ES3012638T3 - Antibodies capable of binding to the spike protein of coronavirus sars-cov-2 - Google Patents

Abstract

La presente divulgación se refiere a anticuerpos útiles para la prevención, el tratamiento y/o el diagnóstico de infecciones por coronavirus, así como de enfermedades y/o complicaciones asociadas a estas, incluida la COVID-19. En particular, se refiere a anticuerpos capaces de unirse a la proteína de la espícula del coronavirus SARS-CoV-2 y a sus usos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos capaces de unirse a la proteína spike del coronavirus sars-cov-2

Campo de la invención

La invención se refiere a anticuerpos útiles para la prevención, tratamiento y/o diagnóstico de infecciones por coronavirus, y enfermedades y/o complicaciones asociadas a infecciones por coronavirus, incluyendo COVID-19.

Antecedentes de la invención

Un síndrome respiratorio agudo viral grave denominado COVID-19 se notificó por primera vez en Wuhan, China, en diciembre de 2019. El virus se propagó rápidamente por todo el mundo, provocando una pandemia con más de 200 millones de infecciones confirmadas y más de 4.4 millones de muertes en 12 meses. El agente causante, SARS- CoV-2, es un coronavirus beta, relacionado con los coronavirus SARS-CoV-1 y MERS, todos ellos causantes de síndromes respiratorios graves.

En los meses transcurridos desde la identificación del SARS-CoV-2 como agente causal del COVID-19 se han producido enormes avances en el conocimiento de la enfermedad y del virus. En la actualidad existen varios tratamientos de eficacia probada, como la dexametasona y el Tocilizumab, así como los anticuerpos monoclonales (mAbs), que han demostrado ser eficaces cuando se utilizan tanto en entornos profilácticos como terapéuticos (Baum et al., 2020, Science 369, 1014-1018). A pesar de estos avances, la pandemia dista mucho de estar bajo control, lo que da lugar a sucesivas oleadas de infección.

Los coronavirus tienen cuatro proteínas estructurales: nucleocápside, envoltura, membrana y proteínas spike (S). La proteína spike es la proteína de superficie más prominente. Tiene una estructura trimérica alargada y es responsable de la adhesión a las células diana y de desencadenar la fusión de las membranas del virus y del hospedador. Tanto la proteína spike del SARS-CoV-2 como la del SARS- CoV-1 utilizan la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) como receptor de superficie celular. El ACE2 se expresa en varios tejidos, incluidas las células epiteliales de las vías respiratorias superiores e inferiores.

La proteína S consta de dos subunidades, la S1, que media en la unión con el receptor, y la S2, responsable de la fusión de las membranas del virus y de la célula hospedadora. Se trata de una estructura dinámica capaz de pasar a un estado de post-fusión por escisión entre S1 y S2 tras la unión del receptor o el tratamiento con tripsina. En algunas secuencias de SARS-CoV-2 se inserta un sitio de corte de la proteasa furina entre las subunidades S1 y S2, y una mutación del sitio de corte atenúa la enfermedad en modelos animales. El fragmento S 1 ocupa el extremo distal de la membrana de S y puede subdividirse en un dominio N-terminal (NTD) y un dominio de unión al receptor (RBD). Aunque ambas regiones son inmunogénicas, la RBD contiene la superficie de interacción para la unión de ACE2. Aunque normalmente se aprietan contra la parte superior de S2, los RBD pueden bascular hacia arriba para engancharse a ACE2. Los anticuerpos monoclonales (mAbs) reconocen una o ambas conformaciones.

La proteína S está relativamente conservada entre el SARS-CoV-2 y el SARS-CoV-1 (76 %), pero el RBD y el NTD están menos conservados (74 % y 50 % respectivamente) que el dominio S2 (90 %). La conservación con MERS-CoV y los coronavirus humanos estacionales es mucho menor (19-21 %). En general, los anticuerpos contra el SARS-CoV-2 muestran una reactividad cruzada limitada, incluso con el SARS-CoV-1.

S está implicado en la adhesión viral a las células diana a través de la interacción de ACE2 expresada en la superficie celular con el motivo de unión al receptor S (también conocido como huella de ACE-2), un parche de 25 aminoácidos que se encuentra en el extremo del dominio de unión al receptor (RBD), en el fragmento S1 de spike. Tras la adhesión, la escisión de S libera S1, lo que permite un cambio conformacional importante en S2 que expone el bucle de fusión hidrofóbico, para ejecutar la fusión de las membranas de la célula vírica y huésped, liberando el genoma vírico en el citoplasma de la célula hospedante para iniciar la replicación vírica. El análisis de grandes paneles de mAbs generados a partir de individuos infectados por SARS-CoV-2 revela que los mAbs se unen a múltiples epítopos a través de S1 y S2. La mayoría de los mAbs generados contra las cepas originales de SARS-CoV-2, aunque son capaces de unirse a S con alta afinidad, muestran poca o ninguna actividad neutralizante. La vigilancia genómica del SARS-CoV-2 ha identificado muchos miles de mutaciones en proteínas estructurales y no estructurales. Sin embargo, hacia finales de 2020, se describieron variantes víricas que se convirtieron rápidamente en las cepas dominantes a nivel local y condujeron a una propagación mundial y a su designación como variantes preocupantes (VoC).

Alfa (B.1.1.7) se identificó por primera vez en el Reino Unido, con un aumento de la transmisión. B.1.1.7 alberga 9 cambios de aminoácidos en el spike, incluyendo N501Y en la superficie de interacción de ACE2. Beta (501Y.V2 también conocida como B.1.351) se notificó por primera vez en Sudáfrica. Gamma (P1, 501Y.V2) fue reportada por primera vez en Brasil, las cuales tienen 10 y 12 cambios de aminoácidos en la proteína spike, respectivamente. Delta se notificó por primera vez en la India y ahora se ha extendido por todo el mundo, causando brotes en varios países. Omicron BA.1 se notificó por primera vez a finales de noviembre de 2021 en el sur de África y se extendió por todo el mundo, convirtiéndose en la variante dominante en muchos países y desplazando casi por completo a Delta.

Ha surgido una sucesión de sublinajes de Omicron, como BA.1.1, BA.2, BA.2.12.1, BA.2.75 y BA.4/5, que han superado a las cepas precedentes hasta convertirse en dominantes a escala regional o mundial. Se encuentran más de 30 mutaciones en la proteína Omicron S, incluidas 15 sustituciones en el RBD, que conducen a una mayor transmisibilidad (Suzuki et al., 2022 "Attenuated fusogenicity and pathogenicity of SARS-CoV-2 Omicron variant". Nature 603, 700-705) y grandes reducciones generalizadas de los títulos de anticuerpos neutralizantes (Dejnirattisai et al., 2022 "SARS-CoV-2 Omicron-B.1.1.529 leads to widespread escape from neutralizing antibody responses". Cell 185, 467-484 e415).

Omicron BA.2 se notificó casi al mismo tiempo que BA.1. La proporción de infecciones Omicron causadas por BA.2 ha ido en aumento en varios países y se convirtió en el linaje dominante en Dinamarca e India.

BA.1.1, que contiene una mutación adicional R346K en RBD, en un momento dado representó alrededor del 40 % de las secuencias Omicron a nivel mundial, y alrededor del 35-60 % en el Reino Unido y los Estados Unidos (Iketani et al., 2022 "Antibody evasion properties of SARS-CoV-2 Omicron sublineages". Nature 604, 553-556), pero pronto fue superado por bA.2. BA.2, que contiene 8 sustituciones únicas en S, incluyendo 6 dentro del RBD, y carece de 13 mutaciones encontradas en BA.1 (Nutalai et al., 2022), se ha convertido en la cepa dominante en todo el mundo a partir de agosto de 2022. Recientemente, BA.2.12.1 se ha identificado en múltiples países y ha causado un gran brote regional en Norteamérica (58 % de las secuencias a 25 de mayo de 2022) (Del Rio y Malani, 2022, "COVID-19 in 2022-The Beginning of the End or the End of the Beginning?" JAMA 327, 2389-2390).

Ahora está claro que BA.2 tiene una pequeña ventaja de transmisión frente a BA. 1 aunque no hay pruebas de que aumente la gravedad de la enfermedad. A principios de abril de 2022, se notificaron dos nuevos linajes de Omicron en Gauteng (Sudáfrica), designados BA.4 y BA.5. BA.4 y BA.5 (que tienen secuencias S idénticas) se convirtieron en las cepas Omicron dominantes en Gauteng, alimentando una nueva ola de infección en Sudáfrica.

Desde junio de 2022, BA.4/5, que tiene tanto una mayor afinidad de unión al receptor como un escape notablemente mejorado de las respuestas de anticuerpos (Tuekprakhon et al., 2022 "Antibody escape of SARS-CoV-2 Omicron BA.4 and BA.5 from vaccine and BA.1 serum". Cell 185, 2422-2433 e2413) se extendió rápidamente desde Sudáfrica por todo el mundo y ahora se ha convertido en la nueva cepa dominante a nivel mundial, con BA.5 en ascenso en muchas regiones. Estas variantes (en particular la BA.5) representan ahora la mayoría de los casos secuenciados en muchos países.

A principios de mayo de 2022, un nuevo sublinaje Omicron designado como BA.2.75 surgió en la India. Desde entonces, esta cepa se ha extendido a muchos países, como el Reino Unido, Estados Unidos, Australia, Alemania y Canadá. Sin embargo, la prevalencia real de BA.2.75 es difícil de determinar, ya que la secuenciación en muchos países es irregular y se ha reducido considerablemente.

Todas estas variantes contienen múltiples mutaciones en S e incluyen cambios en el RBD, NTD y, en algunos casos, el sitio de escisión de furina entre S1 y S2. Las mutaciones RBD encontradas en Alfa (N501Y), Beta (K417N, E484K, N501Y), Gamma (K417T, E484K, N501Y) y Delta (L452R, T478K) están localizadas en la superficie de interacción con ACE2 o muy próximas a ella, donde tienen el potencial de modular la interacción con ACE2 e interrumpir la unión de anticuerpos neutralizantes. El aumento de la afinidad de la interacción con ACE2 ha sido dominado por Alfa, Beta, Gamma y Delta (7, 19, 19, 2 veces, respectivamente) y puede desempeñar un papel en el aumento de la transmisibilidad viral. Omicron contiene un número sin precedentes de mutaciones concentradas en el gen Spike (S) que conlleva 30 sustituciones más la supresión de 6 y la inserción de 3 residuos. Omicron BA.1 (mutaciones RBD de G339D, S371L, S373P, S375F, K417N, N440K, G446S, S477N, T478K, E484A, Q493R, G496S, Q498R, N501Y, Y505H) contiene las mutaciones únicas S371L, G446S y G496S y, en algunos aislamientos, R346K (BA.1.1), mientras que BA.2 porta S371F, T376A, D405N y R408S. BA.3 no contiene mutaciones únicas en relación con BA.1 y BA.2 y parece ser una fusión de las dos, siendo similar a BA.1 en el extremo N y pasando a ser similar a BA.2 en el extremo C a partir de la mutación G496S.

BA.2.75 contiene múltiples cambios mutacionales en la proteína S en comparación con BA.2, incluyendo cuatro sustituciones en el NTD (W152R, F157L, I210V y G257S) y cuatro en el RBD: D339H, G446S, N460K y R493Q.

También se han detectado en varios países tres nuevas variantes relacionadas con BA.2, a saber, BA.2.11, BA.2.12.1 y BA.2.13. Estos contienen una única mutación de L452R, L452Q y L452M en comparación con el dominio de unión al receptor (RBD) de BA.2 Spike respectivamente (Figura 29). Entre ellos, BA.2.12.1, identificado por primera vez en Nueva York, se convirtió en dominante en los Estados Unidos., representando alrededor del 58 % de los aislamientos de SARS-CoV-2 a partir del 25 de mayo de 2022. Mientras que L452R se encuentra en las variantes Delta y Kappa, y L452Q en Lambda, L452M es nueva.

Teniendo en cuenta las propiedades fisicoquímicas de la cadena lateral del residuo 452, se esperaría que BA.2.13 fuera un cambio relativamente modesto; L a M aumentará el tamaño de la cadena lateral pero sigue siendo hidrofóbica. L a Q en BA.2.12.1 introduce cierto carácter polar, mientras que BA2.11 es la más radical con L a R introduciendo un gran aminoácido básico.

Otras variantes, BA.4 y BA.5, que tienen secuencias S idénticas, parecen haber evolucionado a partir de BA.2. Las secuencias de BA.4 y BA.5 están muy relacionadas con la secuencia de BA.2, pero contienen mutaciones adicionales. En particular, se han suprimido los residuos 69 y 70 del NTD (que también se encuentran en Alfa, BA.1 y BA.3) y contienen dos sustituciones adicionales en el RBD: L452R (también encontrado en Delta) y F486V. Por último, Ba .4 y BA.5 carecen del cambio Q493R observado en BA.1 y BA.2, volviendo a Q493 como en la cepa Victoria/Wuhan. Al observar el RBD, BA.4 y BA.5 han ensamblado mutaciones en todas las posiciones descritas anteriormente en el VoC Alfa (N501Y), Beta (K417N, E484K, N501Y), Gamma (K417T, E484K, N501Y), Delta (L452, T478K), la única diferencia es E484A en BA.4 y BA.5 en lugar de E484K Beta y Gamma.

A partir de septiembre de 2022, una nueva variante relacionada con BA.4/5, designada BA.4.6, ha surgido y se ha expandido en Estados Unidos, donde domina BA.5 (prevalencia del 87,5 % a partir del 10 de septiembre de 2022, triplicándose desde menos del 2 % de las secuencias a principios de julio de 2022 a más del 6 % a mediados de agosto de 2022). En comparación con BA.4/5, BA.4.6 contiene dos mutaciones adicionales en la proteína Spike (S), R346T en el RBD y N658S en el dominio C-terminal. La mutación R346T ha suscitado preocupación por una mayor evasión de anticuerpos con respecto a BA.4/5, ya que la mutación R346K en BA.1.1 redujo la neutralización sérica en comparación con BA.1 y deterioró la actividad de varios anticuerpos monoclonales (mAbs) (Nutalai, et al., 2022). También se han desarrollado kits de detección del SARS-CoV-2 que utilizan anticuerpos monoclonales. Algunos ejemplos son las pruebas de flujo lateral de, por ejemplo, Innova (SARS-CoV-2 Antigen Rapid Qualitative Test) y Quidel (Sofia 2 SARS Antigen FIA). Sin embargo, se ha reportado que estas pruebas son muy imprecisas.

A partir de enero de 2023, han surgido otras variantes como BQ.1 y XBB, que llevan hasta 8 sustituciones de aminoácidos RBD adicionales en comparación con BA.2.

El mapeo de la función estructural de paneles de anticuerpos monoclonales (mAbs) aislados de casos infectados ha permitido comprender en gran medida la antigenicidad de S y los mecanismos de neutralización. La mayoría de los anticuerpos neutralizantes potentes se unen a la huella de ACE2 o muy cerca de ella y funcionan bloqueando la interacción con ACE2, impidiendo así la adhesión celular y la infección. Un segundo sitio de interacción de mAbs potentes está en proximidad al glicano ligado a N en la posición N343, ejemplificado por S309, estos anticuerpos no bloquean la interacción con ACE2 pero pueden funcionar para desestabilizar el trímero S. El tercer grupo de mAbs potentes se une al dominio N-terminal en S1 y su modo de acción no está claro en la actualidad. Otro epítopo RBD de interés potencial se encuentra fuera de la huella de ACE2 y aunque los mAbs que se unen aquí no son potentes neutralizadores pueden, sin embargo, proteger eficazmentein vivo(Huo et al., 2020; Sun et al., 2021; Yuan et al., 2020; Zhou et al., 2020).

Tras BA.5 se observaron varias tendencias nuevas en la evolución de Omicron: i) la aparición de variantes BA.2 de "segunda generación" (incluidos derivados de BA.5) - variantes con largas longitudes de rama filogenética, múltiples mutaciones antigénicas y ausencia de intermediarios genéticos, por ejemplo BA.2.75, BJ.1, BS.1, BA.2.10.4 y BA.2.3.20 (van der Straten et al. 2022. Immunity 55, 1725-1731) y ii) deriva antigénica acelerada, observada tanto en BA.5 (Tuekprakhon et al., 2022) como dentro de estos linajes BA.2 de segunda generación, en particular BQ.1 y BA.2.75 (https://nextstrain.org/nextclade/sars-cov-2/21L). Por último, la recombinación entre dos de estas variantes de segunda generación (BJ.1 y BM.1.1.1) ha producido XBB. Muchas de estas variantes muestran un alto grado de evolución convergente en residuos antigénicos conocidos de la RBD, y las mutaciones se encuentran en zonas que pueden amenazar la unión de anticuerpos neutralizantes, lo que conduce a una mayor evasión de la protección frente a la infección proporcionada por la vacuna o la infección previa por SARS-CoV-2, incluida la infección previa por Omicron.

En la actualidad, varios linajes están creciendo rápidamente dentro de las ramas BA.2 y BA.5. Lo más llamativo es el alto grado de evolución convergente, especialmente en posiciones antigénicas RBD como 346, 444, 446, 452, 460, 486, 490 y 494. Estos linajes incluyen ejemplos de la rama BA.4/5 (que contiene naturalmente L452R, F486V y la reversión R493Q), como BA.4.6 y BF.7 (R346T), BA.4.7 (R346S), BQ.1 (K444T, N460K) y BQ.1.1 (R346T, K444T, N460K); de la rama BA.2.75 (que contiene naturalmente G446S, N460K y la reversión R493Q), bA.2.75.2 (R346T y F486V), BN.1 (R346T, K356T, F490S). También hay ejemplos de otras líneas variantes BA.2 de segunda generación, como BJ.1 (también conocida como BA.2.10.1.1; R346T, L368I, V445P, G446S, V483A y F490V), BA.2.10.4 (G446S, F486P, S494P y la reversión R493Q), BS.1 (BA.2.3.2.1; R346T, L452R, N460K, G476S), BA.2.3.20 (K444R, N450D, L452M, N460K, E484R y la reversión Q493R) y, por último, una recombinación BA.2.75 x BJ.1 recombinante, XBB (que en relación con B<a>.2 contiene R346T, L368I, V445P, G446S, N460K, F486S, F490S).

