ES3015983T3 - Reverse transcriptase and uses thereof - Google Patents

Abstract

Transcriptasa inversa y sus usos. La presente invención se enmarca en los campos de la biología molecular y celular. En particular, se refiere a una transcriptasa inversa (RT) del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MLV) con mayor estabilidad térmica en comparación con el M-MLV silvestre, caracterizada porque comprende al menos la mutación de alanina a cisteína en la posición del aminoácido 154 (A154C) y la mutación de ácido aspártico a cisteína en la posición del aminoácido 224 (D224C), donde se forma un enlace disulfuro entre los grupos tiol de los dos aminoácidos de cisteína en las posiciones 154 y 224. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Transcriptasa inversa y usos de la misma

Campo de la invención

La presente invención se refiere a los campos de la biología molecular y celular. Particularmente, se refiere a una transcriptasa inversa (RT) del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MLV) que tiene estabilidad térmica aumentada en comparación con M-MLV de tipo natural, caracterizada porque comprende al menos la mutación alanina a cisteína en la posición de aminoácido 154 (A154C) y la mutación ácido aspártico a cisteína en la posición de aminoácido 224 (D224C), en la que se forma un enlace disulfuro entre los grupos tiol de los dos aminoácidos cisteína en las posiciones de aminoácido 154 y 224.

Estado de la técnica

Al examinar la estructura y la fisiología de un organismo, un tejido o una célula, a menudo es deseable determinar su contenido genético. El marco genético de un organismo está codificado en la secuencia bicatenaria de bases de nucleótido en el ácido desoxirribonucleico (ADN) que está contenido en las células somáticas y germinales del organismo. El contenido genético de un segmento particular de ADN, o genes, se manifiesta normalmente tras la producción de la proteína que codifica el gen. Para producir una proteína, se produce una copia complementaria de una cadena de la doble hélice del ADN mediante enzimas ARN polimerasa, dando como resultado una secuencia específica de ácido ribonucleico (ARN). Este tipo particular de ARN, puesto que contiene el mensaje genético del<a>D<n>para la producción de una proteína, se denomina ARN mensajero (ARNm).

Dentro de una célula, un tejido o un organismo dado, existe una miríada de especies de ARNm, codificando cada una de ellas para una proteína independiente y específica. Este hecho proporciona una herramienta poderosa a los investigadores interesados en estudiar la expresión genética en un tejido o una célula. Pueden aislarse y manipularse adicionalmente moléculas de ARNm mediante diversas técnicas de biología molecular, permitiendo de ese modo la aclaración del contenido genético funcional completo de una célula, un tejido o un organismo.

Un enfoque habitual al estudio de la expresión génica es la producción de clones de ADN complementario (ADNc). En esta técnica, las moléculas de ARNm de un organismo se aíslan a partir de un extracto de las células o los tejidos del organismo. Este aislamiento a menudo emplea matrices de cromatografía sólidas, tales como celulosa o agarosa, a las cuales se han complejado oligómeros de timidina (T). Puesto que los extremos terminales 3' en la mayoría de las moléculas de ARNm eucariotas contienen una cadena de bases de adenosina (A), y puesto que la base de A se empareja con la T, las moléculas de ARNm pueden purificarse rápidamente a partir de otras moléculas y sustancias en el extracto celular o tisular. A partir de estas moléculas de ARNm purificadas, pueden hacerse copias de ADNc usando la enzima RT, lo que da como resultado la producción de moléculas de ADNc monocatenario. Esta reacción se denomina normalmente reacción de primera cadena. Los ADNc monocatenarios pueden convertirse entonces en una copia completa de ADN bicatenario (es decir, un ADNc bicatenario) del ARNm original (y, por tanto, de la secuencia de ADN bicatenario original, que codifica para este ARNm, contenida en el genoma del organismo) mediante la acción de una ADN polimerasa. Los ADNc bicatenarios específicos de proteína pueden insertarse entonces en un vector plasmídico o viral, que luego se introduce en una célula huésped bacteriana, de levadura, animal o vegetal. Luego se hacen crecer las células huésped en medios de cultivo, dando como resultado una población de células huésped que contienen (o en muchos casos, que expresan) el gen de interés.

