ES3026760T3 - Highly potent antibodies binding to death receptor 4 and death receptor 5 - Google Patents

Abstract

La presente invención está dirigida a anticuerpos monoclonales que se unen al receptor de muerte 4 y/o al receptor de muerte 5, a una composición farmacéutica que los comprende y a métodos de tratamiento que comprenden la administración de dicha composición farmacéutica a un paciente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos altamente potentes que se unen al receptor de muerte 4 y al receptor de muerte 5

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere en general a la combinación de tecnologías de anticuerpos monoclonales (mAb) y ADN recombinante para desarrollar nuevos productos biológicos, y más particularmente, por ejemplo, a la producción de anticuerpos monoclonales que se unen y activan los receptores de muerte 4 y 5.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TRAIL, también conocido como ligando Apo2 y también designado como Apo2L o Apo2L/TRAIL) es un miembro de la superfamilia de ligandos TNF (revisado en 1Am van Roosmalen et al., Biochem Pharmacol 91:447-456, 2014). TRAIL se expresa en numerosas células del sistema inmunitario de forma dependiente del estímulo y modula la respuesta inmunitaria, por ejemplo, como molécula efectora clave en la citotoxicidad mediada por células NK (C Falschlehner et al., Immunol 127:145-154, 2009). TRAIL activa la vía apoptótica extrínseca al unirse a los receptores de membrana celular, el receptor de muerte 4 (DR4, también llamado TRAIL-R1) y/o el receptor de muerte 5 (DR5, también llamado TRAIL-R2 o Apo2), induciendo así la muerte de células susceptibles. Más específicamente, la forma activa y soluble de TRAIL es un homotrímero no covalente autoensamblable que se une al dominio extracelular de tres moléculas receptoras con alta afinidad. Esto induce la oligomerización de los dominios de muerte intracelulares y la formación de complejos homoméricos o heteroméricos (FC Kischkel et al., Immunity 12:611-620, 2000), seguido del reclutamiento de la proteína asociada a Fas con dominio de muerte (FADD) y la formación del complejo de señalización inductor de muerte (DISC), lo que conduce a la activación de caspasas y luego a la apoptosis, muerte celular programada (véase van Roosmalen et al., op. cit.).

Muchas células cancerosas expresan DR4 y/o DR5, y TRAIL puede inducir selectivamente la apoptosis de las células cancerosas (revisado en J Lemke et al., Cell Death Differ 21: 1350-1364, 2014) y en forma reticulada de células endoteliales tumorales (NS Wilson et al., Cancer Cell 22:80-90, 2012). TRAIL en sí mismo y diversos agonistas del receptor de TRAIL han demostrado una fuerte actividad antitumoral contra líneas celulares cancerosas y en modelos preclínicos (p. ej., A Ashkenazi et al., J Clin Invest 104:155-162, 1999). Estos incluyen TRAIL humano recombinante (rhTRAIL; dulanermina) que consiste en la región extracelular de TRAIL humano (R Pitti et al., J. Biol Chem 271: 12687 12690, 1996), y una serie de anticuerpos monoclonales agonistas (mAbs) contra DR4 o DR5, incluyendo mAbs murinos, quiméricos, humanizados y humanos (ver van Roosmalen et al., op. cit.). Dichos mAbs incluyen el mAb 4H6.17.8 (designado en este documento 4H6; Patente de EE. UU. N.° 7.252.994) y mapatumumab (HGS-eTr 1; Pukac et al., Br J Cancer 92:1430-1441, 2005) contra DR4; y el mAb 3H3.14.5 (denominado en este documento 3H3; patente de EE. UU. n.° 6.252.050), conatumumab (AMG 655; P Kaplan-Lefko et al., Cancer Biol Ther 9:618-631, 2010), drozitumab (Apomab; C Adams et al., Cell Death Differ 15:751-761, 2008), lexatumumab (HGS-ETR2; G Georgakis et al., Br J Haematol 130:501-510, 2005) y TRA-8 y su forma humanizada tigatuzumab (c S-1008, A Yada et al., Ann Oneal 19:1060-1067, 2008) contra DR5; así como otros mAb enumerados en van Roosmalen, op. cit. (véase la Tabla 1 en la pág. 450). El documento WO 03/066661 analiza los anticuerpos humanos DR4, y el documento US 2004/120947 analiza los anticuerpos DR4.

Sin embargo, aunque todos estos agentes son muy eficaces para matar células tumorales in vitro y, en general, en modelos animales (véanse las referencias citadas anteriormente), ninguno de ellos ha demostrado una fuerte actividad en ensayos clínicos, ya sea utilizado solo o en combinación con otros agentes, y ninguno ha avanzado a la Fase III (revisado en PM Holland, Cytokine Growth Factor Rev 25:185-193, 2014, y en Lemke et al., op cit. Véase especialmente la Tabla 1 en Holland y las Tablas 2 y 3 en Lemke et al., y las referencias citadas en el mismo). Para los mAb, una razón puede ser el requisito de reticulación de los mAb para oligomerizar los receptores de muerte para desencadenar la vía de la apoptosis. Tal requisito podría satisfacerse in vivo mediante la unión del dominio Fe de los mAb a los receptores gamma Fe (FcYR) en las células inmunitarias, pero puede haber muy pocas células inmunitarias infiltrándose en los tumores o dicha unión puede no ser de suficiente afinidad. Las células cancerosas también pueden expresar inhibidores de proteínas de apoptosis (véase Lemke et al., op. cit.). Para mejorar la eficacia, se están desarrollando formas modificadas de TRAIL, que incluyen fusiones con otros dominios proteicos para mejorar la estabilidad, la oligomerización y/o la focalización (Lemke et al., op. cit. y Holland, op. cit.). De manera similar, se han desarrollado constructos que comprenden múltiples dominios de unión de anticuerpos a Dr 4 y/o DR5 (K Miller et al., J Immunol 170:4854-4861, 2003; W Wang et al., Immunol Cell Biol 91:360-367, 2013; JE Allen et al., Mal Cancer Ther 11:2087-95, 2012; H Huet et al., Cancer Res 72 resumen 3853, 2012; WO 2014/022592; WO 2015/017822) pero no han ingresado o no han tenido éxito en los ensayos clínicos (KP Papadopoulos et al., Cancer Chemother Pharmacol; 27 de febrero de 2015, PMID: 25721064); su estructura muy poco natural puede limitar su utilidad clínica. En otro enfoque, la administración conjunta o combinada de TRAIL y el mAb anti-DR5 AMG 655 resultó más eficaz que cualquiera de los dos agentes por separado, tanto in vitro como in vivo (J. D. Graves et al., Cancer Cell 26:177-189, 2014).

RESUMEN DE LA INVENCIÓN REIVINDICADA

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1. En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica según la reivindicación 9. Se describen otras características de la invención en las reivindicaciones dependientes. La invención proporciona anticuerpos monoclonales (mAb) que se unen a DR4, como la forma humanizada de D114. En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal biespecífico que comprende dos pares de cadena pesada y cadena ligera, donde cada par de cadena pesada/ligera comprende un dominio que se une a DR4 y un dominio que se une a DR5. En otras formas de realización, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal multimérico con cuatro dominios de unión para DR4. En formas de realización preferidas, el anticuerpo tiene la forma de un anticuerpo Bs(scFv)<4>-lgG, como se define este término más adelante. En cualquiera de los mAb biespecíficos o multiméricos, cada dominio de unión proviene preferiblemente de un mAb humanizado o humano, y comprende la forma humanizada de D114. Además, el mAb de la invención contiene una región constante que comprende mutaciones que potencian la unión a un receptor gamma de Fe celular (FcyR), es decir, FcyRllb, es decir, las mutaciones S267E y L328F en una región constante gamma-1 (según la numeración de Kabat con índice EU). Ventajosamente, el mAb inhibe el crecimiento de un xenoinjerto tumoral humano en un ratón. En otro aspecto, se proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de estos mAb. En un tercer aspecto, dicha composición farmacéutica se utiliza como medicamento, administrándose a un paciente para tratar el cáncer u otra enfermedad. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figuras 1A, B. Diagramas esquemáticos del formato del anticuerpo Bs(scFv)<4>-lgG que muestran las regiones variables y constantes individuales (A) o los dominios formados mediante el plegamiento de cada región de cadena ligera con su respectiva región de cadena pesada (B). V<h>1 (V<l>1, respectivamente) = región variable de cadena pesada (o ligera) del primer anticuerpo; y de forma similar para V<h>2 y V<l>2 del segundo anticuerpo. C<h>1, C<h>2, C<h>3 (C<l>, respectivamente) = regiones constantes de cadena pesada (o ligera); H = región bisagra. V1 (V2, respectivamente) = dominio variable completo del primer (o segundo) anticuerpo.

Figuras 2A-D. (A) Gráfico que muestra la unión de los mAb 4H6 y D114 a DR4. (B) Gráfico que muestra la inhibición de la unión de Apo2L a DR4 por los mAb 4H6 y D114. (C) Gráfico que muestra la unión de los mAb 3H3 y G4.2 a DR5. (D) Gráfico que muestra la inhibición de la unión de Apo2L a DR5 por los mAb 3H3 y G4.2. mlgG es un mAb de control negativo de ratón.

Figuras 3A-D. Viabilidad celular de células tumorales de pulmón H60 (A) y células tumorales de colon SW480 (B) tras el tratamiento con mAb 4H6 y D114 en presencia de anticuerpo de cabra anti-lgG-Fc de ratón (anti-mlgG-Fc); viabilidad celular de células tumorales de pulmón H60 (C) y células tumorales de colon COLO 205 (D) tras el tratamiento con mAb 3H3 y G4.2 en presencia de anticuerpo anti-mlgG-Fc.

Figuras 4A-D. Secuencias de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesada (A) y ligera (B) maduras del mAb 4H6, y de las regiones variables de las cadenas pesada (C) y ligera (D) maduras del mAb 3H3, utilizando el código de una letra (SEQ ID NOS:1-4 respectivamente).

Figuras 5A-D. Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables maduras de la cadena ligera HuD114-L1 (A) y las cadenas pesadas HuD114-H1 y HuD114-H2 (B) se muestran alineadas con las regiones aceptoras V de ratón y humano; y las secuencias de aminoácidos de las regiones variables maduras de las cadenas ligeras HuG4.2-L1 y HuG4.2-L2 (C) y las cadenas pesadas HuG4.2-H1 y HuG4.2-H2 (D) se muestran alineadas con las regiones aceptoras V de ratón y humano. Las secuencias se designan (A) SEQ ID NOS. 5-7, (B) SEQ ID NOS.

8-11, (C) SeQ ID NOS. 12-15, y (D) SEQ ID NOS. 16-19. Las CDR están subrayadas en las secuencias D114 (G4.2, respectivamente). Las CDR-L<1>, -L2, -L3, -H1, -H2 y -H3 de D114 se designan como SEQ ID NOS. 20-25, respectivamente, y las de G4.2 se designan como SEQ ID NOS. 26-31. Los aminoácidos sustituidos con aminoácidos de D114 de ratón (G4.2, respectivamente) están doblemente subrayados en las secuencias de HuD114 (HuG4.2, respectivamente). El código de aminoácidos de una letra y el sistema de numeración de Kabat se utilizan tanto para la cadena ligera como para la pesada en todas las Figuras.

Figuras 6A, B. Secuencias de aminoácidos (código de 1 letra) de las cadenas pesada (A) y ligera (B) completas del anticuerpo biespecífico B-3H3/4H6-hFc** (SEQ ID NOS. 32 y 33), incluidos los péptidos señal que se escinden y, por lo tanto, no están presentes en las proteínas maduras, proteínas maduras que se designan como SEQ ID NOS: 34 y 35. Las flechas bajo las secuencias separan en orden el péptido señal (tachado), la región V<h>de 4H6 (A) o la región V<h>de 3H3 (B), respectivamente, la secuencia enlazadora (subrayada), la región V<l>de 4H6 (A) o la región V<l>de 3H3 (B), respectivamente, y la región constante de la cadena pesada (A) o la cadena ligera (B). Los aminoácidos mutados 267E y 328F están doblemente subrayados.

Figuras 7A, B. Viabilidad celular de células tumorales de colon SW480 después del tratamiento con los agentes indicados en ausencia (A) y presencia (B) de anti-hlgG-Fc de cabra, medida mediante un ensayo WST-8. hlgG es un mAb humano de control en las Figuras aquí incluidas.

Figuras 8A, B. Viabilidad celular de células tumorales de pulmón H460 después del tratamiento con los agentes indicados sin anti-hlgG-Fc de cabra (A) y en presencia de PBMC humanas (B).

