[go: up one dir, main page]

ES3014437T3 - Methods and materials for activating an internal ribosome entry site in exon 5 of the dmd gene - Google Patents

Methods and materials for activating an internal ribosome entry site in exon 5 of the dmd gene Download PDF

Info

Publication number
ES3014437T3
ES3014437T3 ES19180710T ES19180710T ES3014437T3 ES 3014437 T3 ES3014437 T3 ES 3014437T3 ES 19180710 T ES19180710 T ES 19180710T ES 19180710 T ES19180710 T ES 19180710T ES 3014437 T3 ES3014437 T3 ES 3014437T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
exon
dmd
seq
raav
nucleotide sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES19180710T
Other languages
English (en)
Inventor
Kevin Flanigan
Nicolas Wein
Stephen Wilton
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Western Australia
Nationwide Childrens Hospital Inc
Original Assignee
University of Western Australia
Nationwide Childrens Hospital Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Western Australia, Nationwide Childrens Hospital Inc filed Critical University of Western Australia
Application granted granted Critical
Publication of ES3014437T3 publication Critical patent/ES3014437T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/57—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone
    • A61K31/573—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone substituted in position 21, e.g. cortisone, dexamethasone, prednisone or aldosterone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/58—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids containing heterocyclic rings, e.g. danazol, stanozolol, pancuronium or digitogenin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/712—Nucleic acids or oligonucleotides having modified sugars, i.e. other than ribose or 2'-deoxyribose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • A61P5/44—Glucocorticosteroids; Drugs increasing or potentiating the activity of glucocorticosteroids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3233—Morpholino-type ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3513—Protein; Peptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3519—Fusion with another nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/31—Combination therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/33—Alteration of splicing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
    • C12N2330/51—Specially adapted vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

La presente invención se refiere a la administración de oligómeros para el tratamiento de pacientes con una mutación 5' en el gen DMD, distinta de una duplicación del exón 2 de DMD. La invención proporciona métodos y materiales para activar un sitio de entrada interno al ribosoma en el exón 5 del gen DMD, lo que resulta en la traducción de una isoforma truncada funcional de la distrofina. Los métodos y materiales pueden utilizarse para el tratamiento de distrofias musculares derivadas de mutaciones 5' en el gen DMD, como la distrofia muscular de Duchenne o la distrofia muscular de Becker. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y materiales para activar un sitio interno de entrada al ribosoma en el exón 5 del gen dela DMD
Esta solicitud reivindica el beneficio de la fecha de presentación de la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. N.° 62/035.395 presentada el 9 de agosto de 2014.
Declaración de interés gubernamental
Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno en virtud de la subvención R01 NS043264 concedida por los Institutos Nacionales de Enfermedades Neurológicas y Accidentes Cerebrovasculares. El gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la administración de oligómeros rAAv para el uso en el tratamiento de pacientes con una mutación 5' en su gen de laDMDdistinta de una duplicación del exón 2 de laDMDpara el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne (DMD) o la distrofia muscular de Becker (BMD).
Antecedentes
Las distrofias musculares (DM) (MD por sus siglas en inglés) son un grupo de enfermedades genéticas. El grupo se caracteriza por debilidad progresiva y degeneración de los músculos esqueléticos que controlan el movimiento. Algunas formas de DM se desarrollan en la infancia o la niñez, mientras que otras puede que no aparezcan hasta la mediana edad o incluso más tarde. Los trastornos difieren en términos de distribución y alcance de la debilidad muscular (algunas formas de DM también afectan al músculo cardíaco), la edad de aparición, la velocidad de progresión y el patrón hereditario.
Una forma de DM es la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD). Es la forma grave más común de distrofia muscular infantil y afecta a 1 de cada 5000 varones recién nacidos. La DMD está causada por mutaciones en el gen de laDMDque dan lugar a la ausencia de la proteína distrofina (427 KDa) en los músculos esqueléticos y cardíacos, así como en el tracto gastrointestinal y la retina. La distrofina no solo protege el sarcolema de las contracciones excéntricas, sino que también ancla una serie de proteínas señalizadoras en las proximidades del sarcolema. Muchos casos clínicos de DMD están vinculados a mutaciones por deleción en el gen de laDMD.A pesar de las numerosas líneas de investigación tras la identificación del gen de laDMD,las opciones de tratamiento son limitadas. Los corticosteroides son claramente beneficiosos, pero incluso con el paso de los años de deambulación, los beneficios se ven superados por los efectos secundarios a largo plazo. El estudio original doble ciego, controlado y aleatorizado publicado hace más de 20 años demostró los beneficios del uso de la prednisona [Mendell et al.,N. Engl. J. Med., 320:1592-1597 (1989)]. Informes posteriores demostraron la misma eficacia con deflazacort, un esteroide conservador del sodio [Biggar et al., J. Pediatr., 138: 45-50 (2001)]. Algunos estudios recientes también demuestran la eficacia de la omisión del exón, prolongando la distancia de marcha en la prueba 6MWT. Hasta ahora, los estudios clínicos publicados han notificado beneficios solo para mutaciones en las que el marco de lectura se restaura omitiendo el exón 51 [Cirak et al.,Lancet, 378:595-605 (2011) and Goemans et al.,New Engl. J. Med. 364:1513-1522 (2011)]. En el único informe de un ensayo de tratamiento doble ciego aleatorizado, se demostraron resultados prometedores con eteplirsen, un oligómero morfolino fosforodiamidato (PMO) [Mendell et al.,Annals Neurology, 74(5):637-647 (2013)]. En todos estos ensayos de omisión del exón, el denominador común de los hallazgos ha sido una estabilización en la capacidad de marcha tras una modesta mejora inicial. Otro artículo sobre omisión del exón es Greer et al.,Molecular Therapy - Nucleic Acids, 3:3155 (2014).
Véase también, las Solicitudes de Patente de EE. UU. N.° de publicación 2012/0077860, publicada el 29 de marzo de 2012; 2013/0072541, publicada el 21 de marzo de 2013; y 2013/0045538, publicada el 21 de febrero de 2013.
A diferencia de las mutaciones por deleción, las duplicaciones del exón de laDMDrepresentan alrededor del 5 % de las mutaciones causantes de enfermedad en muestras no sesgadas de pacientes con distrofinopatía[Dent et al., Am. J. Med. Genet., 734(3):295-298 (2005)], aunque en algunos catálogos de mutaciones el número de duplicaciones es mayor [incluyendo el publicado por el United Dystrophinopathy Project en Flanigan et al., Hum.Mutat, 30(12):1657-1666 (2009), que fue del 11 %].
Las mutaciones en el gen de laDMDdan lugar a la DMD más grave o a la distrofia muscular de Becker más leve (BMD). El fenotipo depende generalmente de si la mutación da lugar a la ausencia completa del producto proteico distrofina (en la DMD) o conserva un marco de lectura que permite la traducción de una proteína distrofina parcialmente funcional (en la BMD) [Monaco,Trends in Biochemical Sciences, 14:412-415 (1989)]. Anteriormente identificamos un alelo fundador particular de la BMD (c.9T>G; p.Trp3X) que no seguía esta regla del marco de lectura [Flanigan et al.,Neuromuscular Disorders: NMD, 19:743-748 (2009) y Flanigan et al.,Human Mutation, 30:1657-1666 (2009)]. Aunque se prevé que esta mutación sin sentido resulte en la no traducción de proteínas, la biopsia muscular reveló cantidades significativas (~21 %) de expresión de distrofina de tamaño mínimamente reducido y el fenotipo clínico es el de una distrofinopatía muy leve [Flanigan et al.,Neuromuscular Disorders: NMD, 19:743-748 (2009)]. En estudios de traducciónin cellulo e in vitro sedemostró que en pacientes p.Trp3X la traducción se inicia a partir de AUG en el exón 6, lo que sugiere un inicio de traducción alternativo como un mecanismo de mejora fenotípica [Gurvich et al.,Human Mutation, 30:633-640 (2009)]. Al observar que la mayoría de las mutaciones truncadas reportadas en los exones 5' estaban de hecho asociadas con BMD en lugar de DMD, propusimos que la iniciación alterada de la traducción podía ser un mecanismo general de rescate fenotípico para las mutaciones 5' en este gen, una predicción respaldada por informes posteriores [Witting y Vissing,Neuromuscular Disorders: NMD, 23:25-28 (2013) y Flanigan et al.,Neuromuscular Disorders: NMD, 23:192 (2013)]. Anteriormente se propuso que el dominio 1 de unión a actina canónico (ABD1) era esencial para la función proteínica [Gimona et al.,FEBS Letters, 513:98-106 (2002).
Comúnmente se entiende que la iniciación de la traducción se produce por iniciación cap dependiente. Los sitios internos de entrada del ribosoma (IRES) son secuencias reguladoras de ARN que rigen el inicio de la traducción cap independiente en células eucariotas, que se activa cuando la traducción cap dependiente está comprometida (por ej., durante el estrés celular). Los ribosomas son reclutados directamente a estos IRES en el ARNm y pueden continuar el escaneado en dirección 5' a 3' para codones de iniciación alternativos. Se describieron por primera vez en virus, y uno de los primeros caracterizados fue el IRES del virus de la encefalomiocarditis (EMCV). Hasta la fecha se han descrito casi 85 IRES celulares, que se encuentran principalmente localizados en regiones 5'UTR; por ejemplo, el 5'UTR de la utrofina A, un homólogo autosómico de la distrofina, contiene un IRES que es a la vez particularmente activo en la regeneración muscular e inducible por la exposición a glucocorticoides (la base de la terapia para la DMD) [Miura et al.,J. Biol. Chem., 280:32997 33005 (2005) y Miura et al.,PloS One, 3:e2309 (2008)]. Sin embargo, se han descrito otros IRES eucariotas dentro de secuencias codificantes, y algunos también han estado implicados en la modulación de la patología. Entre ellos se incluye un IRES en el genAPCvinculado a una versión leve de la poliposis adenomatosa familiar, en la que los pacientes con ciertas mutaciones 5' siguen produciendo una proteína parcialmente funcional a través del uso de un codón de iniciación posterior(downstream).
El virus adenoasociado (AAV) es un parvovirus con deficiencia de replicación, cuyo genoma de ADN monocatenario tiene una longitud aproximada de 4,7 kb e incluye 145 repeticiones de terminales invertidos (ITR) de nucleótidos. Existen múltiples serotipos de AAV. Se conocen las secuencias de nucleótidos de los genomas de los serotipos de AAV. Por ejemplo, el genoma completo del AAV-1 se encuentra en GenBank, N.° de acceso NC_002077; el genoma completo del AAV-2 se encuentra en GenBank, N.° de acceso NC_001401 y en Srivastava et al.,J. Virol., 45:555-564 (1983); el genoma completo del AAV-3 se encuentra en GenBank, N.° de acceso NC_1829; el genoma completo del AAV-4 se encuentra en GenBank, N.° de acceso NC_001829; el genoma del AAV-5 se encuentra en GenBank, N.° número de acceso AF085716; el genoma completo del AAV-6 se encuentra en GenBank, N.° de acceso NC_001862; al menos porciones de los genomas del AAV-7 y AAV-8 se encuentran en GenBank N.° de acceso AX753246 y AX753249, respectivamente (véanse también las Patentes estadounidenses N.° 7.282.199 y N.° 7.790.449 relacionadas con AAV-8); el genoma del AAV-9 se encuentra en Gao et al.,J. Virol., 78:6381-6388 (2004); el genoma del AAV-10 se encuentra enMol. Ther., 13(1):67-76 (2006); y el genoma del AAV-11 se encuentra enVirology, 330(2):375-383 (2004). La secuencia del genoma del AAV rh.74 se facilita en este documento. Las secuencias de acción cis que dirigen la replicación del ADN viral (rep), la encapsulación/empaquetamiento y la integración del cromosoma de la célula huésped están contenidas dentro de las ITR (secuencias internas repetidas) del AAV. Tres promotores del AAV (denominados p5, p19 y p40 por sus ubicaciones relativas en el mapa) dirigen la expresión de los dos marcos abiertos de lectura internos del AAV que codifican los genes rep y cap. Los dos promotores rep (p5 y p19), junto con elsplicing(corte y empalme) diferencial del único intrón del AAV (en los nucleótidos 2107 y 2227), dan lugar a la producción de cuatro proteínas rep (rep 78, rep 68, rep 52 y rep 40) a partir del gen rep. Las proteínas rep poseen múltiples propiedades enzimáticas que son las responsables últimas de la replicación del genoma viral. El gen cap se expresa a partir del promotor p40 y codifica las tres proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3. Elsplicingalternativo y los sitios de inicio de traducción no consensuales son responsables de la producción de las tres proteínas de la cápside relacionadas. Un único sitio de poliadenilación consensual se encuentra en la posición 95 del mapa del genoma del AAV. El ciclo vital y la genética del AAV se analizan en Muzyczka,Current Topics in Microbiology and Immunology, 158:97-129 (1992).
AAV posee características únicas que lo hacen atractivo como vector para introducir ADN extraño en las células, por ejemplo, en la terapia génica. La infección de células de AAV en cultivo no es citopática, y la infección natural de humanos y otros animales es silenciosa y asintomática. Además, el AAV infecta muchas células de mamíferos, lo que permite la posibilidad de apuntar a muchos tejidos diferentesin vivo.Por otra parte, el AAV transcribe células que se dividen lentamente y células no divididas, y puede persistir esencialmente durante la vida de esas células como un episoma nuclear transcripcionalmente activo (elemento extracromosómico). El genoma proviral del AAV es infeccioso como ADN clonado en plásmidos, lo que hace factible la construcción de genomas recombinantes. Además, debido a que las señales que dirigen la replicación, la encapsidación del genoma y la integración del AAV están contenidas dentro de las ITR del genoma del AAV, algunos o todos los aproximadamente 4,3 kb internos del genoma (que codifican la replicación y las proteínas estructurales de la cápside, rep-cap) pueden ser sustituidos por ADN ajeno. Las proteínas rep y cap se pueden proveer en trans. Otra característica importante del AAV es que es un virus extremadamente estable y resistente. Resiste fácilmente las condiciones utilizadas para inactivar adenovirus (de 56 °C a 65 °C durante varias horas), lo que hace que la conservación en frío del AAV sea menos crítica. El AAV puede incluso ser liofilizado. Por último, las células infectadas por el VAA no son resistentes a la superinfección.
WEIN ET AL, "Successful use of Out-of-Frame Exon 2 Skipping induces IRES-Driven expression of the N-Truncated dystrophin isoform: promising approach for treating other 5' Dystrophin Mutations". MOLECULAR THERAPY, (20l4), vol. 22, N.° Supl. 1, páginas S294 - S295 parece revelar un enfoque de omisión del exón fuera del marco para generar un marco de lectura truncado antes(upstream)del iRES en líneas celulares derivadas de pacientes y en un modelo de ratón con DMD, lo que conduce a la síntesis de una isoforma N-truncada funcional.
Sigue habiendo una necesidad en el campo de los tratamientos para las distrofias musculares, incluyendo la DMD y la BMD.
