ES3031988T3

ES3031988T3 - Small rna medicament for prevention and treatment of inflammation-related diseases and combination thereof

Info

Publication number: ES3031988T3
Application number: ES18944638T
Authority: ES
Inventors: Chengyu Jiang; Dandan Zhao; Yuhao Qin; Cong Zhang; Yexuan Lin
Original assignee: Beijing Baishihekang Pharmaceutical Tech Bsjpharma Co Ltd
Current assignee: Beijing Baishihekang Pharmaceutical Tech Bsjpharma Co Ltd
Priority date: 2018-12-25
Filing date: 2018-12-25
Publication date: 2025-07-14
Anticipated expiration: 2038-12-25
Also published as: EP3960858A1; US20230272402A1; CA3124730A1; EP3960858B1; EP4470615A3; EP3960858A4; CN114729354A; EP4470615A2; EP3960858C0; CN118530991A; WO2020132844A1

Abstract

Se proporciona un ARN pequeño, una composición que lo comprende, un método para su uso y su uso. El ARN pequeño o la composición puede inhibir la capacidad de una o más de las vías o genes enumerados en la Tabla 3, o disminuir o regular a la baja la expresión de IL-1 beta, IL-6 y/o TNF-alfa in vivo o in vitro, o tratar o prevenir enfermedades relacionadas con IL-1 beta, IL-6 y/o TNF-alfa, o aumentar la viabilidad celular en un sujeto. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Medicamento de ARN pequeño para la prevención y el tratamiento de enfermedades relacionadas con la inflamación y combinación del mismo

Campo técnico

La presente invención se refiere en general al campo de las opciones terapéuticas con ácidos nucleicos, y más específicamente a ARN pequeños y a métodos de uso y a usos de los mismos.

Antecedentes de la invención

La inflamación es un proceso patológico básico muy común e importante, y una enfermedad habitual y frecuente de la mayoría de los órganos e infecciones traumáticas en la superficie del cuerpo. La inflamación puede estar causada por una infección (tal como neumonía, miocarditis, gastritis aguda y crónica, enteritis aguda y crónica, hepatitis aguda y crónica, nefritis aguda y crónica, dermatitis, encefalitis, linfadenitis, conjuntivitis, queratitis, iridociclitis, timpanitis, etc.). También puede tratarse de una inflamación no infecciosa, que suele estar estrechamente relacionada con la inmunidad del cuerpo (tal como la rinitis alérgica, asma, fibrosis pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, dermatitis alérgica, enfermedad de células falciformes, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, nefritis lúpica, etc.). Al mismo tiempo, la inflamación es también uno de los principales factores predisponentes de la aparición de cáncer (tal como cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de cuello uterino, cáncer de mama, leucemia, mieloma múltiple, etc.). Asimismo, estudios han demostrado que algunos factores inflamatorios también se refieren a enfermedades metabólicas (tal como la diabetes, gota, etc.). En circunstancias normales, la inflamación es ventajosa y es una respuesta de defensa automática del cuerpo. Pero a veces la inflamación también es perjudicial, por ejemplo, ataques a los propios tejidos del cuerpo, inflamación que se produce en los tejidos hialinos, y similares.

Las manifestaciones clínicas de la inflamación incluyen el enrojecimiento, hinchazón, fiebre, dolor, disfunción, etc., mientras que los indicadores bioquímicos de inflamación suelen referirse a una expresión elevada de factores inflamatorios que intervienen en el proceso de inflamación y median en la respuesta inflamatoria, por ejemplo, IL-1beta, IL-6 y TNF-alfa. En la actualidad, la prevención y el tratamiento de la inflamación siguen basándose principalmente en la medicina occidental, pero también hay muchos productos de la medicina tradicional china que tienen ciertos efectos antiinflamatorios, pero todos tienen sus propios defectos inevitables. Las opciones terapéuticas de ARN y su uso para el tratamiento de la inflamación se describen entre otros en los documentos W<o>2018/177383, WO 2010/129919, Glasgow, S.C.et al.(Am.J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol.293(2007), 491-496), y Tahamtan, A.et al.(Front. Immunol.9(2018), 377). Por lo tanto, sigue siendo necesario encontrar nuevas medidas de tratamiento antiinflamatorio.

Compendio de la invención

La presente invención proporciona lo siguiente, tal como se define en las reivindicaciones:

1. Un ARN pequeño para su uso en el tratamiento de una enfermedad relacionada con IL-1beta, IL-6 y/o TNF-alfa de un IL-1beta, IL-6 o/y TNF-alfa, en donde el ARN pequeño tiene una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 20; en donde la administración del ARN pequeño rescata de la muerte celular causada por una infección con un virus; y en donde la enfermedad relacionada con IL-1beta, IL-6 o/y TNF-alfa se selecciona del grupo que consiste en neumonía, miocarditis, gastritis aguda y crónica, enteritis aguda y crónica, hepatitis aguda y crónica, nefritis aguda y crónica, dermatitis, encefalitis, linfadenitis, conjuntivitis, queratitis, iridociclitis, timpanitis, rinitis alérgica, asma, fibrosis pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, dermatitis alérgica, enfermedad de células falciformes, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, nefritis lúpica, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de cuello uterino, cáncer de mama, leucemia, mieloma múltiple, diabetes y gota.

2. El ARN pequeño para el uso según el punto 1, en donde el virus es un virus de la gripe aviar, y preferiblemente es H5N1.

3. El ARN pequeño para el uso según el punto 1 o 2, en donde el ARN pequeño está en una forma bicatenaria o monocatenaria o una forma híbrida bicatenaria o monocatenaria.

4. Una construcción de ácido nucleico que codifica el ARN pequeño según uno cualquiera de los puntos 1 a 3, preferiblemente en donde la construcción es una construcción viral, y en particular preferiblemente una construcción retroviral.

5. Un virus recombinante que comprende la construcción de ácido nucleico según el punto 4, preferiblemente en donde el virus recombinante es un retrovirus.

6. Un vector de expresión que comprende la construcción de ácido nucleico según el punto 4.

7. Una célula, que comprende la construcción de ácido nucleico según el punto 4, o transfectada con el virus recombinante según el punto 5, o que comprende el vector de expresión según el punto 6.

8. Un método para expresar el ARN pequeño como se ha definido en uno cualquiera de los puntos 1 a 3, que comprende expresar la célula según el punto 7 en condiciones adecuadas y recuperar el ARN pequeño.

9. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad relacionada con Il-1beta, IL-6 y/o TNF-alfa como se ha definido anteriormente en el presente documento, comprendiendo la composición farmacéutica el ARN pequeño según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

10. La composición farmacéutica para el uso según el punto 9, en donde la composición farmacéutica es para administración oral o intravenosa, o administración por vía subcutánea, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, intrapulmonar, intracefalorraquídea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, intralesional o inhalatoria, preferiblemente en donde la administración intravenosa es la inyección en bolo o la perfusión continua durante un periodo de tiempo y/o la administración por inhalación es la administración intranasal.

11. La composición farmacéutica para el uso según el punto 9 o 10, comprendiendo la composición farmacéutica el ARN pequeño que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 20 en una cualquiera o más de Mezcla 1 a Mezcla 43 en la Tabla 2, en donde la relación de concentración molar del ARN pequeño que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO. 20 con respecto a otro(s) ARN pequeño(s) en la composición es de 2:1.

Descripción de los dibujos

Cualquier ARN pequeño distinto del ARNp de BZL-20 que tenga SEQ ID NO:20 son ejemplos comparativos y no forman parte de la presente invención.

Figura 1: La expresión del factor inflamatorio IL-1beta a nivel de proteína en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deScutellaria barbata(BZL) 24 horas antes, como se especifica en la figura.

Figura 2: La expresión del factor inflamatorio IL-1beta a nivel de proteína en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deBupleurum(CHu) 24 horas antes, como se especifica en la figura. Figura 3: La expresión del factor inflamatorio IL-1beta a nivel de proteína en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deHouttuynia cordata(YXC) 24 horas antes, como se especifica en la figura.

Figura 4: La expresión del factor inflamatorio IL-1beta a nivel de proteína en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deAndrographis paniculata(CXL) yTaraxacum(PGY) 24 horas antes, como se especifica en la figura.

Figura 5: La expresión del factor inflamatorio IL-6 a nivel de proteína en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deScutellaria barbata(BZL) 24 horas antes, como se especifica en la figura.

Figura 6: La expresión del factor inflamatorio IL-6 a nivel de proteína en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deBupleurum(CHu) 24 horas antes, como se especifica en la figura. Figura 7: La expresión del factor inflamatorio IL-6 a nivel de proteína en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deViola philippica(DDi),Scutellaria baicalensis(HQi),Lonicera japonica(JYH),Fructus forsythiae(LQi) yPrunella vulgaris(XKC) 24 horas antes, como se especifica en la figura. Figura 8 a Figura 9: La expresión del factor inflamatorio IL-6 a nivel de proteína en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deHouttuynia cordata(YXC) 24 horas antes, como se especifica en la figura.

Figura 10: La expresión del factor inflamatorio IL-6 a nivel de proteína en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deAndrographis paniculata(CXL) yTaraxacum(PGY) 24 horas antes, como se especifica en la figura.

Figura 11: La expresión del factor inflamatorio TNF-alfa a nivel de proteína en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deScutellaria barbata(BZL),Viola philippica(DDi),Scutellaria baicalensis(HQi),Fructus forsythiae(LQi) yPrunella vulgaris(XKC) 24 horas antes, como se especifica en la figura.

Figura 12: La expresión del factor inflamatorio TNF-alfa a nivel de proteína en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deBupleurum(CHu) 24 horas antes, como se especifica en la figura.

Figura 13 a Figura 14: La expresión del factor inflamatorio TNF-alfa a nivel de proteína en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deHouttuynia cordata(YXC) 24 horas antes, como se especifica en la figura.

Figura 15: La expresión del factor inflamatorio TNF-alfa a nivel de proteína en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deTaraxacum(PGY) 24 horas antes, como se especifica en la figura.

Figura 16: La expresión del factor inflamatorio IL-1 beta a nivel de ARNm en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deScutellaria barbata(BZL) 24 horas antes, como se especifica en la figura.

Figura 17: La expresión del factor inflamatorio IL-1beta a nivel de ARNm en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deBupleurum(CHu),Fructus forsythiae(LQi) yHouttuynia cordata(YXC) 24 horas antes, como se especifica en la figura.

Figura 18 a Figura 19: La expresión del factor inflamatorio IL-1beta a nivel de ARNm en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deHouttuynia cordata(YXC) 24 horas antes, como se especifica en la figura.

Figura 20: La expresión del factor inflamatorio IL-1beta a nivel de ARNm en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deTaraxacum(PGY) 24 horas antes, como se especifica en la figura.

Figura 21 a Figura 22: La expresión del factor inflamatorio IL-6 a nivel de ARNm en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deScutellaria barbata(BZL) 24 horas antes, como se especifica en la figura.

Figura 23 a Figura 24: La expresión del factor inflamatorio IL-6 a nivel de ARNm en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deBupleurum(CHu) 24 horas antes, como se especifica en la figura.

Figura 25: La expresión del factor inflamatorio IL-6 a nivel de ARNm en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deViola philippica(DDi),Scutellaria baicalensis(HQi),Lonicera japonica(JYH),Fructus forsythiae(LQi) yPrunella vulgaris(XKC) 24 horas antes, como se especifica en la figura.

Figura 26 a Figura 27: La expresión del factor inflamatorio IL-6 a nivel de ARNm en comparación con el grupo NC, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP-1 transfectadas con el ARN pequeño deHouttuynia cordata(YXC) 24 horas antes, como se especifica en la figura.

Figura 28: La expresión del factor inflamatorio IL-6 a nivel de ARNm en comparación con el grupo NC, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deAndrographis paniculata(CXL) yTaraxacum(PGY) 24 horas antes, como se especifica en la figura.

Figura 29: La expresión del factor inflamatorio TNF-alfa a nivel de ARNm en comparación con el grupo NC, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deScutellaria barbata(BZL) y elBupleurum(CHu) 24 horas antes, como se especifica en la figura.

Figura 30: La expresión del factor inflamatorio TNF-alfa a nivel de ARNm en comparación con el grupo NC, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deViola philippica(DDi),Lonicera japónica(JYH),Fructus forsythiae(LQi) yPrunella vulgaris(XKC) 24 horas antes, como se especifica en la figura.

Figura 31 a Figura 32: La expresión del factor inflamatorio TNF-alfa a nivel de ARNm en comparación con el grupo NC, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deHouttuynia cordata(YXC) 24 horas antes, como se especifica en la figura.

Figura 33: La expresión del factor inflamatorio TNF-alfa a nivel de ARNm en comparación con el grupo NC, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deTaraxacum(PGY) 24 horas antes, como se especifica en la figura.

Figura 34A a Figura 34C: ARN pequeño de BZL: tras la infección por H5N1 (0,4 M.O.I), los resultados de rescate del ARN pequeño deScutellaria barbata(BZL) de la muerte celular, como se especifica en la figura; Figura 34D a Figura 34G: ARN pequeño de CHu: tras la infección por H5N1 (0,4 M.O.I), los resultados de rescate del ARN pequeño deBupleurum(CHu) de la muerte celular, como se especifica en la figura; Figuras 34H: ARN pequeño de LQi/XKC: tras la infección por H5N1 (0,4 M.O.I), los resultados de rescate del ARN pequeño deFructus forsythiae(LQi) /Prunella vulgaris(XKC) de la muerte celular, como se especifica en la figura; Figuras 34I: ARN pequeño de XKC/YXC: tras la infección por H5N1 (0,4 M.O.I), los resultados de rescate del ARN pequeño dePrunella vulgaris(XKC) /Houttuynia cordata(YXC) de la muerte celular, como se especifica en la figura; Figura 34J a Figura 34N: ARN pequeño de YXC: tras la infección por H5N1 (0,4 M.O.I), los resultados de rescate del ARN pequeño deHouttuynia cordata(YXC) de la muerte celular, como se especifica en la figura.

Figura 35: La expresión del factor inflamatorio IL-1beta a nivel de proteína en comparación con el grupo NC, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con las mezclas de ARN pequeño 24 horas antes, como se especifica en la figura.

Figura 36 a Figura 37: La expresión del factor inflamatorio IL-6 a nivel de proteína en comparación con el grupo NC, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con las mezclas de ARN pequeño 24 horas antes, como se especifica en la figura.

Figura 38: La expresión del factor inflamatorio IL-1beta a nivel de ARNm en comparación con el grupo NC, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con las mezclas de ARN pequeño 24 horas antes, como se especifica en la figura.

Figura 39 a Figura 40: La expresión del factor inflamatorio IL-6 a nivel de ARNm en comparación con el grupo NC, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con las mezclas de ARN pequeño 24 horas antes, como se especifica en la figura.

Figura 41: La expresión del factor inflamatorio TNF-alfa a nivel de ARNm en comparación con el grupo NC, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con las mezclas de ARN pequeño 24 horas antes, como se especifica en la figura.

Figura 42: La expresión del factor inflamatorio TNF-alfa a nivel de proteína en comparación con el grupo NC, en el líquido de lavado alveolar del modelo de inflamación animal tras 9 horas de estimulación con LPS, en donde se administró por sonda gástrica a los ratones ARN pequeño, tres días antes.

Figura 43: La expresión del factor inflamatorio IL-6 a nivel de ARNm en comparación con el grupo NC, en las células pulmonares exfoliadas del modelo de inflamación animal tras 9 horas de estimulación con LPS, en donde se administró por sonda gástrica a los ratones ARN pequeño, tres días antes.

Descripción detallada

La presente invención se refiere a un ARN pequeño que tiene la secuencia SEQ ID NO: 20 para su uso en el tratamiento de una enfermedad relacionada con IL-1beta, IL-6 y/o TNF-alfa, según se especifica en la reivindicación 1, en donde la administración del ARN pequeño rescata de la muerte celular causada por una infección con un virus, preferiblemente con H5N1. Generalmente, ARNpi, miARN y otros ARN pequeños no codificantes se denominan indistintamente ARN pequeños (ARNp). A menos que se especifique otra cosa, el término "ARN pequeño (ARNp)" se refiere en el presente documento a los ARN pequeños no codificantes, incluidos el ARNpi y el miARN. "Pequeño" en el término no limita el ARN a un tamaño específico.

Las expresiones "que incluye", "que comprende" y "que contiene" significan que además de los elementos característicos enumerados, puede haber otros elementos característicos adicionales. En particular, también puede consistir únicamente en los elementos característicos enumerados.

El término "sujeto" hace referencia a, por ejemplo, un sujeto que sufra inflamación y/o infección por H5N1 y necesite tratamiento o que presente signos de posible desarrollo de inflamación y/o que sea susceptible a la infección por H5N1 y necesite prevención.

La "identidad" de secuencias se usa en el presente documento para describir la relatividad entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos. Como se emplea en esta memoria, la identidad de secuencia entre dos secuencias de desoxirribonucleótidos se determina utilizando el algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970) implementado en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: European Molecular Biology Open Software Suite, Riceet al.,2000, Trends Genet. 16:276-277) (preferiblemente la versión 5.0.0 o posteriores). Los parámetros utilizados son una penalización por apertura de hueco de 10, una penalización de extensión de huecos de 0,5, y la matriz de sustitución EDNAFULL (versión EMBOSS de NCBI NUC4.4). La salida de la aguja (obtenida con la opción -nobrief) marcada como "la identidad más larga" se utiliza como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:

(desoxirribonucleótidos idénticos x 100)/(longitud de la alineación - número total de huecos en la alineación)

Como se emplea en esta memoria, el término "condiciones estrictas" se refiere a, p. ej., hibridación en 4xSSC a 65 °C, seguido de varios lavados en 0,1xSSC a 65 °C, durante aproximadamente 1 hora. El término "condiciones estrictas de hibridación" utilizado en el presente documento también puede referirse a la hibridación en fosfato de sodio 0,25 M, 7 % de SDS pH 7,2, EDTA 1 mM y 1 % de Bs A a 68 °C durante 16 horas, seguido de dos lavados en 2xSSC y 0,1 % de SDS a 68 °C. Los expertos en la técnica pueden determinar las condiciones rigurosas según la secuencia específica.

El término "tasa de supervivencia celular" también se denomina viabilidad celular. La tasa de supervivencia celular puede calcularse utilizando el kit de detección MTS según las instrucciones del fabricante.

El término "enfermedad relacionada con Il-1 beta, IL-6 y/o TNF-alfa" se refiere a las enfermedades caracterizadas por un aumento del nivel de expresión de IL-1beta, IL-6 o/y TNF-alfa seleccionadas del grupo que consiste en neumonía, miocarditis, gastritis aguda y crónica, enteritis aguda y crónica, hepatitis aguda y crónica, nefritis aguda y crónica, dermatitis, encefalitis, linfadenitis, conjuntivitis, queratitis, iridociclitis, timpanitis, rinitis alérgica, asma, fibrosis pulmonar, dermatitis alérgica, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer de hígado, cáncer de cuello uterino, cáncer de mama, leucemia, diabetes, gota, etc.

Se descubrió que el ARN pequeño que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 20 reduce o regula por disminución el nivel de expresión de IL-1beta, IL-6 y/o TNF-alfain vivooin vitro,rescatando así la muerte celular causada por la infección H5N1 en un sujeto. Las secuencias de ARN pequeño utilizadas en el experimento son las que se muestran en la Tabla 1 a continuación (cualquier ARN pequeño distinto del ARNp de BZL-20 que tiene SEQ ID NO:20 son ejemplos comparativos y no forman parte de la presente invención).

Tabla 1: Las secuencias de ARN pequeño utilizadas en los experimentos, todas sintetizadas comercialmente.

Como se emplea en esta memoria, la concentración del ARN pequeño antes mencionado empleada es de 20 pM. Los ARN pequeños sintéticos pueden usarse para probar su capacidad de inhibir una cualquiera o más de las vías o genes enumerados en la Tabla 3, o usarse para reducir o regular por disminución el nivel de expresión de IL-1 beta, IL-6 o/y TNF-alfain vitrooin vivo,y/o para mejorar la tasa de supervivencia celular y/o para tratar o impedir enfermedades relacionadas con IL-1beta, IL-6 y/o TNF-alfa y/o la infección por H5N1 en un sujeto.

Debe entenderse que los expertos en la técnica pueden preparar una construcción de ácido nucleico que codifique el ARN pequeño de la presente invención, y pueden introducir dicha construcción de ácido nucleico en vectores de expresión adecuados. El vector de expresión que expresa el ARN pequeño de la presente invención puede introducirse directamente en una célula, siempre que el vector de expresión pueda expresarse en la célula. Por ejemplo, véase la patente de EE.UU. US 2017/0342410.

Además, los expertos en la técnica pueden preparar construcciones para expresar ARN pequeño en células, p. ej. construcciones retrovirales, y mediante transfección de la línea celular de empaquetamiento con las construcciones producir también partículas retrovirales recombinantes. Por ejemplo, véase la patente de EE.UU. US 2017/0342410.