Todo este proceso, desde el aislamiento del ARNm a partir de un organismo o tejido fuente hasta la inserción del ADNc en un plásmido o vector y el crecimiento de poblaciones de células huésped que contienen el gen aislado, se denomina “clonación de ADNc”. El conjunto de ADNc preparados a partir de una fuente dada de ARNm se denomina “biblioteca de ADNc”. Los clones de ADNc en una biblioteca de ADNc corresponden a los genes transcritos en el tejido fuente. El análisis de una biblioteca de ADNc puede proporcionar mucha información sobre el patrón de expresión génica en el organismo o tejido del que se derivó.

La RT del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MLV) es una de las RT retrovirales que se ha estudiado en el pasado. Contiene una única subunidad de 78 kDa con actividad ARNasa H y ADN polimerasa dependiente de ARN. Esta enzima se ha clonado y expresado en una forma completamente activa enE. coli.La RT del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es un heterodímero de subunidades p66 y p51 en el que la subunidad más pequeña se deriva de la más grande mediante escisión proteolítica. La subunidad p66 tiene tanto una ADN polimerasa dependiente de ARN como un dominio de ARNasa H, mientras que la subunidad p51 sólo tiene un dominio de ADN polimerasa. La RT p66/p51 del VIH activa se ha clonado y expresado con éxito en varios huéspedes de expresión, incluyendoE. coli.Dentro del heterodímero p66/p51 del VIH, la subunidad de 51 kD es catalíticamente inactiva y la subunidad de 66 kD tiene actividad tanto ADN polimerasa como ARNasa H.

Un factor importante que influye en la eficiencia de la transcripción inversa es la capacidad del ARN para formar estructuras secundarias (bucles) o la presencia de zonas GC muy estables. Tales estructuras secundarias pueden formarse, por ejemplo, cuando las regiones de moléculas de ARN tienen la suficiente complementariedad como para hibridarse y formar ARN bicatenario. Generalmente, la formación de estructuras secundarias de ARN puede reducirse elevando la temperatura de las disoluciones que contienen las moléculas de ARN. Por tanto, en muchos casos, es necesario someter a transcripción inversa el ARN a altas temperaturas por encima de 37 °C, incluso por encima de 65 °C y cercanas a 100 °C. Sin embargo, las RT conocidas en la técnica generalmente pierden actividad y estabilidad cuando se incuban a altas temperaturas muy por encima de 65 °C.

Los siguientes documentos también deben considerarse como estado relevante de la técnica:

- El documento de patente WO 2013/060819 A2 divulga mutantes de la RT del M-MLV en diferentes posiciones, incluyendo A154 y D224. Se dice que las sustituciones son defectuosas en cuanto a actividad RT. No se divulga ninguna variante de la RT del M-MLV con las dos sustituciones específicas G154C y D224C. No se divulgan los efectos de ninguna sustitución sobre la estabilidad térmica.

- El documento de patente WO 2018/189184 A1 divulga mutantes de la transcriptasa inversa del M-MLV con estabilidad térmica aumentada.

- Katanoet al.(2017) divulgan la mutagénesis por saturación de la RT del M-MLV para obtener variantes termostables cuando se construyeron las variantes. No se divulgan sustituciones A154C D224C. [Katano, Yutaet al.“Generation of thermostable Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase variants using site saturation mutagenesis library and cell-free protein expression system”.Bioscience, biotechnology, and biochemistryvol. 81, 12 (2017): 2339-2345. doi: 10.1080/09168451.2017.1394790]

- Baranauskaset al.(2012) divulgan la mutagénesis de la RT del M-MLV para obtener variantes termostables. Ninguna de las mutaciones fue a cisteína ni para introducir puentes disulfuro para estabilizar la RT. [Baranauskas, Aurimaset al.“Generation and characterization of new highly thermostable and processive M-MuLV reverse transcriptase variants”.Protein engineering, design & selection: PEDSvol. 25, 10 (2012): 657-68. doi: 10.1093/protein/gzs034]

- Yasukawaet al.(2010) divulgan la mutagénesis de la RT del M-MLV para aumentar la estabilidad térmica.

