ES3019918T3 - Chimeric gallinaceous bird embryo model for studying cancer immunotherapy - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un embrión de ave gallinácea quimérico que comprende ambos tipos de células exógenas: a. Al menos una población de células cancerosas, y b. Al menos una población de células inmunitarias, donde dichas células cancerosas exógenas están presentes en al menos un tejido de dicho embrión, y dichas células inmunitarias exógenas están presentes en al menos un tejido de dicho embrión y/o circulan en los vasos sanguíneos de dicho embrión. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Modelo quimérico de embrión de ave gallinácea para el estudio de la inmunoterapia del cáncer

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un modelo animal para el estudio de células cancerosas, en particular de la relación de células cancerosas y células inmunitarias. El modelo animal de la invención es particularmente relevante para el estudio de estrategias terapéuticas de inmunoterapia.

Introducción

La modelización de cánceres humanos en animales de laboratorio es una cuestión central en los ensayos preclínicos que acompañan al desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer. Los principales criterios de los modelos animales desarrollados a tal efecto son la fiabilidad del modelo y su rapidez y coste de ejecución.

Los modelos animales que se han desarrollado para estudios tumorales y que se utilizan actualmente son principalmente modelos de ratón. La elaboración de estos modelos implica un tiempo de ejecución relativamente largo y unos costes elevados. Además, ciertos tipos de células cancerosas no pueden implantarse en modelos animales de ratón.

El embrión de ave gallinácea, en particular el embrión de pollo o codorniz es un modelo atractivo para realizar experimentosex vivo, en particular para el estudio del desarrollo embrionario y para experimentos de xenotrasplante. En efecto, es barato, muy accesible y fácil de manejar. Además, no es necesaria la aprobación de los estudios por un Comité Ético, ya que el uso de embriones de aves durante los dos primeros tercios del desarrollo embrionario no se considera "experimentación animal" (Directiva Europea 2010/63/UE). Es un modelo de elección para el estudio de la proliferación, diferenciación y migración celular. Este modelo animal también puede utilizarse para estudiar tumores.

Un modelo de estudio clásico que utiliza el embrión de ave gallinácea es el injerto de células exógenas en las estructuras extraembrionarias, más concretamente en la membrana corioalantoidea (CAM). Las células tumorales se implantan en la membrana del embrión de pollo. Tras incubarse durante unos 2 días, se forma un tumor. Este tumor aprovecha la vasculatura de la membrana embrionaria, que está especialmente desarrollada, para crecer. Tal sistema ha permitido reproducirin vivotumores humanos, notablemente el glioblastoma, con características celulares y moleculares similares a las observadas en los tumoresin vivo.

Este modelo de injerto de membrana corioalantoidea también se utiliza ampliamente para cribar moléculas terapéuticas, notablemente moléculas para inhibir la angiogénesis tumoral. Por ejemplo, WO 2015/074050 y US 2013/0171680 describen el xenoinjerto de células hematopoyéticas humanas malignas en estructuras extraembrionarias: las células cancerosas se inyectan en el saco amniótico, el saco vitelino o los vasos sanguíneos de la CAM.

La solicitud internacional WO 2020/075168 describe el injerto, en la CAM, de células cancerosas y células inmunitarias, ambas dispersas en hidrogeles.

Parket al.(2009) describen la introducción de progenitores hematoendoteliales humanos en el saco vitelino de embriones de pollo; estas células progenitoras fueron capaces de injertarse en órganos hematopoyéticos del embrión de pollo.

Algunos autores han informado de la introducción de células cancerosas en los vasos sanguíneos o en el lumen de los tubos neurales del embrión de pollo.

Carteret al.(2012) informan de la inyección de células de neuroblastoma humano en los vasos sanguíneos de un embrión de pollo. Boullandet al.(2010) divulgan la inyección de células madre humanas, en vasos sanguíneos extraembrionarios o en lesiones realizadas en el tubo neural.

Buschet al.(2012) describen la inyección de células de melanoma en el lumen de la vesícula rombencefálica del cerebro de embriones de pollo.

Jayachandranet al.(2015) enseñan la inyección de células de melanoma en el lumen del tubo neural de embriones de pollo, mientras que Joelet al.(2013) enseña la inyección de células de glioblastoma humano en la misma localización.

Ninguna de estas tecnologías permite la implantación de células tumorales en los tejidos del embrión y, por tanto, la formación de tumores. Por el contrario, las células cancerosas introducidas en estos lugares tienden a reprogramarse hacia un fenotipo más benigno y a desaparecer rápidamente.

Ambas solicitudes de patente WO 2016/05398 y WO 2017/103025 describen un novedoso modelo animal en el que se injertan células cancerosas dentro de los tejidos de un embrión de ave gallinácea, y no en las estructuras extraembrionarias, ni inyectadas en vasos o lúmenes de tubos de dichos embriones. Ventajosamente, la introducción de células cancerosas en los tejidos del embrión permite a las células cancerosas seguir vías de migración, guiadas por señales hormonales que circulan en el embrión. En este modelo animal, las células cancerosas migran a tejidos específicos de acuerdo con su naturaleza, y luego se implantan y forman tumores dentro de dichos tejidos.

La presente invención se refiere al desarrollo de otro modelo animal para el estudio de cánceres, diseñado específicamente para el estudio de interacciones de células cancerosas y células inmunitarias. Este modelo animal es especialmente útil para el cribado de fármacos inmunoterapéuticos y/o células.

Estrategias terapéuticas de inmunoterapia

La inmunoterapia puede definirse como un tipo de tratamiento que ayuda/aumenta el sistema inmunitario de los pacientes con cáncer para combatirlo. De hecho, como parte de su función normal, el sistema inmunitario es capaz de detectar y destruir células anormales, en particular células tumorales, y muy probablemente impide el crecimiento de muchos cánceres que se destruyen a tiempo y, por tanto, nunca se detectan. En el caso de los tumores diagnosticados, las células inmunitarias se encuentran dentro y alrededor de dichos tumores. La presencia de estas células inmunitarias, denominadas linfocitos infiltrantes de tumores o TIL, es un signo de que el sistema inmunitario está respondiendo al tumor. Generalmente, la presencia de linfocitos dentro o alrededor del tumor es un marcador de buen pronóstico.

Desgraciadamente, se ha establecido que algunos tumores han encontrado una forma de escapar al sistema inmunitario, que es su medio para evitar la destrucción.

Por ejemplo, las células cancerosas pueden:

• Tener cambios genéticos que los hacen menos visibles para el sistema inmunitario;

• Tener proteínas en su superficie que desactivan las células inmunitarias; y/o

• Cambiar las células normales que rodean al tumor para que interfieran en la respuesta del sistema inmunitario a las células cancerosas.

El objetivo principal de la inmunoterapia es restablecer las interacciones entre el sistema inmunitario y las células cancerosas. En el tratamiento del cáncer se utilizan varios tipos de inmunoterapia para estimular la detección y/o destrucción de las células tumorales por el sistema inmunitario del propio paciente. Entre ellas incluidas:

• Inhibidores de los puntos de control inmunitarios, que son fármacos que bloquean los "puntos de control" inmunitarios. Estos puntos de control son una parte normal del sistema inmunitario que evitan que las respuestas inmunitarias sean demasiado fuertes. Al bloquearlos, estos fármacos permiten que las células inmunitarias respondan con más fuerza al cáncer.

• Moduladores del sistema inmunitario, que potencian la respuesta inmunitaria del cuerpo contra el cáncer.

• Anticuerpos monoclonales, diseñados para unirse a dianas específicas de las células cancerosas. Los anticuerpos monoclonales son capaces de "marcar" las células cancerosas para que sean mejor vistas y destruidas por el sistema inmunitario.

El uso de anticuerpos monoclonales en la terapia del cáncer se introdujo por primera vez en 1997 con rituximab, un anticuerpo anti-CD20 para el tratamiento del linfoma de células B.

• Terapia de transferencia de células T, un tratamiento que restaura y/o potencia la capacidad natural de las células T para combatir el cáncer. La terapia de transferencia de células T también puede denominarse terapia celular adoptiva, inmunoterapia adoptiva o terapia celular inmunitaria.

En 1996, se demostró que el bloqueo de CTLA-4, un elemento clave del agotamiento de las células T, conducía al rechazo del carcinoma rectal en ratones (Leachet al.,1996).

Agotamiento de células T

Los linfocitos T que están presentes en el microambiente tumoral (TME,es decir,células cancerosas, células inflamatorias y citoquinas supresoras) están generalmente "agotados". El agotamiento de las células T se caracteriza por una pérdida de funcionalidad y de expresión de moléculas inhibidoras. Las células T agotadas carecen de la capacidad de secretar moléculas efectoras tales como IL-2, IFN-y, TNF-a y Granzima B, y expresan receptores inhibidores tales como PD1, TIM-3, LAG3 y CTLA-4 (McLaneet al.,2019).

La estrategia terapéutica dirigida a revertir el fenotipo agotado de las células T ha sido un punto de interés durante la última década. Se han logrado avances significativos en el tratamiento de múltiples tipos de cáncer. En particular, los datos clínicos de aPD1 (Pembrolizumab, Nivolumab) y/o aCTLA-4 (Ipilimumab) indican un éxito abrumador. Sin sorpresa, la expresión de PDL1 en el tejido tumoral, el ligando de PD1, se asocia con mejores tasas de respuesta a estos fármacos inmunoterapéuticos.

