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ES3029737T3 - Rna templated ligation - Google Patents

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ES3029737T3
ES3029737T3 ES18782735T ES18782735T ES3029737T3 ES 3029737 T3 ES3029737 T3 ES 3029737T3 ES 18782735 T ES18782735 T ES 18782735T ES 18782735 T ES18782735 T ES 18782735T ES 3029737 T3 ES3029737 T3 ES 3029737T3
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ES
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probe
target
nucleotide
ligation
specific binding
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ES18782735T
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Inventor
Mats Nilsson
Malte Kühnemund
Tomasz Krzywkowski
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
10X Genomics Inc
Original Assignee
10X Genomics Inc
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Abstract

La presente solicitud proporciona métodos para detectar una molécula de ácido nucleico diana en una muestra, que comprenden poner en contacto dicha muestra con una sonda ligable de uno o más componentes y permitir que dicha sonda hibride con la molécula de ácido nucleico diana, ligar cualquier sonda que haya hibridado con la molécula de ácido nucleico diana, amplificar la sonda ligada y detectar el producto de amplificación, para así detectar la molécula de ácido nucleico diana. Dichas sondas comprenden al menos un ribonucleótido en o cerca de un sitio de ligadura, o donde la sonda o un componente de la sonda comprende una secuencia adicional en 5' respecto a un sitio de unión específico de la diana que no hibrida con la molécula de ácido nucleico diana tras la hibridación de la sonda con la molécula de ácido nucleico diana y forma una solapa 5' que contiene uno o más nucleótidos en su extremo 3', que se escinde antes de la ligadura. También proporciona métodos para sintetizar una molécula de ADN con la ADN polimerasa Phi29 utilizando una molécula de ácido nucleico molde que comprende al menos un ribonucleótido. Se proporcionan sondas para su uso en los métodos de detección. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Ligación con plantilla de ARN
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de detección de ácidos nucleicos. Específicamente, la presente invención proporciona métodos para detectar secuencias de ácido nucleico diana en un ácido nucleico diana, y particularmente secuencias de ARN diana en una molécula de ARN diana mediante el uso de sondas de ADN-ARN quiméricas ligables. También se proporcionan sondas de ácido nucleico para usar en dichos métodos.
Antecedentes
La detección de las secuencias de ácidos nucleicos diana tiene aplicaciones en muchos campos diferentes, que incluyen la medicina personalizada, el diagnóstico y el tratamiento del cáncer, las enfermedades infecciosas y la bioseguridad.
Las sondas de hibridación marcadas complementarias a una secuencia de ácido nucleico diana pueden usarse para la detección de una secuencia de ácido nucleico diana, por ejemplo, en ensayos de transferencia Southern o Northern. T ales sondas permiten la detección simple y directa de secuencias de ácidos nucleicos diana, que incluyen secuencias de ARN diana, pero las sondas de hibridación tienen límites de detección inferiores relativamente altos, y no pueden usarse fácilmente para discriminar entre secuencias de ácidos nucleicos similares. Además, tales sondas no pueden adaptarse fácilmente para usar en ensayos de detección múltiples o automatizados.
La sensibilidad de la detección de moléculas de ácido nucleico diana puede mejorarse al amplificar primero una secuencia diana. Las técnicas de amplificación permiten amplificar niveles muy bajos de una secuencia diana en una muestra antes de la detección para aumentar el número de copias de una secuencia diana en una muestra. La amplificación puede realizarse mediante el uso de cualquiera de una variedad de técnicas disponibles en la técnica, tales como la reacción en hebra de la polimerasa (PCR), la amplificación basada en ácido nucleico específico (NASBA), la reacción en hebra de la ligasa (LCR) y la amplificación en círculo rodante (RCA). Sin embargo, estas técnicas están dirigidas principalmente a amplificar secuencias de ADN, y típicamente requieren una plantilla de ADN para continuar eficientemente.
La PCR puede usarse para amplificar una molécula de ácido nucleico diana, y permite que la amplificación exponencial tenga lugar mediante el uso de un par de cebadores específicos para secuencias dentro de la molécula de ácido nucleico diana que flanquea la secuencia de ácido nucleico diana. Sin embargo, las secuencias de ARN diana no pueden detectarse directamente mediante PCR y, en cambio, la detección de ARN requiere la formación de un intermediario de ADNc mediante el uso de una enzima transcriptasa inversa (RT-PCR), que puede amplificarse subsecuentemente. De manera similar, NASBA y LCR también requieren una etapa inicial de transcriptasa inversa para generar una plantilla de ADNc para la amplificación (CA 2136764).
RCA utiliza una enzima polimerasa de desplazamiento de hebra y requiere una plantilla de amplificación circular. La amplificación de la plantilla circular proporciona un producto de RCA concatenado, que comprende múltiples copias de una secuencia complementaria a la de la plantilla de amplificación, que finalmente puede detectarse. La plantilla de RCA circular se proporciona típicamente mediante una reacción de ligación, y puede proporcionarse típicamente ya sea mediante la circularización de una molécula de ácido nucleico diana mediante el uso de una sonda específica de la diana como una plantilla para la circularización, o mediante la circularización de una sonda específica de la diana mediante el uso de una molécula de ácido nucleico diana como una plantilla para la circularización.
Una plantilla de RCA circular puede proporcionarse convenientemente mediante el uso de una sonda selectora simétrica que comprende una hebra de ácido nucleico más larga que sobresale de ambos extremos de una hebra de ácido nucleico más corta, dicha hebra más larga comprende secuencias en sus extremos complementarias a secuencias en una molécula de ácido nucleico diana como se describe en el documento US 7883849. Después de la hibridación, el selector y el fragmento de ácido nucleico diana se unen por ligación para dar una molécula de ácido nucleico circular. Los métodos alternativos para la selección y amplificación de un ácido nucleico implican la circularización general de fragmentos genómicos como se describió en Drmanac y otros 2010. Science 327, 78-81 y el documento US 8518640. Los métodos basados en sondas selectoras para seleccionar una secuencia de ácido nucleico diana también se proporcionan en el documento WO 03/044229. Sin embargo, la circularización y amplificación de plantillas de ARN de esta manera no se ha demostrado.
En técnicas alternativas, en lugar de circularizar un ácido nucleico diana, el ácido nucleico diana puede usarse como una plantilla para la ligación de una sonda o sondas. Por ejemplo, las llamadas “sondas tipo candado”, pueden usarse para detectar una secuencia de ácido nucleico diana como se describió, por ejemplo, en el documento US 5871921. Las sondas tipo candado son moléculas de ácido nucleico lineales que comprenden secuencias complementarias a una molécula de ácido nucleico diana en sus extremos 3' y 5', de manera que después de la hibridación de una sonda tipo candado a su molécula de ácido nucleico diana, los extremos de la sonda se colocan en yuxtaposición para la ligación. La adaptación de dichos métodos dio como resultado el desarrollo de técnicas en las que los extremos de las sondas se unen a secuencias en la molécula de ácido nucleico diana que se separan por una o más bases, y en las que la brecha entre los extremos respectivos de la sonda se llena mediante el uso de una enzima polimerasa de ácido nucleico (Hardenbol y otros 2003. Nat Biotechnol 21, 673-678), o mediante el uso de un oligonucleótido conector (o de brecha) (Weibrecht y otros Nature protocols 8, 355-372). Recientemente se ha demostrado que las técnicas de detección basadas en sondas tipo candado son efectivas para detectar patógenos en una muestra.
Sin embargo, los métodos de detección y amplificación basados en sondas tipo candado típicamente utilizan ADN como diana, así como también sondas de ADN, ya que esto permite obtener un alto grado de especificidad de secuencia, y permite una amplificación (y detección) eficiente de cualquier producto de ligación formado. Se ha demostrado la ligación de sondas de ADN con plantilla de ARN, y se ha demostrado que es suficientemente sensible para distinguir los SNP dentro de una plantilla de ARN (Nilsson y otros 2001. Nucleic acids research 29, 578-581). Otros estudios también han demostrado la detección de miARN específicos mediante el uso de sondas tipo candado de ADN (Zhao y otros 2015. Acta Biochim Biophys Sin 47, 130-136; Jonstrup y otros 2006. RNA 12, 1747-1752). Sin embargo, los ensayos de ligación de ADN típicamente se realizan mejor mediante el uso de una plantilla de ADN en lugar de una plantilla de ARN (Nilsson y otros 2000. Nature Biotechnology 18, 791-793) y se ha encontrado que la ligación de ADN mediante el uso de una plantilla de ARN es ineficiente, y también se ha encontrado que tienen una cinética de reacción altamente variable, incluso entre secuencias estrechamente relacionadas. Además, la mayoría de las enzimas ligasa no toleran plantillas de ARN, y las que sí han demostrado poseer una baja fidelidad de unión a los extremos, o en otras palabras una baja capacidad para diferenciar sondas que han hibridado correctamente con su secuencia diana. Por tanto, típicamente, los métodos de la técnica generan una molécula de ADNc a partir de una molécula de ARN diana antes de la detección.
La ligación, dependiente de la diana, de sondas de ribonucleótidos, o sondas que contienen tanto ribonucleótidos como desoxirribonucleótidos se ha demostrado para una diana de ARN (Zhao y otrossupra).Específicamente, se probó la eficiencia de la ligación de varias combinaciones de sondas de ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos de 7 mer mediante el uso de una plantilla de ligación de ARN, y se demostró que la ligación de tales sondas podría usar una plantilla de ARN. Sin embargo, no se demostró la amplificación del producto ligado que contiene tanto ribonucleótidos como desoxirribonucleótidos. Además, las enzimas polimerasas que se usan típicamente en los métodos de RCA tienen baja capacidad de procesamiento para las plantillas que comprenden segmentos largos de ribonucleótidos.
Por tanto, sigue existiendo la necesidad de técnicas que permitan la detección eficiente de una variedad más amplia de dianas de ácidos nucleicos, es decir, que incluyen dianas de ARN, que combinen tanto una etapa de ligación eficiente, como la posibilidad de amplificación del producto de ligación resultante, para permitir la detección de la diana. El documento WO 2014/030066 A2 (BERNITZ MATS NILSSON [SE]; LARSSON CHATARINA [SE]; GRUNDBERG IDA [SE]), 27 de febrero de 2014 (2014-02-27), describe el método basado en amplificación en círculo rodante. Aunque las moléculas de ARN podrían servir como plantillas detectadas por la sonda tipo candado, hubo problemas con la ligación de las sondas tipo candado hibridadas a la plantilla de ARN. La transcripción inversa de ARN a ADNc y el uso de una sonda tipo candado para detectar el ADNc superaron tales problemas.
Resumen de la invención
Aunque las sondas y métodos se han desarrollado principalmente con la intención de detectar dianas de ARN, se ha descubierto que determinadas sondas y métodos nuevos de la presente invención también demuestran ventajas en la detección de dianas de ADN y, por lo tanto, pueden aplicarse más ampliamente.
El método de la presente invención usa una sonda tipo candado proporcionada en una o más partes que es complementaria e hibrida con una molécula de ARN diana, y que se liga de una manera dependiente de la diana, en donde las sondas se componen principalmente de ADN, pero comprenden al menos un ribonucleótido en o cerca de un sitio de ligación que sirve para mejorar la eficiencia y fidelidad de la ligación que usa como plantilla una molécula de ARN diana. Una vez que se ha formado un producto de ligación, se amplifica, y se detecta el producto de amplificación resultante, para detectar de esta manera la molécula de ARN diana.
Sorprendentemente, en el curso de la presente invención, se observó que proporcionar un ribonucleótido en lugar de un desoxirribonucleótido en o cerca de un extremo ligable de la sonda mejoró la eficiencia de la ligación de una sonda, y en particular dio como resultado un aumento en la eficiencia de la ligación cuando se usó una plantilla de ligación de ARN. Esto también puede ser beneficioso en el contexto de detectar una diana de ADN (es decir, cuando se usa una diana de ADN como plantilla para la ligación de la sonda) cuando las dianas de ARN y ADN se detectan juntas, simultáneamente. Se sabe que las cadenas principales de ribonucleótidos azúcar-fosfato en los oligonucleótidos prefieren conformaciones particulares debido a la presencia del 2'-OH, que inhibe la conformación del C2'-endo en el azúcar ribosa. Las enzimas ligasa también pueden tener una mayor especificidad para las sondas que comprenden ribonucleótidos cuando se unen a una molécula de ARN diana respecto a los desoxirribonucleótidos. Sin desear limitarse a la teoría, se cree que la presencia de un ribonucleótido en o cerca de un extremo ligable de la sonda permite que el(los) extremo(s) de la sonda involucrado(s) en una ligación con plantilla sean reconocido(s) y ligado(s) con mayor eficiencia y fidelidad por una enzima ligasa que una sonda correspondiente que no comprende ribonucleótidos.
También se observó que la eficiencia con la que se podría amplificar un producto de ligación no se inhibió significativamente cuando la cantidad de ribonucleótidos consecutivos en una sonda ligada compuesta principalmente de ADN se mantuvo en un mínimo. Por tanto, se encontró que era posible mejorar la eficiencia de la ligación mediante el uso de una sonda que comprendía uno o más ribonucleótidos, a la vez que permite realizar una amplificación eficiente del producto de ligación resultante.
La presente invención se define por las reivindicaciones adjuntas. En particular, la presente invención proporciona un método para detectar una secuencia de ARN diana en una molécula de ARN diana en una muestra, dicho método comprende:
(a) poner en contacto dicha muestra con una sonda tipo candado y permitir que dicha sonda hibride con la molécula de Ar N diana;
(b) someter dicha muestra a una reacción de ligación mediante el uso de una ADN/ARN ligasa para ligar, y de esta manera circularizar, dicha sonda que ha hibridado con la molécula de ARN diana;
(c) amplificar la sonda circularizada ligada de la etapa (b) mediante amplificación en círculo rodante (RCA) con una ADN polimerasa para generar un producto de RCA; y
(d) detectar el producto de RCA, detectando de esta manera la secuencia de ARN diana;
en donde la sonda tipo candado se proporciona en una o más partes, cada parte tiene al menos un sitio de unión específico de la diana que es complementario a un sitio de unión a la sonda cognado en o adyacente a la secuencia de ARN diana e hibrida con la molécula de ARN diana de manera que, opcionalmente después de una etapa de escisión de la sonda hibridada y/o extensión de un extremo 3' de esta mediante el uso de la molécula de ARN diana como una plantilla, los extremos ligables de la sonda o partes de la sonda se yuxtaponen para la ligación entre sí mediante el uso de la molécula de ARN diana como una plantilla de ligación, para crear un sitio de ligación en o adyacente a la secuencia de ARN diana; y
en donde dicha sonda comprende al menos un ribonucleótido en o cerca de un sitio de ligación, opcionalmente después de dicha etapa de escisión y/o extensión, y la sonda circularizada ligada comprende principalmente ADN y comprende no más de 4 ribonucleótidos consecutivos.
La invención también proporciona una sonda tipo candado de ADN-ARN quimérica capaz de unirse a y detectar una secuencia de ARN diana en una molécula de ARN diana, en donde:
(i) la sonda comprende una o más partes, cada una de las cuales tiene al menos un sitio de unión específico de la diana que es complementario a un sitio de unión a la sonda cognado en o adyacente a la secuencia de ARN diana e hibrida con la molécula de ARN diana de manera que, opcionalmente después de una etapa de escisión de la sonda hibridada o parte de esta y/o extensión de un extremo 3' de esta mediante el uso de la molécula de ARN diana como una plantilla, los extremos ligables de la sonda o partes de esta se yuxtaponen para la ligación entre sí mediante el uso de la molécula de ARN diana como una plantilla de ligación, para crear uno o más sitios de ligación en o adyacentes a la secuencia de ARN diana, en donde la ligación en dichos sitios de ligación circulariza la sonda;
(ii) la sonda comprende al menos un ribonucleótido en o cerca de un sitio de ligación; y
(iii) la sonda cuando se liga para formar un círculo se compone principalmente de ADN y comprende no más de 4 ribonucleótidos consecutivos.
La invención también proporciona un conjunto de dos o más sondas de la invención, en donde:
(a) cada sonda es un único oligonucleótido circularizable que comprende un primer sitio de unión específico de la diana situado en el extremo 5' de la sonda o internamente y un segundo sitio de unión específico de la diana situado en el extremo 3' de la sonda, y en donde:
(i) el segundo sitio de unión específico de la diana comprende uno o más ribonucleótidos;
(ii) donde el primer sitio de unión específico de la diana es interno al extremo 5' de la sonda, la sonda comprende una secuencia adicional 5' respecto al primer sitio de unión específico de la diana, de manera que cuando la sonda hibrida con la molécula de ARN diana la secuencia adicional forma un colgajo 5' que no hibrida con la molécula de ARN diana, y que puede retirarse por escisión para generar un extremo 5' ligable que puede ligarse al extremo 3' de la sonda para circularizar la sonda, en donde la secuencia adicional puede contener opcionalmente uno o más ribonucleótidos; y
(iii) la sonda cuando se liga para formar un círculo se compone principalmente de ADN y comprende no más de 2 ribonucleótidos consecutivos; o
(b) cada sonda comprende dos o más partes, la primera parte es un oligonucleótido de la cadena principal que comprende un primer sitio de unión específico de la diana situado en su extremo 5' o internamente y un segundo sitio de unión específico de la diana situado en su extremo 3', y uno o más oligonucleótidos de brechas que comprenden cada uno un sitio de unión específico de la diana complementario y capaz de hibridar con la molécula de ARN diana entre el primer y segundo sitios de unión específicos de la diana del oligonucleótido de la cadena principal, y en donde:
(i) el segundo sitio de unión específico de la diana del oligonucleótido de la cadena principal y/o en el sitio de unión específico de la diana de al menos un oligonucleótido de brecha comprende uno o más ribonucleótidos en el extremo 3' o cerca de este;
(ii) donde el primer sitio de unión específico de la diana es interno al extremo 5' del oligonucleótido de la cadena principal, el oligonucleótido de la cadena principal comprende una secuencia adicional 5' respecto al primer sitio de unión específico de la diana, de manera que cuando el oligonucleótido de la cadena principal hibrida con la molécula de ARN diana la secuencia adicional forma un colgajo 5' que no hibrida con la molécula de ARN diana, y que puede eliminarse mediante escisión para generar un extremo 5' ligable que puede ligarse al extremo 3' de un oligonucleótido de brecha para circularizar la sonda, en donde la secuencia adicional puede contener opcionalmente uno o más ribonucleótidos;
(iii) uno o más oligonucleótidos de brechas comprenden opcionalmente una secuencia adicional 5' respecto al sitio de unión específico de la diana, de manera que cuando el oligonucleótido de brecha hibrida con la molécula de ARN diana la secuencia adicional forma un colgajo 5' que no hibrida con la molécula de ARN diana, y que puede eliminarse mediante escisión para generar un extremo 5' ligable que puede ligarse al extremo 3' de otro oligonucleótido de brecha o al extremo 3' del oligonucleótido de la cadena principal para circularizar la sonda, en donde la secuencia adicional puede contener opcionalmente uno o más ribonucleótidos; y
(iv) los oligonucleótidos de la cadena principal y de brechas cuando se ligan forman un círculo que se compone principalmente de ADN y comprende no más de 2 ribonucleótidos consecutivos;
en donde la sonda o el oligonucleótido de la cadena principal y/o uno o más oligonucleótidos de brechas comprenden una secuencia adicional 5' respecto al primer sitio de unión específico de la diana o a un sitio de unión específico de la diana de un oligonucleótido de brecha, en donde el nucleótido en el extremo 3' de cualquier secuencia adicional que forma un colgajo 5' es complementario al mismo nucleótido cognado en la molécula de ARN diana que el nucleótido en el extremo 3' de la sonda, o en el extremo 3' del oligonucleótido de la cadena principal y/o uno o más oligonucleótidos de brechas;
en donde la sonda es para detectar una base variante en una molécula de ARN diana, y en donde:
(a) (i) el nucleótido en el extremo 3' de la sonda o el oligonucleótido de la cadena principal y/o de brecha y el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional son complementarios a la base variante, y el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional no es capaz de hibridar con la molécula de ARN diana simultáneamente con el nucleótido en el extremo 3' de la sonda o el oligonucleótido de la cadena principal o el oligonucleótido de brecha, de manera que dicha secuencia adicional puede eliminarse mediante escisión para generar un extremo ligable 5' de la sonda; o
(ii) el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional y el nucleótido en el extremo 3' de la sonda o los oligonucleótidos de la cadena principal y/o de brechas no son complementarios a la base variante, de manera que el nucleótido en el extremo 3' de la sonda o el oligonucleótido de la cadena principal y/o el oligonucleótido de brecha no es capaz de hibridar con la molécula de ARN diana, para evitar de esta manera la ligación, y el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional puede eliminarse mediante escisión; o
(b) (i) el nucleótido en el extremo 5' del primer sitio de unión específico de la diana o en el extremo 5' del sitio de unión específico de la diana de un oligonucleótido de brecha es complementario a la base variante, el nucleótido en el extremo 3' de la sonda o el oligonucleótido de la cadena principal u otro oligonucleótido de brecha y el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional son complementarios al nucleótido en la posición 3' de la base variante, y el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional no es capaz de hibridar con la molécula de ARN diana simultáneamente con el extremo 3' de la sonda o el oligonucleótido de la cadena principal o el otro oligonucleótido de brecha, de manera que dicha secuencia adicional puede eliminarse mediante escisión para generar un extremo ligable 5' de la sonda; o
(ii) el nucleótido en el extremo 5' del primer sitio de unión específico de la diana o en el extremo 5' del sitio de unión específico de la diana de un oligonucleótido de brecha no es complementario a la base variante, y dicho nucleótido también se elimina mediante escisión, para de esta manera generar una brecha entre los extremos ligables 5' y 3' y evitar la ligación; y
en donde en cada sonda, el nucleótido en el extremo 3' de la sonda o el oligonucleótido de la cadena principal y/o de brecha y el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional son complementarios a la base variante, y cada sonda en dicho conjunto de sondas comprende un nucleótido diferente en dicho extremo 3' en comparación con otra(s) sonda(s) en dicho conjunto de sondas, opcionalmente en donde dicho conjunto de sondas comprende tres o cuatro sondas, en donde cada sonda comprende un nucleótido diferente en dicho extremo 3' en comparación con otras sondas en dicho conjunto de sondas.
Descripción detallada
La información técnica que se expone más abajo puede, en algunos aspectos, ir más allá de la descripción de la invención, que se define por las reivindicaciones anexas. La información técnica adicional se proporciona para colocar la invención en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. Dicha información técnica adicional que no cae dentro del alcance de las reivindicaciones anexas no es parte de la invención. En consecuencia, cualquier aspecto, modalidades y ejemplos de la presente descripción que no caen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forman parte de la invención y se proporcionan simplemente con fines ilustrativos.
En una modalidad, el método comprende detectar secuencias diana de ARN y ADN, mediante el uso de al menos una sonda dirigida hacia una secuencia de ARN diana y al menos una sonda dirigida hacia una secuencia de ADN diana. Por tanto, las moléculas de ARN y ADN diana pueden estar en la misma muestra. En tal situación, donde se usa una ARN ligasa, es beneficioso que la sonda dirigida a ADN, cuando hibrida con extremos ligables yuxtapuestos para la ligación, también contenga al menos un ribonucleótido en el sitio de ligación o cerca de este.
En consecuencia, la invención proporciona un método que permite la ligación eficiente de una sonda que comprende tanto nucleótidos de ADN como de ARN, y la amplificación posterior del producto de ligación directamente a partir de una reacción de ligación que usa como plantilla una molécula de ácido nucleico diana, es decir, sin la necesidad primero de proporcionar una molécula de ADNc complementaria a la molécula diana. Esto proporciona por lo tanto un método de detección simplificado con relación a los métodos previamente conocidos en la técnica. Además, en el contexto de la detección de ARN, cuando se prescinde del requisito de preparar una molécula de ADNc separada, la detección de una secuencia de ARN diana en una molécula de ARN diana puede realizarse más fácilmente junto con la detección de otras secuencias de ácidos nucleicos, tales como secuencias de ADN diana. Esto puede, por ejemplo, permitir la detección simultánea de secuencias de ARN y ADN diana en la misma muestra.
También se proporciona una sonda para usar en dicho método. Más particularmente, las sondas circularizables son de interés particular, y en este aspecto la invención proporciona en consecuencia una sonda tipo candado de ADN-ARN quimérica capaz de unirse y detectar una secuencia de ácido nucleico diana en una molécula de ácido nucleico diana, en donde:
la sonda comprende una o más partes, cada una de las cuales tiene al menos un sitio de unión específico de la diana que es complementario a un sitio de unión a la sonda cognado en o adyacente a la secuencia de ácido nucleico diana e hibrida con la molécula de ácido nucleico diana de manera que, opcionalmente después de una etapa de escisión de la sonda hibridada y/o extensión de un extremo 3' de esta mediante el uso de la molécula de ácido nucleico diana como una plantilla, los extremos ligables de la sonda o partes de la sonda se yuxtaponen para la ligación entre sí mediante el uso de la molécula de ácido nucleico diana como una plantilla de ligación, para crear uno o más sitios de ligación en la secuencia de ácido nucleico diana o adyacentes a ella, en donde la ligación en dichos sitios de ligación circulariza la sonda;
la sonda comprende al menos un ribonucleótido en o cerca de un sitio de ligación; y
la sonda cuando se liga para formar un círculo se compone principalmente de<a>D<n>y comprende no más de 4 ribonucleótidos consecutivos.
Por tanto, en una modalidad particular, la presente invención proporciona un método para detectar una secuencia de ácido nucleico diana en una molécula de ácido nucleico diana en una muestra, dicho método comprende: poner en contacto dicha muestra con una sonda tipo candado y permitir que dicha sonda hibride con la molécula de ácido nucleico diana;
someter dicha muestra a una reacción de ligación mediante el uso de una ADN/ARN ligasa para ligar, y de esta manera circularizar, cualquier sonda que ha hibridado con la molécula de ácido nucleico diana;
amplificar la sonda circularizada ligada de la etapa (b) mediante amplificación en círculo rodante con una ADN polimerasa; y
detectar el producto de amplificación de la etapa (c), para detectar de esta manera la secuencia de ácido nucleico diana;
en donde cada sonda tipo candado se proporciona en una o más partes, cada parte tiene al menos un sitio de unión específico de la diana que es complementario a un sitio de unión a la sonda cognado en o adyacente a la secuencia de ácido nucleico diana e hibrida con la molécula de ácido nucleico diana de manera que, opcionalmente después de una etapa de escisión de la sonda hibridada y/o extensión de un extremo 3' de esta mediante el uso de la molécula de ácido nucleico diana como una plantilla, los extremos ligables de la sonda o partes de la sonda se yuxtaponen para la ligación entre sí mediante el uso de la molécula de ácido nucleico diana como una plantilla de ligación, para crear un sitio de ligación en o adyacente a la secuencia de ácido nucleico diana; y
en donde dicha sonda comprende al menos un ribonucleótido en o cerca de un sitio de ligación, opcionalmente después de dicha etapa de escisión y/o extensión, y la sonda circularizada ligada se compone principalmente de ADN y comprende no más de 4 ribonucleótidos consecutivos.
La sonda de la invención es capaz de unirse y detectar una secuencia de ARN diana en una molécula de ARN diana. La sonda de la invención también puede ser para la detección de una secuencia de ADN diana en una molécula de ADN diana y una secuencia de ARN diana en una molécula de ARN diana, como se analizó anteriormente.
Dado que la sonda puede proporcionarse en una o más partes, se deduce que puede haber más de una unión de ligación. En otras palabras, una o más partes de la sonda pueden comprender cada una, o generar (es decir por escisión o extensión), extremos 5' y 3' ligables, y la sonda en su conjunto puede comprender, o generar, uno o más extremos 5' ligables y uno o más extremos 3' ligables.
En determinadas modalidades, la sonda puede comprender dos o más partes y pueden crearse dos o más uniones de ligación. En consecuencia, puede proporcionarse una unión de ligación entre dos partes diferentes de la sonda (o más particularmente entre extremos ligables, o generados a partir de los extremos, de dos partes diferentes de la sonda), o entre dos extremos, o generados a partir de los extremos, de una sonda de una parte.
Después de la ligación, se proporciona una sonda que comprende al menos un ribonucleótido en o cerca de un sitio de ligación. Un sitio de ligación es el sitio de la ligación de un grupo fosfato 5' terminal en el extremo 5' ligable de una sonda al grupo hidroxilo 3' terminal en el extremo 3' ligable de una sonda, y la ligación ocurre cuando los respectivos extremos ligables están directamente en yuxtaposición e hibridados correctamente con sus pares de bases complementarios respectivos en la molécula de ácido nucleico diana. Por tanto, un sitio de ligación, una vez formado, es la unión entre los nucleótidos en los extremos ligables 3' y 5' de la sonda o partes de la sonda, y su posición se define por el enlace fosfodiéster formado entre estos nucleótidos. Por tanto, de acuerdo con los métodos y sondas de la presente invención, al menos uno de los nucleótidos que participan en la reacción de ligación (es decir, el nucleótido que proporciona el grupo fosfato 5' terminal o el grupo hidroxilo 3'), o un nucleótido cerca del sitio de ligación, es un ribonucleótido. Preferentemente, al menos uno de los nucleótidos en o cerca de un extremo 3' ligable en un sitio de ligación es un ribonucleótido. En otras palabras, en una modalidad preferida, cuando se hibrida con una molécula de ácido nucleico diana de manera que los extremos 3' y 5' se yuxtaponen para la ligación, la sonda comprende al menos un ribonucleótido en o cerca de un extremo 3' ligable.
Por tanto, se observará que una vez ligada, la sonda comprende al menos un ribonucleótido en o cerca de un sitio de ligación (o, más particularmente, en o cerca de uno o más sitios de ligación), cuya presencia durante la reacción de ligación mejora tanto la especificidad como la eficiencia de la ligación. De acuerdo con la invención, donde hay dos o más uniones de ligación, puede haber al menos un ribonucleótido en o cerca de una o más de estas. No es un requisito, pero se prefiere, que haya al menos un ribonucleótido en o cerca de cada unión de ligación. Por tanto, puede considerarse que el método de la invención proporciona medios para mejorar la ligación de una sonda principalmente de ADN mediante el uso de una molécula de ácido nucleico diana plantilla, por ejemplo, una molécula de ARN diana. Expresado de otra manera, los métodos de la invención pueden usarse para mejorar la detección de moléculas de ácido nucleico diana en una muestra. Significativamente, al proporcionar un producto de ligación que comprende no más de cuatro ribonucleótidos consecutivos, el método permite además que la amplificación del producto ligado continúe sin impedancia significativa.
Cualquiera de los nucleótidos en el sitio de ligación o cerca de este puede ser un ribonucleótido en oposición a un desoxirribonucleótido. El término “cerca de” en este contexto se refiere a posiciones dentro de 5 nucleótidos del sitio de ligación, es decir, los 5 nucleótidos 3' al sitio de ligación y los 5 nucleótidos 5' al sitio de ligación. En consecuencia, cualquiera de los ribonucleótidos dentro de 5 nucleótidos del sitio de ligación puede ser un ribonucleótido. Un ribonucleótido puede proporcionarse preferentemente en una posición dentro de 4 nucleótidos del sitio de ligación, o con mayor preferencia dentro de 3 nucleótidos de un sitio de ligación. En aún modalidades adicionales, un ribonucleótido puede estar dentro de 2 nucleótidos de un sitio de ligación. Por tanto, el nucleótido terminal y/o el penúltimo nucleótido en un extremo 3' o 5' ligable pueden ser un ribonucleótido. En determinadas modalidades, el penúltimo nucleótido en un extremo 3' o 5' ligable (preferentemente un extremo 3' ligable) puede ser un ribonucleótido.
En una modalidad preferida, el ribonucleótido puede estar en un extremo 3' o 5' ligable en un sitio de ligación. En este contexto el término “en” se refiere específicamente al nucleótido terminal en un extremo de un oligonucleótido, es decir, el nucleótido que proporciona el grupo hidroxilo o fosfato para la ligación. Por tanto, en una modalidad, la referencia a la sonda que comprende un ribonucleótido en el sitio de ligación se refiere al nucleótido 3' terminal de un extremo 3' ligable, o al nucleótido 5' terminal de un extremo 5' ligable, que es un ribonucleótido. Preferentemente, el extremo 3' ligable en un sitio de ligación es un ribonucleótido.
Más de un nucleótido en el sitio de ligación o cerca de este puede ser un ribonucleótido. En consecuencia, en determinadas modalidades, más de un ribonucleótido en el sitio de ligación o cerca de este (es decir, cualquiera de los 10 nucleótidos dentro de los 5 nucleótidos del sitio de ligación) pueden ser ribonucleótidos en combinación, siempre y cuando la sonda ligada comprenda no más de 4 ribonucleótidos consecutivos como se analiza en otra parte.
En una modalidad preferida, la sonda comprende el al menos un ribonucleótido en un extremo ligable de la sonda o una parte de esta. Preferentemente, la sonda comprende el al menos un ribonucleótido en el extremo 3' ligable en un sitio de ligación. En otras palabras, el nucleótido en un extremo 3' ligable de una sonda o parte de esta es preferentemente un ribonucleótido opuesto a un desoxirribonucleótido.