No se divulgó ninguna mutación a cisteína para producir RT estabilizada con enlace disulfuro, incluso menos A154C D224C. [Yasukawa, Kiyoshiet al.“Increase in thermal stability of Moloney murine leukaemia virus reverse transcriptase by site-directed mutagenesis.”Journal of biotechnologyvol. 150, 3 (2010): 299-306. doi: 10.1016/j.jbiotec.2010.09.961]

- Areziet al.(2009) divulgan la mutagénesis dirigida al sitio de la RT del M-MLV para aumentar la estabilidad térmica. No se divulgó ninguna mutación a cisteína para producir RT estabilizada con enlace disulfuro.

[Arezi, Bahram, y Holly Hogrefe. “Novel mutations in Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase increase thermostability through tighter binding to template-primer”.Nucleic acids researchvol. 37, 2 (2009): 473-81. doi: 10.1093/nar/gkn952]

La presente invención se centra en resolver el problema citado anteriormente y se refiere a una RT del M-MLV que tiene estabilidad térmica aumentada incluso a altas temperaturas por encima de 65 °C, en comparación con M-MLV de tipo natural.

Descripción de la invención

Breve descripción de la invención

La presente invención proporciona una enzima RT, composiciones que comprenden la misma y métodos útiles para superar las limitaciones de la transcripción inversa. En general, la presente invención proporciona una RT modificada o mutada de modo que se aumentan o mejoran la termoestabilidad y/o fidelidad de la enzima. Más particularmente, la presente invención se refiere al mutante doble de M-MLV A154C y D224C, en el que se forma un enlace disulfuro entre los grupos tiol de los dos aminoácidos cisteína en las posiciones de aminoácido 154 y 224 (a continuación en el presente documento la “RT de la invención” o “RTSS”). Sorprendentemente, la RT de la invención muestra una alta estabilidad térmica, incluso a temperaturas por encima de 65 °C hasta 100 °C.

Particularmente, tal como puede observarse en los resultados proporcionados en la presente invención:

• La RT de la invención mantiene su actividad después de la incubación a altas temperaturas (preferiblemente 65 80 °C), de modo que es especialmente apropiada para trabajar con ARN que comprende un alto contenido de estructuras secundarias y transcritos largos (bibliotecas de ADNc) en los que moldes ricos en GC pueden interferir en la síntesis de ADNc.

• La RT de la invención muestra una desviación estándar y unos Cq (ciclos de cuantificación) tempranos bajos en comparación con las otras RT. Esto confirma que la RT de la invención ofrece una sensibilidad y reproducibilidad superiores para obtener resultados fiables.

• La RT de la invención pierde menos actividad que la retrotranscriptasa inversa RT SuperScript™ IV disponible comercialmente (Invitrogen, Thermofisher Scientific, Massachusetts, EE. UU.) cuando se trabaja a temperaturas por encima de 65 °C incluso con muestras de ARN de baja concentración.

• La RT de la invención tiene una ventaja de termoestabilidad sobre SuperScript™ IV.

Por consiguiente, la primera realización de la presente invención se refiere a una RT del M-MLV que tiene estabilidad térmica aumentada en comparación con la transcriptasa inversa del M-MLV de tipo natural, caracterizada porque comprende la mutación alanina a cisteína en la posición de aminoácido 154 de la SEQ ID NO: 1 (A154C) y la mutación ácido aspártico a cisteína en la posición de aminoácido 224 de la SEQ ID NO: 1 (D224C), en la que se forma un enlace disulfuro entre los grupos tiol de los dos aminoácidos cisteína en las posiciones de aminoácido 154 y 224.

La segunda realización de la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada o a un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la RT de la invención.

