ES3017865T3

ES3017865T3 - Synergistic bacterial compositions and methods of production and use thereof

Info

Publication number: ES3017865T3
Application number: ES14821918T
Authority: ES
Inventors: Matthew Henn; Kevin Litcofsky; Anthony D'onofrio; Toshiro Ohsumi; Mary-Jane Mckenzie; Maltzahn Geoffrey Von; David Cook; David Berry; Noubar Afeyan; John Aunins
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Priority date: 2013-11-25
Filing date: 2014-11-25
Publication date: 2025-05-13
Anticipated expiration: 2034-11-25
Also published as: WO2015077794A4; JP2021059545A; US11918612B2; US11266699B2; US20200345792A1; MX2016006708A; KR102515850B1; CA2931317C; KR102611070B1; JP6833514B2; CN116370507A; AU2021200287B2; CA2931317A1; WO2015077794A1; JP2016537434A; RU2016125316A; JP2024038027A; DK3074027T3; KR20220042246A; CN105979952A

Abstract

Se proporcionan composiciones terapéuticas que contienen poblaciones microbianas para la prevención, el tratamiento y la reducción de los síntomas asociados con una disbiosis de un sujeto mamífero tal como un ser humano. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones bacterianas sinérgicas y métodos de producción y utilización de las mismas

Antecedentes

Los mamíferos están colonizados por microorganismos en el tracto gastrointestinal (GI), en la piel y en otros nichos epiteliales y tisulares, tales como la cavidad oral, la superficie del ojo y la vagina. El tracto gastrointestinal alberga una comunidad microbiana abundante y diversa. Es un sistema complejo, que proporciona un entorno o nicho para una comunidad de muchas especies u organismos diferentes, incluidas diversas cepas de bacterias. En una persona sana, cientos de especies diferentes pueden formar una comunidad comensal en el tracto GI, y este complemento de organismos evoluciona desde el momento del nacimiento hasta formar una población microbiana funcionalmente madura aproximadamente a los 3 años de edad. Las interacciones entre las cepas microbianas en estas poblaciones y entre los microorganismos y el huésped, p. ej., el sistema inmunitario del huésped, moldean la estructura de la comunidad, de manera que la disponibilidad de los recursos y la competencia por ellos afectan a la distribución de los microorganismos. Dichos recursos pueden ser alimentos, ubicación y la disponibilidad de espacio para crecer, o una estructura física a la que pueda adherirse el microorganismo. Por ejemplo, la dieta del huésped contribuye a dar forma a la flora del tracto GI.

Una microorganismo saludable proporciona al huésped múltiples beneficios, incluyendo resistencia a la colonización por un amplio espectro de patógenos, la biosíntesis y absorción de nutrientes esenciales, y la estimulación inmunitaria que mantiene un epitelio intestinal saludable y una inmunidad sistémica adecuadamente controlada. Bajo condiciones de "disbiosis" o simbiosis alterada, las funciones de la microbiota pueden perderse o alterarse, dando como resultado una mayor susceptibilidad a patógenos, perfiles metabólicos alterados o la inducción de señales proinflamatorias que pueden resultar en inflamación local o sistémica o autoinmunidad. De esta manera, la microbiota intestinal desempeña un papel significativo en la patogénesis de muchas enfermedades y trastornos, incluyendo una variedad de infecciones patogénicas del intestino. Por ejemplo, las personas se vuelven más susceptibles a infecciones patogénicas cuando la microbiota intestinal normal ha sido alterada debido a la utilización de antibióticos de amplio espectro. Algunas de estas enfermedades y trastornos son afecciones crónicas que disminuyen significativamente la calidad de vida de la persona y, en última instancia, algunas pueden ser mortales.

Se ha demostrado que el trasplante de heces a veces resulta un tratamiento eficaz para los sujetos que sufren de infecciones GI graves o refractarias y otros trastornos, mediante la repoblación del tracto intestinal con una variedad diversa de microorganismos que controlan patógenos clave mediante la generación de un entorno ecológico adverso a su proliferación y supervivencia. Tales enfoques han demostrado potencial para reducir la susceptibilidad del huésped a infecciones. El trasplante fecal, sin embargo, generalmente se utiliza solo para casos recurrentes porque tiene el potencial de transmitir agentes infecciosos o alérgenos entre huéspedes, implica la transmisión de potencialmente cientos de cepas desconocidas de donante a sujeto, y resulta difícil de realizar a gran escala. Además, el trasplante fecal inherentemente es un método no estandarizado y en cualquier donación dada se podría transmitir diferente material deseado y/o no deseado. De esta manera, existe la necesidad de composiciones definidas que puedan utilizarse para disminuir la susceptibilidad a infecciones y/o para facilitar la restauración de una microbiota intestinal saludable.

Además, los profesionales tienen la necesidad de tratamientos seguros y reproducibles para trastornos que actualmente se tratan de manera experimental mediante trasplante fecal.

Descripción resumida

Para satisfacer la necesidad de tratamientos seguros y reproducibles para trastornos que pueden modularse mediante la inducción de un microbioma gastrointestinal saludable y para tratar enfermedades asociadas con el microbioma gastrointestinal, los solicitantes han diseñado composiciones bacterianas de cepas bacterianas aisladas con una pluralidad de propiedades funcionales, en particular que resultan útiles para tratar la disbiosis (p. ej., restaurar un microbioma gastrointestinal a un estado de salud) y para tratar trastornos asociados a infecciones o desequilibrios de especies microbianas presentes en el intestino, basadas en los hallazgos de los solicitantes referidos a esas cepas bacterianas y el análisis y conocimiento sobre las propiedades relacionadas con esas cepas y combinaciones de esas cepas, lo que ha llevado a la materia dada a conocer en la presente memoria.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende por lo menos unClostridium orbiscindensaislado capaz de formar una espora y que comprende una secuencia de ácido nucleico 16S por lo menos 97 % idéntica a la SEQ ID NO: 609, por lo menos unClostridium tertiumaislado capaz de formar una espora y que comprende una secuencia de ácido nucleico 16S por lo menos 97 % idéntica a SEQ ID NO: 653, y por lo menos unCoprococcus comesaislado capaz de formar una espora y que comprende una secuencia de ácido nucleico 16S por lo menos 97 % idéntica a SEQ ID NO: 674, en donde la combinación ternaria deClostridium orbiscindens, Clostridium tertium,yCoprococcus comespuede disminuir y/o inhibir de forma sinérgica el crecimiento y/o la colonización de por lo menos un tipo de bacteria patogénica en el tracto gastrointestinal humano.

En otros aspectos, la presente invención proporciona una unidad de dosis única que comprende la composición de la invención, así como formulaciones farmacéuticas de la misma. Se proporciona además una composición de la invención para la utilización en un método de prevención, tratamiento, reducción de la gravedad o reducción de uno o más síntomas de una disbiosis del tracto gastrointestinal. Se proporciona, además, una formulación farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de la composición de la invención, y que además comprende una cantidad eficaz de un agente antimicrobiano, para la utilización en un método de reducción del número de bacterias patogénicas presentes en el tracto gastrointestinal de un sujeto humano.

La presente invención y algunas realizaciones de la misma se exponen en las reivindicaciones adjuntas.

De esta manera, la invención proporciona una composición bacteriana que comprende por lo menos un primer tipo de bacteria aislada capaz de formar una espora, un segundo tipo de bacteria aislada capaz de formar una espora y un tercer tipo de bacteria aislada capaz de formar una espora, en la que el primer tipo, el segundo tipo y el tercer tipo no son idénticos, y en la que el primer tipo, el segundo tipo y el tercer tipo son capaces de disminuir y/o inhibir sinérgicamente el crecimiento y/o la colonización de por lo menos un tipo de bacteria patogénica en el tracto gastrointestinal humano. En algunas realizaciones, la composición bacteriana comprende por lo menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 tipos de bacterias aisladas capaces de formar esporas. En otras realizaciones, la composición bacteriana comprende por lo menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 tipos de bacterias aisladas que no contienen por lo menos un gen asociado a esporulación. En realizaciones adicionales, la composición bacteriana comprende por lo menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 tipos de bacterias aisladas en forma de espora. En realizaciones adicionales, la composición bacteriana comprende por lo menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 tipos de bacterias aisladas en forma vegetativa. En realizaciones adicionales, la composición bacteriana comprende por lo menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 tipos de bacterias aisladas en forma de espora, y en donde la composición bacteriana comprende además por lo menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 tipos de bacterias aisladas en forma vegetativa. En realizaciones adicionales, la composición bacteriana comprende por lo menos aproximadamente cinco tipos de bacterias aisladas y por lo menos aproximadamente el 20 % de las bacterias aisladas son capaces de formar esporas o están en forma de esporas. En realizaciones adicionales, la composición bacteriana comprende por lo menos aproximadamente cinco tipos de bacterias aisladas y por lo menos dos de las bacterias aisladas son capaces de formar esporas o están en forma de esporas. En realizaciones adicionales, el primer tipo, el segundo tipo y el tercer tipo están presentes en la composición en concentraciones aproximadamente iguales. En realizaciones adicionales, el primer tipo y el tercer tipo están presentes en la composición en concentraciones aproximadamente iguales. En realizaciones adicionales, el segundo tipo y el tercer tipo están presentes en la composición en concentraciones aproximadamente iguales. En realizaciones adicionales, el primer tipo está presente en la composición en por lo menos aproximadamente 150 % de la concentración del segundo tipo y/o del tercer tipo. En realizaciones adicionales, el primer tipo, el segundo tipo y el tercer tipo están presentes individualmente en la composición en por lo menos aproximadamente 150 % de la concentración del tercer tipo.

En algunas realizaciones, una combinación de los primeros, segundos y terceros tipos de bacterias aisladas es capaz de ser inhibitoria de la bacteria patogénica. En otras realizaciones, una combinación de los primeros, segundos y terceros tipos es capaz de ser citotóxica o citostática para la bacteria patogénica. En realizaciones adicionales, una combinación de los primeros, segundos y terceros tipos es capaz de ser citotóxica o citostática para la bacteria patogénica. En realizaciones adicionales, una combinación de los primeros, segundos y terceros tipos es capaz de inhibir la proliferación de la bacteria patogénica presente a una concentración por lo menos igual a la concentración de la combinación de los primeros, segundos y terceros tipos. En realizaciones adicionales, el patógeno bacteriano se selecciona del grupo que consiste enYersinia, Vibrio, Treponema, Streptococcus, Staphylococcus, Shigella, Salmonella, Rickettsia, Pseudomonas, Neisseria, Mycoplasma, Mycobacterium, Listeria, Leptospira, Legionella, Helicobacter, Haemophilus, Francisella, Escherichia, Enterococcus, Klebsiella, Corynebacterium, Clostridium, Chlamydia, Chlamydophila, Campylobacter, Brucella, BorreliayBordetella.

En realizaciones adicionales, los primeros, segundos y terceros tipos son capaces de colonizar funcionalmente el tracto gastrointestinal de un sujeto humano al que se le administra la composición. En realizaciones adicionales, la colonización funcional del tracto gastrointestinal comprende prevenir una disbiosis del tracto gastrointestinal. En realizaciones adicionales, la colonización funcional del tracto gastrointestinal comprende tratar una disbiosis del tracto gastrointestinal. En realizaciones adicionales, la colonización funcional del tracto gastrointestinal comprende reducir la gravedad de una disbiosis del tracto gastrointestinal. En realizaciones adicionales, la colonización funcional del tracto gastrointestinal comprende reducir uno o más síntomas de una disbiosis del tracto gastrointestinal. En realizaciones adicionales, la colonización funcional del tracto gastrointestinal comprende prevenir la colonización del tracto gastrointestinal por una bacteria patogénica. En realizaciones adicionales, la colonización funcional del tracto gastrointestinal comprende reducir la colonización del tracto gastrointestinal por una bacteria patogénica. En realizaciones adicionales, la colonización funcional del tracto gastrointestinal comprende la reducción del número de uno o más tipos de bacterias patogénicas en el tracto gastrointestinal. En realizaciones adicionales, la colonización funcional del tracto gastrointestinal comprende incrementar el número de una o más bacterias no patogénicas en el tracto gastrointestinal.

En una realización, la composición bacteriana comprende por lo menos aproximadamente cinco tipos de bacterias aisladas capaces de formar esporas. En una realización, la composición bacteriana comprende por lo menos aproximadamente siete tipos de bacterias aisladas capaces de formar esporas. En una realización, el primer tipo, el segundo tipo y el tercer tipo están presentes en la composición en concentraciones aproximadamente iguales.

En otro aspecto, se proporcionan unidades de dosis única que comprenden las composiciones de la presente invención. En una realización, la unidad de dosis comprende por lo menos 1×10<4>, 1×10<5>, 1×10<6>, 1×10<7>, 1×10<8>, 1×10<9>, 1×10<10>, 1×10<11>o más de 1×10<11>unidades formadoras de colonia (UFC) de esporas o células bacterianas vegetativas. En una realización, la unidad de dosis comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable, un recubrimiento entérico o una combinación de los mismos. En una realización, la unidad de dosis comprende, además, un fármaco seleccionado de corticosteroides, mesalazina, mesalamina, sulfasalazina, derivados de sulfasalazina, fármacos inmunosupresores, ciclosporina A, mercaptopurina, azatioprina, prednisona, metotrexato, antihistamínicos, glucocorticoides, epinefrina, teofilina, cromoglicato sódico, antileucotrienos, fármacos anticolinérgicos para la rinitis, descongestionantes anticolinérgicos, estabilizadores de mastocitos, anticuerpos monoclonales anti-IgE, vacunas y combinaciones de los mismos, en donde el fármaco está presente en una cantidad eficaz para modular la cantidad y/o la actividad de por lo menos un patógeno. En una realización, la unidad de dosis está formulada para la administración oral, la administración rectal, o una combinación de administración oral y rectal, o está formulada para la administración tópica, nasal o por inhalación. En una realización, la unidad de dosis comprende bacterias indicadas en cualquier fila de la Tabla 4a o Tabla 4b, una combinación de bacterias indicadas en cualquier fila de la Tabla 4a que presenta una designación de +++ o ++, o cualquier fila de la Tabla 4a que presente una designación de percentil 75.

Se proporcionan, además, formulaciones farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz de las composiciones de la invención, y que comprenden, además, una cantidad eficaz de un agente antibacteriano, una cantidad eficaz de un agente antifúngico, una cantidad eficaz de un agente antivírico, y una cantidad eficaz de un agente antiparasitario.

Una composición de la invención puede administrarse a un sujeto humano que lo necesite, en donde por lo menos uno del primer tipo, segundo tipo y tercer tipo de bacterias ejerza un efecto inhibitorio sobre una bacteria patogénica presente en el tracto gastrointestinal del sujeto humano, de tal manera que el número de bacterias patogénicas presentes en el tracto gastrointestinal no se incremente de manera detectable o se reduzca de manera detectable durante un período de tiempo. En una realización, se diagnostica que el sujeto humano presenta una disbiosis del tracto gastrointestinal. En una realización, se diagnostica que el sujeto humano presenta una infección por una bacteria patogénica seleccionada del grupo que consiste enYersinia, Vibrio, Treponema, Streptococcus, Staphylococcus, Shigella, Salmonella, Rickettsia, Orientia, Pseudomonas, Providencia, Proteus, Propionibacterium, Neisseria, Mycoplasma, Mycobacterium, Morganella, Listeria, Leptospira, Legionella, Klebsiella, Helicobacter, Haemophilus, Fusobacterium, Francisella, Escherichia, Ehrlichia, Enterococcus, Coxiella, Corynebacterium, Clostridium, Chlamydia, Chlamydophila, Campylobacter, Burkholderia, Brucella, Borrelia, Bordetella, Bifidobacterium, Bacillus,bacterias multirresistentes,Enterobacteriaceaeresistentes a carbapenémicos (CRE, por sus siglas en inglés), enterococos resistentes a beta-lactámicos de espectro extendido (ESBL, por sus siglas en inglés), y enterococos resistentes a vancomicina (VRE, por sus siglas en inglés). En una realización, la composición bacteriana se administra simultáneamente con i) un antibiótico, ii) un prebiótico, o iii) una combinación de i) y ii). En una realización, la composición bacteriana se administra previamente a la administración de i) un antibiótico, ii) un prebiótico, o iii) una combinación de i) y ii). En una realización, la composición bacteriana se administra posteriormente a la administración de i) un antibiótico, ii) un prebiótico, o iii) una combinación de i) y ii). En una realización, el número de bacterias patogénicas presentes en el tracto gastrointestinal del sujeto humano o excretadas del mismo se reduce de manera detectable en menos de un mes, en menos de dos semanas o en menos de una semana después de la administración de la composición bacteriana. En una realización, el número de bacterias patogénicas presentes en el tracto gastrointestinal del sujeto humano o excretadas del mismo se reduce de manera detectable en menos de tres días, en menos de dos días o un día de administración de la composición bacteriana. En una realización, el sujeto humano está detectablemente libre de la bacteria patogénica menos de un mes, dos semanas, una semana, tres días o un día después de la administración de la composición bacteriana. En una realización, la composición bacteriana comprende por lo menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 tipos de bacterias aisladas. En una realización, la composición bacteriana comprende: i) por lo menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más tipos de bacterias aisladas capaces de formar esporas, ii) por lo menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más tipos de bacterias aisladas no conocidas por ser capaces de formar esporas, o iii) cualquier combinación de i) y ii). En una realización, la composición bacteriana comprende por lo menos aproximadamente cinco tipos de bacterias aisladas y por lo menos una de las bacterias aisladas no es capaz de formar esporas. En una realización, una combinación del primer tipo, segundo tipo y tercer tipo es citotóxica o citostática para la bacteria patogénica. En una realización, la combinación es capaz de inhibir la proliferación de las bacterias patogénicas presentes a una concentración por lo menos igual a la concentración de la combinación del primer tipo, segundo tipo y tercer tipo. En una realización, la combinación es capaz de inhibir la proliferación de las bacterias patogénicas presentes a una concentración por lo menos doble de la concentración de la combinación del primer tipo, segundo tipo y tercer tipo. En una realización, la combinación es capaz de inhibir la proliferación de las bacterias patogénicas presentes a una concentración por lo menos diez veces la concentración de la combinación del primer tipo, segundo tipo y tercer tipo. En una realización, la bacteria patogénica se selecciona del grupo que consiste enYersinia, Vibrio, Treponema, Streptococcus, Staphylococcus, Shigella, Salmonella, Rickettsia, Orientia, Pseudomonas, Providencia, Proteus, Propionibacterium, Neisseria, Mycoplasma, Mycobacterium, Morganella, Listeria, Leptospira, Legionella, Klebsiella, Helicobacter, Haemophilus, Fusobacterium, Francisella, Escherichia, Ehrlichia, Enterococcus, Coxiella, Corynebacterium, Clostridium, Chlamydia, Chlamydophila, Campylobacter, Burkholderia, Brucella, Borrelia, Bordetella, Bifidobacterium, Bacillus,bacterias multirresistentes,Enterobacteriaceaeresistentes a carbapenémicos (CRE), enterococos resistentes a beta-lactámicos de espectro extendido (ESBL) y enterococos resistentes a vancomicina (VRE). En una realización, el primer tipo, el segundo tipo y un tercer tipo opcional interactúan sinérgicamente para ser citotóxicos para la bacteria patogénica. En una realización, el primer tipo, el segundo tipo y un tercer tipo interactúan sinérgicamente para ser citotóxicos para la bacteria patogénica.

Se proporciona, además, una composición de la invención para la utilización en un método de colonizar funcionalmente el tracto gastrointestinal de un sujeto humano, en donde el método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la composición bacteriana bajo condiciones tales que el primer tipo, segundo tipo y tercer tipo de bacterias colonicen funcionalmente el tracto gastrointestinal del sujeto humano. En una realización, la composición bacteriana se administra por vía oral, por vía rectal o mediante una combinación de administración por vía oral y rectal. En una realización, la composición bacteriana se administra tópicamente o por vía nasal o se inhala. En una realización, la composición bacteriana consiste esencialmente en esporas, en donde las esporas comprenden esporas del primer tipo de bacterias aisladas, esporas del segundo tipo de bacterias aisladas y esporas del tercer tipo de bacterias aisladas. En una realización, la colonización funcional del tracto gastrointestinal comprende prevenir una disbiosis del tracto gastrointestinal. En una realización, la colonización funcional del tracto gastrointestinal comprende tratar una disbiosis del tracto gastrointestinal. En una realización, la colonización funcional del tracto gastrointestinal comprende reducir la gravedad de una disbiosis del tracto gastrointestinal. En una realización, la colonización funcional del tracto gastrointestinal comprende reducir uno o más síntomas de una disbiosis del tracto gastrointestinal. En una realización, la colonización funcional del tracto gastrointestinal comprende prevenir la colonización del tracto gastrointestinal por una bacteria patogénica. En una realización, la colonización funcional del tracto gastrointestinal comprende reducir la colonización del tracto gastrointestinal y/o el crecimiento de una bacteria patogénica. En una realización, la colonización funcional del tracto gastrointestinal comprende reducir el número de uno o más tipos de bacterias patogénicas en el tracto gastrointestinal. En una realización, la colonización funcional del tracto gastrointestinal comprende incrementar el número de una o más bacterias no patogénicas en el tracto gastrointestinal. En una realización, la composición bacteriana comprende por lo menos aproximadamente 3, 5, 7 o 9 tipos de bacterias aisladas capaces de formar esporas. En una realización, una combinación del primer tipo, segundo tipo y tercer tipo es inhibitoria de la bacteria patogénica. En una realización, la combinación reduce la tasa de crecimiento de la bacteria patogénica. En una realización, la combinación es citostática o citotóxica para la bacteria patogénica. En una realización, la combinación es capaz de inhibir el crecimiento de las bacterias patogénicas presentes a una concentración por lo menos igual a la concentración de la combinación del primer tipo, segundo tipo y tercer tipo. En una realización, la combinación es capaz de inhibir el crecimiento de las bacterias patogénicas presentes a una concentración por lo menos doble de la concentración de la combinación del primer tipo, segundo tipo y tercer tipo. En una realización, la combinación es capaz de inhibir la proliferación de las bacterias patogénicas presentes a una concentración por lo menos diez veces la concentración de la combinación del primer tipo, segundo tipo y tercer tipo. En una realización, la bacteria patogénica se selecciona del grupo que consiste enYersinia, Vibrio, Treponema, Streptococcus, Staphylococcus, Shigella, Salmonella, Rickettsia, Orientia, Pseudomonas, Providencia, Proteus, Propionibacterium, Neisseria, Mycoplasma, Mycobacterium, Morganella, Listeria, Leptospira, Legionella, Klebsiella, Helicobacter, Haemophilus, Fusobacterium, Francisella, Escherichia, Ehrlichia, Enterococcus, Coxiella, Corynebacterium, Clostridium, Chlamydia, Chlamydophila, Campylobacter, Burkholderia, Brucella, Borrelia, Bordetella, Bifidobacterium, Bacillus,bacterias multirresistentes,Enterobacteriaceaeresistentes a carbapenémicos (CRE), enterococos resistentes a beta-lactámicos de espectro extendido (ESBL) y enterococos resistentes a vancomicina (VRE). En una realización, el primer tipo, el segundo tipo y el tercer tipo interactúan sinérgicamente para reducir o inhibir el crecimiento de la bacteria patogénica. En una realización, el primer tipo, el segundo tipo y el tercer tipo interactúan sinérgicamente para reducir o inhibir la colonización de la bacteria patogénica. En una realización, el método comprende administrar al sujeto humano una unidad de dosis única que comprende por lo menos 1×10<4>, 1×10<5>, 1×10<6>, 1×10<7>, 1×10<8>, 1×10<9>, 1×10<10>, 1×10<11>o más de 1×10<11>unidades formadoras de colonias (UFC) de bacterias viables. En una realización, la unidad de dosis comprende una población bacteriana sustancialmente en forma de esporas. En una realización, la unidad de dosis comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o un recubrimiento entérico. En una realización, la dosis unitaria se formula para administración oral, la administración rectal, o una combinación de administración oral y rectal. En una realización, la dosis unitaria se formula para administración tópica o nasal o para inhalación.

Una composición de la invención puede utilizarse, además, en un método para reducir el número de bacterias patogénicas presentes en el tracto gastrointestinal de un sujeto humano, en donde el método comprende la administración al sujeto de una cantidad eficaz de una formulación farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de la composición, y que comprende, además, una cantidad eficaz de un agente antimicrobiano, bajo condiciones tales que el número de bacterias patogénicas presentes en el tracto gastrointestinal del sujeto humano se reduce menos de aproximadamente un mes después de la administración de la formulación farmacéutica. En una realización, el número de bacterias patogénicas presentes en el tracto gastrointestinal del sujeto humano se reduce menos de aproximadamente dos semanas después de la administración de la formulación farmacéutica. En una realización, el número de bacterias patogénicas presentes en el tracto gastrointestinal del sujeto humano se reduce menos de aproximadamente una semana después de la administración de la formulación farmacéutica. En una realización, el número de bacterias patogénicas presentes en el tracto gastrointestinal del sujeto humano se reduce menos de aproximadamente tres semanas después de la administración de la formulación farmacéutica. En una realización, el número de bacterias patogénicas presentes en el tracto gastrointestinal del sujeto humano se reduce menos de aproximadamente un día después de la administración de la formulación farmacéutica. En una realización, el agente antimicrobiano comprende un agente antibacteriano. En una realización, el agente antimicrobiano comprende un agente antifúngico. En una realización, el agente antimicrobiano comprende un agente antivírico. En una realización, el agente antimicrobiano comprende un agente antiparasitario.

Se proporciona, además, una composición de la invención para la utilización en un método de reducción de la abundancia de un patógeno en el tracto gastrointestinal de un sujeto, en donde el método comprende administrar la composición en una cantidad terapéuticamente eficaz y permitir que la composición bacteriana compita con el patógeno en el tracto gastrointestinal de un sujeto.

Las composiciones de la invención pueden utilizarse, además, para tratar la diarrea, de manera que la administración de la composición bacteriana reduce el efecto diarreico de un patógeno en el tracto gastrointestinal de un sujeto. En una realización, el patógeno esYersinia, Vibrio, Treponema, Streptococcus, Staphylococcus, Shigella, Salmonella, Rickettsia, Orientia, Pseudomonas, Providencia, Proteus, Propionibacterium, Neisseria, Mycoplasma, Mycobacterium, Morganella, Listeria, Leptospira, Legionella, Klebsiella, Helicobacter, Haemophilus, Fusobacterium, Francisella, Escherichia, Ehrlichia, Enterococcus, Coxiella, Corynebacterium, Clostridium, Chlamydia, Chlamydophila, Campylobacter, Burkholderia, Brucella, Borrelia, Bordetella, Bifidobacterium, Bacillus,bacterias multirresistentes,Enterobacteriaceaeresistentes a carbapenémicos (CRE), enterococos resistentes a beta-lactámicos de espectro extendido (ESBL) y enterococos resistentes a vancomicina (VRE). En una realización, el patógeno esClostridium difficile, Salmonellaspp., patógenoEscherichia coli,oEnterococcusspp. resistentes a vancomicina. En una realización, el patógeno esClostridium difficile.En una realización, la composición se administra por vía oral.

Se expondrán objetos y ventajas adicionales en parte de la descripción siguiente, y en parte resultarán evidentes a partir de la descripción, o se podrán conocer mediante la práctica de las realizaciones. Los objetos y ventajas se realizarán y alcanzarán mediante los elementos y combinaciones especialmente señalados en las reivindicaciones adjuntas.

Se entiende que tanto la descripción general anteriormente proporcionada como la descripción detallada siguiente se proporcionan a título de ejemplo y de ejemplo únicamente y que no son limitativas de las reivindicaciones. Se apreciará que la presente exposición incluye, y proporciona contexto para, la invención tal como se expone en las reivindicaciones adjuntas.

Los dibujos adjuntos, que están incorporados y constituyen una parte de la presente especificación, ilustran varias realizaciones y junto con la descripción, sirven para explicar adicionalmente las realizaciones.

Breve descripción de las tablas

La Tabla 1 es una lista de unidades taxonómicas operativas (UTO) con asignaciones taxonómicas realizadas a género, especie y clado filogenético. La asignación de las UTO bacterianas a un clado se basa en datos de secuencia 16S. Los clados se definen basándose en la topología de un árbol filogenético que se construye a partir de secuencias 16S de longitud completa utilizando métodos de máxima verosimilitud, conocidos por el experto habitual en la materia de la filogenética. Las clados se construyen para garantizar que todas las UTO en un clado dado están: (i) separadas por un número especificado de nodos respaldados porbootstrap, y (ii) con una similitud génica inferior a 5 %. Las UTO que están dentro del mismo clado pueden distinguirse como genética y filogenéticamente distintos de las UTO en un clado diferente, basándose en datos de secuencia 16S-V4, mientras que las UTO dentro del mismo clado están estrechamente relacionadas. Las UTO comprendidas dentro del mismo clado están evolutivamente relacionadas y pueden o no ser distinguibles entre sí utilizando datos de secuencia 16S-V4. Los miembros del mismo clado, debido a su grado de relación evolutiva, desempeñan funciones similares en la ecología microbiana como la que se encuentra en el intestino humano. Las composiciones que sustituyen una especie por otra del mismo clado probablemente presenten una función ecológica conservada y, por lo tanto, resultan útiles de acuerdo con la presente exposición. Todos las UTO se denominan según su capacidad putativa para formar esporas y de acuerdo a si son un patógeno o un patobionte (ver el apartado de definiciones para la descripción de "patobionte"). Los patógenos prioritarios del NIAID (Instituto nacional de alergias y enfermedades infecciosas) se denotan como "Categoría-A", "Categoría-B" o "Categoría-C", y los patógenos oportunistas se denotan como '"PO". Las UTO que no son patogénicas o cuya capacidad de existir como patógeno es desconocida se denotan como "N". El "número SEQ ID" denota el identificador de la UTO en el archivo de listado de secuencias y "Acceso a BD pública" denota el identificador de la UTO en un repositorio público de secuencias.

La Tabla 2 proporciona clados filogenéticos y sus miembros determinados mediante secuenciación de longitud completa de 16S y V4.

La Tabla 3 es una lista de enfermedades, trastornos y afecciones humanas para las que las composiciones bacterianas proporcionadas resultan útiles.

Tabla 4a. Proporciona combinaciones representativas de la presente exposición sometidas a ensayoin vitro.Tabla 4b. Proporciona combinaciones representativas de la presente exposición sometidas a ensayoin vitro.La Tabla 5 proporciona datos de los ensayos de combinaciones de UTO ternarias representativas de la presente exposición en un ensayo CivSim ein vivo.

La Tabla 6 proporciona datos sobre la capacidad de una composición bacteriana de 15 miembros para inhibir la VREin vitro.

La Tabla 7 proporciona datos sobre la capacidad de una composición bacteriana de 15 miembros para inhibirK. pneumoniae in vitro.

La Tabla 8 proporciona datos sobre la capacidad de una composición bacteriana de 15 miembros para inhibirM. morganii in vitro.

La Tabla 9 proporciona datos que demuestran la eficacia de las combinaciones de la presente exposición contra la infección porC. difficileen un modelo murino preventivo.

Tabla 10. Proporciona combinaciones de ejemplo de la presente exposición que fueron sometidas a ensayo contra la infección porC. difficileen un modelo murino preventivo.

Tabla 11. Proporciona UTO bacterianas asociadas a una composición bacteriana utilizada para tratar a pacientes con enfermedad diarreica asociada aC. difficile, y UTO sometidas a injerto y potenciación ecológica para establecer una ecología microbiana más diversa en el paciente después del tratamiento. Las UTO que comprenden una ecología potenciada no están presentes en el paciente antes del tratamiento y/o se encuentran a frecuencias extremadamente bajas de modo que no constituyen una fracción significativa de la carga microbiana total y no son detectables mediante métodos de ensayo genómico y/o microbiológico. Las UTO que son miembros de las ecologías de injerto y potenciadas se identificaron mediante caracterización de las UTO que se incrementan en su abundancia relativa después del tratamiento y que respectivamente están: (i) presentes en la preparación de esporas tratadas con etanol y ausentes en el pretratamiento del paciente, o (ii) ausentes en la preparación de esporas tratadas con etanol, pero que se incrementan en su abundancia relativa con el tiempo después del tratamiento con la preparación debido al establecimiento de condiciones de crecimiento favorables mediante el tratamiento. Cabe destacar que las UTO potenciadoras puede crecer a partir de reservorios de baja frecuencia en el sujeto, o introducirse a partir de fuentes exógenas, tales como la dieta. Se denotan las UTO que forman una composición "nuclear" en la composición bacteriana de tratamiento.

La Tabla 12 proporciona composiciones bacterianas que mostraron efectos inhibitorios deC. difficilemedidos por un logaritmo medio de inhibición mayor que el intervalo de confianza (I.C.) al 99 % de la hipótesis nula (ver el Ejemplo 6, +++) y que se identifican en por lo menos un tratamiento de ecología de esporas o en un microbioma de un sujeto humano después del tratamiento con una composición.

La Tabla 13 proporciona ejemplos de composiciones bacterianas 4-meras a 10-meras comprendidas en una terapia bacteriana administrada a sujetos con enfermedad diarreica asociada aC. difficile.

La Tabla 14 proporciona ejemplos de UTO ternarias que se injertaron o potenciaron en por lo menos un paciente (de 29 que respondieron al tratamiento) después del tratamiento con una composición de ecología de esporas. Cada combinación ternaria estaba presente en todas las dosis o los organismos de la combinación ternaria estaban presentes juntos en todos los sujetos en algún momento posterior al tratamiento.

La Tabla 15 proporciona UTO de ejemplo que se injertaron en por lo menos un sujeto. Las combinaciones ternarias se encontraron en el 95 % de las dosis de composiciones de ecología de esporas administradas.

La Tabla 16 proporciona ejemplos de UTO potenciadoras en por lo menos un paciente después del tratamiento con una composición de ecología de esporas. Las combinaciones ternarias se encontraron juntas en por lo menos el 75 % de los sujetos en algún momento posterior al tratamiento.

La Tabla 17 proporciona combinaciones de UTO de ejemplo que estaban presentes en por lo menos el 75 % de las dosis de las composiciones de ecología de esporas administradas. Todas las dosis administradas que contenían las combinaciones ternarias enumeradas presentaban la UTOClostridialessp. SM4/1 como potenciadora o injerto en los sujetos que recibieron dosis que contenían la composición ternaria.

La Tabla 18 proporciona combinaciones ternarias de UTO de ejemplo que estaban presentes en por lo menos el 75 % de las dosis de las composiciones de ecología de esporas administradas. Todas las dosis administradas que contenían las combinaciones ternarias enumeradas presentaban la UTOClostridialessp. SM4/2 como potenciadora o injerto en los sujetos que recibieron una composición que contenía la composición ternaria. La Tabla 19 proporciona combinaciones ternarias de UTO de ejemplo que estaban presentes en por lo menos el 75 % de las dosis de las composiciones de ecología de esporas administradas. Todas las dosis administradas que contenían las combinaciones ternarias enumeradas presentaban la UTOClostridiumsp. NML 04A032 como potenciadora o injerto en los sujetos que recibieron una composición que contenía la composición ternaria. La Tabla 20 proporciona combinaciones ternarias de UTO de ejemplo que estaban presentes en por lo menos el 75 % de las dosis de las composiciones de ecología de esporas administradas. Todas las dosis administradas que contenían las combinaciones ternarias enumeradas presentaban las UTOClostridiumsp. NML 04A032,Ruminococcus lactarisyRuminococcus torquescomo potenciadora o injerto en los sujetos que recibieron una composición que contenía la combinación ternaria.

La Tabla 21 proporciona combinaciones ternarias de ejemplo de UTO que estaban presentes en por lo menos el 75 %de las dosis de las composiciones de ecología de esporas administradas. Todas las dosis administradas que contenían las combinaciones ternarias enumeradas presentaban las UTOEubacterium rectale, Faecalibacteriumprausnitzii, Oscillibacter sp. G2, Ruminococcus lactaris,yRuminococcus torquescomo potenciadoras o injertos en los sujetos que recibieron una composición que contenía la combinación ternaria.

La Tabla 22 proporciona nombres alternativos de organismos encontrados en las UTO del presente exposición.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 muestra un árbol filogenético de ejemplo y la relación entre las UTO y los clados A, B, C, D y E representan UTO, también conocidas como "hojas" en el árbol. El clado 1 comprende las UTO A y B, el clado 2 comprende las UTO C, D y E, y el clado 3 es un subconjunto del clado 2 que comprende las UTO D y E. Los nodos en un árbol que definen clados en el árbol pueden tener o no respaldo estadístico. Las UTO dentro de un clado son más similares entre sí que a las UTO en otro clado; la robustez de la asignación del clado se denota por el grado de respaldo estadístico para un nodo más arriba de las UTO en el clado.

