ES3031307T3 - Proteins binding nkg2d, cd16 and egfr - Google Patents

Abstract

Se describen aquí proteínas de unión multiespecíficas que se unen al receptor NKG2D, CD 16 y EGFR, así como composiciones farmacéuticas y métodos terapéuticos útiles para el tratamiento del cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas que se unen a NKG2D, CD16 y EGFR

La presente solicitud se refiere a proteínas de unión multiespecífica que se unen a NKG2D, CD16 y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR).

Antecedentes

A pesar de esfuerzos de investigación sustanciales, el cáncer sigue siendo una carga clínica y financiera significativa en países de todo el mundo. De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS), es la segunda causa principal de muerte. La cirugía, la terapia de radiación, la quimioterapia, la terapia biológica, la inmunoterapia, la terapia hormonal, el trasplante de células madre y la medicina de precisión se encuentran entre las modalidades de tratamiento existentes. A pesar de una amplia investigación en estas áreas, aún no se ha identificado una solución altamente efectiva y curativa, particularmente para los cánceres más agresivos. Además, muchas de las modalidades de tratamiento contra el cáncer existentes tienen efectos secundarios adversos sustanciales.

Las inmunoterapias contra el cáncer son convenientes porque son muy específicas y pueden facilitar la destrucción de células cancerosas mediante el uso del propio sistema inmunitario del paciente. Las proteínas de fusión tales como los acopladores biespecíficos de linfocitos T, son inmunoterapias contra el cáncer descritas en la bibliografía médica que se unen a las células tumorales y a los linfocitos T para facilitar la destrucción de las células tumorales. En la literatura se han descrito anticuerpos que se unen a determinados antígenos asociados a tumores. Ver, por ejemplo, los documentos WO 2016/134371 y WO 2015/095412.

Las células asesinas naturales (NK) son un componente del sistema inmunitario innato y constituyen aproximadamente el 15 % de los linfocitos circulantes. Las células NK infiltran prácticamente todos los tejidos y se caracterizaron originalmente por su capacidad para destruir células tumorales de forma efectiva sin necesidad de sensibilización previa. Las células NK activadas destruyen las células diana por medio de mecanismos similares a los de los linfocitos T citotóxicos, es decir, a través de gránulos citolíticos que contienen perforina y granzimas, así como también a través de vías de receptores de muerte. Las células NK activadas también secretan citocinas inflamatorias tales como IFN-y y quimiocinas que promueven el reclutamiento de otros leucocitos en el tejido diana. Las células NK responden a las señales a través de una variedad de receptores activadores e inhibidores en su superficie. Por ejemplo, cuando las células NK se encuentran con células propias sanas, su actividad se inhibe mediante la activación de los receptores similares a inmunoglobulina (KIR) de células asesinas. Alternativamente, cuando las células NK encuentran células extrañas o células cancerosas, se activan a través de sus receptores de activación (por ejemplo, NKG2D, NCR, DNAM1). Las células NK también son activadas por la región constante de algunas inmunoglobulinas a través de los receptores de CD16 en su superficie. La sensibilidad general de las células NK a la activación depende de la suma de señales estimuladoras e inhibidoras. NKG2D es una proteína transmembrana de tipo II que se expresa esencialmente en todas células asesinas naturales donde NKG2<d>sirve como un receptor activador. NKG2D también se encuentra en los linfocitos T donde actúa como un receptor coestimulador. La capacidad de modular la función de las células NK por medio de NKG2D es útil en varios contextos terapéuticos, que incluyen la neoplasia maligna.

Las mutaciones que conducen a la sobreexpresión o hiperactividad del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) se han asociado con una serie de neoplasias malignas, que incluyen cáncer de pulmón de células no pequeñas, cánceres anales, glioblastoma y tumores epiteliales de cabeza y cuello. Estas mutaciones somáticas que involucran al EGFR conducen a su activación constante, lo que produce una división celular no controlada. En el glioblastoma, a menudo se observa una mutación más o menos específica del EGFR, denominada EGFRvlII. Las mutaciones, amplificaciones o desregulaciones del EGFR o de miembros de la familia están implicadas en otros tumores sólidos, que incluyen cáncer colorrectal, carcinoma de células renales, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de páncreas y cáncer de hígado.

Se han desarrollado anticuerpos monoclonales anti-EGFR, tales como cetuximab, panitumumab, necitumumab y zalutumumab. Sin embargo, sigue existiendo la necesidad de anticuerpos nuevos y útiles y terapias relacionadas para usar en el tratamiento del cáncer que tengan mayor eficacia y efectos adversos reducidos.

El documento WO 2019/035939 describe proteínas de unión multiespecífica que se unen al receptor NKG2D, CD16 y un antígeno asociado a tumores seleccionado de EGFR, HLA-E, CCR4 y PD-L1, así como también composiciones farmacéuticas y métodos terapéuticos útiles para el tratamiento del cáncer.

El documento WO 2015/184203 describe moléculas de unión triespecíficas, que son moléculas polipeptídicas multicatenarias que poseen tres dominios de unión y, por lo tanto, son capaces de mediar la unión coordinada a tres epítopos. Tales epítopos pueden ser epítopos del mismo antígeno o epítopos de dos o tres antígenos diferentes. Por ejemplo, uno de tales epítopos es capaz de unirse a CD3, el segundo de tales epítopos es capaz de unirse a CD8, y el tercero de tales epítopos es capaz de unirse a un epítopo de un antígeno asociado a la enfermedad. El documento también proporciona un anticuerpo de unión a ROR1, así como también derivados de este y usos para tales composiciones.

Resumen

La presente invención proporciona una proteína que comprende:

(a) una secuencia de scFv de unión al EGFR (VL-VH) en la orientación del dominio variable de cadena pesada (VH) ubicado en el extremo C-terminal respecto al dominio variable de cadena ligera (VL), unido a un polipéptido de dominio Fc para formar un polipéptido (VL-VH)-Fc, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 167;

y

(b) un fragmento Fab de unión a NKG2D que incluye:

una porción de cadena pesada que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio CH1, en donde el dominio CH1 se conecta a un polipéptido de dominio Fc para formar un polipéptido VH-CH1-Fc que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 164, y

una porción de cadena ligera que comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) y un dominio constante de cadena ligera (CL) para formar un polipéptido VL-CL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 165.

La invención se define por las reivindicaciones y cualquier otro aspecto, configuración o modalidad que se expone en la presente descripción que no caiga dentro del alcance de las reivindicaciones son solo con fines informativos. Cualquier referencia en la descripción a los métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para usar en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para el diagnóstico).

La presente solicitud proporciona proteínas de unión multiespecífica que se unen al receptor NKG2D, al receptor CD16 en células asesinas naturales y al EGFR. Estas proteínas pueden acoplarse a más de un tipo de receptor de activación de NK y bloquear la unión de ligandos naturales a NKG2D. En determinadas modalidades, las proteínas pueden agonizar las células NK en humanos. En algunas modalidades, las proteínas pueden agonizar las células NK en seres humanos, y en otras especies tales como roedores y macacos cangrejeros. También se proporcionan formulaciones que contienen una cualquiera de las proteínas descritas en la presente descripción; células que contienen uno o más ácidos nucleicos que expresan las proteínas, y métodos para potenciar la muerte de las células tumorales mediante el uso de las proteínas.

En consecuencia, un aspecto de la presente solicitud proporciona una proteína que comprende (a) un primer sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D, (b) un segundo sitio de unión al antígeno que se une al EGFR, y (c) un dominio Fc de anticuerpo o una porción del mismo suficiente para unirse a CD16, o un tercer sitio de unión al antígeno que se une a CD16, en donde el segundo sitio de unión al antígeno comprende: (i) un dominio variable de la cadena pesada (VH) que comprende secuencias de la región determinante de la complementariedad 1 (CDR1), de la región determinante de la complementariedad 2 (CDR2), y de la región determinante de la complementariedad 3 (CDR3) de SEQ ID NO: 136, 157, y 138, respectivamente, y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende secuencias de CDR1, CD<r>2 y CDR3 de SEQ ID NO: 140, 141, y 151, respectivamente; o (ii) un<v>H que comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO: 136, 146, y 138, respectivamente, y un VL que comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO: 140, 141, y 142, respectivamente.

En algunas modalidades, el VH comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO: 136, 157 y 138, respectivamente; y el VL comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO: 140, 141 y 151, respectivamente.

En algunas modalidades, el VH comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO: 136, 146 y 138, respectivamente; y el VL comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO: 140, 141 y 151, respectivamente.

En algunas modalidades, el VH comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO: 136, 137 y 138, respectivamente; y el VL comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO: 140, 141 y 151, respectivamente.

En algunas modalidades, el VH comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO: 136, 146 y 138, respectivamente; y el VL comprende secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO: 140, 141 y 142, respectivamente.

En algunas modalidades, el VH comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 145 y el VL comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 150. En algunas modalidades, el VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 145, y el VL comprende la secuencia de aminoácidos de la<s>E<q>ID NO:150. En algunas modalidades, el VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 170, y el VL comprende la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO:171.

En algunas modalidades, el VH comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 135 y el VL comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 150. En algunas modalidades, el Vh comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 135, y el VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:150.

En algunas modalidades, el VH comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 145 y el VL comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 147. En algunas modalidades, el Vh comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 145, y el VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:147.

Otro aspecto de la presente solicitud la proteína comprende (a) un primer sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D, (b) un segundo sitio de unión al antígeno que se une al EGFR, y (c) un dominio Fc de anticuerpo o una porción del mismo suficiente para unirse a CD16, o un tercer sitio de unión al antígeno que se une a CD16, en donde el segundo sitio de unión al antígeno comprende un VH que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 135 y un VL que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 139, en donde el V<h>comprende una sustitución S62R con relación a la SEQ ID NO: 135 y/o el VL comprende una sustitución D92R y/o una sustitución F87Y con relación a la SEQ ID NO:139, numeradas bajo el esquema de numeración de Chothia.

En algunas modalidades, el VH comprende una sustitución S62R con relación a la SEQ ID NO:135, numerada bajo el esquema de numeración de Chothia. En algunas modalidades, el VL comprende una sustitución D92R con relación a la SEQ ID NO: 139, numerada bajo el esquema de numeración de Chothia. En algunas modalidades, el VH comprende una sustitución S62R con relación a la SEQ ID NO: 135 y el VL comprende una sustitución D92R con relación a la SEQ ID NO: 139, numerada bajo el esquema de numeración de Chothia.

En algunas modalidades de cualquiera de los aspectos anteriores, el VL comprende una sustitución F87Y con relación a la SEQ ID NO: 139, numerada bajo el esquema de numeración de Chothia.

En algunas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno comprende una variable de fragmento de cadena única (scFv), y en donde el scFv comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a, o que comprende, una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 152, 154, 148 y 158.

En algunas modalidades, la proteína de la presente descripción comprende un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a, o que comprende, una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 167, 168 y 166.

En algunas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno se une al EGFR humano con una constante de disociación (K<d>) menor o igual a 5 nM, medida mediante resonancia de plasmones superficiales (SPR). En algunas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno se une al EGFR de macaco Rhesus con una constante de disociación (Kd) menor o igual a 6 nM, medida mediante resonancia de plasmones superficiales (SPR).

En algunas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D es un fragmento Fab, y el segundo sitio de unión al antígeno que se une al EGFR es un scFv. En algunas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D es un scFv, y el segundo sitio de unión al antígeno que se une al EGFR es un fragmento Fab. En algunas modalidades, la proteína comprende además un sitio de unión al antígeno adicional que se une al EGFR. En algunas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D es un scFv, y el segundo y los sitios de unión al antígeno adicionales que se unen al EGFR son cada uno un fragmento Fab. En algunas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D es un scFv, y el segundo y los sitios de unión al antígeno adicionales que se unen al EGFR son cada uno un scFv. En algunas modalidades, las secuencias de aminoácidos del segundo y los sitios de unión al antígeno adicionales son idénticas.

En algunas modalidades, el scFv que se une a NKG2D se une a un dominio constante de anticuerpo o una porción del mismo suficiente para unirse a CD16, a través de una bisagra que comprende Ala-Ser o Gly-Ser, en donde el scFv comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera. En algunas modalidades, cada scFv que se une al EGFR se une a un dominio constante de anticuerpo o una porción del mismo suficiente para unirse a CD16, mediante una bisagra que comprende Ala-Ser o Gly-Ser, en donde el scFv comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera. En algunas modalidades, la bisagra comprende además una secuencia de aminoácidos Thr-Lys-Gly.

En algunas modalidades, dentro del scFv que se une a NKG2D, el dominio variable de la cadena pesada del scFv forma un puente disulfuro con el dominio variable de la cadena ligera del scFv. En algunas modalidades, dentro de cada scFv que se une al EGFR, el dominio variable de la cadena pesada del scFv forma un puente disulfuro con el dominio variable de la cadena ligera del scFv. En algunas modalidades, el puente disulfuro se forma entre C44 del dominio variable de la cadena pesada y C100 del dominio variable de la cadena ligera, numerados bajo el esquema de numeración de Kabat. En algunas modalidades, dentro del scFv que se une a NKG2D, el dominio variable de la cadena pesada se une al dominio variable de la cadena ligera a través de un enlazador flexible. En algunas modalidades, dentro de cada scFv que se une al EGFR, el dominio variable de la cadena pesada se une al dominio variable de la cadena ligera a través de un enlazador flexible. En algunas modalidades, el enlazador flexible comprende (G4S)4 (SEQ ID NO: 119).

En algunas modalidades, dentro del scFv que se une a NKG2D, el dominio variable de la cadena pesada se ubica en el extremo C terminal del dominio variable de la cadena ligera. En algunas modalidades, dentro de cada scFv que se une a EGFR, el dominio variable de la cadena pesada se ubica en el extremo C terminal del dominio variable de la cadena ligera. En algunas modalidades, dentro del scFv que se une a NKG2D, el dominio variable de la cadena pesada se ubica en el extremo N terminal del dominio variable de la cadena ligera.

En algunas modalidades, dentro de cada scFv que se une al EGFR, el dominio variable de la cadena pesada se ubica en el extremo N terminal del dominio variable de la cadena ligera. En algunas modalidades, el fragmento Fab que se une a NKG2D no se ubica entre un sitio de unión a antígeno y el Fc o la porción del mismo. En algunas modalidades, ningún fragmento Fab que se une al EGFR se ubica entre un sitio de unión al antígeno y el Fc o la porción del mismo.

En algunas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D comprende un VH que comprende CDR1, CDR2 y c Dr3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ iD NO: 81, 82 y 112, respectivamente; y un VL que comprende c DR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 86, 77 y 87, respectivamente. En algunas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D comprende un VH que comprende CDR1, CDR2, y CDR3 que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 81, 82, y 97, respectivamente; y un VL que comprende C<d>R1, CDR2, y CDR3 que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 86, 77, y 87, respectivamente. En algunas modalidades, el VH del primer sitio de unión al antígeno comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO:95, y el VL del primer sitio de unión al antígeno comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la SEQ ID NO:85. En algunas modalidades, el VH del primer sitio de unión al antígeno comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:95, y el VL del primer sitio de unión al antígeno comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:85.

En algunas modalidades, el dominio Fc del anticuerpo comprende una bisagra y un dominio CH2. En algunas modalidades, el dominio Fc del anticuerpo es un dominio Fc del anticuerpo IgG1 humano. En algunas modalidades, el dominio Fc del anticuerpo o la porción del mismo comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a los aminoácidos 234-332 de un anticuerpo IgG1 humano o la SEQ ID NO: 118.

En algunas modalidades, al menos una cadena polipeptídica del dominio Fc del anticuerpo comprende una o más mutaciones, con relación a la SEQ ID NO:118, en una o más posiciones seleccionadas de Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411 y K439, numeradas de acuerdo con el sistema de numeración EU. En algunas modalidades, al menos una cadena polipeptídica del dominio Fc del anticuerpo comprende una o más mutaciones, con relación a la SEQ ID NO:118, seleccionadas de Q347E, Q347R, Y349S, Y349K, Y349T, Y349D, Y349E, Y349C, L351K, L351D, L351Y, S354C, E356K, E357Q, E357L, E357W, K360E, K360W, Q362E, S364K, S364E, S364H, S364D, T366V, T366I, T366L, T366M, T366K, T366W, T366S, L368E, L368A, L368D, K370S, N390D, N390E, K392L, K392M, K392V, K392F, K392D, K392E, T394F, D399R, D399K, D399V, S400K, S400R, D401K, F405A, F405T, Y407A, Y407I, Y407V, K409F, K409W, K409D, T411D, T411E, K439D, y K439E, numeradas de acuerdo con el sistema de numeración EU.

En algunas modalidades, una cadena polipeptídica de la región constante de la cadena pesada del anticuerpo comprende una o más mutaciones, con relación a la SEQ ID NO:118, en una o más posiciones seleccionadas de Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411 y K439; y la otra cadena polipeptídica de la región constante de la cadena pesada del anticuerpo comprende una o más mutaciones, con relación a la SEQ ID NO:118, en una o más posiciones seleccionadas de Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, D401, F405, Y407, K409, T411 y K439, numeradas de acuerdo con el sistema de numeración EU. En algunas modalidades, una cadena polipeptídica de la región constante de la cadena pesada del anticuerpo comprende las sustituciones K360E y K409W con relación a la SEQ ID NO:118; y la otra cadena polipeptídica de la región constante de la cadena pesada del anticuerpo comprende las sustituciones Q347R, D399V y F405T con relación a la SEQ ID NO:118, numeradas de acuerdo con el sistema de numeración EU.

En algunas modalidades, una cadena polipeptídica de la región constante de la cadena pesada del anticuerpo comprende una sustitución Y349C con relación a la SEQ ID NO:118; y la otra cadena polipeptídica de la región constante de la cadena pesada del anticuerpo comprende una sustitución S354C con relación a la SEQ ID NO:118, numerada de acuerdo con el sistema de numeración EU.

Otro aspecto de la presente solicitud proporciona una proteína que comprende (a) un primer polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:167, (b) un segundo polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:164, y (c) un tercer polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:165.

Otro aspecto de la presente solicitud proporciona una proteína que comprende (a) un primer polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:168, (b) un segundo polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:164, y (c) un tercer polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:165.

Otro aspecto de la presente solicitud proporciona una proteína que comprende (a) un primer polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:166, (b) un segundo polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:164, y (c) un tercer polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:165.

Otro aspecto de la presente solicitud proporciona una formulación que comprende una proteína como se describe en la presente descripción y un portador farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de la presente solicitud proporciona una célula que comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican una proteína como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, la célula que comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 167 o SEQ ID NO: 169.

Otro aspecto de la presente solicitud proporciona una proteína purificada como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, la proteína se purifica mediante el uso de un método seleccionado del grupo que consiste en centrifugación, filtración en profundidad, lisis celular, homogeneización, congelacióndescongelación, purificación por afinidad, filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de intercambio por interacciones hidrófobas y cromatografía de modo mixto.

Otro aspecto de la presente solicitud proporciona un método para aumentar la muerte de células tumorales, que comprende exponer la célula tumoral y una célula asesina natural a una cantidad efectiva de una proteína como se describe en la presente descripción o una formulación como se describe en la presente descripción, en donde la célula tumoral expresa EGFR.

Otro aspecto de la presente solicitud proporciona una proteína como se describe en la presente descripción o una formulación como se describe en la presente descripción para usar en un método para tratar un cáncer, en donde el método comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad efectiva de la proteína como se describe en la presente descripción o la formulación como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, el cáncer es un tumor sólido. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de riñón, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de cerebro, glioma, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas y cáncer de hígado, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario o cáncer de próstata. En algunas modalidades, el cáncer expresa EGFR.

Estos y otros aspectos y ventajas de los TriNKET descritos en la presente solicitud se ilustran mediante las siguientes figuras, descripción detallada y reivindicaciones.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una representación de un anticuerpo de unión multiespecífica, heterodimérico, por ejemplo, una proteína de unión triespecífica (TriNKET). Cada brazo puede representar el dominio de unión a NKG2D, o el dominio de unión correspondiente a un antígeno asociado a un tumor. En algunas modalidades, el dominio de unión a NKG2D y los dominios de unión a antígeno asociado al tumor pueden compartir una cadena ligera común.

Las Figuras 2A-2E ilustran cinco formatos ilustrativos de una proteína de unión multiespecífica, por ejemplo, una proteína de unión triespecífica (TriNKET). Como se muestra en la Figura 2A, ya sea el dominio de unión a NKG2D o el dominio de unión a antígeno asociado al tumor puede tomar el formato scFv (brazo izquierdo). Un anticuerpo que contiene un scFv dirigido a NKG2D, un antígeno asociado al tumor dirigido al fragmento Fab y una región constante de anticuerpo heterodimerizado se denomina en la presente descripción como el F3-TriNKET. Un anticuerpo que contiene un scFv dirigido a un antígeno asociado al tumor, un fragmento Fab dirigido a NKG2D y una región/dominio constante de anticuerpo heterodimerizado que se une a CD16 se denomina en la presente descripción como el F3'-TriNKET (Figura 2E). Como se muestra en la Figura 2B, tanto el dominio de unión a NKG2D como el dominio de unión a antígeno asociado al tumor pueden tomar el formato scFv. Las Figuras. 2C a 2D son ilustraciones de un anticuerpo con tres sitios de unión a antígeno, que incluyen dos sitios de unión a antígeno que se unen al antígeno asociado al tumor, y el sitio de unión a NKG2D fusionado a la región constante de anticuerpo heterodimerizado. Estos formatos de anticuerpo se denominan en la presente descripción F4-TriNKET. La Figura 2c ilustra que los dos sitios de unión al antígeno asociado al tumor están en el formato de fragmento Fab, y el sitio de unión a NKG2D en el formato scFv. La Figura 2D ilustra que los sitios de unión al antígeno asociado al tumor están en el formato scFv, y el sitio de unión NKG2D está en el formato scFv. La Figura 2E representa un anticuerpo triespecífico (TriNKET) que contiene un scFv dirigido al tumor, un fragmento Fab dirigido a NKG2D y una región/dominio constante de anticuerpo heterodimerizado (“dominio CD”) que se une a CD16. El formato de anticuerpo se denomina en la presente descripción F3'-TriNKET. En determinadas proteínas de unión multiespecífica ilustrativas, las mutaciones de heterodimerización en la región constante del anticuerpo incluyen K360E y K409W en un dominio constante; y Q347R, D399V y F405T en el dominio constante opuesto (mostrado como una forma triangular de cerradura y llave en los dominios CD). La barra en negrita entre los dominios variables de cadena pesada y ligera de los fragmentos Fab representa un enlace disulfuro. La Figura 3 es una representación de un TriNKET en la forma de TriAcM, que es un anticuerpo bifuncional, trifuncional que mantiene una forma similar a IgG. Esta quimera consiste en dos medios anticuerpos, cada uno con una cadena ligera y una cadena pesada, que se originan a partir de dos anticuerpos parentales. La forma de TriAcM puede ser una construcción heterodimérica que contiene 1/2 de anticuerpo de rata y 1/2 de anticuerpo de ratón.