Los expertos en la técnica pueden introducir las células que contienen vectores de expresión o construcciones en una célula n. Como alternativa, los expertos en la técnica pueden aislar los ARN pequeños de las células mediante técnicas convencionales. Por lo tanto, la presente invención abarca métodos para expresar ARN pequeños, que incluyen las etapas de cultivo de las células en condiciones adecuadas y la recuperación de ARN pequeños.

El ARN pequeño reivindicado es ARNp de BZL-20 que tiene la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 20. Los inventores descubrieron que el ARNp de BZL-20 tiene un efecto muy favorable en la inhibición de TNF-alfa, IL-1beta o IL-6 o los respectivos ARNm de los mismos. Por lo tanto, los inventores seleccionaron ARNp de BZL-20 como el ARN pequeño básico, y lo combinaron con otros ARN pequeños para preparar las mezclas de ARN pequeños descritas en la Tabla 2.

Tabla 2: Mezclas de ARN pequeño utilizadas en la presente invención (los resultados experimentales se muestran en la Figura 35 a Figura 41)

Las mezclas de ARNpi se preparan mezclando 20 pM de ARNp de BZL-20 y 20 pM de cada uno de los otros ARN pequeños en una proporción de volumen de 2:1. En una realización, la concentración molar de ARNp de BZL-20 y los otros ARN pequeños es de 2:1. En una realización, la concentración molar de ARN pequeño total en la mezcla de ARN pequeño es de 20 pM. En las Figuras, las mezclas se indican con el símbolo MEZCLA.

Enfermedades relacionadas con IL-6

El ARN pequeño ARNp de BZL-20 que tiene SEQ ID NO:20 puede usarse para tratar enfermedades relacionadas con IL-6. Las enfermedades relacionadas con IL-6 incluyen (las enfermedades distintas de las especificadas en la reivindicación 1 son ejemplos comparativos y no forman parte de la presente invención):

enfermedades obstructivas de las vías respiratorias (tracto respiratorio), incluida enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC); asma, tal como asma bronquial, alérgico, endógeno, exógeno y por polvo, especialmente asma crónico o habitual (p. ej., asma avanzado e hiperreactividad de las vías respiratorias); bronquitis; rinitis aguda, alérgica, atrófica y rinitis crónica, incluida rinitis caseosa, rinitis hipertrófica, rinitis purulenta, rinitis sicca y rinitis inducida por fármacos; rinitis membranosa, incluida rinitis crouposa, fibrinosa y pseudomembranosa, y rinitis adenopática; rinitis estacional, incluida rinitis neurológica (fiebre del heno) y rinitis vasomotora, sinusitis, fibrosis pulmonar idiopática (FPI); sarcoidosis, pulmón de granjero y enfermedades afines, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, neumonía por hipersensibilidad, pulmón fibroso y neumonía intersticial idiopática;

artritis reumatoide (ósea y articular), artritis crónica juvenil, enfermedad sistémica de artritis juvenil, espondiloartropatía seronegativa (incluida espondilitis anquilosante, artritis psoriásica y enfermedad de Reiter), enfermedad de Behcet, síndrome de Sjogren y esclerosis sistémica, gota, osteoporosis y osteoartritis;

psoriasis (cutánea), dermatitis atópica, dermatitis de contacto y otras enfermedades cutáneas eccematosas, dermatitis alérgica de contacto, dermatitis seborreica, liquen plano, esclerodermia, pénfigo, penfigoide ampolloso, epidermólisis ampollosa, urticaria, xeroderma (angioderma), vasculitis, eritema, piel hipereosinofílica, uveítis, alopecia areata, conjuntivitis alérgica y conjuntivitis vernal;

(tracto gastrointestinal) úlcera gástrica, enfermedad abdominal, proctitis, gastroenteritis eosinofílica, mastocitosis, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, síndrome antifosfolípido, produciendo efectos lejos de los órganos, tal como la alergia alimentaria de la migraña, rinitis y eczema;

(otros tejidos y enfermedades sistémicas) caquexia, esclerosis múltiple, ateroesclerosis, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), glomerulonefritis proliferativa mesangial, síndrome nefrótico, nefritis, glomerulonefritis, insuficiencia renal aguda, hemodiálisis, uremia, lupus eritematoso local o discoide, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Castleman, tiroiditis de Hashimoto, miastenia grave, diabetes de tipo I, diabetes insulinorresistente de tipo B, anemia de células falciformes, iridociclitis/uveítis/neuritis óptica, síndrome de nefritis, fascitis eosinofílica, síndrome de IgE alta, vasculitis sistémica/granulomatosis de Wegener, orquitis/procedimiento de reversión de la vasectomía, lepra lepromatosa, hepatitis inducida por el alcohol, síndrome de Sezary y púrpura trombocitopénica idiopática; adherencias postoperatorias, nefropatía, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, síndrome de sepsis, sepsis por grampositivos, sepsis por gramnegativos, sepsis con cultivo negativo, sepsis fúngica, fiebre neutropénica, pancreatitis aguda, urosepsis, enfermedad de Grave, enfermedad de Raynaud, citotoxicidad mediada por anticuerpos, hipersensibilidad de tipo III, síndrome POEMS (polineuropatía, megaorganismo, enfermedad endocrina, gammapatía monoclonal y síndrome de alteración cutánea), enfermedad mixta del tejido conjuntivo, enfermedad de Addison idiopática, diabetes, hepatitis activa crónica, cirrosis biliar primaria, vitíligo, síndrome post-IM (cardiotomía), hipersensibilidad de tipo IV, ranuloma causado por organismos intracelulares, enfermedad de Wilson, hemocromatosis, deficiencia de a-I-antitripsina, retinopatía diabética, tiroiditis de Hashimoto, evaluación del eje hipotálamo-hipófisis-suprarrenal, tiroiditis, encefalomielitis, enfermedad pulmonar crónica neonatal, linfohistiocitosis hemofagocítica familiar, pérdida de cabello, radioterapia (incluida, por ejemplo, debilidad, anemia, caquexia, etc.), intoxicación crónica por ácido salicílico, apnea del sueño, obesidad, insuficiencia cardíaca y meningococcalemia;

(rechazo del aloinjerto) rechazo agudo y crónico tras el trasplante de riñón, corazón, hígado, pulmón, páncreas, médula ósea, hueso, intestino delgado, piel, cartílago y córnea; y enfermedad crónica de injerto contra huésped;

(neoplasia maligna) leucemia, leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia aguda, linfocito T, linfocito B o FABALL, leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia linfocítica crónica (LLC), tricoleucemia, síndrome mielodisplásico (SMD), linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma maligno, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple, sarcoma de Kaposi, carcinoma de células renales, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, carcinoma nasofaríngeo, histiocitosis maligna, síndrome asociado a tumores/hipercalcemia maligna, tumor sólido, adenocarcinoma, sarcoma, melanoma maligno, hemangioma, metástasis, resorción ósea relacionada con el cáncer, dolor óseo relacionado con el cáncer; inhibición de la metástasis del cáncer; perfeccionamiento de la caquexia por cáncer;

fibrosis quística, ictus, lesión por reperfusión del corazón, cerebro, miembros periféricos y otros órganos; quemaduras, traumatismo/hemorragia, exposición a radiaciones ionizantes, úlceras cutáneas crónicas;

enfermedades reproductivas (tales como las enfermedades de ovulación, menstruación e implantación, nacimiento prematuro, preeclampsia, endometriosis); (infección) infección bacteriana aguda o crónica, proceso parasitario agudo y crónico o proceso infeccioso, incluyendo bacterias, infección por virus y hongos, Infección por VIH/neuropatía por VIH, meningitis, hepatitis (A, B o C, u otra hepatitis vírica, etc.), artritis séptica, peritonitis, neumonía, epiglotitis, síndrome urémico hemolítico/púrpura trombocitopénica trombótica, malaria, dengue hemorrágico, leishmaniasis, lepra, síndrome de shock tóxico, miositis estreptocócica, gangrena gaseosa, neumonía porMycobacterium tuberculosis, Mycobacterium aviumintracellulare, Pneumocystis carinii,enfermedad inflamatoria pélvica, orquitis/epididimitis,Legionella,enfermedad de Lyme, gripe A, virus de Epstein Barr, síndrome hemofagocítico vital, encefalitis vírica/meningitis aséptica, etc.

El ARNp de BZL-20 puede usarse junto con uno o más de los siguientes:

agonistas o antagonistas de las citocinas o de las funciones de las citocinas (por ejemplo, agentes que actúan sobre las vías de señalización de las citocinas, tales como moduladores del sistema SOCS), por ejemplo a-, p- y/o Y-interferón; factor de crecimiento similar a la insulina de tipo I (IGF-1), sus receptores y proteínas de unión relacionadas; interleucinas (IL), tal como uno o más de IL-1-33, y/o antagonistas o inhibidores de la interleucina, por ejemplo anakinra; inhibidores de los receptores de los miembros de la familia de interleucina o inhibidores de subunidades específicas de estos receptores; inhibidores del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa), por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-TNF (p. ej., infliximab; adalimumab y/o CDP-870), y/o antagonistas de los receptores de TNF, por ejemplo moléculas de inmunoglobulina (por ejemplo etanercept) y/o agentes de bajo peso molecular, por ejemplo pentoxifilina;

moduladores de linfocitos B, por ejemplo anticuerpos monoclonales dirigidos a los linfocitos B (por ejemplo, CD20 (rituximab) o MRA-aIL16R) o a los linfocitos T (por ejemplo, CTLA4-Ig, HuMaxll-15 o Abatacept);

moduladores que inhiben la actividad de los osteoclastos, por ejemplo anticuerpos RANKL;

moduladores de las quimiocinas o de la función de los receptores de quimiocinas, por ejemplo antagonistas de las siguientes quimiocinas: CCR1, CCR2, CCR2A, CCR2B, CCR3, CCR4, CCR5, CC<r>6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10 y CCR11 (en términos de familia C-C); CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4 y CXCR5 y CXCR6 (en términos de la familia C-X-C) y CX3CR1 de la familia C-X3-C;

metaloproteinasas de matriz (MMP), es decir, inhibidores de uno o más de los siguientes: estromelisina, colagenasa, gelatinasa así como aggrecanasa; especialmente colagenasa-1 (MMP-1), colagenasa -2 (MMP-8), colagenasa-3 (MMP-13), estromelisina-1 (MMP-3), estromelisina-2 (MMP-10) y/o estromelisina-3 (MMP-11) y/o MMP-9 y/o MMP-12, por ejemplo doxiciclina y otro(s) agente(s);

inhibidores de la biosíntesis de leucotrienos, inhibidores de la 5-lipoxigenasa (5-LO) o antagonistas de la proteína activada por la 5-lipoxigenasa (FLAP), por ejemplo: zileuton; ABT-761; fenleuton; tepoxalina; Abbott-79175; Abbott-85761; N-(5-sustituido)-tiofeno-2-alquilsulfonamida; 2,6-di-tercbutilfenol hidrazona; metoxitetrahidropirano, por ejemplo Zenica ZD-2138; compuesto SB-210661; compuestos de 2-cianonaftaleno sustituidos por piridilo, por ejemplo L-739,010; compuestos de 2-cianoquinolina, por ejemplo L-746,530; compuestos de indol y/o quinolina, por ejemplo, MK-591, MK-886 y/o BAYx1005;

antagonistas de receptores B4, LTC4, LTD4 y LTE4 de leucotrieno (LT), seleccionados de: fenotiazina-3-1s, por ejemplo L-651,392; compuestos amidínicos, por ejemplo CGS-25019c; aminobenzoxazoles (benzoxalaminas), p. ej., ontazolast; benzamidinas (benzenecarboximi-damidas), p. ej., BIIL284/260; y compuestos por ejemplo zafirlukast, ablukast, montelukast, pranlukast, verlukast (MK-679), RG-12525, Ro-245913, iralukast (CGP45715A) y BAYx7195, etc;

inhibidores de la fosfodiesterasa (PDE), p. ej., metilxantanina, tal como teofilina y/o aminofilina; y/o inhibidores selectivos de la isoenzima PDE, por ejemplo inhibidores de PDE4 y/o inhibidores del isotipo PDE4D, y/o inhibidores de PDE5;

antagonistas de los receptores de histamina de tipo 1, por ejemplo cetirizina, loratadina, desloratadina, fexofenadina, acrivastina, terfenadina, astemizol, azelastina, levocarbastina, clorfeniramina, prometazina, ciclizina y/o mizolastina (generalmente para administración oral, tópica o parenteral);

inhibidores de la bomba de protones (por ejemplo, omeprazol) o antagonistas gastroprotectores de los receptores de histamina de tipo 2;

antagonistas de los receptores de histamina de tipo 4;

agonistas de los receptores adrenérgicos a-1/a-2, vasoconstrictores, agente(s) simpaticomimético(s), p. ej., propilhexedrina, fenilefrina, fenilpropanolamina, efedrina, pseudoefedrina, hidrocloruro de nafazolina, hidrocloruro de oximetazolina, hidrocloruro de tetrahidrozolina, hidrocloruro de xilometazolina, hidrocloruro de tramazolina y hidrocloruro de etil norepinefrina;

anticolinérgicos, por ejemplo antagonistas de los receptores muscarínicos (M1, M2 y M3), por ejemplo atropina, escopolamina, glicopirrolato, bromuro de ipratropio, bromuro de tiotropio, bromuro de oxitropio, pirenzepina y telenzepina;

agonistas de los receptores beta-adrenérgicos (incluidos los subtipos 1 a 4 de los receptores beta), por ejemplo isoprenalina, salbutamol, formoterol, salmeterol, terbutalina, m-hidroxi-isoproterenol, mesilato de bitolterol y/o pirbuterol, por ejemplo, sus enantiómeros quirales;

cromonas, por ejemplo cromoglicato sódico y/o nedocromil sódico;

glucocorticoides, p. ej., flunisolida, acetónido de hidroxiprednisolona, dipropionato de beclometasona, budesonida, propionato de fluticasona, ciclesonida y/o furoato de mometasona;

agentes que modulan los receptores hormonales nucleares, por ejemplo PPAR;

inmunoglobulina (Ig) o productos de Ig o antagonistas o anticuerpos que modulan la función Ig, por ejemplo, anti-IgE (por ejemplo, omalizumab);

otro(s) agente(s) antiinflamatorio(s) sistémico(s) o tópico(s), por ejemplo talidomida o derivados de los mismos, retinoide, antritriol y/o calcipotriol;

combinación de aminosalicilato y sulfapiridina, por ejemplo sulfasalazina, mesalazina, balsalazida y olsalazina; inmunomoduladores, por ejemplo tiopurinas y corticosteroides, por ejemplo budesonida;

agentes antibacterianos, por ejemplo derivados de penicilina, tetraciclinas, macrólidos, beta-lactamas, fluoroquinolonas, metronidazol y/o aminoglucósidos inhalados; y/o agentes antivirales, por ejemplo aciclovir, famciclovir, valciclovir, ganciclovir, cidofovir; amantadina, rimantadina; ribavirina; zanamivir y/u oseltamivir; inhibidores de la proteasa, por ejemplo indinavir, nelfinavir, ritonavir y/o saquinavir; inhibidores nucleósidos de la transcriptasa inversa, por ejemplo didanosina, lamivudina, estavudina, zalcitabina, zidovudina; inhibidores no nucleósidos de la transcriptasa inversa, por ejemplo nevirapina y efavirenz;

agente(s) cardiovascular(es), por ejemplo bloqueantes de canales de calcio, bloqueantes de los receptores beta-adrenérgicos, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ACE), antagonistas de los receptores de angiotensina-2; agentes hipolipemiantes, por ejemplo estatinas y/o fibratos; reguladores de la morfología de las células sanguíneas, por ejemplo pentoxifilina; disolventes de trombos y/o anticoagulantes, por ejemplo inhibidores de la agregación de las células sanguíneas;

agente(s) del SNC, por ejemplo antidepresivos (por ejemplo sertralina), agente(s) antiparkinsoniano(s) (por ejemplo selegilina, levodopa, ropinirol, pramipexol, inhibidores de MAOB, por ejemplo selegina y rasagilina, inhibidores de comP, por ejemplo tolcapona, inhibidores de A-2, inhibidores de la recaptación de dopamina, antagonistas de NMDA, agonistas nicotínicos, agonistas dopaminérgicos y/o inhibidores de la óxido nítrico sintasa neuronal) y agente(s) contra la enfermedad de Alzheimer, por ejemplo donepezilo, rivastigmina, tacrina, inhibidores de COX-2, propentofilina o metrifonato;

agentes para el tratamiento del dolor agudo y crónico, p. ej., analgésicos centrales o periféricos, p. ej., análogos o derivados opiáceos, carbamazepina, fenitoína, valproato sódico, amitriptilina u otros antidepresivos, acetaminofeno o agente(s) antiinflamatorio(s) no esteroideo(s);

anestésicos locales de administración parenteral o tópica (incluidos los inhalados), por ejemplo lignocaína o análogos de la misma;

agentes antiosteoporosis, por ejemplo agente(s) hormonal(es), tal como raloxifeno o bifosfonatos, tal como alendronato;

(i) inhibidor de tripsina; (ii) antagonista del factor activador de las plaquetas (PAF); (iii) inhibidor de la enzima convertidora de interleucina (ICE); (iv) inhibidor de IMPDH; (v) inhibidor de moléculas de adhesión, incluidos los antagonistas de VLA-4; (vi) catepsina; (vii) inhibidores de cinasa, por ejemplo inhibidores de la tirosina cinasa (por ejemplo, ejemplos de inhibidores de Btk, Itk y Jak3MAP pueden incluir gefitinib y mesilato de imatinib), serina/treonina cinasas (por ejemplo, MAP cinasas tal como inhibidores de p38, JNK, proteína cinasa A, B y C e IKK), o cinasas implicadas en la regulación del ciclo celular (por ejemplo, cinasas dependientes de ciclinas); (viii) inhibidores de la glucosa-6 fosfato deshidrogenasa; (ix) antagonistas de los receptores de la bradicinina-B1 y/o B2; (x) agentes antigota, por ejemplo colchicina; (xi) inhibidores de xantina oxidasa, por ejrmplo alopurinol; (xii) agentes uricosúricos, por ejrmplo probenecid, sulfinpirazona y/o benzbromarona; (xiii) secretagogos de la hormona del crecimiento; (xiv) factor de crecimiento transformante (TGFbeta); (xv) factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF); (xvi) factor de crecimiento de fibroblastos, por ejemplo factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF); (xvii) factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF); (xviii) crema de capsaicina; (xix) antagonistas de los receptores taquicinínicos NK1 y/o NK3, por ejemplo, NKP-608C, SB-233412 (talnetant) y/o D-4418; (xx) inhibidores de la elastasa, por ejemplo UT-77 y/o ZD-0892; (xxi) inhibidor de la enzima convertidora de TNF-alfa (TACE); (xxii) inhibidor de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) o (xxiii) moléculas homólogas del receptor quimioatrayente expresado en las células TH2, (por ejemplo, antagonistas de CRTH2); (xxiv) inhibidores de P38; (xxv) agentes que modulan la función de los receptores tipo Toll (TLR) y (xxvi) agentes que regulan la actividad de los receptores purinérgicos, por ejemplo, P2X7; (xxvii) inhibidores de la activación de los factores de transcripción, por ejemplo NFkB, API y/o STATS.

Para tratar enfermedades inflamatorias, ARNp de BZL-20 puede usarse junto con uno o más de los siguientes agentes: por ejemplo, agente(s) antiinflamatorio(s) no esteroideo(s) (en lo sucesivo en el presente documento denominados AINE), incluidos los inhibidores no selectivos de la ciclooxigenasa COX-1/COX-2, independientemente de la administración tópica o sistémica (por ejemplo, piroxicam, diclofenaco, ácidos propiónicos, tal como naproxeno, flurbiprofeno, fenoprofeno, ketoprofeno e ibuprofeno, fenamatos, tal como ácido mefenámico, indometacina, sulindac, azapropazona, pirazolonas, por ejemplo fenilbutazona, salicilatos, por ejemplo aspirina); inhibidores selectivos de la COX-2 (por ejemplo, meloxicam, celecoxib, rofecoxib, valdecoxib, lumarocoxib, parecoxib y etoricoxib); donadores de óxido nítrico inhibidores de la ciclooxigenasa (CINOD); glucocorticoides (ya sea por vía local, oral, intramuscular, intravenosa o intraarticular); metotrexato, leflunomida; hidroxicloroquina, d-penicilamina, auranofina u otros productos de oro parenterales u orales; analgésicos; diacereína; tratamientos intraarticulares, por ejemplo, derivados del ácido hialurónico; y aditivos nutricionales, por ejemplo glucosamina.

ARNp de BZL-20 también puede usarse junto con agentes terapéuticos existentes para el tratamiento del cáncer.