Epítopos específicos - CAR-T

Otro cambio de paradigma en inmunoterapia ha sido la aparición de células T quiméricas receptoras de antígeno designadas como células CAR-T. Las células CAR-T son células T autólogas modificadas genéticamente para expresar un receptor quimérico dirigido a un epítopo específico. La porción específica del CAR está conectada, a través de un dominio transmembrana, a dominios de transducción de señales de CD28, 41BB y CD3^, lo que permite una activación eficiente y una supervivencia óptima de las células T después de la transferencia adoptiva (Feinset al.,2019).

Se ha logrado un éxito notable en la leucemia de células B con el uso de células CAR-T específicas de CD19. Sin embargo, la estrategia de células CAR-T para tumores sólidos parece ser mucho menos eficiente, quizás como consecuencia de razones multifactoriales tales como la falta de accesibilidad del microambiente tumoral (TME), las capacidades inmunosupresoras de dicho TME y la inmunogenicidad/heterogeneidad del Antígeno Asociado al Tumor. No obstante, aún se están investigando nuevas construcciones de células CAR-T para tumores sólidos con varias dianas nuevas, diferentes modos de direccionamiento a la TME y diversas estrategias para la persistencia/supervivencia de las células CAR-T (Martinez & Moon, 2019).

Además, otro punto de interés es el desarrollo de células CAR-T alogénicas, emitidas a partir de donantes. De hecho, esta tecnología tiene muchas ventajas potenciales sobre los enfoques autólogos, como la disponibilidad inmediata de lotes crioconservados para el tratamiento de pacientes, la posible estandarización del producto de células CAR-T, el tiempo para múltiples modificaciones celulares, la redosificación o la combinación de células CAR-T dirigidas contra diferentes dianas y, por último, pero no por ello menos importante, la disminución del coste utilizando un procedimiento industrializado. Por lo tanto, el desarrollo de células CAR-T alogénicas es un área activa de investigación.

Modelos para el estudio de la inmunoterapia

La aparición de nuevas estrategias terapéuticas y, en mayor medida, la aparente heterogeneidad de las respuestas a las intervenciones inmunomoduladoras, hacen necesarios modelos prácticos para categorizar a los pacientes antes de iniciar los tratamientos.

Desde un punto de vista clínico, la puntuación de los pacientes puede basarse en la expresión de biomarcadores tales como el eje PD1/PDL1, el cribado genético/transcriptómico, la presencia de TIL adecuados y/o la capacidad de estos TIL para cumplir funciones efectoras en el contexto del tumor, etc.

Además, se han desarrollado varios modelos de xenoinjerto derivado de paciente (PDX) en ratones. La estrategia general consiste en injertar tejido tumoral derivado del paciente y, finalmente, coinjertar células inmunitarias derivadas del paciente en ratones receptores inmunodeficientes.

Sin embargo, este enfoque requiere mucho tiempo, es caro y no es fiable, ya que el éxito del injerto puede ser tan bajo como el 10 %. Los esfuerzos e inversiones pecuniarias para la generación de tales modelos animales son incompatibles con el contexto clínico (Jung et al., 2018).

En vista de esta situación, se buscan activamente modelos animales novedosos para estudiarin vivolas interacciones de las células cancerosas y las células inmunitarias, preferiblemente para todos y cada uno de los pacientes. También se necesitan modelos preclínicos para probar las células de ingeniería CAR-T (Siegler y Wang, 2018).

En este contexto, la presente invención propone un modelo animal novedoso, que consiste en un embrión quimérico de ave gallinácea, que es particularmente útil para el cribado de fármacos inmunoterapéuticos y/o células, y para la categorización de pacientes.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a un embrión quimérico de ave gallinácea que comprende ambos tipos de células exógenas:

1. a. Al menos una población de células cancerosas, y

2. b. Al menos una población de células inmunitarias,

en el que dichas células cancerosas exógenas están presentes en al menos un tejido de dicho embrión, y dichas células inmunitarias exógenas están presentes en al menos un tejido de dicho embrión y/o circulan por los vasos sanguíneos de dicho embrión,

en el que el embrión de ave gallinácea proviene de un pollo(Gallus gallus)o de una codorniz(Coturnix japonica),y en el que dicho tejido embrionario designa cualquier tejido del embrión con excepción de los anexos extraembrionarios y el lumen de tubos y vasos.

La invención también se refiere a un procedimiento para obtener un embrión quimérico de ave gallinácea como el descrito anteriormente, es decir, que comprende ambos tipos de células exógenas:

1. a. Al menos una población de células cancerosas, y

2. b. Al menos una población de células inmunitarias,

que comprende los siguientes pasos:

• Introducir ambas poblaciones de células inmunitarias y células cancerosas en un embrión de ave gallinácea, en el que el embrión de ave gallinácea se encuentra en un período de desarrollo comprendida entre el período HH10 y el período HH30, y

• incubar el embrión quimérico durante al menos 6 horas a una temperatura comprendida entre 35° C y 42° C, en el que dichas células cancerosas exógenas se introducen en al menos un tejido de dicho embrión, y dichas células inmunitarias exógenas se introducen en al menos un tejido de dicho embrión y/o en los vasos sanguíneos de dicho embrión,

en el que el embrión de ave gallinácea proviene de un pollo(Gallus gallus)o de una codorniz(Coturnix japónica),y en el que dicho tejido embrionario designa cualquier tejido del embrión con excepción de los anexos extraembrionarios y el lumen de tubos y vasos.

Por la presente se consideran al menos dos implementaciones de este procedimiento:

1. 1) un procedimiento que comprende los siguientes pasos:

o Coinjertar ambas poblaciones de células inmunitarias y células cancerosas en al menos un tejido de un embrión de ave gallinácea en un período de desarrollo comprendido entre el período HH10 y el período HH30, e

o incubar el embrión quimérico durante al menos 6 horas a una temperatura comprendida entre 35 °C y 42 °C, y

2. 2) un procedimiento que comprende los siguientes pasos:

o Injertar al menos una población de células cancerosas en al menos un tejido de un embrión de ave gallinácea en un período de desarrollo comprendido entre el período HH10 y el período HH30, o Inyectar dicha al menos una población de células inmunitarias en los vasos sanguíneos de dicho embrión, e

o incubar el embrión injertado durante al menos 6 horas a una temperatura comprendida entre 35 °C y 42 °C.

La presente invención también se refiere a un modelo animal para el estudio de cánceres humanos que consiste en un embrión quimérico de ave gallinácea como el descrito anteriormente, o como el obtenido por el procedimiento anteriormente presentado.

La presente invención también se refiere al uso de tal modelo animal para el cribado de al menos una terapia anticancerosa elegida entre el siguiente grupo: inmunoterapia, quimioterapia, terapia dirigida, hormonoterapia, fármacos anticancerosos y enzimas terapéuticas.

La presente invención también se refiere al uso de dicho modelo animal para evaluar la actividad de células CAR-T modificadas genéticamente.

Breve descripción de las figuras

Figura 1:Imágenes de PBMC humanas marcadas dos días después de la inyección (1A) o después del injerto (1B) en un embrión aviar. Las células fluorescentes (en blanco) son células inmunitarias que se han asentado en los tejidos embrionarios.

Figura 2:Análisis de PBMC humanas inyectadas en el embrión aviar mediante FACS, dos días después de la inyección. CFSE: Carboxifluoresceína succinimidil éster; FSC: Dispersión hacia delante; SSC: Dispersión lateral.

Figura 3:Supervivencia de PBMC después de su inyección en el embrión de pollo. Se han inyectado PBMC a diferentes dosis (representadas en el eje de abscisas); el porcentaje de supervivencia celular se presenta en el eje de ordenadas. Cada símbolo (triángulos, cuadrados, rombos, círculos) representa un experimento independiente con una cantidad determinada de PBMC inyectadas.

Figura 4:Análisis de la subpoblación de PBMC después del injerto mediante citometría de flujo

Determinación de las proporciones relativas de subpoblaciones de células inmunitarias después del injerto de PBMC. PBMC: células anteriores al injerto. AVI-PBMC: Células PBMC injertadas y analizadas después del aislamiento Percoll de embriones tratados con colagenasa (después de las 48 horas de incubación del embrión).

(4A) Se cuantifican las células CD19+ y CD3+. Los valores se expresan en relación con el total de linfocitos identificados. También se ilustra la relación CD3+/CD4+ y CD3+/CD8+.

(4B) Comparación mediante análisis FACS de subpoblaciones de células inmunitarias (población CD45+ sobreviva) en las muestras antes del injerto (PBMC) y dos días después del injerto en el embrión aviar (AVI-PBMC).

(4C) Comparación mediante análisis FACS de marcadores de activación y agotamiento de células inmunitarias (población CD45+CD3+ sobreviva), antes del injerto (PBMC) y dos días después del injerto en el embrión aviar (AVI-PBMC). Marcadores de activación: CD69 y CD25 humanos; Marcadores de agotamiento: TIM-3 y PD-1 humanos.Figura 5:Microfotografías de tumores formados después del rallado en el embrión aviar.

Las PBMC y las células tumorales se coinjertaron en un lugar específico del embrión de pollo. Antes del injerto, ambos grupos de células se marcaron con un marcador vital fluorescente (rojo para las PBMC y verde para las células tumorales). Dos días después del injerto, se recogieron los embriones y se tomaron imágenes con un microscopio confocal para visualizar las células injertadas. Un componente celular PBMC estaba presente dentro de los tumores formados.

Combinado) Se visualizan ambos tipos de células; PBMC) Sólo se visualizan las PBMC; Células tumorales) Sólo se visualizan las células tumorales.

