ES3019566T3 - Medical use of interferon-lambda for the treatment of fibrosis - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para el tratamiento de la fibrosis. La invención divulga nuevas investigaciones que demuestran que el interferón lambda tiene efectos antifibróticos de acción directa, tanto in vitro como in vivo, y puede utilizarse para proporcionar nuevas terapias eficaces para el tratamiento de múltiples tipos de fibrosis. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Uso médico de interferón-lambda para el tratamiento de fibrosis

La presente invención se refiere a interferón-lambda para su uso en métodos para el tratamiento de fibrosis. La invención divulga una nueva investigación que demuestra que el interferón-lambda tiene efectos antifibróticos de acción directa tantoin vitrocomoin vivoy se puede usar para proporcionar terapias nuevas y eficaces para el tratamiento de múltiples tipos de fibrosis.

ANTECEDENTES

Las enfermedades fibróticas son enfermedades que se caracterizan por una respuesta de cicatrización aberrante en la que se forma un exceso de tejido conjuntivo fibroso en un órgano o tejido. La deposición y acumulación de exceso de componentes de la matriz extracelular (MEC), tales como el colágeno y la fibronectina, da como resultado el endurecimiento y la cicatrización de tejidos, causando una remodelación patológica del órgano, y puede en último lugar conducir a un fallo del órgano.

La formación de heridas en órganos sólidos empieza normalmente con un daño endotelial, agregación de plaquetas y activación que inicia una respuesta inflamatoria con infiltración de neutrófilos, macrófagos, eosinófilos y linfocitos en el lugar de la herida. Las células inflamatorias infiltrantes y las células epiteliales afectadas secretan una variedad de factores de crecimiento y citocinas que sirven para amplificar aún más la respuesta inflamatoria. Moléculas tales como TGF-p, PDGF e IL-13 activan a los macrófagos y conducen al reclutamiento, a la proliferación y a la activación de fibroblastos en el lugar de la herida. Los fibroblastos o miofibroblastos activados se caracterizan por la expresión de a-actina de músculo liso y secretan colágeno y otros componentes de MEC para estabilizar el sustrato celular. Esto permite la proliferación y migración de células epiteliales y endoteliales sobre la matriz temporal para regenerar el tejido dañado. Una vez completo, el proceso inflamatorio se detiene mientras que los fibroblastos sufren apoptosis, que conduce a la resolución de la respuesta de la herida.

En la remodelación fibrótica, la agresión o lesión persistente del tejido, o una desregulación de la vía de reparación, conduce a una respuesta inapropiada de la herida. Ocurre un exceso de deposición y la hiperreticulación del colágeno y la MEC, dando como resultado una acumulación excesiva de MEC por encima de los requisitos normales, que está asociada con la activación persistente de miofibroblastos, daño a células epiteliales y una pérdida de la arquitectura normal del tejido.

Las enfermedades fibróticas pueden afectar a cualquier órgano o tejido, por ejemplo, el riñón, el pulmón, el intestino, la piel o el hígado. La causa de enfermedad fibrótica puede depender del órgano o tejido implicado y sigue siendo desconocida en algunas enfermedades, tales como la fibrosis pulmonar idiopática. En otros tipos de enfermedad pulmonar intersticial, la causa es reconocida, tal como la exposición a alérgenos ambientales que provoca neumonitis hipersensible. La fibrosis hepática y, en último lugar, la cirrosis resulta de un daño hepático crónico sostenido a través de la exposición a una variedad de factores que incluyen factores ambientales y dietéticos o agentes infecciosos. El consumo prolongado de alcohol o una dieta rica en grasas/azúcares también puede conducir a la cirrosis del hígado. Similarmente, la diabetes, la hipertensión, la exposición a agentes tóxicos y diversos tipos de enfermedad autoinmunitaria pueden dañar los riñones, conduciendo a una remodelación fibrótica y pérdida de función. Muchos tipos de enfermedad inflamatoria del intestino, tales como enfermedad de Crohn o celiaquía, pueden conducir a remodelación fibrótica, causando estrecheces y/o malabsorción.

El tratamiento de la fibrosis progresiva es predominantemente tratando la enfermedad preexistente. Por ejemplo, el control de la tensión arterial, el control mejorado de la glucosa en la diabetes, o la retirada del alérgeno nocivo o causa ambiental. Sin embargo, en muchos pacientes, una vez se ha establecido la remodelación fibrótica, la enfermedad se autoperpetúa y la terapia mejorada simple de la enfermedad iniciadora deja de detener el proceso. Algunas enfermedades fibróticas se pueden tratar con agentes antiinflamatorios e inmunosupresores, pero éstos sólo son eficaces en subconjuntos de pacientes y ralentizan la enfermedad, en vez de detenerla.

Hasta la fecha sólo existen 2 terapias validadas para la remodelación fibrótica y ambas de estas están únicamente autorizadas para su uso en fibrosis pulmonar idiopática (FPI). La pirfenidona es un fármaco de molécula pequeña que fue autorizado para su uso en el tratamiento de FPI en Japón en 2008 y en Europa en 2011 que es probable que funcione a través de múltiples mecanismos de acción que no son completamente entendidos, pero pueden funcionar en parte a través de una regulación por disminución de TGF-p. El nintedanib es un inhibidor de tri-angiocinasas que bloquea la actividad de tirosina cinasas en receptores de VEGF, FGF y PDGF. Ambos compuestos ralentizan el desarrollo de la FPI, pero probablemente solo prolongan la vida durante hasta 2 años basándose en los estudios actuales. Además, ambos están asociados con significativos efectos secundarios de forma que más del 30 % de los pacientes no pueden tolerar su uso a largo plazo. Hasta la fecha, no han sido autorizadas terapias dirigidas para indicaciones fibróticas.

Por lo tanto, actualmente existe una necesidad médica sin cumplir para el tratamiento mejorado de la enfermedad fibrótica en todos los órganos. Por consiguiente, es un objeto de la presente invención proporcionar un nuevo método de tratamiento de la fibrosis.

El descubrimiento y la descripción inicial de la familia del interferón-A (IFN-A) a principios de 2003 abrió un nuevo y excitante capítulo en el campo de la investigación del IFN. Existen 4 proteínas distintas, pero altamente relacionadas, denominadas IFN-A1, IFN-A2, IFN-A3 e IFN-A4. Estas proteínas también se conocen como interleucina-29 (IL-29), IL-28A, IL-28B e IFNL4, respectivamente. Conjuntamente, estas 4 citocinas comprenden el subconjunto de tipo III del IFN. Son distintos de los IFN tanto de tipo I como de tipo II por varios motivos, que incluyen el hecho de que señalizan a través de un complejo de receptor heterodimérico que es diferente de los receptores usados por los IFN de tipo I o tipo II. Aunque los IFN de tipo I (IFN-a/b) y los IFN de tipo III (IFN-I) señalizan a través de distintos complejos de receptores, activan la misma vía de señalización intracelular y muchas de las mismas actividades biológicas, incluidas la actividad antivírica, en una amplia variedad de células diana. De acuerdo con su actividad antivírica, la expresión de los genes IFN-A y sus proteínas correspondientes es inducible por infección con muchos tipos de virus. Por lo tanto, la expresión de IFN de tipo III (IFN-A) y su actividad biológica primaria es muy similar a la de los IFN de tipo I. Sin embargo, a diferencia de los receptores de IFN-a que se expresan ampliamente en la mayoría de los tipos de células, incluidos leucocitos, los receptores de IFN-a están restringidos en gran medida a las células de origen epitelial. La posible importancia clínica del IFN-A como agente terapéutico antivírico novedoso ya es evidente. Además, estudios preclínicos por varios grupos indican que el IFN-A también puede ser útil como un posible agente terapéutico para ciertos tipos de cáncer.

En la presente invención, los presentes inventores divulgan una nueva investigación que demuestra por primera vez que las citocinas de la familia del interferón-lambda tienen efectos antifibróticos de acción directa tantoin vitrocomoin vivo,y que estas proteínas se pueden usar para diseñar métodos nuevos y eficaces para el tratamiento de múltiples tipos de fibrosis.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona interferón-lambda para su uso en el tratamiento de fibrosis, en donde la fibrosis es fibrosis renal, fibrosis pulmonar, fibrosis del intestino delgado o fibrosis de la piel. La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

DESCRIPCIÓN

A menos que se defina lo contrario, todos los términos científicos y técnicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente es entendido por un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención.

La presente divulgación proporciona interferón-lambda para su uso en el tratamiento de fibrosis.

La divulgación también proporciona el uso de interferón-lambda para la preparación de un medicamento para el tratamiento de fibrosis. La divulgación proporciona además un método para el tratamiento de fibrosis que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de interferón-lambda.

Los interferones (IFN) son una clase importante de citocinas con diversas funciones en la protección de hospedadores de la infección vírica y la modulación de la respuesta inmunitaria. Se reconocen tres tipos distintos de interferones (tipo I, II y III) basándose en sus características estructurales, uso del receptor y actividades biológicas, y sus funciones en la defensa del hospedador varían entre los diferentes tipos.

Los IFN de tipo I (IFN-a/p/w/s/K en seres humanos) poseen una fuerte actividad antivírica y son capaces de inducir una potente respuesta antivírica en una amplia variedad de tipos de células (Huang et al., 1993). El IFN-a/p se une al receptor transmembranario heterodimérico denominado IFNaR (compuesto de subunidades de IFNAR1 y IFNAR2) que, tras el acoplamiento al ligando, desencadena la activación de las cinasas, JAK1 y TYK2, que entonces fosforilan tirosinas específicas en el dominio intracelular del receptor. Esto crea sitios de acoplamiento para las moléculas de señalización STAT1 y STAT2, que conducen a su reclutamiento y posterior fosforilación. Los STAT fosforilados reclutan el factor 9 regulador de IFN (IRF9), que juntos forman el factor 3 génico estimulado por IFN (ISGF3), que atraviesa el núcleo y acciona la transcripción de genes estimulados por IFN (ISG).

La clase de tipo II incluye solo IFN-y, que se clasifica como una citocina de tipo Th1 que estimula respuestas inmunitarias celulares que son importantes para la protección del hospedador contra microorganismos patógenos, tales comoMycobacterium tuberculosis(Bach et al., 1997), tiene una función central en la inmunidad tumoral y amplifica la actividad antivírica de IFN de tipo I. Por lo tanto, los IFN de tipo I y tipo II trabajan juntos para activar respuestas inmunitarias tanto innatas como adaptativas, con el fin de proteger al hospedador contra tanto la infección como la invasión tumoral (Biron et al., 2001).

Los IFN son parte de la familia más grande de citocinas de la clase II que incluyen seis citocinas relacionadas con IL-10: IL-10, IL-19, IL-20, IL-22, IL-24 e IL-26 (Kotenko 2002) y se clasifican juntas debido a que señalizan a través de receptores que comparten motivos comunes en sus dominios extracelulares. Estos receptores comprenden la familia de receptores de citocina de clase II (CRF2) y normalmente son heterodímeros compuestos de 2 cadenas de receptores distintas, las subunidades de receptores a y p (Stahl et al., 1993). En general, las subunidades a son las proteínas de unión a citocina primarias, y las subunidades p se requieren para la formación de sitios de unión de alta afinidad y para la transducción de señales.

Los IFN de tipo III o IFN-A son la adición más reciente a la familia de CRF2. Demuestran características estructurales de las citocinas relacionadas con IL-10 e inducen la actividad antivírica en una población más restringida de células que los IFN de tipo I, concretamente células epiteliales y ciertas células inmunitarias (Kotenko et al., 2003; Sheppard et al., 2003). En seres humanos, la familia de IFN de tipo III está compuesta por 4 proteínas estrechamente relacionadas, IFN-A1, -A2, -A3 y -A4 (también conocidas como IL-29, IL-28A, IL-28B e IFNL4, respectivamente), mientras que el ratón solo tiene IFN-A2 y -A3 (IL-28A e IL-28B, respectivamente). Son altamente homólogos; la identidad de aminoácidos entre IFN-A2 y IFN-A3 es ~96 % y la identidad entre IFN-A1 y IFN-A2/A3 es ~81 %. IFN-A4 se parece más estrechamente a IFN-A3, pero estas proteínas solo comparten ~30 % de identidad y IFN-A4 es predominantemente intracelular y se secreta muy poco en seres humanos (Hong et al., 2016).

El complejo receptor de IFN-A está compuesto por la cadena 1 del receptor de IFN-A específico (IFN-AR1 o IL-28RA) y la cadena 2 del receptor de IL-10 compartido (IL-10R2 o IL-10Rp). El acoplamiento del complejo receptor de IFN-A por cualquiera de los cuatro ligandos conduce a la activación de JAK1 y TYK2, la activación de los factores de transcripción STAT1, STAT2 y IRF9 para formar el factor 3 génico estimulado por IFN (ISGF3). El ISGF3 regula la transcripción génica uniéndose a los elementos estimulados por IFN (ISRE) en los promotores de varios cientos de genes estimulados por IFN (ISG) que incluyen varios genes que están asociados con el fenotipo antivírico, que incluyeOAS1, MX1, EIF2AK2(proteína cinasa activada por ARN bicatenario) e IRF7. Los análisis comparativos de micromatrices de ADNc han mostrado que el repertorio de genes que se induce por IFN de tipo III (IFN-A) es esencialmente el mismo que el inducido por IFN de tipo I (IFN-a/p) (Doyle et al., 2006). En conclusión, a pesar del uso de diferentes receptores, los IFN tanto de tipo I como III activan ISGF3 (Zhou et al., 2007), y por lo tanto, inducen respuestas transcripcionales similares.

Aún cuando el patrón de expresión génica inducido por IFN tanto de tipo I como de tipo III sea muy similar, la magnitud relativa de la expresión génica inducida por IFN-a es frecuentemente superior a IFN-A. Esto puede reflejar una diferencia en la intensidad relativa de la señalización a través de los receptores de tipo I frente a de tipo III o simplemente puede reflejar diferencias en los niveles de expresión de los receptores respectivos para estos ligandos.