Figuras 9A, B. (A) Viabilidad celular de células tumorales de colon COLO 205 tras la incubación con 0,5 pg/mL de los agentes indicados con PBMC de 4 donantes humanos. (B) Viabilidad celular de las células indicadas tras la incubación con 1,0 pg/mL de los agentes indicados con PBMC. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM) en las Figuras.

Figuras 10A, B. (A) Viabilidad celular de las células COLO 205 tras el tratamiento con los agentes indicados en presencia de PBMC (líneas cortas: 4H6-hFc; líneas largas: 4H6-hFc*). (B) Inhibición del crecimiento de xenoinjertos de tumor de colon COLO 205 por los agentes indicados.

Figuras 11A-C. Inhibición del crecimiento de los xenoinjertos de tumor de colon COLO 205 (A, C) y SW480 (B) por los agentes indicados.

Figuras 12A, B. Inhibición del crecimiento de xenoinjertos de tumor de colon COLO 205 (A) y xenoinjertos de tumor de páncreas MIA PaCa-2 (B) por los agentes indicados.

Figuras 13<a>, B. Gráficos que muestran la unión de los mAb anti-DR4 indicados a DR4 (A) y de los mAb anti-DR5 a DR5 (B). En todas las leyendas de las Figuras, los sufijos -Fe y -Fe** significan lo mismo que -hFc y -hFc**, respectivamente (p. ej., HuD114-Fc #1 significa lo mismo que HuD114-hFc #1, etc.). En esta Figura y en las siguientes, como se indica en las leyendas, generalmente las líneas continuas indican la forma hFc** de los mAb, las líneas discontinuas indican la forma hFc o hFc*, y las líneas punteadas indican los mAb de ratón.

Figuras 14A, B. Viabilidad celular de células tumorales de colon COLO 205 tras el tratamiento con mAb anti-DR4 (A) y anti-DR5 (B) en presencia de anti-hlgG-Fc de cabra. Se utilizan diferentes unidades de concentración en (A) y (B).

Figuras 15A-D. Viabilidad celular de células tumorales de colon COLO 205 (A), células tumorales de colon SW480 (B) , células COLO 205 (C) y células tumorales pancreáticas MIA PaCa-2 (D) tras el tratamiento con los mAb indicados, en presencia de anti-mlgG-Fc en el caso del mAb TRA-8 de ratón o anti-hlgG-Fc de cabra en el caso de los mAb humanizados o humanos.

Figuras 16A-B. Viabilidad celular de células tumorales de pulmón H60 (A) y células tumorales de colon SW480 (B) después del tratamiento con los agentes indicados en presencia de anti-hlgG-Fc de cabra.

Figuras 17A-F. Viabilidad celular de células tumorales de colon COLO 205 (A, C y E) y células tumorales de pulmón H60 (B, D y F) después del tratamiento con los agentes indicados en presencia de PBMC humanas. Figuras 18A-D. Inhibición del crecimiento de xenoinjertos de tumor de colon COLO 205 (A), xenoinjertos de tumor de pulmón H60 (B), xenoinjertos COLO 205 (C) y xenoinjertos de linfoma de Ramos (D) por los agentes indicados. Figuras 19A, B. Inhibición del crecimiento de xenoinjertos de tumor de colon COLO 205 (A) y xenoinjertos de tumor de páncreas MIA PaCa-2 (B) por los agentes indicados.

Figuras 20A-D. (A, C) Resultados del ensayo ELISA que mide la unión simultánea de cada agente indicado a DR4 y DR5. En (A), las curvas de 4H6-hFc** y 3H3-hFc** se superponen y no se pueden distinguir. (B, D) Viabilidad celular de células COLO 205 tras el tratamiento con los agentes indicados en ausencia de anti-mlgG-Fc de cabra.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

1. Anticuerpos

Tal como se utiliza en este documento, "anticuerpo" se refiere a una proteína que contiene uno o más dominios capaces de unirse a un antígeno, donde dicho(s) dominio(s) deriva(n) del dominio variable de un anticuerpo natural o es (son) homólogo(s) al mismo. Un anticuerpo monoclonal ("mAb") es simplemente una especie única de anticuerpo, a diferencia de una mezcla de diferentes anticuerpos. Los anticuerpos descritos en el presente documento son generalmente monoclonales, a menos que el contexto indique lo contrario. Un "antígeno" de un anticuerpo se refiere a un compuesto al que el anticuerpo se une específicamente y es típicamente un polipéptido, pero también puede ser un péptido pequeño, un hapteno de molécula pequeña, un carbohidrato u otra fracción. Ejemplos de anticuerpos incluyen anticuerpos tetraméricos naturales de longitud completa; fragmentos de anticuerpos como Fv, Fab, Fab' y (Fab')<2>; anticuerpos monocatenarios (scFv) (Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879, 1988; Bird et al., Science 242:423, 1988); anticuerpos de un solo brazo (Nguyen et al., Cancer Gene Ther 10:840, 2003); y anticuerpos biespecíficos, quiméricos y humanizados, cuyos términos se explican con más detalle más adelante. Los anticuerpos pueden derivar de cualquier especie de vertebrado, incluyendo pollos, roedores (p. ej., ratones, ratas y hámsteres), conejos, camellos, primates y humanos. Un anticuerpo con un dominio constante puede ser de cualquiera de los isotipos conocidos IgG, IgA, IgM, IgD e IgE y sus subtipos, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanos, e IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 murinos, y sus alotipos e isoalotipos, incluyendo permutaciones de residuos que ocupan posiciones polimórficas en alotipos e isoalotipos. Un anticuerpo también puede ser de isotipo quimérico, es decir, una o más de sus regiones constantes (C) pueden contener regiones de diferentes isotipos, por ejemplo, una región gamma-1 C<h>1 junto con los dominios bisagra, C<h>2 o C<h>3 de los genes gamma-2, gamma-3 o gamma-4. El anticuerpo también puede contener reemplazos en las regiones constantes para reducir o aumentar la función efectora, como la citotoxicidad mediada por complemento o ADCC (ver, por ejemplo, Winter et al., patente de EE. UU. N.° 5.624.821; Tso et al., patente de EE. UU. N.° 5.834.597; y Lazar et al., Proc Natl Acad Sci USA 103:4005, 2006), o para prolongar la vida media en humanos (ver, por ejemplo, Hinton et al., J Biol Chem 279:6213, 2004).

Una molécula de anticuerpo natural es generalmente un tetrámero que consta de dos heterodímeros idénticos, cada uno de los cuales comprende una cadena ligera emparejada con una cadena pesada. Cada cadena ligera y pesada consta de una región variable (V<l>para la cadena ligera, V<h>para la cadena pesada o V para ambas) seguida de una región constante (C<l>, C<h>o C). La región C<h>comprende las regiones C<h>1, bisagra (H), C<h>2 y C<h>3. En el espacio tridimensional (3D), las regiones V<l>y V<h>se pliegan para formar un dominio V, también conocido como dominio de unión, ya que se une al antígeno. La región C<l>se pliega junto con la región C<h>1, de modo que la cadena ligera V<l>-C<l>y la región V<h>-C<h>1 de la cadena pesada forman juntas una parte del anticuerpo conocido como Fab: un anticuerpo con forma de Y natural contiene dos Fab, uno de cada heterodímero, que forman los brazos de la Y. La región C<h>2 de un heterodímero se posiciona opuesta a la región C<h>2 del otro heterodímero, y las respectivas regiones C<h>3 se pliegan entre sí, formando juntas el dominio Fe único del anticuerpo (la base de la Y), que interactúa con otros componentes del sistema inmunitario.

Dentro de cada región variable de cadena ligera o pesada, existen tres segmentos cortos (con una longitud promedio de unos 10 aminoácidos) denominados regiones determinantes de complementariedad ("CDR"). Las seis CDR de un dominio variable de anticuerpo (tres de la cadena ligera y tres de la cadena pesada) se pliegan en un espacio tridimensional para formar el sitio de unión del anticuerpo, que se une al antígeno diana. La posición y la longitud de las CDR han sido definidas con precisión por E. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU., 1983, 1987, 1991. La parte de una región variable que no está contenida en las CDR se denomina marco estructural, que constituye el entorno para las CDR. Chothia et al., J. Mal. Biol. 196:901, 1987, han definido el concepto relacionado de regiones hipervariables o bucles determinados por la estructura.

En el presente documento, un mAb "genéticamente modificado" es aquel cuyos genes se han construido o colocado en un entorno artificial (p. ej., genes humanos en un ratón o en un bacteriófago) mediante técnicas de ADN recombinante. Por lo tanto, incluye anticuerpos quiméricos y humanizados, como se describe a continuación, pero no abarcaría un mAb de ratón u otro roedor elaborado con tecnología de hibridoma convencional. Un anticuerpo quimérico (o cadena ligera o pesada de anticuerpo quimérico) es un anticuerpo (o cadena ligera o pesada de anticuerpo) en el que la región variable de un anticuerpo de ratón (o de otra especie no humana) (o cadena ligera o pesada de anticuerpo) se combina con la región constante de un anticuerpo humano; su construcción mediante ingeniería genética es bien conocida. Dichos anticuerpos conservan la especificidad de unión del anticuerpo de ratón, a la vez que son aproximadamente dos tercios humanos.

Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo diseñado genéticamente en el que las CDR de un anticuerpo "donante" no humano (por ejemplo, pollo, ratón, rata, conejo o hámster) se injertan en secuencias de anticuerpos "aceptores" humanos, de modo que el anticuerpo humanizado conserva la especificidad de unión del anticuerpo donante (véanse, p. ej., Queen, patentes de EE. UU. n.° 5.530.101 y 5.585.089; Winter, patente de EE. UU. n.° 5.225.539; Carter, patente de EE. UU. n.° 6.407.213; Adair, patentes de EE. UU. n.° 5.859.205 y 6.881.557; Foote, patente de EE. UU. n.° 6.881.557). Las secuencias de anticuerpos aceptores pueden ser, por ejemplo, una secuencia de anticuerpo humano maduro, una secuencia consenso de secuencias de anticuerpos humanos, una secuencia de anticuerpo humano de línea germinal o una combinación de dos o más de estas secuencias. Por lo tanto, un anticuerpo humanizado es un anticuerpo que tiene algunas o todas las CDR, total o sustancialmente, de un anticuerpo donante y secuencias marco de la región variable y regiones constantes, si están presentes, total o sustancialmente de secuencias de anticuerpos humanos. De manera similar, una cadena ligera humanizada (respectivamente cadena pesada) tiene al menos una, dos y usualmente las tres CDR, total o sustancialmente de una cadena ligera (o pesada) de un anticuerpo donante, y una región marco de la región variable de la cadena ligera (o pesada) y una región constante de la cadena ligera (o pesada), si está presente, sustancialmente de una cadena aceptora ligera (o pesada) humana. Un anticuerpo humanizado generalmente comprende una cadena pesada humanizada y una cadena ligera humanizada. Una CDR en un anticuerpo humanizado es sustancialmente de una CDR correspondiente en un anticuerpo no humano cuando al menos el 85%, 90%, 95% o 100% de los aminoácidos correspondientes (según la definición de Kabat) son idénticos entre las respectivas CDR. El marco de la región variable o la región constante de una cadena de anticuerpos son sustancialmente de una región variable humana o de una región constante humana respectivamente cuando al menos el 85, 90, 95 o 100 % de los aminoácidos correspondientes (según lo definido por Kabat) son idénticos.

En este documento, como en otras secciones de esta solicitud, el porcentaje de identidad de secuencia se determina con secuencias de anticuerpos alineadas al máximo según la convención de numeración de Kabat (índice Eu para la región C<h>). Tras la alineación, si se compara una región de un anticuerpo sujeto (p. ej., la región variable madura completa de una cadena pesada o ligera) con la misma región de un anticuerpo de referencia, el porcentaje de identidad de secuencia entre las regiones de anticuerpo sujeto y de referencia se obtiene dividiendo el número de posiciones ocupadas por el mismo aminoácido en ambas regiones, sin contar los espacios, y multiplicado por 100 para obtener el porcentaje.