Los agentes adecuados que pueden usarse en combinación incluyen: (i) agente(s) antiproliferativo(s)/antitumoral(es) y combinaciones de los mismos utilizados en oncología médica, por ejemplo gleevec (mesilato de imatinib), agentes alquilantes (por ejemplo, cisplatino, carboplatino, ciclofosfamida, clormetina, melfalán, clorambucilo, busulfán y nitrosourea); antimetabolitos (por ejemplo, antifolatos, tal como fluoropirimidinas, como 5-fluorouracilo y tegafur, raltitrexed, metotrexato, citarabina, hidroxiurea, gemcitabina y paclitaxel; antibióticos antitumorales (por ejemplo, antibióticos de antraciclina, tales como adriamicina, bleomicina, doxorrubicina, daunorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, mitomicina-C, dactinomicina y mitramicina); agentes de división anti-(mitosis) (por ejemplo, vinblastinas, tales como vincristina, vinblastina, vindesina y vinorelbina y taxanos, tales como paclitaxel y taxotere); e inhibidores de la topoisomerasa (por ejemplo, etopósidos, tales como etopósido y tenipósido, amsacrina, topotecán y camptotecina);

(ii) agente(s) citostático(s), por ejemplo antiestrógenos (por ejemplo, tamoxifeno, toremifeno, raloxifeno, droloxifeno y yodoxifeno), reguladores por disminución de los receptores de estrógenos (por ejemplo, fulvestrant), antiandrógenos (por ejemplo, bicalutamida, flutamida, nilutamida y acetato de ciproterona), antagonistas de LHRH o agonistas de LHRH (por ejemplo, goserelina, leuprorelina y buserelina), progestinas (por ejemplo, acetato de megestrol), inhibidores de la aromatasa (por ejemplo, anastrozol, letrozol, vorazol y exemestano) e inhibidores de la 5a-reductasa, por ejemplo finasterida;

(iii) agentes que inhiben la invasión de células cancerosas (p. ej., inhibidores de la metaloproteinasa, tales como marimastat e inhibidores de la función del receptor del activador del plasminógeno urocinasa);

(iv) inhibidores de la función del factor de crecimiento, por ejemplo, anticuerpos del factor de crecimiento, anticuerpos del receptor del factor de crecimiento (por ejemplo, anticuerpo anti-erbb2, trastuzumab y el anticuerpo anti-erbb1 cetuximab [C225]), inhibidores de la farnesil transferasa, inhibidores de la tirosina cinasa e inhibidores de la serina/treonina cinasa, por ejemplo, inhibidores de la familia del factor de crecimiento epidérmico (p. ej., inhibidores de la tirosina cinasa de la familia EGFR, tal como N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metoxi-6-(3-morfolinilpropoxi)quinazolin-4-amina (gefitinib, AZD1839), N-(3-etinil-fenil)-6,7-bis(2-metoxietoxi)quinazolin-4-amina (erlotinib, OSI-774) y 6-propenil-amido-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-(3-morfolinopropoxi)quinazolin-4-amina (CI1033)), por ejemplo, los inhibidores de la familia del factor de crecimiento derivado de las plaquetas y, por ejemplo, los inhibidores de la familia del factor de crecimiento de los hepatocitos;

(v) agentes antiangiogénicos, por ejemplo los agentes que inhiben el efecto del factor de crecimiento endotelial vascular, (por ejemplo, el anticuerpo contra el factor de crecimiento endotelial vascular bevacizumab, los compuestos descritos en las solicitudes de patente internacional WO97/22596, WO97/30035, WO97/32856 y WO98/13354, y compuestos que actúan por otros mecanismos (por ejemplo, linomida, inhibidores de la función de la integrina avbeta3 y angiostatina);

(vi) disruptores vasculares, p. ej., combretastatina A4 y los compuestos descritos en las solicitudes de patente internacional WO99/02166, WO00/40529, WO00/41669, WO01/92224, WO02/04434 y WO02/08213;

(vii) terapia antisentido, por ejemplo, las dirigidas a los objetivos mencionados, tales como ISIS2503 y antisentido anti-ras;

(viii) métodos de terapia génica, que incluyen por ejemplo, sustitución de genes anómalos, tal como p53 anómalo o BRCA1 o BRCA2 anómalo, métodos de GDEPT (terapia enzimática con profármacos dirigida por genes), por ejemplo los métodos que usan citosina desaminasa, timidina cinasa o nitrorreductasa bacteriana, y métodos para aumentar la tolerancia de los pacientes a la quimioterapia o la radioterapia, por ejemplo la terapia génica de resistencia a múltiples fármacos; y

(ix) métodos de inmunoterapia, que incluyen por ejemplo, métodos para aumentar la inmunogenicidad de las células tumorales del paciente, tal como la transfección con citocinas (como la interleucina 2, la interleucina 4 o el factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos) para reducir la no respuesta de los linfocitos T, métodos para usar células inmunitarias transfectadas, por ejemplo, células dendríticas transfectadas con citocinas, métodos para usar líneas celulares tumorales transfectadas con citocinas, y métodos para usar anticuerpos antiidiotípicos.

Enfermedades relacionadas con IL-1beta

IL-1beta desempeña un papel clave en la patología relacionada con diversas enfermedades en las que intervienen elementos inmunitarios e inflamatorios. El ARN pequeño ARNp de BZL-20 que tiene SEQ ID NO: 20 puede usarse para tratar enfermedades relacionadas con IL-1beta. Estas enfermedades incluyen (las enfermedades distintas de las especificadas en la reivindicación 1 son ejemplos comparativos y no forman parte de la presente invención): síndrome de inmunodeficiencia adquirida; enfermedades relacionadas con la inmunodeficiencia adquirida; anemia perniciosa adquirida; síndrome coronario agudo; dolor agudo y crónico (diferentes formas de dolor); inflamación de la polineuropatía idiopática aguda; enfermedades inmunitarias agudas relacionadas con el trasplante de órganos; enfermedades inmunitarias agudas o crónicas relacionadas con el trasplante de órganos; neuropatía polineurótica desmielinizante inflamatoria aguda; isquemia aguda; enfermedad hepática aguda; fiebre reumática aguda; mielitis transversal aguda; enfermedad de Addison; síndrome de distrés respiratorio (agudo) del adulto; enfermedad de Still del adulto; cirrosis inducida por el alcohol; lesiones hepáticas inducidas por el alcohol; enfermedad alérgica; alergia; alopecia; alopecia areata; enfermedad de Alzheimer; reacción alérgica; espondilitis anquilosante; enfermedad pulmonar relacionada con la espondilitis anquilosante; síndrome de anticuerpos antifosfolípidos; anemia aplásica; arteriosclerosis; artropatía; asma; enfermedad aterosclerótica/ arteriosclerosis; ateroesclerosis; alergia atópica; eczema atópico; dermatitis atópica; atrofia hipotiroidismo autoinmunitario; enfermedad ampollosa autoinmunitaria; dermatitis autoinmunitaria; diabetes autoinmunitaria; trastornos autoinmunitarios relacionados con la infección estreptocócica; enteropatía autoinmunitaria; anemia hemolítica autoinmunitaria; hepatitis autoinmunitaria; pérdida de audición autoinmunitaria; síndrome linfoproliferativo autoinmunitario (ALPS); hipo-glucemia autoinmunitaria; miocarditis autoinmunitaria; neutropenia autoinmunitaria; fallo ovárico prematuro autoinmunitario; trombocitopenia autoinmunitaria (TEA); enfermedad tiroidea autoinmunitaria; uveítis autoinmunitaria; bronquiolitis obliterante; enfermedad de Behcet; blefaritis; bronquiectasias; penfigoide ampolloso; caquexia; enfermedad cardiovascular; síndrome antifosfolípido catastrófico; enfermedad celiaca; rigidez de la articulación cervical; chlamydia; coleosatatis; hepatitis activa crónica; neumonía eosinofílica crónica; síndrome de fatiga crónica; enfermedades inmunitarias crónicas relacionadas con el trasplante de órganos; isquemia crónica; enfermedad hepática crónica; candidiasis mucocutánea crónica; penfigoide cicatricial; síndrome de aislamiento clínico con riesgo de esclerosis múltiple (CIS); inmunodeficiencias comunes (hipogammaglobulinemia común variable); enfermedad pulmonar intersticial relacionada con la enfermedad del tejido conjuntivo; conjuntivitis; anemia hemolítica Coombs positiva; psicosis de inicio en la infancia; enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC); enfermedad de Crohn; hepatitis autoinmunitaria criptogénica; alveolitis fibrótica criptogénica; dacriocistitis; depresión; dermatitis esclerodermia; dermatomiositis; dermatomiositis/enfermedad pulmonar relacionada con la polimiositis; retinopatía diabética; diabetes; miocardiopatía dilatada; lupus eritematoso discoide; hernia discal; prolapso discal; coagulación intravascular diseminada; hepatitis inducida por fármacos; enfermedad pulmonar intersticial inducida por fármacos; anemia hemolítica inmunitaria inducida por fármacos; endocarditis; endometriosis; endoftalmitis; sinovitis enteropática; episcleitis; eritema multiforme; eritema multiforme grave; infertilidad femenina; fibrosis; enfermedad pulmonar fibrótica; penfigoide gestacional; arteritis de células gigantes (ACG); glomerulonefritis; bocio hipotiroidismo autoinmunitario (enfermedad de Hashimoto); síndrome de Goodpasture; artritis gotosa; enfermedad de injerto contra huésped (EICH); enfermedad de Grave; infección por estreptococos del grupo B (BGS); síndrome de Guillain-Barré (SGB); enfermedad pulmonar relacionada con la hemosiderinosis; fiebre del heno; insuficiencia cardíaca; anemia hemolítica; púrpura de Henoch-Schonlein; hepatitis B; hepatitis C; síndrome de Hughes; enfermedad de Huntington; hipertiroidismo; hipoparatiroidismo; leucopenia idiopática; trombocitopenia idiopática; enfermedad de Parkinson idiopática; neumonía intersticial idiopática; enfermedad hepática idiocrática; alergias mediadas por IgE; anemia hemolítica inmunitaria; miositis por cuerpos de inclusión; enfermedad infecciosa; enfermedades infecciosas oftálmicas; enfermedad inflamatoria intestinal; enfermedad desmielinizante inflamatoria; enfermedad cardiaca inflamatoria; nefropatía inflamatoria; diabetes insulinodependiente; neumonía intersticial; IPF/UIP; iritis; artritis crónica juvenil; anemia perniciosa juvenil; artritis reumatoide juvenil (ARJ); enfermedad de Kawasaki; queratitis; queratoconjuntivitis seca; enfermedad de Kussmaul o enfermedad de Kussmaul-Meier; parálisis de Landry; histiocitosis de células de Langerhans; enfermedad de IgA lineal; livedo reticularis; artritis de Lyme; enfermedad pulmonar infiltrante linfocítica; degeneración macular; infertilidad idiopática masculina o NOS; tumor maligno; microvasculitis renal; poliangeítis microscópica; enfermedad pulmonar mixta relacionada con la enfermedad del tejido conjuntivo; Morbus Bechterev; enfermedad de la motoneurona; penfigoide mucoso; esclerosis múltiple (todos los subtipos: primaria progresiva, secundaria progresiva, remitente recidivante, etc.); fallo multiorgánico; encefalitis miálgica/enfermedad de Royal Free; miastenia grave; síndrome mielodisplásico; infarto de miocardio; miocarditis; síndrome nefrótico; trastorno de la raíz nerviosa; neuropatía; esteatohepatitis no alcohólica; hepatitis no A, no B; neuritis óptica; rechazo de trasplante de órganos; osteoartritis; osteólisis; cáncer de ovario; insuficiencia ovárica; pancreatitis; enfermedad parasitaria; enfermedad de Parkinson; ARJ pauciarticular; penfigoide; pénfigo foliáceo; pénfigo vulgar; enfermedad oclusiva arterial periférica (EOP); enfermedad vascular periférica (PVD); enfermedad arterial periférica (EAP); uveítis facolítica; flebitis; poliarteritis nodosa (o epiarteritis nodular); policondritis; polimialgia reumática; poliosis; ARJ poliarticular; síndrome de deficiencia poliendocrina; polimiositis; deficiencia poliglandular de tipo I y poliglandular de tipo II; polimialgia reumática (PMR); enfermedad pulmonar intersticial postinfección; enfermedad pulmonar intersticial postinflamatoria; síndrome postbump; fallo ovárico prematuro; cirrosis biliar primaria; edema mucinoso primario; síndrome de Parkinson primario; colangitis esclerosante primaria; hepatitis esclerosante primaria; vasculitis primaria; cáncer de próstata y recto y neoplasias hematopoyéticas (leucemia y linfoma); prostatitis; psoriasis; psoriasis tipo 1; psoriasis tipo 2; artritis psoriásica; artropatía psoriásica; hipertensión pulmonar secundaria a enfermedad del tejido conjuntivo; manifestaciones pulmonares de la poliarteritis nodosa; aplasia pura de glóbulos rojos; insuficiencia suprarrenal primaria; fibrosis por radiación; artritis reactiva; enfermedad de Reiter; neuromielitis óptica recurrente; enfermedad renal NOS; restenosis; artritis reumatoide; enfermedad pulmonar intersticial relacionada con la artritis reumatoide; cardiopatía reumática; SAPHO (sinovitis, acné, pustulosis, hiperostosis y osteítis); sarcoidosis; esquizofrenia; síndrome de Schmidt; esclerodermia; dosis secundaria de amiloide; edema pulmonar fulminante; escleritis; ciática; insuficiencia suprarrenal secundaria; síndrome séptico; artritis séptica; choque séptico; artropatía seronegativa; enfermedad del tejido conjuntivo relacionada con silicona; enfermedad pulmonar relacionada con la enfermedad de Sjogren Síndrome de Sjogren; enfermedad cutánea de Sneddon-Wilkinson; autoinmunidad del esperma; espondiloartropatía; espondilitis anquilopoyética; síndrome de Stevens-Johnson (SJS); enfermedad de Still; ictus; oftalmia simpática; síndrome de respuesta inflamatoria sistémica; lupus eritematoso sistémico; enfermedad pulmonar relacionada con el lupus eritematoso sistémico; esclerodermia sistémica; enfermedad pulmonar intersticial relacionada con la esclerodermia sistémica; enfermedad de Takayasu/arteritis; arteritis temporal; enfermedades mediadas por el tipo Th2 y el tipo Th1; tiroiditis; síndrome de shock tóxico; retinitis por toxoplasma; necrólisis epidérmica toxica; mielitis transversal; TRAPS (síndrome periódico asociado al receptor del factor de necrosis tumoral tipo I (TNFR)); resistencia a la insulina de tipo B con acantosis nigricans; alergia de tipo 1; hepatitis autoinmunitaria de tipo 1 (hepatitis autoinmunitaria tradicional o similar a lupus); hepatitis autoinmunitaria de tipo 2 (hepatitis por anticuerpos anti-LKM); diabetes de tipo II; artropatía por colitis ulcerosa; colitis ulcerosa; urticaria; neumonía intersticial habitual (NIU); uveítis; vasculitis enfermedad pulmonar diseminada; vasculitis; conjuntivitis vernal; retinitis vírica; vitíligo; síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada (síndrome VKH); granulomatosis de Wegener; degeneración macular húmeda; cicatrización de heridas; artropatía asociada a Yersinia y Salmonella.

El ARN pequeño ARNp de BZL-20 puede usarse en combinación con al menos uno de los agentes adicionales que se enumeran a continuación. La combinación también puede incluir más de un agente adicional, por ejemplo, 2 o 3 agentes adicionales.

Las combinaciones ilustrativas incluyen el ARN pequeño ARNp de BZL-20 y los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), por ejemplo ibuprofeno. Otras combinaciones ilustrativas incluyen ARNp de BZL-20 y corticosteroides, incluida la prednisolona. Entre los ejemplos de agentes terapéuticos con los que puede combinarse ARNp de BZL-20 para la artritis reumatoide se incluyen: fármacos antiinflamatorios supresores de citocinas (CSAID); anticuerpos o antagonistas contra otras citocinas o factores de crecimiento humanos, por ejemplo, TNF, LT, IL-1 a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, IL-21, interferón, EMAP-II, GM-CSF, FGF y PDGF. ARNp de BZL-20 puede combinarse con anticuerpos contra moléculas de la superficie celular o ligandos de las mismas, incluido CD154 (gp39 o CD40L); dichas moléculas de la superficie celular son, por ejemplo, CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90 y CTLA.

Los agentes terapéuticos ilustrativos utilizados junto con ARNp de BZL-20 pueden interferir en diferentes puntos de la cascada autoinmunitaria y de la posterior cascada inflamatoria, por ejemplo antagonistas de TNF, tal como anticuerpos contra el TNF quiméricos, humanizados o humanos, D2E7 (número de publicación PCT WO 97/29131), CA2 (REMICADEa), Cd P 571, y receptores solubles de TNF p55 o p75, derivados de los mismos (p75TNFR1gG (ENBRELa) o p55TNFR1gG (Lenercept), e inhibidores de la enzima convertidora de TNF-alfa (TACE), y otros inhibidores de la IL-1 (inhibidores de la enzima convertidora de la interleucina-1, IL-1 RA, etc.). Otros reactivos utilizados junto con ARNp de BZL-20 incluyen interleucina 11, reactivos que actúan en paralelo con la función de la IL-1 a, dependen de la función de la IL-1 a, o son coherentes con la función de la IL-1 a, por ejemplo, antagonistas de la IL-18 (por ejemplo, proteínas de unión a la IL-18, por ejemplo, anticuerpos o receptores solubles de la IL-18, o fragmentos de unión a antígenos de la misma). Los reactivos adicionales utilizados junto con ARNp de BZL-20 incluyen inhibidores anti-CD4 no exhaustivos, antagonistas de la vía coestimuladora CD80 (B7.1) o CD86 (B7.2), incluidos los anticuerpos, receptores solubles, ligandos antagonistas o fragmentos de unión a antígenos de los mismos.

ARNp de BZL-20 también puede combinarse con agentes para el tratamiento de la artritis reumatoide, por ejemplo metotrexato, 6-MP, azatioprina sulfasalazina, mesalazina, olsalazina cloroquinina/hidroxicloroquina, penicilamina, tiomalato sódico de oro (intramuscular y oral), azatioprina, colchicina, corticosteroides (orales, inhalatorios e inyección local), agonistas de los receptores adrenérgicos beta2 (salbutamol, terbutalina y salmeterol), xantina (teofilina y aminofilina), cromoglicatos, nadocromil, ketotifeno, ipratropio y oxitropio, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato mofetilo, leflunomida, AINE, por ejemplo ibuprofeno, corticosteroides, por ejemplo prednisolona, inhibidores de la fosfodiesterasa, agonistas de la adenosina, anticoagulantes, inhibidores del complemento, adrenérgicos, reactivos que interfieren en la señalización a través de citocinas proinflamatorias, por ejemplo TNF-alfa o IL-1 (por ejemplo IRAK, NIK, IKK, p38 e inhibidores de cinasas MAP), inhibidores de la enzima convertidora de IL-1beta, inhibidores de la enzima convertidora de TNF-alfa (TACE), inhibidores de la señalización de linfocitos T, por ejemplo inhibidores de cinasas, inhibidores de la metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurina, inhibidores de la enzima convertidora angiotensina, receptores solubles de citocinas y derivados de los mismos (por ejemplo, receptores solubles de TNF p55 o p75 y derivados p75TNFRIgG (ENBRELTM y p55TNFRIgG (Lenercept)), sIL-1 RI, sIL-1 RII, sIL-6R), citocinas antiinflamatorias (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 y TGFbeta), celecoxib, ácido fólico, sulfato de hidroxicloroquina, profencoxib, etanercept, infliximab, naproxeno, valdecoxib, sulfasalazina, metilprednisolona, meloxicam, acetato de metilprednisolona, tiomalato sódico de oro, aspirina, triamcinolona, dextropropoxifeno naftalenosulfonato/paracetamol, folatos, naproxeno, voltarin, piroxicam, etodolac, diclofenaco sódico, oxaprozina, hidrocloruro de oxicodona, dihidrocodeinona bitartrato/paracetamol, diclofenaco sódico/misoprostol, fentanilo, anakinra, recombinante humano, hidrocloruro de tramadol, salsalato, sulindac, cianocobalamina/fa/ piridoxina, paracetamol, alendronato sódico, prednisolona, sulfato de morfina, hidrocloruro de lidocaína, indometacina, sulfato de glucosamina (glucosamina sulf)/condroitina, hidrocloruro de amitriptilina, sulfadiazina, hidrocloruro de oxicodona/paracetamol, hidrocloruro de olopatidina, misoprostol, metoxi-naftil propionato sódico, omeprazol, ciclofosfamida, rituximab, IL-1 TRAP, MRA, CTLA4-IG, IL-18 BP, anti-IL-18, anti-IL15, BIRB-796, SCIO-469, VX-702, AMG-548, VX-740, roflumilast, IC-485, CDC-801 y mesopram.

