ES3027639T3 - Insect-pathogenic fungus, spores, composition and use of same - Google Patents

Abstract

Se describen nuevas cepas del hongo insecticida Metarhizium var. anisopliae, cepa BNL 101, depositada en el Centro CABI UK, Reino Unido, con el número ICI CC 06833; o BNL 102, depositada en el Centro CABI UK, Reino Unido, con el número ICI CC 506834; o un cultivo con sus características distintivas. La presente invención también describe métodos para usar las cepas fúngicas y las esporas obtenidas de ellas para controlar insectos, y proporciona una preparación natural para el control de plagas. Las preparaciones y composiciones presentan varias características únicas y deseables, como una amplia gama de hospedadores o, alternativamente, una gama selectiva de hospedadores, y una patogenicidad consistente. Las preparaciones y composiciones presentan una alta virulencia (actividad insecticida), es decir, de 2 a 3 veces más virulenta (insecticida) que las composiciones o preparaciones que no contienen la preparación o composición, y especialmente que no contienen las cepas fúngicas BNL 101 o BNL 102 ni sus esporas. Las cepas fúngicas también proporcionan una alta producción de esporas y poseen una alta estabilidad en el campo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Hongos insectos patógenos, esporas, composición y uso de los mismos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a las composiciones, partículas y usos de las mismas, métodos para controlar plagas y métodos de producción de composiciones y partículas para el control de plagas de insectos. En particular, la invención se refiere a hongos patógenos insectos (entomopatógenos), composiciones y partículas que comprenden hongos patógenos insectos (o esporas fúngicas - conidios), sus usos en el material vegetal, métodos para controlar plagas con hongos patógenos insectos y procesos para producir partículas y partículas para su uso en el control de plagas, empleando dichos organismos.

Antecedentes de la invención

Un problema importante en la agricultura son las continuas pérdidas de cultivos causadas por los ataques de plagas. Thrip de flores occidentales (WFT),Frankliniella occidentalis,picudo de vid negro, (BVW)Otiorhynchus sulcatus,mosca blanca, ácaros de araña roja, minero de hojas, gorgojo de pino grande, las orugas, etc., son la causa más grande de pérdidas económicas asociadas a nivel internacional. Por ejemplo, en Europa, la pérdida combinada debida a la transmisión del virus y los daños directos a la alimentación causados por el WFT se estima en 550 millones de libras esterlinas al año. Los daños mundiales del WFT superan los 6,0 mil millones de libras esterlinas anuales y no existen medidas de control efectivas individualmente. BVW por sí solo causa pérdidas anuales de £40 millones al Reino Unido, y más de £4,0 mil millones a nivel mundial a la industria hortícola y agrícola.

Actualmente, los agricultores, los cultivadores y los verdes utilizan combinaciones de técnicas para lograr un control adecuado de plagas de insectos. Sin embargo, estos son poco fiables, inadecuados y las pérdidas de cosechas son considerables. La retirada del mercado de la UE en 2016 de insecticidas químicos como los neonicotinoides y los organofosforados ha agravado el problema. Las plagas de insectos son expertos en desarrollar resistencia a los productos químicos y el uso de depredadores de biocontrol disponibles comercialmente contra WFT y BVW no es confiable debido a las dificultades de tiempo y la depredación ineficiente. El problema está teniendo un impacto importante en la agricultura en el Reino Unido, Europa continental y en todo el mundo.

En el Reino Unido se produjeron con éxito 36.000 toneladas de fresas (= 325 millones de libras en valor, informe HDC 2015) en 2015. Sin embargo, cuando el control del WFT no tuvo éxito, en años anteriores se registraron pérdidas totales de cultivos. Por lo tanto, es esencial contar con un programa de control más sólido para evitar pérdidas de hasta 45 millones de libras esterlinas al año. El valor de la industria de las acciones de viveros resistentes del Reino Unido se estima en 796 millones de libras esterlinas al año. Los daños a los cultivos y los rechazos de cultivos debido a la presencia de, por ejemplo, larvas de BVW pueden causar hasta un 100% de pérdidas si las medidas de control son inadecuadas.

Actualmente, hay una creciente demanda de productores impulsada por los consumidores para reducir el uso de plaguicidas químicos en la producción de cultivos y para cultivar frutas y hortalizas con residuos detectables reducidos. También hay una disminución en la eficacia de los plaguicidas químicos convencionales debido a la resistencia a los plaguicidas y al aumento de la regulación contenida en el Reglamento Europeo (CE) 1107/2009.

Microorganismos naturales, incluidos los hongos patógenos insectos, las especies Metarhizium, Beauveria e Isaria, se han comercializado para el control de una serie de plagas de insectos. Sin embargo, su eficacia en el campo es inconsistente debido a la variabilidad observada entre diferentes cepas de los microorganismos.

Los hongos patógenosmetarhiziumspp.,Beauveriaspp.,LecanicilliumeIsaria fumosorosea,son un patógeno generalizado, transmitido por el suelo. Hasta la fecha, algunas cepas deMetarhizium anisopliaevar.las anisopliasse han comercializado como bioinsecticida para el control de diversas plagas de insectos.Metarhizium anisopliaepuede producirse en masa utilizando un sistema de producción difásico donde se utilizan cultivos de caldo de fase logarítmica para inocular una fermentación de estado sólido (SSF) relativamente barata, generalmente en arroz o cebada. Sin embargo, diferentes cepas del mismo hongo patógeno-insecto pueden tener patogenicidad variable para una plaga particular, así como responder de manera diferente a las condiciones bióticas y abióticas. Por lo tanto, la búsqueda de cepas más agresivas de hongos insectos-patógenos continúa. Wraight et al. (Biological Control, vol. 97, 26 de febrero de 2016, págs. 31 -47) enseña acerca de la eficacia de las aplicaciones en aerosol de hongos entomopatógenos contra los trips de flores occidentales que infestan impacientes de invernadero bajo condiciones variables de humedad.

Por lo tanto, es deseable proporcionar una opción natural de control de plagas que comprenda una o más características deseables, tales como una amplia gama de hospedadores y patogenicidad constante en una gama de plagas, alta virulencia, alto rendimiento de esporas en la producción y alta estabilidad en el campo.

Sumario de la invención

La información técnica que se expone a continuación puede, en algunos aspectos, ir más allá del alcance de la invención, que se define exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas. La información técnica adicional se proporciona para situar la invención real en un contexto técnico más amplio e ilustrar posibles avances técnicos conexos.

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una cepa del hongo insecto-patógeno,Metarhizium var. anisoplias:BNL 102 depositado en el CABI UK Centre, Reino Unido, el 1 de mayo de 2018 con el número ICI CC 506834; o una cultura que tenga las características identificativas del mismo. BNL 101 depositado en el CABI UK Centre, Reino Unido, el 1 de mayo de 2018 con el número ICI CC 506833 también se describe.

El primer aspecto de la presente invención se relaciona con una nueva cepa de hongos matadores de insectos del grupo, la muscardina verde, llamadaMetarhizium anisopliaevar.anisoplias:BNL 102 depositado en el CABI UK Centre, Reino Unido, el 1 de mayo de 2018 con el número ICI CC 506834. Otra cepa deMetarhizium anisopliaevar.anisoplias:BNL 101 depositado en el CABI UK Centre, Reino Unido, el 1 de mayo de 2018 con el número ICI CC 506833 también se describe. En comparación con otros productos y cepas bioinsecticidas conocidos, un biológico granular producido con la cepa actual, BNL 102, es eficaz para lograr altas tasas de mortalidad en una amplia variedad de plagas de insectos. La cepa según el primer aspecto también puede alcanzar uno o más de: Alto rendimiento de esporas (2,5 veces mayor que los productos bioinsecticidas existentes - Met52); mayor estabilidad; mayor vida útil; y pocos o ningún efecto fuera del objetivo.

El hongoMetarhizium anisopliaecepa BNL 102 tiene una amplia gama de hospedadores, alta virulencia y alto rendimiento de esporas, tiene alta estabilidad y puede producirse en sustratos como el arroz o formulado dentro de una composición de nanopartículas, nanoshell o microencapsulación. Las formulaciones granulares de la cepa BNL 102 han demostrado su eficacia contra WFT, mosca blanca, áfidos, gorgojos, orugas, etc. picudo de pino, etc. La investigación del solicitante sobre BNL 102 formulada dentro de varias composiciones de nanopartículas, microencapsulación y/o biopolímeros solubles en agua ha demostrado una alta adherencia de esporas en WFT, y un aumento de la eficacia, longevidad y entrega de esporas de hongos al objetivo.

Preferiblemente, la cepa es sustancialmente pura biológicamente, lo que será apreciado por el lector experto como lo que significa que la cepa está compuesta principalmente deMetarhizium anisopliaecepa BNL 102 sustancialmente sin ningún tipo de contaminantes biológicos, dentro de un grado de error que es apreciablemente factible utilizando prácticas y procesos de fabricación estándar.

De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención, se proporcionan esporas, obtenibles del hongo insectopatógeno,Metarhiziumvar.anisoplias:BNL 102 depositado en el CABI UK Centre, Reino Unido, el 1 de mayo de 2018 con el número ICI CC 506834; o una cultura que tenga las características identificativas del mismo. También se describen las esporas de BNL 101 depositadas en el CABI UK Centre, Reino Unido, el 1 de mayo de 2018 con el número ICI CC 506833.

Preferiblemente las esporas comprenden al menos una seleccionada de: Conidios; blastosporas. Preferiblemente, las esporas son sustancialmente puras biológicamente. Como se ha señalado anteriormente, el término "sustancialmente biológicamente puro" en el contexto de la presente invención será interpretado por la persona calificada en el sentido de un grado de pureza viable utilizando las prácticas y procesos de fabricación actualmente disponibles.

De acuerdo con un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona una composición que comprende, una cantidad insecticida eficaz de hongos patógenos o esporas insectos obtenibles de ellos; y un portador agronómicamente aceptable del mismo, el portador que comprende al menos uno seleccionado de: Bioplástico; biopolímero; ácido poliacrílico; sílice; óxido de cinc; dióxido de titanio; selenosulfato de sodio; plata; hidrogel; carboximetilcelulosa; metoxilpectina; iones metálicos; quitosano; humectante; acetato de celulosa; goma de xantam; goma arábiga; alginato de sodio; quitosano; pectina cítrica; arabinogalactano; alfa-ciclodextrina; maltodextrosa; celulosa.

Naturalmente, el destinatario experto entenderá que, a los efectos de la presente invención, la "cantidad insecticida efectiva" se refiere a una cantidad que induce la mortalidad, interrumpe o impide el crecimiento, interfiera con la metamorfosis u otras funciones morfogénicas, efectúe la esterilización y/o interfiera con la reproducción de uno o más insectos objetivo.

Preferiblemente la composición comprende uno seleccionado de: Un polvo; un líquido.

