en por lo menos dos, cuatro, cinco, diez, doce, quince o veinte veces o más, con respecto a la suma de la expresión de los polinucleótidos observada cuando tales primeras nanopartículas lipídicas se administran independientemente de las segundas nanopartículas lipídicas.

Aunque los polinucleótidos transcritos in vitro (por ejemplo, ARNm) pueden transfectarse en células diana, tales polinucleótidos pueden ser degradados fácil y eficientemente por la célula in vivo, haciendo por tanto que tales polinucleótidos sean ineficaces. Además, algunos polinucleótidos son inestables en los fluidos corporales (particularmente en el suero humano) y pueden degradarse o digerirse incluso antes de llegar a una célula diana. Además, dentro de una célula, un ARNm natural puede descomponerse con una vida media de entre 30 minutos y varios días. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, los polinucleótidos de ARNm encapsulados en nanopartículas lipídicas que se proporcionan en la presente, retienen preferiblemente por lo menos cierta capacidad de ser expresados o traducidos, para producir de este modo una proteína o enzima funcional dentro de una o más células diana.

En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente comprenden una o más nanopartículas lipídicas que incluyen o encapsulan uno o más polinucleótidos estabilizados (por ejemplo, ARNm que se ha estabilizado contra la digestión o degradación in vivo por nucleasas) que modulan la expresión de un gen o que pueden expresarse o traducirse para producir un polipéptido o proteína funcional dentro de una o más células diana. En ciertas realizaciones, la actividad de tales polinucleótidos encapsulados (por ejemplo, ARNm que codifica una proteína o enzima funcional) se prolonga durante un periodo de tiempo prolongado. Por ejemplo, la actividad de los polinucleótidos puede prolongarse de tal manera que las composiciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente pueden administrarse a un sujeto de manera quincenal o bisemanal, o más preferiblemente de manera mensual, bimensual, trimestral o anual. La actividad ampliada o prolongada de las composiciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente de la presente invención, y en particular del ARNm encapsulado, está directamente relacionada con la cantidad de proteína o enzima funcional traducida a partir de dicho ARNm. De manera similar, la actividad de las composiciones mezcladas homogéneamente de la presente invención puede ampliarse o prolongarse aún más mediante modificaciones químicas realizadas para mejorar o potenciar aún más la traducción de los polinucleótidos de ARNm. Por ejemplo, la secuencia consenso de Kozac desempeña una función en el inicio de la traducción de proteínas, y la inclusión de dicha secuencia consenso de Kozac en los polinucleótidos de ARNm encapsulados puede ampliar o prolongar aún más la actividad de los polinucleótidos de ARNm. Además, la cantidad de proteína o enzima funcional expresada y producida por la célula diana es una función de la cantidad de polinucleótido (por ejemplo, ARNm) administrado a las células diana y de la estabilidad de dicho polinucleótido. En la medida en que pueda mejorarse o potenciarse la estabilidad de los polinucleótidos para su uso en la presente invención, pueden ampliarse aún más la vida media, la actividad de la proteína o enzima traducida y la frecuencia de dosificación de la composición.

Los polinucleótidos encapsulados en las composiciones farmacéuticas comprenden ARNm (por ejemplo, la SEQ ID NO: 3 que codifica ARNm de eritropoyetina humana). En ciertas realizaciones, los polinucleótidos pueden modificarse químicamente, por ejemplo, para conferir estabilidad (por ejemplo, estabilidad relativa a la versión de tipo salvaje o de origen natural del ARNm y/o la versión del ARNm endógena natural a las células diana). Por consiguiente, en algunas realizaciones, los polinucleótidos encapsulados proporcionados en la presente comprenden por lo menos una modificación química que confiere estabilidad aumentada o mejorada al polinucleótido, incluyendo, por ejemplo, resistencia mejorada a la digestión por nucleasas in vivo. Como se usan en la presente, las frases "modificaciones químicas" y "modificado químicamente", en la medida que tales términos se refieren a los polinucleótidos proporcionados en la presente, incluyen por lo menos una alteración que preferiblemente mejora la estabilidad y hace que el polinucleótido sea más estable (por ejemplo, resistente a la digestión por nucleasas) que la versión de tipo salvaje o de origen natural de ese polinucleótido. Los términos "estable" y "estabilidad" en la medida que tales términos se refieren a los polinucleótidos para su uso en la presente invención, y en particular con respecto al ARNm, se refieren a una resistencia aumentada o mejorada a la degradación por, por ejemplo, nucleasas (es decir, endonucleasas o exonucleasas) que normalmente son capaces de degradar dicho ARN La estabilidad aumentada puede incluir, por ejemplo, menor sensibilidad a la hidrólisis u otra destrucción por enzimas endógenas (por ejemplo, endonucleasas o exonucleasas) o condiciones dentro de la célula o tejido diana, aumentando o mejorando de este modo la residencia de tales polinucleótidos en la célula, tejido, sujeto y/o citoplasma diana. Las moléculas de polinucleótidos estabilizadas proporcionadas en la presente demuestran vidas medias más largas con respecto a sus homólogos de origen natural no modificados (por ejemplo, la versión de tipo salvaje del polinucleótido).

También se contemplan por las frases "modificación química" y "modificado químicamente", en la medida que tañes términos se refieren a los polinucleótidos para su uso con la presente invención, alteraciones que mejoran o potencian la traducción de polinucleótidos de ARNm, incluyendo por ejemplo, la inclusión de secuencias que funcionan en el inicio de la traducción de proteínas (por ejemplo, la secuencia consenso de Kozac). (Kozak, M., Nucleic Acids Res 15 (20): 8125-48 (1987)). La frase "modificaciones químicas", como se usa en la presente, también incluye modificaciones que introducen químicas que difieren de las observadas en polinucleótidos de origen natural, por ejemplo, modificaciones covalentes como la introducción de nucleótidos modificados (por ejemplo, análogos de nucleótidos, o la inclusión de grupos colgantes que no se encuentran de manera natural en tales moléculas de polinucleótidos). En algunas realizaciones, los polinucleótidos han experimentado una modificación química o biológica para hacerlos más estables antes de su encapsulación en una o más nanopartículas lipídicas. Las modificaciones químicas ejemplares de un polinucleótido incluyen la eliminación de una base (por ejemplo, por deleción o por sustitución de un nucleótido por otro) o la modificación química de una base.

Además, las modificaciones adecuadas incluyen alteraciones en uno o más nucleótidos de un codón de tal manera que el codón codifica el mismo aminoácido pero es más estable que el codón que se encuentra en la versión de tipo salvaje del polinucleótido. Por ejemplo, se ha demostrado una relación inversa entre la estabilidad del ARN y un mayor número de residuos de citidinas (C) y/o uridinas (U), y se ha descubierto que el ARN desprovisto de residuos de C y U es estable para la mayoría de las RNasas (Heidenreich, et al. J Biol Chem 269, 2131-8 (1994)). En algunas realizaciones, se reduce el número de residuos C y/o U en una secuencia de ARNm. En otra realización, el número de residuos C y/o U se reduce mediante la sustitución de un codón que codifica un aminoácido particular por otro codón que codifica el mismo aminoácido o un aminoácido relacionado. Las modificaciones contempladas en los polinucleótidos de ARNm para su uso con la presente invención también incluyen la incorporación de pseudouridinas. La incorporación de pseudouridinas en los polinucleótidos de ARNm para su uso con la presente invención puede mejorar la estabilidad y la capacidad de traducción, así como disminuir la inmunogenicidad in vivo. (Véase, por ejemplo, Karikó, K., et al., Molecular Therapy 16 (11): 1833-1840 (2008)). Las sustituciones y modificaciones de los polinucleótidos para su uso con la presente invención pueden realizarse mediante métodos fácilmente conocidos por un experto en la técnica.

Las limitaciones en la reducción del número de residuos C y U en una secuencia probablemente serán mayores dentro de la región codificante de un ARNm, en comparación con una región no traducida, (es decir, probablemente no será posible eliminar todos los residuos C y U presentes en el mensaje mientras el mensaje todavía conserve la capacidad de codificar la secuencia de aminoácidos deseada). Sin embargo, la degeneración del código genético proporciona la oportunidad de reducir el número de residuos C y/o U presentes en la secuencia, a la vez que se mantiene la misma capacidad de codificación (es decir, dependiendo de que aminoácido sea codificado por un codón, pueden ser posibles varias posibilidades de modificación de las secuencias de ARN). Por ejemplo, los codones para Gly pueden alterarse a GGA o GGG en lugar de GGU o GGC.

Los polinucleótidos encapsulados pueden incluir variantes tanto de origen natural como de no natural y, por consiguiente, tales polinucleótidos pueden comprender no sólo los heterociclos de purina y pirimidina conocidos, sino también análogos heterocíclicos y tautómeros de los mismos. Ejemplos contemplados incluyen, pero no se limitan a, adenina, guanina, citosina, timidina, uracilo, xantina, hipoxantina, pseudouridina, 5-metilcitosina, isocitosina, pseudoisocitosina, 5-bromouracilo, 5-propiniluracilo, 6-aminopurina, 2-aminopurina, inosina, diaminopurina y 2-cloro-6-aminopurina. En algunas realizaciones, por lo menos uno de los nucleótidos presentes en el polinucleótido es una nucleobase modificada seleccionada del grupo que consiste en 5-metilcitosina, isocitosina, pseudoisocitosina, 5-bromouracilo, 5-propiniluracilo, 6-aminopurina, 2-aminopurina, inosina, diaminopurina y 2-cloro-6-aminopurina.

El término modificación química también incluye, por ejemplo, la incorporación de enlaces no nucleotídicos o nucleótidos modificados en las secuencias de polinucleótidos para su uso con la presente invención (por ejemplo, modificaciones de bloqueo del extremo a uno o ambos de los extremos 3' y 5' de una molécula de ARNm que codifica una proteína o enzima funcional). Tales modificaciones pueden incluir la adición de bases a una secuencia de polinucleótidos (por ejemplo, la inclusión de una cola poli A o una cola poli A más larga), la alteración de la UTR 3' o la UTR 5', la formación de complejo del polinucleótido con un agente (por ejemplo, una proteína o una molécula de polinucleótido complementaria), y la inclusión de elementos que cambian la estructura de una molécula de polinucleótido (por ejemplo, que forman estructuras secundarias).

Se piensa que la cola poli A estabiliza los mensajeros naturales y el ARN sintético de sentido. Por lo tanto, en ciertas realizaciones a una molécula de ARNm se le puede añadir una cola larga de poli A, haciendo por tanto que el ARN sea más estable. Las colas de poli A pueden añadirse usando una variedad de técnicas reconocidas en la técnica. Por ejemplo, al ARN sintético o transcrito in vitro se pueden añadir colas largas de poli A usando poli A polimerasa (Yokoe, et al. Nature Biotechnology. 1996; 14: 1252-1256). Un vector de transcripción también puede codificar colas de poli A largas. Además, las colas de poli A pueden añadirse por transcripción directamente a partir de productos de PCR. El poli A también puede ligarse al extremo 3' de un ARN de sentido con ARN ligasa (véase, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2a Ed., ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: edición de 1991)). En ciertas realizaciones, la longitud de la cola poli A es de por lo menos aproximadamente 90, 200, 300, 400 o por lo menos 500 nucleótidos. En ciertas realizaciones, la longitud de la cola poli A se ajusta para controlar la estabilidad de una molécula de ARNm de sentido modificada de composiciones de la invención y, por tanto, la transcripción de proteína. Por ejemplo, como la longitud de la cola de poli A puede influir en la vida media de una molécula de ARNm de sentido, la longitud de la cola de poli A puede ajustarse para modificar el nivel de resistencia del ARNm a las nucleasas y controlar de este modo el curso temporal de la expresión de polinucleótidos y/o la producción de polipéptidos en una célula diana. En ciertas realizaciones, las moléculas de polinucleótidos estabilizadas son suficientemente resistentes a la degradación in vivo (por ejemplo, por nucleasas), de tal manera que pueden administrarse a la célula diana sin una nanopartícula lipídica.

En ciertas realizaciones, las modificaciones químicas son modificaciones de bloqueo del extremo de uno o más polinucleótidos que comprenden las composiciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente de la invención. Por ejemplo, tales polinucleótidos pueden modificarse mediante la incorporación de secuencias no traducidas (UTR) 3' y/o 5' que no se encuentran de manera natural en el polinucleótido de tipo salvaje. En ciertas realizaciones, puede incorporarse la secuencia flanqueante 3' y/o 5' que flanquea de manera natural un ARNm y codifica una segunda proteína no relacionada a la secuencia de nucleótidos de una molécula de ARNm que codifica una proteína o funcional para modificarla. Por ejemplo, pueden incorporarse las secuencias 3' o 5' de moléculas de ARNm que son estables (por ejemplo, globina, actina, GAPDH, tubulina, histona o enzimas del ciclo del ácido cítrico) a la región 3' y/o 5' de una molécula de polinucleótido de ARNm de sentido para aumentar la estabilidad de la molécula de ARNm de sentido.