Para mantener una alta afinidad de unión en un anticuerpo humanizado, se puede emplear al menos uno de dos elementos estructurales adicionales. Véanse las patentes estadounidenses n.° 5.530.101 y n.° 5.585.089, que proporcionan instrucciones detalladas para la construcción de anticuerpos humanizados. En el primer elemento estructural, el marco de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo aceptor o humanizado se selecciona para que tenga una alta identidad de secuencia (entre el 65 % y el 95 %) con el marco de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo donante, seleccionando adecuadamente la cadena pesada del anticuerpo aceptor entre los numerosos anticuerpos humanos conocidos. En el segundo elemento estructural, al construir el anticuerpo humanizado, se reemplazan los aminoácidos seleccionados en el marco del anticuerpo aceptor humano (fuera de las CDR) con los aminoácidos correspondientes del anticuerpo donante, de acuerdo con las reglas especificadas. Específicamente, los aminoácidos que se reemplazarán en el marco se seleccionan en función de su capacidad para interactuar con las CDR. Por ejemplo, los aminoácidos reemplazados pueden estar adyacentes a un CDR en la secuencia del anticuerpo donante o dentro de 4-6 angstroms de un CDR en el anticuerpo humanizado, medido en el espacio tridimensizonal.

También se pueden utilizar otros enfoques para diseñar anticuerpos humanizados con el fin de lograr el mismo resultado que los métodos descritos en las patentes estadounidenses n.° 5.530.101 y 5.585.089, por ejemplo, la «superhumanización» (véase Tan et al., J. Immunol. 169: 1119, 2002, y la patente estadounidense n.° 6.881.557) o el método de Studnicak et al., Protein Eng. 7:805, 1994. Además, otros enfoques para producir mAb de inmunogenicidad reducida modificados genéticamente incluyen la «remodelación», la «hiperquimerización» y el recubrimiento/resurfacing, como se describe, por ejemplo, en Vaswami et al., Annals of Allergy, Asthma and Immunology 81:105, 1998; Roguska et al., Protein Eng. 9:895, 1996; y las patentes estadounidenses n.° 6.072.035 y 5.639.641. Los anticuerpos enchapados se asemejan más a los humanos mediante la sustitución de aminoácidos específicos en las estructuras de la región variable del anticuerpo donante no humano que pueden contribuir a los epítopos de células B o T, por ejemplo, residuos expuestos (Padlan, Mal. Immunol. 28:489, 1991). Otros tipos de anticuerpos modificados genéticamente incluyen anticuerpos humanos elaborados mediante métodos de visualización de fagos (Dower et al., WO91/17271; McCafferty et al., WO92/001047; Winter, WO92/20791; y Winter, FEBS Lett. 23:92, 1998) o mediante el uso de animales transgénicos (Lonberg et al., WO93/12227; Kucherlapati, WO91/10741).

Los términos “anticuerpo” o “mAb” también abarcan los anticuerpos biespecíficos. Un "anticuerpo biespecífico" es un anticuerpo que contiene un primer dominio que se une a un primer antígeno y un segundo dominio (diferente) que se une a un segundo antígeno, donde el primer y el segundo dominio derivan de, o son homólogos a, dominios variables de anticuerpos naturales. El primer y el segundo antígeno pueden ser el mismo antígeno, en cuyo caso el primer y el segundo dominio pueden unirse a diferentes epítopos del antígeno. El término anticuerpo biespecífico abarca los anticuerpos multiespecíficos que, además del primer y el segundo dominio, contienen uno o más dominios que se unen a otros antígenos y derivan de, o son homólogos a, dominios variables de anticuerpos naturales. El término anticuerpo biespecífico también abarca un anticuerpo que contiene un primer dominio de unión derivado de, u homólogo a, un dominio variable de un anticuerpo natural, y un segundo dominio de unión derivado de otro tipo de proteína, por ejemplo, el dominio extracelular de un receptor (un "anticuerpo biespecífico-inmunoadhesina"). El término anticuerpo biespecífico engloba además un anticuerpo "dos en uno" con un dominio de unión de especificidad dual (G Schaefer et al., Cancer Cell 20:472-486, 2011).

Los anticuerpos biespecíficos se han producido en una variedad de formas (véase, por ejemplo, Kontermann, MAbs 4:182-197, 2012 y referencias citadas allí), por ejemplo, fragmento variable de cadena única (scFv), proteínas de fusión Fab-scFv y scFv-scFv (Coloma et al., Nat Biotechnol 15:125-126, 1997; Lu et al., J Immunol Methods 267:213-226, 2002; Mallender, J Biol Chem 269:199-206, 1994), Bs(scFv)<4>-lgG (ZZuo et al., Protein Eng 13: 361-367, 2000), anticuerpos de dominio variable doble (C Wu et al., Nat Biotechnol 25:1290- 1297, 2007) y diacuerpos (Holliger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90:6444-6448, 1993). Se han producido fragmentos de anticuerpos biespecíficos F(ab')<2>mediante acoplamiento químico (Brennan et al., Science 229:81, 1985) o mediante cremalleras de leucina (Kostelny et al., J Immunol 148:1547-1553, 1992). Se puede producir un anticuerpo biespecífico con una forma más natural, en el que cada par de cadena pesada-cadena ligera tenga una región V diferente, por ejemplo, entrecruzando químicamente los dos pares de cadena pesada-cadena ligera producidos por separado (Karpovsky et al., J Exp Med 160:1686-1701, 1984). Los anticuerpos biespecíficos con forma natural también se pueden producir expresando ambas cadenas pesadas y ligeras requeridas en una sola célula, fabricadas mediante la fusión de dos líneas celulares de hibridoma (un "cuadroma"; Milstein et al., Nature 305: 537-540) o mediante transfección. La asociación de las cadenas ligeras y pesadas correctas expresadas en una célula para formar el anticuerpo biespecífico deseado se puede promover mediante el uso de la tecnología de "perillas en agujeros" (Ridgway et al., Protein Eng 9:617-621, 1996; Atwell et al., J Mal Biol 270:26-35, 1997; y patente de EE. UU. n.° 7.695.936); opcionalmente con intercambio o "entrecruzamiento" de los dominios de cadena pesada y cadena ligera dentro del fragmento de unión al antígeno (Fab) de un par de cadena ligera-cadena pesada, creando así anticuerpos biespecíficos llamados "CrossMabs" (Schaefer et al., Proc Natl Acad Sci USA 108:11187-11192, 2011; WO 2009/080251; WO 2009/080252; WO 2009/080253).

Relacionados con el concepto de anticuerpos biespecíficos están los anticuerpos "multiméricos", que son mAb que contienen más de dos dominios de unión, cada uno de los cuales se une al mismo antígeno. Muchos formatos de mAb biespecíficos, por ejemplo, Bs(scFv)<4>-lgG y dominio variable doble, pueden adaptarse para generar mAb multiméricos utilizando el mismo dominio variable que cada dominio de unión. Por ejemplo, un anticuerpo multimérico Bs(scFv)<4>-lgG contendría cuatro copias del mismo dominio de unión.

Se dice que un anticuerpo se une "específicamente" a un antígeno si se une en un grado significativamente mayor que los anticuerpos irrelevantes que no se unen al antígeno y, por lo tanto, normalmente tiene una afinidad de unión (K<a>) de al menos aproximadamente 10<6>pero preferiblemente 10<7>, 10<8>, 10<9>o 10<10>M<' 1>para el antígeno. Generalmente, cuando se dice que un anticuerpo se une a un antígeno, se refiere a una unión específica. Si se dice que un anticuerpo no se une a un antígeno, se refiere a que cualquier señal indicativa de unión no se puede distinguir, dentro del margen de error experimental, de la señal de los anticuerpos de control irrelevantes. El epítopo de un mAb es la región de su antígeno a la que se une. Se considera que dos anticuerpos se unen al mismo epítopo o a epítopos superpuestos si cada uno inhibe (bloquea) competitivamente la unión del otro al antígeno. Inhibir competitivamente la unión significa que un exceso de 1x o 5x de un anticuerpo inhibe la unión del otro en al menos un 50%, pero preferiblemente en un 75%, o que un exceso de 10x, 20x o 100x de un anticuerpo inhibe la unión del otro en al menos un 75%, pero preferiblemente en un 90%, o incluso en un 95% o 99%, medido en un ensayo de unión competitiva (véase, p. ej., Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990). Se dice que un mAb (el segundo mAb) compite "completamente" por la unión a un antígeno con otro mAb (el primero) si la concentración inhibitoria 50 (CI50) del segundo mAb para inhibir la unión (del primero) es comparable, es decir, dentro de un margen de 2 o 3 veces, a la CI50 del primer mAb para inhibir su propia unión, en ensayos de unión competitiva. Se dice que un segundo mAb compite "parcialmente" por la unión a un antígeno con un primer mAb si la CI50 del segundo mAb para inhibir la unión (del primer mAb) es sustancialmente mayor que, por ejemplo, 3, 5 o 10 veces mayor que la CI50 del primer mAb para inhibir la unión. En general, dos mAb tienen el mismo epítopo en un antígeno si cada uno compite completamente con el otro por la unión al antígeno, y tienen epítopos superpuestos si al menos un mAb compite parcialmente por la unión con el otro. Alternativamente, dos anticuerpos tienen el mismo epítopo si prácticamente todas las mutaciones de aminoácidos en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro, mientras que dos anticuerpos tienen epítopos superpuestos si algunas mutaciones de aminoácidos que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro.

2. Anticuerpos anti-DR4 y anti-DR5

Un anticuerpo monoclonal que se une a DR4 (es decir, un mAb anti-DR4) o un anticuerpo que se une a DR5 (es decir, un mAb anti-DR5) se considera agonista si la unión del mAb al receptor de membrana celular DR4 o DR5 transmite una señal apoptótica a al menos algunos tipos de células, induciendo así la apoptosis. Dicho anticuerpo puede ser bloqueante o no bloqueante, es decir, inhibir o no la unión de Apo2L/TRAIL a DR4 o DR5, respectivamente. Un mAb agonista de la invención, que puede ser un anticuerpo biespecífico que se une a DR4 y a un segundo antígeno, o a ambos, DR4 y DR5, en una concentración de, por ejemplo, 0,1, 1, 10, 100, 1000 o 10000 ng/ml, inhibe la viabilidad celular o induce la apoptosis en aproximadamente un 25 %, 50 %, 75 %, 90 %, 95 %, 99 % o más, medido, por ejemplo, mediante la inhibición del metabolismo celular, por ejemplo, mediante el ensayo WST-8. Dicha línea celular puede ser, por ejemplo, las líneas tumorales de colon COLO 205 o SW480, la línea de cáncer de pulmón H460 o la línea celular de cáncer de páncreas BxPC-3. Dicha actividad puede obtenerse utilizando el mAb solo o en presencia de células humanas, como células mononucleares de sangre periférica, o de un anticuerpo que entrecruza el mAb, por ejemplo, anti-IgG-Fc de cabra (p. ej., 10 |jg/mL). La actividad se mide típicamente tras la incubación del mAb, junto con las células y cualquier otro agente, durante una noche a 37 °C.

Los MAbs que se utilizarán en la presente invención son específicos para DR4, es decir, no se unen (específicamente), o solo se unen en un grado mucho menor (por ejemplo, menos de diez veces), a proteínas que están relacionadas con DR4 o DR5, como los receptores del factor de necrosis tumoral (TNF) TNFR1 y TNFR2 y otros miembros de la superfamilia TNFR, otros receptores de muerte como Apo-1 (Fas) y los receptores señuelo DcR1 y DcR2. Los MAb que se utilizarán en la invención suelen tener una afinidad de unión (K<a>) por DR4 de al menos 10<7>M“1, pero preferiblemente de 10<8>M“ i o superior, y más preferiblemente de 10<9>M“ \ 10<10>M“i o 10<11>M“ i o superior. Este mAb se une al DR4 humano, pero ventajosamente también al DR4 de otras especies, por ejemplo, ratones o primates no humanos como los monos cinomolgos, idealmente con una afinidad de unión similar (p. ej., hasta diez veces mayor) a la del DR4 humano. Las secuencias del DR4 y el DR5 humanos se proporcionan respectivamente, por ejemplo, en G Pan et al., Science. 276:111-113, 1997 (GenBank: AAC51226.1) y H Walczak et al., EMBO J 16:5386-5397, 1997 (GenBank: CAG46696.1).