En realizaciones en las que, la composición comprende un polvo, el polvo se puede aplicar preferiblemente directamente a los cultivos y plantas. En otras realizaciones, el polvo puede mezclarse preferiblemente con un líquido y aplicarse preferiblemente directamente al suelo o a los cultivos como una solución, una dispersión, una suspensión y/o una mezcla. La composición puede estar comprendida preferiblemente dentro de un spray que puede ser preferiblemente un spray foliar. La composición de la presente invención es preferiblemente un bioinsecticida de contacto, y sin querer estar ligado por la teoría, se piensa que el control posterior de una población de insectos no depende únicamente de la ingestión de la composición por insectos dentro de dicha población. Se cree que la composición está dispuesta preferiblemente para adherirse a la cutícula del insecto huésped, preferiblemente donde pueda penetrar en el exoesqueleto del insecto huésped y posteriormente causar morbilidad y/o mortalidad dentro del insecto huésped, preferiblemente sin entrar en el medio ambiente más amplio.

Preferiblemente la composición comprende uno seleccionado de: Nanopartículas; nanocápsulas; micropartículas; microcápsulas; microcápsulas.

El destinatario informado apreciará que el término "nanopartículas" en el contexto de la presente invención se refiere a partículas entre 1 y 100 nanómetros (nm) en una dimensión con una capa interfacial circundante. Del mismo modo, el lector informado apreciará que "nanocápsulas" en el contexto de la presente invención se refiere a un tipo de nanopartícula esférica que consiste en un núcleo dieléctrico que está cubierto por una capa metálica delgada, y que "nanocápsulas", se refiere a nanoscale (1 nm a 100 nm en una dimensión) sistemas vesiculares, que a menudo comprenden una membrana polimérica que encapsula un núcleo líquido interno. El destinatario informado apreciará que el término "micropartículas" en el contexto de la presente invención se refiere a partículas de entre 0,1 y 100 pm de tamaño. El significado de los términos "microcápsulas" y "microcápsulas" son inferibles de las descripciones anteriores de sus equivalentes "nano".

Preferiblemente, el hidrogel comprende alginato de sodio. Preferiblemente al menos una porción de la composición es soluble en un solvente. Más preferiblemente el disolvente es el agua. Preferiblemente los iones metálicos comprenden al menos uno seleccionado de: Iones de cobre; iones de hierro. Preferiblemente el humectante comprende glicerol. Preferiblemente, el hongo insecto-patógeno comprende la cepa del primer aspecto de la presente invención. Aún más preferiblemente, las esporas comprenden las esporas del segundo aspecto de la presente invención.

La encarnación más preferible del tercer aspecto de la presente invención comprende la cepa del primer aspecto, y/o las esporas del segundo aspecto.

De acuerdo con un cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de una composición que comprende una cepa del hongo insecto-patógeno,Metarhiziumvar.anisoplias:BNL 102 depositado en el CABI UK Centre, Reino Unido, el 1 de mayo de 2018 con el número ICI CC 506834; o un cultivo que tenga las características identificativas del mismo, o esporas obtenidas de él para controlar una población de insectos. También se describe el uso de una composición que comprende la cepa BNL 101 depositada en el CABI UK Centre, Reino Unido, el 1 de mayo de 2018 con el número ICI CC 506833.

Preferiblemente la cepa está de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención. Preferiblemente las esporas están de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención. Preferiblemente la cepa y/o esporas están comprendidas dentro de una composición de acuerdo con el tercer aspecto de la presente invención.

De acuerdo con un quinto aspecto de la presente invención, se proporciona un método para controlar una población de insectos, el método que comprende el paso de aplicar una cantidad insecticida efectiva de una cepa del hongo insecto-patógeno,Metarhiziumvar.anisoplias:BNL 102 depositado en el CABI UK Centre, Reino Unido, el 1 de mayo de 2018 con el número ICI CC 506834; o un cultivo que tenga las características identificativas del mismo, a un lugar de dicha población de insectos. También se describe un método de control de una población de insectos que comprende el paso de aplicación de la cepa BNL 101 depositada en el Centro CABI UK, Reino Unido, el 1 de mayo de 2018 con el número ICI CC 506833.

Preferiblemente, la cantidad insecticida efectiva de una cepa del hongo insecto-patógeno se comprende dentro de una composición de acuerdo con el tercer aspecto de la presente invención.

De acuerdo con un sexto aspecto de la presente invención, se proporciona un método para controlar una población de insectos, el método que comprende el paso de aplicar una cantidad insecticida efectiva de esporas obtenidas del hongo insecto-patógeno,Metarhiziumvar.anisoplias:BNL 102 depositado en el CABI UK Centre, Reino Unido, el 1 de mayo de 2018 con el número ICI CC 506834; o un cultivo que tenga las características identificativas del mismo, a un lugar de dicha población de insectos. También se describe un método de control de una población de insectos que comprende el paso de aplicación de esporas obtenibles de BNL 101 depositadas en el CABI UK Centre, Reino Unido, el 1 de mayo de 2018 con el número ICI CC 506833.

Preferiblemente, la cantidad insecticida efectiva de esporas está comprendida dentro de una composición de acuerdo con el tercer aspecto de la presente invención.

El destinatario experto comprenderá que, a los efectos de la presente invención, "una población de insectos" puede referirse a una población de insectos de especies mixtas, geográficamente discreta, o una población de insectos geográficamente discreta de una sola especie. El término «control de una población de insectos» se utiliza aquí para significar que el número de insectos dentro de una población de insectos se reduce, principalmente a través de la mortalidad, a un nivel que es significativamente mayor que el de una población a la que no se aplica el método de la presente invención.

En el uso del cuarto aspecto, y el método de los aspectos quinto y sexto de la presente invención, la población de insectos comprende preferiblemente al menos uno seleccionado de la gama: WFT, gorgojos, pulgones, mosca blanca, ácaros de araña, orugas, chafers, garrapatas, mosquitos y mosquitos.

En el uso del cuarto aspecto, y el método de los aspectos quinto y sexto de la presente invención, la población de insectos comprende preferiblemente al menos uno seleccionado de la gama: WFTS(Frankliniella occidentalis); ácaro araña(Tetranychus urticae);mosca blanca(Aleyrodidaespp); áfidos ( Myzus persicae ); mosquitos(Aedes aegypti; Anopheles stephensi; Culex quinquefasciatus);garrapatas ( Ixodes sppj;gusanos del ejército ( Spodoptera littura); escarabajo europeo de mayo (chaquetas de cuero(Tipula paludosa);gusano de alambre(Agriotesspp) ; midge mordedor ( Culicoides spp); picudo de vid ( Otiorhynchus sulcatus ); picudo del pino(Hylobius abietis).

Se apreciarán las realizaciones de la presente invención que comprende una cepa que es una mezcla de: BNL 101 depositado en el CABI UK Centre, Reino Unido, el 1 de mayo de 2018 con el número ICI CC 506833; y BNL 102 depositado en el CABI UK Centre, Reino Unido, el 1 de mayo de 2018 con el número ICI CC 506834, o una cultura que tenga las características identificativas del mismo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Las realizaciones específicas ahora se describirán solo a modo de ejemplo, y con referencia a los dibujos que las acompañan.

FIG. 1 muestra la eficacia del hongo no formulado BNL 102 contra WFT en condiciones de semicampo comparado con alternativas comercializadas actualmente en forma de bioinsecticida comúnmente empleado (Naturalis®L); un insecticida de molécula pequeña comúnmente utilizado (Tracer®); e insectos beneficiosos (depredadores).

FIG. 2 muestra la actividad del agua (aw) de varias composiciones de nanopartículas en función del tiempo.

FIG. 3A-FIG. 3H: LA FIG 3A muestra germinación de BNL 102 en presencia de una selección de composiciones de nanopartículas, después de 48 horas de incubación a 25°C, en Agar Dextrosa Sabouraud (SDA) modificado a 0,95 Ap; M control; FIG.3B: Bioplástico; FIG. 3C: PAA; FIG. 3D: SIO<2>; FIG. 3E: ZnO; FIG. 3F: Tio<2>; FIG. 3G: NaSSS; FIG. 3H: AG.

FIG. 4 muestra fotografías de cápsulas de alginato/Cu que comprenden BNL 102.

FIG. 5A-FIG. 5D: FIG 5A: Muestra muestras de alginato con Fe(III); FIG. 5B: Fe(II); FIG. 5C: Muestras después de 3 horas bajo la lámpara; y FIG. 5D: Muestras después de 4 horas bajo luz natural.

FIG. 6A-FIG. 6I: FIG. 6A: Muestra alginato/BNL 102/Cu a 0,93 Aw después de 48 horas; FIG. 6B: Después de 72 horas; FIG. 6C: Alginato/BNL 102/Cu/quitosano a 0,93 Aw después de 48 horas; FIG. 6D: Después de 72 horas; FIG. 6E: Alginato/BNL 102/Cu a 0,95 Aw después de 48 horas; FIG. 6F: Después de 72 horas; FIG. 6G: Alginato/BNL 102/Cu/quitosano a 0,95 Aw después de 48 horas; FIG. 6H: Después de 72 horas; y FIG 6I: Alginato/BNL 102/Cu/quitosano en SDA después de 48 horas.

FIG. 7A-FIG. 7E: FIG. 7A muestra alginato/BNL 102/Fe(III) en 0,93 Aw después de 24 horas; FIG 7B: Después de 48 horas; FIG 7C: Alginato/BNL 102/Fe(III) en 0,95 Aw: FIG. 7D: Después de 48 horas; alginato/BNL 102/Fe(III) en SDA D: Después de 24 horas; y FIG. 7E: Después de 48 horas.

FIG. 8A-Fig. 8C: FIG. 8A muestra alginato/BNL 102/Fe(III)/quitosano/glicerol a 0,93 Aw después de 24 horas; FIG. 8B: 0,95 aw después de 24 horas; y FIG. 8C: SDA después de 24 horas;

FIG. 9A-FIG. 9D: FIG. 19A: Alginato/BNL 102/Fe(II) a las 0,93 horas; FIG. 19B: Alginato/BNL 102/Fe(II) después de 48 horas; FIG. 9C: Alginato/BNL 102/Fe(II); FIG. 19D: SDA después de 48 horas.

FIG. 10 muestra germinación de conidios a 25°C; 24 h (0.0995aw = 99,5% HR) con 1/<2>Sabouraud Dextrosa Agar.

FIG. 11 muestra extensión del tubo germinativo de conidios germinantes a 25°C; 24 h (0.0995aw = 99,5% HR) con / Sabouraud Dextrosa Agar.

FIG. 12 muestra germinación de blastosporas a 25°C; 24 h (0.0995aw = 99,5% HR) con / Sabouraud Dextrosa Agar.

FIG. 13 muestra la longitud del tubo germinativo de los blastoporos germinantes a 25°C; 24 h (0.0995aw = 99,5% HR) con / Sabouraud Dextrosa Agar.

FIG. 14 muestra germinación conidial (%) después de 48 h a 0.95aw = 95% HR) en / Sabouraud Dextrosa Agar a 25°C.

FIG. 15 muestra la longitud del tubo germinal de conidios a 25°C; 48 h (0.95aw = 95% HR) en / Sabouraud Dextrosa Agar.

FIG. 16 muestra germinación de blastoporos a 25°C; 48 h (0.95aw = 95% HR) con / Sabouraud Dextrosa Agar. FIG. 17 muestra la longitud del tubo germinativo de los blastoporos germinantes a 25°C; 48 h (0.95aw = 95% HR) con / Sabouraud Dextrosa Agar.