La estructura cristalina de IFN-A revela una estructura de haz de cuatro hélices típica de las citocina de clase II, siendo IL-22 el homólogo estructural más próximo de IFN-A (Gad et al., 2009) y puede indicar que IFN-A e IL-22 poseen funciones paralelas, que protegen el tejido epitelial contra las infecciones víricas y bacterianas, respectivamente. El sitio de unión en la cadena del receptor de IFN-AR1 está muy bien conservado entre los cuatro IFN-A, mientras que el sitio de unión en IL-10R2 está poco definido (Miknis et al., 2010). IFN-AR1 consiste en dos dominios de fibronectina de tipo III distintos de aproximadamente 100 aminoácidos cada uno. La interfase ligandoreceptor incluye la hélice A, el bucle AB y la hélice F en el sitio IFN, así como bucles principalmente del dominio aminoterminal y la región bisagra interdominio de IFN-AR1. El modo de unión entre el ligando y el receptor soportan una interacción iónica inicial de largo intervalo mediada través del enlace de hidrógeno, que entonces va seguido de interacciones hidrófobas para finalizar el ajuste.

Los IFN-A se expresan mediante una variedad de células hematopoyéticas y células epiteliales en respuesta a la infección vírica. Los receptores de reconocimiento de patrones que detectan el virus invasor sobre la superficie epitelial de la mucosa inician una respuesta transcripcional a través de los factores de transcripción NF-kB, IRF3,<i>R<f>7 y Med23 (Osterlund et al., 2007, Griffiths et al., 2013). Se ha mostrado que la función de los IFN de tipo I y tipo III en mediar en las defensas antivíricas en las interfases mucosas es tanto redundante como única, dependiendo del virus y el punto de entrada. Las células epiteliales del intestino responden exclusivamente al IFN de tipo III que media en el control de virus epiteliotrópicos, tales como los rotavirus, en un modo no redundante (Pott et al., 2011). Los reovirus inician su infección en los epitelios intestinales, pero pueden penetrar en la capa epitelial intestinal para causar una infección sistémica en ratones; el IFN de tipo III restringe la replicación inicial en el epitelio intestinal, pero los IFN de tipo I son indispensables para la prevención de la infección sistémica (Mahlakoiv et al., 2015). La compartimentalización de los IFN de tipo I y III es menos clara en las vías respiratorias donde existe un grado de redundancia entre los dos sistemas de IFN (Mordstein et al., 2008). Por lo tanto, los epitelios de las vías respiratorias expresan receptores para ambos tipos de IFN, mientras que los epitelios intestinales solo expresaron receptores de IFN-A.

La expresión del receptor IFN-AR1 está restringida principalmente a células epiteliales y ciertos subconjuntos de células inmunitarias, tales como macrófagos derivados de monocitos, células dendríticas plasmacitoides y células NK en ciertos escenarios. La activación de IFN-AR1 en células NK está asociada a la producción máxima de IFN-y y actividad antitumoral, que puede ser un efecto mediado sinérgicamente con otros estímulos o en combinación con otros tipos de células (Souza-Fonseca-Guimaraes et al., 2015). Debido a la expresión restringida de IFN-AR1 a células inmunitarias y células epiteliales, los efectos inmunomoduladores de los IFN de tipo III están limitados, pero son antivíricos muy eficaces cuando una respuesta mucosa local es suficiente para controlar el virus. Esto es a diferencia de la actividad ubicua de los IFN de tipo I durante las respuestas a la infección y, por lo tanto, más apropiado en el control de infección grave o sistémica donde se necesita la activación inmunitaria generalizada.

Las siguientes referencias describen diferencias en la señalización y los efectos biológicos entre los interferones de tipo I y tipo III: Wack et al., 2015, Chow & Gale 2015, Hemann et al., 2017, Broggi et al., 2017, Blumer et al., 2017, Chiriac et al., 2017, Bhushal et al 2017, Andreakos et al., 2017, y Bhushal et al., 2017.

La contribución de IFN-A a las terapias antivíricas está bien establecida con datos disponibles en modelos preclínicos en ratones y chimpancés e,in vitro,en hepatocitos humanos primarios infectados con el virus de la hepatitis C (VHC) (Thomas et al., 2012, Park et al., 2012) y en ensayos clínicos humanos (datos de Phil BMS). La gama de virus a los que se puede dirigir el IFN-A incluyen, pero no se restringen a, los siguientes: gripe A/B, síndrome respiratorio agudo grave (SARS), coronavirus, H1N1, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus del herpes simple de tipo 2 (HSV2), citomegalovirus (CMV), síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS), norovirus, rotavirus y Ébola (Eslam y George 2015; Gresser 2015). Todos estos virus se dirigen a un punto de entrada epitelial y terapéuticamente el IFN-A podría dirigirse a ellos, que puede activar el complejo del receptor IFN-AR1 en este punto de acceso.

Numerosos estudios preclínicos han demostrado que los IFN-A tienen actividad antitumoral en una variedad de tipos tumorales, tales como hepatoma, melanoma, carcinoma esofágico, tumores neuroendocrinos, carcinoma colorrectal, adenocarcinoma de pulmón y linfoma de Burkitt (Sato et al., 2006, Zitzmann et al., 2006, Steen et al., 2010). Los mecanismos antitumorales de IFN-A son la inducción de la apoptosis por células tumorales y un efecto directo sobre las células inmunitarias para reforzar tanto las actividades estimulantes inmunitarias innatas como las adaptativas. Los IFN-A se inducen en el microentorno tumoral y se ha mostrado que la señalización a través del receptor de IFN-AR1 desempeña una función antitumoral en los ratones con genes IFN-AR1 inactivados que son más susceptibles a la formación de sarcoma y la muerte en modelos de tumor trasplantado. El tratamiento con IFN-A retrasó la letalidad y redujo el desarrollo de sarcoma (Numasaki et al., 2007). En el contexto del tratamiento del cáncer, podría preverse que los IFN-A complementaran la terapia actual con IFN-a, inhibidores inmunitarios del punto de control, o como auxiliares a agentes antineoplásicos tradicionales, tales como bortezomib, temozolomida, cisplatino o 5-FU (Guenterberg et al., 2010, Li et al., 2010).

La evidencia genética y funcional ha sugerido una función protectora para IFN-A en enfermedades inflamatorias, tales como asma, psoriasis y artritis reumatoide. En un modelo de ratón de asma, el IFN-A minimizó la gravedad de la enfermedad, redujo la infiltración de eosinófilos y demostró un efecto de sesgo inmunitario de Th1 lejos de la citocinas Th2 y Th17 (Koltsida et al., 2011). En un modelo de ratón de artritis inducida por colágeno, el tratamiento con IFN-A2 produjo la anulación de la enfermedad suprimiendo las respuestas de IL-1 e IL-17, así como el reclutamiento de neutrófilos (Blazek et al., 2015). En lesiones psoriásicas, se ha mostrado que las células Th17 son una fuente de IFN-A, donde pueden suprimir la citocina Th2, IL-13 (Wolk et al., 2013). La función de IFN-A en enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias es todavía ambigua.

Tres estudios de asociación de genoma completo (GWAS) fundamentales sobre el VHC han mostrado que los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en la región de IFN-A son el factor pronóstico individual más fuerte de tanto la respuesta a la terapia con IFN-A1/ribavirina pegilada (PEG-IFN/RBV) como la depuración espontánea de la infección crónica por el VHC. Estos SNP se mapean en el sitio del gen IFNL3/IFNL4 y se ha mostrado que son eficaces para todos los genotipos del VHC y en todas las ubicaciones geográficas (Ge et al., 2009, Suppiah et al., 2009, Tanaka et al., 2009). La función del genotipo de IFNL3/IFNL4 en predecir los resultados del tratamiento a todas las terapias antivíricas (incluyendo los fármacos antivíricos de acción directa tanto de primera como de segunda generación) también se extiende a una amplia lista de otras infecciones víricas que incluyen CMV, VHS y virus de Epstein-Barr (VEB), y también a la coinfección con VHC/VIH y VHC/VHB (Rallon et 2010, Guo et al., 2013). Los datos están de acuerdo con una función primaria para IFN-A en controlar las infecciones víricas en diferentes órganos, particularmente los de origen epitelial.

Hay pruebas de la función de dos SNP en la fibrosis hepática, concretamente los genotipos 'respondedores' rs12979860 y rs8099917, y la aceleración de la inflamación hepática y fibrosis, en las infecciones del virus de la hepatitis C y hepatitis B y esteatosis hepática no alcohólica (Bochud et al., 2012, Eslam et al., 2015).

Se han descrito dos variantes funcionales en la región de IFNL3/IFNL4 que conectan con el descubrimiento de GWAS original, pero podría haber muchos otros factores contribuyentes hasta ahora no identificados. El primer SNP es AG/TT (rs368234815) que controla la producción de IFN-A4 y también predice la depuración del VHC (Prokunina-Olsson et al., 2013). El alelo 'AG' ancestral codifica un IFN-A4 funcional, que altera la depuración del VHC y, por tanto, aumenta la carga vírica, mientras que el alelo 'TT' más reciente (en términos evolutivos) de rs368234815 altera el marco de lectura abierto de IFNL4 (alterando la expresión de proteínas) y está asociado con depuración vírica mejorada. Esta evidente paradoja se puede unir a la localización predominantemente intracelular y a la mala secreción de IFNL4 y a la sugerencia de que IFNL4 puede inhibir la secreción y, por tanto, la función de los otros miembros de la familia de IFN-A. Un segundo SNP en la región 3'UTR de IFNL3 (rs4803217) afecta la estabilidad del ARN mensajero de IFNL3 (McFarland et al., 2014). Aunque la función de estas variantes en predecir la fibrosis hepática es desconocida, especialmente en cohortes distintas del VHC, están en desequilibrio de enlace con rs12979860, por lo que se necesita más trabajo para mostrar si existe alguna asociación.

En resumen, hasta la fecha, se ha descrito que los IFN-A tienen actividad antivírica y antitumoral, funciones inmunoinflamatorias y efectos homeostáticos. En la presente invención, los presentes inventores desvelan que los IFN-A tienen inesperadamente efectos antifibróticos de acción directa tantoin vitrocomoin vivo.Los ejemplos demuestran que las proteínas de interferón-lambda tienen efectos antifibróticos en modelosin vivode ratón de enfermedad renal crónica y en modelosin vitrode fibrosis humana con células primarias relevantes de los aparatos y sistemas del hígado, intestino delgado, piel, riñón y pulmón. Estas proteínas, por lo tanto, tienen un potencial inesperado como agentes antifibróticos en múltiples tipos de fibrosis, y se pueden usar para diseñar terapias nuevas y eficaces para el tratamiento de enfermedades fibróticas.

Los términos interferón-lambda (IFN-A) e interferones-lambda (IFN-A) se usan indistintamente en el presente documento para referirse a citocinas de la familia del interferón-lambda. Las proteínas de interferón-lambda y el receptor de interferón-lambda también se conocen por varios otros sinónimos, como se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1

En una realización, el interferón-lambda es IFN-A1.

En una realización, el interferón-lambda es IFN-A2.

En una realización, el interferón-lambda es IFN-A3.

En una realización, el interferón-lambda es IFN-A4.

Las secuencias de aminoácidos y de ADN para IFN-A1, IFN-A2, IFN-A3 e IFN-A4 se muestran en la Figura 18.

El IFN-A se puede usar en forma de una proteína de fusión, tal como una fusión de Fc. Una proteína de fusión de Fc está compuesta de un dominio Fc de un anticuerpo (por ejemplo, una IgG) fusionado con el IFN-A. Las proteínas de fusión de Fc forman dímeros como resultado de la asociación de los dominios Fc. El IFN-A puede así estar en forma dimérica, así como en forma monomérica.

Miméticos funcionales

En la presente divulgación, pero no como parte de la invención reivindicada, el término ''mimético funcional" significa una molécula que tiene los mismos efectos biológicos que la proteína natural o similares. Por ejemplo, un mimético funcional de interferón-lambda puede activar el receptor de interferón-lambda y conducir a la transcripción de genes estimulados por IFN.

Un mimético funcional puede reducir los niveles de hidroxiprolina en un modelo de fibrosisin vivocomo se describe en el Ejemplo 1. Un mimético funcional puede inhibir la deposición de fibronectina y/o colágeno en un modelo de fibrosisin vitrocomo se describe en el Ejemplo 2.

Un mimético funcional de interferón-lambda puede ser un fragmento de IFN-A1.

Un mimético funcional de interferón-lambda puede ser un fragmento de IFN-A2.

Un mimético funcional de interferón-lambda puede ser un fragmento de IFN-A3.

Un mimético funcional de interferón-lambda puede ser un fragmento de IFN-A4.

Un mimético funcional de interferón-lambda puede ser una variante de IFN-A1.

Un mimético funcional de interferón-lambda puede ser una variante de IFN-A2.

Un mimético funcional de interferón-lambda puede ser una variante de IFN-A3.

Un mimético funcional de interferón-lambda puede ser una variante de IFN-A4.

Un interferón-lambda de variante puede ser o puede comprender una variante de una de las secuencias específicas como se muestra en la Figura 18. Por ejemplo, una variante puede ser una variante de sustitución, deleción o adición de cualquiera de las secuencias de aminoácidos en la Figura 18. Un fragmento de un IFN-A puede tener, por ejemplo, un tamaño superior a 50 aminoácidos, superior a 100 aminoácidos o superior a 150 aminoácidos.

Un interferón-lambda de variante puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, hasta 10, hasta 20 o más (normalmente hasta un máximo de 50) sustituciones, deleciones y/o adiciones de aminoácidos en comparación con las secuencias de aminoácidos específicas en la Figura 18. Las variantes de "deleción" pueden comprender la deleción de aminoácidos individuales, deleción de pequeños grupos de aminoácidos, tales como 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, o deleción de regiones de aminoácidos más grandes, tales como la deleción de dominios de aminoácidos específicos u otras características. Las variantes de "sustitución" implican normalmente la sustitución de uno o más aminoácidos con el mismo número de aminoácidos y hacer sustituciones de aminoácidos conservativas. Por ejemplo, un aminoácido se puede sustituir con un aminoácido alternativo que tiene propiedades similares, por ejemplo, otro aminoácido básico, otro aminoácido ácido, otro aminoácido neutro, otro aminoácido cargado, otro aminoácido hidrófilo, otro aminoácido hidrófobo, otro aminoácido polar, otro aminoácido aromático u otro aminoácido alifático. Algunas propiedades de los 20 aminoácidos principales que se pueden usar para seleccionar sustituyentes adecuados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2

Un interferón-lambda de variante puede tener una secuencia de aminoácidos que tiene más de aproximadamente 60 %, o más de aproximadamente 70 %, por ejemplo 75 u 80 %, normalmente más de aproximadamente 85 %, por ejemplo, más de aproximadamente 90 o 95 % de identidad de aminoácidos con las secuencias de aminoácidos en la Figura 18. Las variantes pueden retener al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con las secuencias en la Figura 18. Las variantes retienen normalmente aproximadamente 60 % - aproximadamente 99 % de identidad, aproximadamente 80 % - aproximadamente 99 % de identidad, aproximadamente 90 % - aproximadamente 99 % de identidad o aproximadamente 95 % -aproximadamente 99 % de identidad. Este nivel de identidad de aminoácidos se puede observar a través de la longitud completa de la secuencia de SEQ ID NO relevante o a través de una parte de la secuencia, tal como a través de aproximadamente 20, 30, 50, 75, 100, 150, 200 o más aminoácidos.

