ES3024991T3 - Methods and kits for determining the efficiency of plasma separation from whole blood - Google Patents

Abstract

Se proporcionan métodos y kits para determinar la eficiencia de la separación de plasma de la sangre completa mediante la amplificación por PCR en tiempo real de dos amplicones: uno corto (p. ej., 70-150 bps) y otro largo (p. ej., 350-600 bps). La eficiencia de separación se determina en función de la diferencia en los patrones de amplificación de ambos amplicones. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y kits para determinar la eficacia de la separación de plasma a partir de sangre completa

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un ensayo de PCR en tiempo real para evaluar si una muestra de plasma está lo suficientemente separada de la fracción celular de la sangre completa. La presente invención es ventajosa para las pruebas de diagnóstico que requieren la utilización de ADN libre de células circulantes.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El ADN circulante libre de células (ADNcf) es el ADN liberado tanto por células normales como tumorales a la circulación sanguínea. El origen del ADNcf en la sangre no se comprende del todo, pero se cree que está relacionado con la apoptosis, la necrosis y la liberación activa de las células. La presencia de ADNcf en sangre se conoce desde hace décadas, sin embargo su verdadero potencial de diagnóstico no se ha conocido hasta los últimos años, lo que ha provocado un creciente interés en la detección y análisis del ADNcf. Por ejemplo, el ADNcf fetal presente en la sangre materna se usa actualmente para el diagnóstico prenatal no invasivo, y están en marcha estudios clínicos que usan ADNcf derivado de tumores como marcadores sustitutos en pacientes con cáncer.

El análisis del ADNcf requiere en primer lugar la separación del plasma (que contiene el ADNcf) de la sangre completa. Tradicionalmente, el plasma se separa de la sangre por centrifugación o filtración. Actualmente están apareciendo métodos microfluídicos más modernos. Después de la separación, el ADNcf puede purificarse adicionalmente mediante extracción antes de su análisis posterior.

La separación eficaz del ADNcf de la fracción celular de la sangre es muy importante para la calidad del análisis de ADNcf. La contaminación del plasma con ADN liberado de los glóbulos blancos entre el momento de la extracción de sangre y el procesamiento del plasma disminuye la proporción de ADNcf en la muestra y aumenta el ruido y las imprecisiones del análisis de ADNcf. Para evaluar la eficacia de la separación, típicamente se realizan recuentos de células sanguíneas, ya sea manualmente usando un hemocitómetro o automáticamente usando un citómetro de flujo. Sin embargo, tales métodos presentan una serie de inconvenientes, ya que algunos son laboriosos y caros y otros no son suficientemente precisos.

Los estudios han demostrado que el ADNcf circulante está formado en su mayoría por fragmentos de menos de 300 bps de longitud, e incluso de menos de 200 bps (Chan et al., 2004, Clinical Chemistry, 50(1): 88-92), mientras que el<a>D<n>procedente de los glóbulos blancos es en su mayoría fragmentos largos de más de 10 Kbs.

Se ha sugerido la electroforesis en gel, en la que el ADN se separa sobre la base del tamaño molecular, para determinar la eficacia de la separación, detectando la presencia de fragmentos de ADN largos frente a los cortos. Sin embargo, este método requiere grandes cantidades de ADN, lo que supone una gran dificultad cuando se trabaja con ADN circulante libre de células.

Norton et al. (2013, Clinical Biochemistry, 46: 1561-1565) estudiaron la capacidad de un agente estabilizador para prevenir la contaminación del ADN libre de células (ADNcf) por ADN genómico celular (ADNg) durante el almacenamiento y envío de muestras de sangre. La contaminación por ADNg se evaluó mediante PCR digital. En concreto, se usó la tecnología de PCR digital para cuantificar el ADNg contaminante mediante la amplificación de un fragmento de ADN de 420 bps del gen de la p-actina. Se usó un segundo ensayo de PCR digital para cuantificar el ADNcf mediante la amplificación de un amplicón de p-actina 136 bps más corto. Usando estos ensayos, se determinó la calidad de una muestra de ADNcf de plasma, para evaluar el grado de contaminación por ADNg. El documento US2016/186239A1 se refiere a un ensayo multiplexado para cuantificar y evaluar la integridad del ADN libre de células en fluidos biológicos para el diagnóstico, pronóstico y vigilancia del cáncer.

Hay una necesidad de métodos y kits mejorados para determinar la eficacia de la separación del plasma de la sangre completa, que sean sencillos de utilizar, rentables y precisos.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

La presente invención proporciona un método para determinar la eficacia de la separación de plasma a partir de sangre completa, el método comprendiendo:

(a) obtener ADN a partir de una muestra de plasma;

(b) generar mediante coamplificación por PCR:

(i) un primer producto de amplificación de 70-150 bps a partir de un primer locus genómico usando un primer par de cebadores, y

(ii) un segundo producto de amplificación de por lo menos 350 bps a partir de un segundo locus genómico usando un segundo par de cebadores;

(c) calcular una intensidad de señal para cada uno de dichos primer y segundo productos de amplificación; y (d) determinar que la muestra de plasma está separada cuando la diferencia entre las intensidades de señal se encuentra por encima de un umbral predefinido,

en donde dichos primer y segundo productos de amplificación producen diferencias de intensidad de señal distintas para el ADN plasmático y el ADN de sangre completa.

La presente invención también proporciona un kit para determinar la eficacia de la separación de plasma a partir de sangre completa, que comprende:

(i) un primer par de cebadores, para generar por PCR un primer producto de amplificación de 70-150 bps a partir de un primer locus genómico, en donde el primer producto de amplificación comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ iD NO: 1 y la SEQ ID NO: 10;

(ii) un segundo par de cebadores, para generar por PCR un segundo producto de amplificación de por lo menos 350 bps a partir de un segundo locus genómico, en donde el segundo producto de amplificación comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9; y

(iii) sondas para detectar el primer y el segundo productos de amplificación, para determinar una intensidad de señal para cada producto de amplificación,

en donde el primer y el segundo productos de amplificación producen diferencias de intensidad de señal distintas para el ADN plasmático y el ADN de sangre completa

En algunas realizaciones, hay métodos y kits como se define en las reivindicaciones anexas para determinar la eficacia de la separación del plasma de la sangre completa usando amplificación cuantitativa por PCR de dos amplicones, concretamente, un amplicón corto de 70-150 bps y un amplicón largo de, por ejemplo, 350-600 bps. La eficacia de la separación se determina sobre la base de la diferencia en los niveles de amplificación de los dos amplicones. Ventajosamente, la eficacia de separación se determina sin cuantificación absoluta del ADN y/o determinación del número de copias de cualquier gen/locus.

El ADN de la fracción plasmática de la sangre está formado principalmente por fragmentos cortos de ADN libre de células, de hasta aproximadamente 300 bps de longitud. Cuando la fracción plasmática no está bien separada de los componentes celulares de la sangre, el plasma contiene además ADN procedente de los glóbulos blancos. Este último es en su mayoría fragmentos largos de más de 10 Kbs. Por tanto, la presencia de fragmentos largos de ADN en una muestra de plasma proporciona una indicación referente a la eficacia de la separación del plasma de la sangre completa.

En los métodos divulgados en la presente, los amplicones cortos y largos de una muestra de plasma analizada se coamplifican y se analizan los patrones de amplificación. De acuerdo con los métodos divulgados en la presente, en muestras de plasma que están bien separadas de la fracción celular de la sangre, se observa una diferencia significativa en los niveles de amplificación de los dos amplicones, donde el amplicón corto se amplifica con mayor eficiencia en comparación con el amplicón largo. Sin querer estar limitados por ninguna teoría o mecanismo de acción, la diferencia en los niveles de amplificación refleja la proporción de ADN corto libre de células con respecto al ADN largo procedente de los glóbulos blancos en la muestra de plasma analizada y es, por lo tanto, indicativa de la eficacia de la separación del plasma.

