ES3031453T3

ES3031453T3 - Kits for genotyping

Info

Publication number: ES3031453T3
Application number: ES23180094T
Authority: ES
Inventors: Andrew Slatter; Eric Hans Vermaas
Original assignee: Illumina Cambridge Ltd; Illumina Inc
Current assignee: Illumina Cambridge Ltd; Illumina Inc
Priority date: 2020-02-26
Filing date: 2021-02-24
Publication date: 2025-07-08
Anticipated expiration: 2041-02-24
Also published as: WO2021173666A1

Abstract

Un kit de ejemplo incluye una celda de flujo y un fluido de sonda de genotipado. La celda de flujo incluye un sustrato y un primer y un segundo cebador de captura unidos al sustrato. El fluido de sonda de genotipado incluye un vehículo líquido y un oligonucleótido de genotipado en el vehículo líquido. El oligonucleótido de genotipado incluye una primera secuencia de cebador; una secuencia de sonda representativa de un locus de genotipado diana; un sitio de endonucleasa de restricción; y una segunda secuencia de cebador que es al menos parcialmente complementaria al segundo cebador de captura. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Kits para genotipificación

Antecedentes

La detección de ácidos nucleicos específicos se puede utilizar para la investigación en medicina diagnóstica y biología molecular. Los ensayos con sondas genéticas pueden ser útiles, por ejemplo, para identificar organismos infecciosos, tales como bacterias y virus; en el estudio de la expresión de genes normales y mutantes y en la identificación de genes mutantes, tales como los oncógenos; en la tipificación del tejido para determinar la compatibilidad antes del trasplante de tejido; en la comparación de muestras de tejido o sangre para la medicina forense; y para explorar la homología entre genes de diferentes especies.

Hopmans y col., Nucleic Acids Res, junio de 2014;42 (10): e88, describe enfoques de secuenciación selectiva de oligonucleótidos, en donde los cebadores unidos a la superficie se extienden utilizando oligonucleótidos moldes específicos del objetivo, para permitir una captura específica del objetivo, y en donde los ácidos nucleicos capturados se amplifican en una celda de flujo y, a continuación, se secuencian. El documento WO 2018/161019 A1 describe un método para seleccionar un parámetro fundamental para la secuenciación dirigida directa que incluye la hibridación de sondas en una biblioteca de sondas de captura con oligonucleótidos unidos a la superficie. El documento WO 2016/075204 A1 describe métodos para capturar y amplificar polinucleótidos objetivo en una superficie sólida, en particular en un pocillo en una micromatriz, así como métodos para modificar los cebadores de captura inmovilizados.

Resumen

La presente invención se refiere a un fluido de sondas para genotipificación, a un kit y a un método según las reivindicaciones adjuntas.

En la presente memoria se describen oligonucleótidos para genotipificación que incluyen secciones de secuencia de nucleótidos específicas diseñadas para tener una función designada en la formación de grupos, la linealización, la identificación del locus objetivo y/o la secuenciación. Los oligonucleótidos para genotipificación permiten que la genotipificación tenga lugar en celdas de flujo sin patrón o con patrón, y no involucran componentes de inmovilización adicionales.

Un tercer aspecto descrito en la presente memoria es un kit que comprende una celda de flujo, que incluye: un sustrato; y un primer y un segundo cebadores de captura unidos al sustrato; y un fluido de sonda para genotipificación, que incluye: un vehículo líquido; y un oligonucleótido para genotipificación en el vehículo líquido, incluyendo el oligonucleótido para genotipificación una primera secuencia de cebador; una secuencia sonda representativa de un locus objetivo para genotipificación; un sitio para endonucleasa de restricción; y una segunda secuencia de cebador que es al menos parcialmente complementaria al segundo cebador de captura.

Debe entenderse que cualquier característica del kit descrito en la presente memoria se puede combinar de cualquier manera y/o configuración que se desee para lograr los beneficios descritos en esta descripción, incluyendo, por ejemplo, lograr la genotipificación en una celda de flujo.

Un segundo aspecto descrito en la presente memoria es un método que comprende: introducir un fluido de sonda para genotipificación en una celda de flujo que incluye un primer y un segundo cebador de captura, incluyendo el fluido de sonda para genotipificación una pluralidad de oligonucleótidos para genotipificación, incluyendo cada uno de los oligonucleótidos para genotipificación una primera secuencia de cebador; una secuencia sonda que representa un respectivo locus objetivo para genotipificación; un sitio para endonucleasa de restricción; y una segunda secuencia de cebador que es al menos parcialmente complementaria al segundo cebador de captura; donde un oligonucleótido para genotipificación respectivo reacciona para producir poblaciones clonales respectivas de amplicones a partir del oligonucleótido para genotipificación respectivo; linealizar los amplicones para producir sondas molde; secuenciar al menos una sección de identificación de sonda de las sondas molde para identificar cada una de las secuencias sonda; eliminar al menos las respectivas cadenas nacientes de las sondas molde, donde queda expuesto un grupo OH 3' en un extremo de las sondas molde; hibridar las muestras respectivas con las sondas molde; y realizar las respectivas reacciones de genotipificación de las muestras en los grupos OH 3' expuestos.

Debe entenderse que cualquiera de las características del método se pueden combinar de cualquier manera que se desee. Además, debe entenderse que cualquier combinación de características del método y/o del kit se puede utilizar conjuntamente y/o combinarse con cualquiera de los ejemplos descritos en la presente memoria para lograr los beneficios descritos en esta descripción, que incluyen, por ejemplo, lograr la genotipificación en una celda de flujo.

Breve descripción de las figuras

Las características de los ejemplos de la presente descripción se harán evidentes como referencia a la siguiente descripción detallada y los siguientes dibujos, en los cuales los mismos números de referencia corresponden a componentes similares, aunque quizás no idénticos. En aras de la brevedad, los números de referencia o las características cuya función ya se haya descrito anteriormente podrán o no describirse en relación con otros dibujos en los que aparezcan.

La figura 1A es una ilustración esquemática de un ejemplo del oligonucleótido para genotipificación descrito en la presente memoria;

la figura 1B es una ilustración esquemática de otro ejemplo del oligonucleótido para genotipificación descrito en la presente memoria;

La Fig. 2A es una vista superior de un ejemplo de una celda de flujo;

la figura 2B es una vista ampliada y parcialmente recortada de un ejemplo de un canal de flujo de la celda de flujo, que incluye depresiones formadas a lo largo del canal de flujo;

las figuras 3A a 3H representan esquemáticamente un ejemplo de un método descrito en la presente memoria; y las figuras 4A a 4H representan esquemáticamente otro ejemplo de un método descrito en la presente memoria.Descripción detallada

En la presente memoria se describen oligonucleótidos para genotipificación que incluyen secciones de secuencia de nucleótidos específicas. Cada sección de secuencia de nucleótidos del oligonucleótido para genotipificación se diseña de modo que tenga una función designada en la formación de grupos, la linealización, la identificación del locus objetivo y/o la secuenciación.

Los oligonucleótidos para genotipificación se pueden utilizar en una celda de flujo sin patrón que tenga cebadores de captura en una superficie de la misma, o en una celda de flujo con patrón que incluya depresiones con cebadores de captura en las mismas. En diferentes áreas de la superficie de celda de flujo sin patrón o dentro de las depresiones respectivas de la celda de flujo con patrón, se pueden generar poblaciones (grupos) monoclonales de amplicones a partir de los respectivos oligonucleótidos para genotipificación. Los amplicones de un área o depresión en particular pueden ser diferentes de los amplicones de cada una de las otras áreas o depresiones y, por lo tanto, cada población monoclonal de amplicones puede representar un locus objetivo único para genotipificación.

Los oligonucleótidos para genotipificación descritos en la presente memoria permiten que la genotipificación tenga lugar en celdas de flujo sin patrón o en celdas de flujo con patrón, y no involucran componentes de inmovilización adicionales, tales como perlas en fase sólida. Además, los oligonucleótidos para genotipificación descritos en la presente memoria pueden ser adecuados para una utilización con cualquier superficie de celda de flujo que utilice grupos amplificados clonalmente. En la presente memoria también se describen métodos para preparar un locus objetivo para genotipificación, que pueda utilizarse con los oligonucleótidos para genotipificación. Estos métodos son métodos de amplificación que generan fragmentos de ADN genómico (ADNg) sin tener que introducir un sitio de escisión ni realizar la fragmentación. Definiciones

Debe entenderse que los términos utilizados en la presente memoria adoptarán su significado habitual en la técnica correspondiente, a menos que se especifique lo contrario. A continuación se exponen varios términos utilizados en la presente memoria, y sus significados.

Como se utiliza en la presente memoria, las formas en singular “ un” , “ una” , “ uno” y “ el” o “ la” hacen referencia tanto al singular como al plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. El término “ comprende” tal como se utiliza en la presente memoria, es sinónimo de “ incluye” , “ contiene” o “ caracterizado por” y es inclusivo o abierto y no excluye elementos o pasos de método adicionales no enumerados.

La referencia a lo largo de la descripción a “ como un ejemplo” , “ otro ejemplo” , “ un ejemplo” , etc., denota que un elemento en particular (p. ej., propiedad, estructura, composición, configuración y/o característica) que se describe en relación con el ejemplo se incluye en al menos un ejemplo descrito en la presente memoria, y puede estar presente o no en otros ejemplos. Además, debe entenderse que los elementos descritos para cualquier ejemplo pueden combinarse de cualquier manera adecuada en los diversos ejemplos, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Los términos “ sustancialmente” y “ aproximadamente” usados a lo largo de esta descripción, incluyendo las reivindicaciones, se usan para describir y considerar pequeñas fluctuaciones, tales como las debidas a variaciones en el procesamiento. Por ejemplo, estos términos pueden referirse a inferior que o igual a ±10 % de un valor indicado, tal como a inferior que o igual a ±5 % de un valor indicado, tal como a inferior que o igual a ±2 % de un valor indicado, tal como a inferior que o igual a ±1 % de un valor indicado, tal como a inferior que o igual a ±0,5 % de un valor indicado, tal como a inferior que o igual a ±0,2 % de un valor indicado, tal como a inferior que o igual a ±0,1 % de un valor indicado, tal como a inferior que o igual a ±0,05 % de un valor indicado.

Además, ha de entenderse que los intervalos proporcionados en la presente memoria incluyen el intervalo indicado y cualquier valor o subintervalo dentro del intervalo indicado, como si se citasen explícitamente. Por ejemplo, debe interpretarse que un intervalo representado como de aproximadamente 2 mm a aproximadamente 300 mm incluye no solo los límites explícitamente citados de aproximadamente 2 mm a aproximadamente 300 mm, sino que también incluye valores individuales, tal como aproximadamente 15 mm, 22,5 mm, 245 mm, etc., y subintervalos, tal como de aproximadamente 20 mm a aproximadamente 225 mm, etc.

Unido:El estado en el que dos cosas se juntan, sujetan, adhieren, conectan o unen entre sí, ya sea directa o indirectamente. Por ejemplo, un ácido nucleico se puede unir a un polímero funcionalizado mediante un enlace covalente o no covalente. Un enlace covalente se caracteriza por el intercambio de pares de electrones entre átomos. Un enlace no covalente es un enlace químico que no implica el intercambio de pares de electrones y puede incluir, por ejemplo, enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos, fuerzas de van der Waals, interacciones hidrófilas e interacciones hidrófobas. Cuando dos cosas están directamente conectadas, no hay ningún componente intermedio. Por ejemplo, el primer cebador de captura y la secuencia sonda en algunos ejemplos del oligonucleótido para genotipificación se unen directamente de forma covalente entre sí. Cuando dos cosas se unen indirectamente, hay algún componente intermedio. Por ejemplo, el primer cebador de captura y la secuencia sonda en algunos ejemplos del oligonucleótido para genotipificación se unen indirectamente entre sí a través de una porción de secuencia índice y una porción de sitio de cebado.

Depósito:Cualquier técnica de aplicación adecuada, que puede ser manual o automatizada y, en algunos casos, da como resultado la modificación de las propiedades de superficie. Generalmente, el depósito se puede realizar utilizando técnicas de deposición de vapor, técnicas de recubrimiento, técnicas de injerto o similares. Algunos ejemplos específicos incluyen el depósito químico en fase de vapor (CVD), el recubrimiento por pulverización (p. ej., el recubrimiento por pulverización ultrasónica), el recubrimiento por centrifugación, el recubrimiento por inmersión, el recubrimiento con cuchilla, la dispensación en charcos, el recubrimiento por flujo continuo, la impresión en aerosol, la serigrafía, la impresión por microcontacto, la impresión por inyección de tinta o similares.

Depresión:Una característica cóncava discreta en un sustrato o una resina con patrón que tiene una abertura superficial que está rodeada al menos parcialmente por una o más regiones intersticiales del sustrato o la resina con patrón. Las depresiones pueden tener cualquiera de una variedad de formas en su abertura en una superficie, que incluyen, como ejemplos, formas redonda, elíptica, cuadrada, poligonal, de estrella (con cualquier número de vértices), etc. La sección transversal de una depresión tomada ortogonalmente con la superficie puede ser curva, cuadrada, poligonal, hiperbólica, cónica, angular, etc. Como ejemplo, la depresión puede ser un pocillo o dos pocillos interconectados. La depresión también puede tener arquitecturas más complejas, tales como crestas, escalones, etc.

Cada uno:El término “ cada uno” , cuando se utiliza con referencia a una colección de elementos, pretende identificar un elemento individual en la colección, pero no se refiere necesariamente a cada elemento de la colección. Puede haber excepciones si la descripción explícita o el contexto claramente dictan lo contrario.

Celda de flujo:Un recipiente que tiene una cámara (p. ej., un canal de flujo) donde se puede llevar a cabo una reacción, una entrada para suministrar uno o más reactivos a la cámara y una salida para retirar uno o más reactivos de la cámara. En algunos ejemplos, la cámara permite la detección de la reacción que se produce en la cámara. Por ejemplo, la cámara puede incluir una o más superficies transparentes que permiten la detección óptica de matrices, moléculas marcadas ópticamente o similares.

ADNgenómico (ADNg):Una o más moléculas de desoxirribonucleótidos poliméricos cromosómicos que se encuentran naturalmente en el núcleo de una célula eucariota o en una procariota, virus, mitocondria o cloroplasto y que contienen secuencias que se transcriben naturalmente en ARN, así como secuencias que la célula no transcribe naturalmente en ARN. Un ADNg de una célula eucariota contiene al menos un centrómero, dos telómeros, un origen de replicación y una secuencia que la célula eucariota no transcribe en ARN, incluido, por ejemplo, un intrón o un promotor de la transcripción. Un ADNg de una célula procariota contiene al menos un origen de replicación y una secuencia que la célula procariota no transcribe en ARN, incluido, por ejemplo, un promotor de la transcripción. Un ADN genómico eucariótico puede distinguirse del ADN genómico procariótico, viral u organelar, por ejemplo, según la presencia de intrones en el ADN genómico eucariótico y la ausencia de intrones en el ADNg de los demás.

Oligonucleótido para genotipificación:Una secuencia de ácido desoxirribonucleico monocatenario que incluye secciones de secuencia de nucleótidos específicas, una de las cuales es una secuencia sonda que representa un locus objetivo para genotipificación. El oligonucleótido para genotipificación puede servir como molde para la generación de grupos.

Porción de secuencia índice:Una cadena corta, que varía de 10 a 30 nucleobases, que identifica la secuencia sonda en algunos ejemplos del oligonucleótido para genotipificación.

Locus o loci:Una ubicación específica de la secuencia en una muestra de ácido nucleico. El término puede incluir secuencias de ácido nucleico predeterminadas o predichas que se espera que estén presentes en moléculas de ácido nucleico aisladas. Estas secuencias de ácido nucleico predeterminadas o predichas pueden denominarse en la presente memoria “ locus objetivo para genotipificación” y pueden ser regiones de interés para el análisis. El término pretende abarcar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), mutaciones, número variable de repeticiones en tándem (VNTR) y repeticiones en tándem único (STR), otros polimorfismos, inserciones, deleciones, variantes de corte y empalme o cualquier otro marcador genético conocido.