La tercera realización de la presente invención se refiere a una célula huésped recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico o el vector citado anteriormente.

La cuarta realización de la presente invención se refiere a una composición que comprende la RT de la invención. La quinta realización de la presente invención se refiere a un kit adaptado para preparar, amplificar o secuenciar moléculas de ácido nucleico que comprende un primer recipiente que a su vez comprende al menos la RT de la invención.

La sexta realización de la presente invención se refiere a un métodoin vitrode transcripción inversa para generar ADN complementario (ADNc) a partir de una molécula molde de ácido nucleico, que comprende mezclar el molde de ácido nucleico con al menos la RT de la invención, e incubar la mezcla en condiciones suficientes para preparar moléculas de ácido nucleico complementarias a la totalidad o una porción del molde.

La séptima realización de la presente invención se refiere a un métodoin vitropara secuenciar una molécula de ácido nucleico, que comprende mezclar el molde de ácido nucleico que va a secuenciarse con uno o más cebadores, con al menos la RT de la invención, uno o más nucleótidos y uno o más agentes de terminación; incubar la mezcla en condiciones suficientes para sintetizar una población de moléculas complementarias a la totalidad o una porción de la molécula que está secuenciándose; y separar la población para determinar la secuencia de nucleótidos de la totalidad o una porción de la molécula que está secuenciándose.

La octava realización de la presente invención se refiere a un métodoin vitropara amplificar una molécula molde de ácido nucleico, que comprende mezclar el molde de ácido nucleico con al menos la RT de la invención y una o más ADN polimerasas, e incubar la mezcla en condiciones suficientes para amplificar moléculas de ácido nucleico complementarias a la totalidad o una porción del molde.

La novena realización de la presente invención se refiere al usoin vitrode la RT de la invención para generar ADN complementario (ADNc) a partir de una molécula molde de ácido nucleico, para secuenciar una molécula de ácido nucleico o para amplificar una molécula molde de ácido nucleico.

En una realización preferida, el método para amplificar una molécula molde de ácido nucleico comprende una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), preferiblemente PCR cuantitativa (qPCR) o reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR).

En una realización preferida, los métodos de la invención se realizan a una temperatura por encima de 65 °C, preferiblemente por encima de 95 °C.

En una realización preferida, la RT de la invención está caracterizada por la SEQ ID NO: 1, que comprende los residuos 22-704 de la RT del M-MLV de tipo natural con mutaciones A154C y D224C, y comprende además la extensión N-terminal de la secuencia MGSSHHHHHHSSGLEVLFQGP:

Para el propósito de la presente invención se definen los siguientes términos:

• Por “que comprende” se entiende que incluye, pero sin limitarse a, todo lo que sigue a la expresión “que comprende”. Por tanto, el uso de la expresión “que comprende” indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden estar presentes o no.

• Por “que consiste en” se entiende “que incluye, y se limita a” todo lo que sigue a la expresión “que consiste en”. Por tanto, la expresión “que consiste en” indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios y que no pueden estar presentes otros elementos.

• RT sometidas a ensayo en la presente invención:

oRTH-: RT del M-MLV con la mutación D524N.

oRTSS: RT del M-MLV de la invención con mutaciones A154C y D224C y formación del enlace disulfuro.

oRTSSX: RT del M-MLV con mutaciones A154C y D224C sin enlace disulfuro.

oRTWT: RT del M-MLV de tipo natural.

oTranscriptasa inversa del M-MLV Tetro: es una RT disponible comercialmente que comercializa la empresa Bioline Meridian Bioscience, Ohio, EE. UU.

oSuperScript™ IV: RT disponible comercialmente que comercializa la empresa Invitrogen, Thermofisher Scientific, Massachusetts, EE. UU.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Desnaturalización térmica de RTWT (línea a trazos), RTH- (líneas discontinuas), RTSS (círculos rellenos) y RTSSX (línea delgada). Se midió la fluorescencia (unidades arbitrarias) de enzimas a 5 |iM durante una rampa térmica desde 1 hasta 90 °C.