Ventajosamente, la diferencia en los niveles de amplificación se calcula entre amplicones coamplificados a partir de la misma plantilla de ADN en la misma mezcla de reacción (es decir, bajo las mismas condiciones de reacción). Esta configuración hace que los métodos divulgados en la presente sean insensibles a varios factores de "ruido", como los cambios en la concentración de ADN plantilla, las condiciones de PCR y la presencia de impurezas/inhibidores. Cabe señalar que los métodos de la invención no requieren en ningún momento la cuantificación absoluta del ADN y/o la determinación del número de copias de ningún gen/locus. Por lo tanto, ninguna cantidad, concentración y/o número de copias reales de cualquier locus genómico están asociados con los métodos de la invención. Por lo tanto, los métodos divulgados en la presente eliminan la necesidad de curvas estándar y/o pasos laboriosos adicionales implicados en la cuantificación absoluta, ofreciendo de este modo un procedimiento sencillo y rentable sin comprometer la sensibilidad, la calidad y/o la precisión. Además, al emplear la PCR en tiempo real, los métodos son eficaces para cualquier concentración de ADN plantilla y no requieren diluciones u otros ajustes de la plantilla.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un método para determinar la eficacia de la separación de plasma a partir de sangre completa, el método comprendiendo:

(a) obtener ADN de una muestra de plasma;

(b) generar mediante coamplificación por PCR:

(i) un primer producto de amplificación de 70-150 bps a partir de un primer locus genómico usando un primer par de cebadores, y

(ii) un segundo producto de amplificación de por lo menos 350 bps a partir de un segundo locus genómico usando un segundo par de cebadores;

(c) calcular una intensidad de señal para cada uno de dichos primer y segundo productos de amplificación; y (d) determinar que la muestra de plasma está separada cuando la diferencia entre las intensidades de las señales es superior a un umbral predefinido,

en donde el primer y el segundo productos de amplificación producen diferencias de intensidad de señal distintas para el ADN plasmático y el ADN de sangre completa.

En algunas realizaciones, el paso (b) se lleva a cabo mediante PCR en tiempo real. En algunas realizaciones, cuando el paso (b) se realiza usando PCR en tiempo real, el método comprende además añadir sondas fluorescentes para detectar específicamente el primer y el segundo productos de amplificación.

En algunas realizaciones, cuando el paso (b) se lleva a cabo usando PCR en tiempo real, la intensidad de la señal es el ciclo de cuantificación (Cq), y se determina que la muestra de plasma está separada basándose en la diferencia entre los valores Cq (ACq) del primer y el segundo productos de amplificación. En algunas realizaciones, se determina que la muestra de plasma está separada cuando el ACq (Cq(segundo) - Cq(primero)) está por encima de un umbral predefinido ACq.

En algunas realizaciones, el primer y el segundo pares de cebadores tienen la misma eficacia.

En algunas realizaciones, el primer producto de amplificación tiene 100-150 bps.

En algunas realizaciones, el segundo producto de amplificación tiene 350-700 bps. En algunas realizaciones, el segundo producto de amplificación tiene 350-650 bps. En algunas realizaciones, el segundo producto de amplificación tiene 350-550 bps.

En algunas realizaciones, el primer producto de amplificación comprende una seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 10. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención. En algunas realizaciones, el primer producto de amplificación consiste en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 10. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención.

En algunas realizaciones, el segundo producto de amplificación comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2, la<s>E<q>ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8 y la SEQ ID NO: 9. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención. En algunas realizaciones, el segundo producto de amplificación consiste en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 9. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención.

En algunas realizaciones, el primer y el segundo productos de amplificación comprenden secuencias como las expuestas en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, respectivamente. En algunas realizaciones particulares, el primer y el segundo productos de amplificación consisten en secuencias como las expuestas en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, respectivamente.

En algunas realizaciones, la muestra de plasma se deriva de una muestra de sangre humana.

De acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona un kit como se define en la presente reivindicación 9, para determinar la eficiencia de la separación de plasma a partir de sangre completa, que comprende:

(i) un primer par de cebadores, para generar por PCR un primer producto de amplificación de 70-150 bps a partir de un primer locus genómico;

(ii) un segundo par de cebadores, para generar por PCR un segundo producto de amplificación de por lo menos 350 bps, a partir de un segundo locus genómico; y

(iii) sondas para detectar el primer y el segundo productos de amplificación, para determinar una intensidad de señal para cada producto de amplificación,

en donde el primer y el segundo productos de amplificación definidos en la presente reivindicación 9 producen diferencias de intensidad de señal distintas para el ADN plasmático y el ADN de sangre completa.

En algunas realizaciones, el kit comprende además un manual de instrucciones que dirige la correlación entre las diferencias de intensidad de señal y el nivel de separación. En algunas realizaciones, el manual de instrucciones proporciona una diferencia de intensidad de señal umbral entre el primer y el segundo productos de amplificación, por encima de la cual se determina que una muestra de plasma está separada. En algunas realizaciones particulares, el manual de instrucciones proporciona un ACq umbral (Cq(segundo) -Cq(primero)), por encima del cual se determina que una muestra de plasma está separada.

En algunas realizaciones, las sondas son sondas de oligonucleótidos marcadas con fluorescencia.

En algunas realizaciones, el primero y el segundo pares de cebadores tienen la misma eficacia.

En algunas realizaciones, el primer producto de amplificación tiene 100-150 bps.

En algunas realizaciones, el segundo producto de amplificación tiene 350-700 bps. En algunas realizaciones, el segundo producto de amplificación tiene 350-650 bps. En algunas realizaciones, el segundo producto de amplificación tiene 350-550 bps.

De acuerdo con la reivindicación 9 de la presente invención, el primer producto de amplificación comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 10. En algunas realizaciones, el primer producto de amplificación consiste en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 10.

De acuerdo con la reivindicación 9 de la presente invención, el segundo producto de amplificación comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 7, la<s>E<q>ID NO: 8 y la SEQ ID NO: 9. En algunas realizaciones, el segundo producto de amplificación consiste en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 9.

En algunas realizaciones, el primer y el segundo productos de amplificación comprenden secuencias como se expone en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, respectivamente. En algunas realizaciones particulares, el primer y el segundo productos de amplificación consisten en secuencias como se expone en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, respectivamente.

En algunas realizaciones, el primer par de cebadores es la SEQ ID NO: 3 (directo) y la SEQ ID NO: 4 (inverso).

En algunas realizaciones, el segundo par de cebadores es la SEQ ID NO: 5 (directo) y la SEQ ID NO: 6 (inverso).

En algunas realizaciones, el primer par de cebadores es la SEQ ID NO: 3 (directo) y la SEQ ID NO: 4 (inverso), y el segundo par de cebadores es la SEQ ID NO: 5 (directo) y la SEQ ID NO: 6 (inverso).

Estos aspectos y características y otros adicionales de la presente invención resultarán evidentes a partir de la descripción detallada, los ejemplos y las reivindicaciones que siguen.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1A-C. Gráficos de PCR cuantitativa ejemplares de productos de amplificación cortos ("JOE") y largos ("FAM") en muestras de ADN plasmático (A), plasma contaminado con leucocitos (B) y ADN de sangre completa (C).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a la determinación de la eficacia de la separación del plasma de la fracción celular de la sangre completa usando amplificación por PCR en tiempo real de dos amplicones, concretamente, un amplicón corto de 70-150 bps y un amplicón largo de por lo menos 350 bps.

El ADN que se encuentra en el plasma ("ADN plasmático") es principalmente ADN libre de células, que típicamente incluye fragmentos de ADN de menos de 300 bps de longitud. En cambio, el ADN en la sangre completa ("ADN de sangre completa") es en su mayor parte ADN liberado por los glóbulos blancos, que incluye típicamente fragmentos de ADN de más de 10Kb. La diferencia en el contenido de ADN entre el plasma y la sangre completa en términos de la proporción de fragmentos de ADN cortos frente a los largos establece diferentes patrones de amplificación de los amplicones cortos y largos, lo que permite determinar la eficacia de separación de una muestra de plasma de los componentes celulares de la sangre.

Como se usa en la presente, los términos "ADN libre de células" y "ADN libre de células circulante" (abreviado "ADNcf') se usan indistintamente y se refieren a moléculas de ADN que circulan libremente en la sangre. Las moléculas de ADN libre de células tienen en su mayoría menos de 400 bps de longitud, e incluso menos de 300 bps, o incluso menos de 200 bps.