Ácido nucleico: Una forma oligomérica o polimérica de nucleótidos de cualquier longitud y puede incluir ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, análogos de los mismos o mezclas de los mismos. El término puede referirse a oligonucleótidos o polinucleótidos monocatenarios o bicatenarios.

Nucleótido:Base heterocíclica que contiene nitrógeno (una nucleobase), un azúcar y uno o más grupos fosfato. Los nucleótidos son unidades monoméricas de una secuencia de ácido nucleico. En los ribonucleótidos (ARN), el azúcar es una ribosa, y en los desoxirribonucleótidos (ADN), el azúcar es una desoxirribosa, es decir, un azúcar que carece de un grupo hidroxilo que está presente en la posición 2' de la ribosa. La base heterocíclica que contiene nitrógeno (es decir, nucleobase) puede ser una base de purina o una base de pirimidina. Las bases de purina incluyen adenina (A) y guanina (G), y derivados modificados o análogos de las mismas. Las bases de pirimidina incluyen citosina (C), timina (T) y uracilo (U) y derivados modificados o análogos de los mismos. El átomo C-1 de la desoxirribosa se une al N-1 de una pirimidina o al N-9 de una purina. Los nucleótidos naturales generalmente tienen un armazón que contiene enlaces fosfodiéster. Un análogo de ácido nucleico puede tener alterado cualquiera de: la cadena principal de fosfato, el azúcar o la nucleobase. Los ejemplos de análogos de ácido nucleico incluyen, por ejemplo, bases universales o análogos de la cadena principal de fosfato-azúcar, tales como el ácido nucleico peptídico (p Na ).

Sección de secuencias de nucleótidos:Una parte del oligonucleótido de genotipado. Cada porción del oligonucleótido para genotipificación se puede diseñar de modo que participe en uno o varios procesos específicos en el(los) método(s) descrito(s) en la presente memoria.

Cebador.Una secuencia de ácido desoxirribonucleico monocatenario que puede hibridarse con una secuencia específica. Un ejemplo de un cebador es un “ cebador de captura” . Un cebador de captura puede estar presente en las depresiones de una celda de flujo y puede hibridarse con una secuencia de cebador de un oligonucleótido para genotipificación o un amplicón del mismo. El cebador de captura puede servir como punto de partida para la amplificación y la generación de grupos. Otro ejemplo de un cebador es un “cebador de secuenciación” . Un cebador de secuenciación puede hibridarse con una porción de un sonda molde monocatenaria para cebar la síntesis de al menos una porción de la sonda molde monocatenaria. Se pueden utilizar otros cebadores, tales como cebadores aleatorios, en una reacción de amplificación de cebadores aleatorios para generar fragmentos de ADNg, tales como el locus objetivo para genotipificación. Cualquier cebador puede incluir cualquier combinación de nucleótidos o análogos de los mismos. La longitud del cebador puede ser cualquier cantidad de bases largas y puede incluir una diversidad de nucleótidos no naturales. En un ejemplo, el cebador de captura o el cebador de secuenciación es una cadena corta, que varía de 10 a 60 nucleobases o de 20 a 40 nucleobases.

Parte de secuencia de cebado:Un sitio de cebado para secuenciar una porción de secuencia índice, ambos incluidos en algunos ejemplos del oligonucleótido para genotipificación.

Secuencia sonda:Una sección específica del oligonucleótido para genotipificación que incluye una secuencia de nucleótidos que representa un locus objetivo para genotipificación. La secuencia sonda, o un amplicón de la misma, incluye de 25 a 50 nucleobases que tienen un orden específico que es complementario y, por lo tanto, puede hibridarse con la secuencia de locus objetivo.

Sonda molde monocatenaria:Secuencia de ácido desoxirribonucleico monocatenario que se genera durante la agrupación. El oligonucleótido para genotipificación sirve como molde para la generación de grupos y, por lo tanto, las sondas molde monocatenarias son amplicones o porciones de amplicones del oligonucleótido para genotipificación.

Oligonucleótidos para genotipificación

La figura 1A y la figura 1B representan esquemáticamente dos ejemplos diferentes de oligonucleótidos 10, 10' para genotipificación. Cada uno de los oligonucleótidos 10, 10' para genotipificación incluye secciones de secuencia de nucleótidos específicas, que incluyen una primera secuencia 12 de cebador, una secuencia sonda 14, un sitio 16 o 16' para endonucleasa de restricción y una segunda secuencia 18 o 18' de cebador.

El oligonucleótido 10 para genotipificación de ejemplo mostrado en la figura 1A incluye la primera secuencia 12 de cebador unida directa y covalentemente a la secuencia sonda 14, que está unida directa y covalentemente al sitio 16 para endonucleasa de restricción, que está unido directa y covalentemente a la segunda secuencia 18 de cebador. Un ejemplo del método que implica estos oligonucleótidos 10 para genotipificación se muestra y describe con referencia a las figuras 3A a 3H.

La primera secuencia 12 de cebador del oligonucleótido 10 para genotipificación puede tener la misma polaridad y la misma secuencia que las de un primer cebador 22 de captura (ver la figura 2B) que está presente en la superficie de una celda 20 de flujo (ver la figura 2A y la figura 2B). Como tal, el número, el orden y el tipo de nucleobases en al menos una porción de la primera secuencia 12 de cebador dependen del número, orden y tipo de nucleobases en el primer cebador 22 de captura. Durante la agrupación, se generan amplicones de los oligonucleótidos 10 para genotipificación que incluyen una secuencia complementaria a la primera secuencia 12 de cebador (p. ej., P5'). Esta porción complementaria (mostrada como C<12>en la figura 3B) puede hibridarse con el primer cebador 22 de captura.

En un ejemplo, el primer cebador 22 de captura tiene una secuencia universal para fines de captura y/o amplificación. Un ejemplo del primer cebador 22 de captura incluye cebadores P5, ejemplos de los ejemplos se utilizan en la superficie de celdas de flujo comerciales comercializadas por Illumina Inc. para la secuenciación, por ejemplo, en HISEQ™, HISEQX™, MISEQ™, MISEQDX™, MINISEQ™, NEXTSEQ™, NEXTSEQDX™, NOVASEQ™, ISEQ™, GENOME ANALYZER™ y otras plataformas de instrumentos. En otro ejemplo, el primer cebador 22 de captura incluye lo siguiente:

Primer cebador de captura: 5' → 3'

AATGATACGGCGACCACCGA (Id. de sec. n.°: 1)

La primera secuencia de cebador 12 puede tener la misma secuencia que el primer cebador 22 de captura. Si bien se ha proporcionado un ejemplo, debe entenderse que se pueden utilizar otras secuencias para la primera secuencia 12 de cebador y para el primer cebador 22 de captura. La primera secuencia 12 de cebador también puede ser al menos parcialmente la misma que el primer cebador 22 de captura. Por “ al menos parcialmente la misma” , se entiende que un número suficiente de nucleobases en la primera secuencia 12 de cebador y en el primer cebador 22 de captura son los mismos para que pueda producirse la hibridación entre los dos 12, 22. La primera secuencia 12 de cebador del oligonucleótido 10 para genotipificación se une directamente a la secuencia sonda 14. La secuencia sonda 14 es representativa de un locus objetivo para genotipificación. Por lo tanto, la secuencia sonda 14 es capaz de hibridarse con la secuencia de locus objetivo durante la genotipificación.

El sitio 16 para endonucleasa de restricción del oligonucleótido 10 para genotipificación se une directamente a la secuencia sonda 14. Este sitio 16 para endonucleasa de restricción proporciona al oligonucleótido 10 para genotipificación un sitio de digestión. En un ejemplo, el sitio 16 para endonucleasa de restricción es sensible a una enzima de restricción seleccionada del grupo que consiste en una endonucleasa de restricción de corte de 4 bases, una endonucleasa de restricción de corte de 5 bases y una endonucleasa de restricción de corte de 6 bases. Algunos ejemplos de cortadores de base 4 incluyen DpnlI, Fatl, MluCl, BfuCl, Mbol, Sau3Al, Bfal, BstUI, PmII, Kasl y otros que están disponibles comercialmente, por ejemplo, de New England BioLabs Inc., ThermoFisher Scientific, etc. Algunos ejemplos de cortadores de base 5 incluyen BssKI, StyD41, MaeIII, PspGI, Ddel, Fmul, PspGI, Tfil y otros que están disponibles comercialmente, por ejemplo, de New England BioLabs Inc., ThermoFisher Scientific, etc. Algunos ejemplos de cortadores de base 6 incluyen AcII, Afel, Nspl, Haell, TatI y otros que están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Nueva Inglaterra BioLabs Inc., ThermoFisher Scientific, etc. El sitio 16 para endonucleasa de restricción se coloca de tal modo que, después de la escisión/digestión con una enzima de restricción, la última base de la secuencia sonda 14 sea el OH 3' final que se expone a la reacción de secuenciación/genotipificación.

La segunda secuencia 18 de cebador del oligonucleótido 10 para genotipificación es al menos parcialmente complementaria al segundo cebador 24 de captura (ver la figura 2B) que está presente en la superficie de una celda 20 de flujo. Por “ al menos parcialmente complementaria” , se entiende que un número suficiente de nucleobases en la segunda secuencia 18 de cebador y en el segundo cebador 24 de captura son complementarias para que la hibridación pueda producirse entre los dos 18, 24. Como tal, el número, el orden y el tipo de nucleobases en la segunda secuencia 18 de cebador dependen del número, el orden y el tipo de nucleobases en el segundo cebador 24 de captura.

En un ejemplo, el segundo cebador 24 de captura tiene una secuencia universal para fines de captura y/o amplificación. Un ejemplo del segundo cebador 24 de captura incluye cebadores P7, ejemplos de los cuales se utilizan en la superficie de celdas de flujo comerciales comercializadas por Illumina Inc. para la secuenciación, por ejemplo, en HISEQ™, HISEQX™, MISEQ™, MISEQDX™, MINISEQ™, NEXTSEQ™, NEXTSEQDX™, NOVASEQ™, ISEQ™, GENOME ANALYZER™ y otras plataformas de instrumentos. En otro ejemplo, el segundo cebador 24 de captura incluye lo siguiente:

Segundo cebador de captura: 5' → 3'

CAAGCAGAAGACGGCATACGA (Id. de sec. n.° 2)

La segunda secuencia 18 de cebador es al menos parcialmente complementaria a la secuencia del segundo cebador 24 de captura. En este ejemplo, la segunda secuencia 18 de cebador puede incluir lo siguiente:

Segunda secuencia de cebador: 5' → 3'

GTTCGTCTCTGCCGTATGCT (Id. de sec. n.° 3)

Si bien se ha proporcionado un ejemplo, debe entenderse que se pueden utilizar otras secuencias para la segunda secuencia 18 de cebador y para el segundo cebador 24 de captura.

El segundo cebador 24 de captura en la celda 20 de flujo también incluye un sitio de escisión (ver el número de referencia 46 en la figura 3A). El sitio de escisión se puede utilizar para linealizar las sondas molde en puente después de la formación de grupos (descrita más con referencia a la figura 3E). La química del sitio de escisión del segundo cebador 24 de captura puede ser diferente de la química del sitio 16 para endonucleasa de restricción del nucleótido 10 para genotipificación, de modo que no se produzca una digestión prematura del sitio 16 para endonucleasa de restricción. El sitio de escisión y el sitio 16 para endonucleasa de restricción tienen reacciones de escisión separadas y específicas. Estas reacciones pueden considerarse ortogonales, en el sentido de que una reacción no inicia, afecta o interfiere de otro modo con la otra reacción. Los ejemplos de sitios de escisión adecuados para el segundo cebador 24 de captura incluyen nucleobases escindibles enzimáticamente o nucleobases escindibles químicamente, nucleobases modificadas o conectores (p. ej., unidos entre nucleobases). La nucleobase escindible enzimáticamente puede ser susceptible de escisión por reacción con una glicosilasa y una endonucleasa, o con una exonucleasa. Un ejemplo específico de la nucleobase escindible es el desoxiuracilo (dU), que puede ser el objetivo de la enzima USER. En un ejemplo, la base de uracilo puede incorporarse en la 7.a posición de base desde el extremo 3' del segundo cebador 24 de captura. También se pueden utilizar otros sitios abásicos. Los ejemplos de nucleobases escindibles químicamente, nucleobases modificadas o conectores incluyen 8-oxoguanina, un diol vecinal, un disulfuro, un silano, un azobenceno, un grupo fotoescindible, alilo T (un análogo de nucleótido de timina que tiene una funcionalidad alílica), éteres de alilo o un éter funcional azido.

Con referencia ahora a la figura 1B, se representa esquemáticamente otro ejemplo del oligonucleótido 10' para genotipificación. El oligonucleótido 10' para genotipificación de ejemplo mostrado en la figura 1B incluye más secciones de secuencia de nucleótidos que el oligonucleótido 10 para genotipificación mostrado en la figura 1A. Específicamente, el oligonucleótido 10' para genotipificación comprende además una porción 26 de secuencia índice y una porción 28 de sitio de cebado. En este ejemplo, el oligonucleótido 10' para genotipificación incluye la primera secuencia 12 de cebador unida directa y covalentemente a la porción 26 de secuencia índice, que está unida directa y covalentemente a la porción 28 de sitio de cebado, que está unida directa y covalentemente a la secuencia sonda 14, que está unida a la segunda secuencia 18' de cebador. En este ejemplo, el sitio 16' para endonucleasa de restricción puede estar posicionado entre la secuencia sonda 14 y la segunda secuencia 18' de cebador, o puede estar integrado en la segunda secuencia 18' de cebador. Un ejemplo del método que involucra a estos oligonucleótidos 10' para genotipificación se muestra y describe con referencia a las figuras 4A a 4H.

La primera secuencia 12 de cebador del oligonucleótido 10' para genotipificación puede ser cualquier ejemplo expuesto en la presente memoria para el oligonucleótido 10 para genotipificación.

La primera secuencia 12 de cebador del oligonucleótido 10' para genotipificación se une directamente a la porción 26 de secuencia índice. La porción 26 de secuencia índice es exclusiva de la secuencia sonda 14 en el oligonucleótido 10' para genotipificación. Como tal, la porción 26 de secuencia índice proporciona un identificador o código de barras distinto que puede utilizarse para identificar la secuencia de locus objetivo representada por la secuencia sonda 14.

La porción 26 de secuencia índice se une directamente a la porción 28 de sitio de cebado. La porción 28 de sitio de cebado puede hibridarse con un cebador de secuenciación que inicia la introducción de nucleótidos a lo largo de la porción 26 de secuencia índice de una manera dependiente del molde, una nucleobase a la vez.

La porción 28 de sitio de cebado del oligonucleótido 10' para genotipificación se une directamente a la secuencia sonda 14. Como se describe en la presente memoria, la secuencia sonda 14 es capaz de hibridarse con la secuencia de locus objetivo durante la genotipificación.