Resumen
La presente divulgación contempla productos para el uso en métodos de prevención de enfermedades, retraso de la progresión de enfermedades y/o tratamiento de pacientes con una o más mutaciones 5' del gen de la DMD. El uso de los métodos se basa en la identificación de un IRES inducible por glucocorticoides en el exón 5 del gen de la DMD, cuya activación puede generar una isoforma de distrofina truncada N-terminal funcional.
La divulgación contempla el uso en métodos para mejorar la distrofia muscular de Duchenne o la distrofia muscular de Becker en un paciente con una mutación 5' en el gen de la DMD que comprende el paso de administrar al paciente una construcción del oligómero activador de IRES del exón 5 de DMD, donde el paciente no tiene una duplicación del exón 2 de DMD.
La invención se define en las reivindicaciones. La invención contempla un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende una construcción del oligómero activador del sitio de entrada del ribosoma interno (IRES) del exón 5 de la distrofia muscular de Duchenne (DMD) que comprende:
(a) un polinucleótido antisentido U7-C que comprende la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 6, o
(b) un polinucleótido que codifica el oligómero antisentido U7-C que comprende la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 10 para el uso en el tratamiento de la DMD o distrofia muscular de Becker en un paciente con una mutación 5' en el gen de la DMD, donde el paciente no tiene una duplicación del exón 2 de DMD.
En algunas realizaciones, la construcción del oligómero activador del IRES del exón 5 de DMD es una construcción del polinucleótido U7snRNA en el genoma del rAAV.
En algunas realizaciones, el rAAV comprende la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 15.
En algunas realizaciones, el tratamiento comprende además la administración de un glucocorticoide al paciente.
En algunas realizaciones, a) se inhibe la progresión de una patología distrófica en el paciente; b) se mejora la función muscular en el paciente; c) se mejora la función muscular en el paciente y la mejora de la función muscular es una mejora de la fuerza muscular; d) se mejora la función muscular del paciente y la mejora de la función muscular es una mejora de la estabilidad al estar de pie y al caminar; o e) se expresa una isoforma truncada funcional de la distrofina en el tejido muscular del paciente.
En algunas realizaciones, a) el genoma del rAAV carece de ADN rep y cap del virus adenoasociado; b) el genoma del rAAV es autocomplementario o monocatenario; o c) el rAAV es rAAVI, rAAV2, rAAV3, rAAV4, rAAV5, rAAV6, rAAV7, rAAV8, rAAV9, rAAV10, rAAV11 o rAAVrh74.
En algunas realizaciones, la construcción del oligómero activador del IRES del exón 5 de la DMD comprende un polinucleótido que comprende dos copias de (a) la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 6 y la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 7; o (b) la secuencia de nucleótidos que expresa una transcripción de ARN comprende la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: l0 y la secuencia de nucleótidos que expresa una transcripción de ARN comprende la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID<n>O: 11.
En algunas realizaciones, el AAV comprende el polinucleótido antisentido U7-C que comprende la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 6.
En algunas realizaciones, el polinucleótido que expresa el oligómero antisentido U7-C comprende la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID<n>O: 10.
Breve descripción de las ilustraciones:
Figura 1. Las muestras de biopsia humana corroboran la traducción del exón 6. (a) El análisis inmunoblot del músculo de un individuo asintomático con una deleción del exón 2 (DEL2) que resulta en un cambio del marco y un codón de terminación prematuro (p.Tyr11PhefsX7) demuestra la expresión de distrofina de tamaño mínimamente reducido. Anticuerpos: NCL-DYS1 (dominio rod), NCL-DYS2 (C-terminal) (b) El análisis por espectrometría de masas de péptidos de distrofina de biopsia muscular del individuo con deleción del exón 2 da como resultado la no identificación de péptidos codificados antes de M124 (en el exón 6), mientras que los péptidos codificados dentro de los exones 2, 3 y 4 se identificaron fácilmente en el músculo de control (Control). Secuencia de referencia de la distrofina Número de acceso UniProt P11532. SEQ ID NO: 27-29, respectivamente, (c) Análisis inmunoblot de la expresión de distrofina del músculo de un paciente con DMD con una mutación del cambio de marco (FS) truncante en el exón 2 (c.40_41del), de un control normal (WT) y de un paciente con DMD con una duplicación del exón 2 (DUP2). En presencia del codón de terminación prematuro inducido por la mutación del cambio de marco, se puede detectar una proteína distrofina de tamaño y cantidad reducidos utilizando un anticuerpo C-terminal (PA1-21011, Thermo, Inc.; rojo), pero sin usar un anticuerpo detectado en epítopos codificados dentro del exón 1 (Manex1A, verde). Por el contrario, la distrofina está completamente ausente en el paciente Dup2. (d) Se utilizaron datos de perfiles de ribosomas para calcular una métrica de eficiencia de traducción (TE) para cada uno de los 1000 transcritos más abundantes (por masa de ARNm) del paciente FS (c.40_41del) y músculo de control normal. El valor TE para cada gen se calculó a partir del número normalizado de lecturas de secuencias de huellas de ribosomas dividido por el número de lecturas de secuenciación de ARN mapeadas dentro de la secuencia codificante (CDS). La abundancia de transcripciones de rango de los 1000 genes principales se calculó a partir del número total de lecturas mapeadas por transcripción. El subconjunto de genes clasificados como "sarcoméricos- por la anotación de Gene Ontology está coloreado en rojo y la localización del gen de laDMDestá marcada con un círculo, (e) profundidad de lectura de la secuencia de ARN del ARN total del músculo mapeado en la región 5' del gen de laDMD(hg 19, chrX:32,737,599-33,487,390). La profundidad de lectura de los exones 1 a 7 Dp427m se truncó a 40 lecturas por nucleótido; la profundidad de lectura exónica osciló entre 67 y 91 (FS, c.40_41del) y 58 y 89 (normal) lecturas por nucleótido, (f) Huellas de ribosomas mapeadas en la región 5' (nt. 1 a 1500) de la transcripción Dp427m (NM_004006.2). Se muestran las ubicaciones del codón de inicio del exón 1 Dp427m y las mutaciones c.40_41del, con el ORF corto (p.Glu14Argfs*17) como primer segmento CDS (verde) separado del resto de CDS (verde) que comienza en los codones de iniciación AUG alternativos (verde) del exón 6. Los asteriscos muestran las ubicaciones de los 9 codones AUG fuera del marco en los exones 1 a 5.
Figura 2. El exón 5 de la distrofina puede inducir la traducción cap independiente, (a) Inducción de la traducción del cistrón (Fluc) posterior(downstream)en un sistema de transcripción/traducciónin vitro(lisado de reticulocitos de conejo [RRL], izquierda) y tras la transfección en células C2C12 (derecha) en un reportero de luciferasa dual dicistrónico. Los resultados se expresan como la ratio de luciferasa Luciérnaga:Renilla (F/L) y normalizados en el vector vacío (establecido como 1). (b) La electroforesis en formaldehído de los productos de transcripción T7 utilizados en el ensayo RRL confirma la integridad del ARN, (c) Mapeado del IRES del exón 5: construcciones de mapeado dicistrónicas (izquierda) utilizadas para mapear la actividad de traducción cap independiente. En cada caso, la numeración se basa en la secuencia de ADNc Dp427m; la construcción de longitud completa pRdEF+4+369 (exón 1 a 6) empieza en la posición 4 para excluir el codón de iniciación AUG nativo. Se conservó el exón 6 y se clonaron AUG2 (M124) y AUG3 (M128) en marco con el reportero Fluc posterior(downstream).La luminiscencia FLuc (cap independiente) se expresa como un porcentaje de la luminiscencia RLuc (cap dependiente) después de la transfección de las construcciones dicistrónicas en células C2C12 (derecha). Todos los resultados se normalizaron en el vector del exón 6 solo, la ratio de FLuc: RLuc se estableció en un valor de 1. El análisis estadístico se realizó mediante una prueba de Kruskal-Wallis, comparando los resultados de cada construcción con el vector del exón 6 solo, lo que dio como resultado niveles de expresión comparables a un vector completamente vacío (p>.99). Se demostró un aumento significativo de la traducción del reportero posterior(downstream)con el exón 1 a 6 (p<.0001), el exón 2 a 6 (p=0,0175), el exón 3 a 6 (p=0,0009), el exón 3* a 6 (p=0,0078), el exón 4 a 6 (p=0,0078) o el exón 5 a 6 (p=0,0019). Por el contrario, la eliminación del exón 5 (ya sea en su totalidad o en parte) no dio lugar a diferencias significativas en los tres en comparación con el exón 6 solo, (d) los productos de la RT-PCR amplificados a partir de ARN derivaron de células C2C12 transfectadas, utilizando cebadores ubicados como se muestra en el esquema del panel (c), no muestra evidencia desplicingalterado, (e) el análisis Northern blot de células C2C12 transfectadas utilizando una sonda radiomarcadan P32 que apunta al cistrón FLuc no muestra evidencia de rotura de la cadena de ARN que explique el aumento de la señal en presencia de los exones 1-5 de la distrofina. (Se detecta una banda no específica de aproximadamente 3 kb en todas las condiciones de transfección, incluido el vector vacío, y por tanto no está relacionado con el aumento de las señales de FLuc o EMCV en comparación con el vector vacío, (f) la actividad del IRES se anula por la presencia de un exón 2 duplicado, pero no por una deleción del exón 2. Las barras de error representan la desviación estándar (s.d).
Figura 3. La omisión del exón fuera de marco estimula la actividad de IRES en líneas celulares derivadas de pacientes, (a) Representación esquemática del marco de lectura del exón 1-10 deDMDhumana (azul) y 5'UTR (rojo). Los números azules sobre cada exón indican las posiciones del ADNc; los números rojos en la base de cada exón indican la posición del aminoácido. Se representa el dominio de unión a actina canónico 1, junto con los dominios CH y ABS antedichos (a través de ScanProsite), (b) Representación esquemática del exón 2 (SEQ ID NO: 30). Las secuencias diana seleccionadas se indican más adelante, y afectan a las secuencias aceptoras de empalme (S.A.), donantes de empalme (S.D.) o potenciadoras de empalme de exones (E.S.E.) (según lo antedicho utilizando Human Splicing Finder o ESE Finder 3.0). (c) Se clonaron dos copias de U7-C y U7-AL en el mismo plásmido de AAV, ya que eran las más eficientes en la omisión del exón 2 (véase Figura 10). La construcción resultante se denominó U7-ACCA. Resultados de RT-PCR tras la infección del vector U7-ACCA (1E11 vg) o del oligonucleótido antisentido H2A (AON H2A) en células FibroMyoD (FM) wt o con el exón 2 duplicado. Estos se derivan de líneas de fibroblastos de pacientes infectados de forma estable con hTERT y un lentivirus MyoD tet-inducible; el tratamiento con doxiciclina resulta en la transdiferenciación en un linaje miogénico, con la consiguiente expresión de ARNm de distrofina, (d) el análisis de inmunoblot realizado 14 días después de la infección de las células FM con U7-ACCA muestra la expresión de la proteína distrofina N-truncada más pequeña (flecha). Anticuerpo: Distrofina C-terminal (PA1-21011, Thermo, Inc.). En cada banda de aproximadamente 390 kDa se detecta un carril más pequeño, pero no es específico (como se ve en la muestra no tratada) y no corresponde a la isoforma dirigida por IRES. (La imagen fue ensamblada a efectos de mayor claridad; las imágenes completas se incluyen como Figura 11).
Figura 4. La administración intramuscular de U7-ACCA da como resultado una expresión significativa de distrofina N-truncada en ratones Dup2, restaurando la localización de las proteínas asociadas a la distrofina, (a, b) Los resultados de RT-PCR realizados 4 semanas después de la inyección intramuscular de TA de 1e11 vg U7-ACCA muestran una omisión casi completa de ambas copias del exón 2 tanto en (a) ratones Dup2 como en (b) ratones BI6 de control (PDN: metil prednisolona 1 mg/kg/día intraperitoneal). En los animales Dup2 (a), la cuantificación reveló que la transcripción Dup2 era del 5,1 % del total, mientras que el tipo salvaje era del 8,6 % y la transcripción Del2 era del 86,3 %. En los animales BI6 de tipo salvaje (b), la transcripción de tipo salvaje era del 14,2 % y la transcripción Del2 era del 85,8 %. (c) Profundidad de lectura de la secuencia del ARN utilizando una biblioteca de ARN total del músculo tibial anterior de ratones Dup2 tratados con U7-ACCA (superior) y ratones Dup2 no tratados (inferior), mapeada en la región 5' del gen deDMDdel ratón (mm9, chrX:80,150,000-81,050,000). (d) El inmunoblot realizado un mes después de la infección muestra una expresión significativa de la isoforma N-truncada (asterisco) tanto en ratones Dup2 como en ratones BI6 de control. La proteína inducida en machos BI6 inyectados con U7-ACCA es del mismo tamaño que la expresada en los animales Dup2 tratados, lo que confirma la diferencia de tamaño entre esta proteína y la isoforma de longitud completa. (Anticuerpo C-terminal: PA1-21011, Thermo, Inc). La tinción de Coomassie de las mismas muestras no muestra diferencias en el comportamiento de migración, (e) Tinción inmunofluorescente de distrofina (anticuerpo C-terminal: PA1-21011, Thermo, Inc.), p-distroglicano (Beta-DG; MANDAG2); y óxido nítrico sintetasa neuronal (nNOS; sc-648; Santa Cruz), (f) El ensayo de protección con azul Evans (EBD) en ratones Dup2 un mes después de la inyección intramuscular con 1e11 vg muestra la estabilización de las membranas musculares. La captación de azul Evans (rojo) solo se observa en fibras sin expresión positiva de distrofina (verde, anticuerpo C-terminal: PA1-21011, Thermo, Inc). (Ratones Dup2 utilizados para este panel; n=5)
Figura 5. Activación glucorticoide del IRES de la distrofina, (a) Doble ensayo de luciferasa realizado en lisados de células C2C12 transfectadas con el vector pRDEF que porta la construcción de IRES de los exones 5-6. La metilprednisolona (PDN) aumenta la actividad del IRES de forma dependiente de la dosis. Las barras de error representan la desviación estándar (s.d). (b) Las células de Dup2 FM tratadas tanto con U7-ACCA como con PDN (6,4|jM) muestran una mayor expresión de distrofina. La intensidad de la imagen del carril de tipo salvaje se redujo para permitir la identificación de las bandas. MHC = cadena pesada de miosina (control de carga), (c) El inmunoblot representativo demuestra una mayor expresión de distrofina en ratones Dup2 inyectados con 1e11 vg U7-ACCA después del tratamiento con PDN (1 mg/kg/día). %Días: relación de intensidad de distrofina:a-actinina, normalizada en el músculo de control, (d) cuantificación de la señal de distrofina/a-actinina en músculos tratados con U7-ACCA en presencia o ausencia de PDN. A cinco animales tratados con U7-ACCA en los músculos tibiales anteriores se les inyectó PBS o PDN (1 mg/kg/día). Se realizó un inmunoblot en cada músculo por duplicado, y las señales de distrofina y a-actinina de los 5 carriles resultantes se cuantificaron con ImageJ. Había mucha más distrofina en los músculos de los animales tratados con PDN (P = 0,0159, prueba de Mann-Whitney de doble colas, las barras de error representan la desviación estándar). (e) El Western blot representativo demuestra un mayor nivel de utrofina en el ratón Dup2 en comparación con el ratón BI6. El tratamiento con PDN (1 mg/kg/día) no aumenta la expresión de utrofina. (f) Cuantificación de la señal de utrofina/a-actinina en los músculos tratados en presencia o ausencia de U7-ACCA y PDN. A cinco animales tratados con U7-ACCA en los músculos tibiales anteriores se les inyectó PBS o PDN (1 mg/kg/día). Las señales tanto de utrofina como de a-actinina de los 5 carriles resultantes se cuantificaron utilizando ImageJ. No se detectó significación alguna entre los cuatro (Kruskal-Wallis, las barras de error representan la desviación estándar).