Los anticuerpos ejemplares de la invención son las formas humanizadas de D114, como HuD114. Estos, así como otros mAb anti-DR4, como 4H6 (producido por el hibridoma ATCC HB-12455; véase la patente estadounidense n.° 7.252.994) y mAb anti-DR5, como 3H3 (producido por el hibridoma ATCC HB-12534; véase la patente estadounidense n.° 6.252.050), u otros anticuerpos que incluyan todas las CDR de 4H6 o 3H3, pueden utilizarse en los mAb biespecíficos y multiméricos de la invención, siendo los mAb agonistas quiméricos, humanizados o humanos los preferidos para dicho uso. Otras formas de realización de la invención incluyen un mAb anti-DR4 agonista (ya sea un anticuerpo IgG ordinario o un anticuerpo biespecífico o multimérico) que comprende mutaciones en la región constante que aumentan la unión a un receptor de Fe, como un receptor para anticuerpos IgG (FcyR), p. ej., el receptor FcyRllb, por ejemplo, los mAb HuD114-hFc** descritos más adelante. La mutación es doble, es decir, S267E/L328F, que proporciona mayor afinidad de unión a un FcyR que cualquiera de las mutaciones simples constituyentes (SY Chu et al., Mal Immunol 45:3926-3933, 2008), así como otras mutaciones en estas posiciones de aminoácidos, utilizando el sistema de numeración de Kabat, que define todas las posiciones de aminoácidos aquí descritas. De estas, se ha demostrado que la mutación única S267E aumenta la potencia de un mAb anti-DR5 in vitro e in vivo (F. Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci.<u>S<a>109:10966-10971,2012). Preferiblemente, el mAb de la invención inhibe el crecimiento de un xenoinjerto tumoral humano en un ratón, según se evalúa mediante cualquiera de los ensayos de los ejemplos o de otro modo conocido en la técnica.

Los mAb de la invención tienen CDR (por ejemplo, tres CDR en la cadena ligera y tres CDR en la cadena pesada), como se define por Kabat, que son idénticos a los CDR de D114 en la secuencia de aminoácidos y que mantienen sus propiedades funcionales, por ejemplo, un mAb D114 humanizado, o que difieren de D114 por un pequeño número de sustituciones de aminoácidos funcionalmente intrascendentes (por ejemplo, sustituciones conservadoras, como se define a continuación), deleciones o inserciones, con o sin las mutaciones descritas anteriormente.

Una vez que se ha aislado un único mAb anti-DR4 humano arquetípico (respectivamente anti-DRS humano), por ejemplo D114 (resp. G4.2), que tiene las propiedades deseadas descritas en este documento, es sencillo generar otros mAb con propiedades similares mediante métodos conocidos en la técnica, incluyendo mAb que compiten con D114 (G4.2) por la unión a DR4 (DRS) o que tienen el mismo epítopo. Por ejemplo, se pueden inmunizar ratones con el dominio extracelular de DR4 (DRS), producir hibridomas y analizar los mAb resultantes para determinar su capacidad de competir con D114 (G4.2) por la unión a DR4 (DRS). También se pueden inmunizar ratones con un fragmento más pequeño de DR4 (DRS) que contenga el epítopo al que se une D114 (G4.2). El epítopo puede localizarse, por ejemplo, mediante el cribado de la unión a una serie de péptidos superpuestos que abarcan DR4 (resp. DRS). Los mAb de ratón generados de estas maneras pueden humanizarse. Como alternativa, se puede utilizar el método de Jespers et al., Biotechnology 12:899, 1994, para guiar la selección de mAb que tengan el mismo epítopo y, por lo tanto, propiedades similares a D114 (resp. G4.2). Mediante la visualización de fagos, primero se empareja la cadena pesada de D114 (resp. G4.2) con un repertorio de cadenas ligeras (preferiblemente humanas) para seleccionar un mAb que se una a DR4 (resp. DRS), y luego la nueva cadena ligera se empareja con un repertorio de cadenas pesadas (preferiblemente humanas) para seleccionar un mAb que se una a DR4 (resp. DRS) (preferiblemente humano) que tenga el mismo epítopo que D114 (resp. G4.2). Alternativamente, se pueden obtener variantes de D114 (resp. G4.2) mediante mutagénesis del ADN que codifica las cadenas pesada y ligera de D114 (resp. G4.2).

Los mAb modificados genéticamente, por ejemplo, los mAb quiméricos, humanizados o biespecíficos, pueden expresarse mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los genes que codifican las regiones V de sus cadenas ligera y pesada pueden sintetizarse a partir de oligonucleótidos superpuestos e insertarse junto con las regiones C disponibles en vectores de expresión (por ejemplo, comercializados por Invitrogen) que proporcionan las regiones reguladoras necesarias, como promotores, potenciadores, sitios poli A, etc. Se prefiere el uso del promotorpotenciador de CMV. Los vectores de expresión pueden transfectarse posteriormente mediante diversos métodos conocidos, como la lipofección o la electroporación, en diversas líneas celulares de mamíferos, como CHO o mielomas no productores, incluyendo Sp2/0 y NS0, y en células que expresan los anticuerpos seleccionados mediante la selección de antibióticos adecuada. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.530.101. Se pueden producir mayores cantidades de anticuerpos cultivando las células en biorreactores comerciales. Por lo tanto, se describen líneas celulares que expresan cualquiera de los mAb descritos en este documento.

Una vez expresados, los mAb de la invención, incluidos los mAb biespecíficos, pueden purificarse de acuerdo con procedimientos estándar de la técnica, tales como microfiltración, ultrafiltración, cromatografía de afinidad de proteína A o G, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio catiónico y/u otras formas de cromatografía de afinidad basadas en colorantes orgánicos o similares. Se prefieren anticuerpos sustancialmente puros con una homogeneidad de al menos aproximadamente el 90 o 95 %, siendo la más preferida una homogeneidad del 98 o 99 % o superior, para usos farmacéuticos. También se entiende que, cuando el mAb se fabrica mediante procedimientos convencionales, uno o varios aminoácidos en el extremo amino o carboxilo terminal de la cadena ligera y/o pesada, como la lisina C-terminal de la cadena pesada, pueden faltar o estar derivatizados en una proporción o en la totalidad de las moléculas, y dicha composición se considera el mismo mAb.

3. Anticuerpos biespecíficos y multiméricos

En una forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal biespecífico que comprende al menos un dominio de unión que se une a DR4 y al menos un dominio de unión que se une a DR5. Dicho anticuerpo se denomina en el presente documento anticuerpo biespecífico DR4/DR5 o mAb. En formas de realización preferidas, cada dominio de unión proviene de un mAb humanizado o humano. En formas de realización preferidas, el anticuerpo biespecífico comprende dos o más dominios de unión a DR4 y dos o más dominios de unión a DR5; a menudo, los dos dominios de unión a DR4 y a DR5 son iguales. En cualquier caso, el mAb biespecífico es preferiblemente agonista, como se describió anteriormente, es decir, induce una señal apoptótica a través de DR4 y/o DR5 en células susceptibles, como las células cancerosas. Los mAb biespecíficos ejemplares comprenden el dominio de unión del mAb anti-DR4 4H6 o el mAb D114 descritos en este documento o sus formas humanizadas, y el dominio de unión del mAb anti-DR5 3H3 o el mAb G4.2 descritos en este documento o sus formas humanizadas.

El anticuerpo biespecífico de la invención puede presentarse en cualquier formato, como cualquiera de los enumerados en Kontermann, op. cit. En una forma de realización preferida, el anticuerpo biespecífico se presenta en el formato Bs(scFv)<4>-lgG descrito en Zuo et al., op. cit. e ilustrado en las Figuras 1A y 1B. En este formato, un dominio de unión en forma de cadena sencilla (scFv) se conecta a la región C<l>y, por lo tanto, se convierte en el dominio N-terminal de la cadena ligera, mientras que el otro dominio de unión en forma de scFv se conecta al dominio Ch1 y, por lo tanto, se convierte en el dominio N-terminal de la cadena pesada; dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas forman un homodímero, como en un anticuerpo lgG convencional, pero que contiene dos de cada dominio de unión. Por lo tanto, una ventaja del formato Bs(scFv)<4>-lgG es que es un homodímero, con la misma cadena pesada y ligera en cada monómero, por lo que no es necesario tomar precauciones para asegurar una heterodimerización correcta. El enlazador dentro de cada scFv que conecta las regiones V<l>y V<h>suele elegirse como (G<4>S)<3>GS o ASGS(G<4>S)<3>. Cada dominio de unión de scFv puede tener la forma V<L>-enlazador-V<H>o Vwenlazador-V<L>(como se muestra en la Figura 1A), y cualquiera de los dominios de unión puede formar parte de la cadena ligera mientras que el otro forma parte de la cadena pesada. Por lo tanto, en total, se pueden generar 2 x 2 x 2 = 8 variantes de un anticuerpo Bs(scFv)<4>-lgG a partir de dos dominios de unión determinados (p. ej., los de HuD114 y HuG4.2), que pueden tener propiedades diferentes.

En otra forma de realización de la invención, el anticuerpo biespecífico está en el formato de dominio variable doble descrito, por ejemplo, en Wu et al., op. cit., (véase la Figura 1A con el etiquetado allí incluido). Al igual que los mAb Bs(scFv)<4>-lgG, dicho mAb biespecífico es un homodímero, donde cada monómero contiene uno de cada uno de los dominios de unión, unidos en la secuencia V1-V2-dominio constante. Se pueden utilizar diversos enlaces peptídicos para conectar la primera y la segunda región variable, por ejemplo, ASTKGPSVFPLAP en la cadena pesada y RTVAAPSVIFIPP en la cadena ligera, o ASGS(G<4>S)<3>en ambas cadenas. Por ejemplo, en dicho mAb biespecífico, el dominio variable de HuG4.2 podría ser el primer dominio, el dominio variable de HuD114 podría ser el segundo dominio; Los enlazadores podrían ser los mencionados anteriormente, y la región constante podría ser del isotipo lgG1, kappa humano.

En otras formas de realización preferidas de la invención, un monómero del mAb anti-DR4 que comprende una cadena ligera y pesada se aparea con un monómero del mAb anti-DR5 que comprende una cadena ligera y pesada para formar un heterodímero con la configuración normal de una molécula de IgG. Si se deben expresar las cuatro cadenas en una célula, la formación de los anticuerpos biespecíficos heterodímeros deseados en lugar de homodímeros se promueve insertando protuberancias y agujeros en las regiones C<h>3 de las respectivas cadenas pesadas (Ridgway et al., Protein Eng 9:617-2l, 1996; Atwell et al., J Mal Biol 270:26-35, 1997; y patente estadounidense n.° 7.695.936), mientras que el emparejamiento correcto de las cadenas ligeras y pesadas para formar cada monómero anti-DR4 y anti-DR5 se promueve mediante el "entrecruzamiento" de los dominios de la cadena pesada y la cadena ligera dentro de uno de los monómeros (Schaefer et al., Proc Natl Acad Sci USA 108:11187-92, 2011; WO 2009/080251; WO 2009/080252; WO 2009/080253).

En otra forma de realización, la invención proporciona un anticuerpo multimérico que contiene tres o más dominios de unión para DR4, por ejemplo, cuatro dominios de unión. En formas de realización preferidas, el mAb multimérico anti-DR4 está en formato Bs(scFv)<4>-lgG o de dominio variable doble, de modo que contiene precisamente cuatro dominios de unión para DR4.

El DR4/DR5 biespecífico o anti-DR4 multimérico, en cualquier forma, incluidas las descritas específicamente anteriormente, como Bs(scFv)<4>-lgG y el dominio variable doble, comprende mutaciones en la región constante que aumentan la unión a un receptor Fe, es decir, el receptor FcyRllb, es decir, la mutación doble S267E/L328F (descrita en SY Chu et al., op. cit.). Cualquier anticuerpo biespecífico Bs(scFv)<4>-lgG o dominio variable doble con el dominio V1 unido a DR5 y el dominio V2 unido a DR4 (véase la Figura 1B) con regiones constantes humanas naturales se designa B-DR5/DR4-hFc y se designa B-DR5/DR4- hFc** si además contiene las mutaciones dobles S267E/L328F; Análogamente, para B-DR4/DR5-hFc y B-DR4/DR5-hFc**, con unión de V1 a DR4 y V2 a DR5. Un anticuerpo multimérico Bs(scFv)<4>-lgG o de dominio variable doble, en el que tanto V1 como V2 se unen a DR4 (o DR5), se denomina B-DR4/DR4-hFc (o B-DR5/DR5-hFc), y B-DR4/DR4-hFc** (o B-DR5/DR5-hFc**) si además contiene las mutaciones S267E/L328F.