Figura 2. Pérdida de actividad RTWT (barra gris) después de la incubación a 65 °C. RTSS (barra negra) pudo llevar a cabo retrotranscripción y amplificación en todas las condiciones sometidas a prueba, incluso a las temperaturas más altas. Estos experimentos demuestran que la termoestabilidad se debe a mutaciones estratégicas ubicadas en A154C y D224C en combinación con la formación del enlace disulfuro.

Figura 3. RTSS (círculos) muestra hasta 7 Cq antes que RTWT (cuadrados). RTSS presenta la desviación estándar más baja a través de diferentes temperaturas sometidas a prueba en comparación con la versión RTWT. Se muestra la dilución de una muestra positiva para rotavirus (460710'1) a lo largo de diferentes temperaturas de preincubación para ambas RT.

Figura 4. Gráfico de amplificación para una muestra positiva para rotavirus (4607 10'1) después de la RT-PCR en tiempo real en un intervalo de temperaturas de preincubación (66 °C-82 °C), usando RTSS (círculos) y RTWT (cuadrados). La etapa de retrotranscripción se realizó a 65 °C durante 15 min.

Figura 5. Pérdida de actividad para SuperScript™ IV después de la incubación en comparación con RTSS. Comparación con el experimento sin incubación. Muestra en dilución 10-2.

Descripción detallada de la invención

Ejemplo 1. Materiales y métodos.

Ejemplo 1.1. Clonación.

GenScript (Hong-Kong) sintetizó la secuencia de ADN para RT hiperestable recombinante (RTSS) y se optimizaron los codones para la expresión en células deE. coli.La secuencia recombinante correspondiente a los residuos 22 683 de la RT del virus de la leucemia murina de Moloney de tipo natural, con las mutaciones A154C y D224C, preferiblemente fusionada a una etiqueta His en el extremo N-terminal y a un sitio de proteasa 3C para la escisión de la etiqueta His, se clonó en un vector derivado del plásmido p-ET15b. La secuencia final expresada fue la SEQ ID NO: 1.

Ejemplo 1.2. Expresión.

Se transformó un plásmido en una cepa BL21 DE3 deE. coliy se cultivó a 30 °C en medio LB hasta una DO de 0,6 y se indujo con isopropil-p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM. Después de la inducción, se redujo la temperatura de cultivo hasta 18 °C. Después de 12 horas, se recogieron las células y se almacenó el sedimento celular congelado a -20 °C.

Ejemplo 1.3. Purificación.

Se resuspendió el sedimento en tampón Hepes 30 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 7,4 y se cargó en una columna His-Trap (GE Healthcare). Se realizó la elución con tampón Hepes 30 mM, NaCl 300 mM, imidazol 500 mM, pH 7,4 y se dializó la enzima en primer lugar frente a tampón Hepes 30 mM, NaCl 300 mM, cisteína 2 mM, cistina 1 mM, pH 7,4 durante 48 horas (para la formación del enlace disulfuro) y después de eso frente a tampón Hepes 30 mM, NaCl 300 mM, pH 7,4 a 4 °C. Finalmente, se tomaron alícuotas de la enzima, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C.

Ejemplo 1.4. Estabilidad térmica.

A la desnaturalización térmica de RTSS le siguió la emisión de fluorescencia del triptófano. RTWT, y RTH- que se sabe que es más estable que la versión de tipo natural, también se analizaron a modo de comparación (figura 1). Para comprender el papel de la formación del enlace disulfuro, también se caracterizó la enzima RTSS sin formación del enlace disulfuro (RTSSX), dializada sin cisteína y con cisteína durante la purificación (figura 1).

Se registraron curvas desde 1 hasta 90 °C. Las concentraciones de enzima fueron de 5 ^M, la longitud de onda de excitación fue de 280 nm y la emisión de fluorescencia se registró a 350 nM (emisión del triptófano).

Se ajustaron las curvas de desplegamiento a ecuaciones de dos o tres estados dependiendo del caso.