La Figura 4 es una representación de un TriNKET en la forma de cadena ligera común de KiH, que implica la tecnología de botón en ojal (KIH). KiH es un heterodímero que contiene 2 fragmentos Fab de unión a la diana 1 y 2, y un Fc estabilizado por mutaciones de heterodimerización. La TriNKET en el formato de KiH puede ser un constructo heterodimérico con 2 fragmentos Fab que se unen a la diana 1 y a la diana 2, que contiene dos cadenas pesadas diferentes y una cadena ligera común que se empareja con ambas cadenas pesadas.

La Figura 5 es una representación de un TriNKET en la forma de inmunoglobulina de dominio variable dual (DVD-Ig™), que combina los dominios de unión a la diana de dos anticuerpos monoclonales a través de enlazadores flexibles de origen natural, y produce una molécula de tipo IgG tetravalente. DVD-Ig™ es un constructo homodimérico donde el dominio variable dirigido al antígeno 2 se fusiona al extremo N terminal de un dominio variable de un fragmento Fab dirigido al antígeno 1. La forma DVD-Ig™ contiene Fc normal.

La Figura 6 es una representación de un TriNKET en la forma de interfaz de fragmento Fab ortogonal (Orto-Fab), que es un constructo heterodimérico que contiene 2 fragmentos Fab que se unen a la diana 1 y la diana 2 fusionados a Fc. El emparejamiento de la cadena ligera (LC)-cadena pesada (HC) está garantizado por una interfaz ortogonal. La heterodimerización está garantizada por mutaciones en el Fc.

La Figura 7 es una representación de un TriNKET en el formato de Ig de 2 en 1.

La Figura 8 es una representación de un TriNKET en la forma ES, que es un constructo heterodimérico que contiene dos fragmentos Fab diferentes que se unen a la diana 1 y la diana 2 fusionadas con el Fc. La heterodimerización está garantizada por mutaciones de dirección electrostática en el Fc.

La Figura 9 es una representación de un TriNKET en la forma de intercambio de brazos Fab: anticuerpos que intercambian brazos de fragmentos Fab al intercambiar una cadena pesada y una cadena ligera unida (media molécula) por un par de cadenas pesada-ligera de otra molécula, lo que da como resultado anticuerpos biespecíficos. La forma de intercambio de brazos Fab (cFae) es un heterodímero que contiene 2 fragmentos Fab que se unen a la diana 1 y 2, y un Fc estabilizado por mutaciones de heterodimerización.

La Figura 10 es una representación de un TriNKET en la forma de cuerpo SEED, que es un heterodímero que contiene 2 fragmentos Fab que se unen a las dianas 1 y 2, y un Fc estabilizado por mutaciones de heterodimerización.

La Figura 11 es una representación de un TriNKET en la forma LuZ-Y, en la que la cremallera de leucina se usa para inducir la heterodimerización de dos HC diferentes. La forma LuZ-Y es un heterodímero que contiene dos scFab diferentes que se unen a la diana 1 y 2, fusionados a un Fc. La heterodimerización se garantiza a través de motivos de cremallera de leucina fusionados con el extremo C-terminal de Fc.

La Figura 12 es una representación de un TriNKET en la forma de Cov-X-Cuerpo.

Las Figuras 13A-13B son representaciones de TriNKET en las formas de Cuerpo kA, que son constructos heterodiméricos con dos fragmentos Fab diferentes fusionados a un Fc estabilizado por mutaciones de heterodimerización: un fragmento Fab dirigido al antígeno 1 contiene LC kappa, y el segundo fragmento Fab dirigido al antígeno 2 contiene LC lambda. La Figura 13A es una representación ilustrativa de una forma de un Cuerpo kA; la Figura 13B es una representación ilustrativa de otro Cuerpo<k>A.

La Figura 14 es una representación de un constructo heterodimérico Oasc-Fab que incluye un fragmento Fab que se une a la diana 1 y scFab que se une a la diana 2, los cuales se fusionan al dominio Fc. La heterodimerización está garantizada por mutaciones en el dominio Fc.

La Figura 15 es una representación de un DuetMab, que es un constructo heterodimérico que contiene dos fragmentos Fab diferentes que se unen a los antígenos 1 y 2, y un Fc estabilizado por mutaciones de heterodimerización. Los fragmentos Fab 1 y 2 contienen puentes S-S diferenciales que garantizan un emparejamiento correcto de la cadena ligera y la cadena pesada.

La Figura 16 es una representación de un CrossAcM, que es un constructo heterodimérico con dos fragmentos Fab diferentes que se unen a las dianas 1 y 2 y un Fc estabilizado por mutaciones de heterodimerización. Los dominios CL y CH1 y los dominios VH y VL se intercambian, por ejemplo, CH1 se fusiona en línea con VL, y CL se fusiona en línea con VH.

La Figura 17 es una representación de una Fit-Ig, que es un constructo homodimérico donde el fragmento Fab que se une al antígeno 2 se fusiona al extremo N terminal de HC del fragmento Fab que se une al antígeno 1. El constructo contiene Fc de tipo silvestre.

La Figura 18 es un diagrama que muestra el modelado estructural del panitumumab que tiene la sustitución S62R en el VH (bajo el esquema de numeración de Chothia), en el que el enlace de hidrógeno entre esta Arg y el Asp en la posición 1 del VL puede contribuir a la estabilización de la interfaz VH-VL.

La Figura 19 es un diagrama que muestra el modelado estructural del panitumumab que tiene la sustitución F87Y en el VL (bajo el esquema de numeración de Chothia), en el que el enlace de hidrógeno entre esta Tyr y la Gln en la posición 39 del VH puede contribuir a la estabilización de la interfaz VH-VL.

La Figura 20 es un diagrama que muestra el modelado estructural del panitumumab que tiene una sustitución D92R en el VL (bajo el esquema de numeración de Chothia), en el que el contacto de van der Waals entre esta Arg (en CDRL3) y la Tyr en la posición 32 del VL (en CDRL1) puede contribuir a la estabilización del paratopo.

La Figura 21 es un sensorgrama de SPR para una titulación de la unión de EGFR-TriNKET-1 al EGFR humano. La Figura 22 es un sensorgrama de SPR para una titulación de la unión de EGFR-TriNKET-2 al EGFR humano. La Figura 23 es un sensorgrama de SPR para una titulación de la unión de EGFR-TriNKET-3 al EGFR humano. La Figura 24 es un sensorgrama de SPR para una titulación de la unión de EGFR-TriNKET-4 al EGFR humano. Las Figuras 25A, 25B, 25C y 25D son gráficos que muestran los Termogramas para EGFR-TriNKET-1 (Figura 25A), EGFR-TriNKET-2 (Figura 25B) y EGFR-TriNKET-3 en PBS, pH 7,4 (Figura 25C), respectivamente, según se determina mediante análisis diferencial de calorimetría de barrido (DSC).

Las Figuras 26A y 26B son gráficos que muestran los Termogramas para EGFR-TriNKET-3 (Figura 26A) y EGFR-TriNKET-4 (Figura 26B), en histidina 20 mM, trehalosa 250 mM, PS80 al 0,01 %, pH 6,0, respectivamente, según se determina mediante análisis de DSC.

La Figura 27 es un gráfico que muestra la afinidad de unión de una serie de concentraciones de EGFR-TriNKET-1 ("EGFR1"), EGFR-TriNKET-2 ("EGFR2"), EGFR-TriNKET-3 ("EGFR3") y panitumumab a células cancerosas H2172 positivas para EGFR.

La Figura 28 es un gráfico que muestra la lisis mediada por células NK de células cancerosas H2172 que expresan EGFR en presencia de una serie de concentraciones de EGFR-TriNKET-1 ("EGFR1"), EGFR-TriNKET-3 ("EGFR3"), EGFR-TriNKET-4 ("EGFR4") y cetuximab.

La Figura 29 es un gráfico que muestra la lisis mediada por linfocitos T CD8+ de células cancerosas 786-0 positivas para EGFR en presencia de una serie de concentraciones de EGFR-TriNKET-3 ("EGFR3"), EGFR-TriNKET-4 ("EGFR4") y cetuximab.

La Figura 30 es un gráfico que muestra la producción de IFN-<y>a partir de células NK cuando se incuban con células cancerosas BT-474 positivas para EGFR en presencia de una serie de concentraciones de EGFR-TriNKET-1 ("EGFR1"), EGFR-TriNKET-2 ("EGFR2"), EGFR-TriNKET-3 ("EGFR3") y cetuximab.

La Figura 31 es un gráfico que muestra la producción de IFN-<y>a partir de células NK activadas por IL-2 cuando se incuban con células cancerosas BT-474 positivas para EGFR en presencia de una serie de concentraciones de EGFR-TriNKET-1 ("EGFR1"), EGFR-TriNKET-3 ("EGFR3") y cetuximab.

La Figura 32 es un gráfico que muestra la proliferación de una línea celular positiva para EGFR durante 72 horas en presencia de una serie de concentraciones de EGFR-TriNKET-1 ("EGFR1"), EGFR-TriNKET-2 ("EGFR2"), EGFR-TriNKET-3 ("EGFR3"), panitumumab y cetuximab.

La Figura 33 es un gráfico que muestra el porcentaje de células diana que expresan el EGFR fagocitadas por macrófagos como resultado de la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) después de la incubación durante 2 horas en presencia de una serie de concentraciones de EGFR-TriNKET-1 ("EGFR1"), una variante de EGFR-TriNKET-1 que tiene una mutación L234A, L235A y P329G (LALAPG) en el dominio Fc ("EGFR1-CD16si"), EGFR-TriNKET-3 ("EGFR3"), EGFR-TriNKET-4 ("EGFR4") y cetuximab, medido mediante citometría de flujo.

Las Figuras 34A-34D son gráficos que muestran el volumen tumoral a lo largo del tiempo en ratones desnudos con xenoinjertos de células NCI-H292 positivas para EGFR tratadas con control de isotipo o EGFR-TriNKET como se indica.

La Figura 34A muestra el volumen tumoral en ratones tratados con 300 |jg, 100 |jg o 30 |jg de EGFR-TriNKET en los puntos de tiempo indicados. La Figura 34B muestra el volumen tumoral en ratones tratados con 300 jg de control de isotipo o EGFR-TriNKET en los puntos de tiempo indicados. La Figura 34C muestra el volumen tumoral en ratones tratados con 100 jg de control de isotipo o EGFR-TriNKET en los puntos de tiempo indicados. La Figura 34D muestra el volumen tumoral en ratones tratados con 30 jg de control de isotipo o EGFR-TriNKET en los puntos de tiempo indicados.

Las Figuras 35A-35B son gráficos que muestran el volumen tumoral o el peso corporal a lo largo del tiempo en ratones desnudos con xenoinjertos de células NCI-H292 positivas para EGFR tratadas con control de isotipo, EGFR-TriNKET o Cetuximab según se indique. La Figura 35A muestra el volumen tumoral en ratones tratados con 100 jg de control de isotipo, EGFR-TriNKET o Cetuximab en los puntos de tiempo indicados. La Figura 35B muestra el peso corporal en ratones tratados con 100 jg de control de isotipo, EGFR-TriNKET o Cetuximab en los puntos de tiempo indicados.

Descripción detallada

La presente invención proporciona una proteína que comprende:

(a) una secuencia de scFv de unión al EGFR (VL-VH) en la orientación del dominio variable de cadena pesada (VH) ubicado en el extremo C-terminal respecto al dominio variable de cadena ligera (VL), unido a un polipéptido de dominio Fc para formar un polipéptido (VL-VH)-Fc, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 167;

y

(b) un fragmento Fab de unión a NKG2D que incluye:

una porción de cadena pesada que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio CH1, en donde el dominio CH1 se conecta a un polipéptido de dominio Fc para formar un polipéptido VH-CH1-Fc que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 164, y

una porción de cadena ligera que comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) y un dominio constante de cadena ligera (CL) para formar un polipéptido VL-CL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 165.

La invención se define por las reivindicaciones y cualquier otro aspecto, configuración o modalidad que se expone en la presente descripción que no caiga dentro del alcance de las reivindicaciones son solo con fines informativos. Cualquier referencia en la descripción a los métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para usar en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para el diagnóstico).

La presente solicitud proporciona proteínas de unión multiespecífica que se unen al receptor NKG2D y al receptor CD16 en células asesinas naturales, y EGFR. En algunas modalidades, las proteínas de unión multiespecífica incluyen además un sitio de unión al antígeno adicional que se une al EGF<r>. La presente solicitud también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden tales proteínas de unión multiespecífica, y métodos terapéuticos que usan tales proteínas de unión multiespecífica y composiciones farmacéuticas, para propósitos tales como tratar un cáncer. Varios aspectos de las proteínas de unión multiespecífica descritas en la presente solicitud se exponen más abajo en secciones; sin embargo, los aspectos de las proteínas de unión multiespecífica que se describen en una sección particular no deben limitarse a ninguna sección particular.

Para facilitar la comprensión de la presente solicitud, más abajo se definen una serie de términos y frases.

Los términos "un" y "una" cómo se usan en la presente descripción significan "uno o más" e incluyen el plural a menos que el contexto no sea apropiado.

Como se usa en la presente descripción, el término "sitio de unión al antígeno" se refiere a la parte de la molécula de inmunoglobulina que participa en la unión al antígeno. En los anticuerpos humanos, el sitio de unión al antígeno está formado por residuos de aminoácidos de las regiones variables ("V") N-terminales de las cadenas pesada ("H") y ligera ("L"). Tres segmentos muy divergentes dentro de las regiones V de las cadenas pesada y ligera se denominan "regiones hipervariables" que se interponen entre segmentos flanqueantes más conservados conocidos como "regiones de marco estructural" o "FR". Por lo tanto, el término "FR" se refiere a secuencias de aminoácidos que se encuentran naturalmente entre y adyacentes a las regiones hipervariables en las inmunoglobulinas. En una molécula de anticuerpo humano, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera y las tres regiones hipervariables de una cadena pesada se disponen entre sí en un espacio tridimensional para formar una superficie de unión al antígeno. La superficie de unión al antígeno es complementaria a la superficie tridimensional de un antígeno unido, y las tres regiones hipervariables de cada una de las cadenas pesada y ligera se denominan "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR". En ciertos animales, tales como camellos y peces cartilaginosos, el sitio de unión al antígeno se forma por una única cadena de anticuerpo que proporciona un "anticuerpo de dominio único". Los sitios de unión al antígeno pueden existir en un anticuerpo intacto, en un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo que retiene la superficie de unión al antígeno, o en un polipéptido recombinante tal como un scFv, mediante el uso de un enlazador peptídico para conectar el dominio variable de cadena pesada al dominio variable de cadena ligera en un único polipéptido.

El término “antígeno asociado a tumor” como se usa en la presente descripción significa cualquier antígeno que incluye, pero sin limitarse a, una proteína, glicoproteína, gangliósido, carbohidrato, lípido que se asocia con un cáncer. Tal antígeno puede expresarse en células malignas o en el microentorno tumoral tal como en vasos sanguíneos asociados al tumor, matriz extracelular, estroma mesenquimatoso o infiltrados inmunitarios. En determinadas modalidades de la presente descripción, el término "antígeno asociado al tumor" se refiere al EGFR. Como se usa en la presente descripción, los términos "sujeto" y "paciente" se refieren a un organismo a tratar mediante los métodos y composiciones descritos en la presente descripción. Tales organismos incluyen preferentemente, pero no se limitan a, mamíferos (por ejemplo, murinos, simios, equinos, bovinos, porcinos, caninos, felinos, y similares), y con mayor preferencia incluyen seres humanos.

Como se usa en la presente, el término “cantidad efectiva” se refiere a la cantidad de un compuesto(porejemplo, un compuesto descrito en la presente solicitud) suficiente para lograr resultados beneficiosos o convenientes. Una cantidad efectiva puede administrarse en una o más administraciones, aplicaciones o dosificaciones y no pretende limitarse a una formulación o vía de administración particular. Como se usa en la presente descripción, el término "tratar" incluye cualquier efecto, por ejemplo, disminuir, reducir, modular, mejorar o eliminar, que da como resultado la mejora de la afección, enfermedad, trastorno, y similares, o mejorar un síntoma del mismo.

Como se usa en la presente descripción, el término "composición farmacéutica" se refiere a la combinación de un agente activo con un portador, inerte o activo, lo que hace que la composición sea especialmente adecuada para el uso diagnóstico o terapéuticoin vivooex vivo.

Como se usa en la presente descripción, el término "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquiera de los portadores farmacéuticos estándar, tales como una solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones (por ejemplo, tales como emulsiones de aceite/agua o agua/aceite) y varios tipos de agentes humectantes. Las composiciones también pueden incluir estabilizadores y conservantes. Para ejemplos de portadores, estabilizadores y adyuvantes,véase,por ejemplo, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA [1975].

Como se usa en la presente, el término “sal farmacéuticamente aceptable” se refiere a cualquier sal farmacéuticamente aceptable (por ejemplo,ácido o base) de un compuesto descrito en la presente solicitud que, tras la administración a un sujeto, puede proporcionar un compuesto descrito en la presente solicitud o un metabolito activo o residuo de este. Como conocen los expertos en la técnica, las “sales” de los compuestos de la presente solicitud pueden derivarse de ácidos y bases inorgánicos u orgánicos. Los ácidos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, perclórico, fumárico, maleico, fosfórico, glicólico, láctico, salicílico, succínico, tolueno-p-sulfónico, tartárico, acético, cítrico, metanosulfónico, etanosulfónico, fórmico, benzoico, malónico, naftaleno-2-sulfónico, bencenosulfónico, y similares. Otros ácidos, tales como oxálicos, aunque no en sí mismos farmacéuticamente aceptables, pueden emplearse en la preparación de sales útiles como productos intermedios para obtener los compuestos de la presente solicitud y sus sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables.

Las bases ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, hidróxidos de metales alcalinos (por ejemplo, sodio), hidróxidos de metales alcalinotérreos (por ejemplo, magnesio), amoniaco y compuestos de fórmula NW4+, en donde W es alquilo C1-4, y similares.

Las sales ilustrativas incluyen, pero no se limitan a: acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, citrato, alcanforato, alcanforsulfonato, ciclopentano propionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, flucoheptanoato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, clorhidrato, bromuro, yoduro, 2-hidroxietanosulfonato, lactato, maleato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, oxalato, palmoato, pectinato, persulfato, fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, tosilato, undecanoato, y similares. Otros ejemplos de sales incluyen aniones de los compuestos de la presente solicitud compuestos con un catión adecuado tal como Na+, NH4+, y NW4+ (en donde W es un grupo alquilo C1-4), y similares.

Para uso terapéutico, las sales de los compuestos de la presente solicitud se contemplan como farmacéuticamente aceptables. Sin embargo, las sales de ácidos y bases que son no farmacéuticamente aceptables también pueden encontrar uso, por ejemplo, en la preparación o purificación de un compuesto farmacéuticamente aceptable.

Como se usa en la presente descripción, el EGFR (también conocido como receptor del factor de crecimiento epidérmico, ErbB-1, o HER1 en humanos) se refiere a la proteína con núm. de acceso de Uniprot P00533 (humano) e isoformas y ortólogos relacionados.

A lo largo de la descripción, cuando las composiciones se describen como que tienen, que incluyen, o que comprenden componentes específicos, o cuando los procesos y métodos se describen como que tienen, que incluyen, o que comprenden etapas específicas, se contempla que, adicionalmente, existen composiciones que consisten esencialmente en, o consisten en, los componentes mencionados, y que existen procesos y métodos de acuerdo con la presente solicitud que consisten esencialmente en, o consisten en, las etapas de procesamiento mencionadas.

Como consideración general, las composiciones que especifican un porcentaje son en peso a menos que se especifique de cualquier otra manera. Además, si una variable no va acompañada de una definición, entonces la definición anterior de los controles de variable.

I. Proteínas

La presente solicitud proporciona proteínas de unión multiespecífica que se unen al receptor NKG2D y al receptor CD16 en las células asesinas naturales, y al EGFR. Las proteínas de unión multiespecífica son útiles en las composiciones farmacéuticas y los métodos terapéuticos descritos en la presente descripción. La unión de las proteínas de unión multiespecífica al receptor NKG2D y al receptor CD16 en una célula asesina natural potencia la actividad de la célula asesina natural hacia la destrucción de células cancerosas que expresan el antígeno tumoral. La unión de las proteínas de unión multiespecífica a células tumorales que expresan el antígeno tumoral acerca estas células a la célula asesina natural, lo que facilita la destrucción directa e indirecta de las células tumorales por la célula asesina natural. Las proteínas de unión multiespecífica que se unen a NKG2D, CD16 y otra diana se describen en las publicaciones de solicitud internacional núms. WO2018148445 y WO2019157366. Más abajo se proporciona una descripción adicional de algunas proteínas de unión multiespecífica ilustrativas.

El primer componente de la proteína de unión multiespecífica es un sitio de unión al antígeno que se une a las células que expresan el receptor NKG2D, que pueden incluir, pero sin limitarse a, células NK, linfocitos T y§ y linfocitos T CD8+ ap. Tras la unión a NKG2D, las proteínas de unión multiespecífica pueden bloquear los ligandos naturales, tales como ULBP6 y MICA, para que no se unan a NKG2D y activen las células NK.

El segundo componente de las proteínas de unión multiespecífica es un sitio de unión al antígeno que se une al EGFR. Las células que expresan EGFR pueden encontrarse, por ejemplo, en tumores sólidos, por ejemplo, en indicaciones tales como cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de riñón, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de cerebro, glioma, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas y cáncer de hígado, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario o cáncer de próstata. El sitio de unión al antígeno que se une al EGFR comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) derivado del panitumumab y que tiene mutaciones en VH y VL que aumentan la termoestabilidad y retienen la afinidad por el EGFR.