La invención proporciona también anticuerpos variantes que incluyen anticuerpos biespecíficos cuya cadena ligera y pesada difieren de las descritas específicamente en este documento en un pequeño número (p. ej., típicamente no más de 1, 2, 3, 5 o 10) de reemplazos, deleciones o inserciones, generalmente en el marco de la región C o la región V. Muy a menudo, los reemplazos hechos en las secuencias variantes son conservadores con respecto a los aminoácidos reemplazados. Los aminoácidos se pueden agrupar de la siguiente manera para determinar sustituciones conservadoras, es decir, sustituciones dentro de un grupo: Grupo I (cadenas laterales hidrófobas): met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadenas laterales hidrófilas neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadenas laterales ácidas): asp, glu; Grupo IV (cadenas laterales básicas): asn, gin, his, lys, arg; Grupo V (residuos que influyen en la orientación de la cadena): gly, pro; y Grupo VI (cadenas laterales aromáticas): trp, tyr, phe. Preferiblemente, las sustituciones en el anticuerpo no tienen un efecto sustancial en la afinidad o potencia de unión del anticuerpo, es decir, en su capacidad para transmitir una señal apoptótica a través de DR4 y/o DR5. Preferiblemente, las secuencias variantes son al menos un 90 %, más preferiblemente al menos un 95 % y, aún más preferiblemente, al menos un 98 % idénticas a las secuencias originales. Además, se pueden utilizar otros alotipos o isotipos de las regiones constantes.

4. Métodos terapéuticos

En una forma de realización preferida, la presente invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo de la invención, por ejemplo, un mAb biespecífico B-DR5/DR4-hFc**, B-DR4/DR5-hFc** o un mAb multimérico B-DR4/DR4-hFc**, así como formas humanizadas de D114, como HuD114-hFc**. Las formulaciones farmacéuticas contienen el mAb en un vehículo fisiológicamente aceptable, opcionalmente con excipientes o estabilizantes, en forma de soluciones liofilizadas o acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones como fosfato, citrato o acetato a un pH típicamente de 5,0 a 8,0, con mayor frecuencia de 6,0 a 7,0; sales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, etc. para lograr la isotonización; antioxidantes, conservantes, polipéptidos de bajo peso molecular, proteínas, polímeros hidrófilos como el polisorbato 80, aminoácidos, carbohidratos, agentes quelantes, azúcares y otros ingredientes estándar conocidos por los expertos en la materia (Remington's Pharmaceutical Science, 16.a edición, Osol, A Ed., 1980). El mAb suele estar presente en una concentración de 0,1 a 1 mg/kg o de 1 a 100 mg/ml, pero con mayor frecuencia se encuentra entre 10 y 50 mg/ml, por ejemplo, 10, 20, 30, 40 o 50 mg/ml.

La invención es útil en un método de tratamiento de un paciente con una enfermedad mediante la administración de cualquier anticuerpo de la invención, por ejemplo, un mAb biespecífico B-DR5/DR4-hFc**, B-DR4/DR5-hFc** o un mAb multimérico B-DR4/DR4-hFc**, así como formas humanizadas de D114 como HuD114-hFc**, en una formulación farmacéutica, generalmente para destruir células dañinas, como las células cancerosas que expresan DR4. El mAb preparado en una formulación farmacéutica puede administrarse al paciente por cualquier vía adecuada, especialmente por vía parenteral mediante infusión intravenosa o inyección en bolo, intramuscular o subcutánea. La infusión intravenosa puede administrarse en tan solo 15 minutos, pero con mayor frecuencia durante 30 minutos, o durante 1, 2 o incluso 3 horas. El mAb también puede inyectarse directamente en el foco de la enfermedad (p. ej., un tumor) o encapsularse en agentes transportadores como liposomas. La dosis administrada es suficiente para aliviar la afección tratada (dosis terapéuticamente efectiva) y probablemente sea de 0,1 a 5 mg/kg de peso corporal (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5 mg/kg), pero puede alcanzar 10 mg/kg, o incluso 15, 20 o 30 mg/kg (por ejemplo, en los rangos de 0,1 a 1 mg/kg, 1 a 10 mg/kg o 1 a 20 mg/kg). También se puede administrar una dosis unitaria fija (por ejemplo, 50, 100, 200, 500 o 1000 mg), o la dosis puede basarse en la superficie corporal del paciente (por ejemplo, 1000 mg/m2). Generalmente se administran entre 1 y 8 dosis (p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) para tratar el cáncer, pero pueden administrarse 10, 20 o más dosis. El mAb puede administrarse diariamente, dos veces por semana, semanalmente, cada dos semanas, mensualmente o con otro intervalo, dependiendo, por ejemplo, de su semivida, durante 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 3-6 meses o más. También son posibles ciclos de tratamiento repetidos, así como la administración crónica.

Las enfermedades especialmente susceptibles a la terapia con los mAb de esta invención incluyen aquellas asociadas con células tales como células cancerosas que expresan niveles elevados de DR4, en comparación con células normales del mismo tipo de tejido, por ejemplo, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer de pulmón (microcítico o no microcítico), cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de hígado (carcinoma hepatocelular), cáncer de riñón (carcinoma de células renales), tumores de cabeza y cuello, melanoma, sarcomas y tumores cerebrales (p. ej., glioblastomas). Las neoplasias hematológicas, como leucemias y linfomas, también pueden ser susceptibles. Opcionalmente, se puede evaluar la expresión de DR4 y/o DR5 en células cancerosas de un sujeto en tratamiento antes de iniciar o continuar el tratamiento. La expresión se puede evaluar a nivel del ARNm o, preferiblemente, a nivel proteico, por ejemplo, mediante inmunoensayo de muestras de biopsia, como la inmunohistoquímica (IHQ). La expresión de DR4 y/o DR5 se encuentra preferiblemente al menos por encima del nivel basal evaluado con un anticuerpo de control irrelevante mediante inmunoensayo, y más preferiblemente por encima del nivel de células no cancerosas del mismo tipo de tejido. Otras enfermedades susceptibles al tratamiento con los mAb de la invención incluyen enfermedades autoinmunes como la artritis reumatoide, la esclerosis múltiple y la enfermedad inflamatoria intestinal.

En una forma de realización preferida, el mAb de la invención se utiliza como medicamento, donde puede administrarse en combinación con (es decir, junto con, es decir, antes, durante o después) de otra terapia. Por ejemplo, para tratar el cáncer, el mAb puede administrarse junto con uno o más de los fármacos quimioterapéuticos conocidos, como agentes alquilantes como carmustina, clorambucilo, cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, procarbazina y ciclofosfamida; antimetabolitos como fluorouracilo, floxuridina, fludarabina, gemcitabina, metotrexato e hidroxiurea; productos naturales, incluyendo alcaloides vegetales y antibióticos como bleomicina, doxorrubicina, daunorrubicina, idarrubicina, etopósido, mitomicina, mitoxantrona, vinblastina, vincristina y Taxol (paclitaxel) o compuestos relacionados como Taxotere®. el inhibidor de la topoisomerasa 1, irinotecán; e inhibidores de las tirosina quinasas como Gleevec® (imatinib), Sutent® (sunitinib), Nexavar® (sorafenib), Tarceva® (erlotinib), Tykerb® (lapatinib), lressa® (gefitinib) y Xalkori® (crizotinib); Rapamicina® (sirolimus) y otros inhibidores de mTOR; e inhibidores de la angiogénesis; y todos los agentes anticancerígenos aprobados y experimentales enumerados en el documento WO 2005/017107 A2. El mAb puede utilizarse en combinación con 1, 2, 3 o más de estos otros agentes, preferiblemente en un régimen quimioterapéutico estándar. Normalmente, los otros agentes son aquellos que ya se cree o se sabe que son eficaces para el tipo de cáncer que se está tratando.

Otros agentes con los que se puede administrar el mAb de la invención para tratar el cáncer incluyen productos biológicos como anticuerpos monoclonales, incluidos Herceptin® o Perjeta® (pertuzumab), contra el antígeno HER2; Avastin® contra VEGF; o anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF), como Erbitux® (cetuximab) y Vectibix® (panitumumab); activadores del sistema inmunitario, como Yervoy® (ipilimumab), incluyendo mAb anti-PD-1, como Opdivo® (nivolumab) y Keytruda® (pembroluzimab), así como conjugados anticuerpo-fármaco, como Kadcyla™ (ado trastuzumab emtansina). Además, el mAb puede utilizarse junto con cualquier tipo de cirugía o radioterapia.

El tratamiento (p. ej., quimioterapia estándar) que incluye el mAb de la invención puede aumentar la mediana de supervivencia libre de progresión o el tiempo de supervivencia global de pacientes con un tipo particular de cáncer, como los mencionados anteriormente, en al menos un 20 %, 30 % o 40 %, pero preferiblemente en un 50 %, entre un 60 % y un 70 % o incluso en un 100 % o más, en comparación con el mismo tratamiento (p. ej., quimioterapia) pero sin el mAb; o en (al menos) 2, 3, 4, 6 o 12 meses. Además, o como alternativa, el tratamiento (p. ej., quimioterapia estándar) que incluye el mAb puede aumentar la tasa de respuesta completa, la tasa de respuesta parcial o la tasa de respuesta objetiva (completa parcial) de los pacientes (especialmente en recaída o refractarios) en al menos un 30 % o un 40 %, pero preferiblemente en un 50 %, entre un 60 % y un 70 % o incluso en un 100 %, en comparación con el mismo tratamiento (p. ej., quimioterapia) pero sin el mAb.

Normalmente, en un ensayo clínico (p. ej., un ensayo de fase II, fase II/NI o fase III), los aumentos mencionados en la mediana de supervivencia libre de progresión y/o la tasa de respuesta de los pacientes tratados con quimioterapia más el mAb de la invención, en comparación con el grupo control de pacientes que recibieron quimioterapia sola (o más placebo), son estadísticamente significativos, por ejemplo, con un valor de p = 0,05, 0,01 o incluso 0,001. Se entiende también que las tasas de respuesta se determinan mediante criterios objetivos comúnmente utilizados en ensayos clínicos para el cáncer, por ejemplo, los aceptados por el Instituto Nacional del Cáncer y/o la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA), como los criterios RECIST (Criterios de Evaluación de la Respuesta en Tumores Sólidos).

5. Otros métodos

Los mAb de la invención también se utilizan en métodos de diagnóstico, pronóstico y de laboratorio. Pueden utilizarse para medir el nivel de DR4 o DR5 en un tumor o en la circulación de un paciente con un tumor y, por lo tanto, para el seguimiento y la guía del tratamiento del tumor. Por ejemplo, un tumor asociado con altos niveles de DR4 o DR5 sería especialmente susceptible al tratamiento con el mAb. Los mAb pueden utilizarse en un ELISA o un radioinmunoensayo para medir el nivel de DR4 o DR5, por ejemplo, en una muestra de biopsia tumoral o en suero. El uso de un mAb anti-DR4 y un mAb anti-DR5 es especialmente útil para detectar células que expresan tanto DR4 como DR5. Para diversos ensayos, el mAb puede marcarse con moléculas fluorescentes, moléculas marcadas por espín, enzimas o radioisótopos, y puede proporcionarse en forma de kit con todos los reactivos necesarios para realizar el ensayo. En otros usos, los mAb se utilizan para purificar DR4 o DR5, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad.

6. Ejemplos

Ejemplo 1: Generación de mAbs anti-DR4 y anti-DR5

Para generar y analizar mAb que se unen al DR4 humano, se construyeron varias proteínas de fusión mediante métodos estándar de biología molecular. Para producir DR4-hFc, se generó ADNc que codifica el dominio extracelular (aminoácidos 109 a 239) del DR4 humano y se insertó en derivados del vector pCI (Invitrogen), se unió a una región Fe de Ig gamma-1 humana (bisagra-CH2-CH3) en el extremo C-terminal, se transfectó y se expresó en células de mamífero 293F. De forma similar, se construyó una proteína de fusión cDR4-hFc de mono cynomolgus utilizando el dominio extracelular del DR4 de mono clonado a partir de ADNc de hígado de mono cynomolgus (Biochain) para obtener el dominio DR4 de mono. Estas proteínas de fusión Fe se purificaron a partir del sobrenadante de cultivo 293F mediante una columna de proteína A. La proteína de fusión DR4-KF se produjo de forma similar mediante la unión del dominio extracelular DR4 humano a la región constante lg kappa humana, seguida del péptido FLAG (DYKDDDDK) en el extremo C. Se generó una proteína análoga cDR4-KF utilizando DR4 de mono cynomolgus. Estas proteínas de fusión marcadas con FLAG se purificaron utilizando columnas anti-FLAG. Para generar y ensayar mAb que se unen a DR5 humano, se generó un conjunto completamente análogo de proteínas DR5-hFc y DR5-KF, y cDR5-hFc y cDR5-KF, de la misma manera que para DR4 utilizando el dominio extracelular DR5 humano y de mono cynomolgus (aminoácidos 54-183), respectivamente. Para los ensayos de bloqueo, se utilizó la proteína humana Apo2L/TRAIL (aminoácidos 95-281) (R&D systems). También se utilizaron proteínas de fusión DR4-Fc y DR5-Fc humanas comerciales (R&D systems).