La figura 2 proporciona un esquema del gen del ADNr 16S y denota las coordenadas de las regiones hipervariables 1 a 9 (V1 a V9), de acuerdo con un caso de la exposición. Las coordenadas de V1 a V9 son 69-99, 137-242, 433-497, 576-682, 822-879, 986-1043, 1117-1173, 1243-1294 y 1435-1465 respectivamente, basadas en la numeración con el sistema de nomenclatura deE. colidefinido en Brosius et al., Complete nucleotide sequence of a 16S ribosomal RNA gene (16S ARNr) fromEscherichia coli, PNAS 75(10):4801-4805 (1978).

La figura 3 resalta en negrita las secuencias nucleotídicas para cada región hipervariable en la secuencia 16S de referencia de ejemplo deE. colidescrita por Brosius et al.,supra.

La figura 4 proporciona combinaciones representativas de la presente exposición sometidas a ensayoin vitroy su respectiva inhibición del crecimiento de patógenos.

La figura 5 muestra un modeloin vivode prevención en hámsteres de recaídas porClostridium difficilepara validar la eficacia de la composición bacteriana basada en ecología de redes, según un caso de la exposición.

La figura 6 muestra el incremento de la diversidad microbiana total (medida utilizando el índice de diversidad Chao-1) en el intestino de sujetos humanos con enfermedad asociada aClostridium difficileantes y después del tratamiento con una ecología de esporas microbianas.

La figura 7 muestra el cambio composicional en el microbioma (medido utilizando el métrico PCoA de Bray-Curtis) en el intestino de sujetos humanos con enfermedad asociada aClostridium difficilerecurrente antes y después del tratamiento con una ecología de esporas microbianas.

Definiciones

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "antioxidante" se refiere, aunque sin limitación, a una o más de diversas sustancias tales como el beta-caroteno (un precursor de la vitamina A), la vitamina C, la vitamina E y el selenio que inhiben la oxidación o reacciones promovidas por especies de oxígeno reactivo (EOR) y otras especies de radicales y no radicales. Además, los antioxidantes son moléculas capaces de ralentizar o bloquear la oxidación de otras moléculas. Entre los ejemplos no limitativos de antioxidantes se incluyen astaxantina, carotenoides, coenzima Q10 ("CoQ10"), flavonoides, glutatión, Goji (bayas de Goji), hesperidina, lactobaya de Goji, lignano, luteína, licopeno, polifenoles, selenio, vitamina A, vitamina C, vitamina E, zeaxantina, o combinaciones de los mismos.

Una "ecología de redes troncal" o simplemente "red troncal" o "troncal" son composiciones de microorganismos que forman una composición fundamental que puede ser ampliada o reducida para optimizar una ecología de redes o ecología de redes funcional para presentar características biológicas específicas o para comprender propiedades funcionales deseadas, respectivamente. Los terapéuticos de microbioma pueden estar comprendidos en su totalidad por estas "ecologías de redes troncales", o las "redes troncales" pueden ser modificadas mediante la adición o sustracción de "grupos R" para otorgar a la ecología de redes las características y propiedades deseadas. Los "grupos R" tal como se utilizan en la presente memoria, pueden definirse en múltiples términos, que incluyen, aunque sin limitación: UTO individuales, UTO individuales o múltiples derivadas de un clado filogenético específico o de un fenotipo deseado, tal como la capacidad de formar esporas, o composiciones bacterianas funcionales que comprenden esporas. Las "redes troncales" pueden comprender una ecología de redes derivada computacionalmente en su totalidad o pueden ser subconjuntos de la red computada que representan nodos clave en la red que contribuyen a la eficacia, tales como, aunque sin limitación, una composición de UTO clave. El número de organismos en el tracto gastrointestinal humano, así como la diversidad entre individuos sanos, es indicativo de la redundancia funcional de una ecología de microbioma de un intestino saludable.VerThe Human Microbiome Consortia.2012 Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature 486: 207-214. Esta redundancia hace que sea muy probable que subconjuntos no evidentes de UTO o rutas funcionales (es decir, "redes troncales") sean cruciales para mantener estados de salud y/o catalizar un cambio de un estado disbiótico a uno saludable. Una forma de explotar esta redundancia es mediante la sustitución de las UTO que comparten un clado dado (ver posteriormente) o de añadir miembros de un clado que no se encuentra en la red troncal.

La expresión "composición bacteriana" se refiere a un consorcio de microorganismos que comprende dos o más UTO. Las ecologías de redes troncales, ecologías de red funcional, clases de redes y ecologías troncales son todos tipos de composiciones bacterianas. Una "composición bacteriana" también puede referirse a una composición de enzimas que se derivan de un microorganismo o múltiples microorganismos. Tal como se utiliza en la presente memoria, la composición bacteriana incluye una composición microbiana terapéutica, una composición microbiana profiláctica, una población de esporas, una población de esporas purificada o una población de esporas tratada con etanol.

El término "clado" se refiere a las UTO o miembros de un árbol filogenético que están después de un nodo estadísticamente válido en un árbol filogenético (figura 1). El clado comprende un conjunto de hojas terminales en el árbol filogenético (es decir, las puntas del árbol) que son una unidad evolutiva monofilogenética distinta y que comparten cierto grado de similitud de secuencia. Los clados son jerárquicos. En una realización, el nodo en un árbol filogenético que se selecciona para definir un clado depende del nivel de resolución adecuado para los datos subyacentes utilizados para calcular la topología del árbol. Las clados de ejemplo se definen en las Tablas 1 y 2. Tal como se utiliza en la presente memoria, la asignación de las UTO bacterianas a un clado se basa en datos de la secuencia 16S. Los clados se definen basándose en la topología de un árbol filogenético que se construye a partir de secuencias 16S de longitud completa utilizando métodos de máxima verosimilitud, conocidos por el experto habitual en la materia de la filogenética. Los clados se construyen para asegurar que todos las UTO en una clado dada están (i) separados por un número específico de nodos respaldados porbootstrap, y (ii) con una identidad génica inferior a 5 %. Las UTO que están dentro del mismo clado pueden distinguirse como genética y filogenéticamente distintos de las UTO en un clado diferente, basándose en datos de secuencia 16S-V4, mientras que las UTO dentro del mismo clado están estrechamente relacionadas. Las UTO comprendidas dentro del mismo clado están evolutivamente relacionadas y pueden o no ser distinguibles entre sí utilizando datos de secuencia 16S-V4. Los miembros del mismo clado, debido a su grado de relación evolutiva, desempeñan funciones similares en la ecología microbiana, tal como la que se observa en el intestino humano. En algunos casos, una UTO de un clado puede ser sustituida en una composición por una UTO diferente del mismo clado.

La "colonización" de un organismo huésped incluye la residencia no transitoria de una bacteria u otro organismo microscópico. Tal como se utiliza en la presente memoria, "reducir la colonización" del tracto gastrointestinal de un sujeto huésped (o cualquier otro nicho microorganismol) por una bacteria patogénica o no patogénica incluye una reducción en el tiempo de residencia de la bacteria en el tracto gastrointestinal, así como una reducción del número (o concentración) de la bacteria en el tracto gastrointestinal o adherida a la superficie luminal del tracto gastrointestinal. La reducción de la colonización puede ser permanente u ocurrir durante un período transitorio de tiempo. Las reducciones de patógenos adherentes pueden demostrarse directamente, p. ej., determinando la carga patogénica en una muestra de biopsia, o las reducciones pueden medirse indirectamente, p. ej., mediante la medición de la carga patogénica en las heces de un huésped mamífero.

Una "combinación" de dos o más bacterias incluye la coexistencia física de las dos bacterias, ya sea en el mismo material o producto, o en productos físicamente conectados, así como la coadministración temporal o la colocalización de las dos bacterias.

La expresión "que consiste esencialmente en" tal como se utiliza en la presente memoria se ajusta a la definición proporcionada en el Manual de examen y procedimiento de patentes (MEPP, marzo de 2014). Las características básicas y novedosas dadas a conocer en la presente memoria incluyen la capacidad de catalizar cambios en la ecología del microbioma de un sujeto mamífero, por ejemplo, un ser humano, de un estado disbiótico a un estado más normativo, y de promover el injerto y la potenciación del componente del microbioma expuesto en la especificación, p. ej., ver las Tablas 14 a 21. Un estado más normativo puede incluir, en un ejemplo no limitativo, una disminución en un signo o síntoma de una enfermedad o trastorno asociado a una disbiosis.

La actividad "citotóxica" de la bacteria incluye la capacidad de matar una célula bacteriana, tal como una célula bacteriana patogénica. Una actividad o bacteria "citostática" incluye la capacidad de inhibir, parcial o totalmente, el crecimiento, metabolismo y/o proliferación de una célula bacteriana, tal como una célula bacteriana patogénica. La actividad citotóxica también puede aplicarse a otros tipos de células, tales como, aunque sin limitación, a células eucarióticas.

El término "dímero" se refiere a una combinación de bacterias que comprende dos UTO. Las descripciones "homodímero" y "heterodímero" se refieren a combinaciones en las que las dos UTO son iguales o diferentes, respectivamente.

El término "disbiosis" se refiere a un estado de la microbiota o microbioma del intestino u otra zona corporal, incluyendo las superficies mucosas o de la piel, en el que la diversidad y/o función normal de la red ecológica está alterada. Cualquier alteración de un estado preferente (p. ej., ideal) de la microbiota puede considerarse una disbiosis, incluso si tal disbiosis no resulta en una disminución detectable de la salud. Este estado de disbiosis puede resultar perjudicial para la salud, puede resultar perjudicial solo bajo determinadas condiciones, o puede impedir que un sujeto se vuelva más saludable. La disbiosis puede deberse a una disminución en la diversidad, el crecimiento excesivo de uno o más patógenos o patobiontes, organismos simbióticos capaces de causar enfermedad solo en presencia de determinadas condiciones genéticas y/o ambientales en el sujeto, o el cambio a una red ecológica que ya no proporciona una función beneficiosa para el huésped y, por lo tanto, ya no promueve la salud.

La expresión "nicho ecológico", o simplemente "nicho", se refiere al espacio ecológico que ocupa un organismo o grupo de organismos. El nicho describe cómo un organismo o población de organismos responde a la distribución de recursos, parámetros físicos (p. ej., espacio del tejido huésped) y competidores (p. ej., creciendo cuando los recursos son abundantes y cuando los depredadores, parásitos y patógenos son escasos) y cómo, a su vez, altera esos mismos factores (p. ej., limitando el acceso a los recursos por otros organismos, actuando como fuente de alimento para los depredadores y como consumidor de presas).

El término "germinante" es un material o composición o proceso fisicoquímico capaz de inducir el crecimiento vegetativo de una bacteria que se encuentra en forma de espora quiescente, o grupo de bacterias en forma de espora, ya sea directa o indirectamente en un organismo huésped y/oin vitro.

El término "inhibición" de un patógeno o no patógeno abarca la inhibición de cualquier función o actividad deseada de las composiciones bacterianas de la presente exposición. Se presentan en la presente memoria demostraciones de inhibición, tales como la disminución en el crecimiento de una bacteria patogénica o la reducción en el nivel de colonización de una bacteria patogénica, que son reconocidas por el experto habitual en la materia. La inhibición del "crecimiento" de una bacteria patogénica o no patogénica puede incluir la inhibición del aumento de tamaño de la bacteria patogénica o no patogénica y/o la inhibición de la proliferación (o multiplicación) de la bacteria patogénica o no patogénica. La inhibición de la colonización de una bacteria patogénica o no patogénica puede demostrarse mediante la medición de la cantidad o carga de un patógeno antes y después de un tratamiento. Una "inhibición" o el acto de "inhibir" incluye el cese total y la reducción parcial de una o más actividades de un patógeno, tales como el crecimiento, la proliferación, la colonización y la función. La inhibición de la función incluye, por ejemplo, la inhibición de la expresión de productos génicos patogénicos, tales como una toxina o pili invasivos inducidos por la composición bacteriana.

El término "aislado" comprende una bacteria u otra entidad o sustancia que ha sido (1) separada de por lo menos algunos de los componentes con los que estaba asociada cuando fue producida inicialmente (ya sea en la naturaleza o en un entorno experimental), y/o (2) producida, preparada, purificada y/o fabricada de modo artificial. Entre las bacterias aisladas se incluyen aquellas bacterias que se cultivan, incluso si tales cultivos no son monocultivos. Las bacterias aisladas pueden separarse de por lo menos aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 % o más de los otros componentes con los que estaban inicialmente asociadas. En algunas realizaciones, las bacterias aisladas son más de aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o más de 99 % puras. En algunas realizaciones, las bacterias aisladas se separan del 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más de los demás componentes con los que estaban inicialmente asociadas. En algunas realizaciones, las bacterias aisladas son más de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de 99 % puras. Tal como se utiliza en la presente memoria, una sustancia es "pura" si está sustancialmente libre de otros componentes. Los términos "purificar", "purificando" y "purificado" se refieren a una bacteria u otro material que ha sido separado de por lo menos algunos de los componentes con los que estaba asociado, ya sea cuando se produjo o generó inicialmente (p. ej., ya sea en la naturaleza o en un entorno experimental), o en cualquier momento después de su producción inicial. Una bacteria o una población bacteriana puede considerarse purificada si se aísla durante o después de su producción, tal como respecto a un material o ambiente que contiene la bacteria o la población bacteriana, o mediante el subcultivo, y una bacteria o población bacteriana purificada puede contener otros materiales en una proporción de hasta aproximadamente 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más de 90 % y seguir considerándose "aislada". En otras realizaciones, una bacteria o población bacteriana purificada puede contener otros materiales en una proporción de hasta 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 90 % y seguir considerándose "aislada". En algunas realizaciones, las bacterias y poblaciones bacterianas purificadas son más de aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o más de 99 % puras. En algunas realizaciones, las bacterias y poblaciones bacterianas purificadas son más de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de 99 % puras. En el caso de las composiciones bacterianas proporcionadas en la presente memoria, el tipo o tipos de bacterias presentes en la composición pueden purificarse de manera independiente respecto a una o más otras bacterias producidas y/o presentes en el material o ambiente que contiene el tipo bacteriano. Las composiciones bacterianas y los componentes bacterianos de las mismas se purifican generalmente respecto de productos residuales del hábitat.

La expresión "UTO clave" o "función clave" se refiere a una o más UTO o rutas funcionales (p. ej., rutas KEGG o COG) que son comunes a muchas ecologías de red o ecologías de red funcional y que pertenecen a redes que se encuentran en muchos sujetos (es decir, son ubicuas). Debido a la naturaleza ubicua de las UTO clave y sus rutas funcionales asociadas, son fundamentales para el funcionamiento de las ecologías de red en sujetos sanos y frecuentemente están ausentes o presentes a niveles reducidos en sujetos enfermos. Las UTO clave y sus funciones asociadas pueden existir en abundancia baja, moderada o alta en los sujetos. Las "UTO no clave" o "funciones no clave" se refieren a UTO o funciones que se observa en una ecología de red o en una ecología de redes funcional y que no es una UTO o función clave.

El término "microbiota" se refiere a la comunidad de microorganismos que ocurren (sosteniblemente o de manera transitoria) en y sobre un sujeto animal, habitualmente un mamífero tal como un ser humano, incluyendo eucariotas, arqueobacterias, bacterias y virus (incluidos los virus bacterianos, es decir, los fagos).

El término “microbioma” se refiere al contenido génico de las comunidades de microorganismos que viven en y sobre el cuerpo humano, tanto de manera sostenible como transitoria, incluyendo eucariotas, arqueobacterias, bacterias y virus (incluyendo virus bacterianos (es decir, fagos)), en donde el “contenido genético” incluye ADN genómico, ARN tal como el ARN ribosómico, el epigenoma, los plásmidos y todos los demás tipos de información génica.

La expresión "carga microbiana" o simplemente "carga" se refiere a la población de microorganismos que habitan en un nicho dentro o sobre los seres humanos. El transporte a menudo se define en términos de abundancia relativa. Por ejemplo, la UTO1 comprende el 60 % del total de la carga microbiana, lo que significa que la UTO1 presenta una abundancia relativa del 60 % respecto a las demás UTO en la muestra a partir de la que se ha realizado la medición. La carga se basa con mayor frecuencia en datos de secuenciación genómica, en los que la abundancia relativa o carga de una única UTO o grupo de UTO se define por el número de lecturas de secuenciación que se asignan a esas UTO respecto al número total de lecturas de secuenciación para la muestra. Alternativamente, la carga puede medirse utilizando ensayos microbiológicos.

La expresión "potenciación microbiana" o simplemente "potenciación" se refiere al establecimiento o incremento significativo de una población de microorganismos que (i) están ausentes o son indetectables (según lo determinado mediante el uso de técnicas genómicas y microbiológicas estándares) en la composición microbiana terapéutica administrada, (ii) están ausentes, son indetectables o están presentes a bajas frecuencias en el nicho del huésped (por ejemplo: tracto gastrointestinal, piel, narinas anteriores o vagina) antes de la administración de la composición microbiana, y (iii) se detectan después de la administración de la composición microbiana o se encuentran significativamente incrementadas, por ejemplo, en un factor de 2, 5, 1×10<2>, 1×10<3>, 1×10<4>, 1×10<5>, 1×10<6>, 1×10<7>, o superior a 1×10<8>, en casos en los que estaban presentes a bajas frecuencias. Los microorganismos que comprenden una ecología potenciada pueden derivarse de fuentes exógenas, tales como alimentos y el entorno, o crecer a partir de micronichos dentro del huésped en donde residen a baja frecuencia. La administración de una composición microbiana bacteriana induce un cambio ambiental en el nicho objetivo que promueve condiciones favorables para el crecimiento de estos microorganismos comensales. En ausencia de tratamiento con una composición bacteriana, el huésped puede estar constantemente expuesto a estos microorganismos; sin embargo, no se observa un crecimiento sostenido ni los efectos positivos sobre la salud asociados a la población estable de niveles incrementados de los microorganismos que componen la ecología potenciada.

La expresión "injerto microbiano" o simplemente "injerto" se refiere al establecimiento de UTO presentes en la composición bacteriana en un nicho objetivo que están ausentes en el huésped tratado antes del tratamiento. Los microorganismos que componen la ecología injertada se encuentran en la composición microbiana terapéutica y se establecen como constituyentes de la ecología microbiana del huésped tras el tratamiento. Las UTO injertadas pueden establecerse durante un período transitorio de tiempo, o mostrar estabilidad a largo plazo en la ecología microbiana que coloniza al huésped después del tratamiento con una composición bacteriana. La ecología injertada puede inducir un cambio ambiental en el nicho objetivo que promueve condiciones favorables para el crecimiento de microorganismos comensales capaces de catalizar un cambio desde una ecología disbiótica a una representativa de un estado saludable.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "minerales" se entiende que incluye boro, cromo, cobre, yodo, hierro, magnesio, manganeso, molibdeno, níquel, fósforo, potasio, selenio, silicio, estaño, vanadio, zinc, y combinaciones de los mismos.

La expresión "ecología de red" se refiere a un consorcio de clados o UTO que coexisten en un número determinado de sujetos. Tal como se utiliza en la presente memoria, una "red" se define matemáticamente por un grafo que delimita cómo se relacionan entre sí nodos específicos (es decir, clados o UTO) y aristas (conexiones entre clados o UTO específicas) para definir la ecología estructural de un consorcio de clados o UTO. Cualquier ecología de red dada poseerá una diversidad filogenética y propiedades funcionales inherentes. Una ecología de redes también puede definirse en términos de sus capacidades funcionales donde, por ejemplo, los nodos comprenderían elementos tales como, aunque sin limitación, enzimas, agrupaciones de grupos ortólogos (COGS; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21090/), o rutas de ortología de KEGG (www.genome.jp/kegg/); estas redes se denominan "ecología de red funcional". Las ecologías de red funcional se pueden reducir a la práctica al definir el grupo de UTO que juntas comprenden las funciones definidas por la ecología de red funcional.

La "clase de red" y la "ecología de clase de red" se refieren a un grupo de ecologías de red que, en general, se determinan computacionalmente para que comprendan ecologías con características filogenéticas y/o funcionales similares. Por lo tanto, una clase de red contiene características biológicas importantes, definidas ya sea filogenética o funcionalmente, de un grupo (es decir, una agrupación) de ecologías de red relacionadas. Una representación de una ecología de clase de red es un consorcio diseñado de microorganismos, normalmente bacterias no patogénicas, que representa características troncales de un conjunto de ecologías de red relacionadas filogenética o funcionalmente que se observan en muchos sujetos diferentes. En algunas ocasiones, una clase de red, aunque diseñada tal como se describe en la presente memoria, existe como una ecología de red observada en uno o más sujetos. Las ecologías de clase de red resultan útiles para revertir o reducir una disbiosis en sujetos en los que la ecología de red subyacente relacionada ha sido alterada.

Estar libre de "productos no comestibles" significa que una composición bacteriana u otro material proporcionado en la presente memoria no presenta una cantidad sustancial de un producto no comestible, p. ej., un producto o material que no es comestible, dañino o de otro modo indeseado en un producto adecuado para la administración, p. ej., la administración oral, a un sujeto humano. Los productos no comestibles se encuentran frecuentemente en preparaciones de bacterias de la técnica anterior.

Las "unidades taxonómicas operativas" y "UTO" (o en plural, "las UTO") se refieren a una hoja terminal en un árbol filogenético y se definen por una secuencia de ácido nucleico, p. ej., el genoma completo o una secuencia génica específica, y todas las secuencias que comparten identidad de secuencia con esta secuencia de ácido nucleico a nivel de especie. En algunas realizaciones, la secuencia genética específica puede ser la secuencia 16S o una parte de la secuencia 16S. En otras realizaciones, se secuencian y comparan los genomas completos de dos entidades. En otra realización, se pueden comparar génicamente regiones seleccionadas, tales como etiquetas de secuencia multilocus (MLST, por sus siglas en inglés), genes específicos o conjuntos de genes. En realizaciones de 16S, las UTO que comparten de media ≥97 % de identidad de nucleótidos en toda la región 16S o en alguna región variable de la 16S se consideran la misma UTO. Ver, p. ej.,,Claesson et al., 2010. Comparison of two next-generation sequencing technologies for resolving highly complex microbiota composition using tandem variable 16S ARNr gene regions. Nucleic Acids Res 38: e200. Konstantinidis et al., 2006. The bacterial species definition in the genomic era. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 361: 1929-1940. En las realizaciones que involucran el genoma completo, las MLST, genes específicos, aparte de 16S, o conjuntos de genes UTO que comparten ≥95 % de identidad nucleotídica media se consideran la misma UTO. Ver, p. ej., Achtman y Wagner. 2008. Microbial diversity and the genetic nature of microbial species. Nat. Rev. Microbiol.6: 431-440; Konstantinidis et al., 2006,supra.The bacterial species definition in the genomic era. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 361: 1929-1940. Las UTO se pueden definir mediante la comparación de secuencias entre organismos. Generalmente, las secuencias con menos del 95 % de identidad de secuencia no se consideran parte de la misma UTO. Las UTO también pueden caracterizarse por cualquier combinación de marcadores nucleotídicos o genes, en particular genes altamente conservados (p. ej., genes "de mantenimiento"), o una combinación de los mismos. Dicha caracterización utiliza, p. ej., datos de WGS o una secuencia de genoma completo. Tal como se utiliza en la presente memoria, un "tipo" de bacteria se refiere a una UTO que puede estar a nivel de una cepa, especie, clado o familia.

La Tabla 1, posteriormente, muestra una lista de unidades taxonómicas operativas (UTO) con asignaciones taxonómicas realizadas a nivel de género, especie y clado filogenético. La asignación de las UTO bacterianas a un clado se basa en datos de secuencia 16S. Los clados se definen basándose en la topología de un árbol filogenético que se construye a partir de secuencias 16S de longitud completa utilizando métodos de máxima verosimilitud, conocidos por el experto habitual en la materia de la filogenética. Las clados se construyen para garantizar que todas las UTO en un clado dado están: (i) separadas por un número especificado de nodos respaldados porbootstrap, y (ii) con una similitud genética inferior a 5 %. Las UTO que están dentro del mismo clado pueden distinguirse como genética y filogenéticamente distintos de las UTO en un clado diferente, basándose en datos de secuencia 16S-V4, mientras que las UTO dentro del mismo clado están estrechamente relacionadas. Las UTO comprendidas dentro del mismo clado están evolutivamente relacionadas y pueden o no ser distinguibles entre sí utilizando datos de secuencia 16S-V4. Los miembros del mismo clado, debido a su grado de relación evolutiva, desempeñan funciones similares en la ecología microbiana como la que se encuentra en el intestino humano. Las composiciones que sustituyen una especie por otra del mismo clado probablemente presenten una función ecológica conservada y, por lo tanto, resulten útiles de acuerdo con la presente exposición. Todas las UTO se denominan según su capacidad putativa para formar esporas y de acuerdo a si son un patógeno o un patobionte (ver el apartado de definiciones para la descripción de "patobionte"). Los patógenos prioritarios de NIAID se denominan "categoría-A", "categoría-B" o "categoría-C", y los patógenos oportunistas se denominan "PO". Las UTO que no son patogénicas o cuya capacidad de existir como patógeno es desconocida se denotan como "N". El "número SEQ ID" denota el identificador de la UTO en el archivo de listado de secuencias y "Acceso a BD pública" denota el identificador de la UTO en un repositorio público de secuencias.

Los términos "patobiontes" o "patógenos oportunistas" se refiere a especies bacterianas específicas que se encuentran en huéspedes sanos que pueden inducir una patología y/o enfermedad mediada por el sistema inmunitario en respuesta a determinados factores genéticos o ambientales (Chow et al., 2011. Curr. Op. Immunol. Pathobionts of the intestinal microbiota and inflammatory disease.23: 473-80). Un patobionte es un microorganismo oportunista que es mecanísticamente distinto de un organismo infeccioso adquirido. El término "patógeno" tal como se utiliza en la presente memoria incluye tanto organismos infecciosos adquiridos como patobiontes.

Los términos “patógeno”, “patobionte” y “patogénico” se refieren a una bacteria o cualquier otro organismo o entidad que incluye cualquier organismo o entidad que es capaz de causar, o presentar un efecto sobre, una enfermedad, trastorno o afección de un organismo huésped que contiene el organismo o entidad, incluyendo, aunque sin limitación, prediabetes, diabetes tipo 1 o diabetes tipo 2.

El término “fenotipo” se refiere a un conjunto de características observables de una entidad individual. A título de ejemplo, un sujeto individual puede presentar un fenotipo de "salud" o "enfermedad". Los fenotipos describen el estado de una entidad y todas las entidades dentro de un fenotipo comparten el mismo conjunto de características que describen el fenotipo. El fenotipo de un individuo resulta en parte, o en su totalidad, de la interacción del genoma y/o microbioma de la entidad con el medio ambiente, incluyendo especialmente la dieta.

La "diversidad filogenética" es una característica biológica que se refiere a la biodiversidad presente en una recología de red o ecología de clase de red dada, basada en las UTO que comprende la red. La expresión "diversidad filogenética" es una expresión relativa, lo que significa que una ecología de red o clase de red que sea comparativamente más diversa filogenéticamente que otra red contendrá un mayor número de especies, géneros y familias taxonómicas únicos. La singularidad de una especie, género o familia taxonómica se define generalmente utilizando un árbol filogenético que representa la diversidad genética de todas las especies, géneros o familias taxonómicas unos respecto a otros. La diversidad filogenética también se puede medir utilizando la longitud total de las ramas o la longitud media de las ramas de un árbol filogenético. La diversidad filogenética puede optimizarse en una composición bacteriana mediante la inclusión de una amplia gama de biodiversidad.

El "árbol filogenético" se refiere a una representación gráfica de las relaciones evolutivas de una secuencia genética con otra que se genera utilizando un conjunto definido de algoritmos de reconstrucción filogenética (p. ej., parsimonia, máxima verosimilitud o bayesiano). Los nodos en el árbol representan secuencias ancestrales distintas y la confianza de cualquier nodo se proporciona mediante unbootstrapo probabilidad posterior bayesiana, que mide la incertidumbre de una rama.

El término "prediabetes" se refiere a una afección en la que los niveles de glucosa en sangre son más altos de lo normal, pero no lo suficientemente altos como para ser clasificados como diabetes. Las personas con prediabetes presentan un mayor riesgo de desarrollar diabetes tipo 2 en menos de diez años. Según la CDC, la prediabetes se puede diagnosticar a partir de niveles de glucosa en ayunas de entre 100 y 125 mg/dl, glucosa plasmática dos horas después de la carga de glucosa en la prueba de tolerancia a la glucosa oral (PTGO) de entre 140 y 199 mg/dl, o una prueba de hemoglobina A1c de entre 5,7 % y 6,4 %.

Los términos "ADNr", "ARNr", "ADNr 16S", "ARNr 16S", "16S", "secuenciación de 16S", "NGS-16S," "18S," "ARNr-18S", "ADNr-18S", "secuenciación de 18S" y "NGS-18S" se refieren a los ácidos nucleicos que codifican las subunidades de ARN del ribosoma. El ADNr se refiere al gen que codifica el ARNr que compone las subunidades de ARN. Hay dos subunidades de ARN en el ribosoma, denominadas subunidad pequeña (SUP) y subunidad grande (SUG); las secuencias genéticas de ARN (ARNr) de estas subunidades están relacionadas con el gen que las codifica (ADNr) a través del código genético. Los genes de ADNr y sus secuencias de ARN complementarias se utilizan ampliamente para determinar las relaciones evolutivas entre los organismos, ya que son variables, pero lo suficientemente conservadas como para permitir comparaciones moleculares entre organismos. Normalmente, se utiliza la secuencia de ADNr de 16S (de aproximadamente 1.542 nucleótidos de longitud) de la SUP 30S para asignaciones taxonómicas basadas en moléculas de procariotas y la secuencia de ADNr de 18S (aproximadamente 1.869 nucleótidos de longitud) de la SUP 40S se usa para eucariotas. Las secuencias de 16S se utilizan para la reconstrucción filogenética, ya que generalmente están altamente conservadas, pero contienen regiones hipervariables específicas que albergan suficiente diversidad de nucleótidos para diferenciar géneros y especies de la mayoría de las bacterias.

Los "productos de hábitat residuales" se refiere a materiales derivados del hábitat para la microbiota dentro o sobre un ser humano o animal. Por ejemplo, la microbiota vive en las heces en el tracto gastrointestinal, sobre la piel misma, en la saliva, en el moco del tracto respiratorio o en las secreciones del tracto genitourinario (es decir, materia biológica asociada a la comunidad microbiana). La expresión "sustancialmente libre de productos residuales del hábitat" se refiere a que la composición bacteriana ya no contiene la materia biológica asociada al entorno microbiano sobre o en el sujeto humano o animal y que está 100 % libre, 99 % libre, 98 % libre, 97 % libre, 96 % libre o 95 % libre de cualquier materia biológica contaminante asociada a la comunidad microbiana. Los productos de hábitat residuales pueden incluir materiales abióticos (incluyendo alimentos no digeridos) o pueden incluir microorganismos no deseados. La expresión "libre de productos residuales del hábitat" también puede referirse a que la composición bacteriana no contiene células detectables de un ser humano o animal y que solo pueden detectarse células microbianas. En una realización, "sustancialmente libre de productos residuales del hábitat" también puede referirse a que la composición bacteriana no contiene virus detectables (incluidos virus bacterianos, es decir, fagos), contaminantes fúngicos o de micoplasmas. En otra realización, significa que menos de 1x10<-2>%, 1x10<-3>%, 1x10<-4>%, 1x10<-5>%, 1x10<-6>%, 1x10<-7>%, 1x10<-8>% de las células viables en la composición bacteriana son humanas o animales, respecto a las células microbianas. Existen múltiples formas de alcanzar este grado de pureza, ninguna de las cuales es limitativa. De esta manera, la contaminación puede reducirse mediante aislamiento de los constituyentes deseados a través de múltiples etapas de siembra de colonias individuales en medios sólidos hasta que las réplicas (tales como, aunque sin limitación, dos réplicas) de siembra de colonia individual en serie hayan mostrado la morfología de una sola colonia. Alternativamente, la reducción de la contaminación se puede conseguir mediante múltiples rondas de diluciones en serie hasta alcanzar células individuales deseadas (p. ej., una dilución de 10<-8>o 10<-9>), tal como a través de múltiples diluciones en serie de 10 veces. Lo anterior se puede confirmar adicionalmente mostrando que múltiples colonias aisladas presentan formas celulares y comportamiento de tinción Gram similares. Entre otros métodos para confirmar una pureza adecuada se incluyen el análisis genético (p. ej., PCR, secuenciación de ADN), serología y análisis de antígenos, análisis enzimático y metabólico, y métodos que utilizan instrumentación tales como la citometría de flujo con reactivos que distinguen los constituyentes deseados de los contaminantes.

El término "sinergia" se refiere a un efecto producido por una combinación, p. ej., de dos microorganismos (por ejemplo, microorganismos de dos especies diferentes o de dos clados diferentes) que es mayor que los efectos aditivos esperados de los componentes de la combinación. En determinadas realizaciones, la "sinergia" entre dos o más microorganismos puede resultar en la inhibición de la capacidad de un patógeno para crecer. Por ejemplo, las combinaciones ternarias inhiben sinérgicamenteC. difficilesi su logaritmo medio de inhibición es mayor que la suma de la inhibición logarítmica de los homotrímeros de cada bacteria constituyente dividida por tres, a fin de considerar la dosis tres veces mayor de cada cepa, o para combinaciones binarias, el logaritmo de inhibición de un homodímero de cada bacteria constituyente dividido por dos. En otro ejemplo, puede calcularse la sinergia mediante la definición de las composiciones de UTO que muestran una mayor inhibición que la representada por la suma del logaritmo de inhibición de cada bacteria sometida a ensayo por separado. En otras realizaciones, la sinergia puede definirse como una propiedad de las composiciones que muestran una inhibición mayor que la inhibición logarítmica máxima entre las de cada homodímero u homotrímero de bacteria constituyente medidos de forma independiente. Tal como se utiliza en la presente memoria, "sinergia" o "interacciones sinérgicas" se refiere a la interacción o cooperación de dos o más microorganismos para producir un efecto combinado mayor que la suma de sus efectos separados.

El término “espora” o una población de “esporas” incluye bacterias (u otros organismos unicelulares) que son generalmente viables, más resistentes a influencias ambientales tales como el calor y agentes bactericidas que las formas vegetativas de la misma bacteria, y que normalmente son capaces de germinar y crecer. Las esporas se caracterizan por la ausencia de metabolismo activo hasta que responden a señales ambientales específicas, lo que provoca su germinación. Los "formadores de esporas" o bacterias "capaces de formar esporas" son aquellas bacterias que contienen los genes y otras capacidades necesarias para producir esporas bajo las condiciones ambientales adecuadas.

La expresión "población de esporas" se refiere a una pluralidad de esporas presentes en una composición. Entre los términos y expresiones sinónimos utilizados en la presente memoria se incluyen "composición de esporas", "preparación de esporas", "fracción de esporas tratadas con etanol" y "ecología de esporas". Una población de esporas puede purificarse a partir de una donación fecal, p. ej., mediante tratamiento con etanol o calor, o una separación por gradiente de densidad o cualquier combinación de métodos descritos en la presente memoria para incrementar la pureza, potencia y/o concentración de esporas en una muestra. Alternativamente, puede obtenerse una población de esporas mediante métodos de cultivo partiendo de especies aisladas de formadores de esporas o unidades taxonómicas operativas (UTO) aisladas de formadores de esporas, o de una mezcla de tales especies, ya sea en forma vegetativa o en forma de esporas.

En una realización, la preparación de esporas comprende especies formadoras de esporas en donde las especies no formadoras de esporas residuales han sido inactivadas mediante tratamientos químicos o físicos, incluyendo etanol, detergente, calor, sonicación y similares; o en donde las especies no formadoras de esporas han sido eliminadas de la preparación de esporas mediante varias etapas de separación, incluyendo gradientes de densidad, centrifugación, filtración y/o cromatografía; o en donde se combinan métodos de inactivación y separación para llegar a la preparación de esporas. En todavía otra realización, la preparación de esporas comprende especies formadoras de esporas que se enriquecen respecto a formas no formadoras de esporas viables o respecto a formas vegetativas de formadores de esporas. En la presente realización, las esporas se enriquecen de 2 a 4 veces, de 5 a 10 veces, de 50 a 100 veces, de 1.000 a 10.000 veces o más de 10.000 veces respecto a todas las formas vegetativas de bacterias. En todavía otra realización, las esporas en la preparación de esporas sufren una germinación parcial durante el procesamiento y la formulación, de modo que la composición final comprende esporas y bacterias vegetativas derivadas de especies formadoras de esporas.