Como se usa en la presente, los términos "ADN de glóbulos blancos", "ADN de glóbulos blancos contaminante" y similares se refieren al ADN liberado de los glóbulos blancos. El ADN de los glóbulos blancos se compone principalmente de fragmentos de ADN de más de 10Kb de longitud.

Como se usan en la presente, las frases "determinar la eficacia de la separación del plasma", "determinar que una muestra de plasma está separada", "determinar que una muestra de plasma está suficientemente/eficientemente separada" y similares son intercambiables y se refieren a determinar que el nivel de ADN de glóbulos blancos contaminante en el plasma es tal que no interfiere con el análisis del ADN libre de células. Se observa que diferentes aplicaciones de diagnóstico que implican el análisis del ADN libre de células pueden requerir diferentes niveles de pureza del plasma (es decir, pueden caracterizarse por diferentes niveles de contaminación por ADN de glóbulos blancos que son tolerados). Así, un umbral por encima del cual se determina que una muestra de plasma está separada, como un ACq umbral entre los amplicones cortos y largos amplificados de acuerdo con la presente invención, puede ser diferente para diferentes ensayos. El umbral puede establecerse basándose en los requisitos de un ensayo de diagnóstico particular.

Selección del primer y segundo loci genómicos y diseño de cebadores para producir amplicones cortos y largos:

El ensayo para evaluar la calidad de la separación del plasma descrito en la presente incluye una PCR dúplex con cebadores que producen un amplicón corto (por ejemplo, ~100bp) de un primer locus genómico y un amplicón largo (por ejemplo, ~500bp) de un segundo locus genómico. Los amplicones cortos y largos producen diferencias de intensidad de señal distintas para el ADN plasmático y el ADN de sangre completa, como valores de ACq distintos para el ADN plasmático y el ADN de sangre completa.

El ADN del plasma no es simplemente ADN genómico fragmentado, sino que es una representación sesgada del genoma, en la que algunos loci genómicos están infrarrepresentados y otros loci genómicos están sobrerrepresentados con respecto al ADN de sangre completa Los pares de amplicones cortos y largos que producen valores de ACq distintos para el ADN plasmático y el de sangre completa incluyen pares de amplicones cortos y largos procedentes de loci genómicos representados por igual en el ADN plasmático, y pares de amplicones cortos y largos en los que el amplicón largo procede de un locus genómico infrarrepresentado en el ADN plasmático en comparación con el locus genómico del amplicón corto.

Cuando estos pares de loci se amplifican con cebadores que tienen la misma eficacia, las diferencias en sus niveles de amplificación reflejan la proporción de fragmentos de ADN cortos frente a largos en la muestra, donde un menor nivel de amplificación del amplicón largo refleja una menor cantidad de fragmentos de ADN largos en la muestra y, en consecuencia, una mejor separación del plasma.

Por tanto, en algunas realizaciones, el primer y el segundo loci genómicos están representados por igual en el ADN plasmático. En realizaciones adicionales, el segundo locus genómico está infrarrepresentado en el ADN plasmático en comparación con el primer locus. De acuerdo con algunas realizaciones, el método de la presente invención comprende: (a) obtener a Dn de una muestra de plasma; (b) generar mediante coamplificación por PCR un primer producto de amplificación de 70- 150 bps a partir de un primer locus genómico usando un primer par de cebadores y un segundo producto de amplificación de por lo menos 350 bps a partir de un segundo locus genómico usando un segundo par de cebadores, en donde dichos primer y segundo loci genómicos están representados por iguale en el ADN plasmático o el segundo locus genómico está infrarrepresentado en el ADN plasmático en comparación con el primer locus; (c) calcular una intensidad de señal para cada uno de dichos primer y segundo productos de amplificación; y d) determinar que la muestra de plasma está separada cuando la diferencia entre las intensidades de señal está por encima de un umbral predefinido.

En algunas realizaciones, el método de la presente invención comprende: (a) obtener ADN de una muestra de plasma; b) generar mediante amplificación por PCR en tiempo real un primer producto de amplificación de 70-150 bps a partir de un primer locus genómico usando un primer par de cebadores y un segundo producto de amplificación de por lo menos 350 bps a partir de un segundo locus genómico usando un segundo par de cebadores, en donde dichos primer y segundo loci genómicos están representados por igual en el ADN plasmático o el segundo locus genómico está infrarrepresentado en el ADN plasmático en comparación con el primer locus; (c) calcular un valor Cq para cada uno de dichos primer y segundo productos de amplificación; y d) determinar que la muestra de plasma está separada cuando el ACq (Cq(segundo) - Cq(primero) está por encima de un umbral predefinido ACq.

En algunas realizaciones, en la presente se proporciona un método para analizar una muestra de plasma, que comprende: (a) obtener ADN de una muestra de plasma; (b) generar mediante amplificación por PCR en tiempo real un primer producto de amplificación de 70-150 bps a partir de un primer locus genómico usando un primer par de cebadores y un segundo producto de amplificación de por lo menos 350 bps a partir de un segundo locus genómico usando un segundo par de cebadores, en donde dichos primer y segundo loci genómicos están representados por igual en el ADN plasmático o el segundo locus genómico está infrarrepresentado en el ADN plasmático en comparación con el primer locus; (c) determinar un valor de Cq para cada uno de dichos primer y segundo productos de amplificación; y opcionalmente (d) calcular ACq (Cq(segundo) - Cq(primero)), en donde el primer y el segundo productos de amplificación producen ACq distintos para el ADN plasmático y el ADN de sangre completa.

La selección de dos loci genómicos que están representados por igual en el ADN plasmático libre de células y el diseño de amplicones cortos y largos a partir de estos loci puede realizarse, por ejemplo, de la siguiente manera:

1. Eligiendo pares aleatorios de loci genómicos. Pueden seleccionarse, por ejemplo, loci con un contenido de GC de entre el 30 y el 60%;

2. Diseñando pares de cebadores para su amplificación que produzcan amplicones cortos (~100bp);

3. Determinando la eficacia de los pares de cebadores en la PCR sobre ADN de sangre completa en reacciones de multiplexación simple (separadas).

Los métodos para determinar la eficacia de los cebadores son conocidos en la técnica. Por ejemplo, la eficacia de un par de cebadores puede determinarse (i) seleccionando una concentración particular de los cebadores; (ii) realizando reacciones de PCR en tiempo real en diluciones en serie de un ADN plantilla (por ejemplo, ADN de sangre completa) y determinando los valores de Cq para cada reacción (cada dilución); (ii) generando una curva estándar trazando los valores de Cq frente al logaritmo de la cantidad inicial del plantilla para cada dilución; (iv) calculando una pendiente para la curva estándar; y (v) determinando la eficacia de la reacción basándose en la pendiente. Típicamente, la eficacia se calcula usando la siguiente fórmula: Eficacia = 10<-1/Pendiente>. La eficacia de la amplificación también se presenta con frecuencia como un porcentaje, es decir, el porcentaje de plantilla que se amplificó en cada ciclo. Para calcular un porcentaje se aplica la siguiente fórmula: % Eficacia = (Eficacia -1 ) x 100.

4. Eliminando pares de loci genómicos para los que la eficacia de los cebadores no es igual, y continuando con pares de loci genómicos para los que la eficacia de los cebadores es igual;

5. Para cada par de loci genómicos, comparando el número de copias de los loci en el ADN plasmático y eliminando los pares con números de copias diferentes (en otras palabras, eliminando los pares con un sesgo de representación en el ADN plasmático, en el que uno de los loci está sobrerrepresentado en el ADN plasmático en comparación con el otro, y seleccionando los pares con igual representación en el ADN plasmático).

La evaluación de las diferencias en el número de copias en el ADN plasmático puede realizarse, por ejemplo: (i) amplificando cuantitativamente los loci genómicos del ADN plasmático y del ADN de sangre completa usando los cebadores seleccionados en los pasos anteriores que amplifican amplicones cortos de cada locus con igual eficacia; (ii) Para cada muestra de ADN (ADN plasmático o ADN de sangre completa), calculando un ACq entre los dos loci; y (iii) determinando la diferencia en el número de copias de acuerdo con el ACq en el ADN plasmático frente al ACq en el ADN de sangre completa.