Para el modelo más simple, una ecuación de dos estados donde:

F es la señal espectroscópica, T corresponde a la temperatura absoluta, F<n>y F<d>, las señales espectroscópicas de enzimas nativas y desnaturalizadas a una temperatura (T0) varían linealmente con la temperatura con pendientes mN y mD.

AG, energía libre del proceso de desplegamiento, corresponde a:

Tm es la temperatura de fusión (temperatura en la que el 50 % de las moléculas están en un estado plegado y el 50 % en un estado desnaturalizado). AH es el cambio de entalpía y ACp es la capacidad calorífica, ambos considerados a la temperatura de fusión.

La temperatura de fusión y la extensión de la transición a una temperatura (expresada como disminución de fluorescencia) son los indicadores más potentes de la estabilidad térmica.

Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 1. Para interpretar los resultados, es importante observar que cuanto mayor sea Tm, y menor sea la pérdida de fluorescencia en una transición, mayor será la estabilidad de una proteína.

Tabla 1

El desplegamiento para la enzima RTWT es un proceso de dos etapas con una Tm de 32 °C. La RTH- mutante es mucho más estable, con una primera transición caracterizada por una Tm de 43 °C y con una segunda desnaturalización a 62 °C. La RTSS que comprende enlace disulfuro proporcionó la estabilidad más alta. RTSS no sólo se define por sus mayores Tm1 y Tm2 (45 y 70 °C, respectivamente), sino también por la extensión mucho menor de la primera transición (véase en la figura 1 el pequeño descenso de fluorescencia durante este cambio de estado). La explicación más probable para este hecho es que la aparición de desplegamiento que se produce de manera local a esta temperatura se restringe a una pequeña porción de la proteína, debido a la presencia del enlace disulfuro. Tal como se observará en los experimentos funcionales realizados mediante q-PCR, esta mayor estabilidad térmica se correlaciona con la capacidad de la enzima RTSS para desarrollar su actividad retrotranscriptasa a una mayor temperatura, en comparación, por ejemplo, con RTWT.

Por consiguiente, la presencia de dos mutaciones específicas A154C y D224C, junto con la formación del enlace disulfuro en esas posiciones específicas, dan lugar a un aumento de la estabilidad de la RT de la invención.

La desnaturalización térmica de la RTSSX, seguida de emisión de fluorescencia, revela que, ya a temperaturas muy bajas, la RTSSX está en un estado parcialmente desplegado, tal como puede observarse por la baja señal de fluorescencia en comparación con las otras enzimas. Además, la enzima con el enlace disulfuro no formado carece completamente de actividad retrotranscriptasa detectable.

Ejemplo 1.5. Muestras de heces y extracción de ARN.

La extracción de ARN de muestras de heces de pacientes con sospecha de diarrea por rotavirus se realizó usando el kit INVISORB® Spin Universal (Stratec) siguiendo el protocolo del fabricante. Se prepararon diluciones en serie de 10 veces de ARN extraído en tampón TE 1X con bajo contenido de EDTA. Se almacenaron las diluciones de extracto de ARN a -80 °C hasta las pruebas de RT-PCR en tiempo real.

Ejemplo 1.6. Ensayo funcional mediante RT-PCR en tiempo real.

Se usó ARN extraído para PCR en tiempo real de una etapa usando diferentes enzimas RT: RTH-, RTSS, RTSSX, RTWT, transcriptasa inversa del M-MLV Tetro y retrotranscriptasa inversa SuperScript™ IV.

Se realizó el ensayo de RT-PCR en tiempo real usando el kit SensiFAST®Probe No-ROX (Bioline Meridian Bioscience). Cada 20 |il de mezcla de reacción contenían 10 |il de mezcla 2x SensiFAST™ Probe No-ROX, cebador directo e inverso 250 nM (cada uno), sonda 125 nM, agua libre de nucleasa, 100 unidades de retrotranscriptasa seleccionada y 5 |il de ARN extraído. Se diseñaron los cebadores y la sonda para la detección específica del rotavirus A, generando una alineación de secuencias múltiples con MAFFT y confirmando la especificidad de la secuencia seleccionada usando BLAST.