La expresión "agente de inducción de esporulación" es un material o proceso fisicoquímico que es capaz de inducir la esporulación en una bacteria, ya sea de manera directa o indirecta, en un organismo huésped y/oin vitro.

La expresión “incrementar la producción de esporas bacterianas” incluye una actividad o un agente de inducción de la esporulación. El término "producción" incluye la conversión de células bacterianas vegetativas en esporas y el incremento de la tasa de dicha conversión, así como la reducción de la germinación de bacterias en forma de espora, la reducción de la tasa de descomposición de esporasin vivo,oex vivo,o el incremento de la producción total de esporas (p. ej., a través de un aumento en la producción volumétrica de material fecal).

El término "sujeto" se refiere a cualquier sujeto animal, incluyendo seres humanos, animales de laboratorio (p. ej., primates no humanos, ratas y ratones), ganado (p. ej., vacas, ovejas, cabras y cerdos), aves de corral (pavos y pollos) y animales de compañía (p. ej., perros, gatos y roedores). El sujeto puede estar sufriendo una disbiosis, que contribuye o provoca una afección clasificada como diabetes o prediabetes, incluyendo, aunque sin limitación, mecanismos tales como endotoxemia metabólica, alteración del metabolismo de los ácidos biliares primarios, activación del sistema inmunitario o un desequilibrio o reducción en la producción de ácidos grasos de cadena corta, incluyendo butirato, propionato, acetato y ácidos grasos de cadena ramificada.

El término "trímero" se refiere a una combinación de bacterias que comprende tres UTO. Las descripciones "homotrímero" y "heterotrímero" se refieren a combinaciones en las que las tres UTO son iguales o diferentes, respectivamente. Un "semi-heterotrímero" se refiere a combinaciones en las que tres constituyentes son iguales y un tercero es diferente.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "vitamina" se entiende que incluye cualquiera de diversas sustancias orgánicas liposolubles o hidrosolubles (entre los ejemplos no limitativos se incluyen la vitamina A, la vitamina B1 (tiamina), la vitamina B2 (riboflavina), la vitamina B3 (niacina o niacinamida), la vitamina B5 (ácido pantoténico), la vitamina B6 (piridoxina, piridoxal o piridoxamina, o hidrocloruro de piridoxina), la vitamina B7 (biotina), la vitamina B9 (ácido fólico) y la vitamina B12 (diversas cobalaminas; habitualmente cianocobalamina en los suplementos vitamínicos), la vitamina C, la vitamina D, la vitamina E, la vitamina K, K1 y K2 (es decir, MK-4, MK-7), ácido fólico y biotina) esenciales en cantidades minúsculas para el crecimiento y actividad corporal normales, y que se obtienen de forma natural a partir de alimentos vegetales y animales o se fabrican sintéticamente, provitaminas, derivados y análogos.

Las "regiones V1 a V9" o las "regiones V1 a V9 de 16S" se refieren a las primeras a novenas regiones hipervariables del gen de ADNr 16S que se utilizan para el tipado génico de muestras bacterianas. Estas regiones en bacterias están definidas por los nucleótidos 69 a 99, 137 a 242, 433 a 497, 576 a 682, 822 a 879, 986 a 1043, 1117 a 1173, 1243 a 1294 y 1435 a 1465, respectivamente, utilizando una numeración basada en el sistema de nomenclatura deE.coli(Brosius et al., 1978. Complete nucleotide sequence of a 16S ribosomal RNA gene from Escherichia coli, PNAS USA 75(10):4801-4805). En algunas realizaciones, por lo menos una de las regiones V1, V2, V3, V4, V5, V6, V7, V8 y V9 se utiliza para caracterizar una UTO. En una realización, se utilizan las regiones V1, V2 y V3 para caracterizar una UTO. En una realización, se utilizan las regiones V3, V4 y V5 para caracterizar una UTO. En otra realización, se utiliza la región V4 para caracterizar una UTO. El experto habitual en la materia puede identificar las regiones hipervariables específicas de un ADNr 16S candidato mediante la comparación de la secuencia candidata en cuestión con una secuencia de referencia y la identificación de las regiones hipervariables basándose en la similitud con las regiones hipervariables de referencia; alternativamente, se puede utilizar la caracterización de secuencias de escopeta de genomas completos (WGS, por sus siglas en inglés) de microorganismos o de una comunidad microbiana.

Descripción detallada

Los solicitantes han encontrado combinaciones de bacterias que, cuando están presentes, están asociadas a la mejora del microbioma de un sujeto, p. ej., de un sujeto que presenta una disbiosis, tal como una disbiosis asociada aC. difficile.Además, se han identificado combinaciones de microorganismos que están asociadas al injerto y/o potenciación de organismos asociados a un microbioma saludable. Los solicitantes han identificado, además, combinaciones de microorganismos que pueden resultar útiles para tratar afecciones bacterianas resistentes a los antibióticos u otras patogénicas. En algunos casos, el contenido microbiano de esta composición comprende los organismos; en otros casos, el contenido microbiano de la composición consiste esencialmente en los organismos; y en otros casos, el contenido microbiano de la composición consiste en los organismos. En todos los casos, la composición puede incluir componentes no microbianos.

Emergencia de la resistencia a los antibióticos en bacterias

La resistencia a los antibióticos es un problema emergente de salud pública (Carlet et al., 2011. Society's failure to protect a precious resource: antibiotics. Lancet 378: 369-371). Numerosos géneros de bacterias albergan especies que están desarrollando resistencia a antibióticos. Entre ellos se incluyen, aunque sin limitación,Enterococcusresistente a la vancomicina (VRE) yKlebsiellaresistente a carbapenémicos (CRKp). Las cepas deKlebsiella pneumoniaeyEscherichia coliestán adquiriendo resistencia a los carbapenémicos y requieren el uso de antibióticos antiguos caracterizados por su alta toxicidad, tales como la colistina (Canton et al.2012. Rapid evolution and spread of carbapenemases among Enterobacteriaceae in Europe. Clin Microbiol Infect 18: 413-431). Se observan clínicamente cepas multirresistentes adicionales, incluyendoPseudomonas aeruginosa, Enterobacterspp. yAcinetobacterspp., incluidos aislados que son altamente resistentes a ceftazidima, carbapenémicos y quinolonas (Centro Europeo para la Prevención y Control de Enfermedades: banco de datos EARSS-net: http://ecdc.europa.eu. El Center for Disease Control and Prevention publicó en 2013 un "Informe de amenazas" (http://www.cdc.gov/drugresistance/threat-report-2013/) citando numerosas amenazas de infecciones bacterianas que incluíanClostridium difficile, Enterobacteriaceaeresistentes a carbapenémicos (CRE),Acinetobactermultirresistente,Campylobacterresistente a fármacos,Enterobacteriaceaeque producen β-lactamasa de espectro extendido (ESBL, por sus siglas en inglés),Enterococcusresistente a vancomicina (VRE),Pseudomonas aeruginosamultirresistente,Salmonellano tifoidea resistente a fármacos,Salmonella typhiresistente a fármacos,Shigellaresistente a fármacos,Staphylococcus aureusresistente a meticilina (MRSA, por sus siglas en inglés),Streptococcus pneumoniaeresistente a fármacos,Staphylococcus aureusresistente a vancomicina (VRSA, por sus siglas en inglés),Streptococcusdel grupo A resistente a eritromicina, yStreptococcusdel grupo B resistente a clindamicina. El creciente fracaso de los antibióticos debido al aumento de los microorganismos resistentes exige nuevos tratamientos para tratar las infecciones bacterianas. La administración de una composición bacteriana terapéutica del microbioma ofrece potencial para tales terapias.

Los solicitantes han encontrado que los sujetos que padecen diarrea asociada aC. difficile(DACD) recurrente a menudo albergan bacterias Gram-negativas resistentes a antibióticos, en particularEnterobacteriaceae, y que el tratamiento con una composición bacteriana trata eficazmente la DACD y reduce las bacterias Gram-negativas resistentes a antibióticos. El tracto gastrointestinal participa como un reservorio para muchos de estos organismos, incluyendo VRE, MRSA,Pseudomonas aeruginosa, Acinetobactery la levaduraCandida(Donskey, Clinical Infectious Diseases 200439:214,The Role of the Intestinal Tract as a Reservoir and Source for Transmission of Nosocomial Pathogens), y por lo tanto como fuente de infecciones nosocomiales. El tratamiento con antibióticos y otros procedimientos de descontaminación son algunas de las herramientas que se utilizan para reducir la colonización de estos organismos en sujetos susceptibles, incluyendo aquellos que están inmunosuprimidos. Los tratamientos basados en bacterias proporcionarían una nueva herramienta para la descolonización, con el beneficio clave de no promover la resistencia a antibióticos como sí lo hacen los tratamientos con antibióticos.

Composiciones bacterianas

Se dan a conocer bacterias y combinaciones de bacterias de la microbiota intestinal humana con la capacidad de proporcionar funciones significativas de una microbiota saludable o catalizar una potenciación del microbioma residente cuando se administran a huéspedes mamíferos. En particular, se dan a conocer combinaciones sinérgicas que tratan, previenen, retrasan o reducen los síntomas de enfermedades, trastornos y afecciones asociadas a una disbiosis. Las enfermedades, trastornos y afecciones representativas potencialmente asociadas a una disbiosis, que resultan adecuadas para el tratamiento con las composiciones y métodos descritos en la presente memoria, se proporcionan en la Tabla 3. Aunque sin limitarse a un mecanismo específico, se cree que dichas composiciones inhiben el crecimiento, la proliferación y/o la colonización de una o una pluralidad de bacterias patogénicas en el nicho microbiano disbiótico, de modo que una microbiota saludable, diversa y protectora coloniza y puebla la luz intestinal, estableciendo o restableciendo el control ecológico sobre patógenos o posibles patógenos (p. ej., algunas bacterias son patogénicas solo cuando están presentes en un entorno disbiótico). La inhibición de patógenos incluye aquellos patógenos tales comoC.difficile, Salmonellaspp.,E. colienteropatogénica, bacterias multirresistentes tales comoKlebsiellayE. coli,Enterobacteriaceaeresistentes a carbapenémicos (CRE),Enterococci (ESBL)resistentes a betalactama de espectro extendido yEnterococciresistentes a vancomicina (VRE).

Las composiciones bacterianas dadas a conocer en la presente memoria se producen y se demuestra su eficacia en la inhibición de bacterias patogénicas, tal como se proporciona en mayor detalle a continuación en la presente memoria.

En particular, con el fin de caracterizar esas relaciones antagónicas entre comensales intestinales que son relevantes para la dinámica del hábitat intestinal de los mamíferos, se da a conocer un sistema de cribado basado en microplacasin vitroque demuestra la eficacia de esas composiciones bacterianas, incluyendo la capacidad de inhibir (o antagonizar) el crecimiento de un patógeno bacteriano o patobionte, normalmente un microorganismo gastrointestinal. Estos métodos proporcionan nuevas combinaciones de especies y UTO de microorganismo intestinal que son capaces de restaurar o mejorar el control ecológico sobre patógenos intestinales importantes o patobiontesin vivo.

Las composiciones bacterianas pueden comprender dos tipos de bacterias (denominadas "combinaciones binarias" o "pares binarios") o más de dos tipos de bacterias. Las composiciones bacterianas que comprenden tres tipos de bacterias se denominan "combinaciones ternarias". Por ejemplo, una composición bacteriana puede comprender por lo menos 2, por lo menos 3, por lo menos 4, por lo menos 5, por lo menos 6, por lo menos 7, por lo menos 8, por lo menos 9, por lo menos 10, por lo menos 11, por lo menos 12, por lo menos 13, por lo menos 14, por lo menos 15, por lo menos 16, por lo menos 17, por lo menos 18, por lo menos 19, por lo menos 20, o por lo menos 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o por lo menos 40, por lo menos 50 o más de 50 tipos de bacterias, según se define a nivel de especie o unidad taxonómica operativa (UTO), o de otra manera proporcionada en la presente memoria. En una realización, la composición comprende bacterias seleccionadas de la Tabla 1.

En otra realización, el número de tipos de bacterias presentes en una composición bacteriana presenta un valor igual o inferior a un valor conocido. Por ejemplo, en tales realizaciones, la composición bacteriana comprende 50 o menos tipos de bacterias, tales como 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, o 10 o menos, o 9 o menos tipos de bacterias, 8 o menos tipos de bacterias, 7 o menos tipos de bacterias, 6 o menos tipos de bacterias, 5 o menos tipos de bacterias, o 4 o menos tipos de bacterias. En otra realización, una composición bacteriana comprende no más de 40, no más de 30, no más de 20, no más de 15, no más de 10 o no más de 5 tipos de bacterias.

En algunas realizaciones, se proporcionan composiciones bacterianas con la capacidad de excluir bacterias patogénicas. Se demuestra que las composiciones bacterianas de ejemplo reducen la tasa de crecimiento de un patógeno,C. difficile,tal como se proporciona en los Ejemplos, en donde se muestra la capacidad de las composiciones bacterianas mediante la evaluación de la actividad de antagonismo de una combinación de UTO o cepas contra un patógeno dado mediante ensayosin vitro.

En algunas realizaciones, se desarrollan composiciones bacterianas con la capacidad de excluir de manera duradera a C.difficile,utilizando una metodología para estimar un Factor de control ecológico (FCE) para los constituyentes en la microbiota humana. El FCE se determina mediante evaluación de la actividad antagonista de una cepa comensal dada o combinación de cepas hacia un patógeno dado utilizando unin vitroensayo, dando como resultado niveles observados de control ecológico a diversas concentraciones de las cepas comensales añadidas. El FCE para una cepa comensal o combinación de cepas es algo análogo a la evaluación tradicional de la concentración mínima inhibitoria (CMI) que se utiliza para la evaluación de los antibióticos. El FCE permite la evaluación y clasificación de las potencias relativas de cepas comensales y combinaciones de cepas a partir de su capacidad de antagonizar patógenos gastrointestinales. El FCE de una cepa comensal o combinación de cepas puede calcularse mediante evaluación de la concentración de la composición que es capaz de actuar como mediador en un porcentaje dado de inhibición (p. ej., por lo menos 10 %, 20 %, 50 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 %) de un patógeno objetivo en el ensayoin vitro. Se proporcionan en la presente memoria combinaciones de cepas u UTO dentro de la microbiota humana que son capaces de reducir significativamente la tasa de replicación de patógenos gastrointestinales en el ensayoin vitro. Estas composiciones son capaces de proporcionar un medio seguro y eficaz para afectar el crecimiento, la replicación y la gravedad de enfermedades de tales patógenos bacterianos.

En general, pueden prepararse composiciones bacterianas que comprenden por lo menos dos tipos de bacterias aisladas, en donde se seleccionan independientemente un primer tipo y un segundo tipo de entre las especies o las UTO enumeradas en la Tabla 1. Determinadas composiciones bacterianas con por lo menos dos tipos de bacterias aisladas que contienen pares binarios se proporcionan en la Tabla 4a. Adicionalmente, se puede preparar una composición bacteriana que comprenda por lo menos dos tipos de bacterias aisladas, en donde una primera UTO y una segunda UTO se caracterizan independientemente por una identidad de secuencia de por lo menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o incluyendo 100 % respecto a las secuencias enumeradas en la Tabla 1. Generalmente, la primera bacteria y la segunda bacteria no son la misma UTO. Las secuencias proporcionadas en el archivo de listado de secuencias para las UTO en la Tabla 1 son secuencias 16S completas. Por lo tanto, en un caso, las primeras y/o segundas UTO pueden caracterizarse por las secuencias 16S completas de las UTO enumeradas en la Tabla 1. En otro caso, las primeras y/o segundas UTO pueden caracterizarse por una o más de las regiones variables de la secuencia 16S (V1 a V9). Estas regiones en las bacterias están definidas por los nucleótidos 69 a 99, 137 a 242, 433 a 497, 576 a 682, 822 a 879, 986 a 1043, 1117 a 1173, 1243 a 1294 y 1435 a 1465, respectivamente, utilizando una numeración basada en el sistema de nomenclatura deE.coli(ver, p. ej., Brosius et al., Complete nucleotide sequence of a 16S ribosomal RNA gene from Escherichia coli, PNAS 75(10):4801-4805 (1978)). En algunos casos, por lo menos una de las regiones V1, V2, V3, V4, V5, V6, V7, V8 y V9 se utiliza para caracterizar una UTO. En un caso, se utilizan las regiones V1, V2 y V3 para caracterizar una UTO. En otro caso, se utilizan las regiones V3, V4 y V5 para caracterizar una UTO. En otro caso, se utiliza la región V4 para caracterizar una UTO.

Composiciones bacterianas descritas por especies

En algunos casos, las composiciones se definen a partir de las especies incluidas en la composición. Se conocen en la técnica métodos para identificar especies.

Composiciones bacterianas descritas por unidades taxonómicas operativas (UTO)

Las UTO pueden definirse ya sea mediante la secuenciación completa del gen de ADNr 16S, mediante la secuenciación de una región hipervariable específica de este gen (es decir, V1, V2, V3, V4, V5, V6, V7, V8 o V9), o mediante la secuenciación de cualquier combinación de regiones hipervariables de este gen (p. ej., V1 a 3 o V3 a 5). El ADNr 16S bacteriano presenta aproximadamente 1.500 nucleótidos de longitud y se utiliza para reconstruir las relaciones evolutivas y la similitud de secuencias entre un aislado bacteriano y otro utilizando enfoques filogenéticos. Las secuencias de 16S se utilizan para la reconstrucción filogenética, ya que generalmente están altamente conservadas, aunque contienen regiones hipervariables específicas que albergan suficiente diversidad de nucleótidos para diferenciar géneros y especies de la mayoría de bacterias. Utilizando técnicas bien conocidas, con el fin de determinar la secuencia completa del 16S o la secuencia de cualquier región hipervariable de la secuencia del 16S, se extrae ADN genómico de una muestra bacteriana, se amplifica el ADNr 16S (región completa o regiones hipervariables específicas) utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se limpian los productos de PCR y se definen las secuencias de nucleótidos para determinar la composición genética del gen 16S o subdominio del gen. En el caso de que se lleve a cabo una secuenciación completa de 16S, el método de secuenciación utilizado puede ser, aunque sin limitación, secuenciación de Sanger. Si se utilizan una o más regiones hipervariables, tales como la región V4, la secuenciación puede llevarse a cabo, aunque sin limitación, mediante el método de Sanger o utilizando un método de secuenciación de próxima generación, tal como un método de Illumina (secuenciación mediante síntesis) que utiliza cebadores con código de barras que permiten reacciones multiplex.

Composiciones bacterianas excluyentes de determinadas especies o cepas bacterianas

En una realización, la composición bacteriana no comprende por lo menos uno deEnterococcus faecalis(previamente conocido comoStreptococcus faecalis),Clostridium innocuum, Clostridium ramosum, Bacteroides ovatus, Bacteroides vulgatus, Bacteroides thetaoiotaomicron, Escherichia coli(1109 y 1108-1),Clostridium bifermentansyBlautia producta(previamente conocido comoPeptostreptococcus productus).

En otra realización, la composición bacteriana no comprende por lo menos uno deAcidaminococcus intestinalis, Bacteroides ovatus,dos especies deBifidobacterium adolescentis,dos especies deBifidobacterium longum, Collinsella aerofaciens,dos especies deDorea longicatena, Escherichia coli, Eubacterium eligens, Eubacterium limosum,cuatro especies deEubacterium rectale, Eubacterium ventriosumi, Faecalibacterium prausnitzii, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Paracateroides distasonis, Raoultella sp.,una especie deRoseburia(seleccionado deRoseburiafaecalisoRoseburiafaecis),Roseburia intestinalis,dos especies deRuminococcus torquesyStreptococcus mitis.

En otra realización, la composición bacteriana no comprende por lo menos uno deBarnesiella intestinihominis; Lactobacillus reuteri;una especie caracterizada como una deEnterococcus hirae, Enterococcus faecium,oEnterococcus durans;una especie caracterizada como unade Anaerostipes caccaeoClostridium indolis;una especie caracterizada como una deStaphylococcus warnerioStaphylococcus pasteuriyAdlercreutzia equolifaciens.

En otra realización, la composición bacteriana no comprende por lo menos uno deClostridium absonum, Clostridium argentinense, Clostridium baratii, Clostridium bifermentans, Clostridium bUTOlinum, Clostridium butyricum, Clostridium cadaveris, Clostridium camis, Clostridium celatum, Clostridium chauvoei, Clostridium clostridioforme, Clostridium cochlearium, Clostridium difficile, Clostridium fallax, Clostridium felsineum, Clostridium ghonii, Clostridium glycolicum, Clostridium haemolyticum, Clostridium hastiforme, Clostridium histolyticum, Clostridium indolis, Clostridium innocuum, Clostridium irregulare, Clostridium limosum, Clostridium malenominatum, Clostridium novyi, Clostridium oroticum, Clostridium paraputrificum, Clostridium perfringens, Clostridium piliforme, Clostridium putrefaciens, Clostridium putrificum, Clostridium ramosum, Clostridium sardiniense, Clostridium sartagoforme, Clostridium scindens, Clostridium septicum, Clostridium sordellii, Clostridium sphenoides, Clostridium spiroforme, Clostridium sporogenes, Clostridium subterminale, Clostridium symbiosum, Clostridium tetani, Clostridium welchiiyClostridium villosum.

En otra realización, la composición bacteriana no comprende por lo menos uno deClostridium innocuum, Clostridium bifermentans, Clostridium butyricum, Bacteroides fragilis, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides uniformis,tres cepas deEscherichia coliyLactobacillus sp.

En otra realización, la composición bacteriana no comprende por lo menos uno deClostridium bifermentans, Clostridium innocuum, Clostridium butyricum,tres cepas deEscherichia coli,tres cepas deBacteroidesyBlautia producta(previamente conocido comoPeptostreptococcus productus).

En otra realización, la composición bacteriana no comprende por lo menos uno deBacteroides caccae, Bacteroides capillosus, Bacteroides coagulans, Bacteroides distasonis, Bacteroides eggerthii, Bacteroides forsythus, Bacteroides fragilis, Bacteroides fragilis-ryhm, Bacteroides gracilis, Bacteroides levii, Bacteroides macacae, Bacteroides merdae, Bacteroides ovatus, Bacteroides pneumosintes, Bacteroides putredinis, Bacteroides pyogenes, Bacteroides splanchnicus, Bacteroides stercoris, Bacteroides tectum, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides uniformis, Bacteroides ureolyticusyBacteroides vulgatus.

En otra realización, la composición bacteriana no comprende por lo menos uno deBacteroides, Eubacteria, Fusobacteria, Propionibacteria, Lactobacilli,cocos anaerobios,Ruminococcus, Escherichia coli, Gemmiger, DesulfomonasyPeptostreptococcus.

En otra realización, la composición bacteriana no comprende por lo menos uno deBacteroides fragilis ss vulgatus, Eubacterium aerofaciens, Bacteroides fragilis ss. thetaiotaomicron, Blautia producta(previamente conocido comoPeptostreptococcus productus II),Bacteroides fragilis ss. distasonis, Fusobacterium prausnitzii, Coprococcus eutactus, Eubacterium aerofaciens III, Blautia producta(previamente conocido comoPeptostreptococcus productus I),Ruminococcus bromii, Bifidobacterium adolescentis, Gemmiger formicilis, Bifidobacterium longum, Eubacterium siraeum, Ruminococcus torques, Eubacterium rectale III-H, Eubacterium rectale IV, Eubacterium eligens, Bacteroides eggerthii, Clostridium leptum, Bacteroides fragilis ss. A, Eubacterium biforme, Bifidobacterium infantis, Eubacterium rectale III-F, Bacteroides capillosus, Ruminococcus albus, Eubacteriumformicigenerans, Eubacterium hallii, Eubacterium ventriosum 7, Fusobacterium russii, Ruminococcus obeum, Eubacterium rectale II, Clostridium ramosum 7, Lactobacillus leichmanii, Ruminococcus cailidus, Butyrivibrio crossotus, Acidaminococcus fermentans, Eubacterium ventriosum, Bacteroides fragilis ss. fragilis, Bacteroides AR, Coprococcus catus, Eubacterium hadrum, Eubacterium cylindroides, Eubacterium ruminantium, Eubacterium CH-1, Staphylococcus epidermidis, Peptostreptococcus BL, Eubacterium limosum, Bacteroides praeacutus, Bacteroides L, Fusobacterium mortiferum I, Fusobacterium naviforme, Clostridium innocuum, Clostridium ramosum, Propionibacterium acnes, Ruminococcus flavefaciens, Ruminococcus AT, Peptococcus AU-1, Eubacterium AG, -AK, -AL, -AL-1, -AN; Bacteroides fragilis ss. ovatus, -ss. d, -ss. f; Bacteroides L-1, L-5; Fusobacterium nucleatum, Fusobacterium mortiferum, Escherichia coli, Streptococcus morbiliorum, Peptococcus magnus, Peptococcus G, AU-2; Streptococcus intermedius, Ruminococcus lactaris, Ruminococcus CO GemmigerX, Coprococcus BH, -CC; Eubacterium tenue, Eubacterium ramulus, Eubacterium AE, -AG-H, - AG-M, -AJ, -BN-1; Bacteroides clostridiiformis ss. clostridliformis, Bacteroides coagulans, Bacteroides orails, Bacteroides ruminicola ss. brevis, -ss. ruminicola, Bacteroides splanchnicus, Desuifomonas pigra, Bacteroides L-4, -N-i; Fusobacterium H, Lactobacillus GySuccinivibrio A.

En otra realización, la composición bacteriana no comprende por lo menos uno deBifidobacterium bifidum W23, Bifidobacterium lactis W18, Bifidobacterium longum W51, Enterococcus faecium W54, Lactobacillus plantarum W62, Lactobacillus rhamnosus W71, Lactobacillus acidophilus W37, Lactobacillus acidophilus W55, Lactobacillus paracasei W20yLactobacillus salivarius W24.

En otra realización, la composición bacteriana no comprende por lo menos uno deAnaerotruncus colihominis DSM 17241, Blautia producta JCM 1471, Clostridiales bacterium 1 7 47FAA, Clostridium asparagiforme DSM15981, Clostridium bacterium JC13, Clostridium bolteae ATCC BAA 613, Clostridium hathewayi DSM 13479, Clostridium indolis CM971, Clostridium ramosum DSM1402, Clostridium saccharogumia SDG Mt853Db, Clostridium scindens VP 12708, Clostridium sp 7354FAA, Eubacterium contortum DSM 3982, Lachnospiraceae bacterium 3157FAA CT1, Lachnospiraceae bacterium 7158FAAyRuminococcus sp ID8.

En otra realización, la composición bacteriana no comprende por lo menos uno deAnaerotruncus colihominis DSM 17241, Blautia producta JCM1471, Clostridiales bacterium 1 7 47FAA, Clostridium asparagiforme DSM15981, Clostridium bacterium JC13, Clostridium bolteae ATCC BAA 613, Clostridium hathewayi DSM 13479, Clostridium indolis CM971, Clostridium ramosum DSM1402, Clostridium saccharogumia SDG Mt853Db, Clostridium scindens VP 12708, Clostridium sp 7354FAA, Eubacterium contortion DSM 3982, Lachnospiraceae bacterium 3157FAA CT1, Lachnospiraceae bacterium 7158FAA, Oscillospiraceae bacterium NML 061048yRuminococcus sp ID8.

En otra realización, la composición bacteriana no comprende por lo menos uno deClostridium ramosumDSM 1402,Clostridium saccharogumiaSDG Mt853Db yLachnospiraceae bacterium7158FAA.

En otra realización, la composición bacteriana no comprende por lo menos uno deClostridium hathewayi DSM 13479, Clostridium saccharogumia SDG Mt853Db, Clostridium sp 7354FAAyLachnospiraceae bacterium 3157FAA CT1.En otra realización, la composición bacteriana no comprende por lo menos uno deAnaerotruncus colihominis DSM 17241, Blautia producta JCM 1471, Clostridium bacterium JC13, Clostridium scindens VP 12708yRuminococcus sp ID8.

En otra realización, la composición bacteriana no comprende por lo menos uno deClostridiales bacterium 1747FAA, Clostridium asparagiforme DSM 15981, Clostridium bolteae ATCC BAA 613, Clostridium indolis CM971yLachnospiraceae bacterium 7158FAA.

Inhibición de patógenos bacterianos

Las composiciones bacterianas ofrecen un efecto protector o terapéutico contra la infección por uno o más patógenos GI de interés, algunos de los cuales se enumeran en la Tabla 3.

En algunas realizaciones, la bacteria patogénica se selecciona del grupo que consiste enYersinia, Vibrio, Treponema, Streptococcus, Staphylococcus, Shigella, Salmonella, Rickettsia, Orientia, Pseudomonas, Neisseria, Mycoplasma, Mycobacterium, Listeria, Leptospira, Legionella, Klebsiella, Helicobacter, Haemophilus, Francisella, Escherichia, Ehrlichia, Enterococcus, Coxiella, Corynebacterium, Clostridium, Chlamydia, Chlamydophila, Campylobacter, Burkholderia, Brucella, Borrelia, Bordetella, Bifidobacterium,Bacillus,bacterias multirresistentes, enterococos resistentes a beta-lactama de espectro extendido (ESBL),Enterobacteriaceaeresistentes a carbapenémicos (CRE) y enterococos resistentes a vancomicina (VRE).

En algunas realizaciones, entre estos patógenos se incluyen, aunque sin limitación,Aeromonas hydrophila, Campylobacter fetus, Plesiomonas shigelloides, Bacillus cereus, Campylobacter jejuni, Clostridium butolinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens,enteroagregativaEscherichia coli, Escherichia colienterohemorrágica,Escherichia colienteroinvasiva, Escherichia colienterotoxigénica (tal como, aunque sin limitación, LT y/o ST),Escherichia coli0157:H7,Fusariumspp.,Helicobacter pylori, Klebsiella pneumonia, Klebsiella oxytoca, Lysteria monocytogenes, Morganellaspp.,Plesiomonas shigelloides, Proteusspp.,Providenciaspp.,Salmonellaspp.,Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Shigellaspp.,Staphylococcusspp.,Staphylococcus aureus,especies de enterococos resistentes a vancomicina,Vibriospp.,Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificusyYersinia enterocolitica.

En una realización, el patógeno de interés es por lo menos un patógeno seleccionado deClostridium difficile, Salmonellaspp.,Escherichia colipatogénica,Enterococcusspp. resistentes a vancomicina y enterococos resistentes a beta-lactamas de espectro extendido (ESBL).

Ensayos in vitro que sustentan el efecto protector de las composiciones bacterianas

En un caso, se da a conocer un ensayoin vitroque utiliza la competencia entre las composiciones bacterianas o subconjuntos de las mismas yC. difficile. Se proporcionan casos de ejemplo del ensayo en la presente memoria y en los Ejemplos.

En otro caso, se da a conocer un ensayoin vitroque utiliza heces filtradas a esterilidad (HFE) al 10 % (p/v). Se da a conocer, además, un ensayoin vitropara analizar el efecto protector de las composiciones bacterianas y para seleccionarin vitrocombinaciones de microorganismos que inhiben el crecimiento de un patógeno. El ensayo puede funcionar en modos automatizados de alto rendimiento o en modos manuales. Bajo cualquiera de los sistemas, las heces humanas o animales pueden resuspenderse en una solución tamponadora anaeróbica, tal como PBS prerreducido u otro tampón adecuado, eliminarse las partículas mediante centrifugación y se esterilizar mediante filtración. Dicho material de heces filtradas a esterilidad al 10 % sirve como el medio base para el ensayoin vitro. Para someter a ensayo una composición bacteriana, el investigador puede añadirla al material de heces filtrado a esterilidad y dejarlo durante un primer período de incubación y a continuación inocular la solución microbiana incubada con el patógeno de interés y dejarlo durante un segundo período de incubación. El título resultante del patógeno puede cuantificarse mediante varios métodos, tales como los descritos a continuación, y comparar el cambio en la cantidad de patógeno con controles estándares, incluyendo el patógeno cultivado en ausencia de la composición bacteriana. El ensayo se lleva a cabo utilizando por lo menos un control. Las heces de un sujeto sano pueden usarse a modo de control positivo. Como control negativo, se pueden utilizar heces tratadas con antibióticos o heces tratadas por calor. Se pueden someter a ensayo diversas composiciones bacterianas en este material y opcionalmente compararse las composiciones bacterianas con los controles positivos y/o negativos. La capacidad de inhibir el crecimiento del patógeno puede medirse mediante la siembra del material incubado en un medio selectivo deC. difficiley el recuento de las colonias. Después de la competencia entre la composición bacteriana yC. difficile,cada pocillo de la placa de ensayoin vitrose diluye en serie en un factor de diez en seis ocasiones, y se siembra en medio selectivo, tal como, aunque sin limitación, agar de manitol-cefoxitina-cicloserina (AMCC) o agar de fructosa-cefoxitina-cicloserina (AFCC), y se incuba. Se realiza un recuento de las colonias deC.difficilepara calcular la densidad de células viables en cada pocillo al final de la competencia. Las colonias deC. difficilese confirman por su característica morfología de borde difuso de las colonias, así como por la fluorescencia bajo luz UV.

En otro caso, el ensayoin vitroutiliza heces tratadas con antibióticos. En un caso alternativo, y en lugar de utilizar heces filtradas a esterilidad al 10 %, se pueden resuspender heces humanas o animales en una solución de tampón anaeróbico, tal como PBS prerreducido u otro tampón adecuado. La materia fecal resuspendida se trata con un antibiótico, tal como la clindamicina, o un cóctel de varios antibióticos con el fin de reducir la capacidad de las heces de un sujeto sano para inhibir el crecimiento deC. difficile;este material se denomina "matriz tratada con antibióticos". Sin restringirse a ningún mecanismo en particular, se cree que las bacterias beneficiosas en sujetos sanos les protegen frente a infecciones mediante competencia conC. difficile.El tratamiento de las heces con antibióticos mata o reduce la población de esas bacterias beneficiosas, permitiendo queC. difficilecrezca en esta matriz de ensayo. Entre los antibióticos aparte de la clindamicina que inhiben la flora normal se incluyen ceftriaxona y piperacilina-tazobactam y pueden ser sustituidos por clindamicina. La matriz tratada con antibióticos se centrifuga, se elimina el sobrenadante y el material sedimentado se resuspende en heces diluidas y esterilizadas mediante filtración, a fin de eliminar cualquier antibiótico residual. Esta matriz tratada con antibióticos y lavada puede utilizarse en el ensayoin vitrodescrito anteriormente en lugar de las heces esterilizadas mediante filtración al 10 %.

También se da a conocer un ensayoin vitroque utiliza la competencia entre las composiciones bacterianas o subgrupos de las mismas yEnterococcus faeciumresistente a vancomicina. Se proporcionan ejemplos de este ensayo en la presente memoria y en los ejemplos.

Se da a conocer, además, un ensayoin vitroque utiliza la competencia entre las composiciones bacterianas o subgrupos de las mismas yMorganella morganii.Se proporcionan ejemplos de este ensayo en la presente memoria y en los ejemplos.

Se da a conocer, además, un ensayoin vitroque utiliza la competencia entre las composiciones bacterianas o subgrupos de las mismas yKlebsiella pneumoniae.Se proporcionan ejemplos de este ensayo en la presente memoria y en los ejemplos.

Alternativamente, la capacidad de inhibir el crecimiento del patógeno puede medirse mediante PCR cuantitativa (qPCR). Pueden seguirse técnicas estándares para generar una curva patrón para el patógeno de interés. El ADN genómico puede extraerse de muestras utilizando kits disponibles comercialmente, tales como el kit de aislamiento de ADN de suelo Mo Bio Powersoil<®>-htp de 96 pocillos (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA), el kit de aislamiento de ADN Mo Bio Powersoil<®>(Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA), o el minikit de ADN fecal QIAamp (QIAGEN, Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La qPCR puede llevarse a cabo utilizando HotMasterMix (5PRIME, Gaithersburg, MD) y cebadores específicos para el patógeno de interés, y puede llevarse a cabo en una placa de reacción óptica rápida de 96 pocillos MicroAmp<®>con código de barras (0,1 ml) (Life Technologies, Grand Island, NY) y ejecutarse en un ciclador térmico BioRad C1000<™>dotado de un sistema en tiempo Real CFX96<™>(BioRad, Hercules, CA), con lecturas fluorescentes de los canales FAM y ROX. El valor de Cq para cada pocillo en el canal FAM se determina con el software CFX Manager<™>versión 2.1. El log10(UFC/ml) de cada muestra experimental se calcula mediante la introducción del valor de Cq de una muestra determinada en el modelo de regresión lineal generado a partir de la curva patrón que compara los valores de Cq de los pocillos de la curva patrón con el log10(UFC/ml) conocido de esas muestras. El experto en la materia podrá utilizar modos alternativos de qPCR.