También se contemplan en la presente invención modificaciones de las secuencias de polinucleótidos realizadas en uno o ambos de los extremos 3' y 5' del polinucleótido. Por ejemplo, la presente invención contempla modificaciones en el extremo 5' de los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) para incluir una secuencia parcial de un gen inmediato-temprano 1 (IE1) de CMV, o un fragmento del mismo para mejorar la resistencia a nucleasas y/o mejorar la vida media del polinucleótido. Además de aumentar la estabilidad de la secuencia de polinucleótidos del ARNm, se ha descubierto sorprendentemente que la inclusión de una secuencia parcial de un gen inmediato-temprano 1 (IE1) de CMV (por ejemplo, en la región 5' no traducida del ARNm) mejora aún más la traducción del ARNm. También se contempla la inclusión de una secuencia que codifica la hormona del crecimiento humano (hGH), o un fragmento de la misma en el extremo 3' o en la región no traducida del polinucleótido (por ejemplo, ARNm) para estabilizar aún más el polinucleótido. En general, las modificaciones químicas contempladas mejoran la estabilidad y/o las propiedades farmacocinéticas (por ejemplo, la vida media) del polinucleótido con respecto a sus homólogos no modificados, e incluyen, por ejemplo, modificaciones realizadas para mejorar la resistencia de dichos polinucleótidos a la digestión in vivo por nucleasas.

Las modificaciones químicas contempladas también incluyen, por ejemplo, la modificación de polinucleótidos encapsulados para incluir nucleótidos de origen no naturas que comprenden, por ejemplo, fracciones de azúcar y/o base modificadas, que también se denominan en la presente "análogos de nucleótidos". Los nucleótidos de origen no natural incluyen nucleótidos que tienen fracciones de azúcar modificadas, como nucleótidos bicíclicos o nucleótidos 2' modificados, como nucleótidos 2' sustituidos. En algunas realizaciones, los análogos de nucleótidos son variantes de nucleótidos naturales, como nucleótidos de ADN o ARN, en virtud de, por ejemplo, modificaciones en los grupos de azúcares y/o bases.

En ciertas realizaciones, en el contexto del polinucleótido los análogos de nucleótidos contemplados pueden ser funcionalmente equivalentes a los nucleótidos de origen natural. Por ejemplo, los análogos de nucleótidos pueden no tener ningún efecto funcional en la forma en que funciona el polinucleótido. No obstante, tales análogos de nucleótidos funcionalmente equivalentes pueden ser útiles si, por ejemplo, son más fáciles o baratos de fabricar, o son más estables a las condiciones de almacenamiento o fabricación, o representan una etiqueta o marcador.

En otras realizaciones, los análogos de nucleótidos pueden tener un efecto funcional sobre la manera en la que funciona el polinucleótido (por ejemplo, aumentando la resistencia a las nucleasas intracelulares y/o una facilidad de transporte aumentada a la célula diana). Ejemplos específicos de análogos de nucleótidos contemplados se describen, por ejemplo, en Freier, et al., Nucl. Acid Res. (1997) 25: 4429-4443 y Uhlmann, et al., Curr. Opinion in Drug Development (2000) 3(2): 293-213.

Los polinucleótidos divulgados en la presente pueden comprender o consistir en una secuencia de nucleótidos de origen natural (por ejemplo, ADN o ARNm) o, alternativamente, pueden comprender o consistir en una combinación de tales nucleótidos de origen natural y uno o más nucleótidos de origen no natural (por ejemplo, análogos de nucleótidos). En ciertas realizaciones, por ejemplo, cuando los polinucleótidos encapsulados comprenden o consisten en oligonucleótidos antisentido, la inclusión de análogos de nucleótidos en tales polinucleótidos puede mejorar adecuadamente la afinidad del polinucleótido por una o más secuencias diana. En la Solicitud de Patente Internacional WO 2007/031091 se proporcionan ejemplos adicionales de análogos de nucleótidos adecuados y preferidos.

En algunas realizaciones, los análogos de nucleótidos se seleccionan independientemente entre, por ejemplo: unidades de 2'-O-alquilo-ARN, unidades de 2'-amino-ADN, unidades de 2'-fluoro-ADN, unidades de ácidos nucleicos bloqueados, unidades de ácido nucleico arabino (ANA), unidades de 2'-fluoro-ANA, unidades de HNA, INA (unidades de ácido nucleico intercalante según lo analizado por Christensen, et al., Nucl. Acids. Res. (2002) 30: 4918 4925) y unidades de 2'MOE. En ciertas realizaciones, en los polinucleótidos para su uso con la invención sólo hay uno de los tipos anteriores de análogos de nucleótidos.

En algunas realizaciones los análogos de nucleótidos comprenden 2'-O-metoxietil-ARN (2'MOE), monómeros de 2'-fluoro-ADN o análogos de nucleótidos de LNA, y como tales los polinucleótidos para uso con la invención pueden comprender análogos de nucleótidos que se seleccionan independientemente entre estos tres tipos de análogos, o alternativamente pueden comprender sólo un tipo de análogo seleccionado entre los tres tipos. En algunas realizaciones, por lo menos uno de los nucleótidos de un polinucleótido encapsulado es 2'-MOE-ARN, como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 unidades de nucleótidos 2'-MOE-ARN. En algunas realizaciones por lo menos uno de los nucleótidos de un polinucleótido encapsulado es 2'-fluoro-ADN, como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 unidades de nucleótido 2'-fluoro-ADN.

En algunas realizaciones, los polinucleótidos encapsulados comprenden por lo menos una unidad de ácido nucleico bloqueado (LNA), como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 unidades de LNA, como de aproximadamente 3-7 o 4-8 unidades de LNA, o 3, 4, 5, 6 o 7 unidades de LNA. En algunas realizaciones, todos los nucleótidos del polinucleótido son LNA. En algunas realizaciones, el polinucleótido puede comprender tanto beta-D-oxi-LNA, como una o más de las siguientes unidades de LNA: tio-LNA, amino-LNA, oxi-LNA, y/o ENA en las configuraciones beta-D o alfa-L o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, todas las unidades de citosina de LNA son 5' metil-citosina.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica mezclada homogéneamente, las dos o más nanopartículas lipídicas comprendidas en la misma o los polinucleótidos encapsulados por tales nanopartículas lipídicas pueden comprender un reactivo de estabilización. Las composiciones pueden incluir uno o más reactivos de formulación que se unen directa o indirectamente al polinucleótido y lo estabilizan, aumentando de este modo el tiempo de residencia en el citoplasma de una célula diana. Tales reactivos llevan preferiblemente a una vida media mejorada de un polinucleótido en las células diana. Por ejemplo, la estabilidad de un ARNm y la eficiencia de la traducción pueden aumentarse mediante la incorporación de "reactivos de estabilización" que forman complejos con los polinucleótidos (por ejemplo, ARNm) que se encuentran de manera natural dentro de una célula (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5.677.124). La incorporación de un reactivo de estabilización puede lograrse, por ejemplo, combinando el poli A y una proteína con el ARNm que se va a estabilizar in vitro antes de cargar o encapsular el ARNm dentro de las una o más nanopartículas lipídicas que comprenden la composición farmacéutica mezclada homogéneamente. Los reactivos de estabilización ejemplares incluyen una o más proteínas, péptidos, aptámeros, proteínas accesorias de la traducción, proteínas de unión al ARNm y/o factores de inicio de la traducción.

La estabilización de las composiciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente descritas en la presente, y de las nanopartículas lipídicas constituyentes, también puede mejorarse mediante el uso de sustancias inhibidoras de la opsonización, que típicamente son polímeros hidrófilos grandes que se unen química o físicamente o se incorporan de otro modo a la nanopartícula lipídica (por ejemplo, mediante la intercalación de un anclaje soluble en lípidos en la propia membrana, o uniéndose directamente a grupos activos de lípidos de membrana). Estos polímeros hidrófilos inhibidores de la opsonización forman una capa superficial protectora que disminuye significativamente la captación de los liposomas por el sistema macrófago-monocito y el sistema reticuloendotelial (por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 4.920.016). Por ejemplo, los retrasos en la captación de nanopartículas lipídicas por el sistema reticuloendotelial pueden facilitarse mediante la adición de un recubrimiento superficial de polímero hidrófilo sobre o dentro de las nanopartículas lipídicas para enmascarar el reconocimiento y la captación de la nanopartícula lipídica a base de liposomas por el sistema reticuloendotelial. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, una o más de las nanopartículas lipídicas que componen las formulaciones mezcladas homogéneamente comprenden un polímero de polietilenglicol (PEG) o un lípido modificado con PEG para mejorar aún más la administración de tales nanopartículas lipídicas a la célula y tejidos diana.

Cuando el ARN se hibrida con una molécula de polinucleótido complementaria (por ejemplo, ADN o ARN) puede protegerse de las nucleasas. (Krieg, et al. Melton. Methods in Enzymology. 1987; 155, 397-415). La estabilidad del ARNm hibridado se debe probablemente a la especificidad inherente de cadena sencilla de la mayoría de las RNasas. En algunas realizaciones, el reactivo de estabilización seleccionado para formar complejo con un polinucleótido es una proteína eucariota (por ejemplo, una proteína de mamífero). En otra realización más, el polinucleótido (ARNm) para su uso en terapia de sentido puede modificarse por hibridación con una segunda molécula de polinucleótido. Si se hibrida una molécula completa de ARNm con una molécula de polinucleótido complementaria, puede reducirse el inicio de la traducción. En algunas realizaciones, pueden dejarse opcionalmente sin hibridar la región no traducida 5' y la región de inicio AUG de la molécula de ARNm. Después del inicio de la traducción, la actividad de desenrollado del complejo ribosómico puede funcionar incluso en dúplex de alta afinidad, de tal manera que pueda proceder la traducción. (Liebhaber. J. Mol. Biol. 1992; 226: 2-13; Monia, et al. J Biol Chem. 1993; 268: 14514-22.) Se entenderá que cualquiera de los métodos descritos anteriormente para mejorar la estabilidad de los polinucleótidos puede usarse solo o en combinación con uno o más de cualquier otro de los métodos y/o composiciones descritos anteriormente .

En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente de la presente invención mejoran la administración de polinucleótidos encapsulados en nanopartículas lipídicas a una o más células, tejidos u órganos diana. En algunas realizaciones, la administración mejorada a una o más células diana comprende aumentar la cantidad de polinucleótido que entra en contacto o se administra de otro modo a las células diana. En algunas realizaciones, la mejora de la administración a las células diana comprende la reducción de la cantidad de polinucleótido que entra en contacto con células no diana. En algunas realizaciones, mejorar la administración a las células diana comprende permitir la transfección de por lo menos algunas células diana con el polinucleótido encapsulado. En algunas realizaciones, el nivel de expresión del polinucleótido encapsulado por las nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente objeto aumenta en las células diana.

Los polinucleótidos para su uso con la presente invención pueden combinarse opcionalmente con un gen reportero (por ejemplo, en sentido ascendente o en sentido descendente de la región codificante del polinucleótido) que, por ejemplo, facilita la determinación de la administración del polinucleótido a las células o tejidos diana. Los genes reporteros adecuados pueden incluir, por ejemplo, ARNm de proteína fluorescente verde (ARNm de GFP), ARNm de luciferasa deRenilla(ARNm de luciferasa), ARNm de luciferasa de luciérnaga (SEQ ID NO: 1), o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, el ARNm de GFP puede fusionarse con un polinucleótido que codifique ARNm de OTC para facilitar la confirmación de la localización del ARNm en las células, tejidos u órganos diana.

En algunas realizaciones, las composiciones mezcladas homogéneamente de la presente invención comprenden una o más moléculas adicionales (por ejemplo, proteínas, péptidos, aptámeros u oliogonucleótidos) que facilitan la transferencia del ARNm y/u otros polinucleótidos (por ejemplo, miARN, ARNsn y ARNsno) desde la nanopartícula lipídica a un compartimento intracelular de la célula diana. En algunas realizaciones, la molécula adicional facilita la administración de los polinucleótidos en, por ejemplo, el citosol, el lisosoma, la mitocondria, el núcleo, los nucléolos o el proteasoma de una célula diana. También se incluyen agentes que facilitan el transporte de la proteína traducida de interés desde el citoplasma hasta su localización intercelular normal (por ejemplo, en la mitocondria) para tratar deficiencias en ese orgánulo. En algunas realizaciones, el agente se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un péptido, un aptámero y un oligonucleótido.

En algunas realizaciones, las composiciones de la presente invención facilitan la producción endógena por el sujeto de una o más proteínas y/o enzimas funcionales, y en particular la producción de proteínas y/o enzimas que demuestran menos inmunogenicidad con respecto a sus homólogos preparados recombinantemente. En ciertas realizaciones de la presente invención, las nanopartículas lipídicas comprenden ARNm que codifica una proteína o enzima deficiente. Tras la distribución de tales composiciones a los tejidos diana y la posterior transfección de tales células diana, el ARNm exógeno cargado o encapsulado en las nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones mezcladas homogéneamente puede traducirse in vivo para producir una proteína o enzima funcional codificada por dicho ARNm encapsulado (por ejemplo, una proteína o enzima de la que el sujeto es deficiente). Por consiguiente, en ciertas realizaciones, las composiciones de la presente invención aprovechan la capacidad de un sujeto para traducir ARNm preparado exógena o recombinantemente para producir una proteína o enzima traducida endógenamente, y producir de este modo (y en su caso excretar) una proteína o enzima funcional. El ARNm expresado y/o las proteínas o enzimas traducidas producidas a partir del mismo también pueden caracterizarse por la inclusión in vivo de modificaciones postraduccionales nativas que a menudo pueden estar ausentes en las proteínas o enzimas preparadas remezclan recombinantemente, reduciendo de este modo aún más la inmunogenicidad de la proteína o enzima traducida.