Entre los ejemplos de agentes terapéuticos con los que puede combinarse ARNp de BZL-20 para la enfermedad inflamatoria intestinal se incluyen: budesonida; factores de crecimiento epidérmico, corticosteroides, ciclosporina, sulfasalazina, aminosalicilatos, 6-mercapto-purina, azatioprina, metronidazol, inhibidores de la lipoxigenasa, mesalazina, olsalazina, balsalazida, antioxidantes, inhibidores del tromboxano, antagonistas de los receptores de IL-1, anticuerpos monoclonales anti-IL-1beta, anticuerpos monoclonales anti-IL-6, factores de crecimiento, inhibidores de la elastasa, compuestos de piridil-imidazol, anticuerpos o antagonistas contra otras citocinas o factores de crecimiento humanos, por ejemplo TNF, LT, IL-1 beta, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF y Pd Gf . ARNp de BZL-20 puede combinarse con anticuerpos contra moléculas de la superficie celular y ligandos de la misma, dichas moléculas de superficie celular son, por ejemplo, CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69 y CD90. ARNp de BZL-20 también puede combinarse con reactivos como, por ejemplo metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato mofetilo, leflunomida, AINE tales como ibuprofeno, corticosteroides tales como prednisolona, inhibidores de la fosfodiesterasa, agonistas de la adenosina, anticoagulantes, inhibidores del complemento, agente(s) adrenérgico(s), reactivos que interfieren en la señalización a través de citocinas proinflamatorias, por ejemplo TNF-alfa o IL-1 (p. ej., IRAK, NIK, IKK, p38 o inhibidores de cinasas MAP), inhibidores de la enzima convertidora de IL-1beta, inhibidores de la enzima convertidora de TNF-alfa, inhibidores de la señalización de linfocitos T, por ejemplo inhibidores de cinasas, inhibidores de la metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurina, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, receptores solubles de citocinas y derivados de los mismos (p. ej., receptores solubles de TNF p55 o p75, sIL-1 RI, sIL-1 RII, sIL-6R) y citocinas antiinflamatorias (p. ej., IL-4, IL-10, IL-11, IL-13, TGFbeta).

Entre los ejemplos de agentes terapéuticos con los que puede combinarse ARNp de BZL-20 para la enfermedad de Crohn se incluyen: antagonistas de TNF, por ejemplo anticuerpos anti-TNF, D2E7 (número de publicación PCT WO97/29131; HUMIRA®), CA2 (REMICADE®), CDP 571, construcciones de TNFR-Ig, (p75TNFRIgG (ENBREL®) y p55TNFRIgG (Lenercept)) e inhibidores de PDE4. ARNp de BZL-20 puede combinarse con corticosteroides, por ejemplo budesonida y dexametasona. ARNp de BZL-20 también puede combinarse con reactivos, por ejemplo sulfasalazina, ácido 5-aminosalicílico y olsalazina, y reactivos que interfieren con la síntesis o la acción de citocinas proinflamatorias (por ejemplo, IL-1) (por ejemplo, inhibidores de la enzima convertidora de IL-1beta y IL-1RA). Los ARN pequeños también pueden usarse junto con inhibidores de la señalización de linfocitos T, por ejemplo, inhibidor de la tirosina cinasa 6-mercaptopurina. ARNp de BZL-20 puede combinarse con IL-11. ARNp de BZL-20 puede combinarse con los siguientes reactivos: mesalazina, prednisona, azatioprina, mercaptopurina, infliximab, succinato sódico de metilprednisolona, difenoxilato/sulfato de atropina, clorhidrato de loperamida, metotrexato, omeprazol, folatos, inyección de ciprofloxacino/glucosa, dihidrocodeinona bitartrato/paracetamol, hidrocloruro de tetraciclina, fluocinolona, metronidazol, timerosal/ácido bórico, colestiramina/sacarosa, hidrocloruro de ciprofloxacino, sulfato de hiosciamina, hidrocloruro de petidina, hidrocloruro de midazolam, hidrocloruro de oxicodona/paracetamol, hidrocloruro de prometazina, fosfato de sodio, sulfametoxazol/trimetoprima, celecoxib, policarbofilo, napsilato de propoxifeno, hidrocortisona, multivitaminas, balsalazida disódica, fosfato de codeína/paracetamol, hidrocloruro de colesevelam (colesevelam hcl), cianocobalamina, ácido fólico, levofloxacino, metilprednisolona, natalizumab e interferón y.

Entre los ejemplos de agentes terapéuticos con los que puede combinarse ARNp de BZL-20 para la esclerosis múltiple se incluyen: corticosteroides, prednisolona, metilprednisolona, azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina, metotrexato, 4-amino-piridina, tizanidina, interferón-p1a (AVONEX®, Biogen), interferón-p1b (BETA<s>ERO<n>®, Chiron/Berlex), interferón a-n3 (Interferon Sciences/Fujimoto), interferón-a (Alfa Wassermann/J&J), interferón beta1A-IF (Serono/Inhale Therapeutics), interferón pegilado (peginterferón) a2b (Enzon/Schering-Plough), copolímero 1 (Cop-1, COPAXONE®; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.), oxígeno hiperbárico, inmunoglobulina intravenosa, cladribina, anticuerpos, antagonistas o inhibidores contra otras citocinas o factores de crecimiento humanos y receptores de los mismos, por ejemplo, TNF, LT, IL-1beta, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-1A, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF y PDGF. ARNp de BZL-20 puede combinarse con anticuerpos contra moléculas de la superficie celular o ligandos de las mismas, dichas moléculas de superficie celular son, por ejemplo, CD2, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, c D69, CD80, CD86 y CD90. ARNp de BZL-20 también puede combinarse con reactivos, por ejemplo FK506, rapamicina, micofenolato mofetilo, leflunomida, AINE, por ejemplo ibuprofeno, inhibidores de la fosfodiesterasa, agonistas de la adenosina, anticoagulantes, inhibidores del complemento, agente(s) adrenérgico(s), reactivos que interfieren en la señalización a través de citocinas proinflamatorias, por ejemplo TNF-alfa o IL-1 (por ejemplo IRAK, NIK, IKK, p38 o inhibidores de cinasas MAP), inhibidores de la enzima convertidora de IL-1b, inhibidores TACE, inhibidores de la señalización de linfocitos T, por ejemplo inhibidores de cinasas, inhibidores de la metaloproteinasa, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurina, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, receptores solubles de citocinas y derivados de los mismos (por ejemplo, receptores solubles de TNF p55 o p75, sIL-1 RI, sIL-1 RII, sIL-6R), citocinas antiinflamatorias (por ejemplo, IL-4, IL-10, IL-13 y TGFbeta), COPAXONE®, e inhibidores de la caspasa, por ejemplo inhibidores de la caspasa-1.

ARNp de BZL-20 también puede combinarse con reactivos, por ejemplo alemtuzumab, dronabinol, Unimed, daclizumab, mitoxantrona, hidrocloruro de xaliproden, 4-aminopiridina, acetato de glatiramer, natalizumab, sinnabidol, a-inmunocina NNSO3, ABR-215062, AnergiX.MS, antagonistas de los receptores de quimiocinas, BBR-2778, calagualina, CPI-1189, LEM (mitoxantrona encapsulada en liposomas), THC.CBD (agonista cannabinoide), MBP-8298, mesopram (inhibidor de PDE4), MNA-715, anticuerpos contra el receptor de IL-6, neurovax, pirfenidona alltrap 1258 (RDP-1258), sTNF-R1, talampanel, teriflunomida, TGF-beta2, tiplimotida, antagonista de VLA-4 (p. ej., TR-14035, Ultrahaler de VLA4, antegran-ELAN/Biogen), antagonistas de interferón y y agonistas de IL-4.

Entre los ejemplos de agentes terapéuticos con los que puede combinarse ARNp de BZL-20 para el tratamiento o la prevención de la angina de pecho se incluyen: aspirina, nitroglicerina, mononitrato de isosorbida, succinato de metoprolol, atenolol, tartrato de metoprolol, besilato de amlodipino, hidrocloruro de diltiazem, dinitrato de isosorbida, disulfato de clopidogrel, nifedipina, atorvastatina cálcica, cloruro de potasio, furosemida, simvastatina, hidrocloruro de verapamilo, digoxina, hidrocloruro de propranolol, carvedilol, lisinopril, espironolactona, hidroclorotiazida, maleato de enalapril, nadolol, ramipril, enoxaparina sódica, heparina sódica, valsartán, hidrocloruro de sotalol, fenofibrato, ezetimiba, bumetanida, losartán potásico, lisinopril/hidroclorotiazida, felodipina, captopril y fumarato de bisoprolol.

Entre los ejemplos de agentes terapéuticos con los que puede combinarse ARNp de BZL-20 para el tratamiento o la prevención de la espondilitis anquilosante se incluyen: ibuprofeno, voltaren y misoprostol, naproxeno, meloxicam, indometacina, voltaren, celecoxib, lofencoxib, sulfasalazina, metotrexato, azatioprina, minociclina, prednisona, etanercept e infliximab.

Entre los ejemplos de agentes terapéuticos con los que puede combinarse ARNp de BZL-20 para el tratamiento o la prevención del asma se incluyen: salbutamol, salmeterol/fluticasona, montelukast sódico, propionato de fluticasona, budesonida, prednisona, xinafoato de salmeterol, hidrocloruro de levalbuterol, sulfato de salbutamol/ipratropio, fosfato sódico de prednisolona, triamcinolona, dipropionato de beclometasona, bromuro de ipratropio, azitromicina, acetato de pirbuterol, prednisolona, teofilina anhidra, succinato sódico de metilprednisolona, claritromicina, zafirlukast, fumarato de formoterol, vacuna contra el virus de la gripe, metilprednisolona, amoxicilina trihidrato, flunisolida, inyección antialérgica, cromolino sódico, hidrocloruro de fexonadina, flunisolida/mentol, amoxicilina/clavulanato potásico, levofloxacino, dispositivo auxiliar del inhalador, guaifenesina, fosfato sódico de dexametasona, hidrocloruro de moxifloxacino, hidrocloruro de doxiciclina, guaifenesina/metilmorfano, p-efedrina/cod/clorfenir, gatifloxacina, hidrocloruro de cetirizina, furoato de mometasona, xinafoato de salmeterol, benzonatato, cefalexina, dihidrocodeinona/clorfeniramina, hidrocloruro de cetirizina/pseudoefedrina, fenilefrina/prometazina, codeína/prometazina, cef-prozil, dexametasona, guaifenesina/pseudoefedrina, clorfeniramina/dihidrocodeinona, nedocromil sódico, sulfato de terbutalina, epinefrina, metilprednisolona y sulfato de m-hidroxi-isoproterenol.

Entre los ejemplos de agentes terapéuticos con los que puede combinarse ARNp de BZL-20 para el tratamiento o la prevención de la EPOC se incluyen: sulfato de salbutamol/ipratropio, bromuro de ipratropio, salmeterol/fluticasona, salbutamol, xinafoato de salmeterol, propionato de fluticasona, prednisona, teofilina anhidra, succinato sódico de metilprednisolona, montelukast sódico, budesonida, fumarato de formoterol, triamcinolona, levofloxacino, guaifenesina, azitromicina, dipropionato de beclometasona, hidrocloruro de levalbuterol, funisolida, ceftriaxona sódica, amoxicilina trihidrato, gatifloxacina, zafirlukast, amoxicilina/clavulanato potásico, flunisolida/ mentol, clorfeniramina/dihidrocodeinona, sulfato de m-hidroxiisoproterenol, metilprednisolona, furoato de mometasona, p-efedrina/cod/clorfeniramina, acetato de pirbuterol, p-efedrina/loratadina, sulfato de terbutalina, bromuro de tiotropio, (R,R)-formoterol, TgAAT, cilomilast y roflumilast.

Entre los ejemplos de agentes terapéuticos con los que puede combinarse ARNp de BZL-20 para el tratamiento o la prevención del VHC se incluyen: interferón-a-2a, interferón-a-2b, interferón-a con1, interferón-a-n1, interferón-a-2a pegilado, interferón pegilado-a-2b, ribavirina, peginterferón a-2b+ribavirina, ácido ursodesoxicólico, ácido glicirrícico, timalfasina, maxamina, VX-497 y cualquier compuesto utilizado para tratar el VHC interfiriendo con las siguientes dianas: VHC polimerasa, VHC proteasa, VHC helicasa, VHC IRES (sitio interno de entrada del ribosoma).

Entre los ejemplos de agentes terapéuticos con los que puede combinarse ARNp de BZL-20 para el tratamiento o la prevención de la fibrosis pulmonar idiopática se incluyen: prednisona, azatioprina, salbutamol, colchicina, sulfato de salbutamol, digoxina, interferón y, succinato sódico de metilprednisolona (succ sod), lorazepam, furosemida, lisinopril, nitroglicerina, espironolactona, ciclofosfamida, bromuro de ipratropio, actinomicetos D, alteplasa, propionato de fluticasona, levofloxacino, sulfato de m-hidroxi-isoproterenol, sulfato de morfina, hidrocloruro de oxicodona, cloruro de potasio, triamcinolona, tacrolimus anhidro, calcio, interferón-a, metotrexato, micofenolato mofetilo e interferón-Y-1b.

Entre los ejemplos de agentes terapéuticos con los que puede combinarse ARNp de BZL-20 para el tratamiento o la prevención del infarto de miocardio se incluyen: aspirina, nitroglicerina, tartrato de metoprolol, enoxaparina sódica, heparina sódica, bisulfato de clopidogrel, carvedilol, atenolol, sulfato de morfina, succinato de metoprolol, warfarina sódica, lisinopril, mononitrato de isosorbida, digoxina, furosemida, simvastatina, ramipril, tenecteplasa, maleato de enalapril, torsemida, reteplasa, losartán potásico, hidrocloruro de quinapril/mag carb, bumetanida, alteplasa, enalaprilat, hidrocloruro de amiodarona, hidrocloruro de tirofibán monohidratado, hidrocloruro de diltiazem, captoprilo, irbesartán, valsartán, hidrocloruro de propranolol, fosinopril sódico, hidrocloruro de lidocaína, eptifibatida, cefazolina sódica, sulfato de atropina, ácido aminocaproico, espironolactona, interferón, hidrocloruro de sotalol, cloruro de potasio, docusato sódico, hidrocloruro de dobutamina, alprazolam, pravastatina sódica, atorvastatina cálcica, hidrocloruro de midazol, hidrocloruro de petidina, dinitrato de isosorbida, epinefrina, hidrocloruro de dopamina, bivalirudina, rosuvastatina, ezetimiba/ simvastatina, avasimiba y cariporida.

Entre los ejemplos de agentes terapéuticos con los que puede combinarse ARNp de BZL-20 para el tratamiento o la prevención de la psoriasis se incluyen: calcipotrieno, propionato de clobetasol, triamcinolona, proionato de halobatasol, tazoroteno, metotrexato, fluocinolona, dipropionato de betametasona potenciado, acetato de fluocinolona, acitretina, champú de alquitrán, valerato de betametasona, furoato de mometasona, ketoconazol, pramocaína/fluocinolona, valerato de hidrocortisona, fluoxicortisona, urea, betametasona, propionato de clobetasol/emoliente (emoll), propionato de fluticasona, azitromicina, hidrocortisona, fórmula hidratante, ácido fólico, desonida, pimecrolimus, alquitrán de hulla, diacetato de diflorasona, etanercept folato, ácido láctico, 8-metoxipsoraleno, hc/bismuto subgal/znox/resor, acetato de metil-prednisolona, prednisona, protector solar, clofloxasona, ácido salicílico, antralina, clocotrolona, extracto de carbón, alquitrán de hulla/ácido salicílico, alquitrán de hulla/ácido salicílico/azufre, desoximetasona, diazepam, emoliente, fluocinolona/ emoliente, aceite mineral/aceite de ricino/na lact, aceite mineral/aceite de cacahuete, petróleo/miristato de isopropilo, psoraleno, ácido salicílico, saponificado/tribromsalan, timerosal/ácido bórico, celecoxib, infliximab, ciclosporina, alacepril, efalizumab, tacrolimus, pimecrolimus, PUVA, UVB y salicilazosulfapiridina.

Entre los ejemplos de agentes terapéuticos con los que puede combinarse ARNp de BZL-20 para el tratamiento o la prevención de la artritis psoriásica se incluyen: metotrexato, etanercept, lofencoxib, celecoxib, ácido fólico, sulfasalazina, naproxeno, leflunomida, acetato de metilprednisolona, indometacina, sulfato de hidroxicloroquina, prednisona, sulindac, dipropionato de betametasona potenciado, infliximab, metotrexato, folatos, triamcinolona, voltarin, dimetilsulfóxido, piroxicam, diclofenaco sódico, ketoprofeno, meloxicam, metilprednisolona, naproxeno, tolmentina sódica, calcipotriol, ciclosporina, diclofenaco sódico/misoprostol, fluocinolona, sulfato de glucosamina, tiomalato sódico de oro, dihidrocodeinona bitartrato/paracetamol, ibuprofeno, risedronato sódico, sulfadiazina, tioguanina, valdecoxib, alacepril y efalizumab.

Entre los ejemplos de agentes terapéuticos con los que puede combinarse ARNp de BZL-20 para el tratamiento o la prevención de la restenosis se incluyen: sirolimus, paclitaxel, everolimus, tacrolimus, ABT-578 y paracetamol.

Entre los ejemplos de agentes terapéuticos con los que puede combinarse ARNp de BZL-20 para el tratamiento o la prevención de la ciática se incluyen: dihidrocodeinona bitartrato/paracetamol, profencoxib, hidrocloruro de ciclobenzaprina, metilprednisolona, naproxeno, ibuprofeno, hidrocloruro de oxicodona/paracetamol, celecoxib, valdecoxib, acetato de metilprednisolona, prednisona, fosfato de codeína/paracetamol, hidrocloruro de tramadol/paracetamol, metaxalona, meloxicam, metopamol, hidrocloruro de lidocaína, diclofenaco sódico, gabapentina, dexametasona, cariprado, ketorolac trometamina, indometacina, paracetamol, diazepam, naproxeno, hidrocloruro de oxicodona, hidrocloruro de tizanidina, diclofenaco sódico/misoprostol, dextropropoxifeno naftalenosulfonato/paracetamol, asa/oxicod/oxicodona, ibuprofeno/ dihidrocodeinona bit, hidrocloruro de tramadol, ácido etodólico, hidrocloruro de propoxifeno, hidrocloruro de amitriptilina, cariprado/fosfato de codeína/asa, sulfato de morfina, multivitaminas, metoxi-naftil propionato sódico, citrato de orfenadrina y temazepam.

Entre los ejemplos de agentes terapéuticos en los que puede combinarse ARNp de BZL-20 para el tratamiento o la prevención del lupus eritematoso sistémico (LES) se incluyen: AINE, por ejemplo, voltaren, naproxeno, ibuprofeno, piroxicam e indometacina; inhibidores de COX2, por ejemplo, celecoxib, profencoxib y valdecoxib; agente(s) antipalúdico(s), por ejemplo, hidroxicloroquina; esteroides, por ejemplo, prednisona, prednisolona, budesonida y dexametasona; citotoxinas, por ejemplo, azatioprina, ciclofosfamida, micofenolato mofetilo y metotrexato; inhibidores de PDE4 o inhibidores de la síntesis de purinas, por ejemplo CELLCEPT®. ARNp de BZL-20 también puede combinarse con reactivos, por ejemplo sulfasalazina, ácido 5-aminosalicílico, olsalazina, imulan, y reactivos que interfieren en la síntesis, producción o acción de citocinas proinflamatorias (por ejemplo IL-1) (por ejemplo inhibidores de caspasas, tales como inhibidores de la enzima convertidora de IL-1 beta e IL-1ra). ARNp de BZL-20 también puede usarse junto con inhibidores de la señalización de linfocitos T, por ejemplo inhibidores de la tirosina cinasa, o moléculas dirigidas a las moléculas de activación de los linfocitos T, por ejemplo CTLA-4-IgG o anticuerpos de la familia anti-B7 y anticuerpos de la familia anti-PD-1. ARNp de BZL-20 puede combinarse con IL-11 o anticuerpos anticitocinas, por ejemplo fonotolizumab (anticuerpo anti-IFNg), 0 anticuerpos anti-receptores, por ejemplo anticuerpos contra el receptor de IL-6 y anticuerpos contra las moléculas de superficie de linfocitos B. ARNp de BZL-20 puede usarse también junto con los siguientes reactivos: LJP 394 (abetimus), reactivos que agotan o inactivan los linfocitos B, por ejemplo rituximab (anticuerpo anti-CD20), lymphostat-B (anticuerpo anti-BlyS), antagonistas de TNF, por ejemplo, anticuerpos anti-TNF, D2E7 (número de publicación PCT WO 97/29131, HUMIRA®), CA2 (REMICADE®), CDP 571, construcciones de TNFR-Ig (p75TNFRIgG (ENBREL®) y p55TNFRIgG (Lenercept)).

Enfermedades relacionadas con TNF-alfa

Se ha demostrado que TNF-alfa tiene efectos fisiopatológicos en diversas enfermedades humanas, especialmente los trastornos inflamatorios, trastornos inmunitarios y de regulación inmunitaria, infecciones que causan septicemia, shock endotóxico y cardiovascular, enfermedades neurodegenerativas y neoplasias malignas. El ARN pequeño ARNp de BZL-20 que tiene SEQ ID NO:20 puede usarse para tratar las enfermedades enumeradas a continuación (las enfermedades distintas de las especificadas en la reivindicación 1 son ejemplos comparativos y no forman parte de la presente invención).