Ensayo in vivo que establece el efecto protector de las composiciones bacterianas.

Se da a conocer un modelo de ratónin vivopara someter a ensayo el efecto protector de las composiciones bacterianas contra C.difficile.En este modelo (basado en Chen, et al., A mouse model of Clostridium difficile associated disease, Gastroenterology 135(6): 1984-1992 (2008)), se hace que los ratones sean susceptibles a la infección porC. difficilemediante un tratamiento de siete días (días -12 a -5 del experimento) con 5 a 7 antibióticos (incluyendo kanamicina, colistina, gentamicina, metronidazol y vancomicina, e incluyendo opcionalmente ampicilina y ciprofloxacino) administrado en el agua de bebida, seguido de una dosis única de clindamicina el día -3, seguido de un reto tres días después, el día 0, con 10<4>esporas deC. difficilemediante sonda oral (es decir, lavado orogástrico). Las composiciones bacterianas pueden administrarse ya sea antes (tratamiento profiláctico) o después (tratamiento terapéutico) de la administración por sonda deC. difficile. Además, se pueden administrar composiciones bacterianas después del tratamiento opcional con vancomicina (ver posteriormente) para evaluar su capacidad de prevenir la recurrencia y, por lo tanto, suprimir el patógenoin vivo.Los resultados evaluados cada día entre el día -1 y el día 6 (o después, para la prevención de recurrencias) son el peso, los signos clínicos, la mortalidad y la eliminación deC. difficileen las heces. Habitualmente sin tratamiento se observa pérdida de peso, signos clínicos de enfermedad y excreción deC. difficile. La vancomicina administrada por sonda oral entre el día -1 y el día 4 protege contra estos resultados y sirve como un control positivo. Los signos clínicos son subjetivos y son evaluados cada día por el mismo observador experimentado. Los animales que pierden el 25 % o más de su peso corporal son sacrificados y contados como muertes relacionadas con infecciones. Se recogen heces de las jaulas de ratones (5 ratones por jaula) cada día, y se detecta la excreción de esporas deC. difficileen las heces utilizando un ensayo de cultivo selectivo tal como se ha descrito para el ensayoin vitroanterior, o mediante qPCR para el gen de la toxina tal como se describe en la presente memoria. Los efectos de los materiales de ensayo, incluyendo la suspensión al 10 % de heces humanas (como control positivo), las composiciones bacterianas o PBS (como control negativo), se determinaron mediante la introducción del artículo de ensayo en un volumen de 0,2 ml en los ratones mediante sonda oral el día -1, un día antes del reto deC. difficile, los días 1, 2 y 3 como tratamiento o postratamiento con vancomicina en los días 5, 6, 7 y 8. La vancomicina, tal como se ha comentado anteriormente, se administra en los días 1 a 4 como otro control positivo. Se pueden utilizar esquemas de dosificación y vías de administración (p. ej., rectal) alternativos, incluyendo múltiples dosis del artículo de ensayo, y se pueden administrar de 10<3>a 10<10>de un organismo o composición dada.

Métodos para preparar una composición bacteriana para la administración a un sujeto

Los métodos para producir composiciones bacterianas pueden incluir tres etapas principales de procesamiento, combinadas con una o más etapas de mezcla. Las etapas son: depósito de organismos en bancos, producción de organismos y preservación.

Para el depósito en bancos, las cepas incluidas en la composición bacteriana pueden ser (1) aisladas directamente de un espécimen o tomadas de una reserva almacenado, (2) opcionalmente cultivadas en un medio de cultivo sólido o líquido que permita el crecimiento para generar biomasa viable, y (3) la biomasa opcionalmente puede conservarse en múltiples alícuotas para el almacenamiento a largo plazo.

Cuando se utiliza una etapa de cultivo, el agar o caldo puede contener nutrientes que proporcionan elementos esenciales y factores específicos que permiten el crecimiento. Un ejemplo sería un medio compuesto por 20 g/l de glucosa, 10 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de peptonas de soja, 2 g/l de ácido cítrico, 1,5 g/l de fosfato monosódico, 100 mg/l de citrato de amonio férrico, 80 mg/l de sulfato de magnesio, 10 mg/l de cloruro de hemina, 2 mg/l de cloruro de calcio y 1 mg/l de menadiona. Una variedad de medios microbiológicos y variaciones son bien conocidos en la técnica (p. ej., RM. Atlas,Handbook of Microbiological Media(2010) CRC Press). El medio se puede añadir al cultivo al inicio, puede añadirse durante el cultivo, o puede fluir a través del cultivo de manera intermitente/continua. Las cepas en la composición bacteriana pueden cultivarse solas, en forma de un subgrupo de la composición bacteriana, o como una colección completa que comprende la composición bacteriana. A título de ejemplo, puede cultivarse una primera cepa junto con una segunda cepa en un cultivo continua mixta, a una tasa de dilución inferior a la tasa de crecimiento máxima de cualquiera de las células para evitar que el cultivo resulte eliminado por dilución.

El cultivo inoculado se incubó bajo condiciones favorables durante un tiempo suficiente para desarrollar biomasa. Para composiciones bacterianas de uso humano, lo anterior con frecuencia es una temperatura de 37 °C, y pH y otros parámetros con valores similares al nicho humano normal. El entorno puede controlarse de manera activa, controlarse de manera pasiva (p. ej., mediante tampones) o permitir su deriva. Por ejemplo, para composiciones bacterianas anaerobias (p. ej., microbiota intestinal), se puede utilizar un entorno anóxico/reductor. Ello se puede conseguir mediante la adición de agentes reductores tales como la cisteína al caldo y/o despojándolo de oxígeno. A título de ejemplo, un cultivo de una composición bacteriana puede cultivarse a 37 °C, pH 7, en el medio indicado anteriormente, prerreducido con 1 g/l de HCl de cisteína.

Cuando el cultivo ha generado suficiente biomasa, puede preservarse para su conservación en un banco. Los organismos pueden introducirse en un medio químico que los proteja de la congelación (añadiendo "crioprotectores"), de la deshidratación ("lioprotectores") y/o del choque osmótico ("osmoprotectores"), distribuyéndolos en múltiples recipientes (opcionalmente idénticos) para crear un banco uniforme, y después tratar el cultivo para su preservación. Los recipientes son generalmente impermeables y presentan cierres que garantizan el aislamiento respecto al medio ambiente. El tratamiento de conservación criogénica se realiza mediante la congelación de un líquido a temperaturas ultrabajas (p. ej., a -80 °C o inferiores). La preservación por secado elimina el agua del cultivo mediante evaporación (en el caso del secado por pulverización o "secado en frío") o por sublimación (p. ej., en el caso del secado por congelación, el secado por congelación por pulverización). La eliminación de agua mejora la estabilidad del almacenamiento de la composición bacteriana a largo plazo a temperaturas elevadas por encima de las criogénicas. Si la composición bacteriana comprende especies formadoras de esporas y resulta en la producción de esporas, la composición final puede purificarse por medios adicionales, tales como la centrifugación en gradiente de densidad, conservada utilizando las técnicas descritas anteriormente. El almacenamiento de la composición bacteriana en un banco puede llevarse a cabo mediante cultivo y preservando las cepas individualmente, o mediante la mezcla de las cepas para crear un banco combinado. A modo de ejemplo de conservación criogénica, puede recogerse un cultivo de composición bacteriana mediante centrifugación para sedimentar las células del medio de cultivo, decantar el sobrenadante y sustituir por un nuevo caldo de cultivo que contiene 15 % de glicerol. A continuación, el cultivo puede fraccionarse en tubos criogénicos de 1 ml, sellarse y someterse a -80 °C para la retención a largo plazo de la viabilidad. Este procedimiento consigue una viabilidad aceptable tras la recuperación a partir del almacenamiento en congelación. La producción de organismos puede llevarse a cabo utilizando etapas de cultivo similares a los de la conservación en un banco, incluyendo la composición del medio y las condiciones de cultivo. Puede llevarse a cabo a escalas de operación más grandes, especialmente para el desarrollo clínico o la producción comercial. A escalas más grandes, pueden realizarse varios subcultivos de la composición bacteriana antes del cultivo final. Al final del cultivo, se recoge el cultivo para permitir su posterior formulación en una forma de dosificación para la administración. Lo anterior puede implicar la concentración, eliminación de componentes indeseables del medio y/o la introducción en un medio químico que preserve la composición bacteriana y la haga aceptable para su administración a través de la vía seleccionada. Por ejemplo, una composición bacteriana puede cultivarse a una concentración de 10<10>UFC/ml, después concentrarse 20 veces mediante microfiltración por flujo tangencial; el medio agotado puede intercambiarse mediante diafiltración con un medio de conservación que consiste en 2 % de gelatina, trehalosa 100 mM y tampón de fosfato sódico 10 mM. A continuación, la suspensión puede liofilizarse para formar unos polvos y titularse.

Después del secado, los polvos pueden mezclarse a una potencia adecuada y mezclarse con otros cultivos y/o un agente de carga como la celulosa microcristalina a fin de obtener consistencia y facilidad de manipulación, y la composición bacteriana puede formularse tal como se da a conocer en la presente memoria.

Formulaciones

Se dan a conocer formulaciones para la administración a seres humanos y otros sujetos que lo necesiten. En general, las composiciones bacterianas se combinan con materiales activos y/o inactivos adicionales para producir un producto final, que puede presentarse en una unidad de dosis única o en un formato de múltiples dosis.

En algunas realizaciones, la composición beneficiosa comprende por lo menos un carbohidrato. Un "carbohidrato" se refiere a un azúcar o a un polímero de azúcares. Los términos "sacárido", "polisacárido", "carbohidrato" y "oligosacárido" pueden usarse indistintamente. La mayoría de los carbohidratos son aldehídos o cetonas con muchos grupos hidroxilo, generalmente uno en cada átomo de carbono de la molécula. Los carbohidratos generalmente presentan la fórmula molecular CnH2nOn. Un carbohidrato puede ser un monosacárido, un disacárido, un trisacárido, un oligosacárido o un polisacárido. El carbohidrato más básico es un monosacárido, tal como glucosa, sacarosa, galactosa, manosa, ribosa, arabinosa, xilosa y fructosa. Los disacáridos son dos monosacáridos unidos. Entre los disacáridos de ejemplo se incluyen sacarosa, maltosa, celobiosa y lactosa. Normalmente, un oligosacárido incluye entre tres y seis unidades de monosacáridos (p. ej., rafinosa, estaquiosa), y los polisacáridos incluyen seis o más unidades de monosacáridos. Entre los polisacáridos de ejemplo se incluyen almidón, glucógeno y celulosa. Los carbohidratos pueden contener unidades de sacárido modificadas, tales como 2'-desoxirribosa, en la que se ha eliminado un grupo hidroxilo: 2'-fluororribosa, en la que un grupo hidroxilo se ha sustituido por un flúor, o N-acetilglucosamina, una forma de glucosa que contiene nitrógeno (p. ej., 2'-fluororribosa, desoxirribosa y hexosa). Los carbohidratos pueden existir en muchas formas diferentes, por ejemplo, confórmeros, formas cíclicas, formas acíclicas, estereoisómeros, tautómeros, anómeros e isómeros.

En algunas realizaciones, la composición comprende por lo menos un lípido. Tal como se utiliza en la presente memoria, un "lípido" incluye grasas, aceites, triglicéridos, colesterol, fosfolípidos, ácidos grasos en cualquier forma, incluidos los ácidos grasos libres. Las grasas, los aceites y los ácidos grasos pueden ser saturados, insaturados (cis o trans) o parcialmente insaturados (cis o trans). En algunas realizaciones, el lípido comprende por lo menos un ácido graso seleccionado de ácido láurico (12:0), ácido mirístico (14:0), ácido palmítico (16:0), ácido palmoleico (16:1), ácido margárico (17:0), ácido heptadecenoico (17:1), ácido esteárico (18:0), ácido oleico (18:1), ácido linoleico (18:2), ácido linolénico (18:3), ácido octadecatetraenoico (18:4), ácido araquídico (20:0), ácido eicosenoico (20:1), ácido eicosadienoico (20:2), ácido eicosatetraenoico (20:4), ácido eicosapentaenoico (20:5) (EPA), ácido docosanoico (22:0), ácido docosenoico (22:1), ácido docosapentaenoico (22:5), ácido docosahexaenoico (22:6) (DHA), y ácido tetracosanoico (24:0). En algunas realizaciones, la composición comprende por lo menos un lípido modificado, por ejemplo, un lípido que ha sido modificado mediante cocción.

En algunas realizaciones, la composición comprende por lo menos un mineral suplementario o fuente mineral. Entre los ejemplos de minerales se incluyen, aunque sin limitación: cloruro, sodio, calcio, hierro, cromo, cobre, yodo, zinc, magnesio, manganeso, molibdeno, fósforo, potasio y selenio. Entre las formas adecuadas de cualquiera de los minerales anteriormente indicados se incluyen sales minerales solubles, sales minerales ligeramente solubles, sales minerales insolubles, minerales quelados, complejos minerales, minerales no reactivos tales como los minerales carbonilos, y minerales reducidos, así como combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, la composición comprende por lo menos una vitamina suplementaria. Por lo menos una vitamina puede ser una vitamina liposoluble o hidrosoluble. Entre las vitaminas adecuadas se incluyen, aunque sin limitación, vitamina C, vitamina A, vitamina E, vitamina B12, vitamina K, riboflavina, niacina, vitamina D, vitamina B6, ácido fólico, piridoxina, tiamina, ácido pantoténico y biotina. Las formas adecuadas de cualquiera de los anteriormente indicados son sales de la vitamina, derivados de la vitamina, compuestos que presentan la misma o similar actividad de la vitamina, y metabolitos de la vitamina.

En algunas realizaciones, la composición comprende un excipiente. Entre los ejemplos no limitativos de excipientes adecuados se incluyen un agente tamponador, un conservante, un estabilizante, un aglutinante, un agente de compactación, un lubricante, un potenciador de la dispersión, un agente desintegrante, un agente saborizante, un edulcorante y un agente colorante.

En algunas realizaciones, el excipiente es un agente tamponador. Entre los ejemplos no limitativos de agentes tamponadores adecuados se incluyen citrato sódico, carbonato de magnesio, bicarbonato de magnesio, carbonato de calcio y bicarbonato de calcio.

En algunas realizaciones, el excipiente comprende un conservante. Entre los ejemplos no limitativos de conservantes adecuados se incluyen antioxidantes, tales como el alfa-tocoferol y el ascorbato, y antimicrobianos, tales como los parabenos, el clorobutanol y el fenol.

En algunas realizaciones, la composición comprende un aglutinante como excipiente. Entre los ejemplos no limitativos de aglutinantes adecuados se incluyen almidones, almidones pregelatinizados, gelatina, polivinilpirrolidona, celulosa, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa, poliacrilamidas, poliviniloxazolidona, alcoholes polivinílicos, alcoholes de ácidos grasos C12-C18, polietilenglicol, polioles, sacáridos, oligosacáridos y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la composición comprende un lubricante como excipiente. Entre los ejemplos no limitativos de lubricantes adecuados se incluyen estearato de magnesio, estearato de calcio, estearato de zinc, aceites vegetales hidrogenados, estereotex, monostearato de polioxietileno, talco, polietilenglicol, benzoato sódico, laurilsulfato sódico, laurilsulfato de magnesio, y aceite mineral ligero.

En algunas realizaciones, la composición comprende un potenciador de la dispersión como excipiente. Entre los ejemplos no limitativos de dispersantes adecuados se incluyen almidón, ácido algínico, polivinilpirrolidonas, goma guar, caolín, bentonita, celulosa de madera purificada, glicolato de almidón sódico, silicato isoamorfo y celulosa microcristalina como surfactantes emulsionantes con alto equilibrio hidrofílico-lipofílico (EHL).

En algunas realizaciones, la composición comprende un desintegrante como excipiente. En algunas realizaciones, el desintegrante es un desintegrante no efervescente. Entre los ejemplos no limitativos de desintegrantes no efervescentes adecuados se incluyen almidones tales como almidón de maíz, almidón de patata, almidones pregelatinizados y modificados, edulcorantes, arcillas, tales como bentonita, celulosa microcristalina, alginatos, glicolato de almidón sódico, gomas tales como el agar, goma guar, algarrobo, karaya, pectina y tragacanto. En algunas realizaciones, el desintegrante es un desintegrante efervescente. Entre los ejemplos no limitativos de desintegrantes efervescentes adecuados se incluyen bicarbonato sódico en combinación con ácido cítrico, y bicarbonato sódico en combinación con ácido tartárico.

En algunas realizaciones, el excipiente comprende un agente saborizante. Los agentes saborizantes se pueden seleccionar de entre aceites saborizantes sintéticos y aromáticos; aceites naturales; extractos de plantas, hojas, flores y frutas; y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el agente saborizante se selecciona de aceites de canela, aceite de Gaulteria, aceites de menta piperita, aceite de clavo, aceite de heno, aceite de anís, eucalipto, vainilla, aceite cítrico, tal como aceite de limón, aceite de naranja, aceite de uva y aceite de pomelo, y esencias de frutas, incluyendo manzana, melocotón, pera, fresa, frambuesa, cereza, ciruela, piña y albaricoque.

En algunas realizaciones, el excipiente comprende un edulcorante. Entre los ejemplos no limitantes de edulcorantes adecuados se incluyen glucosa (jarabe de maíz), dextrosa, azúcar invertido, fructosa y mezclas de los mismos (cuando no se utilizan como portadores); sacarina y sus diversas sales, tales como la sal sódica; edulcorantes dipéptidos, tales como aspartamo; compuestos de dihidrocalcona, glicirricina;Stevia rebaudiana(esteviosido); derivados clorados de sacarosa, tales como sucralosa, y polioles, tales como sorbitol, manitol, xilitol y similares. También se contemplan los hidrolizados de almidón hidrogenados y el edulcorante sintético 3,6-dihidro-6-metil-1,2,3-oxatiazín-4-ona-2,2-dióxido, particularmente la sal potásica (acesulfamo-K), y las sales sódica y cálcica de las mismas.

En algunas realizaciones, la composición comprende un agente colorante. Entre los ejemplos no limitantes de agentes colorantes adecuados se incluyen colorantes para alimentos, medicamentos y cosméticos (FD&C), colorantes para medicamentos y cosméticos (D&C), y colorantes externos para medicamentos y cosméticos (D&C ext.). Los agentes colorantes se pueden utilizar como tintes o en sus lacas correspondientes.

La fracción de peso del excipiente o combinación de excipientes en la formulación habitualmente es aproximadamente 99 % o menos, tal como aproximadamente 95 % o menos, aproximadamente 90 % o menos, aproximadamente 85 % o menos, aproximadamente 80 % o menos, aproximadamente 75 % o menos, aproximadamente 70 % o menos, aproximadamente 65 % o menos, aproximadamente 60 % o menos, aproximadamente 55 % o menos, 50 % o menos, aproximadamente 45 % o menos, aproximadamente 40 % o menos, aproximadamente 35 % o menos, aproximadamente 30 % o menos, aproximadamente 25 % o menos, aproximadamente 20 % o menos, aproximadamente 15 % o menos, aproximadamente 10 % o menos, aproximadamente 5 % o menos, aproximadamente 2 % o menos, o aproximadamente 1 % o menos del peso total de la composición.

Las composiciones bacterianas dadas a conocer en la presente memoria pueden formularse en una variedad de formas y administrarse por diferentes medios. Las composiciones se pueden administrar por vía oral, rectal o parenteral, en formulaciones que contienen portadores, adyuvantes y vehículos convencionalmente aceptables, según se desee. El término "parenteral" tal como se utiliza en la presente memoria incluye técnicas de inyección e infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular o intraesternal. En una realización de ejemplo, la composición bacteriana se administra por vía oral.

Entre las formas de dosificación sólida para la administración oral se incluyen cápsulas, tabletas, comprimidos alargados, píldoras, trociscos, pastillas, polvos y gránulos. Una cápsula normalmente comprende un material central que incluye una composición bacteriana y una pared de cubierta que encapsula el material central. En algunas realizaciones, el material central comprende por lo menos uno de un sólido, un líquido y una emulsión. En algunas realizaciones, el material de la pared de la cubierta comprende por lo menos uno de gelatina blanda, gelatina dura y un polímero. Entre los polímeros adecuados se incluyen, aunque sin limitación: polímeros celulósicos, tales como hidroxipropilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropil-metilcelulosa (HPMC), metilcelulosa, etilcelulosa, acetato de celulosa, ftalato de acetato de celulosa, trimelitato de acetato de celulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, succinato de hidroxipropilmetilcelulosa y carboximetilcelulosa sódica; polímeros y copolímeros de ácido acrílico, tales como los formados a partir de ácido acrílico, ácido metacrílico, acrilato de metilo, metacrilato de amonio, acrilato de etilo, metacrilato de metilo y/o metacrilato de etilo (p. ej., aquellos copolímeros comercializados bajo la marca "Eudragit"); polímeros y copolímeros de vinilo, tales como el polivinilpirrolidona, acetato de polivinilo, ftalato de acetato de polivinilo, copolímero de ácido crotónico-acetato de vinilo y copolímeros de etileno-acetato de vinilo, y goma laca (laca purificada). En algunas realizaciones, por lo menos un polímero funciona como agente enmascarador del sabor.

Las tabletas, píldoras y similares pueden comprimirse, comprimirse múltiples veces, estratificarse múltiples veces y/o recubrirse. El recubrimiento puede ser simple o múltiple. En una realización, el material de recubrimiento comprende por lo menos uno de sacárido, un polisacárido y glucoproteínas extraídas de por lo menos una de una planta, un hongo y un microorganismo. Entre los ejemplos no limitativos se incluyen almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de patata, almidón de tapioca, celulosa, hemicelulosa, dextranos, maltodextrina, ciclodextrinas, inulinas, pectina, mananos, goma arábiga, goma de semilla de algarrobo, goma de mezquite, goma guar, goma karaya, goma ghatti, goma tragacanto, funori, carragenanos, agar, alginatos, quitosanos o goma gelano. En algunas realizaciones, el material de recubrimiento comprende una proteína. En algunas realizaciones, el material de recubrimiento comprende por lo menos una grasa y un aceite. En algunas realizaciones, por lo menos uno de entre una grasa y un aceite se funde a alta temperatura. En algunas realizaciones, por lo menos uno de entre una grasa y un aceite se hidrogena o se hidrogena parcialmente. En algunas realizaciones, por lo menos uno de entre una grasa y un aceite se deriva de una planta. En algunas realizaciones, por lo menos uno de una grasa y un aceite comprende por lo menos uno de glicéridos, ácidos grasos libres y ésteres de ácidos grasos. En algunas realizaciones, el material de recubrimiento comprende por lo menos una cera comestible. La cera comestible puede derivarse de animales, insectos o plantas. Entre los ejemplos no limitativos se incluyen cera de abejas, lanolina, cera de arrayán, cera de carnauba y cera de salvado de arroz. Las tabletas y las píldoras también se pueden preparar con recubrimientos entéricos.

Alternativamente, los polvos o gránulos que incorporan las composiciones bacterianas dadas a conocer en la presente memoria pueden incorporarse en un producto alimenticio. En algunas realizaciones, el producto alimenticio es una bebida para la administración oral. Entre los ejemplos no limitativos de una bebida adecuada se incluyen zumo de fruta, una bebida de fruta, una bebida artificialmente saborizada, una bebida artificialmente endulzada, una bebida carbonatada, una bebida deportiva, un producto lácteo líquido, un batido, una bebida alcohólica, una bebida con cafeína, un preparado infantil, etc. Entre otros medios adecuados para la administración oral se incluyen soluciones acuosas y no acuosas, emulsiones, suspensiones y soluciones y/o suspensiones reconstituidas a partir de gránulos no efervescentes, que contienen por lo menos uno de solventes, conservantes, agentes emulsionantes, agentes suspensores, diluyentes, edulcorantes, colorantes y agentes saborizantes adecuados.

En algunos casos, el producto alimenticio es un alimento sólido. Entre los ejemplos adecuados de un alimento sólido se incluyen, aunque sin limitación, una barra de alimento, una barra de refrigerio, una galleta, unbrownie, una madalena, una galleta salada, una barra de helado, una barra de yogur helado, y similares.

Las composiciones dadas a conocer en la presente memoria se pueden incorporar en un alimento terapéutico. En algunos casos, el alimento terapéutico es un alimento listo para usar que opcionalmente contiene algunos o todos los macronutrientes y micronutrientes esenciales. En algunos casos, las composiciones dadas a conocer en la presente memoria se incorporan en un alimento suplementario que está diseñado para ser mezclado con una comida existente. En algunos casos, el alimento suplementario contiene algunos o todos los macronutrientes y micronutrientes esenciales. En algunos casos, las composiciones bacterianas dadas a conocer en la presente memoria se mezclan o se añaden a un alimento existente para enriquecer la nutrición proteica del alimento. Entre los ejemplos se incluyen alimentos básicos (cereales, sal, azúcar, aceite de cocina, margarina), bebidas (café, té, refrescos, cerveza, licor, bebidas deportivas), bocadillos, dulces y otros alimentos.

En una realización, las formulaciones se rellenan en cápsulas de gelatina para la administración oral. Un ejemplo de una cápsula apropiada es una cápsula de gelatina de 250 mg que contiene de 10 (hasta 100 mg) de polvos liofilizados (10<8>a 10<11>bacterias), 160 mg de celulosa microcristalina, 77,5 mg de gelatina y 2,5 mg de estearato de magnesio. En una realización alternativa, pueden utilizarse de 10<5>a 10<12>bacterias; en caso necesario, de 10<5>a 10<7>, de 10<6>a 10<7>, o de 10<8>a 10<10>, con los ajustes correspondientes de los excipientes. En una realización alternativa, se puede utilizar una cápsula o tableta con recubrimiento entérico o con una composición tamponadora o protectora.

En una realización, el número de bacterias de cada tipo puede estar presente en la misma cantidad o en diferentes cantidades. Por ejemplo, en una composición bacteriana con dos tipos de bacterias, las bacterias pueden estar presentes en una proporción de entre 1: 10,000 y 1:1, en una proporción de entre 1:10.000 y 1: 1.000 relación, de entre 1:1.000 y 1:100, de entre 1:100 y 1:50, de entre 1:50 y 1:20, de entre 1:20 y 1:10, de entre 1:10 y 1:1. Para composiciones bacterianas que comprenden por lo menos tres tipos de bacterias, la proporción de tipos de bacterias puede seleccionarse por pares a partir de proporciones para composiciones bacterianas con dos tipos de bacterias. Por ejemplo, en una composición bacteriana que comprende las bacterias A, B y C, por lo menos una de las proporciones entre las bacterias A y B, la proporción entre las bacterias B y C, y la proporción entre las bacterias A y C puede seleccionarse, de manera independiente, de las combinaciones por pares mencionadas anteriormente.Composiciones para la utilización en métodos de tratamiento de un sujeto

En algunos casos, las proteínas y composiciones dadas a conocer en la presente memoria se administran a un sujeto o a un usuario (a veces denominados colectivamente como un "sujeto"). Desde este punto de vista, la exposición proporciona una composición de la invención para la utilización en un método de tratamiento de un sujeto. Tal como se utiliza en la presente memoria, "administrar" y "administración" comprenden casos en los que una persona dirige a otra a consumir una composición bacteriana de una manera determinada y/o para un propósito determinado, así como situaciones en las que un usuario utiliza una composición bacteriana de una manera determinada y/o para un propósito determinado de manera independiente o discrepando en cualquier instrucción recibida de una segunda persona. Entre los ejemplos no limitativos de situaciones en las que una persona dirige a otra a consumir una composición bacteriana de cierta manera y/o para un determinado propósito se incluyen cuando un médico prescribe un curso de acción y/o tratamiento a un sujeto, cuando un padre manda a un usuario menor (tal como un niño) a que consuma una composición bacteriana, cuando un entrenador aconseja a un usuario (tal como un atleta) que siga un curso de acción y/o tratamiento particular, y cuando un fabricante, distribuidor o comercializador recomienda condiciones de uso a un usuario final, por ejemplo, a través de anuncios o en el etiquetado en el envase o en otros materiales proporcionados en asociación con la comercialización o el marketing de un producto.

Las composiciones bacterianas ofrecen un efecto protector y/o terapéutico contra la infección por uno o más patógenos GI de interés y, de esta manera, pueden administrarse después de que un caso agudo de infección se haya resuelto para prevenir una recaída, durante un caso agudo de infección como complemento a la terapia antibiótica si la composición bacteriana no es sensible a los mismos antibióticos que el patógeno gastrointestinal, o para prevenir la infección o reducir la transmisión desde los portadores de la enfermedad. Entre estos patógenos se incluyen, aunque sin limitación,Aeromonas hydrophila, Campylobacter fetus, Plesiomonas shigelloides, Bacillus cereus, Campylobacter jejuni, Clostridium bUTOlinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Escherichia colienteroagregativa,Escherichia colienterohemorrágica,Escherichia colienteroinvasiva,Escherichia coli(LT y/o ST) enterotoxigénica,Escherichia coli0157:H7,Helicobacter pylori, Klebsiella pneumonia, Lysteria monocytogenes, Plesiomonas shigelloides, Salmonellaspp.,Salmonella typhi,Shigellaspp.,Staphylococcus, Staphylococcus aureus,resistente a vancomicinaEnterococcusspp.,Vibriospp.,Vibrio cholerae,Vibrio parahaemolyticus,Vibrio vulnificus,yYersinia enterocolitica.

En una realización, el patógeno puede serClostridium difficile, Salmonellaspp.,Escherichia coli,patogénica,Enterobacteriaceae(CRE) resistentes a carbapenémicos, enterococos resistentes a beta-lactámicos de espectro extendido (ESBL) y enterococos resistentes a vancomicina (VRE). En todavía otra realización, el patógeno puede serClostridium difficile.

Las presentes composiciones bacterianas pueden resultar útiles en una variedad de situaciones clínicas. Por ejemplo, las composiciones bacterianas pueden administrarse solas, como un tratamiento complementario a los antibióticos (p. ej., cuando un sujeto está sufriendo una infección aguda, para reducir el riesgo de recurrencia después de que la infección aguda haya disminuido, o en previsión de que un sujeto esté en estrecha proximidad a otras personas con o en riesgo de infecciones gastrointestinales graves (médicos, enfermeras, trabajadores hospitalarios, familiares de aquellos que están enfermos u hospitalizados).

Las presentes composiciones bacterianas pueden administrarse a animales, incluidos seres humanos, animales de laboratorio (p. ej., primates, ratas y ratones), ganado (p. ej., vacas, ovejas, cabras y cerdos), aves de corral (pavos y pollos) y animales de compañía (p. ej., perros, gatos y roedores).

Las composiciones bacterianas presentes pueden administrarse por vía enteral, en otras palabras, a través de una ruta de acceso al tracto gastrointestinal. Lo anterior incluye la administración oral, la administración rectal (incluyendo enema, supositorio o colonoscopia), mediante un tubo oral o nasal (nasogástrico, nasoentérico, gástrico oral o yeyunal oral), tal como se detalla en mayor detalle en la presente memoria.

Se ha informado que una disbiosis GI está asociada a la diabetes (Qin et al., 2012. Nature 490:55). En algunos casos, una composición proporcionada en la presente memoria puede utilizarse para alterar la microbiota de un sujeto que presenta o es susceptible a la diabetes. Normalmente, dicha composición proporciona por lo menos una, dos o tres UTO identificadas en la técnica como asociadas a una mejora de la sensibilidad a la insulina u otro signo o síntoma asociado a la diabetes, p. ej., diabetes tipo 2 o tipo 1. En algunos casos, la composición está asociada a un aumento en el injerto y/o potenciación de por lo menos una, dos o tres UTO asociadas a una mejora en por lo menos un signo o síntoma de diabetes.

Protocolos de pretratamiento

Antes de la administración de la composición bacteriana, el sujeto opcionalmente puede seguir un protocolo de pretratamiento para preparar el tracto gastrointestinal para recibir la composición bacteriana. En determinadas realizaciones, el protocolo de pretratamiento es recomendable, tal como cuando un sujeto presenta una infección aguda con un patógeno altamente resistente. En otras realizaciones, el protocolo de pretratamiento es completamente opcional, tal como cuando el patógeno que causa la infección no es resistente, o el sujeto ha tenido una infección aguda que se ha tratado con éxito, pero el médico está preocupado de que la infección pueda recurrir. En estos casos, el protocolo de pretratamiento puede mejorar la capacidad de la composición bacteriana de presentar un efecto sobre el microbioma del sujeto.

A modo de forma de preparación del sujeto para la administración del ecosistema microbiano, se puede administrar por lo menos un antibiótico para alterar las bacterias en el sujeto. A modo de otra forma de preparar al sujeto para la administración del ecosistema microbiano, se puede administrar una preparación estándar de limpieza del colon al sujeto para vaciar sustancialmente el contenido del colon, tal como se utiliza para preparar a un sujeto para una colonoscopia. La expresión "vaciar sustancialmente el contenido del colon" en la presente solicitud se refiere a eliminar por lo menos el 75 %, por lo menos el 80 %, por lo menos el 90 %, por lo menos el 95 % o aproximadamente el 100 % del contenido del volumen habitual contenido en el colon. El tratamiento con antibióticos puede preceder al protocolo de limpieza intestinal.

Si un sujeto ha recibido un antibiótico para el tratamiento de una infección, o si un sujeto ha recibido un antibiótico como parte de un protocolo de pretratamiento específico, en una realización, debe interrumpirse el antibiótico con suficiente antelación para permitir que la concentración del antibiótico se reduzca sustancialmente en el intestino antes de administrar la composición bacteriana. En una realización, el antibiótico puede interrumpirse 1, 2 o 3 días antes de la administración de la composición bacteriana. En una realización, el antibiótico puede interrumpirse 3, 4, 5, 6 o 7 semividas del antibiótico antes de la administración de la composición bacteriana. En otra realización, el antibiótico puede seleccionarse de manera que los constituyentes en la composición bacteriana presenten una concentración inhibitoria mínima al 50 % (CIM50) que sea mayor que la concentración del antibiótico en el intestino.

La CIM50de una composición bacteriana o de los elementos en la composición puede determinarse mediante métodos bien conocidos de la técnica. Reller et al., Antimicrobial Susceptibility Testing: A Review of General Principles and Contemporary Practices, Clinical Infectious Diseases 49(11):1749-1755 (2009). En este tipo de realización, no resulta necesario el tiempo adicional entre la administración de antibiótico y la administración de la composición bacteriana. Si el protocolo de pretratamiento es parte del tratamiento de una infección aguda, se puede seleccionar el antibiótico de manera que la infección sea sensible al antibiótico, pero los componentes de la composición bacteriana no sean sensibles al antibiótico.

Vías de administración

Las composiciones bacterianas de la exposición resultan adecuadas para la administración a mamíferos y animales no mamíferos que lo requieran. En determinadas realizaciones, el sujeto mamífero es un sujeto humano que presenta uno o más síntomas de disbiosis.

Cuando el sujeto mamífero sufre de una enfermedad, trastorno o afección caracterizada por una microbiota aberrante, las composiciones bacterianas indicadas en la presente memoria resultan adecuadas para el tratamiento del mismo.

En algunas realizaciones, el sujeto mamífero no ha recibido antibióticos antes del tratamiento con las composiciones bacterianas. Por ejemplo, el sujeto mamífero no ha recibido por lo menos dos dosis de vancomicina, metronidazol y/o un compuesto antibiótico similar en la semana previa a la administración de la composición terapéutica. En otras realizaciones, el sujeto mamífero no ha recibido previamente un compuesto antibiótico en el mes anterior a la administración de la composición terapéutica. En otras realizaciones, el sujeto mamífero ha recibido uno o más tratamientos con uno o más compuestos antibióticos diferentes y dicho tratamiento o tratamientos no resultaron en ninguna mejora o en un empeoramiento de los síntomas.