La encapsulación de ARNm en las nanopartículas lipídicas y la administración de las composiciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente que comprenden tales nanopartículas lipídicas evita la necesidad de administrar el ARNm a orgánulos específicos dentro de una célula diana (por ejemplo, mitocondrias). Más bien, tras la transfección de una célula diana y la administración del ARNm encapsulado al citoplasma de la célula diana, el contenido de ARNm de las nanopartículas lipídicas puede traducirse y producirse y/o excretarse una proteína o enzima funcional.

También se contempla el direccionamiento discriminatorio de una o más células y tejidos diana por medios de direccionamiento tanto pasivos como activos. El fenómeno del direccionamiento pasivo aprovecha los patrones de distribución naturales de las nanopartículas lipídicas in vivo sin depender del uso de excipientes o medios adicionales para mejorar el reconocimiento de la nanopartícula lipídica por una o más células diana. Por ejemplo, es probable que las nanopartículas lipídicas sujetas a fagocitosis por las células del sistema reticuloendotelial se acumulen en el hígado o el bazo y, por consiguiente, pueden proporcionar medios para dirigir pasivamente la administración de las composiciones a dichas células diana.

Alternativamente, se contempla el direccionamiento activo, que implica el uso de excipientes adicionales, denominados en la presente "ligandos de direccionamiento", que pueden unirse (covalente o no covalentemente) a la nanopartícula lipídica para fomentar la localización de dicha nanopartícula lipídica en ciertas células o tejidos diana. Por ejemplo, el direccionamiento puede estar mediado por la inclusión de uno o más ligandos de direccionamiento endógenos (por ejemplo, apolipoproteína E) en o sobre la nanopartícula lipídica para fomentar la distribución a las células o tejidos diana. El reconocimiento del ligando de direccionamiento por los tejidos diana facilita activamente la distribución tisular y la captación celular de las nanopartículas lipídicas y/o su contenido por las células y tejidos diana. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, una o más de las nanopartículas lipídicas que comprenden la formulación farmacéutica mezclada homogéneamente pueden comprender un ligando de direccionamiento de apolipoproteína-E en o sobre dichas nanopartículas lipídicas para facilitar o fomentar el reconocimiento y la unión de dicha nanopartícula lipídica a receptores endógenos de lipoproteína de baja densidad expresados, por ejemplo, por hepatocitos. Como se expone en la presente, la composición puede comprender un ligando capaz de aumentar la afinidad de las composiciones mezcladas homogéneamente para una o más células diana. Los ligandos de direccionamiento pueden enlazarse a la bicapa externa de la nanopartícula lipídica durante la formulación o después de la formulación. Estos métodos son bien conocidos en la técnica. Además, algunas nanopartículas lipídicas pueden comprender polímeros fusogénicos como PEAA, hemagluttinina, otros lipopéptidos (véanse las Solicitudes de Patente de Estados Unidos N° de Ser. 08/835,281, y 60/083,294) y otras características útiles para la administración in vivo y/o intracelular. En otras realizaciones, las composiciones mezcladas homogéneamente de la presente invención demuestran eficacias de transfección mejoradas, y/o demuestran una selectividad mejorada hacia las células o tejidos diana de interés. Por lo tanto, se contemplan composiciones mezcladas homogéneamente o nanopartículas lipídicas que comprenden uno o más ligandos (por ejemplo, péptidos, aptámeros, oligonucleótidos, una vitamina u otras moléculas) que sean capaces de mejorar la afinidad de las composiciones mezcladas homogéneamente o sus nanopartículas lipídicas constituyentes y sus contenidos de polinucleótidos a una o más células o tejidos diana. Los ligandos adecuados pueden unirse o enlazarse opcionalmente a la superficie de la nanopartícula lipídica. En algunas realizaciones, el ligando de direccionamiento puede abarcar la superficie de una nanopartícula lipídica o estar encapsulado dentro de la nanopartícula lipídica. Los ligandos adecuados se seleccionan sobre la base de sus propiedades físicas, químicas o biológicas (por ejemplo, afinidad selectiva y/o reconocimiento de marcadores o características de la superficie de la célula diana). Los sitios diana específicos de la célula y su ligando de direccionamiento correspondiente pueden variar ampliamente. Los ligandos de direccionamiento adecuados se seleccionan de tal manera que se aprovechen las características únicas de una célula diana, permitiendo así que la composición discrimine entre células diana y no diana. Por ejemplo, las composiciones de la presente invención pueden llevar marcadores de superficie (por ejemplo, apolipoproteína-B o apolipoproteína-E) que mejoran selectivamente el reconocimiento, o la afinidad, de los hepatocitos (por ejemplo, mediante el reconocimiento mediado por receptores y la unión a tales marcadores de superficie). Además, se esperaría que el uso de galactosa como ligando de direccionamiento dirigiese las composiciones de la presente invención a los hepatocitos parenquimatosos, o alternativamente se esperaría que el uso de residuos de azúcar que contienen manosa como ligando de direccionamiento dirigiese las composiciones de la presente invención a las células endoteliales hepáticas (por ejemplo, residuos de azúcar que contienen manosa que pueden unirse preferentemente al receptor de asialoglicoproteína presente en los hepatocitos). (Véase Hillery AM, et al. "Drug Delivery and Targeting: For Pharmacists and Pharmaceutical Scientists" (2002) Taylor & Francis, Inc.) La presentación de tales ligandos de direccionamiento que se han conjugado con fracciones presentes en la nanopartícula lipídica facilita por lo tanto el reconocimiento y la captación de las composiciones mezcladas homogéneamente de la presente invención por una o más células y tejidos diana. Los ejemplos de ligandos de direccionamiento adecuados incluyen uno o más péptidos, proteínas, aptámeros, vitaminas y oligonucleótidos.

Como se usa en la presente, el término "sujeto" se refiere a cualquier animal (por ejemplo, un mamífero), incluyendo, entre otros, humanos, primates no humanos, roedores y similares, a los que pueden administrarse las composiciones mezcladas homogéneamente y métodos de la presente invención. Típicamente, en la presente y en referencia a un sujeto humano, los términos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente.

La capacidad de las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente de mejorar sinérgicamente la expresión de polinucleótidos encapsulados como la producción de un polipéptido o proteína proporciona medios novedosos y más eficientes para efectuar la producción in vivo de polipéptidos y proteínas para el tratamiento de una multitud de enfermedades o afecciones patológicas. Tales composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente son particularmente adecuadas para el tratamiento de enfermedades o afecciones patológicas asociadas con la expresión aberrante de una proteína o enzima. Por ejemplo, la administración con éxito de polinucleótidos como el ARNm a órganos diana como el hígado y, en particular, a los hepatocitos, puede usarse para el tratamiento y la corrección de errores congénitos del metabolismo que estén localizados en el hígado. Por consiguiente, las composiciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente y los métodos relacionados descritos en la presente pueden emplearse para tratar una amplia variedad de enfermedades y afecciones patológicas, en particular aquellas enfermedades que se deben a deficiencias de proteínas o enzimas. Los polinucleótidos encapsulados por las nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente pueden codificar un producto funcional (por ejemplo, una proteína, enzima, polipéptido, péptido y/o ARN funcional), y pueden codificar un producto del que se desee la producción in vivo. Alternativamente, como se define en las reivindicaciones, los polinucleótidos encapsulados por las nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente pueden comprender además un oligonucleótido antisentido y después de la administración de dicho oligonucleótido antisentido a una o más células diana, modularse, reducirse sinérgicamente o eliminarse la expresión de genes o ácidos nucleicos diana.

Los trastornos metabólicos del ciclo de la urea representan ejemplos de tales deficiencias de proteínas y enzimas que pueden tratarse usando los métodos divulgados y las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente proporcionadas en la presente. Tales trastornos metabólicos del ciclo de la urea incluyen deficiencia de ornitina transcarbamilasa (OTC), deficiencia de arginosuccinato sintetasa (ASD) y deficiencia de argininosuccinato liasa (ALD). Por lo tanto, en algunas realizaciones, los polinucleótidos encapsulados por las nanopartículas lipídicas proporcionadas en la presente codifican una enzima implicada en el ciclo de la urea incluyendo, por ejemplo, ornitina transcarbamilasa (OTC), carbamil fosfato sintetasa (CPS), argininosuccinato sintetasa 1 (ASS1) argininosuccinato liasa (ASL) y arginasa (ARG).

Se han descrito cinco trastornos metabólicos que son resultado de defectos en la biosíntesis de las enzimas implicadas en el ciclo de la urea, e incluyen la deficiencia de ornitina transcarbamilasa (OTC), la deficiencia de la carbamil fosfato sintetasa (CPS), la deficiencia de la argininosuccinato sintetasa 1 (ASS1) (citrulinemia), la deficiencia de la argininosuccinato liasa (ASL) y la deficiencia de arginasa (ARG). De estos cinco trastornos metabólicos, la deficiencia de OTC es el más frecuente, ya que se estima que se produce en uno de cada 80.000 nacimientos.

La OTC es una enzima mitocondrial homotrimérica que se expresa casi exclusivamente en el hígado y que codifica una proteína OTC precursora que se escinde en dos pasos tras su incorporación en la matriz mitocondrial. (Horwich AL., et al. Cell 1986; 44: 451-459). La deficiencia de OTC es un trastorno genético que da como resultado una forma mutada y biológicamente inactiva de la enzima ornitina transcarbamilasa. La deficiencia de OTC se hace evidente a menudo en los primeros días de vida, típicamente después de la ingestión de proteínas. En la forma clásica grave de deficiencia de OTC, en los primeros días de vida los pacientes presentan letargo, convulsiones, coma e hiperamonemia grave, lo que lleva rápidamente a un desenlace deteriorado y fatal en ausencia de una intervención médica adecuada. (Monish S., et al., Genetics for Pediatricians; Remedica, Cold Spring Harbor Laboratory (2005)). Si se trata inadecuadamente o si no se trata, las complicaciones de la deficiencia de OTC pueden incluir retraso en el desarrollo y retraso mental. Los sujetos con deficiencia de OTC también pueden presentar daño hepático progresivo, lesiones cutáneas y cabello quebradizo. En algunos individuos afectados, los signos y síntomas de la deficiencia de OTC pueden ser menos graves y no aparecer hasta una edad más avanzada.

El gen deOTC,que está localizado en el brazo corto del cromosoma X dentro de la banda Xp21.1, abarca más de 85 kb y está compuesto por 10 exones que codifican una proteína de 1062 aminoácidos. (Lindgren V., et al. Science 1984; 226: 698-7700; Horwich, AL., et al. Science 224: 1068-1074, 1984; Horwich, AL. et al., Cell 44: 451 459, 1986; Hata, A, et al., J. Biochem. 100: 717-725, 1986). La enzima OTC cataliza la conversión de ornitina y carbamoil fosfato en citrulina. Como laOTCse encuentra en el cromosoma X, las hembras son principalmente portadoras, mientras que los machos con mutaciones no conservadoras raramente sobreviven más allá de las 72 horas de vida.

En sujetos sanos, laOTCse expresa casi exclusivamente en las mitocondrias hepatocelulares. Aunque no se expresa en el cerebro de sujetos sanos, la deficiencia de OTC puede llevar a trastornos neurológicos. Por ejemplo, uno de los síntomas habituales de la deficiencia de OTC, cuya presentación es heterogénea, es el coma hiperamonémico (Gordon, N., Eur J Paediatr Neurol 2003;7: 115-121.).

La deficiencia de OTC es muy heterogénea, con más de 200 mutaciones únicas notificadas y grandes deleciones que representan aproximadamente el 10-15% de todas las mutaciones, mientras que el resto generalmente comprende mutaciones puntuales de sentido erróneo con un menor número de mutaciones sin sentido, de sitio de corte y empalme y deleciones pequeñas. (Monish A, et al.) El fenotipo de la deficiencia de OTC es extremadamente heterogéneo, y puede variar desde un coma hiperamonémico neonatal agudo hasta adultos hemicigotos asintomáticos. (Gordon N. Eur J Paediatr Neurol 2003; 7: 115-121). Las mutaciones que dan como resultado una enfermedad neonatal grave y potencialmente mortal se agrupan en dominios estructurales y funcionales importantes en el interior de la proteína en sitios de actividad enzimática o en la superficie intercadena, mientras que las mutaciones asociadas con la enfermedad de aparición tardía se localizan en la superficie de la proteína (Monish A, et al.) Los pacientes con formas más leves o parciales de deficiencia de OTC pueden tener un inicio de la enfermedad más tarde en la vida, que puede presentarse como vómitos recurrentes, cambios neuroconductuales o convulsiones asociadas con hiperamonemia.