6. Para un par seleccionado de loci genómicos que se comprobó que estaban igualmente representados en el ADN plasmático en el paso anterior, diseñando cebadores para un amplicón largo (> 350 bp) para uno de los loci genómicos del par;

7. Determinando la eficacia de los cebadores del amplicón largo en el ADN de sangre completa, como se ha descrito anteriormente;

8. Calibrando las eficacias de los cebadores del amplicón corto y de los cebadores del amplicón largo hasta que se logre la misma eficacia. La eficacia puede modificarse cambiando ligeramente las secuencias de los cebadores, por ejemplo añadiendo/eliminando bases de los extremos 5' o 3' de los cebadores. Alternativa o adicionalmente, para lograr la misma eficacia puede ajustarse la concentración de cebadores.

Los cebadores resultantes amplifican con la misma eficacia (aunque con amplicones de diferente tamaño) dos loci genómicos que están representados por igual en el ADN plasmático

El diseño de pares de amplicones cortos y largos en los que el amplicón largo procede de un locus genómico infrarrepresentado en el ADN plasmático en comparación con el locus genómico del amplicón corto puede realizarse, por ejemplo, de la siguiente manera:

1. Eligiendo pares aleatorios de loci genómicos;

2. Diseñando cebadores para su amplificación que produzcan amplicones cortos (~100bp);

3. Determinando la eficacia de los cebadores en la PCR sobre ADN de sangre completa en reacciones de multiplexación simple (separadas), como se ha descrito anteriormente.

4. Eliminando los pares de loci genómicos para los que la eficacia de los cebadores no es igual, y continuando con los pares de loci genómicos para los que la eficacia de los cebadores es igual;

5. Para cada par de loci genómicos, comparando el número de copias de los loci en el ADN plasmático (como se ha descrito anteriormente) y seleccionando pares con números de copias diferentes, en los que uno de los loci esté infrarrepresentado en el ADN plasmático en comparación con el otro;

6. Para un par de loci seleccionados, diseñando de cebadores para un amplicón largo (> 350 pb) para el locus genómico que se descubrió que estaba infrarrepresentado en comparación con el otro;

7. Determinando la eficacia de los cebadores del amplicón largo en el ADN de sangre completa, como se ha descrito anteriormente;

8. Calibrando las eficacias de los cebadores del amplicón corto y de los cebadores del amplicón largo hasta que se logre la misma eficacia. La eficacia puede modificarse cambiando ligeramente las secuencias de los cebadores, por ejemplo añadiendo/eliminando bases de los extremos 5' o 3' de los cebadores. Alternativa o adicionalmente, para lograr la misma eficacia puede ajustarse la concentración de cebadores.

Como se ha detallado anteriormente, la eficacia de los cebadores/reacciones de PCR puede medirse mediante métodos conocidos (por ejemplo, generando una curva estándar y calculando la eficacia basándose en la pendiente de la curva estándar), y expresarse como un valor numérico o como un porcentaje. Como se usa en la presente, el término "igual eficacia" con respecto a la eficacia de amplificación/eficacia del cebador se refiere a la misma eficacia exacta (por ejemplo, el mismo porcentaje de eficacia) y también a diferencias de hasta el 5% en la eficacia. "Cebadores de igual eficacia" abarca el ajuste de la secuencia del cebador y/o la concentración en la reacción para lograr igual eficacia. Los cebadores de igual eficacia evitan ventajosamente el sesgo de los resultados debido a la eficacia del cebador.

Como se usa en la presente, el término "representado por igual en el ADN plasmático" con respecto a los loci genómicos se refiere a los loci genómicos que tienen el mismo número de copias en el ADN plasmático. El término abarca exactamente la misma representación (es decir, el número exacto de copias) y también diferencias de hasta el 5% en la representación. El término "infrarrepresentado en el ADN plasmático", en referencia a un determinado locus en comparación con otro locus, indica que este determinado locus tiene un número de copias inferior en el ADN plasmático en comparación con el otro locus. El término indica una diferencia de más del 5% en la representación.

El número de copias puede medirse mediante métodos conocidos, por ejemplo, como se ha detallado con anterioridad.

Al diseñar los productos de amplificación cortos y largos para su uso con los métodos de la presente invención, puede tenerse en cuenta el contenido de CG de la secuencia amplificada. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el contenido de CG de cada producto de amplificación es de menos del 50%.

Procesamiento de muestras de plasma

Como se usa en la presente, los términos "sangre completa" y "sangre" se refieren a una muestra de sangre que no ha sido fraccionada y que contiene tanto componentes celulares (glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas) como componentes fluidos.

El término "plasma" se refiere al líquido que queda después de someter una muestra de sangre completa a un proceso de separación para eliminar las células sanguíneas.

De acuerdo con algunas realizaciones, las muestras de plasma que se van a analizar usando los métodos de la presente invención provienen de sujetos humanos. De acuerdo con algunas realizaciones, las muestras de plasma proceden de sujetos con una enfermedad maligna, como un tipo particular de cáncer, o de sujetos que se sospecha que padecen una enfermedad maligna, como uno o más tipos de cáncer. De acuerdo con realizaciones adicionales, las muestras de plasma proceden de sujetos sanos. El término "sujetos sanos", como se usa en la presente, se refiere a sujetos a los que no se les ha diagnosticado una enfermedad maligna como un cierto tipo de cáncer y/o sujetos que no se sospecha que tienen cáncer, y/o sujetos no susceptibles de tener cáncer.

Las muestras de plasma pueden ser muestras separadas de sangre completa usando cualquier método de separación. En la sección Ejemplos a continuación se describe un procedimiento ejemplar. La muestra de plasma puede ser una muestra recién aislada o una muestra que se almacenó durante un cierto período de tiempo antes del análisis.

Los términos "ADN de", "ADN obtenido de" y similares se refieren al ADN aislado de una muestra de plasma (por ejemplo, extraído del plasma usando métodos conocidos en la técnica), así como a una muestra de plasma tal cual, es decir, una muestra de plasma que contiene ADN.

En algunas realizaciones, los métodos de la presente invención comprenden proporcionar una muestra de plasma. En algunas realizaciones, los métodos de la presente invención comprenden proporcionar ADN de una muestra de plasma.

Generación de productos de amplificación

Los métodos divulgados en la presente comprenden, de acuerdo con algunas realizaciones, coamplificar un amplicón de 70-150 bps a partir de un primer locus genómico usando un primer par de cebadores, y un amplicón de 350-650 bps a partir de un segundo locus genómico usando un segundo par de cebadores.

El primer y el segundo productos de amplificación de la presente invención se generan por amplificación usando pares de cebadores inversos y directos diseñados como se conoce en la técnica para generar específicamente cada producto de amplificación.

La longitud del primer producto de amplificación (corto) se encuentra típicamente entre 70-150 bps, por ejemplo entre 80-150 bps, 100-150 bps, 100-130 bps. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención.

La longitud de los segundos productos de amplificación (largos) es de por lo menos 350 bps, típicamente entre 350-750 bps, entre 350-650 bps, entre 350-600 bps, 350-550 bps o 400- 500 bps. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención.

En algunas realizaciones, el primer producto de amplificación comprende una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el primer producto de amplificación consiste en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el primer producto de amplificación comprende una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 10. En algunas realizaciones, el primer producto de amplificación consiste en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 10.

En algunas realizaciones, el segundo producto de amplificación comprende una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, el segundo producto de amplificación consiste en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, el segundo producto de amplificación comprende una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 7. En algunas realizaciones, el segundo producto de amplificación consiste en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 7. En algunas realizaciones, el segundo producto de amplificación comprende una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, el segundo producto de amplificación consiste en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, el segundo producto de amplificación comprende una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 9. En algunas realizaciones, el segundo producto de amplificación consiste en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 9.

En algunas realizaciones, el primer y el segundo productos de amplificación comprenden secuencias como se expone en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, respectivamente. En realizaciones adicionales, el primer y el segundo productos de amplificación consisten en las secuencias como se expone en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, respectivamente.

En algunas realizaciones, el par de cebadores para amplificar el primer producto de amplificación es: SEQ ID NO: 3 (directo) y SEQ ID NO: 4 (inverso).

En algunas realizaciones, el par de cebadores para amplificar el segundo producto de amplificación es: SEQ ID NO: 5 (directo) y SEQ ID NO: 6 (inverso).