En determinadas modalidades, la sonda o parte de la sonda no comprende un ribonucleótido en o cerca del extremo 5' ligable en un sitio de ligación, y en particular no comprende un ribonucleótido en el extremo 5' ligable en un sitio de ligación. En determinadas modalidades, donde el extremo 5' ligable se proporciona por el extremo 5' de la sonda o parte de la sonda (es decir, donde el extremo 5' ligable no se genera por escisión de la sonda hibridada), el nucleótido terminal 5' de una sonda o parte de la sonda preferentemente no es un ribonucleótido. En otras palabras, en una modalidad preferida de la presente invención, el nucleótido en un extremo 5' ligable de la sonda o parte de esta es un desoxirribonucleótido. En tales modalidades, la ligación de un grupo hidroxilo 3' del nucleótido en un extremo 3' ligable de la sonda o parte de esta (ya sea un ribonucleótido o un desoxirribonucleótido) es a un desoxirribonucleótido 5'.
Como se describió de manera breve anteriormente, los extremos ligables descritos anteriormente que eventualmente forman el sitio de ligación deben estar en yuxtaposición directa e hibridados con sus respectivos pares de bases complementarios en la molécula de ácido nucleico diana para que tenga lugar la ligación. Sin embargo, los extremos ligables pueden ponerse en yuxtaposición para la ligación de varias maneras, en dependencia del diseño de la sonda y/o sus partes.
En una modalidad particular, el extremo 3' de la sonda o parte de esta es un extremo 3' ligable en el sitio de ligación. Por tanto, en tal modalidad, el extremo 3' ligable se proporciona en (o, expresado alternativamente, mediante) el extremo 3' de la sonda, o en otras palabras, la sonda hibrida con la molécula de ácido nucleico diana de manera que el extremo 3' de la sonda puede ligarse al extremo 5' ligable en el sitio de ligación.
Por tanto, en una modalidad preferida, la sonda comprende el al menos un ribonucleótido en o cerca de (pero preferentemente en) el extremo 3' de la sonda o una parte de esta. Por tanto, la sonda no solo puede comprender el al menos un ribonucleótido en o cerca del extremo 3' ligable en el sitio de ligación como se describió anteriormente, el extremo 3' de la sonda o una parte de esta misma puede ser el extremo 3' ligable como se describe en la presente descripción. En tal modalidad, por lo tanto, la sonda o parte de la sonda como se proporciona en la etapa (a) del método de la invención puede comprender en o cerca de su extremo 3' al menos un ribonucleótido, cuyo extremo se hibrida con una secuencia de ácido nucleico diana y es un extremo 3' ligable para la reacción de ligación de la etapa (b). En otras palabras, en tales modalidades, el nucleótido en el extremo 3' de la sonda o parte de esta participa en una reacción de ligación, y se liga a un extremo 5' ligable en un sitio de ligación durante el curso del método de detección.
En una modalidad adicional de la invención, el extremo 5' de la sonda es un extremo 5' ligable en el sitio de ligación. Por tanto, el extremo 5' ligable puede proporcionarse en el extremo 5' de la sonda o una parte de esta, o de otra manera, la sonda puede hibridar con la molécula de ácido nucleico diana de manera que el extremo 5' de la sonda o parte de esta puede ligarse al extremo 3' ligable en el sitio de ligación.
Por tanto, en una modalidad particular, ambos extremos ligables pueden proporcionarse en los extremos de la sonda o parte de la sonda, o en otras palabras la sonda puede hibridar con la molécula de ácido nucleico diana de manera que los extremos ligables de la sonda o partes de la sonda se yuxtaponen directamente para la ligación entre sí mediante el uso de la molécula de ácido nucleico diana como plantilla de ligación sin ninguna modificación o procesamiento adicional (por ejemplo, escisión o extensión) de la sonda. Dicho de otra manera, la sonda o cada parte de esta puede comprender el al menos un sitio de unión específico de la diana en su(s) extremo(s), de manera que cada extremo de la sonda (o sus partes) puede hibridar con sitios de unión de la sonda cognados adyacentes directamente en la molécula de ácido nucleico diana, de manera que se proporcionan los extremos ligables para la ligación. Dicho de otra manera, en determinadas modalidades, la etapa (b) puede consistir en una etapa de ligación sin que se requieran etapas adicionales para proporcionar extremos 5' y 3' de la sonda o partes de la sonda en yuxtaposición para la ligación.
Sin embargo, no se requiere que una sonda comprenda sitios de unión específicos de la diana en sus respectivos extremos que hibriden con secuencias cognadas en la molécula de ácido nucleico diana directamente adyacentes entre sí para llevar los extremos ligables como se describió anteriormente a la yuxtaposición para la ligación, y opcionalmente uno o ambos de los extremos ligables de la sonda solo pueden generarse en una o más etapas de procesamiento antes de que tenga lugar la ligación.
En una modalidad preferida de la presente invención, puede crearse un extremo 5' ligable de la sonda o parte de esta mediante escisión cuando la sonda hibrida con una molécula de ácido nucleico diana (es decir, mediante escisión de la sonda hibridada).
Por tanto, la sonda puede comprender una secuencia adicional 5' (o externamente) a la sonda o parte de la sonda que proporciona un extremo 5' ligable, de manera que el extremo 5' ligable de la sonda o parte de la sonda solo puede crearse una vez que dicha secuencia adicional se ha eliminado por escisión (escindido). Dicho de otra manera, la sonda o parte de la sonda puede comprender una secuencia adicional 5'. La sonda o parte de la sonda puede comprender por lo tanto un primer sitio de unión específico de la diana situado internamente del extremo 5' de la sonda o parte de la sonda, de manera que la porción de la sonda o parte de la sonda que hibrida con la molécula de ácido nucleico diana y a su vez proporciona el extremo 5' ligable en el sitio de ligación (es decir, el sitio de unión específico de la diana) comprende una secuencia adicional en su extremo 5' que no hibrida con la molécula de ácido nucleico diana. De esta manera, una vez que cualquier secuencia adicional situada 5' respecto al extremo 5' ligable de la sonda o parte de la sonda se ha eliminado por escisión, puede producirse la ligación de la sonda.
Esta secuencia adicional 5' respecto al primer sitio de unión específico de la diana que no hibrida con la molécula de ácido nucleico diana forma por lo tanto un colgajo 5', que puede eliminarse por escisión, para crear de esta manera el extremo 5' ligable de la sonda o parte de la sonda.
Se debe entender que en una sonda de múltiples partes (es decir, una sonda que comprende dos o más partes) puede formarse más de un colgajo 5'. Por ejemplo, en el caso de una sonda de dos partes (por ejemplo, una sonda tipo candado que comprende un oligonucleótido de la cadena principal y un oligonucleótido de brecha que híbrida con la diana entre los dos extremos hibridados del oligonucleótido de la cadena principal, como se describe más abajo), el extremo 5' del oligonucleótido de la cadena principal puede formar un colgajo 5'. En una modalidad adicional, el extremo 5' del oligonucleótido de brecha puede formar un colgajo 5', y en una modalidad aún adicional, los extremos 5' de los oligonucleótidos de la cadena principal y de brechas pueden formar ambos colgajos 5'. Además, una sonda tipo candado de múltiples partes puede comprender más de un oligonucleótido de brecha. Por tanto, dos o más oligonucleótidos de brechas pueden formar cada uno colgajos 5'.
Por tanto, después de la etapa (a), el método puede comprender una etapa de escindir cualquier sonda que haya hibridado con la molécula de ácido nucleico diana. Esta etapa elimina un colgajo 5' (o cualquiera) que se ha formado en la hibridación de la sonda o partes de la sonda con la molécula de ácido nucleico diana.
La etapa de escindir la sonda hibridada para eliminar un colgajo 5' puede realizarse mediante el uso de una enzima. Cualquier enzima capaz de llevar a cabo una reacción que elimina un colgajo 5' puede usarse en esta etapa, es decir, cualquier enzima capaz de escindir, degradar o digerir una secuencia monocatenaria 5' que no hibrida con una molécula de ácido nucleico diana, pero típicamente esta será una enzima con actividad nucleasa 5' y/o de escisión específica de la estructura.
Un colgajo 5' formado de esta manera puede ser reconocido por una enzima de escisión específica de la estructura, por ejemplo, una enzima capaz de reconocer la unión entre el saliente 5' monocatenario y un híbrido de ADN, y escindir el saliente monocatenario. Se debe entender que la estructura ramificada de tres hebras que es el sustrato para la enzima de escisión específica de la estructura puede formarse por el extremo 5' de una parte de la sonda y el extremo 3' de otra parte de la sonda cuando ambas han hibridado con la molécula de ácido nucleico diana, así como también por los extremos 5' y 3' de una sonda de una parte. Las enzimas adecuadas para dicha escisión incluyen endonucleasas de colgajos (FENS), que son una clase de enzimas que tienen actividad endonucleolítica y son capaces de catalizar la escisión hidrolítica del enlace fosfodiéster en la unión de ADN monocatenario y bicatenario. Por tanto, en una modalidad preferida, la escisión de la secuencia adicional 5' con respecto al primer sitio de unión específico de la diana se realiza mediante una enzima de escisión específica de la estructura, por ejemplo, una endonucleasa de colgajo. En modalidades preferidas, la enzima puede ser una enzima FEN1 de arqueas, natural o recombinante, deP. furiosus (Pfu), A. fulgidus (Afu), M. jannaschii (Mja)oM. thermoautotrophicum (Mth),por ejemplo, como se describió en Ma y otros 2000. JBC 275, 24693-24 700.
En otras modalidades, una enzima que puede reconocer y degradar un oligonucleótido monocatenario que tiene un extremo 5' libre puede usarse para escindir una secuencia adicional (colgajo 5') de una estructura como se describió anteriormente. Por tanto, una enzima que tiene actividad nucleasa 5' puede usarse para escindir una secuencia adicional 5'. Dicha actividad nucleasa 5' puede ser actividad exonucleasa 5' y/o endonucleasa 5'. Una enzima nucleasa 5' es capaz de reconocer un extremo 5' libre de un oligonucleótido monocatenario y degradar dicho oligonucleótido monocatenario. Una exonucleasa 5' degrada un oligonucleótido monocatenario que tiene un extremo 5' libre al degradar el oligonucleótido en mononucleótidos constituyentes a partir de su extremo 5'. Una actividad de endonucleasa 5' puede escindir la secuencia del colgajo 5' internamente en uno o más nucleótidos. Además, una actividad nucleasa 5' puede tener lugar cuando la enzima recorre el oligonucleótido monocatenario hacia una región de doble hebra una vez que ha reconocido el extremo 5' libre, y escinde la región monocatenaria en nucleótidos constituyentes más grandes (por ejemplo, dinucleótidos o trinucleótidos), o escinde la región monocatenaria 5' completa, por ejemplo, como se describió en Lyamichev y otros, 1999. PNAS 96, 6143-6148, para la ADN polimerasaTaqy la nucleasa 5' de esta. Las enzimas preferidas que tienen actividad nucleasa 5' incluyen la exonucleasa VIII, o una enzima ADN polimerasa natural o recombinante deThermus aquaticus(Taq),Thermus thermophilusoThermus flavus, o su dominio nucleasa.
En determinadas modalidades donde una sonda o parte de la sonda comprende una secuencia adicional en su extremo 5' como se describió anteriormente, uno o más de los nucleótidos dentro de la secuencia adicional pueden ser complementarios a nucleótidos cognados en la molécula de ácido nucleico diana, pero pueden no hibridar con la molécula de ácido nucleico diana simultáneamente con un extremo 3' ligable de la sonda o de una parte de la sonda (que puede ser una parte de la sonda diferente, como se indicó anteriormente). En particular, uno o más nucleótidos en el extremo 3' de dicha secuencia adicional (es decir, en el extremo 3' del colgajo 5') pueden ser complementarios a nucleótidos cognados en la molécula de ácido nucleico diana de esta manera. Como no pueden hibridar con la molécula de ácido nucleico diana, y el extremo 3' ligable de la sonda o una parte de la sonda evita que lo hagan, puede considerarse que la secuencia adicional forma un colgajo desplazado, y los nucleótidos dentro de dicha secuencia adicional complementarios a nucleótidos cognados en la molécula de ácido nucleico diana pueden considerarse nucleótidos desplazados o bases desplazadas.
Por tanto, en una modalidad preferida, uno o más nucleótidos en el extremo 3' de la secuencia adicional (es decir, en el extremo de la secuencia adicional más cercana al primer sitio de unión a la diana) son complementarios a nucleótidos cognados en la molécula de ácido nucleico diana, en donde dichos nucleótidos no pueden hibridar con la molécula de ácido nucleico diana simultáneamente con el extremo 3' ligable de la sonda o con un extremo 3' ligable de otra parte de la sonda. En otras palabras, la unión de uno o más de los nucleótidos en el extremo 3' de la secuencia adicional a la molécula de ácido nucleico diana puede evitarse por un extremo 3' ligable, o puede pensarse que están desplazados de la molécula de ácido nucleico diana. Por tanto, estos nucleótidos pueden denominarse como un nucleótido desplazado.
Se requiere la eliminación de cualquiera de tales secuencias adicionales por escisión antes de que pueda tener lugar la ligación de las sondas. Por tanto, puede considerarse que las sondas que tienen dicha secuencia adicional en su (o un) extremo 5' (es decir, sondas en las que el primer sitio de unión específico de la diana se sitúa internamente del extremo 5' de la sonda o parte de la sonda) necesitan activarse (es decir mediante escisión) antes de la ligación.
Sorprendentemente, se ha encontrado que la presencia de un ribonucleótido en la secuencia adicional 5' de una sonda, en particular en el extremo 3' de dicha secuencia adicional 5' (es decir, el nucleótido más 3' de la secuencia adicional, mejora la eficiencia de eliminación (es decir, de escisión) de la secuencia adicional, tanto para las moléculas de ácido nucleico diana de ADN como de ARN. Este efecto se observa particularmente en las llamadas reacciones de escisión invasiva, descritas con mayor detalle más abajo. La secuencia adicional descrita anteriormente puede, por lo tanto, en determinadas modalidades, comprender uno o más ribonucleótidos. En determinadas modalidades de la presente invención, uno o más de los nucleótidos en el extremo 3' de la secuencia adicional 5' pueden ser un ribonucleótido. Más particularmente, uno o más nucleótidos en el extremo 3' de la secuencia adicional 5' que son complementarios a nucleótidos cognados en la molécula de ácido nucleico diana como se describió anteriormente (es decir, nucleótido desplazado como se describió anteriormente) pueden ser un ribonucleótido. En una modalidad particular, la secuencia adicional puede consistir completamente en ribonucleótidos.
La potenciación de la escisión de una secuencia adicional 5' de una sonda está separada de la potenciación de la eficiencia de ligación resultante de tener un ribonucleótido situado en o cerca de un sitio de ligación en una sonda de ADN-ARN quimérica. Por tanto, el efecto descrito anteriormente también puede observarse en una sonda que, después de la escisión, no comprende un ribonucleótido en o cerca de un sitio de ligación.
En otro aspecto, la presente invención proporciona por lo tanto un método para detectar una secuencia de ácido nucleico diana en una molécula de ácido nucleico diana en una muestra, dicho método comprende:
(a) poner en contacto dicha muestra con una sonda tipo candado y permitir que dicha sonda hibride con la molécula de ácido nucleico diana;
(b) someter dicha muestra a una reacción de ligación mediante el uso de una ADN/ARN ligasa para ligar, y de esta manera circularizar, dicha sonda que ha hibridado con la molécula nucleica diana;
(c) amplificar la sonda circularizada ligada de la etapa (b) mediante la amplificación en círculo rodante (RCA) con una ADN polimerasa; y
(d) detectar el producto de RCA, detectando de esta manera la secuencia de ácido nucleico diana;
en donde la sonda tipo candado se proporciona en una o más partes, cada parte tiene al menos un sitio de unión específico de la diana que es complementario a un sitio de unión a la sonda cognado en o adyacente a la secuencia de ácido nucleico diana e hibrida con la molécula de ácido nucleico diana, en donde un primer sitio de unión específico de la diana de la sonda o al menos un sitio de unión específico de la diana de una parte de la sonda se sitúa internamente del extremo 5' de la sonda o parte de la sonda, de manera que después de la hibridación de la sonda o parte de la sonda con la molécula de ácido nucleico diana, la sonda o parte de la sonda comprende una secuencia adicional 5' respecto al sitio de unión específico de la diana que no hibrida con la molécula de ácido nucleico diana y forma un colgajo 5', en donde uno o más de los nucleótidos en o cerca del extremo 3' de la secuencia adicional 5' es un ribonucleótido, y en donde después de una etapa de escindir la sonda hibridada para eliminar el colgajo 5', y opcionalmente después de una etapa de extender su extremo 3' mediante el uso de la molécula de ácido nucleico diana como plantilla, los extremos ligables de la sonda o partes de la sonda se yuxtaponen para la ligación entre sí mediante el uso de la molécula de ácido nucleico diana como plantilla de ligación, para crear un sitio de ligación en o adyacente a la secuencia de ácido nucleico diana; y
en donde dicha sonda comprende al menos un ribonucleótido en el sitio de ligación o cerca de este después de dicha etapa de escisión, y opcionalmente después de dicha etapa de extensión, y la sonda circularizada ligada se compone principalmente de ADN y comprende no más de 4 ribonucleótidos consecutivos.
En particular, el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional 5' puede ser un ribonucleótido. Opcionalmente, uno o más nucleótidos cerca del extremo 3' de la secuencia adicional 5' también pueden ser ribonucleótidos.
De acuerdo con la invención, la secuencia de ácido nucleico diana es una secuencia de ARN diana, y la molécula diana es una molécula de ARN diana. Como se analizó anteriormente, este método de este aspecto de la invención también puede usarse para detectar más de una secuencia diana, que incluye en más de una molécula diana, y puede comprender detectar tanto secuencias diana de ARN como de ADN en moléculas diana de ARN y ADN (por ejemplo, en la misma muestra).
En otro aspecto, la presente invención proporciona por lo tanto una sonda para usar en tal método. Este aspecto de la invención proporciona una sonda de<a>DN-ARN quimérica capaz de unirse a y detectar una secuencia de ácido nucleico diana en una molécula de ácido nucleico diana, en donde:
(i) la sonda comprende una o más partes, cada una de las cuales tiene al menos un sitio de unión específico de la diana que es complementario a un sitio de unión a la sonda cognado en o adyacente a la secuencia de ácido nucleico diana e hibrida con la molécula de ácido nucleico diana, en donde un primer sitio de unión específico de la diana de la sonda o un sitio de unión específico de la diana de una parte de la sonda es interno al extremo 5' de la sonda o una parte de la sonda, y la sonda o parte de la sonda comprende una secuencia adicional 5' a dicho sitio de unión específico de la diana, de manera que cuando la sonda o parte de la sonda hibrida con la molécula de ácido nucleico diana, la secuencia adicional forma un colgajo 5' que no hibrida con la molécula de ácido nucleico diana, y que puede eliminarse por escisión para generar un extremo 5' ligable que puede ligarse al extremo 3' de la sonda o una parte de la sonda, en donde la secuencia adicional contiene uno o más ribonucleótidos (preferentemente en su extremo 3'), de manera que después de una etapa de escisión de la sonda o parte de la sonda hibridada y opcionalmente después de una etapa de extender un extremo 3' de la misma mediante el uso de la molécula de ácido nucleico diana como una plantilla, los extremos ligables de la sonda o partes de la sonda se yuxtaponen para la ligación entre sí mediante el uso de la molécula de ácido nucleico diana como una plantilla de ligación, para crear uno o más sitios de ligación en la secuencia de ácido nucleico diana o adyacentes a ella, en donde la ligación en dichos sitios de ligación circulariza la sonda;
(ii) la sonda comprende al menos un ribonucleótido en o cerca de un sitio de ligación; y
(iii) la sonda cuando se liga para formar un círculo se compone principalmente de ADN y comprende no más de 4 ribonucleótidos consecutivos.
En una modalidad preferida, el nucleótido en el extremo 3' de cualquier secuencia adicional que forma un colgajo 5' es complementario al mismo nucleótido cognado en la molécula de ácido nucleico diana que el nucleótido en el extremo 3' de la sonda. Por tanto, uno o más nucleótidos en el extremo 3' de cualquier secuencia adicional (es decir, en el extremo de la secuencia adicional más cercana al primer sitio de unión a la diana) pueden ser complementarios a nucleótidos cognados en la molécula de ácido nucleico diana, en donde dichos nucleótidos no son capaces de hibridar con la molécula de ácido nucleico diana simultáneamente con el extremo 3' ligable de la sonda o con un extremo 3' ligable de otra parte de la sonda.
Tal sonda puede ser opcionalmente una sonda tipo candado de una parte o dos (o más) partes, o una sonda que comprende dos o más partes como se define en otra parte en la presente descripción, excepto que no comprende un ribonucleótido en o cerca de un sitio de ligación.
Las sondas que tienen secuencias adicionales 5' que es necesario eliminar por escisión antes de la ligación se conocen bien en la técnica, por ejemplo, en la forma de sondas Invader para usar en un ensayo Invader. Un ensayo Invader de la técnica típicamente comprende el uso de una primera y segunda sondas que tienen sitios de unión específicos de la diana, en donde la primera sonda comprende un primer sitio de unión a la diana situado internamente del extremo 5' de la sonda. En tal ensayo, la primera y segunda sondas se diseñan típicamente para ser complementarias y capaces de hibridar a sitios de unión cognados en una molécula de ácido nucleico diana, de manera que la primera sonda hibrida con una porción 5' de la molécula de ácido nucleico diana, y la segunda sonda hibrida a una porción 3' de la molécula de ácido nucleico diana directamente en yuxtaposición a la primera sonda, y evita que el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional de la primera sonda hibride con la molécula de ácido nucleico diana. Dicho de otra manera, en un ensayo Invader el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional 5' es un nucleótido desplazado como se describió anteriormente. Dado que se evita que el extremo 3' de la secuencia adicional de la primera sonda hibride con la molécula de ácido nucleico diana mediante una segunda sonda, y la secuencia adicional 5' se escinde subsecuentemente, dichos métodos también se conocen como reacciones de escisión invasiva.
Por tanto, las sondas de la invención pueden ser sondas invasoras. Dichas sondas son de particular utilidad en la detección de polimorfismos de un solo nucleótido. El método de detección de la presente invención puede usarse, por lo tanto, en la detección de un polimorfismo de un solo nucleótido, o de hecho cualquier base variante, en la secuencia de ácido nucleico diana. Las sondas para usar en dicho método pueden diseñarse de manera que el extremo ligable 3' de la sonda sea complementario y capaz de hibridar con el nucleótido en la molécula diana que es de interés (el nucleótido variante), y el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional 5' en el extremo 5' de la sonda o en el extremo 5' de otra parte diferente de la sonda es complementario al dicho mismo nucleótido, pero se impide que hibride con él mediante un extremo ligable 3' (es decir, es un nucleótido desplazado como se describió anteriormente). La escisión de la sonda para eliminar la secuencia adicional proporciona un extremo ligable 5', que puede ligarse al extremo ligable 3' de la sonda o parte de la sonda si el extremo ligable 3' hibrida correctamente (es decir, es complementario) a la molécula de ácido nucleico diana. Las sondas diseñadas de acuerdo con este principio proporcionan un grado elevado de discriminación entre diferentes variantes en la posición de interés, ya que solo las sondas en las que el extremo ligable 3' es complementario al nucleótido en la posición de interés pueden participar en una reacción de ligación. En una modalidad, la sonda se proporciona en una sola parte, y los extremos ligables 3' y 5' se proporcionan por la misma sonda.
Recientemente, se ha demostrado que un diseño alternativo para sondas Invader proporciona resultados comparables al diseño descrito anteriormente (Krzywkowski y otros 2017. Nucleic Acids Research 45, e161). Aunque este diseño se describe específicamente en el contexto de un ensayo Invader que utiliza una sonda tipo candado, (una sonda “tipo candado invasora” (iLock) como se describe con mayor detalle a continuación), ciertas características de tales sondas pueden aplicarse a las sondas Invader en general.
En este diseño alternativo, la sonda (que en el contexto de una sonda iLock se proporciona como una sonda que tiene una parte) se diseña de manera que el nucleótido 3' del sitio de unión específico de la diana 3' en la sonda tipo candado (un segundo sitio de unión específico de la diana como se describe en la presente descripción) es complementario y capaz de hibridar con el nucleótido en la molécula de ácido nucleico diana 3' del nucleótido de interés (es decir, al nucleótido que es inmediatamente 3' con respecto al nucleótido variante), y el nucleótido 5' del sitio de unión específico de la diana 5' en la sonda tipo candado (un primer sitio de unión específico de la diana como se describe en la presente descripción) es complementario y capaz de hibridar con el nucleótido que es de interés en la molécula de ácido nucleico diana (es decir, con el nucleótido variante). Tales sondas comprenden una secuencia adicional 5' respecto al primer sitio de unión específico de la diana, de manera que el primer sitio de unión específico de la diana se sitúa internamente del extremo 5' de la sonda. El nucleótido más hacia el extremo 3' de la secuencia adicional es complementario al nucleótido en la molécula de ácido nucleico diana 3' del nucleótido de interés (es decir, inmediatamente 3' al nucleótido de interés/nucleótido variante), pero se evita que hibride con la molécula de ácido nucleico diana por el extremo 3' ligable de la sonda (es decir, el segundo sitio de unión específico de la diana), y por lo tanto es un nucleótido desplazado. Como se analizó anteriormente, puede proporcionarse un diseño de sonda análogo en el que diferentes partes de la sonda proporcionan los sitios de unión específicos de la diana 5' y 3'.
Por tanto, más generalmente, pueden diseñarse sondas de manera que el extremo 3' ligable de la sonda o de una parte de la sonda es complementario y capaz de hibridar con el nucleótido en la molécula diana 3' del nucleótido de interés (el nucleótido variante), y el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional 5' de la sonda, o en el extremo 5' de otra parte diferente de la sonda, es complementario al nucleótido 3' del nucleótido de interés (el nucleótido que es inmediatamente 3' al nucleótido variante), pero se evita que hibride con él mediante un extremo 3' ligable de la sonda o parte de la sonda. La escisión para eliminar la secuencia adicional proporciona un extremo ligable 5', que puede ligarse al extremo ligable 3' de la sonda o parte de la sonda si el extremo ligable 5' se hibrida correctamente (por ejemplo, es complementario) a la molécula de ácido nucleico diana. Las sondas diseñadas de acuerdo con este principio proporcionan un grado elevado de discriminación entre diferentes variantes en la posición de interés, ya que solo las sondas en las que el extremo ligable 5' es complementario al nucleótido en la posición de interés pueden participar en una reacción de ligación. Como se describió anteriormente, en una modalidad, la sonda se proporciona en una sola parte, y la misma sonda proporciona los extremos ligables 3' y 5'.
En consecuencia, en determinadas modalidades, los métodos de la presente invención pueden ser para la detección de una base variante en una molécula de ácido nucleico diana. En particular, las sondas de acuerdo con cualquiera de los diseños “Invader” mencionados anteriormente pueden ser de particular utilidad en la detección de una base variante en una molécula de ácido nucleico diana.
En tales sondas invasoras que crean un colgajo 5', en algunas modalidades se prefiere, como se indicó anteriormente, que uno o más nucleótidos en o cerca del extremo 3' de la secuencia adicional (que crea el colgajo 5') sean ribonucleótidos. Más particularmente el, o al menos el nucleótido más hacia 3' de la secuencia adicional (o en otras palabras el nucleótido terminal 3' del colgajo 5' escindido) es un ribonucleótido.
Las sondas de tipo invasor se proporcionan como sondas tipo candado que pueden componerse de una o más partes, como se describe más abajo. Por tanto, la sonda tipo candado puede ser un candado de una parte que hibrida con la molécula de ácido nucleico diana para formar una estructura “ invasora”, o puede comprender dos o más partes que hibridan para formar una o más estructuras “invasoras” con un colgajo 5' para la escisión.
En una modalidad representativa específica, la sonda para usar en tal método es una sonda tipo candado proporcionada como un único oligonucleótido circularizable que comprende un primer sitio de unión específico de la diana situado internamente del extremo 5' de la sonda y un segundo sitio de unión específico de la diana situado en el extremo 3' de la sonda, de manera que después de la hibridación de la sonda con la molécula de ácido nucleico diana la sonda comprende una secuencia adicional 5' respecto al primer sitio de unión específico de la diana que no hibrida con la molécula de ácido nucleico diana, en donde el nucleótido en el extremo 3' de la sonda es un ribonucleótido y en donde el nucleótido en el extremo 3' de la sonda y el extremo 3' de la secuencia adicional son complementarios al mismo nucleótido, en donde cuando el nucleótido en el extremo 3' de la sonda y el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional son complementarios a la base variante, el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional no es capaz de hibridar con la molécula de ácido nucleico diana simultáneamente con el extremo 3' de la sonda y dicha secuencia adicional se elimina mediante escisión para generar de esta manera el extremo 5' ligable de la sonda, y en donde cuando el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional y el nucleótido en el extremo 3' de la sonda no son complementarios a la base variante, el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional se elimina mediante escisión y el nucleótido en el extremo 3' de la sonda no hibrida con la molécula de ácido nucleico diana, evitando de esta manera la ligación.
En otra modalidad representativa específica, la sonda es un único oligonucleótido circularizable que comprende un primer sitio de unión específico de la diana situado internamente del extremo 5' de la sonda y un segundo sitio de unión específico de la diana situado en el extremo 3' de la sonda, de manera que después de la hibridación de la sonda con la molécula de ácido nucleico diana la sonda comprende una secuencia adicional 5' respecto al primer sitio de unión específico de la diana que no hibrida con la molécula de ácido nucleico diana, en donde el nucleótido en el extremo 3' de la sonda es un ribonucleótido, y en donde el nucleótido en el extremo 3' de la sonda y el extremo 3' de la secuencia adicional son complementarios al mismo nucleótido, en donde el nucleótido en el extremo 3' de la sonda y el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional son complementarios al nucleótido en la posición 3' de la base variante y en donde el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional no es capaz de hibridar con la molécula de ácido nucleico diana simultáneamente con el extremo 3' de la sonda, en donde cuando el nucleótido en el extremo 5' del primer sitio de unión específico de la diana es complementario a la base variante, dicha secuencia adicional se elimina mediante escisión para generar de esta manera el extremo ligable 5' de la sonda, y en donde cuando el nucleótido en el extremo 5' del primer sitio de unión específico de la diana no es complementario a la base variante, dicho nucleótido también se elimina mediante escisión, para de esta manera generar una brecha entre los extremos ligables 5' y 3' y evitar la ligación.
En otras modalidades, tales sondas tipo candado invasoras pueden proporcionarse de manera análoga en dos o más partes, por ejemplo, que comprenden un oligonucleótido de la cadena principal y uno o más oligonucleótidos de brechas, como se describe más abajo.
En determinadas modalidades, la sonda puede diseñarse para unirse a dos o más secuencias no contiguas dentro de la molécula de ácido nucleico diana. Dicho de otra manera, la sonda, o dos partes de la sonda, pueden hibridar con la molécula de ácido nucleico diana con una brecha entre los respectivos sitios de unión específicos de la diana de la sonda o partes de la sonda. Cuando los extremos de la sonda o partes de la sonda han hibridado para dejar una brecha, esta puede llenarse al extender el extremo 3' hibridado de la sonda antes de la ligación al extremo 5', mediante el uso de la molécula de ácido nucleico diana como plantilla para la extensión. Una vez que el extremo 3' de la sonda se ha extendido para estar adyacente al extremo ligable 5', los dos extremos pueden unirse mediante una reacción de ligación. De esta manera, un extremo 3' ligable de la sonda puede generarse por extensión.
Tal modalidad de llenado de brechas por extensión puede ser de particular utilidad en la detección de una secuencia de ácido nucleico diana altamente variable, ya que un complemento de la secuencia de ácido nucleico diana se incorpora en una sonda ligada. Por tanto, después de la amplificación, la detección de la sonda ligada amplificada (por ejemplo, mediante secuenciación) permite determinar la secuencia de la secuencia de ácido nucleico diana. En modalidades adicionales, dicho llenado de brechas por extensión puede combinarse con la característica de generar un extremo 5' ligable mediante la escisión de un colgajo 5'. Por tanto, la extensión para llenado de brechas también puede usarse para generar, o proporcionar, un extremo 3' ligable en el contexto de una sonda de tipo invasora.