Estas variantes de BA.2 de segunda generación se han convertido en dominantes a nivel mundial, siendo BQ.1 la única responsable del 50% de las infecciones a 27 de diciembre de 2022 (https://cov-spectrum.org/ explore/Worldl AllSamples/Past6M) y XBB.1.5 (XBB.1 F486P) expandiéndose rápidamente en Norteamérica).

Fuera de la RBD, el grado de evolución convergente es menor, pero sigue presente. Muchos de los linajes variantes de BA.2 de segunda generación contienen deleciones o mutaciones en el NTD, a menudo similares a las observadas en las VoCs, por ejemplo A-144 en BJ.1 y BA.2.10.4 (observadas previamente en Alfa y BA.1) y NSP12 G671S en BJ.1, BA.2.75 y BA.2.10.4 (observadas previamente en Delta).

Todas las vacunas contra el SRAS-CoV-2 aprobadas actualmente están diseñadas para inducir respuestas de anticuerpos (y células T) contra el S y contienen la secuencia S que se encuentra en la cepa original de Wuhan.

Por lo tanto, existe una preocupación especial sobre si las mutaciones S en los VoCs podrían causar un escape inmunológico, lo que llevaría al fracaso de la vacuna o a la susceptibilidad a infecciones repetidas en individuos previamente infectados.

La extensa carga mutacional en Omicron S interrumpe la actividad de la mayoría de la unión mAb a los tres sitios de unión de anticuerpos potentes descritos anteriormente, la huella ACE-2, alrededor del glicano N343 y el NTD. Esto provoca un grave derribo o la pérdida completa de la capacidad neutralizante del suero de la infección natural o de la vacunación, lo que ha contribuido al aumento de la transmisibilidad y a la propagación explosiva de Omicron.

Es un objeto de la invención identificar anticuerpos adicionales y mejorados útiles para prevenir, tratar y/o diagnosticar infecciones por coronavirus, y enfermedades y/o complicaciones asociadas con infecciones por coronavirus, incluyendo COVID-19, especialmente las variantes Omicron de interés (VoCs) y variantes aún no identificadas que tienen otras mutaciones en la huella ACE-2, RBD y/o NTD en la proteína spike del SARS-CoV-2.

US 10787501 se refiere a anticuerpos de glicoproteína anti-SARS-CoV-2-spike y fragmentos de unión a antígeno. US 11634477 se refiere a anticuerpos neutralizantes anti-SARS-CoV-2 y métodos de uso de los mismos. WO 2021231237 se refiere a anticuerpos contra el SARS-CoV-2 y sus usos. Pinto et al. (2020) se refiere a la neutralización cruzada del SARS-CoV-2 por un anticuerpo monoclonal humano del SARS-CoV. Cao et al. (2020) se refiere a anticuerpos neutralizantes contra el SARS-CoV-2. Wang et al. (2021) se refiere a la resistencia a los anticuerpos de las variantes B.1.351 y B.1.1.7 del SARS-CoV-2. Li et al. (2021) se refiere a anticuerpos neutralizantes del SARS-CoV-2 contra variantes mutacionales de reciente aparición. Dejnirattisai et al. (2021) se refiere a la anatomía antigénica del dominio de unión al receptor del SARS-CoV-2. Westendorf et al. (2021) se refiere a la neutralización de variantes de SARS-CoV-2 por LY-CoV1404 (bebtelovimab) . Dong et al. (2021) se refiere a la neutralización de la variante SARS-CoV-2 mediante un cóctel de dos anticuerpos. Wang et al. (2021) describe anticuerpos con actividad neutralizante frente a variantes del SARS-CoV-2. Zhou et al., (2022) se refiere a un anticuerpo neutralizante que protege contra la provocación de la variante Omicron del SARS-CoV-2.

Resumen de la invención

Los aspectos de la invención cuya protección se solicita se definen en el conjunto de reivindicaciones adjunto. La descripción puede contener información técnica adicional que, aunque no forma parte de la invención reivindicada, se proporciona para situar la invención en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. Las referencias en el presente documento a métodos de tratamiento del cuerpo humano o animal deben entenderse como referencias a medicamentos para su uso en un método de tratamiento.

En un aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo capaz de unirse a la proteína spike del coronavirus SARS-CoV-2, en la que el anticuerpo comprende:

(a) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 952; y

(b) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 954.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un polinucleótido que codifica el dominio variable de cadena ligera y el dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo según el primer aspecto de la invención.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un vector que comprende uno o más polinucleótidos según el segundo aspecto de la invención.

En otro aspecto de la invención, se proporciona una célula hospedante que comprende uno o más polinucleótidos según el segundo aspecto de la invención o uno o más vectores según el tercer aspecto de la invención.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para producir un anticuerpo capaz de unirse a la proteína spike del coronavirus SARS-CoV-2, que comprende cultivar la célula hospedante del cuarto aspecto de la invención y aislar el anticuerpo de dicho cultivo.

En otro aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende:

(a) el anticuerpo según el primer aspecto de la invención

(b) al menos un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto de la invención, se proporciona el anticuerpo según la invención, o la composición farmacéutica según la invención, para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia. En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para identificar la presencia de SARS-CoV-2 en una muestra, que comprende: poner en contacto la muestra con el anticuerpo según el primer aspecto de la invención y detectar la presencia o ausencia de un complejo anticuerpo-antígeno en el que la presencia del complejo anticuerpo-antígeno indica la presencia de SARS- CoV-2 en la muestra.

Los inventores identificaron 28 anticuerpos monoclonales (mAbs) humanos que reconocen la proteína spike del SARS-CoV-2 (véase la Tabla 3). Estos anticuerpos mostraron una potente actividad de neutralización frente al SARS-CoV-2. Algunos de los anticuerpos de la Tabla 3 demostraron potentes efectos de neutralización que fueron ampliamente eficaces contra la cepa hCoV- 19/Wuhan/WIV04/2019, así como contra cepas de SARS-CoV-2 de diversos linajes, como Victoria (Wuhan S247R), Alfa, Beta, Gamma, Delta, Omicron, incluyendo Omicron BA.2.11, Omicron BA.2.12.1, Omicron BA.2.13, Omicron BA.2.3.20, Omicron BA.2.10.4, Omicron BA.1, Omicron BA.1.1, Omicron BA.2, Omicron BA.2.75, BA.2.75.2, Omicron BA.3, Omicron BA.4.6, Omicron BA.4/5, Omicron BJ.1, Omicron BS.1, Omicron BN.1, Omicron XBB, y/o cepas Omicron XBB.1.

Muchos de los mAbs de la Tabla 3 utilizaban V-genes públicos (V-genes compartidos por la mayoría de la población). Los inventores han demostrado previamente que es posible generar más anticuerpos intercambiando las cadenas ligeras y pesadas de los anticuerpos de las Tablas 1, 2 y 3 que se derivan de los mismos genes V públicos. Los anticuerpos derivados de los mismos genes V públicos proporcionaron anticuerpos de cadena mixta particularmente útiles.

En particular, los inventores descubrieron que los anticuerpos Omi02, Omi03, Omi12, Omi18, Omi28, Omi39 y Omi42 eran particularmente eficaces en la neutralización cruzada de las cepas Victoria, Alfa, Beta, Gamma, Delta y Omicron del SARS-CoV-2.

La invención también proporciona uno o más polinucleótidos que codifican el anticuerpo de la invención, uno o más vectores que comprenden dichos polinucleótidos, o una célula hospedante que comprende dichos vectores. La invención también proporciona un método para producir un anticuerpo capaz de unirse a la proteína spike del coronavirus SARS-CoV-2, que comprende cultivar la célula hospedante de la invención y aislar el anticuerpo de dicho cultivo.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende: (a) un anticuerpo o una combinación de anticuerpos de la invención, y (b) al menos un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. La invención también proporciona un anticuerpo, una combinación de anticuerpos o una composición farmacéutica de la invención, para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia. La invención también proporciona un anticuerpo, o una composición farmacéutica de la invención, para su uso en un método de tratamiento o prevención de la infección por coronavirus, o una enfermedad o complicación asociada a la infección por coronavirus.

La invención también proporciona un método para identificar la presencia de coronavirus, o un fragmento de proteína del mismo, en una muestra, que comprende (i) poner en contacto la muestra con un anticuerpo o una combinación de anticuerpos de la invención, y (ii) detectar la presencia o ausencia de un complejo anticuerpoantígeno, en el que la presencia del complejo anticuerpo-antígeno indica la presencia de coronavirus, o un fragmento del mismo, en la muestra.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. El sublinaje BA.2 de Omicron y la generación de un panel de mAb Omicron.La Figura 1 se refiere únicamente a los primeros 22 anticuerpos Omicron divulgados en las Tablas 13 y 14 (es decir, Omi02 a Omi35). (A) Se muestran los títulos FRNT50 contra Victoria y Omicron BA.1 de los donantes para la producción de Omicron mAb. (B) Gráficos FACS que muestran la clasificación de células B utilizando Omicron S de longitud completa. (C) Proporción de anticuerpos de unión RBD y NTD encontrados en el mAb Omicron en comparación con el mAb pandémico temprano. (D) Uso variable de los genes de las cadenas pesada y ligera. (E) Mutaciones somáticas encontradas en el potente mAb Omicron (FRNT50 <100ng/ml) en comparación con el conjunto pandémico temprano.

Figura 2. Curvas de neutralización utilizando Omicron mAb.(A) Virus Victoria, Alfa, Beta, Gamma, Delta y Omicron BA.1. (B) neutralización de los pseudovirus Victoria, BA.1, BA.1.1, BA.2 y BA.3 por mAb Omicron. (C) neutralización de los pseudovirus Victoria, BA.1, BA.1.1, BA.2 y BA.3 por anticuerpos que se están desarrollando para uso comercial.

Figura 3. Neutralización de los pseudovirus Victoria, BA.1, BA.1.1, BA.2 y BA.3.Neutralización de los pseudovirus Victoria, BA.1, BA.1.1, BA.2 y BA.328 días después de la segunda y tercera dosis de (A) AZD1222 (n=41), (B) BNT162b2 (n=20). (C) Ensayos de neutralización de virus vivos con los virus Victoria, Alfa, Beta, Gamma, Delta y Omicron utilizando sueros obtenidos < 14 días y >21 días después de la aparición de los síntomas (D) Neutralización de los pseudovirus Victoria, BA.1, Ba .1.1, BA.2 y BA.3 por sueros tempranos y tardíos. Encima de cada columna se indican los títulos de la media geométrica. Para el análisis se utilizó la prueba de rangos con signo de pares emparejados de Wilcoxon (A y B) y la prueba de Mann-Whitney (C y D) y se calcularon los valores P de dos colas.

Figura 4. Curvas de neutralización pseudoviral.Curvas de neutralización pseudoviral para BA.1, BA.1.1, BA.2 y BA.3 en mAb pandémico temprano (B) Beta mAb.

Figura 5. Títulos de neutralización en los virus indicados relacionados conla Figura 3 (A) virus vivos (B) pseudovirus. Encima de cada columna se indican los títulos de la media geométrica. Para el análisis se utilizó la prueba de rango con signo de pares emparejados de Wilcoxon y se calcularon valores P de dos colas. (C) Curvas de neutralización de pseudovirus para el mAb VH1-58 seleccionado y el mAb de control VH3-53222 contra Victoria e Iota (S477N).

Figura 6. Estructura de BA.1 RBD con Omi-12 Fab.(A) Se comparan dos complejos ternarios de Omi-12 y Beta-54 Fabs con BA.1 (producidos ajustando las estructuras de alta resolución de BA.1 RBD, Omi-12 y Beta-54 a la densidad del complejo ternario de menor resolución) en la unidad asimétrica cristalina superponiendo el RBD. Los Fabs de un complejo están en colores brillantes (representación de dibujos animados HC rojo, LC azul) y el otro en colores pálidos. (B) Modo de unión de Omi-12. (C) Detalle de las diferencias de unión de Omi-12 con Fab 253 complejado con RBD pandémico temprano (azul pálido) y Beta-47 con Beta RBD (cian pálido). (D) La mutación somática V53P contribuye al replegamiento del bucle H3 para que Q493R pueda acomodarse en Omi-12.

Figura 7. Ensayos de neutralización pseudoviral de BA.4/5 por vacuna y suero inmune BA.1.

Valores IC50 para los virus indicados utilizando suero obtenido de vacunados 28 días después de su tercera dosis de vacuna (A) AstraZeneca AZD AZD1222 (n=41), (B) 4 semanas después de la tercera dosis de Pfizer BNT162b2 (n=20). Suero de voluntarios que sufren una infección intercurrente BA.1 tomado voluntariamente (C) temprano <1 14 (n=12) días desde el inicio de los síntomas (mediana de 13 días) (D) tardío > 21 días desde el inicio de los síntomas (mediana de 38 días) n=16. La comparación se realiza con títulos de neutralización a Victoria (una cepa pandémica temprana), BA.1, BA.1.1, BA.2 y BA.3. Encima de cada columna se indican los títulos de la media geométrica. Para el análisis se utilizó la prueba de rango con signo de pares emparejados de Wilcoxon y se calcularon valores P de dos colas.

Figura 8. Ensayos de neutralización pseudoviral contra Omicron y anticuerpos monoclonales comerciales.Curva de neutralización para un panel de 28 anticuerpos monoclonales realizados a partir de muestras tomadas de vacunados infectados con BA.1. Se comparan las curvas de valoración de BA.1 con BA.1, BA.1.1, BA.2 y BA.3. Se indican los mAb propuestos para ser afectados por L452R y F486L.

Figura 9. El linaje Omicron comparado con BA.4/5.(A) Comparación de las mutaciones de la proteína S de Omicron<b>A.1, BA.1.1, BA.2, BA.3 y BA.4/5 con los límites de NTD y RBD indicados. (B) Posición de las mutaciones RBD (superficie gris con la huella de ACE2 en verde oscuro). Las mutaciones comunes a todos los linajes de Omicron se muestran en blanco (Q493R que se revierte en BA.4/5 se muestra con una cruz), las comunes a BA.1 y BA.1.1 en cian, las exclusivas de BA.1.1 en azul y las exclusivas de BA.2 en magenta. El residuo 371 (amarillo) está mutado en todos los virus Omicron, pero difiere entre BA.1 y BA.2. El glicano N343 se muestra en forma de bastones con una superficie transparente

Figura 10. Análisis por resonancia de plasmón superficial (SPR) de la interacción entre BA.2 o BA.4/5 RBD y mAbs seleccionados.(A) La unión de Ba .4/5 RBD es severamente reducida comparada con la de BA.2, por lo que la unión no pudo ser determinada con precisión, como se muestra por una sola inyección de 200 nM RBD sobre células de flujo de muestra que contienen IgG Omi-31. (B-C; E-I) Sensorgramas (Rojo: curva de unión original; negro: curva ajustada) que muestran las interacciones entre BA.2 o BA.4/5 RBD y mAbs seleccionados, con datos cinéticos mostrados. (D) Determinación de la afinidad de BA.4/5 RBD a Omi-12 utilizando un análisis de equilibrio de unión 1:1.

Figura 11. Interacciones entre el mAb y los sitios de mutación BA.4/5.Estructura global (panel izquierdo) e interacciones (< 4 A) con los sitios de mutación BA.4/5 (panel derecho) para los complejos (A) BA.1-RBD/Omi-31 (PDB 7ZFB), (B) BA.1-RBD/Omi-32 (PDB 7ZFE), (C) BA.1-RBD/Omi-25 (PDB 7ZFD), (D) BA.1-RBD/Omi-42 (PDB7ZR7), (E) Wuhan-RBD/AZD8895 (PDB 7L7D) y (F) BA.1-RBD/Omi-3 (PDB 7ZF3). En los paneles de la izquierda se muestra RBD como representación de superficie, con los sitios de mutación de BA.4/5 resaltados en magenta y los dos sitios de mutación adicionales de BA.4/5 en 452 y 486 en cian, y Fab LC como azul y HC como cintas rojas. En el panel derecho, las cadenas laterales de RBD, Fab HC y LC se dibujan como barras grises, rojas y azules, respectivamente. En (B) L452R (barras verdes) se modelan para mostrar que puede formarse un puente salino a D99 de CDR-H3 (barras amarillas rotas). (D) Complejo Beta-RBD/Omi-42 que muestra que el Fab no contacta con ninguno de los dos sitios de mutación BA.4/5.

Figura 12. Afinidad ACE2 RBD.(A)-(D) Sensorgramas SPR que muestran la unión de ACE2 a BA.4/5 RBD (A) en comparación con la unión a ancestral (Wuhan) (B), BA.1 (C) y BA.2 RBD (D). Los datos de Wuhan, BA.1 y BA.2 se han publicado anteriormente en (Nutalai et al., 2022). (E)-(G) Superficies electrostáticas, (E) de izquierda a derecha, pandemia temprana, Delta y BA.1 RBD respectivamente, (F) vista de libro abierto de BA.2 RBD y ACE2 del complejo BA.2 RBD/ACE2 (PDB 7ZF7), y (G) BA.4/5 RBD (modelado basado en la estructura de BA.2 RBD). Los rombos en ACE2 y RBD muestran las áreas de interacción.

Figura 13. Cartografía antigénica.(A) Datos de neutralización y modelo (valores del título logarítmico) utilizados para calcular los mapas antigénicos en (B). Las columnas representan sueros recogidos de voluntarios inoculados o pacientes infectados. Las filas son cepas de desafío: Victoria, Alfa, Delta, Beta, Gamma, BA. 1, BA1.1, BA.2, BA.3 y BA.4/5 por orden. Los valores están coloreados según su desviación del valor de referencia; el valor de referencia se calcula sobre la base del tipo de suero como la media de los títulos de neutralización de la fila que le da el valor más alto. (B) Vistas ortogonales del mapa antigénico mostrando BA.4/5 en el contexto de las posiciones de VoC anteriores y BA.1, BA.1.1, BA.1 y BA.2, calculadas a partir de los datos de neutralización de pseudovirus. La distancia entre dos posiciones es proporcional a la reducción del título de neutralización cuando una de las cepas correspondientes es desafiada con suero derivado de la infección por la otra. Figura 6. Afinidad ACE2/RBD y cartografía antigénica

Figura 14. Curvas de neutralización para mAb VH1-58.Curvas de neutralización pseudoviral para mAb 253 pandémico temprano (Dejnirattisai et al., 2021a) y Beta-47 (Liu et al., 2021b) contra Victoria y el panel de constructos de linaje Omicron.