En el oligonucleótido 10' para genotipificación, la secuencia sonda 14 se une a la segunda secuencia 18' de cebador. En algunos ejemplos, la secuencia sonda 14 se une indirectamente a la segunda secuencia 18' de cebador, y el sitio 16' para endonucleasa de restricción se coloca entre las dos secciones 14, 18'. En otros ejemplos, la secuencia sonda 14 se une directamente a la segunda secuencia 18' de cebador, y el sitio 16' para endonucleasa de restricción se integra en la segunda secuencia 18' de cebador. En cualquiera de estos ejemplos, el sitio 16' para endonucleasa de restricción puede ser sensible a una enzima de restricción de tipo IIS. La enzima de restricción de tipo IIS puede ser sensible al metilo o puede no ser sensible al metilo. Las enzimas de restricción de tipo IIS son un grupo específico de enzimas que reconocen secuencias de ADN asimétricas (p. ej., el sitio 16' para endonucleasa de restricción) y las escinden a una distancia definida (p. ej., de 1 nucleótido a aproximadamente 20 nucleótidos) fuera de la secuencia de reconocimiento. Algunos ejemplos de enzimas de restricción de tipo IIS que no son sensibles al metilo se seleccionan del grupo que consiste en BbvI (BseXI), Bmrl, Bvel (BspMI), etc. Algunas enzimas de restricción de tipo IIS que son sensibles al metilo se seleccionan del grupo que consiste en SfaNI, FoKI, HGAI, etc. Si bien se han proporcionado algunos ejemplos, se puede utilizar cualquier enzima de restricción de tipo IIS adecuada, dependiendo de la secuencia de reconocimiento del sitio 16' para endonucleasa de restricción. Las enzimas sensibles a metilo y no metilo están disponibles comercialmente, por ejemplo, en New England BioLabs Inc., ThermoFisher Scientific, etc.

Cuando el sitio 16' para endonucleasa de restricción se une al extremo de la segunda secuencia 18' de cebador, se puede utilizar cualquier ejemplo de la segunda secuencia 18 de cebador. Cuando el sitio 16' para endonucleasa de restricción se integra en la segunda secuencia 18' de cebador, el sitio 16' para endonucleasa de restricción se puede introducir en cualquier posición que se desee a lo largo de la longitud de la segunda secuencia 18' de cebador. La posición puede depender de la posición de un segundo sitio para endonucleasa de restricción a lo largo del segundo cebador 24' de captura, de la distancia de escisión definida de la enzima de restricción de tipo IIS que se utilizará, así como también del punto donde se desea la escisión a lo largo del oligonucleótido 10' para genotipificación (o un amplicón del mismo). Esta escisión tiene lugar antes de una reacción de genotipificación (durante la linealización, como se describe más adelante en la presente memoria) y hace que el oligonucleótido 10' para genotipificación o un amplicón del mismo esté listo para el análisis de un locus objetivo para genotipificación en una nucleobase de interés. Como ejemplo, durante una reacción de genotipificación, una muestra de ADN monocatenario, p. ej., el locus objetivo para genotipificación, se hibrida, por ejemplo, con el amplicón, y se realiza una única reacción de secuenciación por síntesis para identificar la nucleobase de interés. Para que se produzca este análisis, el amplicón debe escindirse en una posición definida, donde la siguiente nucleobase que ha de secuenciarse sea complementaria a la nucleobase de interés. Como tal, el sitio 16' para endonucleasa de restricción se coloca de tal modo que, después de la escisión/digestión con una enzima de restricción, la última base de la secuencia sonda 14 sea el OH 3' final que se expone a la reacción de secuenciación/genotipificación. En un ejemplo, el sitio 16' para endonucleasa de restricción puede integrarse en cualquier lugar desde la 7.a posición de base hasta la 15.a posición de base desde el extremo 3' de la segunda secuencia 18' de cebador.

Con el oligonucleótido 10' para genotipificación, la segunda secuencia 18' de cebador es complementaria al segundo cebador 24' de captura (ver la figura 2B) que está presente en la superficie de una celda 20 de flujo. Como tal, el oligonucleótido 10' para genotipificación puede hibridarse con el segundo cebador 24' de captura en la celda 20 de flujo.

El segundo cebador 24' de captura también puede incluir el segundo sitio para endonucleasa de restricción (ver el número de referencia 46' en la figura 4<a>), en donde el segundo sitio para endonucleasa de restricción es complementario al sitio 16' para endonucleasa de restricción del oligonucleótido 10' para genotipificación. Las secuencias asimétricas pueden ser sensibles a las endonucleasas de restricción de tipo IIS. La escisión dentro de una distancia predefinida de los sitios 16', sitio 46' para endonucleasa de restricción hibridados se realiza durante la linealización (como se mencionó anteriormente y se describe adicionalmente con referencia a la figura 4F). Esto elimina las cadenas que no van a ser genotipadas. La posición del segundo sitio 46' para endonucleasa de restricción puede estar en el extremo del segundo cebador 24' de captura o estar integrada en el mismo, siempre que los dos sitios 16', sitio 46' para endonucleasa de restricción puedan hibridarse y formar el sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restricción de tipo IIS.

Cualquier ejemplo del oligonucleótido 10, 10' para genotipificación puede prepararse utilizando procesos de síntesis de oligonucleótidos.

Celdas de flujo

Los oligonucleótidos 10, 10' para genotipificación se pueden utilizar con cualquier celda 20 de flujo con patrón. Si bien no se muestra, debe entenderse que otras celdas de flujo sin patrón (p. ej., que no incluyen depresiones) que utilizan la química de agrupamiento descrita en la presente memoria pueden utilizarse alternativamente en los ejemplos descritos en la presente memoria. En el caso de celdas de flujo sin patrón, los grupos se pueden identificar mediante software.

Un ejemplo de una celda 20 de flujo con patrón se representa en la figura 2A, y un ejemplo de la arquitectura con patrón dentro de la celda 20 de flujo se muestra en la figura 2B. La celda 20 de flujo incluye un sustrato 30 que define al menos parcialmente un carril o canal 32 de flujo.

El sustrato 30 puede ser una sola capa/material. Algunos ejemplos de sustratos de una sola capa adecuados incluyen epoxi siloxano, vidrio, vidrio modificado o funcionalizado, plásticos (incluidos acrílicos, poliestireno y copolímeros de estireno y otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, politetrafluoroetileno (tal como TEFLON® de Chemours), olefinas cíclicas/polímeros de cicloolefinas (COP) (tales como ZEONOR® de Zeon), poliimidas, etc.), nailon (poliamidas), cerámica/óxidos de cerámica, sílice, sílice fundida o materiales a base de sílice, silicato de aluminio, silicio y silicio modificado (p. ej., silicio p+ dopado con boro), nitruro de silicio (Si3N4), óxido de silicio (SiO2), pentóxido de tantalio (Ta2O5) u otros óxidos de tantalio (TaOx), óxido de hafnio (HfO2), carbono, metales, vidrios inorgánicos o similares.

Cuando el sustrato 30 es una sola capa, las depresiones 38 (ver la figura 2B) se definen en la capa única.

Como se muestra en la figura 2B, el sustrato 30 también puede ser un sustrato 30' de múltiples capas. Algunos ejemplos de la estructura 30' de múltiples capas incluyen vidrio o silicio, con una capa de recubrimiento de óxido de tantalio u otro óxido cerámico en la superficie. Otros ejemplos del sustrato 30' de múltiples capas pueden incluir un sustrato de silicio sobre aislante (SOI). En el ejemplo mostrado en la figura 2B, el sustrato 30' de múltiples capas incluye un soporte subyacente 34 (p. ej., vidrio o silicio) y un material 36 con patrón colocado sobre el soporte 34.

El material 36 con patrón define depresiones 38 separadas por regiones intersticiales 40. Las depresiones 38 se ubican dentro de cada uno de los canales 32 de flujo.

Debe entenderse que cualquier material que pueda depositarse selectivamente, o depositarse y modelarse para formar las depresiones 38 y las regiones 40 intersticiales puede usarse para el material 36 modelado.

A modo de ejemplo, se puede aplicar selectivamente un óxido inorgánico al soporte 34 mediante depósito de vapor, impresión por aerosol o impresión por chorro de tinta. Algunos ejemplos de óxidos inorgánicos adecuados incluyen óxido de tantalio (p. ej., Ta2O5), óxido de aluminio (p. ej., AbO3), óxido de silicio (p. ej., SO2), óxido de hafnio (p. ej., HfO2), etc.

Como otro ejemplo, se puede aplicar una resina al soporte 34 y luego modelarlo. Las técnicas de depósito adecuadas incluyen depósito químico de vapor, recubrimiento por inmersión, recubrimiento por inmersión, recubrimiento por centrifugación, recubrimiento por pulverización, dispensación en charco, recubrimiento por pulverización ultrasónica, recubrimiento por rasqueta, impresión en aerosol, serigrafía, impresión por microcontacto, etc. Las técnicas de creación de patrones adecuadas incluyen fotolitografía, litografía de nanoimpresión (NIL), técnicas de estampado, técnicas de grabado, técnicas de moldeado, técnicas de micrograbado, técnicas de impresión, etc. Algunos ejemplos de resinas adecuadas incluyen una resina basada en silsesquioxano oligomérico poliédrico (p. ej. POSS<®>de Hybrid Plastics), una resina epoxi sin silsesquioxano oligomérico poliédrico, una resina de poli(etilenglicol), una resina de poliéter (p. ej., resinas epoxi con anillo abierto), una resina acrílica, una resina de acrilato, una resina de metacrilato, una resina de fluoropolímero amorfa (p. ej., CYTOP<®>de Bellex), y combinaciones de las mismas.

Como se utiliza en la presente memoria, el término “ silsesquioxano oligomérico poliédrico” se refiere a una composición química que es un intermedio híbrido (p. ej., RSiO1,5) entre el sílice (SO<2>) y la silicona (R<2>SiO). Un ejemplo de silsesquioxano oligomérico poliédrico puede ser el descrito en Kehagias y col., Microelectronic Engineering 86 (2009), págs. 776-778. En un ejemplo, la composición es un compuesto de organosilicio con la fórmula química [RSiO3/2]<n>, donde los grupos R pueden ser iguales o diferentes. Algunos ejemplos de grupos R para el silsesquioxano oligomérico poliédrico incluyen epoxi, azida/azido, un tiol, un poli(etilenglicol), un norborneno, una tetrazina, acrilatos y/o metacrilatos, o además, por ejemplo, grupos alquilo, arilo, alcoxi y/o haloalquilo. La composición de resina descrita en la presente memoria puede comprender una o más estructuras de jaula o núcleo diferentes como unidades monoméricas.

En un ejemplo, el sustrato 30, 30' puede fabricarse utilizando una oblea que tenga un diámetro que varíe de aproximadamente 2 mm a aproximadamente 300 mm, o a partir de una lámina o panel rectangular que tenga un tamaño mayor de hasta aproximadamente 10 pies (~3 metros). En un ejemplo, el sustrato 30, 30' se fabrica utilizando una oblea redonda que tenga un diámetro que varíe de aproximadamente 200 mm a aproximadamente 300 mm. En otro ejemplo, se puede utilizar un panel que sea un soporte rectangular, que tenga un área de superficie mayor que una oblea redonda de 300 mm. Las obleas, los paneles y otros materiales de sustrato grandes se pueden cortar en cubitos en los sustratos 30, 30' de celda de flujo individuales. En otro ejemplo, el sustrato 30, 30' es una matriz que tiene una anchura que varía de aproximadamente 0,1 mm a aproximadamente 10 mm. Si bien se han proporcionado dimensiones de ejemplo, debe entenderse que se puede utilizar un material de sustrato de cualesquiera dimensiones adecuadas para fabricar el sustrato 30, 30'.

La celda 20 de flujo también incluye los canales 32 de flujo. Si bien se muestran varios canales 32 de flujo en la figura 2A, debe entenderse que se puede incluir cualquier número de canales 32 en la celda 20 de flujo (p. ej., un solo canal 32, cuatro canales 32, etc.). Cada canal 32 de flujo es un área definida entre dos componentes unidos (p. ej., el sustrato 30, 30' y una tapa o dos sustratos 30, 30'), en los que se pueden introducir fluidos y retirarlos de los mismos. Cada canal 32 de flujo puede estar aislado de los demás canales 32 de flujo de modo que el fluido introducido en cualquier canal 32 de flujo particular no fluya hacia ningún canal 32 de flujo adyacente. Algunos ejemplos de los fluidos introducidos en los canales 32 de flujo pueden introducir componentes de reacción (p. ej., fragmentos de biblioteca de locus objetivo para genotipificación, polimerasas, etc.), soluciones de lavado, etc.

Como se ha mencionado, el canal 32 de flujo se define entre el sustrato 30, 30' y una tapa (no se muestra) o entre el sustrato 30, 30' y otro sustrato (no se muestra, pero es similar al sustrato 30, 30').

En un ejemplo, la tapa o el sustrato adicional se puede unir a al menos una porción del sustrato 30, 30', p. ej., en algunas de las regiones intersticiales 40. El enlace que se forma entre la tapa o sustrato adicional y los sustratos 30, 30' puede ser un enlace químico o un enlace mecánico (p. ej., utilizando un sujetador, etc.).

La tapa puede ser de cualquier material que sea transparente a una luz de excitación que se dirija hacia el sustrato 30, 30'. Como ejemplos, la tapa puede ser de vidrio (por ejemplo, borosilicato, sílice fundida, etc.), plástico o similar. Un ejemplo comercialmente disponible de vidrio de borosilicato adecuado es D 263<®>, comercializado por Schott North America Inc. Algunos ejemplos comercialmente disponibles de materiales plásticos adecuados, a saber polímeros de cicloolefina, son los productos ZEONOR<®>comercializados por Zeon Chemicals L.P.

La tapa o sustrato adicional puede unirse al sustrato 30, 30' utilizando cualquier técnica adecuada, tal como unión por láser, unión por difusión, unión anódica, unión eutéctica, unión por activación de plasma, unión por frita de vidrio u otros métodos conocidos en la técnica. En un ejemplo, se puede utilizar una capa espaciadora para unir la tapa 0 sustrato adicional al sustrato 30, 30'. La capa espaciadora puede ser de cualquier material que selle al menos una porción del sustrato 30, 30' y la tapa o sustrato adicional juntos. En algunos ejemplos, la capa espaciadora puede ser de un material que absorba la radiación y ayude a la unión.

En un ejemplo, el canal 32 de flujo tiene una configuración rectangular. La longitud y el ancho del canal 32 de flujo pueden ser menores, respectivamente, que la longitud y el ancho del sustrato 30, 30' de modo que la porción de la superficie de sustrato que rodea el canal 32 de flujo esté disponible para la unión a una tapa (no mostrada) u otro sustrato 30, 30'. En algunos casos, el ancho de cada canal 32 de flujo puede ser de al menos aproximadamente 1 mm, al menos aproximadamente 2,5 mm, al menos aproximadamente 5 mm, al menos aproximadamente 7 mm, al menos aproximadamente 10 mm o más. En algunos casos, la longitud de cada carril/canal 32 de flujo puede ser de al menos aproximadamente 10 mm, al menos aproximadamente 25 mm, al menos aproximadamente 50 mm, al menos aproximadamente 100 mm o más. El ancho y/o la longitud de cada canal 32 de flujo puede ser mayor o menor que los valores especificados anteriormente, o estar entre ellos. En otro ejemplo, el canal 32 de flujo es cuadrado (p. ej., 10 mm * 10 mm).

La profundidad de cada canal 32 de flujo puede ser tan pequeña como el espesor de una monocapa, por ejemplo, cuando se utiliza impresión por microcontacto, aerosol o chorro de tinta para depositar una capa espaciadora que defina las paredes del canal de flujo. La profundidad del canal 32 de flujo puede ser mayor, por ejemplo, cuando el canal 32 de flujo está parcialmente definido en el sustrato 30, 30' (p. ej., mediante grabado, litografía, etc.) de modo que una porción del sustrato y la capa espaciadora definan las paredes del canal de flujo. Para otros ejemplos, la profundidad de cada canal 32 de flujo puede ser de aproximadamente 1 pm, aproximadamente 10 pm, aproximadamente 50 pm, aproximadamente 100 pm o más. En un ejemplo, la profundidad puede oscilar de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 100 pm. En otro ejemplo, la profundidad puede oscilar de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 30 pm. En otro ejemplo más, la profundidad es de aproximadamente 5 pm o menos. Debe entenderse que la profundidad de cada canal 32 de flujo debe ser mayor o menor que los valores especificados anteriormente, o estar entre ellos.