En algunas realizaciones, la enfermedad, trastorno o afección gastrointestinal es la diarrea causada porC. difficile, incluyendo la infección recurrente porC. difficile, colitis ulcerosa, colitis, enfermedad de Crohn o síndrome del intestino irritable. Beneficiosamente, la composición terapéutica se administra solo una vez antes de la mejora de la enfermedad, trastorno o afección. En algunas realizaciones, la composición terapéutica se administra a intervalos superiores a dos días, tal como una vez cada tres, cuatro, cinco o seis días, o cada semana o menos frecuentemente que cada semana. O la preparación puede administrarse intermitentemente de acuerdo con un régimen establecido, p. ej., una vez al día, una vez a la semana, o una vez al mes, o cuando el sujeto recaiga de la enfermedad primaria. En otra realización, la preparación puede administrarse a largo plazo a sujetos que están en riesgo de infección por estos patógenos, o que pueden ser portadores de ellos, incluyendo sujetos que se someterán a un procedimiento médico invasivo (tal como cirugía), que serán hospitalizados, que viven en un centro de atención a largo plazo o de rehabilitación, que están expuestos a patógenos en virtud de su profesión (ganaderos y trabajadores en el procesamiento de animales), o que podrían ser portadores de patógenos (incluyendo trabajadores hospitalarios tales como personal médico, de enfermería y otros profesionales sanitarios).

En realizaciones, la composición bacteriana se administra por vía enteral. Lo anterior incluye preferentemente la administración oral, o mediante un tubo oral o nasal (incluyendo nasogástrico, nasoyeyunal, gástrico oral o yeyunal oral). En otras realizaciones, la administración incluye la administración rectal (incluyendo enema, supositorio o colonoscopia). La composición bacteriana puede administrarse en por lo menos una región del tracto gastrointestinal, incluyendo la boca, el esófago, el estómago, el intestino delgado, el intestino grueso y el recto. En algunas realizaciones se administra en todas las regiones del tracto gastrointestinal. Las composiciones bacterianas pueden administrarse por vía oral en forma de medicamentos, tales como polvos, cápsulas, tabletas, geles o líquidos. Las composiciones bacterianas también pueden administrarse en forma de gel o líquido por vía oral o a través de una sonda nasogástrica, o por vía rectal en forma de gel o líquido, mediante un enema o instilación a través de un colonoscopio o mediante un supositorio.

Si la composición se administra en una colonoscopia y, opcionalmente, si la composición bacteriana se administra por otras vías rectales (tales como un enema o supositorio) o incluso si el sujeto ha recibido una administración oral, el sujeto podría someterse a una preparación de limpieza del colon. La preparación para la limpieza del colon puede facilitar el uso adecuado del colonoscopio u otros dispositivos de administración, pero incluso cuando no cumple una función mecánica, también puede maximizar la proporción de la composición bacteriana en relación con otros organismos que residían previamente en el tracto gastrointestinal del sujeto. Puede utilizarse cualquier preparación de limpieza de colon normalmente aceptable, tal como las que se proporcionan típicamente cuando un sujeto se somete a una colonoscopia.

Dosis y régimen de administración

En algunas realizaciones, las bacterias y composiciones bacterianas se proporcionan en una forma de dosificación. En algunas realizaciones, la forma de dosis está diseñada para la administración de por lo menos una UTO o combinación de las mismas dada a conocer en la presente memoria, en donde la cantidad total de composición bacteriana administrada se selecciona de 0,1 ng a 10 g, de 10 ng a 1 g, de 100 ng a 0,1 g, de 0,1 mg a 500 mg, de 1 mg a 100 mg, o de 10 a 15 mg. En algunas realizaciones, la composición bacteriana se consume a una tasa de entre 0,1 ng y 10 g al día, de 10 ng a 1 g al día, de 100 ng a 0,1 g al día, de 0,1 mg a 500 mg al día, de 1 mg a 100 mg al día, o de 10 a 15 mg al día, o más.

En algunas realizaciones, el período de tratamiento es de por lo menos 1 día, por lo menos 2 días, por lo menos 3 días, por lo menos 4 días, por lo menos 5 días, por lo menos 6 días, por lo menos 1 semana, por lo menos 2 semanas, por lo menos 3 semanas, por lo menos 4 semanas, por lo menos 1 mes, por lo menos 2 meses, por lo menos 3 meses, por lo menos 4 meses, por lo menos 5 meses, por lo menos 6 meses, o por lo menos 1 año. En algunas realizaciones, el período de tratamiento es de 1 día a 1 semana, de 1 semana a 4 semanas, de 1 mes a 3 meses, de 3 meses a 6 meses, de 6 meses a 1 año, o durante más de un año.

En una realización, se pueden administrar entre 10<5>y 10<12>microorganismos en total al sujeto en una forma de dosificación dada. En un modo, se puede proporcionar una cantidad eficaz de 1 a 500 ml o de 1 a 500 gramos de la composición bacteriana que presenta entre 10<7>y 10<11>bacterias por ml o por gramo, o una cápsula, tableta o supositorio que presenta entre 1 mg y 1.000 mg de polvos liofilizados que contienen entre 10<7>y 10<11>bacterias. Los que reciben tratamiento agudo pueden recibir dosis más altas que aquellos que están recibiendo una administración crónica (tal como los trabajadores de hospitales o aquellos ingresados en instalaciones de atención a largo plazo).

Cualquiera de las preparaciones descritas en la presente memoria puede administrarse una vez en una sola ocasión o en múltiples ocasiones, tal como una vez al día durante varios días o más de una vez al día en el día de la administración (incluyendo dos veces al día, tres veces al día o hasta cinco veces al día). O la preparación puede administrarse intermitentemente de acuerdo con un régimen establecido, p. ej., una vez a la semana, una vez al mes, o cuando el sujeto sufra una recaída de la enfermedad primaria. En otra realización, la preparación puede administrarse a largo plazo a sujetos que presentan un riesgo de infección por estos patógenos, o que pueden ser portadores de ellos, incluyendo sujetos que se someterán a un procedimiento médico invasivo (tal como cirugía), que serán hospitalizados, que viven en un centro de atención a largo plazo o de rehabilitación, que están expuestos a patógenos en virtud de su profesión (ganaderos y trabajadores en el procesamiento de animales), o que podrían ser portadores de patógenos (incluyendo trabajadores hospitalarios tales como personal médico, de enfermería y otros profesionales sanitarios).

Selección de sujetos

Se pueden seleccionar composiciones bacterianas particulares para sujetos individuales o para sujetos con perfiles particulares. Por ejemplo, se puede realizar secuenciación de 16S para un sujeto determinado con el fin de identificar las bacterias presentes en su microbiota. La secuenciación puede perfilar todo el microbioma del sujeto utilizando la secuenciación de 16S (hasta el nivel de familia, género o especie), una porción del microbioma del sujeto utilizando la secuenciación de 16S, o puede usarse para detectar la presencia o ausencia de bacterias candidatas específicas que son biomarcadores de salud o de un estado de enfermedad particular, tales como marcadores de organismos multirresistentes o géneros específicos de interés, tales comoEscherichia.Basándose en los datos de biomarcadores, se puede seleccionar una composición particular para su administración a un sujeto a fin de suplementar o complementar la microbiota de un sujeto con el fin de restaurar la salud o tratar o prevenir enfermedades. En otra realización, se pueden evaluar a los sujetos para determinar la composición de su microbiota y determinar de esta manera la probabilidad de que el tratamiento tenga éxito.

Terapia de combinación

Las composiciones bacterianas pueden administrarse con otros agentes en un modo de terapia combinada, incluyendo agentes antimicrobianos y prebióticos. La administración puede ser secuencial, durante un período de horas o días, o simultánea.

En una realización, las composiciones bacterianas se incluyen en una terapia combinada con uno o más agentes antimicrobianos, que incluyen agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, agentes antivirales y agentes antiparasitarios.

Entre los agentes antibacterianos se incluyen antibióticos cefalosporínicos (cefalexina, cefuroxima, cefadroxilo, cefazolina, cefalotina, cefaclor, cefamandol, cefoxitina, cefprozilo y ceftobiprol); antibióticos fluoroquinolónicos (ciprofloxacino, Levaquin, floxina, tequin, avelox y norfloxacino); antibióticos tetraciclínicos (tetraciclina, minociclina, oxitetraciclina y doxiciclina); antibióticos penicilínicos (amoxicilina, ampicilina, penicilina V, dicloxacilina, carbenicilina, vancomicina y meticilina); y antibióticos carbapenémicos (ertapenem, doripenem, imipenem/cilastatina y meropenem). Entre los agentes antivirales se incluyen abacavir, aciclovir, adefovir, amprenavir, atazanavir, cidofovir, darunavir, delavirdina, didanosina, docosanol, efavirenz, elvitegravir, emtricitabina, enfuvirtida, etravirina, famciclovir, foscarnet, fomivirsen, ganciclovir, indinavir, idoxuridina, lamivudina, lopinavir, maraviroc, MK-2048, nelfinavir, nevirapina, penciclovir, raltegravir, rilpivirina, ritonavir, saquinavir, estavudina, tenofovir, trifluridina, valaciclovir, valganciclovir, vidarabina, ibacitabina, amantadina, oseltamivir, rimantidina, iipranavir, zalcitabina, zanamivir y zidovudina.

Entre los ejemplos de compuestos antifúngicos se incluyen, aunque sin limitación, los antifúngicos polienos, tales como natamicina, rimocidina, filipina, nistatina, anfotericina B, candidicina y hamicina; antifúngicos imidazoles, tales como miconazol, ketoconazol, clotrimazol, econazol, omoconazol, bifonazol, butoconazol, fenticonazol, isoconazol, oxiconazol, sertaconazol, sulconazol y tioconazol; antifúngicos triazoles, tales como fluconazol, itraconazol, isavuconazol, ravuconazol, posaconazol, voriconazol, terconazol y albaconazol; antifúngicos tiazoles, tales como abafungina; antifúngicos alilaminas, tales como terbinafina, naftifina y butenafina; y antifúngicos equinocandinas, tales como anidulafungina, caspofungina y micafungina. Entre otros compuestos que presentan propiedades antifúngicas se incluyen, aunque sin limitación, poligodal, ácido benzoico, ciclopirox, tolnaftato, ácido undecilénico, flucitosina o 5-fluorocitosina, griseofulvina y haloprogin.

En una realización, las composiciones bacterianas se incluyen en una terapia combinada con uno o más corticosteroides, mesalazina, mesalamina, sulfasalazina, derivados de sulfasalazina, medicamentos inmunosupresores, ciclosporina A, mercaptopurina, azatioprina, prednisona, metotrexato, antihistamínicos, glucocorticoides, epinefrina, teofilina, sodio cromoglicato, anti-leucotrienos, medicamentos anticolinérgicos para la rinitis, descongestionantes anticolinérgicos, estabilizadores de mastocitos, anticuerpos monoclonales anti-IgE, vacunas, y combinaciones de los mismos.

Un prebiótico es un ingrediente fermentado selectivamente que permite cambios específicos, tanto en la composición como en la actividad de la microbiota gastrointestinal, que confieren beneficios al bienestar y la salud del huésped. Los prebióticos pueden incluir carbohidratos complejos, aminoácidos, péptidos u otros componentes nutricionales esenciales para la supervivencia de la composición bacteriana. Entre los prebióticos se incluyen, aunque sin limitación, aminoácidos, biotina, fructooligosacáridos, galactooligosacáridos, inulina, lactulosa, oligosacáridos de manano, inulina enriquecida con oligofructosa, oligofructosa, oligodextrosa, tagatosa, trans-galactooligosacárido y xilooligosacáridos.

Métodos para la caracterización de las composiciones bacterianas

En la presente memoria se dan a conocer los métodos para someter a ensayo determinadas características de las composiciones bacterianas. Por ejemplo, se puede determinar la sensibilidad de las composiciones bacterianas a determinadas variables ambientales, p. ej., con el fin de seleccionar características particulares deseables en una composición, formulación y/o uso dados. Por ejemplo, los constituyentes de la composición bacteriana pueden evaluarse para resistencia al pH, resistencia a los ácidos biliares y/o sensibilidad a los antibióticos, ya sea individualmente, es decir constituyente a constituyente, o colectivamente como una composición bacteriana compuesta de múltiples constituyentes bacterianos (denominados colectivamente en esta sección como "composición bacteriana").

Ensayos de sensibilidad al pH.Si se administra una composición bacteriana de manera diferente a la colon o recto (es decir, a través, por ejemplo, aunque sin limitación, por vía oral), los ensayos opcionales de resistencia al pH mejora la selección de composiciones bacterianas que sobrevivirán con el mayor rendimiento posible a los diversos entornos de pH de las distintas regiones del tracto gastrointestinal. Entender cómo las composiciones bacterianas reaccionan al pH del tracto gastrointestinal también ayuda en la formulación, de modo que el número de bacterias en una forma de dosificación pueda aumentarse si resulta beneficioso y/o para que la composición pueda administrarse en una cápsula o tableta recubierta entérica o con una composición tamponadora o protectora. Debido a que el pH del estómago puede caer a pH 1 a 2 después de una comida alta en proteínas durante un corto tiempo antes de que los mecanismos fisiológicos lo ajusten a un pH de 3 a 4, y a que frecuentemente se mantiene en un pH en reposo de 4 a 5, y dado que el pH del intestino delgado puede variar entre un pH de 6 y 7,4, se pueden preparar composiciones bacterianas que sobrevivan a estos intervalos de pH variables (específicamente en los que por lo menos 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o hasta el 100 % de las bacterias puedan sobrevivir a los tiempos de tránsito intestinal a través de diversos intervalos de pH). Lo anterior puede someterse a ensayo mediante la exposición de la composición bacteriana a diferentes intervalos de pH durante los tiempos de tránsito intestinal esperados a través de esos intervalos de pH. Por lo tanto, a modo de un ejemplo no limitativo únicamente, los cultivos de 18 horas de composiciones bacterianas pueden cultivarse en medios estándares, tales como el medio de microbiota intestinal ("MMI", ver Goodman et al., Extensive personal human gut microbiota culture collections characterized and manipulated in gnotobiotic mice, PNAS 108(15):6252-6257 (2011)) u otro medio libre de productos animales, con la adición de agentes ajustadores del pH para un pH de entre 1 y 2 durante 30 minutos, un pH de entre 3 y 4 durante una hora, un pH de entre 4 y 5 durante una a dos horas, y un pH de entre 6 y 7,4 durante 2,5 a 3 horas. Se describe un método alternativo para someter a ensayo la estabilidad frente al ácido en la patente US n.º 4.839.281. La supervivencia de las bacterias puede determinarse mediante el cultivo de las bacterias y realizando un recuento de las colonias en medios selectivos o no selectivos apropiados.

Ensayos de sensibilidad a ácidos biliares.Además, los ensayos de resistencia a los ácidos biliares pueden mejorar la selección de composiciones bacterianas que sobrevivirán a las exposiciones a los ácidos biliares durante el tránsito a través del tracto GI. Los ácidos biliares se secretan en el intestino delgado y pueden, al igual que el pH, afectar la supervivencia de las composiciones bacterianas. Lo anterior puede someterse a ensayo mediante la exposición de las composiciones bacterianas a los ácidos biliares durante el tiempo esperado de exposición intestinal de los mismo. Por ejemplo, las soluciones de ácidos biliares pueden prepararse a las concentraciones deseadas utilizando Tris 0,05 mM a pH 9 como el solvente. Después de disolver los ácidos biliares, se puede ajustar el pH de la solución a 7,2 con HCl al 10 %. Las composiciones bacterianas pueden cultivarse en 2.2 ml de una composición de ácido biliar que imite la concentración y el tipo de ácidos biliares en el sujeto, 1,0 ml de medio de heces filtrado a esterilidad al 10 % y 0,1 ml de un cultivo de 18 horas de la cepa bacteriana dada. Las incubaciones pueden llevarse a cabo durante 2,5 a 3 horas o más tiempo. Se describe un método alternativo para someter a ensayo la estabilidad frente a ácidos biliares en la patente US n.º 4.839.281. La supervivencia de las bacterias puede determinarse mediante el cultivo de las bacterias y realizando un recuento de las colonias en medios selectivos o no selectivos apropiados.

Ensayos de sensibilidad a antibióticos.A modo de un ensayo opcional adicional de sensibilidad, se pueden evaluar las composiciones bacterianas para la sensibilidad a los antibióticos. En una realización, las composiciones bacterianas pueden seleccionarse de tal manera que los constituyentes bacterianos sean sensibles a los antibióticos, de modo que, si resulta necesario, puedan ser eliminados o sustancialmente reducidos del tracto gastrointestinal del sujeto mediante por lo menos un antibiótico con diana en la composición bacteriana.

Adherencia a las células gastrointestinales.Las composiciones bacterianas pueden someterse a ensayo opcionalmente para su capacidad de adherirse a las células gastrointestinales. Se describe un método para someter a ensayo la adherencia a las células gastrointestinales en la patente US n.º 4.839.281.

La especificación se entiende más completamente a la luz de las enseñanzas de las referencias citadas dentro de la especificación. Las realizaciones dentro de la especificación proporcionan una ilustración de las realizaciones y no deben interpretarse como limitativas del alcance. El experto en la materia reconocerá fácilmente que están comprendidas muchas otras realizaciones. En la medida en que cualquier material en las publicaciones y patentes citadas en la presente memoria contradiga o sea inconsistente con la presente especificación, la especificación prevalecerá sobre cualquier material de este tipo. La cita cualquier referencia en la presente memoria no es una admisión de que tales referencias son técnica anterior.

A menos que se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, condiciones de reacción, etc., utilizados en la especificación, incluidas las reivindicaciones, deben entenderse como modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". De acuerdo con lo anterior, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos son aproximaciones y pueden variar según las propiedades deseadas que se busque obtener. Como mínimo, y no como un intento de limitar la aplicación de la doctrina de equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico debe interpretarse a la luz del número de cifras significativas y los enfoques de redondeo habituales.

Salvo que se indique lo contrario, la expresión "por lo menos" que precede a una serie de elementos debe entenderse como referida a cada elemento en la serie.

Ejemplos

A continuación se presentan ejemplos de casos específicos para llevar a cabo la presente exposición. Los ejemplos se ofrecen únicamente con fines ilustrativos y no pretenden ser limitativos del alcance de la presente invención en modo alguno. Se han realizado esfuerzos para garantizar la exactitud con respecto a los números (p. ej., cantidades, temperatura, etc.), aunque se debe considerar la existencia de algunos errores y desviaciones. Pueden encontrarse ejemplos de las técnicas y protocolos descritos en la presente memoria con respecto a las composiciones terapéuticas en, p. ej.,Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. (ed), 1980.

Ejemplo 1. Construcción de pares binarios en un formato/preparación de placa de 96 pocillos de alto rendimiento.Se utilizaron pares de bacterias para identificar pares binarios útiles para la inhibición deC. difficile.Para preparar placas para el ensayo de cribado de alto rendimiento de pares binarios, se descongelaron viales de bancos de bacterias en glicerol a -80 °C y se diluyeron a 1x10<8>UFC/ml. A continuación, se diluyó 10x cada cepa bacteriana (a una concentración final de 1x10<7>UFC/ml de cada cepa) en 200 µl de PBS 15 % de glicerol en los pocillos de una placa de 96 pocillos. Las placas se congelaron a -80 °C. En caso necesario, las placas se retiraron de -80 °C y se descongelaron a temperatura ambiente bajo condiciones anaerobias para llevar a cabo ensayos en un ensayo CivSim conC. difficile.

Ejemplo 2. Construcción de combinaciones ternarias en un formato de 96 pocillos de alto rendimiento.

Se utilizaron combinaciones de tripletes de bacterias para identificar combinaciones ternarias útiles para la inhibición deC. difficile. Para preparar placas para la selección de alto rendimiento de combinaciones ternarias, se descongelaron viales de bancos de cultivo bacteriano en glicerol a -80 °C y se diluyeron a 1x10<8>UFC/ml. A continuación, se diluyó 10x cada cepa bacteriana (a una concentración final de 1x10<7>UFC/ml de cada cepa) en 200 µl de PBS 15 % de glicerol en los pocillos de una placa de 96 pocillos. Seguidamente, las placas se congelaron a -80 °C. En caso necesario, las placas se retiraron de -80 °C y se descongelaron a temperatura ambiente bajo condiciones anaerobias para llevar a cabo ensayos en un ensayo CivSim conClostridium difficile.

Ejemplo 3. Construcción de un ensayo CivSim para el cribado de composiciones bacterianas inhibitorias del crecimiento de Clostridium difficile.

Se utilizó un ensayo de competencia (ensayo CivSim) para identificar composiciones que podían inhibir el crecimiento deC. difficile. En resumen, se cultivó un cultivo de durante la noche deC. difficilebajo condiciones anaerobias en SweetB-FosIn para el crecimiento deC. difficile.En algunos casos, se pueden utilizar otros medios adecuados. SweetB-FosIn es una versión de BHI (Remel R452472) suplementada con varios componentes de la siguiente manera: Componentes por litro: 37 g de polvos de infusión de cerebro-corazón (BHI, por sus siglas en inglés) (Remel R452472), suplementado con 5 g de extracto de levadura UF (Difco 210929), 1 g de cisteína-HCl (Spectrum C1473), 1 g de celobiosa (Sigma C7252), 1 g de maltosa (Spectrum MA155), 1,5 ml de solución de hemina, 1 g de almidón soluble (Sigma-Aldrich S9765), 1 g de fructooligosacáridos/inulina (Jarrow Formulas 103025) y 50 ml de MOPS/KOH 1 M a pH 7. Para preparar la solución de hemina, se disolvió hemina (Sigma 51280) en NaOH 0,1 M para preparar una solución madre de 10 mg/ml.

Después de 24 horas de crecimiento, el cultivo se diluyó 100.000 veces en un medio complejo denominado SweetB-FosIn. En algunas realizaciones se selecciona un medio para la utilización en el que pueden crecer todos los organismos deseados, es decir, que resulta adecuado para el crecimiento de una amplia variedad de especies bacterianas anaerobias y, en algunos casos, facultativas anaerobias. La mezcla diluida deC. difficilese dividió equitativamente en los pocillos de una placa de 96 pocillos (180 µl en cada pocillo). Se añadieron 20 μl de una composición bacteriana a cada pocillo a una concentración final de 1x10<6>UFC/ml de cada una o de dos o tres especies. Alternativamente, el ensayo se puede someter a ensayo con pares binarios a diferentes concentraciones iniciales (1x10<9>UFC/ml, 1x10<8>UFC/ml, 1x10<7>UFC/ml, 1x10<5>UFC/ml, 1x10<4>UFC/ml, 1x10<3>UFC/ml, 1x10<2>UFC/ml). Se incluyeron pocillos de control solo inoculados conC. difficilepara una comparación con el crecimiento deC. difficilesin inhibición. Se utilizaron pocillos adicionales como controles ya sea inhibitorios o no inhibitorios del crecimiento deC. difficile.Un ejemplo de un control positivo que inhibía el crecimiento era una combinación deBlautia producta, Clostridium bifermentansyEscherichia coli.Un ejemplo de un control que mostraba una inhibición reducida del crecimiento deC. difficileera una combinación deBacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides ovatusyBacteroides vulgatus.Se envolvieron las placas con Parafilm y se incubaron durante 24 horas a 37 °C bajo condiciones anaerobias. Después de 24 horas, los pocillos que conteníanC. difficilesolo fueron diluidos en serie y sembrados para determinar el título. A continuación, la placa de 96 pocillos se congeló a -80 °C antes de cuantificarC. difficilemediante un ensayo de qPCR (ver el Ejemplo 6). Las combinaciones experimentales que inhibenC. difficileen este ensayo resultan útiles en composiciones para la prevención o el tratamiento de la infección porC. difficile.

Ejemplo 4. Construcción de un ensayo CivSim para seleccionar composiciones bacterianas que produzcan productos dispersables inhibitorios del crecimiento de Clostridium difficile utilizando un inserto de filtro.

Para identificar composiciones bacterianas que pueden producir productos difusibles que inhibenC. difficile, se diseñó un ensayo CivSim modificado. En este experimento, se modificó el ensayo CivSim descrito anteriormente mediante la utilización de un inserto de filtro de 0,22 µm (placas de ensayo MultiScreen<TM>Millipore<TM>de 96 pocillos - artículo n.º MAGVS2210) en formato de 96 pocillos para separar físicamenteC. difficilede las composiciones bacterianas. ElC. difficilese dividió en alícuotas en la placa de 96 pocillos, mientras que las composiciones bacterianas se dividieron en alícuotas en medio sobre la superposición de filtro. El medio de cultivo/nutriente estaba en contacto por ambas caras del filtro de 0,22 µm, permitiendo el intercambio de nutrientes, pequeñas moléculas y muchas macromoléculas (p. ej., bacteriocinas, proteínas de superficie celular o polisacáridos) por difusión. En la presente realización, después de un periodo de incubación de 24 horas, se retiró el inserto de filtro que contenía las composiciones bacterianas. La placa que conteníaC. difficilese transfirió a continuación a un lector de placas de 96 pocillos adecuado para medir la densidad óptica (DO) a 600 nm. Se comparó el crecimiento deC. difficileen presencia de diferentes composiciones bacterianas basándose en las mediciones de DO. Los resultados de estos experimentos demostraron que se pueden identificar composiciones que pueden inhibirC. difficilecuando se cultivan en un medio compartido bajo condiciones que no permiten el contacto entre las bacterias en la composición yC. difficile. Tales composiciones son candidatas para producir productos difusibles que resultan eficaces para tratar la infección porC. difficiley que pueden servir como parte de un procedimiento de aislamiento de tales productos difusibles, p. ej., para la utilización en el tratamiento de infecciones.

Ejemplo 5. Construcción de un ensayo CivSim para el cribado de composiciones bacterianas inhibitorias del crecimiento de Clostridium difficile utilizando medios selectivos para Clostridium difficile para la cuantificación.

El ensayo CivSim descrito anteriormente puede modificarse para determinar el título final deC. difficilemediante diluciones seriadas y siembra en medios selectivos paraC. difficile(Bloedt et al.2009), tales como CCFA (agar de fructosa-cicloserina-cefoxitina, Anaerobe Systems), CDSA (agar selectivo paraClostridium difficile, que es un agar de cicloserina-cefoxitina-manitol, Becton Dickinson).

Ejemplo 6. Cuantificación de C. difficile utilizando PCR cuantitativa (qPCR).

A. Preparación de curva patrón

Para cuantificarC. difficile,se generó una curva patrón a partir de un pocillo en cada placa de ensayo en, p. ej., un ensayo CivSim, que contenía soloC. difficilepatogénico cultivado en medio SweetB FosIn tal como se proporciona en la presente memoria y se cuantificó mediante la siembra puntual selectiva de placas. Se llevaron a cabo diluciones en serie del cultivo en solución salina tamponada con fosfato estéril. Se extrajo el ADN genómico de las muestras de la curva patrón junto con el ADN de los otros pocillos.

B. Extracción de ADN genómico

Se extrajo el ADN genómico de 5 µl de cada muestra utilizando un protocolo de dilución, congelación/descongelación y lisis por calor. Se añadieron 5 µl de las muestras descongeladas a 45 µl de agua UltraPure (Life Technologies, Carlsbad, CA) y se mezclaron mediante pipeteo. Las placas con muestras diluidas se congelaron a -20 °C hasta la utilización para qPCR, que incluyó una etapa de lisis bajo calentamiento antes de la amplificación. Alternativamente, el ADN genómico puede extraerse utilizando el kit de aislamiento de ADN de suelo Mo Bio Powersoil<®>-htp de 96 pocillos (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA), el kit de aislamiento de ADN Mo Bio Powersoil<®>(Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA), o el minikit de ADN fecal QIAamp (QIAGEN, Valencia, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. C. Composición y condiciones de qPCR

La mezcla de reacción qPCR contenía 1x SsoAdvanced Universal Probes Supermix, 900 nM del cebador Wr-tcdB-F (AGCAGTTGAATATAGTGGTTTAGTTAGAGTTG, IDT, Coralville, IA), 900 nM del cebador Wr-tcdB-R (CATGCTTTTTTAGTTTCTGGATTGAA, IDT, Coralville, IA), 250 nM de la sonda Wr-tcdB-P (6FAM-CATCCAGTCTCAATTGTATATGTTTCTCCA-MGB, Life Technologies, Grand Island, NY), y agua de grado de biología molecular (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA) hasta 18 µl (cebadores adaptados de: Wroblewski, D. et al., Rapid Molecular Characterization of Clostridium difficile and Assessment of Populations of C. difficile in Stool Specimens, Journal of Clinical Microbiology 47:2142-2148 (2009)). Esta mezcla de reacción se dividió en alícuotas en pocillos de una placa de PCR de 96 pocillos con faldón, de pared delgada y perfil bajo, de cubierta dura (BioRad, Hercules, CA). Se añadieron 2 µl de las muestras diluidas, congeladas y descongeladas a esta mezcla de reacción y la placa se selló con un sello adhesivo Microseal 'B' (BioRad, Hercules, CA). El qPCR se llevó a cabo en un termociclador BioRad C1000<TM>dotado de un sistema en tiempo real CFX96<™>(BioRad, Hercules, CA). Las condiciones de termociclado fueron 95 °C durante 15 minutos, seguido de 45 ciclos de 95 °C durante 5 segundos, 60 °C durante 30 segundos y lecturas fluorescentes del canal FAM. Alternativamente, la qPCR podría llevarse a cabo con otros métodos estándares conocidos por el experto en la materia.

D. Análisis de los datos

El valor de Cq para cada pocillo en el canal FAM se determinó con el software CFX Manager<™>3.0. El log10(UFC/ml) de cada muestra experimental se calculó mediante la introducción del valor de Cq de una muestra determinada en el modelo de regresión lineal generado a partir de la curva patrón comparando los valores de Cq de los pocillos de la curva patrón con el log10(UFC/ml) conocido de esas muestras. La inhibición del logaritmo se calculó para cada muestra mediante la resta del log10(UFC/ml) deC. difficileen la muestra del log10(UFC/ml) deC. difficileen la muestra en cada placa de ensayo utilizada para la generación de la curva patrón a la que no se habían añadido bacterias adicionales. La media del logaritmo de inhibición se calculó para todas las réplicas de cada composición.

Se representó un histograma del intervalo y desviación estándar de cada composición. Se examinaron los intervalos o desviaciones estándar de las inhibiciones logarítmicas que eran distintas de la distribución general como posibles valores atípicos. Si la eliminación de un único dato logarítmico de inhibición de uno de los pares binarios identificados en los histogramas alineara el intervalo o la desviación estándar con los de la mayoría de muestras, ese dato se eliminaba como valor atípico y se recalculaba la media de inhibición logarítmica.

La varianza agrupada de todas las muestras evaluadas en el ensayo se estimó como el promedio de las varianzas de las muestras ponderadas por los grados de libertad de las mismas. El error estándar agrupado seguidamente se calculó como la raíz cuadrada de la varianza agrupada dividida por la raíz cuadrada del número de muestras. Los intervalos de confianza para la hipótesis nula se determinaron mediante multiplicación del error estándar agrupado por la puntuación z correspondiente a un porcentaje umbral dado. Las inhibiciones logarítmicas medias fuera del intervalo de confianza se consideraron inhibitorias si eran positivas, o estimulatorias si eran negativas, con el porcentaje de confianza correspondiente al intervalo utilizado. Las muestras con una media de inhibición logarítmica superior al intervalo de confianza al 99 % (I.C.) de la hipótesis nula se informan como +++; aquellas con un I.C. entre el 95 % y el 99 % como ++; aquellas con un I.C. entre el 90 % y el 95 % como +; aquellas con un I.C. entre el 80 % y el 90 %, como , mientras que las muestras con una media de inhibición logarítmica inferior al intervalo de confianza (I.C.) al 99 % de la hipótesis nula se informaron como +++; aquellas con un I.C. entre el 95 % y el 99 %, como +; aquellas con un I.C. entre el 90 % y el 95 %, como +; aquellas con un I.C. entre el 80 % y el 90 %, como

Ejemplo 7. Inhibición del crecimiento de C. difficile mediante composiciones bacterianas

Utilizando los métodos descritos en la presente memoria, se identificaron pares binarios que pueden inhibirC. difficile(ver la Tabla 4).622 de 989 combinaciones mostraron una inhibición con un intervalo de confianza >80 %; 545 de 989 con un I.C. >90 %; 507 de 989 con un I.C. >95 %; 430 de 989 con un I.C. >99 %. Entre los pares binarios no limitativos aunque de ejemplo se incluyen aquellos con una reducción logarítmica media superior a 0,366, p. ej.,Allistipes shahiiemparejado conBlautia producta, Clostridium hathaweyi,oCollinsella aerofaciens,oClostridium mayombeiemparejado conC.innocuum, C. tertium, Collinsella aerofaciens,o cualquiera de las otras 424 combinaciones mostradas en la Tabla 4. Igualmente importante, el ensayo CivSim describe pares binarios que no inhiben eficazmenteC. difficile.188 de 989 combinaciones promueven el crecimiento con >80 % de confianza; 52 de 989 muestran una falta de inhibición con >90 % de confianza; 22 de 989 muestran una falta de inhibición con >95 % de confianza; 3 de 989, incluyendoB. productacombinado conCoprococcus catus, Alistipes shahiicombinado conDorea formicigenerans,yEubacterium rectalecombinado conRoseburia intestinalis,muestran una falta de inhibición con >99 % de confianza.249 de 989 combinaciones son neutras en el ensayo, lo que significa que ni promueven ni inhiben el crecimiento deC. difficilehasta el límite de medición.

Las combinaciones ternarias con una media de inhibición logarítmica superior al intervalo de confianza (I.C.) al 99 % de la hipótesis nula se informan como +++; aquellas con un I.C. entre el 95 % y el 99 % como ++; aquellas con un I.C. entre el 90 % y el 95 % como +; aquellas con un I.C. entre el 80 % y el 90 %, como , mientras que las muestras con una media de inhibición logarítmica inferior al intervalo de confianza (I.C.) al 99 % de la hipótesis nula se informaron como ----; aquellas con un I.C. entre el 95 % y el 99 %, como ---; aquellas con un I.C. entre el 90 % y el 95 %, como --; aquellas con un I.C. entre el 80 % <90% como -.

Los resultados del ensayo CivSim demuestran que muchas combinaciones ternarias pueden inhibir a C.difficile(Tabla 4).516 de 632 combinaciones mostraron una inhibición con un intervalo de confianza >80 %; 507 de 632 con un I.C. >90 %; 496 de 632 con un I.C. >95 %; 469 de 632 con un I.C. >99 %. Entre las combinaciones ternarias no limitativas pero de ejemplo se incluyen aquellas con una puntuación de +++, tales comoColinsella aerofaciens, Coprococcus comesyBlautia producta.El ensayo CivSim también describe combinaciones ternarias que no inhiben eficazmenteC. difficile.76 de 632 combinaciones promueven el crecimiento con >80 % de confianza; 67 de 632 promueven el crecimiento con >90 % de confianza; 61 de 632 promueven el crecimiento con >95 % de confianza; y 49 de 632 combinaciones tales como, aunque sin limitación,Clostridium orbiscendens, Coprococcus comesyFaecalibacterium prausnitziipromueven el crecimiento con >99 % de confianza.40 de 632 combinaciones son neutras en el ensayo, lo que significa que ni promueven ni inhiben el crecimiento deC. difficilehasta el límite de confianza.

De las combinaciones ternarias que inhibenC. difficilecon >99 % de confianza, aquellas que inhiben fuertementeC. difficilepueden identificarse mediante comparación de su inhibición logarítmica media con la distribución de todos los resultados de todas las combinaciones ternarias sometidas a ensayo. Los que están por encima del percentil 75 se puede considerar que son inhibidores fuertes deC. difficile.Alternativamente, aquellos por encima del percentil 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 99 se pueden considerar como que inhiben fuertementeC. difficile.Entre las combinaciones ternarias no limitativas pero de ejemplo por encima del percentil 75 se incluyenBlautia producta, Clostridium tertium,yRuminococcus gnavusyEubacterium rectale, Clostridium mayombeiyRuminococcus bromii.

Además de la demostración de que muchas combinaciones binarias y ternarias inhiben a C.difficile,el ensayo CivSim demuestra que muchas de estas combinaciones inhiben sinérgicamente a C.difficile.Entre las combinaciones ternarias de ejemplo que muestran sinergia en la inhibición del crecimiento de C.difficilese incluyen, aunque sin limitación,Blautia producta, Clostridium innocuum, Clostridium orbiscendensyColinsella aerofaciens, Blautia productayEubacterium rectale.Se proporcionan combinaciones adicionales útiles a lo largo de la presente memoria, p. ej., en las Tablas 4a, 4b y 14 a 21.