Figura 6. La expresión de la isoforma dirigida por el IRES mejora la integridad de la membrana muscular y protege el músculo del Dup2 del daño inducido por contracción. Los músculos tibiales anteriores del Dup2 se trataron mediante inyección intramuscular de 5e11 vg U7-ACCA sola o con metilprednisolona (PDN: 1 mg/kg/día intraperitoneal) y se analizaron a las 4 semanas después de la inyección, (a) La nucleación central en los animales Dup2 no tratados (73,0 ± 1,6 % de miofibras) se redujo significativamente con el tratamiento de U7-ACCA solo (65,2 ± 2,2 %, ***p = 0,0002). No se observó diferencia significativa entre Dup2 y Dup2+PDN. (b) El porcentaje de fibras positivas a la tinción azul de Evans (EBD) en el músculo del Dup2 no tratado (14,7 ± 6,6 %; un valor atípico se representa como un punto) se reduce mediante el tratamiento con U7-ACCA solo (2,8 ± 1,8 %, *p = 0,0310) o en combinación con prednisona (0,65 ± 0,5 %, ***p = 0,0005). No se observó diferencia significativa entre Dup2 y Dup2+PDN. Las fibras EBD positivas se cuantificaron como un porcentaje de un total de 5000 fibras contadas por animal, (c) La fuerza de agarre normalizada máxima de la extremidad posterior (Norm HL máx) en ratones Dup2 no tratados (2,22 ± 0,26 kg de fuerza/kg de masa del animal, o kgf/kg) es significativamente menor que en BI6 (3,36 ± 0,37 kgf/kg, ***p < 0, 0001). La fuerza mejora significativamente tras el tratamiento con U7-ACCA solo (3,35 ± 0,32 kgf/kg, *** p <0,0001) o en combinación con prednisona (3,17 ± 0,28 kgf/kg, ***p = 0,0002), y ambos restauran la fuerza a un nivel no significativamente diferente del observado en BI6. No se observó diferencia significativa entre Dup2 y Dup2+PDN. (d) La fuerza específica normalizada tras la contracción tetánica en animales Dup2 no tratados (170,9 ± 14,3 mN/mm2) es significativamente menor que en BI6 (274,0 ± 12,1 mN/mm2, ** p = 0,0061). Se observa un aumento significativo de la fuerza tras el tratamiento con U7-ACCA solo (236,04 ± 19,4 mN/mm2, *p = 0,0350) o con prednisona (251,2 ± 10,4 mN/mm2, **p = 0,0025), que restablece la fuerza específica a un nivel no significativamente diferente del observado en BI6. No se observó diferencia significativa entre Dup2 y Dup2+PDN. (e) El tratamiento protege significativamente el músculo del Dup2 de la pérdida de fuerza tras contracciones excéntricas repetitivas. El análisis de varianza de doble vía demuestra una mejora significativa en las curvas de descomposición frente al Dup2 no tratado (*p < 0,05 y ***p < 0,001), y el análisispost-hocde Bonferroni demuestra que la combinación de ambos tratamientos no mostró diferencias significativas con respecto al BI6 de control en la retención de la fuerza tras las contracciones n.° 3 a n.° 10 (*p < 0,05 y ***p < 0,001). No se observó diferencia alguna significativa entre Dup2 y Dup2+PDN (p < 0,99). El ANOVA de doble vía demuestra una diferencia significativa entre Dup2+U7 y Dup2+U7+PDN (*p < 0,05) (a, b, c) n = 4 animales estudiados para cada condición y cuando se aplicaron 2000 fibras recuento/ratón, Kruskal-Wallis de doble cola, barra de error como s.d.); (d, e) n = 5 músculos de al menos 3 animales, barra de error como media de error estándar (s.e.m)
Figura 7. Análisis mutacional en el niño asintomático con deleción del exón 2. (a) La sección muscular teñida con H&E del paciente con deleción del exón 2 (DEL2) revela una ausencia de características distróficas, (b) Tinción inmunohistoquímica de secciones musculares del mismo paciente utilizando el anticuerpo NCL-DYS3 (exones 10-12). La tinción Manex1A (específica del exón 1) no se realizó en ese momento, y el tejido ya no está disponible, (c) perfil CGH del contexto genómico (panel superior) y de todo el cromosoma X (panel inferior) de la deleción de 12,983 pb, incluido el exón 2 (mostrado en la pista de superposición en la parte inferior del panel superior), (d) alineación de la unión secuenciada con la secuencia del genoma de referencia (NCBI hg18) (SEQ ID NO: 31-33, respectivamente). Las secuencias de referencia proximal y distal están coloreadas de forma diferente y la unión es de color negro. Las barras verticales entre las secuencias representan la homología de secuencia. Se encuentra una microhomología de 5 pb (CTGTG, mostrado en un recuadro) en la unión entre las secuencias distal y proximal, característica de la unión de extremos no homólogos, (e) Secuencias genómicas del punto de ruptura con la secuencia de microhomología subrayada en azul (SEQ ID NO: 34). (f, g) Los resultados de la RT-PCR y de la secuenciación confirman la deleción del exón 2 a nivel del ARN.
Figura 8. Análisis inmunofluorescente del músculo del paciente con cambio del marco (c.40_41del), (a) La inmunotinción con un anticuerpo de distrofina (Abeam 15277, C-terminal) muestra distrofina en la membrana sarcolemal tanto en las biopsias musculares de control como en las del paciente, mientras que la tinción con Manex1A está ausente en la muestra del paciente, lo que confirma la falta de expresión del epítopo codificado por el exón 1. (b) Perfilado ribosómico de la transcripción de la isoforma muscular de laDMD.Las lecturas medias normalizadas (profundidad de lectura por nt. frente a profundidad de lectura media en NM_004006) para las lecturas de la secuenciación de ARN se trazan cada 25 nucleótidos utilizando una profundidad de lectura media normalizada promediada por nucleótido calculada a partir de una ventana deslizante de 500 pb. Las lecturas del paciente FS (c.40_41del) se muestran en rojo y las del músculo de control en gris, con líneas de regresión mostradas para cada conjunto de promedios, (c) como en (b) excepto que se utilizan lecturas de secuenciación de RPF, con la línea de regresión lineal calculada solo para la región CDS, (d) La estructura del exón de la transcripción NM_004006 está trazada a la misma escala que el eje x de (b) y (c). La flecha indica la ubicación de los sitios de inicio de la traducción alternativos en el exón 6. Dado que en el experimento se usó ARN total, las lecturas de la secuenciación del ARN que se asignan a NM_004006 se derivan tanto de transcripciones nacientes como maduras. El gradiente 5' a 3' de las lecturas de secuenciación del ARN que se muestra en (b) concuerda con una estimación original del músculo esquelético humano del exceso relativo de exones 5' en el ARN naciente debido al tiempo de tránsito (-16 h) para que el ARN polimerasa transcriba a través de los ~2,2 Mb de chr. X que contiene los 79 exones deDMDde la isoforma muscular. El análisis de regresión de las lecturas de secuenciación de RPF no indica un gradiente de 5' a 3', lo que permite inferir que los ribosomas están distribuidos de forma uniforme a lo largo de la transcripción madura.
Figura 9. El IRES de la distrofina no es ubicuamente activo, (a) Los dobles ensayos de luciferasa demuestran la activación en dos líneas celulares miogénicas (C2C12 y una línea comercial de mioblastos de músculo esquelético humano [hSKMM]), pero no en células HEK209K, lo que sugiere una activación preferencial en células de un linaje miogénico, (b) El Northern blot de C2C12 y 293k transfectadas utilizando una sonda contra la luciferasa de luciérnaga demuestra la presencia de la transcripción así como la banda inespecífica descrita anteriormente (Figura 2). En particular, esta banda está presente en todas las condiciones, incluso después de la transfección con la construcción del exón 6 solo, y por tanto no está relacionada con la relación de expresión entre muestras(fold change)observada con las construcciones que contienen el exón 5, (c) los productos de RT-PCR amplificados a partir de ARN derivado de células 293k transfectadas no muestran evidencia desplicingalterado. Las barras de error representan la desviación estándar (s.d).
Figura 10. Optimización de la omisión del exón U7 mediada por AAV, (a) Se clonaron cuatro secuencias diana diferentes (AS, AL, B o C) en AAV bajo el control de U7. La infección de estos AAV, ya sea solos (a) o en combinación (b), se realizó tanto en el control como en el paciente FibroMyoD derivado cuyo exón 2 había sido duplicado. Tres días después de la infección por AAV, los resultados de la RT-PCR demostraron que en U7-C es capaz de inducir la omisión del exón tanto en el control como en el paciente FibroMyoD con exón 2 duplicado, mientras que U7-AL solo es capaz de inducir la omisión en las líneas celulares del paciente. Las construcciones de dos copias U7-C y U7-AL se clonaron en el mismo plásmido del AAV (U7-ACCA). (c) La transfección de fibroblastos transformados MyoD cultivados y mioblastos primarios de un paciente Dup2, utilizando un AON (A0NH2A) dirigido a una secuencia interna del exón 2, dio resultados similares, pero con una eficiencia menor que la omisión mediada por U7.
Figura 11. Western blot de líneas celulares derivadas de pacientes, (a) El western blot original de la Figura 3d visto en dos intensidades de imagen diferentes, baja (panel superior) y alta (panel inferior). El carril 1 del panel superior y los carriles 2 y 4 del panel inferior se utilizaron para ensamblar la Figura 3d. FM = líneas celulares de control derivadas de FibroMyoD; Dup2 FM = líneas celulares derivadas de FibroMyoD de un paciente con exón 2 duplicado; FS = proteína de biopsia muscular de c.40_41del. (b) La tinción de Coomassie de las mismas muestras que se ven en la Figura 4c no muestra diferencias significativas en el comportamiento de migración.
Figura 12. El glucocorticoide aumenta la actividad del IRES, pero no puede forzar su activación, (a) Los resultados del doble ensayo de luciferasa tras la transfección de 3 construcciones en 293k tratadas con glucocorticoides demuestran que la actividad del IRES no puede ser inducida por este compuesto. Las barras de error representan la desviación estándar (s.d). (b) La qPCR genómica del número de copias del AAV confirma que el aumento del nivel de distrofina detectado por el western blot en ratones tratados con PDN no se debe a un mayor número de vectores de AAV en los animales tratados con PDN. N=4 animales por grupo. Las barras de error representan la desviación estándar (s.d).
La Figura 13 es la secuencia del genoma rh74 (SEQ ID NO: 14) donde los nucleótidos 210-2147 son el marco abierto de lectura del gen Rep 78, 882-208 son el marco abierto de lectura Rep52, 2079-2081 son la parada Rep78, 2145-2147 son la detención Rep78, 1797-1800 son un sitio donante desplice,2094-2097 son un sitio aceptor delsplice,2121-2124 son un sitio aceptor delsplice,174-181 son el promotor p5 1 predicho, 145-151 son la caja TATA p5, 758-761 son el promotor p19 1 predicho, 732-738 son la caja<t>A<t>A p19, 1711-1716 son la caja TATA p40, 2098-4314 son el marco abierto de lectura del gen Cap VP1, 2509-2511 son el inicio de VP2, 2707-2709 son el inicio de VP3 y 4328-4333 son una señal poli(A).
La Figura 14 muestra un mapa de un plásmido con un inserto del genoma del AAV de un ARNsnU7 ejemplar dirigido al exón 2.
La Figura 15 (a) muestra el inserto del genoma del AAV (31 a 5') (SEQ ID NO: 15 es la misma secuencia en la dirección 5' a 3') del plásmido de la Figura 14. La Figura 15 (b) muestra el complemento inverso (SEQ ID NO: 26) de la secuencia en la Figura 15 (a).
U7 codifica para un U7snRNP que comparte algunas características con los snRNP splicesonales. Aunque no participa en elsplicingdel pre-ARNm, procesa los extremos 3' del ARNm de histona (Müller y Schümperli 1997; Dominski y Marzluff 1999). Los nucleótidos 1-113 de la SEQ ID NO: 15 corresponden a la región 3' ITR, los nucleótidos 114-220 de la SEQ ID NO: 15 corresponden a la región no traducida (UTR) de 3' (secuencia de orientación inversa). Los nucleótidos 221-251 de la SEQ ID NO: 15 corresponden a SmOPT (secuencia de orientación inversa). SmOPT es una modificación del sitio de unión Sm original del ARNsn U7 con una secuencia consenso derivada del ARNsn splicesomal (Grimm et al. 1993; Stefanovic et al. 1995a). Los nucleótidos 252-262 de la SEQ ID NO: 15 corresponden a un bucle (secuencia de orientación inversa). Los nucleótidos 263-295 corresponden a U7-Along (secuencia de orientación inversa), que es una secuencia antisentido que se dirige al sitio aceptor del exón 2. Los nucleótidos 296-551 de la SEQ ID NO: 15 corresponden a U7 (secuencia de orientación inversa), los nucleótidos 558-664 de la SEQ ID NO: 15 corresponden a UTR 3' (secuencia de orientación inversa), los nucleótidos 665-695 de la SEQ ID NO: 15 corresponden a SmOPT (secuencia de orientación inversa), y los nucleótidos 696-706 de la SEQ ID NO: 15 corresponden a un bucle (secuencia de orientación inversa). Los nucleótidos 707-731 de la SEQ ID NO: 15 corresponden a U7-C (secuencia de orientación inversa), que es una secuencia antisentido que se dirige al sitio donante del exón 2. Los nucleótidos 732-987 de la SEQ ID NO: 15 corresponden a U7 (secuencia de orientación inversa), los nucleótidos 994-1100 de la SEQ ID NO: 15 corresponden a UTR 3' (secuencia de orientación inversa), los nucleótidos 1111-1131 de la SEQ ID NO: 15 corresponden a SmOPT (secuencia de orientación inversa), los nucleótidos 1132-1142 de la SEQ ID NO: 15 corresponden a un bucle (secuencia de orientación inversa), los nucleótidos 1143-1167 de la SEQ ID NO: 15 corresponden a U7-C (secuencia de orientación inversa), los nucleótidos 1168-1423 de la SEQ ID NO: 15 corresponden a U7 (secuencia de orientación inversa), los nucleótidos 1430-1536 de la SEQ ID NO: 15 corresponden a UTR 3' (secuencia de orientación inversa), los nucleótidos 1537-1567 de la SEQ ID NO: 15 corresponden a SmOPT (secuencia de orientación inversa), los nucleótidos 1568-1578 de la SEQ ID NO: 15 corresponden a un bucle (secuencia de orientación inversa), los nucleótidos 1579-1611 de la SEQ ID NO: 15 corresponden a U7-Along (secuencia de orientación inversa), los nucleótidos 1612-1867 de la SEQ ID NO: 15 corresponden a U7 (secuencia de orientación inversa) y los nucleótidos 1920-2052 de la SEQ ID NO: 15 corresponden a ITR.