Haciendo referencia ahora específicamente a la figura 2B, se representa un ejemplo de la arquitectura dentro de uno de los canales 32 de flujo de la celda 20 de flujo.

Como se muestra en la figura 2B, el material 36 con patrón incluye las depresiones 38 definidas en el mismo y las regiones intersticiales 40 que separan las depresiones adyacentes 38. Se pueden contemplar muchos diseños diferentes de las depresiones 38, incluidos aquellos con patrones regulares, repetitivos y no regulares. En un ejemplo, las depresiones 38 están dispuestas en una disposición reticular hexagonal para un empaquetamiento cerrado y una densidad mejorada. Otros diseños pueden incluir, por ejemplo, diseños rectilíneos, diseños triangulares, y así sucesivamente. En algunos ejemplos, el diseño o patrón puede consistir en un formato x-y de depresiones 38 que se encuentran en filas y columnas. En algunos ejemplos diferentes, el diseño o patrón puede consistir en una disposición repetitiva de depresiones 38 y/o regiones intersticiales 40. En otros ejemplos adicionales, el diseño o patrón puede consistir en una disposición aleatoria de depresiones 38 y/o regiones intersticiales 40. El patrón puede incluir rayas, espirales, líneas, triángulos, rectángulos, círculos, arcos, cuadrículas, líneas diagonales, flechas, cuadrados y/o rayado cruzado.

El diseño o patrón de las depresiones 38 puede caracterizarse con respecto a la densidad de las depresiones 38 (el número de depresiones 38) en un área definida. Por ejemplo, las depresiones 38 pueden estar presentes a una densidad de aproximadamente 2 millones por mm2. La densidad puede ajustarse a diferentes densidades incluidas, por ejemplo, una densidad de aproximadamente 100 por mm2, aproximadamente 1000 por mm2, aproximadamente 0,1 millones por mm2, aproximadamente 1 millón por mm2, aproximadamente 2 millones por mm2, aproximadamente 5 millones por mm2, aproximadamente 10 millones por mm2, aproximadamente 50 millones por mm2 o más o menos. Debe entenderse además que la densidad de las depresiones 38 en el material 36 con patrón puede estar entre uno de los valores inferiores y uno de los valores superiores seleccionados entre los intervalos anteriores. A modo de ejemplo, una matriz de alta densidad puede caracterizarse por tener depresiones 38 separadas por menos de aproximadamente 100 nm, una matriz de densidad media puede caracterizarse por tener depresiones 38 separadas por aproximadamente 400 nm a aproximadamente 1 pm y una matriz de densidad baja puede caracterizarse por tener depresiones 38 separadas por más de aproximadamente 1 pm. Si bien se han proporcionado densidades ilustrativas, debe entenderse que puede usarse cualquier densidad adecuada. La densidad de las depresiones 38 puede depender, en parte, de la profundidad de las depresiones 38. En algunos casos, puede ser deseable que el espacio entre las depresiones 38 sea incluso mayor que los ejemplos enumerados en la presente memoria.

El diseño o patrón de las depresiones 38 puede también, o alternativamente, caracterizarse en términos de la separación promedio, o la separación desde el centro de la depresión 38 hasta el centro de una depresión adyacente 38 (separación de centro a centro) o desde el borde izquierdo de una depresión 38 al borde derecho de una depresión adyacente 38 (separación de borde a borde). El patrón puede ser regular, de modo que el coeficiente de variación alrededor del espaciado promedio sea pequeño, o el patrón puede ser no regular, en cuyo caso el coeficiente de variación puede ser relativamente grande. En cualquiera de los casos, el espaciado promedio puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 50 nm, aproximadamente 0,1 pm, aproximadamente 0,5 pm, aproximadamente 1 pm, aproximadamente 5 pm, aproximadamente 10 pm, aproximadamente 100 pm, o más, o menos. El espaciado promedio para un patrón particular de depresiones 38 puede estar entre uno de los valores inferiores y uno de los valores superiores seleccionados entre los intervalos anteriores. En un ejemplo, las depresiones 38 tienen un espaciado (separación de centro a centro) de aproximadamente 1,5 pm. Si bien se han proporcionado valores de espaciado promedio ilustrativos, debe entenderse que pueden utilizarse otros valores de espaciado promedio.

El tamaño de cada depresión 38 puede caracterizarse por su volumen, área de apertura, profundidad y/o diámetro.

Cada depresión 38 puede tener cualquier volumen que permita confinar un fluido. El volumen mínimo o máximo se puede seleccionar, por ejemplo, para adecuarse al rendimiento (p. ej., multiplexidad), la resolución, los nucleótidos o la reactividad del analito esperada para usos posteriores de la celda 20 de flujo. Por ejemplo, el volumen puede ser de al menos aproximadamente 1*10'3 pm3, al menos aproximadamente 1*10'2 pm3, al menos aproximadamente 0,1 |jm3, al menos aproximadamente 1 |jm3, al menos aproximadamente 10 |jm3, al menos aproximadamente 100 |jm3, o más. Como alternativa o además, el volumen puede ser de como máximo aproximadamente 1*104 jim3, como máximo aproximadamente 1*103 jim3, como máximo aproximadamente 100 jim3, como máximo aproximadamente 10 jim3, como máximo aproximadamente 1 jim3, como máximo aproximadamente 0,1 jim3, o menos.

El área ocupada por cada abertura de depresión se puede seleccionar en función de criterios similares a los establecidos anteriormente para el volumen. Por ejemplo, el área de cada abertura de depresión puede ser de al menos aproximadamente 1*10'3 jim2, al menos aproximadamente 1*10'2 jim2, al menos aproximadamente 0,1 jim2, al menos aproximadamente 1 jim2, al menos aproximadamente 10 jim2, al menos aproximadamente 100 jim2, o más. Como alternativa o además, el área puede ser de como máximo aproximadamente 1*103 jim2, como máximo aproximadamente 100 jim2, como máximo aproximadamente 10 jim2, como máximo aproximadamente 1 jim2, como máximo aproximadamente 0,1 jim2, como máximo aproximadamente 1*10'2 jim2, o menos. El área ocupada por cada abertura de depresión puede ser mayor, menor o encontrarse entre los valores especificados anteriormente.

La profundidad de cada depresión 38 puede ser lo suficientemente grande como para albergar parte de un hidrogel polimérico 42. En un ejemplo, la profundidad puede ser de al menos aproximadamente 0,1 jim, al menos aproximadamente 0,5 jim, al menos aproximadamente 1 jim, al menos aproximadamente 10 jim, al menos aproximadamente 100 jim o más. Como alternativa o además, la profundidad puede ser de como máximo aproximadamente 1*103 jim, como máximo aproximadamente 100 jim, como máximo aproximadamente 10 jim, o menos. En algunos ejemplos, la profundidad es de aproximadamente 0,4 jm. La profundidad de cada depresión 38 puede ser mayor o menor que los valores especificados anteriormente, o estar entre ellos.

En algunos casos, el diámetro o la longitud y anchura de cada depresión 38 puede ser de al menos aproximadamente 50 nm, al menos aproximadamente 0,1 jim, al menos aproximadamente 0,5 jim, al menos aproximadamente 1 jim, al menos aproximadamente 10 jim, al menos aproximadamente 100 jim, o más. Como alternativa o además, el diámetro o la longitud y el ancho pueden ser de como máximo aproximadamente 1*103 jim, como máximo aproximadamente 100 jim, como máximo aproximadamente 10 jim, como máximo aproximadamente 1 jim, como máximo aproximadamente 0,5 jim, como máximo aproximadamente 0,1 jim, o menos (por ejemplo, aproximadamente 50 nm). En algunos ejemplos, el diámetro o la longitud y la anchura es de aproximadamente 0,4 jim. El diámetro o la longitud y la anchura de cada depresión 38 puede ser mayor o menor que los valores especificados anteriormente, o estar entre ellos.

En el ejemplo que se muestra en la figura 2B, el hidrogel polimérico 42 se coloca dentro de cada una de las depresiones 38. Un ejemplo del hidrogel 42 polimérico incluye un copolímero de acrilamida, tal como poli(N-(5-azidoacetamidilpentil)acrilamida-co-acrilamida, PAZAM. PAZAM y algunas otras formas del copolímero de acrilamida se representan mediante la siguiente estructura (i):

en donde:

RA se selecciona del grupo que consiste en azido, amino opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquino opcionalmente sustituido, halógeno, hidrazona opcionalmente sustituida, hidrazina opcionalmente sustituida, carboxilo, hidroxilo, tetrazol opcionalmente sustituido, tetrazina opcionalmente sustituida, óxido de nitrilo, nitrona, sulfato y tiol;

RB es H o alquilo opcionalmente sustituido;

RC, RD y RE se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H y alquilo opcionalmente sustituido; cada uno de los -(CH2)p- puede estar opcionalmente sustituido;

p es un número entero en el intervalo de 1 a 50;

n es un número entero en el intervalo de 1 a 50.000; y

m es un número entero en el intervalo de 1 a 100.000.

Un experto en la materia reconocerá que la disposición de las características “ n” y “ m” recurrentes en la estructura (I) son representativas, y que las subunidades monoméricas pueden estar presentes en cualquier orden en la estructura del polímero (por ejemplo, aleatorio, en bloque, en patrón o una combinación de los mismos).

La masa molecular de PAZAM y otras formas del copolímero de acrilamida puede encontrarse en el intervalo de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 1500 kDa o de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 1000 kDa o puede ser, en un ejemplo específico, de aproximadamente 312 kDa.

En algunos ejemplos, PAZAM y otras formas del copolímero de acrilamida son polímeros lineales. En algunos otros ejemplos, PAZAM y otras formas del copolímero de acrilamida son polímeros ligeramente reticulados.

En otros ejemplos, el hidrogel 42 polimérico puede ser una variación de la estructura (I). En un ejemplo, la unidad de acrilamida se puede reemplazar con N,N-dimetilacrilamida

. En este ejemplo, la unidad de acrilamida en la estructura (I) se puede reemplazar con

, donde RD, RE y RF son cada uno H o un alquilo C1-C6, y RG y RH son cada uno un alquilo C1-C6 (en lugar de H, como en el caso de la acrilamida). En este ejemplo, q puede ser un número entero en el intervalo de 1 a 100.000. En otro ejemplo, se puede usar el N,N-dimetilacrilamida además de la unidad de acrilamida. En este ejemplo, la estructura (I) puede incluir

además de las características “ n” y “ m” recurrentes, donde RD, RE y RF son cada uno H o un alquilo C1-C6, y RG y RH son cada uno un alquilo C1-C6. En este ejemplo, q puede ser un número entero en el intervalo de 1 a 100.000.

Como otro ejemplo del hidrogel polimérico 42, la característica “ n” recurrente en la estructura (I) se puede reemplazar con un monómero que incluye un grupo azido heterocíclico que tiene la estructura (II):

en donde R1 es H o un alquilo C1-C6; R2 es H o un alquilo C1-C6; L es un enlazador que incluye una cadena lineal con 2 a 20 átomos seleccionados del grupo que consiste en carbono, oxígeno y nitrógeno y 10 sustituyentes opcionales en el carbono y cualquier átomo de nitrógeno en la cadena; E es una cadena lineal que incluye de 1 a 4 átomos seleccionados del grupo que consiste en carbono, oxígeno y nitrógeno, y sustituyentes opcionales en el carbono y cualquier átomo de nitrógeno en la cadena; A es una amida N sustituida con un H o un alquilo C1-C4 unido al N; y Z es un heterociclo que contiene nitrógeno. Algunos ejemplos de Z incluyen de 5 a 10 miembros de anillo presentes como una estructura cíclica única o una estructura fusionada. Algunos ejemplos específicos de Z incluyen pirrolidinilo, piridinilo o pirimidinilo.

Como otro ejemplo más, el hidrogel 42 polimérico puede incluir una unidad recurrente de cada una de las estructuras (III) y (IV):

en donde cada uno de R1a, R2a, R1b y R2b se selecciona independientemente entre hidrógeno un alquilo opcionalmente sustituido o fenilo opcionalmente sustituido; cada uno de R3a y R3b se selecciona independientemente entre hidrógeno, un alquilo opcionalmente sustituido, un fenilo opcionalmente sustituido o un aralquilo C7-C14 opcionalmente sustituido; y cada uno de L1 y L2 se selecciona independientemente entre un enlazador de alquileno opcionalmente sustituido o un enlazador de heteroalquileno opcionalmente sustituido.

Debe entenderse que pueden utilizarse otras moléculas para formar el hidrogel polimérico 42, siempre que estén funcionalizadas para injertar los cebadores 22, 24 o 22, 24’ en él. Otros ejemplos de capas poliméricas adecuadas incluyen aquellas que tienen una estructura coloidal, tal como agarosa; o una estructura de trama polimérica, tal como gelatina; o una estructura de polímero reticulado, tal como polímeros o copolímeros de poliacrilamida, acrilamida exenta de silano (SFA) o una versión azidolizada del SFA. Los ejemplos de polímeros de poliacrilamida adecuados se pueden sintetizar a partir de acrilamida y un ácido acrílico o un ácido acrílico que contenga un grupo vinilo, o a partir de monómeros que forman reacciones de fotocicloadición [2+2]. Otros ejemplos adicionales de hidrogeles 42 poliméricos incluyen copolímeros mixtos de acrilamidas y acrilatos. Pueden utilizarse diversas arquitecturas de polímeros que contienen monómeros acrílicos (por ejemplo, acrilamidas, acrilatos, etc.) en los ejemplos divulgados en la presente memoria, tal como polímeros ramificados, incluidos polímeros en estrella, polímeros en forma de estrella o de estrella-bloque, dendrímeros y similares. Por ejemplo, los monómeros (p. ej., acrilamida, etc.) se pueden incorporar, ya sea aleatoriamente o en bloque, en las ramas (brazos) de un polímero en forma de estrella.

Para introducir el hidrogel polimérico 42 en el canal 32 de flujo, se puede generar una mezcla del hidrogel polimérico 42 y, a continuación, aplicarla al sustrato 30, 30' (incluidas las depresiones 38). En un ejemplo, el hidrogel 42 polimérico puede estar presente en una mezcla (por ejemplo, con agua o con etanol y agua). A continuación, la mezcla se puede aplicar a las superficies de sustrato (incluso en las depresiones 38) mediante recubrimiento por centrifugación, recubrimiento por inmersión, recubrimiento por pulverización o flujo del material bajo presión positiva o negativa, u otra técnica adecuada. Estos tipos de técnicas depositan de forma completa el hidrogel polimérico 42 sobre el sustrato 30, 30' (p. ej., en las depresiones 38 y en las regiones intersticiales 40 que rodean el canal 38 de flujo). Se pueden utilizar otras técnicas de depósito selectivo (p. ej., que involucran una máscara, técnicas de impresión controlada, etc.) para depositar específicamente el hidrogel polimérico 42 en el canal 38 de flujo y no en las regiones intersticiales 40.

En algunos ejemplos, la superficie de sustrato (incluida la porción que está expuesta en las depresiones 38) se puede activar y, a continuación, se puede aplicar la mezcla (incluido el hidrogel polimérico 42) a la misma. En un ejemplo, se puede depositar un silano o un derivado de silano (p. ej., norbornenosilano) sobre la superficie del sustrato usando deposición de vapor, recubrimiento por centrifugación u otros métodos de deposición. En otro ejemplo, la superficie del sustrato puede exponerse a cenizas de plasma para generar agentes activadores de superficie (p. ej., grupos -OH) que pueden adherirse al hidrogel 42 polimérico.

Dependiendo del hidrogel 42 polimérico, la mezcla aplicada puede exponerse a un proceso de curado. En un ejemplo, el curado puede tener lugar a una temperatura que varía de la temperatura ambiente (p. ej., aproximadamente 18 °C a aproximadamente 25 °C) a aproximadamente 95 °C durante un tiempo que varía de aproximadamente 1 milisegundo a aproximadamente varios días.