Se sometieron a ensayo dos composiciones bacterianas de orden superior en el ensayo CivSim para la inhibición deC. difficile.N1962 (también conocido como S030 y N1952), una composición de 15 miembros, inhibióC. difficileun promedio de 2,73 log10UFC/ml con una desviación estándar de 0,58 log10UFC/ml, mientras que N1984 (también conocido como S075), una composición de 9 miembros, inhibióC. difficileen un promedio de 1,42 log10UFC/ml con una desviación estándar de 0,45 log10UFC/ml.

Estos datos demuestran en conjunto que el ensayo CivSim se puede utilizar para identificar composiciones que contienen múltiples especies que son eficaces para inhibir el crecimiento, que promueven el crecimiento o que no presentan ningún efecto sobre el crecimiento de un organismo, p. ej., un organismo patogénico tal comoC. difficile. Ejemplo 8. Validación in vivo de la eficacia de combinaciones ternarias en un modelo murino de infección por Clostridium difficile.

Para someter a ensayo el potencial terapéutico de una composición bacteriana, tal como, aunque sin limitación, una población de esporas, se utilizó un modelo profiláctico de ratón de infección porC. difficile(modelo basado enChen et al..2008. A mouse model of Clostridium difficile-associated disease. Gastroenterology 135: 1984-1992). En resumen, se sometieron a ensayo dos jaulas de cinco ratones cada una para cada grupo del experimento. Todos los ratones recibieron un cóctel de antibióticos que consistía en 10 % de glucosa, kanamicina (0,5 mg/ml), gentamicina (0,044 mg/ml), colistina (1062,5 U/ml), metronidazol (0,269 mg/ml), ciprofloxacino (0,156 mg/ml), ampicilina (0,1 mg/ml) y vancomicina (0,056 mg/ml) en su agua de bebida entre los días -14 y -5, y una dosis de 10 mg/kg de clindamicina por sonda oral el día -3. El día -1, las composiciones de ensayo se centrifugaron durante 5 minutos a 12.100 rcf; se eliminaron los sobrenadantes y los pellets que quedaban se resuspendieron en PBS estéril, prerreducidos si la composición bacteriana no estaba en forma de esporas, y se administraron mediante sonda oral. El día 0, se presentó un reto a los ratones mediante la administración de aproximadamente 4,5 log10UFC deC. difficile(ATCC n.º 43255) o PBS estéril (para el grupo nunca expuesto o "ingenuo") mediante sonda oral. La mortalidad, el peso y la puntuación clínica de los síntomas deC. difficilese basaron en una escala de 0 a 4 mediante la combinación de las puntuaciones de apariencia (0 a 2 puntos basados en normal, encorvado, piloerección o letárgico) y signos clínicos (0 a 2 puntos basados en normal, cola húmeda, frío al tacto o aislamiento de otros animales), con una puntuación de 4 en caso de muerte, y se evaluaron todos los días entre el día -2 y el día 6. Se calculó el peso mínimo medio respecto al día -1 y la puntuación clínica máxima media, así como la mortalidad acumulada media. Se utilizó la reducción de la mortalidad, el aumento del peso mínimo medio respecto al día -1 y la reducción de la puntuación clínica máxima media con muerte asignada a una puntuación de 4 respecto al control de vehículo para evaluar la capacidad de la composición de ensayo de inhibir la infección porC. difficile.

Se sometieron a ensayo combinaciones ternarias en el modelo murino descrito anteriormente a 1x10<9>UFC/ml por cepa. Se muestran los resultados en la Tabla 5. Los datos demuestran que los resultados del ensayo CivSim son altamente predictivos de la capacidad de una combinación de inhibir la pérdida de peso en la infección porC. difficile. La pérdida de peso en este modelo se considera generalmente indicativa de enfermedad.

En un caso, las composiciones de cribado de eficaciain vivopueden seleccionarse mediante la clasificación de las composiciones según un métrico funcional tal como, aunque sin limitación, las puntuacionesin vitrode inhibición del crecimiento; las composiciones que se clasifican ≥percentil 75 pueden considerarse como inhibidoras fuertes del crecimiento y seleccionarse para la validaciónin vivodel fenotipo funcional. En otros casos, las composiciones por encima del percentil 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 99 pueden considerarse que son candidatos óptimos. En otro caso, se seleccionaron combinaciones con una inhibición logarítmica media superior al intervalo de confianza (I.C.) al 99 % de la hipótesis nula. En otros casos, se seleccionaron composiciones mayores que el intervalo de confianza (I.C.) al 95 %, 90 %, 85 % u 80 %. En otro caso, se seleccionaron composiciones que demostraban presentar una inhibición sinérgica (ver el Ejemplo 7) para los ensayos en un modeloin vivotal como el descrito anteriormente.

Las composiciones seleccionadas para el cribado de la eficacia en modelosin vivotambién se pueden seleccionar utilizando una combinación de métricas de inhibición del crecimiento. En un ejemplo no limitativo: (i) las composiciones se seleccionan en función de que su inhibición logarítmica sea mayor que el intervalo de confianza (I.C.) del 99 % de la hipótesis nula, (ii) el subgrupo seleccionado de composiciones se selecciona adicionalmente para representar aquellas que están clasificadas ≥percentil 75 en la distribución de todas las puntuaciones de inhibición, (iii) el subgrupo de (ii) se selecciona entonces adicionalmente en función de las composiciones que muestran una inhibición sinérgica. En algunos casos, se utilizan diferentes intervalos de confianza (I.C.) y percentiles para crear los subgrupos de composición, p. ej., ver la Tabla 4b.

De las doce combinaciones ternarias de ejemplo seleccionadas, todas mostraron inhibición deC. difficileen el ensayo CivSim (ver el Ejemplo 6) con >99 % de confianza. Diez de las doce composiciones mostraron un efecto protector en comparación con un control de vehículo con respecto al peso relativo mínimo medio. Las doce composiciones superaron al vehículo en cuanto a la puntuación clínica máxima media, mientras que once de las doce composiciones superaron al control del vehículo en mortalidad acumulada. Una combinación ternaria no limitativa pero de ejemplo:Collinsella aerofaciens, Clostridium butyricumyRuminococcus gnavus,fue protectora frente a los síntomas de infección porC. difficile, produciendo un peso relativo mínimo medio de 0,96, una puntuación clínica máxima media de 0,2, y una mortalidad acumulada de 0 % en comparación con el control del vehículo, de 0,82 %, 2,6 % y 30 %, respectivamente. Estos resultados demuestran que el ensayo CivSimin vitropuede utilizarse para identificar composiciones que son protectoras en un modelo murinoin vivo. Lo anterior resulta inesperado, dada la naturaleza inherentemente dinámica de los sistemas biológicosin vivoy la simplificación inherente de los ensayosin vitro; no se esperaría que existiese una correlación directa entre las medidas de inhibición y eficaciain vitroein vivo. Ello se debe en parte a la complejidad del sistemain vivoen el que se administra una composición para el tratamiento, en el que se podría haber esperado que los factores de confusión oscurecieran o afectaran a la capacidad de una composición considerada eficazin vitropara ser eficaz bajo condicionesin vivo.

Ejemplo 9. Construcción de un ensayo CivSim para detectar composiciones bacterianas inhibitorias del crecimiento de Enterococcus resistente a vancomicina (VRE) utilizando un medio selectivo para Enterococcus resistente a vancomicina para la cuantificación y el cribado de composiciones.

Para determinar la capacidad de una composición para competir con una bacteria patogénica, por ejemplo,Enterococcusresistente a vancomicina, se desarrolló un ensayo de competencia. En estos experimentos, se cultivó anaeróbicamente en SweetB-FosIn durante 24 horas un cultivo de durante la noche de una cepa resistente a vancomicina deEnterococcus faecium. Se descongeló una reserva en glicerol de una composición bacteriana a -80 °C y se diluyó a 1x10<6>UFC/ml por cepa en SweetB-FosIn en los pocillos apropiados de una placa de 96 pocillos. La placa se incubó anaeróbicamente a 37 °C durante una hora para permitir que las bacterias previamente congeladas se reactivasen. Después de la incubación inicial de una hora, se inoculó VRE en los pocillos apropiados a concentraciones objetivo de 1x10<2>o 1x10<3>UFC/ml. También se inocularon VRE solos en los pocillos, sin ninguna composición bacteriana. La placa se incubó anaeróbicamente a 37 ºC durante 24 horas. Se extrajeron alícuotas a las 15 horas y 24 horas y se determinaron los títulos de VRE. En cada punto temporal, el contenido de los pocillos se diluyó en serie y se sembraron placas de agar selectivas para VRE (agar Enterococcosel 8 μg/ml de hidrocloruro de vancomicina) (agar Enterococcosel de BBL 212205, hidrocloruro de vancomicina de Sigma 94747). Las placas selectivas se incubaron aeróbicamente a 37 °C durante 24 horas antes de realizar un recuento de las colonias para determinar el título final de VRE en cada pocillo de la placa CivSim. La inhibición de VRE se determinó mediante la resta del título final de un pocillo de competencia respecto del título final de un pocillo que contenía solo VRE. Se sometieron a ensayo múltiples proporciones de concentraciones iniciales de VRE y composiciones bacterianas para optimizar las condiciones que resultasen en la mayor señal. Un tiempo de competición de 15 horas, una concentración inicial de VRE de 1x10<2>UFC/ml y una concentración inicial de N1962 (también conocido como S030 y N1952) de 1x10<6>UFC/ml mostró la mayor inhibición del crecimiento en comparación con el control.

Usando las condiciones descritas anteriormente, se sometieron a ensayo una composición bacteriana de 15 miembros y 44 composiciones heterotriméricas, cuyos resultados se presentan en las Tablas 4 y 6. De las 44 composiciones heterotriméricas sometidas a ensayo, 43 inhibieron VRE con más del 80 % de confianza, 41 inhibieron VRE con más del 95 % de confianza y 39 inhibieron VRE con más del 99 % de confianza. Una composición ternaria probada no demostró inhibición o inducción con >80 % de confianza.

De las combinaciones ternarias que inhibieronC. difficilecon >99 % de confianza, aquellas que inhiben fuertementeC. difficilepueden identificarse mediante comparación de su inhibición logarítmica media con la distribución de todos los resultados de todas las combinaciones ternarias sometidas a ensayo. Los que están por encima del percentil 75 se puede considerar que son inhibidores fuertes deC. difficile.Alternativamente, aquellos por encima del percentil 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 99 se pueden considerar como que inhiben fuertementeC. difficile.Entre las combinaciones ternarias no limitativas pero de ejemplo que inhiben VRE con >99 % de confianza y por encima del percentil 75 se incluyenBlautia producta, Clostridium innocuum,yRuminococcus gnavusyBlautia producta, Clostridium butyricumyClostridium hylemonae.

La composición de 15 miembros, N1962 (también conocida como S030 y N1952), inhibió VRE en por lo menos 0,7 log10UFC/ml en todas las condiciones sometidas a ensayo, mostrando una inhibición de 5,7 log10UFC/ml bajo las condiciones óptimas.

Estos datos muestran métodos para identificar composiciones útiles para la profilaxis y el tratamiento de la infección por VRE.

Ejemplo 10. Construcción de un ensayo CivSim para el cribado de composiciones bacterianas inhibitorias del crecimiento de Klebsiella pneumoniae utilizando medio selectivo para Klebsiella para la cuantificación.

Con el fin de determinar la capacidad de una composición de competir con una bacteria patogénica, p. ej.,Klebsiella pneumoniae,se desarrolló un ensayo de competencia. En estos experimentos, se cultivó anaeróbicamente en SweetB-FosIn durante 24 horas un cultivo de durante la noche de una cepa resistente a vancomicina deKlebsiella pneumoniae. Se descongeló una reserva en glicerol de una composición bacteriana (N1962) a -80 °C y se diluyó a 1x10<6>UFC/ml por cepa en SweetB-FosIn en los pocillos apropiados de una placa de 96 pocillos. La placa se incubó anaeróbicamente a 37 °C durante una hora para permitir que las bacterias previamente congeladas se reactivasen. Después de la incubación inicial de una hora, se inoculóK. pneumoniaeen los pocillos apropiados a concentraciones objetivo de 1x10<2>o 1x10<3>UFC/ml. También se inocularon los pocillos con soloK. pneumoniae, sin ninguna composición bacteriana. La placa se incubó anaeróbicamente a 37 ºC durante 24 horas. Se extrajeron alícuotas a las 15 horas y a las 24 horas para titular la concentración final deK. pneumoniaeal final de la competición. En cada punto de tiempo, los pocillos se diluyeron en serie y se sembraron en placas de ágar selectivas paraK. pneumoniae(agar de MacConkey lactosa, Teknova M0149). Las placas selectivas se incubaron aerobicamente a 37 °C durante 24 horas antes de realizar un recuento de las colonias para determinar el título final deK. pneumoniaeen cada pocillo de la placa CivSim. La inhibición deK. pneumoniaese determinó mediante la resta del título final de un pocillo de competencia respecto del título final de un pocillo que contenía soloK. pneumoniae. Se sometieron a ensayo múltiples proporciones de concentraciones iniciales deK. pneumoniaey composiciones bacterianas para optimizar las condiciones que resultasen en la mayor señal. Los resultados del análisis se presentan en la Tabla 7. Un tiempo de competición de 15 horas, una concentración inicial deK. pneumoniaede 1x10<2>UFC/ml y una concentración inicial de N1962 (también conocido como S030 y N1952) de 1x10<6>UFC/ml mostró la mayor inhibición del crecimiento en comparación con el control. N1962 (también conocido como S030 y N1952) inhibióK. pneumoniaeen 0,1-4,2 log10UFC/ml bajo todas las condiciones sometidas a ensayo.

Ejemplo 11. Construcción de un ensayo CivSim para el cribado de composiciones bacterianas inhibitorias del crecimiento de Morganella morganii utilizando medios selectivos para Morganella para la cuantificación.

Con el fin de determinar la capacidad de una composición de competir con una bacteria patogénica, p. ej.,Morganella morganii,se desarrolló un ensayo de competencia. En este experimento, se cultivó anaerobicamente un cultivo de durante la noche de una cepa resistente a vancomicina deMorganella morganiien SweetB-FosIn durante 24 horas. Se descongeló una reserva en glicerol de una composición bacteriana (N1962) a -80 °C y se diluyó a 1x10<6>UFC/ml por cepa en SweetB-FosIn en los pocillos apropiados de una placa de 96 pocillos. La placa se incubó anaeróbicamente a 37 °C durante una hora para permitir que las bacterias previamente congeladas se reactivasen. Después de la incubación inicial de una hora, se inoculóM. morganiien los pocillos apropiados a concentraciones objetivo de 1x10<2>o 1x10<3>UFC/ml. Los pocillos también fueron inoculados conM. morganiisolo, sin una composición bacteriana. La placa se incubó aeróbicamente a 37 ºC durante 24 horas. Se extrajeron alícuotas a las 15 horas y a las 24 horas para medir la concentración final deM. morganiial final de la competencia. En cada punto de tiempo, los pocillos se diluyeron en serie y se sembraron en placas de agar selectivas paraM. morganii(agar MacConkey con lactosa, Teknova M0149). Las placas selectivas se incubaron aeróbicamente a 37 °C durante 24 horas antes de realizar un recuento de las colonias para determinar el título final deM. morganiien cada pocillo de la placa CivSim. La inhibición deM. morganiise determinó mediante la resta del título final de un pocillo de competencia respecto del título final de un pocillo que contenía soloM. morganii. Se sometieron a ensayo múltiples proporciones de concentraciones iniciales deM. morganiiy composiciones bacterianas para optimizar las condiciones que resultasen en la mayor señal. Un tiempo de competición de 15 horas, una concentración inicial deM. morganiide 1x10<2>UFC/ml y una concentración inicial de N1962 (también conocido como S030 y N1952) de 1x10<6>UFC/ml mostró la mayor inhibición del crecimiento en comparación con el control.

Se sometió a ensayo una composición bacteriana de 15 miembros, N1962 (también conocida como S030 y N1952), en el ensayo, cuyos resultados se proporcionan en la Tabla 8. N1962 (también conocido como S030 y N1952) inhibióM. morganiien 1,4-5,8 log10UFC/ml bajo todas las condiciones sometidas a ensayo.

Ejemplo 12. Caracterización genómica basada en secuencias de unidades taxonómicas operativas (UTO) y genes funcionales

Método para determinar la secuencia génica del ADNr 16S

Tal como se ha indicado anteriormente, las UTO se definen ya sea mediante la secuenciación completa del gen de ADNr 16S, mediante la secuenciación de una región hipervariable específica de este gen (es decir, V1, V2, V3, V4, V5, V6, V7, V8 o V9), o mediante la secuenciación de cualquier combinación de regiones hipervariables de este gen (p. ej., V1 a 3 o V3 a 5). El ADNr 16S bacteriano presenta aproximadamente 1.500 nucleótidos de longitud y se utiliza para reconstruir las relaciones evolutivas y la similitud de secuencias entre un aislado bacteriano y otro utilizando enfoques filogenéticos. Las secuencias de 16S se utilizaron para la reconstrucción filogenética, ya que en general están altamente conservadas, aunque contienen regiones hipervariables específicas que albergan una diversidad de nucleótidos suficiente para diferenciar géneros y especies de la mayoría de los microorganismos. Los métodos de secuenciación génica de ADNr son aplicables tanto al análisis de muestras no enriquecidas, como también a la identificación de microorganismos después de etapas de enriquecimiento que enriquecen ya sea en los microorganismos de interés de una composición microbiana o una muestra microbiana y/o los ácidos nucleicos que albergan las secuencias génicas de ADNr apropiadas tal como se describe a continuación. Por ejemplo, los tratamientos de enriquecimiento previos a la caracterización génica del ADNr 16S aumentarán la sensibilidad de 16S, así como de otras caracterizaciones basadas en moléculas de ácidos nucleicos purificados a partir de los microorganismos.

Mediante la utilización de técnicas bien conocidas, con el fin de determinar la secuencia completa de 16S o la secuencia de cualquier región hipervariable de la secuencia de 16S, se extrajo el ADN genómico de una muestra bacteriana, se amplificó el ADNr 16S (región completa o regiones hipervariables específicas) utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se limpiaron los productos de PCR y se definieron las secuencias de nucleótidos para determinar la composición genética del gen 16S o subdominio del gen. En el caso de que se lleve a cabo una secuenciación completa de 16S, el método de secuenciación utilizado puede ser, aunque sin limitación, secuenciación de Sanger. Si se utilizan una o más regiones hipervariables, tales como la región V4, la secuenciación puede llevarse a cabo, aunque sin limitación, mediante el método de Sanger o utilizando un método de secuenciación de próxima generación, tal como un método de Illumina (secuenciación mediante síntesis) que utiliza cebadores con código de barras que permiten reacciones multiplex.

Método para determinar la secuencia génica de ADNr 18S y del espaciador transcrito interno (ITS, por sus siglas en inglés).

Los métodos para asignar e identificar las UTO fúngicas por medios genéticos se pueden llevar a cabo mediante el análisis de secuencias de 18S y de espaciador transcrito interno (ITS). El ARNr fúngico que forma el núcleo del ribosoma se transcribe como un solo gen y consiste en las regiones 8S, 5.8S y 28S, con ITS4 y 5 entre las regiones 8S y 5.8S, y 5.8S y 28S, respectivamente. Estos dos segmentos intercistrónicos entre las regiones 18S y 5.8S, y 5.8S y 28S son eliminados mediante corte y empalme y contienen una variación significativa entre especies para fines de código de barras, tal como se ha descrito anteriormente (Schoch et al. Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi. PNAS USA 109:6241-6246.2012). El ADNr 18S se utiliza habitualmente para la reconstrucción filogenética; sin embargo, el ITS puede cumplir esta función ya que generalmente está altamente conservado, aunque contiene regiones hipervariables que albergan suficiente diversidad de nucleótidos para diferenciar géneros y especies de la mayoría de hongos.

Usando técnicas conocidas para determinar las secuencias completas de 18S e ITS o una sección hipervariable más pequeña de estas secuencias, se extrajo el ADN genómico de una muestra microbiana, se amplificó el ADNr utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se limpiaron los productos de PCR y se delinearon las secuencias de nucleótidos para determinar la composición genética del gen de ADNr o subdominio del gen. El método de secuenciación utilizado puede ser, aunque sin limitación, secuenciación de Sanger o puede utilizarse un método de secuenciación de próxima generación, tal como un método de Illumina (secuenciación mediante síntesis) que utiliza cebadores con código de barras que permiten reacciones multiplex.

Método para determinar otras secuencias de genes marcadores

Además del gen de ADNr 16S y 18S, puede definirse una UTO mediante la secuenciación de un conjunto seleccionado de genes o porciones de genes que son genes marcadores conocidos para una especie o grupo taxonómico de UTO dadas. Dichos genes pueden evaluarse alternativamente utilizando una estrategia de cribado basada en PCR. Por ejemplo, pueden distinguirse diversas cepas deEscherichia colipatogénica utilizando ADN de los genes que codifican las toxinas termolábiles (LTI, LTIIa y LTIIb) y termorresistentes (STI y STII), verotoxina tipos 1, 2 y 2e (VT1, VT2 y VT2e, respectivamente), factores necrotizantes citotóxicos (CNF1 y CNF2), mecanismos de adherencia y borrado (eaeA), mecanismos enteroagregativos (Eagg) y mecanismos enteroinvasivos (Einv). Los genes óptimos para utilizar en la asignación taxonómica de las UTO mediante el uso de genes marcadores resultarán familiares para el experto habitual en la materia de la identificación taxonómica basada en secuencias.

Extracción de ADN genómico

El ADN genómico se puede extraer de cultivos microbianos puros o enriquecidos utilizando un método de lisis alcalina caliente. Por ejemplo, se añade 1 µl de cultivo microbiano a 9 µl de tampón de lisis (NaOH 25 mM, EDTA 0,2 mM) y la mezcla se incubó a 95 °C durante 30 minutos. Posteriormente, las muestras se enfriaron a 4 °C y se neutralizaron mediante la adición de 10 µl de tampón de neutralización (Tris-HCl 40 mM) y después se diluyeron diez veces en tamón de elución (Tris-HCl 10 mM). Alternativamente, se extrae el ADN genómico de cultivos microbianos puros o enriquecidos utilizando kits comercialmente disponibles tales como el kit de aislamiento de ADN microbiano Mo Bio Ultraclean<®>(Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA) o mediante métodos conocidos por el experto en la materia. Para muestras fúngicas, la extracción de ADN se puede llevar a cabo mediante métodos descritos anteriormente (p. ej., ver el documento n.º US2012/0135127) para producir llisados de cuerpos fructificantes fúngicos mediante métodos de trituración mecánica.

Amplificación de secuencias 16S para la secuenciación de Sanger cadena abajo

Para amplificar el ADNr 16S bacteriano (p. ej., en las figura 2 y 3), se añadieron 2 µl de ADN genómico extraído a una reacción de PCR con un volumen final de 20 µl. Para la secuenciación de longitud completa de la secuencia 16S, la reacción de PCR también contenía 1x HotMaster<®>Mix (5PRIME, Gaithersburg, MD), 250 nM de 27f (AGRGTTTGATCMTGGCTCAG, IDT, Coralville, IA), y 250 nM de 1492r (TACGGYTACCTTGTTAYGACTT, IDT, Coralville, IA), con agua para PCR (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA) para completar el volumen.

La figura 2 muestra las regiones hipervariables localizadas en una secuencia 16s y las regiones de secuencia correspondientes a estas secuencias en un mapa de secuencia. Se muestra un esquema de un gen de ADNr 16S y la figura denota las coordenadas de las regiones hipervariables 1 a 9 (V1 a V9). Las coordenadas de V1 a V9 son 69 a 99, 137 a 242, 433 a 497, 576 a 682, 822 a 879, 986 a 1043, 1117 a 1173, 1243 a 1294 y 1435 a 1465, respectivamente, basadas en la numeración utilizando el sistema de nomenclatura deE. colidefinido por Brosius et al. (Complete nucleotide sequence of a 16S ribosomal RNA gene (16S rRNA) from Escherichia coli, PNAS USA 75(10):4801-4805.1978).

Alternativamente, se utilizan otros cebadores bacterianos universales o polimerasas termoestables conocidas por el experto en la materia. Por ejemplo, se encuentran disponibles cebadores para el experto en la materia de la secuenciación de las "regiones V1 a V9" del ADNr 16S (p. ej., la figura 2). Estas regiones se refieren a las primeras a novenas regiones hipervariables del gen de ADNr 16S que se utilizan para la tipificación genética de muestras bacterianas. Estas regiones en las bacterias están definidas por los nucleótidos 69 a 99, 137 a 242, 433 a 497, 576 a 682, 822 a 879, 986 a 1043, 1117 a 1173, 1243 a 1294 y 1435 a 1465, respectivamente, utilizando una numeración basada en el sistema de nomenclatura deE. coli. Ver Brosius et al., 1978,supra.En algunos casos, por lo menos una de las regiones V1, V2, V3, V4, V5, V6, V7, V8 y V9 se utiliza para caracterizar una UTO. En un caso, se utilizan las regiones V1, V2 y V3 para caracterizar una UTO. En otro caso, se utilizan las regiones V3, V4 y V5 para caracterizar una UTO. En otro caso, se utiliza la región V4 para caracterizar una UTO. El experto habitual en la materia puede identificar las regiones hipervariables específicas de un ADNr 16S candidato (p. ej., la figura 2) mediante la comparación de la secuencia candidata en cuestión con la secuencia de referencia (tal como en la figura 3) y la identificación de las regiones hipervariables en función de la similitud con las regiones hipervariables de referencia. La figura 3 resalta en negrita las secuencias nucleotídicas para cada región hipervariable en la secuencia 16S de referencia de ejemplo deE. colidescrita por Brosius et al.,supra.

La PCR se lleva a cabo habitualmente en termocicladores disponibles comercialmente, tales como el termociclador BioRad MyCycler<™>(BioRad, Hercules, CA). Las reacciones se llevan a cabo a 94 °C durante dos minutos, seguidas de 30 ciclos a 94 °C durante 30 segundos, 51 °C durante 30 segundos y 68 °C durante 1 minuto 30 segundos, seguidos de una extensión de siete minutos a 72 °C y un mantenimiento indefinido a 4 °C. Después de la PCR, se utiliza una electroforesis en gel de una porción de los productos de reacción para confirmar la amplificación con éxito de un producto de ~1,5 kb.

Para eliminar nucleótidos y oligonucleótidos de los productos de PCR, se añadieron 2 µl de HT ExoSap-IT<®>(Affymetrix, Santa Clara, CA) a 5 µl de producto de PCR, seguido de una incubación de 15 minutos a 37 °C y a continuación una inactivación de 15 minutos a 80 °C.

Amplicación de secuencias de 16S para la caracterización posterior mediante tecnologías de secuenciación masiva en paralelo.

La amplificación lleva a cabo para la secuenciación posterior mediante tecnologías de lectura corta, tal como Illumina, requiere la amplificación utilizando cebadores conocidos por el experto en la materia que además incluyen una etiqueta con código de barras basada en secuencias. Por ejemplo, para amplificar la región hipervariable V4 del ADNr 16S bacteriano, se añadieron 2 µl de ADNg extraído a una reacción PCR de volumen final de 20 µl. La reacción de PCR también contenía 1x HotMasterMix (5PRIME, Gaithersburg, MD), 200 nM de V4_515f_adapt (AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATGGTAATTGTGTGCCAGCMGCCGCG GTAA, IDT, Coralville, IA), y 200 nM de 806rbc con código de barras (CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT_12bpGolayBarcode_AGTCAGTCAGCCGGACTAC HVGGGTWTCTAAT, IDT, Coralville, IA), con agua para PCR (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA) hasta completar el volumen. En las secuencias de cebadores anteriores, las designaciones de nucleótidos que no son ACTG se refieren a los códigos degenerados convencionales utilizados en la técnica. Dichos cebadores incorporan adaptadores con código de barras para la secuenciación mediante síntesis de Illumina. Opcionalmente, se pueden llevar a cabo reacciones idénticas por duplicado, triplicado o cuadruplicado. Alternativamente, se utilizan otros cebadores bacterianos universales o polimerasas termostables conocidas por el experto en la materia a fin de obtener diferentes tasas de amplificación y error de secuenciación, así como resultados en tecnologías de secuenciación alternativas.

La PCR se lleva a cabo habitualmente en termocicladores disponibles comercialmente, tales como el termociclador BioRad MyCycler<™>(BioRad, Hercules, CA). Las reacciones se llevan a cabo a 94 °C durante tres minutos, seguidas de 25 ciclos a 94 °C durante 45 segundos, 50 °C durante 1 minuto y 72 °C durante 1 minuto 30 segundos, seguidos de una extensión de diez minutos a 72 °C y un mantenimiento indefinido a 4 °C. Después de la PCR, se utiliza una electroforesis en gel de una porción de los productos de reacción para confirmar la amplificación con éxito de un producto de ~1,5 kb. La limpieza de PCR se lleva a cabo tal como se ha indicado anteriormente.

Secuenciación Sanger de amplicones diana a partir de muestras homogéneas puras.

Para detectar ácidos nucleicos para cada muestra, se llevaron a cabo dos reacciones de secuenciación para generar una lectura de secuenciación en sentido directo y inverso. Para la secuenciación de 16S de longitud completa se utilizan los cebadores 27f y 1492r. Se mezclaron 40 ng de productos PCR limpiados con ExoSap-IT, con 25 pmol de cebador de secuenciación y agua de grado molecular de Mo Bio (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA) hasta un volumen total de 15 µl. Se envió esta reacción a una organización comercial de secuenciación, tal como Genewiz (South Plainfield, NJ), para la secuenciación de Sanger.

Amplicación de las regiones 18S e ITS para secuenciación posterior.

Para amplificar las regiones 18S o ITS, se amplificaron 2 µl de ADN fúngico en un volumen final de 30 µl con 15 µl de mezcla maestra AmpliTaq Gold 360, cebadores de PCR y agua. Los cebadores directo e inverso para la PCR de la región ITS eran 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' y 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3' y se añadieron a una concentración de 0,2 µM de cada uno. Los cebadores directo e inverso para la PCR de la región ITS eran 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' y 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3' y se añadieron a una concentración de 0,4 µM de cada uno. La PCR se llevó a cabo siguiendo el siguiente protocolo: 95 °C durante 10 minutos, 35 ciclos de 95 °C durante 15 segundos, 52 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 1,5 segundos y finalmente 72 °C durante siete minutos seguido del almacenamiento a 4 °C. Todos los cebadores directos contenían el cebador de secuenciación M13F-20, y los cebadores inversos incluían el cebador de secuenciación M13R-27. Los productos de PCR (3 µl) se limpiaron enzimáticamente antes de la secuenciación cíclica con 1 µl de ExoSap-IT y 1 µl de Tris EDTA, y se incubaron a 37 °C durante 20 minutos, seguidos de 80 °C durante 15 minutos. Las reacciones de secuenciación cíclica contenían 5 µl de producto de PCR limpio, 2 µl de mezcla de reacción preparada BigDye<®>v3.1 Terminator v3.1, 1 µl de tampón de secuenciación 5×, 1,6 pmoles de los cebadores de secuenciación apropiados diseñados por un experto en la materia, y agua en un volumen final de 10 µl. El protocolo estándar de secuenciación por ciclos es de 27 ciclos de 10 segundos a 96 °C, 5 segundos a 50 °C, 4 minutos a 60 °C y mantenimiento a 4 °C. La limpieza de la secuenciación se llevó a cabo con el kit de purificación BigDye XTerminator según lo recomendado por el fabricante para volúmenes de 10 µl. La secuenciación génica de las secuencias 18S e ITS resultantes se llevó a cabo utilizando métodos familiares para el experto habitual en la materia, utilizando tecnología de secuenciación de Sanger o tecnologías de secuenciación de próxima generación, tales como, entre otras, Illumina.

Preparación de ácidos nucleicos extraídos para la caracterización metagenómica mediante tecnologías de secuenciación masiva en paralelo.

Los ácidos nucleicos extraídos (ADN o ARN) se purificaron y prepararon mediante secuenciación posterior utilizando métodos estándares conocidos por el experto habitual en la materia y siguiendo las instrucciones del fabricante de la tecnología de secuenciación para la preparación de bibliotecas. En resumen, el ARN o el ADN se purificaron utilizando kits de purificación estándares tales como, aunque sin limitación, el kit RNeasy<®>de Qiagen o el kit de purificación de ADN genómico de Promega. Para el ARN, este se convirtió en ADNc antes de la construcción de la biblioteca de secuencias. Después de la purificación de los ácidos nucleicos, el ARN se convirtió en ADNc utilizando tecnología de transcripción inversa, tales como, aunque sin limitación, el sistema RNA-Seq Nugen Ovation<®>o Illumina Truseq, siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN extraído o el ADNc transcrito se fragmentaron utilizando tecnologías físicas (p. ej., Hydroshear), acústicas (p. ej., Covaris) o moleculares (p. ej., Nextera) y después se seleccionó el tamaño de acuerdo con las recomendaciones del fabricante de las tecnologías de secuenciación. Tras la selección del tamaño, los ácidos nucleicos se prepararon para la secuenciación de acuerdo con las instrucciones del fabricante para la indexación de muestras y el ligado de adaptadores de secuenciación utilizando métodos familiares para el experto habitual en la materia de la secuenciación genómica.

Secuenciación masiva en paralelo de amplicones diana a partir de muestras heterogéneas.

Cuantificación de ADN y construcción de bibliotecas.

Los productos de amplificación de PCR limpios se cuantificaron utilizando el kit de ensayo dsDNA QuantiT<™>PicoGreen<®>(Life Technologies, Grand Island, NY) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la cuantificación, los productos de PCR limpios con código de barras se combinaron de tal manera que cada producto de PCR distinto estuviese en una proporción equimolar a fin de generar una biblioteca de Illumina preparada.

Detección de ácidos nucleicos.

La biblioteca preparada se secuenció en secuenciadores Illumina HiSeq o MiSeq (Illumina, San Diego, CA) con generación de agrupaciones, hibridación de moldes, amplificación isotérmica, linealización, bloqueo y desnaturalización, e hibridación de los cebadores de secuenciación llevados a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la secuenciación se utilizaron 16SV4SeqFw (TATGGTAATTGTGTGCCAGCMGCCGCGGTAA), 16SV4SeqRev (AGTCAGTCAGCCGGACTACHVGGGTWTCTAAT) y 16SV4Index (ATTAGAWACCCBDGTAGTCCGGCTGACTGACT) (IDT, Coralville, IA). Pueden utilizarse otras tecnologías de secuenciación, tales como, aunque sin limitación, 454, Pacific Biosciences, Helicos, Ion Torrent y Nanopore, utilizando protocolos que son estándares para el experto en la materia de la secuenciación genómica.

Ejemplo 13. Anotación de lecturas de secuencia.

Anotación de lecturas primarias.

Las secuencias de ácidos nucleicos se analizaron y se anotaron para definir las asignaciones taxonómicas utilizando métodos de similitud de secuencia y colocación filogenética o una combinación de ambas estrategias. Se puede utilizar un enfoque similar para anotar nombres de proteínas, funciones de proteínas, nombres de factores de transcripción y cualquier otro esquema de clasificación para secuencias de ácidos nucleicos. Entre los métodos basados en la similitud de secuencias se incluyen aquellos que resultarán familiares para el experto en la materia, incluyendo, aunque sin limitación, BLAST, BLASTx, tBLASTn, tBLASTx, clasificador RDP, DNAclust y diversas implementaciones de estos algoritmos, tales como Qiime o Mothur. Estos métodos se basan en la localización de una lectura de secuencia en una base de datos de referencia y la selección de la coincidencia con la mejor puntuación y valor e. Entre las bases de datos comunes se incluyen, aunque sin limitación, el Proyecto del Microbioma Humano, la base de datos no redundante del NCBI, Greengenes, RDP y Silva para asignaciones taxonómicas. Para asignaciones funcionales, las lecturas se localizan en diversas bases de datos funcionales, tales como, aunque sin limitación, COG, KEGG, BioCyc y MetaCyc. Se pueden obtener anotaciones funcionales adicionales a partir de las anotaciones taxonómicas de 16S utilizando programas tales como PICRUST (M. Langille, et al.2013. Nature Biotechnology 31, 814-821). Los métodos filogenéticos se pueden utilizar en combinación con métodos de similitud de secuencias para mejorar la precisión de la asignación de una anotación o la clasificación taxonómica. Las topologías de árbol y la estructura nodal se utilizan para refinar la resolución del análisis. En este enfoque, los presentes inventores analizaron secuencias de ácidos nucleicos utilizando uno de numerosos enfoques de similitud de secuencias y se aprovecharon métodos filogenéticos que son conocidos por experto en la materia, incluyendo, aunque sin limitación, la reconstrucción filogenética por máxima verosimilitud (ver, p. ej., RAxMI, and FastTree: Comparing Two Methods for Large-Scale Maximum Likelihood Phylogeny Estimation. PLoS ONE 6: e27731; McGuire et al., 2001. Models of sequence evolution for DNA sequences containing gaps. Mol. Biol. Evol 18 481-490; Wrobel B. 2008. Statistical measures of uncertainty for branches in phylogenetic trees inferred from molecular sequences by using model-based methods. J. Appl. Genet.49: 49-67). Las lecturas de secuencia (p. ej., 16S, 18S o ITS) se colocaron en una filogenia de referencia compuesta por secuencias de referencia apropiadas. Las anotaciones se realizaron en función de la colocación de la lectura en el árbol filogenético. La certeza o la importancia de la anotación de la UTO se definió basándose en la similitud de secuencia de la UTO respecto a una secuencia de ácido nucleico de referencia y la proximidad de la secuencia de la UTO a una o más secuencias de referencia en la filogenia. A título de ejemplo, se definió la especificidad de una asignación taxonómica con confianza a nivel de familia, género, especie o cepa, en donde se determinó la confianza basándose en la posición de las ramas soportadas porbootstrapen el árbol filogenético de referencia en relación a la colocación de la secuencia de la UTO que se está interrogando. Se pueden asignar anotaciones funcionales a las secuencias de ácidos nucleicos mediante los métodos descritos anteriormente.