Las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente de la presente invención y los métodos relacionados contemplados en la presente son ampliamente aplicables a la administración de ARNm, para tratar una serie de trastornos. En particular, las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente de la presente invención son adecuadas para el tratamiento de enfermedades o trastornos relacionados con la deficiencia de proteínas y/o enzimas. En ciertas realizaciones, los polinucleótidos encapsulados en nanopartículas lipídicas codifican proteínas o enzimas funcionales que son excretadas o secretadas por una o más células diana al fluido extracelular circundante (por ejemplo, ARNm que codifica hormonas y neurotransmisores). Alternativamente, en otra realización, los polinucleótidos para su uso con la presente invención codifican proteínas o enzimas funcionales que permanecen en el citosol de una o más células diana (por ejemplo, ARNm que codifica enzimas asociadas con trastornos metabólicos del ciclo de la urea o una enzima asociada con un trastorno de almacenamiento lisosomal). Otros trastornos para los que son útiles las composiciones farmacéuticas de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente de la presente invención incluyen, entre otros, trastornos como la atrofia muscular espinal (SMA) relacionada con SMN1; la esclerosis lateral amiotrófica (ALS); la galactosemia relacionada con GALT; la fibrosis quística (CF); los trastornos relacionados con SLC3A1, incluyendo la cistinuria; los trastornos relacionados con COL4A5, incluyendo el síndrome de Alport; las deficiencias de galactocerebrosidasa; la adrenoleucodistrofia y la adrenomieloneuropatía ligadas al cromosoma X; la ataxia de Friedreich; la enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher; la esclerosis tuberosa relacionada con TSC1 y TSC2; el síndrome de Sanfilippo B (MPS IIIB); la cistinosis relacionada con CTNS; los trastornos relacionados con FMR1, que incluyen el síndrome del cromosoma X frágil, el síndrome de temblor/taxia asociado al cromosoma X frágil y el síndrome de insuficiencia ovárica prematura del cromosoma X frágil; el síndrome de Prader-Willi; la enfermedad de Fabry; la telangiectasia hemorrágica hereditaria (AT); la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C1; las enfermedades relacionadas con la lipofuscinosis neuronal ceroidea, incluyendo la lipofuscinosis neuronal ceroideajuvenil (JNCL), la enfermedad de Battenjuvenil, la enfermedad de Santavuori-Haltia, la enfermedad de Jansky-Bielschowsky y las deficiencias de PTT-1 y TPP1; ataxia infantil relacionada con EIF2B1, EIF2B2, EIF2B3, EIF2B4 y EIF2B5 con hipomielinización del sistema nervioso central/desaparición de materia blanca; ataxia episódica de tipo 2 relacionada con CACNA1A y CACNB4; trastornos relacionados con MECP2, incluyendo el síndrome de Rett clásico, la encefalopatía neonatal grave relacionada con MECP2 y el síndrome PPM-X; el síndrome de Rett atípico relacionado con CDKL5; la enfermedad de Kennedy (SBMA); la arteriopatía cerebral autosómica dominante con infartos subcorticales y leucoencefalopatía (CADASIL) relacionada con Notch-3; los trastornos convulsivos relacionados con SCN1A y SCN1B; los trastornos relacionados con la polimerasa G, que incluyen el síndrome de Alpers-Huttenlocher, la neuropatía atáxica sensorial relacionada con POLG, la disartria y la oftalmoparesia, y la oftalmoplejía externa progresiva autosómica dominante y recesiva con deleciones de ADN mitocondrial; la hipoplasia suprarrenal ligada al cromosoma X; la agammaglobulinemia ligada al cromosoma X; y la enfermedad de Wilson. En ciertas realizaciones, el ARNm para su uso con la presente invención puede codificar proteínas o enzimas funcionales. Por ejemplo, las composiciones de la presente invención pueden incluir ARNm que codifica agalsidasa alfa, eritropoyetina, a1-antitripsina, carboxipeptidasa N, alfa-L-iduronidasa, iduronato-2-sulfatasa, N-acetilglucosamina-1-fosfato transferasa, N-acetilglucosaminidasa, alfa glucosaminida acetiltransferasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa, beta-glucosidasa, galactosa-6-sulfato sulfatasa, beta galactosidasa, beta-glucuronidasa, glucocerebrosidasa, heparán sulfamidasa, hialuronidasa y galactocerebrosidasa u hormona de crecimiento humano.

Alternativamente, los polinucleótidos encapsulados pueden codificar anticuerpos de longitud completa o anticuerpos más pequeños (por ejemplo, cadenas pesadas y cadenas ligeras) para conferir inmunidad a un sujeto. Ciertas realizaciones de la presente invención se refieren a composiciones farmacéuticas de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente que pueden usarse en métodos para conferir inmunidad a un sujeto (por ejemplo, mediante la traducción de ácidos nucleicos de ARNm que codifican anticuerpos funcionales), las invenciones divulgadas en la presente y contempladas por la presente son ampliamente aplicables. En una realización alternativa, las composiciones mezcladas homogéneamente de la presente invención codifican anticuerpos que pueden usarse para efectuar de manera transitoria o crónica una respuesta funcional en sujetos. Por ejemplo, el ARNm encapsulado puede codificar un anticuerpo monoclonal o policlonal funcional, que tras la traducción (y en su caso, la excreción sistémica de las células diana) puede ser útil para dirigir y/o inactivar una diana biológica (por ejemplo, una citoquina estimuladora como el factor de necrosis tumoral). De manera similar, el ARNm encapsulado puede codificar, por ejemplo, anticuerpos funcionales contra el factor nefrítico útiles para el tratamiento de la glomerulonefritis membranoproliferativa de tipo II o el síndrome urémico hemolítico agudo, o alternativamente puede codificar anticuerpos contra el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) útiles para el tratamiento de enfermedades mediadas por VEGF, como el cáncer.

Las composiciones farmacéuticas mezcladas homogéneamente pueden administrarse a un sujeto. En algunas realizaciones, las composiciones mezcladas homogéneamente o las nanopartículas lipídicas constituyentes se formulan en combinación con uno o más polinucleótidos adicionales, portadores, ligandos de direccionamiento o reactivos estabilizadores, o en composiciones farmacológicas mezcladas homogéneamente en donde tales composiciones comprenden otros excipientes adecuados. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, las nanopartículas lipídicas que comprenden las composiciones mezcladas homogéneamente pueden prepararse para administrar ARNm que codifica dos o más proteínas o enzimas distintas. Alternativamente, las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente de la presente invención pueden prepararse para administrar un único polipéptido en dos o más nanopartículas lipídicas, cada una teniendo composiciones lipídicas distintas y que posteriormente se mezclan en una única formulación o forma de dosificación y se administran a un sujeto, como se define en las reivindicaciones. Las técnicas de formulación y administración de fármacos pueden encontrarse en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pa., última edición.

Usando las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente de la presente invención pueden administrarse a las células diana una amplia variedad de moléculas que pueden ejercer efectos farmacéuticos o terapéuticos. Las moléculas pueden ser orgánicas o inorgánicas. Las moléculas orgánicas pueden ser péptidos, proteínas, hidratos de carbono, lípidos, esteroles, ácidos nucleicos (incluyendo ácidos nucleicos peptídicos), o cualquier combinación de los mismos. Una formulación para su administración en células diana puede comprender más de un tipo de molécula, por ejemplo, dos secuencias diferentes de polinucleótidos que codifiquen una proteína, una enzima y/o un esteroide.

Las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente de la presente invención pueden administrarse y dosificarse de acuerdo con la práctica médica actual, teniendo en cuenta el estado clínico del sujeto, el lugar y el método de administración, la programación de la administración, la edad, el sexo, el peso corporal del sujeto y otros factores relevantes para los practicantes clínicos con conocimientos ordinarios en la técnica. La "cantidad eficaz", a los efectos de la presente, puede determinarse mediante consideraciones pertinentes conocidas por los expertos en investigación clínica técnica experimental, farmacológica, clínica y médica, reconociendo que las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente son capaces de mejorar sinérgicamente la expresión de los polinucleótidos encapsulados y la producción de polipéptidos o proteínas codificados por los mismos o de modular la expresión de un ácido nucleico o polinucleótido diana, y que en algunos casos puede estar justificada la reducción de la dosificación de dichos polinucleótidos encapsulados con respecto a la formulación tradicional no mezclada. En algunas realizaciones, la cantidad administrada es eficaz para lograr por lo menos cierta estabilización, mejora o eliminación de los síntomas y otros indicadores seleccionados como medidas adecuadas de progreso, regresión o mejora de la enfermedad por los expertos en la técnica. Por ejemplo, una cantidad y un régimen de dosificación adecuados son aquellos que provocan por lo menos una expresión transitoria de uno o más polinucleótidos en las células diana.

Las mejoras sinérgicas en la expresión de polinucleótidos encapsulados que caracterizan las formulaciones de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente de la presente invención permiten que se alcancen concentraciones terapéuticamente eficaces de polipéptidos producidos tras la expresión de tales polinucleótidos encapsulados (por ejemplo, una proteína o enzima terapéutica) en los tejidos diana (o suero si el producto es excretado por la célula diana) usando una dosis significativamente menor de polinucleótido que la que se había previsto con anterioridad. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, la cantidad eficaz de un polinucleótido necesaria para lograr un efecto terapéutico deseado puede reducirse encapsulando dicho polinucleótido en una o más nanopartículas lipídicas y mezclando homogéneamente por lo menos dos nanopartículas lipídicas, como se define en las reivindicaciones. También se contemplan métodos para reducir la cantidad de un polinucleótido necesaria para provocar un efecto terapéutico en un sujeto. Tales métodos comprenden generalmente un paso de administración de una composición farmacéutica al sujeto, en donde la composición farmacéutica comprende una primera nanopartícula lipídica mezclada homogéneamente con una segunda nanopartícula lipídica, y en donde la primera nanopartícula lipídica comprende el polinucleótido, seguido de la transfección de una o más células diana del sujeto con tales polinucleótidos, de tal manera que se reduce la cantidad del polinucleótido necesaria para producir un efecto terapéutico (por ejemplo, se reduce con respecto a la cantidad de polinucleótido necesaria para producir un efecto terapéutico usando una composición no mezclada homogéneamente u otras técnicas estándar). En ciertas realizaciones, la cantidad de polinucleótido necesaria para producir un efecto terapéutico se reduce en por lo menos un 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, 95% o 99%. En ciertas realizaciones, la cantidad de polinucleótido necesaria para producir un efecto terapéutico se reduce en por lo menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, diez, doce, quince, veinte o veinticinco veces o más.

Las vías de administración adecuadas de las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente incluyen, por ejemplo, administración oral, rectal, vaginal, transmucosal, sublingual, subdural, nasal o intestinal; administración parenteral, incluyendo inyecciones intramusculares, subcutáneas, intramedulares, así como inyecciones o infusiones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasales, oftálmicas o intraoculares. En ciertas realizaciones, la administración de la composición de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente a un sujeto facilita el contacto de las nanopartículas lipídicas constituyentes con una o más células, tejidos u órganos diana.

Alternativamente, las composiciones de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente de la presente invención pueden administrarse de manera local en lugar de sistémica, por ejemplo, mediante inyección o infusión de la composición farmacéutica mezclada homogéneamente directamente en un tejido diana, preferiblemente en una formulación de depósito o de liberación sostenida, de tal manera que se facilite aún más el contacto de las células diana con las nanopartículas lipídicas constituyentes. La administración local puede realizarse de varias maneras, dependiendo del tejido al que se dirige. Por ejemplo, pueden inhalarse aerosoles que contienen composiciones de la presente invención (para administración nasal, traqueal o bronquial); las composiciones mezcladas homogéneamente de la presente invención pueden inyectarse en el lugar de la lesión, manifestación de la enfermedad o dolor, por ejemplo; las composiciones mezcladas homogéneamente pueden proporcionarse en comprimidos para chupar para aplicación oral, traqueal o esofágica; pueden suministrarse en forma de líquido, comprimido o cápsula para administración en el estómago o los intestinos, pueden suministrarse en forma de supositorio para aplicación rectal o vaginal; o incluso pueden administrarse en el ojo mediante cremas, gotas o incluso inyección. Las formulaciones que contienen composiciones mezcladas homogéneamente de la presente invención formando complejos con moléculas o ligandos terapéuticos pueden incluso administrarse quirúrgicamente, por ejemplo en asociación con un polímero u otra estructura o sustancia que pueda permitir que las composiciones se difundan desde el lugar de implantación a las células circundantes. Alternativamente, tales composiciones mezcladas homogéneamente pueden aplicarse quirúrgicamente sin el uso de polímeros o soportes.