La Figura 16 muestra un esquema de un vector utilizado en la creación de un ratón mdxdup2 (Dup2).
La Figura 17 muestra (a) la RT-PCR realizada en 5 músculos de ratón Dup2 diferentes, un mes después de la inyección en la vena de la cola de AAV9.U7-ACCA (3,3E12 vg/kg). Como lo demuestra la presencia de múltiples transcripciones (aquí etiquetadas como Dup2, wt y Del2), el tratamiento con U7-ACCA es capaz de forzar la omisión de una o ambas copias del exón 2 en todos los músculos ensayados. (TA: tibial anterior; Gas: gastrocnemio; V: corazón; Tri: tríceps; dia: diafragma). (B) El western blot realizado en 5 músculos diferentes un mes después de la inyección demuestra la presencia de distrofina en todos los músculos ensayados, (c) La inmunotinción de distrofina en las mismas muestras confirma la expresión de distrofina y su correcta localización en el sarcolema. (d) La evaluación de la fuerza de agarre de las extremidades anteriores y posteriores demuestra una corrección completa de la fuerza de agarre en los animales Dup2 tratados con AAV9.U7-ACCA. (e) Las fuerzas específicas y totales normalizadas tras la contracción tetánica muestran una mejora de la fuerza muscular en comparación con los animales Dup2 no tratados, (f) Los músculos papilares cardíacos muestran mejoras en la generación de fuerza dependiente de la longitud en los animales tratados.
Figura 18. (a) Diseño del estudio de IM (inyección intramuscular). Se administraron dosis crecientes del vector AAV9.U7snRNA-ACCA en el músculo tibial anterior a los 2 meses, y se analizó el músculo a los 3 meses mediante estudios de ARNm, proteínas y electrofisiología, (b) cuantificación de ARNm por RT-PCR a niveles de dosis ascendentes de inyección IM. Las transcripciones contienen dos (Dup2), un (WT) o cero copias (A2) del exón 2. Expresión de la distrofina N-truncada tras niveles ascendentes de la dosis de inyección IM. La expresión de proteínas mediante (c) inmunofluorescencia o (d) inmunoblot demuestra una respuesta a la dosis, (e) La cuantificación del inmunoblot sugiere una expresión máxima de proteínas en 3,1E11 vg. Mejora de los déficits en fuerza absoluta (f), fuerza específica (g), en respuesta a la contracción excéntrica tras la inyección IM en el músculo tibial anterior de 3,1E11 vg.
Figura 19. (a) Diseño del estudio de IV (inyección intravenosa). Se administraron dosis crecientes del vector AAV9.U7snRNA-ACCA en el músculo tibial anterior a los 2 meses, y se analizó el músculo a los 3 meses mediante estudios de ARNm, proteínas y electrofisiología, (b) cuantificación de ARNm por RT-PCR a niveles de dosis ascendentes de inyección IV. Las transcripciones contienen dos (Dup2), un (WT) o cero copias (A2) de no exón 2. (c) Cuantificación de distrofina mediante inmunoblot tras inyección intravenosa (IV). La expresión sigue una respuesta a la dosis, con expresión en el tríceps inferior a la del corazón y el diafragma, (d) Inmunotinción de distrofina de BI6 y Dup2. (e) expresión tras IV. Se observa una respuesta a la dosis, con expresión significativa de distrofina en el corazón y el diafragma a dosis más altas.
Figura 20. La inyección temprana de AAV9.U7-ACCA previene la patología muscular en el ratón Dup2. La inmunotinción de distrofina demuestra la producción y localización de distrofina truncada N-terminal en la membrana plasmática. No se observó centronucleación tras la tinción con hematoxilina y eosina. A los 6 meses de edad, los ratones Dup2 no tratados suelen presentar un 60 % de sus fibras con núcleos centrales (datos no mostrados).
Figura 21. Generación de distrofinas truncadas N-terminal alternativas en líneas celulares humanas derivadas de pacientes portadores de mutaciones en los primeros nueve exones. Resultados de RT-PCR tras omitir el exón 2 utilizando el vector AAV1.U7-ACCA (1 * 10E11 genomas vectoriales) o el oligonucleótido antisentido H2A (AON H2A) en varias líneas celulares de pacientes portadores de mutación en los exones 1 a 4. Esto se traduce en que aproximadamente el 90 % de la transcripción carece del exón 2 (cuantificación no mostrada). FM = Células FibroMyoD derivadas de sujetos humanos sanos. El inmunoblot realizado 14 días después de la infección de las células FibroMyod con AAV1.U7-ACCA muestra la expresión de la proteína distrofina truncada N-terminal. Se detecta una banda más pequeña de aproximadamente 390 kDa en cada carril, pero no es específica (como se ve en la muestra no tratada) y no corresponde a la isoforma dirigida del IRES. (La imagen se ensambló a efectos de mayor claridad, con contraste de tipo salvaje alterado para mostrar claramente las bandas).
Figura 22. Expresión de la distrofina N-truncada tras el tratamiento con el oligonucleótido antisentido PPMO, (a) transfección en mioblastos de ratón C2C12 o (b) inyección intramuscular en músculos tibiales anteriores de ratón Dup2 de AL-PPMO. Los resultados de la RT-PCr de las células o músculos tratados demuestran una omisión eficiente del exón 2. (c) La inmunofluorescencia de la distrofina muestra la expresión de una proteína de la membrana plasmática tras la inyección intramuscular de oligonucleótido antisentido AL-PPMO.
Descripción
Como se ha señalado antes, la presente divulgación contempla productos para el uso en la prevención, el retraso de la progresión y/o el tratamiento de pacientes con una o más mutaciones 5' del gen de laDMDque se basan en la activación de un IRES inducible por glucocorticoides en el exón 5 del gen de laDMD.La activación del IRES inducible en el exón 5 del gen deDMDgenera una isoforma de distrofina truncada N-terminal funcional.
Tal como aquí se utiliza, una "mutación 5' del gen de laDMD'es una mutación dentro o que afecta al exón 1, 2, 3 o 4 del gen de laDMD.En el uso de los métodos de la invención, los pacientes tratados no tienen una duplicación del exón 2 de laDMD,pero una "mutación que afecta al exón 1,2, 3 o 4", como se contempla aquí, puede ser una duplicación distinta de una duplicación del exón 2 de laDMD.
El uso en los métodos implica usar una "construcción de oligómero activador del IRES del exón 5 de laDMD",tal como se define en las reivindicaciones. Tal como aquí se utiliza, una construcción de oligómero activador del IRES del exón 5 de laDMDse dirige al exón 2 para inducir elsplicingalterado que da lugar a la exclusión del exón 2 del ARN maduro, lo que provoca un cambio del marco del gen de laDMDe induce la utilización del IRES en el exón 5 para el inicio de la traducción.
El oligómero activador del IRES del exón 5 de laDMDutilizado en la invención se define en las reivindicaciones. En algunos aspectos de la divulgación, la construcción del oligómero activador de IRES del exón 5 de laDMDse dirige a una de las siguientes porciones (se muestra 5' a 3') del exón 2 del gen de laDMD.
B: TCAAAAGAAAACATTCACAAAATGGGTA (+17+44) (SEQ ID NO: 1)
C: GCACAATTTTCTAAGGTAAGAAT (+48-8) (SEQ ID NO: 2)
AL: TAGATGAAAGAGAAGATGTTCAAAAGAAAAC (-3+28) (SEQ ID NO: 3)
AS: TAGATGAAAGAGAAGATGTTC (-3+18) (SEQ ID NO: 4)
Se utiliza un rAAV para proporcionar una construcción de polinucleotídicos de ARN nuclear pequeño U7 que se dirige al exón 2 de DMD, tal como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el ARN nuclear pequeño U7 es un ARN nuclear pequeño U7 humano. En algunas realizaciones, la construcción de polinucleótidos se inserta en el genoma de un rAAV9, el genoma de un rAAV6 o el genoma de un rAAVrh74. La construcción del oligómero activador de IRES del exón 5 delDMDpara el uso de acuerdo con la invención se define en las reivindicaciones. En algunos aspectos de la divulgación, la construcción de ARN de nucleótidos pequeño U7 comprende polinucleótidos antisentido diana ejemplares incluyendo pero sin limitarse a lo siguiente, donde, por ejemplo, el "polinucleótido antisentido U7-AL" es respectivamente complementario y apunta a la secuencia del exón 2 "AL" en el párrafo anterior. Polinucleótido antisentido U7-B: TACCCATTTTGCGAATGTTTTCTTTTGA (SEQ ID NO: 5) Polinucleótido antisentido U7-C: ATTCTTACCTTAGAAAATTGTGC (SEQ ID NO: 6) Polinucleótido antisentido U7-AL: GTTTTCTTTTGAAGATCTTCTCTTTCATCTA (SEQ ID NO: 7) Polinucleótido antisentido U7-AS: GAAGATCTTCTCTTTCATCTA (SEQ ID NO: 8)
La construcción del oligómero activador de IRES del exón 5 deDMD,tal como se define en las reivindicaciones, es un oligómero antisentido dirigido al exón 2. En algunas realizaciones, se contempla que los oligómeros antisentido incluyan modificaciones en comparación con el polímero oligodesoxinucleótido fosfodiéster nativo para limitar su sensibilidad a la nucleasa. Las modificaciones contempladas incluyen, entre otras, oligómeros fosforodiamidato morfolino (PPO), PMO conjugados con péptidos penetrantes en células (PPMO), péptidos internalizadores de PMO (PIP) [(Betts et al.,Sci. Rep., 5:8986 (2015)], triciclo-ADN (tcADN) [Goyenvalle et al., Nat. Med., 21: 270-275 (2015)] y modificaciones 2'-O-metil-fosforotioato. La construcción del oligómero activador del IRES del exón 5 de laDMDde la invención se define en las reivindicaciones. Ejemplos de construcciones de oligómeros activadores del IRES del exón 5 de laDMDde la divulgación que son oligómeros antisentido dirigidos al exón 2 incluyen, entre otros, los siguientes oligómeros antisentido (mostrados de 5' a 3') donde, por ejemplo, el "oligómero antisentido B" se dirige respectivamente a la diana del exón 2 "B" en el párrafo [0025].
Oligómero antisentido B: UACCCAUUUUGCGAAUGUUUUCUUUUGA (SEQ ID NO: 9) Oligómero antisentido C: AUUCUUACCUUAGAAAAUUGUGC (SEQ ID NO: 10) Oligómero antisentido AL: GUUUUCUUUUGAACAUCUUCUCUUUCAUCUA (SEQ ID NO: 11) Oligómero antisentido AS: GAACAUCUUCUCUUUCAUCUA (SEQ ID NO: 12) H2A (+12+41): CCAUUUUGUGAAUGUUUUCUUUUGAACAUC (SEQ ID NO: 13)
En otro aspecto, se plantea el uso en un método para mejorar una distrofia muscular (como DMD o BMD) en un paciente con una mutación 5' del gen de laDMD.El uso en el método comprende el paso de administrar un rAAV al paciente, donde el genoma del rAAV comprende una construcción oligomérica activadora del IRES del exón 5 de laDMDtal como se define en las reivindicaciones. El uso en el método comprende el paso de administrar una construcción de oligómero activador del IRES del exón 5 de laDMDque es un oligómero antisentido dirigido al exón 2, tal como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el paciente también es tratado con un glucocorticoide.
En otro aspecto, la invención plantea el uso en un método de inhibición de la progresión de la patología distrófica asociada con una distrofia muscular (como DMD o BMD). El uso en el método comprende el paso de administrar un rAAV a un paciente con una mutación 5' del gen de laDMD,donde el genoma del rAAV comprende una construcción de oligómero activador del IRES del exón 5 de laDMDtal como se define en las reivindicaciones. El uso en el método comprende el paso de administrar una construcción de oligómero activador del IRES del exón 5 de laDMDque es un oligómero antisentido dirigido al exón 2, tal como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el paciente también es tratado con un glucocorticoide.
En otro aspecto, se plantea el uso en un método para mejorar la función muscular en un paciente con una mutación 5' del gen de laDMD,el uso en el método comprende el paso de administrar un rAAV al paciente, donde el genoma del rAAV comprende una construcción de oligómero activador del IRES del exón 5 de laDMDtal como se define en las reivindicaciones. El método comprende el paso de administrar una construcción de oligómero activador del IRES del exón 5 de laDMDque es un oligómero antisentido dirigido al exón 2, tal como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, la mejora de la función muscular es una mejora de la fuerza muscular. La mejora de la fuerza muscular se determina mediante técnicas conocidas en la materia, como la prueba de contracción isométrica voluntaria máxima (MVICT). En algunos casos, la mejora de la función muscular es una mejora de la estabilidad al estar de pie y al caminar. La mejora de la estabilidad se determina mediante técnicas conocidas en la materia, como la prueba de marcha de 6 minutos (6MWT) o la subida de escaleras cronometrada. En algunas realizaciones, el paciente también es tratado con un glucocorticoide.
En otro aspecto, la divulgación plantea el uso en un método de administración de una construcción de oligómero activador del IRES del exón 5 de laDMDa un animal (incluyendo, entre otros, un ser humano) con una mutación 5' del gen de laDMD.En algunos aspectos de la divulgación, el uso en el método comprende el paso de un rAAV al paciente, donde el genoma del rAAV comprende una construcción de oligómero activador del IRES del exón 5 de laDMD.En algunos aspectos de la divulgación, el uso en el método comprende el paso de administrar una construcción de oligómero activador del IRES del exón 5 de laDMDque es un oligómero antisentido dirigido al exón 2. En algunos aspectos de la divulgación, el animal también se trata con un glucocorticoide.
Las eficiencias de la transducción celular del uso en los métodos de la invención aquí descritos pueden ser de al menos alrededor del 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95 por ciento.
En algunas realizaciones del uso anterior en los métodos de la invención, el genoma del virus es un genoma autocomplementario. En algunas realizaciones del uso en los métodos, el genoma del rAAV carece de ADN rep y cap del AAV. En algunas realizaciones del uso en los métodos, el rAAV es un SC rAAV U7_ACCA que comprende el genoma ejemplar que se muestra en la Figura 15. En algunas realizaciones, el rAAV es un rAAV6. En algunas realizaciones, el rAAV es un rAAV9. En algunas realizaciones el rAAV es un rAAV rh74 (Figura 13). En otro aspecto, la divulgación proporciona un rAAV que comprende la cápside del AAV rAAV9 y un genoma que comprende la construcción polinucleótica U7_ACCA del ARNsn U7 que activa el IRES del exón 5 de laDMD.En algunos aspectos de la divulgación, el genoma del rAAV carece de ADN rep y cap de AAV. En algunos aspectos de la divulgación, el rAAV comprende un genoma autocomplementario. En algunos aspectos de los métodos de la divulgación, el rAAV es un SC rAAV U7_ACCA que comprende el genoma ejemplar que se muestra en la Figura 15. En algunos aspectos de la divulgación, el rAAV es un rAAV6. En algunos aspectos de la divulgación, el rAAV es un rAAV9. En algunos aspectos de la divulgación, el rAAV es un rAAV rh74 (Figura 13).