En las muestras de plasma contaminadas con altos niveles de ADN de glóbulos blancos, en la muestra se encuentran fragmentos de a Dn tanto cortos como largos, lo que da como resultado una amplificación eficaz tanto de los productos de amplificación cortos como de los largos. En muestras de plasma bien separadas de la fracción celular de la sangre, hay principalmente (o sólo) fragmentos cortos de ADN libre de células. En tales muestras, el producto de amplificación corto se amplifica con mayor eficacia en comparación con el producto de amplificación largo. Cuanto mejor sea la separación de la muestra de plasma, mejor será la amplificación del producto de amplificación corto en comparación con el producto de amplificación largo, lo que se refleja, por ejemplo, en el aumento de los valores de delta Cq entre el Cq del amplicón largo y el Cq del amplicón corto (Cq (largo)-Cq (corto)) después de PCR cuantitativa en tiempo real.

Los términos "locus genómico" o "locus" como se usan en la presente son intercambiables y se refieren a una secuencia de ADN en una posición específica en un cromosoma. La posición específica puede identificarse por la localización molecular, es decir, por los números de los pares de bases inicial y final en el cromosoma. Una variante de una secuencia de ADN en una posición genómica dada se denomina alelo. Los alelos de un locus se localizan en sitios idénticos en cromosomas homólogos. Los loci incluyen secuencias de genes, así como otros elementos genéticos (por ejemplo, secuencias intergénicas).

Como se usa en la presente, "amplificación" se refiere a un aumento del número de copias de una o más secuencias de ácido nucleico de interés. La amplificación se realiza típicamente por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en presencia de una mezcla de reacción PCR que puede incluir un tampón adecuado suplementado con una plantilla de ADN, una polimerasa (habitualmente Taq Polimerasa), dNTPs, cebadores y sondas (según proceda), como se conoce en la técnica.

El término "polinucleótido", como se usa en la presente, incluye formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. El término "oligonucleótido" también se usa en la presente para incluir una forma polimérica de nucleótidos, típicamente de hasta 100 bases de longitud.

Los términos "producto de amplificación" y "amplicón" se usan indistintamente y se refieren colectivamente a moléculas de ácido nucleico de una secuencia diana particular que se generan y acumulan en una reacción de amplificación. Los términos se refieren de manera general a moléculas de ácido nucleico generadas por PCR usando un conjunto dado de cebadores de amplificación.

Como se usa en la presente, un "cebador" define un oligonucleótido que es capaz de aparearse (hibridar) con una secuencia diana, creando de este modo una región de cadena doble que puede servir como punto de inicio para la síntesis de ADN en condiciones adecuadas. La terminología "par de cebadores" se refiere en la presente a un par de oligonucleótidos que se seleccionan para ser usados juntos en la amplificación de una secuencia de ácido nucleico seleccionada mediante uno de una serie de tipos de procesos de amplificación, preferiblemente PCR. Como se conoce comúnmente en la técnica, los cebadores pueden estar diseñados para que se unan a una secuencia complementaria en condiciones seleccionadas.

Los cebadores pueden tener cualquier longitud adecuada, dependiendo del formato particular del ensayo y de las necesidades particulares. En algunas realizaciones, los cebadores pueden incluir por lo menos 15 nucleótidos de longitud, preferiblemente entre 19-25 nucleótidos de longitud. Los cebadores pueden adaptarse especialmente a un sistema de amplificación de ácidos nucleicos elegido. Como es comúnmente conocido en la técnica, los cebadores de oligonucleótidos pueden diseñarse teniendo en cuenta el punto de fusión de la hibridación de los mismos con su secuencia diana.

Los métodos divulgados en la presente implican la amplificación simultánea de más de una secuencia diana (primer y segundo productos de amplificación) en la misma mezcla de reacción, un proceso conocido como amplificación múltiple o coamplificación. Este proceso requiere el uso simultáneo de dos pares de cebadores. Como se sabe en la técnica, los cebadores pueden diseñarse de tal manera que puedan trabajar a la misma temperatura de apareamiento durante la amplificación. En algunas realizaciones, en el método divulgado en al presente se usan cebadores con una temperatura de fusión (Tm) similar. Para los cebadores usados en un conjunto una variación de Tm de entre aproximadamente 3°-5°C se considera aceptable.

De acuerdo con algunas realizaciones, la amplificación de los loci genómicos se lleva a cabo usando PCR en tiempo real (RT-PCR), también conocida como PCR cuantitativa (qPCR), en la que se realizan simultáneamente la amplificación y la detección de los productos de amplificación.

En algunas realizaciones, la detección de los productos de amplificación en la RT-PCR puede lograrse usando sondas de polinucleótidos, típicamente sondas de polinucleótidos marcadas con fluorescencia.

Como se usa en la presente, "sondas de polinucleótidos" o "sondas de oligonucleótidos" son intercambiables y se refieren a polinucleótidos marcados que son complementarios con subsecuencias específicas dentro de las secuencias de ácido nucleico de los loci de interés, por ejemplo, dentro de las secuencias del primer (corto) y del segundo (largo) loci genómicos descritos en la presente. En algunas realizaciones, la detección se logra usando ensayos TaqMan basados en moléculas combinadas reporteras y supresoras (Roche Molecular Systems Inc.). En tales ensayos, las sondas de polinucleótidos tienen una fracción fluorescente (fluoróforo) unida a su extremo 5' y un supresor unido al extremo 3'. Durante la amplificación por PCR, las sondas de polinucleótidos hibridan selectivamente con sus secuencias diana en la plantilla y, a medida que la polimerasa replica la plantilla, también escinde las sondas de polinucleótidos debido a la actividad de nucleasa 5' de la polimerasa. Cuando las sondas de polinucleótidos están intactas en, la proximidad entre el supresor y la fracción fluorescente normalmente da como resultado un bajo nivel de fluorescencia de fondo. Cuando las sondas de polinucleótidos se escinden, el supresor se desacopla de la fracción fluorescente, dando como resultado un aumento de intensidad de la fluorescencia. La señal fluorescente se correlaciona con la cantidad de productos de amplificación, es decir, la señal aumenta a medida que se acumulan los productos de amplificación.

Como se usa en la presente, "hibridar selectivamente con" (así como "hibridación selectiva", "hibridar específicamente con" e "hibridación específica") se refiere a la unión, duplexación o hibridación de una molécula de ácido nucleico (como un cebador o una sonda) preferentemente con una secuencia de nucleótidos complementaria particular en condiciones estrictas. El término "condiciones estrictas" se refiere a las condiciones en las que una molécula de ácido nucleico hibridará preferentemente con su secuencia diana y en menor medida, o en absoluto, con otras secuencias no diana. Una "hibridación estricta" en el contexto de la hibridación de ácidos nucleicos depende de la secuencia, y difiere en diferentes condiciones, como se sabe en la técnica.

Las sondas de polinucleótidos pueden variar en longitud. En algunas realizaciones, las sondas de polinucleótidos pueden incluir entre 15-30 bases. En realizaciones adicionales, las sondas de polinucleótidos pueden incluir entre 25-30 bases. En algunas realizaciones, las sondas de polinucleótidos pueden incluir entre 20-30 bases, por ejemplo, 20 bases, 21 bases, 22 bases, 23 bases, 24 bases, 25 bases, 26 bases, 27 bases, 28 bases, 29 bases, 30 bases. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención.

Las sondas de polinucleótidos pueden diseñarse para que se unan a cualquiera de las cadenas de la plantilla. Consideraciones adicionales incluyen la Tm de las sondas de polinucleótidos, que preferiblemente debe ser compatible con la de los cebadores. Para diseñar los cebadores y las sondas puede usarse software informático.

Como se ha indicado anteriormente, los métodos divulgados en la presente implican la amplificación simultánea de más de una secuencia diana en la misma mezcla de reacción. Para distinguir entre múltiples secuencias diana que se amplifican en paralelo, pueden usarse sondas de polinucleótidos marcadas con distintos colores fluorescentes.

En algunas realizaciones, las sondas de polinucleótidos forman un par fluoróforo/supresor como se conoce en la técnica e incluyen, por ejemplo, FAM-TA<m>R<a>, FAM-BHQ1, Amarillo Yakima-BHQ1, ATT0550-BHQ2 y ROX-BHQ2.