Figura 15. Análisis por resonancia de plasmón superficial (SPR) de la interacción entre BA.2 o BA.4/5 RBD y mAbs seleccionados.(A-F) Sensorgramas (Rojo: curva de unión original; negro: curva ajustada) que muestran las interacciones entre BA.2 o BA.4/5 RBD y mAbs seleccionados, con datos cinéticos mostrados. (G-K) La unión de BA.4/5 RBD es severamente reducida comparada con la de BA.2, de manera que la unión no pudo ser determinada con precisión, como se muestra por una sola inyección de 200 nM RBD sobre celdas de flujo de muestra conteniendo el mAb indicado.

Figura 16. Cambios de secuencia en BA.2.75 en comparación con otros sublinajes de Omicron.(A) Alineaciones de secuencias de BA.2.75 junto con los sublinajes Omicron BA.1, BA.1.1, BA.2, BA.3 y BA.4/5. Los límites de la NTD y la RBD están marcados. (B) Representación superficial de los residuos mutados en BA.2.75 RBD en comparación con BA.2 RBD. Se muestra la posición de las mutaciones BA.2 RBD (superficie gris con la huella de ACE2 en verde oscuro) y los residuos mutados en BA.2.75 se muestran en naranja y etiquetados.

Figura 17. Ensayos de neutralización pseudoviral de BA.2.75 por vacuna y suero inmune de BA.1 y BA.2.Valores IC50 para los virus indicados utilizando suero obtenido de vacunados 28 días después de su tercera dosis de vacuna (A) Pfizer BNT162b2 (n=22). (B) AZD AZD1222 de AstraZeneca (n=41). (C, D) Suero de voluntarios que sufrieron infecciones intercurrentes por la vacuna BA.1 (n=16) o BA.2 (n=23). (EC) Valores IC50 para mutaciones puntuales RBD únicas insertadas en el pseudovirus BA.2 utilizando suero Pfizer BNT162b2 (n=22) Los títulos medios geométricos se muestran encima de cada columna. Para el análisis se utilizó la prueba de rango con signo de pares emparejados de Wilcoxon y se calcularon valores P de dos colas.

Figura 18. Afinidad ACE2/RBD.Sensorgramas SPR que muestran la unión de ACE2 al RBD de BA.2.75 utilizando ACE2-Fc (A) o ACE2 biotinilada como ligando (B) en comparación con la unión al RBD de BA.2 (C), BA.4/5 (D), Alfa (E) y BA.2+R493Q (F). Los datos de BA.2, BA.4/5 y Alfa se han publicado anteriormente en Nutalai et al., 2022, Tuekprakhon et al., 2022 y Dejnirattisai et al., 2022, respectivamente.

Figura 19. Ensayos de neutralización pseudoviral frente a anticuerpos monoclonales.(A) Curvas de neutralización para un panel de 28 mAb realizadas a partir de muestras tomadas de vacunados infectados con BA.1. Las curvas de valoración de BA.2.75 se comparan con las de Victoria, BA.1, BA.1.1, BA.2 y BA.4/5. Los títulos IC50 se muestran en la Tabla 22. (B) Ensayos de neutralización pseudoviral con mAbs desarrollados para uso humano. Los títulos IC50 se muestran en la Tabla 23. Los datos de Victoria, BA.1, BA.1.1 y BA.2 y BA.4/5 se utilizan para la comparación y se han tomado de Tuekprakhon et al., 2022.

Figura 20. Estructura del complejo BA.2.75 RBD/ACE2.(A) Estructura global del complejo BA.2.75 RBD/ACE2. ACE2 se muestra como cintas verdes y el RBD como superficie con mutaciones comunes a BA.2 resaltadas en magenta y diferentes en naranja. (B) Interfaz BA.2.75 RBD (gris) y ACE2 (verde) comparada con la de BA.2 y ACE2 (ambas en salmón). Los primeros planos muestran las interacciones de Q496R y Q493 (R493 en BA2) con ACE2.

Figura 21 Interacciones entre mAb y sitios de mutación BA.75.(A) Vistas frontal y posterior de los modos de unión de Omi-3 (PDB, 7ZF3) y Omi-18 (PDB, 7ZFC) complejado con omicron BA.1 RBD mediante superposición del RBD. La RBD se muestra como una representación de superficie gris con las mutaciones comunes a BA.2 y BA.2.75 coloreadas en magenta, y las cuatro mutaciones diferentes entre ambas en cian. Los VHs y VLs se muestran como cintas y coloreados en rojo y azul para Omi-3, y azul claro y salmón para Omi-18, respectivamente. (B) Interacciones entre N460 del RBD y CDR-H2 de los Fabs. (C) Contactos entre R493 del RBD y CDR-H3 de los Fabs. En (B) y (C) La RBD asociada a Omi-3 está en gris y Omi-18 en cian, y los colores de los Fabs son como en (A). (D) AZD1061 unido al RBD ancestral del SARS-CoV-2 (PDB, 7L7E) y (E) contactos entre G446 del RBD y CDR-L2 del Fab. (E) AZD8895 unido con el ancestral RBD spike del SARS-CoV-2 (PDB, 7L7E) y (F) contactos entre Q493 del RBD y CDR-H2 del Fab. En (D)-(F), RBD está dibujado y coloreado como en (A), HC está en rojo y LC en azul.

Figura 22. Cartografía antigénica.(A) Vistas ortogonales del mapa antigénico mostrando BA.2.75 en el contexto de las posiciones de VoC y BA anteriores. 1, BA.1.1, BA.1 y BA.2, calculados a partir de los datos de neutralización de pseudovirus. La distancia entre dos posiciones es proporcional a la reducción del título de neutralización cuando una de las cepas correspondientes es desafiada con suero derivado de la infección por la otra. No se proporciona ninguna escala ya que las figuras son proyecciones de una distribución tridimensional, sin embargo la variación puede calibrarse por comparación con (i) BA.1 a BA.2 que se reduce 2.93x y (ii) BA.2 a BA.4/5 que se reduce 3.03x. (B) Como (A) pero incluyendo sólo los sublinajes Omicron y los primeros virus pandémicos para permitir una proyección más precisa de este subconjunto en tres dimensiones. Obsérvese que en los cálculos se incluyeron las respuestas de estos virus frente a todos los sueros.

Figura 23. Ensayos de neutralización pseudoviral frente a anticuerpos monoclonales.(A) Curvas de neutralización para un panel de 28 anticuerpos monoclonales realizados a partir de muestras tomadas de vacunados infectados con BA.1. Se comparan las curvas de titulación para mutaciones únicas de BA.2.75 en la columna vertebral de BA.2 con BA.2 y BA.2.75. Los títulos IC50 se muestran en la Tabla 24.

Figura 24. Análisis por resonancia de plasmón superficial (SPR) de la interacción entre BA.2 o BA.2.75 RBD y mAbs seleccionados.(A) La unión de Omi-29 (IGHV3-53) a BA.2.75 RBD es severamente reducida comparada con la de BA.2, como se muestra por una sola inyección de 1 |jM Omi-29 Fab sobre células de flujo de muestra conteniendo BA.2 biotinilado o BA.2.75 RBD. (B) La unión de Omi-36 (IGHV3-66) a BA.2.75 RBD es severamente reducida comparada con la de BA.2, como se muestra por una sola inyección de 0.2 j M BA.2 o BA.2.75 RBD sobre células de flujo de muestra que contienen Omi-36 en la forma IgG. (C-H) Sensorgramas (Rojo / Coloreado: curva de unión original; negro: curva ajustada) que muestran las interacciones entre BA.2 o BA.4/5 RBD y mAbs seleccionados, con datos cinéticos mostrados.

Figura 25. Neutralización de BA.2.75 por paneles de suero convaleciente recogido de infección con variantes históricas.Títulos de neutralización de los sueros indicados contra BA.2.75 y los pseudovirus indicados. Los datos aparte de BA.2.75 se han tomado de Tuekprakhon et al., 2022.

Figura 26. Cebadores para la mutagénesis PCR dirigida al sitio de la BA.2.75 RBD. La mutagénesis PCR dirigida al sitio se realizó utilizando el constructo BA.2 Spike como plantilla. Las mutaciones D339H, G446S, N460K y R493Q se introdujeron utilizando los cebadores mostrados.

Figura 27. Caracterización de BA.2.11, BA.2.12.1 y BA.2.13 mediante ensayos de neutralización pseudoviral, resonancia de plasmón superficial y análisis estructural.(a), (b) Valores IC50 para los virus indicados utilizando suero obtenido 4 semanas después de una tercera dosis de vacuna (a) AstraZeneca AZD1222 (n = 41), (b) Pfizer BNT162b2 (n = 18). (c) Se tomaron los títulos de neutralización del suero de los voluntarios vacunados que sufrían infección intercurrente por BA.1. La comparación se realiza con los títulos de neutralización frente a Victoria, BA.1, BA.1.1, BA.2 y BA.4/5 reportados anteriormente en Tuekprakhon et al. (2022). Los títulos medios geométricos se muestran encima de cada columna. Para el análisis se utilizó la prueba de rangos con signo de pares emparejados de Wilcoxon y se calcularon valores p de dos colas. (d-g) Sensorgramas SPR (rojo: curva de unión experimental; negro: curva ajustada) que muestran la unión de ACE2 del RBD de Ba .2.11 (e), BA.2.12.1 (f), BA.2.13 (g) en comparación con la unión al RBD de BA.2 (h), con los datos cinéticos mostrados. Los datos de BA.2 RBD se publicaron en Nutalai et al. (2022). (h-m) Estructura cristalina del complejo BA.2.12.1 RBDBeta-27/NbC1. (h) Estructura global mostrada como trazas Ca con RBD (gris), Beta-27 HC (rojo) y LC (azul), y NbC1 (amarillo). Los Cas de los residuos L452Q, F486 y Q493R (L, F y R en BA.2, R, V y Q en BA.4/5) se muestran como esferas. (i) Comparación de los modos de unión de Beta-27 en los complejos BA.2.12.1 RBD/Beta-27/NbC1 (RBD como representación de la superficie, HC en rojo y LC en azul), BA.4/5 RBD/Beta-27/NbC1 (cian, PDB 7ZXU) y Beta RBD/Beta-27 (verde, PDB 7PS1) mediante la superposición de los RBD. Aparte de las regiones flexibles N- y C-terminal de los RBD, se producen diferencias significativas en el N-terminal y CDR-H1 del Fab h C, la hélice a2, el bucle 371-375 y el bucle G446 del RBD. CDR-L3 tiene conformaciones dobles en el complejo BA.4/5 RBD, y una única conformación en los otros dos complejos (i). El HC N-terminal y el CDR-H1 que contacta con el residuo 486 del RBD difieren de los de los complejos Beta y BA.4/5 RBD, este último contiene la mutación F486V. Es probable que las diferencias se deban a contactos de un nanocuerpo C1 relacionado con la simetría que se muestra como enlaces grises en (j). (k) La diferencia estructural en el bucle G446 en el RBD BA.4/5 también está inducida por el contacto cristalino. (l) El bucle 371-375 que lleva las mutaciones S371F, S373P y S375F en los RBDs BA.2.12.1 y BA.4/5 está estabilizado por interacciones con la CDR-H3 de NbC1. (m) Superposición de los RBD BA.2.12.1 (gris), BA.2 (verde, PDB 7ZF9) y BA.4/5 (cian). (n) Las mutaciones en 452 no introducen cambios estructurales locales significativos. R452 en BA.4/5 tiene una doble conformación.

Figura 28. Ensayos de neutralización pseudoviral de BA.4.6 por vacuna.BA. 1, BA.2, BA.4.5 suero inmune (a-d) y anticuerpos monoclonales (e-f). Valores IC50 para los virus indicados utilizando suero obtenido de vacunados 28 días después de su tercera dosis de la vacuna Pfizer BNT162b2 (n=22, a). Valores IC50 de los virus indicados frente al suero de voluntarios que sufrieron infecciones intercurrentes por la vacuna BA.1 (n=14, b), BA.2 (n=23, c) y BA.4/5 (n=11, d). Encima de cada columna se indican los títulos de la media geométrica. Para el análisis se utilizó la prueba de rango con signo de pares emparejados de Wilcoxon y se calcularon valores P de dos colas. Se compararon las curvas de neutralización de un panel de 28 anticuerpos monoclonales elaborados a partir de muestras tomadas de vacunados infectados con BA.1 (e) contra BA.4.6 con las variantes Victoria, BA.1, BA.1.1, BA.2, BA.4/5 y BA.2.75. Curvas de neutralización para un panel de 14 anticuerpos monoclonales comerciales contra las mismas variantes (e). Los valores IC50 se muestran en la Tabla 29A y 29B.

Figura 29. Ensayos de neutralización pseudoviral.Ensayos de neutralización pseudoviral contra anticuerpos monoclonales Omicron, relacionados con la Tabla 26 donde se muestran los títulos IC50. Curvas de neutralización de un panel de 27 anticuerpos monoclonales obtenidos a partir de muestras tomadas de vacunados infectados con BA.1. Las curvas de valoración de BA.2.11, BA.2.12.1 y BA.2.13 se comparan con BA.2.

Figura 30. Análisis por resonancia de plasmón superficial (SPR) de la interacción entre BA.2.12.1 o BA.2 RBD y mAbs seleccionados (Omi-6 y Omi-31).(a) Determinación de la afinidad de BA.2.12.1 RBD a Omi-6 utilizando un análisis de equilibrio de unión 1:1. (b), (c), (d) Sensorgramas (rojo: curva de unión original; negro: curva ajustada) que muestran las interacciones entre BA.2.12.1 o BA.2 RBD y mAbs seleccionados, con datos cinéticos mostrados.

Figura 31. Ensayos de neutralización.Curvas de neutralización utilizando lentivirus pseudotipados con el gen S de los linajes BA.2 indicados (A) Omi-mAb, (B) mAb comercial. Véase también el cuadro 32. La variante "BA.4+all" es una variante sintética, diseñada tras la evaluación de diferentes mutaciones que se producen en el gen Omicron S del SARS-CoV-2. Estas mutaciones se combinaron e incorporaron a un gen Omicron BA.4 S para producir el gen artificial S denominado "BA.4+all". Esta variante se creó únicamente como herramienta experimental y no existe en la naturaleza, ni corresponde al gen S de ninguna variante SARs-Cov-2 circulante.

Figura 32. Títulos IC50 de neutralización en suero(dilución en pliegues) de lentivirus pseudotipados con el gen S de los sublinajes BA.2 indicados. (A) Suero obtenido 28 días después de la tercera dosis de la vacuna BNT162b2 o tras la infección con (B) BA.1 (C) BA.2 o (D) BA.4/5. Encima de cada columna se indican los títulos de la media geométrica. Se utilizaron las pruebas de Wilcoxon (C y D) y Mann-Whitney (E) y se calcularon los valores P de dos colas.

Figura 33. Mapas térmicos de la unión de anticuerpos.Mapa térmico que muestra el IC50 (|jg/ml) de varios anticuerpos contra las cepas Victoria y Beta en muestras vacunadas y no vacunadas.

Figura 34. Ensayos de neutralización.Curvas de neutralización utilizando lentivirus pseudotipados con el gen S de los linajes BA.2 indicados.

Figura 35. Mapa de calor de los títulos de neutralización IC50 para el panel de mAb BA.1 (Omi).

Títulos IC50 de neutralización pseudoviral para los mAb indicados frente a un panel de pseudovirus que expresan secuencias S variantes. Los valores IC50 del virus vivo frente a variantes encontradas anteriormente en la pandemia se incluyen a modo de comparación. Los datos de los ensayos con virus vivos y los datos pseudovirales de Victoria, BA.2 y BA.4/5 se reportaron anteriormente en Tuekprakon et al. (2022).

Descripción detallada de la invención

Anticuerpos

Un anticuerpo de la invención se une específicamente a la proteína spike de SAR-CoV-2. En particular, se une específicamente a la subunidad S1 de la proteína spike, como el dominio de unión al receptor (RBD) o el dominio N-terminal (NTD).

También se divulgan en el presente documento, pero no forman parte de la invención reivindicada, los anticuerpos que comprenden al menos tres CDRs de un anticuerpo de la Tabla 3. El anticuerpo puede comprender al menos cuatro, cinco o las seis CDRs de un anticuerpo de la Tabla 3. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 80 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo de la Tabla 3. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 80 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo de la Tabla 3. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 80 % de identidad con el dominio variable de cadena pesada y el dominio de cadena ligera, respectivamente, de un anticuerpo de la Tabla 3. El anticuerpo puede ser cualquiera de los anticuerpos de la Tabla 3.

La tabla 3 enumera 28 anticuerpos individuales que se identificaron de pacientes recuperados de infección intercurrente por SARS-CoV-2 de Omicron, que ya habían recibido dos dosis de la vacuna de Pfizer. La Tabla 1 enumera 42 anticuerpos individuales que se identificaron previamente en pacientes recuperados de COVID-19 [Dejnirattisai, Wanwisa, et al. "La anatomía antigénica del dominio de unión al receptor del SARS-CoV-2". Cell 184(8) (2021): 2183- 2200; Supasa, Piyada, et al. "Neutralización reducida de la variante B. 1.1.7 del SARS-CoV-2 por sueros de convalecientes y vacunales". Cell 184(8) (2021): 2201-2211; Zhou, Darning, et al. "Evidencia de escape de la variante B.1.351 del SARS-CoV-2 de sueros naturales e inducidos por vacunas". Cell 184(9) (2021): 2348-2361; Dejnirattisai, Wanwisa, et al. "Evasión de anticuerpos por la cepa P.1 del SARS-CoV-2". Cell 184(11) (2021): 2939-2954; Liu, Chang, et al. "Neutralización reducida del SARS-CoV-2 B. 1.617 por la vacuna y el suero de convalecientes". Cell 184(16) (2021): 4220-4236.]. La Tabla 2 enumera 28 anticuerpos individuales que se identificaron previamente en pacientes infectados por Beta SARS-CoV-2 [Liu, C et al. "La respuesta de anticuerpos al SARS-CoV-2 Beta subraya la distancia antigénica con otras variantes". Cell host & microbe 30(1)(2021): 53-68]. Los anticuerpos de la Tabla 1 también se denominan en el presente documento con un prefijo "COVOX", por ejemplo COVOX-222. Los anticuerpos de la Tabla 2 también se denominan con un prefijo "p", por ejemplo "p50". Los anticuerpos de la Tabla 3 también se denominan con un prefijo "O", por ejemplo "O02". En las Tablas 1 a 3 se enumeran las SEQ ID NO de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena pesada y de la región variable de la cadena ligera, así como las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de las cadenas variables, de cada uno de los anticuerpos.