Figura 6:Vista ampliada de las células inmunitarias (blanco) en los tumores celulares humanos formados en el embrión aviar (halo más brillante). Se inyectaron PBMC en la vasculatura y se injertaron células tumorales en zonas diana del embrión.

Figura 7:Vista ampliada de células tumorales individuales en un tumor (tumores) y de células inmunitarias (PBMC) que se inyectaron en la vasculatura del embrión de pollo.

Figura 8:Se midió el área cuerpo/tamaño (BSA), un indicador del tamaño y el peso de los embriones individuales, en embriones injertados únicamente con células Pmela (Glo) y de los embriones coinjertados con células Pmela y PBMC (GLO-PBMC) No se observaron diferencias estadísticas del BSA.

Figura 9:Medidas del volumen tumoral comparando las condiciones cuando las células Pmela se injertaban solas o en combinación con PBMC humanas (según el procedimiento 1). El gráfico no muestra diferencias estadísticas entre ambas condiciones. Los datos se normalizaron con respecto al Área de Tamaño Corporal (BSA) de los embriones.

Figura 10:

(IOA) Representación de las proporciones de las subpoblaciones de células inmunitarias después del coinjerto de PBMC con dos tipos diferentes de células cancerosas (células Pmela: GLO; células MDAM: MDAM). Los valores se expresan en relación con el total de linfocitos identificados (CD3+).

(IOB) Expresión de marcadores celulares de superficie (PD1, TIM-3, CD69 y CD25) medida por FACS para las subpoblaciones CD4+ y CD8+ de linfocitos T: a la izquierda CD8+, a la derecha CD4+ (sobre población viva CD45+CD3+).

Las celdas ordenadas son las siguientes: únicamente PBMC antes del injerto (negro), únicamente AVI-PBMC después del injerto en el embrión (gris oscuro), y AVI-PBMC MDAMB231: después del coinjerto de células tumorales y PBMC (gris claro). Las mediciones se realizan 48 horas después del injerto.

Figura 11:Efectos de Keytruda

(11A) Se identificaron subpoblaciones de células mediante FACS después del aislamiento Percoll de PBMC de embriones tratados con colagenasa. Detección de la expresión superficial de PD1 mediante FACS. El anti-PD1 (Keytruda) es capaz de unirse a PD1 expresado por las células T humanas de PBMC injertadas, y por lo tanto competir con el anticuerpo anti-PD1 utilizado para la detección de PD1 en el análisis FACS, dando lugar a una detección reducida de PD1. Así, cuando Keytruda alcanza su diana, se produce una reducción de los niveles de PD-1 detectados.

Análisis de la expresión de PD1 después de la inyección intravenosa de Keytruda (diluido a 5mg/ml), o NaCI como control negativo, en embriones aviares injertados con PBMCS. Los controles negativos se consideran arbitrariamente como el 100 % de las células CD4+ y CD8+ (dentro de la población viva CD45+CD3+). La cuantificación de células CD8+ y CD4+ en embriones tratados con Keytruda se expresa normalizada respecto a los controles.

( IIB ) La expresión de PDL1 en células de cáncer de mama MDAMB436 (figura superior) y en células MDAMB 231 (figura inferior) se mide por FACS después del injerto en el embrión.

( IIC ) Se coinjertaron PBMC con células tumorales: Pmela (una línea celular PDL1 negativa) o MDAMB436 (una línea celular PDL1 débilmente positiva). Posteriormente, las células PBMC injertadas y aisladas se trataron o no con el inmunoestimulador anti-PD1 humano Keytruda (K): K significa en presencia de Keytruda.

Se determinaron marcadores de activación (CD69, HLADR, a la izquierda) y agotamiento (CTLA4, PD1, a la derecha) en PBMC después del coinjerto con células tumorales humanas (Pmela o MDAM) en un embrión aviar. Los valores se expresan en frecuencia sobre las poblaciones CD4+ y CD8+ en relación con el total de linfocitos identificados (CD3+CD4+ y CD3+CD8+). Las desviaciones estándar muestran los datos de un conjunto de PBMC de diferentes donantes sanos. Gráfico de la izquierda: CD4+, gráfico de la derecha: CD8+.

(IID ) Repartición de células T CD8+ (a la izquierda) y células CD4+ (a la derecha) después del tratamiento con keytruda durante 24 horas (en gris oscuro) o NaCl (gris claro) de embriones coinjertados con PBMC y células tumorales m Da MD231 (sobre población viva CD45+CD3+).

Los resultados se presentan en % de la cantidad de control; las flechas blancas señalan la disminución de la expresión de los marcadores de agotamiento (PD1 y TIM-3) en las condiciones de tratamiento con keytruda (5 mg/ml).

Figura 12:Tamaño de los tumores en embriones de pollo injertados

(12A) Análisis de los efectos de un tratamiento anti-PD1 (Keytruda) sobre el volumen de los tumores formados mediante el co-injerto de células de melanoma A375 con PBMC humanas, formándose dichos tumores en el modelo de embrión aviar.

(12B) Efecto de la administración de anti-PD1 (Keytruda) a embriones aviares coinjertados con PBMC humanas y células tumorales MDAMB 231, sobre el volumen tumoral.

Panel izquierdo: efecto de Keytruda en el área de tamaño corporal (BSA); Panel central: Histograma de volúmenes tumorales brutos; Panel derecho: volúmenes tumorales normalizados/ BSA

Todos los resultados muestran una reducción significativa del volumen tumoral en la condición tratada con anti-PD1, en comparación con los embriones tratados con NaCl.

(12C) Efecto de la administración de anti-PD1 (Keytruda) a embriones aviares coinjertados con PBMC humanas y muestra tumoral de un paciente afectado por un melanoma metastásico. Se han evaluado la cantidad de metástasis (a la izquierda) y el volumen de los tumores metastásicos (en el centro). A la derecha, las imágenes muestran la extensión del tumor después del tratamiento con NaCl (arriba) y después del tratamiento con Keytruda (abajo).Figura 13.Análisis de PBMC 48 horas y 72 horas después del injerto Seguimiento de la repartición de subpoblaciones de PBMC después del injerto en el embrión aviar. Los embriones se recolectaron 48 h (gris claro) o 72 h después del injerto (gris oscuro). Las subpoblaciones se observan sobre la población viva CD45+ y se comparan con PBMC antes del injerto (PBMC D0).

Descripción detallada de las realizaciones de la invención

La presente invención se refiere a un embrión quimérico de ave gallinácea que comprende ambos tipos de células exógenas:

1. a. Al menos una población de células cancerosas, y

2. b. Al menos una población de células inmunitarias,

en el que dichas células cancerosas exógenas están presentes en al menos un tejido de dicho embrión, y dichas células inmunitarias exógenas están presentes en al menos un tejido de dicho embrión y/o circulan por los vasos sanguíneos de dicho embrión,

en el que el embrión de ave gallinácea proviene de un pollo(Gallus gallus)o de una codorniz(Coturnix japónica),y en el que dicho tejido embrionario designa cualquier tejido del embrión con excepción de los anexos extraembrionarios y el lumen de tubos y vasos.

A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos y frases tal como se utilizan en el presente documento pretenden tener los siguientes significados en el sentido de la invención.

El término "ave gallinácea" se refiere a un ave del orden Galliformes (o gallináceos) que incluye pollos, codornices, pavos, faisanes, pavos reales, pintadas y otros animales de corral. En el contexto de la invención, el embrión será de un pollo(Gallus gallus)o de una codorniz(Coturnix japónica),dos especies utilizadas habitualmente en el laboratorio.

El término "embrión de ave gallinácea" se refiere a un huevo de ave gallinácea fecundado en el que un embrión se desarrolla normalmente, en condiciones adecuadas, notablemente colocándolo en una incubadora calentada a una temperatura de 35 °C a 42 °C.

En una realización específica de la invención, el embrión de ave gallinácea es un embrión de pollo.

El término "embrión quimérico" designa un embrión que posee células de dicho embrión, designadas como células endógenas, y además células exógenas de al menos otro organismo, convirtiéndose dichas células exógenas en parte integrante del embrión después de su aceptación como injerto, y continuando su desarrollo dentro de los tejidos del embrión receptor. No se pretende que este embrión quimérico se desarrolle lo suficiente como para crear un organismo quimérico adulto, sino que se utiliza únicamente como soporte de células exógenas durante un breve periodo de tiempo. Este embrión de ave gallinácea no producirá un organismo vivo quimérico, sino que será sacrificado de acuerdo con las normas éticas vigentes en cuanto finalice el estudio sobre las poblaciones de células exógenas.

Los términos "células exógenas" designan células de otro organismo que se han introducido en un organismo receptor, en el presente caso un embrión de ave gallinácea.

El término "población de células" designa un grupo de células similares, que tienen todas la misma naturaleza y función. Por ejemplo, una "población de células inmunitarias" serían los linfocitos T, otra población serían los linfocitos B y otra población serían los macrófagos.

El término "cáncer" se refiere a la patología caracterizada por la presencia en un organismo de células malignas formadas a partir de la transformación, por mutaciones o inestabilidad genética, de células inicialmente normales del organismo afectado por esta patología.

Los términos "células cancerosas" designan células malignas procedentes de un tumor líquido o sólido. Una "población de células cancerosas" sería, por ejemplo, células de melanoma, otra población serían células de glioblastoma, otra población serían células de cáncer de mama.

Los términos "células inmunitarias" designan células del sistema inmunitario, todas designadas como "glóbulos blancos". Estas células pueden clasificarse en dos grandes familias: neutrófilos y células mononucleares de sangre periférica (PBMC), es decir, células sanguíneas con un núcleo redondo. Aunque ambas proceden de las mismas células progenitoras hematopoyéticas, el término "células inmunitarias" no incluye los eritrocitos, también denominados "glóbulos rojos".