El tercer componente de las proteínas de unión multiespecífica es un dominio Fc de anticuerpo o una porción de este o un sitio de unión al antígeno que se une a células que expresan CD16, un receptor de Fc en la superficie de los leucocitos que incluyen células asesinas naturales, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, mastocitos y células dendríticas foliculares.

Un sitio de unión al antígeno adicional de las proteínas de unión multiespecífica puede unirse al mismo antígeno asociado al tumor (EGFR). En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D es un scFv, y el segundo y los sitios de unión al antígeno adicionales que se unen al EGFR son cada uno un fragmento Fab. En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D es un scFv, y el segundo y los sitios de unión al antígeno adicionales que se unen al EGFR son cada uno un scFv. En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D es un fragmento Fab, y el segundo y los sitios de unión al antígeno adicionales que se unen al EGFR son cada uno un scFv. En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D es un Fab, y el segundo y los sitios de unión al antígeno adicionales que se unen al EGFR son cada uno un fragmento Fab.

Los sitios de unión al antígeno pueden incorporar cada uno un dominio variable de la cadena pesada de anticuerpo y un dominio variable de la cadena ligera de anticuerpo (por ejemplo, dispuestos como en un anticuerpo, o fusionados entre sí para formar un scFv), o uno o más de los sitios de unión al antígeno pueden ser un anticuerpo de dominio único, tal como un anticuerpo V<h>H como un anticuerpo de camélido o un anticuerpo V<nar>como los que se encuentran en los peces cartilaginosos.

En algunas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno incorpora un dominio variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera presente en el primer sitio de unión al antígeno.

Las proteínas de unión multiespecífica descritas en la presente descripción pueden adoptar varios formatos. Por ejemplo, un formato es un anticuerpo heterodimérico multiespecífico que incluye una primera cadena pesada de inmunoglobulina, una primera cadena ligera de inmunoglobulina, una segunda cadena pesada de inmunoglobulina y una segunda cadena ligera de inmunoglobulina (Figura 1). La primera cadena pesada de inmunoglobulina incluye un primer polipéptido de dominio Fc (bisagra-CH2-CH3), un primer dominio variable de cadena pesada y opcionalmente un primer dominio de cadena pesada CH1. La primera cadena ligera de inmunoglobulina incluye un primer dominio variable de cadena ligera y opcionalmente un primer dominio constante de cadena ligera. La primera cadena ligera de inmunoglobulina, junto con la primera cadena pesada de inmunoglobulina, forma un sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D. La segunda cadena pesada de inmunoglobulina comprende un segundo polipéptido de dominio Fc (bisagra-CH2-CH3), un segundo dominio variable de cadena pesada y opcionalmente un segundo dominio de cadena pesada CH1. La segunda cadena ligera de inmunoglobulina incluye un segundo dominio variable de cadena ligera y opcionalmente un segundo dominio constante de cadena ligera. La segunda cadena ligera de inmunoglobulina, junto con la segunda cadena pesada de inmunoglobulina, forma un sitio de unión al antígeno que se une a EGFR. En algunas modalidades, el primer polipéptido de dominio Fc y el segundo polipéptido de dominio Fc juntos son capaces de unirse a CD16 (Figura 1). En algunas modalidades, la primera cadena ligera de inmunoglobulina es idéntica a la segunda cadena ligera de inmunoglobulina.

Otro formato ilustrativo implica un anticuerpo heterodimérico multiespecífico, que incluye una primera cadena pesada de inmunoglobulina, una segunda cadena pesada de inmunoglobulina y una cadena ligera de inmunoglobulina(porejemplo, Figura 2A). En algunas modalidades, la primera cadena pesada de inmunoglobulina incluye un primer polipéptido de dominio Fc (bisagra-CH2-CH3) fusionado por medio de un enlazador o una bisagra de anticuerpo a un fragmento variable de cadena única (scFv) compuesto por un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera que se aparean y se unen a NKG2D o se unen a EGFR. La segunda cadena pesada de inmunoglobulina incluye un segundo polipéptido de dominio Fc (bisagra-CH2-CH3), un segundo dominio variable de cadena pesada y un dominio de cadena pesada CH1. La cadena ligera de inmunoglobulina incluye un dominio variable de cadena ligera y un dominio constante de cadena ligera. En algunas modalidades, la segunda cadena pesada de inmunoglobulina se empareja con la cadena ligera de inmunoglobulina y se une a NKG2D o se une al EGFR, con la condición de que cuando el primer polipéptido de dominio Fc se fusiona a un scFv que se une a NKG2D, la segunda cadena pesada de inmunoglobulina emparejada con la cadena ligera de inmunoglobulina se une al EGFR, pero no a NKG2D, y viceversa. En algunas modalidades, el scFv en la primera cadena pesada de inmunoglobulina se une al EGFR; y el dominio variable de la cadena pesada en la segunda cadena pesada de inmunoglobulina y el dominio variable de la cadena ligera en la cadena ligera de inmunoglobulina, cuando se emparejan, se unen a NKG2D(porejemplo, Figura 2E). En algunas modalidades, el scFv en la primera cadena pesada de inmunoglobulina se une a NKG2D; y el dominio variable de la cadena pesada en la segunda cadena pesada de inmunoglobulina y el dominio variable de la cadena ligera en la cadena ligera de inmunoglobulina, cuando se emparejan, se unen al EGFR. En algunas modalidades, el primer polipéptido de dominio Fc y el segundo polipéptido de dominio Fc juntos son capaces de unirse a CD16 (por ejemplo, Figura 2A).

Otro formato ilustrativo implica un anticuerpo heterodimérico multiespecífico que incluye una primera cadena pesada de inmunoglobulina y una segunda cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, Figura 2B). En algunas modalidades, la primera cadena pesada de inmunoglobulina incluye un primer polipéptido de dominio Fc (bisagra-CH2-CH3) fusionado por medio de un enlazador o una bisagra de anticuerpo a un fragmento variable de cadena única (scFv) compuesto por un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera que se aparean y se unen a NKG2D, o se unen a EGFR. En algunas modalidades, la segunda cadena pesada de inmunoglobulina incluye un segundo polipéptido de dominio Fc (bisagra-CH2-CH3) fusionado a través de un enlazador o una bisagra de anticuerpo con un fragmento variable de cadena única (scFv) compuesto por un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera que se emparejan y se unen a NKG2D, o EGFR, con la condición de que cuando el primer polipéptido de dominio Fc se fusiona a un scFv que se une a NKG2D, el segundo polipéptido de dominio Fc se fusiona a un scFv que se une al EGFR, pero no a NKG2D, y viceversa. En algunas modalidades, el primer polipéptido de dominio Fc y el segundo polipéptido de dominio Fc juntos son capaces de unirse a CD16 (por ejemplo, Figura 2B).

En algunas modalidades, el fragmento variable de cadena única (scFv) descrito anteriormente se une al dominio constante de anticuerpo a través de una secuencia bisagra. En algunas modalidades, la bisagra comprende aminoácidos Ala-Ser o Gly-Ser. En algunas modalidades, la bisagra que conecta un scFv (por ejemplo, un scFv que se une al EGFR o un scFv que se une a NKG2D) y el dominio constante de la cadena pesada del anticuerpo comprende los aminoácidos Ala-Ser. En algunas modalidades, la bisagra que conecta un scFv (por ejemplo, un scFv que se une al EGFR o un scFv que se une a NKG2D) y el dominio constante de la cadena pesada del anticuerpo comprende los aminoácidos Gly-Ser. En algunas otras modalidades, la bisagra comprende los aminoácidos Ala-Ser y Thr-Lys-Gly. La secuencia bisagra puede proporcionar flexibilidad de unión a la antígena diana y equilibrar la flexibilidad con la geometría óptima.

En algunas modalidades, el fragmento variable de cadena única (scFv) descrito anteriormente incluye un dominio variable de la cadena pesada y un dominio variable de la cadena ligera. En algunas modalidades, el dominio variable de la cadena pesada forma un puente disulfuro con el dominio variable de la cadena ligera para mejorar la estabilidad del scFv. Por ejemplo, puede formarse un puente disulfuro entre el residuo C44 del dominio variable de la cadena pesada y el residuo C100 del dominio variable de la cadena ligera, las posiciones de aminoácidos numeradas bajo Kabat. En algunas modalidades, el dominio variable de la cadena pesada se une al dominio variable de la cadena ligera a través de un enlazador flexible. Puede usarse cualquier enlazador adecuado, por ejemplo, el enlazador (G4S)4 ((GlyGlyGlyGlySer)4 (SEQ ID NO: 119)). En algunas modalidades del scFv, el dominio variable de la cadena pesada se ubica en el extremo N terminal del dominio variable de la cadena ligera. En algunas modalidades del scFv, el dominio variable de la cadena pesada se ubica en el extremo C terminal del dominio variable de la cadena ligera.

Las proteínas de unión multiespecífica descritas en la presente descripción pueden incluir además uno o más sitios de unión al antígeno adicionales. El/los sitio(s) de unión al antígeno adicionales pueden fusionarse al extremo N terminal del dominio CH2 de la región constante o al extremo C terminal del dominio CH3 de la región constante, opcionalmente a través de una secuencia enlazadora. En determinadas modalidades, el/los sitio(s) de unión al antígeno adicionales toman la forma de una región variable de cadena única (scFv) que está opcionalmente estabilizada con disulfuro, lo que da como resultado una proteína de unión multiespecífica tetravalente o trivalente. Por ejemplo, una proteína de unión multiespecífica incluye un sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D, un segundo sitio de unión al antígeno que se une a EGFR, un sitio de unión al antígeno adicional que se une al EGFR, y una región constante de anticuerpo o una porción de esta suficiente para unirse a CD16, o un cuarto sitio de unión al antígeno que se une a CD16. Cualquiera de estos sitios de unión al antígeno puede tomar la forma de un fragmento Fab o un scFv, tal como un scFv descrito anteriormente.

En algunas modalidades, el sitio de unión al antígeno adicional se une a un epítopo diferente del EGFR respecto al segundo sitio de unión al antígeno. En algunas modalidades, el sitio de unión al antígeno adicional se une al mismo epítopo que el segundo sitio de unión al antígeno. En algunas modalidades, el sitio de unión al antígeno adicional comprende las mismas secuencias de CDR de cadena pesada y cadena ligera que el segundo sitio de unión al antígeno. En algunas modalidades, el sitio de unión al antígeno adicional comprende las mismas secuencias de dominio variable de cadena pesada y cadena ligera que el segundo sitio de unión al antígeno. En algunas modalidades, el sitio de unión al antígeno adicional tiene la(s) misma(s) secuencia(s) de aminoácidos que el segundo sitio de unión al antígeno. En algunas modalidades, el sitio de unión a antígeno adicional comprende secuencias de dominio variable de cadena pesada y cadena ligera que son diferentes de las secuencias de dominio variable de cadena pesada y cadena ligera del segundo sitio de unión al antígeno. En algunas modalidades, el sitio de unión al antígeno adicional tiene una secuencia de aminoácidos que es diferente de la secuencia del segundo sitio de unión al antígeno. En algunas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno y el sitio de unión al antígeno adicional se unen a diferentes antígenos asociados al tumor. En algunas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno y el sitio de unión al antígeno adicional se unen a diferentes antígenos. Los formatos ilustrativos se muestran en la Figura 2C y la Figura 2D. En consecuencia, las proteínas de unión multiespecífica pueden proporcionar un acoplamiento bivalente de EGFR. El acoplamiento bivalente de EGFR por las proteínas de unión multiespecífica puede estabilizar el EGFR en la superficie de las células tumorales y potenciar la citotoxicidad de las células NK hacia las células tumorales. El acoplamiento bivalente de EGFR por las proteínas de unión multiespecífica puede conferir una unión más fuerte de las proteínas de unión multiespecífica a las células tumorales, lo que facilita de esta manera una respuesta citotóxica más fuerte de las células NK hacia las células tumorales, especialmente hacia las células tumorales que expresan un nivel bajo de EGFR.

Las proteínas de unión multiespecífica pueden tomar formatos adicionales. En algunas modalidades, la proteína de unión multiespecífica está en la forma de TriAcM, que es un anticuerpo biespecífico trifuncional que mantiene una forma similar a IgG. Esta quimera consiste en dos medios anticuerpos, cada uno con una cadena ligera y una cadena pesada, que se originan a partir de dos anticuerpos parentales.

En algunas modalidades, la proteína de unión multiespecífica es la forma KiH, que implica la tecnología de botón en ojal (KiH). KiH implica modificar genéticamente los dominios Ch3 para crear un "botón" o un "ojal" en cada cadena pesada para promover la heterodimerización. El concepto detrás de la tecnología de Fc de “botones en ojales (KiH)” fue introducir un “botón” en un dominio CH3 (CH3A) mediante la sustitución de un pequeño residuo por uno voluminoso (por ejemplo, T366W<ch>3<a>en la numeración de EU). Para acomodar el “botón”, se creó una superficie de “ojal” complementaria en el otro dominio CH3 (CH3B) mediante el reemplazo de los residuos adyacentes más cercanos al botón por otros más pequeños (por ejemplo, T366S/L368A/Y407V<ch>3<b>). La mutación de “ojal” se optimizó mediante cribado de bibliotecas de fagos guiado por estructuras (Atwell S, Ridgway JB, Wells JA, Carter P. Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library. J. Mol. Biol. (1997) 270(1):26-35). Las estructuras cristalinas de rayos X de las variantes de Fc de KiH (Elliott JM, Ultsch M, Lee J, Tong R, Takeda K, Spiess C, y otros, Antiparallel conformation of knob and hole aglycosylated half-antibody homodimers is mediated by a CH2-CH3 hydrophobic interaction. J. Mol. Biol. (2014) 426(9):1947-57; Mimoto F, Kadono S, Katada H, Igawa T, Kamikawa T, Hattori K. Crystal structure of a novel asymmetrically engineered Fc variant with improved affinity for FcyRs. Mol. Immunol. (2014) 58(1):132-8) demostró que la heterodimerización está favorecida termodinámicamente por interacciones hidrófobas impulsadas por complementariedad estérica en la interfaz central del dominio inter-CH3, mientras que las interfaces botón-botón y ojal-ojal no favorecen la homodimerización debido al impedimento estérico y la interrupción de las interacciones favorables, respectivamente. En algunas modalidades, la proteína de unión multiespecífica está en la forma de inmunoglobulina de dominio variable doble (DVD-Ig™), que combina los dominios de unión a diana de dos anticuerpos monoclonales a través de enlazadores flexibles de origen natural, y produce una molécula similar a IgG tetravalente.

En algunas modalidades, la proteína de unión multiespecífica está en la forma de interfaz Fab ortogonal (Orto-Fab). En el enfoque de IgG orto-Fab (Lewis SM, Wu X, Pustilnik A, Sereno A, Huang F, Rick HL, y otros, Generation of bispecific IgG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface. Nat. Biotechnol. (2014) 32(2):191-8), el diseño regional basado en estructuras introduce mutaciones complementarias en la interfaz de LC y HC<vh>-<ch>1 en un solo fragmento Fab, sin que se realice ningún cambio en el otro fragmento Fab.

En algunas modalidades, la proteína de unión multiespecífica está en el formato de Ig 2 en 1. En algunas modalidades, la proteína de unión multiespecífica tiene la forma ES, que es un constructo heterodimérico que contiene dos fragmentos Fab diferentes que se unen a la diana 1 y la diana 2 fusionados al Fc. La heterodimerización está garantizada por mutaciones de dirección electrostática en el Fc.

En algunas modalidades, la proteína de unión multiespecífica está en forma de Cuerpo kA, que es un constructo heterodimérico con dos fragmentos Fab diferentes fusionados a un Fc estabilizado mediante mutaciones de heterodimerización: El fragmento Fab 1 dirigido al antígeno 1 que contiene LC kappa, mientras que el fragmento Fab 2 dirigido al antígeno 2 contiene LC lambda. La Figura 13A es una representación ilustrativa de una forma de un Cuerpo kA; la Figura 13B es una representación ilustrativa de otro Cuerpo kA.

En algunas modalidades, la proteína de unión multiespecífica está en forma de intercambio de brazos del fragmento Fab (anticuerpos que intercambian brazos del fragmento Fab al intercambiar una cadena pesada y una cadena ligera unida (semimolécula) con un par de cadenas pesada y ligera de otra molécula, lo que da como resultado anticuerpos biespecíficos).

En algunas modalidades, la proteína de unión multiespecífica está en la forma del cuerpo de SEED. La plataforma de dominios modificados genéticamente por intercambio de hebras (SEED) se diseñó para generar moléculas asimétricas y biespecíficas de tipo anticuerpo, una capacidad que amplía las aplicaciones terapéuticas de los anticuerpos naturales. Esta plataforma de modificación genética de proteínas se basa en el intercambio de secuencias de inmunoglobulinas estructuralmente relacionadas dentro de los dominios CH3 conservados. El diseño de SEED permite la generación eficiente de heterodímeros AG/GA, a la vez que desfavorece la homodimerización de los dominios CH3 de SEED AG y GA. (Muda M. y otros, Protein Eng. Des. Sel. (2011, 24(5):447-54)).

En algunas modalidades, la proteína de unión multiespecífica tiene la forma de LuZ-Y, en la que se usa una cremallera de leucina para inducir la heterodimerización de dos HC diferentes. (Wranik, BJ. y otros, J. Biol. Chem. (2012), 287:43331-9).

En algunas modalidades, la proteína de unión multiespecífica está en la forma de Cov-X-cuerpo. En los Cov-X-Cuerpo biespecíficos, dos péptidos diferentes se unen mediante el uso de un enlazador de azetidinona ramificado y se fusionan con el anticuerpo del andamio en condiciones leves de una manera específica de sitio. Mientras que las farmacóforos son responsables de las actividades funcionales, el andamio de anticuerpos imparte una larga semivida y una distribución similar a Ig. Los farmacóforos pueden optimizarse químicamente o sustituirse por otros farmacóforos para generar anticuerpos biespecíficos optimizados o únicos. (Doppalapudi VR y otros, PNAS (2010), 107(52);22611-22616).

En algunas modalidades, la proteína de unión multiespecífica está en una forma heterodimérica Oasc-Fab que incluye un fragmento Fab que se une a la diana 1 y un scFab que se une a la diana 2 fusionados a Fc. La heterodimerización está garantizada por mutaciones en el Fc.

En algunas modalidades, la proteína de unión multiespecífica está en una forma AcMDoble, que es un constructo heterodimérico que contiene dos fragmentos Fab diferentes que se unen a los antígenos 1 y 2 y Fc estabilizado por mutaciones de heterodimerización. Los fragmentos Fab 1 y 2 contienen puentes S-S diferenciales que garantizan el emparejamiento correcto de LC y HC.

En algunas modalidades, la proteína de unión multiespecífica está en una forma CrossAcM que es un constructo heterodimérico con dos fragmentos Fab diferentes que se unen a las dianas 1 y 2 fusionados a Fc estabilizado por heterodimerización. Los dominios CL y CH1 y los dominios VH y VL se intercambian, por ejemplo, CH1 se fusiona en marco con VL, mientras que CL se fusiona en marco con VH.

En algunas modalidades, la proteína de unión multiespecífica está en una forma Fit-Ig, que es un constructo homodimérico donde un fragmento Fab que se une al antígeno 2 se fusiona al extremo N terminal de HC de un fragmento Fab que se une al antígeno 1. El constructo contiene Fc de tipo silvestre.

Los componentes individuales de las proteínas de unión multiespecífica se describen con más detalle más abajo. Sitio de unión a NKG2D

Al unirse al receptor NKG2D y al receptor CD16 en las células asesinas naturales, y a EGFR, las proteínas de unión multiespecífica pueden acoplarse a más de un tipo de receptor activador de NK y pueden bloquear la unión de ligandos naturales a NKG2D. En determinadas modalidades, las proteínas pueden agonizar las células NK en humanos. En algunas modalidades, las proteínas pueden agonizar las células NK en seres humanos, y en otras especies tales como roedores y macacos cangrejeros. En algunas modalidades, las proteínas pueden agonizar las células NK en seres humanos, y en otras especies tales como macacos cangrejeros.

La Tabla 1 presenta secuencias peptídicas de dominios variables de cadena pesada y dominios variables de cadena ligera que, en combinación, pueden unirse a NKG2D. En algunas modalidades, el dominio variable de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera están dispuestos en formato Fab. En algunas modalidades, el dominio variable de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera se fusionan entre sí para formar un scFv.

Los sitios de unión a NKG2D incluidos en la Tabla 1 pueden variar en su afinidad de unión a NKG2D, sin embargo, todos activan las células NK humanas.

A menos que se indique de cualquier otra manera, las secuencias de CDR proporcionadas en la Tabla 1 se determinan según la numeración de Kabat.

En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D (por ejemplo, NKG2D humano) comprende un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica al VH de un anticuerpo descrito en la Tabla 1, y un dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica al VL del mismo anticuerpo descrito en la Tabla 1. En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno comprende las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera, determinadas bajo Kabat(verKabat y otros, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH Publication núm. 91-3242, Bethesda), Chothia (ver, por ejemplo, Chothia C & Lesk A M, (1987), J. Mol. Biol. 196: 901-917), MacCallum(verMacCallum R M y otros, (1996) J. Mol. Biol. 262: 732-745), o cualquier otro método de determinación de CDR conocido en la técnica, de las secuencias VH y VL de un anticuerpo descritas en la Tabla 1. En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de un anticuerpo descrito en la Tabla 1.

En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D comprende un dominio variable de cadena pesada derivado de la SEQ ID NO: 1, tal como tener una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la SEQ ID NO: 1, y/o incorporar secuencias de aminoácidos idénticas a las secuencias de CDR1 (SEQ ID NO:2), CDR2 (SEQ ID NO:3), y CDR3 (SEQ ID NO:4) de la SEQ ID NO: 1. El dominio variable de la cadena pesada relacionado con la SEQ<i>D NO: 1 puede acoplarse con una variedad de dominios variables de la cadena ligera para formar un sitio de unión a NKG2D. Por ejemplo, el primer sitio de unión al antígeno que incorpora un dominio variable de cadena pesada relacionado con la SEQ ID NO: 1 puede incorporar además un dominio variable de cadena ligera seleccionado de las secuencias derivadas de las SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 y 46. Por ejemplo, el primer sitio de unión al antígeno incorpora un dominio variable de cadena pesada con secuencias de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idénticas a la SEQ ID NO: 1 y un dominio variable de cadena ligera con secuencias de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idénticas a cualquiera de las secuencias seleccionadas de las SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, y 46.