En algunos ejemplos, se puede realizar a continuación un pulido para eliminar el hidrogel polimérico 42 de las regiones intersticiales 40 en el perímetro de las depresiones 38, dejando al mismo tiempo el hidrogel polimérico 42 en la superficie de las depresiones 38 al menos sustancialmente intacto.

La celda 20 de flujo también incluye el primer y el segundo cebador 22, 24 o 22, 24' de captura. Se puede utilizar cualquier ejemplo de los cebadores 22, 24 o 22, 24' de captura expuestos en la presente memoria. El conjunto de cebadores 22, 24 o 22, 24' de captura que se selecciona para una celda 20 de flujo particular puede depender, en parte, del oligonucleótido 10, 10' para genotipificación que se ha de utilizar con ella.

Se puede realizar un proceso de injerto para injertar el primer y el segundo cebador 22, 24 o 22, 24' de captura en el hidrogel polimérico 42 en las depresiones 38. En un ejemplo, el primer y el segundo cebador 22, 24 o 22, 24' de captura se pueden inmovilizar en el hidrogel polimérico 42 mediante unión covalente de un solo punto en el extremo 5' de cada uno del primer y el segundo cebador 22, 24 o 22, 24', o cerca de él. Esta unión deja i) una porción específica de secuencia de cebador de los cebadores 22, 24 o 22, 24' de captura libre para hibridarse con su secuencia 12 de cebador cognada o la secuencia C18, C18 de cebador copiada, y ii) un grupo hidroxilo (OH) en 3' libre para la extensión del cebador de captura. Se puede utilizar cualquier unión covalente adecuada para la unión del primer y el segundo cebador 22, 24 o 22, 24' de captura al hidrogel polimérico 42. Algunos ejemplos de cebadores terminados que se pueden usar incluyen cebadores terminados en alquino, que se pueden unir a un resto azida del hidrogel 42 polimérico. Como se ha mencionado, los ejemplos específicos de cebadores 22, 24 de captura adecuados incluyen los cebadores P5 y P7, y un ejemplo específico de un cebador 24' de captura adecuado es P7 modificado para incluir el segundo sitio para endonucleasa de restricción.

En un ejemplo, el injerto puede implicar el depósito por flujo continuo (p. ej., utilizando una tapa adherida temporalmente o adherida permanentemente), recubrimiento por inmersión, recubrimiento por pulverización, dispensación en charco u otro método adecuado que unirá el(los) cebador(es) 22, 24 o 22, 24' de captura al hidrogel polimérico 42. Cada una de estas técnicas de ejemplo puede utilizar una solución o mezcla de cebadores, que puede incluir el(los) cebador(es) 22, 24 o 22, 24', agua, un tampón y un catalizador. Con cualquiera de los métodos de injerto, el(los) cebador(es) 22, 24 o 22, 24' reaccionan con los grupos reactivos del hidrogel polimérico 42 en las depresiones 38 y no tienen afinidad por las regiones intersticiales 40 circundantes. Como tal, el(los) cebador(es) 22, 24 o 22, 24' se injerta(n) selectivamente en el hidrogel polimérico 42 en las depresiones 38.

Métodos que implican el genotipado de oligonucleótidos

Los ejemplos del método descrito en la presente memoria generalmente incluyen la introducción de un fluido de sonda para genotipificación en una celda 20 de flujo que incluye las depresiones individuales 38 y el primer y el segundo cebador 22, 24 o 22', 24' de captura en cada una de las depresiones individuales 38, incluyendo el fluido de sonda para genotipificación una pluralidad de oligonucleótidos 10 o 10' para genotipificación, donde un oligonucleótido 10 o 10' para genotipificación respectivo reacciona en al menos algunas de las depresiones individuales 38 para producir poblaciones clonales respectivas de amplicones a partir del oligonucleótido 10 o 10' para genotipificación respectivo; linealizar los amplicones para producir sondas molde; secuenciar al menos una sección de identificación de sonda de las sondas molde para identificar cada una de las secuencias sonda; eliminar al menos las respectivas cadenas nacientes de las sondas molde, donde queda expuesto un grupo OH 3' en un extremo de las sondas molde; hibridar las muestras respectivas con las sondas molde; y realizar las respectivas reacciones de genotipificación de las muestras en los grupos OH 3' expuestos.

En los ejemplos del método, la celda 20 de flujo puede introducirse en un sistema (no mostrado), donde está en comunicación fluida con un sistema de control de fluido (p. ej., bombas, válvulas y similares) y está en comunicación óptica con un sistema de iluminación y un sistema de detección.

Las figuras 3A a 3H juntas ilustran un ejemplo del método que involucra el oligonucleótido 10 para genotipificación.

La figura 3A representa una depresión 38 de la celda 20 de flujo, que incluye el hidrogel polimérico 42 que tiene el primer y el segundo cebador 22, 24 de captura unidos al mismo. Como se describe en la presente memoria, el segundo cebador 24 de captura incluye un sitio 46 de escisión.

En la figura 3B, se introduce un fluido de sonda para genotipificación (no mostrado) en la celda 20 de flujo (p. ej., en cada canal 32 de flujo). En este ejemplo, el fluido de sonda para genotipificación incluye un vehículo líquido y el oligonucleótido 10 para genotipificación en el vehículo líquido. El vehículo líquido del fluido de sonda para genotipificación puede ser cualquier tampón para hibridación adecuado, tal como el tampón Tris-HCl o el tampón de citrato de sodio salino (SSC) 0,5x. En algunos ejemplos, el fluido de sonda para genotipificación incluye una pluralidad de oligonucleótidos 10 para genotipificación, donde cada oligonucleótido 10 para genotipificación incluye una secuencia sonda 14 diferente a la de cada uno de los otros oligonucleótidos 10 para genotipificación. Con este fluido, se pueden suministrar diferentes oligonucleótidos 10 para genotipificación (cada uno con una secuencia sonda 14 única) a diferentes depresiones 38.

Como se muestra en la figura 3B, un oligonucleótido 10 para genotipificación se siembra dentro de la depresión 38. Más específicamente, la segunda secuencia 18 de cebador de un oligonucleótido 10 para genotipificación se hibrida con uno de los segundos cebadores 24 de captura en la depresión 38.

Cuando se siembra un oligonucleótido 10 para genotipificación, la generación de grupos puede iniciarse inmediatamente. En otros ejemplos, se pueden realizar una hibridación (siembra) y una generación de grupos por separado. Los procesos involucrados en la generación de grupos se muestran en la figura 3B, la figura 3C, la figura 3D y la figura 3E.

Como lo indica la flecha en la figura 3B, el oligonucleótido 10 para genotipificación se copia a partir de los cebadores hibridados mediante una extensión en 3' utilizando una ADN-polimerasa. Esto genera el amplicón 44A, que se une a la superficie de la celda de flujo a través del segundo cebador 24 de captura. Las secciones etiquetadas como C<16>, C<14>, C<12>del amplicón 44A son copias complementarias del sitio 16 para endonucleasa de restricción, la secuencia sonda 14 y la primera secuencia 12 de cebador, respectivamente.

El oligonucleótido 10 para genotipificación original se desnaturaliza, dejando el amplicón 44A inmovilizado en la depresión 38 mediante el segundo cebador 24 de captura. El amplicón monocatenario 44<a>se voltea y forma un puente, p. ej., mediante la hibridación de la copia C<12>de la primera secuencia de cebador con un primer cebador 22 de captura complementario adyacente. Esto se muestra en la figura 3C. A continuación, como lo indica la flecha en la figura 3C, el cebador hibridado (primer cebador 22 de captura) se extiende mediante una o más polimerasas para formar otro amplicón 44B. Las secciones CC<16>, CC<14>del amplicón 44B son copias complementarias de las secciones C<16>, C<14>y, por lo tanto, tienen las mismas secuencias que el sitio 16 para endonucleasa de restricción original y la secuencia sonda 14, respectivamente. La sección C<24>del amplicón 44B es una copia complementaria del segundo cebador 24 de captura y, por lo tanto, tiene la misma secuencia que la segunda secuencia 18 de cebador. Como se representa en la figura 3C, la formación del amplicón 44B genera un puente bicatenario que incluye los amplicones 44A y 44B.

A continuación, el puente bicatenario se desnaturaliza, como se muestra en la figura 3D. Esto da como resultado dos copias (amplicones 44A y 44B) que se unen covalentemente a la celda 20 de flujo. La amplificación por puente isotérmico o alguna otra forma de amplificación amplifica las copias inmovilizadas. Por ejemplo, los moldes copiados forman un bucle para hibridarse con un cebador 22, 24 de captura complementario adyacente, y una polimerasa copia los moldes copiados para formar puentes bicatenarios, que se desnaturalizan para formar dos cadenas monocatenarias. Estas dos cadenas forman un bucle y se hibridan con los cebadores 22, 24 de captura complementarios adyacentes, y se extienden de nuevo para formar dos nuevos bucles bicatenarios. El proceso se repite en cada copia de molde mediante ciclos de desnaturalización isotérmica y amplificación para crear grupos clonales densos de puentes bicatenarios. En la figura 3E se muestra un grupo simplificado, que incluye dos puentes bicatenarios.

Debe entenderse que la siembra de los respectivos oligonucleótidos 10 para genotipificación en las depresiones 38 respectivas y la amplificación de dichos oligonucleótidos 10 para genotipificación en las depresiones 38 respectivas pueden tener lugar en condiciones donde la velocidad de amplificación supera la velocidad de siembra. Como tal, la velocidad relativamente rápida a la que se crean copias (amplicones 44A, 44B) dentro de la depresión 38 en la que se ha sembrado un oligonucleótido 10 para genotipificación impedirá eficazmente que un segundo oligonucleótido 10 para genotipificación se siembre dentro de esa depresión 38 para la amplificación. Como tal, se puede capturar y amplificar un oligonucleótido 10 para genotipificación diferente (con una secuencia sonda 14 única) en cada una de las depresiones 38, lo que permite analizar simultáneamente una pluralidad de loci objetivo para genotipificación diferentes en la celda 20 de flujo.

La linealización de los amplicones 44A, 44B en puente se puede realizar escindiendo los amplicones unidos a los segundos cebadores de captura (p. ej., los amplicones 44A) en los sitios 46 de escisión respectivos de los segundos cebadores 24 de captura; y desnaturalizar las porciones escindidas de los amplicones (p. ej., los amplicones 44A) unidas a los segundos cebadores 24 de captura para producir las sondas molde 48 (figura 3F).

Para iniciar la escisión, se puede introducir un agente de escisión en la celda 20 de flujo, p. ej., a través de un puerto de entrada (no mostrado). El agente de escisión que se seleccione dependerá del sitio 46 de escisión del segundo cebador 24 de captura. El agente de escisión puede ser un agente de escisión química o un agente de escisión enzimático dependiendo del sitio 46 de escisión. La escisión en el sitio 46 de escisión separa los amplicones 44A entre los segundos cebadores 24 de captura y el resto de la secuencia de amplicón (que incluye las secciones C<16>, C<14>y C<12>o las secciones C<16>, C<14>y C<22>[que es una copia complementaria del cebador 22 de captura]).

Como resultado de la escisión, las secciones C<16>, C<14>y C<12>y las secciones C<16>, C<14>y C<22>ya no están unidas a la superficie de la celda de flujo a través de un cebador 24 y, por lo tanto, se pueden eliminar mediante desnaturalización. La desnaturalización puede tener lugar usando cualquier condición adecuada. La eliminación de las secciones C<16>, C<14>y C<12>y las secciones C<16>, C<14>y C<22>deja los amplicones 44B unidos a la superficie de la celda de flujo a través del primer cebador 22 de captura e hibridados con los segundos cebadores 24 de captura (a través de la sección C<24>). En este ejemplo, la porción monocatenaria expuesta de los amplicones 44B, específicamente las secciones CC<16>y CC<14>, constituyen la sonda molde 48. La sección CC<14>es una copia complementaria de la sección C<14>y, por lo tanto, tiene la misma secuencia que la secuencia sonda 14. La secuenciación de esta sección CC<14>permite identificar/decodificar la secuencia sonda original 14. En algunos casos, una porción de la sección CC<14>se puede secuenciar para identificar o decodificar la secuencia sonda original. La sección CC<16>es una copia complementaria de la sección C<16>y, por lo tanto, tiene la misma secuencia que el sitio 16 para la enzima de restricción. Después de la secuenciación, la sección bicatenaria que incluye CC<16>y N<16>(figura 3G) proporciona un sustrato para la escisión por enzimas de restricción.

Después de la escisión y la desnaturalización, cada segundo cebador 24 de captura puede tener un fosfato 3' en su extremo, que debe eliminarse antes del procesamiento posterior. El fosfato 3' se puede eliminar mediante la introducción de una quinasa, que desprotege el segundo cebador 24 de captura, haciéndolo adecuado para una utilización como cebador de secuenciación (como se describe en referencia a la figura 3G).

La figura 3G ilustra la secuenciación de la sonda molde 48, que incluye las secciones CC<16>y CC<14>, la última de las cuales es la al menos una sección de identificación de sonda.

En el ejemplo mostrado, la secuenciación de la sonda molde 48 implica utilizar el segundo cebador 24 de captura como cebador de secuenciación y realizar una reacción de extensión de bases (una base a la vez) a lo largo de la sonda molde 48.

En otro ejemplo, la sección C<24>y el segundo cebador 24 de captura se pueden desnaturalizar y se puede añadir un cebador de secuenciación separado (que está en una solución). El cebador de secuenciación separado se puede hibridar con la sección C<24>, y se realizaría una reacción de extensión de bases (una base a la vez) a lo largo de la sonda molde 48.

El proceso químico subyacente para la secuenciación puede ser la polimerización (p. ej., catalizada por una enzima polimerasa). En un proceso particular basado en polimerasa, se añaden los nucleótidos marcados con fluorescencia al segundo cebador 24 de una manera dependiente del molde, de tal modo que pueda realizarse la detección del orden y el tipo de nucleótidos añadidos al segundo cebador 24 de captura. Esto permite determinar la secuencia de la sección de identificación de sonda, p. ej., la sección CC<14>, que se puede utilizar para decodificar la secuencia sonda original 14.

Por ejemplo, para iniciar un primer ciclo de secuenciación, se pueden suministrar uno o más nucleótidos marcados, ADN-polimerasa, etc. en o a través de la celda 20 de flujo, etc., donde la extensión del cebador de secuenciación provoca la incorporación de un nucleótido marcado a la sonda molde 48. Esta incorporación se puede detectar a través de un evento de formación de imagen. Durante un procedimiento de obtención de imágenes, el sistema de iluminación puede proporcionar una luz de excitación a la celda 20 de flujo.

En algunos ejemplos, los nucleótidos marcados con fluorescencia también pueden incluir una propiedad de terminación reversible que termina la extensión adicional del cebador una vez que se ha añadido un nucleótido al molde 48. Por ejemplo, se puede añadir al molde 48 un análogo de nucleótido que tenga un resto de terminador reversible, de tal forma que no pueda producirse la extensión posterior hasta que no se suministre un agente de desbloqueo para eliminar el resto. Por tanto, para los ejemplos que utilizan terminación reversible, puede suministrarse un reactivo de desbloqueo a la celda 20 de flujo, etc. (después de que se produzca la detección).

Pueden realizarse lavados entre las diversas etapas de suministro de fluidos. A continuación, el ciclo de secuenciación se puede repetir n veces para extender el molde 48 en n nucleótidos, generando así una cadena naciente que incluye la sección naciente N<16>(que es complementaria a la sección CC<16>) y la sección naciente N<14>(que es complementaria a la sección CC<14>).