FIG. 18, los estudios ¡nidales se centraron en la formación de diferentes formulaciones conidiales que fueron hechas con diferentes compuestos compatibles. Dos ejemplos que luego fueron comprobados para germinación después de 4, 6 y 15 horas a 25°C.

FIG. 19A-FIG. 19D: FIG. 19A: Germinación, compuesto 4 goma arábiga-6h (1/2 sda); FIG. 19B: Germinación Arabinugalactan-6h (1/2 sda); FIG. 19C: Germinador, compuesto 10 sal de sodio poliacrílico - 6 h. (1/2 SDA); FIG. 19D: Germinador, compuesto 11 maltodextrosa-6h (1/2 sda).

FIG. 20 muestra microperlas: Formulación de goma árabe 1-5 hrs sobre / Sabouraud Dextrosa Agar.

FIG. 21 muestra microperlas: Formulación maltodextrosa 3 - 5 hrs - / Sabouraud Dextrosa Agar.

FIG. 22 muestra formulación maltodextrosa 1 - 5 hrs 0,95 aw / Sabouraud Dextrosa Agar, algunas germinaciones iniciales solamente.

FIG. 23 muestra formulación de blastosporas (log 4 y log 6) en alginato de sodio y goma arábiga y PAA;

FIG. 24 muestra germinación de blastosporas formuladas en goma arábiga después de 24 horas en / Sabouraud Dextrosa Agar;

FIG. 25 muestra la producción de diferentes formulaciones secas utilizando cinco diferentes compuestos compatibles. FIG. 26 muestra el efecto de la formulación sobre la supervivencia de WFT en adultos. Supervivencia proporcional acumulada media de la TFW adulta expuesta durante 3 días a conidios secos (106cfu/cm-sin formular), goma arábiga (104cfu/cm), (106cfu/cm), maltodextrina (104cfu/cm) y maltodextrina (106cfu/cm) de hongos entomopatógenos MetarhiziumanisopliaeBNL 102. El tratamiento control no se expuso a ningún hongo ('0' dosis). Los datos representan la supervivencia de cuatro réplicas de aproximadamente 400 hombres y mujeres adultos/réplicas.

FIG. 27A-FIG 27C: Muestra WFT después del contacto con diferentes formulaciones que contienenMetarhizium anisopliaeBNL 102. FIG. 27A: WFT saludable; FIG. 27B: Un cadáver adulto WFT 5 días después de la muerte mostrando esporulación deM. anisopliaeBNL 102; FIG. 27C: Foto de primer plano de esporas de hongos producidas en cadáveres muertos.

FIG. 28 muestra el efecto de la formulación sobre la supervivencia de WFT en adultos. Supervivencia proporcional acumulada media de la TFW adulta expuesta durante 3 días a conidios secos (106cfu/cm-sin formular), goma arábiga (104cfu/cm), (106cfu/cm), maltodextrina (104cfu/cm) y maltodextrina (106cfu/cm) deMetarhizium anisopliaeBNL 102. El tratamiento control no se expuso a ningún hongo ('0' dosis). Los datos representan la supervivencia de cuatro réplicas de aproximadamente 400 hombres y mujeres adultos/réplicas.

FIG. 29A-FIG. 29E: FIG. 29A: Muestra un procedimiento de bioensayo. Protocolo utilizado para contaminar WFT adulto con conida y blastosporas-formulación de hongos entomopatógenos,Metarhizium anisopliaecepa BNL102. Los recipientes experimentales fueron recipientes de plástico blanco opaco (25 x 25 cm; 15 cm de profundidad; superficie 625 cm<2>) con un orificio de ventilación (10 x 10 cm) cortado en las tapas y cubierto con gasa de nylon (tamaño de poro de 64 mm); FIG. 29B: Se colocó una doble capa de papel de seda (36,5 cm de largo; 25 cm de ancho; superficie 917,5 cm 2 ) en cada recipiente de manera que cubriera el fondo y a la mitad de cada lado. Este papel de seda fue humedecido usando un rociador de mano; FIG. 29C: Los frijoles frescos y las flores se colocaron en el fondo antes de la pulverización de ambas formulaciones; FIG. 29D: Las formulaciones de conidios y blastosporos se rociaron uniformemente utilizando un rociador manual (tamaño de poro 300 gm); FIG. 29E: Se liberaron aproximadamente 400 WFT masculino y femenino adultos en los contenedores y se monitoreó la supervivencia de WFT diariamente durante 3 días.

FIG. 30 muestra un método preferido para preparar una composición de microencapsulación de acuerdo con un tercer aspecto de la presente invención: Mezcla de cloruro de calcio y hongo entomopatógeno,Metarhizium anisopliaecepas BNL101 y BNL102.

FIG. 31 muestra el diagrama esquemático del proceso de emulsificación-gelificación. Adición de una solución acuosa de alginato de sodio que contiene esporas fúngicas. Emulsificación W/O al tamaño deseado en escala de g; w = 500 - 600 rpm. Emulsificación de gotas de fase interna que contienen las esporas fúngicas viables. CACL<2>polvo para dispensar la reacción de disociación lenta CaCl<2>(aq)

CA2+ 2cl-. inicio/progresión del mecanismo de intercambio: SA (C6H7Nao6)n a [Ca(C<6>H/O<6>)<2>]n recogida de microcápsulas en la parte inferior de la cisterna.

FIG. 32 -Formación de microcápsulas. Se analizaron las soluciones de alginato de sodio al 1,5%, 2%, 3% y 4%, y se seleccionaron 2% y 1,5% para su posterior estudio.

FIG.33 - Ejemplos de microcápsulas que contienen esporas de alginato-base: A) microscopía de luz, b) observada bajo el microscopio de luz del equipo de micromanipulación, c) microscopía electrónica de barrido. Los bares a) y b) son de 100 pm.

FIG. 34A - FIG. 34B. El diagrama de la distribución por tamaño de las microcápsulas de las muestras preparadas a una velocidad de agitación de 700 rpm (SAFS0022%SA, FIG. 34A) y 430 rpm (2% SA+PE+HPMC 2:1:1, FIG. 34B)

FIG. 35 - Una cápsula de alginato en la superficie SDA que muestra un crecimiento micelial intenso.

FIG 36 - una aglomeración de microcápsulas de alginato con esporas después de la rehidratación. Bar 100 pm.

FIG. 37A - 37C - Medición de la resistencia mecánica de microcápsulas en el equipo de micromanipulación en modo seco (37A) y en modo húmedo (37B); una cápsula con esporas. Dentro debajo de la sonda de vidrio en agua (37C).

Descripción detallada

Refiriéndose a LA FIG. 1, los datos demuestran una tasa de mortalidad de hasta 90% cuando se utilizó el BNL 102 contra WFT (insecto), y los ensayos adicionales realizados han demostrado hasta un 100% de eficacia contra una amplia gama de especies de insectos, incluyendo WFT, pulgones, gusanos del ejército, picudo de la vid y picudo del pino (que mostraron entre 80-100% de eficacia en ensayos de invernadero). Los datos mostraron que BNL 102, sin una composición de nanopartículas, fue dos veces y tres veces más eficaz en el control de una población de WFT sobre otros productos que no incluyen BNL 102. Estos otros productos no incluyen BNL 102.

Como se muestra en LA FIG. 1, los datos muestran que BNL 102 proporcionó un control del 100% de WFT en comparación con los resultados de otros productos que no incluyen BNL 102. Los resultados con estos otros productos demostraron los siguientes resultados: Un 50% para insectos beneficiosos, un 20% para insecticidas y un 20% para bioinsecticidas. Como componente significativamente más eficaz de un programa de gestión de plagas, los productos que contengan y/o estén basados en BNL102 proporcionarán muchas ventajas, entre ellas ayudar a la comunidad de productores a cumplir con las regulaciones de la UE sobre gestión integrada de plagas, reducir el uso de pesticidas químicos, mejorar el rendimiento de los cultivos y/o aumentar los beneficios de los usuarios.

La cepa del hongo patógeno insectos del primer aspecto de la presente invención, y las esporas asociadas de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención, se muestra que proporcionan una mejora en el control de plagas en un factor de 2 a 4 veces sobre las soluciones disponibles actualmente, como se puede ver en LA FIG. 1. Un problema importante con los insecticidas químicos implica el desarrollo de resistencia a los compuestos activos. Dado que la presente invención no comprende un plaguicida de molécula pequeña que tenga un compuesto activo al cual una plaga pueda desarrollar una resistencia, la presente solución puede superar una limitación significativa de los insecticidas químicos actuales. La presente invención puede proporcionar un aumento significativo en el rendimiento de los cultivos, pero preferiblemente seguir siendo una alternativa relativamente barata a los insecticidas químicos cuando se considera la eficacia (ver Tabla 1), y por lo tanto, potencialmente minimizar la carga económica para los productores de cultivos.

Tabla 1.Comparación de costos del tratamiento de WFT conMetarhiziumanisoplae BNL102 y otros productos biológicos e insecticidas.

Como puede verse en la Tabla 2, los aspectos primero y segundo de la presente invención muestran una amplia gama de hospederos, y por lo tanto proporcionan una posible reducción del desperdicio de alimentos, que podría ser causado por daños directos atribuidos a una amplia gama de plagas de insectos.

Tabla 2.Patogenicidad deMetarhiziumanisoplae BNL 102 contra plagas múltiples en condiciones de laboratorio.

La presente invención puede facilitar el cumplimiento de la legislación de la UE cuando se utiliza en un programa de gestión integrada de plagas, es preferiblemente no tóxica para los trabajadores y/o usuarios y/o consumidores y/o es segura para el medio ambiente, puede estar libre de residuos y puede ser adecuada para la agricultura tradicional y/o ecológica. La presente invención es preferiblemente compatible con otros bio-pesticidas, bio-fungicidas y/o pesticidas, para su integración en un programa más grande, o ya establecido, de Manejo Integrado de Plagas. La presente invención también puede ser fácil de usar en diferentes sistemas de cultivo.

Los ensayos de semicampo han demostrado una tasa de mortalidad de hasta 90-100% frente a la TMA (FIG. 1) y estudios adicionales realizados contra otras plagas se mencionan en la Tabla 2. Estos datos sugieren queM. anisoplaeBNL 102 es una tecnología de amplio rango de hospederos y puede utilizarse contra muchas plagas y, por lo tanto, puede ser un candidato potencial para la comercialización.M.AnisoplaeBNL 102 sin una nanoformulación / composición es 2 veces, 3 veces, o más de 2-3 veces más eficaz en el control de la WFT sobre productos conocidos en el mercado. Por ejemplo, BNL 102 proporcionó un control del 100% de WFT en comparación con otros productos, estos otros productos proporcionaron un 52% para insectos beneficiosos, un 20% para insecticidas (Tracer) y un 20% para bioinsecticidas (Naturalis-L). La formulación encapsulada de M. anisoplae BNL 102 tendrá un impacto significativo en condiciones de campo cuando las condiciones ambientales son diferentes de las de laboratorio o semicampo. Como componente significativamente más eficaz en los programas de gestión integrada de plagas, los productos basados en M. anisoplae BNL 102 pueden ayudar a los productores africanos a cumplir con las regulaciones de gestión integrada de plagas de la UE, reducir el uso de plaguicidas químicos, mejorar el rendimiento de los cultivos y/o potencialmente aumentar los beneficios de los usuarios.