El anticuerpo de la Tabla 3 puede seleccionarse del grupo formado por: Omi03, Omi12, Omi02, Omi39, Omi42, Omi16, Omi18, Omi20, Omi 23, Omi28, Omi08,Omi17, Omi29, Omi36 y Omi38. Sorprendentemente, se observó que estos anticuerpos mantenían una fuerte neutralización de las cepas vivas variantes Victoria, Alfa, Beta, Gamma, Delta y Omicron del SARS-CoV-2 (por ejemplo, un IC50 de < 0.1 pg/ml contra todas las cepas vivas ensayadas).

El anticuerpo de la Tabla 3 puede seleccionarse del grupo formado por: Omi03, Omi12, Omi02, Omi39, Omi42, Omi16, Omi18, Omi20, Omi 23, Omi28 y Omi 08. Sorprendentemente, se observó que estos anticuerpos mantenían una fuerte neutralización de las cepas vivas Victoria, Alfa, Beta, Gamma, Delta y Omicron de la variante CoV-2 del SRAS (por ejemplo, un IC50 de< 0.05 pg/ml contra todas las cepas vivas probadas).

El anticuerpo de la Tabla 3 puede seleccionarse del grupo formado por: Omi03, Omi12, Omi02, Omi39 y Omi42. Sorprendentemente, se observó que estos anticuerpos mantenían una fuerte neutralización de las cepas vivas variantes Victoria, Alfa, Beta, Gamma, Delta y Omicron del SARS-CoV-2 (por ejemplo, un IC50 de < 0.02 pg/ml contra todas las cepas vivas ensayadas).

El anticuerpo de la Tabla 3 puede seleccionarse del grupo formado por: Omi03 y Omi12. Sorprendentemente, se observó que estos anticuerpos mantenían una neutralización muy fuerte de las cepas vivas variantes Victoria, Alfa, Beta, Gamma, Delta y Omicron del SARS-CoV-2 (por ejemplo, un IC50 de < 0.01 pg/ml contra todas las cepas vivas ensayadas).

El anticuerpo de la Tabla 3 puede seleccionarse del grupo formado por: Omi02, Omi03, Omi12, Omi18, Omi28, Omi39 y Omi42. Sorprendentemente, se observó que estos anticuerpos mantenían una neutralización muy fuerte de las cepas vivas variantes Victoria, Alfa, Beta, Gamma, Delta y Omicron del SARS-CoV-2.

Por consiguiente, el anticuerpo de la Tabla 3 puede ser Omi03. Se observó que Omi03 neutralizaba las cepas vivas variantes de SARS-CoV-2 Victoria, Alfa, Beta, Gamma, Delta y Omicron, y los constructos psuedovirales de Victoria, Omicron BA.1, Omicron BA.1.1, Omicron BA.2 y Omicron BA.3 (véanse las Tablas 13 y 14, Figura 2). Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden comprender un CDRH1, CDRH2 y CDRH3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en SEQ ID NOs: 695, 696 y 697, respectivamente, y un CDRL1, CDRL2 y CDRL3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las<s>E<q>ID NOs: 698, 699 y 700, respectivamente. Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo Omi03 (es decir, la SEQ ID NO: 692). Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo Omi03 (es decir, la SEQ ID NO: 694). Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera que comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos que tiene >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 %, 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera, respectivamente, del anticuerpo Omi03 (es decir, las SEQ ID NOs: 692 y 694, respectivamente).

El dominio de cadena pesada de Omi03 se deriva de una v-región IGHV3-53, y los inventores han demostrado previamente que la conmutación de las cadenas pesadas y ligeras entre anticuerpos derivados de la misma vregión da lugar a un anticuerpo que es particularmente útil con la presente divulgación (se explica más adelante). Por lo tanto, los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender la cadena pesada de Omi03, y no la cadena ligera de Omi03. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender un CDRH1,CDRH2 y CDRH3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 695, 696 y 697, respectivamente. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo Omi03 (es decir, la SEQ ID NO: 692). El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en la SEQ ID NO: 692.

Alternativamente, el anticuerpo puede comprender la cadena ligera de Omi03, y no la cadena pesada de Omi03. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender un CDRL1, CDRL2 y CDRL3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 698, 699 y 700, respectivamente. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo Omi03 (es decir, la SEQ ID NO: 694). El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en la SEQ ID NO: 694.

El anticuerpo de la Tabla 3 puede ser Omi12. Se observó que Omi12 neutralizaba las cepas vivas variantes de SARS-CoV-2 Victoria, Alfa, Beta, Gamma, Delta y Omicron, y los constructos psuedovirales de Victoria, Omicron BA.1, Omicron BA.1.1,

Omicron BA.2 y Omicron BA.3 (véanse las tablas 13 y 14 y la Figura 2). Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden comprender un CDRH1, CDRH2 y CDRH3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en SEQ ID NOs: 735, 736 y 737, respectivamente, y un CDRL1, CDRL2 y CDRL3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 738, 739 y 740, respectivamente. Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo Omi12 (es decir, la SEQ ID NO: 732). Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo Omi12 (es decir, la SEQ ID NO: 734). Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera que comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos que tiene >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 %, 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera, respectivamente, del anticuerpo Omi12 (es decir, las SEQ ID NOs: 732 y 734, respectivamente).

El dominio de cadena pesada de Omi12 se deriva de una v-región IGHV1-58, y los inventores han demostrado previamente que la conmutación de las cadenas pesadas y ligeras entre anticuerpos derivados de la misma vregión da lugar a un anticuerpo que es particularmente útil con la presente divulgación (se explica más adelante). Por lo tanto, los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender la cadena pesada de Omi12, y no la cadena ligera de Omi12. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender un CDRH1,CDRH2 y CDRH3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en SEQ ID NOs: 735, 736 y 737, respectivamente. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo Omi12 (es decir, la SEQ ID NO: 732). El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en la SEQ ID NO: 732.

Alternativamente, el anticuerpo puede comprender la cadena ligera de Omi12, y no la cadena pesada de Omi12. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender un CDRL1, CDRL2 y CDRL3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 738, 739 y 740, respectivamente. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo Omi12 (es decir, la SEQ ID NO: 734). El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en la SEQ ID NO: 734.

El anticuerpo de la Tabla 3 puede ser Omi02. Se observó que Omi02 neutralizaba las cepas vivas variantes de SARS-CoV-2 Victoria, Alfa, Beta, Gamma, Delta y Omicron, y los constructos psuedovirales de Victoria, Omicron BA.1, Omicron BA.1.1, Omicron BA.2 y Omicron BA.3 (véanse las Tablas 13 y 14, Figura 2). Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden comprender un CDRH1, CDRH2 y CDRH3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en SEQ iD NOs: 685, 686 y 687, respectivamente, y un CDRL1, CDRL2 y CDRL3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 688, 689 y 690, respectivamente. Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo Omi02 (es decir, la SEQ ID NO: 682). Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo Omi02 (es decir, la SEQ ID NO: 684). Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera que comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos que tiene >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 %, 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera, respectivamente, del anticuerpo Omi02 (es decir, las SEQ ID NOs: 682 y 684, respectivamente).

El dominio de cadena pesada de Omi02 se deriva de una v-región IGHV1-69, y los inventores han demostrado previamente que la conmutación de las cadenas pesadas y ligeras entre anticuerpos derivados de la misma vregión da lugar a un anticuerpo que es particularmente útil con la presente divulgación (se explica más adelante). Por lo tanto, los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender la cadena pesada de Omi02, y no la cadena ligera de Omi02. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender un CDRH1,CDRH2 y CDRH3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en SEQ ID NOs: 685, 686 y 687, respectivamente. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo Omi02 (es decir, la SEQ ID NO: 682). El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en la SEQ ID NO: 682.

Alternativamente, el anticuerpo puede comprender la cadena ligera de Omi02, y no la cadena pesada de Omi02. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender un CDRL1, CDRL2 y CDRL3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 688, 689 y 690, respectivamente. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo Omi02 (es decir, la SEQ ID NO: 684). El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en la SEQ ID NO: 684.

El anticuerpo de la Tabla 3 puede ser Omi08. Se observó que Omi08 neutralizaba las cepas vivas de la variante SARS-CoV-2 Victoria, Alfa, Beta, Gamma, Delta y

Omicron, y los constructos psuedovirales de Victoria, Omicron BA.1 Omicron BA.1, Omicron BA.1.1, Omicron BA.2 y Omicron BA.3(véanse las Tablas 13 y 14, Figura 2). Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden comprender un CDRH1, CDRH2 y CDRH3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en SEQ ID NOs: 715, 716 y 717, respectivamente, y un CDRL1, CDRL2 y CDRL3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 718, 719 y 720, respectivamente. Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo Omi08 (es decir, la SEQ ID NO: 712). Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo Omi08 (es decir, la SEQ ID NO: 714). Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera que comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos que tiene >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 %, 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera, respectivamente, del anticuerpo Omi08 (es decir, las SEQ ID NOs: 712 y 714, respectivamente).

En una realización, el anticuerpo de la Tabla 3 puede ser Omi42. Se observó que Omi42 neutralizaba las cepas vivas variantes de SARS-CoV-2 Victoria, Alfa, Beta, Gamma, Delta y Omicron, y los contructos psuedovirales de Victoria, Omicron BA.1, Omicron BA.1.1, Omicron BA.2 y Omicron BA.3 (véanse las Tablas 13 y 14, Figura 2). En una realización, un anticuerpo de la invención puede comprender un CDRH1, CDRH2 y CDRH3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 955, 956 y 957, respectivamente, y un CDRL1, CDRL2 y CDRL3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 958, 959 y 960, respectivamente. También se divulgan en el presente documento, pero no forman parte de la invención reivindicada, anticuerpos que comprenden un dominio variable de cadena pesada que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, o >99 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo Omi42 (es decir, la SEQ ID NO: 952). También se divulgan en el presente documento, pero no forman parte de la invención reivindicada, anticuerpos que pueden comprender un dominio variable de cadena ligera que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, o >99 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo Omi42 (es decir, la SEQ ID NO: 954). En un caso, un anticuerpo divulgado en el presente documento puede comprender un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga una identidad de secuencia del 100% con el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera, respectivamente, del anticuerpo Omi42 (es decir, las SEQ ID NOs: 952 y 954, respectivamente).

El dominio de cadena pesada de Omi42 se deriva de una v-región IGHV3-9, y los inventores han demostrado previamente que la conmutación de las cadenas pesadas y ligeras entre anticuerpos derivados de la misma vregión da lugar a un anticuerpo que es particularmente útil con la presente divulgación (se explica más adelante). Por lo tanto, los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender la cadena pesada de Omi42, y no la cadena ligera de Omi42. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender un CDRH1,CDRH2 y CDRH3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en SEQ ID NOs: 955, 956 y 957, respectivamente. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo Omi42 (es decir, la SEQ ID NO: 952). El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en la SEQ ID NO: 952.

Alternativamente, el anticuerpo puede comprender la cadena ligera de Omi42, y no la cadena pesada de Omi42. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender un CDRL1, CDRL2 y CDRL3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 958, 959 y 960, respectivamente. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo Omi42 (es decir, la SEQ ID NO: 954). El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en la SEQ ID NO: 954.

El anticuerpo de la Tabla 3 puede ser Omi16. Se observó que Omi16 neutralizaba las cepas vivas variantes de SARS-CoV-2 Victoria, Alfa, Beta, Gamma, Delta y Omicron, y los constructos psuedovirales de Victoria, Omicron BA.1, Omicron BA.1, Omicron BA.1.1, Omicron B<a>.2 y Omicron BA.3 (véanse las Tablas 13 y 14, Figura 2). Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un CDRH1, CDRH2 y CDRH3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 745, 746 y 747, respectivamente, y un CDRL1, CDRL2 y CDRL3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 748, 749 y 750, respectivamente. Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo Omi16 (es decir, la SEQ ID NO: 742). Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo Omi16 (es decir, la SEQ ID NO: 744). Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera que comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos que tiene >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 %, 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera, respectivamente, del anticuerpo Omi16 (es decir, las SEQ ID NOs: 742 y 744, respectivamente).

El dominio de cadena pesada de Omi16 se deriva de una v-región IGHV3-66, y los inventores han demostrado previamente que la conmutación de las cadenas pesadas y ligeras entre anticuerpos derivados de la misma vregión da lugar a un anticuerpo que es particularmente útil con la presente divulgación (se explica más adelante). Por lo tanto, los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender la cadena pesada de Omi16, y no la cadena ligera de Omi16. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender un CDRH1,CDRH2 y CDRH3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en SEQ ID NOs: 745, 746 y 747, respectivamente. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo Omi16 (es decir, la SEQ ID NO: 742). El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en la SEQ ID NO: 742.

Alternativamente, el anticuerpo puede comprender la cadena ligera de Omi16, y no la cadena pesada de Omi16. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender un CDRL1, CDRL2 y CDRL3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 748, 749 y 750, respectivamente. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo Omi16 (es decir, la SEQ ID NO: 744). El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en la SEQ ID NO: 744.

El anticuerpo de la Tabla 3 puede ser Omi18. Se observó que Omi18 neutralizaba las cepas vivas variantes de SARS-CoV-2 Victoria, Alfa, Beta, Gamma, Delta y Omicron, y los constructos psuedovirales de Victoria, Omicron BA.1, Omicron BA.1.1, Omicron BA.2 y Omicron BA.3 (véanse las Tablas 13 y 14, Figura 2). Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden comprender un CDRH1, CDRH2 y CDRH3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en SEQ iD NOs: 765, 766 y 767, respectivamente, y un CDRL1, CDRL2 y CDRL3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 768, 769 y 770, respectivamente. Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo Omi18 (es decir, la SEQ ID NO: 762). Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo Omi18 (es decir, la SEQ ID NO: 764). Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera que comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos que tiene >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 %, 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera, respectivamente, del anticuerpo Omi18 (es decir, las SEQ ID NOs: 762 y 764, respectivamente).

El dominio de cadena pesada de Omi18 se deriva de una v-región IGHV3-53, y los inventores han demostrado previamente que la conmutación de las cadenas pesadas y ligeras entre anticuerpos derivados de la misma vregión da lugar a un anticuerpo que es particularmente útil con la presente divulgación (se explica más adelante). Por lo tanto, los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender la cadena pesada de Omi18, y no la cadena ligera de Omi18. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender un CDRH1,CDRH2 y CDRH3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en SEQ ID NOs: 765, 766 y 767, respectivamente. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo Omi18 (es decir, la SEQ ID NO: 762).

El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en la SEQ ID NO: 762.

Alternativamente, el anticuerpo puede comprender la cadena ligera de Omi18, y no la cadena pesada de Omi18. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender un CDRL1, CDRL2 y CDRL3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 768, 769 y 770, respectivamente. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo Omi18 (es decir, la SEQ ID NO: 764). El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en la SEQ ID NO: 764.

El anticuerpo de la Tabla 3 puede ser Omi20. Se observó que Omi20 neutralizaba las cepas vivas variantes de SARS-CoV-2 Victoria, Alfa, Beta, Gamma, Delta y Omicron, y los constructos psuedovirales de Victoria, Omicron BA.1, Omicron BA.1.1, Omicron BA.2 y Omicron BA.3 (véanse las Tablas 13 y 14, Figura 2). Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden comprender un CDRH1, CDRH2 y CDRH3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en SEQ ID NOs: 775, 776 y 777, respectivamente, y un CDRL1, CDRL2 y CDRL3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 778, 779 y 780, respectivamente. Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo Omi20 (es decir, la SEQ ID NO: 772). Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo Omi20 (es decir, la SEQ ID NO: 774). Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera que comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos que tiene >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 %, 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera, respectivamente, del anticuerpo Omi20 (es decir, las SEQ ID NOs: 772 y 774, respectivamente).

El dominio de cadena pesada de Omi20 se deriva de una v-región IGHV3-66, y los inventores han demostrado previamente que la conmutación de las cadenas pesadas y ligeras entre anticuerpos derivados de la misma vregión da lugar a un anticuerpo que es particularmente útil con la presente divulgación (se explica más adelante). Por lo tanto, los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender la cadena pesada de Omi20, y no la cadena ligera de Omi20. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender un CDRH1,CDRH2 y CDRH3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en SEQ ID NOs: 775, 776 y 777, respectivamente. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo Omi20 (es decir, la SEQ ID NO: 772). El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en la SEQ ID NO: 772.

Alternativamente, el anticuerpo puede comprender la cadena ligera de Omi20, y no la cadena pesada de Omi20. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender un CDRL1, CDRL2 y CDRL3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 778, 779 y 780, respectivamente. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo Omi20 (es decir, la SEQ ID NO: 774). El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en la SEQ ID NO: 774.

El anticuerpo de la Tabla 3 puede ser Omi23. Se observó que Omi23 neutralizaba las cepas vivas variantes de SARS-CoV-2 Victoria, Alfa, Beta, Gamma, Delta y Omicron, y los constructos psuedovirales de Victoria, Omicron BA.1, Omicron BA.1.1, Omicron BA.2 y Omicron BA.3 (véanse las Tablas 13 y 14, Figura 2). Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden comprender un CDRH1, CDRH2 y CDRH3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en SEQ iD NOs: 785, 786 y 787, respectivamente, y un CDRL1, CDRL2 y CDRL3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 788, 789 y 790, respectivamente. Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo Omi23 (es decir, la SEQ ID NO: 782). Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo Omi23 (es decir, la SEQ ID NO: 784). Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera que comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos que tiene >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 %, 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera, respectivamente, del anticuerpo Omi23 (es decir, las SEQ ID NOs: 782 y 784, respectivamente).

El dominio de cadena pesada de Omi23 se deriva de una v-región IGHV4-31, y los inventores han demostrado previamente que la conmutación de las cadenas pesadas y ligeras entre anticuerpos derivados de la misma vregión da lugar a un anticuerpo que es particularmente útil con la presente divulgación (se explica más adelante). Por lo tanto, los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender la cadena pesada de Omi23, y no la cadena ligera de Omi23. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender un CDRH1,CDRH2 y CDRH3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en SEQ ID NOs: 785, 786 y 787, respectivamente. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo Omi23 (es decir, la SEQ ID NO: 782). El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en la SEQ ID NO: 782.