El término "identidad", como se usa en el presente documento, indica que en cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el residuo de aminoácido es idéntico entre las secuencias. El término "similitud", como se usa en el presente documento, indica que, en cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el residuo de aminoácido es de un tipo similar entre las secuencias. Por ejemplo, la leucina se puede sustituir con isoleucina o valina. Otros aminoácidos que se pueden sustituir frecuentemente con otro incluyen, pero no se limitan a:

• fenilalanina, tirosina y triptófano (aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas)

• lisina, arginina e histidina (aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas);

• aspartato y glutamato (aminoácidos que tienen cadenas laterales amida); y

• cisteína y metionina (aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre).

Un mimético funcional de interferón-lambda puede ser un derivado de IFN-A1.

Un mimético funcional de interferón-lambda puede ser un derivado de IFN-A2.

Un mimético funcional de interferón-lambda puede ser un derivado de IFN-A3.

Un mimético funcional de interferón-lambda puede ser un derivado de IFN-A4.

En una realización, el interferón-lambda puede ser o puede comprender un derivado de una de las secuencias específicas como se muestra en la Figura 18. En un ejemplo, un derivado puede incluir un análogo estructural de un aminoácido que existe de forma natural. Alternativamente, un aminoácido se puede modificar, por ejemplo, marcar. En una realización, el interferón-lambda para su uso en la invención está pegilado, es decir, el interferón-lambda se une covalentemente a poli(etilenglicol) (PEG). Los métodos de producción de proteínas pegiladas se conocen bien en la técnica, véase, por ejemplo, Chapman A et al., 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54: 531 -545.

En una realización, el interferón-lambda pegilado es peginterferón lambda-1a "lambda" (Andersen et al., 2013). "Lambda" es un agente terapéutico en fase de investigación de interferón de tipo III desarrollado originalmente en ZymoGenetics (ahora una subsidiaria en propiedad absoluta de Bristol-Myers Squibb). Se concedió la licencia a Eiger Biopharmaceuticals en 2016 y actualmente se encuentra en desarrollo clínico para el tratamiento de la infección crónica por el virus de la hepatitis delta (VHD).

Un mimético funcional de interferón-lambda puede ser un anticuerpo.

Las moléculas de anticuerpo para su uso en la presente divulgación pueden comprender una molécula de anticuerpo completa que tiene cadenas pesadas y ligeras de longitud completa, o un fragmento o porción de unión al antígeno del mismo. El término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad para unirse selectivamente a un antígeno. Se ha mostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo se puede realizar por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los anticuerpos y fragmentos y porciones de unión al antígeno de los mismos pueden ser, pero no se limitan a, Fab, Fab modificado, Fab', Fab' modificado, F(ab')2, Fv, anticuerpos de un solo dominio (por ejemplo, VH o VL o VHH), scFv, anticuerpos bi, tri o tetra-valentes, Bis-scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y fragmentos de unión al epítopo de cualquiera de los anteriores (véase, por ejemplo, Holliger y Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136; Adair y Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217). Los métodos para crear y fabricar estos fragmentos de anticuerpos se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181). Otros fragmentos de anticuerpos para su uso en la presente divulgación incluyen los fragmentos Fab y Fab' descritos en las solicitudes de patente internacional WO 2005/003169, WO 2005/003170 y WO 2005/003171 y fragmentos Fab-dAb descritos en la solicitud de patente internacional WO2009/040562. Los anticuerpos multivalentes pueden comprender múltiples especificidades o pueden ser monoespecíficos (véanse, por ejemplo, los documentos de patente WO 92/22853 y WO 05/113605). Estos fragmentos de anticuerpos se pueden obtener usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos se pueden cribar para su utilidad del mismo modo que los anticuerpos intactos.

El anticuerpo para su uso en la divulgación es un mimético funcional de interferón-lambda y provoca los mismos efectos biológicos que la proteína natural o similares. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse a un epítopo en el receptor de interferón-lambda, activar la señalización del receptor y conducir la transcripción de genes estimulados por IFN.

Un derivado de interferón-lambda puede ser una entidad química de molécula pequeña (tal como una entidad química con un peso molecular inferior a 900 dáltones).

Los métodos de cribado de bibliotecas químicas para identificar entidades químicas de molécula pequeña que pueden ser posibles candidatos a fármaco se conocen en la técnica. Por ejemplo, se puede probar una biblioteca química en un ensayo de unión ligando-receptor, o en un modelo de cultivo celular de fibrosis de órgano, como se describe en el Ejemplo 2.

Enfermedades fibróticas

Ejemplos de enfermedades fibróticas que se pueden tratar usando el interferón-lambda según la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, enfermedad pulmonar intersticial, fibrosis pulmonar, tal como fibrosis pulmonar idiopática, silicosis, neumonitis por hipersensibilidad, neumonía intersticial no específica, pulmón reumatoide, esclerodermia, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y fibrosis quística; fibrosis renal (incluyendo glomerulonefritis crónica, nefropatías tubulointersticiales y enfermedades genéticas del riñón), tales como nefropatía diabética, nefroesclerosis hipertensiva, glomeruloesclerosis focal y segmentaria, nefropatía por IgA, glomerulonefritis proliferativa mesangial, nefropatía membranosa, enfermedad renovascular, enfermedad renal poliquística, nefropatía crónica por aloinjerto y enfermedad de Goodpasture; fibrosis hepática y cirrosis hepática que incluyen colangitis esclerosante primaria, cirrosis biliar primaria, enfermedades hepáticas inducidas por el alcohol y esteatohepatitis no alcohólica (incluyendo otras enfermedades de ácido graso hígado); así como fibrosis endomiocárdica, fibrosis mediastinal, mielofibrosis, fibrosis retroperitoneal, fibrosis peritoneal encapsulante, fibrosis masiva progresiva, fibrosis sistémica nefrogénica, enfermedad de Crohn (más otras enfermedades causantes de estrecheces intestinales), queloide, infarto de miocardio, esclerodermia, esclerosis sistémica y artrofibrosis. En la presente invención, la fibrosis que se va a tratar es fibrosis renal, fibrosis pulmonar, fibrosis del intestino delgado, o fibrosis de la piel.

En una realización, la fibrosis es fibrosis renal (en cuyo caso el IFN-A puede ser IFN-A1, IFN-A2, IFN-A3 o IFN-A4). En una realización, la fibrosis es fibrosis pulmonar (en cuyo caso el IFN-A puede ser IFN-A1, IFN-A2, IFN-A3 o IFN-A4).

En una realización, la fibrosis es fibrosis del intestino delgado (en cuyo caso el IFN-A puede ser IFN-A1, IFN-A2, IFN-A3 o IFN-A4).

En una realización, la fibrosis es fibrosis de la piel (en cuyo caso el IFN-A puede ser IFN-A1, IFN-A2, IFN-A3 o IFN-A4).

En un aspecto de la divulgación, la fibrosis es fibrosis hepática (en cuyo caso el IFN-A puede ser IFN-A1, IFN-A2, IFN-A3 o IFN-A4).

En un aspecto de la divulgación, la fibrosis es fibrosis peritoneal (en cuyo caso el IFN-A puede ser IFN-A1, IFN-A2, IFN-A3 o IFN-A4).

En un aspecto de la divulgación, la fibrosis es fibrosis pancreática (en cuyo caso el IFN-A puede ser IFN-A1, IFN-A2, IFN-A3 o IFN-A4).

En un aspecto de la divulgación, la fibrosis es aterosclerosis (en cuyo caso el IFN-A puede ser IFN-A1, IFN-A2, IFN-A3 o IFN-A4).

En un aspecto de la divulgación, la fibrosis se selecciona del grupo que consiste en fibrosis renal, fibrosis pulmonar, fibrosis del intestino delgado, fibrosis de la piel, fibrosis hepática, fibrosis peritoneal, fibrosis pancreática y aterosclerosis.

En un aspecto de la divulgación, la fibrosis se selecciona del grupo que consiste en fibrosis renal, fibrosis pulmonar, fibrosis del intestino delgado, fibrosis de la piel, fibrosis peritoneal, fibrosis pancreática y aterosclerosis.

En un aspecto de la divulgación, la fibrosis no se asocia a una infección microbiana, por ejemplo, una infección vírica. Por lo tanto, el sujeto tratado en la invención puede ser uno que no tiene una infección, tal como una infección vírica. Por ejemplo, el sujeto puede ser uno que no tiene una infección vírica que se sabe que es tratable por IFN-A. El sujeto puede ser uno que no está infectado por un virus de la hepatitis, tal como hepatitis A, B o C; virus de la gripe; virus del síndrome respiratorio agudo grave (SARS); coronavirus; virus de la inmunodeficiencia humana (VIH); virus del herpes simple tipo 2 (VHS2); citomegalovirus (CMV); virus del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS); norovirus; rotavirus; o virus del Ébola.

Composiciones farmacéuticas, dosis y pautas de administración

Un interferón-lambda de la invención, o un fragmento funcionalmente activo o derivado del mismo, se puede proporcionar en una composición farmacéutica. La composición farmacéutica será normalmente estéril, adicionalmente puede comprender un adyuvante y/o vehículo farmacéuticamente aceptable.

Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de la absorción, y similares, que son fisiológicamente compatibles. El vehículo puede ser adecuado para administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraocular, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras vías parenterales de administración, por ejemplo, por inyección o infusión. Alternativamente, el vehículo puede ser adecuado para administración no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa. El vehículo puede ser adecuado para administración por vía oral. Dependiendo de la vía de administración, el interferón-lambda o fragmento funcionalmente activo o derivado del mismo se puede recubrir de un material para protegerlo de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que puedan inactivarlo.

Las composiciones farmacéuticas de la divulgación pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto parental y no confiere efectos toxicológicos no deseados. Los ejemplos de dichas sales incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de base.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables comprenden vehículos acuosos o diluyentes. Los ejemplos de vehículos acuosos adecuados que se pueden emplear en las composiciones farmacéuticas de la divulgación incluyen agua, agua tamponada y solución salina. Los ejemplos de otros vehículos incluyen etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. En muchos casos, será conveniente incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición.

Las composiciones terapéuticas normalmente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como una disolución, microemulsión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada a la alta concentración de fármaco.

Las composiciones farmacéuticas de la divulgación pueden comprender principios activos adicionales.

También están dentro del alcance de la presente divulgación kits que comprenden un interferón-lambda de la invención e instrucciones para su uso. El kit puede contener además uno o más reactivos adicionales, tales como un agente terapéutico o profiláctico adicional como se trata anteriormente.

El interferón-lambda de la invención, o formulaciones o composiciones del mismo, se puede administrar para tratamiento profiláctico y/o terapéutico de una enfermedad fibrótica.

En una realización, el tratamiento de una enfermedad fibrótica es un tratamiento terapéutico. En aplicaciones terapéuticas, los compuestos se administran a un sujeto que ya padece un trastorno o condición como se ha descrito anteriormente, en una cantidad suficiente para curar, aliviar o parcialmente detener la afección o uno o más de sus síntomas. Dicho tratamiento terapéutico puede dar como resultado una disminución en la gravedad de los síntomas de la enfermedad, o un aumento en la frecuencia o duración de los periodos sin síntomas. Una cantidad adecuada para realizar esto se define como una "cantidad terapéuticamente eficaz".

En una realización, el tratamiento de una enfermedad fibrótica es un tratamiento profiláctico. En aplicaciones profilácticas, las formulaciones se administran a un sujeto en riesgo de un trastorno o afección como se ha descrito anteriormente, en una cantidad suficiente para prevenir o reducir los efectos posteriores de la afección o uno o más de sus síntomas. Una cantidad adecuada para realizar esto se define como una "cantidad profilácticamente eficaz".

Las cantidades eficaces para cada fin dependerán de la intensidad de la enfermedad o lesión, así como el peso y el estado general del sujeto.

Un sujeto para administración puede ser un animal humano o no humano. El término "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc. La administración a los seres humanos es típica.

Un anticuerpo/modulador o composición farmacéutica de la divulgación se puede administrar a través de una o más vías de administración usando uno o más de una variedad de métodos conocidos en la técnica. Como será apreciado por el experto, la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Los ejemplos de vías de administración para las composiciones farmacéuticas de la divulgación incluyen intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraocular, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras vías de administración parenteral, por ejemplo por inyección o infusión. La expresión "administración parenteral" como se usa en el presente documento significa modos de administración distintos de administración enteral y tópica, normalmente por inyección. Alternativamente, una composición farmacéutica de la divulgación se puede administrar por una vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa. La composición farmacéutica de la divulgación puede ser para administración por vía oral.

Una dosis adecuada de una composición farmacéutica de la divulgación se puede determinar por un profesional médico experto. Los niveles reales de dosis de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación se pueden variar para obtener una cantidad del principio activo que es eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente particular, composición y modo de administración, sin ser tóxico para el paciente. El nivel de dosis seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente divulgación empleada, la vía de administración, el tiempo de administración, la velocidad de eliminación del compuesto particular que se emplea, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, afección, salud general y antecedentes médicos previos del paciente que está tratándose, y factores similares bien conocidos en las artes médicas.

Una dosis adecuada puede ser, por ejemplo, en el intervalo de desde aproximadamente 0,01 pg/kg hasta aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal, normalmente desde aproximadamente 0,1 pg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, del paciente que se va a tratar. Por ejemplo, una dosis adecuada puede ser desde aproximadamente 1 pg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por día o desde aproximadamente 10 pg/kg hasta aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal por día.