En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D comprende un VH que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:26, y un VL que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la SEQ ID NO:32. En determinadas modalidades, el VH comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 27 o 28, 29 y 30 o 31, respectivamente (por ejemplo, las SEQ ID NO: 27, 29 y 30, respectivamente, o las SEQ ID NO: 28, 29 y 31, respectivamente). En determinadas modalidades, el VL comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 33, 34 y 35, respectivamente. En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno comprende (a) un VH que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 27 o 28, 29 y 30 o 31, respectivamente (por ejemplo, las SEQ ID NO: 27, 29 y 30, respectivamente, o las SEQ ID NO: 28, 29 y 31, respectivamente); y (b) un VL que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 33, 34 y 35, respectivamente.

En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D comprende un VH que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:36, y un VL que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la SEQ ID NO:42. En determinadas modalidades, el VH comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 37 o 38, 39 y 40 o 41, respectivamente (por ejemplo, las SEQ ID NO: 37, 39 y 40, respectivamente, o las SEQ ID NO: 38, 39 y 41, respectivamente). En determinadas modalidades, el VL comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 43, 44 y 45, respectivamente. En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno comprende (a) un VH que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 37 o 38, 39 y 40 o 41, respectivamente (por ejemplo, las SEQ ID NO: 37, 39 y 40, respectivamente, o las SEQ ID NO: 38, 39 y 41, respectivamente); y (b) un VL que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 43, 44 y 45, respectivamente.

En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D comprende un VH que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:47, y un VL que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la SEQ ID NO:49. En determinadas modalidades, el VH comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 27, 29 y 48, respectivamente. En determinadas modalidades, el VL comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50, 34 y 51, respectivamente. En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno comprende:(a) un VH que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 27, 29, y 48, respectivamente; y (b) un VL que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50, 34 y 51, respectivamente.

En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D comprende un VH que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:52, y un VL que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la SEQ ID NO:58. En determinadas modalidades, el VH comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 53 o 54, 55 y 56 o 57, respectivamente (por ejemplo,las SEQ ID NO: 53, 55 y 56, respectivamente, o las SEQ ID NO: 54, 55 y 57, respectivamente). En determinadas modalidades, el VL comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 59, 60 y 61, respectivamente. En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno comprende (a) un VH que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 53 o 54, 55 y 56 o 57, respectivamente (por ejemplo, las SEQ ID NO: 53, 55 y 56, respectivamente, o las SEQ ID NO: 54, 55 y 57, respectivamente); y (b) un VL que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 59, 60 y 61, respectivamente.

En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D comprende un VH que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:62, y un VL que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la SEQ ID NO:68. En determinadas modalidades, el VH comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 63 o 64, 65 y 66 o 67, respectivamente (por ejemplo,las SEQ ID NO: 63, 65 y 66, respectivamente, o las SEQ ID NO: 64, 65 y 67, respectivamente). En determinadas modalidades, el VL comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 59, 60 y 69, respectivamente. En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno comprende (a) un VH que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 63 o 64, 65 y 66 o 67, respectivamente (por ejemplo, las SEQ ID NO: 63, 65 y 66, respectivamente, o las SEQ ID NO: 64, 65 y 67, respectivamente); y (b) un VL que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 59, 60 y 69, respectivamente.

En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D comprende un VH que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:89, y un VL que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la SEQ ID NO:92. En determinadas modalidades, el VH comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 53 o 54, 55 y 90 o 91, respectivamente (por ejemplo, las SEQ ID NO: 53, 55 y 90, respectivamente, o las SEQ ID NO: 54, 55 y 91, respectivamente). En determinadas modalidades, el VL comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 93, 44 y 94, respectivamente. En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno comprende (a) un VH que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 53 o 54, 55 y 90 o 91, respectivamente (por ejemplo, las SEQ ID NO: 53, 55 y 90, respectivamente, o las SEQ ID NO: 54, 55 y 91, respectivamente); y (b) un VL que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 93, 44 y 94, respectivamente.

En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D comprende un VH que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:70, y un VL que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90%(por ejemplo, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la SEQ ID NO:75. En determinadas modalidades, el VH comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 71 o 115, 72 y 73 o 74, respectivamente (por ejemplo, las SEQ ID NO: 71, 72 y 73, respectivamente, o las SEQ ID NO: 115, 72 y 74, respectivamente). En determinadas modalidades, el VL comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 76, 77 y 78, respectivamente. En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno comprende (a) un VH que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 71 o 115, 72 y 73 o 74, respectivamente (por ejemplo, las SEQ ID NO: 71, 72 y 73, respectivamente, o las SEQ ID NO: 115, 72 y 74, respectivamente); y (b) un V<l>que comprende CDR1, CDR2 y<c>DR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 76, 77 y 78, respectivamente.

En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D comprende un VH que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:79, y un VL que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la SEQ ID NO:85. En determinadas modalidades, el VH comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 80 u 81, 82 y 83 u 84, respectivamente (por ejemplo, las SEQ ID NO: 80, 82 y 83, respectivamente, o las SEQ ID NO: 81, 82 y 84, respectivamente). En determinadas modalidades, el VL comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 86, 77 y 87, respectivamente. En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno comprende (a) un VH que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 80 u 81, 82 y 83 u 84 respectivamente (por ejemplo, las S<e>Q ID NO: 80, 82 y 83, respectivamente, o las SEQ ID NO: 81, 82 y 84, respectivamente); y (b) un VL que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 86, 77 y 87, respectivamente.

En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D comprende un VH que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:95, y un VL que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la SEQ ID NO:85. En determinadas modalidades, el VH comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 80 u 81, 82 y 96 o 97, respectivamente (por ejemplo, las SEQ ID NO: 80, 82 y 96, respectivamente, o las SEQ ID NO: 81, 82 y 97, respectivamente). En determinadas modalidades, el VL comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 86, 77 y 87, respectivamente. En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno comprende (a) un VH que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 80 u 81, 82 y 96 o 97, respectivamente (por ejemplo, las SEQ ID NO: 80, 82 y 96, respectivamente, o las SEQ ID NO: 81, 82 y 97, respectivamente); y (b) un VL que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 86, 77 y 87, respectivamente.

En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D comprende un VH que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:98, y un VL que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la SEQ ID NO:85. En determinadas modalidades, el VH comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 80 u 81, 82 y 99 o 100, respectivamente (por ejemplo, las SEQ ID NO: 80, 82 y 99, respectivamente, o las SEQ ID NO: 81, 82 y 100, respectivamente). En determinadas modalidades, el VL comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 86, 77 y 87, respectivamente. En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno comprende (a) un VH que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 80 u 81, 82 y 99 o 100, respectivamente (por ejemplo, las SEQ ID NO: 80, 82 y 99, respectivamente, o las SEQ ID NO: 81, 82 y 100, respectivamente); y (b) un VL que comprende CDR1, CDR2 y<c>DR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 86, 77 y 87, respectivamente.

En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D comprende un VH que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:101, y un VL que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la SEQ ID NO:85. En determinadas modalidades, el VH comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 80 u 81, 82 y 102 o 103, respectivamente (por ejemplo, las SEQ ID NO: 80, 82 y 102, respectivamente, o las SEQ ID NO: 81, 82 y 103, respectivamente). En determinadas modalidades, el VL comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 86, 77 y 87, respectivamente. En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno comprende (a) un VH que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 80 u 81, 82 y 102 o 103, respectivamente (por ejemplo, las SEQ ID NO: 80, 82 y 102, respectivamente, o las SEQ ID NO: 81, 82 y 103, respectivamente); y (b) un VL que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 86, 77 y 87, respectivamente.

En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D comprende un VH que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:104, y un VL que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la SEQ ID NO:85. En determinadas modalidades, el VH comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 80 u 81, 82 y 105 o 106, respectivamente (por ejemplo, las SEQ ID NO: 80, 82 y 105, respectivamente, o las SEQ ID NO: 81, 82 y 106, respectivamente). En determinadas modalidades, el VL comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 86, 77 y 87, respectivamente. En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno comprende (a) un VH que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 80 u 81, 82 y 105 o 106, respectivamente (por ejemplo, las SEQ ID NO: 80, 82 y 105, respectivamente, o las SEQ ID NO: 81, 82 y 106, respectivamente); y (b) un VL que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 86, 77 y 87, respectivamente.

En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D comprende un VH que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:107, y un VL que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la SEQ ID NO:85. En determinadas modalidades, el VH comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 80 u 81, 82 y 108 o 109, respectivamente (por ejemplo, las SEQ ID NO: 80, 82 y 108, respectivamente, o las SEQ ID NO: 81, 82 y 109, respectivamente). En determinadas modalidades, el VL comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 86, 77 y 87, respectivamente. En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno comprende (a) un VH que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 80 u 81, 82 y 108 o 109, respectivamente (por ejemplo, las SEQ ID NO: 80, 82 y 108, respectivamente, o las SEQ ID NO: 81, 82 y 109, respectivamente); y (b) un VL que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 86, 77 y 87, respectivamente.

En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D comprende un VH que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:110, y un VL que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 %(porejemplo, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la SEQ ID NO:85. En determinadas modalidades, el VH comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 80 u 81, 82 y 111 o 112, respectivamente (por ejemplo, las SEQ ID NO: 80, 82 y 111, respectivamente, o las SEQ ID NO: 81, 82 y 112, respectivamente). En determinadas modalidades, el VL comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 86, 77 y 87, respectivamente. En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno comprende (a) un VH que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 80 u 81, 82 y 111 o 112, respectivamente (por ejemplo, las SEQ ID NO: 80, 82 y 111, respectivamente, o las SEQ ID NO: 81, 82 y 112, respectivamente); y (b) un VL que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 86, 77 y 87, respectivamente.

En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D comprende un VH que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 113, y un VL que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la SEQ ID NO: 114.

En determinadas modalidades, el primer sitio de unión al antígeno que se une a NKG2D comprende un VH que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90%(por ejemplo, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 116, y un VL que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la SEQ ID NO: 117.

Las proteínas de unión multiespecífica pueden unirse a células que expresan NKG2D, que incluyen, pero no se limitan a, células NK, linfocitos T y§ y linfocitos T CD8+ ap. Tras la unión a NKG2D, las proteínas de unión multiespecífica pueden bloquear los ligandos naturales, tales como ULBP6 y MICA, para que no se unan a NKG2D y activen las células NK.

Las proteínas de unión multiespecífica se unen a las células que expresan CD16, un receptor Fc en la superficie de leucocitos que incluyen células asesinas naturales, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, mastocitos y células dendríticas foliculares. Una proteína descrita en la presente descripción se une a NKG2D con una afinidad de Kd de 2 nM a 120 nM, por ejemplo, 2 nM a 110 nM, 2 nM a 100 nM, 2 nM a 90 nM, 2 nM a 80 nM, 2 nM a 70 nM, 2 nM a 60 nM, 2 nM a 50 nM, 2 nM a 40 nM, 2 nM a 30 nM, 2 nM a 20 nM, 2 nM a 10 nM, aproximadamente 15 nM, aproximadamente 14 nM, aproximadamente 13 nM, aproximadamente 12 nM, aproximadamente 11 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 9 nM, aproximadamente 8 nM, aproximadamente 7 nM, aproximadamente 6 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 4,5 nM, aproximadamente 4 nM, aproximadamente 3,5 nM, aproximadamente 3 nM, aproximadamente 2,5 nM, aproximadamente 2 nM, aproximadamente 1,5 nM, aproximadamente 1 nM, entre aproximadamente 0,5 nM a aproximadamente 1 nM, aproximadamente 1 nM a aproximadamente 2 nM, aproximadamente 2 nM a 3 nM, aproximadamente 3 nM a 4 nM, aproximadamente 4 nM a aproximadamente 5 nM, aproximadamente 5 nM a aproximadamente 6 nM, aproximadamente 6 nM a aproximadamente 7 nM, aproximadamente 7 nM a aproximadamente 8 nM, aproximadamente 8 nM a aproximadamente 9 nM, aproximadamente 9 nM a aproximadamente 10 nM, aproximadamente 1 nM a aproximadamente 10 nM, aproximadamente 2 nM a aproximadamente 10 nM, aproximadamente 3 nM a aproximadamente 10 nM, aproximadamente 4 nM a aproximadamente 10 nM, aproximadamente 5 nM a aproximadamente 10 nM, aproximadamente 6 nM a aproximadamente 10 nM, aproximadamente 7 nM a aproximadamente 10 nM, o aproximadamente 8 nM a aproximadamente 10 nM. En algunas modalidades, los sitios de unión a NKG2D se unen a NKG2D con una K<d>de 10 a 62 nM.

Sitio de unión a EGFR

En un aspecto, la presente descripción proporciona proteínas de unión multiespecífica que se unen al receptor NKG2D y al receptor CD16 en células asesinas naturales, y al EGFR, en donde el sitio de unión al EGFR comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) derivados del panitumumab y que tiene mutaciones en VH y VL. Las mutaciones que se contemplan, individualmente o en combinación, en las secuencias de VH y VL descritas en la presente descripción incluyen S62R en el VH, D92R en el VL y/o F87Y en el VL, bajo el esquema de numeración de Chothia. Se ha descubierto que estas mutaciones aumentan la termoestabilidad del sitio de unión al antígeno y retienen su afinidad por el EGFR. La Tabla 2 presenta algunas secuencias ilustrativas de dominios variables de cadena pesada, dominios variables de cadena ligera y secuencias de scFV que pueden unirse al EGFR. Las secuencias de CDR se identifican bajo la numeración de Chothia como se indica. Los residuos en negrita indican residuos mutados y la secuenciaen cursivaindica un enlazador polipeptídico.

En determinadas modalidades, la secuencia de aminoácidos del segundo sitio de unión al antígeno comprende un residuo de arginina (R) adicional en el extremo C-terminal del VL (por ejemplo, SEQ ID NO: 139, 147 o 150). En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno comprende un scFv que incluye una secuencia de aminoácidos de VL que contiene un residuo de arginina (R) adicional en el extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos de VL.

En determinadas modalidades, la secuencia de aminoácidos del segundo sitio de unión al antígeno comprende una o más mutaciones con relación a la secuencia de panitumumab seleccionada de S62R en VH, D92R en VL y F87Y en VL, bajo el esquema de numeración de Chothia. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno que se une al EGFR (por ejemplo, EGFR humano) comprende un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %) idéntica al VH del aglutinante de EGFR-1 como se describe en la Tabla 1, y un dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %) idéntica a la VL del aglutinante de EGFR-1 como se describe en la Tabla 1. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno que se une al EGFR (por ejemplo,EGFR humano) comprende un dominio variable de la cadena pesada (VH) de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica al VH del aglutinante de EGFR-2, aglutinante de EGFR-3, o aglutinante de EGFR-4 como se describe en la Tabla 2, y un dominio variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la VL del aglutinante de EGFR-2, aglutinante de EGFR-3, o aglutinante de EGFR-4 como se describe en la Tabla 2. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno comprende las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera, determinadas bajo Kabat (ver Kabat y otros, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH Publication núm. 91-3242, Bethesda), Chothia (ver, por ejemplo, Chothia C & Lesk A M, (1987), J. Mol. Biol. 196:

901-917), MacCallum (ver MacCallum R M y otros, (1996) J. Mol. Biol. 262: 732-745), o cualquier otro método de determinación de CDR conocido en la técnica, de las secuencias VH y VL del aglutinante de EGFR-2, el aglutinante de EGFR-3 o el aglutinante de EGFR-4 como se describe en la Tabla 2. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera del aglutinante de EGFR-2, el aglutinante de EGFR-3 o el aglutinante de EGFR-4 como se describe en la Tabla 2.

En determinadas modalidades, la secuencia de aminoácidos del segundo sitio de unión al antígeno comprende las mutaciones S62R en VH y F87Y en VL con relación a la secuencia de panitumumab, bajo el esquema de numeración de Chothia. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno que se une al EGFR comprende un VH que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %) idéntica a la SEQ ID NO: 135, y un VL que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %) idéntica a la SEQ ID NO: 139. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno que se une al EGFR comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la SEQ ID NO: 145, y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la SEQ ID NO: 147. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno comprende las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera, determinadas bajo Kabat (ver Kabat y otros, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH Publication núm. 91-3242, Bethesda), Chothia (ver, por ejemplo, Chothia C & Lesk A M, (1987), J. Mol. Biol. 196: 901-917), MacCallum (ver MacCallum R M y otros, (1996) J. Mol. Biol. 262:

732-745), o cualquier otro método de determinación de CDR conocido en la técnica, de las secuencias VH y VL del aglutinante de EGFR-2 descritas en la Tabla 2. En determinadas modalidades, el VH comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 136, 146 y 138, respectivamente. En determinadas modalidades, el VL comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 140, 141 y 142, respectivamente. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno comprende: (a) un VH que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las s Eq ID nO: 136, 146, y 138, respectivamente; y (b) un VL que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 140, 141, y 142, respectivamente. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno está presente como un scFv, en donde el scFv comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 %) idéntica a la SEQ ID NO: 148 o 149. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno está presente como un scFv, en donde el scFv comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 148 o 149. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno está presente como un scFv, en donde el scFv comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 148. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno está presente como un scFv, en donde el scFv comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 149.

En determinadas modalidades, la secuencia de aminoácidos del segundo sitio de unión al antígeno comprende las mutaciones S62R en VH, F87Y en VL y D92R en VL con relación a la secuencia de panitumumab, bajo el esquema de numeración de Chothia. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno que se une al EGFR comprende un VH que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 %(porejemplo, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %) idéntica a la SEQ ID NO:135, y un VL que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %) idéntica a la SEQ ID NO: 139. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno que se une al EGFR comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la SEQ ID NO: 145, y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la SEQ ID NO: 150. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno que se une al EGFR comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la SEQ ID NO: 170, y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la SEQ ID NO: 171. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno comprende las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera, determinadas bajo Kabat (ver Kabat y otros, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH Publication núm. 91-3242, Bethesda), Chothia (ver, por ejemplo, Chothia C & Lesk A M, (1987), J. Mol. Biol. 196: 901-917), MacCallum (ver MacCallum R M y otros, (1996) J. Mol. Biol. 262: 732-745), o cualquier otro método de determinación de CDR conocido en la técnica, de las secuencias VH y VL del aglutinante de EGFR-3 descritas en la Tabla 2. En determinadas modalidades, el VH comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 136, 146 y 138, respectivamente. En determinadas modalidades, el VL comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 140, 141 y 151, respectivamente. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno comprende: (a) un VH que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 136, 146, y 138, respectivamente; y (b) un VL que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 140, 141, y 151, respectivamente. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno está presente como un scFV, en donde el scFv comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 %) idéntica a la SEQ ID NO: 152 o 153. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno está presente como un scFv, en donde el scFv comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 152 o 153. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno está presente como un scFv, en donde el scFv comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 152. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno está presente como un scFv, en donde el scFv comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 153.

En determinadas modalidades, la secuencia de aminoácidos del segundo sitio de unión al antígeno comprende las mutaciones F87Y en VL y D92R en VL con relación a la secuencia de panitumumab, bajo el esquema de numeración de Chothia. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno que se une al EGFR comprende un VH que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %) idéntica a la SEQ ID NO: 135, y un VL que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %) idéntica a la SEQ ID NO: 139. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno que se une al EGFR comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la SEQ ID NO:135, y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la SEQ ID NO: 150. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno comprende las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera, determinadas bajo Kabat (ver Kabat y otros, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH Publication núm. 91-3242, Bethesda), Chothia (ver, por ejemplo, Chothia C & Lesk A M, (1987), J. Mol. Biol. 196: 901-917), MacCallum (ver MacCallum R M y otros, (1996) J. Mol. Biol. 262: 732-745), o cualquier otro método de determinación de CDR conocido en la técnica, de las secuencias VH y VL del aglutinante de EGFR-4 descritas en la Tabla 2. En determinadas modalidades, el VH comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 136, 137 y 138, respectivamente. En determinadas modalidades, el VL comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 140, 141 y 151, respectivamente. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno comprende: (a) un VH que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las<s>E<q>ID<n>O: 136, 137, y 138, respectivamente; y (b) un VL que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 140, 141, y 151, respectivamente. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno está presente como un scFV, en donde el scFv comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 %) idéntica a la SEQ ID NO: 154 o 155. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno está presente como un scFv, en donde el scFv comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 154. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno está presente como un scFv, en donde el scFv comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 155.

En determinadas modalidades, la secuencia de aminoácidos del segundo sitio de unión al antígeno comprende F87Y en el VL y D92R en el VL, y opcionalmente S62R en las mutaciones VH con relación a la secuencia de panitumumab, bajo el esquema de numeración de Chothia. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno que se une al EGFR comprende un VH que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 %(porejemplo, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %) idéntica a la SEQ ID NO:135, y un VL que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %) idéntica a la SEQ ID NO: 139. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno que se une al EGFR comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la SEQ ID NO: 156, y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 %) idéntica a la SEQ ID NO: 150. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno comprende las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera, determinadas bajo Kabat (ver Kabat y otros, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH Publication núm.

91-3242, Bethesda), Chothia (ver, por ejemplo, Chothia C & Lesk A M, (1987), J. Mol. Biol. 196: 901-917), MacCallum (ver MacCallum R M y otros, (1996) J. Mol. Biol. 262: 732-745), o cualquier otro método de determinación de CDR conocido en la técnica, de las secuencias VH y VL consenso descritas en la Tabla 2. En determinadas modalidades, el VH comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 136, 157 y 138, respectivamente. En determinadas modalidades, el VL comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 140, 141 y 151, respectivamente. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno comprende: (a) un VH que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 136, 157, y 138, respectivamente; y (b) un VL que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 140, 141, y 151, respectivamente. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno está presente como un scFV, en donde el scFv comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (por ejemplo,al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 %) idéntica a la SEQ ID NO: 158 o 159. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno está presente como un scFv, en donde el scFv comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 158. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno está presente como un scFv, en donde el scFv comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 159.

Alternativamente, los novedosos sitios de unión al antígeno que pueden unirse al EGFR pueden identificarse mediante cribado para determinar la unión a la secuencia de aminoácidos del EGFR, una isoforma de este, una variante de este, un fragmento extracelular maduro de este o un fragmento que contiene un dominio del EGFR.