Alternativamente, el anticuerpo puede comprender la cadena ligera de Omi23, y no la cadena pesada de Omi23. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender un CDRL1, CDRL2 y CDRL3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 788, 789 y 790, respectivamente. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo Omi23 (es decir, la SEQ ID NO: 784). El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en la SEQ ID NO: 784.

El anticuerpo de la Tabla 3 puede ser Omi28. Se observó que Omi28 neutralizaba las cepas vivas variantes de SARS-CoV-2 Victoria, Alfa, Beta, Gamma, Delta y Omicron, y los constructos psuedovirales de Victoria, Omicron BA.1, Omicron BA.1.1, Omicron BA.2 y Omicron BA.3 (véanse las Tablas 13 y 14, Figura 2). Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden comprender un CDRH1, CDRH2 y CDRH3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en SEQ iD NOs: 835, 836 y 837, respectivamente, y un CDRL1, CDRL2 y CDRL3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 838, 839 y 840, respectivamente. Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99%o 100%de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo Omi28 (es decir, la SEQ ID NO: 832). Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo Omi28 (es decir, la SEQ ID NO: 834). Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera que comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos que tiene >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 %, 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera, respectivamente, del anticuerpo Omi28 (es decir, las SEQ ID NOs: 832 y 834, respectivamente). El dominio de cadena pesada de Omi28 se deriva de una v-región IGHV3-66, y los inventores han demostrado previamente que la conmutación de las cadenas pesadas y ligeras entre anticuerpos derivados de la misma v-región da lugar a un anticuerpo que es particularmente útil con la presente divulgación (se explica más adelante). Por lo tanto, los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender la cadena pesada de Omi28, y no la cadena ligera de Omi28. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender un CDRH1,CDRH2 y CDRH3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en SEQ ID NOs: 835, 836 y 837, respectivamente. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de secuencia 10 de identidad con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo Omi28 (es decir, SEQ ID NO: 832). El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en la SEQ ID NO: 832.

Alternativamente, el anticuerpo puede comprender la cadena ligera de Omi28, y no la cadena pesada de Omi28. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender un CDRL1, CDRL2 y CDRL3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 838, 839 y 840, respectivamente. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo Omi28 (es decir, la SEQ ID NO: 834). El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en la SEQ ID NO: 834.

El anticuerpo de la Tabla 3 puede ser Omi39. Se observó que Omi39 neutralizaba las cepas vivas variantes de SARS-CoV-2 Victoria, Alfa, Beta, Gamma, Delta y Omicron, y los constructos psuedovirales de Victoria, Omicron BA.1, Omicron BA.1.1, Omicron BA.2 y Omicron BA.3 (véanse las Tablas 13 y 14, Figura 2). Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden comprender un CDRH1, CDRH2 y CDRH3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en SEQ<i>D NOs: 935, 936 y 937, respectivamente, y un CDRL1, CDRL2 y CDRL3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 938, 939 y 940, respectivamente. Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo Omi39 (es decir, la SEQ ID NO: 932). Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo Omi39 (es decir, la SEQ ID NO: 934). Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera que comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos que tiene >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 %, 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera, respectivamente, del anticuerpo Omi39 (es decir, las SEQ ID NOs: 932 y 934, respectivamente).

El anticuerpo de la Tabla 3 puede ser Omi17. Se observó que Omi17 neutralizaba las cepas vivas variantes de SARS-CoV-2 Victoria, Alfa, Beta, Gamma, Delta y Omicron, y los constructos psuedovirales de Victoria, Omicron BA.1, Omicron BA.1.1, Omicron BA.2 y Omicron BA.3 (véanse las Tablas 13 y 14, Figura 2). Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden comprender un CDRH1, CDRH2 y CDRH3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en SEQ ID NOs: 755, 756 y 757, respectivamente, y un CDRL1, CDRL2 y CDRL3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 758, 759 y 760, respectivamente. Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo Omi17 (es decir, la SEQ ID NO: 752). Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo Omi17 (es decir, la SEQ ID NO: 754). Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera que comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos que tiene >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 % , >99 %, 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera, respectivamente, del anticuerpo Omi17 (es decir, las SEQ ID NOs: 752 y 754, respectivamente).

El dominio de cadena pesada de Omi17 se deriva de una v-región IGHV3-66, y los inventores han demostrado previamente que la conmutación de las cadenas pesadas y ligeras entre anticuerpos derivados de la misma vregión da lugar a un anticuerpo que es particularmente útil con la presente divulgación (se explica más adelante). Por lo tanto, los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender la cadena pesada de Omi17, y no la cadena ligera de Omi17. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender un CDRH1,CDRH2 y CDRH3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en SEQ ID NOs: 755, 756 y 757, respectivamente. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo Omi17 (es decir, la SEQ ID NO: 752). El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en la SEQ ID NO: 752.

Alternativamente, el anticuerpo puede comprender la cadena ligera de Omi17, y no la cadena pesada de Omi17. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender un CDRL1, CDRL2 y CDRL3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 758, 759 y 760, respectivamente. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo Omi17 (es decir, la SEQ ID NO: 754). El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en la SEQ ID NO: 754.

El anticuerpo de la Tabla 3 puede ser Omi29. Se observó que Omi29 neutralizaba las cepas vivas variantes de SARS-CoV-2 Victoria, Alfa, Beta, Gamma, Delta y Omicron, y los constructos psuedovirales de Victoria Omicron BA.1, Omicron BA.1.1, Omicron BA.2 y Omicron BA.3 (véanse las Tablas 13 y 14, Figura 2). Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden comprender un CDRH1, CDRH2 y CDRH3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en SEQ<i>D NOs: 845, 846 y 847, respectivamente, y un CDRL1, CDRL2 y CDRL3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 848, 849 y 850, respectivamente. Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo Omi29 (es decir, la SEQ ID NO: 842). Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo Omi29 (es decir, la SEQ ID NO: 844). Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera que comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos que tiene >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 %, 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera, respectivamente, del anticuerpo Omi29 (es decir, las SEQ ID NOs: 842 y 844, respectivamente).

El dominio de cadena pesada de Omi29 se deriva de una v-región IGHV3-53, y los inventores han demostrado previamente que la conmutación de las cadenas pesadas y ligeras entre anticuerpos derivados de la misma vregión da lugar a un anticuerpo que es particularmente útil con la presente divulgación (se explica más adelante). Por lo tanto, los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender la cadena pesada de Omi29, y no la cadena ligera de Omi29. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender un CDRH1,CDRH2 y CDRH3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en SEQ ID NOs: 845, 846 y 847, respectivamente. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo Omi29 (es decir, la SEQ ID NO: 842). El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en la SEQ ID NO: 842.

Alternativamente, el anticuerpo puede comprender la cadena ligera de Omi29, y no la cadena pesada de Omi29. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender un CDRL1, CDRL2 y CDRL3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 848, 849 y 850, respectivamente. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo Omi29 (es decir, la SEQ ID NO: 844). El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en la SEQ ID NO: 844.

El anticuerpo de la Tabla 3 puede ser Omi36. Se observó que Omi36 neutralizaba las cepas vivas variantes de SARS-CoV-2 Victoria, Alfa, Beta, Gamma, Delta y Omicron, y los constructos psuedovirales de Victoria, Omicron BA.1, Omicron BA.1.1, Omicron BA.2 y Omicron BA.3 (véanse las Tablas 13 y 14, Figura 2). Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden comprender un CDRH1, CDRH2 y CDRH3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en SEQ iD NOs: 915, 916 y 917, respectivamente, y un CDRL1, CDRL2 y CDRL3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 918, 919 y 920, respectivamente. Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo Omi36 (es decir, la SEQ ID NO: 912). Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100%de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo Omi36 (es decir, la SEQ ID NO: 914).

Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera que comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos que tiene >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 %, 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera, respectivamente, del anticuerpo Omi36 (es decir, las SEQ ID NOs: 912 y 914, respectivamente). El dominio de cadena pesada de Omi36 se deriva de una v-región IGHV3-66, y los inventores han demostrado previamente que la conmutación de las cadenas pesadas y ligeras entre anticuerpos derivados de la misma v-región da lugar a un anticuerpo que es particularmente útil con la presente divulgación (se explica más adelante). Por lo tanto, los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender la cadena pesada de Omi36, y no la cadena ligera de Omi36. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender un CDRH1, CDRH2 y CDRH3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 915, 916 y 917, respectivamente. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo Omi36 (es decir, la SEQ ID NO: 912). El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en la SEQ ID NO: 912.

Alternativamente, el anticuerpo puede comprender la cadena ligera de Omi36, y no la cadena pesada de Omi36. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender un CDRL1, CDRL2 y CDRL3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 918, 919 y 920, respectivamente. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo Omi36 (es decir, la SEQ ID NO: 914). El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en la SEQ ID NO: 914.

El anticuerpo de la Tabla 3 puede ser Omi38. Se observó que Omi38 neutralizaba las cepas vivas variantes de SARS-CoV-2 Victoria, Alfa, Beta, Gamma, Delta y Omicron, y los constructos psuedovirales de Victoria, Omicron BA.1, Omicron BA.1.1, Omicron BA.2 y Omicron BA.3 (véanse las Tablas 13 y 14, Figura 2). Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un CDRH1, CDRH2 y CDRH3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 925, 926 y 927, respectivamente, y un CDRL1, CDRL2 y CDRL3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 928, 929 y 930, respectivamente. Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo Omi38 (es decir, la SEQ ID NO: 922). Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo Omi38 (es decir, la SEQ ID NO: 924). Los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera que comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos que tiene >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 %, 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera, respectivamente, del anticuerpo Omi38 (es decir, las SEQ ID NOs: 922 y 924, respectivamente).

El dominio de cadena pesada de Omi38 se deriva de una v-región IGHV1-69, y los inventores han demostrado previamente que la conmutación de las cadenas pesadas y ligeras entre anticuerpos derivados de la misma vregión da lugar a un anticuerpo que es particularmente útil con la presente divulgación (se explica más adelante). Por lo tanto, los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender la cadena pesada de Omi38, y no la cadena ligera de Omi38. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender un CDRH1, CDRH2 y CDRH3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 925, 926 y 927, respectivamente. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo Omi38 (es decir, la SEQ ID NO: 922). El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en la SEQ ID NO: 922.

Alternativamente, el anticuerpo puede comprender la cadena ligera de Omi38, y no la cadena pesada de Omi38. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender un CDRL1, CDRL2 y CDRL3 con las secuencias de aminoácidos especificadas en las SEQ ID NOs: 928, 929 y 930, respectivamente. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo Om38 (es decir, la SEQ ID NO: 924). El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en la SEQ ID NO: 924.

Anticuerpos de cadena mixta

Se divulgan en el presente documento, pero no forman parte de la invención reivindicada, anticuerpos que comprenden un dominio variable de cadena ligera que comprende CDRL1, CDRL2 y CDRL3 de un primer anticuerpo de la Tabla 1, 2 o 3 y un dominio variable de cadena pesada que comprende CDRH1, CDRH2 y CDRH3 de un segundo anticuerpo de la Tabla 1, 2 o 3, con la condición de que el primer y el segundo anticuerpos sean diferentes. Tales anticuerpos se denominan aquí anticuerpos de cadena mixta.

En las Tablas 4 a 12 se ofrecen ejemplos de anticuerpos de cadena mixta. La Tabla 4 muestra ejemplos de anticuerpos de cadena mixta generados a partir de anticuerpos de las Tablas 1 a 3 derivados de la misma cadena pesada germinal IGHV 3-53. La Tabla 5 muestra ejemplos de anticuerpos de cadena mixta generados a partir de anticuerpos de las Tablas 1 a 3 derivados de la misma cadena pesada de línea germinal IGHV 3-53 e IGHV3-66. La Tabla 6 muestra ejemplos de anticuerpos de cadena mixta generados a partir de anticuerpos de las Tablas 1 a 3 derivados de la misma cadena pesada de línea germinal IGHV1-58. La Tabla 7 muestra ejemplos de anticuerpos de cadena mixta generados a partir de anticuerpos de las Tablas 2 y 3 derivados de la misma cadena pesada de línea germinal IGHV1-69. La Tabla 8 muestra ejemplos de anticuerpos de cadena mixta generados a partir de anticuerpos de las Tablas 1 a 3 derivados de la misma cadena pesada de línea germinal IGHV3-30. La Tabla 9 muestra ejemplos de anticuerpos de cadena mixta generados a partir de anticuerpos de las Tablas 2 y 3 derivados de la misma cadena pesada de línea germinal IGHV3-33. La Tabla 10 muestra ejemplos de anticuerpos de cadena mixta generados a partir de anticuerpos de las Tablas 1 a 3 derivados de la misma cadena pesada de línea germinal IGHV1-18. La Tabla 11 muestra ejemplos de anticuerpos de cadena mixta generados a partir de anticuerpos de las Tablas 1 y 3 derivados de la misma cadena pesada de línea germinal IGHV3-9. La Tabla 12 muestra ejemplos de anticuerpos de cadena mixta generados a partir de anticuerpos de las Tablas 2 y 3 derivados de la misma cadena pesada de línea germinal IGHV4-31. Ejemplos de anticuerpos de cadena mixta que derivan de la misma cadena pesada IGHV1-69 de la línea germinal son Omi02H/Beta-49L y Omi38H/Omi24L.

Por lo tanto, los anticuerpos aquí divulgados comprenden un dominio variable de cadena pesada que comprende CDRH1, CDRH2 y CDRH3 de un primer anticuerpo de la Tabla 1,2 o 3 y un dominio variable de cadena ligera que comprende CDRL1, CDRL2 y CDRL3 de un segundo anticuerpo de la Tabla 1, 2 o 3, con la condición de que el primer y segundo anticuerpos sean diferentes. El anticuerpo puede comprender una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada que tenga al menos un 80 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada de un primer anticuerpo de la Tabla 1, 2 o 3, y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera que tenga al menos un 80 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena ligera de un segundo anticuerpo de la Tabla 1, 2 o 3, con la condición de que el primer y el segundo anticuerpos sean diferentes. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo de las Tablas 1, 2 o 3, y un dominio variable de cadena ligera que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo de la Tabla 1, 2 o 3, con la condición de que el primer y segundo anticuerpos sean diferentes.

El primer anticuerpo puede estar en la Tabla 3 y el segundo anticuerpo puede estar en la Tabla 3.

El primer anticuerpo puede estar en la Tabla 3 y el segundo anticuerpo puede estar en la Tabla 1. El primer anticuerpo puede estar en la Tabla 3 y el segundo anticuerpo puede estar en la Tabla 2. El primer anticuerpo puede estar en la Tabla 1 y el segundo anticuerpo puede estar en la Tabla 3. El primer anticuerpo puede estar en la Tabla 2 y el segundo anticuerpo puede estar en la Tabla 3. El primer anticuerpo puede estar en la Tabla 1 y el segundo anticuerpo puede estar en la Tabla 2. El primer anticuerpo puede estar en la Tabla 2 y el segundo anticuerpo puede estar en la Tabla 1. El primer anticuerpo puede estar en la Tabla 2 y el segundo anticuerpo puede estar en la Tabla 2. El primer anticuerpo puede estar en la Tabla 1 y el segundo anticuerpo puede estar en la Tabla 1.

En un caso de la divulgación, al menos uno de los anticuerpos primero y segundo es un anticuerpo de la Tabla 3.

En un caso de la divulgación, el primer y segundo anticuerpos no están ambos en la Tabla 1. En un caso de la divulgación, el primer y segundo anticuerpos no están ambos en la Tabla 2. En un caso de la divulgación, el primer y segundo anticuerpos no se seleccionan ambos de un anticuerpo de la Tabla 1 o 2.

En un caso de la divulgación, al menos uno del dominio variable de cadena pesada y del dominio variable de cadena ligera son de la Tabla 3.

El anticuerpo de la Tabla 3 puede seleccionarse del grupo formado por: Omi02, Omi03, Omi12, Omi18, Omi28, Omi39 y Omi42. El anticuerpo de la Tabla 3 puede seleccionarse del grupo formado por: Omi03, Omi12, Omi02, Omi39, Omi42, Omi16, Omi18, Omi20, Omi 23, Omi28, Omi08, Omi17, Omi29, Omi36 y Omi38. Por ejemplo, el anticuerpo de la Tabla 3 puede seleccionarse del grupo formado por Omi03, Omi12, Omi02, Omi39, Omi42, Omi16, Omi18, Omi20, Omi 23, Omi28 y Omi08. El anticuerpo de la Tabla 3 puede seleccionarse del grupo formado por Omi03, Omi12, Omi02, Omi39 y Omi42. El anticuerpo de la Tabla 3 puede seleccionarse del grupo formado por Omi03 y Omi12.

En un caso de la divulgación, el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo se seleccionan del grupo que consiste en: Omi03, Omi18, Omi29, Beta-27, anticuerpo 150, anticuerpo 158, anticuerpo 175, anticuerpo 222 y anticuerpo 269. El dominio variable de la cadena pesada de estos anticuerpos se deriva de IGHV3-53. Los anticuerpos de cadena mixta resultantes figuran en la Tabla 4. Por lo tanto, el anticuerpo de la presente divulgación puede comprender las seis CDRs (CDRH1-3 y CDRL1-3), y/o un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera, cada uno de los cuales comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con el correspondiente dominio variable de cualquiera de los anticuerpos de cadena mixta según se establece en la Tabla 4.