La modalidad de “ llenado de brechas por extensión” descrita anteriormente requiere la incorporación de nucleótidos en un producto de extensión, y por lo tanto en tales modalidades se requiere una mezcla de trifosfatos de nucleósidos en la mezcla de reacción para que tenga lugar la extensión. En determinadas modalidades, uno o más de los trifosfatos de nucleósidos (uno, dos, tres o los cuatro trifosfatos de nucleósidos) (nATP, nGTP, nCTP, dTTP/rUTP) proporcionados pueden ser trifosfatos de ribonucleósidos. Esto puede permitir que al menos un ribonucleótido se incorpore en el extremo 3' ligable durante el curso de la extensión del extremo 3' de una sonda. Por tanto, en una modalidad, tres de las moléculas de trifosfato de nucleósido proporcionadas pueden ser trifosfatos de desoxirribonucleósidos, y la cuarta molécula de trifosfato de nucleósido puede ser un trifosfato de ribonucleósido. Preferentemente, el(los) trifosfato(s) de nucleósidos que se proporcionan como un trifosfato de ribonucleósido pueden seleccionarse de manera que el nucleótido en o cerca del extremo 3' del producto de extensión resultante después de la polimerización (por ejemplo, el nucleótido terminal 3' del extremo 3' ligable en el sitio de ligación) es un ribonucleótido, basado en el conocimiento de la secuencia de la molécula de ácido nucleico diana. A modo de ejemplo representativo, si se conoce que el nucleótido en el extremo 5' de la brecha entre dos partes de una sonda es “G”, puede usarse una mezcla de trifosfatos de nucleósidos que comprenden rCTP, para proporcionar de esta manera un nucleótido rCTP en el extremo 3' ligable de la sonda extendida.
En algunas modalidades donde la sonda o una parte de esta se extiende para proporcionar un extremo 3' ligable, la sonda (o parte) que se proporciona e hibrida con la molécula de ácido nucleico diana puede estar compuesta completamente de ADN, y los ribonucleótidos pueden introducirse por extensión como se describió anteriormente. Por tanto, en tal modalidad, una sonda de ADN puede proporcionarse e hibridar con la molécula diana, y la sonda ligable que hibrida con la molécula de ácido nucleico diana puede convertirse en una sonda de ADN-ARN quimérica en virtud de la etapa de extensión. En otras palabras, en los métodos de la invención, la sonda ligable que hibrida con la molécula diana con extremos 5' y 3' ligables en yuxtaposición para la ligación (es decir, lista para la ligación) es una sonda de ADN-ARN quimérica.
En modalidades en las que se introducen ribonucleótidos en la sonda ligable mediante una reacción de extensión, los ribonucleótidos pueden introducirse en o cerca del extremo 3' ligable, por ejemplo, los nucleótidos 3' terminales y/o penúltimos de la secuencia extendida pueden ser ribonucleótidos, y/o la reacción de extensión puede introducir 5 o menos nucleótidos, o no más de 4 nucleótidos.
Cualquier enzima polimerasa conveniente que pueda usar ARN como plantilla para la extensión, preferentemente una polimerasa no desplazante, puede usarse para realizar la extensión de "llenado de brechas" descrita anteriormente, que incluye enzimas tanto a Rn polimerasas como ADN polimerasas. Por tanto, una ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP), y/o una ADN polimerasa dependiente de ARN (RdDP) (por ejemplo, una enzima transcriptasa inversa) puede usarse en la modalidad de 'llenado de brechas' descrita anteriormente.
En una modalidad preferida, la polimerasa puede ser capaz de incorporar residuos de ADN y ARN en un producto de extensión mediante el uso de una plantilla de ARN, por ejemplo, la ADN polimerasa gamma mitocondrial humana mutada que comprende las sustituciones E895A o E895G, que sorprendentemente se ha encontrado que incorpora trifosfatos de nucleósidos de rNTP y dNTP en un producto de extensión (Kasiviswanathan y otros 2011. JBC 286, 31 490-31 500).
La sonda usada en los métodos de detección descritos en la presente descripción se proporciona en una o más partes, cada parte de las cuales comprende al menos un sitio de unión específico de la diana que es complementario a un sitio de unión a la sonda cognado en o adyacente a la secuencia de ácido nucleico diana en la molécula de ácido nucleico diana. Por tanto, la sonda (o cada parte de esta) es capaz de hibridar con la molécula de ácido nucleico diana. La sonda o partes de la sonda hibridan con la molécula de ácido nucleico diana de tal manera que sus extremos se yuxtaponen para la ligación entre sí mediante el uso de la molécula de ácido nucleico diana como una plantilla de ligación, opcionalmente después de una etapa de escisión de la sonda hibridada y/o extensión del extremo 3' de la misma mediante el uso de la molécula de ácido nucleico diana como una plantilla. Por tanto, la reacción de ligación de la etapa (b) del método de detección de la presente invención comprende la formación de al menos un enlace fosfodiéster entre los extremos 3' y 5' ligables respectivos de sondas adyacentes o partes de una sonda hibridadas a la molécula de ácido nucleico diana.
En determinadas modalidades, la sonda puede proporcionarse en dos o más partes, cada una de las cuales tiene al menos un sitio de unión específico de la diana complementario a un sitio de unión a la sonda cognado en la molécula de ácido nucleico diana. Por tanto, en una modalidad, la sonda puede proporcionarse en dos partes, cada parte de las cuales comprende un sitio de unión específico de la diana, y la ligación en la etapa (b) comprende la ligación del extremo 3' ligable de una parte de la sonda al extremo 5' ligable de la otra. Como se describió con mayor detalle anteriormente, los respectivos extremos ligables de las sondas pueden generarse por escisión y/o extensión antes de la ligación.
En otras modalidades de la invención, la sonda puede proporcionarse en dos o más partes, por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o más partes, que crean dos o más uniones de ligación. Cada parte de la sonda puede proporcionar (es decir, formar o comprender) extremos ligables 3' y/o 5' que pueden yuxtaponerse para la ligación y ligarse en la etapa (b) de los métodos de detección de la presente invención como se describió anteriormente. En determinadas modalidades, la etapa (b) puede, por lo tanto, comprender dos o más reacciones de ligación separadas, es decir, entre extremos ligables adyacentes proporcionados por las dos o más partes de una sonda.
Por tanto, la sonda puede proporcionarse en más de dos partes, por ejemplo, en tres partes, cada una de las cuales tiene al menos un sitio de unión específico de la diana complementario a un sitio de unión a la sonda cognado en la molécula de ácido nucleico diana. En tal modalidad, la ligación en la etapa (b) comprende la ligación del extremo 5' ligable de una primera parte de la sonda al extremo 3' ligable de la segunda parte de la sonda, y la ligación del extremo 5' ligable de la segunda parte de la sonda al extremo 3' ligable de una tercera parte de la sonda.
En modalidades particulares, una o más partes de una sonda proporcionada en más de dos partes pueden ser un oligonucleótido para la secuenciación mediante ligación. En el contexto de la presente invención, la secuenciación por ligación permite la detección de una molécula de ácido nucleico diana que tiene una secuencia desconocida (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico diana) que está flanqueada en al menos un extremo por una secuencia conocida, lo que permite de esta manera que se determine dicha secuencia desconocida. Una o más de las partes de una sonda como se describe en la presente descripción tienen cada una un sitio de unión específico de la diana complementario a un sitio de unión específico de la sonda cognado en o adyacente a la secuencia desconocida en la molécula de ácido nucleico diana, y puede comprender además en su extremo 5' y/o 3' un nucleótido que es complementario a un nucleótido particular en la secuencia desconocida. Las partes de la sonda solo pueden ligarse cuando hibridan correctamente con el nucleótido en la secuencia desconocida, y por lo tanto la detección posterior de un producto de ligación amplificado puede permitir que se determine la secuencia de ácido nucleico diana. En una modalidad particular, en el contexto de una sonda tipo candado de múltiples partes, uno o más oligonucleótidos de brechas (como se describe más abajo) pueden ser un oligonucleótido para la secuenciación mediante ligación.
Como se analizó brevemente anteriormente, la sonda usada en el método de detección de la presente invención es una sonda tipo candado que comprende una o más partes que se unen entre sí para formar un círculo, opcionalmente después de una etapa de escisión. En una modalidad típica, una sonda tipo candado puede comprender un oligonucleótido lineal monocatenario (un oligonucleótido de la cadena principal) que comprende dos sitios de unión específicos de la diana complementarios a sitios de unión a la sonda cognados en una molécula de ácido nucleico diana conectados por una secuencia que no es complementaria al ácido nucleico diana (una cadena principal o enlazador), y puede proporcionar por lo tanto (opcionalmente después de la escisión y/o extensión como se analizó anteriormente) extremos ligables 3' y 5' para una reacción de ligación. Los extremos 5' y 3' de una sonda tipo candado pueden, por lo tanto, participar en una o más reacciones de ligación mediante el uso de la molécula de ácido nucleico diana como una plantilla de ligación, para formar de esta manera una molécula de ADN-ARN circular.
En determinadas modalidades, puede proporcionarse una sonda tipo candado como un único oligonucleótido circularizable que comprende un primer sitio de unión específico de la diana en el extremo 5' de la sonda o internamente a este y un segundo sitio de unión específico de la diana en el extremo 3' de la sonda, en donde el primer y segundo sitios de unión específicos de la diana forman o constituyen los extremos ligables 5' y 3' de la sonda, respectivamente.
En tales modalidades, la ligación puede ser directa, es decir, los extremos 5' y 3' de la sonda tipo candado pueden hibridar con la molécula de ácido nucleico diana directamente adyacente entre sí, de manera que el extremo 3' de la sonda tipo candado se liga al extremo 5' ligable de la sonda tipo candado, para formar de esta manera un producto de ligación circular. Alternativamente, en tales modalidades, los extremos 5' y 3' de la sonda tipo candado pueden hibridar con la molécula de ácido nucleico diana con una brecha entre sus sitios de unión específicos de la diana, y el extremo 3' de la sonda puede extenderse como se describe en otra parte en la presente descripción para proporcionar el extremo 3' ligable de la sonda para la ligación al extremo 5' ligable de la sonda tipo candado.
Una sonda tipo candado proporcionada como un único oligonucleótido circularizable puede comprender opcionalmente una secuencia adicional 5' respecto a su sitio de unión específico de la diana 5', cuya secuencia adicional puede escindirse para proporcionar un extremo 5' ligable en un sitio de ligación. Por tanto, en una modalidad particular, la sonda puede ser un único oligonucleótido circularizable que comprende un primer sitio de unión específico de la diana situado internamente del extremo 5' de la sonda y un segundo sitio de unión específico de la diana situado en el extremo 3' de la sonda, de manera que después de la hibridación de la sonda con la molécula de ácido nucleico diana la sonda comprende una secuencia adicional 5' respecto al primer sitio de unión específico de la diana que no hibrida con la molécula de ácido nucleico diana, en donde el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional es un ribonucleótido que es complementario al nucleótido cognado en la molécula de ácido nucleico diana pero no es capaz de hibridar con la molécula de ácido nucleico diana simultáneamente con el extremo 3' ligable de la sonda, en donde dicha secuencia adicional se elimina mediante escisión para crear de esta manera el extremo ligable 5' de la sonda.
Alternativamente, una sonda tipo candado puede proporcionarse en dos o más partes, es decir, como dos o más oligonucleótidos, dichos oligonucleótidos se ligan para formar un oligonucleótido circular. Un primer oligonucleótido puede comprender un primer sitio de unión específico de la diana en su extremo 5' o internamente a este y un segundo sitio de unión específico de la diana en su extremo 3', y puede hibridar con la molécula de ácido nucleico diana con una brecha entre sus sitios de unión específicos de la diana. Sin embargo, en lugar de extender el extremo 3' de la sonda tipo candado para proporcionar el extremo 3' ligable para la ligación, puede proporcionarse un segundo oligonucleótido (y opcionalmente un tercer, cuarto, etc. oligonucleótidos), que comprende un sitio(s) de unión específico de la diana complementario a un sitio de unión a la sonda cognado en la molécula de ácido nucleico diana situado entre los respectivos sitios de unión a la sonda cognados respectivos para el primer y segundo sitios de unión específicos de la diana. La circularización de la sonda tipo candado en tal modalidad comprende la ligación de los extremos ligables 5' y 3' del primer oligonucleótido a los extremos ligables 3' y 5' de estos oligonucleótidos (por ejemplo, a los extremos ligables 3' y 5', respectivamente de un segundo oligonucleótido). En tales modalidades, el segundo oligonucleótido y los oligonucleótidos posteriores pueden considerarse oligonucleótidos de brechas. Por tanto, puede considerarse que una sonda tipo candado proporcionada en dos o más partes comprende un oligonucleótido de la cadena principal (es decir, el oligonucleótido que comprende el primer y segundo sitios de unión específicos de la diana) y uno o más oligonucleótidos de brechas.
Uno o más oligonucleótidos de brechas pueden usarse en la secuenciación por ligación como se describió anteriormente.
En determinadas modalidades, una sonda tipo candado (o más particularmente el oligonucleótido de la cadena principal de una sonda tipo candado) puede proporcionarse en dos o más partes, preferentemente en dos partes, que pueden ligarse durante el curso de circularización de la sonda tipo candado en una posición distinta a un sitio de ligación formado entre porciones de la sonda o partes de la sonda que hibridan con la molécula de ácido nucleico diana. En otras palabras, el oligonucleótido de la cadena principal de una sonda tipo candado puede proporcionarse en dos o más partes, que pueden ligarse en una posición dentro de la secuencia que no es complementaria al ácido nucleico diana (es decir, la cadena principal o enlazador como se describió anteriormente). En la Figura 17 se muestra un ejemplo de una sonda tipo candado en donde el oligonucleótido de la cadena principal se proporciona en dos partes.
Tal ligación de un oligonucleótido de la cadena principal proporcionado en dos o más partes se moldea mediante una plantilla de ligación, que es capaz de hibridar con cada una de las dos o más partes de un oligonucleótido de la cadena principal, para llevar de esta manera los respectivos extremos 5' y 3' a la yuxtaposición para la ligación. La plantilla de ligación comprende por lo tanto regiones de complementariedad con secuencias en los extremos de cada una de las dos o más partes de un oligonucleótido de la cadena principal.
La plantilla de ligación puede ser un oligonucleótido separado, por ejemplo, un oligonucleótido añadido a la muestra junto con la sonda o por separado, o hibridado previamente a la sonda, o puede ser otra molécula de ácido nucleico diana, u otra parte de la misma molécula de ácido nucleico diana (es decir, otra secuencia diana separada en una posición diferente dentro de la misma molécula de ácido nucleico diana). En consecuencia, la plantilla de ligación puede ser un oligonucleótido sintético o natural, y puede ser una molécula de ARN o molécula de ADN.
La ligación de partes de un oligonucleótido de la cadena principal puede ser directa o indirecta como se define en otra parte en la presente descripción, o puede requerir la extensión de llenado de brechas o un oligonucleótido adicional que hibrida con una plantilla de ligación entre los extremos de dos partes de un oligonucleótido de la cadena principal (es decir, de manera análoga a un oligonucleótido de brecha). Además, la ligación puede requerir la escisión de una secuencia adicional 5', opcionalmente en donde el nucleótido en el extremo 3' de una secuencia adicional es un ribonucleótido, y en donde un ribonucleótido se proporciona en o cerca de un sitio de ligación, como se describe en otra parte en la presente descripción. Se observará que tal método de circularización (donde el oligonucleótido de la cadena principal se proporciona en dos o más partes) puede usarse convenientemente para introducir ribonucleótidos en el oligonucleótido de la cadena principal (por ejemplo, por extensión mediante el uso de rNTP) en sitios distintos del sitio (o de un sitio) de ligación en la molécula diana (primaria) como plantilla. La presencia de uno o más de tales ribonucleótidos en uno o más sitios diferentes en el oligonucleótido de la cadena principal puede ser beneficiosa en la sonda tipo candado ligada (circularizada), ya que esto puede actuar para acelerar una reacción de RCA, como se describe más abajo.
Cuando se produce más de una ligación durante la etapa (b) (es decir, donde se forman dos o más sitios de ligación), cualquiera de los sitios de ligación puede comprender al menos un ribonucleótido como se analizó con mayor detalle anteriormente (es decir, la sonda puede comprender un ribonucleótido en o cerca de cualquiera de los sitios de ligación). Por tanto, cuando están presentes dos o más sitios de ligación, uno o más de dichos sitios de ligación pueden comprender al menos un ribonucleótido como se define en la presente descripción. En una modalidad particular de la invención, la sonda puede comprender un ribonucleótido en o cerca de cada sitio de ligación. Por tanto, en un aspecto preferido, cualquiera o todas las partes de una sonda proporcionada en dos o más partes pueden comprender al menos un ribonucleótido en o cerca del extremo 3' ligable en el sitio de ligación, y en una modalidad particular, cada una de las partes de la sonda puede comprender al menos un ribonucleótido en o cerca de su extremo 3' ligable en el sitio de ligación. Con mayor preferencia, cada una de las partes de la sonda puede comprender el al menos un ribonucleótido en el extremo 3' o cerca de este. Debe notarse, sin embargo, que cuando se proporciona una sonda en dos o más partes, puede ser suficiente que solo una de dichas dos o más partes pueda comprender al menos un ribonucleótido en o cerca de su extremo 3' ligable o en su extremo 3'.
Cuando se proporciona una sonda en dos o más partes como se describió anteriormente, el extremo ligable 5' de cualquiera o todas las partes de la sonda puede crearse por escisión como se describe en otra parte en la presente descripción. En particular, un sitio de unión específico de la diana de cualquiera o todas las partes de una sonda proporcionada en dos o más partes puede situarse internamente al extremo 5' de una parte de la sonda (es decir, puede comprender una secuencia adicional 5' respecto al sitio de unión específico de la diana que no hibrida con la molécula de ácido nucleico diana), dicha secuencia adicional puede eliminarse mediante escisión antes de la ligación. De manera similar, cualquiera de las dos o más partes de una sonda puede hibridar con secuencias no contiguas en la molécula de ácido nucleico diana y la brecha entre ellas puede llenarse al extender el extremo 3' de cualquiera o todas las sondas según sea necesario, como se analizó anteriormente.
El número de ribonucleótidos contenidos en la sonda no es crítico siempre que la sonda cumpla con el requisito de que la sonda ligada comprenda no más de 4 ribonucleótidos consecutivos. Más particularmente, la sonda ligada puede comprender no más de 3 ribonucleótidos consecutivos, y en una modalidad preferida no más de 2 ribonucleótidos consecutivos (por ejemplo, 1 o 2 ribonucleótidos). Dado que la sonda puede comprender más de un sitio de ligación, y los ribonucleótidos pueden estar presentes en o cerca de cada uno o múltiples sitios de ligación, se debe entender que los ribonucleótidos pueden estar presentes en múltiples (es decir dos o más) sitios en la sonda ligada, pero en cada sitio no habrá más de 4 (o 3 o 2) ribonucleótidos consecutivos. En otras palabras, en cada sitio de ligación, puede haber 1 ribonucleótido o no más de 4 (o 3 o 2) ribonucleótidos consecutivos. De hecho, no existe limitación en la inclusión de ribonucleótidos en otros sitios a lo largo de la sonda (es decir, no solo en sitios de ligación), dentro de los confines establecidos anteriormente. Sorprendentemente, se ha descubierto que la presencia de ribonucleótidos en una sonda ligada circular permite que la amplificación en círculo rodante continúe más rápidamente. Las sondas para usar en los métodos de la presente invención pueden, por lo tanto, comprender opcionalmente uno o más ribonucleótidos (y hasta 4 consecutivos) en uno o más sitios, que incluyen en una o más posiciones distintas de en o cerca de un sitio de ligación.
Como se describió anteriormente, la sonda o una parte de la sonda puede proporcionarse con una secuencia adicional 5' del primer sitio de unión específico de la diana, y esta secuencia adicional forma un colgajo 5' que puede eliminarse. Como se describió anteriormente, la secuencia adicional (secuencia del colgajo 5') puede comprender uno o más ribonucleótidos que pueden ser consecutivos y no se limitan en número; estos ribonucleótidos pueden eliminarse mediante escisión, de manera que cuando la sonda se liga no hay más de 4 (o no más de 3 o 2) ribonucleótidos consecutivos restantes en la sonda.
En algunas modalidades donde la sonda es una sonda tipo candado, el oligonucleótido de la cadena principal puede estar compuesto completamente de ADN y los ribonucleótidos pueden contenerse en uno o más oligonucleótidos de brechas (más particularmente en o cerca de los extremos ligables 3' de estos), y/o pueden introducirse por extensión, como se analizó anteriormente. En otras modalidades, el oligonucleótido de la cadena principal puede contener uno o más ribonucleótidos, dentro de los confines anteriores, por ejemplo, pueden intercalarse ribonucleótidos individuales en todas partes. En otra modalidad, el oligonucleótido de la cadena principal puede contener al menos un ribonucleótido en o cerca del extremo ligable 3'. En tal modalidad, uno o más oligonucleótidos de brechas también pueden contener al menos un ribonucleótido en o cerca de su extremo ligable 3'. Alternativamente, los ribonucleótidos pueden proporcionarse solo en el oligonucleótido de la cadena principal. Puede usarse cualquier combinación de estas características.
También describimos un método para detectar una secuencia de ácido nucleico diana en una molécula de ácido nucleico diana hibridada a una sonda de ADN-ARN quimérica ligable, dicho método comprende:
i) ligar la sonda de ADN-ARN quimérica hibridada a la molécula de ácido nucleico diana;
ii) amplificar la sonda ligada de la etapa (i) con una ADN polimerasa; y
iii) detectar el producto de amplificación de la etapa (ii), para detectar de esta manera la secuencia de ácido nucleico diana;
en donde la sonda de ADN-ARN quimérica ligable se proporciona en una o más partes, cada una con al menos un sitio de unión específico de la diana que es complementario a un sitio de unión a la sonda cognado en o adyacente a la secuencia de ácido nucleico diana y se hibrida con la molécula de ácido nucleico diana de manera que los extremos ligables de la sonda o partes de la sonda se yuxtaponen para la ligación entre sí mediante el uso de la molécula de ácido nucleico diana como una plantilla de ligación, para crear un sitio de ligación en o adyacente a la secuencia de ácido nucleico diana; y
en donde dicha sonda de ADN-ARN quimérica ligable comprende al menos un ribonucleótido en el sitio de ligación o cerca de este, y la sonda ligada comprende principalmente ADN y comprende no más de 4 ribonucleótidos consecutivos.
Será evidente que, de acuerdo con dicho método, los extremos ligables de la sonda o partes de la sonda, que se yuxtaponen para la ligación entre sí, pueden haberse generado, por ejemplo, después de una etapa de escisión y/o extensión como se describió en mayor detalle anteriormente.
La molécula de ácido nucleico diana puede ser cualquier secuencia que se desee detectar, analizar o amplificar. Por tanto, puede ser ADN o ARN, o una variante modificada de estos. Por tanto, el ácido nucleico puede estar formado por ribonucleótidos y/o desoxirribonucleótidos, así como también nucleótidos sintéticos que son capaces de participar en interacciones de pares de bases análogas o de tipo Watson-Crick. Por tanto, el ácido nucleico puede ser, o puede comprender, por ejemplo, ADN convertido por bisulfito, LNA, PNA o cualquier otro derivado que contenga una cadena principal no nucleotídica.
Por tanto, la molécula de ácido nucleico diana puede ser ADN codificante o no codificante, por ejemplo, ADN genómico o una subfracción de este, o puede derivarse del ADN genómico, por ejemplo, una copia o amplicón de este, o puede ser ADNc o una subfracción de este, o un amplicón o copia de este, etc.
Como se indicó anteriormente, la molécula de ácido nucleico diana es una molécula de ARN diana. La molécula de ácido nucleico diana puede ser, por ejemplo, una molécula de ARN en una mezcla de ARN u otras moléculas de ácidos nucleicos o secuencias de nucleótidos, por ejemplo, ácidos nucleicos genómicos, ya sean humanos o de cualquier fuente, de un transcriptoma, o cualquier otro ácido nucleico (por ejemplo, ácidos nucleicos de orgánulos, es decir, ácidos nucleicos mitocondriales o plastidios), ya sean de origen natural o sintéticos. La molécula de ARN diana puede ser, por lo tanto, o puede derivarse de secuencias de ARN codificantes (es decir, pre-ARNm o ARNm) o no codificantes (tales como ARNt, ARNr, ARNsno, miARN, ARNip, ARNpn, ARNex, ARNpi y ARNnc largo). La molécula de ARN diana puede ser típicamente una molécula de ARN que se desea detectar en una muestra, en el sentido de ser la diana del ensayo, es decir, un analito. En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico diana es un microARN (miARN). En otra modalidad preferida, la molécula de ARN diana es ARN 16S, preferentemente en donde el ARN 16S es de un microorganismo e identificativo de este (por ejemplo, un microorganismo patógeno) en una muestra. Alternativamente, la molécula de ARN diana puede ser ARN genómico, por ejemplo, ARNmc o ARNbc de un virus que tiene ARN como su material genético. Dichos virus notables incluyen ébola, VIH, SARS, influenza, hepatitis C, fiebre del Nilo Occidental, polio y sarampión. En consecuencia, la molécula de ARN diana puede ser ARN de sentido positivo, ARN de sentido negativo, o ARN bicatenario de un genoma viral, o ARN de sentido positivo de un genoma de ARN retroviral.
El método de la presente invención tiene ventajas particulares para la detección de moléculas de ácido nucleico diana cortas, y en particular moléculas de ARN diana cortas, que son típicamente difíciles de amplificar y caracterizar mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica. Por tanto, en modalidades particulares de la invención, la molécula de ácido nucleico diana puede ser menor que, o hasta, 100 nucleótidos de longitud, o con mayor preferencia menor que, o hasta, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 o 25 nucleótidos de longitud. Las moléculas de ácido nucleico cortas particularmente preferidas son moléculas de miARN, que típicamente son de 19-25 nucleótidos de longitud. En el documento WO 2015/071445 se muestra que las sondas tipo candado que tienen un par de sitios de unión específicos de la diana que comprenden 6 nucleótidos cada una pueden unirse a una molécula de ácido nucleico diana y ligarse de una manera dependiente de la diana. Por tanto, las moléculas diana más cortas (por ejemplo, ARN), por ejemplo, que comprenden al menos 18, 17, 16, 15, 14, 13 o 12 nucleótidos, también pueden detectarse en los métodos de la presente invención. Las moléculas de ácido nucleico diana pueden tener un número de nucleótidos en un intervalo entre cualquiera de los enteros citados anteriormente.
La molécula de ácido nucleico diana puede estar presente dentro de una muestra. La muestra puede ser cualquier muestra que contiene cualquier cantidad de ácido nucleico, de cualquier fuente o de cualquier origen, en la que se desea detectar una secuencia de ácido nucleico diana en una molécula de ácido nucleico diana. Por tanto, una muestra puede ser cualquier muestra clínica o no clínica, y puede ser cualquier muestra biológica, clínica o ambiental en la que pueda estar presente la molécula de ácido nucleico diana.
La muestra puede ser cualquier muestra que contiene una molécula de ácido nucleico diana, e incluye muestras naturales y sintéticas, es decir, materiales de origen natural o preparaciones que se han producido. Las muestras de origen natural pueden tratarse o procesarse antes de someterse a los métodos de la invención. Todas las muestras biológicas y clínicas se incluyen, por ejemplo, cualquier muestra de célula o tejido de un organismo, o cualquier fluido corporal o preparación derivada de este, así como también muestras tales como cultivos celulares, preparaciones celulares, lisados celulares, etc. También se incluyen muestras ambientales, por ejemplo, muestras de suelo y agua o muestras de alimentos. Las muestras pueden estar recién preparadas o pueden tratarse previamente de cualquier manera conveniente, por ejemplo, para su almacenamiento.
Por tanto, las muestras representativas incluyen cualquier material que pueda contener una molécula de ácido nucleico diana, que incluye, por ejemplo, alimentos y productos asociados, muestras clínicas y ambientales. La muestra puede ser una muestra biológica, que puede contener cualquier material viral o celular, que incluye todas las células procariotas o eucariotas, virus, bacteriófagos, micoplasmas, protoplastos y orgánulos. Por tanto, dicho material biológico puede comprender todos los tipos de células animales de mamíferos y no mamíferos, células vegetales, algas que incluyen algas verde azules, hongos, bacterias, protozoos, etc., o un virus. Por tanto, las muestras representativas incluyen sangre completa y productos derivados de la sangre tales como plasma, suero y capa leucocitaria, células sanguíneas, orina, heces, líquido cefalorraquídeo o cualquier otro fluido corporal (por ejemplo, secreciones respiratorias, saliva, leche, etc.), tejidos, biopsias, cultivos celulares, suspensiones celulares, medios acondicionados u otras muestras de constituyentes del cultivo celular, etc. La muestra puede tratarse previamente de cualquier manera conveniente o deseada para prepararse para usar en los métodos y usos de la invención, por ejemplo, mediante purificación o lisis celular, aislamiento del ácido nucleico o ARN, etc.
En una modalidad particular, la muestra comprende células microbianas o virus que se han aislado de una muestra clínica o de un cultivo de una muestra clínica. En tal muestra, la molécula de ácido nucleico diana puede ser una secuencia de nucleótidos presente en una célula microbiana, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que es característica, o discriminatoria o identificativa de una célula o virus microbiano, a cualquier nivel, por ejemplo, a nivel de tipo, grupo, clase, género, especie o cepa.
La sonda descrita en la presente descripción, y de hecho una o más partes de una sonda, pueden comprender una o más secuencias adicionales que pueden servir para introducir una secuencia en un producto de ligación, por ejemplo, una etiqueta o secuencia de detección, por ejemplo, un código de barras o motivo identificativo, o un sitio de unión para una sonda o cebador de detección. Tal secuencia adicional puede encontrarse, por ejemplo, en un extremo 3' o 5' de una sonda o parte de la sonda (preferentemente situada en el extremo opuesto a un extremo ligable de una sonda o parte de la sonda), o puede encontrarse intermedia a un extremo de una sonda o parte de la sonda, por ejemplo, en una porción de un oligonucleótido de la cadena principal circularizable no hibridado con una molécula de ácido nucleico diana. Las etiquetas tales como códigos de barras o sitios de unión de sonda/cebador pueden diseñarse con diferentes necesidades/propósitos, por ejemplo, para introducir una secuencia universal o común para permitir el procesamiento conjunto de diferentes sondas ligadas en un entorno multiplexado, por ejemplo, para introducir un sitio de unión para un cebador de amplificación universal o común. Esto permitiría que diferentes sondas ligadas se amplifiquen juntas, por ejemplo, en una amplificación de biblioteca mediante PCR o RCA. Alternativa o adicionalmente, una secuencia de etiqueta/código de barras puede usarse para “etiquetar” diferentes sondas ligadas amplificadas de manera que puedan distinguirse fácilmente entre sí (es decir, una etiqueta o marcador “diana”), o para etiquetar diferentes muestras, etc. de manera que puedan agruparse antes de una etapa de amplificación común/universal (es decir, una etiqueta o marcador de la “muestra”). Por tanto, en un entorno multiplexado, diferentes sondas (es decir, sondas para diferentes moléculas de ácido nucleico diana) pueden proporcionarse con diferentes secuencias etiqueta (por ejemplo, diferentes secuencias marcadoras o de detección) y/o pueden proporcionarse con la misma secuencia(s) etiqueta, por ejemplo, para la introducción de una secuencia común o universal. Dichos métodos pueden usarse preferentemente junto con la secuenciación mediante hibridación, secuenciación por ligación u otras químicas de secuenciación de próxima generación, por ejemplo, en la detección multiplexada de múltiples ácidos nucleicos diana en una muestra.
El término "detección" se usa ampliamente en la presente descripción para incluir cualquier medio para determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana en la molécula de ácido nucleico diana. Se debe entender que, en los métodos de la invención, el ácido nucleico diana se detecta mediante la detección de la sonda ligada amplificada en la muestra (es decir, si está presente o no) o cualquier forma de medición de la sonda ligada amplificada. Por tanto, el producto de amplificación de la etapa (c) puede detectarse como el “ indicador” para la secuencia de ácido nucleico diana. En consecuencia, detectar el producto de amplificación en la etapa (d) puede incluir determinar, medir, evaluar o ensayar la presencia o ausencia o cantidad o ubicación de la sonda ligada amplificada de cualquier manera. La presencia de la sonda ligada amplificada en la muestra (es decir, la confirmación de su presencia o cantidad o ligación) es indicativa o identificativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana, ya que la ligación exitosa de la sonda (que permite que tenga lugar la amplificación) depende de la presencia de la molécula de ácido nucleico diana, y más particularmente de la secuencia de ácido nucleico diana en ella. Por tanto, la detección de la sonda ligada amplificada permite determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana.
Se incluyen determinaciones, mediciones o evaluaciones cuantitativas y cualitativas, incluidas las semicuantitativas. Tales determinaciones, mediciones o evaluaciones pueden ser relativas, por ejemplo, cuando se detectan dos o más moléculas de ácido nucleico diana diferentes en una muestra, o absolutas. Como tal, el término "cuantificar" cuando se usa en el contexto de cuantificar una molécula(s) de ácido nucleico diana en una muestra puede referirse a la cuantificación absoluta o relativa. La cuantificación absoluta puede lograrse mediante la inclusión de concentración(es) conocidas de una o más moléculas de ARN de control y/o que hacen referencia al nivel detectado de la molécula de ácido nucleico diana con moléculas de ARN de control conocidas (por ejemplo, a través de la generación de una curva estándar). Alternativamente, la cuantificación relativa puede lograrse mediante la comparación de los niveles o cantidades detectados entre dos o más moléculas de ácido nucleico diana diferentes para proporcionar una cuantificación relativa de cada una de las dos o más moléculas de ARN diferentes, es decir, una con relación a la otra.