Los siguientes ejemplos 1 a 5 se llevaron a cabo como parte de un único estudio y se utilizaron técnicas, protocolos y materiales congruentes en todo el mundo, a menos que se indique lo contrario.

Ejemplo 1

Preparación de medios culturales

Los medios de cultivo de Agar Dextrosa Sabouraud (SDA) se prepararon en agua destilada siguiendo un procedimiento estándar. El medio se esterilizó en autoclave a 121oC durante 15 minutos, luego se enfrió a 50oC antes de enchapar en placas de Petri para su uso posterior. Se siguió la técnica aséptica. Las placas de Petri se almacenaron a 4oC hasta que se necesitaran en trabajos posteriores.

SDA 0,93 (93% de humedad relativa de equilibrio (ERH)) / SDA 0,95 ((95% de humedad relativa de equilibrio (ERH)): Se añadieron 92 g / 75 g de glicerol a 250 mL / 300 mL de agua destilada. A continuación, se añadieron 19,5 g de polvo SDA a las soluciones de glicerol y las mezclas se agitaron manualmente. Los medios fueron entonces esterilizados en autoclave a 121oC durante 15 minutos y enfriados a 50oC antes de enchapar en placas de Petri, utilizando técnica aséptica, y almacenados a 4°C.

Los conidios de M.anisopliae cepaBNL 102 se cultivaron en el medio de cultivo SDA utilizando protocolo estándar. Preparación de composiciones de nanopartículas de 1% en peso (dispersiones) y suspensión BNL 102

Se prepararon dispersiones de nanopartículas de 1% en peso en agua intermedia/destilada para los siguientes siete tipos de nanopartículas: Bioplástico, PAA, Si, ZnO, Tio<2>, NaSSS y Ag. Las dispersiones se agitaron antes de la aplicación para garantizar una distribución uniforme.

Se preparó una suspensión de M. anisoplae BNL 102 tomando esporas de la placa de Petri en agua y vórtices durante 2 minutos. Las esporas de hongos se contaron utilizando un hemocitómetro. Se preparó una suspensión con 2 x 106 esporas/mL, la suspensión se preparó a partir de una suspensión BNL 102.

Medición de la actividad del agua de las dispersiones preparadas de nanopartículas de 1% en peso

La actividad del agua (aw) de cada una de estas muestras en función del tiempo se midió después de 1 hora, 3 horas y 6 horas. Se utilizó el instrumento de medición de la actividad del agua Aqua Lab Dew Point 4TE.

Los resultados de la actividad del agua (aw) en función del tiempo para varios tipos de dispersiones de nanopartículas se presentan en la Tabla 1 y FIG. 2. Como se puede ver, se observa un cambio leve en la actividad del agua para Na SSS y PAA. Las muestras no mostraron un cambio significativo en la actividad del agua a lo largo del tiempo, sugiriendo estabilidad de la preparación de esporas de M. anisoplae BNL 102 en cada una de las composiciones de nanopartículas.

Tabla 3.Actividad acuática de una selección de composiciones de nanopartículas después de 1,3 y 6 horas.

Ejemplo 2 - Compatibilidad de nanopartículas con las esporas de BNL 102

Se preparó quitosano al 0,5 % y se añadió 1 mL a 9 mL de cada una de las dispersiones de nanopartículas preparadas como se describe en el ejemplo 1.

0,2 mL de cada dispersión de quitosano/nanopartícula y 0,2 mL de suspensión de BNL 102 preparados (2 x 106 esporas/mL) fueron plateados en una placa de Petri con medios de 0,93 y 0,95 SDA preparados como se describe en el Ejemplo 1. Se realizaron duplicados de cada una de las siete dispersiones quitosano/nanopartículas para cada uno de los medios SDA de ERH del 93% y del 95%. También se prepararon placas de Petri Control añadiendo 0,4 mL de suspensión BNL 102 a placas que comprenden cada uno de los medios 0,93 y 0,95 SDA. Las placas fueron incubadas durante al menos 24 horas a 25°C. En total, se incubaron 32 placas; 16 para 93% y 16 para 95% ERH SDA. Se utilizó la técnica aséptica.

La germinación de las esporas fúngicas fue observada usando un microscopio óptico para comprobar la compatibilidad de nanopartículas en las esporas. Se utilizó un microscopio óptico Olympus BX40 con cámara Infinity3 Lumenera y software de ANÁLISIS INFINITO para capturar imágenes de las esporas.

Preparación de las soluciones de stock necesarias para la composición

1,5% en peso de alginato de sodio (en lo sucesivo denominado ''alginato''), 1% en peso de CuSO4 (en lo sucesivo denominado "Cu"), 1% en peso de FeCl3, 1% en peso de FeCl 2 , 0,5% en peso de quitosano, 0,5% en peso de glicerol yM.La suspensión de Anisoplae BNL 102 (concentración desconocida, cantidad aleatoria tomada, hasta que el agua parecía tener un tinte verdoso) se preparó en agua de la entrepierna/destilada en viales separados. Las soluciones fueron vórtices o agitadas manualmente para obtener una solución clara de las muestras.

FIG. 3 muestra las imágenes capturadas para indicar la germinación de esporas en presencia de nanopartículas, después de 48 horas a 0,95 de actividad acuosa. Como se observó, la mayoría de las nanopartículas muestran buena compatibilidad con las esporas de BNL 102 y no inhiben la germinación.

Ejemplo 3-Preparación de cápsulas de Alginato/Cu/BNL 102/quitosano

Cápsulas de alginato/Cu: El alginato de sodio se añadió dropwise a la solución de CuSO4 de 1% en peso en relación 1:1, y se agitó. Se formaron cápsulas de color azul claro.

Cápsulas de alginato/Cu/quitosano: Las cápsulas de Alginate/Cu se mezclaron con el mismo volumen de la solución de quitosano de 0,5% en peso para recubrir con quitosano.

Alginato/Cu/BNL 102 cápsulas: La primera suspensión Alginate/BNL 102 fue preparada añadiendo alginato a la suspensión BNL 102 en relación de volumen 1:4. La mezcla se agitó manualmente. Luego se añadió alginato/BNL 102 a la solución de CuSO4 en relación 1:1 y se mezcló.

Alginato/Cu/BNL 102 cápsulas de quitosano: Las cápsulas preparadas anteriormente se mezclaron con la misma cantidad de la solución de quitosano de 0,5% en peso para recubrir con quitosano.

Efecto de alginato/Cu y alginato/Cu/quitosano sobre la germinación de esporas de BNL 102

Dos tipos de cápsulas, es decir, alginato/BNL 102/Cu y alginato/BNL 102/Cu/quitosano, se platearon en placas separadas de Petri que contenían SDA, 0,93 y 0,95. Cinco cápsulas fueron puestas en los medios en la placa en cinco puntos diferentes. Se prepararon dos placas para cada tipo de medio. Se siguió la técnica aséptica durante este trabajo. Las placas fueron incubadas a 25°C durante al menos 24 horas. La germinación se verificó después de 24, 48 y hasta 72 horas después del plateado.

La apariencia visual de las muestras de alginato que encapsulan Cu, BNL 102/Cu y aquellas recubiertas con quitosano se muestra en LA FIG. 4. Las cápsulas de alginato/Cu son de color azul claro.

Ejemplo 4- Preparación de muestras de alainato/Fe(II) y alainato/Fe(III) (cápsulas de Fe)

Se utilizó una relación de volumen 15 1:1 de alginato de sodio y FeCl3 (Fe(II)) o FeCl 2 (Fe(III)). El procedimiento seguido fue similar al de Cu en el Ejemplo 3. En el caso de Fe(II) y Fe(III), el contenedor FeCl3 o FeCl<2>solución se cubrió con lámina para minimizar el efecto de la luz sobre FeCl3 y FeCl<2>.

El efecto de la luz sobre las cápsulas de Fe y el líquido viscoso se estudió mediante la prueba de muestras en recipientes (abiertos) bajo una lámpara y luz natural durante un máximo de 4 horas.

Preparación de alginato/BNL 102/Fe(III) y alginato/BNL 102/Fe(II)

En primer lugar, la suspensión de alginato/BNL 102 se preparó siguiendo el procedimiento descrito en el ejemplo 3. Relación de volumen 1:4 de BNLM. anisoplae102: Se utilizó alginato y se añadió alginato a la suspensión BNL 102. El pH de la solución se ajustó a 7, mediante la adición de una pequeña cantidad de 0,1 M de NaOH.

Se prepararon muestras de alginato/BNL 102/Fe(III) o Fe(II) siguiendo el método descrito anteriormente. Alginato/BNL 102 fue añadido dropwise usando una jeringa de aguja a las soluciones de Fe(III) o Fe(II) tomadas en dos contenedores diferentes, cada uno cubierto con papel de aluminio.

Efecto de alginato/BNL 102/Fe(III) y alginato/BNL 102/Fe(II) sobre la germinación de esporas de BNL 102

Dos muestras, es decir, alginato/BNL 102/Fe(III) y alginato/BNL 102/Fe(II), fueron plateadas en placas separadas de Petri que contenían SDA, 0,93 y 0,95. Se colocaron cinco cápsulas/gotas en el medio en la placa en cinco puntos diferentes. Se prepararon dos placas para cada tipo de medio. La técnica aséptica se utilizó en todo momento. Las placas fueron incubadas a 25°C durante al menos 24 horas. La germinación se verificó después de 24, 48 y hasta 72 horas después del plateado.

FeCl3 formó cápsulas marrones mientras que FeCl<2>formó líquido blanco viscoso cuando se mezcló con alginato (FIG.

5 A; y FIG. 5 B). Las cápsulas y el líquido viscoso perdieron agua y también se observaron algunos cambios en el color (FIG. 5 C; y FIG. 5 D), por ejemplo, marrón Las cápsulas de alginato/Fe(III) se volvieron más oscuras y se encogieron en tamaño. El líquido viscoso blanco se volvió más sólido. Por otra parte, la actividad hídrica de alginato/BNL 102/Fe(III)/quitosano/glicerol mostró una disminución significativa en el valor de la actividad hídrica de 0,9984 a 0,2748 en 4 horas.

Ejemplo 5 - Preparación de alginato/BNL 102/Fe(III)/quitosano/alicerol

Primer quitosano 1:1: Se preparó la mezcla de glicerol. A continuación, las cápsulas de alginato/BNL 102/Fe(III) preparadas como se describe anteriormente en el ejemplo 4, y fueron recubiertas con quitosano/glicerol utilizando una relación de peso 1:1 de alginato/BNL 102/Fe(III) : quitosano/glicerol.

Actividad hídrica y efecto de germinación de alginato/BNL 102/Fe (III)/quitosano/glicerol

Se midió la actividad hídrica y se estudió la germinación, en función del tiempo. FIG. 6 a LA FIG. 9 muestran imágenes ópticas del microscopio para formulaciones de alginato/BNL 102 con iones Cu, Fe(III) y Fe(II) con y sin recubrimiento de quitosano o quitosano/glicerol. Como se puede ver, el alginato, los iones metálicos, el quitosano o el glicerol no tienen ningún efecto inhibitorio sobre la germinación de las esporas de hongos.