Para generar mAb anti-DR4, se inmunizaron ratones Balb/c en cada almohadilla de la pata trasera dos veces por semana 11 veces con 1 |jg de DR4-hFc (TRAILR1-Fc de R&D Systems) y, posteriormente, 5 veces con 5 |jg de DR4-hFc, preparado como se describió anteriormente, resuspendido en adyuvante MPL/TDM (Sigma-Aldrich). Tres días después del refuerzo final, se fusionaron células del ganglio linfático poplíteo con células de mieloma murino, P3X63AgU.1 (ATCC CRL1597), utilizando polietilenglicol al 35 %. Se seleccionaron hibridomas en medio HAT como se describe (Chuntharapai y Kim, J. Immunol. 163:766, 1997). Diez días después de la fusión, se analizaron los sobrenadantes de cultivo de hibridoma mediante la prueba ELISA de unión a DR4 que se describe a continuación. Los hibridomas seleccionados se clonaron dos veces mediante dilución limitante. Los anticuerpos monoclonales presentes en ascitis y líquidos de cultivo de hibridomas seleccionados se purificaron mediante una columna de proteína A/G. De varios anticuerpos seleccionados para su posterior análisis, se seleccionó el anticuerpo D114 para su desarrollo debido a su superior actividad agonista demostrada en ensayos de muerte celular. El isotipo de D114 se determinó como IgG1, kappa mediante un kit de isotipado.

Para generar mAb anti-DR5, se inmunizaron ratones Balb/c en cada almohadilla de la pata trasera dos veces por semana 12 veces con 5 jg de DR5-hFc y, posteriormente, una vez con 1 jg de DR5-hFc resuspendidos en adyuvante MPL/TDM (Sigma-Aldrich). Tres días después de la dosis final de refuerzo, se fusionaron células del ganglio linfático poplíteo con células de mieloma murino e hibridomas seleccionados en medio HAT, como se describió anteriormente para mAb anti-DR4. Diez días después de la fusión, se analizaron los sobrenadantes de cultivo de hibridoma mediante la prueba ELISA de unión a DR5 que se describe a continuación. Los hibridomas seleccionados se clonaron dos veces mediante dilución limitante y los mAb se purificaron como se describió anteriormente para mAb anti-DR4. Los mAb seleccionados se analizaron posteriormente para determinar sus efectos sobre la viabilidad de las células COLO 205 y su actividad de unión a DR5 de mono, como se describe a continuación. De varios anticuerpos seleccionados, se seleccionó el anticuerpo G4.2 para su desarrollo debido a su superior actividad agonista, demostrada en ensayos de muerte celular. El isotipo de G4.2 se determinó como IgG1, kappa mediante un kit de isotipado.

Ejemplo 2: Actividad de unión y bloqueo de anticuerpos

Cada paso de cada ensayo ELISA descrito en esta solicitud de patente se realizó mediante incubación a temperatura ambiente con el reactivo apropiado durante 1 hora, excepto el paso de recubrimiento de la placa inicial que se realizó durante la noche a 4 °C seguido de bloqueo con BSA al 2 % durante 1 hora. Entre cada paso, las placas se lavaron tres veces con PBS con Tween 20 al 0,05 %. Los datos se obtuvieron generalmente por duplicado o triplicado; la variabilidad entre las réplicas fue generalmente baja.

Para medir la unión de mAb a DR4 (respectivamente DR5), generalmente se utilizaron ensayos de captura: las placas se recubrieron primero con IgG-Fc de cabra anti-ratón (2 jg/mL) durante la noche, se bloquearon con<b>S<a>al 2%, se incubaron con sobrenadante de hibridoma o concentraciones crecientes del anticuerpo purificado a analizar y, a continuación, con 0,3 pg/mL de DR4-KF (o DR5-KF). El DR4-KF (o DR5-KF) capturado se detectó mediante la adición de HRP de cabra anti-kappa humana y, a continuación, sustrato TMB. Sin embargo, para medir la unión de las variantes de HuG4.2 a DR5, como se describe a continuación, se utilizó un ensayo de unión directa: las placas se recubrieron con Dr5-Fc (0,5 pg/mL), se bloquearon, se incubaron con concentraciones crecientes de mAb y el mAb unido se detectó con HRP de cabra anti-kappa humana.

Para medir la actividad de bloqueo de los mAb, las placas se recubrieron primero con igG-Fc anti-humano de cabra (2 pg/mL) durante la noche, se bloquearon con BSA al 2 % y se incubaron con DR4-hFc o, respectivamente, DR5-hFc (0,5 pg/mL). A continuación, se añadieron a los pocillos 50 ng/ml de Apo2L (TRAIL, R&D Systems) mezclado con diversas concentraciones de mAb purificado. La Apo2L unida se detectó mediante la adición de 0,2 pg/mL de anticuerpo anti-TRAIL biotinilado (R&D Systems), seguida de la adición de HRP-estreptavidina y, finalmente, sustrato TMB.

Mediante estos ensayos ELISA, se demostró que D114 se une a DR4 tan bien como 4H6 (Figura 2A) y bloquea la unión de Apo2L a DR4 tan bien como 4H6 (Figura 2B). De forma similar, se demostró que D114 se une a DR4 de mono cinomolgo casi tan bien como a DR4 humano mediante el uso de la proteína cDR4-hFc en el ensayo de unión. También se demostró que G4.2 se une bien a DR5 (Figura 2C) y bloquea eficazmente la unión de Apo2L a DR5 (Figura 2D). Además, se demostró que G4.2 también se une bien al DR5 del mono cynomolgus mediante el uso de la proteína cDR5-hFc en el ensayo de unión descrito anteriormente, mientras que 3H3 no se une al DR5 del mono cynomolgus en este ensayo, lo que proporciona una ventaja de G4.2 en relación con 3H3 y muestra que G4.2 debe tener un epítopo diferente al de 3H3.

Ejemplo 3: Muerte celular por D114 y G4.2

Para realizar ensayos para medir la reducción de la viabilidad celular (denominada en este documento muerte celular), se sembraron líneas de células tumorales humanas en DMEM/10 % FCS en una placa de 96 pocillos a 2 x 104 células/100 pl/pocillo y se incubaron durante la noche (en condiciones estándar de 37 °C y 5 % de CO<2>). A continuación, se retiró el medio y se reemplazó por 100 pl del mismo medio que contenía concentraciones crecientes de mAb, con o sin 10 pg/mL de IgG-Fc de cabra antirratón (anti-mlgG-Fc) para anticuerpos de ratón y de IgG-Fc de cabra antihumana (anti-hlgG-Fc) para anticuerpos humanos, humanizados o quiméricos. En ciertos ensayos, el mAb y el anti-IgG-Fc se incluyeron en el medio durante la siembra de las células tumorales. Cada concentración de mAb se determinó por duplicado. Tras la incubación durante la noche en condiciones estándar, se determinó la viabilidad celular añadiendo 10 pI/pocillo de WST-8 durante 1 hora y midiendo la absorbancia a una DO de 450. El objetivo de la anti-mlgG-Fc o la antihlgG-Fc de cabra utilizada en algunos experimentos era reticular (oligomerizar) el anticuerpo anti-DR4 o anti-DR5 en estudio, transmitiendo así una señal apoptótica más potente a las células. Se cree que dicha reticulación por el anticuerpo anti-lgG-Fc imita la reticulación que se produce cuando el anticuerpo anti-DR4 o anti-DR5 se une a los glóbulos blancos que se infiltran en un tumor y, por lo tanto, se une a ellos a través del FcyR en la superficie de dichas células.

Mediante este ensayo, se determinó que D114 inhibe la viabilidad celular de la línea celular de tumor pulmonar H460 (ATCC HTB-177; Figura 3A) y la línea celular de tumor de colon SW480 (ATCC CCL-228; Figura 3B), así como de otras líneas celulares analizadas, así como 4H6, en presencia de anti-mlgG-Fc. De igual forma, G4.2 inhibe la viabilidad celular de las células H460 (Figura 3C) y las células de tumor de colon COLO 205 (ATCC CCL-222; Figura 3D) casi tan eficazmente como 3H3.

Ejemplo 4: Construcción y caracterización de anticuerpos.

La clonación de las regiones variables de cadena pesada y ligera de los mAb, la construcción y expresión de varios mAb y la introducción de mutaciones se realizaron utilizando métodos estándar de biología molecular, por ejemplo como se describe en la patente de EE. UU. N.° 7.632.926. Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera (maduras) de 4H6 se muestran, respectivamente, en las Figuras 4A y 4B, y las de 3H3 se muestran, respectivamente, en las Figuras 4C y 4D. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera (maduras) de D114 se muestran, respectivamente, en las Figuras 5A y 5B, con las líneas superiores marcadas como D114; y las regiones variables de las cadenas pesada y ligera (maduras) de G4.2 se muestran, respectivamente, en las Figuras 5C y 5D, con las líneas superiores marcadas como G4.2.

Además, para comparar con los mAb divulgados en este documento, se construyeron varios otros mAb anti-DR5 basados en sus secuencias publicadas: los mAb humanos drozitumab (Apomab; Figuras 17 y 18 de la patente estadounidense N.° US 8.030.023) y conatumumab (AMG 655; Figura 19 de WO 2012/106556), y el mAb de ratón TRA-8 (Figuras 23 y 24 de la patente estadounidense N.° 7.244.429).

Como convención utilizada en este documento, el sufijo hFc** (también escrito como Fe** en ciertas Figuras) aplicado a un anticuerpo significa que contiene la región constante gamma-1 humana con mutaciones S267E y L328F, cuya secuencia se muestra como parte de la Figura 6A (véase la leyenda de la Figura 6A), mientras que el sufijo hFc significa que contiene la región constante gamma-1 humana sin las mutaciones S267E y L328F (por lo que tiene S y L en esas posiciones de aminoácidos). Se construyeron los anticuerpos quiméricos 3H3-hFc, 4H6-hFc, D114-hFc y G4.2-hFc combinando las regiones variables de los respectivos anticuerpos murinos con una región constante kappa humana y una región constante gamma-1 humana, y los correspondientes anticuerpos quiméricos 3H3-hFc**, 4H6-hFc**, D114-hFc** y G4.2-hFc** con la región constante gamma-1 humana que contiene las mutaciones S267E y L328F. Para realizar comparaciones en algunos experimentos, también se construyó el anticuerpo Apomab-hFc** combinando las regiones variables de Apomab humano con la región constante gamma-1 humana que contiene las mutaciones S267E y L328F.

Se construyó un anticuerpo biespecífico B-4H6/3H3-hFc** en el formato Bs(scFv)4-lgG: las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de este mAb se muestran respectivamente en la Figura 6A y la Figura 6B, donde cada cadena madura comienza en el primer aminoácido después del péptido señal. Por lo tanto, este mAb tiene la configuración que se muestra en la Figura 1A, con V<h>1 y V<l>1 del mAb 4H6 y V<h>2 y V<l>2 del mAb 3H3.

Ejemplo 5: Muerte celular por anticuerpos

La capacidad de los diversos anticuerpos descritos anteriormente para destruir diferentes líneas celulares (es decir, reducir la viabilidad celular) se evaluó en el ensayo de destrucción celular descrito anteriormente. En ausencia de anti-hlgG-Fc, ni 3H3-hFc** ni 4H6-hFc**, ni siquiera una combinación (mezcla) de estos dos mAb, mostraron destrucción de las células tumorales de colon SW480 (Figura 7A) ni de las células tumorales de pulmón H460 (Figura 8A), ya que, sin un agente de entrecruzamiento que oligomerice los anticuerpos, no pueden transmitir una señal de muerte a las células. Sin embargo, 3H3-hFc* y, en mayor medida, 4H6-hFc**, pudieron destruir las células SW480 en presencia del agente de entrecruzamiento anti-hlgG-Fc (Figura 7B); la adición de 3H3-hFc** a 4H6-hFc** no incrementó aún más la destrucción.

Para determinar si las formas de anticuerpos con mutaciones tendrían una ventaja en la destrucción de células tumorales en presencia de células que expresan FcyRllb, se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC), compuestas principalmente por monocitos y linfocitos, de sangre humana utilizando Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los ensayos de viabilidad celular se realizaron como se describió anteriormente, excepto que los medios que contenían mAb también contenían generalmente 2 x 105 PBMC humanas. En presencia de las PBMC, 4H6-hFc** destruyó células tumorales H460 con una eficacia considerablemente mayor que 4H6-hFc (Figura 8B).