Las secuencias de las sondas pueden elegirse o seleccionarse con respecto a la secuencia de la sonda y su molécula de ácido nucleico diana. Por tanto, aunque las regiones complementarias a la diana se eligen con respecto a la molécula de ácido nucleico diana a la que se unen, la secuencia del resto de la sonda no es crítica. Sin embargo, las secuencias deben elegirse para evitar la aparición de hibridación intramolecular. Una vez que la secuencia se selecciona o identifica, la sonda puede sintetizarse mediante el uso de cualquier método conveniente.
El término "hibridación" o "se hibrida", como se usa en la presente descripción, se refiere a la formación de un híbrido entre secuencias de nucleótidos que son suficientemente complementarias para formar híbridos por medio de apareamiento de bases de tipo Watson-Crick. Dos secuencias de nucleótidos son "complementarias" entre sí cuando esas moléculas comparten homología de organización de pares de bases. Por tanto, una región de complementariedad en una región de una sonda se refiere a una porción de esa región que es capaz de formar un híbrido (o en otras palabras, unirse a su secuencia complementaria cognada). Estos términos también se usan para referirse a interacciones de pares de bases que son análogas al apareamiento de bases de Watson-Crick, que incluye el apareamiento de bases de Hoogsteen que es una variación raramente observada del apareamiento de bases que también permite que una tercera hebra se enrolle alrededor de una doble hélice ensamblada en un patrón de Watson-Crick para formar una estructura triple.
La cantidad de sonda que se añade a una muestra puede seleccionarse para proporcionar una concentración suficientemente baja de sonda en la mezcla de reacción para minimizar las interacciones específicas fuera de la diana, es decir, para garantizar que la sonda no se una aleatoriamente a moléculas de ácido nucleico diferentes de la diana en la muestra en ningún grado grande o sustancial. Generalmente, sin embargo, la sonda se usará en exceso con la molécula diana. En modalidades representativas, la concentración de cada sonda en la mezcla de reacción después de la combinación con la muestra tiene un intervalo de aproximadamente 1 fM a 1 pM, tal 10 como de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 1 nM, que incluye de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 100 nM, por ejemplo 1, 2, 5, 10, 20, 50 nM.
Se pueden añadir varias sondas diferentes a una muestra para un ensayo múltiple (por ejemplo, en una situación donde hay múltiples moléculas de ácido nucleico diana diferentes presentes en una muestra, para detectar múltiples moléculas de ácido nucleico diana en paralelo). Los ensayos múltiples pueden implicar la detección de decenas, cientos, miles o incluso decenas de miles de moléculas de ácidos nucleicos en una muestra. En consecuencia, los ensayos múltiples pueden comprender al menos 2 sondas distintas, es decir, sondas capaces de hibridar (directa o indirectamente) con diferentes primeros productos de RCA y, por lo tanto, por ejemplo, detectar diferentes analitos. Por ejemplo, los ensayos múltiples pueden utilizar al menos 20, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40 o 50 sondas, tal como 100, 200, 500, 1000, 10000 o más sondas. Además, el método de detección de la presente invención (es decir, para detectar una molécula de ácido nucleico diana) puede usarse en combinación con métodos más amplios para la detección de otras moléculas de ácido nucleico en una muestra. Como se analizó anteriormente, el método de la presente invención puede permitir la detección de una molécula de ARN diana en combinación con métodos más amplios para la detección de otras moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, diferentes de ARN) en una muestra.
Después de la combinación de la muestra que contiene la molécula de ácido nucleico diana y la (las) sonda(s), la mezcla de reacción puede incubarse durante un período de tiempo suficiente para que la (las) sonda(s) se una(n) a su molécula de ácido nucleico diana en la muestra. Como se describió anteriormente, una vez que la sonda se ha unido a la molécula de ácido nucleico diana, la sonda se liga (opcionalmente después de una etapa de escisión y/o extensión de la sonda hibridada) para generar un producto de ligación que puede amplificarse subsecuentemente, y el producto de amplificación se detecta de esta manera para detectar la secuencia de ácido nucleico diana.
En algunas modalidades representativas, por ejemplo, ensayosin situu otros ensayos en los que la molécula de ácido nucleico diana se inmoviliza, pueden incluirse etapas de lavado entre la adición de la sonda y la ligación y/o amplificación del producto de ligación. En otras palabras, una molécula de ácido nucleico diana puede capturarse o inmovilizarse en un soporte o sustrato sólido, que puede lavarse para eliminar la sonda no unida o unida de manera no específica. En algunas modalidades, las etapas de lavado pueden incluirse entre la ligación de la sonda y la amplificación del producto de ligación, para eliminar las sondas no ligadas. En otras modalidades representativas, puede incluirse una etapa de lavado antes de que tenga lugar la ligación.
Cuando la sonda es un candado de múltiples partes, el oligonucleótido de la cadena principal a puede ponerse en contacto con la muestra y dejarse hibridar, y el(los) oligonucleótido(s) de brechas pueden añadirse, si se usa(n), y dejarse hibridar. Alternativamente, pueden añadirse todas las partes de una sonda de múltiples partes.
La ligación comprende la formación de un enlace fosfodiéster entre el grupo OH 3' en el extremo 3' de una sonda y el grupo fosfato 5' en el extremo 5' de una sonda en dos bases adyacentes hibridadas a una secuencia de ácido nucleico diana y yuxtapuestas para la ligación. Por tanto, en dependencia del diseño de la sonda, el grupo OH 3' y/o el grupo fosfato 5' pueden proporcionarse en un ribonucleótido o un desoxirribonucleótido. En consecuencia, puede seleccionarse una enzima ligasa que sea capaz de catalizar la formación de un enlace fosfodiéster de una manera específica de la diana.
La ligasa puede ser una ADN ligasa (es decir, una enzima ligasa caracterizada por su capacidad de catalizar la formación de un enlace fosfodiéster entre dos desoxirribonucleótidos adyacentes hibridados a una molécula de ácido nucleico diana), o una ARN ligasa (es decir, una enzima ligasa caracterizada por su capacidad de catalizar la formación de un enlace fosfodiéster entre dos ribonucleótidos adyacentes hibridados a una molécula de ácido nucleico diana). Como se demostró en los Ejemplos, ahora se ha demostrado que tanto las enzimas ADN como ARN ligasas catalizan la formación de enlaces fosfodiéster entre un ribonucleótido 3' adyacente y un desoxirribonucleótido 5', y entre un ribonucleótido 3' adyacente y un ribonucleótido 5', que hibridan con una molécula de ácido nucleico diana, de una manera eficiente y dependiente de la diana. Por tanto, las ADN y ARN ligasas pueden ser útiles en los métodos de la presente invención. En consecuencia, la referencia a una ADN/ARN ligasa incluye ligasas de ADN y ARN que son capaces de unir nucleótidos 3' y 5' hibridados para formar un producto de ligación que comprende un ribonucleótido en el sitio de ligación o cerca de este como se describe en otra parte en la presente descripción.
Las ligasas ilustrativas que son de particular utilidad en el método de detección de la presente invención incluyen ADN ligasa del virus de Chlorella (PBCV-1 ADN ligasa I), T4DNA ligasa, T4RNA ligasa 1 (T4Rnl1), T4RNA ligasa 2 (T4Rnl2) y DraRN1 ligasa. Hasta la fecha, la fidelidad de la unión de extremos con plantilla de ARN de la T4 ADN ligasa y la PBCV-1 ligasa solo se ha caracterizado para sondas de ADN. Sorprendentemente, se observan mejoras en la eficiencia y fidelidad para la ligación cuando las sondas como se definen en la presente descripción se usan en la detección de una secuencia de ácido nucleico diana, en comparación con sondas de ADN solamente de la técnica anterior.
Una ligasa adecuada y cualquier reactivo que sea necesario y/o conveniente pueden combinarse con la mezcla de reacción y mantenerse en condiciones suficientes para que ocurra la ligación de los oligonucleótidos hibridados. Las condiciones de reacción de ligación se conocen bien por los expertos en la técnica. Durante la ligación, la mezcla de reacción en determinadas modalidades puede mantenerse en un intervalo de temperatura de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 105 °C, tal como de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 80 °C, tal como de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 70 °C, de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 60 °C, típicamente tal como de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 37 °C durante un período de tiempo que varía de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 16 horas, tal como de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 1 hora. Aún en otras modalidades, la mezcla de reacción puede mantenerse a un intervalo de temperatura de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 45 °C, tal como de aproximadamente 37 °C a aproximadamente 42 °C, por ejemplo, a o aproximadamente 38 °C, 39 °C, 40 °C o 41 °C, durante un período de tiempo que varía de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 16 horas, tal como de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 1 hora, que incluye de aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 8 horas. En una modalidad representativa, la mezcla de reacción de ligación incluye Tris 50 mM pH 7,5, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 1 mM, BSA 25 mg/ml, inhibidor de RNasas 0,25 unidades/ml y ADN ligasa de T4 a 0,125 unidades/ml. Aún en otra modalidad representativa, se emplean iones de magnesio 2,125 mM, inhibidor de RNasas 0,2 unidades/ml; y ADN ligasa 0,125 unidades/ml.
Será evidente que las condiciones de ligación pueden depender de la enzima ligasa usada en los métodos de la invención. Por tanto, las condiciones de ligación descritas anteriormente son simplemente un ejemplo representativo y los parámetros pueden variarse de acuerdo con protocolos bien conocidos. Sin embargo, se entenderá además que la alteración de un parámetro, por ejemplo, la temperatura, puede requerir la modificación de otras condiciones para garantizar que otras etapas del ensayo no se inhiban o interrumpan, por ejemplo, la unión de la sonda a la molécula de ácido nucleico diana. Dicha manipulación de los métodos de ensayo de RCA es rutinaria en la técnica.
Una vez que se forma la sonda ligada, se amplifica para aumentar el número de copias del producto de ligación en una muestra, lo que puede aumentar la sensibilidad del método de detección de la presente invención. En determinadas modalidades, se amplifica una parte o porción de la sonda ligada. La sonda ligada (o parte de esta) puede amplificarse mediante el uso de cualquier método conveniente conocido en la técnica, tal como PCR o una variante de esta, SDA, HAD, LAMP de SMAP.
En el método de la invención, la sonda se circulariza mediante ligación. La sonda circularizada ligada se amplifica mediante amplificación en círculo rodante (RCA). La RCA que usa una plantilla circular para la amplificación proporciona un producto de RCA concatenado que comprende múltiples repeticiones en tándem, cada una con una secuencia complementaria al oligonucleótido de plantilla circular (es decir, el producto de ligación circularizado). La RCA puede realizarse, por ejemplo, al poner en contacto la muestra con un cebador separado complementario y capaz de hibridar con el círculo resultante, y el extremo 3' de dicho cebador puede extenderse para proporcionar un producto de RCA concatenado. Alternativamente, la molécula de ácido nucleico diana puede comprender o proporcionar un extremo 3' que puede servir como cebador para la amplificación RCA.
La amplificación de la sonda ligada se realiza mediante el uso de una enzima ADN polimerasa, es decir, una enzima polimerasa capaz de sintetizar un oligonucleótido de ADN a partir de dNTP. El término “ADN polimerasa”, como se usa en la presente descripción, incluye cualquier enzima capaz de incorporar dNTP y, por lo tanto, incluye enzimas que tienen actividad tanto de ADN como de ARN polimerasa. En particular, la ADN polimerasa puede ser una enzima cuya función o actividad principal es sintetizar ADN, pero que también es capaz de incorporar nucleótidos de ARN. Puede seleccionarse una ADN polimerasa que sea capaz de usar un oligonucleótido de ADN-ARN quimérico como una plantilla para la amplificación, ya que la sonda ligada comprende al menos un ribonucleótido. Las enzimas polimerasas representativas para usar en la etapa (c) incluyen la ADN polimerasa Vent y la ADN polimerasa Bst.
Sorprendentemente, también se ha descubierto que la ADN polimerasa Phi29 es capaz de sintetizar un oligonucleótido de ADN mediante el uso de un oligonucleótido quimérico de plantilla que contiene ribonucleótidos, que incluye incorporar un desoxirribonucleótido en un producto de síntesis complementario a un ribonucleótido en una molécula de ácido nucleico diana. En otras palabras, Phi29 es capaz de funcionar como una transcriptasa inversa e incorporar un nucleótido de ADN (dNTP) correspondiente a la base de ARN que es complementaria al ribonucleótido en la plantilla. Se ha demostrado la amplificación de una sonda ligada que comprende hasta cuatro ribonucleótidos consecutivos mediante el uso de<a>D<n>polimerasa Phi29. En una modalidad preferida de los diversos métodos de la invención definidos anteriormente, la enzima ADN= polimerasa es ADN polimerasa Phi29. Sin embargo, esta sorprendente capacidad recién observada de Phi29 para aceptar sustratos que contienen ARN amplía el espectro de aplicaciones para la amplificación mediada por Phi29, y la RCA en particular, y suma nuevos usos para la enzima, más allá de los métodos de detección de la invención descritos anteriormente. Por ejemplo, la RCA basada en Phi29 tiene aplicaciones no solo en la detección de ácidos nucleicos, sino también en la síntesis de oligonucleótidos y la preparación de bibliotecas para la tecnología de secuenciación de próxima generación.
En un aspecto, la ADN polimerasa Phi29 puede usarse como una transcriptasa inversa en la presente invención.
Por tanto, también describimos un método para sintetizar una molécula de ADN, dicho método comprende poner en contacto una molécula de ácido nucleico plantilla que comprende tanto las bases de ARN como de ADN con la ADN polimerasa Phi29, y generar un complemento inverso de ADN.
Aunque se ha informado que la ADN polimerasa Phi29 puede convertirse para tener actividad de ADN polimerasa dependiente de ARN mediante la introducción de sustituciones de aminoácidos particulares, no se ha demostrado que la ADN polimerasa Phi29 de tipo silvestre, o cualquier otra variante de secuencia de Phi29 que no se haya modificado con el propósito de aumentar la actividad de transcriptasa inversa, pueda tener la capacidad de actuar de esta manera.
En particular, la ADN polimerasa Phi29 puede usarse como una transcriptasa inversa en la presente invención, en donde la secuencia de la ADN polimerasa Phi29 no se ha modificado para aumentar la actividad de transcriptasa inversa.
Además, también describimos un método para sintetizar una molécula de ADN, dicho método comprende poner en contacto una molécula de ácido nucleico plantilla que comprende tanto las bases de ARN como de ADN con la ADN polimerasa Phi29, y generar un complemento inverso de ADN a la misma, en donde la secuencia de la ADN polimerasa Phi29 no se ha modificado para aumentar la actividad de transcriptasa inversa.
En particular, el método de la descripción puede comprender sintetizar una molécula de ADN mediante amplificación en círculo rodante, dicho método comprende poner en contacto una molécula de ácido nucleico de plantilla circular que comprende al menos un ribonucleótido y no más de cuatro ribonucleótidos consecutivos con una ADN polimerasa Phi29, y generar una molécula de ADN que comprende múltiples repeticiones en tándem de la secuencia complemento inversa a la molécula de ácido nucleico plantilla, en donde la secuencia de la ADN polimerasa Phi29 no se ha modificado para aumentar la actividad de Rt .
Con referencia a la secuencia de la ADN polimerasa Phi29 que no se ha modificado para aumentar la actividad de transcriptasa inversa, se entiende que no se han introducido modificaciones de secuencia en una secuencia de aminoácidos de Phi29 con el propósito de introducir (es decir, conferir) o aumentar la actividad de transcriptasa inversa, que es una actividad de la enzima para actuar sobre una plantilla que comprende ribonucleótido(s) e incorporar en un producto de síntesis un desoxinucleótido complementario a un ribonucleótido en la plantilla. Por tanto, la secuencia no se ha modificado con el propósito de conferir o aumentar la actividad de transcriptasa inversa de la ADN polimerasa Phi29. Esto no excluye que la secuencia de aminoácidos de la enzima Phi29 pueda tener otras modificaciones de secuencia en comparación con una secuencia de tipo salvaje o natural, pero que las modificaciones no se hayan introducido de manera intencionada o deliberada para conferir o aumentar la actividad. Más particularmente, cualquier modificación de secuencia que pueda presentarse con relación a una enzima Phi29 de tipo silvestre o natural no confiere ni aumenta la actividad RT.
A modo de ejemplo representativo, un enfoque guiado por la estructura para convertir la ADN polimerasa Phi29 para que tenga actividad de ADN polimerasa dependiente de ARN se describe en el documento US 2017/0159033, que propone un número de sustituciones de aminoácidos para proporcionar enzimas que tienen propiedades tales como aumento de la estabilidad o capacidad de procesamiento de la plantilla-polimerasa, reducción de la actividad exonucleasa y/o alteración de la especificidad por la plantilla en comparación con una polimerasa original correspondiente. Los aminoácidos ilustrativos que pueden sustituirse incluyen aquellos que pueden colisionar con un heterohíbrido ARN/ADN, o aquellos que pueden contribuir al choque estérico entre la polimerasa y un resto OH 2' de la plantilla, y se proponen una serie de sustituciones ilustrativas. Las sustituciones de aminoácidos adicionales pueden ser las que reducen o eliminan la actividad exonucleasa de la ADN polimerasa Phi29, sustituciones que aumentan la afinidad por la base cognada en el sitio activo, sustituciones que inhiben la unión de la hebra cebadora al dominio exonucleasa, sustituciones para mejorar la longitud de lectura y/o la capacidad de procesamiento, sustituciones para disminuir la distancia de interpulso, sustituciones que mejoran la termoestabilidad y/o estabilidad de un complejo binario que incluye la polimerasa y el sustrato de ácido nucleico y/o un complejo ternario que incluye la polimerasa, un sustrato de ácido nucleico y un nucleótido cognado o análogo de nucleótido. En consecuencia, preferentemente, la ADN polimerasa Phi29 no se ha modificado para afectar una o más de las propiedades mencionadas anteriormente, y no comprende una o más de las sustituciones ilustrativas sugeridas en el documento US 2017/0159033 para convertir una ADN polimerasa Phi29 en una enzima que tiene actividad de ADN polimerasa dependiente de ARN.
Sin embargo, la ADN polimerasa Phi29 usada en este aspecto de la presente invención puede, de acuerdo con determinadas modalidades, comprender una o más modificaciones alternativas introducidas para un objetivo diferente (es decir, que no sea aumentar su actividad de transcriptasa inversa), por ejemplo, para alterar una o más de sus otras propiedades bioquímicas, y/o para mejorar la expresión recombinante y/o purificación de la enzima (es decir, mejorar su producción).
De acuerdo con determinadas modalidades, la secuencia de la ADN polimerasa Phi29 puede no modificarse con relación a una secuencia de tipo silvestre. De acuerdo con una modalidad particular, la secuencia de la enzima ADN polimerasa Phi29 puede ser, por lo tanto, una secuencia de tipo silvestre o natural. Dicho de otra manera, la secuencia de la ADN polimerasa Phi29 puede ser una secuencia no mutante.
En una modalidad particular, la enzima ADN polimerasa Phi29 de acuerdo con este aspecto de la invención puede tener la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 268, o una secuencia que tiene al menos 95, 96, 97, 98, o 99 % de identidad de secuencia con esta.
La molécula de ácido nucleico plantilla comprende por lo tanto al menos un ribonucleótido, y el método de este aspecto de la invención comprende generar una molécula de ADN que comprende o que tiene una secuencia que es complementaria a la molécula de ácido nucleico plantilla.
En estos aspectos, se prefiere que la molécula de ácido nucleico plantilla comprenda no más de 4, y preferentemente no más de 3, o 2 ribonucleótidos consecutivos (ver el análisis anterior, que se aplica también en este contexto). Aunque en algunos casos pueden obtenerse mejores resultados cuando el número de ribonucleótidos consecutivos no es superior a 2, se entenderá que es posible la optimización rutinaria del método, particularmente en el contexto de una plantilla circular, de manera que no es un requisito limitar el número de ribonucleótidos consecutivos a no más de 2. En determinadas modalidades, la molécula de ácido nucleico plantilla puede comprender por lo tanto 1, 2, 3 o 4 ribonucleótidos consecutivos.
Esto se demuestra en los ejemplos más abajo. La molécula plantilla puede contener ribonucleótidos en múltiples sitios y el número total de ribonucleótidos no es crítico o limitante. Por tanto, la molécula de ácido nucleico plantilla puede comprender no más de 4 (es decir, 4, 3, 2 o 1) ribonucleótidos en cada uno de dos o más sitios separados o distintos. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico plantilla puede comprender uno o más ribonucleótidos únicos, es decir, un ribonucleótido flanqueado en sus lados 5' y 3' por desoxirribonucleótidos, en más de una posición como se describe en otra parte en la presente descripción. Por tanto, cada uno de los sitios de ribonucleótidos se separa por uno o más desoxirribonucleótidos entre ellos. En determinadas modalidades, dos sitios pueden separarse por solo un único desoxirribonucleótido.
En aún una modalidad adicional, la molécula de ácido nucleico plantilla puede comprender ribonucleótidos en un solo sitio dentro de la molécula de ácido nucleico plantilla. En una modalidad particular, la molécula de ácido nucleico plantilla puede comprender solo un único ribonucleótido.
Los ribonucleótidos consecutivos pueden ser preferentemente nucleótidos de pirimidina en lugar de nucleótidos de purina, ya que se ha demostrado que Phi29 en los ejemplos más abajo tiene una mejor capacidad de procesamiento y una mayor precisión de replicación para los ribonucleótidos de pirimidina (es decir C y U) en una plantilla de amplificación.
Se prefiere en este aspecto particular de la invención que la molécula de ácido nucleico plantilla comprenda al menos un ribonucleótido, en lugar de una modificación química, análogo o derivado de este. Por tanto, en determinadas modalidades preferidas, el ribonucleótido no es un ribonucleótido modificado 2'-O-Me, un ribonucleótido modificado 2'-F o un ácido nucleico bloqueado (LNA).
Factores tales como la concentración de sal o de cationes metálicos particulares, por ejemplo Mn2+, que se ha demostrado que se requiere para la actividad óptima de transcriptasa inversa de las polimerasas Taq y Bst descritas anteriormente, pueden ajustarse para optimizar la actividad de transcriptasa inversa de Phi29. La actividad de Phi29 en segmentos más largos de ribonucleótidos y/o en bases de ARN de purina puede mejorarse alterando las condiciones de reacción de la RCA.
Las moléculas plantillas quiméricas que comprenden tanto bases de ARN como de ADN pueden generarse, por supuesto, mediante la ligación de sondas de acuerdo con la presente invención. Sin embargo, este aspecto de la presente invención no se limita al uso de Phi29 para la amplificación de las sondas ligadas de acuerdo con los métodos en la presente descripción, e incluye el uso en la amplificación de cualquier molécula quimérica que comprende tanto ribonucleótidos como desoxirribonucleótidos. Tal molécula de ADN-ARN quimérica puede ser una molécula circular y puede ser cualquier sonda circular o circularizada. Por tanto, la polimerasa Phi29 puede usarse para amplificar cualquier sonda circularizada (por ejemplo, sonda tipo candado, iLock, sonda de inversión molecular, sonda selectora, etc.) como se genere, en cualquier contexto. Por ejemplo, la sonda puede ser una sonda de inversión molecular con brechas llenas con ARN, o una sonda selectora que hibrida con una molécula diana que contiene ARN, etc. Por tanto, en determinadas modalidades preferidas, la molécula de ácido nucleico plantilla puede ser una plantilla circular, por ejemplo, como se forma de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción.
Otras áreas de aplicación pueden incluir la producción de oligonucleótidos y la secuenciación de próxima generación como se mencionó anteriormente, así como también agentes terapéuticos basados en ARN.
En general, cualquier protocolo conveniente que sea capaz de detectar la presencia del producto de ligación amplificado puede emplearse en el método de detección de la presente invención. El protocolo de detección puede requerir o no una etapa de separación. La referencia a la detección del producto de ligación amplificado en la presente descripción se refiere a la detección de la secuencia formada por la ligación de la sonda, y/o de un complemento de esta (es decir, la secuencia complementaria a ella).
El producto de ligación amplificado (es decir, el producto de amplificación) puede detectarse mediante el uso de cualquier protocolo conveniente, donde el protocolo particular empleado puede detectar el producto de ligación amplificado de manera no específica o específica, como se describe en mayor detalle más abajo. Por ejemplo, el producto de ligación amplificado puede detectarse directamente, por ejemplo, mediante el uso de electroforesis en gel, o con mayor preferencia mediante la hibridación de oligonucleótidos de detección marcados que hibridan con el producto de ligación amplificado. Alternativamente, el producto amplificado puede detectarse indirectamente, por ejemplo, el producto puede amplificarse mediante PCR y los productos de amplificación pueden detectarse.
Los protocolos de detección no específicos representativos de interés incluyen protocolos que emplean sistemas que producen señales que detectan selectivamente productos de ADN monocatenario o bicatenario, por ejemplo, mediante intercalación. Las moléculas detectables representativas que pueden ser útiles en tales modalidades incluyen tinciones de ácidos nucleicos fluorescentes, tales como colorantes de fenantridinio, que incluyen monómeros u homodímeros o heterodímeros de estos, que dan una fluorescencia mejorada cuando forman complejos con ácidos nucleicos. Los ejemplos de colorantes de fenantridinio incluyen homodímero de etidio, bromuro de etidio, yoduro de propidio y otros colorantes de fenantridinio sustituidos con alquilo. En otra modalidad de la invención, la tinción de ácido nucleico es o incorpora un colorante de acridina, o un homodímero o heterodímero de este, tal como naranja de acridina, homodímero de acridina, etidio, heterodímero de acridina o 9-amino-6-cloro-2-metoxiacridina. Aún en otra modalidad de la invención, la tinción de ácido nucleico es un colorante indólico o imidazólico, tal como Hoechst 33258, Hoechst 33342, Hoechst 34580 (BIOPROBES 34, Molecular Probes, Inc. Eugene, Oreg., (mayo de 2000)) DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) o DIPI (4',6-(diimidazolin-2-il)-2-fenilindol). Otras tinciones de ácido nucleico permitidas incluyen, pero no se limitan a, 7-aminoactinomicina D, hidroxiestilbamidina, LDS 751, psoralenos seleccionados (furocumarinas), colorantes de estirilo, complejos con metales tales como complejos de rutenio y complejos con metales de transición (que incorporan Tb3+ y Eu3+, por ejemplo). En determinadas modalidades de la invención, la tinción de ácido nucleico es un colorante de cianina o un homodímero o heterodímero de un colorante de cianina que da una fluorescencia potenciada cuando se asocia con ácidos nucleicos. Cualquiera de los colorantes descritos en la patente de Estados Unidos núm. 4,883,867 de Lee (1989), la patente de Estados Unidos núm. 5,582,977 de Yue y otros, (1996), la patente de Estados Unidos núm. 5,321,130 de Yue y otros (1994), y la patente de Estados Unidos núm. 5,410,030 de Yue y otros (1995) puede usarse, que incluye las tinciones de ácidos nucleicos disponibles comercialmente bajo las marcas comerciales TOTO, BOBO, POPO, YOYO, TO-PRO, BO-PRO, PO-PRO y YO-PRO de Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg. Cualquiera de los colorantes descritos en la patente de Estados Unidos núm. 5,436,134 de Haugland y otros (1995), la patente de Estados Unidos núm. 5,658,751 de Yue y otros (1997), y la patente de Estados Unidos núm. 5,863,753 de Haugland y otros (1999) puede usarse, que incluye las tinciones de ácidos nucleicos disponibles comercialmente bajo las marcas comerciales SYBR Green, EvaGreen, SYTO, SYTOX, PICOGREEN, OLIGREEN y RIBOGREEN de Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg.
En aún otras modalidades de la invención, la tinción de ácido nucleico es un colorante de cianina monomérico, homodimérico o heterodimérico que incorpora un heterociclo de aza- o poliazabenzazolio, tal como un azabenzoxazol, azabencimidazoe o azabenzotiazol, que da una fluorescencia mejorada cuando se asocia con ácidos nucleicos, que incluye tinciones de ácidos nucleicos disponibles comercialmente bajo las marcas comerciales SYTO, SYTOX, JOJO, JO-PRO, LOLO, LO-PRO de Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg.
Aún en otras modalidades, puede emplearse un sistema productor de señal que es específico para el producto de ligación amplificado, en oposición a las moléculas de ácido nucleico en general, para detectar la amplificación. En estas modalidades, el sistema productor de señal puede incluir un ácido nucleico u oligonucleótido que se une específicamente a una secuencia que se encuentra en el producto de ligación amplificado (es decir, una secuencia de dominio indicador), donde el ácido nucleico/oligonucleótido puede marcarse con una etiqueta detectable directa o indirectamente. En modalidades específicas, una sonda ligada amplificada puede detectarse mediante secuenciación por ligación.
Una etiqueta detectable directamente es una que puede detectarse directamente sin el uso de reactivos adicionales, mientras que una etiqueta detectable indirectamente es una que puede detectarse mediante el empleo de uno o más reactivos adicionales, por ejemplo, cuando la etiqueta es un miembro de un sistema productor de señal formado por dos o más componentes.
En muchas modalidades, la etiqueta es una etiqueta detectable directamente, donde las etiquetas detectables directamente de interés incluyen, pero no se limitan a: etiquetas fluorescentes, etiquetas radioisotópicas, etiquetas quimioluminiscentes y similares. En muchas modalidades, la etiqueta es una etiqueta fluorescente, donde el reactivo de etiquetado empleado en tales modalidades es un nucleótido(s) marcado(s) con fluorescencia, por ejemplo, CTP marcado con fluorescencia (tal como Cy3-CTP, Cy5-CTP), etc. Los restos fluorescentes que pueden usarse para marcar nucleótidos para producir ácidos nucleicos de sondas etiquetadas (es decir, sondas de detección) incluyen, pero no se limitan a: fluoresceína, los colorantes de cianina, tales como Cy3, Cy5, Alexa 555, Bodipy 630/650, y similares. También pueden emplearse otras etiquetas, tales como las descritas anteriormente, como se conoce en la técnica.
En determinadas modalidades, los ácidos nucleicos etiquetados específicamente (sondas de detección) se etiquetan con etiquetas de "transferencia de energía". Como se usa en la presente descripción, "transferencia de energía" se refiere al proceso mediante el cual la emisión de fluorescencia de un grupo fluorescente se altera por un grupo modificador de fluorescencia. Las etiquetas de transferencia de energía se conocen bien en la técnica, y tales sondas de oligonucleótidos marcadas incluyen las sondas tipo TaqMan®, como se describió en la patente de Estados Unidos núm. 6,248,526 (así como también Held y otros, Genome Res. (1996) 6:986-994; Holland y otros, Proc. Natl Acad. Sci. USA (1991) 88:7276-7280; y Lee y otros, Nuc. Acids Res. (1993) 21:3761-3766). Otros ejemplos de sondas de detección incluyen: Sondas Scorpion (como se describe en Whitcombe y otros, Nature Biotechnology (1999) 17:804-807; Patente de Estados Unidos núm. 6,326,145), sondas Sunrise (como se describe en Nazarenko y otros, Nuc. Acids Res. (1997) 25:2516-2521; patente de Estados Unidos núm. 6,117,635), balizas moleculares (Tyagi y otros, Nature Biotechnology (1996) 14:303-308; patente de Estados Unidos núm. 5,989,823), y sondas asistidas conformacionalmente (como se describió en la solicitud provisional núm. de serie 60/138,376).
Por tanto, determinar la presencia del producto de ligación amplificado puede lograrse mediante el uso de cualquier protocolo conveniente. La mezcla de reacción puede tamizarse, etc. (es decir, analizarse, ensayarse, evaluarse, probarse, etc.) para determinar la presencia de cualquier producto de ligación amplificado resultante con el fin de detectar la presencia de la molécula de ácido nucleico diana en la muestra que se analiza. El protocolo de detección particular puede variar en dependencia de la sensibilidad deseada y la aplicación en la que se pone en práctica el método.
El producto de ligación amplificado puede detectarse de varias maneras diferentes. Por ejemplo, los nucleótidos incorporados en el producto de ligación amplificado pueden etiquetarse directamente, por ejemplo, con fluorescencia, o etiquetarse de cualquier otra manera de manera espectrofotométrica, o radioisotópica o con cualquier etiqueta que proporcione una señal, de manera que el producto de ligación amplificado se etiquete directamente. En algunas modalidades, las sondas de detección como se analizó anteriormente, por ejemplo, sondas etiquetadas con fluorescencia, balizas moleculares (como se describió anteriormente) etc. pueden emplearse para detectar la presencia del producto de ligación amplificado, donde estas sondas se dirigen a una secuencia (por ejemplo, una secuencia de dominio indicador) que está presente en el producto de ligación (es decir, se forma por o durante dicha ligación) y por lo tanto solo existe en su totalidad en el producto de ligación amplificado.