Las pautas posológicas se pueden ajustar para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar una dosis única, se pueden administrar con el tiempo varias dosis divididas o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente, como se indica por las exigencias de la situación terapéutica. La forma unitaria de administración, como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas aptas como dosis unitarias para los sujetos que se va a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido.

La administración puede ser en dosis únicas o dosis múltiples. Las dosis múltiples se pueden administrar a través de las mismas vías o diferentes y a las mismas ubicaciones o diferentes. Alternativamente, las dosis pueden ser a través de una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere administración menos frecuente. La dosis y frecuencia pueden variar dependiendo de la semivida del antagonista en el paciente y la duración deseada del tratamiento.

Como se ha mencionado anteriormente, se pueden coadministrar moduladores/anticuerpos o composiciones farmacéuticas de la divulgación con uno u otros varios de otros agentes terapéuticos. La administración combinada de dos o más agentes se puede lograr en varias formas diferentes. Ambos se pueden administrar juntos en una única composición, o se pueden administrar en composiciones separadas como parte de una terapia combinada. Por ejemplo, una se puede administrar antes, después o simultáneamente con la otra.

En un aspecto, el interferón-lambda para su uso en la invención se administra en combinación con otro compuesto terapéuticamente activo. En un aspecto, el otro compuesto terapéuticamente activo es otro agente terapéutico antifibrótico.

Alternativamente, el interferón-lambdanose puede administrar en combinación con otro compuesto terapéuticamente activo. Por ejemplo, el paciente tratado con el interferón-lambda puede ser uno quenose trata con un agente antivírico, tal como otro interferón (por ejemplo, un interferón de tipo I o un interferón de tipo II, tal como interferón-gamma).

FIGURAS

Figura 1: Identificación de IL-28A como activo antifibrótico en un modelo de adriamicina de enfermedad renal

En condiciones de cribado, se introdujo IL-28A de ratón (ILFNL2) en el ratón por transfección hidrodinámica como par de ADNc (es decir, ADNc de IL-28A con otro ADNc no divulgado) (tamaño de grupo n=15 para todos los grupos de tratamiento) antes de la administración de adriamicina por inyección IV para inducir enfermedad renal crónica. Se transfectó a los ratones de control con sólo solución salina antes de la inyección de adriamicina. Los ratones se monitorizaron hasta 49 días y al finalizar se midieron los niveles de hidroxiprolina renal (Fig 1(a) y (b)) y los niveles de creatinina sérica (Fig 1 (c)) (no hay datos de supervivencia condicionada por el cribado primario). Las figuras para hidroxiprolina (pg/mg de riñón) y creatinina sérica (pg/ml) son diagramas de cajas y bigotes. La línea horizontal central muestra la mediana de los datos y la caja se extiende de los centiles 25 a 75. Los 'bigotes' cubren un intervalo típico de los datos. La hidroxiprolina normalizada (Colágeno en los riñones) muestra la media con una barra de error EEM, **** p<0,0001, *** p<0,001, * p<0,05.

Figura 2: Confirmación de IL-28A como activo antifibrótico en un modelo de adriamicina de enfermedad renal

Se introdujo IL-28A de ratón (IFNL2) en los ratones por transfección hidrodinámica como un único ADNc (tamaño de grupo n=22 para todos los grupos de tratamiento) antes de la administración de adriamicina por inyección IV para inducir enfermedad renal crónica. Se transfectó a los ratones de control con sólo solución salina antes de la inyección de adriamicina. Se siguió a los ratones durante 49 días. Al finalizar, se midieron los niveles de hidroxiprolina renal (Fig 2(a) y (b)) y los niveles de creatinina sérica (Fig 2(c)) y los datos de supervivencia condicionada se registraron durante todo el periodo de estudio (Fig 2(d)). Las figuras para hidroxiprolina (pg/mg de riñón) y creatinina sérica (pg/ml) son diagramas de cajas y bigotes. La línea horizontal central muestra la mediana de los datos y la caja se extiende de los centiles 25 a 75. Los 'bigotes' cubren un intervalo típico de los datos. La hidroxiprolina normalizada (Colágeno en los riñones) muestra la media con una barra de error EEM, **** p<0,0001, *** p<0,001, * p<0,05.

Figura 3: Identificación de IL-28B como activo antifibrótico en un modelo de adriamicina de enfermedad renal

En el cribado primario, se introdujo IL-28B de ratón (ILFNL3) en el grupo de ratón por transfección hidrodinámica como un par de ADNc (tamaño de grupo n=15 para todos los grupos de tratamiento) antes de la adriamicina, y los ratones se monitorizaron hasta 49 días y al finalizar se midieron los niveles de hidroxiprolina renal (Fig 3(a) y (b)) y los niveles de creatinina sérica (Fig 3(c)) (no hay datos de supervivencia condicionada por el cribado primario). Se transfectó a los ratones de control con sólo solución salina antes de la inyección de adriamicina. Las figuras para hidroxiprolina (pg/mg de riñón) y creatinina sérica (pg/ml) son diagramas de cajas y bigotes. La línea horizontal central muestra la mediana de los datos y la caja se extiende de los centiles 25 a 75. Los 'bigotes' cubren un intervalo típico de los datos. La hidroxiprolina normalizada (Colágeno en los riñones) muestra la media con una barra de error EEM, **** p<0,0001, *** p<0,001, * p<0,05.

Figura 4: Confirmación de IL-28B como activo antifibrótico en un modelo de adriamicina de enfermedad renal

Se introdujo IL-28B de ratón (IFNL3) en el grupo de ratón por transfección hidrodinámica como un único clon (tamaño de grupo n=22 en cada grupo de tratamiento) antes de la adriamicina, y se siguió a los ratones hasta 49 días. Se transfectó a los ratones de control con sólo solución salina antes de la inyección de adriamicina. Al finalizar, se midieron los niveles de hidroxiprolina renal (Fig 4(a) y (b)) y los niveles de creatinina sérica (Fig 4(c)) y los datos de supervivencia condicionada se registraron durante todo el periodo de estudio (Fig 4(d)). Las figuras para hidroxiprolina (pg/mg de riñón) y creatinina sérica (pg/ml) son diagramas de cajas y bigotes. La línea horizontal central muestra la mediana de los datos y la caja se extiende de los centiles 25 a 75. Los 'bigotes' cubren un intervalo típico de los datos. La hidroxiprolina normalizada (Colágeno en los riñones) muestra la media con una barra de error EEM, **** p<0,0001, *** p<0,001, * p<0,05.

Figura 5: Confirmación histológica de IL-28B e IL-28A como antifibrótico en un modelo de adriamicina de enfermedad renal

Al finalizar, los riñones del estudio descritos en la Figura 2 y Figura 4 se fijaron en NBF, se incorporaron en parafina, se cortaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E), rojo picrosirio (PSR) o tricrómico de Masson (MT). A continuación, se obtuvieron imágenes de los portaobjetos con un escáner de portaobjetos Hamamatsu. Imágenes representativas de las secciones de riñón teñidas con PSR se muestran para IL-28B en la Fig 5(a) para 1 ratón intacto, 3 ratones tratados con adriamicina en solución salina y 3 ratones tratados con adriamicina que también recibieron IL-28B y para IL-28A en la Fig 5(f) para 1 ratón intacto, 3 ratones tratados con adriamicina en solución salina y 3 ratones tratados con adriamicina que también recibieron IL-28A. Se obtuvieron imágenes de las secciones de riñón de ratones terminales para tanto los grupos de IL-28B (10 ratones intactos, 18 tratados con solución salina y 22 con IL-28B) como los grupos de IL-28A (8 ratones intactos, 20 tratados con solución salina y 19 con IL-28A) y se estimó el área total cubierta por la tinción PSR usando la plataforma de análisis de imágenes Definiens como se presenta en la Fig 5(b) y Fig 5(g), respectivamente. Además, todos los portaobjetos se puntuaron manualmente para la fibrosis por expertos separados en el campo de la fibrosis (2 científicos y 1 anatomopatólogo clínico) y las puntuaciones de patología se calcularon para IL-28B a partir de tinción H&E (Fig 5(c)), y tinción PSR (Fig 5(d) y (e)) y para IL-28A a partir de tinción PSR (Fig(h)) y tinción MT (Fig(i)). Aumentos = x100.

Figura 6: Efecto de IL-28A en un modelo de fibrosis de MEC in vitroen el hígado

Se trataron células estrelladas primarias humanas (Fig 6(a)) (sembradas a 1000 células/pocillo) o células estrelladas primarias humanas en cocultivo con hepatocitos primarios humanos (Fig 6(b)) (sembrados a 1000 células/pocillo, relación 1:1) con IL-28A en cultivo durante 5 días. Las células se retiraron y las proteínas de MEC, fibronectina, colágeno I y III y colágeno IV, se midieron por inmunomarcado fluorescente con obtención de imágenes y cuantificación en un Cellomics Arrayscan. Los datos representan la intensidad total media representada como media /- DE de 4 pocillos separados.

Figura 7: Efecto de IL-28A e IL-28B en un modelo de fibrosis de MEC in vitro en el hígado más TGFB

Se trataron células estrelladas primarias humanas (a 1000 células/pocillo) (Fig 7a)) o células estrelladas primarias humanas en cocultivo con hepatocitos primarios humanos (a 1000 células/pocillo, relación 1:1) (Fig 7(b)) con IL-28A o IL-28B en cultivo durante 5 días en presencia de TGFp a 250 pg/ml. Las células se retiraron y las proteínas de MEC, fibronectina, colágeno I y III y colágeno IV, se midieron por inmunomarcado fluorescente con obtención de imágenes y cuantificación en un Cellomics Arrayscan. Los datos representan la intensidad total media representada como media /- DE de 4 pocillos separados.

Figura 8: Imágenes de alto contenido que muestran el efecto de IL-28A e IL-28B en MEC de cocultivo de células estrelladas-hepatocitos estimulado con TGFB1

Células estrelladas primarias humanas en cocultivo con hepatocitos primarios (en una relación de 1:1 con una concentración de células final de 1000 células/pocillo), estimulados con TGFp1 (250 pg/ml), se cultivaron solas (cocultivo de TGFp1) o se trataron con IL-28A o IL-28B a 10000, 1000, 100 o 10 ng/ml durante 5 días. Las imágenes mostradas son de 1 campo representativo de 16 campos para cada condición. El aumento se realizó con un objetivo x10.

Figura 9: Efecto de IL-28A, IL-28B e IL-29 en un modelo in vitro de MEC de fibroblastos del intestino delgado estimulados con TGFB1

Se trataron fibroblastos intestinales pequeños primarios humanos (a 2000 células/pocillo) con IL-28A, IL-28B o IL-29 (todos a 10 ng/ml) en cultivo durante 7 días en presencia de TGFp (10 ng/ml). Las células se retiraron y las proteínas de MEC, fibronectina, colágeno I y III y colágeno IV, se midieron por inmunomarcado fluorescente con obtención de imágenes y cuantificación en un Cellomics Arrayscan. Los datos representan la intensidad total media representada como media /- DE de 4 pocillos separados.

Figura 10: % de inhibición de IL-28A e IL-28B en un modelo in vitro de MEC de cocultivo con fibroblastosqueratinocitos de piel

Se dispusieron fibroblastos dérmicos primarios humanos de 3 lotes individuales en cocultivo con queratinocitos humanos primarios (en una relación de 9:1 con una concentración de células final de 1500 células/pocillo) y se trataron con cantidades crecientes de IL-28A o IL-28B durante 7 días. Las células se retiraron y las proteínas de MEC, fibronectina, colágeno I y III y colágeno IV, se midieron por inmunomarcado fluorescente con obtención de imágenes y cuantificación en un Cellomics Arrayscan. Los datos normalizados de los 3 lotes se calcularon como el % de inhibición y se representaron como media ± DE. Se midió la viabilidad celular con PrestoBlue, con los 3 lotes de fibroblastos en cocultivo con queratinocitos normalizados para controlar el cocultivo y los datos se promediaron para dar el cambio en veces.

Figura 11: Efecto de IL-28A, IL-28B e IL-29 en un modelo in vitro de MEC de cocultivo con fibroblastosqueratinocitos de piel

Se trataron fibroblastos dérmicos primarios humanos en cocultivo con queratinocitos humanos primarios (en una relación de 9:1 con una concentración de células final de 1500 células/pocillo) con IL-29, IL-28A o IL-28B durante 7 días en el intervalo de concentración de 1250-10000 ng/ml de citocina. Las células se retiraron y las proteínas de MEC, fibronectina, colágeno I y III y colágeno IV, se midieron por inmunomarcado fluorescente con obtención de imágenes y cuantificación en un Cellomics Arrayscan. Los datos representan la intensidad total media representada como media /- DE de 4 pocillos separados.

La viabilidad celular se midió con PrestoBlue.

Figura 12: Imágenes de alto contenido que muestran el efecto de IL-28A, IL-28B e IL-29 en un modelo in vitro de MEC de cocultivo de fibroblastos-queratinocitos de piel

Fibroblastos dérmicos primarios humanos de un donante representativo en cocultivo con queratinocitos primarios (en una relación de 9:1 con una concentración de células final de 1500 células/pocillo) se cultivaron solos (control) o se trataron con IL-29, IL-28A o IL-28B a 10000 o 1250 ng/ml durante 7 días. Las imágenes representan la señal combinada de las proteínas de la matriz MEC fibronectina, Col I y III y Col IV y la muestra 1 campo representativo de un total de 16 campos por condición. El aumento se realizó con un objetivo x10.

Figura 13: Efecto de IL-28A e IL-28B en un modelo in vitro de MEC de fibroblastos de piel estimulados con IL-1a

Se trataron fibroblastos dérmicos primarios humanos (1500 células/pocillo), estimulados con IL-1 a (10 ng/ml), con cantidades crecientes de IL-28A o IL-28B en cultivo durante 7 días. Las células se retiraron y las proteínas de MEC, fibronectina, colágeno I y III y colágeno IV, se midieron por inmunomarcado fluorescente con obtención de imágenes y cuantificación en un Cellomics Arrayscan. Los datos representan la intensidad total media representada como media /- DE de 4 pocillos separados.

La viabilidad celular se midió con PrestoBlue. Los datos son representativos de uno de dos lotes de fibroblastos diferentes.