Inflamación autoinmunitaria o crónica: inflamación crónica general y/o estado autoinmunitario, trastornos inflamatorios inmunomediados generales, enfermedades inflamatorias del SNC, enfermedades inflamatorias que afectan a los ojos, articulaciones, piel, membrana mucosa, sistema nervio central, tracto gastrointestinal, vías urinarias o pulmón, estado general de uveítis, retinitis, HLA-B27+ uveítis, enfermedad de Behcet, síndrome del ojo seco, glaucoma, síndrome de Sjgren, diabetes (incluida la neuropatía diabética), resistencia a la insulina, estado general de artritis, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis reactiva y síndrome de Reiter, artritis juvenil, espondilitis anquilosante, esclerosis múltiple, síndrome de Guillain-Barré, miastenia grave, esclerosis lateral amiotrófica, sarcoidosis, glomerulonefritis, enfermedad renal crónica, cistitis, psoriasis (incluida la artritis psoriásica), hidradenitis supurativa, paniculitis, pioderma gangrenoso, síndrome SAPHO (sinovitis, acné, pustulosis, hiperostosis y osteítis), acné, síndrome de Sweet, pénfigo, enfermedad de Crohn (incluyendo manifestaciones extraintestinales), colitis ulcerosa, asma bronquial, neumonía alérgica, alergias generales, rinitis alérgica, sinusitis alérgica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), fibrosis pulmonar, granulomatosis de Wegener, síndrome de Kawasaki, arteritis de células gigantes, vasculitis de Churg-Strauss, panarteritis nodular, quemaduras, enfermedad de injerto contra huésped, reacción de hospedador contra injerto, rechazo tras un trasplante de órganos o de médula ósea, estado general de vasculitis sistémica o local, lupus eritematoso sistémico y discoide, miositis múltiple y dermatomiositis, esclerodermia, preeclampsia, pancreatitis aguda y crónica, hepatitis vírica y hepatitis alcohólica. inflamación aguda y/o prevención de la inflamación y el dolor postoperatorios o postraumáticos: prevención de la inflamación postoperatoria general, cirugía ocular (por ejemplo, cirugía de cataratas (sustitución del cristalino) o glaucoma), cirugía articular (incluida la cirugía artroscópica), cirugía de estructuras articulares (por ejemplo, ligamentos), cirugía oral y/o dental, procedimientos cardiovasculares intervencionistas mínimos (por ejemplo ACTP, aterectomía, colocación de stents), intervenciones laparoscópicas y/o endoscópicas abdominales y ginecológicas, procedimientos de urología endoscópicos (por ejemplo, cirugía de próstata, ureteroscopia, cistoscopia y cistitis intersticial), inflamación general pre y postoperatoria (prevención). Neuropatía y enfermedades neurodegenerativas: enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, parálisis de Bell y enfermedad de Creutzfeld-Jakob. Cáncer: osteólisis relacionada con el cáncer, inflamación relacionada con el cáncer, dolor relacionado con el cáncer, caquexia relacionada con el cáncer y metástasis óseas. Dolor: formas agudas y crónicas de dolor (independientemente de que estén causadas por los efectos centrales o periféricos de TNF-alfa e independientemente de que se clasifiquen como formas de dolor inflamatorias, nocivas o neuropáticas), ciática, lumbalgia, síndrome del túnel carpiano, síndrome de dolor regional complejo (SDRC), gota, neuralgia postherpética, fibromialgia, estado de dolor local, síndrome de dolor crónico debido a tumor metastásico y dismenorrea. Infección: sepsis bacteriana, vírica o fúngica, tuberculosis, SIDA. Enfermedades cardiovasculares: ateroesclerosis, enfermedad de la arteria coronaria, hipertensión, dislipidemia, insuficiencia cardiaca e insuficiencia cardiaca crónica. En una realización, la enfermedad relacionada con TNF-alfa es la espondiloartropatía, trastornos relacionados con el pulmón, cardiopatía coronaria, trastornos metabólicos, anemia, dolor, trastornos hepáticos, trastornos cutáneos, trastornos de las uñas o vasculitis. En otra realización, la enfermedad relacionada con TNF-alfa es la caquexia relacionada con la edad, enfermedad de Alzheimer, edema cerebral, lesión cerebral inflamatoria, síndrome de fatiga crónica, dermatomiositis, reacción al fármaco, edema intraespinal y/o periférico, fiebre periódica familiar, síndrome de Felty, fibrosis, nefropatía glomerular (por ejemplo, glomerulonefritis tras infección estreptocócica o nefropatía IgA), relajación de la prótesis, poliangeítis microscópica, trastorno mixto del tejido conjuntivo, mieloma múltiple, cáncer y caquexia, trastornos multiorgánicos, síndrome mielodisplásico, orquitismo, osteólisis, pancreatitis, incluida la aguda, crónica y absceso pancreático, polimiositis periodontal, insuficiencia renal progresiva, pseudogota, pioderma gangraenosum, policondritis recurrente, cardiopatía reumática, sarcoidosis, colangitis esclerosa, ictus, reparación de aneurisma aórtico torácico-abdominal (TAAA), síndrome periódico asociado al receptor de TNF (TRAPS) y síndromes relacionados con la vacunación contra la fiebre amarilla, enfermedades inflamatorias asociadas a los oídos, otitis crónica u otitis pediátrica. En otra realización de la presente invención, la enfermedad relacionada con TNF-alfa es la enfermedad de Crohn, artritis juvenil/enfermedad de Still (ARJ), uveítis, ciática, prostatitis, endometrio ectópico, neovascularización coroidea, lupus, síndrome de Sjogren y degeneración macular húmeda.

Entre los ejemplos de agente(s) terapéutico(s) con los que puede usarse ARNp de BZL-20 en combinación se incluyen: fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE); fármacos antiinflamatorios supresores de citocinas (CSAID); CDP-571/BAY-10 -3356 (anti ARN pequeño humanizado; Celltech/Bayer); cA2/infliximab (anti-ARN pequeño quimérico; Centocor); 75kd TNFR-IgG/etanercept (proteína de fusión de receptor de TNF-IgG de 75 kD; Immunex (J Invest. Med. (1996) vol. 44, 235A); 55kd TNF-IgG (proteína de fusión de receptor de TNF-IgG de 55 kD; Hoffmann-LaRoche); IDEC-CE 9.1/SB 210396 (anticuerpo anti-CD4 primatizado no agotado); IDEC/SmithKline; DAB 486-IL-2 y/o DAB 389-IL-2 (proteína de fusión de IL-2; Seragen); Anti-Tac (anti-IL-2Ra humanizado; Protein Design Labs/Roche); IL-4 (citocina antiinflamatoria; DNAX/Schering); IL-10 (SCH 52000; IL-10 recombinante, citocina antiinflamatoria; DNAX/Schering); IL-4; agonistas de IL-10 y/o IL-4 (p. ej., anticuerpos agonistas); IL-1RA (antagonista del receptor de IL-1; Synergen/Amgen); TNF-bp/s-TNF (proteína soluble de unión al t Nf); R973401 (inhibidor de la fosfodiesterasa tipo IV); MK-966 (inhibidor de la COX-2); iloprost; metotrexato; talidomida y agente(s) relacionado(s) con la talidomida (por ejemplo, Celgen); leflunomida (antiinflamatorio e inhibidor de citocinas); ácido tranexámico (inhibidor de la activación del plasminógeno); T-614 (inhibidor de citocinas); prostaglandina El; tenidap (fármaco antiinflamatorio no esteroideo); naproxeno (fármaco antiinflamatorio no esteroideo); mobic (fármaco antiinflamatorio no esteroideo); ibuprofeno (fármaco antiinflamatorio no esteroideo); piroxicam (fármaco antiinflamatorio no esteroideo); diclofenaco sódico (fármaco antiinflamatorio no esteroideo); indometacina (fármaco antiinflamatorio no esteroideo); salicilazosulfapiridina; azatioprina; Inhibidores de ICE (inhibidor de la enzima convertidora de la interleucina-1beta); inhibidores zap-70 y/o de Ick (inhibidor de caseína cinasa zap-70 o Ick); inhibidores del VEGF y/o inhibidores del VEGF-R (factor de crecimiento de las células endoteliales vasculares o receptor del factor de crecimiento de las células endoteliales vasculares; inhibidores de la angiogénesis); agente(s) antiinflamatorio(s) corticosteroide(s) (por ejemplo, SB203580); inhibidores de la enzima convertidora de TNF; anticuerpos anti-IL-12; anticuerpos anti-IL-18; interleucina-11; interleucina-13; inhibidores de interleucina-17; oro; penicilina; cloroquina; hidroxicloroquina; clorambucilo; ciclofosfamida; ciclosporina; método de irradiación total de linfocitos; globulina antitimocítica; anticuerpos anti-CD4; toxina CD5; péptidos y colágeno administrados por vía oral; lobenzarit disódico; agentes reguladores de citocinas (ARC) HP 228 y HP 466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.); oligodesoxinucleótido de fosforotioato antialérgico ICAM-1 (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); receptor soluble del complemento 1 (TP10; T Cell Sciences, Inc.); prednisona; oculina; polisulfato de glicosaminoglicano; minociclina; anticuerpos anti-IL2R; ácidos grasos de pescado y semillas vegetales; auranofina; fenilbutazona; ácido meclofenámico; ácido flufenámico; inmunoglobulina intravenosa; zileuton; ácido micofenólico (RS-61443); tacrolimus (FK-506); sirolimus (rapamicina); amprilose (terafectina); cladribina (2-clorodesoxiadenosina); azuridina; metotrexato; agentes antivirales; e inmunomoduladores. Cualquiera de los agentes mencionados puede combinarse con los ARN pequeños de la presente invención para tratar enfermedades relacionadas con el TNF-a.

ARNp de BZL-20 puede combinarse con uno de los siguientes agentes para tratar la artritis reumatoide: inhibidor de molécula pequeña KDR (ABT-123), inhibidor de molécula pequeña de Tie-2; metotrexato; prednisona; celecoxib; ácido fólico; sulfato de hidroxicloroquina; rofecoxib; etanercept; infliximab; leflunomida; naproxeno; valdecoxib; sulfapiridina; metilhidro-prednisolona; ibuprofeno; meloxicam; acetato de metilprednisolona; tiomalato sódico de oro; aspirina; azatiopurina; acetato de triamcinolona; propoxifeno naftalenosulfonato/ paracetamol; folatos; nabumetona; diclofenaco sódico; piroxicam; etodolac; diclofenaco sódico; oxaprazina; hidrocloruro de oxicodona; ditartrato de hidrocodona/paracetamol; diclofenaco sódico/misoprote; fentanilo; anakinra, recombinante humano; hidrocloruro de tramadol; salsalato; sulindac; vitamina B12/fa/vitamina B6; acetaminofeno; arsendronato sódico; hidroprednisona; sulfato de morfina; hidrocloruro de lidocaína; indometacina; sulfato de glucosamina/condroitina; ciclosporina; hidrocloruro de amitriptilina; sulfadiazina; hidrocloruro de oxicodona/acetaminofeno; hidrocloruro de olopatidina; misoprote; metoxi-naftil propionato sódico; omeprazol; micofenolato mofetilo; ciclofosfamida; rituximab; IL-1 TRAP; MRA; CTLA4-IG; IL-8BP; ABT-874; ABT-324 (anti-IL18); anti-IL15; BIRB-796; SCIO-469; VX-702; AMG-548; VX-740; roflumilast; IC-485; CDC-801; y mesopram. El ARNp de BZL-20 y el fármaco mencionado anteriormente para el tratamiento de la artritis reumatoide también pueden usarse en combinación para el tratamiento de enfermedades relacionadas con TNF-alfa.

ARNp de BZL-20 puede combinarse con uno o varios de los siguientes agentes para tratar enfermedades relacionadas con TNF-alfa en las que la actividad de TNF-alfa es perjudicial: anticuerpo anti-IL12 (ABT874); anticuerpo anti-IL18 (ABT 325); inhibidores de molécula pequeña de LCK; inhibidores de molécula pequeña de COT; anticuerpos anti-III; inhibidores de molécula pequeña de MK2; anticuerpos anti-CD19; inhibidores de molécula pequeña de CXCR3; inhibidores de molécula pequeña de CCR5; inhibidores de molécula pequeña de CCR11; anticuerpos anti-E/L selectina; inhibidores de molécula pequeña de P2X7; inhibidores de molécula pequeña de IRAK-4; agonistas de molécula pequeña del receptor de glucocorticoides; anticuerpos anti-receptor C5a; inhibidores de molécula pequeña del receptor C5a; anticuerpos anti-CD32; y CD32 como proteínas terapéuticas.

ARNp de BZL-20 puede administrarse junto con antibióticos y antiinfecciosos. El término "antibiótico" utilizado en el presente documento se refiere a una sustancia química que inhibe el crecimiento de microorganismos o destruye microorganismos. El término incluye los antibióticos producidos por microorganismos conocidos en la técnica, así como antibióticos sintéticos (por ejemplo, análogos). Los antibióticos incluyen la claritromicina (Biaxin), ciprofloxacino (Cipro) y metronidazol (Flagyl).

ARNp de BZL-20 también puede administrarse junto con otro(s) agente(s) terapéutico(s) para tratar la ciática o el dolor. Entre los ejemplos de agentes que pueden usarse para aliviar o suprimir los síntomas de la ciática o el dolor se incluyen ditartrato de hidrocodona/paracetamol, rofecoxib, hidrocloruro de ciclobenzaprina, metilprednisona, naproxeno, ibuprofeno, hidrocloruro de oxicodona/acetaminofeno, celecoxib, valdecoxib, acetato de metilprednisona, prednisona, fosfato de cocaína/paracetamol, hidrocloruro de tramadol/acetaminofeno, metaxalona, meloxicam, metocarbamol, hidrocloruro de lidocaína, diclofenaco sódico, gabapentina, dexametasona, carlipodor, ketorolac, indometacina, acetaminofeno, diazepam, nabumetona, hidrocloruro de oxicodona, hidrocloruro de tizanidina, diclofenaco sódico/misoprostol, sulfonato de propoxifenaftaleno/paracetamol, una pequeña cantidad de ibuprofeno/hidrocodona; hidrocloruro de tramadol, ácido etodólico; hidrocloruro de propoxifeno, hidrocloruro de amitriptilina, carliprol/fosfato de codeína, sulfato de morfina, multivitaminas, metoxi-naftil propionato sódico, citrato de orfenadrina y temazepam.

ARNp de BZL-20 puede usarse junto con hemodiálisis para tratar enfermedades relacionadas con TNF-alfa.

ARNp de BZL-20 también puede usarse junto con agente(s) utilizado(s) para tratar la enfermedad de Crohn o enfermedades relacionadas con la enfermedad de Crohn. Entre los agentes terapéuticos que pueden usarse para tratar la enfermedad de Crohn se incluye mesalazina, prednisona, azatioprina, mercaptopurina, infliximab, budesonida, salicilazosulfapiridina, metilprednisolona, difenoxilato, hidrocloruro de loperamida, metotrexato, folatos, inyección de ciprofloxacina/glucosa, ditartrato de hidrocodona, hidrocloruro de tetraciclina, acetato de fluocinolona, metronidazol, timerosal/ácido bórico, colestiramina/sacarosa, clorhidrato de ciprofloxacino, sulfato de hiosciamina, hidrocloruro de dolantina, hidrocloruro de midazolam, hidrocloruro de oxicodona/acetaminofeno, hidrocloruro de prometazina, fosfato de sodio, sulfametoxazol/trimetoprima, celecoxib, resina poliacrílica, napsilato de propoxifeno, hidrocortisona, multivitaminas, balsalazida disódica, fosfato de cocaína/paracetamol, clorhidrato de colesevelam, vitamina B12, ácido fólico, levofloxacino, metilprednisolona, natalizumab y Y-interferón.

ARNp de BZL-20 puede administrarse junto con otro(s) agente(s) terapéutico(s) para el tratamiento del asma. Algunos ejemplos de agentes que pueden usarse para reducir o suprimir los síntomas del asma incluyen: salbutamol; salmeterol/fludesona; sodio; propionato de fludexona; budesonida; prednisona; xinafoato de salmeterol; hidrocloruro de levalbuterol; sulfato/ipratropio; fosfato sódico de prednisona; acetónido de triamcinolona; dipropionato de beclometasona; bromuro de ipratropio; azitromicina; acetato de pirbuterol, prednisona, teofilina anhidra, metilprednisolona, claritromicina, zafirlukast, fumarato de formoterol, vacuna contra el virus de la gripe, trihidrato de metilprednisolona, flunisolida, inyección antialérgica, cromolino sódico, hidrocloruro de fexofenadina, flunisolida/mentol, amoxicilina/clavulanato potásico, levofloxacino, dispositivo de ayuda a la inhalación, guaifenesina, fosfato sódico de dexametasona; hidrocloruro de moxifloxacino; hiclato; guaifenesina/dextrometorfano; clorfeniramina; gatifloxacina; hidrocloruro de cetirizina; furoato de mometasona; xinafoato de salmeterol; jarabe para la tos; cefalexina; hidrocodona/clorfeniramina; hidrocloruro de cetirizina/pseudoefedrina; fenilefedrina/prometazina; codeína/prometazina; cefprozil; dexametasona; guaifenesina/pseudoefedrina; clorfeniramina/hidrocodona, nedocromil sódico, sulfato de terbutalina, epinefrina, metilprednisona y sulfato de orciprenalina.

ARNp de BZL-20 puede administrarse junto con otro(s) agente(s) terapéutico(s) utilizado(s) para el tratamiento de EPOC. Algunos ejemplos de agentes que pueden usarse para reducir o suprimir los síntomas de la EPOC incluyen: sulfato de salbutamol/ipratropio; bromuro de ipratropio; salmeterol/fludexona; salbutamol; xinafoato de salmeterol; propionato de fludexona; prednisona; teofilina anhidra; succ. sódico de metilprednisolona; montelukast sódico; budesonida; fumarato de formoterol; acetónido de triamcinolona; levofloxacino; guaifenesina; azitromicina; beclometasona; ácido dipropiónico; hidrocloruro de levalbuterol; flunisolida; sodio; trihidratos; gatifloxacina; zafirlukast; amoxicilina/clavulanato potásico; flunisolida/mentol; clorfeniramina/hicodona; sulfato de orciprenalina; metilprednisolona; furoatos; efedrina/cod/clorfeniramina; hidrocloruro de pirbuterol; efedrina/loratadina; sulfato de terbutalina; bromuro de tiotropio; (R, R)-formoterol; TgAAT; cilomilast y roflumilast.

ARNp de BZL-20 puede administrarse junto con otro(s) agente(s) terapéutico(s) utilizado(s) para el tratamiento de FPI. Algunos ejemplos de agentes que pueden usarse para reducir o suprimir los síntomas de la FPI incluyen: prednisona; azatioprina; salbutanolamina; colchicina; sulfatos; digoxina; Y-interferón; succ. sódico de metilprednisolona; furosemida; lisinopril; nitroglicerina; espironolactona; ciclofosfamida; bromuro de ipratropio; actinomicina d; alteplasa; propionato de fluticasona; levofloxacino; sulfato de oxinalina; sulfato de morfina; hidrocloruro de oxicodona; cloruro de potasio; acetónido de triamcinolona; tacrolimus anhidro; calcio; ainterferón; metotrexato; micofenolato mofetilo.

ARNp de BZL-20 puede administrarse junto con otro(s) agente(s) terapéutico(s) utilizado(s) para el tratamiento la espondiloartropatía. Entre los ejemplos de dicho(s) agente(s) se incluyen: fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), inhibidores de COX 2, incluyendo Celebrex, Vioxx; y Bextra, y etoricoxib. La fisioterapia también se utiliza para tratar la espondiloartropatía, normalmente junto con fármacos antiinflamatorios no esteroideos.

ARNp de BZL-20 puede administrarse junto con otro(s) agente(s) terapéutico(s) utilizado(s) para el tratamiento de espondilitis anquilosante. Algunos ejemplos de agentes que pueden utilizarse para reducir o suprimir los síntomas de la espondilitis anquilosante incluyen: ibuprofeno, diclofenaco y misoprostol, naproxeno, meloxicam, indometacina, diclofenaco, celecoxib, rofecoxib, salicilazosulfapiridina, prednisona, metotrexato, azatioprina, minociclina, prednisona, etanercept e infumab.

ARNp de BZL-20 puede administrarse junto con otro(s) agente(s) terapéutico(s) utilizado(s) para el tratamiento de la artritis psoriásica en pacientes. Algunos ejemplos de agentes que pueden utilizarse para reducir o suprimir los síntomas de la artritis en pacientes con psoriasis incluyen: metotrexato; etanercept; rofecoxib; celecoxib; ácido fólico; salicilazosulfapiridina; naproxeno; leflunomida; acetato de metilprednisolona; indometacina; sulfato de hidroxicloroquina; sulindac; prednisona; betametasona (diprospan); infliximab; metotrexato; ácido fólico; acetónido de triamcinolona; diclofenaco; dimetilsulfóxido; piroxicam; diclofenaco sódico; ketoprofeno; meloxicam; prednisona; metilprednisolona; nabumetona; acetato sódico de tetrabenzoilpirrol; calcipotrieno; ciclosporina; diclofenaco; sodio/ misoprostol; acetato de fluocinolona; sulfato de glucosamina; tiomalato sódico de oro; hidrocodona; ditartrato/paracetamol; ibuprofeno; risedronato sódico; sulfadiazina; tioguanina; valdecoxib; alefacept; y efalizumab.