En ciertas realizaciones, las composiciones mezcladas homogéneamente de la presente invención están formuladas de tal manera que son adecuadas para la liberación prolongada de los polinucleótidos o ácidos nucleicos encapsulados en las nanopartículas lipídicas constituyentes. Tales composiciones mezcladas homogéneamente de liberación prolongada pueden administrarse convenientemente a un sujeto a intervalos de dosificación prolongados. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, las composiciones de la presente invención se administran a un sujeto dos veces al día, diariamente o cada dos días. En ciertas realizaciones, las composiciones de la presente invención se administran a un sujeto dos veces por semana, una vez por semana, cada diez días, cada dos semanas, cada tres semanas, o más preferiblemente cada cuatro semanas, una vez al mes, cada seis semanas, cada ocho semanas, cada dos meses, cada tres meses, cada cuatro meses, cada seis meses, cada ocho meses, cada nueve meses o anualmente. También se contemplan composiciones y nanopartículas lipídicas formuladas para administración de depósito (por ejemplo, intramuscular, subcutánea, intravítrea) para administrar o liberar un polinucleótido (por ejemplo, ARNm) durante periodos de tiempo prolongados. Preferiblemente, los medios de liberación prolongada empleados se combinan con modificaciones (por ejemplo, modificaciones químicas) introducidas en los polinucleótidos para mejorar la estabilidad.

También se contemplan en la presente composiciones farmacéuticas liofilizadas que comprenden uno o más de los compuestos divulgados en la presente y métodos relacionados para el uso de tales composiciones liofilizadas como se divulga, por ejemplo, en la Solicitud Provisional de Estados Unidos N° PCT/US2012/041663, presentada el 8 de junio de 2011.

Aunque se han descrito con especificidad ciertas composiciones de la presente invención de acuerdo con ciertas realizaciones, los siguientes ejemplos sirven únicamente para ilustrar las composiciones de la invención y no se pretende que limiten las mismas.

Debe entenderse que los artículos "un" y "uno", como se usan en la presente en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, a menos que se indique claramente lo contrario, incluyen los referentes plurales. Cuando los elementos se presentan como listas (por ejemplo, en formato de grupo de Markush o similar) debe entenderse que también se divulga cada subgrupo de los elementos, y que puede eliminarse del grupo cualquier elemento o elementos. Debe entenderse que, en general, cuando se hace referencia a que la invención, o a aspectos de la invención, comprenden elementos, características, etc. particulares, ciertas realizaciones de la invención o aspectos de la invención consisten, o consisten esencialmente, en tales elementos, características, etc. En aras de la simplicidad, aquellas realizaciones no se han expuesto específicamente en cada caso con tantas palabras en la presente.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se refieren en general a composiciones y formulaciones farmacéuticas de nanopartículas lipídicas, y en particular a composiciones y formulaciones farmacéuticas que comprenden "mezclas homogéneas" de dichas nanopartículas lipídicas, así como a métodos altamente eficaces de uso de las composiciones y formulaciones farmacéuticas anteriores para administrar constructos de polinucleótidos a una o más células, tejidos y órganos diana.

Ejemplo 1. Formulaciones y material de ARN mensajero

Materiales lipídicos

Las formulaciones descritas en la presente incluyen una mezcla lipídica de múltiples componentes de proporciones variables que emplea uno o más lípidos catiónicos, lípidos auxiliares y lípidos PEGilados diseñados para encapsular diversos materiales a base de ácidos nucleicos. Los lípidos catiónicos pueden incluir, entre otros, DOTAP (1,2-dioleil-3-trimetilamonio propano), DODAP (1,2-dioleil-3-dimetilamonio propano), DOTMA(1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano), DLinDMA (Heyes, J.Palmer, L.; Bremner, K.; MacLachlan, I. "Cationic lipid saturation influences intracellular delivery of encapsulated nucleic acids" J Contr. Rel. 2005, 107, 276- 287), DLin-KC2-DMA (Semple, S.C. et al. "Rational Design of Cationic Lipids for siRNA Delivery" Nature Biotech. 2010, 28, 172-176), C12-200 (Love, K.T. et al. "Lipid-like materials for low-dose in vivo gene silencing" PNAS 2010, 107, 1864-1869), HGT4003, ICE, a base de dialquilamino, a base de imidazol o a base de guanidinio. Otros componentes de nanopartículas pueden incluir, entre otros, DSPC (1,2-destearoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DPPC (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DOPE (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DMPE (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPG (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol)) o colesterol. Los lípidos PEGilados pueden incluir, entre otros, una cadena de polietilenglicol de hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lípido con una cadena o cadenas de alquilo de C6-C20 de longitud.

Material de ARN mensajero

Se sintetizaron ARN mensajero de luciferasa de luciérnaga optimizado por codones (ARNm CO-FFL), galactosa-1-fosfato uridil transferasa (GALT) y eritropoyetina humana (EPO) mediante transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN plasmídico que codificaba el gen, a lo que le siguió la adición de una estructura de caperuza 5' (Cap1) (Fechter, P.; Brownlee, G.G. "Recognition of mRNAcap structures by viral and cellular proteins" J Gen. Virology 2005, 86, 1239-1249) y una cola 3' de poli(A) de aproximadamente 200 nucleótidos de longitud, según se determinó mediante electroforesis en gel. Las regiones no traducidas 5' y 3' presentes en cada producto de ARNm se representan como X e Y, respectivamente, y se definen como se indica.

ARNm de Luciferasa CO-FF:

XAUGGAAGAUGCCAAAAACAUUAAGAAGGGCCCAGCGCCAUUCUACCCACUCGAAGA CGGGACCGCCGGCGAGCAGCUGCACAAAGCCAUGAAGCGCUACGCCCUGGUGCCCGG CACCAUCGCCUUUACCGACGCACAUAUCGAGGUGGACAUUACCUACGCCGAGUACUU CGAGAUGAGCGUUCGGCUGGCAGAAGCUAUGAAGCGCUAUGGGCUGAAUACAAACCA UCGGAUCGUGGUGUGCAGCGAGAAUAGCUUGCAGUUCUUCAUGCCCGUGUUGGGUGC CCUGUUCAUCGGUGUGGCUGUGGCCCCAGCUAACGACAUCUACAACGAGCGCGAGCU GCUGAACAGCAUGGGCAUCAGCCAGCCCACCGUCGUAUUCGUGAGCAAGAAAGGGCU GCAAAAGAUCCUCAACGUGCAAAAGAAGCUACCGAUCAUACAAAAGAUCAUCAUCAU GGAUAGCAAGACCGACUACCAGGGCUUCCAAAGCAUGUACACCUUCGUGACUUCCCA UUUGCCACCCGGCUUCAACGAGUACGACUUCGUGCCCGAGAGCUUCGACCGGGACAA AACCAUCGCCCUGAUCAUGAACAGUAGUGGCAGUACCGGAUUGCCCAAGGGCGUAGC CCUACCGCACCGCACCGCUUGUGUCCGAUUCAGUCAUGCCCGCGACCCCAUCUUCGG CAACCAGAUCAUCCCCGACACCGCUAUCCUCAGCGUGGUGCCAUUUCACCACGGCUU CGGCAUGUUCACCACGCUGGGCUACUUGAUCUGCGGCUUUCGGGUCGUGCUCAUGUA CCGCUUCGAGGAGGAGCUAUUCUUGCGCAGCUUGCAAGACUAUAAGAUUCAAUCUGC CCUGCUGGUGCCCACACUAUUUAGCUUCUUCGCUAAGAGCACUCUCAUCGACAAGUA CGACCUAAGCAACUUGCACGAGAUCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCUCAGCAAGGAGGU AGGUGAGGCCGUGGCCAAACGCUUCCACCUACCAGGCAUCCGCCAGGGCUACGGCCU GACAGAAACAACCAGCGCCAUUCUGAUCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCUGGCGC AGUAGGCAAGGUGGUGCCCUUCUUCGAGGCUAAGGUGGUGGACUUGGACACCGGUAA GACACUGGGUGUGAACCAGCGCGGCGAGCUGUGCGUCCGUGGCCCCAUGAUCAUGAG CGGCUACGUUAACAACCCCGAGGCUACAAACGCUCUCAUCGACAAGGACGGCUGGCU GCACAGCGGCGACAUCGCCUACUGGGACGAGGACGAGCACUUCUUCAUCGUGGACCG GCUGAAGAGCCUGAUCAAAUACAAGGGCUACCAGGUAGCCCCAGCCGAACUGGAGAG CAUCCUGCUGCAACACCCCAACAUCUUCGACGCCGGGGUCGCCGGCCUGCCCGACGA CGAUGCCGGCGAGCUGCCCGCCGCAGUCGUCGUGCUGGAACACGGUAAAACCAUGAC CGAGAAGGAGAUCGUGGACUAUGUGGCCAGCCAGGUUACAACCGCCAAGAAGCUGCG CGGUGGUGUUGUGUUCGUGGACGAGGUGCCUAAAGGACUGACCGGCAAGUUGGACGC CCGCAAGAUCCGCGAGAUUCUCAUUAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGAUCGCCGUGUA AY(SEQ ID NO: 1)

ARNm de GALT humana:

XAUGUCGCGCAGUGGAACCGAUCCUCAGCAACGCCAGCAGGCGUCAGAGGCGGACGC CGCAGCAGCAACCUUCCGGGCAAACGACCAUCAGCAUAUCCGCUACAACCCGCUGCA GGAUGAGUGGGUGCUGGUGUCAGCUCACCGCAUGAAGCGGCCCUGGCAGGGUCAAGU GGAGCCCCAGCUUCUGAAGACAGUGCCCCGCCAUGACCCUCUCAACCCUCUGUGUCC UGGGGCCAUCCGAGCCAACGGAGAGGUGAAUCCCCAGUACGAUAGCACCUUCCUGUU UGACAACGACUUCCCAGCUCUGCAGCCUGAUGCCCCCAGUCCAGGACCCAGUGAUCA UCCCCUUUUCCAAGCAAAGUCUGCUCGAGGAGUCUGUAAGGUCAUGUGCUUCCACCC CUGGUCGGAUGUAACGCUGCCACUCAUGUCGGUCCCUGAGAUCCGGGCUGUUGUUGA UGCAUGGGCCUCAGUCACAGAGGAGCUGGGUGCCCAGUACCCUUGGGUGCAGAUCUU UGAAAACAAAGGUGCCAUGAUGGGCUGUUCUAACCCCCACCCCCACUGCCAGGUAUG GGCCAGCAGUUUCCUGCCAGAUAUUGCCCAGCGUGAGGAGCGAUCUCAGCAGGCCUA UAAGAGUCAGCAUGGAGAGCCCCUGCUAAUGGAGUACAGCCGCCAGGAGCUACUCAG GAAGGAACGUCUGGUCCUAACCAGUGAGCACUGGUUAGUACUGGUCCCCUUCUGGGC AACAUGGCCCUACCAGACACUGCUGCUGCCCCGUCGGCAUGUGCGGCGGCUACCUGA GCUGACCCCUGCUGAGCGUGAUGAUCUAGCCUCCAUCAUGAAGAAGCUCUUGACCAA GUAUGACAACCUCUUUGAGACGUCCUUUCCCUACUCCAUGGGCUGGCAUGGGGCUCC CACAGGAUCAGAGGCUGGGGCCAACUGGAACCAUUGGCAGCUGCACGCUCAUUACUA CCCUCCGCUCCUGCGCUCUGCCACUGUCCGGAAAUUCAUGGUUGGCUACGAAAUGCU UGCUCAGGCUCAGAGGGACCUCACCCCUGAGCAGGCUGCAGAGAGACUAAGGGCACU UCCUGAGGUUCAUUACCACCUGGGGCAGAAGGACAGGGAGACAGCAACCAUCGCCUG AY(SEQ ID NO: 2)

ARNm de EPO humana:

XAUGGGGGUGCACGAAUGUCCUGCCUGGCUGUGGCUUCUCCUGUCCCUGCUGUCGCU CCCUCUGGGCCUCCCAGUCCUGGGCGCCCCACCACGCCUCAUCUGUGACAGCCGAGU CCUGGAGAGGUACCUCUUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAAUAUCACGACGGGCUGUGC UGAACACUGCAGCUUGAAUGAGAAUAUCACUGUCCCAGACACCAAAGUUAAUUUCUA UGCCUGGAAGAGGAUGGAGGUCGGGCAGCAGGCCGUAGAAGUCUGGCAGGGCCUGGC CCUGCUGUCGGAAGCUGUCCUGCGGGGCCAGGCCCUGUUGGUCAACUCUUCCCAGCC GUGGGAGCCCCUGCAGCUGCAUGUGGAUAAAGCCGUCAGUGGCCUUCGCAGCCUCAC CACUCUGCUUCGGGCUCUGGGAGCCCAGAAGGAAGCCAUCUCCCCUCCAGAUGCGGC CUCAGCUGCUCCACUCCGAACAAUCACUGCUGACACUUUCCGCAAACUCUUCCGAGU CUACUCCAAUUUCCUCCGGGGAAAGCUGAAGCUGUACACAGGGGAGGCCUGCAGGAC AGGGGACAGAUGAY(SEQ ID NO: 3)

Secuencias UTR 5 y 3'

X = GGGAUCCUACC (SEQ ID NO: 4)

o

GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGG GACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCC AAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG(SEQ ID NO: 5)

Y = UUUGAAUU (SEQ ID NO: 6)

o

CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCAC UCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUC(SEQ ID N O :7)

Protocolo de formulación ejemplar

Las nanopartículas lipídicas (LNP) se formaron mediante métodos estándar de inyección de etanol (Ponsa, M.; Foradada, M.; Estelrich, J. "Liposomes obtained bythe ethanol injection method" Int. J Pharm. 1993, 95, 51-56).