Figura 14: Efecto de IL-28A, IL-28B e IL-29 en un modelo in vitro de MEC de cocultivo con RPTEC-fibroblastos de riñón

Se dispusieron células epiteliales tubulares proximales renales (RPTEC) primarias humanas en cocultivo con fibroblastos primarios de riñón humano (en una relación de 1:1 con una concentración de células de siembra final de 2000 células/pocillo) y se trataron con IL-29, IL-28A o IL-28B durante 7 días. Las células se retiraron y las proteínas de MEC, fibronectina, colágeno I y III y colágeno IV, se midieron por inmunomarcado fluorescente con obtención de imágenes y cuantificación en un Cellomics Arrayscan. Los datos representan la intensidad total media representada como media /- DE de 4 pocillos separados. La viabilidad celular se midió con PrestoBlue. Se añadieron IL-29, IL-28A o IL-28B al cocultivo de RPTEC y los fibroblastos en el día 0 (Fig 14(a)), o se añadieron a las RPTEC durante 24 horas antes de la combinación con los fibroblastos (Fig 14(b)) o se añadieron a los fibroblastos durante 24 horas antes de la combinación con las RPTEC (Fig 14(c)).

Figura 15: Comparación de formatos de adición sobre el efecto de IL-28A, IL-28B e IL-29 en un modelo in vitro de MEC de cocultivo con RPTEC-fibroblastos de riñón

Los datos presentados en la Figura 14 volvieron a presentarse mostrando el efecto de IL-28A, IL-28B e IL-29 en el sistema de células de cocultivo de riñón usando 3 protocolos de adición diferentes en un gráfico, donde IL-28A, IL-28B o IL-29 se añadieron al cocultivo de RPTEC y HRF juntos (denominado Cocultivo), a las RPTEC primero y 24 horas después los HRF se introdujeron (denominado RPTEC añadidas 1.°) y a los HRF primero y 24 horas después las RPTEC se introdujeron (denominado HRF añadidos 1.°) y el cocultivo continuó durante 7 días con fibronectina y colágenos I y III, volviéndose a representar los datos en la Fig 15 (a) y (b), respectivamente. Se analizaron los marcadores de MEC, para cada citocina, usando análisis de la varianza que tiene en cuenta las diferencias entre el orden de adición (cocultivo, RPTEC primeras y HRF primeros) y la dosis (0 a 10000 ng/ml). Se realizaron comparaciones después del análisis y se usó una corrección de Bonferroni para ajustar los valores depinformados. Todos los análisis se realizaron usando SAS v9.4 (SAS Institute). Las dosis de citocina que alcanzan significancia se marcan en los gráficos con **** p<0,0001, *** p<0,001, ** p<0,01 y * p<0,05.

Figura 16: Imágenes de alto contenido que muestran el efecto de IL-28A, IL-28B e IL-29 en la MEC de cocultivo de RPTEC-fibroblastos de riñón

Se cultivaron células tubulares proximales renales (RPTEC) primarias humanas en cocultivo con fibroblastos de riñón humanos primarios (en una relación de 1:1 con una concentración de células final de 2000 células/pocillo en la siembra) solas (control) o se trataron con IL-29, IL-28A o IL-28B a 1000, 100 o 10 ng/ml durante 7 días. Las citocinas se añadieron a las RPTEC 24 horas antes de la inclusión de los fibroblastos en el cultivo como se representa en la Fig 14(b). Las imágenes mostradas son de 1 campo representativo de un total de 16 campos para cada condición. El aumento se realizó con un objetivo x10.

Figura 17: Efecto de IL-28A e IL-28B en un modelo in vitro de MEC de cocultivo de células epiteliales SA-fibroblastos de pulmón

Se trataron células epiteliales de pulmón de las vías respiratorias pequeñas (epiteliales SA) primarias en cocultivo con fibroblastos de pulmón primarios humanos IPF (relación 1:1 en una concentración de células final de 2000 células/pocillo en la siembra) con IL-28A o IL-28B durante 7 días. Las células se retiraron y las proteínas de MEC, fibronectina, colágeno I y III y colágeno IV, se midieron por inmunomarcado fluorescente mientras que la proteína de la MEC total se identificó por tinción con rosa flamenco. La obtención y cuantificación de imágenes se realizaron en un Cellomics Arrayscan. Los datos representan la intensidad total media representada como media /- DE de 4 pocilios separados. La viabilidad celular se midió con PrestoBlue con una lectura de fluorescencia.

Figura 18: Proteína y secuencias de ADN de IFNL1, IFNL2, IFNL3 e IFNL4

Las secuencias de las proteínas de IFNL1, IFNL2, IFNL3 e IFNL4 se obtuvieron de la base de datos Uniprot y las secuencias de ADN de IFNL1, IFNL2, IFNL3 e IFNL4 fueron de GenBank.

Figura 19: Efecto de IL-28A e IL-29 en un modelo de cocultivo in vitro de células estrelladas y epiteliales de hígado humano de fibrosis hepática

Se dispusieron células estrellas humanas primarias y células epiteliales biliares intrahepáticas primarias en cocultivo a 1000 células/pocillo (relación 1:1), y se trataron con IL-28A o IL-29 durante 5 días. Las células se retiraron y las proteínas de MEC, fibronectina, colágeno I y III y colágeno IV, se midieron por inmunomarcado fluorescente con obtención de imágenes y cuantificación en un Cellomics Arrayscan. Los datos representan la intensidad total media representada como media /- DE de 4 pocillos separados.

Figura 20: Efecto de IL-28A sobre la supervivencia de podocitos en un modelo de esferoides glomerulares 3D in vitro de glomeruloesclerosis

(a) Se construyeron esferoides glomerulares 3D a partir de un núcleo interno de células endoteliales glomerulares humanas rodeadas por podocitos humanos marcados con GFP. (b) Los esferoides crecieron en medio o se trataron con plasma de pacientes con esclerosis glomerular segmentaria y focal (FSGS) a una concentración final del 15 % más o menos la presencia de la proteína humana IL-28A. En cada experimento y para cada condición, se obtuvieron imágenes de al menos 5 esferoides. (c) La proyección de intensidad máxima 2D (MIP) de estos esferoides se analizó entonces usando el análisis de imágenes Definiens para definir áreas de marcador por encima de la intensidad umbral en el canal verde en las diferentes condiciones de cultivo que se representaron como área de marcador celular como una proporción de área total de esferoides. El 7 % de los podocitos se marcó con GFP.Figura 21: La transfección hidrodinámica de IL-28B de ratón protege contra la fibrosis en el modelo de fibrosis renal por obstrucción ureteral unilateral (UUO) de ratón

Ratones operados para UUO (HDT de control operados para UUO, n=10), no operados (no-op, n=5), operados para UUO pero tratados con IL-28B en el día -1 para administración profiláctica (HDT de IL-28B día -1, n=10) o tratados con IL-28B en el día 7 para administración terapéutica (HDT de IL-28B día 7, n=10) y todos los animales se sacrificaron en el día 21, se extirparon los riñones, se fijaron en NBF, se incorporaron en parafina, se cortaron y se tiñeron con rojo picrosirio (PSR). A continuación, se obtuvieron imágenes de los portaobjetos con un escáner de portaobjetos Hamamatsu. Imágenes representativas de secciones de riñón teñidas con PSR se muestran en la Fig 21 (a) para 1 ratón normal, 2 ratones de control operados para UUO, 2 ratones operados para UUO y tratados con IL-28B en el día -1 o 2 ratones operados para UUO y tratados con IL-28B en el día 7, por transfección hidrodinámica. Todas las secciones de riñón de ratones terminales (5x ratones no operados, 10x control de UUO, 10x UUO IL-28B en el día -1 y 10x UUO tratados con IL-28B en el día 7) y el área total cubierta por la tinción PSR se estimó usando la plataforma de análisis de imágenes Definiens que lee el área teñida total (Fig 21 (b)) o el área teñida de alta intensidad (Fig 21 (c)). El % de área de colágeno se muestra como media /- EEM con grupos de tratamiento en comparación con el control de SEAP usando la prueba de comparación múltiple de Dunnett; ** = p<0,01, *** p<0,001 y **** = P<0,0001.

SEAP = proteína de control de fosfatasa alcalina secretada

Figura 22: Efecto de IL-29 en un modelo in vitro de monocultivo de células epiteliales tubulares proximales renales de riñón humano de fibrosis renal

Se dispusieron células epiteliales tubulares proximales renales primarias humanas en cocultivo a 2000 células/pocillo y se trataron con IL-29 durante 5 días. Las células se retiraron y las proteínas de MEC, fibronectina, colágeno I y III y colágeno IV, se midieron por inmunomarcado fluorescente con obtención de imágenes y cuantificación en un Cellomics Arrayscan. Los datos representan la intensidad total media representada como media /- DE de 4 pocillos separados.

Figura 23: El tratamiento con IL-29 humana por transfección hidrodinámica protege contra la fibrosis tubulointersticial en el modelo de obstrucción ureteral unilateral de ratón de fibrosis renal

Se sometieron ratones C57BI/6 a transfección hidrodinámica con un vector de control que contenía SEAP (n=10) o un vector que contenía una construcción de IL-29 humana (n=9). 24 horas después de la transfección, los ratones se sometieron a obstrucción ureteral unilateral (UUO) del riñón izquierdo o los ratones no se operaron (n=4). Después de 7 días, se repitieron las transfecciones hidrodinámicas y los animales se sacrificaron 19 días después de la UUO. Figura 23(a); se tomaron muestras de suero de los ratones en el día 0 (24 horas después de la transfección) y nuevamente a los 19 días y se analizaron para la proteína IL-29 humana. Los niveles de IL-29 humana se representaron comparando los niveles de IL-29 en el grupo de IL-29 UUO día 0, grupo de SEAP terminal UUO D19 y el grupo de IL-29 UUO terminal.

Se recuperaron los riñones fijados en NBF, se incorporaron en parafina, se cortaron y se tiñeron con rojo picrosirio (PSR) y a continuación se obtuvieron imágenes de los portaobjetos con un escáner de portaobjetos Hamamatsu. La Figura 23(b) muestra imágenes representativas de un riñón normal, un riñón con UUO transfectado con vector que contiene SEAP de control o vector que contiene IL-29 humana como se muestra a 100x (línea superior) y 200x (línea inferior) de aumento. Se obtuvieron imágenes de todas las secciones de riñones de ratones terminales (4x no operados, 10x control de SEAP con UUO, 9x IL-29 UUO en el día -1) y se estimó el área total cubierta por la tinción PSR usando la plataforma de análisis de imágenes Definiens leyendo el área teñida total (Fig 23(c)). El % del área de colágeno se muestra como media /- EEM con el grupo de tratamiento de IL-29 en comparación con el grupo de control de UUO SEAP usando la prueba de comparación de LSD de Fisher sin corregir; ** = p<0,01.

SEAP = proteína de control de fosfatasa alcalina secretada

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EJEMPLOS

Sumario

Citocinas de la familia del interferón-A (IFN-A), conocidas como IFN-A1 (IL-29), IFN-A2 (IL-28A) e IFN-A3 (IL-28B), señalizan a través de un complejo receptor distinto, compuesto de las cadenas de receptores IFN-AR1 (IL-28R1) e interleucina-10R2 (IL-10R2).

Usando un cribadoin vivopor transfección hidrodinámica en el modelo de enfermedad renal crónica (CKD) de ratón inducida por adriamicina, se informaron IFN-A2 y IFN-A3 como activos. Se llamó a un activo basándose en el nivel de fibrosis renal como se ha determinado por una reducción del 40 % en los niveles de hidroxiprolina renal (colágeno renal). Tanto IFN-A2 como IFN-A3 también mostraron una preservación correspondiente de la función renal como se mide por la creatinina sérica. Esto condujo a tasas condicionadas por la supervivencia (es decir, que no llegan a la insuficiencia renal terminal) para aumentar del 50 % a los 49 días después de la adriamicina en ratones transfectados con solución salina al 85 % cuando se transfectaron con IFN-A2 , y 100 % con IFN-A3 para validar este efecto antibiótico en un modelo alternativo de CKD con un estímulo diferente, tanto IFN-A1 como IFN-A3 se aplicaron por transfección hidrodinámica en el modelo de enfermedad renal crónica de fibrosis renal inducida por obstrucción ureteral unilateral (UUO), dando ambos protección contra la fibrosis tubulointersticial.

El efecto antifibrótico de ligandos de IL-28R1 se ha confirmado en varios modelosin vitrode fibrosis de células primarias humanas que se leen en la proteína de matriz extracelular (MEC) acumulada madura. Cada uno de IFN-A1, IFN-A2 e IFN-A3 humano recombinante inhibió la acumulación de las proteínas de MEC asociadas a la fibrosis (fibronectina y colágenos I, III y IV) en modelosin vitrode células humanas primarias de fibrosis renal, pulmonar, intestinal, de la piel y renal. Esto se observa en varios modelos que incluyen células estrelladas del hígado, cocultivos de estrelladas-hepatocitos del hígado (tanto matriz basal como inducida por TGFp), cocultivos de células estrelladas-epiteliales del hígado, fibroblastos intestinales pequeños inducidos por TGFp, fibroblastos dérmicos inducidos por IL-1 a, cocultivos de queratinocitos-fibroblastos dérmicos, co- y monocultivos de células epiteliales tubulares proximales renales-fibroblastos renales y cocultivos de células epiteliales de las vías respiratorias pequeñas de pulmón-fibroblastos de pulmón IPF. En un modelo de organoides glomerulares de glomeruloesclerosis más compleja, la aplicación de plasma de un paciente con síndrome nefrótico recidivante causó tanto una pérdida del número de podocitos como la retracción de procesos y pedicelos de manera consistente con el borramiento de podocitos y pérdida observada en muchas enfermedades glomerulares que conducen a glomeruloesclerosis y fibrosis renal. La aplicación de IFN-A2 recombinante en este modelo previno totalmente los cambios a los podocitos causados por este plasma del paciente.

Se ha mostrado que los ligandos de IL-28R1 tienen potentes efectos antifibróticos tanto en cribados de fibrosisin vitrocomoin vivo.Se han descrito potentes efectos en modelosin vivode ratón de fibrosis renal y en numerosos modelosin vitrode fibrosis humana con células primarias relevantes de los aparatos y sistemas de órganos hígado, intestino delgado, piel, riñón y pulmón. Por lo tanto, estas proteínas tienen un potencial inesperado como agentes antifibróticos en múltiples tipos de fibrosis.