La mezcla de reacción preparada en la etapa de detección de los métodos de la invención puede incluir además un medio tampón acuoso que incluye una fuente de iones monovalentes, una fuente de cationes divalentes y un agente tampón. Puede emplearse cualquier fuente conveniente de iones monovalentes, tales como KCl, acetato de K, acetato de NH4, glutamato de K, NH4Cl, sulfato de amonio y similares. El catión divalente puede ser magnesio, manganeso, zinc y similares, donde el catión será típicamente magnesio. Puede emplearse cualquier fuente conveniente de catión de magnesio, que incluye MgCl2, acetato de Mg y similares. La cantidad de Mg2+ presente en el tampón puede variar de 0,5 a 10 mM, aunque pueden usarse cantidades mayores o menores y puede depender del tipo de reacción. Por ejemplo, para PCR la cantidad de Mg2+ presente en el tampón puede ser aproximadamente 1,5 mM, mientras que, para RCA, la cantidad de Mg2+ presente en el tampón puede aproximadamente 10 mM. Los agentes tampones representativos o sales que pueden estar presentes en el tampón incluyen Tris, tricina, HEPES, MOPS y similares, donde la cantidad de agente tamponante variará típicamente de aproximadamente 5 a 150 mM, usualmente de aproximadamente 10 a 100 mM, y más usualmente de aproximadamente 20 a 50 mM, donde en determinadas modalidades preferidas el agente tamponante estará presente en una cantidad suficiente para proporcionar un pH que varía de aproximadamente 6,0 a 9,5, donde la máxima preferencia es el pH 7,3 a 72 °C. Otros agentes que pueden estar presentes en el medio tampón incluyen agentes quelantes, tales como EDTA, EGTA y similares.
La siguiente etapa en los métodos de la invención es la detección de la señal de los productos etiquetados de interés, donde la detección de la señal puede variar en dependencia del sistema productor de señal particular empleado. En determinadas modalidades, se determina simplemente la presencia o ausencia de una señal detectable, por ejemplo, fluorescencia, y se usa en los ensayos de la invención, por ejemplo, para determinar o identificar la presencia o ausencia del producto de ligación amplificado y por lo tanto la molécula de ácido nucleico diana. En dependencia de la etiqueta particular empleada, la detección de una señal puede indicar la presencia o ausencia de la secuencia de ácido nucleico diana en la molécula de ácido nucleico diana.
En esas modalidades, donde el sistema productor de señal es un sistema productor de señal fluorescente, la detección de señales típicamente incluye detectar un cambio en una señal fluorescente de la mezcla de reacción para obtener un resultado del ensayo. En otras palabras, se evalúa cualquier modulación en la señal fluorescente generada por la mezcla de reacción. El cambio puede ser un aumento o disminución de la fluorescencia, en dependencia de la naturaleza de la etiqueta empleada, pero en determinadas modalidades es un aumento de la fluorescencia. La muestra puede tamizarse para determinar un aumento de la fluorescencia mediante el uso de cualquier medio conveniente, por ejemplo, un fluorímetro adecuado, tal como una cubeta termoestable o un fluorímetro lector de placas, o, por ejemplo, cuando la muestra es una muestra de tejido en un portaobjetos de microscopio, puede detectarse la fluorescencia mediante el uso de un microscopio de fluorescencia. La fluorescencia se monitorea adecuadamente mediante el uso de un fluorímetro conocido. Las señales de estos dispositivos, por ejemplo, en forma de voltajes fotomultiplicadores, se envían a una placa de procesamiento de datos y se convierten en un espectro asociado con cada tubo de la muestra. Pueden evaluarse al mismo tiempo múltiples tubos, por ejemplo 96 tubos. Por tanto, en algunas modalidades, pueden detectarse múltiples analitos en paralelo, mientras que, en otras modalidades, pueden detectarse múltiples analitos secuencialmente, por ejemplo, un analito a la vez o un grupo de analitos a la vez.
Cuando el protocolo de detección es un protocolo en tiempo real, por ejemplo, como se emplea en protocolos de reacción de PCR en tiempo real, los datos pueden recopilarse de esta manera a intervalos frecuentes, por ejemplo, una vez cada 3 minutos, a lo largo de la reacción. Mediante el monitoreo de la fluorescencia de la molécula reactiva de la muestra durante cada ciclo, el progreso de la reacción de amplificación puede monitorearse de varias maneras. Por ejemplo, los datos proporcionados por los picos de fusión pueden analizarse, por ejemplo, mediante el cálculo del área debajo de los picos de fusión y estos datos pueden graficarse contra el número de ciclos.
Los espectros generados de esta manera pueden resolverse, por ejemplo, mediante el uso de "ajustes" de restos fluorescentes preseleccionados tales como colorantes, para formar picos representativos de cada resto de señalización (es decir, fluoróforo). Las áreas debajo de los picos pueden determinarse lo que representa el valor de intensidad para cada señal, y si es necesario, expresarse como cocientes entre sí. El diferencial de las intensidades y/o relaciones de las señales permitirá que los cambios en las sondas etiquetadas se registren a través de la reacción o en diferentes condiciones de reacción, tales como temperaturas. Los cambios se relacionan con el fenómeno de unión entre la sonda de oligonucleótidos y la secuencia diana o degradación de la sonda de oligonucleótidos unida a la secuencia diana. La integral del área debajo de los picos diferenciales permitirá calcular los valores de intensidad para los efectos de la etiqueta.
El tamizaje de la mezcla para detectar un cambio en la fluorescencia proporciona uno o más resultados del ensayo, en dependencia de si la muestra se tamiza una vez al final de la reacción de extensión del cebador, o múltiples veces, por ejemplo, después de cada ciclo, de una reacción de amplificación (por ejemplo, como se realiza en el monitoreo de PCR en tiempo real). Los datos generados como se describió anteriormente pueden interpretarse de varias maneras. En su forma más simple, un aumento o disminución de la fluorescencia de la muestra en el curso de o al final de la reacción de amplificación es indicativo de un aumento en la cantidad del analito diana presente en la muestra, por ejemplo, correlacionado con la cantidad del producto de ligación amplificado detectado en la mezcla de reacción, lo que sugiere el hecho de que la reacción de amplificación ha progresado y, por lo tanto, la molécula de ácido nucleico diana estaba de hecho presente en la muestra inicial. La cuantificación también es posible al monitorear la reacción de amplificación a lo largo del proceso de amplificación. La cuantificación también puede incluir el ensayo de uno o más controles de ácido nucleico en la mezcla de reacción, como se describió anteriormente.
De esta manera, una mezcla de reacción puede tamizarse fácilmente (o evaluarse o ensayarse, etc.) para determinar la presencia del producto de amplificación, y por lo tanto de molécula(s) de ácido nucleico diana. Los métodos son adecuados para la detección de una molécula de ácido nucleico diana única, así como también múltiples moléculas de ácido nucleico, en las que se analizan dos o más moléculas de ácido nucleico diana diferentes en la muestra. En estas últimas situaciones de multiplexación, el número de diferentes sondas que pueden emplearse típicamente varía de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 o más, por ejemplo, hasta 100 o más, 1000 o más, etc. en donde los múltiples analitos en una muestra pueden detectarse en paralelo o secuencialmente. El análisis de muchos analitos simultáneamente y en una única reacción mediante el uso de varias sondas diferentes (multiplexación) puede mejorarse mediante el aumento de la sensibilidad, y en determinadas modalidades también aumenta la especificidad, que puede obtenerse mediante el uso de los métodos y sondas de la invención. Cada conjunto de sondas puede diseñarse para producir un producto de ligación que puede usarse para determinar la presencia o ausencia, cantidad y/o ubicación de los analitos que finalmente se analizan mediante la sonda.
La sonda ligada amplificada puede detectarse mediante el uso de cualquiera de los métodos bien establecidos para el análisis de moléculas de ácidos nucleicos conocidas de la literatura que incluyen cromatografía líquida, electroforesis, espectrometría de masas, microscopía, PCR en tiempo real, sondas fluorescentes, micromatriz, análisis colorimétrico tal como ELISA, citometría de flujo, espectrometría de masas (CyTOF), etc.
La detección de la sonda ligada amplificada abarca además determinar la secuencia de la sonda ligada amplificada. Por tanto, en determinadas modalidades, la detección puede comprender la secuenciación de toda o una parte de la sonda ligada amplificada. Las sondas y métodos de la presente invención pueden emplearse homogéneamente (es decir, en solución) como se describió anteriormente, o alternativamente de manera heterogénea, mediante el uso de una fase sólida, por ejemplo, en la que la molécula de ácido nucleico diana se inmoviliza en una fase sólida, lo que permite el uso de etapas de lavado. Esto puede resultar de la inmovilización de la molécula de ácido nucleico diana, por ejemplo, en procedimientos de detecciónin situ.El uso de ensayos de fase sólida ofrece ventajas, particularmente para la detección de muestras difíciles: las etapas de lavado pueden ayudar en la eliminación de sondas no unidas y/o no ligadas, etc., los componentes inhibidores, y las moléculas diana pueden enriquecerse a partir de un volumen de muestra indeseablemente grande. Pueden usarse mayores concentraciones y mayores cantidades de sondas, ya que las sondas no unidas y las moléculas de ARN pueden eliminarse mediante lavado.
En una modalidad preferida de la presente invención, la molécula de ácido nucleico diana se detectain situ.Esto puede permitir que el nivel, ubicación o posición de una molécula de ácido nucleico diana se detecte directamente en una muestra. Por tanto, la muestra puede ser preferentemente cualquier muestra que refleje la localización normal o natural ("in situ") de la molécula de ácido nucleico diana, es decir, cualquier muestra en la que se produzca de forma normal o natural. Dicha muestra será ventajosamente una muestra de célula o tejido. Se prefieren particularmente muestras tales como muestras de células o tejidos cultivados o cosechados u obtenidos de biopsias en las que la molécula de ácido nucleico diana puede detectarse para revelar la localización de la molécula de ácido nucleico diana con relación a otras características de la muestra. Además de las preparaciones celulares o tisulares, tales muestras también pueden incluir, por ejemplo, fluidos biológicos deshidratados o fijados, y material nuclear tal como preparaciones de cromosomas/cromatina, por ejemplo, en portaobjetos de microscopio. Las muestras pueden estar recién preparadas o pueden tratarse previamente de cualquier manera conveniente, tal como mediante fijación o congelación. En consecuencia, pueden usarse células o tejidos frescos, congelados o fijos, por ejemplo, tejido FFPE (fijado en formalina e incluido en parafina).
En modalidades alternativas, la molécula de ácido nucleico diana puede inmovilizarse. La inmovilización de la molécula de ácido nucleico diana en una fase sólida puede lograrse de varias maneras. En consecuencia, se contemplan varias modalidades de ensayos de fase sólida. En una modalidad de este tipo, la molécula puede capturarse primero por una sonda de captura inmovilizada (o inmovilizable), el producto de ligación amplificado puede generarse de manera que se una a la molécula de ácido nucleico diana, por ejemplo, en virtud de un cebador para amplificación que se une o se une a la molécula de ácido nucleico diana como se describe en otra parte en la presente descripción. Alternativamente, el producto de ligación amplificado puede simplemente inmovilizarse a un soporte sólido. Por ejemplo, un cebador para la amplificación puede proporcionarse con un grupo o resto inmovilizable o medios para la inmovilización, o puede inmovilizarse, antes de la amplificación.
La sonda de captura inmovilizada, la molécula de ácido nucleico diana, el cebador para la amplificación, o el producto de ligación amplificado, pueden inmovilizarse, es decir, unirse al soporte, de cualquier manera conveniente. Por tanto, la manera o medios de inmovilización y el soporte sólido pueden seleccionarse, de acuerdo con la elección, de cualquier número de medios de inmovilización y soportes sólidos como se conoce ampliamente en la técnica y se describe en la literatura. Por tanto, la sonda de captura, la molécula de ácido nucleico diana, el cebador para la amplificación o el producto de ligación amplificado pueden unirse directamente al soporte (por ejemplo, reticularse químicamente), pueden unirse indirectamente por medio de un grupo enlazador, o mediante un grupo(s) de unión intermedia (por ejemplo, por medio de una interacción biotina-estreptavidina). Por tanto, la sonda de captura, la molécula de ácido nucleico diana, el cebador para la amplificación o el producto de ligación amplificado pueden proporcionarse con medios para la inmovilización (por ejemplo, un compañero de unión por afinidad, por ejemplo, biotina o un hapteno o una molécula de ácido nucleico, capaz de unirse a su compañero de unión, es decir, un compañero de unión cognado, por ejemplo, estreptavidina o un anticuerpo o una molécula de ácido nucleico) proporcionado en el soporte. Una sonda de captura puede inmovilizarse antes o después de la unión al analito. Además, tal sonda de captura "inmovilizable" puede ponerse en contacto con la muestra junto con el soporte.
De manera análoga, un cebador para la amplificación puede inmovilizarse antes o después de la amplificación. La sonda de captura puede ser, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que es capaz de unirse a la molécula de ácido nucleico diana específicamente. En otras palabras, la sonda de captura puede ser una sonda inmovilizada (o inmovilizable) específica para la molécula de ácido nucleico diana que comprende un dominio de unión complementario a esta. Por tanto, en tal modalidad, la molécula de ácido nucleico diana se captura primero por la sonda de captura inmovilizada o inmovilizable que sirve solo para inmovilizar la molécula de ácido nucleico diana en la fase sólida, y subsecuentemente la molécula de ácido nucleico diana inmovilizada se somete a un protocolo de detección que usa, o conduce a la generación de un producto de ligación amplificado. Más particularmente, dicha sonda de captura se une específicamente al analito.
El soporte sólido puede ser cualquiera de los soportes o matrices bien conocidos que se usan o proponen actualmente para la inmovilización, separación, etc. Estos pueden adoptar la forma de partículas (por ejemplo, perlas que pueden ser magnéticas o no magnéticas), láminas, geles, filtros, membranas, fibras, capilares o tiras de microtitulación, tubos, placas o pocillos, etc.
El soporte puede estar hecho de vidrio, sílice, látex o un material polimérico. Los materiales adecuados presentan un área superficial alta para la unión del analito. Tales soportes pueden tener una superficie irregular y pueden ser, por ejemplo, porosos o formados de partículas, por ejemplo, partículas, fibras, tramas, sinterizadores o tamices. Los materiales en forma de partículas, por ejemplo, perlas, son útiles debido a su mayor capacidad de unión, particularmente perlas poliméricas.
Convenientemente, un soporte sólido en forma de partículas usado de acuerdo con la invención comprenderá perlas esféricas. El tamaño de las perlas no es crítico, pero pueden ser, por ejemplo, del orden del diámetro de al menos 1 y preferentemente al menos 2 pm, y tener un diámetro máximo de preferentemente no más de 10, y por ejemplo no más de 6 pm.
Las partículas monodispersas, es decir, aquellas que son sustancialmente de tamaño uniforme (por ejemplo, un tamaño de una desviación estándar de diámetro de menos del 5 %) tienen la ventaja de que proporcionan una reproducibilidad de la reacción muy uniforme. Las partículas de polímeros monodispersos representativas pueden producirse mediante la técnica descrita en el documento US-A-4336173.
Sin embargo, para ayudar a la manipulación y separación, las perlas magnéticas son ventajosas. El término "magnético" como se usa en la presente descripción significa que el soporte es capaz de tener un momento magnético que se le imparte cuando se coloca en un campo magnético, es decir, paramagnético, y por lo tanto puede desplazarse bajo la acción de ese campo. En otras palabras, un soporte que comprende partículas magnéticas puede retirarse fácilmente mediante agregación magnética, lo que proporciona una forma rápida, simple y eficiente de separar las partículas después de las etapas de unión.
En una modalidad adicional, la molécula de ácido nucleico diana en sí misma puede inmovilizarse (o puede ser inmovilizable) en la fase sólida, por ejemplo, mediante absorción inespecífica. En una modalidad particular de este tipo, el analito puede estar presente dentro de las células, que opcionalmente se fijan y/o permeabilizan, que están unidas (o son capaces de unirse) a un soporte sólido, por ejemplo, una muestra de tejido que comprende el analito puede inmovilizarse en un portaobjetos de microscopio.
Como se indicó anteriormente, la presente invención también proporciona determinadas sondas para usar en el método de la invención, específicamente sondas circularizables como se definió anteriormente, que pueden proporcionarse en una o más partes. Por tanto, la invención proporciona sondas tipo candado de ADN-ARN quiméricas como se define en la presente descripción, que incluyen sondas tipo candado invasoras.
En una modalidad de este tipo, la sonda tipo candado de ADN-ARN quimérica es un único oligonucleótido circularizable que comprende un primer sitio de unión a la diana específico de la diana situado en el extremo 5' de la sonda o internamente y un segundo sitio de unión específico de la diana situado en el extremo 3' de la sonda, y en donde:
(i) el segundo sitio de unión específico de la diana comprende uno o más ribonucleótidos;
(ii) donde el primer sitio de unión específico de la diana es interno al extremo 5' de la sonda, la sonda comprende una secuencia adicional 5' respecto al primer sitio de unión específico de la diana, de manera que cuando la sonda hibrida con la molécula de ácido nucleico diana, la secuencia adicional forma un colgajo 5' que no hibrida con la molécula de ácido nucleico diana, y que puede retirarse por escisión para generar un extremo 5' ligable que puede ligarse al extremo 3' de la sonda para circularizar la sonda, en donde la secuencia adicional puede contener opcionalmente uno o más ribonucleótidos; y
(iii) la sonda cuando se liga para formar un círculo se compone principalmente de ADN y comprende no más de 4 ribonucleótidos consecutivos.
En otra modalidad, la sonda tipo candado de ADN-ARN quimérica comprende dos o más partes, la primera parte es un oligonucleótido de la cadena principal que comprende un primer sitio de unión específico de la diana situado en su extremo 5' o internamente y un segundo sitio de unión específico de la diana situado en su extremo 3', y uno o más oligonucleótidos de brechas que comprenden cada uno un sitio de unión específico de la diana complementario a y capaz de hibridar con la molécula de ácido nucleico diana entre el primer y segundo sitios de unión específicos de la diana del oligonucleótido de la cadena principal, y en donde:
(i) el segundo sitio de unión específico de la diana del oligonucleótido de la cadena principal y/o en el sitio de unión específico de la diana de al menos un oligonucleótido de brecha comprende uno o más ribonucleótidos en o cerca del extremo 3' de este;
(ii) donde el primer sitio de unión específico de la diana es interno al extremo 5' del oligonucleótido de la cadena principal, el oligonucleótido de la cadena principal comprende una secuencia adicional 5' respecto al primer sitio de unión específico de la diana, de manera que cuando el oligonucleótido de la cadena principal hibrida con la molécula de ácido nucleico diana, la secuencia adicional forma un colgajo 5' que no hibrida con la molécula de ácido nucleico diana, y que puede eliminarse mediante escisión para generar un extremo 5' ligable que puede ligarse al extremo 3' de un oligonucleótido de brecha para circularizar la sonda, en donde la secuencia adicional puede contener opcionalmente uno o más ribonucleótidos;
(iii) uno o más oligonucleótidos de brechas comprenden opcionalmente una secuencia adicional 5' respecto al sitio de unión específico de la diana, de manera que cuando el oligonucleótido de brecha hibrida con la molécula de ácido nucleico diana, la secuencia adicional forma un colgajo 5' que no hibrida con la molécula de ácido nucleico diana, y que puede eliminarse mediante escisión para generar un extremo 5' ligable que puede ligarse al extremo 3' de otro oligonucleótido de brecha o al extremo 3' del oligonucleótido de la cadena principal para circularizar la sonda, en donde la secuencia adicional puede contener opcionalmente uno o más ribonucleótidos; y
(iv) los oligonucleótidos de la cadena principal y de brechas cuando se ligan forman un círculo que se compone principalmente de ADN y comprende no más de 4 ribonucleótidos consecutivos.
T ales sondas pueden ser sondas tipo candado invasoras, también conocidas en la presente descripción como sondas iLock. En determinadas modalidades, las sondas de la invención (es decir, una sonda proporcionada como un único oligonucleótido circularizable, o una parte de una sonda proporcionada en dos o más partes, es decir, un oligonucleótido de la cadena principal y/o uno o más oligonucleótidos de brechas) puede comprender por lo tanto una secuencia adicional 5' respecto al primer sitio de unión específico de la diana o a un sitio de unión específico de la diana de un oligonucleótido de brecha como se describió anteriormente, en donde el nucleótido en el extremo 3' de cualquier secuencia adicional que forma un colgajo 5' es complementario al mismo nucleótido cognado en la molécula de ácido nucleico diana que el nucleótido en el extremo 3' de la sonda, o de una cadena principal y/o uno o más oligonucleótidos de brechas (es decir, un extremo ligable de una parte adyacente de la sonda). Cuando tales sondas hibridan con la molécula de ácido nucleico diana, el nucleótido en el extremo 3' de una secuencia adicional que forma el colgajo 5' se evita por lo tanto que hibride con la molécula de ácido nucleico diana por el extremo 3' ligable de la sonda o los oligonucleótidos de la cadena principal y/o el uno o más oligonucleótidos de brechas.
Tales sondas invasoras pueden ser adecuadas para detectar una base variante en una molécula de ácido nucleico diana. En una sonda para detectar una base variante en una molécula de ácido nucleico diana:
(i) el nucleótido en el extremo 3' de la sonda o los oligonucleótidos de la cadena principal y/o de brechas y el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional descrita anteriormente son complementarios a una base variante, y el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional no es capaz de hibridar con la molécula de ácido nucleico diana simultáneamente con el extremo 3' de la sonda u oligonucleótido de la cadena principal o de brecha, de manera que dicha secuencia adicional puede eliminarse mediante escisión para generar un extremo ligable 5' de la sonda; o
(ii) el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional y el nucleótido en el extremo 3' de la sonda o los oligonucleótidos de la cadena principal y/o de brechas no son complementarios a la base variante, de manera que el nucleótido en el extremo 3' de la sonda, o el oligonucleótido de la cadena principal y/o brecha no es capaz de hibridar con la molécula de ácido nucleico diana, evitando de esta manera la ligación, y el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional también puede eliminarse mediante escisión.
Alternativamente, en una sonda para detectar una base variante en una molécula de ácido nucleico diana:
(i) el nucleótido en el extremo 5' del primer sitio de unión específico de la diana o en el extremo 5' del sitio de unión específico de la diana de un oligonucleótido de la cadena principal o de brecha es complementario a la base variante, el nucleótido en el extremo 3' de la sonda o el oligonucleótido de la cadena principal y/o de brecha y el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional descrita anteriormente son complementarios al nucleótido en la posición 3' de la base variante, y el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional no es capaz de hibridar con la molécula de ácido nucleico diana simultáneamente con el extremo 3' de la sonda u oligonucleótido de la cadena principal o de brecha, de manera que dicha secuencia adicional puede eliminarse mediante escisión para generar un extremo ligable 5' de la sonda; o
(ii) el nucleótido en el extremo 5' del primer sitio de unión específico de la diana o en el extremo 5' del sitio de unión específico de la diana de un oligonucleótido de la cadena principal o de brecha no es complementario a la base variante, dicho nucleótido también se elimina mediante escisión, para generar de esta manera una brecha entre los extremos ligables 5' y 3' y evitar la ligación.
En una modalidad preferida, el nucleótido en el extremo 3' de una secuencia adicional que forma el colgajo 5' es un ribonucleótido.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un conjunto de sondas invasoras que comprenden dos o más sondas invasoras para la detección de una base variante en una molécula de ácido nucleico diana, en donde cada sonda en dicho conjunto de sondas comprende un nucleótido diferente (por ejemplo, A, G, C o T/U) en una posición en la secuencia adicional y el extremo 3' de la sonda u oligonucleótido de la cadena principal o de brecha complementario a la base variante. En determinadas modalidades, el conjunto de sondas invasoras puede comprender tres o cuatro sondas, donde cada una que comprende un nucleótido diferente en dichas posiciones.
Como se analizó anteriormente, el número total de ribonucleótidos en la sonda no es crítico siempre que la sonda, cuando se liga, no contenga más de 4, o con mayor preferencia no más de 3, o 2 ribonucleótidos consecutivos (ver el análisis anterior).
En determinadas modalidades, el segundo sitio de unión específico de la diana en el extremo 3' de la sonda de una parte o en el extremo 3' del oligonucleótido de la cadena principal, o el sitio de unión específico de la diana de un oligonucleótido de brecha puede comprender no más de 4 o 5 ribonucleótidos.
La presente invención puede entenderse mejor con referencia a los Ejemplos y Figuras.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra el efecto de un nucleótido de ARN en el extremo 3' ligable en un sitio de ligación mediante el uso de ligasa PBCV-1 en la ligación de una sonda tipo candado con plantilla de un ARN. A: Descripción general del experimento. B: Las sondas tipo candado (PLP) dirigidas a los miembros de la familia let-7 se diseñaron con nucleótidos 3' terminales de ARN o ADN. Las sondas se hibridaron con plantillas coincidentes, se ligaron con PBCV-1 y se amplificaron. Un número total de productos de RCA (RCP) para cada par PLP/miARN se muestra en el gráfico de columna. El eje y muestra el número de RCP mientras que el tipo de miARN se representa en el eje x. Barras de error ± s.d.; n=2.
La Figura 2 muestra el efecto de un nucleótido de ARN en el extremo 3' ligable en un sitio de ligación mediante el uso de ligasa PBCV-1 o T4Rnl2. Se comparó la ligación de un 3'-OH(N)/5'-p(N) frente a 3'-OH(rN)/5'-p(N) mediante el uso de una plantilla de ARN. Las sondas tipo candado completas de ADN y quiméricas se hibridaron con una diana de ARN correspondiente y se ligaron con (A) PBCV-1 y (B) T4Rnl2. El eje y muestra el número de productos de círculo rodante (RCP) y el eje x la plantilla de ARN usada. Barras de error ± s.d.; n=2. Se observó un mayor número de productos de ligación para todos los ARN diana para PBCV-1, y se observó un gran aumento en el número de productos de ligación para todos los ARN diana para la ligasa T4RnI2 cuando la sonda comprendió un ribonucleótido 3' en su extremo 3'.
La Figura 3 muestra el efecto de los errores de apareamiento de 3'-OH(rN) en el sellado de muescas por las ligasas PBCV-1 y T4Rnl2. Se añadieron las cantidades de RCP para cada plantilla de ARN (Figura 3B y 3C) y se presentaron como porcentaje dentro de un grupo de sonda iLock (Figura 3A) para cada enzima ligasa.
La Figura 4 muestra el efecto de sustituciones de ARN en varias posiciones en una sonda tipo candado Invader (iLock) usada en un ensayo de detección de ARN con ligasa PBCV-1. El reconocimiento de la estructura del invasor y la actividad nucleolítica específica de la estructura de la ADN polimerasa Taq puede variar para diferentes sustituciones de ARN. A: dirigida a let-7a con sonda iLock, que muestra la disposición del primer y segundo sitios de unión específica de la diana de la sonda iLock, y una secuencia adicional 5'. Los nucleótidos de ARN se introdujeron en diferentes posiciones: en el extremo 3' terminal (3); en el nucleótido más hacia 3' en el colgajo 5' que compite con el nucleótido 3' terminal en el extremo de la sonda para la unión a la diana (base desplazada, D); la base en el primer sitio de unión a la diana que se convierte en el extremo 5' ligable (proporciona el donante fosforilado 5') después de la escisión para eliminar la secuencia adicional (activación de la sonda iLock) (5); toda la secuencia del colgajo (F). B: Se evaluó la circularización de seis diseños de iLock: iLock solo de ADN; una iLock con la modificación (3) (iLock-3); una iLock con las modificaciones (3) y (D) (iLock-3D); una iLock con las modificaciones (3), (D) y (5) (iLock-3D5); una iLock con las modificaciones (3), (D) y (F) (iLock-3DF); y una iLock con las modificaciones (D) y (F) (iLock-DF). El número total de RCP detectados para cada sonda iLock se muestra en el eje x. Las sondas que comprenden la modificación (3), y la modificación (3) en combinación con la modificación (D) o las modificaciones (D) y (F) mostraron un gran aumento en el número de RCP generados con relación al iLock de solo ADN. La combinación de la modificación (3) con las modificaciones (D) y (5), y de las modificaciones (D) y (F), mostraron un aumento mucho menor en el número relativo de RCP generados con relación al iLock solo de ADN. C: PAGE de las sondas de ADN iLock, iLock-3 e iLock-3D después de la activación y ligación, sin (carriles 1-3) y con ADN polimerasa Taq (carriles 4-6). La sonda iLock no activada (79) se acorta tras la activación en 14 nt (65) y se liga (observada como la banda de alto peso molecular en la parte superior del gel). Carril 4: una banda para la sonda activada y sin ligar es visible (65 nt), la banda para la sonda sin ligar es claramente visible (79 nt) y solo es visible una banda débil para la sonda ligada. Carril 5: no es visible ninguna banda para la sonda no ligada, la banda para la sonda sin escindir es claramente visible (65 nt) y una banda para la sonda ligada es visible. Carril 6: no es visible ninguna banda para la sonda sin ligar, la banda para la sonda sin escindir es débil (65 nt) y es visible una banda fuerte para la sonda ligada. Juntos, estos datos muestran que una ribonucleasa en un extremo 3' ligable en un sitio de ligación mejora la ligación (carriles 4 y 5), y que una ribonucleasa en la posición más hacia 3' en una secuencia adicional que se escinde en un ensayo Invader mejora la escisión (carriles 5 y 6).
La Figura 5 muestra una comparación de la ligación de sondas iLock quiméricas y no quiméricas. A: Rendimiento de sondas iLock 3D y no quiméricas en dianas más largas, diferentes de miARN. El número total de RCP para cada sonda en plantillas polimórficas coincidentes se muestra en el eje y. B: una comparación de sondas iLock quiméricas y no quiméricas en miR21 mediante el uso de PBCV-1 y T4Rnl2. El número total de RCP para sondas iLock quiméricas o no quiméricas se presenta en el eje y. La ligasa usada se representa en el eje x. Barras de error ± s.d.; n=2. Ambas ligasas demuestran una mejor ligación cuando se usa una sonda quimérica.
La Figura 6 muestra la eficiencia y fidelidad de la ligación de sondas iLock quiméricas en plantillas diferentes de miARN para ligasa PBCV-1 y T4Rnl2. A y B: Fidelidad del sellado de muescas por las ligasas PBCV-1 y T4Rnl2 en plantillas de ARN polimórfico coincidentes. C y D: Datos presentados en (A) y (B) pero como un número total de RCP generados para cada sonda iLock en cada plantilla polimórfica. Barras de error ± s.d.; n=2.
La Figura 7 muestra la detección múltiple de isoformas de miARN de let-7 mediante el uso de sondas iLock quiméricas y ligasa PBCV-1. A: se incluyó un código de barras específico de miARN (NN) en la cadena principal de la sonda, entre la región de hibridación del cebador de anclaje y un sitio de hibridación de la biblioteca de secuenciación. Durante la secuenciación, el cebador de anclaje (AP) hibrida con el RCP y la mezcla de oligonucleótidos de la biblioteca de secuenciación compiten entre sí por la hibridación sobre la base del nucleótido en su extremo 5'. La biblioteca que contiene el terminal T estaba etiquetada con 3'-FITC; G estaba etiquetada con 3'Cy3; A estaba etiquetada con 3'Cy5. La ligasa se une a un oligonucleótido de la biblioteca correspondiente a una base del código de barras. B: imágenes de una primera base del código de barras mediante secuenciación por ligación (SBL). AP: todos los RCP teñidos con AP. Se muestran imágenes de cada base de código de barras, así como también imágenes fusionadas. Barra de escala de 5 pm. C: los miARN se mezclaron en relaciones estequiométricas como se indica en el eje x. 1:1:1 representa la misma relación y 0:0:0 sin control de plantilla. El número total de lecturas se representa en el eje y. Barras de error ± s.d.; n=número de muestras fotografiadas=2. Una relación 1:1:3 generó un número similar de RCP para cada plantilla.
La Figura 8 muestra una comparación de las eficiencias de ligación de una sonda tipo candado, y una sonda tipo candado quimérica que comprende 1 (R1pd) o 2 (R2pd) ribonucleótidos en el extremo 3', para la ligasa PBCV-1 y la T4 ligasa RNl2 a concentraciones altas y bajas, mediante el uso de (A) una plantilla de ARN o (B) una plantilla de ADN. Se demostró que las sondas tipo candado quiméricas se ligan y amplifican de manera más eficiente que las sondas tipo candado de solo ADN para dianas de ARN y ADN para ambas ligasas.
La Figura 9 muestra la detección de ARN de KRAS wt y mutantein situmediante el uso de sondas tipo candado de ADN o sondas tipo candado quiméricas. A: imagen de microscopía que muestra la detección de ARN mutante y WT mediante el uso de sondas tipo candado (arriba) o sondas tipo candado quiméricas (parte inferior). B: Número promedio de RCP mutantes y RCP de tipo silvestre por célula en ambas líneas celulares A549 y OncoDG1. La eficiencia de las sondas tipo candado quiméricas es mucho mayor en ambos casos. La especificidad es lo suficientemente alta para distinguir entre KRAS mutante y de tipo silvestre (más RCP mutantes en A549 y más RCP de tipo silvestre en OncoDG1).