Las composiciones de nanopartículas hechas con alginato (un hidrogel) mostraron propiedades deseables que se esperaría para mejorar la adhesión de esporas de hongos en plantas y plagas de insectos, por ejemplo, cuando se usan en aplicaciones de pulverización. Los ejemplos presentados en la actualidad de las composiciones de nanopartículas según el tercer aspecto de la presente invención han sido demostrados con una cepa de hongos patógenos insectos según el primer aspecto de la presente invención, y esporas de los mismos según el segundo aspecto de la presente invención, recientemente identificadas como con características favorables de rango hospedero, virulencia y eficacia sobre las alternativas actualmente disponibles. La combinación de hongos o esporas según el primer y segundo aspecto, junto con la composición según el tercer aspecto, podría proporcionar a su vez una eficacia mejorada sobre las alternativas disponibles actualmente. Además, la adición de iones metálicos como el cobre y el hierro se ha demostrado aquí para no tener ningún efecto negativo y no inhibe la germinación de esporas. La eficacia de la composición puede mejorarse aún más con el recubrimiento de quitosano y la humedad de la composición podría controlarse mediante la adición de humectantes como el glicerol.

La microencapsulación de esporas fúngicas también puede usarse para formar un ejemplo adicional de encarnación de una composición del tercer aspecto de la presente invención. Las esporas de hongos patógenos insectos cosechadas de la fermentación en estado sólido se almacenarían preferiblemente a 40°C.

Los biopolímeros solubles en agua se disuelven preferiblemente en agua para formar una solución acuosa. Los candidatos de tales biopolímeros, podrían incluir, por ejemplo, una mezcla de carboximetilcelulosa (CMC) y alginato de sodio (SA) o pectina baja en metoxilo. Otros ejemplos de candidatos para biopolímeros serían apreciados por el lector experto. Las esporas de hongos se añaden preferiblemente a la solución para formar una suspensión. La suspensión acuosa entonces se dispersaría en una fase de aceite (en, por ejemplo, aceite vegetal) para formar una emulsión de agua/aceite. Se apreciarán ejemplos adicionales de aceites adecuados para producir una emulsión agua/aceite. La emulsión se produce idealmente en un tanque agitado con una turbina Rushton de configuración estándar. Otros métodos para producir una emulsión serán evidentes. El tamaño máximo de la gota de la fase acuosa, con esporas de hongos, será controlado idealmente para ser inferior a 100 micras mediante la velocidad de agitación variable del impulsor de la turbina Rushton. En el ejemplo descrito actualmente,los polvos de cloruro de calcio (CaCl 2 ) se añadirían a la fase de aceite y se mantendría la mezcla de la emulsión. Cuando los polvos CaCl 2 entran en contacto con la fase acuosa, Ca<2>+ se liberará en la interfaz agua/aceite para intercambiar con iones de sodio (Na+) en la solución acuosa, para formar una cáscara sólida de alginato de calcio cuando el alginato de sodio está presente, o para dar lugar ala gelificación de interacciones iónicas no covalentes específicas entre bloques de residuos de ácido galacturónico de la columna vertebral pectina con Ca 2 . En cada caso, las esporas de hongos mezcladas con carboximetilcelulosa se pueden encapsular. Las microcápsulas formadas se centrifugarán del aceite, y el aire o la liofilización se secarán para mantener la estabilidad de almacenamiento a largo plazo. La actividad hídrica de las microcápsulas secas debería mantenerse idealmente en 0,1 - 0,3.

En relación con un método de ejemplo de uso de la composición de ejemplo descrita anteriormente, las microcápsulas resultantes se utilizarían para formar un spray foliar. Antes de que las microcápsulas se rocien sobre plantas y cultivos, se dispersarán en agua con un biosurfactante de alto valor de equilibrio hidrofilo-lipofilo (HLB) como rhamnolipidos, soforolípidos o lípidos de zaforosa de origen microbiano. Las microcápsulas de hidrogel seco deben tener una capacidad súper absorbente de agua e hincharse en una medida significativa después de estar expuestas al agua. El biosurfactante puede reducir significativamente la tensión interfacial de la suspensión acuosa. Después de que las microcápsulas en agua se rocían a la superficie de las plantas, el biosurfactante debe reducir el tamaño de la gota formada, y ayudar a que la suspensión acuosa se extienda bien en la superficie para mejorar la retención de las microcápsulas. Además, el agua absorbida en las microcápsulas debe mantenerse hasta 5 horas, lo que permite que las esporas de hongos germinen. La resistencia mecánica de las microcápsulas debe ser ajustada para permitir que las microcápsulas se rompan después de 5 horas debido a la hidratación y la hinchazón o ruptura por los insectos cuando se mueven sobre las microcápsulas, lo que permite el contacto directo entre los insectos y las esporas de hongos para realizar las funcionalidades del insecticida.

Los siguientes ejemplos 6 a 9 se llevaron a cabo como parte de un segundo estudio y se utilizaron técnicas, protocolos y materiales congruentes a menos que se indique lo contrario.

Ejemplo 6 - Producción de inoculo

M. anisoplaeBNL 102 conidios fueron obtenidos a partir del cultivo de las cepas cultivadas en Saubaroud Dextrosa Agar (<s>D<a>) a 25°C durante 10 días.

Para la producción de blastoporos se utilizó el equivalente a 10 g de peptonona y 40 g de medio de caldo de glucosa. Esto fue en forma de alícuotas de 50 mL en frascos desconcertados de 250 mL o de 100 a 125 mL en frascos desconcertados de 500 mL en un agitador orbital a 125 rpm e incubados durante 72 h. Antes de su uso, los conidios se colocaron en una botella de vidrio universal de 25 mL que contenía 10 mL de agua estéril y 0,01% entre 80 utilizando un lazo estéril de los cultivos mencionados y agitados vigorosamente. Para cultivos de caldo líquido se filtraron 25 mL de medio a través de lana de vidrio estéril para eliminar el micelio y fragmentos para producir un caldo que contenía solo blastosporas.

Las concentraciones de conidios y blastosporas fueron verificadas con un hemocitómetro y diluidas en caso necesario para obtener 1 x 104 y 106 cfu/mL.

Compatibilidad deMetarhizium anisopliaeBNL 102 conidios y blastosporas

1. CMC (insoluble)

2. Acetato de celulosa (mezcla insoluble)

3. Xantham Gum (insoluble)

4. Goma arábiga (soluble)

5. Na Alginato (insoluble)

6. Quitosano (soluble/gel)

7. Pectina cítrica (insoluble)

8. (+) Arabinogalactán (soluble)

9. Alfa-ciclodextrina (soluble)

10. Poli (sal sódica de ácido acrílico) (soluble)

11. Maltodextrosa (soluble)

12. Celulosa (mezcla insoluble)

En todos los casos se hizo una mezcla del 12,5% de todos los compuestos en agua estéril y entre 80. Esto se diluyó para constituir el 1,25% de cada compuesto. Esto se utilizó para los ensayos de compatibilidad. Siete compuestos fueron solubles en el agua estéril. Los otros formaron geles muy rígidos que los hacía difíciles de trabajar y por lo tanto no fueron incluidos en los ensayos.

Ensayos de germinación

Se añadió una alícuota de 0,1 mL de suspensión conidial o blastospora a los tratamientos. Estos fueron sacudidos y dejados por 60 minutos. Luego, se distribuyeron 0,2 mL alícuotas sobre 2 placas réplicas de resistencia a / SDA (0,995 ap = 99.5% ERH) y sobre 2 placas réplicas de resistencia a / SDA modificadas a 0,95 ap (=95% ERH) con glicerol. Las suspensiones y compuestos de esporas se extendieron utilizando un esparcidor estéril de acero inoxidable. Los diferentestratamientos de actividad hídrica (a w) (placas SDA) fueron almacenados en bolsas de polietileno que fueron selladas para asegurar que las condiciones se mantuvieron e incubaron a 25°C durante un máximo de 48 h. Los tratamientos y réplicas se verificaron después de 24 y 48 h.

Para comprobar la germinación, se utilizó un barrenador de corcho de acero inoxidable de 1 cm para cortar discos aleatorios de las placas SDA replicadas. Dos de cada réplica fueron tomados al azar colocados en un portaobjetos de vidrio, teñidos con lactofenol/algodón azul para detener la germinación y crecimiento. Luego se colocaron cubreobjetos de vidrio sobre los discos para un examen microscópico. Se realizaron fotografías de los diferentes tratamientos en campos aleatorios y se almacenaron en el PC del laboratorio. Se evaluó el porcentaje de germinación. Donde todos los conidios/blastosporas habían germinado, las longitudes del tubo germinal se midieron de hasta 20 - 25 propágulos al azar. Los medios y S.E. (error estándar) para los diferentes tratamientos se calcularon y graficaron.

FIG. 10 muestra que los tratamientos conidiales fueron completamente compatibles con todos los compuestos probados con germinación en todos los casos después de 24 h con agua de libre disponibilidad. Sin embargo, hubo diferencias en las longitudes de los tubos germinales (FIG. 10).

En el tubo de germen de control no tratado la longitud era muy larga y no se podía medir. Con los diferentes compuestos las longitudes del tubo germinal fueron significativamente más cortas y hubo algunas diferencias entre los tratamientos.

Algunos como el acetato de celulosa, ciclodextrina, maltodextrina y celulosa parecen ser más compatibles (FIG. 11). Después de 24 h, ningún tratamiento, ni conidiales ni blastosporas, había germinado a 0,95 ap (=95% ERH). Así, la germinación y la extensión del tubo germinativo se examinaron cuantificadas después de 48 h.

Las figs 14 y 15 muestran el efecto de los tratamientos sobre la germinación y la extensión del tubo germinal respectivamente a 0,95 A y 25°C. Esto mostró que el control y cuatro tratamientos tuvieron una germinación del 100% en comparación con otros (76-82%). Los otros mostraron menos germinación. Sin embargo, las longitudes del tubo germinal fueron mucho más cortas en los tratamientos que en los controles (FIG. 15). No pareció haber mucha diferencia entre los compuestos basados en la extensión del tubo germinal bajo estrés hídrico con todos los tratamientos que inhiben la extensión del tubo germinal cuando comparados con los controles.

Para la comparación, experimentos similares se llevaron a cabo con blastosporas de cultivo de caldo líquido.

Las figuras 16 y 17 muestran los efectos de diferentes compuestos sobre la germinación y la extensión del tubo germinal de las blastosporas. Esto muestra que las mezclas de todos los compuestos con blastosporas resultaron en una germinación del 100%. Sin embargo, la longitud del tubo germinal de las blastosporas volvió a ser variable, con algunos compuestos que resultaron en una mejor extensión del tubo germinal en comparación con los controles a 0,95 aw y 25°C después de 48 h. En este caso, el acetato de celulosa, quitosano, alfa galactan y celulosa parecían ser particularmente buenos en comparación con otros compuestos.

Ejemplo 7

Utilizando técnicas del Ejemplo 6:

Formulación de los mejores compuestos compatibles con conidios y blastosporas de BNL 102.