En algunas realizaciones, las combinaciones de colorantes pueden ser compatibles con el termociclador de RT-PCR elegido.

En algunas realizaciones, puede monitorizarse la fluorescencia durante cada ciclo de PCR, proporcionando un gráfico de amplificación que muestra el cambio de las señales fluorescentes de las sondas en función del número de ciclos.

En el contexto de la RT-PCR, se usa la siguiente terminología:

"Ciclo de cuantificación" ("Cq") se refiere al número de ciclos en los que la fluorescencia aumenta por encima de un umbral de fluorescencia, establecido automáticamente por el software o manualmente por el usuario. En algunas realizaciones, el umbral de fluorescencia puede ser constante para todos los amplicones y puede establecerse por adelantado, antes de llevar a cabo la amplificación y la detección. En otras realizaciones, el umbral de fluorescencia puede definirse por separado para cada amplicón después de la serie, basándose en el nivel máximo de fluorescencia detectado para este amplicón durante los ciclos de amplificación. En algunas realizaciones, la fluorescencia umbral puede ser un valor por encima de la fluorescencia de referencia, y/o por encima del ruido de fondo, y dentro de la fase de crecimiento exponencial del gráfico de amplificación. "Valor de referencia" se refiere a los ciclos iniciales de PCR en los que hay poco o ningún cambio en la fluorescencia.

Para analizar los gráficos de amplificación y determinar el valor de referencia, el umbral y el Cq puede usarse un software informático.

En muestras de plasma bien separadas de los componentes celulares, sin ADN celular o con cantidades residuales de ADN celular, no hay esencialmente ADN plantilla para la amplificación del amplicón largo. Después de la PCR usando el primer y el segundo pares de cebadores, el amplicón corto se amplifica con alta eficacia, mientras que para el amplicón largo se forma una cantidad muy baja de producto de amplificación, si es que se forma alguno. El gráfico de amplificación mostraría un valor de Cq bajo para el amplicón corto (el producto de amplificación se detecta después de un número relativamente bajo de ciclos de amplificación) y un valor Cq alto para el amplicón largo (el producto de amplificación se detecta después de un número relativamente elevado de ciclos de amplificación).

En las muestras de plasma contaminadas con ADN genómico celular, cuanto mayor sea la contaminación, menor será el valor Cq del amplicón largo.

La diferencia entre el Cq del amplicón corto y el Cq del amplicón largo es indicativa de la calidad de separación de la muestra de plasma.

Determinación de la eficacia de la separación

La eficacia de la separación plasmática se determina sobre la base de las diferencias en las intensidades de señal, como las diferencias en los valores de Cq, entre los productos de amplificación cortos y largos después de la PCR en tiempo real.

El término "intensidad de la señal", como se usa en la presente se refiere a una medida que refleja la cantidad de un producto de amplificación específico de la secuencia, correspondiente a la cantidad inicial de copias de la secuencia diana. Sin embargo, la intensidad de la señal puede no indicar cantidades reales de productos de amplificación/secuencias diana, y puede no implicar el cálculo de ninguna cantidad absoluta de productos de amplificación/secuencias diana. Así, en algunas realizaciones, para calcular las intensidades de señal de los productos de amplificación, no se emplea ninguna curva estándar ni ADN de referencia, ya que es innecesario calcular las cantidades reales de ADN per se.

En algunas realizaciones, la amplificación y la detección de los productos de amplificación se llevan a cabo mediante RT-PCR, donde la intensidad de la señal de un producto de amplificación específico está representada por el Cq calculado para este producto de amplificación.

En algunas realizaciones, en caso de no amplificación o de muy poca amplificación, el Cq se determina como "infinito". En algunas realizaciones, en tales casos el valor numérico del delta Cq se fija en 14.

En algunas realizaciones, calcular una diferencia entre las intensidades de señal del primer y del segundo productos de amplificación en la muestra de ADN comprende determinar el Cq para cada locus, y calcular la diferencia entre los valores de Cq (ACq). En algunas realizaciones, calcular una diferencia entre las intensidades de señal de los dos productos de amplificación se lleva a cabo calculando Cq(largo) - Cq(corto).

Por ejemplo, suponiendo que el primer Cq (corto) de un primer producto de amplificación es '25' y el segundo Cq de un segundo producto de amplificación (largo) es '30', el Cq(largo) - Cq(corto) es '5'.

En algunas realizaciones, para calcular la diferencia entre los Cq de los productos de amplificación se usa software informático.

En algunas realizaciones, un delta Cq calculado indica que una muestra de plasma analizada está suficientemente separada de la sangre completa cuando el delta Cq calculado está por encima de un delta Cq umbral predefinido.

Un " delta Cq umbral " se refiere a un delta Cq que diferencia entre muestras de plasma suficientemente separadas y muestras de plasma poco o nada separadas. El umbral se establece típicamente para que refleje el ADN de glóbulos rojos contaminante por debajo de una cierta cantidad o porcentaje, que no interfiere con el análisis de ADN libre de células. Como se ha indicado anteriormente, las diferentes aplicaciones de diagnóstico que implican el análisis de ADN libre de células pueden requerir diferentes niveles de pureza del plasma (es decir, pueden caracterizarse por diferentes niveles de contaminación de ADN de glóbulos blancos que son tolerados). Por ejemplo, en algunas realizaciones, una muestra de plasma separada es una muestra de plasma que contiene menos del 50% de ADN de glóbulos blancos contaminante, menos del 40% de ADN de glóbulos blancos contaminante, menos del 30% de ADN de glóbulos blancos contaminante, menos del 20% de ADN de glóbulos blancos contaminante, menos del 10% de ADN de glóbulos blancos contaminante, menos del 5% de ADN de glóbulos blancos contaminante, menos del 1% de ADN de glóbulos blancos contaminante Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención.

El ACq umbral por encima del cual se determina que una muestra de plasma está separada puede establecerse basándose en los requisitos de un ensayo de diagnóstico particular.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, el ACq umbral es de 1 ciclo, lo que refleja una proporción 50:50 entre el ADN de glóbulos blancos contaminante y el ADN libre de células de la muestra.

En algunas realizaciones, el ACq umbral es de aproximadamente 1 ciclo. En algunas realizaciones, el ACq umbral es de por lo menos 1 ciclo. En realizaciones adicionales, el ACq umbral es de por lo menos 2 ciclos. En otras realizaciones, el ACq umbral es de por lo menos 3 ciclos. En otras realizaciones más, el ACq umbral es de por lo menos 4 ciclos.

En algunas realizaciones, determinar de ACq umbral incluye: (i) enriquecer una muestra de plasma con diferentes cantidades (o porcentajes) de ADN de la capa leucocitaria o de sangre completa para obtener una serie de muestras de plasma con diferentes grados de contaminación por ADN de glóbulos blancos; (ii) realizar PCR en tiempo real para un par de amplicones cortos y largos en cada muestra y determinar el Cq para cada amplicón en cada muestra; (iii) calcular ACq para cada muestra (para cada grado de contaminación por ADN de glóbulos blancos) y determinar el umbral de acuerdo con la contaminación máxima que permite un ensayo/aplicación particular.

En algunas realizaciones, los métodos de la presente invención comprenden proporcionar un delta Cq umbral.

En algunas realizaciones, los valores umbral son valores estadísticamente significativos. La significancia estadística se determina a menudo comparando dos o más poblaciones y determinando un intervalo de confianza (IC) y/o un valor p. En algunas realizaciones, los valores estadísticamente significativos se refieren a intervalos de confianza (IC) de aproximadamente el 90%, 95%, 97,5%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% y 99,99%, mientras que los valores p preferidos son menores de aproximadamente 0,1, 0,05, 0,025, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001 o menos de 0,0001. Cada posibilidad representa una realización separada de la presente invención. De acuerdo con algunas realizaciones, el valor p del valor umbral es como máximo 0,05.

Como se usa en la presente, el término "aproximadamente", cuando se refiere a un valor medible, se pretende que abarque variaciones de /-10%, más preferiblemente /-5%, incluso más preferiblemente /-1%, y aún más preferiblemente /-0,1% del valor especificado.

Kits y sistemas

En algunas realizaciones, en la presente se proporciona un kit como se define en la reivindicación adjunta 9, para determinar la eficacia de la separación de plasma a partir de sangre completa, de acuerdo con los métodos de la presente invención.