Dichas PBMC incluyen:

• linfocitos, que incluyen las células T, las células B y las células NK (Natural Killer),

• monocitos, macrófagos y células dendríticas.

El término "tejido" designa un conjunto de células similares y su matriz extracelular del mismo origen, que desempeñan una función específica en un organismo. Un tejido puede ser un órgano, un músculo, un tejido conjuntivo, un epitelio, una glándula, un tejido nervioso (central o periférico) o un tejido embrionario cuya función específica aún se desconoce. Por lo tanto, un "tejido embrionario" designa un tejido embrionario, aún no completamente diferenciado, representativo u homólogo a un tejido adulto.

Además, en el sentido de la invención, un "tejido embrionario" designa específicamente cualquier tejido del embrión, con excepción de:

• los anexos extraembrionarios de dicho embrión, tales como la membrana corioalantoidea (CAM); y

• el lumen de tubos (tal como el tubo neural) y vasos (tales como los vasos sanguíneos).

La frase "presente en al menos un tejido de dicho embrión" designa la presencia, en un tejido del embrión de ave en el sentido de la presente invención, de células exógenas. Estas células se agregan preferiblemente en forma de tumor.

La frase "circular en los vasos sanguíneos de dicho embrión" designa la presencia, en la circulación sanguínea del embrión de ave, es decir, en los vasos sanguíneos de dicho embrión, de células inmunitarias exógenas circulantes.

La población de células inmunitarias presentes en el embrión de ave

El embrión quimérico de ave gallinácea comprende al menos una población de células inmunitarias.

Preferiblemente, esta al menos una población de células inmunitarias se elige entre las siguientes: Células Mononucleares de Sangre Periférica (PBMC), linfocitos que incluyen células T, células B y células NK (Natural Killer).

En una realización específica, todas las poblaciones de células inmunitarias se originan en un organismo, en particular del mismo Ser Humano. Las células inmunitarias de los Seres Humanos pueden recogerse fácilmente extrayendo una muestra de sangre y separando a continuación los distintos tipos de células sanguíneas.

En una realización específica de la invención, el embrión quimérico de ave gallinácea comprende sólo una población de células inmunitarias.

En una realización más específica de la invención, la población de células inmunitarias consiste en Células Mononucleares de Sangre Periférica (PBMC).

En otra realización específica de la invención, población de células inmunitarias consiste en linfocitos. En otra realización específica de la invención, población de células inmunitarias consiste en linfocitos B En otra realización específica de la invención, población de células inmunitarias consiste en linfocitos T En otra realización específica de la invención, la población de células inmunitarias consiste en células CAR-T modificadas genéticamente.

Las células CAR-T modificadas genéticamente designan células CAR-T que han sido modificadas genéticamente, según cualquier procedimiento bien conocido por el experto en la técnica, con el fin de expresar receptor(es) específico(s) dirigido(s) a epítopo(s) tumoral(es) específico(s). Estas células son capaces de dirigirse a las células tumorales y reconocerlas para destruirlas. En el sentido de la invención, las células CAR-T modificadas genéticamente pueden ser autólogas (emitidas a partir de un paciente antes de su reinyección a dicho paciente) o alogénicas (emitidas a partir de donantes y modificadas para ser inyectables a cualquier persona).

Ventajosamente, estas células CAR-T modificadas genéticamente expresan receptores quiméricos capaces de reconocer antígenos específicos del tumor, inducir la activación de células T y mantener una señal de coestimulación.

La población de células cancerosas presentes en el embrión de ave

El embrión quimérico de ave gallinácea comprende al menos una población de células cancerosas.

En una realización específica, todas las poblaciones de células cancerosas se originan de un organismo, en particular del mismo ser Humano. Las células cancerosas de seres humanos pueden obtenerse mediante cualquier técnica conocida por el experto en la técnica.

En una realización específica de la invención, el embrión quimérico de ave gallinácea comprende sólo una población de células cancerosas.

Las células cancerosas exógenas presentes en al menos un tejido de dicho embrión pueden ser de cualquier origen.

En particular, estas células cancerosas pueden proceder de líneas celulares cancerosas inmortalizadas o de muestras tumorales.

En una realización específica de la invención, células cancerosas exógenas provienen de un tumor de un paciente.

Según una realización de la invención, las células cancerosas exógenas se seleccionan del grupo que consiste en: células derivadas de tumores cerebrales primarios o secundarios tales como células de glioblastoma o células de glioma, células de cáncer de pulmón en particular células de cáncer de pulmón "EGFR-mutante", células de cáncer de mama en particular células de tumor mamario HER2+/ER+, células de cáncer de próstata, células de sarcoma, células de melanoma, células de tumor de células germinales, células de linfoma en particular células de linfoma folicular, células de cáncer de hígado, células de cáncer digestivo y células de cáncer de ovario.

Características de ambas poblaciones de células

El embrión quimérico de ave gallinácea de la invención comprende ambos tipos de células exógenas. En una realización específica de la invención, ambas poblaciones de células exógenas son células humanas.

En otra realización específica de la invención, ambas poblaciones de células exógenas provienen del mismo organismo, en particular del mismo paciente con cáncer.

En otra realización de la invención, ambas poblaciones de células exógenas provienen de al menos dos organismos diferentes, por ejemplo:

• al menos una población de células cancerosas procede de un tumor de un paciente, y

• al menos una población de células inmunitarias es una población de células CAR-T alogénicas se originan de donantes y modificadas genéticamente.

En esta configuración, el embrión quimérico se utiliza para probar las capacidades de las células CAR-T alogénicas para reconocer y/o destruir células cancerosas de un paciente específico.

Otro ejemplo de esta realización es el siguiente:

• al menos una población de células cancerosas procede de una línea celular inmortalizada, y

• al menos una población de células inmunitarias procede de un paciente o de un donante sano.

En esta configuración, el embrión quimérico se utiliza para probar las capacidades de las células inmunitarias de un paciente para reconocer y/o destruir células cancerosas específicas.

Otro ejemplo de realización es el siguiente:

• al menos una población de células cancerosas se emite a partir de un ratón xenoinjerto derivado de paciente (PDX), y

• al menos una población de células inmunitarias procede de un paciente o de un donante sano.

En esta configuración, el embrión quimérico se utiliza para probar las capacidades de las células inmunitarias de un paciente/donante sano para reconocer y/o destruir células cancerosas específicas.

En otra configuración:

• al menos una población de células cancerosas procede de un paciente o de una línea celular humana o de un ratón PDX, y

• al menos una población de células inmunitarias procede de un modelo de ratón humanizado en el que se ha reconstituido el sistema inmunitario humano.

En esta configuración, el embrión quimérico se utiliza para probar las capacidades de las células inmunitarias para reconocer y/o destruir células cancerosas específicas.

En otra realización preferente de la invención, se etiqueta al menos una población de células exógenas. Preferiblemente, ambas poblaciones de células inmunitarias y cancerosas se etiquetan, notablemente con dos colores o marcadores distintos para distinguirlas.

Localización de células exógenas en el embrión de ave

En el embrión de ave gallinácea quimérica de la invención:

• las células cancerosas exógenas están presentes en al menos un tejido de dicho embrión, y

• las células inmunitarias exógenas están presentes en al menos un tejido de dicho embrión y/o circulan por los vasos sanguíneos de dicho embrión.

En consecuencia, la presente invención se refiere a tres configuraciones distintas:

1. (1) un embrión quimérico de ave gallinácea en el que las células cancerosas y las células inmunitarias están presentes en al menos un tejido de dicho embrión;

2. (2) un embrión quimérico de ave gallinácea en el que las células cancerosas están presentes en al menos un tejido, y todas las células inmunitarias circulan por los vasos sanguíneos de dicho embrión; y

3. (3) un embrión quimérico de ave gallinácea en el que las células cancerosas y las células inmunitarias están presentes en al menos un tejido, y algunas células inmunitarias circulan por los vasos sanguíneos de dicho embrión.

En las tres configuraciones, las células cancerosas están presentes en al menos un tejido de dicho embrión. Las células cancerosas pueden reagruparse todas en un solo tejido de dicho embrión, o estar presentes en dos, tres, cuatro, cinco o más tejidos diferentes.

En una realización específica, las células cancerosas forman al menos un tumor, es decir, una masa de células cancerosas insertada en el tejido.

En una realización preferente de las configuraciones (1) y (3), ambos tipos de células exógenas se localizan en el mismo al menos un tejido embrionario, en particular las células inmunitarias están presentes en el tumor o tumores formados por células cancerosas. Más concretamente, las células inmunitarias se han infiltrado en el tumor o tumores. Las células cancerosas pueden haber formado un tumor o más.

Esta configuración es particularmente ventajosa ya que refleja la situaciónin vivo, en la que un tumor está infiltrado con células inmunitarias del cuerpo. Esta asociación física de células cancerosas e inmunitarias exógenas en el embrión receptor refleja la estructura de un tumor en un cuerpo y, por lo tanto, el embrión quimérico de ave gallinácea de la invención es un modelo animal pertinente para estudiar las interacciones entre células tumorales y células inmunitarias.

En una realización preferente de la invención, ambos tipos de células exógenas se asocian físicamente. En particular, las células inmunitarias y las células cancerosas forman un tumor sólido infiltrado de células inmunitarias, en al menos un tejido del embrión.