Asignaciones de clado.

Las asignaciones de clado se llevaron a cabo generalmente utilizando secuencias de longitud completa de ADNr 16S y de V4. La capacidad de identificación de las UTO 16S-V4 para asignar una UTO a una especie específica depende en parte de la capacidad de resolución de la región 16S-V4 del gen 16S para una especie o grupo de especies particular. Tanto la densidad de las secuencias 16S de referencia disponibles para diferentes regiones del árbol, como la variabilidad inherente en el gen de 16S entre diferentes especies, determinarán el carácter definitivo de una anotación taxonómica. Dada la naturaleza topológica de un árbol filogenético y el hecho de que el árbol representa relaciones jerárquicas de las UTO entre sí, basadas en su similitud de secuencia y un modelo evolutivo subyacente, las anotaciones taxonómicas de una lectura pueden consolidarse a un nivel superior utilizando un procedimiento de asignación basado en clados. Los clados se definen basándose en la topología de un árbol filogenético que se construye a partir de secuencias 16S de longitud completa utilizando métodos de máxima verosimilitud u otros modelos filogenéticos conocidos por el experto habitual en la materia de la filogenética. Las clados se construyen para garantizar que todas las UTO en un clado dado están: (i) separadas por un número especificado de nodos soportados porbootstrap(generalmente, 1 a 5bootstraps), y (ii) comparten un porcentaje definido de similitud (para datos moleculares de 16S típicamente establecido en 95 % a 97 % de similitud de secuencias). Las UTO que están dentro del mismo clado pueden distinguirse como genética y filogenéticamente distintos de las UTO en un clado diferente, basado en datos de secuencia de 16S-V4. Las UTO comprendidas dentro del mismo clado están evolutivamente relacionadas y pueden o no ser distinguibles entre sí utilizando datos de secuencia 16S-V4. El poder del análisis basado en clados es que los miembros del mismo clado, debido a su relación evolutiva, probablemente desempeñen roles funcionales similares en una ecología microbiana, tales como la observada en el intestino humano. Las composiciones que sustituyen una especie por otra del mismo clado probablemente presenten una función ecológica conservada y, por lo tanto, resulten útiles de acuerdo con la presente exposición. En particular, además de las secuencias de 16S-V4, se puede utilizar el análisis basado en clados para analizar secuencias génicas de 18S, ITS y otras secuencias.

Especialmente, las secuencias de 16S de los aislados de una UTO determinada se colocan filogenéticamente dentro de sus respectivos clados, en ocasiones en conflicto con la asignación basada en la microbiología de especies y géneros que puede haber precedido la asignación basada en 16S. Es conocido que existen discrepancias entre las asignaciones taxonómicas basadas en características microbiológicas y en la secuenciación génica, de acuerdo con la literatura.

Para una ecología de red o ecología funcional de red dada, se puede definir un conjunto de UTO a partir de los clados representativos de la red. A título de ejemplo, si una red comprende clado_100 y clado_102, se puede decir que está compuesta de por lo menos una UTO del grupo que consiste enCorynebacterium coyleae, Corynebacterium mucifaciens,yCorynebacterium ureicelerivorans,y por lo menos un UTO del grupo que consiste enCorynebacterium appendicis, Corynebacterium genitalium, Corynebacterium glaucum, Corynebacterium imitans, Corynebacterium riegelii, Corynebacteriumsp. L_2012475,Corynebacteriumsp. NML 93_0481,Corynebacterium sundsvallense,yCorynebacterium tuscaniae(ver la Tabla 1). A la inversa, a modo de ejemplo, si se afirmara que una red consiste enCorynebacterium coyleaey/oCorynebacterium mucifaciensy/oCorynebacterium ureicelerivoransy también consiste enCorynebacterium appendicisy/oCorynebacterium genitaliumy/oCorynebacterium glaucumy/oCorynebacterium imitansy/oCorynebacterium riegeliiy/oCorynebacteriumsp. L_2012475 y/oCorynebacteriumsp. NML 93_0481 y/oCorynebacterium sundsvallensey/oCorynebacterium tuscaniae, se puede afirmar que comprende clado_100 y clado_102.

Los solicitantes han realizado asignaciones de clado a todas las UTO dadas a conocer en la presente memoria utilizando el método descrito anteriormente y estas asignaciones se presentan en la Tabla 1. Los resultados del análisis de red proporcionan, en algunos casos, p. ej., de composiciones, la sustitución del clado_172 por el clado_172i. En otro caso, el análisis de red proporciona la sustitución del clado_198 por el clado_198i. En otro caso, el análisis de la red permite la sustitución del clado_260 por el clado_260c, el clado_260g o el clado_260h. En otro caso, el análisis de la red permite la sustitución del clado_262 por el clado_262i. En otro caso, el análisis de red permite la sustitución del clado_309 por el clado_309c, el clado_309e, el clado_309g, el clado_309h o el clado_309i. En otro caso, el análisis de red permite la sustitución del clado_313 por el clado_313f. En otro caso, el análisis de red permite la sustitución del clado_325 por clado_325f. En otro caso, el análisis de red permite la sustitución del clado_335 por el clado_335i. En otro caso, el análisis de red permite la sustitución del clado_351 por el clado_351e. En otro caso, el análisis de red permite la sustitución del clado_354 por el clado_354e. En otro caso, el análisis de la red permite la sustitución del clado_360 por el clado_360c, el clado_360g, el clado_360h o el clado_360i. En otro caso, el análisis de red permite la sustitución del clado_378 por el clado_378e. En otro caso, el análisis de red permite la sustitución del clado_38 por el clado_38e o el clado_38i. En otro caso, el análisis de la red permite la sustitución del clado_408 por el clado_408b, el clado_408d, el clado_408f, el clado_408g o el clado_408h. En otro caso, el análisis de red permite la sustitución del clado_420 por el clado_420f. En otro caso, el análisis de red permite la sustitución del clado_444 por el clado_444i. En otro caso, el análisis de red permite la sustitución del clado_478 por el clado_478i. En otro caso, el análisis de red permite la sustitución del clado_479 por el clado_479c, por el clado_479g o por el clado_479h. En otro caso, el análisis de la red permite la sustitución del clado_481 por el clado_481a, el clado_481b, el clado_481e, el clado_481g, el clado_481h o por el clado_481i. En otro caso, el análisis de la red permite la sustitución del clado_497 por el clado_497e o por el clado_497f. En otro caso, el análisis de red permite la sustitución del clado_512 por el clado_512i. En otro caso, el análisis de la red permite las sustituciones del clado_516 por el clado_516c, por el clado_516g o por el clado_516h. En otro caso, el análisis de red permite las sustituciones del clado_522 por el clado_522i. En otro caso, el análisis de red permite las sustituciones del clado_553 por el clado_553i. En otro caso, el análisis de red permite las sustituciones del clado_566 por el clado_566f. En otro caso, el análisis de red permite las sustituciones del clado_572 por el clado_572i. En otro caso, el análisis de red permite las sustituciones del clado_65 por el clado_65e. En otro caso, el análisis de la red permite sustituciones del clado_92 por el clado_92e o por el clado_92i. En otro caso, el análisis de la red permite sustituciones del clado_96 por el clado_96g o por el clado_96h. En otro caso, el análisis de red permite las sustituciones del clado_98 por el clado_98i. Estas sustituciones de clados permitidas se presentan en la Tabla 2.

Anotación de lecturas metagenómicas.

Los datos de secuenciación metagenómica o de secuenciación de genoma completo mediante técnica de escopeta génica se anotan tal como se ha indicado anteriormente, con la etapa adicional de que las secuencias se agrupan o se ensamblan antes de la anotación. Después de la caracterización de la secuencia tal como se ha indicado anteriormente, las lecturas de la secuencia se desmultiplexan utilizando la indexación (es decir, los códigos de barras). Las siguientes lecturas de secuencia de desmultiplexación: (i) se agrupan utilizando un algoritmo de agrupamiento rápido, tal como, aunque sin limitación, UCLUST (http://drive5.com/usearch/manual/uclust_algo.html) o métodos de hash, tales como VICUNA (Xiao Yang, Patrick Charlebois, Sante Gnerre, Matthew G Coole, Niall J. Lennon, Joshua Z. Levin, James Qu, Elizabeth M. Ryan, Michael C. Zody y Matthew R. Henn.2012. De novo assembly of highly diverse viral populations. BMC Genomics 13:475). Después de la agrupación, se identifica y analiza una lectura representativa para cada agrupación tal como se ha indicado anteriormente en "Anotación de lecturas primarias". El resultado de la anotación primaria se aplica seguidamente a todas las lecturas en una agrupación dada. (ii) Una segunda estrategia para el análisis de secuencias metagenómicas es la ensamblaje del genoma seguido de la anotación de ensamblajes genómicos utilizando una plataforma tal como, aunque sin limitación, MetAMOS (Treangen et al.2013 Genome Biology 14:R2), HUMAaN (Abubucker et al.2012. Metabolic Reconstruction for Metagenomic Data and Its Application to the Human Microbiome ed. J.A. Eisen. PLoS Computational Biology 8: e1002358) y otros métodos que resultarán familiares para el experto en la materia.

Ejemplo 14. Identificación de UTO utilizando técnicas de cultivo microbiano.

La identidad de las especies bacterianas que crecen a partir de una fracción compleja se puede determinar de múltiples maneras. Por ejemplo, las colonias individuales se pueden seleccionar en medios líquidos en un formato de 96 pocillos, cultivarse y conservarse en forma de reservas en glicerol al 15 % a -80 °C. Se pueden añadir alícuotas de las cultivos a un tampón de lisis celular y utilizarse métodos de PCR de colonias para amplificar y secuenciar el gen de ADNr 16S (Ejemplo 1). Alternativamente, las colonias pueden purificarse mediante siembra con asa en varios subcultivos sobre medio sólido. Se siembran colonias bien separadas en placas nuevas del mismo tipo y se incuban durante 48 a 72 horas a 37 °C. El procedimiento se repite varias veces para asegurar la pureza. Los cultivos puros pueden analizarse mediante métodos basados en el fenotipo o en secuencias, incluyendo la amplificación y secuenciación de ADNr 16S tal como se describe en el Ejemplo 1. La caracterización de secuencias de aislados puros o comunidades mixtas, p. ej., raspados de placas y fracciones de esporas, también puede incluir la secuenciación de genoma completo mediante técnica de secuenciación de escopeta. Ésta última técnica resulta valiosa para determinar la presencia de genes asociados a esporulación, resistencia a antibióticos, patogenicidad y virulencia. Las colonias también pueden rasparse de placas en masa y secuenciarse utilizando un método de secuenciación masiva en paralelo, tal como se describe en el Ejemplo 1, de modo que se puedan identificar firmas individuales de 16S en una mezcla compleja. Opcionalmente, la muestra puede secuenciarse antes de la germinación (si se utilizan procedimientos de aislamiento de ADN apropiados para lisar y liberar el ADN de las esporas) con el fin de comparar la diversidad de especies germinables con el número total de especies en una muestra de esporas. Como un enfoque alternativo o complementario al análisis de 16S, también puede utilizarse la espectrometría de masas MALDI-TOF para la identificación de especies (Barreau et al., 2013.). Improving the identification of anaerobes in the clinical microbiology laboratory through MALDI-TOF mass spectrometry. Anaerobe 22: 123-125).

Ejemplo 15. Enfoques para la identificación de cepas microbiológicas

Los aislados bacterianos puros pueden identificarse mediante métodos microbiológicos, tal como se describe en Wadsworth-KTL Anaerobic Microbiology Manual (Jouseimies-Somer et al., 2002. Wadsworth-KTL Anaerobic Bacteriology Manual) y The Manual of Clinical Microbiology (ASM Press, 10a edición). Estos métodos se basan en los fenotipos de las cepas e incluyen la tinción de Gram para confirmar el comportamiento de tinción positivo o negativo de la cubierta celular, la observación de las morfologías de las colonias en medio sólido, la motilidad, la morfología celular observada microscópicamente a 60x o 100x de ampliación, incluida la presencia de endosporas bacterianas y flagelos. Se llevan a cabo análisis bioquímicos que discriminan entre géneros y especies utilizando agares selectivos y diferenciales apropiados y/o kits comerciales disponibles para la identificación de bacterias gram-negativas y grampositivas, y levaduras, por ejemplo, ensayos RapID (Remel) o ensayos API (bioMerieux). También se pueden llevar a cabo ensayos de identificación similares utilizando instrumental tal como el sistema Vitek 2 (bioMerieux). También pueden llevarse a cabo ensayos fenotípicos que discriminan entre géneros, especies y cepas (por ejemplo, la capacidad de utilizar diversas fuentes de carbono y nitrógeno) utilizando métodos de detección de crecimiento y actividad metabólica, tales como, por ejemplo, las microplacas de identificación microbiana Biolog. El perfil de producción de ácidos grasos de cadena corta durante la fermentación de fuentes de carbono particulares también puede usarse como una forma de discriminar entre especies (Wadsworth-KTL Anaerobic Microbiology Manual, Jousimies-Somer, et al 2002). La espectrometría de masas MALDI-TOF también se puede utilizar para la identificación de especies (tal como en la revisión proporcionada en Anaerobe 22:123).

Ejemplo 16. Construcción de un ensayo in vitro para seleccionar combinaciones de microorganismos inhibitorios del crecimiento de E. coli patogénicas.

Una modificación del ensayoin vitrodescrito en la presente memoria se utiliza para seleccionar combinaciones de bacterias inhibitorias del crecimiento deE. coli.En general, el ensayo se modifica mediante la utilización de un medio adecuado para el crecimiento del inóculo del patógeno. Por ejemplo, entre los medios adecuados se incluyen medio clostridial reforzado (RCM, por sus siglas en inglés), caldo de infusión de cerebro y corazón (BHI, por sus siglas en inglés) o caldo de Luria-Bertani (LB) (también conocido como "caldo de lisogenia"). Se cuantificaE. colimediante la utilización de medios selectivos alternativos específicos paraE. colio utilizando sondas de qPCR específicas para el patógeno. Por ejemplo, el crecimiento aerobio en medio de MacConkey con lactosa selecciona bacterias Gramnegativas entéricas, incluyendoE.coli.Se lleva a cabo una qPCR utilizando sondas específicas para la toxina shiga de lasE. colipatogénicas.

En general, el método se puede utilizar para someter a ensayo composicionesin vitropara su capacidad de inhibir el crecimiento de cualquier patógeno que se pueda cultivar.

Ejemplo 17. Construcción de un ensayo in vitro para seleccionar combinaciones de microorganismos inhibitorios del crecimiento de Enterococcus resistente a vancomicina (VRE).

El ensayoin vitrose puede utilizar para detectar combinaciones de bacterias que inhiben el crecimiento deEnterococcusspp. resistentes a vancomicina (VRE) mediante modificación del medio utilizado para el crecimiento del inóculo de patógeno. Se pueden utilizar varias opciones de medios para el crecimiento del patógeno, tales como el medio clostridial reforzado (RCM), el caldo de infusión de corazón y cerebro (BHI) o el caldo de Luria-Bertani (LB). Se cuantifica VRE mediante la utilización de medios selectivos alternativos específicos para VRE o utilizando sondas de qPCR específicas para el patógeno. Por ejemplo, el agar m-Enterococcusque contiene azida sódico es selectivo paraEnterococcusspp. y un pequeño número de otras especies. Se utilizan sondas conocidas de la técnica que son específicas para los genes van que confieren resistencia a la vancomicina en el qPCR, o se pueden diseñar tales sondas utilizando métodos conocidos de la técnica.

Ejemplo 18. Ensayo in vitro de cribado de composiciones bacterianas para la inhibición de Salmonella.

El ensayoin vitrodescrito en la presente memoria se puede utilizar para detectar combinaciones de bacterias que inhiben el crecimiento deSalmonellaspp. mediante modificación del medio utilizado para el crecimiento del inóculo de patógeno. Se pueden utilizar varias opciones de medios para el crecimiento del patógeno, tales como el medio clostridial reforzado (RCM), el caldo de infusión de corazón y cerebro (BHI) o el caldo de Luria-Bertani (LB). Se cuantifican las especies deSalmonellautilizando medios selectivos alternativos específicos para especies deSalmonellao utilizando sondas de qPCR específicas para el patógeno. Por ejemplo, el agar MacConkey se utiliza para seleccionarSalmonellaspp. y la diana de las sondas de qPCR es el geninvA; este gen codifica una proteína de invasión llevada por muchasSalmonellaspp. patogénicas y se utiliza para invadir células eucarióticas.

Ejemplo 19. Validación in vivo de la eficacia de las composiciones bacterianas de ecología de red para la prevención de la infección por Clostridium difficile en un modelo murino.

Para someter a ensayo el potencial terapéutico de la composición bacteriana, se utilizó un modelo de ratón profiláctico de infección porC. difficile(modelo basado en Chen et al., 2008. A mouse model of Clostridium difficile-associated disease. Gastroenterology 135: 1984-1992). En resumen, se sometieron a ensayo dos jaulas de cinco ratones cada una para cada grupo del experimento. Todos los ratones recibieron un cóctel de antibióticos que consistía en 10 % de glucosa, kanamicina (0,5 mg/ml), gentamicina (0,044 mg/ml), colistina (1062,5 U/ml), metronidazol (0,269 mg/ml), ciprofloxacino (0,156 mg/ml), ampicilina (0,1 mg/ml) y vancomicina (0,056 mg/ml) en su agua de bebida entre los días -14 y -5, y una dosis de 10 mg/kg de clindamicina por sonda oral el día -3. El día -1, los artículos de ensayo se centrifugaron durante 5 minutos a 12.100 rcf; se eliminaron los sobrenadantes y los pellets que quedaban se resuspendieron en PBS estéril, prerreducidos si la composición bacteriana no estaba en forma de esporas, y se administraron mediante sonda oral. El día 0, se presentó un reto a los ratones mediante la administración de aproximadamente 4,5 log10UFC deC. difficile(ATCC n.º 43255) o PBS estéril (para el grupo nunca expuesto o "ingenuo") mediante sonda oral. Opcionalmente, un grupo de control positivo recibió vancomicina desde el día -1 hasta el día 3, además del protocolo de antibióticos y el reto deC. difficileespecificado anteriormente. Se recogieron muestras fecales de las jaulas para el análisis de la carga bacteriana. Se evaluó la mortalidad, el peso y la puntuación clínica de los síntomas deC. difficilebasada en una escala de 0 a 4, mediante la combinación de las puntuaciones de apariencia (0 a 2 puntos basados en normal, encorvado, piloerección o letárgico) y signos clínicos (0 a 2 puntos basados en normal, cola húmeda, frío al tacto o aislamiento de otros animales), con una puntuación de 4 en caso de muerte, y se evaluaron todos los días entre el día -2 y el día 6. Se calculó el peso mínimo medio respecto al día -1 y la puntuación clínica máxima media, en donde se asignó una puntuación clínica de 4 a una muerte, así como la mortalidad acumulada media. Se utilizó la reducción de la mortalidad, el aumento del peso mínimo medio respecto al día -1 y la reducción de la puntuación clínica máxima media con muerte asignada a una puntuación de 4 respecto al control de vehículo para evaluar el éxito del artículo de ensayo.

Las Tablas 9 y 10 presentan los resultados de catorce experimentos en el modelo profiláctico de ratón de infección porC. difficile, en donde el tratamiento fue con una composición bacteriana. En los catorce experimentos, 157 de los grupos sometieron a ensayo ecologías de red, y se sometieron a ensayo 86 ecologías de red distintas (Tabla 10). La indicación de eficacia de una composición (artículo de ensayo) en estos experimentos es una baja mortalidad acumulada de la composición de ensayo respecto al control de vehículo, un peso relativo mínimo medio de por lo menos 0,85 (p. ej., por lo menos 0,90, por lo menos 0,95 o por lo menos 0,97), y una puntuación clínica máxima media inferior a 1, por ejemplo, de 0,9, 0,8, 0,7, 0,5, 0,2 o 0. De los 157 grupos del experimento, 136 de los grupos y 73 de las redes presentaron un mejor desempeño que el grupo de control de vehículo del experimento respectivo en por lo menos una de las siguientes métricas: mortalidad acumulada, peso relativo mínimo medio y puntuación clínica máxima media. Entre los ejemplos de redes eficaces se incluyen, aunque sin limitación, redes N1979 sometidas a ensayo en SP-361, que presentó una mortalidad acumulada de 0 %, un peso relativo mínimo medio de 0,97 y una puntuación clínica máxima media de 0, o N2007, que presentó una mortalidad acumulada de 10 %, un peso relativo mínimo medio de 0,91 y una puntuación clínica máxima media de 0,9, con ambas redes en comparación con el control de vehículo en SP-361, que presentó una mortalidad acumulada de 30 %, un peso relativo mínimo medio de 0,88 y una puntuación clínica máxima media de 2,4. En SP-376, N1962 no presentó mortalidad acumulada, con puntuaciones clínicas máximas medias de 0 a ambas dosis diana sometidas a ensayo y pesos relativos mínimos medios de 0,98 y 0,95 para las dosis diana de 1x10<8>y 1x10<7>UFC/UTO/ratón, respectivamente. Estos resultados confirman que las composiciones bacterianas compuestas por combinaciones binarias y terciarias son eficaces, tal como se demuestra en el modelo de ratón.

Ejemplo 20. Validación in vivo de la eficacia de la composición bacteriana de ecología de red en un modelo profiláctico y de prevención de recaídas de hámster.

Los estudios previos con hámsteres utilizando cepas toxigénicas y no toxigénicas deC. difficilehan demostrado la utilidad del modelo de hámster en el examen de la recaída después del tratamiento con antibióticos y los efectos de los tratamientos profilácticos con la flora cecal en la infección porC. difficile(Wilson et al., 1981. Infect Immun 34:626-628), Wilson et al., 1983. J Infect Dis 147:733, Borriello et al., 1985. J Med Microbiol 19:339-350) y más ampliamente en enfermedades infecciosas gastrointestinales. De acuerdo con lo anterior, para demostrar el uso profiláctico de composiciones bacterianas que comprenden unidades taxonómicas operativas específicas para aliviar la infección porC. difficile, se utilizó el siguiente modelo de hámster. Se administró clindamicina (10 mg/kg s.c.) a los animales el día -5, se administró la composición de ensayo o el control el día -3, y el reto deC. difficilese realizó el día 0. En el grupo de control positivo, se administró vancomicina los días 1 a 5 (y el control de vehículo se administró el día -3). Se recogieron muestras fecales los días -5, -4, -1, 1, 3, 5, 7, 9 y se evaluaron para carga y reducción de patógenos mediante métodos microbiológicos. Los enfoques de secuenciación de 16S u otros métodos también podrían ser utilizados por el experto en la materia. Se evaluó la mortalidad varias veces al día durante los 21 días posteriores al reto deC. difficile. Las curvas de porcentaje de supervivencia mostraron que una composición bacteriana (N1962) compuesta por UTO que se había mostrado que eran inhibitorias deC. difficileen un ensayo de inhibiciónin vitro(ver ejemplos anteriores) protegieron mejor a los hámsteres que el control de vancomicina y el control de vehículo (figura 5).

Estos datos demuestran la eficacia de una composiciónin vivo,así como la utilidad de utilizar un método de inhibiciónin vitrotal como el descrito en la presente memoria para predecir composiciones que poseen actividadin vivo.

Ejemplo 21. Método de preparación de una composición bacteriana para la administración a un sujeto.

Se cultivaron de manera independiente dos o más cepas que comprendían la composición bacteriana y se mezclaron antes de la administración. Se cultivaron independientemente ambas cepas a 37 °C, pH 7, en un medio GMM u otro medio libre de productos de origen animal, prerreducido con 1 g/l de HCl de cisteína. Después de que cada cepa alcanzase una biomasa suficiente, se conservó en un banco mediante la adición de glicerol al 15 % y congelación a -80 °C en tubos criogénicos de 1 ml.

A continuación, se cultivó cada cepa a una densidad de 10<10>UFC/ml, y después se concentró 20 veces mediante microfiltración por flujo tangencial; el medio agotado se reemplazó mediante diafiltración por un medio conservante que consistía en 2 % de gelatina, 100 mM de trehalosa y 10 mM de tampón de fosfato sódico, u otro medio conservante adecuado. Se liofilizó la suspensión hasta producir unos polvos y se tituló.

Después del secado, los polvos se mezclaron con celulosa microcristalina y estearato de magnesio y se formularon en una cápsula de gelatina de 250 mg que contenía 10 mg de polvos liofilizados (10<8>a 10<11>bacterias), 160 mg de celulosa microcristalina, 77,5 mg de gelatina y 2,5 mg de estearato de magnesio.

Se puede obtener una composición bacteriana mediante la fraccionación selectiva de las UTO bacterianas deseadas de un material en bruto tal como, aunque sin limitación, heces. A título de ejemplo, se preparó una suspensión al 10 % p/v de material fecal humano en PBS que se filtró, se centrifugó a baja velocidad y después se mezcló el sobrenadante que contenía esporas con etanol absoluto en una proporción 1:1 y se se sometió a agitación con vórtex para mezclar. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la incubación, la suspensión se centrifugó a alta velocidad para concentrar las esporas en un pellet que contenía una preparación purificada de esporas. Se descartó el sobrenadante y el pellet se resuspendió en una masa igual de glicerol, y la preparación de esporas purificadas se introdujo en cápsulas y se almacenó a -80 °C; esta preparación se denomina población de esporas tratadas con etanol.

Ejemplo 22. Método para tratar a un sujeto con infección recurrente por C. difficile con una composición bacterianaEn un ejemplo, un sujeto ha sufrido episodios recurrentes deC. difficile.En la fase aguda más reciente de la enfermedad, al sujeto se le trata con un antibiótico suficiente para mejorar los síntomas de la enfermedad. Para prevenir otra recaída de infección porC. difficile, se administra al sujeto una composición bacteriana descrita en la presente memoria. Por ejemplo, al sujeto se le administra una de las presentes composiciones bacterianas a una dosis comprendida en el intervalo de 1x10<7>a 1x10<12>, p. ej. en una forma liofilizada, en una o más cápsulas de gelatina (p. ej., 2, 3, 4, 5, 10, 15 o más cápsulas) que contienen 10 mg de bacterias liofilizadas y componentes estabilizantes. La cápsula se administra por vía oral y el sujeto reanuda una dieta normal después de 4, 8, 12 o 24 horas. En otra realización, el sujeto puede tomar la cápsula por vía oral antes, durante o inmediatamente después de una comida. En una realización adicional, el sujeto toma la dosis diariamente durante un período de tiempo especificado.

Se recoge la muestra de materia fecal del sujeto antes y después del tratamiento. En una realización, se recoge la muestra fecal 1 día, 3 días, 1 semana y 1 mes después de la administración. Se confirma la presencia de C.difficileen las heces antes de la administración de la composición bacteriana, pero las muestras de heces recogidas después de la administración muestran una reducción en el nivel deC. difficileen las heces (por ejemplo, de por lo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 %) hasta niveles no detectables deC. difficile,según medición mediante qPCR y, en su caso, en comparación con el microbioma de un sujeto de referencia sano, tal como se ha indicado anteriormente. Normalmente, la cuantificación se lleva a cabo utilizando material extraído de las mismas cantidades de material inicial, por ejemplo, heces. También puede utilizarse un ELISA para la proteína toxina o técnicas tradicionales de identificación microbiológica. El tratamiento eficaz se define como una reducción en la cantidad deC. difficilepresente después del tratamiento.

En algunos casos, el tratamiento eficaz, es decir, una respuesta positiva al tratamiento con una composición dada a conocer en la presente memoria, se define como la ausencia de diarrea, que a su vez se define como 3 o más heces sueltas o líquidas al día durante por lo menos 2 días consecutivos o 8 o más heces sueltas o líquidas en 48 horas, o diarrea persistente (debido a otras causas) con ensayo de heces negativo (tres veces) para toxinas deC. difficile.El fallo en el tratamiento se define como diarrea persistente con un ensayo de toxina en heces positivo paraC. difficileo sin reducción en los niveles deC. difficile,según lo medido mediante secuenciación por qPCR. Se pueden utilizar técnicas de identificación microbiológica tradicionales o ELISA.

En algunos casos, el tratamiento eficaz se determina por la falta de recurrencia de signos o síntomas de infección porC.difficileen las, p. ej., 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 10 semanas, 12 semanas, 16 semanas, 20 semanas, o 24 semanas posteriores al tratamiento.

Ejemplo 23. Tratamiento de sujetos con enfermedad diarreica asociada a Clostridium difficile con una composición bacteriana.

Injerto de poblaciones microbianas, potenciación y reducción de la carga de patógenos en pacientes tratados con composiciones de esporas.

Se utilizaron métodos genómicos y microbiológicos complementarios para caracterizar la composición de la microbiota de 15 sujetos con enfermedad asociada aC. difficilerecurrente (DADC) que fueron tratados con una composición bacteriana. El microbioma de estos sujetos se caracterizó pretratamiento y inicialmente hasta 4 semanas después del tratamiento y posteriormente hasta 24 semanas. Se trataron 15 sujetos adicionales y se recopilaron datos para esos sujetos durante por lo menos 8 semanas después del tratamiento y hasta 24 semanas después del tratamiento. Las composiciones bacterianas utilizadas para el tratamiento estaban compuestas por bacterias formadoras de esporas y constituyen una ecología microbiana de esporas obtenida a partir de heces humanas saludables. Los métodos para preparar tales composiciones se pueden encontrar en el documento n.º PCT/US2014/014715.

Se proporcionan en la Tabla 11 las UTO y clados de ejemplo no limitativo de los microorganismos formadores de esporas identificados en las composiciones iniciales. Las UTO y clados en el tratamiento de ecología de esporas se observaron en 1 a 15 de los 15 sujetos iniciales tratados (Tabla 11) y en sujetos tratados posteriormente. El tratamiento de los sujetos con la ecología de esporas microbianas resolvió la enfermedad asociada aC. difficile(DADC) en todos los sujetos tratados. Además, el tratamiento con la composición de esporas microbianas condujo a la reducción o eliminación de los patobiontes Gram(-) y Gram(+) incluyendo, aunque sin limitación, patobiontes con resistencia a múltiples fármacos tales como, aunque sin limitación, enterococos resistentes a vancomicina (ERV) y bacterias resistentes a carbapenémicos o imipenem. Además, el tratamiento condujo a un aumento de la diversidad microbiana total del microbioma intestinal de los sujetos (figura 6) y la comunidad microbiana resultante que se estableció como resultado del tratamiento con la ecología de esporas microbianas era diferente del microbioma antes del tratamiento y representaba más de cerca el microbioma de un individuo saludable que el de un individuo con DADC (figura 7).

Utilizando nuevos enfoques computacionales, los solicitantes delinearon las UTO bacterianas asociadas a injerto y la potenciación ecológica, así como el establecimiento de una ecología microbiana más diversa en pacientes tratados con una preparación de esporas tratadas con etanol (Tabla 11). Las UTO que comprenden una ecología potenciada son las presentes en el paciente por debajo del límite de detección antes del tratamiento y/o que se encuentran a frecuencias extremadamente bajas de modo que no constituyen una fracción significativa de la carga microbiana total y no son detectables mediante métodos de ensayo genómico y/o microbiológico en la composición bacteriana. Las UTO que son miembros de las ecologías de injerto y potenciadas se identificaron mediante caracterización de las UTO que se incrementan en su abundancia relativa después del tratamiento y que respectivamente están: (i) presentes en la preparación de esporas tratadas con etanol y ausentes en el pretratamiento del paciente (UTO de injerto), o (ii) ausentes en la preparación de esporas tratadas con etanol, pero que se incrementan en su abundancia relativa con el tiempo después del tratamiento con la preparación debido al establecimiento de condiciones de crecimiento favorables mediante el tratamiento (UTO potenciadoras). Cabe destacar que las UTO potenciadoras puede crecer a partir de reservorios de baja frecuencia en el sujeto, o introducirse a partir de fuentes exógenas, tales como la dieta.

Especialmente, las secuencias de 16S de los aislados de una UTO dada están colocadas filogenéticamente dentro de sus respectivos clados, a pesar de que la asignación taxonómica real de especie y género puede sugerir que son taxonómicamente distintos de otros miembros de los clados en los que se encuentran. Existen discrepancias entre los nombres taxonómicos dados a una UTO basadas en características microbiológicas y los obtenidos mediante secuenciación génica, según la literatura. Las UTO anotadas en esta tabla es conocido que son discrepantes entre los diferentes métodos de asignación de un nombre taxonómico.

Diseño racional de composiciones terapéuticas a partir de ecologías troncales.

Para definir la ecología troncal subyacente a la notable eficacia clínica de las esporas bacterianas microbianas, se llevó a cabo el siguiente análisis. La composición de UTO de la ecología de esporas microbianas se determinó mediante la secuenciación del ADNr 16S-V4 y la asignación computacional de las UTO según el Ejemplo 13. Se estableció un requisito para detectar por lo menos diez lecturas de secuencia en la ecología de esporas microbianas como un umbral conservador para definir únicamente las UTO que era muy poco probable que surgiesen a partir de errores durante la amplificación o la secuenciación. Los métodos rutinariamente utilizados por las personas familiarizadas con la técnica de la caracterización del microbioma basada en la genómica utilizan un umbral de abundancia relativa de lectura de 0,005 % (ver, p. ej., Bokulich et al. 2013 Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing. Nature Methods 10: 57-59), lo que equivaldría a ≥2 lecturas dado la profundidad de secuenciación obtenida para las muestras analizadas en el presente ejemplo, como punto de corte que es sustancialmente más bajo que las ≥10 lecturas utilizadas en el presente análisis. Se realizaron todas las asignaciones taxonómicas y de clados para cada UTO tal como se describe en el Ejemplo 13. La lista resultante de las UTO, asignaciones de clados y frecuencia de detección en las preparaciones de esporas se muestran en la Tabla 11.

Las UTO que componen una composición bacteriana "troncal" de una ecología microbiana de esporas, ecología potenciada o ecología injertada se pueden definir a partir del porcentaje de sujetos totales en los que se observan; cuanto mayor sea este porcentaje, más probable es que sean parte de una ecología troncal responsable de catalizar un cambio que la aleje de una ecología disbiótica. En un caso, las composiciones bacterianas terapéuticas se diseñan racionalmente mediante la identificación de las UTO que ocurren en el mayor número de sujetos evaluados. En una realización, las UTO que ocurren en el 100 % de los sujetos definen una composición bacteriana terapéutica. En otros casos, las UTO que se define que ocurren en ≥90 %, ≥80 %, ≥70 %, ≥60 % o ≥50 % de los sujetos evaluados comprenden la composición bacteriana terapéutica. En un caso adicional, las UTO que se encuentran en 100 %, ≥90 %, ≥80 %, ≥70 %, ≥60 % o ≥50 % se refinan adicionalmente para diseñar racionalmente una composición bacteriana terapéutica utilizando parámetros filogenéticos u otras características, tales como su capacidad para metabolizar ácidos biliares secundarios, inducir la señalización inmune de TH17 o producir ácidos grasos de cadena corta.