La secuenciación de la sección CC<14>proporciona la sección N<14>de cadena naciente, que puede utilizarse para decodificar la secuencia sonda original 14 del oligonucleótido 10 para genotipificación. Esta información permite al usuario identificar el locus objetivo para genotipificación que se analizará en una depresión particular 38 (ya que todos los moldes 48 en una depresión 38 tienen la misma sección de identificación de sonda, p. ej., CC<14>).

La secuenciación de la sección CC<16>proporciona la sección N<16>de cadena naciente. Como tal, este ejemplo de secuenciación también genera la sección bicatenaria, que incluye tanto la CC<16>como la N<16>, que proporciona un sustrato para la escisión por enzimas de restricción.

Después de secuenciar la(s) sección(es) de identificación de sonda, el método incluye además eliminar al menos las respectivas cadenas nacientes (que incluyen las secciones N<14>y N<16>) de las sondas molde 48, donde queda expuesto un grupo OH 3' en un extremo de las sondas molde 48. En este ejemplo, la eliminación implica más que solo la eliminación de las cadenas nacientes N<14>y N<16>. En este ejemplo, la eliminación implica digerir los sitios para endonucleasa de restricción, p. ej., las secciones CC<16>y N<16>, y desnaturalizar la cadena naciente restante, incluida la sección N<14>, de las sondas molde 48.

La sonda molde 48 incluye la sección CC<16>(que tiene la misma secuencia que el sitio 16 para endonucleasa de restricción) y la cadena naciente incluye la sección N<16>(que es complementaria al sitio 16 para endonucleasa de restricción). Esta porción bicatenaria (secciones CC<16>y N<16>) crea un sustrato para una endonucleasa de restricción apropiada (enzima de restricción). Como tal, mediante la introducción de la endonucleasa de restricción, los sitios para endonucleasa de restricción, en este ejemplo, la sección CC<16>y la sección N<16>, pueden digerirse. Como se menciona en la presente memoria, la enzima de restricción puede ser una endonucleasa de restricción de corte de 4 bases, una endonucleasa de restricción de corte de 5 bases, una endonucleasa de restricción de corte de 6 bases o similares. La enzima de restricción escinde las secciones CC<16>, N<16>en nucleótidos específicos, que se identifican esquemáticamente mediante las estrellas en la figura 3G. En este ejemplo, después de la digestión de sitios para endonucleasa de restricción, quedan el segundo cebador 24 de captura y el primer cebador 22 de captura que tiene la sección CC<14>unida al mismo, y la cadena naciente N<14>hibridada con la sección CC<14>. A continuación, la cadena naciente N<14>se desnaturaliza de la sección CC<14>. La digestión y la desnaturalización permiten que la sección CC<16>y las cadenas nacientes N<14>, N<16>se eliminen de la depresión 38 y la celda 20 de flujo, p. ej., mediante un paso de lavado.

La digestión y la desnaturalización exponen un OH 3' en un extremo de lo que queda de la sonda molde 48. La sonda molde restante se muestra en el número de referencia 52 en la figura 3H. La sonda molde 52 restante incluye el primer cebador 22 de captura y la sección CC<14>, que es la misma que la secuencia sonda original 14 y, por lo tanto, en este ejemplo, es complementaria a una muestra de ADN que tiene el locus objetivo 54 para genotipificación.

Una muestra de fragmentos de ADN desnaturalizados, que incluye el locus objetivo 54 para genotipificación, se introduce en la celda 20 de flujo. El locus objetivo 54 para genotipificación se puede incluir en un fluido de biblioteca que incluye una pluralidad de loci objetivo para genotipificación, al menos algunos de los cuales tienen loci diferentes que se han de genotipificar. Los loci objetivo para genotipificación se pueden preparar a partir de la muestra de ADN más grande utilizando cualquier técnica de preparación de bibliotecas de genotipificación. Algunas técnicas de preparación de bibliotecas de genotipado implican amplificación y fragmentación. Otros implican la amplificación sin fragmentación (ejemplos de los cuales se describen más adelante). Como tal, varias copias de uno cualquiera de los tipos de locus objetivo 54 para genotipificación pueden estar presentes en el fluido de biblioteca.

Una vez introducidos en la celda 20 de flujo, los loci objetivo 54 para genotipificación se hibridan con las respectivas secciones complementarias CC<14>de las sondas molde 52 restantes en la depresión 38.

A continuación, se puede realizar la reacción de genotipado. En esta reacción, la sonda molde 52 restante se utiliza como cebador de secuenciación para realizar un ciclo de secuenciación como se describe en la presente memoria. Como se muestra en la figura 3H, un nucleótido 57 marcado, que es complementario a la nucleobase de interés en el locus objetivo 54 para genotipificación, se incorpora en la sonda molde 52 restante.

51 bien la descripción en la presente memoria se refiere a una depresión 38 y, por lo tanto, a la genotipificación de un locus objetivo 54 para genotipificación, debe entenderse que cada depresión 38 incluye diferentes sondas molde 52 con diferentes secciones CC<14>. Como tal, con este método, se pueden genotipificar simultáneamente de cientos a miles o millones (dependiendo del número de depresiones en la celda 20 de flujo) de diferentes loci.

Las figuras 4A a 4H juntas ilustran otro ejemplo del método que involucra el oligonucleótido 10' para genotipificación.

La figura 4A representa una depresión 38 de la celda 20 de flujo, que incluye el hidrogel polimérico 42 que tiene el primer y el segundo cebador 22, 24' de captura unidos al mismo. Como se describe en la presente memoria, el segundo cebador 24' de captura incluye el segundo sitio 46' para endonucleasa de restricción.

En la figura 4B, se introduce un fluido de sonda para genotipificación (no mostrado) en la celda 20 de flujo (p. ej., en cada canal 32 de flujo). En este ejemplo, el fluido de sonda para genotipificación incluye un vehículo líquido y el oligonucleótido 10' para genotipificación en el vehículo líquido. El vehículo líquido puede ser cualquiera de los ejemplos descritos en la presente memoria. En algunos ejemplos, el fluido de sonda para genotipificación incluye una pluralidad de oligonucleótidos 10' para genotipificación, donde cada oligonucleótido 10' para genotipificación incluye una secuencia sonda 14 diferente a la de cada uno de los otros oligonucleótidos 10' para genotipificación. Con este fluido, se pueden suministrar diferentes oligonucleótidos 10' para genotipificación (cada uno con una secuencia sonda única 14) a diferentes depresiones 38.

Como se muestra en la figura 4B, un oligonucleótido 10' para genotipificación se siembra dentro de la depresión 38. Más específicamente, la segunda secuencia 18' de cebador y el sitio 16' para endonucleasa de restricción de un oligonucleótido 10' para genotipificación se hibridan respectivamente con uno de los segundos cebadores 24' de captura y su sitio 46' para endonucleasa de restricción en la depresión 38.

Cuando se siembra un oligonucleótido 10' para genotipificación, la generación de grupos puede iniciarse inmediatamente. En otros ejemplos, se pueden realizar una hibridación (siembra) y una generación de grupos por separado. Los procesos involucrados en la generación de grupos se muestran en la figura 4B, la figura 4C, la figura 4D y la figura 4E.

Como se representa mediante la flecha en la figura 4B, el oligonucleótido 10' para genotipificación se copia a partir de los cebadores hibridados mediante una extensión en 3' utilizando una ADN-polimerasa de alta fidelidad. Esto genera el amplicón 44C, que se une a la superficie de la celda de flujo a través del segundo cebador 24' de captura. Las secciones etiquetadas como C<14>, C<28>, C<26>y C<12>del amplicón 44C son copias complementarias de la secuencia sonda 14, la porción 28 de sitio de cebado, la porción 26 de secuencia índice y la primera secuencia 12 de cebador, respectivamente.

El oligonucleótido 10' para genotipificación original se desnaturaliza, dejando el amplicón 44C inmovilizado en la depresión 38 a través del segundo cebador 24' de captura y el segundo sitio 46' para endonucleasa de restricción. El amplicón monocatenario 44C se voltea y forma un puente, por ejemplo, mediante la hibridación de la copia de la primera secuencia C<12>de cebador con un primer cebador 22 de captura complementario adyacente. Esto se muestra en la figura 4C.

A continuación, como lo indica la flecha en la figura 4C, el cebador hibridado se extiende mediante una o más polimerasas para formar otro amplicón 44D. Las secciones CC<14>, CC<26>, CC<28>del amplicón 44D son copias complementarias de las secciones C<14>, C<26>, C<28>y, por lo tanto, tienen las mismas secuencias que la secuencia sonda original 14, la porción 26 de secuencia índice y la porción 28 de sitio de cebado, respectivamente. La sección C<46>del amplicón 44D es una copia complementaria del segundo sitio 46' para endonucleasa de restricción y, por lo tanto, tiene la misma secuencia que el sitio 16' para endonucleasa de restricción del oligonucleótido 10' para genotipificación. La sección C<24>del amplicón 44D es una copia complementaria del segundo cebador 24' de captura y, por lo tanto, tiene la misma secuencia que la segunda secuencia 18' de cebador. Como se representa en la figura 4C, la formación del amplicón 44D genera un puente bicatenario que incluye los amplicones 44<c>y 44D unidos covalentemente a la celda 20 de flujo.

A continuación, el puente bicatenario se desnaturaliza, como se muestra en la figura 4D. Esto da como resultado dos copias (amplicones 44C y 44D) que se unen covalentemente a la celda 20 de flujo. La amplificación por puente isotérmico o alguna otra forma de amplificación amplifica las copias inmovilizadas. Por ejemplo, los moldes copiados se hibridan en bucle con un cebador 22, 24' de captura complementario adyacente, y una polimerasa copia los moldes copiados para formar puentes bicatenarios, que se desnaturalizan para formar dos cadenas monocatenarias. Estas dos cadenas forman un bucle y se hibridan con los cebadores 22, 24 de captura complementarios adyacentes y se extienden de nuevo para formar dos nuevos bucles bicatenarios. El proceso se repite en cada copia de molde mediante ciclos de desnaturalización isotérmica y amplificación para crear grupos clonales densos de puentes bicatenarios. En la figura 4E se muestra un grupo simplificado, que incluye dos puentes bicatenarios.

Debe entenderse que la siembra de los respectivos oligonucleótidos 10' para genotipificación en las respectivas depresiones 38 y la amplificación de dichos oligonucleótidos 10' para genotipificación en las depresiones 38 respectivas pueden tener lugar en condiciones donde la velocidad de amplificación supere la velocidad de siembra. Como tal, la velocidad relativamente rápida a la que se producen copias (amplicones 44C, 44D) dentro de la depresión 38 en la que se ha sembrado un oligonucleótido 10' para genotipificación impedirá eficazmente que un segundo oligonucleótido 10' para genotipificación se siembre dentro de esa depresión 38 para la amplificación. Como tal, se puede capturar y amplificar un oligonucleótido 10' para genotipificación diferente (con una secuencia sonda única 14) en cada una de las depresiones 38, lo que permite analizar simultáneamente una pluralidad de loci objetivo para genotipificación diferentes en la celda 20 de flujo.

En este ejemplo, la amplificación se puede realizar utilizando dCTP (trifosfato de desoxicitidina) metilado para proteger el sitio 16' para endonucleasa de restricción y las copias complementarias C<46'>del segundo sitio 46' para endonucleasa de restricción. Esta modificación metilará completamente los amplicones 44C, 44D y metilará a la mitad los cebadores 22, 24' de captura (incluido el segundo sitio 46' para endonucleasa de restricción).

A continuación, se linealizan los puentes bicatenarios. La linealización se describe con referencia a la figura 4E y la figura 4F. La linealización de los amplicones 44C, 44D en puente en este método de ejemplo se puede realizar digiriendo la porción 56 para endonucleasa de restricción de los amplicones 44C, 44D para dejar los segundos cebadores 24' de captura en las depresiones 38; y desnaturalizar una porción restante de los amplicones 44C, 44D para producir sondas molde monocatenarias 49 que incluyen los primeros cebadores 22 de captura y la al menos una sección de identificación de sonda en las depresiones 38. El resultado del proceso de linealización se muestra en la figura 4F.

En este ejemplo, cada uno de los segundos cebadores 24' de captura incluye además el segundo sitio 46' para endonucleasa de restricción, en donde el segundo sitio 46' para endonucleasa de restricción es complementario al sitio 16' para endonucleasa de restricción del oligonucleótido 10' para genotipificación y, por lo tanto, también es complementario a la sección C<46'>. Como se muestra en la figura 4E, los puentes bicatenarios incluyen las secciones hibridadas 46', C<46'>, que proporcionan los sustratos respectivos para la escisión por enzimas de restricción. Más específicamente, las secciones hibridadas C<46>y 46' de los amplicones 44<c>, 44D en puente constituyen la porción 56 para endonucleasa de restricción, que es reconocible por una enzima de restricción de tipo IIS. En este ejemplo, la digestión de la porción 56 para endonucleasa de restricción se logra mediante la introducción de la enzima de restricción de tipo IIS. La enzima de restricción de tipo IIS puede ser sensible al metilo o puede no ser sensible al metilo. Los protocolos metilados protegerán los sitios internos de las copias C<14>, CC<14>de la secuencia sonda y/o pueden proteger los cortes simétricos. La enzima de restricción de tipo IIS reconocerá las secuencias de ADN asimétricas de la porción 56 y las escindirá a una distancia definida (p. ej., de 1 nucleótido a aproximadamente 20 nucleótidos) fuera de la porción 56. La digestión deja los segundos cebadores 24' de captura unidos a la celda 20 de flujo y también escinde el amplicón 44C en una posición deseada para la genotipificación.

A continuación, las porciones restantes de los amplicones 44C, 44D se pueden desnaturalizar, dejando sondas molde monocatenarias 49 unidas a la celda 20 de flujo. Como se muestra en la figura 4F, las sondas molde monocatenarias 49 incluyen los primeros cebadores 22 de captura y al menos una sección de identificación de sonda, que en este ejemplo incluye parte o la totalidad de la sección CC<14>, así como las secciones CC<28>y CC<26>.

El método puede comprender además bloquear los segundos cebadores 24' de captura antes de la secuenciación a lo largo de al menos una sección de identificación de sonda de cada una de las primeras sondas molde monocatenarias 49. Se puede añadir un grupo bloqueador (p. ej., un fosfato 3') que se una a los extremos 3' expuestos de los segundos cebadores 24' de captura para evitar una extensión que no se desea en estos cebadores 24'.

Haciendo referencia ahora a la figura 4F, se representa la secuenciación de al menos una sección de identificación de sonda de las sondas molde monocatenarias 49. En este ejemplo, la al menos una sección de identificación de sonda es la sección CC<26>, que es idéntica a la porción 26 de secuenciación de índice.

La secuenciación de al menos una sección de identificación de sonda implica la introducción de un cebador 50 de secuenciación, que se hibrida con la sección CC<28>, que es idéntica a la porción 28 de sitio de cebado. Este cebador 50 de secuenciación hace que al menos una sección de identificación de sonda, p. ej., la CC<26>, de la sonda molde monocatenaria 49 esté lista para la secuenciación. A continuación, se lleva a cabo una reacción de extensión de base a lo largo de la sección CC<26>.

El proceso químico subyacente para la secuenciación puede ser la polimerización (p. ej., catalizada por una enzima polimerasa) como se describe en la presente memoria con referencia a la figura 3G.

Para iniciar un primer ciclo de secuenciación, se pueden suministrar uno o más nucleótidos marcados, la ADN-polimerasa, etc., a la celda 20 de flujo, etc., o a través de ella, donde la extensión del cebador de secuenciación hace que un nucleótido marcado se incorpore a una cadena naciente N<26>formada a lo largo de la sección CC<26>de la sonda molde monocatenaria 49. Esta incorporación se puede detectar a través de un evento de formación de imagen.

En algunos ejemplos, los nucleótidos marcados con fluorescencia pueden incluir además una propiedad de terminación reversible que termina la extensión adicional del cebador una vez que se ha añadido un nucleótido a la cadena naciente N<26>. Por tanto, para los ejemplos que utilizan terminación reversible, puede suministrarse un reactivo de desbloqueo a la celda 20 de flujo, etc. (después de que se produzca la detección).