Ventajosamente, el tumor está infiltrado con diferentes subpoblaciones de células inmunitarias, en particular con células T CD4+ y CD8+; los ejemplos muestran la diversidad de las poblaciones de células inmunitarias que están presentes en el tumor formado en el embrión injertado. Como se muestra en la figura 4B, todas las subpoblaciones de PBMC injertadas se mantienen en el embrión después del injerto.

Ventajosamente, el tumor está infiltrado con células inmunitarias que expresan marcadores de activación y/o agotamiento. En particular, dichas células inmunitarias expresan marcadores de agotamiento PD1 y/o TIM-3. Curiosamente, las células inmunitarias que expresan PD1 responden al tratamiento con un compuesto anti-PD1.

En una realización específica de la invención, el tumor formado en el embrión comprende células inmunitarias exógenas que expresan marcadores de activación (CD69, CD25) y/o agotamiento (PD1, TIM-3).

Ventajosamente, en el tumor formado en el embrión de ave gallinácea después del injerto, existe un "diálogo" entre las células inmunitarias y tumorales que es representativo de la fisiología de un tumor en el cuerpo de un paciente.

En una realización preferente de las tres configuraciones, las células cancerosas exógenas están presentes en al menos un tejido embrionario que es relevante con la naturaleza de la población de células cancerosas, en particular es representativo -es decir, el tejido u órgano equivalente- de tejidos/órganos en los que se forma(n) tumor(es) primario(s) o secundario(s) en pacientes con cáncer.

Un "tejido representativo" o "tejido equivalente", utilizándose ambos términos indistintamente, designa un tejido embrionario de ave gallinácea equivalente a un tejido no embrionario de mamífero, pero en su estado embrionario y en la configuración de un organismo de ave gallinácea. Designa un tejido que imita los aspectos tisulares, celulares y/o moleculares de un tejido mamífero no embrionario específico.

Por ejemplo, el colon embrionario emitido a partir del endodermo es representativo del órgano del colon de un mamífero; cuando las células cancerosas exógenas son células cancerosas de colon, están presentes en dicha capa germinal endodérmica.

Otro ejemplo es el caso en el que las células cancerosas exógenas son células de cáncer de mama, que tienden a la metástasis en tejidos óseos; las células cancerosas exógenas pueden, en este caso, estar presentes en huesos embrionarios, emitidos de la capa germinal del mesodermo.

Procedimientos de obtención de embriones quiméricos de aves gallináceas de la invención

La presente invención también se refiere a un procedimiento para obtener un embrión quimérico de ave gallinácea tal como el descrito anteriormente, es decir, que comprende ambos tipos de células exógenas:

1. a. Al menos una población de células cancerosas, y

2. b. Al menos una población de células inmunitarias,

Dicho procedimiento comprende los siguientes pasos sucesivos:

• Introducir ambas poblaciones de células inmunitarias exógenas y células cancerosas en un embrión de ave gallinácea, en el que el embrión de ave gallinácea se encuentra en un período de desarrollo comprendido entre el período HH10 y el período HH30, e

• incubar el embrión quimérico durante al menos 6 horas, preferiblemente a una temperatura comprendida entre 35 °C y 42 °C,

en el que dichas células cancerosas exógenas se introducen en al menos un tejido de dicho embrión, y dichas células inmunitarias exógenas se introducen en al menos un tejido de dicho embrión y/o en los vasos sanguíneos de dicho embrión,

en el que el embrión de ave gallinácea proviene de un pollo(Gallus gallus)o de una codorniz(Coturnix japónica),y

en el que dicho tejido embrionario designa cualquier tejido del embrión con excepción de los anexos extraembrionarios y el lumen de tubos y vasos.

El término "introducción" designa cualquier técnica útil para crear un embrión quimérico, que comprende células exógenas además de sus propias células. En concreto, la introducción de células es un injerto de células exógenas en un tejido específico del embrión.

El paso de incubación se realizará según técnicas estándar, en particular en una incubadora saturada de humedad.

La temperatura de incubación se adaptará a la naturaleza del embrión de ave gallinácea según los conocimientos del experto en la técnica. En una realización específica, la temperatura de la incubadora está comprendida entre 35 °C y 42 °C, incluyéndose los valores límite del intervalo. Preferiblemente, la temperatura de incubación está comprendida entre 37 °C y 40 °C, y es preferiblemente de unos 38.5 °C para un embrión de pollo.

El tiempo de incubación es de al menos 6 horas, tiempo que es necesario para obtener una primera agregación de células cancerosas en al menos un tejido del embrión. Preferiblemente, el periodo de incubación es de al menos 8 horas; al menos 10 horas; al menos 12 horas; al menos 16 horas; al menos 24 horas; al menos 36 horas; o al menos 48 horas. Los periodos de incubación suelen ser de unas 24 horas o de unas 48 horas.

Preferiblemente, la incubación y el análisis del embrión se detienen antes del desarrollo embrionario completo del embrión (es decir, 21 días después de la fecundación para un embrión de pollo), y más preferiblemente, el procedimiento de incubación y análisis finaliza en los dos primeros tercios del periodo de desarrollo embrionario, es decir, antes del día catorce después de la fecundación.

Ambos tipos de procedimiento son objetos de la presente invención y se detallan a continuación.

En una primera realización, el procedimiento de la invención comprende los siguientes pasos sucesivos:

• injertar conjuntamente ambas poblaciones de células inmunitarias y células cancerosas en al menos un tejido de un embrión de ave gallinácea en un período de desarrollo comprendida entre el período HH10 y el período HH30, y

• incubar el embrión quimérico durante al menos 6 horas a una temperatura comprendida entre 35 °C y 42 °C.

El término "co-injerto", en el sentido de la invención, se refiere a la introducción de ambos tipos de células exógenas en al menos un tejido del embrión receptor, durante un único procedimiento.

Las células exógenas pueden injertarse en forma de:

• células en suspensión, inyectadas en los tejidos diana;

• una pieza sólida (bloque) de tejido tumoral que comprende tanto células inmunitarias como células cancerosas;

• un agregado/homogeneizado de células aisladas.

El injerto de células exógenas en el embrión receptor de ave gallinácea se realiza según los procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica. En efecto, el embrión de las gallináceas es fácilmente accesible, después de haber realizado una pequeña abertura en la cáscara del huevo. En concreto, el injerto de las células cancerosas se realiza utilizando un microinyector neumático (Picopump PV830, World Precision Instruments). La técnica se presenta, en particular, en las solicitudes de patente WO 2016/05398 y WO 2017/103025.

Previamente se han definido varios períodos de desarrollo del embrión de las gallináceas en función del tiempo de incubación después de la fecundación y se han determinado según los criterios definidos por Hamburger y Hamilton (1951, J Morphol.).

Según la invención, en el momento del injerto de células exógenas, el embrión de ave gallinácea se encuentra en un período de desarrollo comprendido entre el período HH10 y el período HH30.

Preferiblemente, en el momento de la introducción de las células exógenas, el embrión de ave gallinácea se encuentra en un período de desarrollo comprendido entre el período HH12 y el período HH25. Esta fase de desarrollo del embrión, que tiene lugar entre las 40 horas y los 4.5 días posteriores a la fecundación, se caracteriza por numerosos acontecimientos clave de la embriogénesis, entre los que destacan la aparición de somitas, la subdivisión de las grandes regiones cerebrales, las curvaturas de las distintas regiones del embrión y la formación de numerosos órganos.

Según otro aspecto preferente, en el momento de la introducción de células exógenas, el embrión de ave gallinácea se encuentra en un período de desarrollo comprendido entre el período HH10 y el período HH18, entre el período HH10 y el período h H15, o entre el período HH12 y el período HH16.

Preferiblemente, el injerto de células cancerosas se realiza en un embrión receptor de ave gallinácea en un período de desarrollo entre los períodos HH13 y HH15,es decir,entre 48 y 55 horas después de la fertilización, y preferiblemente entre 50 y 53 horas después de la fertilización (período HH14).

En una segunda realización, el procedimiento de la invención comprende los siguientes pasos:

• Injertar al menos una población de células cancerosas en al menos un tejido de un embrión de ave gallinácea en un período de desarrollo comprendido entre el período HH10 y el período HH30,

• Inyectar dicha al menos una población de células inmunitarias en los vasos sanguíneos de dicho embrión, e

• incubar el embrión injertado durante al menos 6 horas a una temperatura comprendida entre 35 °C y 42 °C.

El paso de injerto y los pasos de incubación se han descrito previamente, y se realizan como se ha indicado anteriormente.

En esta implementación del procedimiento, el paso de "inyectar células" corresponde a un paso en el que se introducen células inmunitarias en la circulación sanguínea del embrión mediante cualquier técnica conocida por el experto en la técnica.

Este paso de inyección puede realizarse concomitantemente al paso de injerto de células cancerosas, o antes o después. En particular, el paso de inyección de células inmunitarias puede realizarse en el último período del desarrollo del embrión, es decir, después del período HH30. Sin embargo, en una realización preferente, ambos tipos de células exógenas se introducen en el embrión al mismo tiempo.

En algunos casos, como se muestra en la sección de ejemplos, las células inmunitarias se unirán a las células cancerosas implantadas en al menos un tejido y se infiltrarán en el tumor o tumores. En otros casos, las células inmunitarias circularán por los vasos sanguíneos del embrión y se comprobará su capacidad para actuar sobre el desarrollo de células cancerosas a partir de la circulación sanguínea. En otros casos, las células inmunitarias se unen a las células cancerosas y circulan por los vasos sanguíneos del embrión.