La Figura 10 muestra la detección de ARN de KRAS wt y mutantein situmediante el uso de sondas iLock quiméricas. A: imagen de microscopía que muestra la detección de ARN mutante y WT mediante el uso de sondas iLock quiméricas. B: Número promedio de RCP mutantes y RCP de tipo silvestre por célula en ambas líneas celulares A549 y OncoDG1. La especificidad es lo suficientemente alta para distinguir entre KRAS mutante y de tipo silvestre (más RCP mutantes en A549 y más RCP de tipo silvestre en OncoDG1).
La Figura 11 muestra la detección de moléculas de ARN diana mediante el uso de polimerización con llenado de brechas y una sonda iLock. A: número de RCP contados en solución después de la polimerización con llenado de brechas con transcriptasa inversa y escisión Taq ligación de ligasa PBCV-1 (todas a la vez) seguido de RCA, mediante el uso de sondas iLock quiméricas. B: detecciónin situde RCP mediante el uso de polimerización con llenado de brechas y sondas iLock quiméricas.
La Figura 12 muestra un diseño para una sonda iLock de 2 partes que comprende un ribonucleótido en el extremo de los oligonucleótidos de la cadena principal y de brechas. Una molécula de ARN diana (1) se pone en contacto con una sonda iLock de 2 partes que comprende un oligonucleótido de la cadena principal (2) y un oligonucleótido de llenado de brecha (3). Tanto el oligonucleótido de la cadena principal como el oligonucleótido de llenado de brecha comprenden una secuencia adicional en su extremo 5' que no hibrida con la molécula de ARN diana (4) y un ribonucleótido en su extremo 3' (5).
La Figura 13 muestra el efecto de sustituciones de ARN sobre la amplificación en círculo rodante con ADN polimerasa Phi29. A: Cantidad total de productos de RCA (eje y) generados por sondas tipo candado con/sin un ARN 3' terminal y en ausencia de plantilla sintética para la ligación de ARN (plantilla -). B: Los círculos con 0-7 subestaciones de ARN en la cadena principal se amplificaron y se contaron digitalmente. El eje y muestra el número de productos de círculo rodante (RCP); barras de error ± s.d.; n=2. Las mismas reacciones de RCA con círculos quiméricos también se monitorearon en tiempo real midiendo la incorporación de Sybr Gold en un instrumento de qPCR (C y E). C: Curvas de reacción de RCA de círculos con 0, 1, 2 o 3 sustitutos de ARN. D: Se obtuvieron imágenes de RCP de C en portaobjetos de microscopio y se cuantificaron el tamaño y la intensidad de RCP individuales. Línea negra, mediana; límite superior, valor más alto que está dentro de 1,5 el intervalo intercuartílico de la bisagra; límite inferior, valor más bajo dentro de 1,5 el intervalo intercuartílico de la bisagra. E: Se muestran datos en tiempo real de las mismas reacciones de RCA que en B con 0-7 sustitutos de ARN. Se presentan muestras representativas de un experimento duplicado. Para resaltar las etapas iniciales de la RCA y ver la diferencia entre las muestras con baja eficiencia de<r>C<a>, se muestra la fluorescencia entre 4000 y 6000.
La Figura 14 muestra que las sondas tipo candado quiméricas que comprenden un ribonucleótido 3' se ligan más fácilmente mediante el uso de ligasa PBCV-1 que una sonda tipo candado que comprende un desoxirribonucleótido en su extremo 3'. Carriles 1-6: sondas tipo candado quiméricas. Carriles 7-12: sondas tipo candado no quiméricas. Un producto de sonda ligada se muestra (*) como el fragmento más pesado. Esto es claramente visible después de 1-2 minutos para sondas quiméricas (carriles 2-3), mientras que esto solo se vuelve claramente visible en puntos de tiempo posteriores para sondas no quiméricas (carril 12).
La Figura 15 muestra una sonda tipo candado de llenado de brecha (2) que comprende un ribonucleótido (3) en el extremo 3' de una secuencia adicional 5' (4), que se escinde antes de la ligación. Un extremo 3' de la sonda (5) hibridada a la molécula de ácido nucleico diana (1) puede extenderse mediante polimerización con llenado de brechas.
La Figura 16 muestra una sonda tipo candado (2), que comprende ribonucleótidos (3) en posiciones distintas o cercanas a un sitio de ligación (4) hibridado a una molécula de ácido nucleico diana (1).
La Figura 17 muestra una sonda tipo candado (2) que comprende un oligonucleótido de la cadena principal proporcionado en dos partes, y una plantilla de ligación (4) que hibrida con cada parte del oligonucleótido de la cadena principal para servir como plantilla a la ligación. Como se muestra, el nucleótido en el extremo 3' ligable en este sitio de ligación es un ribonucleótido.
La Figura 18 muestra las velocidades de amplificación de sondas tipo candado circularizadas que comprenden diferentes ribonucleótidos. A: Se muestran curvas de RCA en tiempo real de círculos que contienen 1, 2 o 3 sustituciones consecutivas de ARN de las cuatro bases de ARN. La velocidad de RCA se monitoreó mediante la medición de la acumulación de fluorescencia (eje y) resultante de la incorporación de SybrGold en los RCP. Se muestran datos representativos para cada experimento. B: Se muestran las velocidades de RCA para el control positivo (círculo de ADN puro - parte inferior izquierda), control negativo (sin círculo) y círculos con 2, 3, 5 y 7 sustituciones de ARN consecutivas, así como también círculos con sustituciones de ARN intercaladas con bases de ADN. La ADN polimerasa Phi29 exhibe una mayor velocidad de RCA con círculos que contienen sustituciones de ARN de pirimidina.
La Figura 19 muestra que la replicación limitada de las sondas tipo candado enriquecidas con ARN no se recupera en presencia de la transcriptasa inversa M-MuLV. Se muestran las curvas de amplificación de las sondas tipo candado con 0-7 subestaciones de ARN en la cadena principal. La velocidad de RCA se monitoreó mediante la medición de la acumulación de fluorescencia (eje y; 3000-30000) como resultado de la incorporación de SybrGold en RCP. La replicación se muestra para círculos sin transcriptasa inversa adicional (panel superior) y con transcriptasa inversa M-MuLV adicional (panel inferior).
La Figura 20 muestra gráficos apilados que muestran la incorporación de dNTP esperados durante la transcripción inversa de la RCA. Las sondas tipo candado que contienen ARN se amplificaron, se monomerizaron y se secuenciaron. Los monómeros de RCA se generaron a partir del círculo de ADN de control (hilera superior) y círculos que contenían rA, rC, rG y rU en la primera posición de ARN (R1) y rUrU, rArA, rCrC y rGrG en sus posiciones R1 y R2 (secuencias completas de los oligos en la Tabla 9). Las lecturas de secuenciación se alinearon y se calculó la frecuencia de cada base en cada posición. El tamaño de cada base es proporcional a la frecuencia de la base. El cuadro indica las posiciones R1 y R2 (con relación a las posiciones del ARN en la cadena principal de la sonda tipo candado) y se señaló la posición R1 (ver flecha).
La Figura 21 muestra la detecciónin situdel ARNm de ACTB en fibroblastos humanos (BjhTERT) y de ratón (MEF) cultivados. A: Detección del ARNm de ACTB humano y de ratón en células BjhTERT y MEF mediante el uso de sondas tipo candado quiméricas y no quiméricas (PLP) y sondas iLock. Se incluyeron sondas para ambas dianas en cada muestra y mostraron buenos niveles de especificidad para la diana. B: Se muestra el número promedio de RCP por célula que surge de cada sonda para cada línea celular mediante el uso de PLP e iLocks quiméricas y de solo ADN. PLP: sonda tipo candado de solo ADN; PLPr - 3'-(rN) PLP; RiLock: iLock de ARN; iLock: iLock solo de ADN. Para cada sonda, la señal de sondas específicas para humano es la parte superior, y la señal de sondas específicas para ratón es la parte inferior. En BjhTERT, la PLP específica para ACTB humano (gráfico de caja superior) muestra menos inexactitud que PLPr de ARN (segundo gráfico de caja). Las PLP y PLPr específicas de ratón no muestran señal. Para iLock (3er y 4to gráficos de caja) las RiLock muestran una mediana más alta que las iLock (el gráfico de caja está un poco desplazado), pero la cantidad de señal es mucho menor en comparación con las PLP. Se obtuvieron los datos correspondientes para las células de ratón MEF, donde las señales de las sondas específicas de ratón fueron mayores que las de las sondas específicas de humanos.
La Figura 22 muestra la detecciónin situde ARN de miR21 inmovilizado sobre una superficie sólida. A: miR21 se inmovilizó y una sonda complementaria (etiquetada con colorante fluorescente) se hibridó. Se obtuvieron imágenes intencionadas del borde de la cámara de silicona para visualizar el efecto de inmovilización; B) cuando no se añadió miR21, la sonda complementaria no generó fluorescencia visible; detección de mir21 con PLP no quiméricas (C) PLP quiméricas (E) sondas iLock (D) y sondas iLock quiméricas (F). El número de RCP cuantificados se presenta como el número total de RCP/campo visual (FOV).
La Figura 23 muestra la detección de ARN múltiplein situmediante el uso de sondas tipo candado quiméricas y secuenciación in situ en secciones de tejido cerebral de ratón. El panel superior muestra una imagen general de la sección de tejido cerebral de ratón con núcleos teñidos en DAPI y los productos de RCA con tinción para sonda de anclaje generados a partir de PLP quiméricas dirigidas a 18 genes neuronales diferentes (con 5 sondas por gen cada una = 90 sondas diferentes en total). Más abajo, se muestra un área de la imagen general izquierda donde se observan células individuales.
La Figura 24 muestra que la ADN polimerasa Phi29 exhibe una mayor velocidad de RCA con círculos que contienen sustituciones de ARN de pirimidina. (A) Se muestran curvas de RCA en tiempo real de círculos que contienen 1, 2, 3 o 4 subestaciones de ARN consecutivas de las bases de ARN rG, rU, rA, rC (el número de sustituciones consecutivas se indica encima de los gráficos). La velocidad de RCA se monitoreó mediante la medición de la acumulación de fluorescencia (eje y) resultante de la incorporación de SYBR Gold en los RCP. La intensidad de fluorescencia promedio para cada punto de tiempo de RCA se calculó a partir de un experimento duplicado. La RCA se realizó en presencia de Mg2+ y Mn2+ (líneas continuas y discontinuas respectivamente). (B) La velocidad lineal de la RCA en etapa temprana (eje y) se presenta para PLP de (A) en presencia de Mg2+ (líneas continuas) y Mn2+ (líneas discontinuas). (C) Se muestran la RCA para la PLP de control (círculo de ADN no quimérico, con Mg2+ (línea continua) y Mn2+ (línea discontinua).
La Figura 25 muestra la RCA de sustratos circulares quiméricos con sustituciones de ARN organizadas en diferentes patrones. La velocidad de RCA se monitoreó mediante la medición de la acumulación de fluorescencia (eje y) resultante de la incorporación de SybrGold en RCP. Se introdujeron 4, 5 y 7 sustituciones consecutivas (amarilla, roja, verde); 3, 6 sustituciones de ARN interespaciadas con 1 o 2 bases de ADN (azul, gris), así como también 3 y 8 sustituciones de ARN interespaciadas con un mayor número de bases de ADN (naranja, magenta) en la cadena principal de PLP como se indica en la leyenda (solo se representa el fragmento de un fragmento de cadena principal, secuencias de PLP completas como se indicó. Datos promedio de un experimento duplicado. La RCA se llevó a cabo en presencia de iones magnesio y manganeso (líneas continuas y discontinuas respectivamente).
La Figura 26 muestra el efecto de las sustituciones de ARN en la estabilidad y la ligación de la sonda tipo candado 3'-OH(rG) y 3'-OH(G) con la ligasa PBCV-1 en ARN. A: Valoración de la ligasa PBCV-1. Número total de RCP (eje y) generados por cada concentración de ligasa (eje x) durante 30 minutos de ligación. Para cada punto temporal, los datos de las sondas quiméricas se muestran a la izquierda y las sondas no quiméricas se muestran a la derecha. B: Para evaluar la estabilidad de las sondas tipo candado quiméricas durante los primeros minutos de la reacción se usó una concentración de 26,5 nM (62 mU//pl). La reacción de ligación se detuvo por inactivación de la enzima por calor a 70 °C durante 10 min. Se presenta el número total de productos de RCA (eje y) para el punto temporal dado (eje x).
La Figura 27 muestra una comparación de la ligación de sondas iLock quiméricas y no quiméricas en miR21 y let-7f mediante el uso de PBCV-1 y T4Rnl2. El número total de RCP para quimérico (izquierda) o no quimérico (derecha) sondas iLock se presentan en el eje y con PBCV-1 o T4Rnl2 (eje x). Se presentan los datos para la plantilla de ARN de miR21 y let-7f.
La Figura 28 muestra el efecto de los errores de apareamiento de 3'-OH(rN) en la activación de iLock y la fidelidad del sellado de muescas para la ligasa PBCV-1 y T4Rnl2. A y B: Rendimiento de las sondas iLock-3D quiméricas (izquierda) e iLock no quiméricas (derecha) en dianas de ARN polimórfico. El número total de RCP para cada sonda en plantillas polimórficas coincidentes se muestra en el eje y para A) ADN ligasa PBCV-1 y B) T4Rnl2. NC-control negativo. C: Fidelidad del sellado de muescas mediante ADn ligasa PBCV-1 (panel izquierdo) y T4Rnl2 (panel derecho) mediante el uso de sondas iLock tipo 3D en ARN. Los números de RCP para la misma sonda iLock en cada plantilla de ARN se añadieron y se presentaron como porcentaje dentro de un grupo de sonda iLock. Se resalta la proporción calculada para el par de sondas esperado.
La Figura 29 muestra la eficiencia y fidelidad de la ligación de sondas iLock quiméricas con ligasa PBCV-1 y T4Rnl2 en plantillas polimórficas. El número total de RCP generados y cuantificados (eje y) para cada sonda iLock en cada plantilla polimórfica se muestra en la Figura 28 para A) ADN ligasa PBCV-1 y B) T4Rnl2.
La Figura 30 muestra la incorporación de dNTP durante la transcripción inversa de la RCA. Las sondas tipo candado se monomerizaron, se amplificaron y se secuenciaron, como se describe en los Ejemplos. Las muestras con bases de ARN simple y doble se secuenciaron con este enfoque como se representa junto a los gráficos individuales. Las lecturas de secuenciación se alinearon y se calculó la frecuencia de cada base en cada posición. El tamaño de cada base es proporcional a la frecuencia de la base. La reacción de RCA se realizó en presencia de iones de magnesio y manganeso como se indicó anteriormente en los gráficos. La posición de las bases de ARN se indica con la caja. La secuencia de ADN/ARN presente originalmente en la secuencia de PLP se representa en el lado derecho.
La Figura 31 muestra la tasa de incorporación errónea para cada posición en la cadena principal de la sonda tipo candado durante la transcripción inversa de la RCA. La probabilidad de incorporación errónea de nucleótidos inesperados en cada posición para sondas tipo candado con sustituciones de un solo ARN (gráficos de la izquierda) y de doble ARN (gráficos de la derecha) se calculó como error de incorporación [%] = 1-número de lecturas con nucleótido esperado/número total de lecturas. Se muestra el error promedio (eje y) para cada base de la lectura secuenciada (eje x) y para cada muestra analizada. La reacción de RCA se realizó en presencia de manganeso (A) y magnesio (B).
La Figura 32 muestra el efecto de las sustituciones de ARN en plantillas circulares sobre la amplificación en círculo rodante con phi29ADN polimerasa. (A) Los círculos con 0-7 sustituciones de ARN en la cadena principal se amplificaron y se contaron digitalmente. El eje y muestra el número de productos de círculo rodante (RCP); barras de error ± S.D.; n = 2. Las mismas reacciones de RCA con círculos quiméricos también se monitorearon en tiempo real mediante la medición de la incorporación de SYBR Gold en el instrumento de qPCR (B y C). (B) Curvas de reacción de RCA de círculos con 0, 1 y 2 sustituciones de ARN. (C) Se muestran datos en tiempo real de las mismas reacciones de RCA que en B con 0-7 sustitutos de ARN. Se presentan muestras representativas de un experimento duplicado. Para resaltar las etapas iniciales de la RCA y mostrar la diferencia entre las muestras con baja eficiencia de RCA, se presenta la lectura de intensidad de fluorescencia entre 3000 y 6000.
La Figura 33 muestra que el análisis basado en secuenciación de ADN de productos de círculos rodantes revela la actividad de transcripción inversa de la ADN polimerasa phi29. (A) Después de la RCA, los oligonucleótidos de ADN cortos se hibridaron con un sitio de restricción de AluI en los productos de RCA y los RCP se digirieron con enzima de restricción AluI, lo que produjo monómeros de RCA. Después de la digestión, los monómeros se amplificaron por PCR mediante el uso de cebadores que contenían secuencias adaptadoras de Ilumina. Los productos de PCR se extendieron mediante el uso de cebadores indexados IIlumina. Finalmente, la biblioteca de secuenciación se preparó mediante el uso de cebadores indexados-cebadores de PCR P5/7 específicos. La región de interés que contiene sustituciones de ARN en la secuencia original de la sonda tipo candado se indica con cajas verdes. (B) Logotipos que muestran frecuencias de secuenciación para cada posición dentro de monómeros de RCA generados a partir del círculo de ADN de control (P1 = dG), y círculos que contienen sustituciones de rG, rU, rA y rC únicas en la posición del ARN (P1). Se indican las posiciones P1 y P2 y la posición P1 se ha destacado adicionalmente con el cuadro rojo. (C) Incorporación de nucleótidos incorrectos para cada posición en los monómeros secuenciados de (B). Las tasas de error, calculadas como error de incorporación [%] = 1 - número de lecturas con nucleótidos esperados/número total de lecturas, se presentan para sondas tipo candado con sustituciones de un solo ARN (gráfico superior) y de doble ARN (gráficos inferiores). La posición P1 para la primera sustitución de ARN se indica con la caja.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Detección de miARN mediante el uso de sondas iLock de ADN/ARN quiméricas mediante el uso de una actividad novedosa de la ADN ligasa PBCV-1: Ligación de ARNmc con plantilla de ARN
Material y métodos
Oligonucleótidos usados en el estudio
Todos los oligonucleótidos usados se adquirieron de IDT (Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA, Estados Unidos) mediante el uso de las siguientes condiciones de síntesis y purificación: sondas tipo candado de ADN y sondas iLock: 4 nM de oligonucleótidos de ADN Ultramer® estándar desalados; sondas tipo candado quiméricas e iLock: 4 nM de oligonucleótidos de ARN Ultramer® estándar desalados; sondas decoradoras: oligonucleótidos de ADN purificados por HPLC con fluoróforo conjugado en 5'. Todas las sondas tipo candado se fosforilaron previamente en el extremo 5' terminal para permitir la ligación. Las plantillas de ARN que albergan un sitio polimórfico localizado centralmente se muestran en la Tabla 1 (oligómeros de referencia) con el polimorfismo indicado con un asterisco.
Las sondas tipo candado se diseñaron, de manera que los brazos terminales formaran un círculo dentado cuando la base se aparea con las dianas de ARN consideradas y la base discriminatoria se localizó en el extremo 3' terminal de la sonda (tabla 1). Las sondas tipo candado de miARN usadas en este estudio se muestran en la tabla 1. Las sondas tipo candado quiméricas se solicitaron con un ARN terminal 3'-OH. Las sondas iLock se usaron en el presente trabajo con fines comparativos (tabla 2). El diseño de sondas iLock quiméricas estandarizadas incluye la sustitución de ARN en la base 3' terminal, así como también una base en el brazo 5' con el que la base terminal 3' compitió por la unión a la diana (base desplazada, Figura 4A, Tabla 2). Se usaron dos tipos de métodos de códigos de barras de sondas: el tradicional y el compatible con la lectura de secuenciación por ligación (usado en sondas iLock quiméricas dirigidas a miARN). Para la tinción tradicional del producto de círculo rodante (RCP) y la cuantificación digital, se incorporó una secuencia indicadora en la secuencia que une los brazos de la sonda, separada de los brazos de la sonda con una serie de 10 adeninas (tabla 2). Para este último, se usó una cadena principal consenso con un código de barras único específico de la sonda (tabla 3). Para permitir la decodificación del código de barras, se incorporó una secuencia cebadora de anclaje común en la cadena principal de la sonda, seguido de un código de barras de dos bases y una secuencia de anclaje de la biblioteca de secuenciación (tabla 3).
Ensayo de detección de ARN y cuantificación digital de sondas tipo candado e iLock amplificadas
La activación de iLock (escisión) se realizó en exceso 4:1 de sonda respecto a la plantilla (típicamente, la sonda iLock 2 nM se mezcló con plantilla de ARN 0,5 nM). Se incubaron reacciones duplicadas en un termociclador de tapa calentada a 51 °C durante 30 min, en un volumen de 10 pl que contenía 1 U de ADN polimerasa Taq (ThermoFisher Scientific), 4 U de inhibidor de RNasa y tampón de polimerasa Taq 1 * suministrado con MgCl28 mM. A continuación, se transfirieron 3 pl de volumen de muestra a una mezcla de reacción de ligación suplementada con 3,75 U de ADN ligasa PBCV-1 (SplintR, M0375S, NEB) o 4 U de T4Rnl2 (M0239S, NEB) en los tampones respectivos en un volumen final de 15 pl. Las reacciones se incubaron a 37 °C durante 30 min. Para las sondas tipo candado, se aplicaron condiciones de ligación idénticas, excluyendo la etapa de activación. Para la RCA, se incubaron 5 pl de la reacción de ligación con sonda decoradora 10 nmol, dNTP 0,125 mM, BSA 0,2 pg/pl, 250 mU de polimerasa Phi29 (Monserate Biotechnology Group) y tampón de reacción de phi291 x (Thermo Fisher) en un volumen final de 25 |jl a 37 °C durante 60 minutos. La polimerasa se inactivó por calor a 65 °C durante 3 minutos y se dejó enfriar a temperatura ambiente. La concentración final estimada de los productos amplificados fue de 5 pM y 20 pM para las sondas tipo candado e iLock respectivamente, a menos que se indique de cualquier otra manera. Se analizaron 15 j l de la muestra de RCA mediante el uso de la unidad de detección Aquila 400 (Q-linea, Uppsala). Si la concentración de RCP estaba fuera del intervalo dinámico del instrumento, las muestras se diluyeron en 4 nM de la sonda decoradora en solución de etiquetado 1 * (EDTA 20 mM, Tris-HCl 20 mM (pH 7,5), Tween 20 al 0,05 % y NaCl 1 M), se incubaron a 65 °C durante 3 min, se dejaron enfriar a temperatura ambiente durante 15 min y se volvieron a contar. Las reacciones con plantilla negativa se ejecutaron en paralelo con cada experimento como un control.
Detección de miARN múltiple mediante el uso de sondas iLock quiméricas y secuenciación por ligación
Para probar si las sondas iLock quiméricas pueden usarse para detectar la variación de la expresión de miARN en mezclas de ARN, hemos combinado miARN (let-7f):(let-7e):(let-7d) en las relaciones (1):(1):(1), (3):(1):(1), (1):(3):(1) y (1):(1):(3). La concentración inicial de miARN durante la etapa de activación de iLock fue de 0,5 nM y 1,5 nM para las muestras donde se aumentó la concentración de miARN. Se usó un cóctel de 2 nM de sondas iLock quiméricas de let-7f, let-7e, let-7d, cada una incluida con un código de barras único de dos nucleótidos (tabla 3) y secuencias químicas de secuenciación por ligación. El protocolo se realizó como se describió anteriormente (mediante el uso de ligasa PBCV-1) excepto que se añadieron gotitas de 10 j l de productos de RCA en portaobjetos de microscopio cargados positivamente (Superfrost Plus, Menzel Glaser) y se evaporaron a 55 °C durante 10 min. La cámara de silicona de volumen de 50 j l (cámara de hibridación de sellado seguro, Sigma) se montó sobre cada gotita y las muestras se lavaron 3 veces con TBS 1 *. El cebador de anclaje de 0,5 jM se hibridó en SSC 2 *, formamida al 20 % a temperatura ambiente durante 30 min. Después de 3 lavados con TBS 1 *, los RCP se mezclaron con una mezcla de secuenciación, que contenía tampón de T4 ADN ligasa 1 *, 10 jg de BSA, ATP 1 mM, oligonucleótidos de secuenciación 0,1 jM (tabla 3) y 5 U de T4 ADN ligasa. Los portaobjetos se incubaron a temperatura ambiente durante 60 min. Después de 3 lavados con TBS 1 *, se retiraron las cámaras de silicona, los portaobjetos se enjuagaron con ETOH al 100 %, se secaron al aire y se montaron (antidecoloración SlowFade, ThermoFisher). Las imágenes de RCP se adquirieron mediante el uso del objetivo 20*.
Para visualizar la activación y la eficiencia de la ligación de varias sondas iLock quiméricas (tabla 2) los productos se separaron electroforéticamente. Se procesaron ARN sintético 5 jM y sonda 2,5 jM como se indicó anteriormente. Después de la ligación, se diluyeron 50 nM de muestra en tampón de muestra TBE-Urea Novex® (LC6876, ThermoFisher Scientific) hasta un volumen final de 12 jl. Las muestras se desnaturalizaron a 70 °C durante 3 min, se colocaron en hielo durante 5 min, se cargaron 10 j l en gel de TBE-Urea Novex® al 15 % (EC6885 Box, ThermoFisher Scientific) y se separaron en el sistema de electroforesis Mini-Cell SureLock™ (ThemoFisher Scientific) mediante el uso del suministro de energía básica PowerPac (Bio-Rad) durante ~ 90 min a 170 V. Los geles se tiñeron mediante el uso de SybrGold 1 * (S11194, Invitrogen) en tampón de corrida TBE 1 * durante 15 min seguido de la obtención de imágenes en el sistema Gel Doc XR (Bio-Rad). En el ensayo de unión de sondas quiméricas, las concentraciones de la plantilla y de las sondas tipo candado como se indicó anteriormente se incubaron con ADN ligasa PBCV-1 a 62 m U/jl e inhibidor de RNasa 0,4 U /jl a temperatura ambiente durante 10 minutos. Las reacciones se detuvieron mediante la adición de 1 j l de EDTA 0,5 M y 5 j l de formamida al 100 %.
Resultados
Efecto del ARN 3'-OH sobre la ligación dependiente del ARN de la ADN ligasa PBCV-1: Unión de extremos de ARN para diferentes sustratos de ARN
Se comparó la capacidad de la ligasa PBCV-1 para circularizar sondas tipo candado hibridadas a let-7a, donde el extremo 5' de la sonda es ADN, y el extremo 3' fue ADN o ARN. Aunque la capacidad de T4Rnl2 para unir hebras aceptoras de ARN 3' quiméricas con hebras donantes 5' en el ARN está bien caracterizada, esto solo se ha demostrado para la ADN ligasa PBCV-1 en plantillas de ADN. Se comparó la eficiencia de la ligación de las sondas tipo candado quiméricas frente a las sondas tipo candado de ADN durante el tiempo de reacción mediante separación por PAGE (Figura 14). Además, se midió la eficiencia de la ligación como el número total de productos de la amplificación en círculo rodante (RCP), contados digitalmente para cada par de candado/plantilla (Figura 1A).
La ligasa PBCV-1 catalizó la unión de extremos de manera altamente eficiente cuando las PLP que contienen ARN 3' se ligaron en las dianas de miARN (Figura 1B). Para dianas diferentes de miARN más largas, la eficiencia de la ligación de las sondas quiméricas y no quiméricas fue similar (Figura 2A). Dado que la presencia de ARN da como resultado una mayor estabilidad de los híbridos de ácidos nucleicos, planteamos la hipótesis de que los híbridos más estables se ligarían más rápido durante la etapa de reacción inicial. T4Rnl2 ligó eficientemente las sondas tipo candado quiméricas, mientras que se observó una actividad relativamente menor para las sondas tipo candado de ADN (Figura 2B). Nuestro hallazgo de que la PBCV-1 acepta fácilmente sondas tipo candado quiméricas como sustratos, nos motivó a caracterizar sistemáticamente la fidelidad de la ligación en dianas sintéticas que tienen una posición polimórfica en el nucleótido ubicado centralmente (Figura 3 y Tabla 1). Para medir el efecto de los sustratos quiméricos con errores de apareamiento sobre la actividad de unión de extremos de la ligasa PBCV-1 y T4Rnl2, se hibridaron cuatro sondas tipo candado quiméricas, que difieren de un nucleótido 3' terminal (rA, rU, rG, rC,), con cuatro dianas de ARN diferentes cada una, se ligaron y amplificaron con RCA (Figura 3). La ligasa PBCV-1 fue altamente tolerante a la mayoría de los errores de apareamiento del ARN 3' (Figura 3A, 3B). T4Rnl2, por otro lado, fue moderadamente precisa ligando rC/rG (82 %) y rA/rC (64 %) pero mostró poca fidelidad de unión de extremos hacia otras combinaciones (Figura 3A, 3C).
Efecto de varias sustituciones de ARN en la activación de sondas iLock con plantilla de ARN, eficiencia y fidelidad de la ligación para PBCV-1, así como también para T4Rnl2
En nuestro estudio anterior, hemos utilizado la actividad de escisión de colgajo 5' específica de la estructura de la ADN polimerasaTaq,usada en el ensayo de invasión, para activar las moléculas de sondas tipo candado para la ligación. Hemos demostrado que este ensayo de sondas iLock aumenta la fidelidad de la detección de ARN basado en ligasa (Krzywkowski supra). Como la ligasa PBCV-1 fue bastante tolerante para la mayoría de los errores de apareamiento quiméricos 3' probados, se probó cómo la presencia de sustituciones de ARN en varias posiciones de una sonda iLock afectará la activación y la ligación de la sonda, en comparación con una sonda iLock de ADN. Se diseñaron múltiples sondas iLock, dirigidas al miARN let-7a (tabla 2), que contenían sustituciones de ARN en varias posiciones de la sonda (Figura 4A). Una sonda quimérica (llamada “3”) tenía la sustitución de ARN en el extremo 3' terminal. En la sonda “3D”, el terminal 3' y la base desplazada del colgajo 5' se sustituyó con ARN. La sonda “3D5” tenía además de las sustituciones en la sonda “3D”, una base de ARN adicional en la posición 3' a la posición “D”. Esta base de ARN se convertiría en el extremo donante 5'-fosfato en una reacción de ligación después de una activación de iLock exitosa. Por último, diseñamos una sonda con el terminal 3' y el colgajo 5' completo como bases de ARN (“3DF”), y una sonda donde solo el colgajo 5' se componía de ARN (“DF”) (es decir, que carece del ARN 3').
En comparación con una iLock para let-7a no quimérica, iLock-3 aumentó en gran medida la detección del miARN de let-7a. De acuerdo con PAGE de las sondas iLock ligadas (Figura 4C), solo se activó (escindió) una fracción de sondas iLock no quiméricas en las condiciones dadas e incluso se ligó una fracción aún menor (Figura 4C, carril 4). Prácticamente todas las sondas iLock-3 activadas se ligaron como se evidenció por un desplazamiento en el gel cuantitativo en la Figura 4C (carril 5), así como también el número total de productos de RCA generados con la sonda iLock-3 (Figura 4B). Cuando el nucleótido del colgajo desplazado por un ARN 3' terminal invasor se sustituyó con ARN, como en iLock-3D, se observó un aumento adicional de la eficiencia. La mayoría de iLock-3D se activó y se ligó (Figura 4C). Se observó un efecto similar para la sonda iLock-3DF, donde toda la secuencia del colgajo 5' fue ARN, mientras que el efecto positivo se perdió en ausencia de una base de ARN 3' terminal (Figura 4B). Curiosamente, la sonda iLock-3D5, que contiene 3'-(rN)/5'-(rN) después de la activación, mostró un rendimiento significativamente menor que una sonda iLock con un desoxirribonucleótido en la posición (5). Se observó un rendimiento significativamente mayor de las sondas iLock-3D para otros miARN que se han probado (miR21) mediante el uso de ligasa PBCV-1 y T4Rnl2 (Figura 5). De manera similar, en un experimento repetido con otras sondas iLock-3D también se observó un mayor rendimiento mediante el uso de let-7f como plantilla, tanto para PBCV-1 como para T4Rnl2 (Figura 27). Para probar si se mantiene la precisión de la detección de ARN con sondas iLock-3D quiméricas, nos dirigimos a las cuatro plantillas de ARN polimórfico (tabla 2) con cuatro sondas iLocks-3D quiméricas. Las sondas iLock quiméricas mostraron una excelente fidelidad hacia los pares de la sonda rC/rG, rA/rU y rU/rA coincidentes (Figura 6). Las sondas iLock-3D no mostraron productos de ligación cuando se omitieron las plantillas. T4Rnl2 mostró compatibilidad total con el ensayo de detección de ARN iLock, ligando fácilmente las sondas iLock 3'- OH(rN)/5'-p(N) coincidentes con las dianas (Figura 6B). Se detectó una fidelidad relativamente menor con el par rG/rC tanto para PBCV-1 como para T4RNl2, que mostraron una ligación errónea de rG/rU del 5 % y del 27 %, respectivamente (Figura 6A, 6B). En un experimento adicional, tanto PBCV-1 como T4Rnl2 mostraron compatibilidad total con el ensayo de detección de ARN iLock, ligando fácilmente las dianas que coincidían con las sondas iLock 3'-OH(rN)/5' - p(n) (Figuras 28A-B, Figura 29, A-B). El par rG/rC se detectó con fidelidad relativamente menor para ambas enzimas, que mostraron una ligación errónea de rG/rU del 21 % y 11 %, respectivamente. Por tanto, como puede observarse en la Figura 28A-B, las iLock quiméricas tienen mejor rendimiento que las iLock de ADN.