Los genomas de AAV recombinantes para el uso de acuerdo con la invención comprenden una o más ITR (secuencias inversas repetidas) de AAV que flanquean al menos una construcción polinucleótica de ARNsn U7 que activa el IRES del exón 5 de laDMD.Se contemplan específicamente los genomas con construcciones polinucleóticas de ARNsn U7 activadoras del IRES del exón 5 de laDMDque comprenden cada una las secuencias antisentido diana establecidas en el párrafo [0026], así como los genomas con construcciones polinucleóticas de ARNsn U7 activadoras del IRES del exón 5 de laDMDcomprendiendo cada combinación posible dos o más de las secuencias antisentido diana establecidas en el párrafo [0026]. En algunas realizaciones, incluyendo las realizaciones ejemplificadas, el polinucleótido de ARNsn U7 incluye su propio promotor. El ADN del AAV en los genomas del rAAV puede ser de cualquier serotipo de AAV del que se pueda derivar un virus recombinante, incluyendo, entre otros, los serotipos AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, Aa V-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, Aa V-10, AAV-11 y AAV rh.74. Como se ha señalado en la sección de Antecedentes expuesta al principio, las secuencias de nucleótidos de los genomas de varios serotipos de AAV son conocidas en la técnica. En algunas realizaciones de la invención, los ADN promotores son elementos de control específicos de los músculos, incluyendo entre otros, los derivados de las familias de genes de la actina y miosina, como los de la familia de genes myoD [véase Weintraub et al., Science, 251: 761-766 (1991)], el factor de unión potenciador específico de miocitos MEF-2 [Cserjesi and Olson,Mol. Cell. Biol., 11:4854-4862 (1991)], elementos de control derivados del gen de la actina del esqueleto humano [Muscat et al.,Mol. Cell. Biol., 1:4089-4099 (1987)], el gen de la actina cardíaca, elementos de secuencia de la creatina quinasa muscular [Johnson et al.,Mol. Cell. Biol., 9:3393-3399 (1989)] y el elemento potenciador de la creatina quinasa murina (MCK), promotor de desmina, elementos de control derivados del gen de la troponina C esquelética de contracción rápida, el gen de la troponina C cardíaca de contracción lenta y el gen de la troponina I de contracción lenta: factores nucleares inducibles por hipoxia [Semenza et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 88:5680-5684 (1991)], elementos inducibles por esteroides y promotores que incluyen el elemento de respuesta a glucocorticoides (GRE) [Ver Mader y White,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5603-5607 (1993)], y otros elementos de control.
Los plásmidos de ADN para el uso de acuerdo con la invención comprenden genomas de rAAV tal como se definen en las reivindicaciones. Los plásmidos de ADN se transfieren a células susceptibles de infección con un virus auxiliar de AAV (por ej., adenovirus, adenovirus con deleción E1 o herpesvirus) para el ensamblaje del genoma de rAAV en partículas virales infecciosas. Las técnicas para producir partículas de rAAV, en las que se proporciona a una célula un genoma de AAV para empaquetar, genes rep y cap, y funciones de virus ayudante, son estándar en la técnica. La producción de rAAV requiere que los siguientes componentes estén presentes dentro de una sola célula (denominada aquí célula de empaquetamiento): un genoma rAAV, genes rep y cap de AAV separados del genoma rAAV (es decir, no dentro de él) y funciones de virus auxiliar. Los genes rep AAV pueden proceder de cualquier serotipo de AAV del que se pueda derivar un virus recombinante y pueden proceder de un serotipo de AAV diferente al de las secuencias ITR del genoma del rAAV, incluyendo, entre otros, los serotipos de AAV AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-1 0, AAV-11 y AAV rh74. Se contempla específicamente el uso de componentes cognados. La producción de AAV-r pseudotipados se describe, por ejemplo, en WO 01/83692.
Un método para generar una célula de empaquetamiento consiste en crear una línea celular que exprese de forma estable todos los componentes necesarios para la producción de partículas de AAV. Por ejemplo, un plásmido (o múltiples plásmidos) que comprenda un genoma rAAV carente de los genes rep y cap del<a>A<v>, los genes rep y cap del a Av separados del genoma rAAV y un marcador seleccionable, como un gen resistente a la neomicina, están integrados en el genoma de una célula. Los genomas de AAV se han introducido en plásmidos bacterianos mediante procedimientos como elGC tailing[Samulski et al.,Proc. Natl. Acad. S6.USA,79:2077-2081 (1982)], adición de enlazadores sintéticos que contienen sitios de clivaje de endonucleasas de restricción [Laughlin et al., Gene, 23:65-73 (1983)] o por ligado directo de extremos romos [Senapathy y Carter,J. Biol. Chem.,259/4661-4666 (1984)]. La línea celular de empaquetamiento se infecta entonces con un virus auxiliar como el adenovirus. Las ventajas de este método son que las células son seleccionables y adecuadas para la producción a gran escala de rAAV. Otros ejemplos de métodos adecuados emplean adenovirus o baculovirus en lugar de plásmidos para introducir genomas de rAAV y/o genes rep y cap en células de empaquetamiento.
Los principios generales de la producción de rAAV se analizan, por ejemplo, en Carter,Current Opinions in Biotechnology,1533-1539 (1992); y Muzyczka,Curr. Topics in Microbial, and Immunol.,158/97-129 (1992). Algunos enfoques están descritos en Ratschin et al.,Mol. Cell. Biol.,4/2072 (1984); Hermon at et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81:6466 (1984); Tratschin et al.,Mol. Cell. Biol.5/3251 (1985); McLaughlin et al.,J. Virol,62/1963 (1988); y Lebkowski et al.,Mol. Cell. Biol.,7/349 (1988). Samulski et al., J. Virol., 63:3822-3828 (1989); Patente estadounidense N.° 5.173.414; WO 95/13365 y Patente estadounidense N.° 5.658.776 correspondiente; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872); WO 97/21825 (PCT/US96/20777); WO 97/06243 (PCT/FR 96/01064); WO 99/11764; Perrin et al., Vaccine, 13:1244-1250 (1995); Paul et al.,Human Gene Therapy,4:609-615 (1993); Clark et al.,Gene Therapy,3:1124-1132 (1996); Patente estadounidense N.° 5,786,211; Patente estadounidense N.° 5,871,982; y Patente estadounidense N.° 6.258.595.
La divulgación proporciona, por tanto, células de empaquetamiento que producen rAAV infeccioso. En un aspecto de la divulgación, las células de empaquetamiento pueden ser células cancerosas transformadas de forma estable, como células HeLa, células 293 y células PerC.6 (una línea 293 cognada). En otro aspecto de la divulgación, las células de empaquetamiento son células que no son células cancerosas transformadas, como las células 293 de pasaje bajo (células renales fetales humanas transformadas con E1 de adenovirus), células MRC-5 (fibroblastos fetales humanos), células WI-38 (fibroblastos fetales humanos), células Vero (células renales de mono) y células FRhL-2 (células pulmonares fetales rhesus).
El rAAV puede purificarse mediante métodos estándar en la técnica, como la cromatografía de columna o gradientes de cloruro de cesio. Los métodos para purificar vectores de rAAV del virus auxiliar son conocidos en la técnica e incluyen los métodos descritos, por ejemplo, en Clark et al.,Hum. Gene Ther., 10(6)/1031-1039 (1999); Schenpp and Clark,Methods Mol. Med., 69/427-443 (2002); Patente estadounidense N.° 6.566.118 y WO 98/09657.
En otro aspecto, la divulgación contempla composiciones que comprenden una construcción de oligómero activador del IRES del exón 5 de laDMDde la presente divulgación en un vector de administración viral u otro vehículo de administración. Las composiciones de la divulgación comprenden un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones también pueden incluir otros ingredientes, como diluyentes. Los portadores y diluyentes aceptables no son tóxicos para los receptores y son preferiblemente inertes en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones como fosfato, citrato u otros ácidos orgánicos; antioxidantes como el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular; proteínas, como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos como la polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, como glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; alcoholes de azúcar como el manitol o el sorbitol; contraiones formadores de sal como sodio; y/o tensioactivos no iónicos como Tween, plurónico o polietilenglicol (PEG).
Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando el ingrediente activo en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con algunos otros ingredientes enumerados anteriormente, según se necesite, seguido de esterilización por filtración. Por lo general, las dispersiones se preparan incorporando el ingrediente activo esterilizado en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los demás ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y la técnica de liofilización, que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de la solución previamente filtrada estéril del mismo.
Los títulos de rAAV que se administrarán en el uso en los métodos de la invención variarán dependiendo, por ejemplo, del rAAV en particular, el modo de administración, el objetivo del tratamiento, el individuo y el tipo o tipos de células a los que se dirige, y pueden determinarse mediante métodos estándar en la técnica. Los títulos de rAAV pueden ir de aprox. 1*10®, aprox.1*107, aprox. 1*108, aprox. 1*109, aprox. 1*101°, aprox. 1*1011, aprox. 1*1012, aprox. 1*1013 a aprox. 1*1014 o más partículas resistentes a DNasa (DRP) por ml. Las dosis también pueden expresarse en unidades de genomas virales (vg) (es decir, 1*107 vg, 1*1°8 vg, 1*109 vg, 1x101°vg, 1x1011 vg, 1x1012vg, 1x1013vg, 1x1014vg, respectivamente).
El uso de un rAAV tal como se define en las reivindicaciones en métodos de transducción de una célula diana (por ej., un músculo esquelético) de un paciente con una mutación 5' del gen de laDMD, in vivo o in vitro,se contempla aquí como parte de la divulgación. El uso en los métodos comprende el paso de administrar una dosis efectiva, o múltiples dosis efectivas, de una composición que comprende un rAAV como se define en las reivindicaciones a un animal (incluido un ser humano) con una mutación 5' del gen de laDMD.Si la dosis se administra antes del desarrollo de la DMD, la administración es profiláctica. Si la dosis se administra antes del desarrollo de la DMD, la administración es terapéutica. En las realizaciones de la invención, una "dosis efectiva" es una dosis que alivia (elimina o reduce) al menos un síntoma asociado con la DMD que se está tratando, que retrasa o previene la progresión a DMD, que retrasa o previene la progresión de un trastorno/estado de enfermedad, que disminuye el alcance de la enfermedad, que resulta en la remisión (parcial o total) de la enfermedad, y/o que prolonga la supervivencia.
La administración de una dosis efectiva de las composiciones puede realizarse por las vías estándar en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, vía intramuscular, parenteral, intravenosa, oral, bucal, nasal, pulmonar, intracraneal, intraósea, intraocular, rectal o vaginal. La vía(s) de administración y el serotipo(s) de los componentes del AAV del rAAV (en particular, las ITR del AAV y la proteína de la cápside) tal como se definen en las reivindicaciones se pueden elegir y/o adaptar por parte de los expertos en la materia teniendo en cuenta el estado de infección y/o la enfermedad que se está tratando y las células/tejido(s) diana. En algunas realizaciones, la vía de administración es intramuscular. En algunas realizaciones, la vía de administración es intravenosa.
La invención también contempla terapias combinadas. La terapia combinada tal como aquí se utiliza incluye el tratamiento simultáneo o tratamientos secuenciales. Se contemplan específicamente combinaciones de métodos de la invención con tratamientos médicos estándar (por ej., corticosteroides y/o fármacos inmunosupresores), así como combinaciones con otras terapias como las mencionadas en la sección Antecedentes expuesta más arriba. En algunas realizaciones, el corticosteroide es un glucocorticoide como la prednisona, deflazacort o Medrol (6-metil-prednisolona; PDN).
Ejemplos
Los siguientes ejemplos ilustran los aspectos y realizaciones de la invención. Los ejemplos que quedan fuera del alcance de las reivindicaciones se proporcionan con fines comparativos.
La mayoría de mutaciones que truncan el marco de lectura del gen de laDMDcausan la pérdida de la expresión de la distrofina y conducen a la DMD. Sin embargo, la gravedad de la enfermedad puede mejorar si se inicia una traducción alternativa a partir del exón 6 del gen de la DMD, lo que conduce a la expresión de una distrofina N-truncada altamente funcional. Esta nueva isoforma resulta del uso de un IRES en el exón 5 que es inducible por glucocorticoides. La actividad del IRES se confirmó en el músculo del paciente mediante la secuenciación de péptidos y el perfil de ribosomas, como se describe más abajo. La generación de un marco de lectura truncado antes(upstream)del IRES por omisión del exón condujo a la síntesis de una isoforma funcional N-truncada tanto en líneas celulares derivadas de pacientes como en un modelo de ratón con DMD, donde la expresión protege al músculo de lesiones inducidas por la contracción y corrige la fuerza muscular al mismo nivel que los ratones de control. Estos resultados apoyan un nuevo enfoque terapéutico para pacientes con mutaciones en los exones 5' del gen de laDMD.Véase también, Wein et al.,Abstracts/Neuromuscular Disorders, 23:738-852 (2013).
Ejemplo 1
Evidencia de traducción inducida por IRES a partir de muestras de músculo humano
Anteriormente publicamos que las mutaciones sin sentido y cambio en el marco que conducen a un codón de terminación al menos en los dos primeros exones de la DMD deberían dar lugar al fenotipo de BMD leve a través de la iniciación de la traducción del exón 6 [Gurvich et al.,Human Mutation, 30:633-64° (2009)]. Sin embargo, la duplicación del exón 2, que es la duplicación de un solo exón más común y da lugar a un codón de terminación prematuro dentro de la secuencia duplicada del exón 2, parece ser una excepción a esta predicción, ya que suele estar asociada con la DMD [White et al.,Human Mutation,27: 938-945 (2006)]. No obstante, no se ha descrito una deleción del exón 2, que también da lugar a un codón de terminación prematuro, ni en nuestra amplia cohorte [Flanigan et al.,Human Mutation, 30:1657-1666 (2009)] ni en otros amplios catálogos disponibles (www.dmd.nl). Interpretamos esta falta de casos notificados en el sentido de que las características clínicas en pacientes con deleciones del exón 2 son asintomáticas o excesivamente leves debido a la expresión de la isoforma N-truncada.
Esta interpretación se confirmó mediante la detección de una deleción del exón 2 (DEL2) en un niño italiano que acudió por primera vez a los 6 años para la evaluación de una elevación de la creatina quinasa sérica detectada de forma incidental (550 iu/l; valor normal < 200 iu/l). Se notificaron hitos motores tempranos normales y nunca se informó de una distrofia muscular en la familia. Su examen neurológico fue completamente normal a los 15 años de edad. La biopsia muscular mostró una ligera variabilidad en el tamaño de las fibras (Figura 7a), y en algunas secciones un mayor número de núcleos centrales junto con algunas fibras hipercontraídas densamente teñidas. El análisis inmunofluorescente con un anticuerpo C-terminal mostró la presencia de distrofina en la membrana (Figura 7b). Curiosamente, el análisis de western blot reveló que la distrofina detectada tenía un peso molecular menor (~410 kDa) (Figura 1a), y el análisis mutacional reveló una deleción del exón 2 (Figura 7c-g). La secuenciación posterior de péptidos mediante espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS)20 confirmó la ausencia de cualquier residuo codificado por los exones 1 a 5 entre los 99 péptidos únicos detectados y coincidentes con la distrofina, lo que coincide con el inicio de la traducción dentro del exón 6 (Figura 1b y Tabla 1).