ARNp de BZL-20 puede administrarse junto con otro(s) agente(s) terapéutico(s) utilizado(s) para el tratamiento de la reestenosis. Algunos ejemplos de agentes que pueden usarse para reducir o inhibir la restenosis incluyen: rapamicina, paclitaxel, everolimus, tacrolimus, a BT-578 y acetaminofeno.

ARNp de BZL-20 puede administrarse junto con otro(s) agente(s) terapéutico(s) utilizado(s) para el tratamiento del infarto de miocardio. Algunos ejemplos de agentes que pueden usarse para reducir o suprimir el infarto de miocardio incluyen: aspirina, nitroglicerina, tartrato de metoprolol, enoxaparina sódica, heparina sódica, hidrosulfato de clopidogrel, carvedilol, atenolol, sulfato de morfina, succinato de metoprolol, warfarina sódica, lisinopril, mononitrato de isosorbida, digoxina, furosemida, simvastatina, ramipril, tenecteplasa, maleato de enalapril, torsemida, reteplasa, losartán potásico, hidrocloruro de quinapril/mag carb, bumetanib, alteplasa, enalaprilat, hidrocloruro de amiodarona, hidrocloruro de tirofibán m-hidrato, hidrocloruro de diltiazem, captoprilo, comprimidos de irbesartán, valsartán, hidrocloruro de propranolol, fosinopril sódico, hidrocloruro de lidocaína, eptifibatida, cefazolina sódica, sulfato de atropina, leucina, espironolactona, interferón, hidrocloruro de sotalol, cloruro de potasio, docusato sódico, hidrocloruro de dobutamina, alprazolam, pravastatina sódica, lipitor, hidrocloruro de midazolam, hidrocloruro de dolantina, dinitrato de isosorbida, epinefrina, hidrocloruro de dopamina, bivalirudina, rosuvastatina, ezetimiba/simvastatina, avasimiba, abciximab y cariporida.

ARNp de BZL-20 puede administrarse junto con otro(s) agente(s) terapéutico(s) utilizado(s) para el tratamiento de la angina de pecho. Algunos ejemplos de agentes que pueden usarse para reducir o suprimir la angina incluyen: aspirina; nitroglicerina; mononitrato de isosorbida; succinato de metoprolol; atenolol; tartrato de metoprolol; sulfonato de alodipina, hidrocloruro de dilitiazem, dinitrato de isosorbida, hidrosulfato de clopidogrel; nifedipina; lipitor; cloruro de potasio; furosemida; simvastatina; hidrocloruro de verapamilo; digoxina; hidrocloruro de propranolol; carvedilol; lisinopril; esprionolactona; dihidroclorotiazida; maleato de enalapril; madolol; ramipril; enoxaparina sódica; heparina sódica; valsartán; hidrocloruro de sotalol; fenofibrato; ezetimiba; bumetanida; losartán potásico lisinopril/hidroclorotiazida; felodipina; captoprilo; y fumarato de bisoprolol.

ARNp de BZL-20 puede administrarse junto con agente(s) utilizado(s) habitualmente para el tratamiento del virus de la hepatitis C. Entre los ejemplos de dicho(s) agente(s) se incluyen: interferón-a-2a, interferón-a-2b, interferón-a conl, interferón-a-nl, interferón-a-2a pegilado, interferón pegilado-a-2b, ribavirina, interferón pegilado-a-2b y ribavirina, ácido andro-desoxicólico, ácido glicirrícico, timalfasina, maxamina y VX-497.

ARNp de BZL-20 puede utilizarse junto con corticosteroides, análogos de la vitamina D y ácido retinoico tópico u oral, o una combinación de los mismos, para el tratamiento de la psoriasis. Además, ARNp de BZL-20 puede usarse junto con uno de los siguientes agentes para el tratamiento de la psoriasis: inhibidor de molécula pequeña de KDR (ABT-123), inhibidor de molécula pequeña de Tie-2, calcipotrieno, propionato de clobetasol, acetónido de triamcinolona, propionato de halobetasol, tazoroteno, metotrexato, acetato de fluocinolona, fluocinolona, acitretina, champú de alquitrán, valerato de betametasona, furoato de mometasona, ketoconazol, pramocaína/fluocinolona, valerato de hidrocortisona, fludrolona, urea, betametasona, propionato de clobetasol/emoll, propionato de fludiasona, azitromicina, hidrocortisona, receta para aumentar la humedad, ácido fólico, desonida, alquitrán de hulla, acetato de diflurazona, etanercept, folatos, ácido láctico, metoxsalina, hc/subgalato de bismuto/znox/resor, acetato de metilprednisolona, prednisona, sustancias de protección solar, ácido salicílico, hascinonida, antranol, pivalato de clocortolona, extractos de carbón, alquitrán de hulla/ácido salicílico, alquitrán de hulla/ácido salicílico/azufre, desoxi-metasona, diazepam, emoliente, pimecrolimus emoliente, acetato de fluocinolona/emoliente, aceite mineral/aceite de ricino/na lact, aceite mineral/aceite de cacahuete, miristato isopropílico de petróleo, psoraleno, ácido salicílico, saponificado/ tribromosalen, timerosal/ácido bórico, celecoxib, infliximab, alefacept, efalizumab, tacrolimus, pimecrolimus, PUVA, UVB y salicilazosulfapiridina.

ARNp de BZL-20 puede administrarse junto con otro(s) agente(s) terapéutico(s) para el tratamiento de enfermedades de la piel. Por ejemplo, ARNp de BZL-20 puede combinarse con la terapia PUVA. PUVA es una combinación de psoraleno (P) y rayos ultravioleta de onda larga, que se utiliza para tratar muchas enfermedades de la piel. ARNp de BZL-20 también puede combinarse con pimecrolimus. ARNp de BZL-20 también puede utilizarse para tratar la psoriasis junto con tacrolimus. Tacrolimus y ARNp de BZL-20 pueden administrarse junto con metotrexato y/o ciclosporina. ARNp de BZL-20 también puede administrarse junto con la terapia con láser excimer estimulado para el tratamiento de la psoriasis.

Entre los ejemplos de otro(s) agente(s) terapéutico(s) con los que puede combinarse el ARNp de BZL-20 para tratar enfermedades de la piel o de las uñas se incluye la fototerapia con rayos UVA y UVB. Otros ejemplos para usar junto con ARNp de BZL-20 incluyen agente(s) terapéutico(s) anti-IL-12 y anti-IL-18, incluidos los anticuerpos.

ARNp de BZL-20 puede administrarse junto con otro(s) agente(s) terapéutico(s) para el tratamiento de la enfermedad de Behcet. El (los) agente(s) terapéutico(s) para el tratamiento de la enfermedad de Behcet incluye(n): prednisona, ciclofosfamida (cytoxan), azatioprina (también se denomina imuran), metotrexato, timetoprima/sulfametoxazol (también conocidos como comprimidos de sulfametoxazol compuesto o TMP-SMZ) y ácido fólico.

La presente invención se ilustra con más detalle a continuación haciendo referencia a los ejemplos. Estas realizaciones son sólo ilustrativas. El alcance de la presente invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplos

Materiales y métodos experimentales

ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima) y RT-qPCR (PCR cuantitativa fluorescente en tiempo real).

Principales instrumentos y equipos experimentales: Placas de cultivo celular de 10 cm, placas de cultivo celular de 12 pocillos, pipeteadores, pipetas, microscopios ópticos.

Principales reactivos experimentales:

Cultivo celular: Medio de cultivo RPMI 1640 (MACGENE, cat. CM10041), suero fetal bovino (GE, cat. SV30160.03) añadido al medio de cultivo al 10 %

Establecimiento del modelo y transfección: ARN pequeños sintetizados artificialmente (bicatenarios, Genepharma) mostrados en la Tabla 1, reactivo de transfección (RNAimax, invitrogen, 17338-150), Opti-MEM (gibco, 31985-070 500 ml), LPS (sigma, cat. L4391-1MG)

ARN: Kit de extracción rápida de ARN total (Shanghai Fastagen Biotech Co., Ltd., n.° de cat. 220011), reactivo TRIZOL (SIGMA, T9424-200 ml), Kit de transcripción inversa (High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, Thermo, 4368813), LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche, 04887352001)

Kit de detección ELISA: (DuoSet Human IL-1beta/IL-6/TNF-alpha, R&D, DY201/DY206/DY210), inhibidor de proteasa (TargetMol, n.° de cat. C0001).

1. Experimento funcional de ARN pequeños sintetizados artificialmente a nivel de proteína verificados mediante el uso del modelo celular THP-1 estimulado por LPS

1.1 Células THP-1 (macrófagos monocíticos, adquiridos desde el Cell Center of the Institute of Basic Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences) se cultivaron en medio de cultivo RPMI 1640 con suero bovino fetal hasta la fase de crecimiento logarítmico. Se distribuyeron en placas de 12 pocillos con 1 ml de medio/pocillo, se incubaron durante la noche a 37 °C para los experimentos posteriores.

1.2 Los grupos del experimento fueron los siguientes: Grupo en blanco, es decir, grupo vacío, se denominan células no tratadas. Este grupo sirvió como control en blanco; Grupo LPS: este grupo fue tratado de la siguiente manera: Se diluyeron 2 gl de RNAimax en 200 gl de Opti-MEM y se añadieron a las células, que fueron estimuladas con LPS. Este grupo sirvió como control negativo; Grupo NC: la secuencia aleatoria sin sentido 5' UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3 (bicatenaria, Genepharma) se añadió a las células con la misma concentración y el mismo método de transfección que la del grupo experimental, y las células se estimularon con LPS. Este grupo sirvió como control negativo.

1.3 Los ARN pequeños sintetizados artificialmente se transfectaron utilizando RNAimax a RNAimax 2 gl/100 gl de Opti-MEM, ARN pequeño (20 gM) 5 gl/100 gl de Opti-MEM. Los líquidos anteriores se mezclaron y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente y se añadieron a las células.

1.4 Se añadió LPS para la estimulación 24 horas después de la transfección, y la concentración final de LPS fue de 1 gg/ml.

1.5 El sobrenadante celular se recogió 9 horas después de la estimulación con LPS, y la concentración del inhibidor de la proteasa añadido fue de 10 gl/ml.

1.6 Las expresiones de los tres factores IL-1beta/IL-6/TNF-alfa se detectaron mediante un kit ELISA.

2. Experimento funcional de ARN pequeños sintetizados artificialmente a nivel de ARNm verificados mediante el uso del modelo celular THP-1 estimulado por LPS

2.1 Células THP-1 (macrófagos monocíticos, adquiridos desde el Cell Center of the Institute of Basic Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences) se cultivaron en medio de cultivo RPMI 1640 con suero bovino fetal hasta la fase de crecimiento logarítmico. Se distribuyeron en placas de 12 pocillos con 1 ml de medio/pocillo, se incubaron durante la noche a 37 °C para los experimentos posteriores.

2.2 Los grupos del experimento fueron los siguientes: Grupo en blanco: grupo vacío, se denominan células no tratadas. Este grupo sirvió como control en blanco; Grupo LPS: en este grupo, se diluyeron 2 gl de RNAimax en 200 gl de Opti-MEM y se añadieron a las células sometidas a estimulación con LPS. Este grupo sirvió como control negativo; Grupo NC: la secuencia aleatoria sin sentido 5' UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3 (Genepharma) se añadió a las células con la misma concentración y el mismo método de transfección que la del grupo experimental, y las células se estimularon con LPS. Este grupo sirvió como control negativo.

2.3 Los ARN pequeños sintetizados artificialmente se transfectaron utilizando RNAimax a RNAimax 2 gl/100 gl de Opti-MEM, ARN pequeño (20 gM) 5 gl/100 gl de Opti-MEM. Los líquidos anteriores se mezclaron y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente y se añadieron a las células.

2.4 Se añadió LPS para la estimulación 24 horas después de la transfección, y la concentración final de LPS fue de 1 gg/ml.

2.5 Nueve horas después de la estimulación con LPS, las células se recogieron por centrifugación a 800 g durante 5 minutos.

2.6 El ARN celular total se extrajo utilizando el kit de extracción rápida de ARN total de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

2.7 Transcripción inversa del ARN en ADNc: La transcripción inversa del ARN pequeño en ADNc se llevó a cabo utilizando un kit de transcripción inversa (High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits, Applied Biosystems, n.° de cat. 4368813) según las instrucciones del fabricante. El sistema de transcripción inversa fue el siguiente: ARN mensajero (150 ng/gl) 10 gl, 10x tampón RT 2,0 gl, 25x mezcla de dNTP (100 mM) 0,8 gl, 10x cebador aleatorio (incluido en el kit) 2,0 gl, MultiScribe™ transcriptasa inversa 1,0 gl, inhibidor de la RNasa 1,0 gl, H2O libre de nucleasas 1,2 gl. Después de la centrifugación transitoria, el sistema se introdujo en el instrumento de PCR para la reacción, y las condiciones de reacción fueron las siguientes: (1) 25 °C, 10 min; (2) 37 °C, 120 min; (3) 85 °C, 5 min; (4) la reacción se detuvo a 4 °C. Después de la reacción, se añadieron 20 gl de dH2O libre de RNasa para completar el volumen final hasta 40 gl.

2.8 Reacción de amplificación por PCR cuantitativa: el volumen total del sistema de reacción de qPCR fue de 10 pl, incluido: 5 pl de 2xSYBR Green Master Mix, 0,5 pl de cebador directo (10 pM), 0,5 pl de cebador inverso (10 pM), 1 pl de ADNc obtenido por transcripción inversa y 3 pl de dhbO libre de RNasa. Se utilizó un instrumento de PCR cuantitativa fluorescente LightCycler 480 y las condiciones de reacción de PCR fueron: pre-desnaturalización durante 5 minutos a 95 °C, a continuación, ciclo de amplificación por PCR: (1) 95 °C, 10 s; (2) 55 °C, 10 s; (3) 72 °C, 20 s; para un total de 40 ciclos; finalmente 40 °C durante 10 s para enfriar. Todos los cebadores directos y cebadores inversos para la reacción de amplificación fueron diseñados y sintetizados por Beijing Tsingke Xinye Biological Technology Co., Ltd. Las secuencias de cebadores utilizadas son las siguientes:

Los cebadores para UBC son:

Has-UBC-Dir CT GG AAGATGGT CGTACCCTG

Has-UBC-lnv GGT CTT GCCAGT GAGT GT CT

Los cebadores para Il-1 beta son:

Has-IL-1 beta-Dir CT CGCCAGT G AAAT GAT GGCT

Has-IL-1 beta-lnv GT CGGAGATTCGTAGCT GGAT

Los cebadores para la IL-6 son:

Has-I L-6-Dir GGTACAT CCTCGACGGCAT CT

Has-IL-6 Inv GTGCCTCTTTGCTGCTTTCAC

Los cebadores para TNF-alfa son:

Has-TNF-alfa Dir CTGCCCCAATCCCTTTATT

Has-TNF-alfa Inv CCCAATTCTCTTTTTGAGCC

2.9 Cálculo de la expresión relativa mediante el método 2-AACt.

3. Detección de viabilidad celular mediante MTS

3.1. Principales instrumentos y equipos experimentales: Placas de cultivo celular de 10 cm, placas de cultivo celular de 96 pocillos, pipeteadores, pipeta, microscopios ópticos, tubos de centrífuga de 1,5 ml, lector de microplacas, kit de detección de MTS (Promega, Celltiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, REF: G3581, LOTE: 0000064219).

3.2. Principales reactivos experimentales: Cultivo celular: Medio de cultivo F12 (Hyclone), FBS (Gibico); Establecimiento del modelo y transfección: ARN pequeño sintetizado artificialmente, RNAimax, opti-MEM, Virus H5N1 (A/Jilin/9/2004); Tasa de supervivencia celular: kit de detección de viabilidad celular mediante MTS. 3.3 La función de los ARN pequeños sintetizados artificialmente derivados de la fitoterapia china para resistir la infección por H5N1 y aliviar la muerte celular se verificó aplicando un modelo celular A549 infectado por la cepa H5N1 derivada de Jilin de 2004 (A/Jilin/9/2004).

3.3.1 Células A549 (células epiteliales de adenocarcinoma de pulmón humano, adquiridas a la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Rockville, MD, EE.UU.) se cultivaron en placas de cultivo celular de 10 cm (cultivadas en medio nutritivo F12 de Ham (HyClone, Logan, UT, EE.UU.), distribuidas en placas de 96 pocillos, 100 pl de medio de cultivo que contiene células por pocillo).

3.3.2 Cuando se observó que las células crecían hasta un 90 % de confluencia (aproximadamente 12 horas) bajo un microscopio óptico, los ARN pequeños de plantas sintetizados artificialmente se transfectaron utilizando un reactivo de transfección, reactivo de transfección 0,2 pl/ml, ARN pequeño 100 nmol/ml.

3.3.3 Las células se infectaron con el virus H5N1 24 horas después de la transfección, y la cantidad de exposición fue de 0,4 M.O.I.

3.3.4 El estado de muerte celular se detectó utilizando el kit MTS 48 horas después de la exposición. Los reactivos relevantes para la detección de MTS se mezclaron a fondo de acuerdo con: medio de cultivo libre de suero: solución A: solución B = 100:20:1. Se aspiró el sobrenadante de las células en las placas de 96 pocillos.

La mezcla del reactivo de detección de MTS se añadió a las placas de 96 pocilios a 100 pl/pocillo y se incubó en una estufa a 37 °C durante 30 min (protegida de la luz) después de la adición.

3.3.5 El estado de supervivencia de las células se detectó utilizando un lector de microplacas: la absorbancia a 492 nm se detectó tres veces por placa, y prevalecerá el resultado de la tercera vez.

4. Experimento funcional de mezclas de ARN pequeños sintetizados artificialmente a nivel de proteína verificadas mediante el uso del modelo celular THP-1 estimulado por LPS

4.1 Células THP-1 (macrófagos monocíticos, adquiridos desde el Cell Center of the Institute of Basic Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences) se cultivaron hasta la fase de crecimiento logarítmico. Se distribuyeron en placas de 12 pocillos con 1 ml de medio/pocillo, se incubaron durante la noche a 37 °C para los experimentos posteriores.

4.2 Los grupos del experimento fueron los siguientes: Grupo en blanco: grupo vacío, se denominan células no tratadas. Este grupo sirvió como control en blanco; Grupo LPS: en este grupo, se diluyeron 2 pl de RNAimax en 200 pl de Opti-MEM y se añadieron a las células sometidas a estimulación con LPS. Este grupo sirvió como control negativo; Grupo NC (nativo): la secuencia aleatoria sin sentido 5' UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3 (bicatenaria, Genepharma) se añadió a las células con la misma concentración y el mismo método de transfección que la del grupo experimental, y las células se estimularon con LPS. Este grupo sirvió como control negativo.

4.3 Las mezclas de ARN pequeños sintetizados artificialmente (Tabla 2) se transfectaron utilizando RNAimax. La proporción de volumen de ARNp de BZL-20 con respecto a otros ARN pequeños fue de 2:1 (las concentraciones iniciales de diversos ARN pequeños fueron todas de 20 pM), RNAimax 2 pl/100 pl de Opti-MEM, mezcla de ARN pequeños (20 pM) 10 pl/100 pl de Opti-MEM. Los líquidos anteriores se mezclaron y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente y se añadieron a las células.

4.4 Se añadió LPS para la estimulación 24 horas después de la transfección, y la concentración final de LPS fue de 1 pg/ml.

4.5 El sobrenadante celular se recogió 9 horas después de la estimulación con LPS, y la concentración del inhibidor de la proteasa añadido fue de 10 pl/ml.

4.6 Las expresiones de los tres factores IL-1beta/IL-6/TNF-alfa se detectaron mediante un kit ELISA.

5. Experimento funcional de mezclas de ARN pequeños sintetizados artificialmente a nivel de ARNm verificadas mediante el uso del modelo celular THP-1 estimulado por LPS

5.1 Células THP-1 (macrófagos monocíticos, adquiridos desde el Cell Center of the Institute of Basic Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences) se cultivaron hasta la fase de crecimiento logarítmico. Se distribuyeron en placas de 12 pocillos con 1 ml de medio/pocillo, se incubaron durante la noche a 37 °C para los experimentos posteriores.

5.2 Los grupos del experimento fueron los siguientes: Grupo en blanco: grupo vacío, se denominan células no tratadas. Este grupo sirvió como control en blanco; Grupo LPS: en este grupo, se diluyeron 2 pl de RNAimax en 200 pl de Opti-MEM y se añadieron a las células sometidas a estimulación con LPS. Este grupo sirvió como control negativo; Grupo NC: la secuencia aleatoria sin sentido 5' UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3 (bicatenaria, Genepharma) se añadió a las células con la misma concentración y el mismo método de transfección que la del grupo experimental, y las células se estimularon con LPS. Este grupo sirvió como control negativo.