A continuación, exploramos si dos mutaciones en la región constante gamma-1 humana proporcionaban mayor actividad destructora celular que una sola mutación. Por lo tanto, construimos el mAb quimérico 4H6-hFc* (indicado por hFc* con un asterisco) que contenía únicamente la mutación S267E, en lugar de la doble mutación S267E/L328F en 4H6-hFc**. El ensayo de destrucción celular descrito anteriormente se utilizó con una concentración fija de 0,5 pg/mL de mAb, 4 x 104 células tumorales COLO 205 por pocillo y 4 x 105 PBMC por pocillo de cuatro donantes humanos diferentes, para considerar la posible variabilidad de las PBMC. Para cada uno de los donantes, 4H6-hFc redujo modestamente la viabilidad de las células tumorales (en relación con el mAb hlgG de control establecido en 100 % de viabilidad para cada donante), 4H6-hFc* con una sola mutación redujo la viabilidad ligeramente a significativamente más que 4H6-hFc, pero 4H6-hFc** redujo la viabilidad sustancialmente mejor que 4H6-hFc* (Figura 9A), lo que muestra la ventaja de dos mutaciones que aumentan la unión a FcyRllb sobre una de dichas mutaciones. Para determinar si esto también era cierto para otras combinaciones de al menos dos mutaciones, introdujimos otros pares de mutaciones en 4H6-hFc de acuerdo con la siguiente tabla:

Tabla 1: Variantes de mutación

A una concentración fija de anticuerpos de 1 pg/mL y en presencia de PBMC humanas, las cuatro variantes redujeron la viabilidad celular aproximadamente por igual para las células COLO 205, las células MDA-MB-231 (ATCC HTB-26) y las células H460 (Fig. 9B), observándose el mayor efecto en las células COLO 205 y solo un efecto moderado en las H60 en las condiciones del ensayo. Por lo tanto, diversas combinaciones de dos o más mutaciones que aumenten la unión a FcyRllb son igualmente adecuadas para potenciar la destrucción de células tumorales.

Para explorar más a fondo la ventaja de dos mutaciones sobre una, se probó la capacidad de 4H6-hFc, 4H6-hFc* y 4H6-hFc** para matar células COLO 205 en presencia de PBMC en un rango de concentraciones de anticuerpos (Figura 10A). En este experimento, no se observó destrucción por 4H6-hFc, pero sí una destrucción moderada por 4H6-hFc* y una destrucción sustancial por 4H6-hFc**, lo que demuestra nuevamente la ventaja de dos mutaciones sobre una.

Como experimento final, se comparó la capacidad de 4H6-hFc, 4H6-hFc* y 4H6-hFc** para inhibir el crecimiento de xenoinjertos tumorales COLO 205 en ratones, utilizando los métodos descritos a continuación. Al administrar 2 mg/kg de cada mAb dos veces por semana, 4H6-hFc** con dos mutaciones inhibió los xenoinjertos con mayor intensidad que 4H6-Fc o 4H6-Fc* (Fig. l0B), con una o ninguna mutación, respectivamente, lo cual coincide con los resultados de muerte celular.

Ejemplo 6: Capacidad de los anticuerpos para inhibir el crecimiento de xenoinjertos tumorales

Los experimentos de xenoinjerto se llevaron a cabo esencialmente como se describió previamente (Kim et al., Nature 362:841, 1993). Las células tumorales humanas, cultivadas típicamente en medio DMEM completo, se obtuvieron en HBSS. Se inyectaron por vía subcutánea de 2 a 10 x 106 células en 0,1 a 0,2 ml de HBSS, con Matrigel (Corning) en algunos experimentos, en las áreas dorsales. Cuando el tamaño del tumor alcanzó aproximadamente 100 mm3, los ratones se agruparon aleatoriamente y se les administraron típicamente de 0,5 a 5 mg/kg de mAb por vía intraperitoneal una sola vez o una o dos veces por semana en un volumen de 0,1 ml. El tamaño del tumor se determinó dos veces por semana mediante mediciones bidimensionales [longitud (a) y anchura (b)]. El volumen tumoral se calculó según V = ab2/2 y se expresó como volumen tumoral medio ± SEM. El número de ratones en cada grupo de tratamiento fue típicamente de 5 a 7. Se puede realizar un análisis estadístico, por ejemplo, mediante la prueba t de Student en el último punto de datos.

Primero, realizamos experimentos de xenoinjerto para determinar si, en consonancia con la mayor destrucción celular en presencia de PBMC descrita anteriormente, las formas hFc** de los mAb anti-DR4 y anti-DR5 eran más eficaces que las formas hFc in vivo, debido a la mayor unión a FcyR proporcionada por las mutaciones en la región constante hFc**. De hecho, mientras que el mAb anti-DR4 D114-hFc solo inhibió moderadamente el crecimiento de los xenoinjertos COLO 205 al administrarse en una dosis única de 2 mg/kg, D114-hFc** inhibió casi por completo los xenoinjertos en estas condiciones (Figura 11A). (Como se describe a continuación, se obtuvieron resultados muy similares para la inhibición de los xenoinjertos COLO 205 por las formas humanizadas, HuD114-hFc y HuD114-hFc**; Figura 18A). Mientras que D114-hFc no inhibió significativamente el crecimiento de los xenoinjertos de tumor de colon SW480 al administrarse también de esta manera, D114-hFc** inhibió moderadamente el crecimiento de los xenoinjertos en estas condiciones (Figura 11B). Finalmente, otro mAb anti-DR4, 4H6-hFc, inhibió moderadamente el crecimiento de los xenoinjertos COLO 205 al administrarse a 2 mg/kg dos veces por semana, pero 4H6-hFc** inhibió completamente los xenoinjertos en estas condiciones (Figura 11C).

Con respecto a los mAb anti-DR5, 3H3-Fc no inhibió significativamente el crecimiento de los xenoinjertos COLO 205 cuando se administró una vez a 0,5 mg/kg, pero 3H3-hFc** inhibió completamente el crecimiento de estos xenoinjertos incluso cuando se administró en este nivel de dosis muy bajo (Fig. 12A). De igual manera, 3H3-Fc solo inhibió moderadamente el crecimiento de los xenoinjertos de tumor pancreático MIA PaCa-2 (ATCC CRL-1420) al administrarse una sola vez a 1 mg/kg, pero 3H3-hFc** inhibió completamente su crecimiento incluso a esta dosis tan baja (Figura 12B). De forma análoga, como se describe a continuación, al administrarse una vez a 1 mg/kg, el mAb humanizado HuG4.2-hFc** inhibió el crecimiento de los xenoinjertos COLO 205 y MIA PaCa-2 mejor que HuG4.2-hFc (Figuras 19A, B). Por lo tanto, tanto para los mAb anti-DR4 como anti-DR5, las formas de hFc** con mutaciones fueron mucho más eficaces in vivo que las formas de hFc sin mutaciones.

Ejemplo 7: Construcción y caracterización de anticuerpos humanizados

El diseño, la construcción, la expresión y la purificación de los mAb humanizados D114 y G4.2 se realizaron utilizando métodos estándar de biología molecular, por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. N.° 7.632.926 para el mAb L2G7. Más específicamente, para diseñar un mAb humanizado D114 (G4.2), se siguieron los métodos de Queen et al., patentes estadounidenses n.° 5.530.101 y 5.585.089. La secuencia VK humana AIT38746 y la secuencia V<h>AAC18293 (respectivamente, la secuencia VK humana AAQ02698 y la secuencia V<h>AAC50998), como se muestra en las Figuras 5A y 5B (resp. 5C y 5D), líneas inferiores, fueron elegidas respectivamente para servir como secuencias aceptoras para las secuencias V<l>y V<h>de D114 (resp. G4.2), debido a que tienen una homología de marco particularmente alta (es decir, identidad de secuencia) con ellas. Se utilizó un modelo molecular generado por computadora del dominio variable de D114 (respectivamente G4.2) para localizar los aminoácidos en el marco que están lo suficientemente cerca de los CDR para interactuar potencialmente con ellos. Para diseñar las regiones variables de cadena ligera y pesada de D114 (respectivamente G4.2) humanizadas, las CDR del mAb D114 (resp. G4.2) de ratón se injertaron primero conceptualmente en las regiones del marco aceptor. En las posiciones del marco donde el modelo de computadora sugirió un contacto significativo con los CDR, que puede ser necesario para mantener la conformación de CDR, los aminoácidos del anticuerpo de ratón se sustituyeron por los aminoácidos del marco humano.

Para D114, dichas sustituciones se realizaron en los residuos 48 y 71 de la cadena ligera (HuD114-L 1), y en los residuos 48 y 71 de la cadena pesada (HuD114-H1) o en estos residuos más los residuos adicionales de la cadena pesada 67 y 69 (HuD114-H2). Las secuencias de la región V de la cadena ligera y pesada del D114 humanizado se muestran en las Figuras 5A y 5B, respectivamente; las líneas centrales se denominan HuD114, donde se alinean con las respectivas regiones V del donante y del aceptor humano de D114. Los mAb con la cadena ligera HuD114-L1 y la cadena pesada HuD114-H1 o HuD114-H2 se denominan HuD114 #1 y HuD114 #2, respectivamente. Cada uno de estos se elaboró en dos formas: HuD114-hFc, donde la región constante gamma-1 humana no presenta las mutaciones S267E y L328F (y, por lo tanto, presenta las posiciones S y L a 267 y 328), y HuD114-hFc**, donde la región constante sí presenta estas mutaciones. Mediante el ensayo de unión descrito anteriormente, tanto HuD114-hFc #1 como HuD114-hFc #2 se unen a DR4, así como al anticuerpo quimérico D114-hFc descrito anteriormente (Figura 13A), lo que indica que no se perdió afinidad durante la humanización. HuD114-hFc** #1 y HuD114-hFc** #2 destruyen células COLO 205 en presencia de anti-hlgG-Fc de cabra con la misma eficacia (Figura 14A). En un intento por mejorar la actividad de destrucción celular, se produjeron nuevas versiones de la cadena ligera y pesada de HuD114 con sustituciones adicionales de ratón: HuD114L2, que contiene sustituciones de ratón en los residuos 48 y 71 más 43 y 44, y HuD114-H3, que contiene sustituciones de ratón en los residuos 48, 67, 69 y 71 más 91. Se produjeron seis anticuerpos que consisten en todas las combinaciones de HuD114-L1 y HuD114-L2 con HuD114-H1, HuD114-H2 y HuD114-H3, pero todos tuvieron una actividad de unión y actividad de destrucción celular comparables. Por lo tanto, HuD114-hFc #2 y HuD114-hFc** #2 se utilizaron para estudios posteriores y se denotan HuD114-hFc y HuD114-hFc** de ahora en adelante y en las figuras.

La invención también incluye variantes de estos anticuerpos preferidos, por ejemplo, anticuerpos humanizados que comprenden una región V de cadena ligera con una secuencia al menos 90, 95, 98 o 99 % idéntica a la de HuD114-L1 (Fig. 5A) y una región V de cadena pesada con una secuencia al menos 90, 95, 98 o 99 % idéntica a la de HuD114-H1 o HuD114-H2 (Fig. 5B). Todos los residuos de CDR en estos anticuerpos son los del donante. Las posiciones 48 y 71 de la cadena ligera están ocupadas por V e Y, respectivamente, y las posiciones 48 y 71 de la cadena pesada están ocupadas por L y A, respectivamente.

Similarmente, para G4.2, se realizaron sustituciones en los residuos 4 y 68 de la cadena ligera (HuG4.2-L1) o en estos residuos más el residuo 1 (HuG4.2-L2), y en los residuos 27, 28, 30 y 93 de la cadena pesada (HuG4.2-H1) o en estos residuos más el residuo 47 (HuG4.2-H2). Las secuencias de la región V de la cadena ligera y pesada de HuG4.2 se muestran en las Figuras 5C y 5D, respectivamente; las líneas centrales se denominan HuG4.2, donde se alinean con las respectivas regiones V donante y aceptora humana de G4.2. Al combinar cada cadena ligera humanizada con cada cadena pesada humanizada, se obtuvieron cuatro anticuerpos humanizados G4.21 diferentes, denominados HuG4.2 #1, #2, #3 y #4, como se muestra en la siguiente tabla, donde el número de sustituciones en cada cadena se indica entre paréntesis. En cuanto a HuD114, cada uno de estos mAb se obtuvo en dos formas: hFc sin mutaciones en la región constante de la cadena pesada gamma-1 humana y hFc** con las mutaciones S267E y L328F.