Ensayos de gel bead: La producción de conidios inmovilizados de BNL 102 se examinó mediante el uso de diferentes tamaños de aguja para la extrusión de las mezclas de alginato de sodio y compuestos compatibles (1,25%) y conidiales (log 6 esporas/mL). La solución se pasó a través de una jeringa y las gotas formaron geles en una solución de cloruro de calcio al 3%. Al variar el tamaño de la aguja, fue posible producir tamaños de perlas de aproximadamente 0,5 mm a 0,2-0,25 mm de diámetro. Estos fueron plateados directamente sobre / fuerza SDA y<1/2>SDA/0,95 Aw para el examen de la viabilidad después de 3, 6 y 24 h. discos estériles (6 mm de diámetro). fueron cortados de la superficie del agar, teñidos, cubiertos con una cubierta de vidrio y examinados bajo el microscopio con un sistema de software de captura de imágenes fotográficas para registrar la germinación.

Micro-escala gel bead producción: Se decidió que los tamaños de perlas mucho más pequeños eran necesarios para la pulverización - en el rango de 100 - 200 gm de diámetro. Por lo tanto, se decidió hacer mezclas específicas de conidios o blastosporas a dos niveles de inóculo (log 4 y 6 esporas/mL) para dos tratamientos compatibles de cada uno. Estos fueron preparados como suspensiones líquidas. Estos se están utilizando para bioensayos. Los compuestos y concentraciones compatibles de los propágulos de M. anisoplae BNL 102 elegidos fueron:

Formulaciones conidiales:

1. Goma arábiga (106 cfu/mL)

2. Goma arábiga (104 cfu/mL)

3. Maltodextrina (106 cfu/mL)

4. Maltodextrina (104 cfu/mL)

Formulaciones de Blastospore

1. Goma arábiga (106 cfu/mL)

2. Goma arábiga (104 cfu/mL)

3. PAA (106 cfu/mL)

4. PAA (104 cfu/mL)

Producción y viabilidad de geles formulados de conidios y blastosporas

Inicialmente se hicieron dos tamaños diferentes de perlas de gel con algunos de los compuestos compatibles y alginato de sodio y conidios en solución de cloruro de calcio. FIG. 18 muestra un ejemplo de las cuentas inicialmente hechas.

El más pequeño era de unos 0,5 mm sin ninguna agitación de la solución de cloruro de calcio para la formación de gel.

Se colocaron 10-12 perlas en la celda de actividad del agua y se midió esto después de la formulación y la eliminación del exceso de agua y luego 4 h más tarde a 25°C en 50-60% HR. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

La Tabla 4 muestra la actividad hídrica inicial y final de las formulaciones de gel inmovilizado más pequeñas utilizando la máquina de actividad hídrica Aqualab 4TE. Las muestras de geles se mantuvieron a 25°C y 50-60% HR. Esto muestra claramente que hubo una variación en la actividad inicial del agua del gel dependiendo de los compuestos utilizados para su formación. Inicialmente eran todos familiares húmedos con actividades de alta agua. Sin embargo, después de 4 h se habían secado significativamente a niveles donde no se produciría ningún crecimiento de hongos. Esto sugiere que los humectantes o aditivos serían necesarios para tratar de conservar el agua durante períodos de tiempo más largos.

Tabla 4.Cambio en la actividad del agua durante el secado de las perlas de gel formuladas se mantiene a 25°C y 50-60% R.H.

Estas perlas fueron enchapadas en la actividad acuosa de / SDA y<1/2>SDA 0,95 para examinar la germinación después de 3, 6 y posteriormente 15 h por tinción. Después de 3 h no hubo germinación de los conidios independientemente del tratamiento (4 compuestos diferentes y conidios). Sin embargo, después de 6 h pudimos ver algo de germinación en el medio / SDA con agua disponible libremente. FIG. 19 muestra la germinación de conidios a partir de cuatro formulaciones diferentes hechas. Hubo algunas diferencias en la longitud de los tubos germinales entre las formulaciones, pero esto tendría que cuantificarse por mediciones posteriormente.

Microencapsulación de conidios en perlas más pequeñas utilizando soluciones de cloruro de calcio agitadas

Las figuras 20 y 21 muestran ejemplos de las cuentas mucho más pequeñas que se hicieron posteriormente. Estos eran variables en tamaño pero tenían mucho menos cargas conidiales que antes. El tamaño promedio de estas cuentas fue entre 75 - 200 pm de diámetro. La germinación de estas perlas se puede ver claramente después de 15 h para dos de las cuatro formulaciones que se han enviado al solicitante para bioensayos.

Se observó que bajo condiciones de estrés hídrico, independientemente de las formulaciones hechas, la germinación apenas estaba comenzando a tener lugar a las 0,95 aw después de las 15 h (FIG. 22).

Micro formulación de cuatro formulaciones de blastosporas para bioensayos

Se utilizaron dos compuestos compatibles diferentes para la formulación de blastosporas. Se utilizaron goma arábiga y sal de sodio poliacrílico.

FIG. 23 muestra las cuatro formulaciones hechas y enviadas al solicitante para bioensayos. FIG. 24 muestra un ejemplo del crecimiento de blastosporas después de 24 h en el medio / SDA.

En general, el crecimiento no fue tan rápido como para la extensión del tubo germinal de conidios después de la formulación, sin crecimiento de formulaciones de blastosporas a 0,95 aw / medio SDA incluso después de 48 h a 25°C.

Ejemplo 8

Utilizando técnicas de los Ejemplos 6 y 7:

Formulaciones secas de conidiales para la dispersión como polvo humectable

Conidios deM. anisoplaeBNL 102 se inmovilizó en alginato de sodio y cinco compuestos compatibles diferentes (concentración del 1,25%). Estos se han mezclado con agitadores magnéticos y luego los geles se formaron en cloruro de calcio al 3%. Aproximadamente 20 ml de cada formulación se utilizaron para preparar suficientes perlas para el secado y la fabricación de polvos formulados y para ensayos de viabilidad sobre / fuerza SDA y el mismo medio a 0,95 de actividad de agua. Los tratamientos utilizados fueron:

1. Goma arábiga (soluble)

2. (+) Arabinogalactán (soluble)

3. Alfa-ciclodextrina (soluble)

4. Poli (sal sódica de ácido acrílico) (soluble)

5. Maltodextrosa (soluble)

Formulación de cinco conidios diferentes para producir polvos secos

Cinco (5) formulaciones diferentes fueron hechas en pequeñas microcápsulas de aproximadamente 0,25 - 0,5 mm de diámetro. La intención aquí era secarlos y luego convertirlos en polvos que pudieran dispersarse en agua y un agente humectante y rociarse. Sin embargo, cuando estos fueron secados y molidos, formaron capas finas de material que contenían las esporas y no muy partículas. Esto sugiere que se requieren aditivos adicionales para poder secar y luego moler las cuentas de gel en polvos.

FIG. 25 muestra las 5 formulaciones diferentes después del secado y la molienda. Clave de los compuestos utilizados: 4, goma arábiga (soluble); 8, (+) arabinogalactán (soluble); 9, alfa-ciclodextrina (soluble); 10, Poli (sal sódica de ácido acrílico) (soluble); 11, Maltodextrosa (soluble)

Ejemplo 9

Utilizando técnicas del Ejemplo 6 al 8:

Infectividad de materiales formulados contra WFT adulto

Cría de WFT

Una colonia de WFT fue mantenida en Bioneas descrita por Ansari et al. (2007). Brevemente, las WFT fueron criadas en recipientes de plástico ventilados (29 ± 29 x 16 cm) mantenidos a 28 1 °C, 50 - 60 % h. y fotoperiodo L16:D8. Entre 40 y 50 adultos WFT fueron introducidos en los recipientes y provistos de 3 a 4 piezas (8 - 9 cm de longitud) de frijol verde (Phaseolus vulgaris L.) para la oviposición y 2 a 3 flores amarillas de crisantemo (Asda). Después de 3 días, los granos fueron transferidos a recipientes de plástico fresco ventilado (28 x 20 x 10 cm). En todos los bioensayos se utilizó la WFT en adultos (FIG. 27A).

Formulación

Las siguientes formulaciones fueron recibidas por el solicitante de un CRO, para la prueba de bioensayo. Los productos se almacenaron a 10°C hasta su uso.

Formulación a partir de conidios secos de BNL 102

1. Goma arábiga (106 cfu/mL)

2. Goma arábiga (104 cfu/mL)

3. Maltodextrina (106 cfu/mL)

4. Maltodextrina (104 cfu/mL)

Formulación blastospora de BNL 102

1. Goma arábiga (106 cfu/mL)

2. Goma arábiga (104 cfu/mL)

3. PAA (106 cfu/mL)

4. PAA (104 cfu/mL)

Pruebas de formulaciones contra WFT adulto

Estos experimentos fueron diseñados para evaluar la infectividad de diferentes formulaciones frente a WFT adultos. Los ensayos se realizaron en recipientes de plástico blanco opaco (25 x 25 cm; 15 cm de profundidad; área de superficie 625 cm<2>) como describen Ansari et al. (2011) con ligera modificación. Se hizo un orificio de ventilación (10 x 10 cm) en cada tapa y se cubrió con gasa de nylon (tamaño de poro de 64 mm). Se colocó una doble capa de papel de seda húmedo en cada contenedor de manera que cubriera el fondo y a la mitad de cada lado. Tres frijoles frescos y cinco flores de crisantemo se colocaron en la parte superior del papel de seda. Después de eso, las formulaciones de conidios y blastosporos a razón de 104 y 106 cfu/cm<2>fueron rociadas usando un rociador manual (tamaño de poro 300 pm) (FIG. 29).

Para cada réplica, aproximadamente 400 WFT adultos fueron liberados en cada contenedor. Por lo tanto, la WFT estuvo continuamente expuesta a formulaciones a través del contacto tarsal o en la región de la cabeza y el tórax durante la duración del estudio. El papel de seda permaneció en el recipiente hasta el final de la prueba (un mínimo de 72 h). Las WFT control fueron tratadas de la misma manera pero en ausencia de formulación de conidios o blastosporos. Los contenedores se mantuvieron en una sala de temperatura constante (28 ± 1oC, 80 - 90% r.h., y L16:D8). La supervivencia de la WFT se monitorizó diariamente 5 durante 72 h. Las WFT muertas se recolectaron individualmente de cada envase, se sumergieron en etanol al 70% e incubaron en papel de seda húmedo en placas de Petri (25 ± 1C durante 2 - 3 días) después de lo cual se examinaron con un microscopio de luz a aumento 40x para evidencia de esporulación fúngica. Cada tratamiento se replicó cuatro veces y todo el experimento se llevó a cabo dos veces.

Resultados del bioensayo

Los resultados globales de los bioensayos mostraron que las formulaciones de blastosporas fueron mejores que las formulaciones conidiales y proporcionaron un control de la WFT > 80%.

Formulaciones conidiales

Tanto las formulaciones de goma arábiga como de maltodextrina redujeron significativamente la supervivencia de la WFT en comparación con el control no tratado 3 días después de la exposición (FIG. 26). En general, los conidios formulados en Maltodextrina fueron la formulación más efectiva y causaron una reducción significativamente mayor en la supervivencia de WFT en comparación con la formulación de goma arábiga. Después de la exposición continua, 100% de mortalidad (confirmada por esporulación fúngica en cadáveres WFT; FIG. 27) se observó con ambas formulaciones al día 5 comparadas con las mortales acumuladas estimadas de 38,8%, 28,3%, 50,5%, 48,1 y 85,0% para Esporas secas (106 ufu/cm-sin formular), GA (104 ufu/cm), GA (106 ufu/ cm), MD (104 ufu/cm) y MD (106 ufu/cm), respectivamente. Los tratamientos control mostraron 4,0% (con 0% de esporulación) de mortalidad por WFT 5 días después del tratamiento.