5.3 Las mezclas de ARN pequeños sintetizados artificialmente (Tabla 2) se transfectaron utilizando RNAimax. La proporción de volumen de ARNp de BZL-20 con respecto a otros ARN pequeños fue de 2:1, RNAimax 2 pl/100 pl de Opti-MEM, mezcla de ARN pequeños (20 pM) 10 pl/100 pl de Opti-MEM. Los líquidos anteriores se mezclaron y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente y se añadieron a las células.

5.4 Se añadió LPS para la estimulación 24 horas después de la transfección, y la concentración final de LPS fue de 1 pg/ml.

5.5 Nueve horas después de la estimulación con LPS, las células se recogieron por centrifugación a 800 g durante 5 minutos.

5.6 Las células se lisaron con 0,5 ml de reactivo TRI (sigma, T9424-200ML), se centrifugaron a 12.000 rpm, 4 °C durante 5 min y se desechó el precipitado. Se añadió cloroformo a la proporción de 200 pl/ml de TRIzol, se agitó y se mezcló bien y se dejó a temperatura ambiente durante 15 min. La mezcla se centrifugó a 12.000 rpm, 4 °C durante 15 min. La fase acuosa superior se transfirió a otro tubo de centrífuga. La fase acuosa superior se transfirió a otro tubo EP nuevo. Se añadió isopropanol a 0,5 ml/ml de TRIzol, se mezcló bien y se dejó a temperatura ambiente durante 5-10 min. La mezcla se centrifugó a 12.000 rpm, 4 °C durante 10 min. Se desechó el sobrenadante, se añadió 1 ml de etanol al 75 % y se agitó suavemente el tubo de centrífuga para suspender el precipitado. La mezcla se centrifugó a 8000 g, 4 °C durante 5 min. El sobrenadante se desechó al máximo y el tubo se secó a temperatura ambiente durante 5-10 min. La muestra de ARN se disolvió utilizando 20 gl de H2O tratada con DEPC.

5.7 Transcripción inversa del ARN en ADNc: La transcripción inversa del ARN pequeño en ADNc se llevó a cabo utilizando un kit de transcripción inversa (High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits, Applied Biosystems, n.° de cat. 4368813). El sistema de transcripción inversa fue el siguiente: ARN mensajero (150 ng/gl) 10 gl, 10x tampón RT 2,0 gl, 25x mezcla de dNTp (100 mM) 0,8 gl, 10x cebador aleatorio (incluido en el kit) 2,0 gl, MultiScribe™ transcriptasa inversa 1,0 gl, inhibidor de la RNasa 1,0 gl, H2O libre de nucleasas 1,2 gl. Después de la centrifugación transitoria, el sistema se introdujo en el instrumento de PCR para la reacción, y las condiciones de reacción fueron las siguientes: (1) 25 °C, 10 min; (2) 37 °C, 120 min; (3) 85 °C, 5 min; (4) la reacción se detuvo a 4 °C. Después de la reacción, se añadieron 20 gl de dH2O libre de RNasa para completar el volumen final hasta 40 gl.

5.8 Reacción de amplificación por PCR cuantitativa: el volumen total del sistema de reacción de qPCR fue de 10 gl, incluido: 5 gl de 2xSYBR Green Master Mix, 0,5 gl de cebador directo (10 gM), 0,5 gl de cebador inverso (10 gM), 1 gl de ADNc obtenido por transcripción inversa y 3 gl de dH2O libre de RNasa. Se utilizó un instrumento de PCR cuantitativa fluorescente LightCycler 480 y las condiciones de reacción de PCR fueron: pre-desnaturalización durante 5 minutos a 95 °C, a continuación, ciclo de amplificación por PCR: (1) 95 °C, 10 s; (2) 55 °C, 10 s; (3) 72 °C, 20 s; para un total de 40 ciclos; finalmente 40 °C durante 10 s para enfriar. Todos los cebadores directos y cebadores inversos para la reacción de amplificación fueron diseñados y sintetizados por Beijing Tsingke Xinye Biological Technology Co., Ltd. El gen UBC se utilizó como gen de referencia interno. Las secuencias de cebadores utilizadas son las siguientes:

Has-UBC-Dir CTGGAAGATGGTCGTACCCTG

Has-UBC-Inv GGT CTT GCCAGT GAGTGTCT

Has-IL-1beta-Dir CTCGCCAGT GAAAT GAT GGCT

Has-IL-1beta-Inv GTCGGAGATTCGTAGCTGGAT

Has-IL-6-Dir GGT ACATCCT CG ACGGCAT CT

Has-IL-6 Inv GT GCCT CTTT GCT GCTTT C AC

Has-TNF-alfa Dir CTGCCCCAATCCCTTTATT

Has-TNF-alfa Inv CCCAATTCTCI I I I IGAGCC

5.9 Cálculo de la expresión relativa mediante el método 2-AACt.

6. Experimento para verificar el efecto antiinflamatorio de ARNp de BZL-20 in vivo

6.1 Se dividieron en 4 grupos ratones C57 macho de 7 semanas de edad y 20-23 g de peso, uno de los cuales permaneció sin tratar durante todo el experimento, es decir, el grupo en blanco.

6.2 Los ratones recibieron una dosis de 1 nmol/animal de ARN pequeño ARNp de BZL-20 o NC por sonda gástrica durante 3 días, 2 días y 1 día antes, respectivamente, y los grupos fueron grupo ARNp de BZL-20 o NC (grupo nativo), respectivamente.

6.3 Tras anestesia con pentobarbital sódico al 1 % a las 0 h, los ratones fueron inyectados por vía traqueal con una dosis de LPS (1 mg/ml) 50 gl, a 50 gg/animal. Entre ellos, el grupo tratado únicamente con LPS se denominó grupo LPS.

6.4 Nueve horas después de la anestesia con pentobarbital sódico al 1 %, se realizaron 2 lavados alveolares (800 gl), cada vez con 800 gl de PBS pipeteados repetidamente durante 3 veces.

6.5 El líquido de lavado obtenido se centrifugó a 800 g durante 5 min. Las células pulmonares exfoliadas obtenidas se lisaron con 0,5 ml de Trizol (Thermo), se centrifugaron a 12.000 rpm, 4 °C durante 5 min y se desechó el precipitado. Se añadió cloroformo a la proporción de 200 gl/ml de TRIzol, se agitó y se mezcló bien y se dejó a temperatura ambiente durante 15 min. La mezcla se centrifugó a 12.000 rpm, 4 °C durante 15 min. La fase acuosa superior se transfirió a otro tubo de centrífuga. La fase acuosa superior se transfirió a otro tubo EP nuevo. Se añadió isopropanol a 0,5 ml/ml de TRIzol, se mezcló bien y se dejó a temperatura ambiente durante 5-10 min. La mezcla se centrifugó a 12.000 rpm, 4 °C durante 10 min. Se desechó el sobrenadante, se añadió 1 ml de etanol al 75 % y se agitó suavemente el tubo de centrífuga para suspender el precipitado. La mezcla se centrifugó a 8000 g, 4 °C durante 5 min. El sobrenadante se desechó al máximo y el tubo se secó a temperatura ambiente durante 5-10 min. La muestra de ARN se disolvió utilizando 20 pl de H2O tratada con DEPC.

6.6 Transcripción inversa del ARN en ADNc: La transcripción inversa del ARN pequeño en ADNc se llevó a cabo utilizando un kit de transcripción inversa (High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits, Applied Biosystems, n.° de cat. 4368813). El sistema de transcripción inversa fue el siguiente: ARN mensajero (150 ng/pl) 10 pl, 10x tampón RT 2,0 pl, 25x mezcla de dNTP (100 mM) 0,8 pl, 10x cebador aleatorio (incluido en el kit) 2,0 pl, MultiScribe™ transcriptasa inversa 1,0 pl, inhibidor de la RNasa 1,0 pl, H2O libre de nucleasas 1,2 pl. Después de la centrifugación transitoria, el sistema se introdujo en el instrumento de PCR para la reacción, y las condiciones de reacción fueron las siguientes: (1) 25 °C, 10 min; (2) 37 °C, 120 min; (3) 85 °C, 5 min; (4) la reacción se detuvo a 4 °C. Después de la reacción, se añadieron 20 pl de dH2O libre de RNasa para completar el volumen final hasta 40 pl.

6.7 Reacción de amplificación por PCR cuantitativa: el volumen total del sistema de reacción de qPCR fue de 10 pl, incluido: 5 pl de 2xSYBR Green Master Mix, 0,5 pl de cebador directo (10 pM), 0,5 pl de cebador inverso (10 pM), 1 pl de ADNc obtenido por transcripción inversa y 3 pl de dH2O libre de RNasa. Se utilizó un instrumento de PCR cuantitativa fluorescente LightCycler 480 y las condiciones de reacción de PCR fueron: pre-desnaturalización durante 5 minutos a 95 °C, a continuación, ciclo de amplificación por PCR: (1) 95 °C, 10 s; (2) 55 °C, 10 s; (3) 72 °C, 20 s; para un total de 40 ciclos; finalmente 40 °C durante 10 s para enfriar. Todos los cebadores directos y cebadores inversos para la reacción de amplificación fueron diseñados y sintetizados por Beijing Tsingke Xinye Biological Technology Co., Ltd. El gen GAPDH se utilizó como gen de referencia interno. Las secuencias de cebadores utilizadas son las siguientes:

Mus-IL-1beta-DirGTT CCCATTAGACAACT GC

Mus-IL-1beta-InvG ATT CTTT CCTTT GAGGC

Mus-IL-6-DirTAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC

Mus-IL-6-InvTT GGTCCTTAGCCACT CCTTC

Mus-TNF-DirCCTGTAGCCCACGTCGTAG

Mus-TNF-InvGGGAGTAGACAAGGTACAACCC

Mus-GAPDH-DirCACT C ACGGCAAATT C AACGGCAC

Mus-GAPDH-InvGACTCCACGACATACTCAGCAC

6.8 Cálculo de la expresión relativa mediante el método 2-AACt.

6.9 El sobrenadante se centrifugó a 12000 rpm durante 10 min y se eliminaron los residuos celulares. La expresión de los factores se verificó mediante detección con kits ELISA (DuoSet Mouse IL-1beta/IL-6/TNF-alpha, R&D, DY401/DY406/DY410).

7. Secuenciación del transcriptoma de ARN pequeños sintetizados artificialmente verificados mediante el uso del modelo celular THP-1 estimulado por LPS

7.1 Preparación y extracción de ARN para secuenciación

7.1.1 Los grupos del experimento:_Grupo en blanco: grupo vacío, se denominan células no tratadas. Este grupo sirvió como control en blanco;_Grupo LPS: en este grupo, se diluyeron 2 pl de RNAimax en 200 pl de Opti-MEM y se añadieron a las células sometidas a estimulación con LPS. Este grupo sirvió como control negativo;_Grupo NC: la secuencia aleatoria sin sentido 5' UUC UCC GAA<c>G<u>GUC ACG UTT-3 (Genepharma) se añadió a las células con la misma concentración y el mismo método de transfección que la del grupo experimental, y las células se estimularon con LPS. Este grupo sirvió como control negativo.

7.1.2 Los ARN pequeños de plantas sintetizados artificialmente se transfectaron utilizando RNAimax a RNAimax 2 pl/100 pl de Opti-MEM, ARN pequeño (20 pM) 5 pl/100 pl de Opti-MEM. Los líquidos anteriores se mezclaron y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente y se añadieron a las células.

7.1.3 Se añadió LPS para la estimulación 24 horas después de la transfección, y la concentración final de LPS fue de 1 pg/ml.

7.1.4 Nueve horas después de la estimulación con LPS, las células se recogieron por centrifugación a 800 g durante 5 minutos.

7.1.5 Las células se lisaron totalmente usando 0,5 ml de reactivo Trizol (sigma). Se añadieron 100 pl de cloroformo, se mezclaron bien y se centrifugaron a 4 °C, 13200 rpm durante 25 min. Se tomaron 280 pl de sobrenadante y se añadió la misma cantidad de isopropanol, se mezcló bien y se dejó reposar a -40 °C durante 30 min. La mezcla se centrifugó a 4 °C, 13200 rpm durante 25 min. El sobrenadante se desechó y el precipitado se lavó dos veces con etanol al 75 % preparado con agua DEPC. El precipitado se secó y se disolvió con 20 gl de agua DEPC.

7.1.6 La solución de ARN obtenida se envió a la empresa para su secuenciación.

7.2 Análisis de datos

7.2.1 Carga de los datos de secuenciación: Se cargó un total de 194 datos de muestra (incluidos 2 NC) en el servidor bioinformático 222.28.163.113 puerto 222 utilizando el protocolo SSH, usando Xftp (versión Xftp 5.0) como herramienta de transferencia y XShell (versión XShell 5.0) como software de simulación de terminal seguro en plataforma WINDOW10.

7.2.2 Preparación de los datos de la base de datos y cálculo de los datos de secuenciación: La siguiente etapa se llevó a cabo después de cargar los datos. Se descargó la versión hg19 del genoma humano de UCSC y se construyó la biblioteca utilizando bowtie2 (versión bowtie2 2.1.0). Se utilizó como archivo de anotación el que coincidía con hg19 en la base de datos de UCSC. Los fragmentos de 150 pb secuenciados se cotejaron con el archivo del genoma humano del nombre del gen de cada segmento anotado utilizando el script shell para ejecutar Tophat (versión 2.0.11) y cufflink (versión 2.2.1), y se completaron las estadísticas del recuento de expresión de cada gen.

Parámetros de funcionamiento de Tophat: distancia promedio de separación entre cada par de fragmentos secuenciados - r: 150; desviación estándar de la distancia de separación --mate-std-dev: 149; tipo biblioteca (específica de la cadena): fr-secondstrand; número de los hilos - p: 16.

7.2.3 Compendio de los resultados de los datos de secuenciación: Los datos de secuenciación clasificados por Tophat se escribieron en un nuevo texto utilizando el script python (versión 3.6.1).

7.2.4 Estadísticas de genes diferenciales de 194 muestras de resultados de secuenciación: El script de ejecución se escribió usando DEGseq de R (versión 3.3.2). Las expresiones de cada muestra y cada gen se clasificaron y compararon con las expresiones de cada gen en el grupo NC para calcular el MV (múltiplo de variación).

7.2.5 Estadística y agrupación de genes diferencialmente regulados por disminución: Los resultados de la etapa 4 se procesaron seleccionando los genes (en donde el nivel de expresión génica MV estaba regulado por disminución en más de 1,5 veces en cada muestra en comparación con el grupo de control NC). Estos genes se cargaron en la base de datos Metacore para su análisis. Se seleccionaron los parámetros (ignora la primera línea; especies:homo sapiens;tipo: regulación por disminución; valor de p y FDR: sin límite).

7.2.6 Estadística del número de genes diferencialmente regulados por disminución: Las estadísticas de 192 muestras de ARN pequeños se realizaron utilizando el script en python (3.6.1). Los niveles de expresión de los genes regulados por disminución (nivel de regulación por disminución: múltiplo de variación > 1,5) se calcularon, y se obtuvieron los genes que podían regularse por disminución mediante ARN pequeños en 192 muestras.

7.2.7 Tabulación de clasificación de 192 genes diana de ARN pequeños, y las vías o procesos biológicos implicados por los genes diana: Según las vías o procesos biológicos a los que pertenecen los genes regulados por disminución de cada muestra, los datos se dividieron en 6 categorías y se tabularon consultando las bases de datos PUBMED y KEGG, así como los resultados de agrupación de los genes regulados por disminución (criterios: MV > 1,5) para cada muestra de la base de datos Metacore de 192 muestras, como se describe en 7.2.5.

Ejemplo 1: Verificación del efecto de los ARN pequeños en la Tabla 1

Cualquier ARN pequeño distinto del ARNp de BZL-20 que tiene SEQ ID NO:20 son ejemplos comparativos y no forman parte de la presente invención

1. Como se mencionó anteriormente en "Experimento funcional de ARN pequeños sintetizados artificialmente a nivel de proteína verificados mediante el uso del modelo celular THP-1 estimulado por LPS", para el experimento se usaron los ARN pequeños especificados en la Figura 1 a Figura 15.

Figura 1: La expresión del factor inflamatorio IL-1beta a nivel de proteína en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deScutellaria barbata(BZL) 24 horas antes, como se especifica en la figura. Figura 2: La expresión del factor inflamatorio IL-1beta a nivel de proteína en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deBupleurum(CHu) 24 horas antes, como se especifica en la figura. Figura 3: La expresión del factor inflamatorio IL-1beta a nivel de proteína en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deHouttuynia cordata(YXC) 24 horas antes, como se especifica en la figura. Figura 4: La expresión del factor inflamatorio IL-1beta a nivel de proteína en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deAndrographis paniculata(CXL) yTaraxacum(PGY) 24 horas antes, como se especifica en la figura. En la Figura 1 a Figura 4, "*" significa que la prueba de t no apareada P < 0,05 se consideró estadísticamente significativa en el análisis estadístico, indicando el efecto de inhibición de la expresión de factores inflamatorios en experimentosin vitro.Los resultados experimentales mostraron que los ARN pequeños mostrados en la Figura 1 a Figura 4 tenían un efecto significativamente mayor en la reducción de la expresión de proteínas de IL-1beta que el grupo NC. Los valores de la Figura 1 a Figura 4 fueron todos valores obtenidos por normalización en relación con el grupo NC. ARNp de BZL-20 tenía el valor más bajo en ELISA del factor inflamatorio IL-1beta, indicando el mejor efecto en la inhibición del nivel de proteína IL-1beta entre los ARN pequeños sometidos a prueba.

Figura 5: La expresión del factor inflamatorio IL-6 a nivel de proteína en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deScutellaria barbata(BZL) 24 horas antes, como se especifica en la figura. Figura 6: La expresión del factor inflamatorio IL-6 a nivel de proteína en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deBupleurum(CHu) 24 horas antes, como se especifica en la figura. Figura 7: La expresión del factor inflamatorio IL-6 a nivel de proteína en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con ARN pequeño deViola philippica(DDi),Scutellaria baicalensis(HQi),Lonicera japonica(JYH),Fructus forsythiae(LQi) yPrunella vulgaris(XKC) 24 horas antes, como se especifica en la figura. Figura 8 a Figura 9: La expresión del factor inflamatorio IL-6 a nivel de proteína en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deHouttuynia cordata(YXC) 24 horas antes, como se especifica en la figura. Figura 10: La expresión del factor inflamatorio IL-6 a nivel de proteína en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deAndrographis paniculata(CXL) yTaraxacum(PGY) 24 horas antes, como se especifica en la figura. "*" significa que una prueba de t no apareada P < 0,05 se consideró estadísticamente significativa en el análisis estadístico, indicando el efecto de inhibición de la expresión de factores inflamatorios en experimentosin vitro.Los resultados experimentales mostraron que los ARN pequeños mostrados en la Figura 5 a Figura 10 tenían un efecto significativamente mayor en la reducción de la expresión de proteínas de IL-6 que el grupo NC. Los valores de la Figura 5 a Figura 10 fueron todos valores obtenidos por normalización en relación con el grupo NC. ARNp de BZL-20 inhibió muy bien el nivel de proteína IL-6.

Figura 11: La expresión del factor inflamatorio TNF-alfa a nivel de proteína en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con ARN pequeño deScutellaria barbata(BZL),Viola philippica(DDi),Scutellaria baicalensis(HQi),Fructus forsythiae(LQi) yPrunella vulgaris(XKC) 24 horas antes, como se especifica en la figura. Figura 12: La expresión del factor inflamatorio TNF-alfa a nivel de proteína en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deBupleurum(CHu) 24 horas antes, como se especifica en la figura. Figura 13 a Figura 14: La expresión del factor inflamatorio TNF-alfa a nivel de proteína en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deHouttuynia cordata(YXC) 24 horas antes, como se especifica en la figura. Figura 15: La expresión del factor inflamatorio TNF-alfa a nivel de proteína en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deTaraxacum(PGY) 24 horas antes, como se especifica en la figura. "*" significa que una prueba de t no apareada P < 0,05 se consideró estadísticamente significativa en el análisis estadístico, indicando el efecto de inhibición de la expresión de factores inflamatorios en experimentosin vitro. Los resultados experimentales mostraron que los ARN pequeños mostrados en la Figura 11 a Figura 15 tenían un efecto significativamente mayor en la reducción de la expresión de proteínas de TNF-alfa que el grupo NC. Los valores de la Figura 11 a Figura 15 fueron todos valores obtenidos por normalización en relación con el grupo NC. ARNp de BZL-20 tenía el valor más bajo en ELISA del factor inflamatorio TNF-alfa, indicando el mejor efecto en la inhibición del nivel de proteína TNF-alfa entre los ARN pequeños sometidos a prueba.

2. Como se mencionó anteriormente en "Experimento funcional de ARN pequeños sintetizados artificialmente a nivel de ARNm verificados mediante el uso del modelo celular THP-1 estimulado por LPS", para el experimento se usaron los ARN pequeños especificados en la Figura 14 a Figura 33.