Tabla 2: Variantes de HuG4.2

Las cuatro versiones de HuG4.2 se unieron bien a DR5, siendo HuG4.2-hFc** #1 y HuG4.2-hFc** #2 ligeramente mejor que HuG4.2-hFc** #3 y HuG4.2-hFc** #4 (Fig. 13B). De hecho, HuG4.2-hFc** #1 y #2 se unieron a DR5 de forma comparable al anticuerpo quimérico G4.2-hFc**, lo que indica que se perdió poca o ninguna afinidad durante la humanización. Las cuatro versiones de HuG4.2 también eliminaron bien las células COLO 205 en presencia de anti-hlgG-Fc de cabra (Fig. 14B), siendo HuG4.2-hFc** #2 ligeramente mejor que las demás y esencialmente igual que el anticuerpo quimérico G4.2-hFc**. Por lo tanto, HuG4.2-Fc #2 y HuG4.2-hFc** #2 se utilizaron para estudios posteriores y se denominarán HuG4.2-Fc y HuG4.2-Fc** en adelante y en las figuras.

Las variantes de HuG4.2 pueden comprender una región V de cadena ligera con una secuencia al menos 90, 95, 98 o 99 % idéntica a HuG4.2-L1 o HuG4.2-L2 en la Fig. 5C y una región V de cadena pesada con una secuencia al menos 90, 95, 98 o 99 % idéntica a HuG4.2-H1 o HuG4.2-H2 en la Fig. 5D. Preferiblemente, todos los residuos de CDR en dichos anticuerpos son los del anticuerpo donante. Preferiblemente, las posiciones 4 y 68 de la cadena ligera están ocupadas por L y R, respectivamente, y las posiciones 27, 28, 30 y 93 de la cadena pesada están ocupadas por L, P, N y T, respectivamente. Opcionalmente, la posición 47 de la cadena pesada está ocupada por L.

La capacidad de los diversos mAb humanizados para destruir células se evaluó en presencia de anti-lgG-Fc de cabra (10 pg/mL) como agente de reticulación. Tanto HuD114-hFc como HuD114-hFc** destruyeron células tumorales de colon COLO 205 (Fig. 15A) y SW480 (Fig. 15B) mucho mejor que mapatumumab, el mAb anti-DR4 que se ha probado en ensayos clínicos. Sin embargo, no se observó una diferencia significativa entre HuD114-hFc y HuD114-hFc**, como se esperaba, ya que el aumento de la unión a FcyRllb proporcionado por las mutaciones no debería tener efecto en ausencia de células que expresan FcyRllb. De manera similar, se comparó la capacidad de HuG4.2-hFc y/o HuG4.2-hFc** con la de los mAb anti-DR5 Apomab, AMG 655 y lexatumumab para matar células COLO 205 (Figura 15C), y con Apomab y TRA-8 para matar células tumorales pancreáticas MIA PaCa-2 (Figura 15D). Nuevamente, donde se probó, no hubo diferencia significativa entre HuG4.2-hFc y HuG4.2-hFc** debido a la ausencia de células que expresan FcyRllb. Sin embargo, HuG4.2-hFc y HuG4.2- hFc** mataron ambas líneas celulares sustancialmente mejor que los otros mAb probados, que han estado en ensayos clínicos. También se determinó la capacidad de varios mAb para matar células H460 (Figura 16A) y células Sw 480 (Figura 16B) en presencia de anti-hlgG-Fc. HuD114-hFc** y HuG4.2-hFc** destruyeron las células H460 sustancialmente mejor que los mAbs anti-DR5 Apomab y AMG 655, mientras que HuD114-hFc** destruyeron las células SW480 sustancialmente mejor y HuG4.2-hFc** levemente mejor que Apomab y AMG655, en consonancia con los resultados recién mencionados (Figuras 15A-D).

A continuación, comparamos la capacidad de varios mAb para destruir células en presencia de PBMC humanas, donde las formas hFc** podrían ser superiores a las formas hFc debido a la mayor unión de FcyRllb proporcionada por las mutaciones S267E y L328F. De hecho, HuG4.2-Fe** destruyó células COLO 205 (Figura 17A) o células H60 (Figura 17B) mucho mejor que HuG4.2-Fc. Asimismo, Apomab-hFc**, una forma de Apomab en la que introdujimos estas mutaciones como se describió anteriormente, destruyó las células mejor que el propio Apomab (Figura 17A, B). Sin embargo, HuG4.2-hFc** aún mató a las células COLO 205 o H60 sustancialmente mejor que Apomab-hFc** (y mejor que AMG 655), mostrando nuevamente la potencia superior del mAb anti-DR5 HuG4.2-hRFc**.

Para comparar el efecto de dos mutaciones versus una en el contexto de HuD114 y HuG4.2, evaluamos la capacidad de destrucción celular en presencia de PBMC de los mAb HuD114-hFc (HuG4.2-hFc, respectivamente) sin mutaciones, los mAb HuD114-hFc* (HuG4.2-hFc*, respectivamente) con solo la mutación S267E, y los mAb HuD114-hFc** (HuG4.2-hFc**, respectivamente) con la doble mutación S267<e>/L328F. El HuD114-hFc* destruyó células COLO 205 (Figura 17C) y células H460 (Figura 17D) ligeramente mejor que el HuD114-hFc, mientras que el HuD114-hFc** destruyó las células mucho mejor. De forma similar, HuG4.2-hFc* destruyó las células COLO 205 (Figura 17E) y H460 (Figura 17F) ligeramente mejor que HuG4.2-hFc, mientras que HuG4.2-hFc** destruyó las células mucho mejor. Por lo tanto, la presencia de dos mutaciones en la región constante es sustancialmente ventajosa en comparación con una sola mutación.

Pasando finalmente a la capacidad de los mAbs humanizados HuD114 y HuG4.2 para inhibir el crecimiento de xenoinjertos, HuD114-hFc inhibió moderadamente el crecimiento de xenoinjertos COLO 205 cuando se administró una vez a 2 mg/kg, mientras que HuD114-hFc** inhibió completamente el crecimiento de xenoinjertos en estas condiciones (Fig. 18A). HuD114-hFc**, administrado una vez a 2 mg/kg, también inhibió fuertemente la capacidad de crecimiento de xenoinjertos de tumor pulmonar H460 (Figura 18B). En otro experimento, a la dosis baja probada, HuD114-hFc* inhibió completamente el crecimiento de xenoinjertos COLO 205, mientras que el anticuerpo mapatumumab, probado en ensayos clínicos, no tuvo efecto (Figura 18C). Cuando se administró una vez a 2 mg/kg, HuD114- hFc** también fue algo más eficaz que mapatumumab en la inhibición del crecimiento de xenoinjertos de linfoma de Ramos (ATCC CRL-1596) (Figura 18D). Una dosis única de 1 mg/kg de HuG4.2-hFc o HuG4.2-hFc** inhibió el crecimiento de xenoinjertos COLO 205 (Figura 19A) y xenoinjertos de tumor pancreático MIA PaCa-2 (Figura 19B), con HuG4.2-hFc** claramente más eficaz que HuG4.2-hFc. (HuD114-hFc** también fue eficaz en este modelo; Figura 19B). La mayor eficacia de las formas hFc** de estos mAb en relación con las formas hFc en modelos de xenoinjerto es consistente con la mayor capacidad de las formas hFc** para destruir células tumorales in vitro en presencia de PBMC descritas anteriormente.

Ejemplo 8: Caracterización de un anticuerpo biespecífico

Para demostrar que el mAb biespecífico B-4H6/3H3-hFc** descrito anteriormente (Figs. 6A, B) puede unirse simultáneamente a DR4 y DR5, las placas se recubrieron primero durante la noche con un mAb anti-DR4 (2 pg/ml) que no compite por la unión con 4H6, se bloquearon con<b>S<a>al 2% y luego se incubaron con DR4-hFc (0,5 pg/ml). A continuación, se añadieron concentraciones crecientes de mAb B-4H6/3H3-hFc** a los pocillos, seguidas de 0,5 pg/mL de DR5-KF. La unión de DR5-KF se detectó con HRP-anti-Flag M2 (Sigma) y sustrato. Como solo un mAb que puede unirse tanto a DR4 (en forma de DR4-hFc) como a DR5 (en forma de DR5-KF) dará un resultado positivo en este ensayo ELISA, los resultados (Figura 20A) muestran que B-4H6/3H3-hFc** tiene esta capacidad, mientras que, por supuesto, los mAb 4H6-hFc** y 3H3-hFc** no la tienen.

Se determinó la capacidad de B-4H6/3H3-hFc** para destruir células COLO 205 sin el agente de entrecruzamiento anti-mlgG-Fc. 4H6-hFc** no logró destruir las células en estas condiciones, mientras que 3H3-hFc** mostró cierta capacidad de destrucción (Figura 20B). Esto se debe a que las células COLO 205 son muy sensibles a los agonistas del receptor de muerte, más que otras líneas celulares como H60 y SW480 utilizadas en este estudio. Sin embargo, el mAb biespecífico B-4H6/3H3-hFc** destruyó las células considerablemente mejor que 3H3-hFc**, aunque el componente 4H6 no mostró capacidad de destrucción celular por sí solo (Figura 20B). Por el contrario, la simple mezcla de los mAbs separados 3H3-hFc** y 4H6-hFc** no aumentó la capacidad de destrucción celular de ninguno de ellos (Figura 7A, B).

Se construyó otro anticuerpo biespecífico, B-HuD114/HuG4.2-hFc**, en el formato Bs(scFv)<4>-lgG, de la misma manera que el B-4H6/3H3-hFc**, y también con la doble mutación en la región constante. Mediante el ensayo ELISA descrito anteriormente en este ejemplo, este mAb B-HuD114/HuG4.2-hFc** se unió tanto a DR4 como a DR5, mientras que el mAb HuG4.2-hFC** no lo hizo (Figura 20C). Un mAb B-HuD114/HuG4.2-hFc** también destruyó células COLO 205 en ausencia de anti-hlgG-Fc (Figura 20D), incluso mejor que el ligando natural TRAIL.

Aunque la invención se ha descrito con referencia a las formas de realización actualmente preferidas, debe entenderse que no son limitativas. Salvo que el contexto indique lo contrario, cualquier paso, elemento, realización, característica o aspecto de la invención puede utilizarse con cualquier otro. El término "en la presente" se refiere a cualquier parte de esta solicitud de patente, no solo a la sección donde aparece dicho término. Si más de una secuencia está asociada a un número de acceso en diferentes momentos, se entiende la secuencia asociada al número de acceso en la fecha de presentación efectiva de esta solicitud, entendiéndose por fecha de presentación efectiva la fecha de presentación real o una fecha anterior de presentación de una solicitud de prioridad que divulgue el número de acceso en cuestión. La invención puede modificarse dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal (mAb) que se une al receptor de muerte 4 (DR4) y que comprende una región variable (V) de cadena ligera con tres CDR de la secuencia de la región V de cadena ligera de SEQ ID NO:5, es decir, SASQDITNYLN, YTSSLHS y HQYSKLPWT, y una región V de cadena pesada con tres CDR de la secuencia de la región V de cadena pesada de SEQ ID NO:8, es decir, NYYIN, WIYPGIGDIKYNEKFKG y SGWAWFVD,

que comprende una región constante humana con una doble mutación que aumenta la unión al receptor FcyRIIb humano, donde la región constante humana es una región constante gamma-I y la doble mutación es S267E/L328F según la numeración de Kabat con índice EU, y

donde la región V de cadena ligera tiene una secuencia al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:6 y la región V de cadena pesada tiene una secuencia al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10, donde las posiciones de cadena ligera 48 y 71 por numeración de Kabat están ocupadas por V e Y respectivamente, y las posiciones de cadena pesada 48 y 71 por numeración de Kabat están ocupadas por L y A respectivamente.

2. El mAb de la reivindicación 1, que es un anticuerpo humanizado.

3. El mAb de la reivindicación 2, en donde la región V de la cadena ligera tiene la secuencia de SEQ ID NO:6 y la región V de la cadena pesada tiene la secuencia de SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10.

4. El mAb de la reivindicación 1, que inhibe el crecimiento de un xenoinjerto tumoral humano en un ratón.

5. El mAb de la reivindicación 1, que es un anticuerpo biespecífico.

6. El mAb de la reivindicación 1, 2 o 4, que reduce la viabilidad celular de las células tumorales humanas mejor que el mismo mAb pero que contiene solo la mutación S267E, cuando está en presencia de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas.

7. El mAb de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la región constante de la cadena pesada tiene la secuencia de los residuos 256-585 de la SEQ ID NO:34.

8. El mAb de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la región constante de la cadena pesada tiene la secuencia de los residuos 256-584 de la SEQ ID NO:34.

9. Una composición farmacéutica que comprende el mAb según se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

10. La composición farmacéutica de la reivindicación 9 para su uso como medicamento.

11. La composición farmacéutica de la reivindicación 9 para su uso en el tratamiento del cáncer.