Las soluciones madre etanólicas de los lípidos se prepararon con antelación a 50 mg/ml y se almacenaron a -20°C. El ARNm de FFL se almacenó en agua a una concentración final de 1 mg/ml a -80°C hasta el momento de su uso. Todas las concentraciones de ARNm se determinaron mediante el ensayo Ribogreen (Invitrogen). La encapsulación del ARNm se calculó realizando el ensayo Ribogreen con y sin la presencia de un 0,1% de Triton-X100. Los tamaños de las partículas (dispersión dinámica de la luz [DLS]) y los potenciales zeta se determinaron usando un instrumento Malvern Zetasizer en soluciones1x de PBS y 1mM de KCl, respectivamente.

Ejemplo de formulación 1:

Se mezclaron alícuotas de soluciones etanólicas de 50 mg/ml del lípido catiónico a base de imidazol ICE, DOPE y DMG-PEG2K y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 ml. Por separado, se preparó una solución tamponada acuosa (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm de FFL a partir de una reserva de 1 mg/ml. La solución lipídica se inyectó rápidamente en la solución acuosa de ARNm y se agitó para proporcionar una suspensión final en etanol al 20%. La suspensión de nanopartículas resultante se filtró, se diafiltró con 1x de PBS (pH 7,4), se concentró y se almacenó a 2-8°C. Concentración final = 1,73 mg/ml de ARNm de CO-FF (encapsulado). Zmed = 68,0 nm (Dv(50) = 41,8 nm; Dv(90) = 78,0 nm). Potencial zeta = 25,7 mV.

Ejemplo de formulación 2:

Se mezclaron alícuotas de soluciones etanólicas de 50 mg/ml de DLinKC2DMA, DOPE, colesterol y DMG-PEG2K y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 ml. Por separado, se preparó una solución tamponada acuosa (acetato 10 mM, pH 6,5) de ARNm de FFL a partir de una reserva de 1 mg/ml. La solución lipídica se inyectó rápidamente en la solución acuosa de ARNm y se agitó para proporcionar una suspensión final en etanol al 20%. La suspensión de nanopartículas resultante se filtró, se diafiltró con 1x de PBS (pH 7,4), se concentró y se almacenó a 2-8°C. Concentración final = 3,47 mg/ml de ARNm de CO-FF (encapsulado). Zmed = 74,3 nm (Dv(50) = 58,6 nm; Dv(90) = 95.2 nm).

Todas las formulaciones se elaboraron de acuerdo con el procedimiento descrito en elEjemplo de Formulación 1,con la excepción de las formulaciones de DLinKC2DMA, que se formularon de acuerdo con elEjemplo de Formulación 2.En la Tabla 1 se presentan varias formulaciones ejemplares de nanopartículas lipídicas. Todas las proporciones de lípidos se calculan como porcentaje molar.

Tabla 1.Formulaciones ejemplares de nanopartículas lipídicas.

(continuación)

Formulaciones "mezcladas homogéneamente":

Una parte de una formulación lipídica catiónica se combinó con una alícuota separada de una formulación lipídica catiónica diferente en una proporción deseada, sobre la base de las concentraciones de ARNm encapsulado y se dosificó en consecuencia.

Formulaciones "mezcladas":

Una única formulación sintetizada a partir de una solución orgánica previamente combinada de lípidos auxiliares, lípidos PEGilados y múltiples lípidos catiónicos/ionizables no idénticos.

Como se usa en la presente, el término "mezcla homogénea" se refiere a una combinación de dos o más formulaciones separadas, no idénticas. Típicamente, las dos o más formulaciones separadas, no idénticas se combinan o mezclan homogéneamente en una composición, como una suspensión, como se representa, por ejemplo, en la FIG. 1. Como se usa en la presente, las formulaciones no idénticas se refieren a formulaciones que contienen por lo menos un componente lipídico distinto. En algunas realizaciones, las formulaciones no idénticas adecuadas para mezclar homogéneamente contienen por lo menos un componente lipídico catiónico distinto. El término "mezclar homogéneamente", como se usa en la presente, se distingue de los términos "mezclar" o "mezcla", que se usan en la presente para definir una única formulación que contiene múltiples lípidos catiónicos/ionizables no idénticos, múltiples lípidos auxiliares no idénticos y/o múltiples lípidos PEGilados no idénticos. En algunas realizaciones, una formulación de "mezcla" contiene por lo menos dos o más lípidos catiónicos/ionizables no idénticos. Típicamente, una formulación de "mezcla" contiene una única población homogénea de nanopartículas lipídicas.

Ejemplo 2. Protocolo de inyección y ensayos para la expresión y la biodistribución in vivo.

Protocolo de inyección

Todos los estudios se realizaron usando ratones CD-1 macho o hembra de aproximadamente 6-8 semanas de edad al inicio de cada experimento. Las muestras se introdujeron mediante una única inyección en bolo en la vena de la cola o la administración intracerebroventricular (ICV) de una dosis total equivalente de ARNm de FFL encapsulado hasta una dosis de 230 microgramos. Cuatro horas después de la inyección, se sacrificó a los ratones y se perfundieron con solución salina.

Aislamiento de tejidos de órganos para análisis

Se recogieron el hígado, el bazo y, en su caso, el cerebro de cada ratón, se dividieron en dos partes y se almacenaron en: (1) -formalina tamponada neutra al 10% o; (2) - se congelaron al instante y se almacenaron a -80°C para el análisis de bioluminiscencia.

Ensayo de bioluminiscencia

Homogeneización de tejidos

El ensayo de bioluminiscencia se realizó usando un sistema de ensayo de luciferasa de Promega (Promega). La preparación del tejido se realizó de la siguiente manera: brevemente, se descongelaron porciones de la muestra de tejido deseada (congelada al instante), se lavaron con agua DI y se colocaron en un tubo de homogeneización de perlas de cerámica. El tejido se trató con tampón de lisis y se homogeneizó. Después de someterlo a cinco ciclos de congelación/descongelación seguidos de centrifugación a 4°C, el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo de microcentrífuga y se almacenó a - 80°C.

Ensayo de luciferasa

El reactivo de ensayo de luciferasa se preparó añadiendo 10 ml de tampón de ensayo de luciferasa al sustrato de ensayo de luciferasa y se mezcló mediante vórtice. Se cargaron 20 microlitros de cada homogeneizado en una placa de 96 pocillos seguido, junto con 20 microlitros de control de placa. Por separado, se cargaron 120 microlitros de reactivo de ensayo de luciferasa en cada pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos y se analizaron usando un instrumento Biotek Synergy 2 para medir la luminiscencia (las mediciones se registraron en unidades luminosas relativas (RLU)).

Ensayo de EPO

La proteína EPO humana se detectó mediante el sistema ELISA hEPO (R&D Systems). Se realizaron análisis de transferencia Western usando un anticuerpo anti-hEPO MAB2871 (R&D Systems) y proteína EPO humana ultrapura (R&D Systems) como control.

Ejemplo 3. Administración de ARNm de CO-FFL mediante nanopartículas derivadas de lípidos

Para el estudio, se les inyecto a los animales por vía intravenosa una dosis única de ARNm encapsulado y se sacrificaron después de cuatro horas. La actividad de la proteína luciferasa de luciérnaga expresada en hígados y bazos se determinó usando un ensayo de bioluminiscencia. Para determinar la expresión de la proteína luciferasa de luciérnaga a partir del ARNm exógeno, se observó una señal detectable por encima del valor de referencia en cada animal analizado.

Como se ilustra en la Figura 2, todas las formulaciones probadas produjeron una salida de luminiscencia mejorada con respecto a los diferentes controles (por ejemplo, nanopartículas lipídicas encapsuladas de ARNm no-FFL, nanopartículas vacías y PBS). En la Tabla 2 siguiente se presenta una representación detallada de los valores brutos de la producción de luminiscencia (expresada como RLU/mg mediana de proteína total) de la proteína luciferasa de luciérnaga detectada en los hígados de ratones 4 horas después de la administración de una dosis única de las formulaciones lipídicas. Los controles usados en el presente estudio incluyeron una nanopartícula lipídica catiónica a base de C12- 200 que encapsulaba un ARNm no fluorescente (dosis de 30 |jg) y el vehículo de PBS.

Tabla 2.Producción de luminiscencia de la proteína CO-FFL en el hígado de ratones

Ejemplo 4. El mezclado homogéneo de dos nanopartículas lipídicas separadas, no idénticas, lleva a una mejora sinérgica de la expresión

Para evaluar la eficacia de transfección de varias formulaciones de encapsulación lipídica de ARNm de CO-FFL, se prepararon tanto mezclas como mezclas homogéneas de varias formulaciones de nanopartículas lipídicas, así como las nanopartículas lipídicas constituyentes individuales, y se ensayaron para determinar su capacidad de transfectary expresar ARNm en varias células y tejidos diana (según se determina por la luminiscencia de la proteína luciferasa de luciérnaga) in vivo.

Específicamente, se prepararon dos formulaciones de nanopartículas lipídicas que encapsulan ARNm de FFL y que comprenden o C12-200 o DLin-KC2-DMA como lípido catiónico de acuerdo con el protocolo de formulación descrito en el Ejemplo 1 (tales formulaciones se denominan en la presente Formulaciones 1 y 2, respectivamente). Se preparó una tercera formulación de nanopartículas lipídicas que encapsulaban ARNm de FFL que comprendía una mezcla de los lípidos catiónicos C12-200 y DLin-KC2-DMA en una única nanopartícula lipídica (denominada en la presente Formulación 3). Finalmente, se preparó una cuarta formulación de nanopartículas lipídicas que comprendía una mezcla homogénea de las Formulaciones 1 y 2 en una proporción de 1:3 sobre la base de la dosis de ARNm de FFL encapsulado (denominada en la presente Formulación 4). La Tabla 3 representa el componente o componentes lipídicos catiónicos de las Formulaciones 1, 2, 3 y 4, así como la dosis total de ARNm FFL encapsulado.

Tabla 3.Intensidad de fluorescencia hepática para formulaciones lipídicas simples, mezcladas y mezcladas homogéneamente

Se inyectó a los animales por vía intravenosa (a través de una inyección en la vena de la cola) una dosis única de ARNm de FFL encapsulado en las Formulaciones 1, 2, 3 o 4 y se sacrificaron después de cuatro horas. La actividad del ARNm de luciferasa de luciérnaga expresado en el hígado y el bazo de los animales se determinó en un ensayo de bioluminiscencia. Se observó una señal detectable por encima del valor de referencia en todos los animales probados, lo que infiere la expresión del ARNm de FFL encapsulado administrado exógenamente y la producción correspondiente de la proteína luciferasa de luciérnaga.

Se evaluó una comparación de la producción de luminiscencia de la proteína FFL expresada en el hígado tras la administración a través de varias nanopartículas liposomales. La luminiscencia de una sola formulación varió en intensidad en función del lípido catiónico empleado. Dicha luminiscencia también puede depender (aunque no exclusivamente) de la composición lipídica, del contenido total de lípidos y de la dosis. Todas las formulaciones probadas, sin embargo, produjeron una salida mejorada de luz con respecto a diferentes controles (nanopartículas no cargadas con ARNm de FFL, nanopartículas vacías, PBS, etc.) (Figura 2). En la Tabla 3 se muestra una representación más detallada de la producción luminiscente (valores brutos) de estas formulaciones.

Como se muestra en la Tabla 3, la mezcla de diferentes lípidos catiónicos dentro de una sola formulación (C12-200, DLin-KC2-DMA) todavía permite la administración con éxito del ARNm deseado al tejido diana con una producción general comparable de proteína (basada en la producción de RLU medida de proteína FFL) en comparación con la formulación a base de C12-200 o DLin-KC2-DMA. Sin embargo, al mezclar homogéneamente dos formulaciones separadas, no idénticas, se observó una mejora sinérgica (no aditiva) en la producción de luz (Figura 3, Tabla 3). Específicamente, como se enumera en la Tabla 3, al mezclar homogéneamente una nanopartícula lipídica a base de C12-200 que encapsula ARNm de FFL (Formulación N° 1) con una nanopartícula lipídica cargada con ARNm de FFL a base de DLin-KC2-DMA (Formulación N° 2) en una proporción de 1:3 (30 ug de ARNm de FFL:90 ug de ARNm de FFL, respectivamente), se observa un valor medio de RLU de 46,8 x 106 RLU/mg de proteína (Formulación N° 4). Esto se compara con un valor aditivo esperado de 5,05 x 106 RLU/mg proteína, basado en la suma de cada formulación probada individualmente (2,77 x 106 y 2,28 x 106 RLU/mg proteína para la Formulación N°1 y N°2, respectivamente (Figura 3, Tabla 3)). Al administrar una mezcla homogénea de las dos formulaciones, se logra una producción luminiscente 9 veces mayor (es decir, una producción más eficaz de la proteína deseada).