Tabla 3. Secuencias para isoformas de EGFR ilustrativas

En algunas modalidades, los novedosos sitios de unión a antígeno que pueden unirse al EGFR pueden identificarse mediante cribado para determinar la unión a la secuencia de aminoácidos definida por las SEQ ID NO: 160-163, una variante de estas, un fragmento extracelular maduro de estas o un fragmento que contiene un dominio del EGFR.

En cada una de las modalidades anteriores, se contempla en la presente descripción que las secuencias de scFv, VH y/o VL que se unen al EGFR pueden contener alteraciones de aminoácidos (por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 10 sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos) en las regiones del marco estructural del VH y/o VL sin afectar su capacidad de unirse al EGFR. Por ejemplo, se contempla en la presente descripción que las secuencias de scFv, VH y/o VL que se unen al EGFR pueden contener mutaciones de heterodimerización de cisteína, lo que facilita la formación de un puente disulfuro entre el VH y VL del scFv.

En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno de la proteína de unión multiespecífica descrita en la presente descripción se une al EGFR humano o a la región extracelular de este a un valor de Kd menor o igual a (afinidad mayor o igual a) 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM o 4 nM. En determinadas modalidades, el sitio de unión al antígeno de la presente solicitud se une al EGFR humano o la región extracelular de este a un valor de K<d>menor o igual a (afinidad mayor o igual a) 4 nM. En determinadas modalidades, un sitio de unión al antígeno de la presente solicitud se une al EGFR humano o la región extracelular de este a un valor de K<d>menor o igual que (afinidad mayor o igual que) aproximadamente 2,0 nM, 2,1 nM, 2,2 nM, 2,3 nM, 2,4 nM, 2,5 nM, 2,6 nM, 2,7 nM, 2,8 nM, 2,9 nM, 3,0 nM, 3,1 nM, 3,2 nM, 3,3 nM, 3,4 nM, 3,5 nM, 3,6 nM, 3,7 nM, 3,8 nM, 3,9 nM, 4,0 nM, 4,1 nM, 4,2 nM, 4,3 nM, 4,4 nM, 4,5 nM, 4,6 nM, 4,7 nM, 4,8 nM, 4,9 nM o 5,0 nM. En determinadas modalidades, un sitio de unión a antígeno de la presente solicitud se une al EGFR humano o a la región extracelular de este a un valor de K<d>en el intervalo de aproximadamente 1,0-3,5 nM, 1,0-4,0 nM, 1,0-4,5 nM, 1,0-5,0 nM, 1,5-3,5 nM, 1,5-4,0 nM, 1,5-4,5 nM, 1,5-5,0 nM, 2,0-3,5 nM, 2,0-4,0 nM, 2,0-4,5 nM, 2,0-5,0 nM, 2,5-3,5 nM, 2,5-4,0 nM, 2,5-4,5 nM, 2,5-5,0 nM, 3,0-3,5 nM, 3,0-4,0 nM, 3,0-4,5 nM, o 3,0-5,0 nM.

En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno de la proteína de unión multiespecífica descrita en la presente descripción se une al EGFR de macaco Rhesus o la región extracelular de este a un valor de K<d>menor o igual a (afinidad mayor o igual a) 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM o 4 nM. En determinadas modalidades, un sitio de unión a antígeno de la presente solicitud se une al EGFR de macaco Rhesus o la región extracelular de este a un valor de Kd en el intervalo de aproximadamente 1-10 nM, 1-6 nM, 2-10 nM, 2-6 nM, 3-10 nM, 3-6 nM, 4-10 nM, 4-6 nM, 5-10 nM o 5-6 nM.

En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno de la proteína de unión multiespecífica descrita en la presente descripción tiene mayor estabilidad térmica que un sitio de unión a antígeno correspondiente que tiene las secuencias VH y VL de las SEQ ID NO: 135 y 139, en donde el segundo sitio de unión al antígeno no comprende una mutación G44C en el VH y una mutación G100C en el VL. En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión al antígeno de la proteína de unión multiespecífica descrita en la presente descripción tiene mayor estabilidad térmica que un sitio de unión a antígeno correspondiente que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 143 o 144, en donde el segundo sitio de unión a la antígena toma un formato scFv en la orientación VL-VH o VH-VL, respectivamente. Los métodos para medir la termoestabilidad incluyen, pero no se limitan a, calorimetría diferencial de barrido (DSC), por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 3 más abajo. En determinadas modalidades, donde el segundo sitio de unión a la antígena toma un formato scFv en la orientación VL-VH, una temperatura de fusión del segundo sitio de unión al antígeno (por ejemplo, Tinicio o Tm1 de un TriNKET en el formato F3', medido por DSC) es mayor que la temperatura de fusión correspondiente de un scFv que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 143 en al menos 1 °C, 2 °C, 3 °C, 4 °C, 5 °C o 6 °C. En determinadas modalidades, donde el segundo sitio de unión a la antígena toma un formato scFv en la orientación VH-VL, una temperatura de fusión del segundo sitio de unión al antígeno (por ejemplo, Tinicio o Tm1 de un TriNKET en el formato F3', medido por DSC) es mayor que la temperatura de fusión correspondiente de un scFv que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID<n>O: 144 en al menos 1 °C, 2 °C, 3 °C, 4 °C, 5 °C o 6 °C.

Dominio Fc

Dentro del dominio Fc, la unión a CD16 está mediada por la región de bisagra y el dominio CH2. Por ejemplo, dentro de la IgG1 humana, la interacción con CD16 se centra principalmente en los residuos de aminoácidos Asp 265 - Glu 269, Asn 297 - Thr 299, Ala 327 - Ile 332, Leu 234 - Ser 239 y el residuo de carbohidrato N-acetil-D-glucosamina en el dominio CH2 (véase, Sondermann y otros, Nature, 406(6793):267-273). Sobre la base de los dominios conocidos, las mutaciones pueden seleccionarse para potenciar o reducir la afinidad de unión a CD16, tal como mediante el uso de bibliotecas presentadas por fagos o bibliotecas de ADNc presentadas en la superficie de levadura, o pueden diseñarse sobre la base de la estructura tridimensional conocida de la interacción. En consecuencia, en determinadas modalidades, el dominio Fc del anticuerpo o la porción de este comprende una bisagra y un dominio CH2.

El ensamble de cadenas pesadas de anticuerpo heterodiméricas puede lograrse mediante la expresión de dos secuencias de cadenas pesadas de anticuerpo diferentes en la misma célula, lo que puede conducir al ensamble de homodímeros de cada cadena pesada de anticuerpo, así como también al ensamble de heterodímeros. La promoción del ensamble preferencial de heterodímeros puede lograrse al incorporar diferentes mutaciones en el dominio CH3 de cada región constante de la cadena pesada de anticuerpos como se muestra en los documentos US13/494870, US16/028850, US11/533709, US12/875015, US13/289934, US14/773418, US12/811207, US13/866756, US14/647480, y US14/830336. Por ejemplo, pueden producirse mutaciones en el dominio CH3 en base a IgG1 humana e incorporar pares distintos de sustituciones de aminoácidos dentro de un primer polipéptido y un segundo polipéptido que permiten que estas dos cadenas se heterodimericen selectivamente entre sí. Las posiciones de sustituciones de aminoácidos ilustradas más abajo están numeradas de acuerdo con el índice EU como en Kabat.

En un escenario, una sustitución de aminoácido en el primer polipéptido reemplaza el aminoácido original con un aminoácido más grande, seleccionado de arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y) o triptófano (W), y al menos una sustitución de aminoácido en el segundo polipéptido reemplaza el(los) aminoácido(s) originales con un(os) aminoácido(s) más pequeño(s), elegido(s) de alanina (A), serina (S), treonina (T) o valina (V), de manera que la sustitución del aminoácido más grande (una protuberancia) encaja en la superficie de las sustituciones de aminoácidos más pequeños (una cavidad). Por ejemplo, un polipéptido puede incorporar una sustitución T366W, y el otro puede incorporar tres sustituciones que incluyen T366S, L368A y Y407V.

Un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo de la presente solicitud puede acoplarse opcionalmente a una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a una región constante de anticuerpo, tal como una región constante de IgG que incluye dominios bisagra, CH2 y CH3 con o sin dominio CH1. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de la región constante es al menos 90 % idéntica a una región constante de anticuerpo humano, tal como una región constante de IgG1 humana, una región constante de IgG2, una región constante de IgG3 o una región constante de IgG4. En una modalidad, el dominio Fc de anticuerpo o una porción de este suficiente para unirse a CD16 comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 %(porejemplo, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 %) idéntica a una secuencia de Fc de IgG1 humana de tipo silvestre: DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 118). En algunas otras modalidades, la secuencia de aminoácidos de la región constante es al menos 90 % idéntica a una región constante de anticuerpo de otro mamífero, tal como conejo, perro, gato, ratón o caballo.

En algunas modalidades, el dominio constante de anticuerpo unido al scFv o al fragmento Fab es capaz de unirse a CD16. En algunas modalidades, la proteína incorpora una porción de un dominio Fc de anticuerpo (por ejemplo, una porción de un dominio Fc de anticuerpo suficiente para unirse a CD16), en donde el dominio Fc de anticuerpo comprende una bisagra y un dominio CH2 (por ejemplo, una bisagra y un dominio CH2 de un anticuerpo IgG1 humano), y/o secuencias de aminoácidos al menos 90 % idénticas a la secuencia de aminoácidos 234-332 de un anticuerpo IgG humano.

Se pueden incorporar una o más mutaciones en la región constante en comparación con la región constante de IgG1 humana, por ejemplo, en Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411 y/o K439. Las sustituciones ilustrativas incluyen, por ejemplo, Q347E, Q347R, Y349S, Y349K, Y349T, Y349D, Y349E, Y349C, T350V, L351K, L351D, L351Y, S354C, E356K, E357Q, E357L, E357W, K360E, K360W, Q362E, S364K, S364E, S364H, S364D, T366V, T366I, T366L, T366M, T366K, T366W, T366S, L368E, L368A, L368D, K370S, N390D, N390E, K392L, K392M, K392V, K392F, K392D, K392E, T394F, T394W, D399R, D399K, D399V, S400K, S400R, D401K, F405A, F405T, Y407A, Y407I , Y407V, K409F, K409W, K409D, K409R, T411D, T411E, K439D, y K439E.

En determinadas modalidades, las mutaciones que pueden incorporarse en el CH1 de una región constante de IgG1 humana pueden estar en los aminoácidos V125, F126, P127, T135, T139, A140, F170, P171, y/o V173. En determinadas modalidades, las mutaciones que pueden incorporarse al C<k>de una región constante de IgG1 humana pueden estar en los aminoácidos E123, F116, s 176, V163, s 174 y/o T164.

Alternativamente, las sustituciones de aminoácidos podrían seleccionarse de los siguientes conjuntos de sustituciones que se muestran en la Tabla 4.

Alternativamente, las sustituciones de aminoácidos podrían seleccionarse de los siguientes conjuntos de sustituciones que se muestran en la Tabla 5.

T a b la 5

Alternativamente, las sustituciones de aminoácidos podrían seleccionarse de los siguientes conjuntos de sustituciones que se muestran en la Tabla 6.

Alternativamente, al menos una sustitución de aminoácido en cada cadena polipeptídica podría seleccionarse de la Tabla 7.

Alternativamente, al menos una sustitución de aminoácido podría seleccionarse del siguiente conjunto de sustituciones en la Tabla 8, donde la(s) posición(es) indicada(s) en la columna del primer polipéptido se reemplaza(n) por cualquier aminoácido cargado negativamente conocido, y la(s) posición(es) indicada(s) en la columna del segundo polipéptido se reemplaza(n) por cualquier aminoácido cargado positivamente conocido.

Alternativamente, al menos una sustitución de aminoácido podría seleccionarse del siguiente conjunto de la Tabla 9, donde la(s) posición(es) indicada(s) en la columna del primer polipéptido se reemplaza(n) por cualquier aminoácido cargado positivamente conocido, y la(s) posición(es) indicada(s) en la columna del segundo polipéptido se reemplaza(n) por cualquier aminoácido cargado negativamente conocido.

Alternativamente, las sustituciones de aminoácidos podrían seleccionarse del siguiente conjunto en la Tabla 10.

Alternativamente, o, además, la estabilidad estructural de una proteína heteromultimérica puede aumentarse mediante la introducción de S354C en cualquiera de la primera o segunda cadena polipeptídica, e Y349C en la cadena polipeptídica opuesta, que forma un puente disulfuro artificial dentro de la interfaz de los dos polipéptidos.

En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 en la posición T366, y en donde la secuencia de aminoácidos de la otra cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en T366, L368 e Y407.

En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en T366, L368 y Y407, y en donde la secuencia de aminoácidos de la otra cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 en la posición T366.

En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en E357, K360, Q362, S364, L368, K370, T394, D401, F405, y T411 y en donde la secuencia de aminoácidos de la otra cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en Y349, E357, S364, L368, K370, T394, D401, F405 y T411.

En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en Y349, E357, S364, L368, K370, T394, D401, F405 y T411 y en donde la secuencia de aminoácidos de la otra cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en E357, K360, Q362, S364, L368, K370, T394, D401, F405, y T411.

En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en L351, D399, S400 e Y407 y en donde la secuencia de aminoácidos de la otra cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en T366, N390, K392, K409 y T411.

En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en T366, N390, K392, K409 y T411 y en donde la secuencia de aminoácidos de la otra cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en L351, D399, S400 e Y407.

En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en Q347, Y349, K360, y K409, y en donde la secuencia de aminoácidos de la otra cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en Q347, E357, D399 y F405.

En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en Q347, E357, D399 y F405, y en donde la secuencia de aminoácidos de la otra cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en Y349, K360, Q347 y K409.

En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en K370, K392, K409 y K439, y en donde la secuencia de aminoácidos de la otra cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en D356, E357 y D399.

En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en D356, E357 y D399, y en donde la secuencia de aminoácidos de la otr cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en K370, K392, K409 y K439.

En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en L351, E356, T366 y D399, y en donde la secuencia de aminoácidos de la otra cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en Y349, L351, L368, K392 y K409.

En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en Y349, L351, L368, K392 y K409, y en donde la secuencia de aminoácidos de la otra cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en L351, E356, T366 y D399.

En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 por una sustitución S354C y en donde la secuencia de aminoácidos de la otra cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 por una sustitución Y349C.

En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 por una sustitución Y349C y en donde la secuencia de aminoácidos de la otra cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 por una sustitución S354C.

En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 por las sustituciones K360E y K409W y en donde la secuencia de aminoácidos de la otra cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 por las sustituciones Q347R, D399V y F405T.

En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 por las sustituciones Q347R, D399V y F405T y en donde la secuencia de aminoácidos de la otra cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 por las sustituciones K360E y K409W.

En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 por una sustitución T366W y en donde la secuencia de aminoácidos de la otra cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 por las sustituciones T366S, T368A, e Y407V.

En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 por las sustituciones T366S, T368A, e Y407V y en donde la secuencia de aminoácidos de la otra cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 por una sustitución T366W. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 por las sustituciones T350V, L351Y, F405A, e Y407V y en donde la secuencia de aminoácidos de la otra cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 por las sustituciones T350V, T366L, K392L, y T394W.

En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 por las sustituciones T350V, T366L, K392L, y T394W y en donde la secuencia de aminoácidos de la otra cadena polipeptídica de la región constante de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 por las sustituciones T350V, L351Y, F405A, e Y407V.

Proteínas de unión multiespecífica ilustrativas

Más abajo se enumeran ejemplos de TriNKET que comprenden un sitio de unión a antígeno que se une a EGFR y un sitio de unión a antígeno que se une a NKG2<d>cada uno unido a una región constante de anticuerpo, en donde las regiones constantes de anticuerpo incluyen mutaciones que permiten la heterodimerización de dos cadenas Fc. Los TriNKET se contemplan en el formato F3, es decir, el sitio de unión al antígeno que se une al EGFR es un Fab, y el sitio de unión al antígeno que se une al NKG2D es un scFv. Todos los TriNKET que se muestranmás abajoestán en el formato F3', es decir, el sitio de unión al antígeno que se une al EGFR es un scFv y el sitio de unión al antígeno que se une al NKG2D es un Fab. En cada TriNKET, el scFv puede comprender la sustitución de Cys en las regiones VH y VL, lo que facilita la formación de un puente disulfuro entre el VH y VL del scFv.

El VH y VL del scFv pueden conectarse a través de un enlazador, por ejemplo, un enlazador peptídico. En determinadas modalidades, el enlazador peptídico es un enlazador flexible. Con respecto a la composición de aminoácidos del enlazador, los péptidos se seleccionan con propiedades que confieren flexibilidad, no interfieren con la estructura y la función de los otros dominios de las proteínas de la presente solicitud, y resisten la escisión de las proteasas. Por ejemplo, los residuos de glicina y serina generalmente proporcionan resistencia a la proteasa. En determinadas modalidades, el VL se une N-terminal o C-terminal al VH a través de un enlazador (GlyGlyGlyGlySer)4 ((G4SW (SEQ ID NO: 119).

La longitud del enlazador (por ejemplo, enlazador flexible) puede ser "corta", por ejemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 residuos de aminoácidos, o “larga", por ejemplo, al menos 13 residuos de aminoácidos. En determinadas modalidades, el enlazador tiene una longitud de 10-50, 10-40, 10-30, 10-25, 10-20, 15-50, 15-40, 15-30, 15-25, 15-20, 20-50, 20-40, 20-30, o 20-25 residuos de aminoácidos.

En determinadas modalidades, el enlazador comprende o consiste en una secuencia (GS)n (SEQ ID NO:120), (GGS)n (SEQ ID NO:121), (GGGS)n (SEQ ID NO:122), (GGSG)n (SEQ ID NO:123), (GGSGG)n (SEQ ID NO:124), y (GGGGS)n (SEQ ID NO:125), en donde n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20. En determinadas modalidades, el enlazador comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NO: 119, y 126-134, como se enumera en la Tabla 11.

____________________________

En los F3'-TriNKET, un scFv de unión al EGFR se une al extremo N-terminal de un Fc a través de un enlazador Gly-Ser. El enlazador Ala-Ser o Gly-Ser se incluye en la secuencia de la región bisagra del codo para equilibrar la flexibilidad y la geometría óptima. En determinadas modalidades, una secuencia adicional Thr-Lys-Gly puede añadirse N-terminal o C-terminal a la secuencia Ala-Ser o Gly-Ser en la bisagra.

Como se usa en la presente descripción para describir estos TriNKET ilustrativos, un Fc incluye una bisagra, CH2 y CH3 de anticuerpo. En cada TriNKET ilustrativo, el polipéptido del dominio Fc unido a un scFv comprende las mutaciones de Q347R, D399V y F405T, y el polipéptido del dominio Fc unido a un Fab comprende las mutaciones correspondientes K360E y K409<w>para formar un heterodímero. El polipéptido del dominio Fc unido al scFv incluye además una sustitución S354C en el dominio CH3, que forma un puente disulfuro con una sustitución Y349C en el Fc unido al Fab. Estas sustituciones están en negrita en las secuencias descritas en esta subsección.

Por ejemplo, un TriNKET descrito en la presente descripción es EGFR-TriNKET-2. El EGFR-TriNKET-2 incluye (a) una secuencia de EGFR-scFv-2 (VL-VH) proporcionada en la Tabla 2, en la orientación de VH ubicado C-terminal a VL, unido a un polipéptido de dominio Fc y (b) un fragmento Fab de unión a NKG2D derivado de A49MI que incluye una porción de cadena pesada que comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio CH1, y una porción de cadena ligera que comprende un dominio variable de cadena ligera y un dominio constante de cadena ligera, en donde el dominio CH1 se conecta al polipéptido de dominio Fc. EGFR-TriNKET-2 incluye tres polipéptidos: EGFR-scFv-2 (VL-VH)-Fc (SEQ ID NO:166), A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO: 164), y A49MI-VL-CL (SEQ ID NO: 165).

EGFR-scFv-2 (VL-VH)-Fc (SEQ ID NO:166). Los residuos en negrita indican residuos mutados en el dominio Fc.

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETG

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A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO: 164). Los residuos en negrita indican residuos mutados en el dominio Fc y las secuencias subrayadas indican secuencias de CDR.

EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSC AASGFTFS S Y SMNWVRO APGKGLEWV S SIS S S S S YI

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A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:165). Las secuencias subrayadas indican secuencias de CDR.

DIOMTOSPSSVSASVGDRVTITCRASOGISSWLAWYOOKPGKAPKLLIYAASSLOSG

VP SRF SGS GSGTDFTLTIS SLOPEDF AT YYCOOGV SFPRTF GGGTK VEDC

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT

EQD SKD ST Y SL S S TLTL SK AD YEKHK V Y ACE VTHQGL S SP VTK SFNRGECEGFR-scFv-2 (VL-VH)-Fc (SEQ ID NO: 166) representa la secuencia completa de un scFv de unión al EGFR unido a un polipéptido de dominio Fc a través de una bisagra que comprende Gly-Ser. El polipéptido de dominio Fc unido al scFv incluye las sustituciones Q347R, D399V y F405T para la heterodimerización y una sustitución S354C para formar un enlace disulfuro con una sustitución Y349C en A49MI-VH-CH1-Fc como se describe más abajo. El scFv incluye un dominio variable de cadena pesada del aglutinante de EGFR-2 en la Tabla 2 conectado al extremo C-terminal de un dominio variable de cadena ligera del aglutinante de EGFR-2 en la Tabla 2 a través de un enlazador (G4S)4 (SEQ ID NO: 119), en donde el scFv comprende además la sustitución de Cys en las regiones VH y VL en G44 y S100, respectivamente, lo que facilita de esta manera la formación de un puente disulfuro entre el VH y VL del scFv.

A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:164) representa la porción de cadena pesada del fragmento Fab, que comprende un dominio variable de cadena pesada de A49MI que se une a NKG2D (SEQ ID NO:95) y un dominio CH1, conectado a un dominio Fc. El polipéptido del dominio Fc en A49MI-VH-CH1-Fc incluye una sustitución Y349C en el dominio CH3, que forma un enlace disulfuro con una sustitución S354C en el polipéptido Fc en EGFR-scFv-2 (VL-VH)-Fc. En A49MI-VH-CH1-Fc, el dominio Fc también incluye las sustituciones K360E y K409W para la heterodimerización con el Fc en EGFR-scFv-2 (VL-VH)-Fc.

A49MI-VL-CL (SEQ ID NO: 165) representa la porción de cadena ligera del fragmento Fab que comprende un dominio variable de la cadena ligera de A49MI de unión a NKG2D (SEQ ID NO:85) y un dominio constante de cadena ligera.