Los métodos y kits de la invención pueden usarse en un sistema para determinar la eficacia de la separación de plasma a partir de sangre completa, de acuerdo con los métodos de la presente invención.

El kit incluye un par de cebadores para la amplificación de un primer producto de amplificación de 70-150 bps a partir de un primer locus genómico y un segundo producto de amplificación de por lo menos 350 bps a partir de un segundo locus genómico; medios para detectar el primer y el segundo productos de amplificación; y, opcionalmente, un manual de instrucciones para llevar a cabo la determinación de la eficacia de separación del plasma de acuerdo con el método divulgado en la presente. En algunas realizaciones, el manual de instrucciones puede ser un manual de instrucciones electrónico.

En algunas realizaciones, el manual de instrucciones puede proporcionar un delta Cq umbral, por encima del cual se determina que una muestra de plasma está separada.

En algunas realizaciones, el manual de instrucciones puede incluir instrucciones para realizar los pasos del método descrito en la presente.

El manual de instrucciones puede incluir instrucciones que dirijan la correlación entre delta Cq y la separación.

En algunas realizaciones, el manual de instrucciones puede incluir instrucciones para llevar a cabo la determinación de la separación del plasma usando un software informático almacenado en un medio legible por ordenador, el software informático dirige un procesador informático para determinar la separación del plasma basándose en la diferencia de intensidades de señal entre el primer y el segundo productos de amplificación.

En algunas realizaciones, el kit puede comprender además un medio legible por ordenador que almacena un programa informático que dirige un procesador informático para determinar la separación del plasma basándose en la diferencia de intensidades de señal entre el primer y el segundo productos de amplificación.

Los métodos y kits de la invención pueden usarse en un sistema que comprende: (i) un primer par de cebadores, para generar mediante PCR un primer producto de amplificación de 70-150 bps a partir de un primer locus genómico; (ii) un segundo par de cebadores, para generar mediante PCR un segundo producto de amplificación de por lo menos 350 bps, a partir de un segundo locus genómico; (iii) sondas para detectar el primer y el segundo productos de amplificación, para determinar una intensidad de señal para cada producto de amplificación; y (iv) software informático almacenado en un medio legible por ordenador que dirige un procesador informático para determinar la separación de plasma basándose en la diferencia de intensidades de señal entre el primer y el segundo productos de amplificación.

El software informático puede dirigir al procesador informático para que realice los siguientes pasos: determinar una intensidad de señal para cada uno del primer y del segundo productos de amplificación; y calcular una diferencia entre las intensidades de señal. El software informático puede además dirigir al procesador para que compare la diferencia calculada con un umbral predefinido y, basándose en la comparación, determine si la muestra de plasma está separada. El software informático puede ser un software informático que dirige un procesador informático para que calcule por lo menos uno de Cq y delta Cq.

El software informático puede recibir como entrada parámetros o datos brutos de una serie de PCR en tiempo real. El software informático puede dirigir un procesador informático para que analice la serie de PCR en tiempo real con el fin de determinar las intensidades de señal (Cqs) y las diferencias de intensidad de señal (ACq).

El software informático incluye instrucciones ejecutables por el procesador que se almacenan en un medio legible por ordenador no transitorio. El software informático también puede incluir datos almacenados. El medio legible por ordenador es un medio legible por ordenadortangible, como un disco compacto (CD), almacenamiento magnético, almacenamiento óptico, memoria de acceso aleatorio (RAM), memoria de sólo lectura (ROM) o cualquier otro medio tangible.

El sistema puede comprender un procesador, configurado para llevar a cabo lo siguiente: determinar la separación del plasma basándose en la comparación de una diferencia de intensidad de señal calculada entre el primer y el segundo producto de amplificación con una diferencia de intensidad de señal umbral.

El sistema puede incluir maquinaria para llevar a cabo la generación de productos de amplificación, como una máquina de PCR en tiempo real.

El kit o sistema puede comprender sondas de oligonucleótidos marcadas con fluorescencia complementarias a subsecuencias dentro del primer y del segundo productos de amplificación, para detectar el primer y el segundo productos de amplificación.

El kit o sistema comprende pares de primeros y segundos cebadores, cada uno diseñado para amplificar selectivamente un fragmento del genoma para generar el primer y el segundo productos de amplificación, como se describe en la presente.

A veces, el primer par de cebadores es SEQ ID NO: 3 (directo) y SEQ ID NO: 4 (inverso).

A veces, el segundo par de cebadores es SEQ ID NO: 5 (directo) y SEQ ID NO: 6 (inverso).

El kit o sistema puede incluir además por lo menos un ingrediente adicional necesario para la amplificación y detección de los productos de amplificación, como la ADN polimerasa y la mezcla de nucleótidos.

El kit o sistema puede incluir además tampones de reacción adecuados y un protocolo escrito para realizar el ensayo. El protocolo escrito puede comprender instrucciones para realizar cualquiera de los pasos divulgados en la presente incluyendo, entre otros, los parámetros de los ciclos de PCR, la determinación y el análisis de Cq y un delta Cq umbral.

Se entiende que los métodos, pasos y procesos relacionados con la informática descritos en la presente se implementan usando software almacenado en instrucciones legibles por ordenador no volátiles o no transitorias que, cuando se ejecutan, configuran o dirigen un procesador informático u ordenador para que realice las instrucciones.

Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar de manera más completa ciertas realizaciones de la invención, que se define mediante las reivindicaciones adjuntas. Sin embargo, no deben interpretarse en modo alguno como limitativos del amplio alcance de la invención. Un experto en técnica puede concebir fácilmente muchas variaciones y modificaciones de los principios divulgados en la presente.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 - Pruebas de muestras de plasma

El siguiente par de amplicones cortos y largos se diseñó para probar ADN de muestras de plasma, muestras de plasma contaminadas con leucocitos y muestras de sangre completa:

"Corto" (126bps)(SEQ ID NO: 1):

GTCTTTGTGACATTGAGTTACAGGGCTTTGACTCCTGGGTCTAAAAATT ACACCAAATATTGTTAAATCTTAAACACTAACAGCAATTCAAGCCTCATCTTC AGGTCCTGGAGAAGATGCCAATAT

El amplicón corto corresponde a la posición 155565467 - 155565601 en el cromosoma 1 (de acuerdo con hg 18). El amplicón corto se diseñó para su amplificación usando los siguientes cebadores:

Directo (SEQ ID NO: 3): GTCTTTGTGACATTGAGTTACAG

Inverso (SEQ ID NO: 4): ATATTGGCATCTTCTCCAGGAC

"Largo" (450 bps)(SEQ ID NO: 2):

GTCAGCCTTTATTATCACTTTGCAATACAAAGAAAGCAAGGTGAAGAC TAACTTTTCTCTTGTACAGAATCATCAGGCTAAATTTTTGGCATTATTTCAGTC CTTGGAGACATCTGAGAGATTCCGGGATGCCAGTGGTGCCTCTCTGGCCACAC TGACAACAAATAATTCACCTAAGGAATAGTTCACTTCAGCTATTTTTTGCTACT CATTGGTTGTCAGTGCCATTGAGGAGAGCTCAGTGTAGATCAAAGAAAACGGT GTAGATCAAAGAAAACGGTGATTCGGTGATTGTTCCCCTTCTTCCCAGCCACC CACCATCTGAACCTAATGCATCATTGTACAATGGCCGTAAAGGATGACAAGGG ACTCAGCAATCAGTTCCTGGAGGAAATGATGCTGTGGCTTTTGGCTGGTGGCA CCATCATCCTCAGTCATCAGTCAGAGTCA

El amplicón largo corresponde a la posición 121380810 - 121381259 en el cromosoma 7 (de acuerdo con hg18). El amplicón largo se diseñó para su amplificación usando los siguientes cebadores:

Directo (SEQ ID NO: 5): GTCAGCCTTTATTATCACTTTGC

Inverso (SEQ ID NO: 6): TGACTCTGACTGATGACTGAGG

Se recogieron muestras de sangre de sujetos humanos y se procesaron para obtener plasma o plasma capa leucocitaria (leucocitos y plaquetas), o se mantuvieron sin procesar (sangre completa).