El injerto de la población de células cancerosas puede realizarse en al menos un tejido embrionario que sea relevante con la naturaleza de dicha población de células cancerosas, en particular es representativo de tejidos/órganos en los que se forma(n) tumor(es) primario(s) y/o secundario(s) en pacientes con cáncer.

En el sentido de la invención, dicho tejido "relevante" está de acuerdo con el origen de las células cancerosas, o es un tejido que está habitualmente colonizado por dichas células cancerosas, es decir, donde se implantan tumores secundarios (metástasis).

Las células cancerosas exógenas pueden injertarse en el embrión receptor en diferentes tejidos, y, por ejemplo: en el tejido que constituye el tubo neural (no en el lumen), en los tejidos cerebrales, en tejidos embrionarios que prefiguran estructuras digestivas tales como el hígado, el intestino o el páncreas, en tejidos embrionarios que prefiguran la piel, los huesos y la médula ósea, o en el dominio somítico.

Modelo animal y usos del mismo

La presente invención también se refiere a un modelo animal para el estudio de cánceres humanos que consiste en un embrión quimérico de ave gallinácea como el presentado anteriormente, o susceptible de ser obtenido por cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente.

La presente invención también se refiere a un modelo animal para el estudio de cánceres humanos obtenido por cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente.

Este modelo animal de la invención tiene numerosos usos.

En particular, este modelo animal puede utilizarse para el seguimiento de un paciente afectado por un cáncer. En efecto, tal modelo animal permite observar,ex vivo,el desarrollo del tumor de un paciente, y en particular después de iniciar un tratamiento en un momento T0 (por ejemplo, antes del inicio de dicho tratamiento) y en un momento T1, T2, T3 (por ejemplo, después del inicio del tratamiento del paciente oncológico).

El modelo animal también puede utilizarse para el cribado de moléculas terapéuticas destinadas al tratamiento del cáncer.

En particular, la presente invención se refiere al uso de un modelo animal de la invención para el cribado de al menos una terapia anticancerosa elegida entre el siguiente grupo:

• inmunoterapia: estrategia terapéutica que consiste en promover la actividad antitumoral de las células inmunitarias del paciente,

• quimioterapia: fármacos que afectan a la viabilidad, el metabolismo, la motilidad y/o la proliferación de las células cancerosas,

• terapia dirigida: uso de compuesto(s) tales como anticuerpos dirigidos a una molécula específica expresada por las células cancerosas,

• hormonoterapia: uso de compuesto(s) dirigido(s) a la señalización molecular hormonal,

• fármacos contra el cáncer, y

• enzimas terapéuticas.

Más particularmente, el modelo animal de la invención puede usarse para evaluar la actividad de células CAR-T modificadas genéticamente. En una realización específica, estas células CAR-T son células CAR-T alogénicas, destinadas a ser utilizadas en cualquier paciente. La eficacia y la seguridad de estas células alogénicas pueden probarse en un modelo animal según la invención.

Ejemplos

Aunque la presente invención en el presente documento se ha descrito con referencia a realizaciones particulares, debe entenderse que estas realizaciones son meramente ilustrativas de los principios y aplicaciones de la presente invención. Por lo tanto, debe entenderse que pueden hacerse numerosas modificaciones a las realizaciones ilustrativas y que pueden idearse otras disposiciones sin apartarse del espíritu y el alcance de la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Materiales y procedimientos

Los huevos degallus gallusfecundados se obtuvieron de granjas dedicadas tales como EARL MORIZEAU, DANGERS, FRANCE, y se mantuvieron a 14 °C hasta su uso. Para realizar los experimentos, los huevos se incubaron a 38.5 °C durante 52 horas, con el fin de obtener embriones en el período de desarrollo HH13 a HH16, según la nomenclatura de Hamilton.

Para las manipulaciones, se abrió una ventana en el shell.

Las PBMC humanas y las células tumorales se injertaron utilizando un microinyector en el que se insertan (Pipopump PV830, World Precision Instruments).

1. (1) En algunos experimentos, se inyectaron PBMC humanas en los vasos del embrión, a través de los vasos presentes en la membrana corioalantoidea. Las células cancerosas se injertan según el procedimiento descrito en las solicitudes de patente WO 2016/05398yWO 2017/103025.

2. (2) En otros experimentos, ambos tipos de células se coinjertaron en lugares escogidos del embrión, dentro del tejido en el que las células tumorales humanas forman tumores, para establecer tumores con un estroma de células inmunitarias humanas.

Los embriones se mantuvieron en incubación durante 24 horas a 48 horas después del injerto de células cancerosas. Se recogieron de los huevos y se procesaron para diferentes experimentos. En algunos experimentos, los embriones se digirieron con colagenasa y se aislaron células humanas para su posterior análisis. En otros experimentos, los embriones se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante toda la noche, a 4 °C. Los embriones se limpiaron para obtener imágenes con microscopio de lámina de luz (LaVision Biotec).

I. Demostración de la viabilidad del injerto de PBMC en un modelo de embrión aviar

Ejemplo 1

Condiciones (1): Se abrió la cáscara de los huevos embrionados de pollo. Se inyectaron PBMC humanas de donantes sanos en la vasculatura (circulación sanguínea) del embrión.

Condiciones (2): se prepararon las PBMC, se marcaron con un trazador fluorescente vital y se injertaron mediante inyección utilizando un microcapilar en tejidos diana del embrión aviar.

Dos días después de la inyección de PBMC (1) o del injerto (2), se recogieron los embriones, se fijaron en paraformaldehído, se visualizaron con un estereomicroscopio y, a continuación, se aclararon y se visualizaron mediante microscopía de lámina de luz.

En otros experimentos, los embriones se digirieron con colagenasa, y las PBMC se purificaron en gradiente Percoll.

En ambas condiciones experimentales, se encontraron PBMC vivas en los tejidos embrionarios aviares, como se muestra en las figuras 1A y 1B.

Ejemplo 2

En otro experimento, se marcaron PBMC de donantes sanos con un trazador fluorescente vital (CFSE: carboxifluoresceína succinimidílico éster) y, a continuación, se inyectaron en la vasculatura de embriones de pollo a las 56h después de la gestación (HH13-HH15).

Dos días después, se recogieron los embriones, se digirieron con colagenasa después de retirar la cabeza. Las PBMC se aislaron mediante técnicas de gradiente FICOLL y PERCOLL y las células PBMC fluorescentes se analizaron mediante FACS.

Los resultados se presentan en la figura 2, y demuestran que las PBMC inyectadas están vivas 48 horas después de su introducción en el embrión.

Ejemplo 3

Se inyectaron PBMC en la vasculatura del embrión en diferentes dosis. Dos días (48 horas) después de la inyección, se contaron las PBMC aisladas para determinar el porcentaje de supervivencia.

Los resultados se presentan en la figura 3. La supervivencia celular se vio comprometida a dosis elevadas, tales como 6*105 células/pl (triángulo negro), en comparación con la inyección de cantidad inferior de PBMC (dilución en 2), en la que se observó una buena supervivencia. Parece que, más que la cantidad absoluta de células, la concentración de células inyectadas es un parámetro importante para la supervivencia celular.

Ejemplo 4

Se prepararon PBMC a partir de muestras de sangre humana, y se injertaron en los tejidos del embrión aviar a las 56 horas después de la puesta (HH14).

Dos días después del injerto, se recogieron los embriones y se digirieron utilizando colagenasa. Se purificaron las células inmunitarias y se analizaron las subpoblaciones de células inmunitarias en FACS con marcadores moleculares, para determinar la proporción de la población de linfocitos B (CD19+) y T (CD3+CD4+ y CD3+CD8+) sobre la población total de células inmunitarias. A continuación, se controlaron todas las subpoblaciones principales de PBMC: Linfocitos (B y T), Natural Killer, células mieloides (aquí denominadas monocitos) sobre la población total de PBMC (células CD45+).

Los resultados se presentan en las figuras 4A, 4B y 4C. "PBMC" designa las células inmunitarias antes del injerto; "AVI-PBMC" designa las células PBMC injertadas y analizadas después del aislamiento Percoll a partir de embriones tratados con colagenasa.

En la Figura 4A, los valores se expresan en relaciones del total de linfocitos identificados (CD19+ y CD3+).

En estas condiciones, la proporción de la población de linfocitos B sobre la población total de células inmunitarias fue más débil en el embrión de pollo, en comparación con la población de PBMC frescas. Esta diferencia de proporciones también se observa en modelos murinos de xenoinjerto (PDX).

La Figura 4B muestra la repartición de subpoblaciones de células inmunitarias, antes de su injerto (PBMC) y 48 horas después de su injerto en el embrión de pollo (AVI-PBMC). Curiosamente, todas las subpoblaciones de PBMc se han mantenido después del injerto en el embrión de pollo.

La Figura 4C muestra la expresión de marcadores de activación (CD69, CD25) y agotamiento (PD1, TIM-3) por células inmunitarias, antes de su injerto (PBMC) y 48 horas después de su injerto en el embrión de pollo (AVI-PBMC). Se analizan dos poblaciones de linfocitos T: CD8+ y CD4+.

Excepto en el caso de CD69 que aumenta significativamente después del injerto tanto en linfocitos T CD4° como CD8+, la expresión de otros marcadores se mantiene o aumenta ligeramente después del injerto. La activación de PBMC es bastante débil, lo que demuestra que la reacción alogénica es débil. El injerto de PBMC no perturba el desarrollo del embrión, lo que indica que el huésped y las PBMC injertadas pueden cohabitar.