Tabla 1. Coincidencia del espectro de péptidos en el músculo humano. Péptidos de distrofina codificados en los exones 1-10. (N) representa el número de veces que se detectó una secuencia peptídica en el músculo de control normal o en el músculo del paciente con una deleción del exón 2.
En un enfoque complementario, examinamos la eficiencia de la traducción deDMD,el uso de promotores y elsplicingutilizando ARN del músculo aislado de un paciente con BMD leve con una mutación de cambio de marco del exón 2 (c.40_41del [p.Glu14ArgfsX17], denominada FS) cuyo análisis western blot también reveló la expresión de la misma distrofina de menor peso molecular (~410 kDa) que carecía del epítopo N-terminal (Figura 1c; Figura 8a). Para confirmar los resultados del western blot, se utilizó homogeneizado muscular del mismo paciente con FS para construir bibliotecas de secuenciación de ARN para fragmentos protegidos por ribosomas(es decir,huellas de ribosomas aisladas tras la digestión con RNasa) y para ARN total. Comparamos la eficiencia de traducción del ARNm en el músculo normal frente al del paciente utilizando la proporción de lecturas de fragmentos protegidos por ribosomas (RPF) frente a las lecturas de secuenciación de ARN. Entre los 1000 ARNm musculares más abundantes,DMDmostró el mayor cambio en eficiencia de traducción (Figura 1 d), lo que indica una reducción de ~5 veces en la cantidad de ribosomas que traducen el transcrito muscular de laDMDen el FS del paciente con cambio del marco. Esta disminución de la cantidad de traducción es consistente tanto con la reducción esperada del nivel de distrofina dado el fenotipo de BMD leve del paciente, como con la cantidad de distrofina observada en pacientes4 p.Trp3X y otros alelos de mutación 5' (Figura 1c).
El patrón de la secuenciación del ARN en diente de sierra observado en los intrones 1 a 8 en laDMD(Figura 1e) confirmó que el inicio principal de la transcripción se localizaba en el promotor específico del músculo de la distrofina (Dp427m) y que los exones 1 a 7 de la DMD experimentaban unsplicingcotranscripcional eficiente.
[Ameur et al.,Nature Structural & Molecular Biology, 18:1435-1440 (2011)] tanto en las muestras de control como en las de pacientes FS. Dos isoformas alternativas de 427 kD de la distrofina (Dp427p y Dp427c) se expresan principalmente en el sistema nervioso central y se diferencian de Dp427m solo en el uso de secuencias alternativas del exón 1. La falta de una señal de ARN naciente fuerte de los promotores Dp427p o Dp427c confirmó que la regulación al alza de los promotores alternativos no contribuye al uso alternativo de AUG en el exón 6 (Figura 1e). En ambas muestras, las lecturas de la secuenciación de ARN que abarcan las uniones exón-exón se mapeaban exclusivamente en las uniones conocidas entre el exón 1 y el exón 11 de Dp427m, lo que indica que elsplicingde nuevos 5' UTR de promotores alternativos no contribuyó en el uso de AUG del exón 6. La distribución de las huellas de ribosomas mapeadas en los exones 1 a 11 de Dp427m reveló niveles normales de iniciación AUG del exón 1, seguida de terminación prematura en el exón 2 y reanudación de la traducción después de los codones AUG en el marco del exón 6 (Figura 1f) que continuaron en el cuerpo de la transcripción de laDMD(Figura 8b, c y d), consistente con una iniciación de traducción alternativa eficiente.
Ejemplo 2
Estudios de transcripción/traducciónin vitro
Tras haber demostrado nuevas pruebas de la iniciación eficiente de la traducción alternativa utilizando tanto el perfilado de ribosomas como el análisis de proteínas directamente en el músculo del paciente, buscamos caracterizar los elementos que contribuyen a la alta eficiencia de la traducción. Para determinar si los exones 1 a 5 de laDMDcontienen un IRES, clonamos la porción 5' del ADNc que abarca los exones 1 hasta parte del exón 6, comenzando en la posición 4 para excluir el codón de inicio a Ug nativo (c.4_c.369, denominado exón 1 a 6), en el vector del reportero dicistrónico de luciferasa dual pRDEF. Este vector contiene un marco abierto de lectura (ORF) de luciferasa renilla (RLuc) cap dependiente anterior(upstream)bajo el control de un promotor SV40 y un ORF de luciferasa de luciérnaga (FLuc) cap independiente posterior(downstream)bajo el control de las secuencias de interés, con los dos ORF separados por un elemento de estructura secundaria (dEMCV) que impide el escaneado ribosómico (Figura 2c). Utilizamos la secuencia del IRES del EMCV como control positivo y normalizamos todos los valores al vector vacío. En cada caso, incluimos 49 nucleótidos del exón 6 que colocaron los AUG del exón 6 en el marco con el reportero FLuc posterior(downstream).Esta secuencia corresponde a los primeros 39 nt, incluidos los dos AUG en marco (M124 y M128), y 10 nucleótidos adicionales utilizados para fines de clonación. Se generaron ARN mediados por T7 a partir de las diferentes construcciones y se utilizaron para hacer ensayos de traducción de lisado de reticulocitos de conejo (RRL) (Figura 2a, panel izquierdo). Se comprobó el tamaño y la integridad de los ARN correspondientes utilizando un gel de agarosa con formaldehído (Figura 2b). La actividad de traducción cap independiente (representada como la relación entre la luminiscencia FLuc posterior(downstream)y la RLuc) de los exones 1-5 de laDMDda como resultado un aumento de 1,5-1,7 veces en la señal de FLuc, menor que el aumento de 3,4-3,8 observado con el control del IRES del EMCV, pero consistente con la actividad del iRES (Figura 2a, panel izquierdo).
Ejemplo 3
Actividad del IRES en cultivos celulares
La traducción basada en RRL puede subestimar la actividad del IRES de los IRES celulares virales o eucariotas, posiblemente debido a las cantidades limitadas de proteínas de unión al ARN en este extracto especializado o debido a la falta de factores transaccionales del IRES específicos de tejido. (ITAF). Así pues, el ensayo se realizó en mioblastos C2C12 que expresaban distrofina, y observamos que la presencia de la construcción del exón 1 al 6 condujo a una expresión de FLuc ~8 veces mayor en relación con el vector del exón 6 solo (Figura 2a, panel derecho). Esto representa ~50 % de la actividad del control del IRES del EMCV, lo que sugiere la presencia de un IRES relativamente fuerte dentro de los exones 1-5. Para mapear la posición del IRES, se clonaron en pRDEF construcciones de deleción consistentes en la porción 5' del gen de laDMD(exones 1-5) o controles apropiados (Figura 2c). La deleción de los primeros 300 nucleótidos (nt) de esta secuencia no cambió significativamente la expresión de FLuc, mientras que la eliminación o inversión de los últimos 71 nt (que representan casi todo el exón 5) anula por completo la expresión del reportero FLuc, y las eliminaciones adicionales dentro del exón 5 dan como resultado una expresión de FLuc muy reducida. Para probar la hipótesis de que el IRES putativo requería factores específicos del músculo, repetimos los experimentos en células HEK293K, que no expresan distrofina de forma endógena, y en una línea celular comercial de mioblastos humanos (hSKMM). A diferencia del IRES de la EMCV, el IRES de laDMDputativo no estimuló la expresión de FLuc en células 293K, mientras que el nivel de estimulación en células hSKMM replicó los resultados de C2C12 (Figura 9a), lo que sugiere que el IRES es preferentemente activo en el músculo.
Se hicieron experimentos de control para excluir la posibilidad de eventos desplicingaberrantes, actividades del promotor crípticas u otros artefactos potenciales que condujeran a una mala interpretación del ensayo dicistrónico. Eliminamos el promotor SV40 antes(upstream)para generar una versión sin promotor del vector pRDEF que contiene la secuencia deDMDdel exón 1 al 6 (c.4_c.369). La transfección de esta construcción en mioblastos C2C12 mostró solo una luminiscencia de fondo mínima tanto de RLuc como de FLuc, lo que contradice en gran medida cualquier actividad del promotor críptica en la secuencia de codificación de laDMD(datos no mostrados). No se detectó ningúnsplicingaberrante por RT-PCR (Figura 2d y 9c), y la integridad del ARN se confirmó mediante un Northern blot (Figura 2e y 9b).
En particular, aunque la duplicación o la eliminación del exón 2 da lugar a un marco de lectura interrumpido, los fenotipos clínicos dispares asociados llevaron a la hipótesis de que la actividad del IRES puede disminuir en presencia de una duplicación del exón 2. Probamos esta hipótesis en células C2C12 y demostramos que la activación del IRES era equivalente entre los ADNc de longitud completa (exones 1-6) y de deleción 2, pero se reducía notablemente en presencia de una duplicación del exón 2 (Figura 2f), lo que confirma que la duplicación, pero no la deleción del exón 2, elimina la actividad del IRES.
Ejemplo 4
La omisión del exón fuera del marco es capaz de llevar a la distrofina mediada por IRESin vitro.
Al considerar la omisión de exones antes del IRES del exón 5, solo la eliminación del exón 2 interrumpirá el marco de lectura y dará lugar a un codón de terminación prematuro (Figura 3a). Contemplamos que la eliminación de este exón podría utilizarse terapéuticamente para aumentar la activación del IRES, ya sea mediante el uso de oligonucleótidos antisentido (AON) [Wood et al.,Brain: A Journal of Neurology, 133:957 972 (2010); van Deutekom et al.,New England Journal of Medicine, 357:2677-2686 (2007) and Kinali et al.,Lancet Neurology, 8:918-928 (2009)] o mediante el uso de la aportación antisentido mediada por AAV-U7 [Goyenvalle et al.,Science, 306 :1796-1799 (2004) and Vulin et al.,Molecular Therapy: Journal of the American Society of Gene Therapy, 20:2120-2133 (2012)]. Seleccionamos cuatro secuencias diferentes (etiquetadas respectivamente como "B", "AL", "AS" y "C" en la Figura 3b) para la focalización de U7snRNA y las clonamos en AAV1 para evaluar la eficiencia de omisión del exón en mioblastos generados a partir de líneas celulares de fibroblastos de tipo salvaje o una duplicación del exón 2 que expresa un MyoD inducible por doxiciclina (denominado FibroMyoD) [Chaouch et al.,Human Gene Therapy, 20:784-790 (2009)]. Todas las construcciones pudieron omitir una o dos copias del exón 2 (Figura 10). Posteriormente, con el fin de aumentar la eficiencia de omisión, se clonaron dos copias de cada una de las secuencias antisentido focalizadas U7-C y U7-AL en el único vector AAV1 autocomplementario (sc) (y designado AAV1.U7-ACCA), cuyo genoma se muestra en la Figura 15 en la orientación 3' a 5'. Se utilizaron U7-C y U7-AL para evitar cualquier posible solapamiento en la secuencia antisentido entre AL y B. Se utilizó una secuencia antisentido conocida (AON H2A) como control positivo de omisión [Tennyson y Worton,Nucleic Acids Res., 24:3059-3064 (1996)]. La infección de células FibroMyoD dio lugar al 88,6 % de la transcripción de DMD con omisión completa del exón 2, conduciendo a la producción de distrofina truncada en N-terminal (Figura 3c, 3d y 12a).
Ejemplo 5
La distrofina N-truncada dirigida por el IRES se expresa después de la omisión del exón fuera del marco en un nuevo modelo de ratón que presenta una duplicación del exón 2.
Probamos la capacidad del vector U7-ACCA para omitir el exón 2in vivoen un modelo de ratón que portaba una duplicación del exón 2 en un fondo C57BL/6 (el ratón Dup2; descrito en el Ejemplo 8 más abajo). El ARNm de DMD resultante contiene dos copias del exón 2, lo que interrumpe el marco de lectura y da lugar a una ausencia casi completa de la expresión de distrofina. Se inyectó AAV1.U7-ACCA (1e11 vg) directamente en el músculo tibial anterior de ratones Dup2 de seis a ocho semanas de edad (n=5) o ratones BI6 de control. Cuatro semanas después, el análisis de<r>T-PCR de los músculos inyectados demuestra una omisión del exón casi completa del exón 2 en Dup2 o BI6 (Figura 4a, 4b). En consonancia con los resultados de la RT-PCR, el patrón de secuenciación del ARN en diente de sierra observado en los intrones de laDMD1 y 2 confirmó la supresión delsplicingcotranscripcional del exón 2 duplicado, así como la alta eficiencia delsplicingcotranscripcional del exón 1 al exón 3 en los ratones tratados (Figura 4c). El análisis Western blot y la inmunotinción demuestran la expresión de la proteína N-truncada. La tinción sarcolemal se restableció para p-distroglicano y nNOS (Figura 4d, 4e), lo que sugiere la presencia de un complejo distroglicano funcional.
También realizamos un estudio de aumento de dosis mediante inyección intramuscular (IM) en el tibial anterior (TA) de ratones Dup2 para evaluar el grado de respuesta a la dosis para la omisión de exón y la expresión de proteínas. Las dosis crecientes de la IM se muestran en la Figura 18a. Como se ve en la Figura 18b, el grado de transcripción omitida muestra una respuesta esperada a la dosis. La Figura 18b muestra una respuesta similar esperada a la dosis en la expresión de proteínas, máxima a 3,1 E11 vg por inyección, con una corrección significativa de los defectos de fuerza fisiológica (Figura 18c).
Ejemplo 6
Los glucocorticoides aumentan la activación del IRES de la distrofina
Examinamos el efecto de la exposición a glucocorticoides sobre la actividad del IRES, ya que se descubrió que un IRES específico del músculo que se encuentra en el UTR 5' de la utrofina, un análogo de la distrofina, se activaba con glucocorticoides [Miura et al.,PloS One,3: e2309 (2008)]. Además, el tratamiento con los glucocorticoides prednisona y deflazacort es el tratamiento estándar para la DMD. Analizamos la actividad del IRES del exón 5 usando la construcción del exón 5 al 6 en células C2C12 en presencia de concentraciones crecientes de 6-metil-prednisolona (PDN) y descubrimos que la actividad FLuc posterior(downstream)aumentaba de forma dependiente de la dosis, desde un cambio de aproximadamente 7 veces en ausencia de PDN hasta más de 20 veces con 6,4 pM de PDN. (Figura 5a). Esta activación de los glucocorticoides no se observó tras la transfección del exón 6 solo o de las construcciones de control del exón 5 invertido o en 293K (Figura 5a y S5a). Se observó un aumento en la expresión de la distrofina en las células de FibroMyoD del Dup2 tratadas con 6,4 pM de PDN (Figura 5b) y el tratamiento conjunto de ratones Dup2 (n=5) con U7-ACCA y PDN dio como resultado un aumento en la expresión de distrofina con respecto a U7-ACCA solo (Figura 5cd), consistente con la inducibilidad de los glucocorticoides. Se observó un aumento de menos del 3 % en comparación con el Dup2 no tratado con PDN solo en muestras raras (representadas en la Figura 5c), lo que sugiere cierta fuga del IRES en el modelo Dup2. En todos los casos, este aumento de la expresión de la distrofina no se debió a una diferencia en el número de copias del genoma del vector AAV (datos no mostrados). Dado que la traducción de la utrofina puede estar regulada por corticosteroides y la sobreexpresión puede compensar la ausencia de distrofina, evaluamos los niveles de utrofina en los mismos músculos inyectados (Figura 5e). En los animales Dup2 no tratados, los niveles de utrofina aumentaron en comparación con BI6, de forma similar a lo que se ha descrito enmdx,el modelo estándar de ratón con distrofinopatía. La comparación de los cuatro grupos no revela ninguna diferencia estadísticamente significativa en los niveles de utrofina entre los animales tratados y no tratados con PDN (Figura 5f), lo que excluye la regulación al alza de la utrofina como causa de rescate funcional tras el tratamiento con PDN.