Formulaciones de Blastospore

Tanto las formulaciones de goma arábiga como de maltodextrina redujeron significativamente la supervivencia de la WFT en comparación con el control no tratado 3 días después de la exposición (FIG. 28). En general, los conidios formulados en Maltodextrina fueron la formulación más efectiva y causaron una reducción significativamente mayor en la supervivencia de WFT en comparación con la formulación de goma arábiga. Después de la exposición continua, se observó una mortalidad del 100% (confirmada por esporulación fúngica en cadáveres WFT) con ambas formulaciones al día 5, comparado con las muertes acumuladas estimadas de 45,0%, 57,5%, 65,0%, 67,0% y 75,6% para esp°ras secas oo 6 du /cm-sin formular), GA (104 cfu/cm), GA (106 cfu/cm), respectivamente. Los tratamientos control mostraron 4,0% (con 0% de esporulación) de mortalidad por WFT 5 días después del tratamiento.

Conclusiones de los ejemplos 6 a 9

Estudios de compatibilidad

El estudio de compatibilidad ha demostrado que existe una buena compatibilidad entre conidios y blastosporas con muchos de los compuestos.

Se encontró que los datos importantes estaban relacionados con la capacidad de extensión del tubo germinal conidial o blastospora, donde se observaron diferencias tanto a 0,995 aw después de 24 h, como a 0,95 aw después de 48 h.

Formulaciones de conidios y blastosporas

En general, se prepararon tres tipos diferentes de formulaciones. Debido a que se consideraron partículas de pf de dos tamaños grandes (0,25 - 0,75 mm de diámetro), se utilizó un sistema de mezcla con un agitador magnético para obtener conidios y blastosporas formulados mucho más finos para obtener el rango de tamaños necesarios.

En algunas realizaciones, si el tamaño del grano no está controlado, los granos formados pueden ser de tamaños variables. Esto podría mejorarse preferiblemente utilizando, por ejemplo, un sistema de mezcla basado en hélices con diferentes velocidades y tamaños de hélices.

En general, la germinación de conidios y blastosporas no se inició después de aproximadamente 4 h. Sin embargo, después de 6 h esto se inició en las formulaciones hechas con los dos compuestos utilizados para ambos tipos de propágulos, independientemente del nivel de inóculo.

Las formulaciones de Blastospore fueron más sensibles a la formulación que los conidios.

En general, el crecimiento de blastosporas, incluso con agua libre disponible, no fue tan bueno como el de las formulaciones de conidios después de 24 y 48 h. Esto podría deberse a blastosporas, aunque son más virulentas en la matanza de plagas de insectos, son más sensibles a la desecación y menos susceptibles a la formulación debido a la naturaleza más frágil de la pared celular micelial frente a los conidios que tienen una pared más gruesa y son más resilientes.

Se intentó producir las cinco formulaciones secas. Pudimos producir los conidios microencapsulados en geles de 0,25 a 0,5 mm. Estos fueron secados y luego molidos. En algunos casos, esto puede resultar en hojas finas/fragmentos de los productos encapsulados.

Esto puede ser adecuado para aplicaciones particulares. En aplicaciones que requieran productos en polvo, en algunos de estos casos se puede requerir que proporcionen aditivos adicionales, como por ejemplo dispersantes, pegatinas y/o rellenos para proporcionar un producto a base de polvo seco. Los destinatarios calificados conocerán ejemplos de tales productos.

Bioensayo

Este estudio busca demostrar la eficacia de los productos formulados por hongos entomopatógenos frente a WFT en adultos. Si bien todas las formulaciones y dosis analizadas redujeron significativamente la supervivencia de la WFT, los conidios o blastosporos formulados en maltodextrina fueron la formulación más eficaz y causaron una reducción significativamente mayor en la supervivencia de la WFT en comparación con la formulación de goma arábiga a dosis más altas.

Las larvas de WFT también causan daños considerables.

Los WFT adultos son muy móviles y por lo tanto es importante adquirir suficiente producto formulado en la superficie de la hoja.

Después de la exposición continua, se confirmó la mortalidad del 100%. La presencia de esporulación fúngica en los cadáveres WFT confirmó que los insectos infectados pueden transmitir esporas fúngicas a otros insectos sanos, reduciendo aún más la población de plagas.

Las boquillas de pulverización varían en tamaño. Se proporcionan preferiblemente microcápsulas formuladas para uso en pulverización que son adecuadas para su uso en boquillas de pulverización convencionales (100, 200, 300 gm) y boquillas de pulverización especialmente diseñadas dependiendo de la aplicación. Es preferible adaptar el tamaño de cualquier formulación a la boquilla de pulverización deseada, o opcionalmente viceversa, para permitir una pulverización uniforme.

En LA FIG. Se proporciona un método para preparar una composición de microencapsulación de acuerdo con un tercer o cuarto aspecto de la presente invención. 30. La Figura 30 proporciona el método que se utiliza para producir una composición que comprende una mezcla de BNL101 y BNL102 de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención. Las realizaciones están disponibles en donde el método se utiliza para producir una composición que comprende solo BNL101 o BNL102.

Ejemplo - Microencapsulación de esporas fúngicas - Nueva Microencapsulación de esporas fúngicas para el control de plagas de los cultivos principales y procedimientos eficaces de manejo integrado de plagas

El control de las plagas de insectos que utilizan hongos entomopatógenos para evitar la aplicación de pesticidas químicos y aumentar la protección ambiental se proporciona a través de las formulaciones biopesticidas actuales. Para una aplicación segura y específica, el biopesticida fúngico debe formularse de una manera que mantenga la viabilidad, estabilidad y virulencia de los conidios fúngicos, y que los proteja de los efectos adversos del medio ambiente. El producto también es económico (menos costoso que otros pesticidas y biopesticidas disponibles) y fácil de aplicar.

Existen varios enfoques para preparar formulaciones de biopesticidas. Una preparación prevé la encapsulación de las esporas de hongos en polímeros. Las composiciones de materiales para los biopesticidas aquí descritos incluyen gelatina, quitosano, alginato de sodio, hidroxipropil metilcelulosa (HPMC), dextrina, ciclodextrinas, poliésteres alifáticos, como homo y copolímeros de lactato y glicolato (PLA, PGA y PLGA), poli y caprolactona (PCL), polihidroxialcanoatos (PHA), mandioca. Estos agentes se describen generalmente en Liu & Liu, 2009 y Rodrigues et al., 2017.

Para microencapsular las esporas deMetharizium anesoplea ,se utilizó como polímero base el ácido algínico, la sal Na de Acros Organic o Sigma-Aldrich. El alginato de sodio (SA) es un heteropolisacárido lineal con dos unidades estructurales: Los ácidos D-manurónico y L-gulurónico. En el proceso de encapsulación, las esporas fueron atrapadas en una red 3D de alginato iónicamente reticulado.

Para modificar las propiedades de las microcápsulas, se utilizaron los siguientes copolímeros:

1. Pectina (PE) de cáscara de cítricos - polisacárido natural, composición: Ácido galacturónico >74,0 % (base seca), <10 % de humedad. Produce sal insoluble pectinato de calcio.

2. Hidroxipropil metilcelulosa (Hipromelosa, HPMC) - polímero viscoelástico semisintético H7509, Sigma, viscosidad 2.600-5.600 CP, 2 % en H<2>O<(20>C).

3. Metilcelulosa (MC) - M0562, Sigma, viscosidad 400 cp, 2 % en H<2>O (20 C).

4. Goma arábiga (GA) de árbol de acacia, polisacárido brunch - G9752, Sigma.

5. Goma guar (GG) polisacárido de galactomanano extraído de granos guar - G4129, Sigma.

Todos los copolímeros utilizados son sustancias no tóxicas, no alergénicas y comestibles.

Los copolímeros de diferente viscosidad fueron elegidos como moduladores de la morfología de las microcápsulas: Una viscosidad más baja permite obtener microesferas más pequeñas y esféricas, mientras que los polímeros de alta viscosidad producen microesferas más grandes y alargadas y pueden aumentar el grado de aglomeración de microesferas (L.W. Chan, et al., 1997).

Cápsulas que contienen esporas-producción

Para la microencapsulación de esporas M anisopliea se utilizó el método de emulsificación-gelificación. Este método de emulsificación fue modificado. Se consideraron las modificaciones descritas en Xue J., Zhang ZH., 2009. Las esporas del hongo entomopatógenoM.Anisoplieaobtenida de Bionema Ltd (~600 mg).

El diagrama esquemático del proceso de emulsificación-gelificación se muestra en la Figura 31.

Las esporas de M. anisopliea son altamente hidrofóbicas, para dispersarlas se utilizó la solución Tween-80 al 0,03%. La concentración de la suspensión de trabajo fue de ~107 (1 mg/ml). Fig. 31.

La cantidad requerida (200 ml) de una fase aceitosa continua (aceite de girasol, comprado en un mercado local por lo que s 0,9 gm L-1) se puso en un reactor encamisado de 250 ml, la temperatura del reactor se estabilizó a 25 °C. La suspensión de esporas de hongos se mezcló con la solución del polímero/polímeros a una concentración requerida de un polímero. La mezcla de esporas y polímero fue dispersada en aceite por un impulsor de turbina a la velocidad de agitación de 400 rpm durante 30 min para formar una emulsión estable. CACL<2>polvo (1g - 250 mg) fue agregado lentamente en el sistema de agua/aceite (p/o). La agitación se mantuvo durante otras 2 h o como se indicó. Las microesferas formadas asentadas en el fondo del vaso agitado fueron recolectadas después de que la agitación fue detenida por filtración al vacío, lavada con solución Tween 80 al 0,03% y secada a temperatura ambiente.

Las microcápsulas preparadas con pectina solo eran estables cuando se suspenden en agua y se aglomeran cuando se secan al aire. La aglomeración ocurrió independientemente del tiempo de reticulación y esta formulación no fue considerada para un estudio posterior. Las cápsulas preparadas con mayor concentración (30%, 20%) de un copolímero, como HPMC y MC, tienden a aglomerarse más en comparación con la adición de copolímero del 10%. Estudio de formulaciones de microcápsulas de alginato de sodio con goma arábiga y goma guar como copolímero

Caracterización de cápsulas que contienen esporas

Las microcápsulas producidas se observaron rutinariamente bajo el microscopio de luz. Las microcápsulas de diferente composición mostraron forma esférica u ovalada ligeramente irregular, variaron en tamaño y distribución de tamaños dependiendo de la velocidad de dirección utilizada para preparar la emulsión. Fig.33A-33C muestra un ejemplo de una cápsula utilizando diferentes técnicas de microscopía. Vista superior (33A), vista lateral (33B), vista SEM (33C).

La distribución del tamaño de las cápsulas se estudió utilizando el analizador de tamaño de partículas láser Mastersizer 2000. Según nuestra observación, la velocidad de agitación óptima para la formulación de microcápsulas de ~50-80 pm de diámetro es de aproximadamente 700 rpm.