Pueden realizarse lavados entre las diversas etapas de suministro de fluidos. A continuación, el ciclo de secuenciación puede repetirse n veces para extender la sonda molde monocatenaria 49 en n nucleótidos para generar una cadena naciente que incluye la sección naciente N<26>(que es complementaria a la sección CC<26>, que tiene la misma secuencia que la porción 26 de secuenciación de índice).

La secuenciación de la cadena naciente N<26>se puede utilizar para identificar la sección CC<26>y, por lo tanto, la porción 26 de secuenciación de índice original, que es exclusiva de la secuencia sonda 14 (y su copia complementaria C<14>). Esta información permite al usuario identificar el locus objetivo para genotipificación que se analizará en una depresión particular 38 (ya que todos los moldes 49 en una depresión 38 tienen la misma sección de identificación de sonda, p. ej., CC<26>, y la misma sección de secuencia sonda, p. ej., CC<14>).

Después de secuenciar la(s) sección(es) de identificación de sonda, el método incluye además eliminar al menos las respectivas cadenas nacientes (que incluyen la sección N<26>) de las sondas molde monocatenarias 49. En este ejemplo, la eliminación implica desnaturalizar el cebador 50 de secuenciación y la cadena naciente N<26>.

Una muestra de fragmentos de ADN monocatenario, que incluye el locus objetivo 54 para genotipificación, se introduce en la celda 20 de flujo, como se muestra en la figura 4h . El locus objetivo 54 para genotipificación se puede incluir en un fluido de biblioteca que incluye una pluralidad de loci objetivo para genotipificación, al menos algunos de los cuales tienen loci diferentes que se han de genotipificar. Los loci objetivo para genotipificación se pueden preparar a partir de la muestra de ADN más grande utilizando cualquier técnica de preparación de bibliotecas de genotipificación. Algunas técnicas de preparación de bibliotecas de genotipado implican amplificación y fragmentación. Otras implican la amplificación sin fragmentación, como se describe más adelante. Como tal, varias copias de uno cualquiera de los tipos de locus objetivo 54 para genotipificación pueden estar presentes en el fluido de biblioteca.

Una vez introducidos en la celda 20 de flujo, los loci objetivo 54 para genotipificación se hibridan con las respectivas secciones complementarias CC<14>de las sondas molde monocatenarias 49 en la depresión 38.

A continuación, se puede realizar la reacción de genotipado. En esta reacción, la sonda molde monocatenaria 49 se utiliza como cebador de secuenciación para realizar un ciclo de secuenciación como se describe en la presente memoria. Como se muestra en la figura 4H, un nucleótido 57 marcado, que es complementario a la nucleobase de interés en el locus objetivo 54 para genotipificación, se incorpora en la sonda molde monocatenaria 49.

Si bien la descripción en la presente memoria se refiere a una depresión 38 y, por lo tanto, a la genotipificación de un locus objetivo 54 para genotipificación, debe entenderse que cada depresión 38 incluye diferentes sondas molde monocatenarias 49 con diferentes secciones CC<14>. Como tal, con este método, se pueden genotipificar simultáneamente de cientos a miles o millones (dependiendo del número de depresiones en la celda 20 de flujo) de diferentes loci.

En los ejemplos descritos en la presente memoria, en lugar de bloquear los segundos cebadores 24 o 24' de captura durante la secuenciación y/o la genotipificación, estos cebadores 24 o 24' podrían escindirse después de las reacciones de decodificación utilizando un proceso de escisión que no afectará de manera perjudicial a los moldes 48 o 49 que se han de genotipificar.

Técnica de preparación de bibliotecas de genotipado

Se puede utilizar cualquier técnica adecuada de preparación de bibliotecas de genotipificación para preparar el locus objetivo 54 para genotipificación.

El locus objetivo 54 para genotipificación puede prepararse a partir de ADN genómico. El ADN genómico se puede aislar de una o más células, fluidos corporales o tejidos. Se puede utilizar cualquier método adecuado para obtener un fluido corporal (p. ej., sangre, sudor, lágrimas, linfa, orina, saliva, semen, líquido cefalorraquídeo, heces o líquido amniótico). Algunos ejemplos específicos incluyen un hisopado bucal, un enjuague bucal, una extirpación quirúrgica, una biopsia por aspiración o similares. El ADN genómico también se puede obtener de una o más células o tejidos en un cultivo primario, en una línea celular propagada, una muestra previamente conservada fijada, una muestra forense o una muestra arqueológica.

El ADNg se puede preparar lisando una célula que contiene el ADN. La célula puede lisarse en condiciones que preserven sustancialmente la integridad del ADNg de la célula. En un ejemplo particular, se puede utilizar la lisis térmica para lisar una célula. En otro ejemplo particular, la exposición de una célula a un pH alcalino se puede utilizar para lisar una célula, causando relativamente poco daño al ADNg. Se puede utilizar cualquiera de una variedad de compuestos básicos para la lisis, incluidos, por ejemplo, hidróxido de potasio, hidróxido de sodio y similares. Además, se puede obtener ADNg relativamente intacto de una célula lisada por una enzima que degrada la pared celular. Las células que carecen de pared celular, ya sea de forma natural o debido a la eliminación enzimática, también se pueden lisar mediante exposición al estrés osmótico. Otras condiciones que se pueden utilizar para lisar una célula incluyen la exposición a detergentes, la disrupción mecánica, el calor ultrasónico, el diferencial de presión, tal como en un dispositivo de prensa francesa, o la homogeneización de Dounce. Se pueden incluir agentes que estabilizan el ADNg en un lisado celular o una muestra de ADNg aislada, incluidos, por ejemplo, inhibidores de nucleasas, agentes quelantes, sales, tampones y similares.

En algunos ejemplos, un lisado celular bruto que contiene ADNg se puede amplificar directamente sin aislamiento adicional del ADNg. Por ejemplo, una muestra de sangre se puede exponer a lisis térmica y, a continuación, el lisado celular bruto se puede amplificar utilizando cualquier método adecuado, incluidos los descritos en la presente memoria. Alternativamente, el ADNg puede aislarse adicionalmente de otros componentes celulares antes de la amplificación. Por consiguiente, la amplificación se puede llevar a cabo en ADNg purificado o parcialmente purificado. El ADN genómico se puede aislar utilizando métodos conocidos que incluyen, por ejemplo, extracción en fase líquida, precipitación, extracción en fase sólida, cromatografía y similares.

Se puede proporcionar una población representativa amplificada de fragmentos de genoma (loci 54 objetivo para genotipificación) amplificando un genoma nativo en condiciones que replican el ADN genómico (ADNg) molde para producir una o más copias en las que la proporción relativa de cada secuencia copiada sea sustancialmente la misma que su proporción en el ADNg original. Se puede utilizar cualquiera de una variedad de métodos que replican el ADN genómico de una manera independiente de la secuencia para preparar los loci 54 objetivo para genotipificación. En los ejemplos descritos en la presente memoria, el ADN genómico bicatenario se puede desnaturalizar para generar varios<a>D<n>genómicos monocatenarios molde que se pueden utilizar en los procesos de amplificación.

En un ejemplo específico, el método de amplificación implica poner en contacto un ADN genómico monocatenario con una polimerasa de baja procesividad, una pluralidad de cebadores y nucleótidos libres, generando de este modo fragmentos complementarios del ADN genómico monocatenario molde; y desplazar los fragmentos complementarios del ADN genómico monocatenario molde, generando de este modo al menos algunas de las muestras respectivas.

La polimerasa de baja procesividad puede sintetizar cadenas cortas porque se desprenden naturalmente del ADN genómico monocatenario molde antes de que se replique toda la cadena. Algunos ejemplos de la polimerasa de baja procesividad pueden sintetizar menos de 100 bases por evento de polimerización. Se pueden obtener fragmentos más cortos utilizando una polimerasa que sintetiza menos de 50, 40, 30, 20, 10 o 5 bases por evento de polimerización en las condiciones de amplificación. La polimerasa de baja procesividad se selecciona del grupo que consiste en la ADN-polimerasa T4, la ADN-polimerasa T7, la polimerasa Taq, el fragmento de Stoffel (fragmento de la ADN-polimerasa Taq), el fragmento de Klenow (el fragmento grande de la ADN-polimerasa I de Escherichia coli), la ADN-polimerasa Bsu, la ADN-polimerasa Bst y una polimerasa diseñada. En este método de ejemplo, el término “ polimerasa modificada” es cualquier polimerasa sintética que está diseñada para sintetizar menos de 100 bases por evento de polimerización. Otras polimerasas de baja procesividad adecuadas incluyen la Pol III monomérica deE. coli(que carece de la subunidad beta) o Pol I deE. coli.

La procesividad de algunas polimerasas puede alterarse por las condiciones de procesamiento que se usan. Por ejemplo, la procesividad puede verse alterada por la temperatura de la reacción, el nivel de sal (p. ej., Mg2+) en la reacción (p. ej., la fuerza iónica), el pH, la composición del tampón (p. ej., creatina quinasa o A<m>P<c>[adenosina monofosfato cíclico]) o combinaciones de los mismos. Como ejemplo, una ADN-polimerasa T7 tiene baja procesividad a temperaturas inferiores a 37 °C, y también a altas fuerzas iónicas, p. ej., más de aproximadamente 100 mM de NaCl; pero por lo demás tiene una alta procesividad. Como otro ejemplo, una polimerasa Taq tiene una alta procesividad a temperaturas de alrededor de 70 °C cuando reacciona con un exceso molar de 10 veces con respecto a las muestras de ADN y los cebadores aleatorios. En otro ejemplo, la polimerización del fragmento de Klenow de la ADN-polimerasa de Escherichia coli se puede ralentizar reduciendo el pH a menos de 6,2. En otro ejemplo más, la eficacia de la ADN-polimerasa BST (BST pol), una ADN-polimerasa de la familia A, se puede manipular varias veces mediante la sustitución de cofactores metálicos tales como Mg++ y Cd++.

Los cebadores pueden ser cebadores aleatorios. Se puede sintetizar una población de cebadores aleatorios para incluir un mayor contenido de nucleótidos de guanina (G) y/o citosina (C) en comparación con los nucleótidos de adenina (A) y timidina (T). La población de cebadores aleatorios resultante será rica en g C y, por lo tanto, tendrá una mayor probabilidad de hibridarse con regiones de alto contenido de GC de un genoma, tales como las regiones que codifican genes de un genoma humano que típicamente tienen un contenido de GC más alto que el de las regiones de ADNg no codificantes. Los cebadores de una población de cebadores aleatorios también pueden tener una región de secuencia idéntica, tal como una cola universal. Una cola universal puede incluir un sitio de cebado universal para la amplificación.

En este método de ejemplo, los nucleótidos libres pueden incluir cualquier nucleótido natural, tal como trifosfato de desoxiadenina, trifosfato de desoxitimina, trifosfato de desoxiguanina y trifosfato de desoxicitosina.

Poner en contacto el ADN genómico monocatenario molde con la polimerasa de baja procesividad, la pluralidad de cebadores y los nucleótidos libres puede implicar mezclar los diversos componentes entre sí y exponerlos a condiciones de amplificación adecuadas para la polimerasa de baja procesividad que se esté utilizando. Durante la amplificación, los cebadores se unen a diferentes porciones del ADN genómico monocatenario molde, y la polimerasa de baja procesividad introduce nucleótidos libres complementarios en la cadena molde según la secuencia de la cadena molde. La polimerasa de baja procesividad se desprende naturalmente de la cadena molde, usualmente después de que se hayan replicado 100 bases o menos. Los fragmentos complementarios replicados se pueden desplazar utilizando, p. ej., la desnaturalización. El método puede incluir repetir tanto la puesta en contacto como el desplazamiento de un número predeterminado de ciclos para generar fragmentos complementarios adicionales en cada uno del número predeterminado de ciclos.

Los siguientes son algunos ejemplos de este método.

La ADN-polimerasa T4 se puede utilizar para la amplificación de ADNg monocatenario o desnaturalizado, por ejemplo, en aproximadamente 50 mM de N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(ácido 2-etanosulfónico) (HEPES) (pH 7,5), aproximadamente 50 mM de Tris-HCl (pH 8,6) o aproximadamente 50 mM de glicinato (pH 9,7). Las mezclas de reacción de ejemplo también pueden incluir aproximadamente 50 mM de KCI, aproximadamente 5 mM de MgCb, aproximadamente 5 mM de ditiotreitol (DTT), aproximadamente 40 pg/ml de ADNg, aproximadamente 0,2 mM de cada dNTP, aproximadamente 50 pg/ml de albúmina de suero bovino (BSA), aproximadamente 100 pM de cebador aleatorio (n = 6) y aproximadamente 10 unidades de ADN-polimerasa T4 incubadas a 37 °C durante al menos una hora. Los ciclos de temperatura se pueden utilizar para desplazar las cadenas replicadas durante múltiples rondas de amplificación.

La polimerasa Taq tiene baja procesividad a temperaturas inferiores a 70 °C. Por consiguiente, se pueden obtener pequeños fragmentos de ADNg utilizando la polimerasa Taq a baja temperatura, o en otra condición en la que la Taq tenga una procesividad baja. En otro ejemplo, el fragmento de Stoffel, que carece de los 289 residuos de aminoácidos del extremo N-terminal de la polimerasa Taq y tiene una procesividad baja a 70 °C, se puede utilizar para generar fragmentos de ADNg relativamente pequeños. El fragmento de Taq o Stoffel se puede utilizar para amplificar ADN monocatenarios o desnaturalizados molde, y el ciclo de temperatura se puede utilizar para desplazar las cadenas replicadas durante múltiples rondas de amplificación.

El fragmento de Klenow se puede usar para la amplificación isotérmica de un genoma para producir pequeños fragmentos de ADN genómico, por ejemplo, en una reacción baja en sal (I = 0,085) incubada a una temperatura entre aproximadamente 5 °C y 37 °C. Los tampones y condiciones de pH de ejemplo que pueden utilizarse para amplificar el ADNg con el fragmento de Klenow incluyen, por ejemplo, aproximadamente 50 mM de Tris HCl (pH 7,5), aproximadamente 5 mM de MgCfc, aproximadamente 50 mM de NaCl, aproximadamente 50 pg/ml de albúmina de suero bovino (BSA), aproximadamente 0,2 mM de cada dNTP, aproximadamente 2 pg de cebador aleatorio (n = 6), aproximadamente 10 ng de ADNg molde y aproximadamente 5 unidades del fragmento de Klenow incubado a 37 °C durante aproximadamente 16 horas. Se pueden llevar a cabo reacciones similares en las que se omiten o sustituyen uno o más componentes de reacción. Por ejemplo, el tampón se puede reemplazar con aproximadamente 50 mM de fosfato (pH 7,4) o se pueden utilizar otros valores de pH en el intervalo de aproximadamente 7,0 a 7,8. En otro ejemplo, las condiciones para la amplificación utilizando el fragmento de Klenow pueden incluir, por ejemplo, aproximadamente 10 ng de ADNg molde, aproximadamente 2 mM de dNTP, aproximadamente 10 mM de MgCfc, aproximadamente 0,5 U/pl (microlitro) de polimerasa, aproximadamente 50 uM (micromolar) de cebador aleatorio (n = 6) e incubación isotérmica a 37 °C durante l6 horas.

Otro ejemplo del método de amplificación descrito en la presente memoria implica poner en contacto un ADN genómico monocatenario molde con una polimerasa, una pluralidad de cebadores y una mezcla de nucleótidos libres que incluyen nucleótidos naturales y trifosfato de didesoxitimidina (ddTTP), generando de este modo fragmentos complementarios truncados del ADN genómico monocatenario molde; y desplazar los fragmentos complementarios truncados del ADN genómico monocatenario molde, generando de este modo al menos algunas de las muestras respectivas.