En otro ejemplo, un TriNKET descrito en la presente descripción es EGFR-TriNKET-3. El EGFR-TriNKET-3 incluye (a) una secuencia de EGFR-scFv-3 (VL-VH) proporcionada en la Tabla 2, en la orientación de VH ubicado C-terminal a VL, unido a un polipéptido de dominio Fc y (b) un fragmento Fab de unión a NKG2D derivado de A49MI que incluye una porción de cadena pesada que comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio CH1, y una porción de cadena ligera que comprende un dominio variable de cadena ligera y un dominio constante de cadena ligera, en donde el dominio CH1 se conecta al polipéptido de dominio Fc. EGFR-TriNKET-3 incluye tres polipéptidos: EGFR-scFv-3 (VL-VH)-Fc (SEQ ID NO:167), A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO: 164), y A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:165).

EGFR-scFv-3 (VL-VH)-Fc (SEQ ID NO:167). Los residuos en negrita indican residuos mutados en el dominio Fc.DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETG VPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQHFRHLPLAFGCGTKVEIK GGGGS GGGGS GGGGS GGGGS QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKCLEWIGHIYYSG n t n y n p Rl k s r l t is id t s k t q f s l k l s s v t a a d t a iy y c v r d r v t g a f d iw g q g t m YTYSS GS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSFiEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQ YNST YRV V S VLT VLHQD WLN GKEYKCK V SNKALP APIE KTISK AKGQPREPRV YTLPP CRDELTKN Q VSLT CL VKGF YP SDIA VEWE SN GQPENN YKTTPPVL V SDGSFTLY SKLT VDKSRW QQGNVFSC S VMHEALHNHYTQKSLSLSPGEGFR-scFv-3 (VL-VH)-Fc (SEQ ID NO:167) representa la secuencia completa de un scFv de unión a EGFR unido a un dominio Fc a través de una bisagra que comprende Gly-Ser. El polipéptido de dominio Fc unido al scFv incluye las sustituciones Q347R, D399V y F405T para la heterodimerización y una sustitución S354C para formar un enlace disulfuro con una sustitución Y349C en A49MI-VH-CH1-Fc como se describe más abajo. El scFv incluye un dominio variable de cadena pesada del aglutinante de EGFR-3 en la Tabla 2 conectado al extremo C-terminal de un dominio variable de cadena ligera del clon del aglutinante de EGFR-3 en la Tabla 2 a través de un enlazador (G4S)4 (SEQ ID NO: 119), en donde el scFv comprende además la sustitución de Cys en las regiones VH y VL en G44 y S100, respectivamente, lo que facilita de esta manera la formación de un puente disulfuro entre el VH y VL del scFv.

En otro ejemplo, un TriNKET descrito en la presente descripción es EGFR-TriNKET-4. El EGFR-TriNKET-4 incluye (a) una secuencia de EGFR-scFv-4 (VL-VH) proporcionada en la Tabla 2, en la orientación de VH ubicado C-terminal a VL, unido a un polipéptido de dominio Fc y (b) un fragmento Fab de unión a NKG2D derivado de A49MI que incluye una porción de cadena pesada que comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio CH1, y una porción de cadena ligera que comprende un dominio variable de cadena ligera y un dominio constante de cadena ligera, en donde el dominio CH1 se conecta al polipéptido de dominio Fc. EGFR-TriNKET-4 incluye tres polipéptidos: EGFR-scFv-4 (VL-VH)-Fc (SEQ ID NO:168), A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO: 164), y A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:165).

EGFR-scFv-4 (VL-VH)-Fc (SEQ ID NO:168). Los residuos en negrita indican residuos mutados en el dominio Fc.

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETG VPSRF SGSGSGTDFTFTIS SLQPEDIATYY CQHFRHLPLAF GCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKCLEWIGHIYYSG NTNYNPSLKSRLTISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMV TVSS GS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQ YNST YRV V S VLT VLHQD WLN GKEYKCK V SNKALP APIE KTISK AKGQPREPRV YTLPP CRDELTKN Q VSLT CL VKGF YP SDIA VEWE SN GQPENN YKTTPPVL V SDGSFTLY SKLTVDKSRW QQGNVFSC S VMHEALHNHYTQKSLSLSPGEGFR-scFv-4 (VL-VH)-Fc (SEQ ID NO:168) representa la secuencia completa de un scFv de unión al EGFR unido a un polipéptido de dominio Fc a través de una bisagra que comprende Gly-Ser. El polipéptido de dominio Fc unido al scFv incluye las sustituciones Q347R, D399V y F405T para la heterodimerización y una sustitución S354C para formar un enlace disulfuro con una sustitución Y349C en A49MI-VH-CH1-Fc como se describe más abajo. El scFv incluye un dominio variable de cadena pesada del clon de aglutinante de EGFR-4 en la Tabla 2 conectado al C-terminal de un dominio variable de cadena ligera del clon de aglutinante de EGFR-4 en la Tabla 2 a través de un enlazador (G4S)4 (SEQ ID NO: 119), en donde el scFv comprende además la sustitución de Cys en las regiones VH y VL en G44 y S100, respectivamente, lo que facilita de esta manera la formación de un puente disulfuro entre el VH y VL del scFv.

En determinadas modalidades, un TriNKET descrito en la presente descripción es idéntico a uno de los TriNKET ilustrativos descritos anteriormente que incluye las mutaciones de Fc EW-RVT, excepto que el polipéptido del dominio Fc unido al fragmento Fab de unión a NKG2D comprende las sustituciones de Q347R, D399V, y F405T, y el polipéptido del dominio Fc unido al scFv de unión a EGFR comprende las sustituciones correspondientes K360E y K409W para formar un heterodímero. En determinadas modalidades, un TriNKET descrito en la presente descripción es idéntico a uno de los TriNKET ilustrativos descritos anteriormente que incluye las mutaciones de Fc KiH, excepto que el polipéptido del dominio Fc unido al fragmento Fab de unión a NKG2D comprende las sustituciones de "ojal" de T366S, L368A, e Y407V, y el polipéptido del dominio Fc unido al scFv de unión a EGFR comprende la sustitución de "botón" de T366W para formar un heterodímero.

Un experto en la técnica apreciaría que durante la producción y/o almacenamiento de las proteínas, el glutamato (E) o la glutamina (Q) en el extremo N terminal pueden ciclarse para formar una lactama (por ejemplo, espontáneamente o catalizado por una enzima presente durante la producción y/o almacenamiento). En consecuencia, en algunas modalidades cuando el residuo en extremo N de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido es E o Q, también se contempla en la presente descripción una secuencia de aminoácidos correspondiente con el E o la Q reemplazada con piroglutamato.

Un experto en la técnica también apreciaría que durante la producción y/o el almacenamiento de proteínas, la lisina (K) en el extremo C terminal de una proteína puede eliminarse (por ejemplo, espontáneamente o catalizada por una enzima presente durante la producción y/o el almacenamiento). Dicha eliminación de K se observa a menudo con proteínas que comprenden un dominio Fc en su extremo C-terminal. En consecuencia, en algunas modalidades, cuando el residuo C-terminal de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido (por ejemplo, una secuencia de dominio Fc) es K, también se contempla en la presente descripción una secuencia de aminoácidos correspondiente con la K eliminada.

Las proteínas de unión multiespecífica descritas anteriormente pueden fabricarse mediante el uso de tecnología de ADN recombinante bien conocida por un experto en la técnica. Por ejemplo, una primera secuencia de ácido nucleico que codifica la primera cadena pesada de inmunoglobulina puede clonarse en un primer vector de expresión; una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica la segunda cadena pesada de inmunoglobulina puede clonarse en un segundo vector de expresión; una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena ligera de inmunoglobulina puede clonarse en un tercer vector de expresión; y los vectores de expresión primero, segundo y tercero pueden transfectarse de manera estable juntos en células huésped para producir las proteínas multiméricas.

Para lograr el mayor rendimiento de la proteína de unión multiespecífica, pueden explorarse diferentes relaciones del primer, segundo y tercer vector de expresión para determinar la relación óptima para la transfección en las células huésped. Después de la transfección, los clones únicos pueden aislarse para la generación de bancos celulares mediante el uso de métodos conocidos en la técnica, tales como dilución limitada, ELISA, FACS, microscopía o Clonepix.

Los clones pueden cultivarse en condiciones adecuadas para el escalado del biorreactor y la expresión mantenida de la proteína de unión multiespecífica. Las proteínas de unión multiespecífica pueden aislarse y purificarse mediante el uso de métodos conocidos en la técnica que incluyen centrifugación, filtración en profundidad, lisis celular, homogeneización, congelación-descongelación, purificación por afinidad, filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de intercambio por interacciones hidrófobas y cromatografía de modo mixto.

II. Características de las proteínas de unión multiespecífica

Las proteínas de unión multiespecífica descritas en la presente descripción incluyen un sitio de unión a NKG2D, un sitio de unión a un antígeno asociado a un tumor, que se une a EGFR, y un dominio Fc de anticuerpo o una porción de este suficiente para unirse a CD16, o un sitio de unión a un antígeno que se une a<c>D16. En algunas modalidades, las proteínas de unión multiespecífica contienen un sitio de unión al antígeno adicional que se une al mismo antígeno asociado al tumor (EGFR), como se ejemplifica en el formato F4-TriNKET (por ejemplo, Figuras 2C y 2D).

En algunas modalidades, las proteínas de unión multiespecífica muestran una estabilidad térmica similar a la del anticuerpo monoclonal correspondiente, es decir,un anticuerpo monoclonal que contiene el mismo sitio de unión al antígeno del EGFR que el incorporado en las proteínas de unión multiespecífica.

En algunas modalidades, las proteínas de unión multiespecífica se unen simultáneamente a células que expresan NKG2D y/o CD16, tales como células NK, y células que expresan EGFR, tales como determinadas células tumorales. La unión de las proteínas de unión multiespecífica a las células NK puede potenciar la actividad de las células NK hacia la destrucción de las células tumorales que expresan EGFR. Se ha informado que las células NK exhiben una citotoxicidad más potente contra las células diana que se estresan(verChan y otros, (2014) Cell Death Differ. 21(1 ):5-14). Sin desear estar limitados por la teoría, se plantea la hipótesis de que cuando las células NK se acoplan a una población de células por un TriNKET, las células NK pueden eliminar selectivamente las células diana que están estresadas (por ejemplo, células malignas y células en un microentorno tumoral). Este mecanismo podría contribuir a una mayor especificidad y a una toxicidad reducida de los TriNKET, lo que hace posible eliminar selectivamente las células estresadas incluso si la expresión del EGFR no se limita a las células diana deseadas. En algunas modalidades, las proteínas de unión multiespecífica se unen al EGFR con una afinidad similar al anticuerpo monoclonal anti-EGFR correspondiente (es decir,un anticuerpo monoclonal que contiene el mismo sitio de unión al EGFR que el incorporado en la proteína de unión multiespecífica). En algunas modalidades, las proteínas de unión multiespecífica son más efectivas para mediar la eliminación de las células tumorales que expresan el EGFR por las células efectoras inmunitarias(porejemplo, células NK o linfocitos T CD8+) que los anticuerpos monoclonales correspondientes.

En determinadas modalidades, las proteínas de unión multiespecífica descritas en la presente descripción, que incluyen un sitio de unión para EGFR, activan las células NK humanas primarias cuando se cocultivan con células que expresan el EGFR. La activación de células NK se caracteriza por el aumento de la degranulación de CD107a y la producción de citocinas IFN-<y>. Además, en comparación con un anticuerpo monoclonal anti-EGFR correspondiente, las proteínas de unión multiespecífica muestran una activación superior de las células NK humanas en presencia de células que expresan EGFR.

En algunas modalidades, las proteínas de unión multiespecífica descritas en la presente descripción, que incluyen un sitio de unión al EGFR, mejoran la actividad de las células NK humanas en reposo y/o activadas por IL-2 cuando se cocultivan con células que expresan EGFR.

En algunas modalidades, en comparación con el anticuerpo monoclonal correspondiente que se une al EGFR, las proteínas de unión multiespecífica ofrecen la ventaja de dirigirse a células tumorales que expresan niveles medios y bajos de EGFR.

En algunas modalidades, una proteína de unión multiespecífica descrita en la presente descripción que tiene monovalencia al EGFR, por ejemplo, una en formato F3 o F3', tiene una reducción o retardo de la toxicidad relacionada con la piel en comparación con un AcM anti-EGFR correspondiente que es bivalente.

En algunas modalidades, el formato F4 bivalente de los TriNKET (es decir, los TriNKET incluyen un sitio de unión al antígeno adicional que se une al EGFR) mejora la avidez con la que los TriNKET se unen al EGFR, lo que en efecto estabiliza la expresión y el mantenimiento de altos niveles de TriNKET en la superficie de las células tumorales. En algunas modalidades, los F4-TriNKETs median una eliminación más potente de las células tumorales que los F3-TriNKETs o F3'-TriNKET correspondientes.

III. Aplicaciones terapéuticas

La presente solicitud proporciona métodos para tratar un cáncer mediante el uso de una proteína de unión multiespecífica descrita en la presente descripción y/o una composición farmacéutica descrita en la presente descripción. Los métodos pueden usarse para tratar una variedad de neoplasias malignas que expresan EGFR.

El método terapéutico puede caracterizarse de acuerdo con el cáncer a tratar. El cáncer a tratar puede caracterizarse de acuerdo con la presencia de un antígeno particular expresado en la superficie de la célula cancerosa.

Los tipos de cáncer caracterizados por la expresión del EGFR incluyen, sin limitación, cánceres de tumores sólidos. Por ejemplo, en determinadas modalidades, el cáncer es cáncer de cabeza y cuello, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón de células no pequeñas, glioma, carcinoma de células renales, cáncer de vejiga, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de páncreas o cáncer de hígado. En determinadas modalidades, el cáncer es cáncer de pulmón (que incluye, pero no se limita a, carcinoma de pulmón de células pequeñas o adenocarcinoma de pulmón), cáncer de mama, carcinoma ductal invasivo de mama, cáncer de riñón, glioblastoma multiforme convencional, cáncer de colon, adenocarcinoma de colon, cáncer gástrico, cáncer de cerebro, glioblastoma, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario o cáncer de próstata.

Se contempla que la proteína, conjugado, células y/o las composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción pueden usarse para tratar una variedad de cánceres, sin limitarse a cánceres en los que las células cancerosas o las células en el microentorno del cáncer expresan EGFR.

En determinadas modalidades, el cáncer es un tumor sólido. En determinadas otras modalidades, el cáncer es cáncer de cerebro, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, leucemia, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, melanoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer renal, cáncer de estómago, cáncer testicular o cáncer de útero. En aún otras modalidades, el cáncer es un tumor vascularizado, carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, carcinoma de células pequeñas, melanoma, glioma, neuroblastoma, sarcoma (por ejemplo, un angiosarcoma o condrosarcoma), cáncer de laringe, cáncer de parótida, cáncer de vías biliares, cáncer de tiroides, melanoma lentiginoso acral, queratosis actínica, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma adenoide quístico, adenomas, adenosarcoma, carcinoma adenoescamoso, cáncer de canal anal, cáncer anal, cáncer de ano y recto, tumor astrocítico, carcinoma de la glándula de Bartolino, carcinoma de células basales, cáncer biliar, cáncer de hueso, cáncer de médula ósea, cáncer de bronquios, carcinoma de glándula bronquial, carcinoide, colangiocarcinoma, condrosarcoma, papiloma/carcinoma del plexo coroideo, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, carcinoma de células claras, cáncer de tejido conectivo, cistadenoma, cáncer del sistema digestivo, cáncer de duodeno, cáncer del sistema endocrino, tumor de seno endodérmico, hiperplasia endometrial, sarcoma estromal endometrial, adenocarcinoma endometrioide, cáncer de células endoteliales, cáncer ependimario, cáncer de células epiteliales, sarcoma de Ewing, cáncer de ojo y órbita, cáncer genital femenino, hiperplasia nodular focal, cáncer de vesícula biliar, cáncer de antro gástrico, cáncer de fondo gástrico, gastrinoma, glioblastoma, glucagonoma, cáncer de corazón, hemangioblastomas, hemangioendotelioma, hemangiomas, adenoma hepático, adenomatosis hepática, cáncer hepatobiliar, carcinoma hepatocelular, enfermedad de Hodgkin, cáncer de íleo, insulinoma, neoplasia intraepitelial, neoplasia de células escamosas interepiteliales, cáncer de conducto biliar intrahepático, carcinoma de células escamosas invasivo, cáncer de yeyuno, cáncer de articulaciones, sarcoma de Kaposi, cáncer pélvico, carcinoma de células grandes, cáncer de intestino grueso, leiomiosarcoma, melanoma lentigo maligno, linfoma, cáncer genital masculino, melanoma maligno, tumores mesoteliales malignos, meduloblastoma, meduloepitelioma, cáncer de meninges, cáncer mesotelial, carcinoma metastásico, cáncer bucal, carcinoma mucoepidermoide, mieloma múltiple, cáncer de músculo, cáncer de tracto nasal, cáncer del sistema nervioso, adenocarcinoma neuroepitelial, melanoma nodular, cáncer de piel no epitelial, linfoma no Hodgkin, carcinoma de células pequeñas, cáncer oligodendroglial, cáncer de cavidad oral, osteosarcoma, adenocarcinoma seroso papilar, cáncer de pene, cáncer faríngeo, tumores de glándula pituitaria, plasmacitoma, pseudosarcoma, blastoma pulmonar, cáncer rectal, carcinoma de células renales, cáncer de sistema respiratorio, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma, carcinoma seroso, cáncer de senos, cáncer de piel, carcinoma de células pequeñas, cáncer de intestino delgado, cáncer de músculo liso, cáncer de tejidos blandos, tumor secretor de somatostatina, cáncer de columna, carcinoma de células escamosas, cáncer de músculo estriado, cáncer submesotelial, melanoma de propagación superficial, leucemia de linfocitos T, cáncer de lengua, carcinoma indiferenciado, cáncer de uréter, cáncer de uretra, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de sistema urinario, cáncer cérvico uterino, cáncer de cuerpo uterino, melanoma uveal, cáncer vaginal, carcinoma verrugoso, vipoma, cáncer de vulva, carcinoma bien diferenciado, o tumor de Wilms.

En determinadas otras modalidades, el cáncer es un linfoma no Hodgkin, tal como un linfoma de linfocitos B o un linfoma de linfocitos T. En determinadas modalidades, el linfoma no hodgkiniano es un linfoma de células B, tal como un linfoma de células B grandes difusas, linfoma de células B mediastínicas primarias, linfoma folicular, linfoma linfocítico pequeño, linfoma de células del manto, linfoma de células B de la zona marginal, linfoma extraganglionar de células B de la zona marginal, linfoma ganglionar de células B de la zona marginal, linfoma esplénico de células B de la zona marginal, linfoma de Burkitt, linfoma linfoplasmacítico, leucemia de células pilosas o linfoma primario del sistema nervioso central (SNC). En otras modalidades, el linfoma no hodgkiniano es un linfoma de linfocitos T, tal como un linfoma linfoblástico T precursor, linfoma de linfocitos T periféricas, linfoma cutáneo de linfocitos T, linfoma angioinmunoblástico de linfocitos T, linfoma extraganglionar de linfocitos T/asesinas naturales, linfoma de linfocitos T tipo enteropatía, linfoma subcutáneo de linfocitos T similares a panniculitis, linfoma anaplásico de células grandes o linfoma periférico de linfocitos T.

El cáncer a tratar puede caracterizarse de acuerdo con la presencia de un antígeno particular expresado en la superficie de la célula cancerosa. En determinadas modalidades, la célula cancerosa puede expresar uno o más de los siguientes además de EGFR: CD2, CD19, CD38, CD40, CD52, CD30, CD70, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, TROP2, cMET, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGE-A3, B7.1, B7.2, CTLA4, y PD1.

IV Terapia combinada

Otro aspecto de la presente solicitud proporciona una terapia combinada. Una proteína de unión multiespecífica descrita en la presente descripción puede usarse en combinación con agentes terapéuticos adicionales para tratar un cáncer.

Los agentes terapéuticos ilustrativos que pueden usarse como parte de una terapia combinada en el tratamiento del cáncer, incluyen, por ejemplo, radiación, mitomicina, tretinoína, ribomustina, gemcitabina, vincristina, etopósido, cladribina, mitobronitol, metotrexato, doxorrubicina, carbocuona, pentostatina, nitracrina, zinostatina, cetrorelix, letrozol, raltitrexed, daunorrubicina, fadrozol, fotemustina, timalfasina, sobuzoxano, nedaplatino, citarabina, bicalutamida, vinorelbina, vesnarinona, aminoglutetimida, amsacrina, proglumida, acetato de eliptinio, ketanserina, doxifluridina, etretinato, isotretinoína, estreptozocina, nimustina, vindesina, flutamida, drogenilo, butocina, carmofur, razoxano, sizofilán, carboplatino, mitolactol, tegafur, ifosfamida, prednimustina, picibanil, levamisol, tenipósido, improsulfán, enocitabina, lisurida, oximetolona, tamoxifeno, progesterona, mepitiostano, epitiostanol, formestano, interferón alfa, interferón-2 alfa, interferón beta, interferón gamma (IFN-<y>), factor-1 estimulante de colonias, factor-2 estimulante de colonias, denileucina diftitox, interleucina-2, factor liberador de hormona luteinizante y variaciones de los agentes mencionados anteriormente que pueden exhibir unión diferencial a su receptor cognado, o aumento o disminución de la semivida sérica.

Una clase adicional de agentes que pueden usarse como parte de una terapia combinada en el tratamiento del cáncer son los inhibidores de puntos de regulación inmunitarios. Los inhibidores de puntos de control inmunitario ilustrativos incluyen agentes que inhiben uno o más de (i) antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA4), (ii) proteína de muerte celular programada 1 (PD1), (iii) P<d>L1, (iv) LAG3, (v) B7-H3, (vi) B7-H4, y (vii) TIM3. El inhibidor de CTLA4 ha sido aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos para el tratamiento del melanoma.

Aún otros agentes que pueden usarse como parte de una terapia combinada para tratar el cáncer son agentes tipo anticuerpos monoclonales que se dirigen a dianas que no son puntos de regulación (por ejemplo, herceptin) y agentes no citotóxicos (por ejemplo, inhibidores de tirosina cinasa).