MÉTODOS

Ratón in vivo

Efecto de IL-28A e IL-28B en el modelo de fibrosis renal inducida por adriamicina de enfermedad renal crónica (CKD)

Ratones BALB/c hembra, de al menos 6 semanas y un peso superior a 24 g, recibieron una inyección IV a través de la vena de la cola de ADNc (o par de ADNc para estudios emparejados) en un vector de expresión de transfección hidrodinámica apropiado. Después de 7 días, a los ratones se les administró adriamicina (doxorubicina) a 11 mg/kg IP y se monitorizaron durante 49 días. Se monitorizó a los ratones cada día para peso y salud; los ratones que habían perdido más del 40 % del peso corporal inicial o que mostraban signos físicos de insuficiencia renal terminal se sacrificaron y se recogieron los datos. Al final del periodo de estudio de 49 días, todos los ratones se sacrificaron y se recogieron los riñones y sueros para los análisis. Se midió la hidroxiprolina renal usando el método de ensayo QuickZyme (QuickZyme Biosciences) y se midió la creatinina sérica usando el método de tres enzimas y se leyó como Mg/ml de creatinina sérica. La fibrosis renal (hidroxiprolina) en el grupo de solución salina más adriamicina, marcado como "Solución salina" en los gráficos, se consideró que era una respuesta máxima a la enfermedad. Esto se estableció al 100 % y se usó para normalizar a través de los grupos de tratamiento. Los animales intactos no recibieron adriamicina y cada experimento de cribado contuvo un grupo de "HGF" que recibió adriamicina y el ADNc para HGF. Se usó HGF como control positivo antifibrótico, con una reducción >40 % en la hidroxiprolina usada para el control de calidad.

Efecto de IL-28 e IL-29 en el modelo de fibrosis renal inducida por obstrucción ureteral unilateral de ratón Construcción de ADN para la transfección hidrodinámica de IL28B de ratón e IL29 humana

Se creó una construcción de ADN para la transfección hidrodinámica por inserción de la secuencia de ADN (NM_172140.1) que codifica la proteína precursora de IL29 humana (NP_742152.1) en el vector pLive (Mir5420, Mirus Bio LLC, 545 Science Dr., Madison, WI 53711, EE. UU.) usando la digestión con restricción Nhel-Xhol seguido por ligación de ADN de extremos homólogos. Una construcción de gen (ARNm Ref Seq NM_177396) que codifica IFNL3 de ratón (NP_796370) se clonó en pLive (Mirus) usando una estrategia de digestión con restricción BamHI -Xhol de tanto vector como inserto, seguido de ligación. Las inserciones génicas en pLive se verificaron por secuenciación de ADN. El gen fue precedido de una secuencia CCACC directamente aguas arriba del ATG que codifica la metionina de inicio de la secuencia señalizadora. Este vector alberga un gen de resistencia a kanamicina y un origen pUC que permiten la amplificación de ADN enEscherichia coli.Además, este vector alberga al promotor mínimo de albúmina de ratón para transcribir el gen IFNL-1 humano flanqueado por intrones en cualquier lado. [El vector pLive permite la expresión a largo plazo de proteínas en el hígado].

La construcción de ADN para la transfección hidrodinámica se aisló de cultivo de Escherichia coli que alberga esta construcción usando un kit de aislamiento de plásmido que limita la cantidad de endotoxina en la disolución (HiSpeed Plasmid Giga EF, Qiagen). El ADN de plásmido se secuenció por Sanger para verificar la inserción.

Kanefujiet al.y Liuet al.describen vectores típicos para la transfección hidrodinámica.

Expresión de proteínas por transfección hidrodinámica (HDT)

Se transfectaron hidrodinámicamente ratones con 50 pg de la IL-29 humana pLIVE, IL-28B de ratón pLIVE o vector de SEAP pLIVE (Mirus Bio, Cat n.° MIR 5320) en vehículo TransIT-EE. La disolución que contenía el vector se inyectó rápidamente (menos de 2,5 segundos) por vía intravenosa en un volumen de 2 ml. Se indujo anestesia general con isoflurano antes de la inyección hidrodinámica y se mantuvo durante al menos 1 minuto después de la inyección.

Cuantificación de IL-28B de ratón e IL-29 humana de sueros de ratón

Se cuantificó IL-28B de ratón usando un ensayo de cuantificación de Meso Scale Discovery (MSD) usando pares de anticuerpos comerciales (RnD Systems, cat n.° DY1598B) y se diluyeron sueros de ratón 1 en 100 para poner en la curva estándar lineal. Se cuantificó IL-29 humana usando el conjunto de anticuerpos de IL-29 humana MSD U-plex (cat n.° B21WD) y los sueros de ratón se diluyeron 1 en 100 para poner en el intervalo lineal.

Modelo de fibrosis renal inducida por obstrucción ureteral unilateral (UUO) de enfermedad renal crónicaRatones macho C57BL/6 (Charles River) que pesaban al menos 19 g se sometieron a un modelo de fibrosis renal inducida por obstrucción ureteral unilateral (UUO) de enfermedad renal crónica.

La cirugía se realizó usando anestesia general inducida por isoflurano y en condiciones asépticas según conviniera para las técnicas quirúrgicas. Los ratones se sometieron a laparotomía seguido de ligadura del uréter izquierdo usando ligadura 3.0 Mersilk. La pared del músculo se selló usando Vicryl 5-0 en un patrón continuo, siendo la piel cerrada por puntos subcuticulares usando Vicryl 5-0. Se administró analgesia apropiada precirugía y poscirugía. Se extrajeron muestras de sangre en momentos apropiados como se detalló en los resultados. Los ratones se inmovilizaron usando un inmovilizador de ratones reconocido y se extrajeron 30 pl de sangre de la vena de la cola a través del método de punción de la cola, usando una pipeta para medir con exactitud la muestra de sangre. Esta muestra se puso en un tubo de PCR de 0,2 ml (Thermo) y se centrifugó (20.000 g, 5 minutos) para quitar tanto suero como fuera posible, que se puso en un tubo de PCR nuevo y se conservó a -80 °C.

En el día 19 o 21, los ratones se anestesiaron usando isoflurano, la sangre se retiró por punción cardíaca en tubos de suero (Sarstedt) y los ratones se sacrificaron por dislocación cervical. Se extrajo el riñón izquierdo y dos cuartos se ultracongelaron en nitrógeno líquido y se conservaron a -80 °C. La mitad restante se puso en formol tamponado neutro al 10 %, se deshidrató en un procesador de tejido y se incorporó en parafina para el análisis histológico. Los bloques de parafina se cortaron en 4 pm en un micrótomo y se montaron en portaobjetos de vidrio. Los portaobjetos se desceraron a continuación y se hidrataron, se tiñeron con rojo picrosirio (PSR) antes de lavarse con agua acidificada. Los portaobjetos se deshidrataron a continuación, se limpiaron y se taparon con el cubreobjetos. Se dejaron secar los portaobjetos y a continuación se barrieron usando un escáner de portaobjetos Hamamatsu.

Las imágenes de portaobjetos completas se importaron a Definiens Developer XD 64 y se analizaron usando el módulo de campo brillante. Brevemente, se anotaron manualmente las áreas de la corteza para eliminar la médula del análisis. Se determinaron los niveles de expresión de marcadores (por ejemplo, tinción con PSR) para los marcadores individuales en un conjunto de datos de entrenamiento de no menos de cuatro imágenes. El algoritmo de análisis se ejecutó entonces en un servidor dedicado para determinar las áreas de marcador por encima de la intensidad umbral para cada marcador individual y el área de cada marcador por encima de la intensidad umbral se determinó como una proporción del área de la corteza.

La evaluación histológica del nivel de fibrosis se realizó por investigadores cegados con experiencia en el campo de la fibrosis renal usando una combinación de secciones teñidas con rojo picrosirio, tricrómico de Masson y hematoxilina y eosina según se prefiriera. Se usó una escala de 10 puntos donde 10 era fibrosis muy intensa equivalente a la insuficiencia renal terminal y 1 normal. Los parámetros evaluados en la puntuación fueron expansión basal de la membrana tubular, aplanamiento de células epiteliales, integridad del borde en cepillo, atrofia tubular y colapso, tamaño de la luz tubular, infiltrado de células intersticiales, estructura del ovillo glomerular, expansión mesangial, infiltrado glomerular, espacio urinario glomerular, membrana basal glomerular y expansión de la matriz mesangial.

El análisis de imágenes Definiens y la evaluación histológica de imágenes también se aplica a las secciones de riñón tratadas con adriamicina.

Mediciones del ensayo de fibrosis de matriz extracelular in vivo humana

a) Cultivo celular

Todos los ensayos de acumulación de matriz extracelular (MEC) se realizaron en placas negras de fondo claro de 384 pocillos (cat. de Greiner n.° 781090), donde los medios, número de células/ pocillo, tiempo de incubación y estímulo variaron con el tipo primario de célula usada.

Se sembró un cocultivo de células estrelladas hepáticas humanas (HHSteC) (ScienCell, número de cat. sc-5300) (en el pase 4) y células epiteliales biliares intrahepáticas humanas (ScienCell, número de catálogo sc-5100) (en el pase 3) a 1000 células/pocillo (relación 1:1) en 25 ul de medio de células epiteliales - libre de rojo fenol (EpiCM-prf) con suplementos (ScienCell, número de catálogo sc-sc-4101-prf). Las células estrelladas humanas (ScienCell) en monocultivo se sembraron a 1000 células/pocillo en medio de células estrelladas (ScienCell) y cocultivo de células estrelladas humanas y hepatocitos (ScienCell a 1000 células/pocillo (relación 1:1) en el medio de cultivo mixto (ScienCell).

Se sembraron fibroblastos del intestino delgado humano (ScienCell) a 2000 células/pocillo en medio basal de células epiteliales renales 0,5 % de FCS y suplementos (ATCC).

Se cultivaron fibroblastos de piel dérmica humana en medio de crecimiento de fibroblastos y se cultivaron queratinocitos humanos en medio de queratinocitos y se sembraron a 1500 células/pocillo. El cocultivo de fibroblastos-queratinocitos (relación 9:1) se cultivó en una mezcla 1:1 de medio y se sembró a 1500 células/pocillo. Se sembraron células epiteliales tubulares proximales renales humanas (RPTEC, Innoprot) y fibroblastos renales humanos (HRF, InnoProt) a 2000 células por pocillo (relación 1:1) en cocultivo usando medio basal de células epiteliales renales (ATCC) 0,5 % de FCS y suplementos (ATCC).

Se cultivaron las células epiteliales de las vías respiratorias pequeñas humanas (ATCC) en medio de crecimiento basal más suplementos del kit de crecimiento epitelial bronquial (ATCC) y se cultivaron fibroblastos de pulmón IPF134 (ATCC) en medio de crecimiento de fibroblastos (Lonza). El cocultivo se sembró a 2000 células/pocillo (relación 1:1).

b) Medición del crecimiento celular

Después de 7 días de incubación a 37 °C, 5 % de CO<2>, se evaluó el crecimiento celular usando el reactivo de viabilidad celular PrestoBlue<®>(Thermo Fischer Scientific) siguiendo las instrucciones del fabricante.

c) Medición de la acumulación de MEC

Medición de componentes individuales de MEC: Inmunofluorescencia

Después de 7 días de incubación a 37 °C en 5 % de CO<2>, las células se lavaron en PBS y se lisaron con 20 pl/pocillo de NH<4>OH 0,25 M / Tris 25 mM (Sigma-Aldrich) durante 15 min a 37 °C. A continuación, la matriz se lavó 3 veces en PBS, se fijó en 40 pl de metanol al 100 % durante 30 min a -20 °C y se lavó 3 veces en PBS antes de teñirse usando anticuerpos anti-fibronectina (eBiosciences), anti-colágeno I (Millipore), anti-colágeno III (Millipore), anti-colágeno IV (eBiosciences) y anti-colágeno V (Abcam). Las placas se barrieron en el lector Arrayscan HC (Cellomics) usando un protocolo de 3 canales bajo la bioaplicación de perfilado "Cellomics CellHealth" y un objetivo 10x (cámara X1 nueva) con agrupamiento 2x2 (1.10<4>x 1.10<4>píxeles/campo).

Medición de componentes de MEC total: tinción con Flamingo™

Se lavaron 3 veces placas de inmunofluorescencia en agua Flowfusor antes de teñirse usando el reactivo de tinción de gel fluorescente Flamingo<™>(BioRad) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las placas se barrieron en el lector Arrayscan HC (Cellomics) usando un protocolo de 2 canales bajo la bioaplicación de perfilado "Cellomics CellHealth" y un objetivo 10x (cámara X1 nueva) con agrupamiento 2x2 (1.104 x 1.104 píxeles/campo).

Método para la generación de esferoide glomerular humano 3D

Generación y tratamiento de esferoides

Se añadió Nano-shuttle-PL (n.° de cat. 657841) a matraces T75 de actina transfectada establemente marcada con GFP, podocitos infectados con SV40 condicionalmente inmortalizados y células endoteliales glomerulares humanas (HRGEC) proporcionadas por la Universidad de Bristol, cultivadas en RPMI 1640 (10 % de FCS, 5 ml de L-glutamina y 1XITS, Gibco) y medio EBM-2, con kit de suplemento de Lonza (n.° de cat. CC4147), respectivamente. Los podocitos transfectados con GFP se confirmaron por FACS. Todas las células se recogieron usando TrypLE Express (Gibco) y se sembraron HRGEC magnetizadas a 5000 células/pocillo en placas de Greiner de baja adhesión de 96 pocillos (n.° de cat. 655976). Se colocó un Greiner Spheroid Drive (cat. n.° 655830) debajo de la placa de 96 pocillos durante 6 h y los esferoides se cultivaron en medio EBM-2 a 37 °<c>/5 % de CO2 /100 % de humedad. Se retiró Drive, y los GFP-podocitos magnetizados se sembraron a 5000 células/pocillo. Drive se devolvió debajo durante la noche y los esferoides se diferenciaron durante 10 días de alimentación cada 3 días usando Holding Drive. A continuación, los esferoides se trataron con plasma humano de FSGS a 15 % de concentración final, más o menos IL-28A (10.000 ng/ml), o medio solo durante 7 días.