Por el contrario, el simple mezclado de dos lípidos dentro de una nanopartícula lipídica no dio como resultado ninguna mejora observable (Formulación N°3, Tabla 3). Por ejemplo, una dosis de 30 ug de una nanopartícula lipídica mezclada cargada con ARNm de C12-200/DLin-KC2-DMA FFL proporcionó una producción luminiscente comparable, aunque menor, que una nanopartícula lipídica cargada con ARNm de C12-200 FFL o DLin-KC2-DMA sola (1,53 x106 RLU/mg de proteína frente a 2,77 x106 y 2,28 x106 RLU/mg de proteína, respectivamente) (Figura 3, Tabla 3). Al dosificar dicha "mezcla" a 120 ug, la formulación resultante fue letal. Cabe destacar que el mezclado homogéneo de dos formulaciones separadas a esta dosis (120 ug) fue bien tolerada en ratones después de 4 horas.

El efecto del mezclado se evaluó adicionalmente usando dos mezclas adicionales de lípidos de ARNm de CO-FFL: C12-200/ICE FFL y DODAP/ICE FFL. Cuando la formulación mezclada de C12-200/ICE FFL se dosificó a 30 ug, la producción luminiscente media resultante detectada fue de 2,71 x 106 RLU/mg de proteína, comparable a una formulación lipídica individual a base de C12-200 (2,77 x 106 RLU/mg de proteína). La formulación mezclada de DODAP/ICE FFL, dio como resultado una producción media de 7.300 RLU/mg de proteína, en comparación con una formulación a base de DODAP única (~4.000 RLU/mg de proteína). Como se ha indicado anteriormente, una formulación mezclada ha proporcionado resultados comparables a las formulaciones a base de lípidos catiónicos solas, pero no mejorados.

Ejemplo 5. Sinergia observada en una variedad de mezclas homogéneas de nanopartículas lipídicas diferentes

Este ejemplo demuestra que la sinergia observada en el Ejemplo 4 no se limita a formulaciones específicas mezcladas homogéneamente. De hecho, esta sinergia se observa en una amplia variedad de diferentes nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente en varias proporciones. En la Tabla 4 se resumen los resultados ejemplares de varios experimentos.

Específicamente, se prepararon múltiples formulaciones de nanopartículas lipídicas que encapsulan ARNm de FFL y que comprenden C12-200, DLin-KC2-DMA, ICE, DODAP o HGT4003 como el lípido catiónico de acuerdo con el protocolo de formulación descrito en el Ejemplo 1, y posteriormente se mezclan homogéneamente en varias proporciones para preparar la formulación de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente (Tabla 4). Además, las formulaciones lipídicas designadas como "(A)" comprenden una concentración del 5% del lípido DMG-PEG2000 modificado con PEG, mientras que las formulaciones lipídicas designadas como "(B)" comprenden un 10% de DMG-PEG2000. A los animales se les inyectó por vía intravenosa (a través de una inyección en la vena de la cola) una dosis única en bolo de ARNm de FFL encapsulado o en una formulación lipídica mezclada homogéneamente o en la formulación lipídica constituyente y se les sacrificó después de cuatro horas. La actividad del ARNm de luciferasa de luciérnaga expresado en el hígado se determinó en un ensayo de bioluminiscencia. Los aumentos varían entre 1,1-10x de luminiscencia sobre la suma de cada formulación individual respectiva, lo que demuestra una mejora sinérgica.

Como se muestra en la Tabla 4, cada mezcla homogénea dio como resultado un aumento de la luminiscencia al administrar ARNm de FFL en comparación con la suma de la producción de sus formulaciones individuales. Los experimentos N° 1-4 (Tabla 4) fueron similares a lo descrito anteriormente (Ejemplo 4). Los resultados mostrados en la Tabla 4 también indican que al variar los parámetros de formulación (porcentaje de PEG) para cada nanopartícula, puede ajustarse y controlarse eficazmente la cantidad de mejora sinérgica. Además, esta mejora sinérgica en la producción de proteínas puede verse afectada/ajustada por la composición lipídica (distinta del lípido PEGilado) y el contenido total de lípidos.

Otro ejemplo de mejora sinérgica usando diferentes formulaciones de lípidos catiónicos está representado por el Experimento N°8. Al mezclar homogéneamente una nanopartícula lipídica a base de HGT4003 cargada con ARNm de FFL con una nanopartícula lipídica a base de ICE cargada con ARNm de FFL en una proporción de 1:1 (100 ug de ARNm encapsulado: 100 ug de ARNm encapsulado, respectivamente), se observa un valor medio de RLU/mg de proteína de 4,39 x 105. Esto se compara con un valor aditivo esperado de 2,77 x 105 RLU/mg de proteína, basado en la suma de cada formulación probada individualmente ((2,53 x 105 y 2,40 x 104 RLU/mg de proteína, respectivamente (Tabla 4, Figura 4)).

Otro factor es la proporción a la que se mezclan homogéneamente las formulaciones. Como se muestra en la Figura 4, dos formulaciones que encapsulan ARNm de FFL se dosifican individualmente y como mezclas homogéneas empleando dos proporciones de mezcla homogénea diferentes, 1:1 y 3:1 (HGT4003:1CE) (Tabla 4, Experimento N°8 y N°9, respectivamente). Aunque se observa un aumento sinérgico de la luminiscencia en ambas mezclas homogéneas, se observa una mejora mucho mayor cuando las dos formulaciones se mezclan homogéneamente en una proporción 3:1 (HGT4003:ICE). Las formulaciones mezcladas homogéneamente en una proporción 1:1 proporcionaron una mejora de 1,59 veces sobre la suma de sus homólogas individuales, mientras que las formulaciones mezcladas homogéneamente en una proporción 3:1 proporcionaron una mejora de aproximadamente 4,4 veces.

Los resultados descritos en la presente demuestran que el mezclado homogéneo de dos nanopartículas lipídicas separadas cargadas con ARNm de FFL permite mecanísticamente la producción de más proteína FFL en el hígado de ratón de manera sinérgica que en comparación con sus homólogas separadas. Sin querer estar limitados por ninguna teoría, se contempla que las posibles explicaciones de la sinergia incluyen: a.) vías de entrada celular no competitivas, b.) combinación de diferentes mecanismos de tráfico intracelular (protones-esponja frente a fusogenicidad, c.) "fusión endosomal" que combina propiedades de liberación de fármacos con propiedades de liberación endosomal (es decir, una célula puede captar ambas nanopartículas por separado y, a medida que se procesan a través de la vía endosomal, los endosomas se fusionan y entonces un conjunto de lípidos potencia al otro en términos de liberación de ARNm), d.) modulación de las vías inhibidoras activas permitiendo una mayor captación de nanopartículas.

Tabla4. Varias mezclas homogéneas de lípidos catiónicos y nanopartículas y mejora sinérgica de la luminiscencia de la proteína CO-FFL en el hígado

Ejemplo 6. El efecto sinérgico es independiente del ácido nucleico incorporado

Esta mejora sinérgica de la producción de luz es incluso más evidente cuando se sustituyen nanopartículas lipídicas de ARNm "ficticias" no fluorescentes (no FFL) como componente de la mezcla homogénea. Específicamente, se realizaron experimentos representativos que incorporaban ARNm que codifica galactosa-1-fosfato uridil transferasa (GALT) como componente no fluorescente para demostrar que la noción de sinergia con respecto al mezclado homogéneo de formulaciones separadas es independiente del ácido nucleico incorporado (Figura 5).

La Figura 5 ilustra una comparación de la luminiscencia mediana observada al estudiar formulaciones mezcladas homogéneamente que encapsulan ARNm fluorescente (FFL) y no fluorescente (GALT). Las formulaciones de nanopartículas lipídicas a base de C12-200 se administraron a una dosis de 30 |jg de ARNm, mientras que las formulaciones de nanopartículas lipídicas a base de DLin-KC2-DMA se administraron a una dosis de 90 jg de ARNm. Las formulaciones mezcladas homogéneamente se administraron ambas a dosis de 120 jg de ARNm total. Como se ilustra en la Figura 5, se observó una luminiscencia mediana mejorada en ambas formulaciones mezcladas homogéneamente con respecto a la luminiscencia observada al administrar individualmente las nanopartículas lipídicas constituyentes.

La Tabla 5 enumera algunos ejemplos representativos de varios sistemas a base de lípidos catiónicos que demuestran una producción sinérgica de proteína FFL al incorporar un mensaje GALT no fluorescente en una de las formulaciones.

Como puede verse en la Tabla 5, la sinergia es evidente en toda una variedad de lípidos catiónicos empleados (C12-200, DLin-KC2-DMA, HGT4003, ICE, DODAP, etc., Tabla 5). En algunos casos, se observan mejoras de más de 30 veces superiores a las de las formulaciones individuales administradas por separado (Tabla 5, Experimento N° 14). Esto fue evidente cuando se mezcló homogéneamente una formulación del lípido a base de disulfuro HGT4003 que encapsulaba ARNm de FFL con una formulación a base de C12-200 que encapsulaba ARNm de GALT (Tabla 5, Experimento N°17). La RLU media observada medida en los hígados de los ratones cuatro horas después de la administración fue de 8,38 x 106 RLU para la mezcla en comparación con 3,85 x 105 RLU de la nanopartícula cargada con ARNm de FFL a base de HGT4003 independientemente. Se observó una fluorescencia de fondo insignificante para todos los grupos de nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de GALT no fluorescentes.

En el Experimento N° 18 (Tabla 5) se representa otro ejemplo de mejora sinérgica observada al mezclar homogéneamente una nanopartícula lipídica cargada con ARNm de FFL con una nanopartícula lipídica cargada con ARNm de GALT. Una mezcla homogénea de una nanopartícula lipídica a base de ICE cargada con ARNm de FFL con una nanopartícula lipídica a base de DLin-KC2-DMA cargada con ARNm de GALT no fluorescente (proporción 1:1 sobre la base de la dosis de ARNm encapsulado) proporcionó un valor medio observado de RLU/mg de proteína de 1,84 x 105. Esto se compara con un valor de 3,76 x 1o4 RLU/mg de proteína para la formulación a base de<i>C<e>cargada con ARNm de FFL administrada independientemente. Dicha mezcla homogénea proporcionó una mejora aproximada de 4,85 veces en la producción luminiscente.

Por tanto, los experimentos mostrados en la Tabla 5 demuestran claramente que la mejora sinérgica con respecto a la producción de luz no depende de que ambas nanopartículas tengan un mensaje fluorescente incorporado, lo que sugiere que los efectos sinérgicos con respecto al mezclado homogéneo de formulaciones lipídicas separadas es independiente del ácido nucleico incorporado.

Tabla 5.Varias mezclas homogéneas de lípidos catiónicos y nanopartículas y mejora sinérgica de la luminiscencia l r ín -FFL n l hí

A continuación, probamos si el efecto sinérgico con respecto al mezclado homogéneo de diferentes formulaciones lipídicas dependía de la presencia de ARN mensajero. Con este fin, probamos nanopartículas liposomales vacías (sin ningún ARNm encapsulado) como posibles agentes sinérgicos. Curiosamente, el mezclado homogéneo de una nanopartícula lipídica catiónica vacía a base de C12-200 con una nanopartícula lipídica catiónica a base de DLin-KC2-DMA cargada con ARNm de FFL dio como resultado una fuerte mejora sinérgica de la luminiscencia (4 veces de aumento) (Figura 6, Tabla 6, Experimento N° 24), mientras que la mezcla homogénea inversa respectiva (nanopartículas C12-200 cargadas con ARNm de FFL con nanopartículas liposomales de DLin-KC2-DMA vacías) no dio como resultado ninguna mejora (Figura 6, Tabla 6 (Experimento N° 23)).

Estos resultados indican que el efecto sinérgico puede depender de la presencia de mensaje, por lo menos en algunos casos. Sin querer estar limitados por ninguna teoría en particular, se contempla que dos posibles mecanismos específicos de lípidos pueden estar llevando al efecto sinérgico con o sin la presencia de ARNm.

Tabla 6.Efecto de la encapsulación de ARNm sobre la mejora del mezclado homogéneo

Ejemplo 7. Efecto sinérgico de nanopartículas derivadas de liposomas mediante administración ICV

Como se muestra en los ejemplos anteriores, se ha observado en el hígado el aumento sinérgico en la producción de proteínas en múltiples sistemas cuando los artículos de prueba se han administrado por vía intravenosa como se ha descrito (vide supra). Se contempla que el efecto sinérgico pueda aplicarse además, no sólo a enfermedades específicas del hígado, sino a cualquier lugar que pueda requerir tratamiento, es decir, pulmón, bazo, riñón, corazón, ojo, sistema nervioso central, cerebro, etc. Para confirmarlo, el presente ejemplo demuestra una mejora sinérgica de la luminiscencia de la proteína FFL al administrar una mezcla homogénea de dos nanopartículas lipídicas cargadas con ARNm de FFL por separado mediante administración intracerebroventricular (ICV).