Los anticuerpos derivados de IGHV3-53 pueden utilizarse para producir anticuerpos de cadena mixta con anticuerpos de IGHV3-66 (por ejemplo, los anticuerpos 40 y 398 de la Tabla 1) (véase, por ejemplo, Dejnirattisai, Wanwisa, et al. "La anatomía antigénica del dominio de unión al receptor del SARS-CoV-2". Cell 184(8) (2021): 2183-2200; Supasa, Piyada, et al. "Neutralización reducida de la variante B.1.1.7 del SARS-CoV-2 por sueros de convalecientes y vacunales". Cell 184(8) (2021): 2201-2211; Zhou, Darning, et al. "Evidencia de escape de la variante B.1.351 del SARS-CoV-2 de sueros naturales e inducidos por vacunas". Cell 184(9) (2021): 2348-2361; Dejnirattisai, Wanwisa, et al. "Evasión de anticuerpos por la cepa P.1 del SARS-CoV-2". Cell 184(11) (2021): 2939 2954; Liu, Chang, et al. "Neutralización reducida del SARS-CoV-2 B.1.617 por la vacuna y el suero de convalecientes". Cell 184(16) (2021): 4220-4236)). Por consiguiente, también divulgado en el presente documento pero que no forma parte de la invención actualmente reivindicada, el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo se seleccionan ambos del grupo que consiste en: Omi03, Omi18, Omi29, Omi16, Omi17, Omi20, Omi27, Omi36, Beta-27, anticuerpo 150, anticuerpo 158, anticuerpo 175, anticuerpo 222, anticuerpo 269, anticuerpo 40 y anticuerpo 398. El dominio variable de cadena pesada de estos anticuerpos deriva de IGHV3-53 e IGVH3-66. Los anticuerpos de cadena mixta resultantes figuran en la Tabla 5. Por lo tanto, los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender las seis CDRs (CDRH1-3 y CDRL1-3), y/o un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera, cada uno de los cuales comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % (por ejemplo >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 %) de identidad de secuencia con el dominio variable correspondiente de cualquiera de los anticuerpos de cadena mixta según se establece en la Tabla 5.

En un caso de la divulgación, el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo se seleccionan del grupo que consiste en: Omi12, Beta-47, Beta-25, anticuerpo 55, anticuerpo 165, anticuerpo 253 y anticuerpo 318. El dominio variable de la cadena pesada de estos anticuerpos se deriva de IGHV 1-58. Los anticuerpos de cadena mixta resultantes figuran en la Tabla 6. Por lo tanto, los anticuerpos divulgados en el presente documento pueden comprender las seis CDR (CDRH1-3 y CDRL1-3), y/o un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera, cada uno de los cuales comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % (por ejemplo, >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 %) de identidad de secuencia con el dominio variable correspondiente de cualquiera de los anticuerpos de cadena mixta según se establece en la Tabla 6.

En un caso de la divulgación, el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo se seleccionan del grupo que consiste en: Beta-49, Beta-50, Omi02, Omi24, Omi30, Omi31, Omi34 y Omi38. El dominio variable de la cadena pesada de estos anticuerpos se deriva de IGHV 1-69. Los anticuerpos de cadena mixta resultantes figuran en la Tabla 7. Por lo tanto, los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender las seis CDR (CDRH1-3 y CDRL1-3), y/o un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera, cada uno de los cuales comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% (por ejemplo >80%, >90%, >95%, >96%, >97%, >98%, >99% o 100%) de identidad de secuencia con el dominio variable correspondiente de cualquiera de los anticuerpos de cadena mixta según se establece en la Tabla 7.

En un caso de la divulgación, el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo se seleccionan del grupo que consiste en: Beta-22, Beta-29, anticuerpo 159 y Omi09. El dominio variable de la cadena pesada de estos anticuerpos se deriva de IGHV 3-30. Los anticuerpos de cadena mixta resultantes figuran en la Tabla 8. Por lo tanto, los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender las seis CDRs (CDRH1-3 y CDRL1-3), y/o un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera, cada uno de los cuales comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % (por ejemplo >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 %) de identidad de secuencia con el dominio variable correspondiente de cualquiera de los anticuerpos de cadena mixta según se establece en la Tabla 8.

En un caso de la divulgación, el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo se seleccionan del grupo que consiste en: Beta-20, Beta-43, Omi32 y Omi33. El dominio variable de la cadena pesada de estos anticuerpos se deriva de IGHV 3-33. Los anticuerpos de cadena mixta resultantes figuran en la Tabla 9. Por lo tanto, los anticuerpos divulgados en el presente documento pueden comprender las seis CDR (CDRH1-3 y CDRL1-3), y/o un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera, cada uno de los cuales comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % (por ejemplo, >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 %) de identidad de secuencia con el dominio variable correspondiente de cualquiera de los anticuerpos de cadena mixta según se establece en la Tabla 9. Los CDRL1-3 de Omi32 y Omi33 son idénticos, lo que significa que, efectivamente, ya son anticuerpos de cadena mixta ejemplares de la divulgación.

En un caso de la divulgación, el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo se seleccionan ambos del grupo que consiste en: anticuerpo 278, Beta-44, Omi26 y Omi41. El dominio variable de la cadena pesada de estos anticuerpos se deriva de IGHV 1-18. Los anticuerpos de cadena mixta resultantes figuran en la Tabla 10. Por lo tanto, los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender los seis CDRs (CDRH1-3 y CDRL1-3), y/o un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera, cada uno de los cuales comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % (por ejemplo >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, > 99% o 100 %) de identidad de secuencia con el dominio variable correspondiente de cualquiera de los anticuerpos de cadena mixta según se establece en la Tabla 10.

En un caso de la divulgación, el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo se seleccionan del grupo que consiste en: anticuerpo 58, Omi25, Omi35 y Omi42. El dominio variable de la cadena pesada de estos anticuerpos se deriva de IGHV 3-9. Los anticuerpos de cadena mixta resultantes figuran en la Tabla 11. Por lo tanto, los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender los seis CDRs (CDRH1-3 y CDRL1-3), y/o un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera, cada uno de los cuales comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % (por ejemplo >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, > 99% o 100 %) de identidad de secuencia con el dominio variable correspondiente de cualquiera de los anticuerpos de cadena mixta según se establece en la Tabla 11.

En un caso de la divulgación, el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo se seleccionan del grupo que consiste en: Beta-56 y Omi23. El dominio variable de la cadena pesada de estos anticuerpos se deriva de IGHV 4-31. Los anticuerpos de cadena mixta resultantes figuran en la Tabla 12. Por lo tanto, los anticuerpos aquí divulgados pueden comprender los seis CDRs (CDRH1-3 y CDRL1-3), y/o un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera, cada uno de los cuales comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % (por ejemplo >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, > 99% o 100 %) de identidad de secuencia con el dominio variable correspondiente de cualquiera de los anticuerpos de cadena mixta según se establece en la Tabla 12.

Los dominios de región constante de una molécula de anticuerpo de la presente divulgación, si están presentes, pueden seleccionarse teniendo en cuenta la función propuesta de la molécula de anticuerpo, y en particular las funciones efectoras que puedan requerirse. Por ejemplo, los dominios de la región constante pueden ser dominios IgA, IgD, IgE, IgG o IgM humanos. Normalmente, las regiones constantes son de origen humano. En particular, pueden utilizarse dominios de región constante de IgG humana (es decir, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4). Típicamente, la región constante es una región constante IgG1 humana.

Divulgación de determinados anticuerpos presentes

También se divulga en el presente documento, pero no forma parte de la invención reivindicada, un anticuerpo que es un anticuerpo de longitud completa de cualquiera de los anticuerpos de las Tablas 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12. En otras palabras, el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera consistentes en el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera, respectivamente, de cualquiera de los anticuerpos de las Tablas 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12, y una región constante IgG (por ejemplo IgG1).

Por ejemplo, el anticuerpo puede ser un anticuerpo Omi02, Omi03, Omi12, Omi18, Omi28, Omi39 u Omi42 de longitud completa. El anticuerpo puede ser de longitud completa Omi03, Omi12, Omi02, Omi39, Omi42, Omi16, Omi18, Omi20, Omi 23, Omi28, Omi08, Omi17, Omi29, Omi36 u Omi38. Estos anticuerpos son todos mAbs neutralizantes altamente potentes que han demostrado neutralizar la variante Omicron del SARS-CoV-2 con un IC50 de < 0.1 |jg/ml. Los anticuerpos también conservan la neutralización deinter aliaal menos las cepas Victoria, Alfa, Beta, Gamma y Delta de SARS-CoV-2 con un IC50 de < 0.1 jg/ml.

El anticuerpo puede derivar de la cadena pesada germinal IGHV1-58 y comprende prolina en la posición 53 de la región variable de la cadena pesada (según la numeración absoluta). Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada de Omi-12 (SEQ ID NO: 731), Beta-47 (SEQ ID NO: 591), Beta-25 (SEQ ID NO: 461), anticuerpo 55 (SEQ ID NO: 62), anticuerpo 165 (SEQ ID NO: 182), anticuerpo 253 (SEQ ID NO: 262), o el anticuerpo 318 (SEQ ID NO: 332), con la salvedad de que el aminoácido en la posición 53 de la región variable de la cadena pesada es prolina (según la numeración absoluta). Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera de Beta-47 (SEQ ID NOs: 591 y 592, respectivamente), Beta-25 (s Eq ID n Os: 461 y 462, respectivamente), el anticuerpo 55 (SEQ ID NOs: 62 y 61, respectivamente), el anticuerpo 165 (SEQ ID N<o>: 182 y 181, respectivamente), el anticuerpo 253 (<s>E<q>ID NOs: 262 y 261, respectivamente), o el anticuerpo 318 (SEQ ID NOs: 332 y 331, respectivamente), excepto con una mutación V53P en la región variable de la cadena pesada. Los inventores descubrieron que dichos anticuerpos son particularmente eficaces contra las cepas Omicron (por ejemplo, véase el Ejemplo 5).

La posición 53 en la región variable de la cadena pesada de los anticuerpos derivados de IGHV1-58 Omi-12, Beta-47, Beta-25, anticuerpo 55, anticuerpo 165, anticuerpo 253 y anticuerpo 318 corresponde a la posición 58 según la numeración IMGT.

Por consiguiente, también se divulga en el presente documento, pero no dentro del alcance de la invención reivindicada, un anticuerpo derivado de la cadena pesada de la línea germinal IGHV1-58, capaz de unirse a la proteína spike del coronavirus SARS-CoV-2, en el que el aminoácido en la posición 58 en la región variable de la cadena pesada según la numeración IMGT es prolina o está sustituido con prolina.

El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo derivado de la cadena pesada germinal IGHV1-58, con la condición de que el aminoácido en la posición 58 según la numeración IMGT sea prolina o esté sustituido por prolina.

El anticuerpo derivado de la cadena pesada de la línea germinal IGHV1-58 puede ser AZD8895, Omi-12, Beta-47, Beta-25, anticuerpo 55, anticuerpo 165, anticuerpo 253 o anticuerpo 318. La secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de Omi-12, Beta-47, Beta-25, anticuerpo 55, anticuerpo 165, anticuerpo 253 o anticuerpo 318 se describe en el presente documento (por ejemplo, véanse las Tablas 1 a 3). La secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo AZD8895 se proporciona en la SEQ ID NO: 963.

La secuencia del gen V de la línea germinal IGHV1-58 codifica la secuencia de aminoácidos:

MQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGFTFTSSAVQWVRQARGQRLEWIGWIVVGS GNTNYAQKFQERVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAA (SEQ ID NO: 961).

Por lo tanto, la presente divulgación también proporciona un anticuerpo capaz de unirse a la proteína spike del coronavirus SARS-CoV-2 que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene >60 %, >70 %, >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 961, con la condición de que el aminoácido en la posición 58 según la numeración IMGT sea prolina o esté sustituido por prolina.

El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprenda una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 731, 591,461, 62, 182, 262, 332 o 963, con la condición de que el aminoácido en la posición 58 según la numeración IMGT sea prolina o esté sustituido por prolina. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene SEQ ID NO: 591 461, 62, 182, 262 o 332, en el que la valina en la posición 58 según la numeración IMGT está sustituida por prolina.

El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene SEQ ID NO: 963, en el que la isoleucina en la posición 58 según la numeración IMGT está sustituida por prolina.

También divulgado aquí pero no parte de la invención actualmente reivindicada, el anticuerpo es un anticuerpo derivado de la cadena pesada germinal IGHV1-58, comprende un dominio variable de cadena ligera derivado de IGLV Kappa 3-20. El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda una secuencia de aminoácidos que tenga >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con el dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo derivado de IGLV Kappa 3-20 de línea germinal. La secuencia IGLV Kappa 3-20V de la línea germinal puede codificar la secuencia de aminoácidos: EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAT GIPDRFSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSP (SEQ ID NO: 967). Por lo tanto, el anticuerpo derivado de la cadena pesada germinal IGHV1-58 puede comprender un dominio variable de cadena ligera que comprenda una secuencia de aminoácidos que tenga >60 %, >70 %, >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 % o 100 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 967.

También se divulga en el presente documento, pero no forma parte de la invención reivindicada, un anticuerpo capaz de unirse a la proteína spike del coronavirus SARS-CoV-2 que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es una versión modificada de la SEQ ID NO: 961, con la condición de que el aminoácido en la posición 58 según la numeración IMGT sea prolina o esté sustituido por prolina. La versión modificada de la SEQ ID NO: 961 puede comprender una modificación tal como se describe en el presente documento, por ejemplo, una sustitución, supresión y/o adición. Por ejemplo, la modificación puede comprender <50, <45, <40, <35, <30, <25, <20, <15, <10, <9, <8,<7,<6, <5, <4, <3, <2, o 1 sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de la SEQ ID NO: 961. La modificación puede comprender <4, <3, <2, o 1 sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de la SEQ ID NO: 961.

El anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es una versión modificada de la SEQ ID NO: 731, 591, 461, 62, 182, 262, 332 o 963 que comprende <10, <9, <8, <7, <6, <5, <4, <3, <2, o 1 modificaciones, con la condición de que el aminoácido en la posición 58 según la numeración IMGT sea prolina o esté sustituido por prolina. La versión modificada de la SEQ ID NO: 731,591,461,62, 182, 262, 332 o 963 pueden comprender una modificación como la descrita en el presente documento, por ejemplo, una sustitución, supresión y/o adición.

El anticuerpo puede comprender una región constante IgG (por ejemplo, IgG1).

También se divulga en el presente documento, pero no forma parte de la invención reivindicada, un método de preparación de dichos anticuerpos. Por ejemplo, el método puede comprender la modificación de un anticuerpo derivado de la cadena pesada de la línea germinal IGHV1-58, capaz de unirse a la proteína spike del coronavirus SARS-CoV-2, mediante la sustitución del aminoácido en la posición 58 de la región variable de la cadena pesada (según la numeración IMGT) por prolina. El anticuerpo derivado de la cadena pesada de la línea germinal IGHV1-58 puede ser AZD8895, Omi-12, Beta-47, Beta-25, anticuerpo 55, anticuerpo 165, anticuerpo 253 o anticuerpo 318. La secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada de cada uno de estos anticuerpos se describe en el presente documento (por ejemplo, véanse las Tablas 1 a 3 y la SEQ ID NO: 963). La presente divulgación también proporciona un anticuerpo obtenible u obtenido por el método.

Propiedades de los anticuerpos

También se divulgan en el presente documento, pero no forman parte de la invención reivindicada, anticuerpos que pueden ser o comprender una modificación de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de las Tablas 1 a 12, manteniendo al mismo tiempo la actividad y/o función del anticuerpo. La modificación puede consistir en una sustitución, supresión y/o

adición. Por ejemplo, la modificación puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, hasta 10, hasta 20, hasta 30 o más sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de las tablas 1 a 12. Por ejemplo, la modificación puede comprender un aminoácido sustituido por un aminoácido alternativo que tenga propiedades similares. Algunas propiedades de los 20 aminoácidos principales, que pueden utilizarse para seleccionar los sustituyentes adecuados, son las siguientes:

La modificación puede comprender un aminoácido derivado, por ejemplo, un aminoácido marcado o no natural, siempre que la función del anticuerpo no se vea afectada negativamente de forma significativa.

La modificación de anticuerpos de la presente divulgación como se ha descrito anteriormente puede prepararse durante la síntesis del anticuerpo o mediante modificación posterior a la producción, o cuando el anticuerpo está en forma recombinante utilizando las técnicas conocidas de mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis aleatoria, o escisión enzimática y/o ligadura de ácidos nucleicos.

Los anticuerpos de la presente divulgación pueden modificarse (por ejemplo, como se ha descrito anteriormente) para mejorar la potencia de dichos anticuerpos o para adaptar dichos anticuerpos a nuevas variantes de SARS-CoV-2. Las modificaciones pueden ser sustituciones de aminoácidos para adaptar el anticuerpo a sustituciones en una variante del virus. Por ejemplo, el modo conocido de unión de un anticuerpo a la proteína spike (por ejemplo, mediante la determinación de la estructura cristalina o el modelado) puede utilizarse para identificar los aminoácidos del anticuerpo que interactúan con la sustitución en la variante del virus. Esta información puede utilizarse para identificar posibles sustituciones del anticuerpo que compensen el cambio en las características del epítopo. Por ejemplo, la sustitución de un aminoácido hidrófobo de la proteína spike por un aminoácido con cambios negativos puede compensarse sustituyendo el aminoácido del anticuerpo que interactúa con dicho aminoácido de la proteína spike por un aminoácido con carga positiva. La presente divulgación abarca métodos para identificar residuos de un anticuerpo que pueden ser sustituidos, por ejemplo, mediante la determinación de la estructura de complejos anticuerpo-antígeno como se describe en el presente documento.

Los anticuerpos de la presente divulgación pueden contener una o más modificaciones para aumentar su propiedad de neutralización entre linajes. Por ejemplo, E484 de la proteína spike, que es un residuo clave que media la interacción con ACE2, está mutado en algunas cepas de SARS-CoV-2 (por ejemplo, la cepa Victoria que contiene E484, pero las cepas P.1 y B.1.351 contienen E484K), lo que da lugar a diferentes efectos de neutralización de los anticuerpos. Así, los anticuerpos que se unen a E484 pueden modificarse para compensar los cambios en E484 de la proteína spike. Por ejemplo, E484 ha mutado de un aminoácido con carga positiva a uno con carga negativa en las cepas SAR-CoV-2 de linaje B.1.351 o P.1, en comparación con la cepa original. Los residuos de aminoácidos de los anticuerpos que se unen a o cerca de E484 pueden mutarse para compensar el cambio de carga. Ejemplos de tales residuos de aminoácidos pueden ser G104 y/o K108 en la SEQ ID NO: 102 del anticuerpo 88, o R52 en la SEQ ID NO: 372 de anticuerpo 384.

Los anticuerpos de la invención pueden ser anticuerpos aislados. Un anticuerpo aislado es un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas.