Fijación y tinción

Se fijaron los esferoides y se permeabilizaron durante 3 horas a 4 °C en 10 % de formol/ 1 % de Triton X-100/PBS. Después de 3 x lavados con PBS de 10 min, los esferoides se rehidrataron en series ascendentes de metanol a 4 °C en PBS: 25 %, 50 %, 75 %, 95 % durante 30 min cada y se dejaron en 100 % de metanol durante la noche. Los esferoides se rehidrataron en la misma serie ascendente y se lavaron como antes en PBS antes del bloqueo en PBST (0,1 % de Triton X-100 en PBS) que contenía 3 % de BSA durante la noche a 4 °C. Después de 4 x lavados con PBST de 30 min, se añadieron anticuerpos secundarios (1:500/ PBST: Alexa GAR-AF647 y GAM-AF555). Para potenciar la señal de GFP, se añadió anti-GFP-AF488 a 1:200 durante 24 h. Los esferoides se lavaron (4 x 30 min/PBST) antes de la captura de imágenes usando la cuantificación 1 confocal YokoGawa (CQ1) a 20x de aumento.

Cuantificación del área de marcadores de células de podocitos

Se importaron proyecciones de intensidad máxima en Definiens Developer XD 64 y se analizaron usando el módulo de inmunofluorescencia. Se anotaron manualmente las áreas de esferoides y se determinaron los niveles de marcadores de expresión para los marcadores individuales y se ejecutó un algoritmo de análisis para determinar áreas de marcador por encima de la intensidad umbral para cada marcador. El área de cada marcador por encima de la intensidad umbral se determinó como una proporción del área del esferoide.

RESULTADOS

(1) Modelo inducido por adriamicina en ratón de enfermedad renal crónica (CKD)

Se identificóIL-28A de ratón (IFNL2)en un cribado para proteínas modificadoras de fibrosis en el modelo de CKD por adriamicina en ratón inicialmente como un miembro de un par de ADNc hidrodinámicamente transfectado (n=15 ratones). El par transfectado redujo la fibrosis renal como se mide por hidroxiprolina renal total en un 51 % con respecto a un grupo de control de transfección de solución salina (p=0,02) (Fig 1 (a) y (b)) y se normalizó a la función renal basándose en niveles de creatinina sérica (p<0,05) (Figura 1(c)). Los efectos antifibróticos de IL-28A se confirmaron en un estudio repetido, transfectando el ADNc de IL-28A independientemente en el mismo modelo (n=22 ratones por grupo). La IL-28A redujo la fibrosis renal como se mide por hidroxiprolina renal total en un 48 % con respecto al grupo de control de solución salina (p=0,0004) (Figura 2(a) y (b)), mientras que la pérdida de función renal volvió al intervalo normal, como se mide por creatinina sérica (creatinina sérica media = 1 pg/ml en el grupo de IL-28A en comparación con 4,8 pg/ml en el grupo de control de solución salina con adriamicina no tratado (p<0,0001); creatinina sérica media del grupo intacto = 0,8 pg/ml)(Figura 2(c)). La supervivencia condicionada como se mide por los síntomas de la insuficiencia renal terminal aumentó del 50 % en el grupo de adriamicina tratado con solución salina hasta el 85 % en los transfectados con IL-28A de ratón (Figura 2(d)). A los 49 días, se fijaron todos los riñones de los ratones supervivientes ((intactos (n=8), animales de adriamicina no tratados (n=20) y los animales hidrodinámicamente transfectados con IL-28A (n=19)), se incorporaron en parafina, se cortaron y se tiñeron con tricrómico de Masson (MT) o rojo de picrosirio (PSR) y se obtuvieron imágenes en un escáner de portaobjetos Hamamatsu. Imágenes a modo de ejemplo y representativas de los riñones teñidos con PSR para un animal intacto, tres de adriamicina no tratados y tres de adriamicina tratados con IL-28B se muestran en la Fig 5(f). El tratamiento con adriamicina ha causado que aproximadamente el 50 % de los glomérulos presenten glomeruloesclerosis clara con tinción de PSR potenciada predominantemente en la membrana basal glomerular, pero también en la matriz mesangial. En el tubulintersticio existe una expansión de la membrana basal tubular consistente en más del 70 % de la corteza, presentando un gran número de túbulos epitelios aplanados que causan una pérdida significativa de arquitectura tubular con una enorme distensión del túbulo que conduce a una gran luz sin borde en cepillo. Estas áreas tienen infiltración celular de leve a moderada.

La aplicación de IL-28A ha prevenido casi completamente los signos de la glomeruloesclerosis con poca evidencia de engrosamiento de la membrana basal glomerular. Solo 2 de los 22 animales mostraron signos notables de aplanamiento epitelial y la expansión de luz característica de los animales sin tratar. El resto de los animales tuvieron un tubulointersticio que pareció casi normal en más del 80 % de la corteza con poco efecto de la membrana basal tubular.

Las 47 muestras de riñón de ratón que se tiñeron con PSR se sometieron a análisis de imágenes de alto contenido usando el software Definiens y el área de tinción de PSR medida en los tres grupos se representó como el porcentaje de área teñida con PSR (Fig 5(g)). Los mismos 47 portaobjetos de riñón de ratón se sometieron a una evaluación patológica cegada del grado de fibrosis por dos individuos con experiencia en patologías renales. Un científico renal experto puntuó los portaobjetos teñidos con PSR usando un intervalo de puntuación de una escala de 0-10 puntos (0 que no muestran fibrosis, y 10 la fibrosis más alta). El tratamiento con IL-28A mostró una significativa reducción del 47 % en la puntuación de patología (p< 0,0001) en comparación con el grupo no tratado (Fig 5(h)). Un segundo experto científico renal puntuó manualmente los 47 portaobjetos teñidos con MT usando una escala 1-10 (1 que no muestran fibrosis y 10 la más alta). El grupo tratado con IL-28A demostró nuevamente una clara mejora en el nivel de remodelación fibrótica (p<0,0001) con respecto al grupo no tratado (Fig 5(i).

También se identificóIL-28B de ratón (IFNL3)en un cribado para proteínas modificadoras de fibrosis en el modelo de CKD por adriamicina en ratón inicialmente como un miembro de un par de ADNc hidrodinámicamente transfectado (n=15 ratones por grupo). El par transfectado redujo la fibrosis renal como se mide por hidroxiprolina renal total en un 59 % con respecto al grupo de control de transfección de solución salina (p=0,00086) (Figura 3(a) y (b)) y se normalizó a la función renal basándose en los niveles de creatinina sérica (no significativo) (Figura 3(c)). Los efectos antifibróticos de IL-28B se confirmaron en un estudio repetido, transfectando el ADNc de IL-28B independientemente en el mismo modelo (n=22 ratones por grupo). La fibrosis renal como se mide por hidroxiprolina renal total se redujo en un 65 % con respecto al grupo de control de solución salina (p=0,0000018)(Figura 4(a) y (b)), mientras que la función renal volvió al normal en comparación con un aumento significativo en el grupo de control de solución salina no tratado (creatinina sérica media =1,2 pg/ml en el grupo de IL-28B en comparación con una media de 32 pg/ml en el grupo de control de solución salina con adriamicina no tratado (p<0,05); creatinina sérica media del grupo intacto =0,8 pg/ml)(Figura 4(c)). La supervivencia condicional aumentó de <50 % en los animales no tratados con adriamicina al 100 % en los que recibieron IL-28 B (Figura 4(d)). A los 49 días, se fijaron todos los riñones de ratones supervivientes ((intactos (n=10), animales no tratados con adriamicina (n=18) y los animales hidrodinámicamente transfectados con IL-28B (n=22)), se incorporaron en parafina, se cortaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) o rojo de picrosirio (PSR) y se obtuvieron imágenes en un escáner de portaobjetos Hamamatsu. Imágenes a modo de ejemplo y representativas de los riñones teñidos con PSR para un animal intacto, tres de adriamicina no tratados y tres de adriamicina tratados con IL-28B se muestran en la Fig 5(a). Los riñones de ratones no tratados tuvieron una amplia glomeruloesclerosis y fibrosis tubulointersticial con notable expansión de la membrana basal tubular, aplanamiento del epitelio tubular, extensa dilatación tubular con pérdida del borde en cepillo y atrofia tubular. A diferencia, los ratones tratados con IL28B estuvieron muy protegidos de los dos tipos de remodelación fibrótica. Las 50 muestras de riñón de ratón que se tiñeron con PSR se sometieron a análisis de imágenes de alto contenido usando el software Definiens y el área de tinción con PSR medida en los tres grupos se representó como el porcentaje de área teñida con PSR (Fig 5(b)). El área teñida con PSR del grupo tratado con IL-28B se normalizó (p<0,0001) con respecto al aumento de 3 veces en riñones no tratados. Los mismos 50 portaobjetos de riñón de ratón se sometieron a una evaluación patológica cegada del grado de fibrosis por tres individuos con experiencia en patologías renales. Un anatomopatólogo clínico puntuó los portaobjetos teñidos con H&E usando un intervalo de puntuación de una escala de 0-4 puntos (0 que no muestran fibrosis, y 4 la mayor fibrosis). El tratamiento con IL-28B mostró una significativa reducción del 45 % en la puntuación de patología (p< 0,01) en comparación con el grupo no tratado (Fig 5(c)). Dos científicos renales expertos puntuaron manualmente los 50 portaobjetos teñidos con PSR usando una escala de 1-10 (1 que no muestran fibrosis y 10 la más alta). El grupo tratado con IL-28B demostró nuevamente una clara mejora en el nivel de remodelación fibrótica (p<0,0001) con respecto al grupo no tratado (Fig 5(d) y (e)).

(2) Modelos in vitro de células humanas primarias de fibrosis de órganos

(2.1) Fibrosis hepática

Las células estrelladas primarias humanas cultivadas en plástico son autoactivantes y se acumulan a un nivel basal sustancial de matriz extracelular como se mide por los niveles de las proteínas de MEC fibronectina, colágeno IV y colágeno I y III. Esta acumulación de MEC se puede inhibir por el tratamiento del cultivo con IL-28A recombinante en un modo dependiente de la dosis (Figura 6(a)). El cocultivo de células estrelladas primarias humanas con hepatocitos humanos primarios (relación 1:1) conduce a una matriz extracelular basal que también se puede inhibir mediante el tratamiento con IL-28A humana recombinante en un modo dependiente de la dosis con fibronectina, colágeno IV y colágeno I y III reducido (Figura 6(b)).

La estimulación con TGFpl de tanto el monocultivo de células estrelladas como el cocultivo de estrelladashepatocitos indujo un aumento adicional en las proteínas de MEC, fibronectina, colágeno IV y colágeno I y NI. El tratamiento del monocultivo de células estrelladas estimuladas con TGFp1, o el cocultivo de estrelladas-hepatocitos con cualquiera de IL-28A o IL-28B, demostró una inhibición casi completa de cualquier aumento en cualquier proteína de MEC a la mayor concentración de 10 pg/ml de IL-28A o B, inhibiendo ambos en un modo dependiente de la dosis. La IL-28A fue más potente que IL-28B a través de todas las proteínas de MEC en las células hepáticas estimuladas con TGFp1 (Figura 7(a) y (b)). Las imágenes de MEC en cocultivo estimulado con TGFp1 en presencia de cualquiera de los cocultivos tratados con IL-28A o IL-28B muestran una clara reducción en la cantidad de MEC en comparación con el tratamiento con TGFp1 solo, estando de acuerdo con la cuantificación del análisis de imágenes (Figura 8).

(2.2) Fibrosis del intestino delgado

Fibroblastos del intestino delgado humano estimulados con TGFp1 (10 ng/ml) inducen las proteínas de la matriz extracelular, fibronectina y colágeno I y III. El nivel de fibronectina fue significativamente inhibido por IL-28A, IL-28B e IL-29 (10 ng/ml), con inhibición del 76 %, 73 % y 83 %, respectivamente, con respecto a la estimulación de TGFp1 de control. El colágeno I y III se inhibió por IL-28A, IL-28B e IL-29 (10 ng/ml), en 48 %, 33 % y 35 %, respectivamente. El colágeno IV solo fue inhibido significativamente por IL-28A (inhibición del 37 % a 10 pg/ml) en relación con la estimulación con TGFp1 de control (Figura 9).

(2.3) Fibrosis dérmica

Fibroblastos dérmicos primarios humanos en cocultivo con queratinocitos primarios (relación 9:1) acumulan una cantidad sustancial de fibronectina, colágeno I y III y colágeno IV solo por estar en cocultivo. Usando 3 lotes separados de fibroblastos en combinación con queratinocitos de un único donante, los cultivos se trataron con cualesquiera de IL-28A o IL-28B. El porcentaje de inhibición en proteínas de MEC con respecto a los cultivos no tratados se midió con los 3 lotes de fibroblastos y se representó la inhibición media (Figura 10). Tanto IL-28A como IL-28B inhibieron completamente las 4 proteínas de la matriz a la concentración más alta de 10 pg/ml con eficacia similar. Tanto IL-28A como IL-28B mostraron una inhibición dependiente de la dosis del marcador de MEC Col IV entre 10 y 10000 ng/ml. La viabilidad celular se probó usando el ensayo Presto Blue, que muestra que ni IL-28A ni IL-28B fueron tóxicos a ninguna concentración probada (Figura 10).

El cocultivo de fibroblastos-queratinocitos dérmicos se trató con IL-29, IL-28A e IL-28B en un intervalo de concentración más estrecho de 1250-10000 ng/ml. Esto mostró inhibición dependiente de la dosis de fibronectina, colágeno I y III y colágeno IV con respecto al cocultivo de control (Figura 11). El colágeno IV fue el más inhibido por los IFNL a todas las concentraciones probadas (Figura 11). La viabilidad celular no se vio afectada por el tratamiento con IL-29, IL-28A o IL-28B como se ha determinado por el ensayo de viabilidad celular Presto Blue (Figura 11).

Las imágenes de cocultivos dérmicos no tratados en comparación con los cocultivos tratados con IL-29, IL-28A e IL-28B a tanto 1250 ng/ml como 10000 ng/ml confirmó la prevención total de la acumulación de MEC determinada por análisis de imágenes en presencia de 10 ug/ml de IFNL (Figura 12).

Finalmente, los fibroblastos dérmicos humanos se estimularon en monocultivo con IL-1 a (10 ng/ml) para inducir las proteínas de MEC fibronectina, colágeno I y III y colágeno IV. El tratamiento de los monocultivos de fibroblastos estimulados con IL-1 a con IL-28A o IL-28B demostró una potente inhibición de la respuesta promatriz para todas las proteínas de MEC con inhibición completa de matriz en la concentración más alta de 10 pg/ml. La IL-28A fue más potente que el IL-28B en todos los lotes de fibroblastos, con un ejemplo representativo representado (Figura 13). IL-28A o IL-28B no tuvieron efecto sobre la viabilidad celular como se mide por Presto Blue (Figura 13).