Los cebadores y las sondas personalizados se pidieron a IDT (Integrated DNA Technologies, lowa, EE. UU.).

Después de añadir a la mezcla de reacción las diferentes RT, se preincubaron las enzimas a diferentes temperaturas. Se llevaron a cabo la incubación, retrotranscripción y amplificación de enzimas en un sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 Touch® (BioRad). Las condiciones de termociclado consistieron en 15 min a 56 °C-100 °C para la rT (dependiendo del propósito del experimento), activación de polimerasa a 95 °C durante 2 min; seguido de hasta 45 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 10 segundos e hibridación/extensión a 60 °C durante 50 segundos.

Los experimentos de ensayos funcionales consisten en la transcripción inversa de pequeños fragmentos de ARN acoplados con amplificación de ADN en los que las diferentes RT se incubaron previamente a diferentes temperaturas. La preincubación imita las condiciones de trabajo a alta temperatura con una fuerte síntesis de ARN secundario o ADNc de longitud completa. El propósito de este análisis es comprobar que la RTSS fue capaz de trabajar a temperaturas aumentadas y comparar su funcionalidad con otras rT diferentes en cuanto a valor de desplazamiento de Ct y presencia de amplificación y, por tanto, su capacidad para generar ADNc a partir de muy poco ARN de entrada.

Se realizaron dos tipos de experimentos:

• Estudios comparativos de RTSS con variantes de RT diferentes (incluyendo RTWT) y otras RT del M-MLV de tipo natural disponibles comercialmente.

• Estudios de verificación que comparan RTSS frente a SuperScript™ IV. Por favor, obsérvese que SuperScript™ IV se considera una de las retrotranscriptasas más eficientes y termostables disponibles comercialmente.

Ejemplo 2. Resultados.

En los primeros estudios de evaluación se comparó RTSS con RTSSX, RTH-, RTWT y transcriptasa inversa del M MLV Tetro. En el primer experimento, se preincubaron todas las RT durante 45 minutos a 60 °C, 70 °C u 80 °C. Las condiciones para la etapa de transcripción inversa fueron 45 minutos a diferentes temperaturas que oscilaron desde 56 °C hasta 8o °C. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 2 y la figura 1. RTSS fue capaz de llevar a cabo la retrotranscripción y amplificación en todas las condiciones sometidas a prueba, incluso a las temperaturas más altas. Estos experimentos demuestran que la termoestabilidad se debe a mutaciones estratégicas ubicadas en A154C y D224C en combinación con la formación del enlace disulfuro.

Tabla 2. Evaluación de la capacidad para trabajar a temperatura aumentada en un intervalo de temperaturas de preincubación y transcripción inversa para RT seleccionadas.

Tabla 2

En la tabla 3 se muestran los resultados obtenidos con RT-PCR en tiempo real a partir de diluciones de 10 veces de ácido nucleico de una muestra positiva para rotavirus con la comparación de RTSS y RTWT a diferentes tiempos de incubaciones times. El gráfico de amplificación correspondiente (figura 3) muestra que RTSS presenta resultados más reproducibles que RTWT a lo largo de un intervalo de altas temperaturas (65 °C-80 °C).

Tabla 3. Evaluación de la sensibilidad de RTSS frente a RTWT. Se preincubaron las RT durante 45 minutos a lo largo de un intervalo diferente de altas temperaturas (65 °C-80 °C). Las condiciones de la etapa de retrotranscripción fueron 15 min a 65 °C.

Tabla 3

En cuanto a los estudios de verificación que comparan RTSS frente a SuperScript™ IV, los experimentos realizados se basaron en preincubaciones de las RT en diferentes puntos de temperatura durante 45 minutos (tabla 4). Los resultados demuestran que, en el intervalo de 66-80 °C, la pérdida de actividad es mucho más importante para SuperScript™ IV. Por encima de 65 °C, la RTSS funciona tan bien como SuperScript™ IV con muestras de ARN de alta concentración y mejor con muestras de ARN de baja concentración.