Las preparaciones que contenían los copolímeros de mayor viscosidad (pectina, HPMC) tendían a formar distribuciones de tamaño de dos picos.

Viabilidad de esporas encapsuladas.

Después de producir esporas encapsuladas utilizando alginato, pectina y alginato con polímeros (HPMC, MC, pectina, goma arábiga, goma guar), la suspensión de las microcápsulas fue plateada en placas SDA. En todas las preparaciones las esporas permanecieron viables después de la encapsulación (FIG. 35).

Condiciones de secado en la estabilidad de almacenamiento de las esporas de hongos incapsulados.

El estudio de Horaczek y Viernstein, 2004 [5] comparó tres tecnologías de secado comúnmente utilizadas para la preservación y formulación de conidios aéreos deBeauveria brongniartiiyMetarhizium anisopliae de 14 a 20 días de antigüedad.Los conidios se dispersaron en una mezcla acuosa de leche desnatada y polivinilpirrolidona (PVP K90) y se sometieron a liofilización, secado por pulverización y lecho fluido. Las pruebas iniciales de estrés térmico revelaronqueM.Las anisopliaspueden tolerar la exposición a 50 °C durante 2 minutos sin pérdida de viabilidad. La liofilización fue la más destructiva paraM. anisopliaecon un nivel de viabilidad del 4% después del liofilizado. Tanto los métodos de secado por pulverización como los de lecho fluido resultaron en daños graves al material fúngico ya en un régimen de temperatura de entrada/salida de 60/40 ± 2 °C, reflejado por tasas de germinación bajas y prolongadas.

Los resultados de las pruebas de germinación de Horaczek y Viernstein, 2004 muestran que la liofilización con una matriz SM/PVP es un método de secado prometedor paraB. brongniartii, mientras que el proceso resultó en la pérdida completa de viabilidad paraM. anisopliae.Según los autores, se habían logrado altas tasas de germinación con el secado atmosférico de bandejas, un proceso por el cual organismos y portadores se secan lentamente al aire durante 16 h o más.

Las esporas microencapsuladas, que se secaron al aire y se almacenaron a temperatura ambiente durante 5 meses, fueron viables después de la rehidratación de las cápsulas. Dentro de una muestra rehidratada, una parte de las microcápsulas pareció aglomerarse (FIG. 36).

Resistencia mecánica de microcápsulas para rotura por pulverización.

Las propiedades mecánicas de las microcápsulas fueron probadas mediante la técnica de micromanipulación. Las microcápsulas secas se dispersaron en una portaobjetos de vidrio (FIG.37A) y se colocaron debajo de una sonda de vidrio que se fijó al transductor de fuerza (Modelo 402A, Aurora Scientific, Canadá). El transductor de fuerza fue impulsado por un motor, lo que permitió controlar la distancia y la velocidad. Se encontró que las cápsulas secadas al aire eran duras (escala de fuerza de transductores: 0,5 g, 1 g, 5 g; sensibilidad en consecuencia ~0,5 MN/V, ~0,9 MN/V, ~4,5 MN/V). Para la estimación de la parte mecánica de las cápsulas húmedas se utilizó cámara pequeña especial (FIG. 37B) y se realizaron pruebas de nicromanipulación en agua (FIG. 37C).

Debido a la naturaleza matricial del polímero reticulado que comprende las cápsulas, mostraron comportamiento elástico-plástico y no presentaron ruptura bajo compresión. La fuerza aplicada anidada para acheive el mismo desplazamiento dentro de las esporas secas y húmedas fue aproximadamente 10 veces menor para las cápsulas húmedas. Esta observación indica que hay una alta probabilidad de que las cápsulas húmedas sean interrumpidas por una fuerza shier en el proceso de pulverización.

La suspensión de las microcápsulas de alginato - HPMC, cuando se pulverizó sobre una portaobjetos de vidrio utilizando pulverizador de pequeño volumen (100 ml), mostró una ruptura de las cápsulas. Este estudio está actualmente en curso.

Capacidad de retención de agua de las microcápsulas rotas.

El nivel de humedad se estimó utilizando los balances de humedad Satorius MA37. Antes de las mediciones del nivel de humedad, las muestras se secaron al aire durante 48 h y luego se dejaron para acondicionamiento a humedad 58,7% y t = 26,2 °C durante 4 horas.

Tabla 6. Nivel de humedad de las muestras de microcápsulas que contienen esporas

El alginato actúa como una barrera física y un controlador de humedad; en comparación con HPMC y MC, la pectina es mejor en la retención de humedad.

Una función importante de la encapsulación del alginato son las propiedades de protección UV del alginato. Según Zohar-Pérezet al.,[6] la matriz de alginato seco transmitió un promedio de solo 7,2% de la radiación UV. La incorporación del relleno en la matriz redujo significativamente la transmisión UV: El alginato con caolín, bentonita y quitina transmitió un promedio de 0,15, 0,38 y 3,4% de la radiación, respectivamente [6]. La incorporación de rellenos en formulaciones de microcápsulas también podría ser utilizada.

También se espera preservar la viabilidad de las esporas encapsuladas después de un largo almacenamiento en forma seca y en suspensión de aceite.

Se apreciará que las realizaciones descritas anteriormente se dan solo a modo de ejemplo y que se pueden hacer varias modificaciones a las realizaciones descritas sin apartarse del alcance de la invención como se define en las reivindicaciones adjuntas. Por ejemplo, varios otros aditivos, como los agentes UV incluyendo, por ejemplo, Tio<2>, ZnO se pueden añadir a la composición, como puede apreciar el destinatario experto. Otras realizaciones alternativas pueden incluir diferentes materiales de recubrimiento, tales como, por ejemplo, lípidos, que se pueden utilizar para mejorar la eficacia. Comprenden iones adicionales, u optimizados cambiando cualquiera de las cantidades, porcentajes, proporciones, relaciones o parámetros definidos aquí, tales como variar las cantidades de aditivos o el tiempo de mezcla. Las realizaciones adicionales de la composición pueden ser apreciadas por el lector experto para ser desarrollado para su uso con otras esporas fúngicas patógenas de insectos, tales como,entre otras, Beauveriabassiana e Isaria fumosoroseus.

Referencias

1. C.P. Liu y S. D. Liu, 2009 años. Journal of Microencapsulation, v. 26:5, p. 377-384, DOI:

10,1080/02652040802365455

2. Rodrigues et al., 2017. Acta Scientiarum. Agronomía, Maringá, v. 39, n. 4, pág. 457-464

3. L. W. Chan, P.W.S. Heng y L.S.C. WAN, 1997. J. Microencapsulación, v. 14, n. 5, pág. 545-555

4. J. Xue, ZH. Zhang, 2009 años. J Appl Polymer Sci, v. 113, pág. 1619-1625

5. A. Horaczek, y H. Viernstein, 2004. Control biológico, v. 31 1), pág. 65-71

6. C. Zohar-Perez, L. Chemin, I. Chet, A. Nussinovitch, 2003. La estructura de la matriz de alginato celular seco que contiene rellenos proporciona protección adicional a los microorganismos contra la radiación UVC. Radiat RES V. 160(2), págs. 198 a 204.

Depósitos biológicos

La solicitud se refiere a las siguientes indicaciones de materiales biológicos depositados:

y

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una preparación que comprende un insecto-patógenoMetarhiziumvar. Cepa fúngica anisopliae, en la que dijoMetarhiziumvar. La cepa fúngica anisopliae es una cepa fúngica BNL 102 con el número ICI CC 506834, en donde dicha preparación tiene una actividad insecticida contra el trips floral occidental que es de 2 a 3 veces mayor que la preparación sin la cepa fúngica BNL 102.

2. Una preparación que comprende esporas de hongos de unMetarhiziumvar. Cepa fúngica anisopliae, en la que dijoMetarhiziumvar. La cepa fúngica anisopliae es BNL 102 con ICI CC número 506834, en donde dicha preparación tiene una actividad insecticida contra el trips floral occidental que es de 2 a 3 veces mayor que la preparación sin esporas obtenida de la cepa fúngica BNL 102.

3. Preparación que comprende blastosporas de una cepa fúngica BNL 102 con número ICI CC 506834.

4. Una composición que comprende:

la preparación de la reivindicación 1 o la reivindicación 2; y

un portador agronómicamente aceptable que comprende: bioplástico; ácido poliacrílico; sílice; óxido de cinc; dióxido de titanio; selenosulfato de sodio; plata; hidrogel; carboximetilcelulosa; metoxilpectina; iones metálicos; quitosano; humectante; acetato de celulosa; goma xantham; goma arábiga; alginato de sodio; quitosano; pectina cítrica; arabinogalactano; alfa-ciclodextrina; maltodextrosa; celulosa o una combinación de estos.

5. Un polvo o líquido que comprende la composición de la reivindicación 4.

6. La composición de la reivindicación 4, caracterizada porque el hidrogel comprende alginato de sodio.

7. La composición de la reivindicación 4 o la reivindicación 6, caracterizada porque los iones metálicos comprenden iones de cobre, iones de hierro o una combinación de los mismos.

8. La composición de la reivindicación 4, la reivindicación 6 o la reivindicación 7, caracterizada porque el humectante comprende glicerol.

9. Un preparado microencapsulado que comprende la preparación de la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

10. La preparación microencapsulada de la reivindicación 9 comprende partículas de esporas fúngicas que tienen un tamaño de entre aproximadamente 1 a aproximadamente 100 nanómetros (nm).

11. Un método para controlar una población de insectos que comprende: Proporcionar una composición que comprende la preparación de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 a la población de insectos, y controlar la población de insectos, caracterizado porque la composición tiene una actividad insecticida que es de 2 a 3 veces mayor que una composición sin la preparación de la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

12. El método de la reivindicación 11, en donde la composición comprende un portador agronómicamente aceptable que comprende un bioplástico; ácido poliacrílico; sílice; óxido de zinc; dióxido de titanio; selenosulfato de sodio; plata; hidrogel; carboximetilcelulosa; metoxilpectina; iones metálicos; quitosano; humectante; acetato de celulosa; goma xantham; goma arábiga; alginato de sodio; quitosano; pectina cítrica; arabinogalactano; alfa-ciclodextrina; maltodextrosa; celulosa o una combinación de estos.

13. El método de la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en donde la población de insectos comprende: Thrip floral occidental, gorgojos, pulgones, mosca blanca, ácaros araña, orugas, chafers, garrapatas, mosquitos, mosquitos o una combinación de ellos.

14. El método de la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en donde la población de insectos comprende: Thrip floral occidental (Frankliniella occidentalis); Ácaros araña (Tetranychus urticae); mosca blanca (Aleyrodidae spp); áfidos (Myzus persicae); mosquitos (Aedes aegypti; Anopheles stephensi; Culex quinquefasciatus); garrapatas (Ixodes spp); gusanos del ejército (Spodoptera littura); escarabajo europeo de mayo (Melolontha melolontha); escarabajo de junio (Hoplia philanthus); chalecos de cuero (Tipula paludosa); gusano de alambre (Agriotes spp); midge mordedor (Culicoides spp); gorgoide (Otiorhynchus sulvid (Otiorhynchus), o combinación de écida); Hylobius).