El término "anticuerpo", tal como se utiliza aquí, puede referirse a anticuerpos enteros (es decir, que comprenden los elementos de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras interconectadas por enlaces disulfuro), así como a fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Los anticuerpos suelen comprender porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina (Ig), es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona con) un antígeno. Por "se une específicamente" o "inmunorreacciona con" se entiende que el anticuerpo reacciona con uno o más determinantes antigénicos del antígeno deseado y no reacciona con otros polipéptidos. Cada cadena pesada se compone de una región variable de cadena pesada (abreviada aquí como HCVR o VH) y al menos una región constante de cadena pesada. Cada cadena ligera se compone de una región variable de cadena ligera (abreviada aquí como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones VH y VL pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR).

Los anticuerpos pueden incluir, entre otros, policlonales, monoclonales, quiméricos, dAb (anticuerpo de dominio), de cadena única, Fab, Fab' y fragmentos F(ab')2, scFvs y bibliotecas de expresión Fab.

Un anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales (mAbs) de la invención pueden producirse mediante diversas técnicas, incluida la metodología convencional de anticuerpos monoclonales, por ejemplo las descritas en "Monoclonal Antibodies: a manual of techniques" (Zola H, 1987, CRC Press) y en "Monoclonal Hybridoma Antibodies: techniques and applications" (Hurrell JGR, 1982 CRC Press). Un anticuerpo de la invención puede ser multiespecífico, como por ejemplo biespecífico. Un anticuerpo biespecífico de la invención se une a dos epítopos diferentes. Los epítopos pueden estar en la misma proteína (por ejemplo, dos epítopos en la proteína spike del SARS-CoV-2) o en proteínas diferentes (por ejemplo, un epítopo en la proteína spike y un epítopo en otra proteína (como la proteína de cubierta) del SARS-CoV-2).

En una realización, un anticuerpo biespecífico de la invención puede unirse a dos epítopos separados en la proteína spike del SARS-CoV-2. El anticuerpo biespecífico puede unirse al NTD de la proteína spike y al RBD de la proteína spike El anticuerpo biespecífico puede unirse a dos epítopos diferentes en el RBD de la proteína spike.

Uno o más (por ejemplo, dos) anticuerpos de la invención pueden acoplarse para formar un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, biespecífico). Los métodos para preparar anticuerpos multiespecíficos, por ejemplo biespecíficos, son bien conocidos en la técnica.

Un anticuerpo puede seleccionarse del grupo formado por anticuerpos de cadena simple, fragmentos variables de cadena simple (scFvs), fragmentos variables (Fvs), fragmentos de regiones de unión a antígeno (Fabs), anticuerpos recombinantes, anticuerpos monoclonales, proteínas de fusión que comprenden el dominio de unión a antígeno de un anticuerpo nativo o un aptámero, anticuerpos de dominio único (sdAbs), también conocidos como anticuerpos VHH, nanocuerpos (anticuerpos de dominio único derivados de camélidos), fragmentos de anticuerpos de dominio único derivados de IgNAR de tiburón denominados VNAR, diabodies, triabodies, anticalinas, aptámeros (ADN o ARN) y componentes activos o fragmentos de los mismos.

Los dominios de región constante de una molécula de anticuerpo de la invención, si están presentes, pueden seleccionarse teniendo en cuenta la función propuesta de la molécula de anticuerpo, y en particular las funciones efectoras que puedan requerirse. Por ejemplo, los dominios de la región constante pueden ser dominios IgA, IgD, IgE, IgG o IgM humanos. Normalmente, las regiones constantes son de origen humano. En particular, pueden utilizarse dominios de región constante de IgG humana (es decir, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4). Típicamente, la región constante es una región constante IgG1 humana.

La región constante de la cadena ligera puede ser lambda o kappa.

Los anticuerpos de la invención pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos). Un anticuerpo multiespecífico comprende al menos dos dominios variables diferentes, en los que cada dominio variable es capaz de unirse a un antígeno separado o a un epítopo diferente del mismo antígeno.

Un anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo quimérico, un anticuerpo injertado con CDR, un nanocuerpo, un anticuerpo humano o humanizado. Típicamente, el anticuerpo es un anticuerpo humano. Los anticuerpos totalmente humanos son aquellos anticuerpos en los que las regiones variables y las regiones constantes (cuando están presentes) tanto de la cadena pesada como de la ligera son todas de origen humano, o sustancialmente idénticas a secuencias de origen humano, pero no necesariamente del mismo anticuerpo.

El anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo de longitud completa.

El anticuerpo de la invención puede ser un fragmento de unión a antígeno. Un fragmento de unión a antígeno de la invención se une al mismo epítopo del anticuerpo progenitor, es decir, el anticuerpo del que deriva el fragmento de unión a antígeno. Un fragmento de unión a antígeno de la invención conserva las partes del anticuerpo original que interaccionan con el epítopo. El fragmento de unión al antígeno comprende las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) que interactúan con el antígeno. El fragmento de unión a antígeno comprende además el andamiaje estructural que rodea las CDR del anticuerpo original, como los dominios de región variable de las cadenas pesada y/o ligera. Normalmente, el fragmento de unión al antígeno conserva la misma o similar afinidad de unión al antígeno que el anticuerpo original.

Un fragmento de unión a antígeno no tiene por qué tener una secuencia idéntica a la del anticuerpo original. También se divulgan en el presente documento, pero no forman parte de la invención reivindicada, fragmentos de unión a antígeno que pueden tener >70 %, >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 %, 100 % de identidad de secuencia con las CDRs respectivas del anticuerpo original. En un caso de la divulgación, el fragmento de unión a antígeno puede tener >70 %, >80 %, >90 %, >95 %, >96 %, >97 %, >98 %, >99 %, 100 % de identidad de secuencia con los respectivos dominios de región variable del anticuerpo parental. Normalmente, los aminoácidos no idénticos de una región variable no se encuentran en las CDRs.

Los fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos de la invención conservan la capacidad de unirse selectivamente a un antígeno. Los fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos incluyen anticuerpos de cadena simple (es decir, una cadena pesada y una cadena ligera de longitud completa); Fab, Fab modificado, Fab', Fab' modificado, F(ab')2, Fv, Fab-Fv, Fab-dsFv, anticuerpos de dominio único (por ejemplo, VH o VL o VHH), scFv.

La función de unión al antígeno de un anticuerpo puede ser desempeñada por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los métodos para crear y fabricar estos fragmentos de anticuerpos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Verma R et al., 1998, J. Immunol. Methods, 216, 165-l8 l).

También se divulgan en el presente documento, pero no forman parte de la invención reivindicada, métodos para seleccionar anticuerpos que no comparten el 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con uno de los anticuerpos divulgados en el presente documento, que poseen la especificidad, afinidad y actividad funcional deseadas, incluidos los métodos descritos en el presente documento, por ejemplo, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas, biacore, ensayo de neutralización por reducción de foco (FRNT) y otras técnicas conocidas en la técnica.

Con respecto a la función, un anticuerpo de la invención puede ser capaz de neutralizar al menos una actividad biológica del SAR-CoV-2 (un anticuerpo neutralizante), en particular para neutralizar la infectividad del virus.

La neutralización también puede determinarse utilizando los valores IC50 o IC90. Por ejemplo, el anticuerpo puede tener un valor IC50 de <0.1jig/ml, <0.05jig/ml, <0.01jig/ml <0.005jig/ml o <0.002jig/ml. En algunos casos, un anticuerpo de la invención puede tener un valor IC50 de entre 0.0001 jig/ml y 0.1 jig/ml, a veces entre 0.0001jig/ml y 0.05 jig/ml o incluso entre 0.0001 jig/ml y 0.001 jig/ml.

Por ejemplo, los valores IC50 de algunos de los anticuerpos de las Tablas 1 a 12 se proporcionan en las Tablas 13 a 16.

La capacidad de un anticuerpo para neutralizar la infectividad del virus puede medirse utilizando un ensayo apropiado, en particular utilizando un ensayo de neutralización basado en células, como se muestra en los Ejemplos. Por ejemplo, la capacidad de neutralización puede medirse en un ensayo de neutralización por reducción de foco (FRNT) en el que la reducción del número de células (por ejemplo, células humanas) infectadas con el virus (por ejemplo, durante 2 horas a 37 °C) en presencia del anticuerpo se compara con un control negativo en el que no se añadieron anticuerpos.

Un anticuerpo de la invención puede bloquear la interacción entre la proteína spike del SAR-CoV-2 con el receptor de superficie celular, la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2), de la célula diana, por ejemplo, por bloqueo directo o por alteración de la conformación de pre-fusión de la proteína spike.

El bloqueo de la interacción entre la spike y ACE2 puede ser total o parcial. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede reducir la formación de spike-ACE2 en >50 %, >60 %, >70 %, >80 %, >90 %, >95 %, >99 % o 100 %. El bloqueo de la formación de spike-ACE2 puede medirse por cualquier medio adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, mediante ELISA.

La mayoría de los anticuerpos que mostraron neutralización también mostraron bloqueo de la interacción entre la proteína spike y ACE2. Además, varios anticuerpos no neutralizantes son buenos bloqueadores del ACE2.

En términos de cinética de unión, un anticuerpo de la invención puede tener un valor de constante de afinidad (KD) para la proteína spike del SARS-CoV-2 de <5nM, <4nM, <3nM, <2nM, <1nM, <0.5nM, <0.4nM, <0.3nM, <0.2nM o <0.1nM.

El valor KD puede medirse por cualquier medio adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, por ELISA o Resonancia de Plasmón Superficial (Biacore) a 25 °C.

La afinidad de unión (KD) puede cuantificarse determinando la constante de disociación (Kd) y la constante de asociación (K<a>) para un anticuerpo y su diana. Por ejemplo, el anticuerpo puede tener una constante de asociación (K<a>) de > 10000 M<- V>, > 50000 M<' V 1>, > 100000 M<' V 1>, > 200000 M<' V 1>o > 500000 M<' V 1>, y/o una constante de disociación (Kd) de< 0.001 s<-1>, < 0.0005 s<-1>, < 0.004 s<-1>, < 0.003 s<-1>, < 0.002 s<-1>o < 0.0001 s<-1>.

Un anticuerpo de la invención es preferentemente capaz de proporcionar protecciónin vivoen animales infectados por coronavirus (por ejemplo, SARS-CoV-2). Por ejemplo, la administración de un anticuerpo de la invención a animales infectados por coronavirus (por ejemplo, SARS-CoV-2) puede dar lugar a una tasa de supervivencia de >30 %, >40 %, >50 %, >60 %, >70 %, >80 %, >90 %, >95 % o 100 %.

Las tasas de supervivencia pueden determinarse utilizando métodos rutinarios.

Los anticuerpos de la invención pueden tener cualquier combinación de una o más de las propiedades anteriores.

Los anticuerpos de la presente divulgación pueden unirse al mismo epítopo que, o competir por la unión a la proteína spike del SARS-CoV-2 con, cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento (es decir, en particular con anticuerpos con las regiones variables de cadena pesada y ligera descritas anteriormente). Los métodos para identificar anticuerpos que se unen al mismo epítopo, o que compiten entre sí, se utilizan en los Ejemplos y se discuten más adelante.

Regiones Fc

Un anticuerpo de la invención puede o no comprender un dominio Fc.

Los anticuerpos de la invención pueden modificarse en la región Fc para mejorar su estabilidad. Tales modificaciones son conocidas en la técnica. Las modificaciones pueden mejorar la estabilidad del anticuerpo durante su almacenamiento. La semividain vivodel anticuerpo puede mejorarse modificando la región Fc. Por ejemplo, pueden introducirse residuos de cisteína en la región Fc, permitiendo así la formación de enlaces disulfuro entre cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o un aumento de la destrucción celular mediada por complemento y de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). (Véase Caron et al., J. Exp Med., 176.) 1191-1195 (1992) y Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)).

Alternativamente, se puede diseñar un anticuerpo que tenga regiones Fc duales y que, por tanto, tenga capacidades mejoradas de lisis del complemento y ADCC. (Véase Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3.) 219-230 (1989)).

Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede modificarse para promover la interacción del dominio Fc con FcRn. El dominio Fc puede modificarse para mejorar la estabilidad del anticuerpo afectando a la interacción Fc y FcRn a pH bajo, como en el endosoma. La mutación M252Y/S254T/T256E (YTE) puede utilizarse para mejorar la vida media de un anticuerpo IgG1.

El anticuerpo puede modificarse para afectar a la interacción del anticuerpo con otros receptores, como FcyRI, F<cy>RIIA, FcyRIIB, F<cy>RIII y FcaR. Tales modificaciones pueden utilizarse para afectar a las funciones efectoras del anticuerpo.

En una realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio Fc alterado como se describe a continuación. En otra realización preferida, un anticuerpo de la invención comprende un dominio Fc, pero la secuencia del dominio Fc se ha alterado para modificar una o más funciones efectoras Fc.

En una realización, un anticuerpo de la invención comprende una región Fc "silenciada". Por ejemplo, en una realización, un anticuerpo de la invención no muestra la función o funciones efectoras asociadas con una región Fc normal. Una región Fc de un anticuerpo de la invención no se une a uno o más receptores Fc.

En una realización, un anticuerpo de la invención no comprende un dominio CH2. En una realización, un anticuerpo de la invención no comprende un dominio CH3. En una realización, un anticuerpo de la invención comprende dominios CH2 y/o CH3 adicionales.

En una realización, un anticuerpo de la invención no se une a receptores Fc. En una realización, un anticuerpo de la invención no se une al complemento. En una realización alternativa, un anticuerpo de la invención no se une a FcyR, pero sí se une al complemento.

En una realización, un anticuerpo de la invención en general puede comprender modificaciones que alteran la semivida sérica del anticuerpo. Por lo tanto, en otra realización, un anticuerpo de la invención tiene modificación(es) de la región Fc que alteran la semivida del anticuerpo. Tales modificaciones pueden estar presentes, así como las que alteran las funciones Fc. En una realización preferida, un anticuerpo de la invención tiene modificación(es) que alteran la semivida sérica del anticuerpo.

En una realización, un anticuerpo de la invención puede comprender una región constante humana, por ejemplo dominios IgA, IgD, IgE, IgG o IgM. En particular, pueden utilizarse dominios de región constante IgG humanos, especialmente de los isotipos IgG1 e IgG3 cuando la molécula de anticuerpo se destina a usos terapéuticos en los que se requieren funciones efectoras del anticuerpo. Alternativamente, los isotipos IgG2 e IgG4 pueden utilizarse cuando la molécula de anticuerpo se destina a fines terapéuticos y no se requieren funciones efectoras del anticuerpo.

En una realización, la cadena pesada del anticuerpo comprende un dominio CH1 y la cadena ligera del anticuerpo comprende un dominio CL, ya sea kappa o lambda. En una realización, la cadena pesada del anticuerpo comprende un dominio CH1, un dominio CH2 y un dominio CH3 y la cadena ligera del anticuerpo comprende un dominio CL, ya sea kappa o lambda.

Los cuatro isotipos de IgG humana se unen a los receptores activadores Fcy (FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIc, FcyRIIIa), al receptor inhibidor FcyRIIb y al primer componente del complemento (C1q) con diferentes afinidades, lo que da lugar a funciones efectoras muy diferentes (Bruhns P et al., 2009). Especificidad y afinidad de los receptores Fcy humanos y sus variantes polimórficas por las subclases de IgG humanas. Sangre. 113(16):3716-25), véase también Jeffrey B. Stavenhagen, et al. Cancer Research 2007 Sep 15; 67(18):8882-90. En una realización, un anticuerpo de la invención no se une a receptores Fc. En otra realización de la invención, el anticuerpo se une a uno o más tipos de receptores Fc.

En una realización, la región Fc empleada está mutada, en particular una mutación descrita en el presente documento. En una realización, la mutación Fc se selecciona del grupo que comprende una mutación para eliminar o mejorar la unión de la región Fc a un receptor Fc, una mutación para aumentar o eliminar una función efectora, una mutación para aumentar o disminuir la semivida del anticuerpo y una combinación de las mismas. En una realización, cuando se hace referencia al impacto de una modificación, puede demostrarse por comparación con el anticuerpo equivalente pero carente de la modificación.

Algunos anticuerpos que se unen selectivamente al FcRn a pH 6.0, pero no a pH 7.4, presentan una mayor semivida en diversos modelos animales. Varias mutaciones localizadas en la interfaz entre los dominios CH2 y CH3, como T250Q/M428L (Hinton PR. et al., 2004. Anticuerpos IgG humanos de ingeniería con vidas medias séricas más largas en primates. J Biol Chem. 279(8):6213-6) y M252Y/S254T/T256E H433K/N434F (Vaccaro C. et al., 2005. Ingeniería de la región Fc de la inmunoglobulina G para modular los niveles de anticuerpos in vivo. Nat Biotechnol. 23(10): 1283-8), se ha demostrado que aumentan la afinidad de unión al FcRn y la semivida de la IgG1in vivo.Por lo tanto, puede haber modificaciones en M252/S254/T256 H44/N434 que alteren la semivida sérica y, en particular, pueden estar presentes M252Y/S254T/T256E H433K/N434F. En una realización, se desea aumentar la semivida. En otra realización, se puede desear realmente disminuir la semivida sérica del anticuerpo, por lo que puede haber modificaciones que disminuyan la semivida sérica.

Se han realizado numerosas mutaciones en el dominio CH2 de la IgG1 humana y se ha probado su efecto sobre la ADCC y la CDCin vitro(Idusogie EE. et al., 2001. Anticuerpos de ingeniería con mayor actividad para reclutar el complemento. J Immunol. 166(4):2571-5). En particular, se informó de que la sustitución por alanina en la posición 333 aumentaba tanto la ADCC como la CDC. Por lo tanto, en una realización puede estar presente una modificación en la posición 333, y en particular una que altere la capacidad de reclutar el complemento. Lazaret al.describieron un mutante triple (S239D/I332E/A330L) con una mayor afinidad por FcyRIIIa y una menor afinidad porFcyRIIb que resulta en una ADCC mejorada (Lazar GA. et al., 2006). Por lo tanto, puede haber modificaciones en S239/I332/A330, en particular las que alteran la afinidad por los receptores Fc y, en particular, S239D/I332E/A330L . Variantes Fc de anticuerpos de ingeniería con función efectora mejorada. PNAS 103(11): 4005-4010). Las mismas mutaciones se utilizaron para generar un anticuerpo con mayor ADCC (Ryan MC. et al., 2007. Anticuerpos dirigidos contra el antígeno de maduración de células B en células plasmáticas malignas. Mol. Cancer Ther., 6: 3009 - 3018). Richardset al.estudiaron un mutante triple ligeramente diferente (S239D/I332E/G236A) con afinidad FcyRIIIa mejorada y relación FcyRIIa/FcyRIIb que media en la fagocitosis mejorada de células diana por macrófagos (Richards JO et al 2008. La optimización de la unión de anticuerpos a Fcgamma RIIa mejora la fagocitosis de células tumorales por los macrófagos. Mol Cancer Ther. 7(8):2517-27). En una realización, las modificaciones S239D/I332E/G236A pueden estar presentes.