Aún otras categorías de agentes antineoplásicos incluyen, por ejemplo: (i) un inhibidor seleccionado de un inhibidor de ALK, un inhibidor de ATR, un antagonista de A2A, un inhibidor de la reparación por escisión de bases, un inhibidor de tirosina cinasa Bcr-Abl, un inhibidor de tirosina cinasa de Bruton, un inhibidor de CDC7, un inhibidor de CHK1, un inhibidor de cinasa dependiente de ciclina, un inhibidor de DNA-PK, un inhibidor de DNA-PK y mTOR, un inhibidor de DNMT1, un inhibidor de DNMT1 más 2-cloro-desoxiadenosina, un inhibidor de HDAC, un inhibidor de la vía de señalización de Hedgehog, un inhibidor de IDO, un inhibidor de JAK, un inhibidor de mTOR, un inhibidor de MEK, un inhibidor de MELK, un inhibidor de MTH1, un inhibidor de PARP, un inhibidor de fosfatidilinositol 3-cinasa, un inhibidor de PARP1 y DHODH, un inhibidor de proteasoma, un inhibidor de topoisomerasa II, un inhibidor de tirosina cinasa, un inhibidor de VEGFR y un inhibidor de WEE1; (ii) un agonista de OX40, CD137, CD40, GITR, CD27, HVEM, TNFRSF25 o ICOS; y (iii) una citocina seleccionada de IL-12, IL-15, GM-CSF y G-CSF.

Las proteínas de la presente solicitud también pueden usarse como complemento a la eliminación quirúrgica de la lesión primaria.

La cantidad de proteína de unión multiespecífica y agente terapéutico adicional y el momento relativo de administración pueden seleccionarse para lograr un efecto terapéutico combinado deseado. Por ejemplo, cuando se administra una terapia combinada a un paciente que necesita tal administración, los agentes terapéuticos en la combinación, o una composición o composiciones farmacéuticas que comprenden los agentes terapéuticos, pueden administrarse en cualquier orden tal como, por ejemplo, secuencialmente, simultáneamente, juntos, simultáneamente y similares. Además, por ejemplo, una proteína de unión multiespecífica puede administrarse durante un tiempo en el que el(los) agente(s) terapéutico(s) adicional(es) ejercen su efecto profiláctico o terapéutico, oviceversa.

IV. Composiciones farmacéuticas

La presente descripción también presenta composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína descrita en la presente descripción. La composición puede formularse para usar en una variedad de sistemas de suministro de fármacos. Uno o más excipientes o portadores fisiológicamente aceptables también pueden incluirse en la composición para una formulación adecuada. Las formulaciones adecuadas para usar en las composiciones descritas en la presente descripción se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Filadelfia, Pa., 17a ed., 1985. Para una breve revisión de los métodos de suministro de fármacos, Ver, por ejemplo, Langer (Science 249:1527-1533, 1990).

En determinadas modalidades, la composición puede ser una formulación de suministro de fármacos. La formulación de suministro de fármaco intravenoso descrita en la presente descripción puede estar contenida en una bolsa, una pluma o una jeringa. En determinadas modalidades, la bolsa puede conectarse a un canal que comprende un tubo y/o una aguja. En determinadas modalidades, la formulación puede ser una formulación liofilizada o una formulación líquida. En determinadas modalidades, la formulación puede someterse a secado con congelación (liofilizarse) y estar contenida en aproximadamente 12-60 viales. En determinadas modalidades, la formulación puede secarse por congelación y 45 mg de la formulación secada por congelación pueden estar contenidos en un vial. En determinadas modalidades, los aproximadamente 40 mg a aproximadamente 100 mg de la formulación liofilizada pueden estar contenidos en un vial. En determinadas modalidades, la formulación liofilizada de 12, 27 o 45 viales se combinan para obtener una dosis terapéutica de la proteína en la formulación intravenosa del fármaco. En determinadas modalidades, la formulación puede ser una formulación líquida y almacenarse como aproximadamente 250 mg/vial a aproximadamente 1000 mg/vial. En determinadas modalidades, la formulación puede ser una formulación líquida y almacenarse como aproximadamente 600 mg/vial. En determinadas modalidades, la formulación puede ser una formulación líquida y almacenarse como aproximadamente 250 mg/vial.

Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales, o pueden filtrarse de manera estéril. Las soluciones acuosas resultantes pueden empaquetarse para usar tal cual, o liofilizarse, la preparación liofilizada se combina con un portador acuoso estéril antes de la administración. El pH de las preparaciones típicamente estará entre 3 y 11, por ejemplo, entre 5 y 9 o entre 6 y 8, y en determinadas modalidades entre 7 y 8, tal como 7 a 7,5. Las composiciones resultantes en forma sólida pueden empaquetarse en múltiples unidades de dosis única, cada una que contiene una cantidad fija del agente o los agentes mencionados anteriormente. La composición en forma sólida también puede empaquetarse en un contenedor para una cantidad flexible.

En determinadas modalidades, la presente descripción proporciona una formulación con una vida útil prolongada que incluye la proteína de la presente descripción, en combinación con manitol, monohidrato de ácido cítrico, citrato de sodio, fosfato disódico dihidratado, dihidrogenofosfato de sodio dihidratado, cloruro de sodio, polisorbato 80, agua e hidróxido de sodio.

En determinadas modalidades, se prepara una formulación acuosa que incluye la proteína descrita en la presente descripción en una solución tamponada a pH. El amortiguador de la presente solicitud puede tener un pH que varía de aproximadamente 4 a aproximadamente 8, por ejemplo, de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 6,0, o de aproximadamente 4,8 a aproximadamente 5,5, o puede tener un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 5,2. Los intervalos intermedios a los pH mencionados anteriormente también forman parte de esta descripción. Por ejemplo, se pretenden incluir intervalos de valores mediante el uso de una combinación de cualquiera de los valores mencionados anteriormente como límite superior y/o inferior. Los ejemplos de tampones que controlarán el pH dentro de este intervalo incluyen acetato (por ejemplo, acetato de sodio), succinato (tal como succinato de sodio), gluconato, histidina, citrato y otros tampones de ácidos orgánicos.

En determinadas modalidades, la formulación incluye un sistema tampón que contiene citrato y fosfato para mantener el pH en un intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 8. En determinadas modalidades, el intervalo de pH puede ser de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 6,0, o de aproximadamente pH 4,8 a aproximadamente 5,5, o en un intervalo de pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 5,2. En determinadas modalidades, el sistema tampón incluye ácido cítrico monohidratado, citrato de sodio, fosfato de disodio dihidratado y/o dihidrógeno fosfato de sodio dihidratado. En determinadas modalidades, el sistema tampón incluye aproximadamente 1,3 mg/ml de ácido cítrico (por ejemplo, 1,305 mg/ml), aproximadamente 0,3 mg/ml de citrato de sodio (por ejemplo, 0,305 mg/ml), aproximadamente 1,5 mg/ml de fosfato disódico dihidratado (por ejemplo 1,53 mg/ml), aproximadamente 0,9 mg/ml de dihidrógeno fosfato de sodio dihidratado (por ejemplo, 0,86 mg/ml), y aproximadamente 6,2 mg/ml de cloruro de sodio (por ejemplo, 6,165 mg/ml). En determinadas modalidades, el sistema tampón incluye aproximadamente 1 a aproximadamente 1,5 mg/ml de ácido cítrico, aproximadamente 0,25 a aproximadamente 0,5 mg/ml de citrato de sodio, de aproximadamente 1,25 a aproximadamente 1,75 mg/ml de fosfato disódico dihidrato, aproximadamente 0,7 a aproximadamente 1,1 mg/ml de dihidrógeno fosfato sódico dihidrato y aproximadamente 6,0 a aproximadamente 6,4 mg/ml de cloruro de sodio. En determinadas modalidades, el pH de la formulación se ajusta con hidróxido de sodio.

En la formulación también puede incluirse un poliol, que actúa como un tonificador y puede estabilizar el anticuerpo. El poliol se añade a la formulación en una cantidad que puede variar con respecto a la isotonicidad deseada de la formulación. En determinadas modalidades, la formulación acuosa puede ser isotónica. La cantidad de poliol añadida también puede alterarse con respecto al peso molecular del poliol. Por ejemplo, puede añadirse una cantidad menor de un monosacárido (por ejemplo, manitol), en comparación con un disacárido (tal como trehalosa). En determinadas modalidades, el poliol que puede usarse en la formulación como un agente de tonicidad es manitol.

En determinadas modalidades, la concentración de manitol puede ser de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 mg/ml. En determinadas modalidades, la concentración de manitol puede ser de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 15 mg/ml. En determinadas modalidades, la concentración de manitol puede ser de aproximadamente 10 a aproximadamente 14 mg/ml. En determinadas modalidades, la concentración de manitol puede ser aproximadamente 12 mg/ml. En determinadas modalidades, el poliol sorbitol puede incluirse en la formulación.

También puede añadirse un detergente o surfactante a la formulación. Los detergentes ilustrativos incluyen detergentes no iónicos tales como polisorbatos (por ejemplo, polisorbatos 20, 80 etc.) o poloxámeros (por ejemplo, poloxámero 188). La cantidad de detergente añadida es de manera que reduce la agregación del anticuerpo formulado y/o minimiza la formación de partículas en la formulación y/o reduce la adsorción. En determinadas modalidades, la formulación puede incluir un surfactante que es un polisorbato. En determinadas modalidades, la formulación puede contener el detergente polisorbato 80 o Tween 80. Tween 80 es un término usado para describir el monooleato de polioxietileno (20) sorbitán(véaseFiedler, Lexikon der Hifsstoffe, Editio Cantor Verlag Aulendorf, 4ta ed., 1996). En determinadas modalidades, la formulación puede contener entre aproximadamente 0,1 mg/ml y aproximadamente 10 mg/ml de polisorbato 80, o entre aproximadamente 0,5 mg/ml y aproximadamente 5 mg/ml. En determinadas modalidades, puede añadirse aproximadamente 0,1 % de polisorbato 80 en la formulación.

En modalidades, el producto proteico descrito en la presente descripción se formula como una formulación líquida. La formulación líquida puede presentarse a una concentración de 10 mg/ml en un vial USP / Ph Eur tipo I 50R cerrado con un tapón de goma y sellado con un cierre de sello de reborde de aluminio. El tapón puede estar hecho de elastómero que cumpla con la USP y la Ph. Eur. En determinadas modalidades, los viales pueden llenarse con 61,2 ml de la solución del producto proteico para permitir un volumen extraíble de 60 ml. En determinadas modalidades, la formulación líquida puede diluirse con solución salina al 0,9 %.

En determinadas modalidades, la formulación líquida descrita en la presente descripción puede prepararse como una solución de 10 mg/ml de concentración en combinación con un azúcar a niveles estabilizantes. En determinadas modalidades, la formulación líquida puede prepararse en un portador acuoso. En determinadas modalidades, puede añadirse un estabilizador en una cantidad no mayor que la que puede dar como resultado una viscosidad indeseable o no adecuada para la administración intravenosa. En determinadas modalidades, el azúcar puede ser disacáridos, por ejemplo, sacarosa. En determinadas modalidades, la formulación líquida también puede incluir uno o más de un agente tampón, un surfactante y un conservante.

En determinadas modalidades, el pH de la formulación líquida puede establecerse mediante la adición de un ácido y/o base farmacéuticamente aceptable. En determinadas modalidades, el ácido farmacéuticamente aceptable puede ser ácido clorhídrico. En determinadas modalidades, la base puede ser hidróxido de sodio.

Además de la agregación, la desamidación es una variante de producto común de péptidos y proteínas que puede ocurrir durante la fermentación, la cosecha/clarificación celular, la purificación, el almacenamiento de la sustancia farmacéutica/medicamento y durante el análisis de la muestra. La desamidación es la pérdida de NH3 de una proteína que forma un intermediario de succinimida que puede sufrir hidrólisis. La succinimida intermedia da como resultado una disminución de la masa de 17 dalton del péptido original. La hidrólisis posterior da como resultado un incremento de la masa de 18 dalton. El aislamiento del intermediario de succinimida es difícil debido a la inestabilidad en condiciones acuosas. Como tal, la desamidación es típicamente detectable como 1 incremento de la masa en dalton. La desamidación de una asparagina da como resultado ácido aspártico o isoaspártico. Los parámetros que afectan la tasa de desamidación incluyen pH, temperatura, constante dieléctrica del solvente, fuerza iónica, secuencia primaria, conformación del polipéptido local y estructura terciaria. Los residuos de aminoácidos adyacentes a Asn en la cadena peptídica afectan las tasas de desamidación. Gly y Ser después de una Asn en secuencias de proteínas da como resultado una mayor susceptibilidad a la desamidación.

En determinadas modalidades, la formulación líquida descrita en la presente descripción puede conservarse en condiciones de pH y humedad para evitar la desaminación del producto proteico.

El portador acuoso de interés en la presente descripción es uno que es farmacéuticamente aceptable (seguro y no tóxico para la administración a un ser humano) y es útil para la preparación de una formulación líquida. Los portadores ilustrativos incluyen agua estéril para inyección (SWFI), agua bacteriostática para inyección (BWFI), una solución tamponada para pH (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato), solución salina estéril, solución de Ringer o solución de dextrosa.

Un conservante puede añadirse opcionalmente a las formulaciones en la presente descripción para reducir la acción bacteriana. La adición de un conservante puede, por ejemplo, facilitar la producción de una formulación de múltiples usos (dosis múltiples).

El suministro intravenoso (IV) puede ser una vía de administración en casos particulares, tal como cuando un paciente está en el hospital después de un trasplante y recibe todos los fármacos por vía IV. En determinadas modalidades, la formulación líquida se diluye con solución de cloruro de sodio al 0,9 % antes de la administración.

En determinadas modalidades, el producto farmacéutico diluido para inyección es isotónico y adecuado para la administración mediante infusión intravenosa.

En determinadas modalidades, se puede añadir una sal o componentes de tampón en una cantidad de 10 mM - 200 mM. Las sales y/o tampones son farmacéuticamente aceptables y derivan de varios ácidos conocidos (inorgánicos y orgánicos) con metales o aminas “formadores de bases”. En determinadas modalidades, el tampón puede ser tampón fosfato. En determinadas modalidades, el tampón puede ser tampón de glicinato, carbonato, citrato, en cuyo caso, los iones de sodio, potasio o amonio pueden servir como contraión.

Un conservante puede añadirse opcionalmente a las formulaciones en la presente descripción para reducir la acción bacteriana. La adición de un conservante puede, por ejemplo, facilitar la producción de una formulación de múltiples usos (dosis múltiples).

El portador acuoso de interés en la presente descripción es uno que es farmacéuticamente aceptable (seguro y no tóxico para la administración a un ser humano) y es útil para la preparación de una formulación líquida. Los portadores ilustrativos incluyen agua estéril para inyección (SWFI), agua bacteriostática para inyección (BWFI), una solución tamponada para pH (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato), solución salina estéril, solución de Ringer o solución de dextrosa.

La proteína descrita en la presente descripción podría existir en una formulación liofilizada que incluye las proteínas y un lioprotector. El lioprotector puede ser azúcar, por ejemplo, disacáridos. En determinadas modalidades, el lioprotector puede ser sacarosa o maltosa. La formulación liofilizada también puede incluir uno o más de un agente amortiguador, un surfactante, un agente de carga y/o un conservante.

La cantidad de sacarosa o maltosa útil para la estabilización del producto farmacéutico liofilizado puede estar en una relación en peso de al menos 1:2 de proteína a sacarosa o maltosa. En determinadas modalidades, la relación en peso de proteína con respecto a sacarosa o maltosa puede ser de 1:2 a 1:5.

En determinadas modalidades, el pH de la formulación, antes de la liofilización, puede ajustarse mediante la adición de un ácido y/o base farmacéuticamente aceptable. En determinadas modalidades el ácido farmacéuticamente aceptable puede ser ácido clorhídrico. En determinadas modalidades, la base farmacéuticamente aceptable puede ser hidróxido de sodio.

Antes de la liofilización, el pH de la solución que contiene la proteína descrita en la presente descripción puede ajustarse entre 6 y 8. En determinadas modalidades, el intervalo de pH para el producto farmacéutico liofilizado puede ser de 7 a 8.

En determinadas modalidades, se puede añadir una sal o componente de tampón en una cantidad de 10 mM - 200 mM. Las sales y/o tampones son farmacéuticamente aceptables y derivan de varios ácidos conocidos (inorgánicos y orgánicos) con metales o aminas “formadores de bases”. En determinadas modalidades, el tampón puede ser tampón fosfato. En determinadas modalidades, el tampón puede ser tampón de glicinato, carbonato, citrato, en cuyo caso, los iones de sodio, potasio o amonio pueden servir como contraión.

En determinadas modalidades, puede añadirse un "agente de carga". Un “agente de carga” es un compuesto que añade masa a una mezcla liofilizada y contribuye a la estructura física de la torta liofilizada (por ejemplo, facilita la producción de una torta liofilizada esencialmente uniforme que mantiene una estructura de poro abierto). Los agentes de carga ilustrativos incluyen manitol, glicina, polietilenglicol y sorbitol. Las formulaciones liofilizadas de la presente solicitud pueden contener tales agentes de carga.

Un conservante puede añadirse opcionalmente a las formulaciones en la presente descripción para reducir la acción bacteriana. La adición de un conservante puede, por ejemplo, facilitar la producción de una formulación de múltiples usos (dosis múltiples).

En determinadas modalidades, el producto farmacéutico liofilizado puede reconstituirse con un portador acuoso. El portador acuoso de interés en la presente descripción es uno que es farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, seguro y no tóxico para su administración a un ser humano) y es útil para la preparación de una formulación líquida, después de la liofilización. Los portadores acuosos ilustrativos incluyen agua estéril para inyección (SWFI), agua bacteriostática para inyección (BWFI), una solución tamponada para pH (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato), solución salina estéril, solución de Ringer o solución de dextrosa.

En determinadas modalidades, el producto farmacéutico liofilizado descrito en la presente descripción se reconstituye con agua estéril para inyección, USP (SWFI) o inyección de cloruro de sodio al 0,9 %, USP. Durante la reconstitución, el polvo liofilizado se disuelve en una solución.

En determinadas modalidades, el producto proteico liofilizado descrito en la presente descripción se reconstituye a aproximadamente 4,5 ml de agua para inyección y se diluye con solución salina al 0,9 % (solución de cloruro de sodio).

Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas descritos en la presente descripción pueden variarse para obtener una cantidad del ingrediente activo que es efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particular, sin ser tóxicos para el paciente.

La dosis específica puede ser una dosis uniforme para cada paciente, por ejemplo, 50-5000 mg de proteína. Alternativamente, la dosis de un paciente se puede adaptar al peso corporal aproximado o al área superficial del paciente. Otros factores para determinar la dosificación adecuada pueden incluir la enfermedad o afección que se va a tratar o prevenir, la gravedad de la enfermedad, la vía de administración y la edad, el sexo y la afección médica del paciente. Los expertos en la técnica realizan rutinariamente un perfeccionamiento adicional de los cálculos necesarios para determinar la dosificación apropiada para el tratamiento, especialmente a la luz de la información de dosificación y los ensayos descritos en la presente descripción. La dosis también puede determinarse mediante el uso de ensayos conocidos para determinar las dosificaciones usadas junto con los datos de dosis-respuesta apropiados. La dosis de un paciente individual puede ajustarse a medida que se monitorea el progreso de la enfermedad. Los niveles sanguíneos del constructo o complejo diana en un paciente pueden medirse para ver si es necesario ajustar la dosis para alcanzar o mantener una concentración efectiva. La farmacogenómica puede usarse para determinar qué constructos y/o complejos dirigibles, y sus dosificaciones, son más propensos a ser efectivos para un individuo dado (Schmitz y otros, Clinica Chimica Acta 308: 43-53, 2001; Steimer y otros, Clinica Chimica Acta 308: 33-41, 2001).

En general, las dosificaciones basadas en el peso corporal son de aproximadamente 0,01 |jg a aproximadamente 100 mg por kg de peso corporal, tal como aproximadamente 0,01 jg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,01 jg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,01 jg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,01 jg a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,01 jg a aproximadamente 100 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,01 jg a aproximadamente 50 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,01 jg a aproximadamente 10 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,01 jg a aproximadamente 1 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,01 jg a aproximadamente 0,1 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,1 jg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,1 jg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,1 jg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,1 jg a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,1 jg a aproximadamente 100 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,1 jg a aproximadamente 10 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 0,1 jg a aproximadamente 1 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 jg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 jg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 jg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 jg a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 jg a aproximadamente 100 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 jg a aproximadamente 50 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 jg a aproximadamente 10 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 jg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 jg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 jg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 jg a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 jg a aproximadamente 100 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 jg a aproximadamente 50 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 50 jg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 50 jg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 50 jg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 50 jg a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 50 jg a aproximadamente 100 jg/kg de peso corporal, aproximadamente 100 jg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 100 jg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 100 jg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 100 jg a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 mg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 mg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 mg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 mg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 50 mg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal.

Las dosis pueden administrarse una o más veces al día, semanalmente, mensualmente o anualmente, o incluso una vez cada 2 a 20 años. Los expertos en la técnica pueden estimar fácilmente las tasas de repetición para la dosificación en base a los tiempos de residencia medidos y las concentraciones del constructo o complejo diana en fluidos o tejidos corporales. La administración de las composiciones descritas en la presente descripción podría ser intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intrapleural, intratecal, intracavidad, mediante perfusión a través de un catéter o mediante inyección intralesional directa. Las administraciones pueden ser una o más veces al día, una o más veces a la semana, una o más veces al mes o una o más veces al año.

La descripción anterior describe múltiples aspectos y modalidades de la presente solicitud. La solicitud de patente contempla específicamente todas las combinaciones y permutaciones de los aspectos y modalidades.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos son meramente ilustrativos y no pretenden limitar el alcance o contenido de las proteínas de unión multiespecífica descritas en la presente solicitud de ninguna manera.