En un caso adicional, las UTO dominantes en una ecología pueden identificarse utilizando varios métodos, incluyendo, aunque sin limitación, la definición de las UTO que presentan la mayor abundancia relativa en las ecologías potenciadas o injertadas y la definición de un umbral total de abundancia relativa. A título de ejemplo, las UTO dominantes en la ecología potenciada del Paciente-1 se identificaron mediante la definición de las UTO con la mayor abundancia relativa, que en conjunto comprenden el 60 % de la carga microbiana en la ecología potenciada de este paciente para el día 25 postratamiento.

En un caso adicional, se asigna una UTO como miembro de la ecología troncal de la composición bacteriana, y se debe mostrar que esta UTO se injerta en un paciente. El injerto es importante por como mínimo dos razones. En primer lugar, se cree que el injerto es un requisito imprescindible del mecanismo para remodelar el microbioma y eliminar la colonización porC. difficile. Las UTO que se injertan con mayor frecuencia presentan una alta probabilidad de ser un componente de la ecología troncal de la preparación de esporas o, en términos generales, una composición bacteriana establecida. En segundo lugar, las UTO detectadas mediante secuenciación de una composición bacteriana pueden incluir células no viables u otras moléculas de ADN contaminantes no asociadas a la composición. El requisito de que una UTO debe mostrarse que se injerta en el paciente elimina las UTO que representan células no viables o secuencias contaminantes. Las UTO que están presentes en un gran porcentaje de la composición bacteriana, p. ej., las preparaciones de esporas en etanol analizadas y que se injertan en un gran número de pacientes representan un subconjunto de la ecología troncal que presenta una alta probabilidad de catalizar el cambio de una ecología de enfermedad disbiótica a un microbioma saludable. Las UTO a partir de las cuales se definen dichas composiciones bacterianas terapéuticas derivadas de UTO que se injertan se indican en la Tabla 11.

Se aplicó una tercera lente para refinar adicionalmente los hallazgos en la ecología troncal de la composición bacteriana (p. ej., la ecología de esporas microbianas). El análisis de redes basado en computación ha permitido la descripción de las ecologías microbianas presentes en la microbiota de una amplia población de individuos sanos. Estas ecologías de red están compuestas por múltiples UTO, algunas de los cuales se definen como UTO clave. Las UTO clave son UTO definidas computacionalmente que ocurren en un gran porcentaje de redes computadas y cumplen con los criterios de que las redes en las que ocurren son altamente prevalentes en la población de sujetos evaluados. Las UTO clave forman una base para las ecologías microbianas en las que se encuentran y, como tal, son cruciales para el funcionamiento de las ecologías de red en sujetos sanos. Las UTO clave asociadas a ecologías microbianas en sujetos sanos frecuentemente están ausentes o existen a niveles reducidos en sujetos con enfermedades. Las UTO clave pueden existir en abundancia baja, moderada o alta en los sujetos.

Hay varios hallazgos importantes a partir de estos datos. Se detecta un número relativamente pequeño de especies, 11 en total, en todas las preparaciones de esporas obtenidas de 6 donantes y 10 donaciones. Esto resulta inesperado porque la base de datos HMP (www.hmpdacc.org) describe la enorme variabilidad de las especies comensales entre individuos sanos. La presencia de un pequeño número de UTO consistentes apoya el concepto de ecología troncal y redes troncales. Los datos de injerto respaldan adicionalmente esta conclusión.

En otro caso, tres factores: la prevalencia en la composición bacteriana, tal como, aunque sin limitación, una preparación de esporas, la frecuencia de injerto y la designación como UTO clave, facilitaron la creación de un "puntuación de ecología troncal" (PET) para clasificar UTO individuales. Se definió la PET de la siguiente manera:

● Ponderación del 40 % para la presencia de UTO en la preparación de esporas

∘ multiplicador de 1 para la presencia en 1 a 3 preparaciones de esporas

∘ multiplicador de 2,5 para la presencia en 4 a 8 preparaciones de esporas

∘ multiplicador de 5 para la presencia en ≥ 9 preparaciones de esporas

● Ponderación del 40 % para la injertación en un paciente

∘ multiplicador de 1 para la injertación en 1 a 4 pacientes

∘ multiplicador de 2,5 para la injertación en 5 a 6 pacientes

∘ multiplicador de 5 para la injertación en ≥7 pacientes

● Ponderación del 20 % a las UTO clave

∘ multiplicador de 1 para una OTU clave

∘ multiplicador de 0 para una OTU no clave

Usando esta guía, la PET presenta una puntuación máxima posible de 5 y una puntuación mínima posible de 0,8. A modo de ejemplo, una UTO encontrada en 8 de las 10 composiciones bacterianas, tal como, aunque sin limitación, preparaciones de esporas que se injertaron en tres pacientes y era una UTO clave, se le asignaría la siguiente PET:

PET = (0,4 x 2,5 ) (0,4 x 1) (0,2 x 1) = 1,6

La Tabla 11 proporciona una clasificación de las UTO según PET. Las composiciones bacterianas diseñadas de manera racional utilizando una puntuación PET presentan una alta probabilidad de catalizar el cambio de una ecología de enfermedades disbiótica a un microbioma saludable. En casos adicionales, la puntuación PET se puede combinar con otros factores para refinar el diseño racional de una composición bacteriana terapéutica. Entre dichos factores se incluyen, aunque sin limitación: el uso de parámetros filogenéticos u otras características, tales como, aunque sin limitación, su capacidad para metabolizar ácidos biliares secundarios, inducir señalización inmunitaria de TH17 o producir ácidos grasos de cadena corta. En un caso adicional, se puede llevar a cabo un refinado mediante la identificación de las UTO que presentan la mayor abundancia relativa en las ecologías potenciadas o injertadas y definen un umbral total de abundancia relativa.

El número de organismos en el tracto gastrointestinal humano, así como la diversidad entre individuos sanos, es indicativo de la redundancia funcional de una ecología de microbioma intestinal saludable (ver The Human Microbiome Consortia. 2012 Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature 486: 207-214). Esta redundancia hace que sea muy probable que subgrupos de la ecología troncal describan componentes terapéuticamente beneficiosos de la composición bacteriana, tales como, aunque sin limitación, una preparación de esporas tratadas con etanol, y que tales subgrupos pueden ser composiciones útiles para poblar el tracto gastrointestinal y para el tratamiento de la infección porC. difficile, dadas las características funcionales de las ecologías. Usando la PET, así como otras métricas clave definidas anteriormente, se pueden priorizar las UTO individuales para su evaluación como un subgrupo eficaz de la ecología troncal.

Otro aspecto de la redundancia funcional es que los organismos evolutivamente relacionados (es decir, aquellos que están próximos unos a otros en el árbol filogenético, p. ej., aquellos agrupados en un solo clado) también serán sustitutos eficaces en la ecología troncal o un subgrupo de la misma para el tratamiento deC. difficile.

Para el experto en la materia, la selección de subgrupos de UTO apropiados para ensayosin vitrooin vivoes sencilla. Se pueden seleccionar subgrupos seleccionando 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más de 10 UTO de la Tabla 11, seleccionando habitualmente aquellas con una PET más alta. Además, utilizando las relaciones de clado definidas en el Ejemplo 13, anteriormente, y la Tabla 11, se pueden seleccionar UTO relacionadas como sustitutos de UTO con valores de CES aceptables. Estos organismos se pueden cultivar anaeróbicamentein vitroutilizando los medios apropiados, y después combinarlos en una proporción deseada. Un experimento típico en el modelo de ratón deC. difficileutiliza por lo menos 10<4>y preferentemente por lo menos 10<5>, 10<6>, 10<7>, 10<8>, 10<9>o más de 10<9>unidades formadoras de colonias de cada microorganismo en la composición. En algunas composiciones, los organismos se combinan en proporciones desiguales, por ejemplo, debido a variaciones en los rendimientos de cultivo, p. ej., 1:10, 1:100, 1: 1.000, 1:10.000, 1: 100.000 o más de 1: 100.000. Lo que es importante en estas composiciones es que cada cepa se proporcione en una cantidad mínima para que la contribución de la cepa a la eficacia del subgrupo de ecología troncal pueda resultar terapéuticamente eficaz, y en algunos casos, ser medible. Usando los principios e instrucciones descritos en la presente memoria, el experto en la materia puede realizar sustituciones basadas en clados para someter a ensayo la eficacia de subgrupos de la ecología troncal. Las Tablas 11 y 2 describen los clados para cada UTO de las cuales se pueden derivar tales sustituciones.

Diseño racional de composiciones terapéuticas mediante la integración de datos del microbioma in vitro y clínicos

Se pueden definir subgrupos eficaces de la ecología de esporas microbianas del tratamiento, así como subgrupos de la ecología microbiana del sujeto postratamiento, mediante la interrogación racional de la composición de estas ecologías con respecto a composiciones que comprenden 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o algún número mayor de UTO. En un caso, las composiciones bacterianas que han demostrado eficacia en un ensayoin vitrode inhibición de patógenos y que además se identifican como componentes de la ecología del tratamiento en sí y/o de la ecología microbiana de 100 %, ≥90 %, ≥80 %, ≥70 %, ≥60 % o ≥50 % de los sujetos pueden ser priorizadas para el cribado funcional por el experto habitual en la materia. Entre los cribados funcionales se pueden incluir, aunque sin limitación, cribadosin vivoutilizando diversos modelos patógenos o no patógenos (por ejemplo, modelos murinos, modelos de hámster, modelos de primates o seres humanos). La Tabla 12 proporciona composiciones bacterianas que mostraron efectos inhibitorios deC. difficilemedidos por un logaritmo de inhibición medio mayor que el intervalo de confianza (I.C.) al 99 % de la hipótesis nula (ver el Ejemplo 6, +++) y que se identifican en por lo menos un tratamiento de ecología de esporas o en un microbioma de un sujeto humano después del tratamiento. En otro caso, se seleccionan las composiciones encontradas en los intervalos de confianza (I.C.) del 95 %, 90 % u 80 %, y que ocurren en las ecologías de tratamiento y postratamiento. En otros casos, se seleccionan composiciones bacterianas para el cribado para el potencial terapéutico al seleccionar UTO que ocurren en las ecologías de tratamiento o postratamiento, y la inhibición de crecimiento medida de la composición se clasifica como ≥ el percentil 75 de todas las puntuaciones de inhibición de crecimiento. En otros casos, se seleccionan composiciones clasificadas en ≥ el percentil 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 99. En otro caso, se seleccionan las composiciones que muestran una inhibición sinérgica (ver el Ejemplo 7). En un caso todavía adicional, las composiciones seleccionadas para cribar para la eficaciain vivose seleccionan utilizando una combinación de métricas de inhibición del crecimiento. Como ejemplo no limitativo: (i) las composiciones se seleccionan en primer lugar basándose en que su inhibición logarítmica es mayor que el intervalo de confianza (I.C.) del 99 % de la hipótesis nula, (ii) a continuación, el subgrupo seleccionado de composiciones se selecciona adicionalmente para representar aquellas que están clasificadas ≥ el percentil 75 en la distribución de todas las puntuaciones de inhibición, (iii) el subgrupo de (iii) se selecciona entonces adicionalmente basándose en las composiciones que muestran una inhibición sinérgica. En algunos casos, se utilizan diferentes intervalos de confianza (I.C.) y percentiles para subdividir y seleccionar de manera racional las composiciones. En todavía otro caso, las composiciones bacterianas se definen de manera más racional para su potencial terapéutico utilizando criterios filogenéticos, tales como, aunque sin limitación, la presencia de un clado filogenético particular, u otras características, tales como, aunque sin limitación, su capacidad para metabolizar ácidos biliares secundarios, inducir la señalización inmune TH17, o producir ácidos grasos de cadena corta.

En una realización relacionada, todas las composiciones bacterianas únicas que pueden ser delineadasin silicoutilizando las UTO que ocurren en el 100 % de las ecologías de esporas de dosis están definidas; las composiciones bacterianas de ejemplo se indican en la Tabla 13. En otras realizaciones, las composiciones se derivan de UTO que ocurren en ≥90 %, ≥80 %, ≥70 %, ≥60 % o ≥50 % de la dosis de ecología de esporas o de las ecologías postratamiento del sujeto. El experto habitual en la materia puede interrogar las composiciones bacterianas resultantes y utilizar diversas métricas, incluyendo, aunque sin limitación, el porcentaje de formadores de esporas, la presencia de UTO clave, la composición filogenética o la capacidad de las UTO para metabolizar ácidos biliares secundarios o la capacidad de producir ácidos grasos de cadena corta para definir racionalmente las composiciones bacterianas con eficacia y idoneidad sospechadas para un cribado adicional.

Ejemplo 24. Análisis computacional de las composiciones de dosis de ecologías de esporas administradas, y la potenciación e injertación tras la administración de dosis de ecología de esporas.

El ensayo clínico descrito en el Ejemplo 23 incluyó quince sujetos adicionales. Se realizaron análisis adicionales sobre la información que combina datos de todos los sujetos que respondieron al tratamiento en el ensayo (29 de 30 sujetos). El tratamiento era con una formulación compleja de microorganismos derivados de heces humanas. Se proporciona el análisis de estos resultados en las Tablas 14 a 21. La Tabla 22 se proporciona por conveniencia y enumera nombres alternativos para determinados organismos. Normalmente, la presencia de una UTO se determina utilizando un método conocido de la técnica, por ejemplo, usando qPCR bajo condiciones conocidas de la técnica y descritas en la presente memoria.

El conjunto de dosis utilizado en el ensayo es la colección de dosis que se proporcionó a por lo menos un paciente. De esta manera, una dosis es implícitamente un miembro del conjunto de dosis. En consecuencia, el conjunto de todas las UTO en las dosis se define como el conjunto único de UTO de tal manera que cada UTO está presente en por lo menos una dosis.

Tal como se describe en la presente memoria, una UTO injertada es una UTO que no es detectable en un paciente, p. ej., en su materia fecal, antes del tratamiento, aunque está presente en la composición administrada al sujeto y se detecta en el sujeto (p. ej., en la materia fecal del sujeto) en por lo menos una muestra posterior al tratamiento del sujeto. El conjunto de todas las UTO de injertación se define como el conjunto único de UTO de injertación que se encuentra en por lo menos un sujeto. Una UTO de potenciación es una UTO detectada en un sujeto que no se está injertando y presenta una abundancia diez veces mayor que la abundancia previa al tratamiento en algún punto temporal posterior al tratamiento. El conjunto de todas las UTO de injertación se define como el conjunto único de UTO de injertación que se encuentra en por lo menos un sujeto. El conjunto de todas las UTO de potenciación e injertación se define como el conjunto único de UTO que potencian o injertan en por lo menos un sujeto.

El conjunto de todas las combinaciones ternarias únicas se puede generar a partir del conjunto de UTO derivadas experimentalmente al considerar todas las combinaciones de UTO, de tal manera que 1) cada UTO del ternario sea diferente y 2) las tres UTO no se hayan utilizado juntas previamente. Se puede utilizar un programa informático para generar tales combinaciones.

La Tabla 14 se genera a partir del conjunto de todas las UTO de potenciación e injertación y proporciona las UTO que se encontró que se injertaban o potenciaban en por lo menos un sujeto después de ser tratados con la composición. Cada combinación ternaria enumerada está presente en todas las dosis proporcionadas a los sujetos o se detectaron juntas en todos los pacientes por lo menos en un punto de tiempo posterior al tratamiento. Normalmente, una composición útil incluye por lo menos una de las composiciones ternarias. En algunas realizaciones, los tres miembros de la composición ternaria se injertan o potencian en por lo menos, p. ej., 68 %, 70 %, 71 %, 75 %, 79 %, 86 %, 89 %, 93 % o 100 % de los sujetos. Debido a que todos los sujetos analizados respondieron al tratamiento, los ternarios enumerados en la Tabla resultan útiles en composiciones para el tratamiento de una disbiosis.

La Tabla 15 proporciona la lista de combinaciones ternarias únicas de UTO que estaban presentes en por lo menos el 95 % de las dosis (redondeando al número entero más cercano) y que se injertaron en por lo menos un sujeto. Se observa que las combinaciones ternarias que estaban presentes en el 100 % de las dosis se enumeran en la Tabla 14. Las composiciones que incluyen una combinación ternaria resultan útiles en composiciones para tratar una disbiosis.

La Tabla 16 proporciona el conjunto de todas las combinaciones ternarias únicas de UTO de potenciación, de modo que cada combinación ternaria se detectó en por lo menos el 75 % de los sujetos en un momento posterior al tratamiento.

La Tabla 17 proporciona el conjunto de todas las combinaciones ternarias únicas que estaban presentes en por lo menos el 75 % de las dosis y para las cuales el sujeto que recibió la dosis que contenía la combinación ternaria presentabaClostridialessp. SM4/1 presentes como una UTO de injertación o potenciación. En consecuencia, en algunos casos, una composición que consiste en, que consiste esencialmente en, o que comprende una combinación ternaria seleccionada de la Tabla 17 es útil para aumentar lasClostridialessp. SM4/1 en un sujeto.

La Tabla 18 proporciona el conjunto de todas las combinaciones ternarias únicas generadas a partir del conjunto de todas las UTO en dosis tales que cada ternario está presente en por lo menos el 75 % de las dosis y para el cual el sujeto que recibe la dosis que contiene la combinación ternaria presentabaClostridialessp. SSC/2 presentes como una UTO de injertación o potenciación después del tratamiento. En consecuencia, en algunos casos, una composición que consiste en, que consiste esencialmente en, o que comprende una combinación ternaria seleccionada de la Tabla 18 resulta útil para aumentar lasClostridialessp. SM4/2 en un sujeto.

La Tabla 19 proporciona el conjunto de todas las combinaciones ternarias únicas generadas a partir del conjunto de todas las UTO en dosis tales que cada ternario está presente en por lo menos el 75 % de las dosis y para el cual el sujeto que recibe la dosis que contiene la combinación ternaria presentabaClostridiumsp. NML 04A032 presente como una UTO de injertación o potenciación después del tratamiento. De acuerdo con lo anterior, en algunos casos, una composición que consiste en, que consiste esencialmente en, o que comprende una combinación ternaria seleccionada de la Tabla 19 resulta útil para aumentar laClostridiumsp. NML 04A032 en un sujeto.

La Tabla 20 proporciona el conjunto de todas las combinaciones ternarias únicas generadas a partir del conjunto de todas las UTO en dosis tales que cada ternario está presente en por lo menos el 75 % de las dosis y para el cual el sujeto que recibe la dosis que contiene la combinación ternaria presentabaClostridiumsp. NML 04A032,Ruminococcus lactarisyRuminococcus torquespresente como una UTO de injertación o potenciación. De acuerdo con lo anterior, en algunos casos, una composición que consiste en, que consiste esencialmente en, o que comprende una combinación ternaria seleccionada de la Tabla 20 resulta útil para aumentar laClostridiumsp. NML 04A032,Ruminococcus lactarisyRuminococcus torquesen un sujeto.

La Tabla 21 muestra el conjunto de todas las combinaciones ternarias únicas generadas a partir del conjunto de todas las UTO en dosis tales que cada ternario está presente en por lo menos el 75 % de las dosis y para el cual el sujeto que recibe la dosis que contiene la combinación ternaria presentabaEubacterium rectale, Faecalibacterium prausnitzii, Oscillibacter sp. G2, Ruminococcus lactarisyRuminococcus torquespresentes como una UTO de injertación o potenciación. De acuerdo con lo anterior, en algunos casos, una composición que consiste en, que consiste esencialmente en, o que comprende una combinación ternaria seleccionada de la Tabla 21 resulta útil para aumentaEubacterium rectale, Faecalibacterium prausnitzii, Oscillibacter sp. G2, Ruminococcus lactarisyRuminococcus torquesen un sujeto.

Otras realizaciones resultarán evidentes para el experto en la materia tras la consideración de la especificación y la práctica de los casos y realizaciones descritas en la misma. La especificación y los ejemplos deben considerarse solo a título de ejemplo.

TABLAS

Tabla 3

Indicación de enfermedad

Inflamación de la cavidad abdominal

Infección porAbsidia

Infección porAcinetobacter baumanii

Infección porAcinetobacter

Infección porAcinetobacter lwoffii

Indicación de enfermedad

Acné

Infección porActinomyces israelii

Infección por adenovirus

Infección por virus de la varicela-zóster en el adulto Envejecimiento

Alcoholismo (y efectos)

Conjuntivitis alérgica

Rinitis alérgica

Alergia

ELA

Enfermedad de Alzheimer

Infección por ameba

Cáncer anal

Tratamiento antibiótico

Diarrea asociada a antibióticos

Arterioesclerosis

Artritis

Infección porAspergillus fumigatus

Infección porAspergillus

Asma

Ateroesclerosis

Dermatitis atópica

Atopia/Sensibilidad alérgica

Autismo

Enfermedad autoinmune

Infección porBacillus anthracis

Infección porBacillus

Endocarditis bacteriana

Infección ocular bacteriana

Meningitis bacteriana

Neumonía bacteriana

Infección bacteriana del tracto respiratorio

Infección cutánea bacteriana

Susceptibilidad bacteriana

Infección bacteriana del tracto urinario

Vaginosis bacteriana

Infección porBacteroides caccae

Infección porBacteroides fragilis

Infección porBacteroides

Infección porBacteroides thetaiotaomicron

Infección porBacteroides uniformis

Infección porBacteroides vulgatus

Infección porBartonella bacilliformis

Infección porBartonella

Infección porBifidobacterium

Cáncer biliar

Cirrosis biliar

Enfermedad del tracto biliar

Tumor biliar

Infección por virus BK

Infección porBlastomyces

Indicación de enfermedad

Infección ósea y articular

Infección ósea

Infección porBordetella pertussis

Infección porBorrelia burgdorferi

Infección porBorrelia recurrentis

Infección porBrucella

Infección porBurkholderia

Caquexia

Infección porCampylobacter fetus

Infección porCampylobacter

Infección porCampylobacter jejuni

Cáncer

Infección porCandida albicans

Infección porCandida

Infección porCandida krusei

Enfermedad celíaca

Infección del cuello uterino

Diarrea inducida por quimioterapia

Infección porChlamydia

Infección porChlamydia pneumoniae

Infección porChlamydia trachomatis

Infección porChlamydiae

Síndrome de fatiga crónica

Infección crónica

Polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica

Portadores crónicos de polio

Trastorno del sueño por ritmo circadiano

Cirrosis

Infección porCitrobacter

Infección porCladophialophora

Infección porClostridiaceae

Infección porClostridium botulinum

Infección porClostridium difficile

Infección porClostridium

Infección porClostridium tetani

Infección porCoccidioides

Colitis

Cáncer de colon

Cáncer colorrectal

Resfriado común

Cirrosis hepática compensada

Infección cutánea y de la estructura cutánea complicada

Infección del tracto urinario complicada

Estreñimiento

Síndrome del intestino irritable con predominio de estreñimiento

Infección porCorynebacterium diphtheriae

Infección porCorynebacterium

Infección porCoxiella

Infección porEnterobacteriaceaeresistente a carbapenémicos (CRE) Enfermedad de Crohn

Infección porCryptococcus

Infección porCryptococcus neoformans

Infección porCryptosporidium

Indicación de enfermedad

Lupus eritematoso cutáneo

Fibrosis quística

Cistitis

Infección por citomegalovirus

Demencia

Infección por virus Dengue

Depresión

Dermatitis

Diabetes mellitus

Complicación diabética

Úlcera del pie diabético

Diarrea

Síndrome del intestino irritable con predominio de diarrea

Lupus eritematoso discoide

Diverticulitis

Infección por virus ADN

Úlcera duodenal

Infección por virus ébola

Infección porEntamoeba hystolytica

Infección porEnterobacter aerogenes

Infección porEnterobacter cloacae

Infección porEnterobacter

Infección porEnterobactyeriaceae

Infección porEnterococcus faecalis

Infección porEnterococcus faecium

Infección porEnterococcus

Enterocolitis

Infección por enterovirus 71

Infección porEpidermophyton

Infección por virus de Epstein-Barr

Infección bacteriana productora de ESBL (lactamasa beta de espectro extendido) Infección porEscherichia coli

Cáncer esofágico

Infección porExophiala

Síndrome autoinflamatorio familiar por frío

Infección porFasciola hepatica

Infección del tracto genital femenino

Tumor del tracto genital femenino

Infertilidad femenina

Fibrosis

Infección porFlavivirus

Alergia alimentaria

Infección porFrancisella tularensis

Trastorno intestinal funcional

Infección fúngica

Infección fúngica del tracto respiratorio

Infección fúngica del tracto urinario

Infección porFusarium

Infección porFusobacterium

Úlceras gástricas

Infección gastrointestinal

Dolor gastrointestinal

Úlcera gastrointestinal

Indicación de enfermedad

Infección del tracto genital

Enfermedad genitourinaria

Tumor del tracto genitourinario

Diabetes gestacional

Infección porGiardia lamblia

Gingivitis

Infección por bacteria gram-negativa

Infección por bacteria gram-positiva

Infección porHaemophilus aegyptus

Infección porHaemophilus ducreyi

Infección porHaemophilus

Infección porHaemophilus influenzae

Infección porHaemophilus parainfluenzae

Infección por hantavirus

Infección porHelicobacter pylori

Helmintiasis

Infección por virus de la hepatitis A

Infección por virus de la hepatitis B

Infección por virus de la hepatitis C

Infección por virus de la hepatitis D

Infección por virus de la hepatitis E

Infección por virus de la hepatitis

Infección por virus del herpes simple

Infección por virus herpes

Infección por histoplasma

Infección por VIH

Infección por VIH-1

Infección por VIH-2

Infección por VHS-1

Infección por VHS-2

Infección por virus 1 de la leucemia de células T humana Hipercolesterolemia

Hiperoxaluria

Hipertensión

Artritis infecciosa

Enfermedad infecciosa

Endocarditis infecciosa

Infertilidad

Enfermedad intestinal inflamatoria

Enfermedad inflamatoria

Infección por virus influenza A

Infección por virus influenza B

Infección por virus influenza

Insomnio

Diabetes dependientes de insulina

Infección intestinal

Síndrome del intestino irritable

Infección por virus de la encefalitis japonesa

Infección articular

Artritis reumatoide juvenil

Infección porKlebsiella granulomatis

Infección porKlebsiella

Infección porKlebsiella penumoniae

Indicación de enfermedad

Infección porLegionella

Infección porLegionella pneumophila

Infección porLeishmania braziliensis

Infección porLeishmania donovani

Infección porLeishmania

Infección porLeishmania tropica

Infección porLeptospiraceae

Infección porListeria monocytogenes

Listeriosis

Cirrosis hepática

Fibrosis hepática

Infección del tracto respiratorio inferior

Infección pulmonar

Inflamación pulmonar

Paniculitis eritematosa lúpica

Nefritis lúpica

Enfermedad de Lyme

Infertilidad masculina

Infección por virus Marburg

Infección por virus del sarampión

Trastorno metabólico

Síndrome metabólico

Cáncer de colon metastásico

Cáncer colorrectal metastásico

Cáncer esofágico metastásico

Cáncer gastrointestinal metastásico

Cáncer de estómago metastásico

Infección porMicrococcaceae

Infección porMicrococcus

Infección por microsporidios

Infección porMicrosporum

Infección porMolluscum contagiosum

Infección por virus de la viruela del mono

Infección porMoraxella catarrhalis

Infección porMoraxella

Infección porMorganella

Infección porMorganella morganii

Infección por SARM

Infección por Mucor

Infección multifármacorresistente

Esclerosis múltiple

Infección por virus de la parotiditis

Inflamación del sistema musculoesquelético

Infección porMycobacterium

Infección porMycobacterium leprae

Infección porMycobacterium tuberculosis

Infección porMycoplasma

Infección porMycoplasma pneumoniae

Enterocolitis necrotizante

Pancreatitis necrotizante

Infección porNeisseria gonorrhoeae

Infección porNeisseria

Infección porNeisseria meningitidis

Indicación de enfermedad

Infección por nemátodo

Enfermedad del hígado graso no alcohólica

Esteatohepatitis no alcohólica

Diabetes no dependiente de insulina

Obesidad

Infección ocular

Inflamación ocular

Enfermedad inflamatoria orbital

Osteoartritis

Infección otorrinolaringológica

Dolor

Infección por papilomavirus

Infección parasitaria

Enfermedad de Parkinson

Infección por virus varicela-zóster pediátrica

Enfermedad inflamatoria pélvica

Infección porPeptostreptococcus

Rinitis alérgica perenne

Periatritis

Infección de la conjuntivitis

Infección porPlasmodium falciparum

Infección porPlasmodium

Infección porPlasmodium malariae

Infección porPlasmodium vivax

Infección porPneumocystis carinii

Infección por poliovirus

Infección por poliomavirus

Fugas bacterianas postquirúrgicas

Inflamación del reservorio (en inglés, “pouchitis”)

Infección porPrevotella

Cirrosis biliar primaria

Colangitis esclerosante primaria

Infección porPropionibacterium anes

Infección porPropionibacterium

Cáncer de próstata

Infección porProteus

Infección porProteus mirabilis

Infección protozoaria

Infección porProvidencia

Infección porPseudomonas aeruginosa

Infección porPseudomonas

Soriasis

Artritis soriásica

Fibrosis pulmonar

Infección por virus de la rabia

Cáncer rectal

Infección por virus sincitial respiratorio

Infección del tracto respiratorio

Inflamación del tracto respiratorio

Artritis reumatoide

Rinitis

Infección porRhizomucor

Infección porRhizopus

Indicación de enfermedad

Infección porRickettsia

Infección por virus del río Ross

Infección por rotavirus

Infección por virus de la rubeola

Infección porSalmonella

Infección porSalmonella typhiSarcopenia

Infección por coronavirus SARS

Infección por sarna

Infección porScedosporium

Escleroderma

Rinitis alérgica estacional

Infección porSerratia

Infección porSerratia marcescens

Infección porShigella boydii

Infección porShigella dysenteriae

Infección porShigella flexneri

Infección porShigella

Infección porShigella sonnei

Síndrome del intestino corto

Alergia cutánea

Cáncer de piel

Infección de la piel

Enfermedad inflamatoria de la piel

Trastorno del sueño

Espondiloartritis

Infección porStaphylococcus aureus

Infección porStaphylococcus epidermidis

Infección porStaphylococcus

Infección porStaphylococcus saprophyticus

Infección porStenotrophomonas maltophilia

Cáncer de estómago

Infección de estómago

Úlcera de estómago

Infección porStreptococcus agalactiae

Infección porStreptococcus constellatus

Infección porStreptococcus

Infección porStreptococcus intermedius

Infección porStreptococcus mitis

Infección porStreptococcus oralis

Infección porStreptococcus pyogenes

Lupus eritematoso sistémico

Diarrea del viajero

Estomatis necrosante ulcerativa

Infección porTreponema

Infección porTreponema pallidum

Infección porTrichomonas

Infección porTrichophyton

Infección por Trypanosoma brucei

Infección porTrypanosoma cruzi

Diabetes de tipo 1

Diabetes de tipo 2

Indicación de enfermedad

Colitis ulcerosa

Infección del trato respiratorio superior

Infección porUreaplasma urealyticum

Enfermedad del tracto urinario

Infección del tracto urinario

Tumor del tracto urinario

Infección del tracto urogenital

Infección por virusVaccinia

Infección vaginal

Infección por virus varicela-zóster

Infección por virusVariola

Infección porVibrio cholera

Infección ocular vírica

Infección vírica

Infección vírica del tracto respiratorio

Infección porViridansgrupoStreptococcus

Infección porEnterococcusresistente a vancomicina

Síndrome de caquexia

Pérdida de peso

Infección por virus del Nilo Occidental

Enfermedad de Whipple

Metabolismo xenobiótico

Infección por virus de la fiebre amarilla

Infección porYersinia pestis

Flatulencia

Trastorno gastrointestinal

Inflamación general

Tabla 6

Tabla 7

Tabla 8

(continuación)

Tabla 14: ecologías postratamiento

(continuación)

Tabla 15: UTO de injertación

(continuación)

Tabla 16: UTO de potenciación

Tabla 17: combinaciones ternarias de UTO en dosis de ecología de esporas administradas que resultan en la potenciación o injertación de la UTOClostridialessp. SM4/1

(continuación)

Tabla 18: combinaciones ternarias de UTO en dosis de ecología de esporas administradas que resultan en la potenciación o injertación de la UTOClostridialessp. SSC/2.

(continuación)

Tabla 19: combinaciones ternarias de UTO en dosis de ecología de esporas administradas que resultan en la potenciación o injertación de la UTOClostridiumsp. NML 04A032.

(continuación)

Tabla 20: combinaciones ternarias de UTO en dosis de ecología de esporas administradas que resultan en la potenciación o la injertación de las UTOClostridiumsp. NML 04A032,Ruminococcus lactarisyRuminococcus torques.

(continuación)

Tabla 21: combinaciones ternarias de UTO en dosis de ecología de esporas administradas que resultan en la potenciación o la injertación de las UTOEubacterium rectale, Faecalibacterium prausnitzii, Oscillibactersp. G2,

Ruminococcus lactarisyRuminococcus torques.

(continuación)

Tabla 22: UTO seleccionadas que pueden estar presentes en las tablas, especificación o en la técnica con sus nombres alternativos, p. ej., el nombre actual utilizado por el NCBI. La referencia 1 es Kaur et al., “Hungatella effluviigen. nov., sp. nov., una bacteria anaerobia obligada aislada a partir de una planta de tratamiento de efluyentes, y reclasificación deClostridium hathewayicomoHungatella hathewayigen. nov., comb. nov.”, Int. J. Sys. Evol. Microbiol., marzo de 2014, vol.64, páginas 710 a 718. La referencia 2 es Gerritsen et al., “Characterization ofRomboutsia ilealisgen. nov., sp. nov., aislada del tracto gastrointestinal de una rata, y propuesta de reclasificación de cinco miembros estrechamente relacionados del géneroClostridiumen los génerosRomboutsiagen. nov.,Intestinibactergen. nov.,Terrisporobactergen. nov. yAsaccharosporagen. nov.”, Int. J. Sys. Evol. Microbiol. mayo de 2014, vol.64, páginas 1600 a 1616.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Composición que comprende por lo menos unClostridium orbiscindensaislado capaz de formar una espora y que comprende una secuencia de ácido nucleico 16S por lo menos 97 % idéntica a SEQ ID NO: 609, por lo menos unClostridium tertiumaislado capaz de formar una espora y que comprende una secuencia de ácido nucleico 16S por lo menos 97 % idéntica a SEQ ID NO: 653, y por lo menos unCoprococcus comesaislado capaz de formar una espora y que comprende una secuencia de ácido nucleico 16S por lo menos 97 % idéntica a SEQ ID NO: 674, en donde la combinación ternaria deClostridium orbiscindens, Clostridium tertium,yCoprococcus comespuede disminuir y/o inhibir de forma sinérgica el crecimiento y/o la colonización de por lo menos un tipo de bacteria patogénica en el tracto gastrointestinal humano.

2. Composición según la reivindicación 1, en la queClostridium orbiscindenscomprende una secuencia de ADNr 16S de SEQ ID NO: 609,Clostridium tertiumcomprende una secuencia de ADNr 16S de SEQ ID NO: 653, yCoprococcus comescomprende una secuencia de ADNr 16S de SEQ ID NO: 674.

3. Composición según la reivindicación 2, en la que la combinación ternaria puede inhibir sinérgicamente el crecimiento deClostridium difficile(C.difficile) en un ensayo CivSim con un intervalo de confianza >99 % (++++).

4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la bacteria patogénica es C.difficile.

5. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la queClostridium orbiscindens, Clostridium tertiumyCoprococcus comespresentan forma de espora.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la composiciones para la administración oral.

7. Unidad de dosis única que comprende la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Unidad de dosis única según la reivindicación 7, en la que la unidad comprende por lo menos 1x10<4>unidades formadoras de colonias de esporas o células bacterianas vegetativas por dosis de la composición.

9. Formulación farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y que además comprende una cantidad eficaz de un agente antibacteriano, un agente antifúngico, un agente antiviral o un agente antiparasitario.

10. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la utilización en un método de prevención, tratamiento, reducción de la gravedad o reducción de uno o más síntomas de una disbiosis del tracto gastrointestinal.

11. Formulación farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y que además comprende una cantidad eficaz de un agente antimicrobiano, para la utilización en un método de reducción del número de bacterias patogénicas presentes en el tracto gastrointestinal de un sujeto humano.

12. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la utilización en un método de reducción de la abundancia deC. difficileen el tracto gastrointestinal de un paciente.

13. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la utilización en un método de tratamiento o reducción de la recurrencia de una infección porC. difficileen un sujeto humano.