Para obtener plasma capa leucocitaria, se centrifugó el tubo de sangre (que contenía anticoagulante) a 1500g durante 10 min para separar los componentes sanguíneos. Después de la centrifugación, se recogió la capa de plasma con la capa leucocitaria (leucocitos y plaquetas) y se transfirió a un nuevo tubo.

Para obtener las muestras de plasma, se centrifugó el tubo de sangre (que contenía anticoagulante) a 1500g durante 10 min para separar los componentes sanguíneos. Después de la centrifugación, se recogió la capa de plasma (sin acercarse a la capa leucocitaria) y se transfirió a un nuevo tubo. El plasma se centrifugó de nuevo (1500g durante 10 min) y el plasma puro se transfirió aun nuevo tubo.

El ADN se extrajo de las muestras usando el kit de ácido nucleico circulante QIAamp®. El ADN extraído se sometió a (RT)-PCR en tiempo real para amplificar los amplicones cortos y largos anteriores de cada muestra (coamplificación).

La reacción de amplificación (volumen total 25 microlitros) contenía 2 microlitros del ADN extraído (no se midió la concentración de a Dn antes de la amplificación), 0,05-0,5 pM de cebadores, dNTPs y un tampón de reacción. Para permitir la detección de los productos de amplificación durante la amplificación, se añadieron a la reacción sondas de polinucleótidos marcadas con fluorescencia para cada amplicón (marcadores FAM y JOE, para los amplicones largo y corto, respectivamente). Los cebadores y la concentración de la sonda de cada amplicón se ajustaron para lograr la misma eficacia. Las reacciones de RT-PCR se llevaron a cabo en un instrumento ABI 7500 FastDx con el siguiente programa de PCR: 95°C, 10min -> 45X(95°C, 15seg) -> 60°C, 1min.

Después de la amplificación, se analizaron los gráficos de PCR cuantitativa que mostraban el cambio de las señales fluorescentes de las sondas en función del número de ciclos para calcular el ciclo de cuantificación (Cq) de cada amplicón. Se calculó un ACq entre el Cq del amplicón largo y el Cq del amplicón corto (Cq (largo) - Cq (corto)).

Las Figuras 1A-C muestran gráficos ejemplares de PCR cuantitativa de los productos de amplificación cortos y largos en muestras de ADN procedentes de plasma (Fig. 1A, ACq=3), plasma contaminado con leucocitos (Fig. 1B, ACq= (-0,4)) y ADN de sangre completa (Fig. 1C, ACq= (-0,2)).

En las muestras de plasma, en las que la cantidad de ADN procedente de los glóbulos blancos es muy baja, el amplicón largo se amplificó con escasa eficacia. Se amplificó aproximadamente 3-4 ciclos más tarde que el amplicón corto.

En las muestras de plasma contaminado con leucocitos y en las muestras de sangre completa, en las que los niveles de ADN de glóbulos blancos son altos, los amplicones largos y cortos se amplificaron con una eficacia similar. El amplicón largo se amplificó aproximadamente en el mismo ciclo que el amplicón corto.

La descripción anterior de las realizaciones específicas revelará tan completamente la naturaleza general de la divulgación como para que otros puedan, aplicando el conocimiento actual, modificar y/o adaptar fácilmente para varias aplicaciones tales realizaciones específicas sin experimentación indebida y sin apartarse del concepto genérico, y por lo tanto, tales adaptaciones y modificaciones deben y se pretende que sean comprendidas dentro del significado y alcance de equivalentes de las realizaciones divulgadas. Debe entenderse que la fraseología o terminología empleadas en la presente tienen propósitos descriptivos y no limitativos. Los medios, materiales y pasos para llevar a cabo las varias estructuras y funciones químicas divulgadas pueden adoptar una variedad de formas alternativas.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar la eficacia de la separación de plasma de sangre completa, el método comprendiendo: (a) obtener ADN de una muestra de plasma;

(b) generar mediante coamplificación por PCR:

(i) un primer producto de amplificación de 70-150 bps a partir de un primer locus genómico usando un primer par de cebadores, y

(ii) un segundo producto de amplificación de por lo menos 350 bps a partir de un segundo locus genómico usando un segundo par de cebadores;

(c) calcular una intensidad de señal para cada uno de dichos primer y segundo productos de amplificación; y (d) determinar que la muestra de plasma está separada cuando la diferencia entre las intensidades de señal es superior a un umbral predefinido,

en donde dichos primer y segundo productos de amplificación producen diferencias de intensidad de señal distintas para el ADN plasmático y el ADN de sangre completa.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el paso (b) se realiza usando PCR en tiempo real, preferiblemente en donde el método comprende además añadir sondas fluorescentes para detectar específicamente el primer y el segundo productos de amplificación, preferiblemente en donde la intensidad de la señal es el ciclo de cuantificación (Cq) y en donde se determina que la muestra de plasma está separada basándose en la diferencia entre los valores de Cq (ACq) del primer y del segundo productos de amplificación, en donde se determina que la muestra de plasma está separada cuando el ACq (Cq(segundo) - Cq(primero)) está por encima de un ACq umbral predefinido.

3. El método de la reivindicación 1, en donde dichos primeros y segundos pares de cebadores tienen la misma eficacia.

4. El método de la reivindicación 1, en donde el primer producto de amplificación tiene 100-150 bps.

5. El método de la reivindicación 1, en donde el segundo producto de amplificación tiene 350-700 bps, preferiblemente en donde el segundo producto de amplificación tiene 350-550 bps.

6. El método de la reivindicación 1, en donde el primer producto de amplificación comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 10, preferiblemente en donde el primer producto de amplificación consiste en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 10.

7. El método de la reivindicación 1, en donde el segundo producto de amplificación comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8 y la SEQ ID NO: 9, preferiblemente en donde el segundo producto de amplificación consiste en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 9.

8. El método de la reivindicación 1, en donde el primer y el segundo productos de amplificación comprenden secuencias como las expuestas en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, respectivamente, preferiblemente en donde el primer y el segundo productos de amplificación consisten en secuencias como las expuestas en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, respectivamente.

9. Un kit para determinar la eficacia de la separación de plasma a partir de sangre completa, que comprende:

(i) un primer par de cebadores, para generar mediante PCR un primer producto de amplificación de 70-150 bps a partir de un primer locus genómico, en donde el primer producto de amplificación comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 10;

(ii) un segundo par de cebadores, para generar mediante PCR un segundo producto de amplificación de por lo menos 350 bps a partir de un segundo locus genómico, en donde el segundo producto de amplificación comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 7, l SEQ ID NO: 8 y la SEQ ID NO: 9; y

(iii) sondas para detectar el primer y el segundo productos de amplificación, para determinar una intensidad de señal para cada producto de amplificación,

en donde el primer y el segundo productos de amplificación producen diferencias de intensidad de señal distintas para el ADN plasmático y el ADN de sangre completa.

10. El kit de la reivindicación 9, en donde:

i) el primer y el segundo pares de cebadores tienen la misma eficacia; o

ii) las sondas son oligonucleótidos marcados con fluorescencia.

11. El kit de la reivindicación 9, en donde el primer producto de amplificación tiene 100-150 bps.

12. El kit de la reivindicación 9, en donde el segundo producto de amplificación tiene 350-700 bps, preferiblemente en donde el segundo producto de amplificación tiene 350-550 bps.

13. El kit de la reivindicación 9, en donde el primer producto de amplificación consiste en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 10, preferiblemente en donde el primer par de cebadores es la SEQ ID<n>O: 3 (directo) y la SEQ ID NO: 4 (inverso).

14. El kit de la reivindicación 9, en donde el segundo producto de amplificación consiste en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 9, preferiblemente en donde el segundo par de cebadores es la SEQ ID NO: 5 (directo) y la SEQ ID NO: 6 (inverso).

15. El kit de la reivindicación 9, en donde el primer y el segundo productos de amplificación comprenden secuencias como las expuestas en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, respectivamente, preferiblemente en donde el primer y el segundo productos de amplificación comprenden secuencias como las expuestas en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, respectivamente, preferiblemente en donde el primer par de cebadores es la SEQ ID NO: 3 (directo) y la SEQ ID NO: 4 (inverso), y el segundo par de cebadores es la SEQ ID NO: 5 (directo) y la SEQ ID NO: 6 (inverso).