Como se muestra en la Figura 7, las nanopartículas lipídicas encapsuladas con ARNm de FFL a base de C12-200 mezcladas homogéneamente con nanopartículas lipídicas a base de DLin-KC2-DMA cargadas con ARNm de FFL en una proporción 1:3 (sobre la dosis de ARNm) dieron como resultado una mejora aproximada de 2,0 veces de la luminiscencia de la proteína de FFL en comparación con la suma de la producción luminiscente de cada formulación individual (1,11 x 105 RLU frente a 5,57 x 104 RLU, respectivamente). Para evaluar si las formulaciones mezcladas homogéneamente eran capaces de demostrar una mejora sinérgica de la luminiscencia observada en las células y tejidos del sistema nervioso central, se realizaron estudios adicionales en donde las formulaciones mezcladas homogéneamente se administraron a animales por vía intracerebroventricular (ICV). En particular, se evaluó la mejora sinérgica en la expresión de ARNm exógeno administrado por ICV encapsulado en una formulación de nanopartículas lipídicas mezcladas homogéneamente y la producción correspondiente de la proteína luciferasa de luciérnaga codificada por la misma (como se demostró por la producción luminiscente mediana mejorada) comparando la producción de luminiscencia mediana observada después de la administración por ICV de las formulaciones lipídicas mezcladas homogéneamente con la producción de luminiscencia mediana observada después de la administración por ICV de las formulaciones de nanopartículas lipídicas constituyentes individuales.

Ejemplo 8. Mejora sinérgica de la expresión de proteínas secretadas

Este ejemplo demuestra que el fenómeno sinérgico también se aplica a la idea de un efecto de "depósito" para la secreción de una proteína deseada en el torrente sanguíneo. Por ejemplo, la administración de ARNm que codifica la eritropoyetina humana (EPO) puede empaquetarse mediante una nanopartícula lipídica e inyectarse en un ratón. La formulación puede acumularse dentro del hígado y/u otros órganos y transcribir el ARNm a la proteína EPO deseada. Tras su expresión, la proteína puede secretarse desde el hígado (órgano) y funcionar según sea necesario.

Esta noción se probó usando una nanopartícula lipídica a base de C12-200 cargada con ARNm de EPO humana, una nanopartícula lipídica a base de DLin-KC2-DMA cargada con ARNm de EPO humana y una mezcla homogénea de las dos formulaciones en varias proporciones. Cuatro horas después de la administración intravenosa de estas nanopartículas a ratones, se detectó EPO humana secretada por completo mediante análisis ELISA y de inmunotransferencia (Figuras 8 y 9, respectivamente). Además, tras el tratamiento con una mezcla homogénea de las dos formulaciones individuales, se observó una mejora sinérgica de la proteína EPO humana secretada en el torrente sanguíneo en comparación con la suma de cada homólogo de la formulación individual (Figura 8). Esta mejora fue más pronunciada tras mezclar homogéneamente en una proporción de 1:3 (~2 veces) en comparación con 1:1 (~1,4 veces) (formulación a base de C12- 200:formulación a base de DLin-KC2-DMA).

Este aumento sinérgico de la producción de proteínas es más pronunciado cuando se analiza mediante transferencia western. Como se representa en la Figura 9, una mezcla homogénea de una nanopartícula lipídica a base de C12-200 cargada con ARNm de EPO humana con una nanopartícula lipídica cargada con DLin-KC2-DMA análoga muestra una banda fuerte (Carril 4) significativa de proteína de EPO humana aislada del suero cuatro horas después de la administración. El carril correspondiente a una formulación individual de C12-200 (carril 2) proporciona una banda moderadamente detectada, mientras que la de la formulación a base de DLin-KC2-DMA (carril 3) es indetectable. Puede observarse cualitativamente un aumento de la producción de proteínas en comparación con el "total aditivo" de cada formulación individual.

Estas observaciones confirman que este fenómeno sinérgico no es específico de un sistema de luciferasa, sino que puede aplicarse a otras proteínas diana en general. Además, como se demuestra en el Ejemplo 7, el fenómeno sinérgico se observa no sólo a través de la administración intravenosa al hígado, sino también a través de la administración intracerebroventricular al cerebro. Además de la administración a órganos diana específicos, el mezclado homogéneo de dos formulaciones puede mejorar sinérgicamente la producción de proteínas secretadas, como se ha demostrado con nuestro sistema de EPO humana.

La mejora sinérgica presentada aquí sugiere que puede lograrse una eficacia terapéutica equivalente mediante la administración de una dosis significativamente menor que la prevista anteriormente. La capacidad de crear una producción sinérgica de proteínas a través de la administración de nanopartículas a base de lípidos del ARNm permite una ventana terapéutica mucho mayor para el tratamiento de una multitud de enfermedades. La administración con éxito de este ARNm en el hígado y, en particular, en los hepatocitos, puede usarse para el tratamiento y la corrección de errores congénitos del metabolismo que se localizan en el hígado. Enfermedades como la ASD y la OTC, entre otros trastornos del ciclo de la urea, pueden tratarse mediante terapia con ARNm del gen faltante. La zonación metabólica del ciclo de la urea a los hepatocitos significa que proporcionar la enzima faltante en estas células debería mejorar en gran medida el procesamiento bioquímico normal en individuos con estos trastornos. Para lograr esto de manera sinérgica mediante el proceso descrito anteriormente, se podría administrar una dosis mucho más baja (de ~2 a 30 veces menor) y lograr una eficacia igual o mayor a la vez que se media cualquier acontecimiento adverso o tóxico.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica para la administración de polinucleótidos de ARN mensajero (ARNm) a una célula, la composición comprendiendo una primera nanopartícula lipídica y una segunda nanopartícula lipídica, en donde la primera nanopartícula lipídica comprende el ARNm y en donde la segunda nanopartícula lipídica no encapsula un polinucleótido.

2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde la composición comprende una mezcla homogénea de por lo menos la primera nanopartícula lipídica y la segunda nanopartícula lipídica, en donde la primera nanopartícula lipídica comprende por lo menos un lípido distinto de la segunda nanopartícula lipídica, y en donde el por lo menos un lípido distinto es un lípido catiónico, opcionalmente, en donde el lípido catiónico se selecciona del grupo que consiste en C12-200, DOTAP (1,2-dioleil-3-trimetilamonio propano), Do Da P (1,2-dioleil-3-dimetilamonio propano), DOTMA (1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio propano), DLinDMA, DLin-KC2-DMA, HGT4003 (2-((2,3-Bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)propil)disulfanil)-N,N-dimetiletanamina) e ICE (ésterde colesterol imidazólico).

3. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la primera nanopartícula lipídica y la segunda nanopartícula lipídica comprenden:

(i) uno o más lípidos auxiliares, opcionalmente en donde los uno o más lípidos auxiliares se seleccionan del grupo que consiste en DSPC (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DPPC (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DOPE (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DMPE (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPG (,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol)) y colesterol; o (ii) uno o más lípidos modificados con PEG, opcionalmente en donde los uno o más lípidos modificados con PEG comprenden una cadena de poli(etileno)glicol de hasta 5kDa de longitud unida covalentemente a un lípido que comprende una o más cadenas de alquilo de C6-C20 de longitud.

4. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la primera nanopartícula lipídica o la segunda nanopartícula lipídica comprende:

(i) DLinDMA, CHOL, DOPE y DMG-PEG-2000;

(ii) C12-200, CHOL, DOPE y DMG-PEG-2000;

(iii) DLinKC2, CHOL, DOPE y DMG-PEG-2000;

(iv) uno o más lípidos seleccionados del grupo que consiste en ICE, DSPC, CHOL, DODAP, DOTAP y C8-PEG-2000;

(v) DSPC, CHOL, DODAP y C8-PEG-2000;

(vi) ICE, DOPE y DMG-PEG-2000; o

(vii) HGT4003, DOPE, CHOL y DMG-PEG-2000.

5. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde:

(i) el ARNm codifica una enzima, opcionalmente en donde la enzima es secretada por la célula;

(ii) el ARNm codifica una proteína que es secretada por la célula;

(iii) el ARNm codifica un polipéptido que es expresado aberrantemente por un sujeto, opcionalmente en donde la enzima se selecciona del grupo que consiste en agalsidasa alfa, alfa-L-iduronidasa, iduronato-2-sulfatasa, N-acetilglucosamina-1-fosfato transferasa, beta-glucosidasa, galactosa-6-sulfato sulfatasa, beta-galactosidasa, glucocerebrosidasa, heparán sulfamidasa, hialuronidasa, galactocerebrosidasa, ornitina transcarbamilasa (OTC), carbamoil-fosfato sintetasa 1 (CPS1), argininosuccinato sintetasa (ASS1), argininosuccinato liasa (ASL) y arginasa 1 (ARG1); o

(iv) el ARNm se selecciona entre la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 3.

6. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el ARNm comprende una modificación química, opcionalmente en donde la modificación química:

(i) hace que el ARNm sea más estable;

(ii) comprende una modificación de bloqueo de extremo de una región no traducida 5' del ARNm;

iii) comprende una modificación de bloqueo dl extremo de una región no traducida 3' del ARNm;

(iv) comprende la inclusión de una secuencia parcial de un gen inmediato-temprano 1 (IE1) de CMV en la región no traducida 5' del ARNm;

(v) comprende la inclusión de una cola poli A en la región no traducida 3' del ARNm;

(vi) comprende la inclusión de una estructura Cap1 en la región no traducida 5' del ARNm; o

(vii) comprende la inclusión de una secuencia que codifica la hormona del crecimiento humano (hGH) en la región no traducida 3' del ARNm.

7. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la proporción de la primera nanopartícula lipídica con respecto a la segunda nanopartícula lipídica en la composición farmacéutica es de aproximadamente 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 75:1, 100:1, 125:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:75, 1:100, 1:125 o más.

8. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la célula se selecciona del grupo que consiste en hepatocitos, células epiteliales, células hematopoyéticas, células epiteliales, células endoteliales, células pulmonares, células óseas, células madre, células mesenquimales, células neurales, células cardíacas, adipocitos, células vasculares del músculo liso, cardiomiocitos, células musculares esqueléticas, células beta, células hipofisarias, células de revestimiento sinovial, células ováricas, células testiculares, fibroblastos, células B, células T, reticulocitos, leucocitos, granulocitos y células tumorales.

9. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la expresión del ARNm después de la administración de la composición farmacéutica a un sujeto excede la expresión del ARNm administrado con la primera nanopartícula lipídica pero sin la segunda nanopartícula lipídica en por lo menos aproximadamente dos, cinco, diez, doce, quince, veinte, veinticinco, treinta, cuarenta, cincuenta, cien, quinientas, mil veces o más.

10. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso en un método de tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno en un sujeto.

11. La composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la composición farmacéutica se administra al sujeto por una o más de las siguientes vías de administración: intravenosa, oral, rectal, vaginal, transmucosal, sublingual, subdural, nasal, intramuscular, subcutánea, inyección intramedular, intratecal, intraventricular, intraperitoneal, intranasal, intracerebroventricular (ICV), oftálmica e intraocular.

12. La composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en donde la enfermedad o trastorno es atrofia muscular espinal (SMA) relacionada con SMNI; esclerosis lateral amiotrófica (ALS); galactosemia relacionada con GALT; fibrosis quística (CF); trastornos relacionados con SLC3A1, incluyendo la cistinuria; trastornos relacionados con COL4A5, incluyendo el síndrome de Alport; deficiencias de galactocerebrosidasa; adrenoleucodistrofia y adrenomieloneuropatía ligadas al cromosoma X; ataxia de Friedreich; enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher; esclerosis tuberosa relacionada con TSC1 y TSC2; síndrome de Sanfilippo B (MPS IIIB); cistinosis relacionada con CTNS; trastornos relacionados con FMRi que incluyen el síndrome del cromosoma X frágil, el síndrome de temblor/ataxia asociado al cromosoma X frágil y el síndrome de insuficiencia ovárica prematura por cromosoma X frágil; síndrome de Prader Willi; enfermedad de Fabry; telangiectasia hemorrágica hereditaria (AT); enfermedad de Niemann-Picktipo C1; las enfermedades relacionadas con la lipofuscinosis neuronal ceroidea, incluyendo la lipofuscinosis neuronal ceroideajuvenil (JNCL), la enfermedad de Battenjuvenil, la enfermedad de Santavuori-Haltia, la enfermedad de Jansky-Bielschowsky y las deficiencias de PTT-I y TPPI; ataxia infantil relacionada con EIF2B1, EIF2B2, EIF2B3, EIF2B4 y EIF2B5 con hipomielinización del sistema nervioso central/desaparición de materia blanca; ataxia episódica tipo 2 relacionada con CACNA1A y CACNB4; trastornos relacionados con MECP2, incluyendo el síndrome de Rett clásico, la encefalopatía neonatal grave relacionada con MECP2 y el síndrome PPM-X; síndrome de Rett atípico relacionado con CDKL5; la enfermedad de Kennedy (SBMA); arteriopatía cerebral autosómica dominante relacionada con Notch-3 con infartos subcorticales y leucoencefalopatía (CADASIL); trastornos convulsivos relacionados con SCN1Ay SCN1B; los trastornos relacionados con la polimerasa G, que incluyen el síndrome de Alpers-Huttenlocher, la neuropatía atáxica sensorial, la disartria y la oftalmoparesia relacionadas con POLG, y la oftalmoplejía externa progresiva autosómica dominante y recesiva con deleciones de ADN mitocondrial; hipoplasia suprarrenal ligada al cromosoma X; agammaglobulinemia ligada al cromosoma X; o enfermedad de Wilson.