En este ejemplo, se puede usar cualquier polimerasa adecuada. El ddTTP actúa como un agente de truncamiento y, por lo tanto, se puede utilizar una polimerasa de alta procesividad. Cualquiera de las polimerasas expuestas en la presente memoria se puede utilizar en este método de ejemplo, siempre que las condiciones de procesamiento puedan alterarse para que la polimerasa muestre una mayor procesividad (p. ej., pueda sintetizar más de 100 bases por evento de polimerización). En un ejemplo, la polimerasa de alta procesividad se selecciona del grupo que consiste en la ADN-polimerasa T4, la ADN-polimerasa T7, la polimerasa Taq, el fragmento de Stoffel, el fragmento de Klenow, la ADN-polimerasa de Bsu, la ADN-polimerasa Bst y una polimerasa diseñada. En este método de ejemplo, el término “ polimerasa modificada” es cualquier polimerasa sintética que está diseñada para sintetizar más de 100 bases por evento de polimerización. Las polimerasas de alta procesividad pueden producir fragmentos de 10 kb (kilobase) a 20 kb de longitud. Otras polimerasas de alta procesividad adecuadas incluyen la polimerasa 029.

En este ejemplo, se puede utilizar cualquiera de los cebadores aleatorios descritos en la presente memoria.

En este método de ejemplo, los nucleótidos libres en la mezcla incluyen nucleótidos naturales y trifosfato de didesoxitimidina (ddTTP). El trifosfato de didesoxitimidina sirve como nucleótido o agente truncador de terminación de la síntesis. En un ejemplo, los nucleótidos naturales incluyen trifosfato de desoxiadenina, trifosfato de desoxitimina, trifosfato de desoxiguanina y trifosfato de desoxicitosina. En un ejemplo, la mezcla de nucleótidos libres incluye una relación de trifosfato de desoxitimina (dTTP) a trifosfato de didesoxitimidina (ddTTP) que varía de aproximadamente 10:5 a aproximadamente 10:0,01. Una relación dentro de este intervalo ayuda a garantizar que se incorpore un número deseado de trifosfato de desoxitimina en los fragmentos generados antes de que el trifosfato de didesoxitimidina trunque la amplificación. En un ejemplo específico, la relación de dTTP a ddTTP es de aproximadamente 10:1.

Poner en contacto el ADN genómico monocatenario molde con la polimerasa, una pluralidad de cebadores y la mezcla de nucleótidos libres puede implicar mezclar los diversos componentes entre sí y exponerlos a condiciones de amplificación adecuadas para la polimerasa que se está utilizando. Durante la amplificación, los cebadores se unen a diferentes porciones del a Dn genómico monocatenario molde, y la polimerasa introduce nucleótidos naturales complementarios en la cadena molde según la secuencia de la cadena molde. Cuando se introduce trifosfato de didesoxitimidina (ddTTP) en lugar de trifosfato de desoxitimidina (dTTP), se termina la amplificación de la cadena particular. Como tal, el ddTTP trunca el fragmento de ADN replicado. La relación de dTTP a ddTTP en la mezcla ayuda a garantizar que los fragmentos generados sean lo suficientemente largos para su posterior análisis.

Los fragmentos complementarios truncados replicados se pueden desplazar utilizando, p. ej., la desnaturalización. El método puede incluir repetir tanto la puesta en contacto como el desplazamiento de un número predeterminado de ciclos para generar fragmentos complementarios truncados adicionales en cada uno de los números predeterminados de ciclos.

En este método de ejemplo se puede utilizar cualquiera de los tampones (p. ej., HEPES, Tris-HCl, glicinato, etc.), sales (p. ej., KCI, MgCfc, etc.), reactivos redox (p. ej., ditiotreitol) y/o estabilizadores (p. ej., albúmina de suero bovino [BSA]) en este método de ejemplo en cantidades adecuadas para una alta procesividad.

En un ejemplo específico, la ADN-polimerasa T7 tiene una alta procesividad en las siguientes condiciones de reacción: aproximadamente 40 mM de Tris-HCl (pH 7,5), aproximadamente 15 mM de MgCfc, aproximadamente 25 mM de NaCl, aproximadamente 5 mM de DTT, aproximadamente 0,25 mM de cada dNTP, de aproximadamente 0,00025 mM a aproximadamente 0,125 mM de ddTTP, 50 pg/ml de ADNg monocatenario, aproximadamente 100 pM de cebador aleatorio (n = 6), de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1 unidad de ADN-polimerasa T7, temperatura de reacción superior a 37 °C.

En otro ejemplo específico, la polimerasa Taq es altamente procesiva a temperaturas de alrededor de 70 °C cuando reacciona con un exceso molar de 10 veces con respecto a la muestra de ADN y los cebadores aleatorios (n = 6). Una reacción de amplificación llevada a cabo en estas condiciones puede incluir además un tampón, tal como 20 mM de Tris-HCl, un pH de aproximadamente 7, de aproximadamente 1 mM a 2 mM de MgCh, aproximadamente 0,2 mM de cada dNTP y de aproximadamente 0,0002 mM a aproximadamente 0,1 mM de ddTTP. Además, se puede añadir un agente estabilizador, tal como glicerol, gelatina, BSA o un detergente no iónico.

En otro ejemplo específico más, el fragmento de Klenow tiene una alta procesividad en las siguientes condiciones de reacción: aproximadamente 10 mM de Tris-HCl, pH 7,9, aproximadamente 10 mM de MgCh, aproximadamente 50 mM de NaCl, aproximadamente 1 mM de DTT y aproximadamente 100 g/mol de BSA.

En otro ejemplo específico más, la ADN-polimerasa Bst tiene una alta procesividad en las siguientes condiciones de reacción: aproximadamente 20 mM de Tris-HCl, pH 8,8, aproximadamente 10 mM de (NH4)2SO4, aproximadamente 10 mM de KCI, aproximadamente 2 mM de MgSO4 y aproximadamente el 0,1 % de un surfactante no iónico (p. ej., TRITON™ X-100 de The Dow Chemical Co.).

Ambos procesos de amplificación descritos en la presente memoria generan una pluralidad de fragmentos de ADNg sin tener que utilizar un proceso de fragmentación. El ADNg monocatenario sirve como molde para varios loci objetivo 54 para genotipificación, y se generan varios amplicones de cada locus objetivo 54 para genotipificación. Cuando se introducen en una celda 20 de flujo con los moldes 48 o 49 que se han de genotipificar, los fragmentos de ADNg amplificados (loci objetivo 54 para genotipificación) se hibridan con las secciones complementarias respectivas de los moldes 48 o 49 que se han de genotipificar.

Kits

Los nucleótidos 10 o 10' para genotipificación y la celda 20 de flujo pueden formar parte de un kit de genotipificación.

En un ejemplo, un kit comprende: una celda 20 de flujo que incluye un sustrato 30, 30' que tiene depresiones 38 separadas por regiones intersticiales 40 y un primer y un segundo cebador 22, 24 o 22, 24' de captura unidos dentro de cada una de las depresiones 38; y un fluido de sonda para genotipificación que incluye un vehículo líquido y un oligonucleótido 10 o 10' para genotipificación en el vehículo líquido, incluyendo el oligonucleótido 10 o 10' para genotipificación una primera secuencia 12 de cebador, una secuencia sonda 14 representativa de un locus objetivo 54 para genotipificación, un sitio 16, 16' para endonucleasa de restricción y una segunda secuencia 18, 18' de cebador que es al menos parcialmente complementaria al segundo cebador 24, 24' de captura.

El kit también puede incluir componentes de preparación de bibliotecas de genotipificación, tales como una muestra del genoma completo, una polimerasa (que puede ser una polimerasa de baja procesividad como se define en la presente memoria), una pluralidad de cebadores y nucleótidos libres (incluyendo en algunos ejemplos los nucleótidos naturales y, en otros ejemplos, una mezcla de nucleótidos naturales y trifosfato de didesoxitimidina [ddTTP]).

Se puede utilizar cualquier ejemplo del oligonucleótido 10 o 10' para genotipificación en el kit y se puede utilizar cualquier ejemplo de la celda 20 de flujo en el kit.

El kit puede incluir alternativamente una celda de flujo sin patrón con cebadores en toda la superficie de un canal de flujo.

Claims

REIVINDICACIONES

Un fluido para sonda de genotipado, que comprende:

un vehículo líquido; y

un oligonucleótido para genotipificación en el vehículo líquido, incluyendo el oligonucleótido para genotipificación:

una primera secuencia de cebador;

una porción de secuencia índice directamente unida a la primera secuencia de cebador; una porción de sitio de cebado directamente unida a la porción de secuencia índice; una secuencia sonda directamente unida a la porción de sitio de cebado, siendo la secuencia sonda representativa de un locus objetivo para genotipificación que tiene una nucleobase de interés, en donde una última base de la secuencia sonda es representativa de una nucleobase del locus objetivo para genotipificación que se coloca directamente adyacente a la nucleobase de interés;

un sitio para endonucleasa de restricción; y

una segunda secuencia de cebador que es al menos parcialmente complementaria a un cebador de captura de celda de flujo,

en donde el sitio para endonucleasa de restricción se coloca entre la secuencia sonda y la segunda secuencia de cebador, o

la secuencia sonda se une directamente a la segunda secuencia de cebador y el sitio para endonucleasa de restricción se integra en la segunda secuencia de cebador a una distancia de escisión de la última base de la secuencia sonda.

El fluido de sonda para genotipificación tal como se define en la reivindicación 1, que comprende además una pluralidad de oligonucleótidos para genotipificación en el vehículo líquido, en donde cada oligonucleótido para genotipificación incluye una secuencia sonda diferente a la de cada otro oligonucleótido para genotipificación.

El fluido de sonda para genotipificación tal como se define en la reivindicación 1 o 2, en donde el sitio para endonucleasa de restricción es sensible a una endonucleasa de restricción seleccionada del grupo que consiste en una endonucleasa de restricción de corte de 4 bases, una endonucleasa de restricción de corte de 5 bases y una endonucleasa de restricción de corte de 6 bases.

Un kit que comprende:

una celda de flujo, que incluye:

un sustrato; y

un primer y un segundo cebadores de captura unidos al sustrato, teniendo el segundo cebador de captura un sitio para endonucleasa de restricción;

un fluido para sonda de genotipado, que incluye:

un vehículo líquido; y

un oligonucleótido para genotipificación en el vehículo líquido, incluyendo el oligonucleótido para genotipificación:

una primera secuencia de cebador;

una porción de secuencia índice directamente unida a la primera secuencia de cebador;

una porción de sitio de cebado directamente unida a la porción de secuencia índice;

una secuencia sonda directamente unida a la porción de sitio de cebado, siendo la secuencia sonda representativa de un locus objetivo para genotipificación que tiene una nucleobase de interés, en donde una última base de la secuencia sonda es representativa de una nucleobase del locus objetivo para genotipificación que se coloca directamente adyacente a la nucleobase de interés;

un segundo sitio para endonucleasa de restricción que es complementario al sitio para endonucleasa de restricción del segundo cebador de captura; y una segunda secuencia de cebador que es al menos parcialmente complementaria al segundo cebador de captura,

en donde el sitio para endonucleasa de restricción se coloca entre la secuencia sonda y la segunda secuencia de cebador, o

la secuencia sonda se une directamente a la segunda secuencia de cebador y el sitio para endonucleasa de restricción se integra en la segunda secuencia de cebador a una distancia de escisión de la última base de la secuencia sonda; y componentes de preparación de la biblioteca de genotipado, que incluyen:

una polimerasa;

una pluralidad de cebadores aleatorios; y

nucleótidos libres.

5. El kit se define en la reivindicación 4, en donde:

la polimerasa es una polimerasa de alta procesividad seleccionada del grupo que consiste en la ADN polimerasa T4, la ADN polimerasa T7, la polimerasa Taq, el fragmento de Stoffel, el fragmento de Klenow, la ADN polimerasa de Bsu, la ADN polimerasa Bst y una polimerasa diseñada; y

los nucleótidos libres incluyen una mezcla de nucleótidos naturales y trifosfato de didesoxitimidina (ddTTP).

6. El kit se define en la reivindicación 4, en donde:

la polimerasa es una polimerasa de baja procesividad seleccionada del grupo que consiste en la ADN polimerasa T4, la ADN polimerasa T7, la polimerasa Taq, el fragmento de Stoffel, el fragmento de Klenow, la ADN polimerasa Bsu, la ADN polimerasa Bst, la Pol III monomérica de E. coli o Pol I de E. coli y una polimerasa modificada genéticamente; y

los nucleótidos libres incluyen trifosfato de desoxiadenina, trifosfato de desoxitimina, trifosfato de desoxiguanina y trifosfato de desoxicitosina.

7. El kit como se define en una de las reivindicaciones 4 a 6, en donde la pluralidad de cebadores aleatorios es una población de cebadores aleatorios sintetizados para incluir un mayor contenido de nucleótidos de guanina y/o citosina en comparación con los nucleótidos de adenina y timidina.

8. El kit como se define en las reivindicaciones 4 o 7, en donde el sitio para endonucleasa de restricción y el segundo sitio para endonucleasa de restricción son sensibles a una endonucleasa de restricción sensible al metilo de tipo IIS.

9. Un método, que comprende:

introducir un fluido de sonda para genotipificación como se define en la reivindicación 4 en una celda de flujo como se define en la reivindicación 4, incluyendo el fluido de sonda para genotipificación una pluralidad de oligonucleótidos para genotipificación como se define en la reivindicación 4; donde un oligonucleótido para genotipificación respectivo reacciona para producir poblaciones clonales respectivas de amplicones a partir del oligonucleótido para genotipificación respectivo;

linealizar los amplicones para producir sondas molde;

secuenciar al menos una sección de identificación de sonda de las sondas molde para identificar cada una de las secuencias sonda;

eliminar al menos las respectivas cadenas nacientes de las sondas molde, donde queda expuesto un grupo OH 3' en un extremo de las sondas molde;

hibridar las muestras respectivas con las sondas molde; y

realizar las respectivas reacciones de genotipificación de las muestras en los grupos OH 3' expuestos.

10. El método como se define en la reivindicación 9, en donde, antes de hibridar las muestras respectivas con las sondas molde, el método comprende además preparar las muestras respectivas mediante:

la puesta en contacto de un ADN genómico monocatenario molde con una polimerasa, una pluralidad de cebadores y una mezcla de nucleótidos libres que incluyen nucleótidos naturales y trifosfato de didesoxitimidina, generando de este modo fragmentos complementarios truncados del ADN genómico monocatenario molde; y

el desplazamiento de los fragmentos complementarios truncados del ADN genómico monocatenario molde.

11. El método como se define en la reivindicación 10, en donde los nucleótidos naturales incluyen trifosfato de desoxiadenina, trifosfato de desoxitimina, trifosfato de desoxiguanina y trifosfato de desoxicitosina, y en donde la mezcla de nucleótidos libres incluye una relación de trifosfato de desoxitimina a trifosfato de didesoxitimidina que varía de aproximadamente 10:5 a aproximadamente 10:0,01.

El método como se define en la reivindicación 10 u 11, que comprende además desnaturalizar un ácido desoxirribonucleico (ADN) genómico bicatenario, generando de este modo el ADN genómico monocatenario molde.

El método como se define en una de las reivindicaciones 10 a 12, que comprende además repetir tanto la puesta en contacto como el desplazamiento de un número predeterminado de ciclos para generar fragmentos complementarios truncados adicionales en cada uno de los números predeterminados de ciclos.

El método como se define en una de las reivindicaciones 10 a 13, en donde la polimerasa se selecciona del grupo que consiste en la ADN polimerasa T4, la ADN polimerasa T7, la polimerasa Taq, el fragmento de Stoffel, el fragmento de Klenow, la ADN polimerasa Bsu, la ADN polimerasa Bst y una polimerasa diseñada.