II. Demostración de la viabilidad de coinjertar PBMC en un modelo de embrión aviar con una línea celular tumoral. Ejemplo 5. Introducción tanto de poblaciones exógenas de células inmunitarias como de células cancerosas.

Las PBMC humanas se marcaron con un trazador fluorescente vital.

Se utilizaron dos líneas celulares tumorales humanas fluorescentes:

• una línea celular de melanoma primario derivada de una muestra de paciente (Pmela, melanoma metastásico BRAF V600), también designada como GLO, y

• Células MDAMB436 (línea celular de cáncer de mama triple negativo, disponible comercialmente), también designadas como MDAM.

Ambos tipos de células se introducen en el embrión como se presenta en la sección de Material y Procedimientos.

Condiciones (1): Se coinjertaron PBMC con células tumorales en tejidos elegidos del embrión.

Condiciones (2): Se inyectaron PBMC en la vasculatura. Las células tumorales se injertaron en tejidos elegidos del embrión.

Dos días después del injerto, se tomaron imágenes de los embriones con un estereomicroscopio. Se midieron los embriones recogidos y se determinó su peso. Se limpiaron los embriones y se tomaron imágenes con microscopía confocal de lámina de luz. Las imágenes se procesaron con un programa informático (IMARIS) para la cuantificación del volumen tumoral.

Con ambas condiciones, se observó la presencia de células inmunitarias dentro de los tumores. El "contingente" inmunitario fue más robusto en términos de cantidad de células con el procedimiento de injerto conjunto. Los resultados para las condiciones (1) se presentan en la figura 5. La imagen "Combinado" representa ambos tipos de poblaciones.

Los resultados para las condiciones (2) se presentan en las figuras 6 y 7.

En la figura 6, un halo más brillante (marcado con una línea de puntos) muestra células inmunitarias que se reagrupan alrededor de los tumores formados en el embrión aviar.

En la figura 7, se etiquetan células tumorales individuales en un tumor implantado en embrión de pollo (imagen de la izquierda), y se etiquetan células inmunitarias de PBMC (imagen de la derecha): las células inmunitarias se reagrupan alrededor de los tumores.

Ejemplo 6. Medida del BSA de los embriones de pollo injertados y del volumen de los tumores, con o sin células inmunitarias.

Se mide el indicador Área de Tamaño Corporal (BSA) para determinar la toxicidad de la introducción de PBMC en los embriones de pollo.

Los resultados presentados en la figura 8 muestran que no se observaron diferencias estadísticas de BSA para los embriones que se injertaron con células de Pmela solas (Glo), o coinjertadas con PBMC (GLO-PBMC).

Los resultados presentados en la figura 9 representan medidas del volumen tumoral cuando se injertaron células de Pmela (Glo) solas o en combinación con PBM<c>humanas (GLO-PBMC), según las condiciones (1).

El gráfico no muestra ninguna diferencia estadística entre los embriones con células cancerosas injertadas y aquellos con un coinjerto de células cancerosas e inmunitarias. Los datos se normalizaron con respecto al Área de Tamaño Corporal (BSA) de los embriones.

Ejemplo 7. Coinjerto de células tumorales y PBMC

En un embrión de pollo, se coinjertaron PBMC con al menos una de las dos líneas celulares tumorales siguientes:

• Pmela - células primarias de melanoma metastásico BRAF V600 (PBMC-GLO)

• MDAMB436 y MDAMB231- línea celular inmortalizada de cáncer de mama triple negativo (PBMC-MDAM)

Dos días después del injerto, se purificaron las PBMC de los embriones y se analizaron por citofluorimetría los marcadores moleculares de las diferentes poblaciones celulares: CD3+, CD4+ y CD8+. Los resultados se presentan en la figura 10A.

Como se muestra, las PBMC reaccionan cuando se injertan en los tejidos embrionarios aviares, en comparación con su estado de reposo previo al injerto. La presencia de células tumorales inhibe la actividad de las células T, lo que provoca una regulación a la baja de los marcadores CD69 y HLADR, devolviendo sus niveles a los de las PBM<c>frescas. Se observan mayores niveles de CTLA4 en las células T CD4 y CD8 después del injerto de PBMC. La administración de Keytruda conduce a una minimización de la expresión/accesibilidad de PD1 en las células T CD8. El bloqueo de PD1 conduce a niveles muy elevados de CTLA4 en el compartimento CD8, lo que sugiere una expresión compensatoria.

La Figura 10B ilustra el patrón de expresiones de marcadores en superficie de células inmunes (CD8+ a la izquierda, CD4+ a la derecha) después del coinjerto de PBMC y células MDAMB231 -que expresan altos niveles de<p>DL1- en un embrión de pollo.

En presencia de células cancerosas, las células inmunitarias incluidas en un tumor presentan:

° un aumento en la expresión de los marcadores de activación CD69 y CD25, en particular entre el grupo CD8+; ° un aumento de la expresión de los marcadores de agotamiento PD1 y TIM-3 (también designados como moduladores de control de puntos de control inmunitarios).

Estos resultados ilustran una reacción en dos pasos de las células inmunitarias a la presencia de células tumorales coinjertadas:

1. (i) Las células tumorales MDAMB 231 activan las células T, como muestra el aumento de la expresión de CD69 y CD25, en comparación con las PBMC injertadas solas;

2. (ii) la inhibición de la respuesta inmunitaria ya es visible, como muestra el aumento de la expresión de los moduladores de control de los puntos de control inmunitarios PD1 y TIM-3. Este patrón de expresión refleja la regulación inmunitaria negativa sobre los linfocitos por parte de las células cancerosas (correlacionada con la "huida" de las células tumorales).

Así, el xenoinjerto de células inmunitarias humanas en el embrión aviar induce su activación y su "neutralización". Esto indica que las células T siguen siendo funcionales cuando se introducen en el embrión aviar y son capaces de reconocer células alogénicas.

III. Demostración de la viabilidad de tratar las PBMC injertadas con inmunoterapia.

Ejemplo 8. Tratamientos con Keytruda (anti-PD1)

Este experimento se realizó para estudiar el estado de células T humanas de PBMC introducidas en el embrión aviar. El compartimento de células T es la diana de varios inhibidores de puntos de control actualmente aprobados, tales como el aCTLA4 y el bloqueo del eje PD1.

En primer lugar, se verificó la expresión de receptores PD1 en PBMC injertadas (figura 11A) y la expresión de PDL1 por células cancerosas (figura 11B). Las células MDAMB436 se cultivaronin vitroe inmunomarcadas con anticuerpo anti-PD L1 para determinar la expresión del ligando de PD1, PDL1. Se realizaron experimentos similares con células Pmela y células MDAMB231.

A continuación, se coinjertaron células MDAMB436 o células Pmela con células PBMC humanas.

Se inyectó un anticuerpo anti-PD1, Keytruda (Pemzolibrumab, Merk), 24 horas después del injerto. A los dos días (48 horas) después del injerto, se aislaron PBMC de embriones injertados y se analizaron por FACs .

Finalmente, las PBMC injertadas se aislaron mediante separación por densidad de Percoll y se tiñeron las células para marcadores de activación (CD69/HLADR) y agotamiento (CTLA4/PD1).

Los resultados se comentan a continuación.

a) Expresión de PD1 por las células inmunitarias injertadas

La Figura 11A ilustra el nivel de expresión de PD1 en la superficie de las células, dentro de células T CD8+ y CD4+ de dos donantes diferentes. Tras el tratamiento con Keytruda (diluido 5 veces), que antagoniza los receptores PD1, la detección de PD1 disminuye significativamente. Estos resultados demuestran que Keytruda sí se une a los receptores PD1 de las células inmunitarias injertadas.

b) Expresión de PDL1 por las células cancerosas injertadas

Los resultados se presentan en la figura 11B. Aproximadamente el 10 % de los MDAMB436 cultivadosin vitropresentan una expresión del ligando PDL1. No se detectó expresión de PDL1 en las células Pmela. La expresión de PDL1 es alta en MDAMB231.

c) Estado de las células T

Entre las células tumorales, Pmela es una línea celular PDL1 negativa, y MDAMB436 es una línea celular PDL1 positiva débil. Los embriones aviares injertados fueron tratados o no con la inmunoterapia anti-PD1 humana Keytruda (K).

Se identificaron subpoblaciones de células mediante FACS después del aislamiento con Percoll de PBMC.

Los resultados se presentan en la figura 11C. Se determinaron marcadores de activación (CD69 y HLADR, a la izquierda) y agotamiento (CTLA-4 y PD1, a la derecha) para cada población de células:

• PBMC frescas (no introducidas en ningún embrión)

• PBMC injertadas

• PBMC injertadas K: el embrión ha sido tratado 24 horas con Keytruda, un anticuerpo anti-PD1

• Pmela injertada/PBMC: coinjerto de células inmunitarias y células cancerosas Pmela que no expresan PDL1 • MDAM/PBMC injertados: coinjerto de células inmunitarias y células cancerosas MDAM, que expresan PDL1 • MDAM/PBMC injertados K: el embrión ha sido tratado 24 horas con Keytruda, un anticuerpo anti-PD1. Las desviaciones estándar muestran datos de un conjunto de PBMC de diferentes donantes sanos. Los valores se expresan en relaciones del marcador específico sobre las poblaciones CD3+CD4+ y CD3+CD8+.

Como regla general, las células T CD4 y CD8 aisladas después del injerto mostraban signos de activación: Las células T CD4 y CD8 fueron ampliamente positivas para CD69, mientras que las células T CD4 adquirieron expresión HLADR. En cuanto a los receptores inhibidores, observamos mayores niveles de CTLA4 en células T CD4 y CD8 después del injerto de PBMC mientras que mayores niveles de PD1 eran ciertos solo para células T CD4.