(2.4) Fibrosis renal

Células epiteliales tubulares proximales renales primarias humanas (RPTEC) puestas en cocultivo con fibroblastos renales primarios humanos (sembrados con 2000 células/pocillo en una relación 1:1) generan una robusta MEC, alta en fibronectina y colágeno I y III. Este cocultivo se trató con IL-29, IL-28A o IL-28B usando 3 protocolos diferentes para la adición de citocinas.

En primer lugar, se añadieron IL-29, IL-28A e IL-28B al cocultivo renal en el día 0 y el cultivo se incubó durante 7 días. Las 3 citocinas inhibieron potentemente de un modo dependiente de la dosis la acumulación de fibronectina y colágeno I y III (Figura 14(a)). La IL-29 demostró los efectos más potentes, con poca diferencia entre IL-28A e IL-28B. La viabilidad celular no estuvo comprometida por el tratamiento con citocinas ((Figura 14(a)).

En segundo lugar, las IL-29, IL-28A e IL-28B se añadieron a las células RPTEC en el día 0, los fibroblastos se añadieron 24 horas después y a continuación se dejó que el cultivo continuara durante un total de 7 días después de que se midiera la MEC. Aquí, IL-29, IL-28A e IL-28B inhibieron todos nuevamente en un modo dependiente de la dosis la acumulación de fibronectina y colágeno I y III (Figura 14(b)). La magnitud de la inhibición de las proteínas de MEC en presencia de los IFNL fue mayor cuando las citocinas se añadieron a las RPTEC 24 horas antes de que se iniciara la inducción del cocultivo de MEC mediante la adición de los fibroblastos en vez de a ambas células simultáneamente (comparación de la Figura 14(a) y Figura 14(b)).

Finalmente, IL-29, IL-28 e IL-28B se añadieron a los fibroblastos en el día 0. Veinticuatro horas después, las RPTEC se añadieron y el cocultivo continuó durante un total de 7 días cuando la fibronectina y el colágeno I y III se midieron. La adición de IFNL a los fibroblastos también mostró en primer lugar una inhibición significativa de las proteínas de MEC (Figura 14(c)), pero redujo la eficacia de IL-29, IL-28A e IL-29B en comparación con tanto la adición de las citocinas en el día 0 al cocultivo como la adición de las citocinas a las RPTEC 24 horas antes de los fibroblastos. Esta observación indica a una respuesta de señalización mediada por IL-28R1 en RPTEC que median en un fenotipo antifibrótico que da como resultado una inhibición de la señal de MEC en el cocultivo de tanto los tipos de células epiteliales como de fibroblastos. Para demostrar claramente el efecto diferencial del orden de adición de los IFNL a los diferentes tipos de células frente a la adición simultánea, se volvieron a representar datos de IL-28A, IL-28B e IL-29 para fibronectina (Figura 15(a)) y para Col I y III (Figura 15(b)) que muestran el efecto relativo de los diferentes protocolos de adición al nivel de inhibición para cada ligando de IL-28R1 individual. A ciertas concentraciones más bajas de IL-28A, IL-28B o IL-29, la diferencia entre la adición simultánea de células y citocinas en comparación con la adición a las RPTEC primero (antes fibroblastos) alcanzó significación estadística y estos valores están marcados en los gráficos.

La viabilidad celular no se vio comprometida mediante la adición de las citocinas primero a las RPTEC o fibroblastos antes que a la otra célula del cocultivo como se lee por Presto Blue (Figura 14(a), (b) y (c)).

Imágenes representativas (una de un total de 16 campos por tratamiento) del cocultivo no tratado en comparación con los cocultivos tratados con IL-28A, IL-28B e IL-29 muestran tanto los efectos dependientes de la dosis de IL-29, IL-28A e IL-28B como la inhibición casi total observada en presencia de 1000 ng/ml de IL-29 (Figura 16), lo que confirma los datos de análisis de imágenes.

Células epiteliales tubulares proximales renales (RPTEC) en monocultivo depositan proteínas de MEC basal al crecer en plástico, a pesar de a bajos niveles. Los bajos niveles de MEC se pueden todavía inhibir en presencia de concentraciones muy bajas de IL-29 como se muestra para fibronectina, colágeno IV y colágeno I y III en la Figura 22.

(2.5) Fibrosis pulmonar

Células epiteliales pulmonares de vías respiratorias pequeñas primarias humanas en cocultivo con fibroblastos de pulmón aislados de un paciente con fibrosis pulmonar idiopática (IPF) (2000 células/pocillo a una relación 1:1) generaron una MEC total robusta (medida por tinción con Flamingo) después de 7 días en cultivo y fue positiva para marcadores de MEC, fibronectina, colágeno I y III y colágeno IV. IL-28A o IL-28B no tenían efecto significativo sobre el nivel de fibronectina. Sin embargo, la IL-28B demostró una inhibición significativa del colágeno I y III, colágeno IV y tinciones con Flamingo a la concentración más alta de 10 |ug/ml (Figura 17). Sin embargo, los efectos de IL-28A fueron menos pronunciados. No hubo cambio en la viabilidad celular a los 7 días ni con IL-28A ni con IL-28B (Figura 17).

(3) Modelos de células humanas primarias de fibrosis de órganos

(3.1) Fibrosis hepática

El cocultivo de células estrelladas primarias humanas con células epiteliales biliares intrahepáticas humanas primarias (relación 1:1) conduce a una matriz extracelular basal que también se puede inhibir mediante el tratamiento con IL-28A e IL-29 humana recombinante en un modo dependiente de la dosis con fibronectina, colágeno IV y colágeno I y III reducidos (Figura 19).

(3.2) Modelo de esferoides glomerulares 3D

Se construyeron esferoides glomerulares a partir de un núcleo interno de células endoteliales glomerulares primarias humanas magnetizadas con un núcleo externo de podocitos humanos condicionados por la temperatura que pueden mantenerse en cultivo estable durante hasta 3 semanas. El tratamiento de los esferoides glomerulares con 15 % de plasma de recaída de pacientes con glomeruloesclerosis focal y segmentaria (FSGS) indujo una pérdida de podocitos marcados con GFP del núcleo externo, que se podría proteger en presencia de IL-28A. El plasma de voluntarios sanos no tuvo efecto sobre los podocitos. La cuantificación del área de marcador celular de podocitos fluorescentes verde demostró una reducción significativa en presencia de plasma de recaída de FSGS que aumentó significativamente con el tratamiento con IL-28A (Figura 20(a), (b) y (c)). La progresión clínica de FSGS se caracteriza por borrado y pérdida de podocitos. Este modelo recrea el efecto sobre podocitos del factor circulante en plasma de FSGS y sugiere la capacidad de extrapolación clínica de la terapia con IL-28 para prevenir el síndrome nefrótico asociado y la glomeruloesclerosis.

(4) Modelo de obstrucción ureteral unilateral (UUO) de ratón de fibrosis renal

(4.1) IL28B de ratón administrada por transfección hidrodinámica (HDT)

Riñones con UUO en animales que recibieron el vector SEAP de control por HDT demostraron una fibrosis tubulointersticial en la corteza típica de este modelo 21 días después de la cirugía con expansión generalizada de la membrana basal tubular, tinción fuerte de colágeno con la membrana basal particularmente fuertemente teñida dentro de la columna medular, pérdida generalizada de volumen de células epiteliales, atrofia tubular, pérdida del borde en cepillo tubular proximal y amplio infiltrado tubulointersticial. Menos del 15 % de los túbulos tuvieron una arquitectura casi normal. La médula fue eficazmente destruida y estuvo ausente mientras que los cambios a los glomérulos fueron mínimos (Figura 21(a)).

Riñones con UUO en animales que se sometieron a HDT con IL-28B de ratón tanto 1 día antes de la UUO como aquellos 7 días después de UUO mostraron protección de la fibrosis tubulointersticial cortical 21 días después de la cirugía (Figura 21 (a)). La expansión de la membrana basal tubular y la tinción del colágeno fue al menos del 30 % al 40 % menos en ambos grupos que recibieron IL-28B de ratón por HDT que en ratones UUO que recibieron el vector de control. Ambos grupos de IL28B tuvieron conservación de la arquitectura tubular ocurriendo menos aplanamiento epitelial y atrofia. Entre el 30 y el 40 % de los túbulos mostró una estructura casi normal en aquellos que tenían HDT desde el día -1 antes de HDT y ligeramente menos (20 a 30 %) en aquellos con tratamiento posterior. La infiltración intersticial fue aproximadamente del 40 % en ambos grupos de IL-28 en comparación con el grupo de vector de control. Ningún grupo de IL28 tuvo ninguna protección notable de la estructura medular. En general, la administración tanto temprana como tardía de IL28B por HDT tuvo una protección significativa de la remodelación fibrótica inducida por UUO en la corteza renal.

Las secciones de colágeno teñidas con rojo picrosirio (PSR) fueron cuantificadas usando algoritmos de análisis de imágenes Definiens, que muestran el efecto protector estadísticamente significativo de IL-28B de ratón administra en el día -1 o en el día 7 cuando se representó como el área de colágeno total (Figura 21 (b)) o el área de colágeno de alta intensidad (Figura 21 (c)) con respecto a los ratones tratados con plásmido de control. Esto está de acuerdo con la evaluación histológica visual de las secciones teñidas como se ha descrito anteriormente.

Los niveles en suero de proteína IL28B de ratón alcanzados en el día 21 después de HDT en el modelo de UUO de ratón se midieron por ELISA y estuvieron entre 43 y 485 ng/ml en todos los grupos. Ninguna proteína IL28B de ratón se pudo medir en los ratones SEAP HDT de control, por lo que los niveles estuvieron por debajo de 4 ng/ml, que era el límite inferior de cuantificación (LLQ) del ensayo usado.

(4.2) IL-29 humana administrada por transfección hidrodinámica (HDT)

La IL-29 humana administrada por HDT muestra una expresión significativa de proteínas en todos los ratones tanto en el día 0 (24 horas después de la transfección) como en el día 19 cuando el modelo terminó en comparación con el grupo tratado con plásmido de control SEAP (Figura 23(a)). No se pudo detectar IL-29 humana en ratones no transfectados o SEAP de sueros de control.

La UUO no tratada en el día 19 muestra cambios histológicos típicos para este modelo. Hay una amplia destrucción y pérdida de la médula renal en todos los riñones. La corteza muestra una expansión generalizada de la membrana basal tubular con significativa acumulación de colágeno intersticial como se muestra por el aumento de tinción con rojo de picro-sirio (PSR). También hay una notable infiltración de células en el intersticio a través de la corteza completa. La estructura del epitelio tubular se daña significativamente. La mayoría de las células epiteliales han perdido volumen y, en general, parecen aplanadas, que incluye un pequeño número de túbulos con una luz dilatada. En particular, más del 80 % de los túbulos han experimentado una amplia atrofia y en muchos casos han colapsado completamente. La luz de los túbulos es difícil de distinguir en la mayoría de los casos debido a la pérdida de permeabilidad, con células epiteliales claramente desalojadas de la membrana basal tubular de la nefrona y que residen en lo que habría sido la luz.

Riñones con UUO en el día 19 tratados desde el momento de la UUO con IL-29 tienen un aspecto espectacularmente diferente a los que sólo recibieron el vector SEAP con la estructura claramente conservada. La médula está dañada, pero sigue estando presente y tiene una estructura más reconocible que la UUO no tratada en el 75 % de los animales. En la corteza, la observación primaria a niveles más bajos de aumento es un gran número de túbulos que tienen una luz tubular dilatada en comparación con la UUO de SEAP. Sin embargo, donde esto se asociaría normalmente a células epiteliales muy aplanadas y expansión de la membrana basal tubular en una UUO no tratada, con tratamiento con IL-29 las células epiteliales han retenido volumen, existe una expansión mínima de la membrana basal tubular y la arquitectura de los túbulos se conserva significativamente con poco a nada de evidencia de atrofia y colapso tubular. Hay niveles claramente menores de colágeno intersticial y expansión reducida de la membrana basal tubular. En general, la aplicación de IL-29 ha reducido significativamente la fibrosis tubulointersticial causada por UUO, con menos colágeno intersticial y una espectacular conservación de la arquitectura tubular como se muestra por imágenes representativas en la Figura 23(b).

Todas las secciones de colágeno teñidas con rojo picro-sirio (PSR) se cuantificaron usando los algoritmos de análisis de imágenes Definiens, que muestran el efecto protector estadísticamente significativo de IL-29 humana administrada en el día -1 cuando se representa como área de colágeno teñida total con respecto a los ratones tratados con el plásmido SEAP de control (Figura 23(c)). Esto está de acuerdo con la evaluación histológica visual de las secciones teñidas como se ha descrito anteriormente.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Interferón-lambda para su uso en el tratamiento de fibrosis, en donde la fibrosis es fibrosis renal, fibrosis pulmonar, fibrosis del intestino delgado o fibrosis de la piel.

2. Interferón-lambda para su uso según la reivindicación 1, en donde el interferón-lambda es IFN-A1, IFN-A2, IFN-A3 o IFN-A4.

3. Interferón-lambda para su uso según la reivindicación 1 o 2, en donde el interferón-lambda está pegilado.

4. Interferón-lambda para su uso según la reivindicación 3, en donde el interferón lambda es peginterferón lambda-1a.

5. Interferón-lambda para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el interferón-lambda activa el receptor de interferón-lambda.

6. Interferón-lambda para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el interferón lambda comprende una secuencia de aminoácidos que tienen 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de proteínas de IFNL1 humano en la Figura 18.

7. Interferón-lambda para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el interferón-lambda comprende un fragmento de polipéptido de la secuencia de proteínas de IFNL1 humano en la Figura 18, en donde dicho fragmento comprende más de 150 residuos de aminoácidos de la secuencia de proteínas de IFNL1 humano en la Figura 18.

8. Interferón-lambda para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el interferón-lambda comprende la secuencia de aminoácidos de la secuencia de proteínas de IFNL1 humano en la Figura 18.

9. Interferón-lambda para su uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el interferón lambda es una proteína de fusión.