Ejemplo 7
La expresión de distrofina N-truncada dirigida por el IRES local estabiliza la membrana muscular y corrige los déficits de fuerza en el músculo del ratón Dup2
Examinamos si la expresión de la isoforma dirigida por el IRES mejoraba la integridad y la fisiología muscular en el ratón Dup2. De forma similar al caso de los ratonesmdx,los cambios distróficos en los ratones Dup2 son cuantificables a las 4 semanas de edad como una regeneración muscular generalizada caracterizada por núcleos centralizados (Vulin et al., manuscrito en prensa). Un mes después de la inyección intramuscular de AAV1 .U7-ACCA en el músculo tibial anterior de ratones Dup2 de 4 semanas de edad, la expresión de la isoforma dirigida por el IRES da como resultado una reducción significativa de los núcleos centralizados (Figura 6a). Para demostrar que esta isoforma restaura la integridad de la membrana, se sometió a ratones Dup2 tratados y no tratados a un protocolo de marcha cuesta abajo y se les inyectó azul de Evans (EBD), que penetra en las fibras musculares esqueléticas que han sido permeabilizadas por daños en la membrana. Tras la inyección intraperitoneal de<e>B<d>, la captación solo se encuentra en fibras sin tinción de distrofina, lo que sugiere que la proteína N-truncada estabiliza el sarcolema y proporciona más evidencia de la funcionalidad de esta proteínain vivo(Figura 4f). La cuantificación del número de fibras positivas EBD confirma que la expresión de la isoforma dirigida por el IRES da como resultado la protección de las fibras musculares en estos ratones (Figura 6b). Es importante destacar que esta protección de la membrana está asociada con la restauración de la fuerza de agarre de las extremidades posteriores (Figura 6c) y la fuerza muscular específica (Figura 6d) a los niveles observados en los ratones de control BI6. Los músculos de Dup2 inyectados con U7-ACCA con o sin prednisona fueron significativamente más resistentes a la lesión inducida por contracción que el músculo Dup2 no tratado, y la combinación de ambos tratamientos no mostró diferencias significativas con respecto a los controles de BI6 (Figura 6e). A pesar de la mínima expresión (<3 %) de distrofina observada en algunos músculos del Dup2 por PDN (Figura 5c), el tratamiento de los músculos del Dup2 solo con PDN no resulta en una mejora significativa de la fisiología muscular (Figura 6).
Ejemplo 8
Modelos de DMD
Los ejemplos de modelos de duplicación del exón 2 de la DMD se incluyen los siguientes modelosin vivo e in vitro.
modelo de ratón mdXdup2
Se desarrollaron ratones que portaban una duplicación del exón 2 dentro del locus de laDMD.La mutación por duplicación del exón 2 es la mutación por duplicación humana más común y da lugar a una DMD relativamente grave.
En la Figura D se muestra un mapa del vector de inserción. En el mapa, los números indican las posiciones relativas de los sitios de clonación y los sitios de exones y restricción. El casete neo está en la misma dirección del gen y el punto de inserción está precisamente en 32207/32208 pb en el intrón 2. Se mantienen al menos 150 pb de secuencias intronales extra a cada lado del exón 2 insertado, la región E2 es de 1775-2195 pb. Los tamaños del exón 2 y el intrón 2 son de 62 pb y 209572 pb respectivamente.
Se transfectaron células masculinas C57BL/6 ES con el vector (Figura D) que transportaba una construcción del exón 2 y después se comprobó la inserción mediante PCR. Se encontró un buen clon, se amplificó y se inyectó en docenas de blastocistos albinos BL/6. Los blastocistos inyectados se implantaron en los ratones receptores. El gen de la distrofina de los machos quiméricos se comprobó mediante PCR y luego mediante RT-PCR. La colonia se amplió e incluye algunos ratones hembra criados hasta la homocigosidad. La expresión de distrofina en los músculos de un ratón mdxdup2 hemicigoto de 4 semanas de edad era prácticamente ausente.Líneas celulares de fibroMyoD inmortalizadas e inducibles condicionalmente
La expresión del gen de MyoD en fibroblastos de mamíferos da lugar a la transdiferenciación de células en el linaje miogénico. Estas células pueden diferenciarse aún más en miotubos y expresan genes musculares, incluyendo el gen deDMD.
Se generaron líneas celulares inmortalizadas que expresan condicionalmente MyoD bajo el control de un promotor inducible por tetraciclina. Esto se consigue mediante la transfección estable de las líneas de fibroblastos primarios de un lentivirus que contiene el gen de la telomerasa humana (TER) y el MyoD tetinducible. La línea estable resultante permite iniciar la expresión de MyoD mediante tratamiento con doxiciclina. Estas líneas celulares se generaron a partir de pacientes con DMD que portaban una duplicación del exón 2.
Se demostró el uso de la línea, la omisión de duplicación utilizando oligómeros antisentido (AON) 2-O-metil proporcionados por el Dr. Steve Wilton (Perth, Australia). Se probaron múltiples líneas celulares.
Líneas celulares primarias transfectadas transitoriamente con MyoD
Se hicieron experimentos de prueba de principio utilizando líneas de fibroblastos primarios transfectados transitoriamente con adenovirus-MyoD. Las construcciones de adenovirus no se integraron en los genomas celulares, pero MyoD se expresó transitoriamente. La expresión de DMD resultante fue suficiente para realizar experimentos de omisión del exón (aunque la reproducibilidad favorece las líneas transfectadas de forma estable).
Ejemplo 9
La inyección intravenosa de AAV9-U7_ACCA en el modelo de ratón Dup2 da como resultado una expresión significativa de la isoforma N-truncada y la corrección del déficit de fuerza
Probamos la capacidad de un genoma AAV9-U7-ACCA para omitir el exón 2in vivoen ratones Dup2 tras la inyección intravenosa. El genoma U7-ACCA se clonó en un vector rAAV9 (designado aquí AAV9-U7_ACCA) para la administración a los ratones. Se inyectó AAV9-U7_ACCA en la vena de la cola (3,3E12 vg/kg) de cinco ratones Dup2. Un mes después de la inyección, se examinaron los animales tratados.
Los resultados del experimento se muestran en la Figura 17.
También realizamos estudios de aumento de la dosis de administración intravenosa (Figura 19a). Como se ve en la Figura 19b, el grado de transcripción omitida muestra una respuesta de dosis esperada, como se vio en los estudios de inyección intramuscular (IM). En el nivel más alto, la mayoría de la transcripción consiste en una transcripción de tipo salvaje, que se traduce en distrofina de longitud completa, o en transcripción con deleción del exón 2, que se traduce en la isoforma N-truncada; es importante destacar que cualquiera de las isoformas proporciona un beneficio funcional al ratón (como en humanos). La Figura 19c muestra una respuesta similar a la dosis esperada en la expresión de proteínas. Es muy importante, en términos de utilidad clínica, que a dosis más altas hay una expresión incuestionable y abundante de distrofina en el diafragma y los músculos cardíacos. La cuantificación de la expresión de proteínas en inmunoblot (Figura 19d) confirma la respuesta al aumento de la dosis.
La detección neonatal (NBS) de la DMD en recién nacidos humanos ahora es factible, por lo que probamos los beneficios de la expresión temprana de la isoforma N-truncada mediante la administración del vector AAV9.U7-ACCA (8*1011 vg) en ratones Dup2 el día 1 postnatal (P1). Esta única inyección da lugar a una expresión generalizada de la isoforma N-truncada en todos los músculos, con una protección sostenida de las fibras musculares durante uno y seis meses después del tratamiento (Figura 20).
Ejemplo 10
Se administró a ratones Dup2, PPMOs con las siguientes secuencias (mostradas de 5' a 3').
Oligómero antisentido C: AUUCUUACCUUAGAAAAUUGUGC (SEQ ID NO: 10)
Oligómero antisentido AL: GUUUUCUUUUGAACAUCUUCUCUUUCAUCUA (SEQ ID NO: 11)
Transfectamos el AL-PPMO en mioblastos de ratón C2C12 de tipo salvaje (Fig. 22). Tres días después de la transfección, se realizó una RT-PCR que demostró una omisión eficiente del exón 2 (Figura 22a). Se realizó un experimento similar en el modelo de ratón Dup2. Se aplicó una inyección intramuscular de AL-PPMO en el tibial anterior (TA) de ratones Dup2 para evaluar el grado de omisión del exón 2 y la expresión de proteínas. Como se ve en la Figura 22b, la omisión del exón 2 se logró de manera eficiente. La Figura 22c se obtuvo utilizando los mismos músculos TA tratados. Se llevó a cabo la inmunotinción de la distrofina y los resultados demostraron la producción eficiente y la localización en la proteína de la membrana plasmática.
En otro experimento, se administraron inyecciones sistémicas en la vena de la cola de otra cohorte de ratones de tres dosis semanales a una dosificación de 12 mg/kg. Evaluaremos la omisión y la restauración de la distrofina a las 4 semanas posteriores a la primera inyección.
Ejemplo 11
Los pacientes que presentan una mutación sin sentido dentro del exón 1 o 2 siguen expresando la isoforma de distrofina truncada N-terminal altamente funcional. Esto se debe a la presencia del IRES en el exón 5 que permite la reentrada del ribosoma y la traducción desde el exón 6. Así pues, planteamos la hipótesis de que la creación de una mutación sin sentido debería forzar la activación del IRES en líneas celulares de pacientes humanos que portan una mutación sin sentido o una duplicación de deleción en el marco, dentro del exón 1 a 4. Solo la eliminación del exón 2 genera un codón de terminación en el exón 3. Por tanto, la omisión completa del exón 2 en un paciente portador de la mutación mencionada anteriormente induciría un codón de terminación en el exón 3 y, en consecuencia, la producción de la isoforma truncada N-terminal mediada por el IRES. Recogimos células de pacientes humanos portadores de mutaciones en estos exones. Las células se infectaron después con un lentivirus que expresaba un MyoD inducible que fuerza la conversión de fibroblastos en mioblastos, que luego pueden diferenciarse en miotubos, el tipo de célula que expresa distrofina (en adelante "miofibroblastos"). A pesar de que el objetivo era recoger células de pacientes que albergaran una mutación sin sentido o una deleción o duplicación en el marco dentro del exón 1 a 4, solo se disponía de células de pacientes portadores de una mutación sin sentido. Estas células procedían de pacientes con BMD y, dado que portaban una mutación sin sentido, ya expresaban de forma natural la isoforma de distrofina truncada N-terminal. Sin embargo, el tratamiento con AAV1.U7-ACCA en la diferenciación dio lugar a una mayor expresión de la isoforma iniciada por el IRES en el día 14 (Figura 21).
Debate de los resultados en los ejemplos
Hemos demostrado la presencia de un IRES sensible a los glucocorticoides dentro del exón 5 de la DMD que puede dirigir la expresión de una distrofina N-truncada pero funcional. El perfilado de ribosomas de un paciente con BMD con mutación de cambio en el marco del exón 2 demostró una leve reducción en la eficiencia de traducción de la distrofina y un patrón de huella de ribosomas consistente con la carga de ribosomas que comienza en los exones 5 y 6. La relevancia de esta isoforma inducida por el IRES para la mejora de la gravedad de la enfermedad, que describimos por primera vez en pacientes con mutaciones sin sentido en el exón 1 [Flanigan et al.,Neuromuscular Disorders: NMD, 19:743-748 (2009)], también se confirma con los datos de la espectrometría de masa del primer caso registrado de deleción del exón 2, encontrado en un sujeto completamente asintomático. Por último, en un novedoso enfoque terapéutico, hemos inducido la omisión de exón fuera del marco para generar un codón de terminación prematuro y, en consecuencia, forzar la activación del IRES tanto en líneas celulares derivadas de pacientes como en un novedoso modelo de ratón con DMD, en el que hemos restaurado componentes del complejo de la distrofina y corregido las características patológicas y fisiológicas de la lesión muscular.
La mayoría de los ARNm eucariotas son monocistrónicos y poseen una estructura cap especializada en su extremo 5', que es necesaria para el inicio de la traducción, ya que es donde comienza el escaneado por la subunidad ribosomal 40S. A pesar de la clara evidencia del modelo de iniciación de escaneado 5' ^ 3' cap dependiente, el análisis bioinformático ha sugerido que aprox. el 50 % de las transcripciones humanas contienen marcos abiertos de lectura cortos (uORF) 5'UTR anteriores(upstream)que pueden mediar en la eficiencia y el control de la traducción específica de la transcripción. Los uORF pueden funcionar modulando el escaneado ya sea con fugas o la reiniciación dependiente de la terminación, aunque los uORF también pueden regular dinámicamente el acceso a los elementos del IRES, como se muestra en el gen del transportador de aminoácidos catiónicos de mamíferos 1,CAT1/SLC7A1.Reconociendo las precauciones planteadas con respecto a la identificación del IRES a través de ensayos de reporteros, todos los experimentos de control realizados en este estudio, incluyendo la evaluación de la integridad del ARN mediante RT-PCR y Northern blot, el uso de un plásmido sin promotor y el uso de un control del IRES positivo adecuado, fueron consistentes con la iniciación cap independiente debido a la actividad del IRES. Mapeamos una región mínima que alberga una actividad del IRES de la DMD en 71 nt, de una longitud pequeña en comparación con EMCV (588 nt) pero de tamaño similar a la identificada en el c-myc 5'UTR (50 nt). Esta es una característica importante, ya que los IRES tan pequeños pueden utilizarse en vectores dicistrónicos, donde el espacio es limitado cuando se empaquetan en vectores virales como AAV.
Aunque el mecanismo molecular preciso por el cual los IRES celulares modulan la traducción no se ha definido en la literatura, se ha sugerido firmemente la necesidad de ITAF (factores trans-activadores del IRES). Estas proteínas celulares actúan en trans para aumentar la actividad del IRES. Se ha demostrado que casi todos los ITAF albergan dominios de unión al ARN y se ha planteado la hipótesis de que actúan como chaperonas del ARN, ayudando a la secuencia primaria del IRES a alcanzar el estado conformacional adecuado intrínseco a su actividad. Esto probablemente esté relacionado con la pérdida de actividad del IRES de la distrofina en presencia de una duplicación del exón 2, que puede suprimir la función del IRES mediante la formación de una estructura secundaria compleja o provocar la formación de un uORF inhibitorio que interfiera con el acceso del ITAF al IRES del exón 5.