Figura 16: La expresión del factor inflamatorio IL-1beta a nivel de ARNm (nivel de expresión relativa de IL-1beta en comparación con UBC) en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deScutellaria barbata(BZL) 24 horas antes, como se especifica en la figura. Figura 17: La expresión del factor inflamatorio IL-1beta a nivel de ARNm en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deBupleurum(CHu),Fructus forsythiae(LQi) yHouttuynia cordata(YXC) 24 horas antes, como se especifica en la figura. Figura 18 a Figura 19: La expresión del factor inflamatorio IL-1beta a nivel de ARNm en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deHouttuynia cordata(YXC) 24 horas antes, como se especifica en la figura. Figura 20: La expresión del factor inflamatorio IL-1 beta a nivel de ARNm en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deTaraxacum(PGY) 24 horas antes, como se especifica en la figura. "*" significa que la prueba de t no apareada P < 0,05 se consideró estadísticamente significativa en el análisis estadístico, indicando el efecto de inhibición de la expresión de factores inflamatorios en experimentosin vitro.Los resultados experimentales mostraron que los ARN pequeños mostrados en la Figura 16 a Figura 20 tenían un efecto significativamente mayor en la reducción de la expresión de ARNm de IL-1beta que el grupo NC. Los valores de la Figura 16 a Figura 20 fueron todos valores obtenidos por normalización en relación con el grupo NC. ARNp de BZL-20 tenía el valor más bajo en qPCR del factor inflamatorio Il-1 beta, indicando el mejor efecto en la inhibición del nivel de ARNm de IL-1 beta entre los ARN pequeños sometidos a prueba.

Figura 21 a Figura 22: La expresión del factor inflamatorio IL-6 a nivel de ARNm en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deScutellaria barbata(BZL) 24 horas antes, como se especifica en la figura. Figura 23 a Figura 24: La expresión del factor inflamatorio IL-6 a nivel de ARNm en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deBupleurum(CHu) 24 horas antes, como se especifica en la figura. Figura 25: La expresión del factor inflamatorio IL-6 a nivel de ARNm en comparación con el grupo de control, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deViola philippica(DDi),Scutellaria baicalensis(HQi),Lonicera japonica(JYH),Fructus forsythiae(LQi) yPrunella vulgaris(XKC) 24 horas antes, como se especifica en la figura. Figura 26 a Figura 27: La expresión del factor inflamatorio IL-6 a nivel de ARNm en comparación con el grupo NC, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP-1 transfectadas con el ARN pequeño deHouttuynia cordata(YXC) 24 horas antes, como se especifica en la figura. Figura 28: La expresión del factor inflamatorio IL-6 a nivel de ARNm en comparación con el grupo NC, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deAndrographis paniculata(CXL) yTaraxacum(PGY) 24 horas antes, como se especifica en la figura. "*" significa que la prueba de t no apareada P < 0,05 se consideró estadísticamente significativa en el análisis estadístico, indicando el efecto de inhibición de la expresión de factores inflamatorios en experimentosin vitro.Los resultados experimentales mostraron que los ARN pequeños mostrados en la Figura 21 a Figura 28 tenían un efecto significativamente mayor en la reducción de la expresión de ARNm de IL-6 que el grupo NC. Los valores de la Figura 21 a Figura 22 fueron todos valores obtenidos por normalización en relación con el grupo NC. ARNp de BZL-20 tenía un valor relativamente bajo en la qPCR del factor inflamatorio IL-6, indicando un efecto relativamente favorable en la inhibición del nivel de ARNm de IL-6 entre los ARN pequeños sometidos a prueba.

Figura 29: La expresión del factor inflamatorio TNF-alfa a nivel de ARNm (nivel de expresión relativa de TNF-alfa en comparación con UBC) en comparación con el grupo NC, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deScutellaria barbata(BZL) y elBupleurum(CHu) 24 horas antes, como se especifica en la figura. Figura 30: La expresión del factor inflamatorio TNF-alfa a nivel de ARNm en comparación con el grupo NC, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deViola philippica(DDi),Lonicera japonica(JYH),Fructus forsythiae(LQi) yPrunella vulgaris(XKC) 24 horas antes, como se especifica en la figura. Figura 31 a Figura 32: La expresión del factor inflamatorio TNF-alfa a nivel de ARNm en comparación con el grupo NC, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deHouttuynia cordata(YXC) 24 horas antes, como se especifica en la figura. Figura 33: La expresión del factor inflamatorio TNF-alfa a nivel de ARNm en comparación con el grupo NC, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con el ARN pequeño deTaraxacum(PGY) 24 horas antes, como se especifica en la figura. "*" significa que la prueba de t no apareada P < 0,05 se consideró estadísticamente significativa en el análisis estadístico, indicando el efecto de inhibición de la expresión de factores inflamatorios en experimentosin vitro.Los resultados experimentales mostraron que los ARN pequeños mostrados en la Figura 29 a Figura 33 tenían un efecto significativamente mayor en la reducción de la expresión de ARNm de TNF-alfa que el grupo NC. Los valores de la Figura 29 a Figura 33 fueron todos valores obtenidos por normalización en relación con el grupo NC. ARNp de BZL-20 tenía el valor más bajo en qPCR del factor inflamatorio TNF-alfa, indicando el mejor efecto en la inhibición del nivel de ARNm de TNF-alfa entre los ARN pequeños sometidos a prueba.

3. La detección de viabilidad celular mediante MTS mencionada anteriormente mediante el uso de los ARNm mostrados en la Figura 34A a Figura 34N

Figura 34A-Figura 34C: BZL: tras la infección por H5N1 (0,4 M.O.I), los resultados de rescate de ARN pequeño deScutellaria barbata(BZL) de la muerte celular, como se especifica en la figura. Figura 34D-Figura 34G: CHu: tras la infección por H5N1 (0,4 M.O.I), los resultados de rescate del ARN pequeño deBupleurum(CHu) de la muerte celular, como se especifica en la figura. Figuras 34H: LQi/XKC: tras la infección por H5N1 (0,4 M.O.I), los resultados de rescate del ARN pequeño deFructus forsythiae(LQi) /Prunella vulgaris(XKC) de la muerte celular, como se especifica en la figura. Figuras 34I: XKC/YXC: tras la infección por H5N1 (0,4 M.O.I), los resultados de rescate del ARN pequeño dePrunella vulgaris(XKC) /Houttuynia cordata(YXC) de la muerte celular, como se especifica en la figura. Figura 34J-Figura 34N: YXC: tras la infección por H5N1 (0,4 M.O.I), los resultados de rescate del ARN pequeño deHouttuynia cordata(YXC) de la muerte celular, como se especifica en la figura. En la Figura 34, la prueba de t no apareada P < 0,05 se consideró estadísticamente significativa en el análisis estadístico, indicando el efecto de rescate sobre la muerte celular causada por la infección por H5N1. "*" representa P < 0,05 en la prueba de t no apareada, y "**" representa P < 0,01 en la prueba de t no apareada. Como se muestra en la Figura 34A-Figura 34N, los ARN pequeños, tal como se especifica en la figura, mejoraron significativamente la tasa de supervivencia celular, mostrando un efecto más evidente de rescate de la muerte celular en comparación con el grupo NC. Los valores de la Figura 34A-Figura 34N fueron todos valores obtenidos por normalización en relación con el grupo NC. Entre ellos, ARNp de BZL-20 fue muy eficaz en el rescate de la muerte celular.

Ejemplo 2: Verificación del efecto de las mezclas que comprenden ARNp de BZL-20 que tiene SEQ ID NO:20 en la Tabla 2

Como se mencionó anteriormente en "Experimento funcional de mezclas de ARN pequeños sintetizados artificialmente a nivel de proteína verificadas mediante el uso del modelo celular THP-1 estimulado por LPS", se verificaron los efectos de las mezclas de la Tabla 2.

Figura 35: La expresión del factor inflamatorio IL-1beta a nivel de proteína en comparación con el grupo NC, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con las mezclas de ARN pequeño 24 horas antes, como se especifica en la figura. La proporción de mezcla de ARNp de BZL-20 con respecto a otros ARN pequeños fue de 2:1 (v/v). "*" significa que la prueba de t no apareada P < 0,05 se consideró estadísticamente significativa en el análisis estadístico, indicando el efecto de inhibición de la expresión de factores inflamatorios en experimentosin vitro.Los resultados experimentales mostraron que las mezclas de ARN pequeños mostradas en la Figura 28 tenían un efecto significativamente mayor en la reducción del nivel de proteína de IL-1beta que el grupo NC, entre las que MEZCLA20, 24, 33, 36 y 42 tenían un efecto significativamente mayor en la reducción del nivel de proteína de IL-1beta que el grupo de ARNp de BZL-20. Los valores de la Figura 35 fueron todos valores obtenidos por normalización en relación con el grupo NC. Para la mezcla en la figura que tenía un efecto comparable en la reducción del nivel de proteína de IL-1beta al del grupo de ARNp de BZL-20, ya que la concentración molar de ARN pequeño ARNp de BZL-20 en la mezcla en el líquido de la célula de prueba era muy inferior a la del grupo de ARNp de BZL-20, esto indicaba que los diversos ARN pequeños de la mezcla también tenían un efecto sinérgico favorable en la reducción del nivel de proteína de IL-1 beta.

Figura 36 a Figura 37: La expresión del factor inflamatorio IL-6 a nivel de proteína en comparación con el grupo NC, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con las mezclas de ARN pequeño 24 horas antes, como se especifica en la figura, en donde la proporción de mezcla de ARNp de BZL-20 con respecto a otros ARN pequeños fue de 2:1 (v/v). "*" significa que la prueba de t no apareada P < 0,05 se consideró estadísticamente significativa en el análisis estadístico, indicando el efecto de inhibición de la expresión de factores inflamatorios en experimentosin vitro.Los resultados mostraron que las mezclas de ARN pequeños mostradas en la Figura 36 a Figura 37 tenían un efecto significativamente mayor en la reducción del nivel de proteína de IL-6 que el grupo NC, entre las cuales las de la Figura 36 (excepto MEZCLA10), y MEZCLA22, 25-28, 30-33 y 37-39 en la Figura 37 tenían un efecto significativamente mayor en la reducción del nivel de proteína de IL-6 que el grupo de ARNp de BZL-20. Los valores de la Figura 36 a Figura 37 fueron todos valores obtenidos por normalización en relación con el grupo NC. La mezcla 10 fue comparable al grupo de ARNp de BZL-20 en la reducción del nivel de proteína de IL-1beta. Ya que la concentración molar de ARN pequeño ARNp de BZL-20 en la mezcla 10 en el líquido de la célula de prueba era muy inferior a la del grupo de ARNp de BZL-20, esto indicaba que los diversos ARN pequeños de la Mezcla 10 también tenían un efecto sinérgico favorable en la reducción del nivel de proteína de IL-6.

Figura 38: La expresión del factor inflamatorio IL-1beta a nivel de ARNm en comparación con el grupo NC, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con las mezclas de ARN pequeño 24 horas antes, como se especifica en la figura. La proporción de mezcla de ARNp de BZL-20 con respecto a otros ARN pequeños fue de 2:1 (v/v). "*" significa que la prueba de t no apareada P < 0,05 se consideró estadísticamente significativa en el análisis estadístico, indicando el efecto de inhibición de la expresión de factores inflamatorios en experimentosin vitro.Los resultados experimentales mostraron que las mezclas de ARN pequeños mostradas en la Figura 38 tenían un efecto significativamente mayor en la reducción del nivel de ARNm de IL-1beta que el grupo NC, entre las que MEZCLA23, 42 y 43 tenían un efecto significativamente mayor en la reducción del nivel de ARNm de IL-1beta que el grupo de ARNp de BZL-20. Los valores de la Figura 38 fueron todos valores obtenidos por normalización en relación con el grupo NC. Para la mezcla que fue comparable al grupo de ARNp de BZL-20 en la reducción del nivel de ARNm de IL-1beta, ya que la concentración molar de ARN pequeño ARNp de BZL-20 en la mezcla en el líquido de la célula de prueba era muy inferior a la del grupo de ARNp de BZL-20, esto indicaba que los diversos ARN pequeños de la mezcla también tienen un efecto sinérgico favorable en la reducción del nivel de ARNm de IL-1beta.

Figura 39 a Figura 40: La expresión del factor inflamatorio IL-6 a nivel de ARNm en comparación con el grupo NC, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con las mezclas de ARN pequeño 24 horas antes, como se especifica en la figura, la proporción de mezcla de ARNp de BZL-20 con respecto a otros ARN pequeños fue de 2:1 (v/v). "*" significa que la prueba de t no apareada P < 0,05 se consideró estadísticamente significativa en el análisis estadístico, indicando el efecto de inhibición de la expresión de factores inflamatorios en experimentosin vitro.Los resultados mostraron que las mezclas de ARN pequeños mostradas en la Figura 31 tenían un efecto significativamente mayor en la reducción del nivel de ARNm de IL-6 que el grupo NC, entre las cuales las de la Figura 39 (excepto MEZCLA10 y 14), y MEZCLA25-27, 30, 31 y 38 en la Figura 40 tenían un efecto significativamente mayor en la reducción del nivel de ARNm de IL-6 que el grupo de ARNp de BZL-20. Los valores de la Figura 39 a Figura 40 fueron todos valores obtenidos por normalización en relación con el grupo NC. Para la mezcla que fue comparable al grupo de ARNp de BZL-20 en la reducción del nivel de ARNm de IL-6, ya que la concentración molar de ARN pequeño ARNp de BZL-20 en la mezcla en el líquido de la célula de prueba era muy inferior a la del grupo de ARNp de BZL-20, esto indicaba que los diversos ARN pequeños de la mezcla tenían un efecto sinérgico favorable en la reducción del nivel de ARNm de IL-6.

Figura 41: La expresión del factor inflamatorio TNF-alfa a nivel de ARNm en comparación con el grupo NC, en el modelo de inflamación celular tras 9 horas de estimulación con LPS, con las células THP1 transfectadas con las mezclas de ARN pequeño 24 horas antes, como se especifica en la figura, la proporción de mezcla de ARNp de BZL-20 con respecto a otros ARN pequeños fue de 2:1 (v/v). "*" significa que la prueba de t no apareada P < 0,05 se consideró estadísticamente significativa en el análisis estadístico, indicando el efecto de inhibición de la expresión de factores inflamatorios en experimentosin vitro.Los resultados experimentales mostraron que las mezclas de ARN pequeños mostradas en la Figura 41 tenían un efecto significativamente mayor en la reducción del nivel de ARNm de TNF-alfa que el grupo NC, entre las que MEZCLA32, 33, 40 y 42 tenían un efecto significativamente mayor en la reducción del nivel de ARNm de TNF-alfa que el grupo de ARNp de BZL-20. Los valores de la Figura 41 fueron todos valores obtenidos por normalización en relación con el grupo NC. Una mezcla muestra un efecto comparable en la reducción del nivel de ARNm de TNF-alfa al del grupo de ARNp de BZL-20. Ya que la concentración molar de ARN pequeño ARNp de BZL-20 en la mezcla en el líquido de la célula de prueba era muy inferior a la del grupo de ARNp de BZL-20, esto indicaba que los diversos ARN pequeños de la mezcla también tenían un efecto sinérgico favorable en la reducción del nivel de ARNm de TNF-alfa.

Ejemplo 3: El efecto in vivo de ARNp de BZL-20

El experimento se realizó como se ha mencionado anteriormente en "Experimento para verificar el efecto antiinflamatorio de ARNp de BZL-20 in vivo".

Figura 42: La expresión del factor inflamatorio TNF-alfa a nivel de proteína en comparación con el grupo NC, en el líquido de lavado alveolar del modelo de inflamación animal tras 9 horas de estimulación con LPS, en donde se administró por sonda gástrica a los ratones ARN pequeño, tres días antes. "*" significa que la prueba de t no apareada P < 0,05 se consideró estadísticamente significativa en el análisis estadístico, indicando que ARNp de BZL-20 tenía el efecto de inhibir la expresión del factor inflamatorio TNF-alfa en experimentosin vivo.

Figura 43: La expresión del factor inflamatorio IL-6 a nivel de ARNm en comparación con el grupo NC, en las células pulmonares exfoliadas del modelo de inflamación animal tras 9 horas de estimulación con LPS, en donde se administró por sonda gástrica a los ratones ARN pequeño, tres días antes. "**" significa que la prueba de t no apareada P < 0,01 se consideró estadísticamente significativa en el análisis estadístico, indicando el efecto de inhibición de la expresión del factor inflamatorio IL-6 en experimentosin vivo.

Ejemplo 4: Clasificación de genes diana regulados por disminución mediante el ARN pequeño ARNp de BZL-20 que tiene SEQ ID NO:20 y las vías o procesos biológicos en los que participan, según los resultados de la secuenciación del transcriptoma de ARN pequeños sintetizados artificialmente verificados mediante el uso de modelo celular THP-1 estimulado por LPS

Cualquier ARN pequeño distinto del ARNp de BZL-20 que tiene SEQ ID NO:20 son ejemplos comparativos y no forman parte de la presente invención.

La tabulación de clasificación de 192 genes diana de ARN pequeño y las vías o procesos biológicos en los que participaban se realizó como se ha mencionado anteriormente.

Tabla 3: Tabla de clasificación de genes diana de ARN pequeño y las vías o procesos biológicos en los que intervienen, obtenidos mediante el cálculo de la secuenciación del transcriptoma de 192 ARN pequeños seleccionados de la Tabla 1. Esta tabla muestra que los factores inflamatorios y/o la infección por H5N1 fueron inhibidos por ARN pequeños mediante: el mecanismo de acción, dianas de acción y vías de acción de las vías de señalización relacionadas con quimiocinas, transducción de señales JAK/STAT, metabolismo de aminoácidos, activación y función del ARNm, metabolismo de coenzimas, ARN nucleolar pequeño, etc., sugiriendo que diferentes ARN pequeños tenían la posibilidad de efectos sinérgicos en vías de señalización y genes diana relacionados.

Los genes de la tabla siguiente corresponden a las vías de las filas correspondientes de la tabla anterior.

ARNp de ARNp de ARNp de ARNp de ARNp de ARNp de ARNp de ARNp de ARNp de ARNp de YXC-64 YXC-65 YXC-68 YXC-69 YXC-71 YXC-72 YXC-73 YXC-74 YXC-75 YXC-76

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un ARN pequeño para su uso en el tratamiento de una enfermedad relacionada con IL-1beta, IL-6 y/o TNF-alfa,

en donde el ARN pequeño tiene una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 20;

en donde la administración del ARN pequeño rescata de la muerte celular causada por una infección con un virus; y

en donde la enfermedad relacionada con IL-1beta, IL-6 y/o TNF-alfa se selecciona del grupo que consiste en neumonía, miocarditis, gastritis aguda y crónica, enteritis aguda y crónica, hepatitis aguda y crónica, nefritis aguda y crónica, dermatitis, encefalitis, linfadenitis, conjuntivitis, queratitis, iridociclitis, timpanitis, rinitis alérgica, asma, fibrosis pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, dermatitis alérgica, enfermedad de células falciformes, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, nefritis lúpica, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de cuello uterino, cáncer de mama, leucemia, mieloma múltiple, diabetes y gota.

2. El ARN pequeño para el uso según la reivindicación 1, en donde el virus es un virus de la gripe aviar, y preferiblemente es H5N1.

3. El ARN pequeño para el uso según la reivindicación 1 o 2, en donde el ARN pequeño está en una forma bicatenaria o monocatenaria o en una forma híbrida bicatenaria o monocatenaria.

4. Una construcción de ácido nucleico que codifica el ARN pequeño según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, preferiblemente en donde la construcción es una construcción viral, y en particular preferiblemente una construcción retroviral.

5. Un virus recombinante que comprende la construcción de ácido nucleico según la reivindicación 4, preferiblemente en donde el virus recombinante es un retrovirus.

6. Un vector de expresión que comprende la construcción de ácido nucleico según la reivindicación 4.

7. Una célula, que comprende la construcción de ácido nucleico según la reivindicación 4, o transfectada con el virus recombinante según la reivindicación 5, o que comprende el vector de expresión según la reivindicación 6.

8. Un método para expresar el ARN pequeño como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende: cultivar la célula según la reivindicación 7 en condiciones adecuadas y recuperar el ARN pequeño.

9. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad relacionada con IL-1beta, IL-6 y/o TNF-alfa como se ha definido en la reivindicación 1, comprendiendo la composición farmacéutica el ARN pequeño según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

10. La composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 9, en donde la composición farmacéutica es para administración oral o intravenosa, o administración por vía subcutánea, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, intrapulmonar, intracefalorraquídea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, intralesional o inhalatoria, preferiblemente en donde la administración intravenosa es la inyección en bolo o la perfusión continua durante un periodo de tiempo y/o la administración por inhalación es la administración intranasal.

11. La composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 9 o 10, comprendiendo la composición farmacéutica el ARN pequeño que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 20 en una cualquiera o más de Mezcla 1 a Mezcla 43 en la Tabla 2, en donde la relación de concentración molar del ARN pequeño que tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 20 con respecto a otro(s) ARN pequeño(s) en la composición farmacéutica es de 2:1.