Detección múltiple de isoformas de let-7 mediante el uso de sondas iLock quiméricas
La alta capacidad de multiplexación es una de las características más ventajosas de las sondas tipo candado. La diferenciación de los productos amplificados, originados a partir de diferentes sondas tipo candado, se logra típicamente mediante el uso de oligonucleótidos decoradores únicos, específicos de la sonda, marcados con fluoróforos con diferentes espectros de emisión. Alternativamente, puede incorporarse una secuencia de código de barras única en la cadena principal de la sonda tipo candado que puede decodificarse mediante el uso de química de secuenciación por ligación de próxima generación. Para evaluar la compatibilidad de las sondas iLock quiméricas con la lectura de secuenciación por ligación, hemos rediseñado cuatro sondas iLock-3D para la familia let-7 como se describe en la sección de métodos (tabla 3). Para evaluar si las sondas iLock-3D con código de barras podrían utilizarse en perfiles de miARN múltiples, hemos combinado miARN de let-7f, let-7e, let-7d en cuatro relaciones estequiométricas diferentes. Idealmente, las relaciones se reflejarían con precisión en las lecturas de secuenciación específicas de los miARN. Las sondas iLock se aplicaron en multiplexación y los productos amplificados se fijaron sobre una superficie de vidrio. Los códigos de barras de los RCP se decodificaron mediante el uso de química de secuenciación por ligación. Dado que solo se usaron tres sondas iLock en este experimento, fue suficiente con secuenciar la primera posición del código de barras para decodificar el miARN que se detectó. Las sondas iLock mostraron una eficiencia relativa similar en el conjunto de miARN (Figura 7). En muestras donde se aumentó la concentración de un miARN, la señal aumentó para la sonda iLock correspondiente, mientras que la señal para las otras dianas permaneció estable (Figura 7C).
Ejemplo 2 - Ligación de sondas tipo candado de ADN, y sondas quiméricas que comprenden 1 o 2 ribonucleótidos en su extremo 3'.
Materiales y métodos
Las reacciones de ligación se realizaron con una concentración final de 1 nM de la sonda tipo candado de ADN o la sonda tipo candado quimérica con 1 o 2 bases de ribonucleótidos 3' terminales, y una concentración final de 2 nM de la plantilla sintética de ARN de KRAS o la plantilla de ADN de KRAS. Las secuencias de los oligonucleótidos se muestran en la Tabla 6. Las reacciones se incubaron en tampón de ligación que contenía inhibidor de RNasa 1 U/jl, BSA 0,2 mg/ml y tampón SplintR 1x o tampón de T4RNA ligasa II y ligasa SplintR 0,25 U /jl (conc. baja) o 1,25 u / j l (conc. alta), o t 4 ARN ligasa II 0,2 U /jl (conc. baja) o 1 U /jl (conc. alta), respectivamente, en volumen final de 10 j l durante 30 min a 37 C. Después de eso, los círculos se amplificaron con amplificación en círculo rodante en tampón de reacción de RCA, como se describió anteriormente, con una concentración final de círculos de 100 pM. Finalmente, los productos de RCA se etiquetaron con sondas de detección etiquetadas con Cy3 en concentración final de 10 pM. Los productos de RCA etiquetados se contaron digitalmente.
Resultados
Ambas sondas tipo candado quiméricas, con 1 o 2 bases de ribonucleótidos terminales 3' generan más productos de RCA contabilizares que las sondas tipo candado de ADN puro, tanto para la ligasa SplintR como para la T4 ARN ligasa II, y tanto en plantillas de ARN como en plantillas de ADN (Figura 8). Un aumento de la concentración de ligasa no tuvo ningún efecto sobre las sondas tipo candado quiméricas, sino un efecto ligeramente negativo sobre las sondas tipo candado de ADN. No hubo diferencia en el conteo de productos de RCA entre las sondas tipo candado quiméricas con 1 o 2 bases de ribonucleótidos 3' terminales.
En las plantillas de ARN, la actividad de la ligasa Splint R y la T4 ARN ligasa II son similares (Figura 8A). En las plantillas de ADN, la diferencia entre las sondas tipo candado de ADN y las sondas tipo candado quiméricas es similarmente alta para la ligasa SplintR como en las plantillas de ARN, mientras que se registró un aumento muy fuerte en los conteos de RCP para la ligación de las sondas tipo candado quiméricas en plantillas de ADN con la T4 ARN ligasa II (Figura 8B). La T4 ARN ligasa II no acepta extremos de ADN 3' y ADN 5' cuando se usa una plantilla de ADN, pero acepta fácilmente sondas con extremos de ARN 3' cuando se usa una plantilla de ADN.
En conclusión, el uso de sondas quiméricas hace que las reacciones de ligación tanto con la ligasa SplintR como con la T4 ARN ligasa II con plantillas de ARN sean más eficientes que las sondas de ADN convencionales. Las sondas quiméricas permiten el uso de T4 ARN ligasa II para reacciones de ligación con plantillas de ADN.
Ejemplo 3 - Detección de mutaciones puntuales de KRAS in situ mediante el uso de sondas tipo candado quiméricas y sondas iLock quiméricas
Materiales y métodos
Las líneas celulares ONCO-DG-1 y A-427 se cultivaron en medio de cultivo RPMI sin L-glutamina suplementado con FBS al 10 % L-glutamina 2 mM y penicilina-estreptomicina 1x (PEST). A-549 se cultivó en FBS al 10 % suplementado con DMEM y PEST 1x. Cuando fueron confluentes, todas las líneas celulares se sembraron en portaobjetos Superfrost Plus y se dejaron adherirse durante 12 h. Las células se fijaron después en paraformaldehído al 3 % en PBS tratado con DEPC (DEPC-PBS) durante 15 min a temperatura ambiente. Después de la fijación, los portaobjetos se lavaron dos veces en DEPC-PBS y se deshidrataron a través de una serie de etanol de 70 %, 85 % y 100 % durante 4 min cada uno. Las cámaras de sellado seguro se montaron en los portaobjetos, las células se hidrataron mediante un breve lavado con PBS-T (DEPC-PBS con Tween20 al 0,05 % seguido de una permeabilización con HCl 0,1 en H2O durante 1 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron dos veces en DEPC-PBS-T y luego se añadieron sondas de ADN o quiméricas en concentración final de 50 nM en tampón de hibridación que contenía SSC 2x, formamida 20& e inhibidor de RNasa 0,4 U/jl. Las secuencias de oligonucleótidos se muestran en la Tabla 6. Las sondas se hibridaron durante 60 min a 37 °C. Luego se retiró la mezcla de hibridación de las sondas y las células se lavaron en tampón de lavado precalentado (37 °C) que contenía SSC 2x y formamida al 25 % durante 15 min a 37 °C y una vez en tampón de lavado precalentado (37 °C) que contenía SSC 2x y formamida a 20 % durante 15 min a 37 °C. Las células se lavaron una vez en PBS-T. Luego se añadió una mezcla de reacción de ligación a los experimentos de sondas tipo candado quiméricas/ADN (Figura 9) y se añadió una mezcla de reacción de invasor al experimento de iLock quiméricas/ADN (Figura 10). La mezcla de reacción de ligación contenía tampón de ligasa SplintR, BSA 0,2 mg/ml, inhibidor de RNasa 0,8 U /jl y ligasa SplintR 0,25 U/jl. La reacción de ligación se incubó durante 60 min a 37 °C. La mezcla de reacción Invader contenía lo mismo que la reacción de ligación y ADN polimerasa Taq adicional 0,1 U/jl. La mezcla de reacción Invader se incubó durante 60 min a 37 °C. Subsecuentemente, todas las reacciones experimentales se lavaron con PBS-T dos veces. El cebador de RCA 100 nM se hibridó con los círculos in situ en SSC 2x y tampón de hibridación de formamida al 20 % durante 30 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron dos veces en PBS-T. A continuación, se añadió una mezcla de reacción de RCA que contenía tampón de reacción de phi29 1x, dNTP 0,25 mM, BSA 0,2 mg/ml, polimerasa phi29 1 U/|jl y glicerol 5 % y se incubó a 37 C durante 3 horas. Subsecuentemente, las células se lavaron en PBS-T dos veces y las sondas de detección se hibridaron con los productos de RCA in situ (sondas etiquetadas con Cy3 para las sondas de KRAS de tipo silvestre, sondas etiquetadas con Cy5 para las sondas de KRAS mutante) en SSC 2x y tampón de hibridación de formamida al 20 % durante 30 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron en PBS-T tres veces, los núcleos se tiñeron con DAPI, se lavaron tres veces de nuevo y luego se montaron en medio de montaje de desvanecimiento lento. Se obtuvieron imágenes de las células en un microscopio fluorescente con objetivo 20x y los productos de RCA se cuantificaron mediante el uso del software Cell profiler.
Resultados
Las sondas tipo candado quiméricas dieron como resultado una mayor eficiencia de detección de ARN in situ tanto en las líneas celulares A549 como en OncoDGI en comparación con las sondas tipo candado de ADN (Figura 9B). Además, la relación de RCP específicos/inespecíficos por célula tanto en A549 como en OncoDGI aumenta para las sondas tipo candado quiméricas respecto a las sondas tipo candado de ADN (se detectan más RCP mutantes que RCP de tipo salvaje en las células A549 (que portan una mutación puntual en el codón 12 de KRAS) y se detectan más RCP de tipo salvaje que RCP mutantes en las células OncoDGl (KRAS de tipo silvestre), lo que hace posible detectar con mayor precisión mutaciones puntuales con sondas quiméricas directamente sobre ARN in situ.
Para aumentar aún más la especificidad para las mutaciones puntuales, se aplicaron sondas iLock quiméricas in situ y se encontró detección específica del ARNm de KRAS de tipo silvestre en las células OncoDGI y se detectó la mutación puntual del codón 12 de KRAS en las células A549 (Figura 10).
En resumen, las sondas quiméricas aumentan fuertemente la eficiencia de detección del ARN in situ, lo que hace que el análisis de ARN in situ sea más sensible, rentable y eficiente en tiempo que los enfoques clásicos de ADNc. Además, en comparación con las sondas tipo candado de ADN, las sondas tipo candado quiméricas, y especialmente las sondas iLock quiméricas muestran una mayor especificidad, lo que hace que el análisis de ARN in situ sea más potente y preciso.
Ejemplo 4 - Sondas iLock de llenado de brechas
Materiales y métodos
Reacción iLock de llenado de brechas en solución:
Las reacciones de ligación se realizaron con una concentración final de 10 nM de la sonda ILock de llenado de brechas y una concentración final de 30 nM de la plantilla sintética de ARN de KRAS (o sin plantilla en el control negativo). Las secuencias de los oligonucleótidos se muestran en la Tabla 7. Las reacciones se incubaron en tampón de reacción que contenía inhibidor de RNasa 1 U/jl, transcriptasa inversa 1 U/jl, dNTP 25 jM (o ningún dNTP en el control negativo del llenado de brechas), BSA 0,2 mg/ml, tampón de ligasa SplintR 1x, ADN polimerasa Taq 0,1 U /jl y ligasa SplintR 0,25 U /jl en volumen final de 10 j l durante 60 min a 37 °C. Después de eso, los círculos se diluyeron 10x en PBS-T (a una concentración teórica de 1 nM) y luego se amplificaron con amplificación en círculo rodante en tampón de reacción de RCA, como se describió anteriormente, con una concentración final de círculos de 100 pM. Finalmente, los productos de RCA se etiquetaron con sondas de detección etiquetadas con Cy3 en una concentración final de 10 pM y se contaron digitalmente.
Reacción iLock de llenado de brechas in situ
Las células OncoDG1 se prepararon y trataron, como se describió en el Ejemplo 3. Las sondas iLock de llenado de brechas se hibridaron al ARN de KRAS in situ en una concentración de 50 nM con las mismas condiciones que en el Ejemplo 3 Después del lavado, a las células se les añadió una mezcla Invader de polimerización para el llenado de brechas que contenía inhibidor de RNasa 1 U/jl, transcriptasa inversa 10 U/jl, dNTP 25 jM (o ningún dNTP en el control negativo de llenado de brechas), BSA a 0,2 mg/ml, tampón de ligasa SplintR 1x, ADN polimerasa Taq 0,1 U /jl y ligasa SplintR 0,25 U /jl y se incubaron en las células durante 60 min a 37 °C. Las células se lavaron dos veces en PBS-T. A continuación, se añadió una mezcla de reacción de RCA que contenía tampón de reacción de phi29 1x, dNTP 0,25 mM, BSA 0,2 mg/ml, polimerasa phi29 1 U /jl y glicerol 5 % y se incubaron a 37 °C durante 3 horas. Subsecuentemente, las células se lavaron en PBS-T dos veces y las sondas de detección marcadas con Cy3 se hibridaron con los productos de RCA como se describió anteriormente. Las células se lavaron en PBS-T tres veces, los núcleos se tiñeron con DAPI, se lavaron tres veces de nuevo y luego se montaron en medio de montaje de desvanecimiento lento. Se obtuvieron imágenes de las células y productos de RCA en microscopio fluorescente con objetivo 20x y los productos de RCA se cuantificaron mediante el uso del software Cell profiler.
Resultados
Los productos de RCA de las reacciones Invader de polimerización de llenado de brechas en solución se cuantificaron y se representaron en la Figura 11A. Cuando la plantilla de ARN estaba presente, se contaron productos de RCA, lo que indica que la reacción funcionó lo suficiente. Se contó un número significativamente menor de RCP cuando no había ninguna plantilla (plantilla negativa) lo que indica que las sondas iLock de llenado de brechas no se pudieron extender y, por lo tanto, el colgajo 5' no se pudo retirar y no se pudo ligar al extremo 3'.
En una reacción de control, en la que estaba presente la plantilla de ARN pero no se añadieron dNTP, se contó un número significativamente menor de RCP respecto a la reacción positiva (con plantilla y dNTP), lo que indica que el llenado de brechas a través de la polimerización y la formación triple fue limitado, reduciendo significativamente la escisión del colgajo y, por lo tanto, generando menos productos de ligación (Figura 11A). La misma tendencia fue visible en la reacción in situ (Figura 11B y C).
Ejemplo 5 - Uso de Phi29 como enzima transcriptasa inversa
Materiales y métodos
Oligonucleótidos
Las secuencias de oligonucleótidos se muestran en la Tabla 8 y la Tabla 9. Las sondas se proporcionaron como se describió en el Ejemplo 1. Las reacciones de ligación se realizaron en plantillas sintéticas de ARNm de KRAS. Las sondas tipo candado se diseñaron de manera que, tras la hibridación del ARN, la sonda experimenta circularización lo que forma una muesca entre los brazos terminales. Para una conveniente evaluación del tamaño de los productos de círculo rodante (RCP), se incorporó una secuencia indicadora en la secuencia que une los brazos de la sonda (cadena principal). Se usaron decoradores complementarios para la tinción de los RCP mediante hibridación a la secuencia indicadora. Para la evaluación de la RCA en tiempo real, el ADN amplificado se tiñó con el colorante SybrGold.
RCA en tiempo real. Para evaluar el efecto de las bases de ARN sobre el rendimiento de la transcripción inversa mediante la polimerasa Phi29, se mezclaron 20 nM de sondas tipo candado con 10 nM de plantilla de ARN suplementado con inhibidor de RNasa 4 U (DNA Gdansk), 3,75 U de Ad N ligasa PBCV-1 (SplintR, M0375S, NEB) en el tampón respectivo en un volumen final de 15 pl. Las reacciones se incubaron a 37 °C durante 30 min. Después de la ligación, se mezcló 2 pl de volumen de ligación (círculos) en 18 pl de mezcla de reacción de RCA que contenía tampón de reacción de Phi29 1x (Thermo Fisher), dNTP 125 pM (<d>N<a>Gdansk), BSA a 0,2 mg/ml (NEB) y SybrGold 1 x (S11194, Invitrogen) hasta una concentración final de círculos de 2 nM. Para garantizar el inicio simultáneo de la RCA en todas las muestras, los círculos se colocaron en las tapas del tubo y se centrifugaron mediante el uso de una centrífuga de mesa en la mezcla maestra dispuesta previamente. La RCA se inició inmediatamente y la incorporación de SybrGold se monitoreó mediante el uso de un sistema de qPCR Mx3005P (Agilent Genomics) a 37 °C durante 60 min, seguido de la inactivación de Phi29 a 65 °C durante 2 min.
Para investigar si la eficiencia de RCA de los círculos ricos en ARN puede estimularse mediante la adición de transcriptasa inversa, se añadieron 100 U de transcriptasa inversa RNasaH(-) T ranscriptME (DNA Gdansk) a la mezcla de reacción de RCA.
Secuenciación de productos de RCA generados a partir de círculos que contienen ARN
Monomerización
Para secuenciar las bases incorporadas dentro de los productos de RCA que corresponden a las bases de ARN dentro de las plantillas circulares, los productos de RCA se monomerizaron primero mediante digestión por restricción. Primero, los productos de RCA de las mediciones de RCA en tiempo real, como se describió anteriormente, se diluyeron en PBS-Tween al 0,05 % a una concentración de 100 pM. A continuación, los productos de RCA se digirieron con enzima de restricción AluI en una mezcla de reacción que contenía tampón de ADN polimerasa Phi29 1x, BSA 2 mg/ml, oligonucleótido de restricción 100 nM (AluI KRAS RO - Tabla 9), AluI (NEB) 120 mU/pl y concentración final 10 pM de productos de RCA durante 10 min de incubación a 37 °C y posterior inactivación por calor a 65 °C durante 2 min. Después de la digestión completa de los productos de RCA 10 pM, la concentración del monómeros de RCA es de aproximadamente 10 nM (1 hora de RCA de un círculo de 80 bases produce una amplificación de ~1000x). Los monómeros de RCA se diluyeron a 100 pM en PBS-Tween al 0,05 %.
Preparación de la biblioteca de secuenciación de monómeros de RCA
Los monómeros de RCA se marcaron primero con secuencias adaptadoras de Illumina durante una reacción de PCR, que contenían tampón de ADN polimerasa Taq 1x (NEB), MgCb (NEB) 1,5 mM, dNTP 250 pM, SybrGold 1x, ADN polimerasa Taq (NEB) 25 mU/pl, cebador directo P<e>1 (tabla 9) 0,5 pM, cebador inverso PE2 (tabla 9) 0,5 pM y concentración final de monómeros de RCA 10 pM. La reacción de PCR se inició con 5 minutos de desnaturalización a 95 °C y se cicló entre 95 °C durante 15 segundos, 55 °C durante 30 segundos y 70 °C durante 20 segundos durante 20 ciclos. La reacción se monitoreó en el instrumento de qPCR y la reacción se detuvo antes de que la amplificación alcanzara la saturación. Después de la primera etapa de PCR (etapa de extensión), se añadió 1 pl de los productos de PCR en la mezcla de PCR de índice que contenía tampón Phusion HF 1x (Thermo Scientific), d(A,T,G,C)TP (Thermo Scientific) 0,2 mM, DMSO al 1 %, cebadores de PCR de índice 250 nM (tabla 11), cada muestra se etiquetó con una combinación única de 1 de 7 cebadores de índice directo diferentes y 1 de 3 cebadores de índice inverso diferentes) y se programó para 2 min iniciales a 95 °C, y 2 ciclos de 95 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 1 min y 72 °C durante 1 min, y un ciclo adicional de 72 °C durante 3 min. Los productos de PCR indexados se diluyeron 200 veces en una mezcla de PCR que contenía tampón Phusion HF 1x (Thermo Scientific), d(A,T,G,C)TP 0,2 mM (Thermo Scientific), DMSO al 1 %, cebadores P5 y P7500 nM y se programó a 2 min a 95 °C y 15 ciclos de 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s. Los productos de PCR se combinaron y purificaron mediante el uso del kit de purificación por<p>C<r>QIAquick y se secuenciaron mediante KT v2 NSQ® 500 hi-Output (75 CYS) en el sistema NextSeq® 550 (Illumina). Las lecturas que contenían secuencias de cebadores correctas en las posiciones esperadas se extrajeron y analizaron con Weblogo.
Evaluación morfológica del tamaño y la intensidad de los RCP
Para medir el tamaño y las intensidades de los productos de RCA, los productos de RCA de la reacción de RCA en tiempo real se diluyeron a una concentración final de 20 pM, se etiquetaron con una concentración final de sondas decoradoras de 5 nM en condiciones de hibridación estándar. Se aplicaron 10 pl de los productos de RCA marcados con fluorescencia a portaobjetos de vidrio Superfrost (Thermo Fisher), se esparcieron por un cubreobjetos de 20 x 20 mm (Menzel) y se dejaron unir electrostáticamente a la superficie cargada positivamente durante 15 min de incubación. Los cubreobjetos se retiraron, los portaobjetos se lavaron brevemente en PBS, se montaron en medio de montaje y se obtuvieron imágenes en un microscopio fluorescente Zeiss Axioplan con un aumento de 20x en el canal de Cy3. Las imágenes se exportaron como imágenes originales en blanco y negro (BW) y se procesaron con el software Cell Profiler. Brevemente, cada imagen se procesó previamente mediante el uso de un filtrado de sombrero de copa automatizado. Los objetos se identificaron mediante el uso de umbrales ajustados manualmente y se separaron sobre la base de la intensidad de los objetos. La intensidad de fluorescencia promedio y el tamaño del objeto se registraron, se exportaron como un archivo csv y se procesaron en R! Studio.
Resultados
La ADN polimerasa Phi29 acepta círculos quiméricos como plantillas para la amplificación en círculo rodante (RCA) Se ha observado que las sondas tipo candado quiméricas circularizadas que contienen tanto nucleótidos de ARN como de ADN pueden usarse como sustratos para la RCA, lo que sugiere que la ADN polimerasa Phi29 posee una actividad de transcriptasa inversa. Para investigar esta actividad, hemos circularizado una variedad de sondas tipo candado quiméricas de ARN/ADN que contienen 1-7 sustituciones de ARN en una cadena principal de una sonda de ADN y hemos usado las sondas circularizadas como plantillas durante la RCA (Figura 13).
La reacción de RCA se monitoreó en tiempo real mediante incorporación de SybrGold. Adicionalmente, los productos de RCA se contaron digitalmente y se evaluó su tamaño e intensidad (es decir, morfología).
Observamos que PBCV-1 selló fácilmente tanto las muescas de sondas de ADN puro como las de sondas 3'-(rN)/5'(N) quiméricas y que la polimerasa Phi29 aceptó tanto círculos de ADN puro como los que contenían ARN como plantillas para la RCA (Figura 13A). El mayor número de productos de RCA de las sondas de ARN 3' se debe probablemente a la mayor eficiencia de ligación de las sondas quiméricas, como se describió en detalle en el Ejemplo 1. Cuando no se añade ninguna plantilla durante la reacción de ligación, las sondas no se ligan y no pueden amplificarse (Figura 13A, diana -).
A continuación, nos propusimos investigar la eficiencia de la RCA de los círculos quiméricos de ADN/ARN sin el sesgo de la reacción de ligación. Para este propósito, añadimos una sustitución de ARN en la cadena principal circular que no participa en la reacción de ligación. Consecuentemente, todas las sondas contenían las mismas secuencias del brazo de la sonda de ADN complementarias a la diana (que contribuyen a formar el sustrato de ligación) y se ligaron en la misma diana de ARN. Luego investigamos cómo un número creciente de sustituciones de ARN afecta la eficiencia de la reacción de RCA mediante el conteo de los productos de RCA (Figura 13B) y el monitoreo de la reacción de amplificación en tiempo real (Figura 13C). Se usaron sondas tipo candado que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 119, 120, 124, 131, 110, 111 y 112, que son una sonda de ADN y sondas quiméricas que tienen 0, 1, 2, 3, 4, 5 y 7 ribonucleótidos consecutivos.
No observamos ningún efecto sobre la eficiencia de la RCA cuando se sustituyó un único ARN en la cadena principal de la sonda (círculo) (Figura 13 B y C, Figura 32A y 32B). Se observó una inhibición fuerte de la RCA (aproximadamente 90 %) cuando los círculos se sustituyeron con 2 nucleótidos de ARN consecutivos (Figura 13B y 13C, Figura 32A y 32B). Para los círculos con más de 2 sustituciones de ARN, no se detectó amplificación (Figura 13E, Figura 32C). Cuando se obtuvieron imágenes de los productos por círculo rodante (RCP) mediante el uso de microscopía de epifluorescencia, el tamaño promedio y la intensidad de los RCP se redujeron para los círculos con 2 sustitutos de ARN consecutivos (Figura 13D). Más de dos sustituciones consecutivas de ARN (3-7) condujeron a la inhibición completa de la RCA y no se detectaron RCP en estas muestras.
Adicionalmente, investigamos si la RCA de los círculos ricos en ARN puede recuperarse al suministrar una transcriptasa inversa M-MuLV durante la reacción de RCA. Sin embargo, bajo las condiciones de reacción usadas, la actividad RCA no se recuperó en presencia de la transcriptasa inversa. Por el contrario, la velocidad de amplificación disminuyó significativamente por la adición de la transcriptasa inversa M-MuLV (panel inferior de las curvas) en comparación con la reacción de RCA sin transcriptasa inversa adicional (Figura 19).
La ADN polimerasa Phi 29 preferentemente transcribe inversamente las pirimidinas de ARN durante la RCA
En el experimento anterior, se aumentó gradualmente la sustitución de las bases de ADN en la cadena principal de los círculos con bases de ARN. Se observó una fuerte inhibición de la amplificación para círculos con sustituciones rGrA y rGrArC. Para estudiar si existe alguna dependencia de la secuencia en la eficiencia de la RCA de círculos que contienen ARN, monitoreamos la velocidad de la RCA en tiempo real mediante el uso de círculos con una única base de ARN rU/rA/rC/rG, así como también, segmentos de homonucleótidos de longitud de dinucleótidos y trinucleótidos (Tabla 9). Se observó una RCA eficiente para todas las sustituciones únicas de ARN (Figura 18A). Para las sustituciones de dinucleótidos de ARN, la mayor velocidad de RCA se observó para los círculos con rCrC seguido de círculos con rUrU, mientras que los círculos con rArA y rGrG se inhibieron sustancialmente. Para los círculos con trinucleótidos de ARN, solo los círculos con rCrCrC generaron RCA detectable, sin embargo, a una velocidad sustancialmente más lenta que los círculos que contenían rCrC (Figura 18A). Una serie de sondas de ribonucleótidos SEQ ID NO: 108-112, 124-127, 131-134, 137 y 139 contenían otros segmentos de ribonucleótidos heteronucleótidos. Los experimentos se repitieron mediante el uso de las sondas de SEQ ID NO: 267-281 (Tabla 13) que no tenían los segmentos de ribonucleótidos adicionales y se observaron resultados similares (Figuras 24-25).
Para investigar si la RCA puede recuperarse para segmentos de ARN/ADN mixtos más largos, interespaciamos 1 y 2 bases de ADN en segmentos de 3 y 6 bases de ARN, respectivamente (Figura 18 B). Los círculos que contenían la secuencia rGArCGrU en la cadena principal se amplificaron, mientras que no se detectó RCA para los círculos con 6 sustituciones de ARN interespaciadas, o para los círculos con 5 y 7 bases de ARN consecutivas (Figura 18B).
Los iones de manganeso aumentan la actividad de RCA dependiente de ARN de la ADN polimerasa phi29
Como determinadas ADN polimerasas dependientes de ADN son capaces de transcribir de forma inversa el ARN en presencia de Mn2+, comparamos las velocidades de RCA de la ADN polimerasa phi29 con Mg2+ y Mn2+. Mediante el uso de Mn2+ como cofactor, la ADN polimerasa phi29 además de rC también amplificó eficientemente los segmentos rU y rA simples, de dinucleótidos y de trinucleótidos (Figura 24). Curiosamente, las velocidades de amplificación de los círculos con rCrC, rUrU y rArA fueron mayores en comparación con los círculos sustituidos con un ARN único, lo que también fue cierto para rCrC con Mg2+ como cofactor (Figura 24A, B). Para investigar si la RCA puede recuperarse si se mezclan múltiples bases de ARN con bases de ADN, se amplificaron múltiples construcciones quiméricas con Mg2+ y Mn2+ (Figura 25). De acuerdo con nuestras observaciones, la ADN polimerasa phi29 fue capaz de acoplarse en una RCA dependiente de Mn2+ de manera eficiente cuando las bases de ARN se interespaciaron con ADN (Figura 25, Tabla 12). Curiosamente, el sustrato quimérico circular con hasta 8 bases de ARN se amplificó bien cuando las sustituciones se organizaron en un patrón disperso uniformemente (Figura 25).
La secuenciación de productos de círculos rodantes demuestra la capacidad de la ADN polimerasa Phi29 para retrotranscribir ARN
Dado que la velocidad de amplificación de la polimerasa Phi29 fue inversamente proporcional al número de bases de ARN en el sustrato, se consideró que la enzima puede ignorar las posiciones del ARN durante la RCA, introduciendo deleciones de uno o dos nucleótidos en el producto amplificado. Para validar esta hipótesis, se amplificaron círculos que contenían sustituciones de uno y dos<a>R<n>(rAr/Ur/G/rC/rArA/rUrU/rGrG/rCrC, Tabla 9) y se monitoreó la velocidad de RCA en tiempo real como se describió anteriormente. Después de la amplificación, se prepararon bibliotecas de secuenciación a partir de los diferentes productos de amplificación y luego se secuenciaron mediante el uso del sistema Illumina NextSeq® 550. Las lecturas de secuenciación de longitud completa se extrajeron del conjunto de datos, las lecturas de secuenciación se alinearon y la frecuencia de las bases se calculó para cada posición en la cadena principal de la sonda tipo candado (Figura 20).
De acuerdo con nuestras observaciones, la ADN polimerasa Phi29 incorporó los nucleótidos de ADN esperados en el RCP amplificado donde la secuencia plantilla era ARN. Para los círculos sin sustituciones de ARN, >99 % de los monómeros secuenciados mostraron una base incorporada correctamente en la región de la sonda tipo candado R1 (denominada aquí como precisión) resaltada en la Figura 20 (99,68 %, precisión de RT para la posición R1 para la sonda tipo candado de<a>D<n>). Cuando la posición R1 se sustituyó por rA, rC, rG o rU, la precisión de RT fue de 99,88 %, 99,70 %, 96,07 %, 99,88 %, respectivamente, mientras que rA, rC y rU se copió con mejor precisión que la secuenciación, o al menos no peor que para dG en la posición investigada, rG destaca con un mayor error de replicación. Curiosamente, este mayor error de incorporación se observó no solo para la posición R1, sino para todas las siguientes bases de citosina en la cadena principal de la sonda tipo candado. Cuando ambas posiciones R1 y R2 se sustituyeron por rArA, rCrC, rGrG y rUrU, la precisión de RT para el sitio R1/R2 fue de 99,81/99,59 %, 99,82/99,86 %, 93,01/89,7 % y 99,93/99,94 %, respectivamente. De manera similar a los círculos con una única sustitución rG en R1, todos los sustratos con dinucleótido de ARN demostraron una mayor tasa de error para las citosinas que no son de ARN a lo largo de la secuencia de la cadena principal de la sonda.
En un experimento adicional, cuando la posición R1 se sustituyó con rA, rC, rG o rU, la tasa de error promedio fue de 0,111 %, 0,153 %, 2,259 % y 0,084 % respectivamente Figura 30, Figura 31, Figura 33). Aunque rA, rC y rU se copiaron con la misma precisión que el ADN (medido mediante secuenciación), rG destaca con un mayor error de replicación. Curiosamente, este mayor error de incorporación se observó no solo para la posición R1, sino para todas las bases de guanosina en la cadena principal de la sonda tipo candado (visible como picos de alta tasa de error en la Figura 31 y la Figura 33) y mayores frecuencias de timina para los gráficos de logotipo de las sondas tipo candado rG en la Figura 30. Cuando tanto las posiciones R1 como R2 se sustituyeron con rArA, rCrC, rGrG y rUrU, la tasa de error para el sitio R1/R2 fue de 0,269/0,561 %, 0,107/0,109 %, 2,827/2,231 % y 0,144/0,220 %, respectivamente. De manera similar a los círculos con una única sustitución de rG en R1, todos los sustratos de dinucleótidos de ARN demostraron una mayor tasa de error para las guanosinas que no son de ARN a lo largo de la secuencia de la cadena principal de la sonda (Figura 3C).