Así, el xenoinjerto de células inmunitarias humanas en el embrión aviar induce su activación. También se ha descrito la activación de células inmunitarias humanas en un modelo de ratón. Esto indica que las células T siguen siendo funcionales cuando se introducen en el embrión aviar y son capaces de reconocer células alogénicas.

El bloqueo de PD1 condujo a niveles muy elevados de CTLA4 en el compartimento CD8, lo que sugiere una expresión compensatoria.

d) Se realizó otro experimento con células MDAMD231, coinjertadas con PBMC, seguido del tratamiento del embrión injertado con Keytruda (5 mg/ml).

Se cuantificó la expresión de marcadores de activación y agotamiento en células inmunitarias coinjertadas. Los resultados se muestran en la figura 11D.

La expresión de los marcadores de agotamiento PD1 y TIM-3 disminuye con el tratamiento con Keytruda, lo que confirma que Keytruda es capaz de restaurar la capacidad de respuesta de los linfocitos T agotados.

Los marcadores de activación a lo mejor se reinstaurarán posteriormente durante el tratamiento con Keytruda (es probable que 24 horas de administración no sean suficientes para reinstaurar la expresión de estos marcadores de activación). Además, una mayor concentración de Keytruda debería aumentar la activación celular.

En conclusión, 24 horas de administración de Keytruda es capaz de iniciar un procedimiento de reactivación de las células inmunitarias, como se representa por la disminución de la expresión de PD1 y TIM-3.

IV. Demostración del potencial del embrión aviar injertado de la invención, como modelo de seguimiento de la respuesta al tratamiento inmunoterapéutico.

Ejemplo 9. PBMC coinjertadas con la línea celular A375

Para determinar si los tumores compuestos por células tumorales humanas mixtas y células inmunitarias son sensibles al tratamiento con anticuerpos anti-PD1, se seleccionó la línea celular de melanoma humano A375 para los experimentos. De hecho, recientemente se informó de que esta línea celular expresa niveles significativos de PDL1 y responde a la inmunoterapia anti-PD1 (Kuryk L, M0ller Aw , Jaderberg M, 2019).

Se cultivaron células de melanoma A375 y se coinjertaron con células PBMC humanas como se ha descrito previamente.

Se inyectó en el embrión un anticuerpo anti-PD1, Keytruda, o un control negativo (excipiente) 24 horas después del injerto.

Dos o tres días después del injerto, se recogieron los embriones y se procesaron para obtener imágenes con un microscopio confocal de lámina de luz. El volumen de los tumores se cuantificó con el programa IMARIS.

Los resultados se presentan en la figura 12A: en presencia de Keytruda, el volumen del tumor disminuye significativamente, lo que demuestra que las células inmunitarias presentes alrededor de las células cancerosas responden positivamente a este tratamiento inmunoterapéutico.

Ejemplo 10. PBMC coinjertadas con células MDAMB 231 o células del paciente

El mismo experimento del ejemplo 9 se realizó con otras células cancerosas:

• MDAMB 231, bien conocido por responder a la inmunoterapia, y

• una muestra tumoral procedente de un paciente afectado por un melanoma metastásico.

La Figura 12B muestra el efecto de la administración de Keytruda a embriones aviares coinjertados con PBMC humanas y células tumorales MDAMB 231, sobre el volumen tumoral (véanse los paneles central y derecho).

Se observa una reducción significativa del volumen tumoral en la condición tratada con anti-PD1, en comparación con la administración de Nacl.

La Figura 12C muestra el efecto de la administración de Keytruda a embriones aviares coinjertados con PBMC humanas y una muestra tumoral de un paciente afectado por un melanoma metastásico.

Se observa una reducción significativa del volumen metastásico en condiciones de administración de Keytruda. Asimismo, la cantidad de metástasis formadas por células tumorales del paciente en los tejidos embrionarios aviares se ha evaluado mediante el seguimiento de células tumorales marcadas con fluorescencia, y la posterior cuantificación de la señal fluorescente en el embrión.

Tras la administración de Keytruda, la capacidad de metástasis de las células tumorales disminuye significativamente, como se muestra en el histograma titulado "cantidad de metástasis".

Ambos histogramas muestran que la administración de anti-PD1 produce una reducción significativa del volumen y de la cantidad de metástasis formadas por las células tumorales del paciente en los tejidos embrionarios aviares.

Ejemplo 11. Análisis de PBMC 48 horas y 72 horas después del injerto.

Los embriones se cosecharon 48 h (gris claro) o 72 h después del injerto (gris oscuro). Las subpoblaciones se observan sobre la población viva CD45+ y se comparan con PBMC antes del injerto (PBMC D0). Los resultados se presentan en la figura 13.

Todas las subpoblaciones principales de PBMC se encuentran vivas. Algunas poblaciones también se encuentran en mayor proporción a las 72 horas, en comparación con las 48 h posteriores al injerto (población Natural Killer). La reacción alogénica de PBMC contra el hospedador aviar no afecta al desarrollo embrionario después de 72h. Por lo tanto, con el modelo se pueden conseguir 48 horas de tratamiento de inmunoterapia.

Referencias

Patentes

WO 2015/074050

US 2013/0171680

WO 2016/05398

WO 2017/103025

WO 2020/075168

Referencias bibliográficas

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Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Embrión quimérico de ave gallinácea que comprende ambos tipos de células exógenas:

a. Al menos una población de células cancerosas, y

b. Al menos una población de células inmunitarias,

en el que dichas células cancerosas exógenas están presentes en al menos un tejido de dicho embrión, y dichas células inmunitarias exógenas están presentes en al menos un tejido de dicho embrión y/o circulan por los vasos sanguíneos de dicho embrión,

en el que el embrión de ave gallinácea proviene de un pollo(Gallus gallus)o de una codorniz(Coturnix japónica),y en el que dicho tejido embrionario designa cualquier tejido del embrión con excepción de los anexos extraembrionarios y el lumen de tubos y vasos.

2. Embrión quimérico de ave gallinácea según la reivindicación 1, en el que la población de células inmunitarias consiste en Células Mononucleares de Sangre Periférica (PBMC).

3. Embrión quimérico de ave gallinácea según la reivindicación 1, en el que la población de células inmunitarias consiste en linfocitos, en particular células CAR-T modificadas genéticamente.

4. Embrión quimérico de ave gallinácea según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las células cancerosas provienen de un tumor de un paciente.

5. Embrión quimérico de ave gallinácea según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que ambas poblaciones de células son células humanas.

6. Embrión quimérico de ave gallinácea según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que ambos tipos de células exógenas se localizan en el mismo al menos un tejido embrionario, en particular las células inmunitarias están presentes en el tumor o tumores formados por células cancerosas.

7. Embrión quimérico de ave gallinácea según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho al menos un tejido embrionario en el que están presentes células cancerosas es relevante con la naturaleza de la población de células cancerosas, en particular es representativo de tejidos/órganos en los que se forma(n) tumor(es) primario(s) y/o secundario(s) en pacientes con cáncer.

8. Embrión quimérico de ave gallinácea según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que al menos una población de células exógenas está marcada.

9. Procedimiento de obtención de un embrión quimérico de ave gallinácea que comprende ambos tipos de células exógenas:

a. Al menos una población de células cancerosas, y

b. Al menos una población de células inmunitarias,

Dicho procedimiento comprende los siguientes pasos:

- Introducir ambas poblaciones de células inmunitarias y células cancerosas en un embrión de ave gallinácea, en el que el embrión de ave gallinácea se encuentra en un período de desarrollo comprendida entre el período HH10 y el período HH30, y

- incubar el embrión quimérico durante al menos 6 horas a una temperatura comprendida entre 35 °C y 42 °C, en el que dichas células cancerosas exógenas se introducen en al menos un tejido de dicho embrión, y dichas células inmunitarias exógenas se introducen en al menos un tejido de dicho embrión y/o en los vasos sanguíneos de dicho embrión,

en el que el embrión de ave gallinácea proviene de un pollo(Gallus gallus)o de una codorniz(Coturnix japónica),y en el que dicho tejido embrionario designa cualquier tejido del embrión con excepción de los anexos extraembrionarios y el lumen de tubos y vasos.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, que comprende los siguientes pasos:

- Coinjertar ambas poblaciones de células inmunitarias y células cancerosas en al menos un tejido de un embrión de ave gallinácea en un período de desarrollo comprendido entre el período HH10 y el período HH30, y

- incubar el embrión quimérico durante al menos 6 horas a una temperatura comprendida entre 35 °C y 42 °C.

11. Procedimiento según la reivindicación 9, que comprende los siguientes pasos:

- Injertar al menos una población de células cancerosas en al menos un tejido de un embrión de ave gallinácea en un período de desarrollo comprendido entre el período HH10 y el período HH30,

- Inyectar dicha al menos una población de células inmunitarias en los vasos sanguíneos de dicho embrión, e - incubar el embrión injertado durante al menos 6 horas a una temperatura comprendida entre 35 °C y 42 °C.

12. Modelo animal para el estudio de cánceres humanos que consiste en un embrión quimérico de ave gallinácea según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

13. Uso de un modelo animal según la reivindicación 12 para el cribado de al menos una terapia anticancerosa elegida entre el siguiente grupo: inmunoterapia, quimioterapia, terapia dirigida, hormonoterapia, fármacos anticancerosos y enzimas terapéuticas.

14. Uso de un modelo animal según la reivindicación 12 para evaluar la actividad de células CAR-T modificadas genéticamente.