Tabla 4. Evaluación de la sensibilidad de la RTSS comparando frente a SuperScript™ IV.

Tabla 4

Cuando la RTSS se sometió a altas temperaturas de preincubación (81 °C-100 °C), presenta alta estabilidad (tabla 5).

Tabla 5. Experimentos de termoestabilidad con RTSS a temperaturas muy altas. El tiempo de preincubación es de 45 minutos. Las condiciones de la etapa de retrotranscripción fueron 15 minutos a 65 °C.

Tabla 5

Se eligió una de las temperaturas altas (91 °C) y se realizó el experimento usando SuperScript™ IV como enzima de termoestabilidad de referencia. La pérdida de actividad es mucho más evidente en SuperScript™ IV que en RTSS a temperaturas muy altas (tabla 6, figura 5).

Tabla 6. Comparación de actividad a temperatura muy alta de RTSS frente a SuperScript™ IV.

Tabla 6

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   i.Transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MLV) que tiene estabilidad térmica aumentada en comparación con la transcriptasa inversa del M-MLV de tipo natural, caracterizada porque comprende la mutación alanina a cisteína en la posición de aminoácido 154 de la SEQ ID NO: 1 (A154C) y la mutación ácido aspártico a cisteína en la posición de aminoácido 224 de la SEQ ID NO: 1 (D224C), en la que se forma un enlace disulfuro entre los grupos tiol de los dos aminoácidos cisteína en las posiciones de aminoácido 154 y 224.
2. 2. Transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MLV), según la reivindicación 1, caracterizada por la SEQ ID NO: 1.
3. 3. Molécula de ácido nucleico aislada o vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la transcriptasa inversa del M-MLV según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
4. 4. Célula huésped recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico o un vector según la reivindicación 3.
5. 5. Composición que comprende la transcriptasa inversa del M-MLV según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.
6. 6. Kit adaptado para preparar, amplificar o secuenciar moléculas de ácido nucleico que comprende un primer recipiente que a su vez comprende al menos la transcriptasa inversa del M-MLV según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.
7. 7. Métodoin vitrode transcripción inversa para generar ADN complementario (ADNc) a partir de una molécula molde de ácido nucleico, que comprende mezclar el molde de ácido nucleico con al menos la transcriptasa inversa del M-MLV según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, e incubar la mezcla en condiciones suficientes para preparar moléculas de ácido nucleico complementarias a la totalidad o una porción del molde.
8. 8. Métodoin vitropara secuenciar una molécula de ácido nucleico, que comprende mezclar el molde de ácido nucleico que va a secuenciarse con uno o más cebadores, con al menos la transcriptasa inversa del M-MLV según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, uno o más nucleótidos y uno o más agentes de terminación; incubar la mezcla en condiciones suficientes para sintetizar una población de moléculas complementarias a la totalidad o una porción de la molécula que está secuenciándose; y separar la población para determinar la secuencia de nucleótidos de la totalidad o una porción de la molécula que está secuenciándose.
9. 9. Métodoin vitropara amplificar una molécula molde de ácido nucleico, que comprende mezclar el molde de ácido nucleico con al menos la transcriptasa inversa del M-MLV según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 y una o más ADN polimerasas, e incubar la mezcla en condiciones suficientes para amplificar moléculas de ácido nucleico complementarias a la totalidad o una porción del molde.
10. 10. Método para amplificar una molécula molde de ácido nucleico, según la reivindicación 9, caracterizado porque comprende una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), preferiblemente PCR cuantitativa (qPCR) o reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR).
11. 11. Método, según la reivindicación 7, caracterizado porque se realiza a una temperatura por encima de 65 °C, preferiblemente por encima de 95 °C.
12. 12. Usoin vitrode la transcriptasa inversa del M-MLV según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 para generar ADN complementario (ADNc) a partir de una molécula molde de ácido nucleico, para secuenciar una molécula de ácido nucleico o para amplificar una molécula molde de ácido nucleico.