Demostramos una actividad de transcripción inversa limitada de la ADN polimerasa Phi29. Mostramos que sustitutos únicos de ARN en plantillas circulares no tienen impacto en la eficiencia de la RCA. Sin embargo, encontramos que la amplificación se suprimió cuando se sustituyeron más bases de ARN consecutivas en la secuencia de la plantilla circular. Con el fin de caracterizar esta actividad novedosa de la polimerasa Phi29, amplificamos plantillas circulares que contenían una, dos o tres bases de ARN consecutivas rA, rG, rC o rU con la polimerasa Phi29 y monitoreamos la velocidad de RCA en tiempo real. Además, se probaron varias combinaciones de diferentes bases de ARN y bases de ARN interespaciadas con bases de ADN. Nuestros datos demuestran una preferencia por sustratos circulares que contienen bases de ARN de pirimidina, ya que los círculos con 3 bases de pirimidina consecutivas aún pueden amplificarse, pero no los círculos con 3 bases de purina consecutivas. Curiosamente, los círculos interespaciados con 3 sustituciones de ARN con bases de ADN condujeron a una recuperación parcial de la eficiencia de la RCA, lo que indica que la RCA de círculos que contienen ARN se restringe a sustituciones únicas de bases de ARN o segmentos muy cortos de bases de ARN consecutivas. El intento de aumentar la eficiencia de RCA de círculos que contienen segmentos más largos de bases de ARN mediante la adición de transcriptasa inversa falló. En su lugar, la RCA se suprimió en presencia de transcriptasa inversa dedicada, potencialmente debido al bloqueo de sustratos circulares para la unión de la ADN polimerasa Phi29.
Nuestros datos ilustran claramente que el mecanismo, mediante el cual la polimerasa copia círculos que contienen ARN, es la transcripción inversa, ya que se encontró la base de ADN coincidente incorporada en los productos de RCA con alta frecuencia (>99 % para rA, rU y rC, ~96 % para rG). La precisión general de incorporación en sustitutos de ARN no fue diferente de la precisión en sustratos de ADN puro.
Ejemplo 6 - Detecciónin situde ARNm mediante el uso de sondas quiméricas
Materiales y métodos
Las células BjHtert y MEF se cultivaron en medio de cultivo que consistió en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Invitrogen), suero fetal bovino al 10 % (Sigma) y mezcla de penicilina-estreptomicina al 1 % (PEST; Gibco). Ambas líneas celulares se cultivaron en una incubadora celular humidificada a 37 °C en presencia de CO2 al 5 %. Antes de los experimentos, las células se separaron del matraz de cultivo mediante el uso de solución de tripsina-EDTA al 0,25 % (T4049 Sigma) y se cultivaron en placas de cultivo celular de 150 mm con 5 portaobjetos de microscopio sumergidos durante la noche. Los portaobjetos con las células unidas se lavaron dos veces con PBS, se fijaron en PBS tratado con pirocarbonato de dietilo (DEPC) recién preparado que contenía formaldehído al 3,4 % durante 15 min en hielo. Después de eso, los portaobjetos se lavaron dos veces con DEPC-PBS, se deshidrataron en un gradiente de etanol (70 %, 85 % y 99 %; 3 min cada uno), se secaron al aire y se almacenaron a 80 °C. En el día del experimento, las células se descongelaron, se secaron y, para cada condición experimental probada, se aislaron cubriendo con una cámara de sellado seguro de 8 mm de diámetro y 50 ul de volumen (Invitrogen). Las células se rehidrataron con tampón DEPC-TBS. A cada etapa de incubación le siguieron dos lavados con DEPC-PBS-T (PBS tratado con (DEPC) que contenía Tween 20 al 0,05 % como agente surfactante). Todas las incubaciones se realizaron en una cámara húmeda para evitar la evaporación de la mezcla de reacción.
Las sondas para ambos transcritos de ACTB (Tabla 4) se agruparon e hibridaron previamente (grupo 1: PLP no quiméricas, grupo 2: PLP quiméricas, grupo 3: iLocks, grupo 4: iLocks quiméricas) en concentración final 0,1 pM en tampón de hibridación (Tris-HCl 475 mM a pH 8; EDTA 0,95 mM, NaCl 760 mM se muestran en la Tabla 4. Inhibidor de RNasa (DNA Gdansk) 0,8 U/pl en un volumen de reacción de 50 ul a 37 °C durante 2 horas. Las sondas sin hibridar se retiraron mediante lavado estricto mediante el uso de tampón TBS-Tween precalentado (37 °C), dos veces. La reacción de ligación se realizó mediante la adición de ligasa SplintR (NEB) 0,5 U/pl, tampón SplintR 1x, inhibidor de RNasa 0,8 U/pl en DEPC-ddH2O. La ligación y activación de iLock (para sondas iLock) se realizó simultáneamente mediante la adición de ADN polimerasa Taq en concentración final de 0,1 U/pl. Los portaobjetos se incubaron durante 2 horas a 37 °C y se lavaron dos veces con DEPC-PBS-T.
La reacción de amplificación en círculo rodante se realizó mediante la adición de ADN polimerasa phi29 a 1 U/pl (Monserate), tampón de ADN polimerasa phi29 1x, dNTP 0,25 mM (Thermo Scientific), BSA (NEB) 0,2 pg/pl, glicerol al 5 % y DEPC-ddH2O en 50 pl de volumen de reacción final durante 6 horas a 37 °C y se lavó dos veces con DEPC-PBS-T.
Finalmente, los oligonucleótidos decoradores se hibridaron con productos de RCA a una concentración final de 0,1 |jM en tampón de hibridación (SSC 2X, formamida al 20 %, ddH2O) con Hoechst 33342 (Thermo Scientific) en DEPC-PBS a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las células se lavaron dos veces con DEPC-PBS-T, se deshidrataron al pasar a través de una serie de etanol (70, 85 y 99,5 % de etanol, cada uno durante 3 min) y se montó el cubreobjetos con medio de desvanecimiento lento (Thermo Scientific).
Las señales en las células se cuantificaron mediante el uso del software CellProfiler y se analizaron en R!
Resultados
Aunque las sondas se agruparon entre sí, solo se observó la señal esperada en las células (Figura 21A). Además, las sondas tipo candado quiméricas funcionaron de manera más eficiente (generaron productos de RCA más detectables) en comparación con las sondas tipo candado no quiméricas. Las sondas iLock generaron una señal significativamente menor en comparación con las sondas tipo candado convencionales, lo que indica que se requiere una optimización adicional del protocolo para garantizar la activación eficiente de la sonda y la detección del ARNin situ.Sin embargo, el análisis de los datos reveló que la señal esperada también se observó para las sondas iLock quiméricas y no quiméricas, y la señal también fue mayor para las sondas iLock quiméricas (Figura 21B).
Ejemplo 7 - detección de miR21 en un soporte sólido mediante el uso de PLP de ADN, PLP quiméricas y sondas iLock de a Dn y quiméricas.
En este ejemplo, miR21 se inmoviliza en la superficie del portaobjetos y se detectain situ.miR21 se prepara con un resto de biotina 5' separado de la secuencia diana con enlazador rU 16x. miR21 se detecta con sondas tipo candado convencionales y quiméricas así como también sondas iLock quiméricas y no quiméricas. Las secuencias de la diana y las sondas se muestran en la Tabla 5.
Materiales y métodos
Se colocaron cámaras de sellado seguro de 8 mm de diámetro y 50 ul de volumen (Invitrogen) sobre los portaobjetos de microscopio recubiertos con neutravidina (PolyAn). En total, se usaron seis cámaras de silicona de sellado seguro. La diana miR21 (miR21_BIO) se diluyó hasta una concentración final de 50 nM en solución de etiquetado 1x (SSC 2x, formamida al 20 %) incubada a temperatura ambiente, 1 hora en agitación suave. En un caso, la diana miR21 se omitió intencionalmente (control negativo). Después de inmovilizar miR21, las cámaras se lavaron con PBS-Tween 20 (0,05 %) 3x. La cámara donde no se estaba llevando a cabo ninguna ligación o activación (control de recubrimiento) se mantuvo en PBS hasta el final del experimento.
Las sondas tipo candado, las sondas iLock y las sondas de “control de recubrimiento” (antimiR21_FAM) se hibridaron con dianas inmovilizadas a una concentración final de 10 pM (sondas tipo candado e iLock) o 50 nM (para la sonda antimiR21_FAM). Las sondas se hibridaron en el tampón de hibridación (Tris-HCl 475 mM a pH 8; e Dt A 0,95 mM, NaCl 760 mM a 45 °C durante 15 minutos y a temperatura ambiente durante 3 horas en agitación suave. A continuación, las cámaras se lavaron con PBS-Tween 20 (0,05 %) 2x.
La reacción de ligación se realizó mediante la adición de ligasa SplintR (NEB) 0,5 U/ul, tampón SplintR 1x, en DEPC-ddH2O. La ligación y activación de iLock (para sondas iLock) se realizó simultáneamente mediante la adición de ADN polimerasa Taq en concentración final 0,1 U/ul. Los portaobjetos se incubaron durante 1 hora a 37 °C y se lavaron dos veces con DEPC-PBS-T.
La reacción de amplificación en círculo rodante se realizó mediante la adición de ADN polimerasa phi29 a 0,5 U /jl (Monserate), tampón de ADN polimerasa phi29 1x, dNTP 0,125 mM (Thermo Scientific), B<s>A 0,2 jg / j l (NEB), glicerol al 5 % y DEPC-ddH2O en 50 j l de volumen de reacción final durante 3 horas a temperatura ambiente y se lavó dos veces con DEPC-PBS-T.
Finalmente, los oligonucleótidos decoradores se hibridaron con productos de RCA a una concentración final de 0,1 jM en tampón de hibridación (SSC 2X, formamida al 20 %, ddH2O) en DEPC-PBS a temperatura ambiente durante 1 hora. Las células se lavaron dos veces con DEPC-PBS-T, se deshidrataron en etanol al 99 % durante 3 min y el cubreobjetos se montó con medio de desvanecimiento lento (Thermo Scientific). Las señales en las células se cuantificaron mediante el uso del software CellProfiler.
Resultados
Nuestros datos demuestran una inmovilización eficiente de la diana de miARN biotinilada en los portaobjetos de microscopio recubiertos con neutravidina, ya que no se detectó fluorescencia de la sonda complementaria etiquetada cuando no se inmovilizó miR21. Los resultados de detección se muestran en la Figura 22B. Las sondas tipo candado tradicionales generaron ~7800 productos de RCA (RCP)/campo visual (fov) a la vez que se cuantificaron ~36 000 RCP/fov cuando se usaron sondas tipo candado quiméricas. De acuerdo con el ejemplo donde se detectaron ARNm de ACTB en células cultivadas BjhTERT y MEF, las sondas iLock generaron menos señal en comparación con las sondas tipo candado. Las sondas iLock quiméricas generaron ~3000 RCP/fov mientras que las sondas iLock no modificadas generaron solo ~195 RCP/fov.
Ejemplo 8 - Perfil de expresión génica múltiplein situy análisis del tipo celular mediante el uso de sondas tipo candado quiméricas y secuenciación in situ en secciones de tejido cerebral de ratón
Materiales y métodos
Un cerebro de ratón P30, justo después de la extracción quirúrgica y sin ninguna fijación, se incluyó en medio OCT y se congeló directamente en hielo seco, y después se almacenó a -80 °C hasta su uso. A continuación, se cortaron secciones de 10 pm con un criostato y las secciones se recogieron en portaobjetos de vidrio Superfrost. A continuación, las secciones se fijaron rápidamente en PFA al 3,7 % en PBS tratado con DEPC durante 5 min a temperatura ambiente. Después de eso, las secciones se lavaron una vez en DEPC-PBS Tween al 0,05 % y se permeabilizaron con HCl 0,1 M durante 5 min a temperatura ambiente. Después de la permeabilización, los portaobjetos se lavaron dos veces en DEPC-PBS y se deshidrataron a través de una serie de etanol de 70 %, 85 % y 100 % durante 2 min cada uno. La cámara de sellado seguro se montó en el portaobjetos cubriendo la sección de tejido, y el tejido se hidrató mediante un breve lavado con PBS-T (DEPC-PBS con Tween al 0,05 %). Para dirigirse a los ARNm con las sondas tipo candado quiméricas (PLP), la sección se sumergió, después del breve lavado de rehidratación, en una mezcla de hibridación con PLP quiméricas que contenía tampón de SSC 2x, formamida 20 %, KCl 0,05 M, BSA 0,2 mg/ml, inhibidor de RNasa 1 U/pl y PLP quiméricas 50 nM. La hibridación se realizó a 45 °C durante la noche. Después de eso, la sección se lavó 2x en tampón precalentado (SSC 2x, Formamida al 20 %) a 37 °C durante 15 min. Finalmente, la sección se lavó 2x en PBS-T. Luego se añadió una mezcla de reacción de ligación a la sección, que contenía tampón de ligasa SplintR 1x, BSA 0,2 mg/ml, inhibidor de RNasa 0,8 U/pl y ligasa SplintR 0,25 U/pl. La reacción de ligación se incubó durante 60 min a 37 °C. Las secciones se lavaron 2x en PBS-T. A continuación, la sección se sumergió en una mezcla de amplificación en círculo rodante, que contenía tampón de polimerasa phi29 1x, dNTP 0,25 mM, BSA 0,2 mg/ml, polimerasa phi29 a 1 U/pl, glicerol 5 % y cebador de Rc A 50 nM. La RCA se realizó durante 3 h a 37 °C. Subsecuentemente, la sección se lavó en PBS-T dos veces y las sondas de detección (que sirven como sondas de anclaje en la reacción de secuenciación in situ) se hibridaron con los productos de RCA in situ en SSC 2x y tampón de hibridación de formamida al 20 % durante 30 min a temperatura ambiente.
Para la secuenciación in situ, como se describió anteriormente en Ke y otros (2013, Nature methods), la sección se sumergió en una mezcla de secuenciación por ligación, que contenía tampón de ligación T4 1x, ATP 1 mM, BSA 0,2 mg/ml, T4 ADN ligasa a 0,1 U/pl y 100 nM de cada una de la base 1 de la biblioteca de secuenciación (para secuenciar la primera posición del código de barras, la base 2 de la biblioteca de secuenciación para secuenciar la 2da posición del código de barras, etc.). La reacción de secuenciación se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. La sección se lavó luego 3 veces en PBS-T y los núcleos se tiñeron con DAPI, se lavaron tres veces de nuevo, se realizó una serie corta de etanol como se describió anteriormente, y luego el tejido se montó en medio de montaje de desvanecimiento lento. A continuación, se obtuvieron imágenes de la sección de tejido en un microscopio fluorescente con un objetivo 20x. Para secuenciar la 2da base, las secciones se lavaron primero en etanol para eliminar el medio de montaje, luego las secciones se lavaron 2x en formamida al 100 % para quitar el anclaje y las sondas de secuenciación ligadas. Las secciones se lavaron 3x en PBS-T y luego se añadió a las secciones la mezcla de secuenciación mediante ligación para la segunda base (la misma composición que anteriormente) y el procedimiento se repitió para la 3ra y 4a posición. Luego se procesaron las imágenes de las reacciones de secuenciación a través del software Cell profiler y scripts de Matlab, como se describió anteriormente en Ke y otros (Nat methods 2013).
Resultados
El perfil de expresión génica in situ múltiple mediante el uso de la síntesis de ADNc y el direccionamiento posterior al ADNc mediante sondas tipo candado de ADN (PLP) se limita usualmente a genes de alta expresión, debido a la baja eficiencia de la síntesis de ADNc. Dirigirse directamente al ARN con PLP hasta ahora ha sido difícil debido a la baja eficiencia de las enzimas para la ligación de las sondas en el ARN y la insuficiente especificidad que resulta en señales de falsos positivos. En este experimento, mostramos una ligación muy eficiente de PLP quiméricas en ARN (Figura 23). Se aplicaron PLP quiméricas en secciones de tejido cerebral de ratón dirigidas a 18 genes diferentes con 5 sondas para cada gen (90 sondas en total) (Tabla 10). Las sondas se codificaron con códigos de barras de secuenciación que posteriormente pudieran decodificarse mediante secuenciación in situ. Las sondas se hibridaron primero con el ARN y después de un lavado, las sondas se ligaron mediante el uso de ligasa SplintR. El uso de la T4RNA ligasa 2 puede aumentar aún más la especificidad, ya que hemos demostrado una mayor especificidad y eficiencia con la t 4 ARN ligasa 2 (ver ejemplos anteriores). Las sondas ligadas se amplificaron con RCA y los códigos de barras en los productos de RCA se secuenciaron con secuenciación mediante química de ligación, como se describió anteriormente en Ke y otros (Nat methods 2013). El patrón de expresión general que se recibió con el enfoque de ARN directo mediante el uso de PLP quiméricas fue muy comparable al recibido por el enfoque de direccionamiento a ADNc tradicional (datos no mostrados). Para simplificar, en este ejemplo se presenta una tinción general de todos los productos de RCA. Además de la ventaja de la alta sensibilidad para el enfoque de ARN directo mediante PLP quiméricas, los costos del ensayo son menores, ya que la etapa de síntesis de ADNc se asocia con altos costos para la transcriptasa inversa, y el ensayo puede realizarse más rápido, ya que se omite la etapa de síntesis de ADNc. En general, las sondas quiméricas muestran un potencial prometedor para el análisis de ARN con alta multiplexación en secciones de tejido combinado con la lectura de secuenciación in situ.
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Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un método para detectar una secuencia de ARN diana en una molécula de ARN diana en una muestra, dicho método comprende:
a) poner en contacto dicha muestra con una sonda tipo candado y permitir que dicha sonda hibride con la molécula de Ar N diana;
b) someter dicha muestra a una reacción de ligación mediante el uso de una ADN/ARN ligasa para ligar, y de esta manera circularizar, dicha sonda que ha hibridado con la molécula de ARN diana;
c) amplificar la sonda circularizada ligada de la etapa (b) mediante amplificación en círculo rodante (RCA) con una a Dn polimerasa para generar un producto de RCA; y d) detectar el producto de RCA, para detectar de esta manera la secuencia de ARN diana; en donde la sonda tipo candado se proporciona en una o más partes, cada parte tiene al menos un sitio de unión específico de la diana que es complementario a un sitio de unión a la sonda cognado en o adyacente a la secuencia de ARN diana e hibrida con la molécula de ARN diana de manera que, opcionalmente después de una etapa de escisión de la sonda hibridada y/o extensión de un extremo 3' de esta mediante el uso de la molécula de ARN diana como una plantilla, los extremos ligables de la sonda o partes de la sonda se yuxtaponen para la ligación entre sí mediante el uso de la molécula de ARN diana como una plantilla de ligación, para crear un sitio de ligación en o adyacente a la secuencia de ARN diana; y
en donde dicha sonda comprende al menos un ribonucleótido en un sitio de ligación o dentro de 5 nucleótidos del sitio de ligación, opcionalmente después de dicha etapa de escisión y/o extensión, y la sonda circularizada ligada se compone principalmente de ADN y comprende no más de 4 ribonucleótidos consecutivos.
2. El método de la reivindicación 1, en donde la sonda comprende dos o más partes, y en donde se crean al menos dos sitios de ligación.
3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la sonda comprende el al menos un ribonucleótido en un extremo 3' ligable en un sitio de ligación, opcionalmente en donde:
(i) el extremo 3' ligable se crea mediante la extensión del extremo 3' de la sonda o una parte de esta hibridada con la molécula de ARN diana; o
(ii) la sonda comprende el al menos un ribonucleótido en el extremo 3' de la sonda o una parte de esta.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde:
(i) un nucleótido terminal 3' y/o penúltimo 3' de la sonda o una parte de esta es un ribonucleótido; y/o (ii) la sonda o parte de esta no comprende un ribonucleótido en un extremo 5' ligable en un sitio de ligación.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde un extremo ligable 5' de la sonda, o una parte de esta, se crea mediante la escisión de la sonda cuando se hibrida con la molécula de ARN diana.
6. El método de la reivindicación 5, en donde un primer sitio de unión específico de la diana de la sonda o parte de esta se sitúa internamente del extremo 5' de la sonda o parte de esta y un segundo sitio de unión específico de la diana se sitúa en el extremo 3' de la sonda o parte de esta, de manera que después de la hibridación de la sonda o partes de esta con la molécula de ARN diana, la sonda o parte de esta comprende una secuencia adicional 5' respecto al primer sitio de unión específico de la diana que no hibrida con la molécula de ARN diana y forma un colgajo 5' que se elimina por escisión para crear de esta manera un extremo 5' ligable,
opcionalmente, en donde uno o más nucleótidos en el extremo 3' de la secuencia adicional que forma el colgajo 5' son: (i) complementarios al(a los) nucleótido(s) cognado(s) en la molécula de ARN diana; y (ii) no son capaces de hibridar con la molécula de ARN diana simultáneamente con el extremo 3' ligable de la sonda o parte de esta.
7. El método de la reivindicación 6, en donde:
(i) la secuencia adicional comprende uno o más ribonucleótidos;
(ii) uno o más nucleótidos en el extremo 3' de la secuencia adicional son ribonucleótidos; y/o
(iii) el nucleótido más hacia 3' de la secuencia adicional es un ribonucleótido.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicha sonda es un único oligonucleótido circularizable que comprende un primer sitio de unión específico de la diana en el extremo 5' de la sonda o internamente a este y un segundo sitio de unión específico de la diana en el extremo 3' de la sonda, en donde el primer y/o segundo sitios de unión específicos de la diana comprenden o se procesan para generar los extremos ligables 5' y 3' de la sonda respectivamente.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde:
(i) la sonda es un único oligonucleótido circularizable que comprende un primer sitio de unión específico de la diana situado internamente del extremo 5' de la sonda y un segundo sitio de unión específico de la diana situado en el extremo 3' de la sonda, de manera que después de la hibridación de la sonda con la molécula de ARN diana la sonda comprende una secuencia adicional 5' respecto al primer sitio de unión específico de la diana que no hibrida con la molécula de ARN diana, en donde el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional es un ribonucleótido que es complementario al nucleótido cognado en la molécula de ARN diana pero no es capaz de hibridar con la molécula de ARN diana simultáneamente con el extremo 3' ligable de la sonda, en donde dicha secuencia adicional se elimina mediante escisión para crear de esta manera el extremo ligable 5' de la sonda; y/o
(ii) la escisión se realiza mediante una enzima que tiene actividad nucleasa 5' o mediante una nucleasa específica de estructura; y/o
(iii) la escisión se realiza mediante una enzima ADN polimerasa seleccionada de la polimerasa deThermus aquaticus,la polimerasa deThermus thermophiluso la polimerasa deThermus flavus;y/o
(iv) la escisión se realiza mediante una endonucleasa de colgajo.
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde:
(i) la sonda ligada comprende no más de 2 ribonucleótidos consecutivos; y/o
(ii) la ADN polimerasa es la polimerasa Bst o la ADN polimerasa Phi29; y/o
(iii) la ligasa es T4 ARN ligasa 1, T4 ARN ligasa 2 o ADN ligasa PBCV-1; y/o
(iv) el método es para la detección de una base variante en la molécula de ARN diana, opcionalmente en donde: (a) la sonda es un único oligonucleótido circularizable que comprende un primer sitio de unión específico de la diana situado internamente del extremo 5' de la sonda y un segundo sitio de unión específico de la diana situado en el extremo 3' de la sonda, de manera que después de la hibridación de la sonda con la molécula de ARN diana la sonda comprende una secuencia adicional 5' respecto al primer sitio de unión específico de la diana que no hibrida con la molécula de ARN diana, en donde el nucleótido en el extremo 3' de la sonda es un ribonucleótido y en donde el nucleótido en el extremo 3' de la sonda y el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional son complementarios al mismo nucleótido, en donde cuando el nucleótido en el extremo 3' de la sonda y el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional son complementarios a la base variante, el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional no es capaz de hibridar con la molécula de ARN diana simultáneamente con el extremo 3' de la sonda y dicha secuencia adicional se elimina mediante escisión para generar de esta manera el extremo 5' ligable de la sonda, y en donde cuando el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional y el nucleótido en el extremo 3' de la sonda no son complementarios a la base variante, el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional se elimina mediante escisión y el nucleótido en el extremo 3' de la sonda no se hibrida con la molécula de ARN diana, para evitar de esta manera la ligación; o
(b) la sonda es un único oligonucleótido circularizable que comprende un primer sitio de unión específico de la diana situado internamente del extremo 5' de la sonda y un segundo sitio de unión específico de la diana situado en el extremo 3' de la sonda, de manera que después de la hibridación de la sonda con la molécula de ARN diana la sonda comprende una secuencia adicional 5' respecto al primer sitio de unión específico de la diana que no hibrida con la molécula de ARN diana, en donde el nucleótido en el extremo 3' de la sonda es un ribonucleótido, y en donde el nucleótido en el extremo 3' de la sonda y el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional son complementarios al mismo nucleótido, en donde el nucleótido en el extremo 3' de la sonda y el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional son complementarios al nucleótido en la posición 3' de la base variante y en donde el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional no es capaz de hibridar con la molécula de ARN diana simultáneamente con el extremo 3' de la sonda, en donde cuando el nucleótido en el extremo 5' del primer sitio de unión específico de la diana es complementario a la base variante, dicha secuencia adicional se elimina mediante escisión para generar de esta manera el extremo ligable 5' de la sonda, y en donde cuando el nucleótido en el extremo 5' del primer sitio de unión específico de la diana no es complementario a la base variante, dicho nucleótido también se elimina mediante escisión, para generar de esta manera una brecha entre los extremos ligables 5' y 3' y evitar la ligación.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la molécula de ARN diana se detectain situ,opcionalmente en donde la muestra es una muestra de células o tejido recién preparada o tratada previamente, y opcionalmente en donde la muestra es una muestra de tejido.
12. Una sonda tipo candado de ADN-ARN quimérica capaz de unirse y detectar una secuencia de ARN diana en una molécula de ARN diana, en donde:
(i) la sonda comprende una o más partes, cada una de las cuales tiene al menos un sitio de unión específico de la diana que es complementario a un sitio de unión a la sonda cognado en o adyacente a la secuencia de ARN diana e hibrida con la molécula de ARN diana de manera que, opcionalmente después de una etapa de escisión de la sonda hibridada o parte de esta y/o extensión de un extremo 3' de esta mediante el uso de la molécula de ARN diana como una plantilla, los extremos ligables de la sonda o partes de esta se yuxtaponen para la ligación entre sí mediante el uso de la molécula de ARN diana como una plantilla de ligación, para crear uno o más sitios de ligación en o adyacentes a la secuencia de ARN diana, en donde la ligación en dichos sitios de ligación circulariza la sonda;
(ii) la sonda comprende al menos un ribonucleótido en un sitio de ligación o dentro de 5 nucleótidos del sitio de ligación; y
(iii) la sonda cuando se liga para formar un círculo se compone principalmente de ADN y comprende no más de 4 ribonucleótidos consecutivos.
13. La sonda tipo candado de ADN-ARN quimérica de acuerdo con la reivindicación 12, en donde:
(a) la sonda es un único oligonucleótido circularizable que comprende un primer sitio de unión específico de la diana situado en el extremo 5' de la sonda o internamente y un segundo sitio de unión específico de la diana situado en el extremo 3' de la sonda, y en donde:
(i) el segundo sitio de unión específico de la diana comprende uno o más ribonucleótidos;
(ii) donde el primer sitio de unión específico de la diana es interno al extremo 5' de la sonda, la sonda comprende una secuencia adicional 5' respecto al primer sitio de unión específico de la diana, de manera que cuando la sonda hibrida con la molécula de ARN diana la secuencia adicional forma un colgajo 5' que no hibrida con la molécula de ARN diana, y que puede eliminarse por escisión para generar un extremo 5' ligable que puede ligarse al extremo 3' de la sonda para circularizar
la sonda, en donde la secuencia adicional puede contener opcionalmente uno o más ribonucleótidos; y (iii) la sonda cuando se liga para formar un círculo se compone principalmente de ADN y comprende no más de 2 ribonucleótidos consecutivos; o
(b) la sonda comprende dos o más partes, la primera parte es un oligonucleótido de la cadena principal que comprende un primer sitio de unión específico de la diana situado en su extremo 5' o internamente y un segundo sitio de unión específico de la diana situado en su extremo 3', y uno o más oligonucleótidos de brechas que comprenden cada uno un sitio de unión específico de la diana complementario y capaz de hibridar con la molécula de ARN diana entre el primer y segundo sitios de unión específicos de la diana del oligonucleótido de la cadena principal, y en donde:
(i) el segundo sitio de unión específico de la diana del oligonucleótido de la cadena principal y/o en el sitio de unión específico de la diana de al menos un oligonucleótido de brecha comprende uno o más ribonucleótidos en el extremo 3' de este;
(ii) donde el primer sitio de unión específico de la diana es interno al extremo 5' del oligonucleótido de la cadena principal, el oligonucleótido de la cadena principal comprende una secuencia adicional 5' respecto al primer sitio de unión específico de la diana, de manera que cuando el oligonucleótido de la cadena principal hibrida con la molécula de ARN diana, la secuencia adicional forma un colgajo 5' que no hibrida con la molécula de ARN diana, y que puede eliminarse mediante escisión para generar un extremo 5' ligable que puede ligarse al extremo 3' de un oligonucleótido de brecha para circularizar la sonda, en donde la secuencia adicional puede contener opcionalmente uno o más ribonucleótidos;
(iii) uno o más oligonucleótidos de brechas comprenden opcionalmente una secuencia adicional 5' respecto al sitio de unión específico de la diana, de manera que cuando el oligonucleótido de brecha hibrida con la molécula de ARN diana la secuencia adicional forma un colgajo 5' que no hibrida con la molécula de ARN diana, y que puede eliminarse mediante escisión para generar un extremo 5' ligable que puede ligarse al extremo 3' de otro oligonucleótido de brecha o al extremo 3' del oligonucleótido de la cadena principal para circularizar la sonda, en donde la secuencia adicional puede contener opcionalmente uno o más ribonucleótidos; y
(iv) los oligonucleótidos de la cadena principal y de brechas cuando se ligan forman un círculo que se compone principalmente de ADN y comprende no más de 2 ribonucleótidos consecutivos.
14. La sonda de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la sonda u oligonucleótido de la cadena principal y/o uno o más oligonucleótidos de brechas comprenden una secuencia adicional 5' respecto al primer sitio de unión específico de la diana o a un sitio de unión específico de la diana de un oligonucleótido de brecha, en donde el nucleótido en el extremo 3' de cualquier secuencia adicional que forma un colgajo 5' es complementario al mismo nucleótido cognado en la molécula de ARN diana que el nucleótido en el extremo 3' de la sonda, o en el extremo 3' del oligonucleótido de la cadena principal y/o uno o más oligonucleótidos de brechas.
15. La sonda de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la sonda es para detectar una base variante en una molécula de ARN diana, y en donde:
(a) (i) el nucleótido en el extremo 3' de la sonda o el oligonucleótido de la cadena principal y/o de brecha y el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional son complementarios a la base variante, y el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional no es capaz de hibridar con la molécula de ARN diana simultáneamente con el nucleótido en el extremo 3' de la sonda o el oligonucleótido de la cadena principal o el oligonucleótido de brecha, de manera que dicha secuencia adicional puede eliminarse mediante escisión para generar un extremo ligable 5' de la sonda; o (ii) el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional y el nucleótido en el extremo 3' de la sonda o los oligonucleótidos de la cadena principal y/o de brechas no son complementarios a la base variante, de manera que el nucleótido en el extremo 3' de la sonda o el oligonucleótido de la cadena principal y/o el oligonucleótido de brecha no es capaz de hibridar con la molécula de ARN diana, evitando de esta manera la ligación, y el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional puede eliminarse mediante escisión; o
(b) (i) el nucleótido en el extremo 5' del primer sitio de unión específico de la diana o en el extremo 5' del sitio de unión específico de la diana de un oligonucleótido de brecha es complementario a la base variante, el nucleótido en el extremo 3' de la sonda o el oligonucleótido de la cadena principal u otro oligonucleótido de brecha y el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional son complementarios al nucleótido en la posición 3' de la base variante, y el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional no es capaz de hibridar con la molécula de ARN diana simultáneamente con el extremo 3' de la sonda o el oligonucleótido de la cadena principal o el otro oligonucleótido de brecha, de manera que dicha secuencia adicional puede eliminarse mediante escisión para generar un extremo ligable 5' de la sonda; o
(iii) el nucleótido en el extremo 5' del primer sitio de unión específico de la diana o en el extremo 5' del sitio de unión específico de la diana de un oligonucleótido de brecha no es complementario a la base variante, y dicho nucleótido también se elimina mediante escisión, para generar de esta manera una brecha entre los extremos ligables 5' y 3' y evitar la ligación.
16. Un conjunto de dos o más sondas como se define en la reivindicación 15, en donde en cada sonda, el nucleótido en el extremo 3' de la sonda o el oligonucleótido de la cadena principal y/o de brecha y el nucleótido en el extremo 3' de la secuencia adicional son complementarios a la base variante, y cada sonda en dicho conjunto de sondas comprende un nucleótido diferente en dicho extremo 3' en comparación con otra(s) sonda(s) en dicho conjunto de sondas, opcionalmente en donde dicho conjunto de sondas comprende tres o cuatro sondas, en donde cada sonda comprende un nucleótido diferente en dicho extremo 3' en comparación con otras sondas en dicho conjunto de sondas.
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