Nuestros resultados aportan una explicación molecular para el rescate de mutaciones de truncamiento 5' a través de un mecanismo no descrito hasta ahora de regulación postranscripcional de la expresión de la distrofina. La identificación de este nuevo IRES celular y la isoterma de la distrofina resultante tiene implicaciones significativas para la comprensión de la biología básica del músculo y la distrofina. Observamos que el exón 5 de la DMD está altamente conservado, con un 87 % de identidad con el humano que se encuentra en los genes deDMDdel perro, el ratón, el caballo y el pollo, y un 67 % entre 39 especies, incluyendoD. rerio y X. tropicalis.La presencia de un IRES dentro de una región tan altamente conservada sugiere claramente una presión selectiva que favorece un papel programado para el inicio de la traducción alternativa. El papel del IRES en condiciones normales no está claro, pero los esfuerzos continuados para comprender las señales de activación condicionales y/o específicas del linaje celular específico relevante arrojarán luz sobre los mecanismos subyacentes de control del IRES y dilucidarán funciones potencialmente nuevas de la distrofina.
Una pregunta intrigante es cómo la isoforma N-truncada sigue siendo funcional. Se presume que una función celular clave de la distrofina es transmitir la fuerza de contracción a través del sarcolema a las estructuras extracelulares, actuando como un importante rol de puente arquitectónico entre el citoesqueleto de F-actina y la membrana plasmática muscular. Dos regiones dentro de la distrofina son responsables de la unión de la F-actina: ABD1 (dominio de unión a actina, que abarca los residuos 15-237) y ABD2 (que abarca los residuos 1468-2208). Diversos estudios han demostrado una falta de estabilidad de la distrofina en el contexto de las deleciones dentro del dominio ABD1. Sin embargo, observamos que la mayoría de estos estudios se realizaron con construcciones de microdistrofina que carecían del dominio ABD2, que ha demostrado mejorar la interacción entre ABD1 y la actina. Estas miniproteínas se unen a la actina y modifican la dinámica de la actina de una manera diferente si lo comparamos con la versión de longitud completa. Aunque los resultados con tales construcciones muestran que la ausencia de ABD2 no anula completamente la unión de la distrofina a la actina, es poco probable que la ausencia de ABD1 interrumpa por completo la interacción entre la distrofina y la actina. La expresión de transgenes suprimidos para ABD1 disminuye el fenotipo mdx y restaura el patrón costamérico de la banda M y las líneas Z, lo que sugiere que el enlace entre la distrofina y el citoesqueleto subsarcolémico implica algo más que una interacción con ABD1. De acuerdo con esto, se ha demostrado que otros elementos del citoesqueleto interactúan con la repetición de espectrina de la distrofina.
Aunque algunas series sugieren que la BMD debida a mutaciones que afectan a ABD1 es más grave [Beggs et al., American Journal of Human Genetics, 49: 54-67 (1991)], nuestras observaciones clínicas y experimentales, así como informes de otros pacientes con BMD que carecen de parte o la totalidad del dominio ABD1 [Winnard et al.,Human Molecular Genetics, 2:737-744 (1993); Winnard et al.,American Journal of Human Genetics, 56:158-166 (1995) and Heald et al.,Neurology, 44:2388-2390 (1994)] - indican claramente la funcionalidad significativa de la isoforma N-truncada dirigida por el IRES a pesar de carecer de la primera mitad del ABD1 canónico (Figura 3a). Esto es de particular interés, ya que forzar la expresión de esta isoforma mediante la generación de una transcripción fuera de marco para inducir la actividad del IRES tiene un potencial terapéutico sustancial. Esta novedosa estrategia fuera del marco podría combinarse con el tratamiento con glucocorticoides, un fármaco que ya se utiliza en pacientes con DMD/BMD, lo que debería aumentar la activación del IRES. De forma significativa, en lugar de ser un enfoque personalizado de omisión de exón para pacientes con duplicaciones del exón 2 (que representan casi el 2 % de los pacientes con DMD en una serie grande), la omisión fuera del marco del exón 2 para inducir la expresión de dicha proteína se contempla para el tratamiento de todos los pacientes que presentan mutaciones en el extremo 5' del gen de la DMD (hasta el 6 % en la misma cohorte) [Flanigan et al.,Neuromuscular Disorders: NMD,19: 743-748 (2009)].

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende una construcción del oligómero activador del sitio de entrada del ribosoma interno (IRES) del exón 5 de la distrofia muscular de Duchenne (DMD) que comprende:
(a) un polinucleótido antisentido U7-C que comprende la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 6, o
(b) un polinucleótido que codifica el oligómero antisentido U7-C que comprende la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 10
para el uso en el tratamiento de la DMD o distrofia muscular de Becker en un paciente con una mutación 5' en el gen de la DMD, donde el paciente no tiene una duplicación del exón 2 de DMD.
2. El rAAV para el uso de la reivindicación 1, donde la construcción del oligómero activador del IRES del exón 5 de la DMD es una construcción del polinucleótidos U7snRNA en el genoma del rAAV.
3. El rAAV para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el rAAV comprende la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 15.
4. El rAAV para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el tratamiento comprende además la administración de un glucocorticoide al paciente.
5. El rAAV para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde
a) se inhibe la progresión de una patología distrófica en el paciente;
b) la función muscular mejora en el paciente;
c) la función muscular mejora en el paciente y la mejora de la función muscular es una mejora en la fuerza muscular;
d) la función muscular mejora en el paciente y la mejora de la función muscular es una mejora de la estabilidad al estar de pie y al caminar; o
e) se expresa una isoforma truncada funcional de la distrofina en el tejido muscular del paciente.
6. El rAAV para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde
a) el genoma del rAAV carece de ADN rep y cap del virus adenoasociado;
b) el genoma del rAAV es autocomplementario o monocatenario; o
c) el rAAV es rAAV1, rAAV2, rAAV3, rAAV4, rAAV5, rAAV6, rAAV7, rAAV8, rAAV9, rAAV10, rAAV11, o rAAVrh74.
7. El rAAV para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la construcción del oligómero activador del IRES del exón 5 de la DMD comprende un polinucleótido que comprende dos o más copias de (a) la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 6 y/o la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 7; o
(b) la secuencia de nucleótidos que expresa una transcripción de ARN que comprende la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 10 y/o la secuencia de nucleótidos que expresa una transcripción de ARN que comprende la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 11.
8. El rAAV para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la construcción del oligómero activador del IRES del exón 5 de la DMD comprende un polinucleótido que comprende dos copias de (a) la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 6 y la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 7; o
(b) la secuencia de nucleótidos que expresa una transcripción de ARN que comprende la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 10 y la secuencia de nucleótidos que expresa una transcripción de ARN comprende la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 11.
9. El AAV recombinante para el uso de la reivindicación 1 que comprende el polinucleótido antisentido U7-C que comprende la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 6.
10. El AAV recombinante para el uso de la reivindicación 1 que comprende el polinucleótido que expresa el oligómero antisentido U7-C que comprende la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 10.
ES19180710T 2014-08-09 2015-08-07 Methods and materials for activating an internal ribosome entry site in exon 5 of the dmd gene Active ES3014437T3 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462035395P 2014-08-09 2014-08-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES3014437T3 true ES3014437T3 (en) 2025-04-22

Family

ID=55304743

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES19180710T Active ES3014437T3 (en) 2014-08-09 2015-08-07 Methods and materials for activating an internal ribosome entry site in exon 5 of the dmd gene

Country Status (7)

Country Link
US (2) US11053494B2 (es)
EP (2) EP3572516B1 (es)
JP (3) JP6986444B2 (es)
AU (3) AU2015301978C1 (es)
CA (1) CA2957661A1 (es)
ES (1) ES3014437T3 (es)
WO (1) WO2016025339A2 (es)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI541024B (zh) 2010-09-01 2016-07-11 日本新藥股份有限公司 反義核酸
WO2016025339A2 (en) * 2014-08-09 2016-02-18 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Methods and materials for activating an internal ribosome entry site in exon 5 of the dmd gene
MA45477A (fr) * 2016-04-15 2019-02-20 Res Inst Nationwide Childrens Hospital Administration à vecteurs de virus adéno-associé de microarn-29 et micro-dystrophine pour traiter la dystrophie musculaire
MY208145A (en) 2018-06-18 2025-04-18 Res Inst Nationwide Childrens Hospital Adeno-associated virus vector delivery of muscle specific micro-dystrophin to treat muscular dystrophy
TW202449155A (zh) * 2018-07-27 2024-12-16 美商薩羅塔治療公司 用於肌肉萎縮症之外顯子跳躍寡聚物
KR20220038771A (ko) * 2019-08-02 2022-03-29 더 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈 엑손 44-표적화된 핵산 및 상기 핵산을 포함하는 디스트로핀-기반 근병증 치료용 재조합 아데노-관련 바이러스
CA3159944A1 (en) 2019-12-02 2021-06-10 David HUSS Therapeutic editing
WO2021216853A1 (en) * 2020-04-22 2021-10-28 Shape Therapeutics Inc. Compositions and methods using snrna components
WO2022067257A1 (en) * 2020-09-28 2022-03-31 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Products and methods for treating muscular dystrophy
WO2022232254A1 (en) * 2021-04-27 2022-11-03 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Products and methods for inducing exon 2 skipping of the dmd gene in treating muscular dystrophy
IL315378A (en) 2022-03-04 2024-11-01 Locanabio Inc Preparations and methods involving small nuclear RNA (snRNA)
CN115806989B (zh) * 2022-11-25 2023-08-08 昆明理工大学 针对DMD基因5号外显子突变的sgRNA及载体和应用
WO2024192281A2 (en) * 2023-03-15 2024-09-19 Regenxbio Inc. Exon skipping gene therapy constructs, vectors and uses thereof
WO2025072530A2 (en) * 2023-09-26 2025-04-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods comprising small nuclear rna (snrna) for treating dmd

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
ATE272123T1 (de) 1993-11-09 2004-08-15 Ohio Med College Stabile zellinie, die in der lage ist, das replikationsgen des adenoassoziertenvirus zu exprimieren
EP0733103B1 (en) 1993-11-09 2004-03-03 Targeted Genetics Corporation Generation of high titers of recombinant aav vectors
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
EP0796339A1 (en) 1994-12-06 1997-09-24 Targeted Genetics Corporation Packaging cell lines for generation of high titers of recombinant aav vectors
FR2737730B1 (fr) 1995-08-10 1997-09-05 Pasteur Merieux Serums Vacc Procede de purification de virus par chromatographie
JPH11511326A (ja) 1995-08-30 1999-10-05 ジエンザイム コーポレイション アデノウィルスおよびａａｖの精製
US6632670B1 (en) 1995-09-08 2003-10-14 Genzyme Corporation AAV vectors for gene therapy
US5910434A (en) 1995-12-15 1999-06-08 Systemix, Inc. Method for obtaining retroviral packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant
ATE465267T1 (de) 1996-09-06 2010-05-15 Univ Pennsylvania Rekombinante aav zur herstellung eines medikaments für die gentherapie von muskelzellen
WO1999011764A2 (en) 1997-09-05 1999-03-11 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of recombinant aav vectors
US6566118B1 (en) 1997-09-05 2003-05-20 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
US6258595B1 (en) 1999-03-18 2001-07-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
CA2406743A1 (en) 2000-04-28 2001-11-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav vectors with aav5 capsids and aav5 vectors pseudotyped in heterologous capsids
ES2602352T3 (es) 2001-12-17 2017-02-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Secuencias de serotipo 8 de virus adenoasociado (VAA), vectores que las contienen y usos de las mismas
AU2003207708A1 (en) 2002-02-20 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of map kinase genes
CA2524255C (en) 2003-03-21 2014-02-11 Academisch Ziekenhuis Leiden Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the secondary rna structure
FR2874384B1 (fr) 2004-08-17 2010-07-30 Genethon Vecteur viral adeno-associe pour realiser du saut d'exons dans un gene codant une proteine a domaines dispensables
WO2010108126A2 (en) 2009-03-19 2010-09-23 Fate Therapeutics, Inc. Reprogramming compositions and methods of using the same
CA2780563C (en) * 2009-11-12 2025-05-06 Univ Western Australia Antisense Molecules and Methods for Treating Pathologies
WO2011078797A2 (en) * 2009-12-22 2011-06-30 Singapore Health Services Pte. Ltd Antisense oligonucleotides and uses threreof
JP5894543B2 (ja) 2010-03-17 2016-03-30 アソシアシオン インスティテュト ドゥ ミョロジー 神経筋疾患の治療のための修飾型Ｕ７ｓｎＲＮＡ
DE102012007232B4 (de) 2012-04-07 2014-03-13 Susanne Weller Verfahren zur Herstellung von rotierenden elektrischen Maschinen
MX388221B (es) 2013-04-20 2025-03-19 Res Institute At Nationwide Children´S Hospital ADMINISTRACIÓN DE VIRUS ADENO-ASOCIADO RECOMBINANTE DE CONSTRUCCIONES DE POLINUCLÉOTIDOS U7snRNA DIRIGIDA AL EXÓN 2.
JP2015092462A (ja) 2013-09-30 2015-05-14 Tdk株式会社 正極及びそれを用いたリチウムイオン二次電池
WO2015141521A1 (ja) 2014-03-21 2015-09-24 株式会社日立国際電気 基板処理装置、半導体装置の製造方法及び記録媒体
WO2016025339A2 (en) * 2014-08-09 2016-02-18 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Methods and materials for activating an internal ribosome entry site in exon 5 of the dmd gene
JP6197169B2 (ja) 2014-09-29 2017-09-20 東芝メモリ株式会社 半導体装置の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
AU2025202945A1 (en) 2025-06-19
US20220127607A1 (en) 2022-04-28
JP2021038262A (ja) 2021-03-11
AU2022200936B2 (en) 2025-01-30
EP3572516B1 (en) 2024-11-20
AU2015301978A1 (en) 2017-03-02
AU2015301978B2 (en) 2021-11-18
JP2023134822A (ja) 2023-09-27
AU2015301978C1 (en) 2022-06-09
CA2957661A1 (en) 2016-02-18
WO2016025339A2 (en) 2016-02-18
US20170218366A1 (en) 2017-08-03
JP2017524722A (ja) 2017-08-31
EP3180435A2 (en) 2017-06-21
EP3180435A4 (en) 2018-01-17
EP3572516A1 (en) 2019-11-27
WO2016025339A3 (en) 2016-04-21
AU2022200936A1 (en) 2022-03-24
JP6986444B2 (ja) 2021-12-22
US11053494B2 (en) 2021-07-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES3014437T3 (en) Methods and materials for activating an internal ribosome entry site in exon 5 of the dmd gene
AU2023200175B2 (en) Recombinant Adeno-Associated Virus Delivery Of Exon 2-Targeted U7snRNA Polynucleotide Constructs
HK40017660B (en) Methods and materials for activating an internal ribosome entry site in exon 5 of the dmd gene
HK40017660A (en) Methods and materials for activating an internal ribosome entry site in exon 5 of the dmd gene
BR112015026579B1 (pt) Vírus adeno associado recombinante e uso do mesmo
HK1221962B (en) Recombinant adeno-associated virus delivery of exon 2-targeted u7snrna polynucleotide constructs