Ejemplo 1. Selección de la interfaz de unión al EGFR mediante el uso de análisis de SPR y DSC

Este ejemplo se diseñó para desarrollar sitios de unión al EGFR derivados del panitumumab que tienen una mejor estabilidad térmica que el panitumumab. Brevemente, se diseñaron 25 constructos, cada uno de los cuales contenía una mutación puntual, seleccionada sobre la base de la estructura cristalina del Fab de panitumumab en complejo con el dominio D3 del EGFR (ID de PDB: 5SX4). Aparte de tres construcciones que no se expresaron bien, se produjeron sitios de unión al EGFR para evaluar el impacto de la mutación sobre la afinidad de unión y la termoestabilidad. Cada constructo scFv también contenía la sustitución G44C en el VH y la sustitución G100C en el VL. La cinética y la afinidad por el EGFR humano y de macaco Rhesus se evaluaron mediante el uso de resonancia de plasmones superficiales (SPR). Los resultados se muestran en la Tabla 12. Dado que el impacto para cada mutación fue pequeño, las que provocaron una reducción notable de la afinidad se eliminaron del análisis. La termoestabilidad de ocho construcciones se evaluó además mediante Fluorimetría de Escaneo Diferencial (DSF) mediante el uso del método descrito en el Ejemplo 3. Los resultados se muestran en la Tabla 13.

Tabla 12. Análisis por SPR de las 22 construcciones anti-EGFR con mutaciones puntuales. *-H- denota una mutación en la cadena pesada; -L- denota una mutación en la cadena ligera; y PANI denota el marco estructural de panitumumab.____________________________________ ___________ ___________ ___________ ___________

Tabla 13. Análisis de DSF de 8 construcciones anti-EGFR con mutaciones puntuales. *-H- denota una mutación en la cadena pesada; -L- denota una mutación en la cadena ligera; y PANI denota el marco estructural de panitumumab.__________________________________________________________________________________ Función esperada d l i ñ Nombre* Tm1 (°C) Tm2 (°C) Estabilidad PANI-H-S62R 66,6 84,5 Estabilidad PANI-L-F87Y 66,0 84,3 Función esperada d Nombre* Tm1 (°C m2 (°C) Estabilidad PANI-L-L96N 62,4 84,1 Afinidad PANI-H-S54Q 65,4 86,3 Afinidad PANI-H-S54N 67,0 84,4 Afinidad PANI-H-T98E 62,4 83,0 idad/estabil PANI-L-D92R 66,1 83,6 Control Pani-scFv origina 66,0 84,0

Sobre la base de estos resultados, se determinó que las siguientes mutaciones mejoran/retienen de manera más efectiva la afinidad y la termoestabilidad:

• Cadena pesada: S62R (bajo el esquema de numeración de Chothia)

• Cadena ligera: F87Y, D92R (bajo el esquema de numeración de Chothia)

El modelado estructural de estas mutaciones se muestra en las Figuras 18-20. Como se muestra en la Figura 18, se encontró que la mutación S62R de la cadena VH del panitumumab introduce enlaces de hidrógeno adicionales con D1 de VL y contribuye a la estabilidad de la interfaz VH/VL de acuerdo con el modelado. Como se muestra en la Figura 19, se encontró que la mutación F87Y de la cadena VL de panitumumab introduce enlaces de hidrógeno adicionales con Q39 de V<h>y contribuye a la estabilidad de la interfaz VH/VL de acuerdo con el modelado. Como se muestra en la Figura 20, se encontró que la mutación D92R en CDR3 de la cadena VL de panitumumab, originalmente diseñada para mejorar la afinidad (para la unión a N449 del EGFR), forma inesperadamente contactos adicionales de van der Waals con Y32 de CDRL1 y estabiliza el paratopo, de acuerdo con el modelado.

Después de eso, el impacto de las combinaciones de mutaciones sobre la afinidad y la termoestabilidad se evaluó mediante el uso de SPR y la calorimetría de barrido diferencial (DSC), respectivamente. Los resultados del análisis de SPR se muestran en la Tabla 14 y los resultados del análisis de DSC se muestran en la Tabla 15.

Tabla 14. Análisis de SPR para mutaciones combinadas. *-H denota una mutación en la cadena pesada; L- denota n m i n n l n li r PANI n l m r r r l ni m m .

-

PANI-H_S62R-L_F87Y-L_D92R (en adelante, "EGFR-scFv-3") y PANI-H_S62R-L_F87Y (en adelante, "EGFR-scFv-2") en las Tablas 14 y 15 demostraron la mejor afinidad y termoestabilidad. Las mutaciones L:G100C y H: G44C facilitan un enlace disulfuro para mejorar el emparejamiento de las cadenas VL y VH.

Ejemplo 2. Análisis de resonancia de plasmones superficiales de TriNKET

Este ejemplo se diseñó para evaluar la afinidad de unión al EGFR de determinados sitios de unión al EGFR derivados del panitumumab. Se construyeron cuatro TriNKET que contenían scFv derivados del panitumumab y sus variantes, específicamente, EGFR-TriNKET-1, EGFR-TriNKET-2, EGFR-TriNKET-3 y EGFR-TriNKET-4 (véase la subsección anterior “Proteínas de unión multiespecífica ilustrativas”). La cinética y las afinidades de los constructos de unión al EGFR para el EGFR recombinante humano y de rhesus se midieron mediante SPR mediante el uso de un instrumento Biacore 8K. Las muestras se capturaron en el chip de IgG anti-hFc y un intervalo de concentraciones de EGFR-His recombinante humano o de rhesus se inyectó sobre artículos de prueba capturados. Los experimentos se realizaron a una temperatura fisiológica de 37 °C. Los datos se analizaron mediante el uso del software de evaluación Biacore 8K Insight (GE Healthcare).

Los sensorgramas de unión del análisis de SPR se muestran en las Figuras 21-24. La Figura 21 muestra el análisis de SPR para una titulación de EGFR-TriNKET-1, la Figura 22 muestra el análisis de SPR para una titulación de EGFR- TriNKET -2, la Figura 23 muestra el análisis de SPR para una titulación de EGFR- TriNKET -3, y la Figura 24 muestra el análisis de SPR para una titulación de EGFR- TriNKET -1. Los parámetros calculados a partir de estos análisis se muestran en la Tabla 16. Los resultados demostraron que las mutaciones de interés no tuvieron un impacto sustancial en la afinidad de las proteínas de unión multiespecífica por el EGFR.

Tabla 16. Análisis de SPR: Unión al EGFR humano N=4

Ejemplo 3. Análisis de calorimetría diferencial de barrido (DSC) de los TriNKET

Este ejemplo se diseñó para evaluar la termoestabilidad de las construcciones de TriNKET mediante el uso del análisis de DSC. Brevemente, los artículos de prueba se intercambiaron con tampón en el tampón de elección mediante el uso de columnas de desalación de Thermo Scientific Zeba Spin. A continuación, el eluato se diluyó a 0,5 mg/ml con el mismo tampón. Se cargaron 325 pl de la muestra en una placa de pocillos profundos de 96 pocillos con el blanco de tampón correspondiente y se analizaron mediante el uso de un instrumento Microcal PEAQ-DSC (Malvern Panalytical). La temperatura se aumentó de 20-25 °C a 100 °C a una velocidad de 60 °C/h. El fondo con tampón se ejecutó por triplicado antes de los analitos. El blanco de tampón más representativo se restó de cada escaneo de analito antes del análisis. Los datos se ajustaron mediante el uso del software de análisis de DSC con un modelo diferente de dos estados y se notificó Tinicio y Tms.

Se usó EGFR-TriNKET-1 para obtener una curva de fusión como valor inicial e identificar los puntos de inflexión, especialmente T de inicio (la temperatura bajo la cual la molécula comienza a fundirse) así como también Tm1, que está relacionada con la estabilidad del scFv. Posteriormente, se analizaron EGFR-TriNKET-2, EGFR-TriNKET-3 y EGFR-TriNKET-4 mediante el uso del mismo método.

La Tabla 17 y las Figuras 25A-25D muestran los resultados del análisis de DSC de las pruebas en PBS, tampón pH 7,4. La Figura 25A muestra el análisis de DSC para EGFR-TriNKET-1 en PBS, tampón pH 7,4. La Figura 25B muestra el análisis de DSC para EGFR- TriNKET -2 en PBS, tampón pH 7,4. La Figura 25C muestra el análisis de DSC para EGFR- TriNKET -3 en PBS, tampón pH 7,4. La Figura 25d muestra el análisis de DSC para EGFR-TriNKET -4 en PBS, tampón pH 7,4. La Tabla 18 y las Figuras 26A y 26B muestran los resultados del análisis de DSC de las pruebas en histidina 20 mM, trehalosa 250 mM, PS80 al 0,01 %, pH 6,0. La Figura 26A muestra el análisis de DSC para EGFR-TriNKET-3 en histidina 20 mM, trehalosa 250 mM, PS80 al 0,01 %, tampón pH 6,0. La Figura 26B muestra el análisis de DSC para EGFR-TriNKET-3 en histidina 20 mM, trehalosa 250 mM, PS80 al 0,01 %, tampón pH 6,0. El análisis de DSC reveló que EGFR-TriNKET-3 (Figura 25C) tuvo una mejor estabilidad térmica con relación al EGFR-TriNKET-2 (Figura 25B), que a su vez tuvo una mejor estabilidad térmica con relación al EGFR-TriNKET-1 (Figura 25A). Los resultados también mostraron una termoestabilidad similar de EGFR-TriNKET-3 (Figura 26A) y EGFR-TriNKET-4 (Figura 26B). Sin embargo, EGFR-TriNKET-4 fue más propenso a la degradación en estudios de termoestabilidad acelerada (40 °C durante 4 semanas, datos no mostrados), lo que destaca el beneficio de una mutación de cadena pesada S62R para la estabilidad.

Tabla 17. Análisis de DSC en tam ón PBS H74

Tabla 18. Análisis de DSC en histidina 2Q mM trehalosa 250 mM PS80 al 001 % H 60

Ejemplo 4. Evaluación de la unión de TriNKET a células positivas para EGFR

Este ejemplo se diseñó para evaluar la afinidad de unión al EGFR de los TriNKET dirigidos al EGFR expresado en la superficie celular. Se usó la línea celular de cáncer humano H2172, derivada de carcinoma de pulmón de células no pequeñas. Brevemente, las células H2172 se incubaron con EGFR-TriNKET-1, EGFR-TriNKET-2, EGFR-TriNKET-3 o panitumumab a 4 °C durante 0,5 horas. Después de la incubación, se detectaron los patrones de unión de los TriNKET y panitumumab a las células EGFR+ mediante el uso de un anticuerpo secundario anti-IgG humana conjugado con fluoróforo. Las células se analizaron mediante citometría de flujo y se reportó la MFI en veces respecto a los controles con solo el secundario.

La Figura 27 muestra la unión a células positivas para EGFR después de la incubación con EGFR-TriNKET-1, EGFR-TriNKET-2, EGFR-TriNKET-3 o panitumumab. Estos TriNKET dirigidos al EGFR se unieron a las células con concentraciones sub-nM y con una unión máxima similar o mayor que el panitumumab.

Ejemplo 5. Ensayo de citotoxicidad de células NK humanas primarias o CD8+

Este ejemplo se diseñó para evaluar la capacidad de los TriNKET dirigidos al EGFR para mediar la citotoxicidad de las células efectoras inmunitarias contra células cancerosas que expresan EGFR. Brevemente, se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de la capa leucocitaria de sangre periférica humana mediante el uso de centrifugación en gradiente de densidad. Las PBMC aisladas se lavaron y prepararon para el aislamiento de células NK o CD8+. Las células NK se aislaron mediante el uso de una técnica de selección negativa con perlas magnéticas, y la pureza de las células NK aisladas fue típicamente >90 % de CD3-CD56+. Las células NK aisladas se dejaron reposar durante toda la noche en medios de cultivo sin citocinas complementarias y se usaron al día siguiente en los ensayos de citotoxicidad. Las CD8+ se aislaron mediante el uso de una técnica de selección negativa con perlas magnéticas, y la pureza de las células CD8+ fue típicamente >90 % de CD3+ CD8+. Los linfocitos T CD8+ aislados se incubaron en medio con IL-15 durante 6-13 días para la expansión.

Para los ensayos de citotoxicidad, las líneas celulares cancerosas humanas que expresan EGFR se cosecharon del cultivo, las células se lavaron con HBS y se resuspendieron en medios de crecimiento a 106/ml para su marcaje con reactivo BATDA (Perkin Elmer AD0116). Se siguieron las instrucciones del fabricante para el marcaje de las células diana. Después del marcaje, las células se lavaron 3 veces con HBS y se resuspendieron a 0,5-1,0*105/ml en medios de cultivo. Para preparar los pocillos de fondo, se reservó una alícuota de las células marcadas, y las células se separaron del medio mediante centrifugación. Se añadieron cuidadosamente 100 pl del medio a los pocillos por triplicado para evitar alterar las células sedimentadas. Se añadieron 100 pl de células marcadas con BATDA a cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Los pocillos se guardaron para la liberación espontánea de las células diana, y los pocillos se prepararon para la lisis máxima de las células diana mediante la adición de Triton-X al 1 %. Los anticuerpos monoclonales (por ejemplo, cetuximab) o T riNKET contra EGFR (por ejemplo, EGFR-T riNKET-1, EGFR-TriNKET-3 y EGFR-TriNKET-4) se diluyeron en medios de cultivo, y se añadieron 50 pl de AcM diluido o TriNKET a cada pocillo. Las células NK en reposo se cosecharon del cultivo, las células se lavaron y se resuspendieron a 105-2,0*10® células/ml en medio de cultivo en dependencia de la relación Efector-diana deseada (E:T). Se añadieron 50 pl de la suspensión de células NK a cada pocillo de la placa para producir un total de 200 pl de volumen de cultivo. La placa se incubó a 37 °C con 5 % de CO2 durante 2-3 horas antes de revelar el ensayo.

Después de cultivar durante 2-3 horas, la placa se retiró de la incubadora y las células se sedimentaron mediante centrifugación a 200 g durante 5 minutos. Se transfirieron 20 pl de sobrenadante de cultivo a una microplaca limpia proporcionada por el fabricante y se añadieron 200 pl de solución de europio a temperatura ambiente a cada pocillo. La placa se protegió de la luz y se incubó en un agitador de placas a 250 rpm durante 15 minutos, luego se leyó mediante el uso de instrumentos Victor 3 o SpectraMax i3X. El % de lisis específica se calculó de la siguiente manera:

% Lisis específica = ((Liberación experimental - Liberación espontánea) / (Liberación máxima - Liberación espontánea)) * 100 %

Como se muestra en las Figuras 28 y 29, se observa lisis de células H2172 (Figura 28) y células 786-0 (Figura 29) por células NK y linfocitos T CD8+ humanos, respectivamente, en presencia de TriNKET de EGFR o AcM anti-EGFR cetuximab, dentro de las 2 horas de incubación. En ambos sistemas y en múltiples donantes (datos no mostrados), los EGFR-TriNKET tuvieron valores de EC50 inferiores a nM. En comparación con la actividad baja o ausente de cetuximab, los TriNKET proporcionaron una mayor lisis y potencia específicas máximas.

Ejemplo 6. Evaluación de la producción de IFN-gamma de NK mediada por TriNKET

Este ejemplo se diseñó para evaluar la capacidad de los TriNKET dirigidos al EGFR para activar las células NK en presencia de células cancerosas que expresan EGFR. Brevemente, las células cancerosas que expresan EGFR BT-474 sirvieron como células diana. Las células NK aisladas (derivadas de múltiples donantes humanos) se dejaron reposar durante toda la noche en medio de cultivo sin citocinas complementarias o en medio de cultivo con IL-2 humana recombinante. Las células NK en reposo se incubaron con las células diana en una relación 2:1 de células efectoras (células NK) con respecto a las células diana (relación E:T) durante 24 horas, mientras que las células NK activadas con IL-2 se incubaron con las células diana en una relación E:T 1:1 durante 24 horas. Después de la incubación, la secreción de IFN-<y>derivado de las células NK se analizó mediante el uso de un kit ELISA de IFN-<y>de acuerdo con las instrucciones del fabricante Mesoscale. Las placas se leyeron mediante el uso de los instrumentos Victor 3 o SpectraMax i3X.

Las Figuras 30 y 31 muestran la producción resultante de IFN-gamma a partir de las células NK en reposo (Figura 30) y activadas con IL-2 (Figura 31), respectivamente, después de la incubación con las células BT-474 en presencia de EGFR-TriNKET o AcM anti-EGFR cetuximab. En ambos casos, los EGFR-TriNKET mediaron una mayor producción de IFN-gamma por las células NK en comparación con las células tratadas con cetuximab.

Ejemplo 7. Ensayo de proliferación celular por EGFR

Este ejemplo se diseñó para evaluar el impacto de los TriNKET de EGFR sobre la proliferación de la línea celular H292 de cáncer humano con expresión de EGFR en ausencia de células efectoras. Brevemente, los EGFR-TriNKET y los AcM anti-EGFR cetuximab y panitumumab se diluyeron e incubaron con células H292 durante 72 horas. Después de la incubación, la proliferación celular se midió mediante el uso del ensayo Cell-Titer Glo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La Figura 32 muestra la proliferación de células H292 en presencia de los EGFR-TriNKET o los AcM anti-EGFR. Las células tratadas con los AcM anti-EGFR mostraron menos proliferación que las tratadas con los EGFR-TriNKET. Esto se atribuyó a la diferencia en la valencia de los TriNKET y los AcM: los TriNKET son monovalentes, mientras que los AcM son bivalentes y demostraron el beneficio de usar un TriNKET que tiene una valencia menor, dada la asociación del direccionamiento al EGFR con la toxicidad relacionada con la piel que se ha observado en los AcM. Ejemplo 8. Ensayo de actividad de ADCP

Este ejemplo se diseñó para evaluar la actividad de fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) de los macrófagos cuando se incuban con células diana que expresan EGFR en presencia de EGFR-TriNKET. Brevemente, las PBMC se aislaron de la capa leucocitaria de sangre periférica humana mediante el uso de centrifugación en gradiente de densidad. Las PBMC aisladas se lavaron y prepararon para el aislamiento de monocitos. Los monocitos se aislaron mediante el uso de una técnica de selección negativa con perlas magnéticas, y la pureza de los monocitos aislados fue típicamente >90 % de CD14. Los monocitos se diferenciaron en macrófagos mediante incubación durante 6 días en GM-CSF e IL-4.

Los macrófagos se cosecharon, se marcaron con Violeta CellTrace y se incubaron con células diana marcadas con CFSE (8:1) y moléculas durante 2 horas. Las células se tiñeron y prepararon para análisis de FAC. La fagocitosis se calculó de la siguiente manera:

% Fagocitosis =% de diana+ y efector+ del portal principal de la “diana+”

Como se muestra en la Figura 33, los macrófagos incubados con células H292 que expresan EGFR en presencia de EGFR-TriNKET-1, EGFR-TriNKET-3 y EGFR-TriNKET-4 mostraron una mayor actividad ADCP que las incubadas en presencia del AcM anti-EGFR cetuximab. Los resultados también mostraron que la actividad ADCP del EGFR-TriNKET-1 se pierde cuando las mutaciones L234A, L235A y P329G (LALAPG) en el dominio Fc anulan la capacidad del TriNKET para unirse a CD16.

Ejemplo 9. Eficacia antitumoral de EGFR-TriNKETin vivo

Este ejemplo se diseñó para probar si EGFR-TriNKET induce funciones antitumoralesin vivo.Brevemente, los ratones desnudos se inyectaron por vía subcutánea con 4*10® células tumorales NCI-H292. Los ratones se aleatorizaron en diferentes grupos de tratamiento cuando el tamaño del tumor promedió un volumen de ~90 mm3 (día 7 después de la inoculación). Los ratones se trataron por vía intraperitoneal (IP) dos veces a la semana con isotipo hIgG1, EGFR-TriNKET o Cetuximab.

EGFR-TriNKET redujo significativamente el crecimiento tumoral de NCI-H292 en ratones a los que se administró una dosis de 300 |jg o 100 jg/dosis en comparación con animales tratados con isotipo (p<0,01; Figuras 34A-C). La Figura 34A muestra volúmenes tumorales promedio de ratones individuales tratados con 300 jg, 100 jg, 30 jg de EGFR-TriNKET o control de isotipo hIgGI. La Figura 34B muestra volúmenes tumorales de ratones individuales tratados con 300 jg de EGFR-TriNKET o control de isotipo hIgGI. La Figura 34C muestra volúmenes tumorales de ratones individuales tratados con 100 jg de EGFR-TriNKET o control de isotipo hIgGI. La Figura 34D muestra volúmenes tumorales de ratones individuales tratados con 30 jg de EGFR-TriNKET o control de isotipo hIgGI. Como se muestra en la Figura 34A, Figura 34B, y Figura 34C, el tratamiento de ratones con 300 jg y 100 jg de EGFR-TriNKET, redujo significativamente los volúmenes tumorales en comparación con el control de isotipo hIgG1. Como se muestra en la Figura 34D, el tratamiento de ratones con 30 jg/dosis de EGFR-TriNKET retrasó significativamente la progresión del tumor en comparación con el grupo control tratado con hIgG1.

Además de la titulación de la dosis de EGFR-TriNKETin vivo,se comparó la eficacia antitumoral mediada por EGFR-TriNKET con Cetuximab a una dosis equimolar de 100 jg de Cetuximab. Como se muestra en la Figura 35a , el tratamiento de ratones individuales con EGFR-TriNKET fue tan potente como Cetuximab en la inducción de respuestas antitumoralesin vivo.

En particular, el régimen de EGFR-TriNKET y Cetuximab pareció tolerarse bien por los ratones portadores de tumor NCI-H292. No hubo observaciones clínicas ni efectos sobre el peso corporal (Figura 35B).

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Una proteína que comprende:

(a) una secuencia de scFv de unión al EGFR (VL-VH) en la orientación del dominio variable de cadena pesada (VH) ubicado en el extremo C-terminal respecto al dominio variable de cadena ligera (VL), unido a un polipéptido de dominio Fc para formar un polipéptido (VL-VH)-Fc, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 167;

y

(b) un fragmento Fab de unión a NKG2D que incluye:

una porción de cadena pesada que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio CH1, en donde el dominio CH1 se conecta a un polipéptido de dominio Fc para formar un polipéptido VH-CH1-Fc que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:164, y

una porción de cadena ligera que comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) y un dominio constante de cadena ligera (CL) para formar un polipéptido VL-CL que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:165.

2. Una formulación que comprende una proteína de acuerdo con la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.

3. Una célula que comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican una proteína de acuerdo con la reivindicación 1.

4. La proteína de acuerdo con la reivindicación 1 para usar en un método para tratar un cáncer, en donde el método comprende administrar una cantidad efectiva de la proteína a un paciente que lo necesite.