En otra realización, un anticuerpo de la invención puede tener una región bisagra y/o región CH1 modificada. Alternativamente, el isotipo empleado puede elegirse por tener unas regiones de bisagra determinadas.

Grandes regiones V públicas

Las regiones V públicas, también descritas aquí como genes V públicos, son las regiones V de las regiones de cadena pesada y cadena ligera de la línea germinal que se encuentran en una gran proporción de las respuestas de anticuerpos al SARS-CoV-2 encontradas en la población. En esta aplicación, las regiones V son respuestas específicas a la variante Beta SARS-CoV-2. Es decir, muchos individuos utilizan las mismas v-regiones de su repertorio de v-regiones de la línea germinal cuando generan una respuesta inmunitaria a las variantes del SARS-CoV-2.

Tal como se utiliza aquí, un anticuerpo "derivado" de una v-región específica se refiere a anticuerpos que fueron generados por recombinación V(D)J utilizando esa secuencia de v-región de línea germinal. Por ejemplo, la secuencia de la v-región IGHV3-53 de la línea germinal puede someterse a recombinación somática y mutación somática para llegar a un anticuerpo que se una específicamente a la proteína spike del SARS-CoV-2. Es poco probable que la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo comprenda una secuencia idéntica a la secuencia de la línea germinal IGHV3-53, no obstante, el anticuerpo sigue derivando de esta región v. Los anticuerpos divulgados en el presente documento normalmente no comprenden más que mutaciones no silentes en la región v, cuando se comparan con la secuencia de la línea germinal, tales como no más de 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5,4, 3, 2 o 1 mutaciones no silentes. Los anticuerpos divulgados en el presente documento normalmente no comprenden entre 2-20 mutaciones no silentes en la región v, en comparación con la secuencia de la línea germinal, tales como entre 5-15, 6-13 y 7-12 mutaciones no silentes. Las secuencias de la región v de la línea germinal son bien conocidas en la técnica, y los métodos para identificar si una determinada región de un anticuerpo deriva de una secuencia particular de la región v de la línea germinal también son bien conocidos en la técnica.

También se da a conocer en el presente documento, pero no forma parte de la invención reivindicada, un anticuerpo derivado de una región v seleccionada de IGHV3-53, IGHV1-58, IGHV3-66, IGHV1-69, IGHV3-30, IGHV3-33, IGHV1-18, IGHV13-9 o IGHV4-31. Los inventores descubrieron que los potentes anticuerpos neutralizantes identificados en el presente documento comprendían relativamente pocas mutaciones en las CDRs de estas regiones v. Así, también se divulga en el presente documento pero no forma parte de la invención reivindicada actualmente un anticuerpo codificado por una región v seleccionada de IGHV3-53, IGHV1-58, IGHV3-66, IGHV1-69, IGHV3-30, IGHV3-33, IGHV1-18, IGHV13-9 o IGHV4-31 y que tiene 2-20 mutaciones nucleotídicas no silenciosas, o 5-15 mutaciones no silenciosas, como 15 o menos, 14 o menos, 13 o menos, 12 o menos, 11 o menos, 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos o 2 mutaciones no silenciosas en comparación con la secuencia de línea germinal natural. Una mutación silenciosa, tal como se define en el presente documento, es un cambio en la secuencia de nucleótidos sin un cambio en la secuencia de aminoácidos para la que codifica la secuencia de nucleótidos. Una mutación no silenciosa es, por tanto, una mutación que provoca un cambio en la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos.

La región variable de cadena ligera de dos anticuerpos que tengan la misma región v de cadena pesada puede intercambiarse para producir un anticuerpo de cadena mixta que comprenda la región variable de cadena pesada de un primer anticuerpo y la región variable de cadena ligera de un segundo anticuerpo. Por ejemplo, ambos anticuerpos pueden comprender una región variable de cadena pesada derivada de IGHV3-53. Preferiblemente, ambos anticuerpos también comprenden una región variable de cadena ligera derivada de la misma región v de cadena ligera, aunque esto no es esencial porque, por ejemplo, la cadena ligera del anticuerpo 222 puede emparejarse con cualquier región variable de cadena pesada derivada de IGHV3-53 y dar lugar a un anticuerpo neutralizante potente. Como se ha descrito anteriormente, los dos anticuerpos pueden comprender una región variable de cadena pesada derivada de IGHV3-53 y/o IGHV3-66.

También se divulga en el presente documento, pero no forma parte de la invención actualmente reivindicada, un anticuerpo que comprende las CDRs de un dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo derivado de una región v pública principal seleccionada de IGHV3-53, IGHV1-58, IGHV3-66, IGHV4-39, IGHV3-30, IGHV5-51, IGHV1-02 o IGHV3-33, tales como los anticuerpos Omi03, Omi18, Omi29, Beta-27, anticuerpo 150, anticuerpo 158, anticuerpo 175, anticuerpo 222 y anticuerpo 269 para IGHV3-53, los anticuerpos Omi16, Omi17, Omi20, Omi27, Omi36, anticuerpo 40 y anticuerpo 398 para IGHV3-66, anticuerpos Omi12, Beta-47, Beta-25, anticuerpo 55, anticuerpo 165, anticuerpo 253 para IGHV1-58, anticuerpos Beta-49, Beta-50, Omi02, Omi24, Omi30, Omi31, Omi34 y Omi38 para IGHV1-69, anticuerpos Beta-22, Beta-29, anticuerpos 159 y Omi09 para IGHV3-30, anticuerpo Beta-20, Beta-43, Omi32 y Omi 33 para IGHV3-33, anticuerpos anticuerpo 278, Beta-44, Omi26 y Omi41 para IGHV1-18, anticuerpos 58, Omi25, Omi35 y Omi42 para IGHV3-9, o anticuerpos Beta-56 y Omi23 para IGHV4-31. Las SEQ ID NOs correspondientes a las CDRs de cada uno de estos anticuerpos se muestran en las Tablas 1, 2 y 3.

También se divulga en el presente documento, pero no forma parte de la invención reivindicada actualmente, un anticuerpo que comprende el dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo derivado de una región v pública mayor seleccionada de IGHV3-53, IGHV1-58, IGHV3-66, IGHV4-39, IGHV3-30, IGHV5-51, IGHV1-02 o IGHV3-33, tales como los anticuerpos Omi03, Omi18, Omi29, Beta-27, anticuerpo 150, anticuerpo 158, anticuerpo 175, anticuerpo 222 y anticuerpo 269 para IGHV3-53, los anticuerpos Omi16, Omi17, Omi20, Omi27, Omi36, anticuerpo 40 y anticuerpo 398 para IGHV3-66 anticuerpos Omi12, Beta-47, Beta-25, anticuerpo 55, anticuerpo 165, anticuerpo 253 para IGHV1-58, anticuerpos Beta-49, Beta-50, Omi02, Omi24, Omi30, Omi31, Omi34 y Omi38 para IGHV1-69, anticuerpos Beta-22, Beta-29, anticuerpo 159 y Omi09 para IGHV3-30, anticuerpos Beta-20, Beta-43, Omi32 y Omi 33 para IGHV3-33, anticuerpos anticuerpo 278, Beta-44, Omi26 y Omi41 para IGHV1-18, anticuerpos 58, Omi25, Omi35 y Omi42 para IGHV3-9, o anticuerpos Beta-56 y Omi23 para IGHV4-31. Las SEQ ID NOs correspondientes a las CDRs de cada uno de estos anticuerpos se muestran en las Tablas 1, 2 y 3.

También se divulga en el presente documento, pero no forma parte de la invención reivindicada, un método para generar un anticuerpo que se une específicamente a la proteína spike del SARS-CoV-2 (por ejemplo, una cepa de SARS-CoV-2 de los linajes Alfa, Beta, Gamma, Delta y/u Omicron), el método comprende la identificación de dos o más anticuerpos derivados de las mismas regiones v de la cadena ligera y/o de la cadena pesada, reemplazando la cadena ligera de un primer anticuerpo por la cadena ligera de un segundo anticuerpo, para generar así un anticuerpo de cadena mixta que comprende la cadena pesada del primer anticuerpo y la cadena ligera del segundo anticuerpo. En un caso, el método comprende además determinar la afinidad por y/o la neutralización del SARS-CoV-2 del anticuerpo de cadena mixta. El método puede comprender además la comparación de la afinidad del anticuerpo de cadena mixta con la de los anticuerpos primero y/o segundo. El método puede comprender además la selección de un anticuerpo de cadena mixta que tenga la misma o mayor afinidad que los anticuerpos primero y/o segundo. En algunos casos, la región v de cadena pesada es IGHV 1- 58 y/o la región v de cadena ligera es IGLV Kappa 3-20.

También se divulga en el presente documento, pero no forma parte de la invención reivindicada, un anticuerpo que se une específicamente a la variante Omicron del SARS-CoV-2, en el que el anticuerpo tiene una región v derivada de IGHV1-69. Se ha descubierto sorprendentemente que la respuesta de los anticuerpos a la infección con la variante Omicron del SARS-CoV-2 está sesgada hacia los anticuerpos con una región variable de cadena pesada derivada de IGHV1-69. En un caso, en el que la cadena pesada del anticuerpo se deriva de IGHV1-69, el anticuerpo de la divulgación comprende los CDRH1, CDRH2 y CDRH3 de Beta-49, Beta-50, Omi02, Omi24, Omi30, Omi31, Omi34 y Omi38.

Conjugados de anticuerpo

También se describen en el presente documento, pero no forman parte de la invención reivindicada, inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico como una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado). Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico pueden realizarse utilizando una variedad de agentes bifuncionales de acoplamiento de proteínas conocidos en la técnica.

Un anticuerpo de la invención puede conjugarse con una molécula que module o altere la semivida sérica. Un anticuerpo de la invención puede unirse a la albúmina, por ejemplo para modular la semivida sérica. En una realización, un anticuerpo de la invención también incluirá una región de unión específica para la albúmina. En otra realización, un anticuerpo de la invención puede incluir un enlazador peptídico que es un péptido de unión a albúmina. En los documentos WO2015/197772 y WO2007/106120 se incluyen ejemplos de péptidos de unión a albúmina.

Polinucleótidos, vectores y células hospedantes

La invención también proporciona uno o más polinucleótidos aislados (por ejemplo, ADN) que codifican el anticuerpo de la invención. En una realización, la secuencia polinucleotídica está presente colectivamente en más de un polinucleótido, pero colectivamente juntos son capaces de codificar un anticuerpo de la invención. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden codificar las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo de la invención. Los polinucleótidos pueden codificar la cadena pesada y ligera completa de un anticuerpo de la invención. Normalmente, un polinucleótido codificaría cada una de las cadenas pesada y ligera.

Los polinucleótidos que codifican un anticuerpo de la invención pueden obtenerse por métodos bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, las secuencias de ADN que codifican parte o la totalidad de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo pueden sintetizarse como se desee a partir de las secuencias de aminoácidos correspondientes. Los métodos generales por los que pueden construirse los vectores, los métodos de transfección y los métodos de cultivo son bien conocidos por los expertos en la técnica. A este respecto, se remite a "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, Nueva York y al Manual Maniatis elaborado por Cold Spring Harbor Publishing. Un polinucleótido de la invención puede proporcionarse en forma de un casete de expresión, que incluye secuencias de control enlazadas operablemente a la secuencia insertada, permitiendo así la expresión del anticuerpo de la invenciónin vivo..Por lo tanto, la invención también proporciona uno o más casetes de expresión que codifican uno o más polinucleótidos que codifican un anticuerpo de la invención. Estos casetes de expresión, a su vez, se proporcionan típicamente dentro de vectores (por ejemplo, plásmidos o vectores virales recombinantes). Por lo tanto, en una realización, la invención proporciona un vector que codifica un anticuerpo de la invención. En otra realización, la invención proporciona vectores que codifican colectivamente un anticuerpo de la invención. Los vectores pueden ser vectores de clonación o vectores de expresión. Un vector adecuado puede ser cualquier vector capaz de transportar una cantidad suficiente de información genética y permitir la expresión de un polipéptido de la invención. Los polinucleótidos, casetes de expresión o vectores de la invención se introducen en una célula huésped, por ejemplo mediante transfección. Por lo tanto, la invención también proporciona una célula hospedante que comprende uno o más polinucleótidos, casetes de expresión o vectores de la invención. Los polinucleótidos, casetes de expresión o vectores de la invención pueden introducirse transitoria o permanentemente en la célula hospeante, permitiendo la expresión de un anticuerpo a partir de uno o más polinucleótidos, casetes de expresión o vectores. Dichas células huésped incluyen líneas celulares eucariotas superiores transitorias, o preferiblemente estables, como células de mamíferos o de insectos, células eucariotas inferiores, como levaduras, o células procariotas, como células bacterianas. Ejemplos particulares de células incluyen células HEK293 de mamífero, como HEK293F,HEK293T, HEK293S o HEK Expi293F, CHO, HeLa, NS0 y<c>O<s>, o cualquier otra línea celular utilizada en el presente documento, como las utilizadas en los Ejemplos. Preferiblemente, la línea celular seleccionada será una que no sólo sea estable, sino que también permita una glicosilación madura.

La invención también proporciona un proceso para la producción de un anticuerpo de la invención, que comprende cultivar una célula hospedante que contiene uno o más vectores de la invención en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo a partir de uno o más polinucleótidos de la invención, y aislar el anticuerpo de dicho cultivo.

Combinación de anticuerpos

Ciertos anticuerpos de la Tabla 3 son particularmente eficaces cuando se utilizan en combinación, y ciertas combinaciones de anticuerpos de la Tabla 3, la Tabla 2 y la Tabla 1, por ejemplo para minimizar la pérdida de actividad debida a las variantes de SARS-CoV-2, maximizan los efectos terapéuticos y/o aumentan el poder diagnóstico. Las combinaciones útiles incluyen los anticuerpos que no compiten entre sí y/o se unen a epítopos que no se solapan.

Así pues, también se divulga en el presente documento, pero no forma parte de la invención reivindicada, una combinación de los anticuerpos , en la que cada anticuerpo es capaz de unirse a la proteína spike del coronavirus SARS-CoV-2, en la que al menos un anticuerpo comprende al menos tres CDRs de cualquiera de los 28 anticuerpos de la Tabla 3.

Una combinación de los anticuerpos de la presente divulgación puede ser útil como cóctel terapéutico. Por lo tanto, también se divulga en el presente documento, pero no forma parte de la invención reivindicada, una composición farmacéutica que comprende una combinación de los anticuerpos de la presente divulgación, como se explica más adelante.

Una combinación de los anticuerpos de la presente divulgación puede ser útil para el diagnóstico. Por lo tanto, la presente divulgación también proporciona un kit de diagnóstico que comprende una combinación de los anticuerpos de la presente divulgación. También se proporcionan aquí métodos para diagnosticar una enfermedad o complicación asociada con infecciones por coronavirus en un sujeto, como se explica más adelante. Un anticuerpo de neutralización cruzada completa, por ejemplo Omi03, puede utilizarse como referencia para confirmar la presencia y/o cantidad de cualquier variante preocupante (VoC) SARS-CoV-2 en la muestra. Un anticuerpo que se une a un número limitado de VoC puede utilizarse para confirmar la presencia y/o cantidad de ese VoC en la muestra. Por ejemplo, si Omi03 muestra unión a la muestra pero Omi24 no muestra unión a la muestra de SARS-CoV-2, entonces la proteína spike puede ser la proteína spike del VoC Delta. Esto puede determinarse por cualquier método conocido por el experto, como por ejemplo mediante un inmunoensayo, por ejemplo un ELISA o un ensayo inmunocromatográfico. La reducción de la unión puede determinarse por comparación y/o normalización con la referencia, y/o por comparación con muestras o datos de control positivos/negativos.

Composición farmacéutica

La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la invención. La composición puede comprender además una combinación (como dos, tres o cuatro) de los anticuerpos de la presente divulgación. La composición farmacéutica también puede comprender un portador farmacéuticamente aceptable.

La composición de la invención puede incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una "sal farmacéuticamente aceptable" es una sal que conserva la actividad biológica deseada del compuesto original y no produce efectos toxicológicos no deseados. Algunos ejemplos de estas sales son las sales de adición de ácidos y las sales de adición de bases.

Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados comprenden portadores acuosos o diluyentes. Algunos ejemplos de soportes acuosos adecuados son el agua, el agua tamponada y la solución salina.

Otros portadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen etanol, polioles (como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, como oleato de etilo. En muchos casos, será deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición.

Por lo general, las composiciones terapéuticas deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse en forma de solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una concentración elevada del fármaco.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo un agente antivírico. El agente antivírico puede unirse al coronavirus e inhibir la actividad viral. Otra posibilidad es que el agente antivírico no se una directamente al coronavirus, pero afecte a la actividad/infectividad vírica. El agente antivírico podría ser otro anticuerpo anticoronavirus, que se une a alguna parte del SARS-CoV-2 distinta de la proteína spike. Ejemplos de un agente antiviral útil con la invención incluyen Remdesivir, Lopinavir, ritonavir, APN01, y Favilavir.

El agente terapéutico adicional puede ser un agente antiinflamatorio, como un corticosteroide (por ejemplo, Dexametasona) o un antiinflamatorio no esteroideo (por ejemplo, Tocilizumab).

El agente terapéutico adicional puede ser una vacuna anticoronavírica. La composición farmacéutica puede administrarse por vía subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intranasal u oral. También se divulgan en el presente documento, pero no forman parte de la invención reivindicada, kits que comprenden anticuerpos u otras composiciones de la invención e instrucciones de uso. El kit puede contener además uno o más reactivos adicionales, como un agente terapéutico o profiláctico adicional, tal y como se expone en el presente documento.

Métodos y usos

También se divulga en el presente documento, pero no forma parte de la invención reivindicada, el uso de los anticuerpos, las combinaciones de anticuerpos y las composiciones farmacéuticas, descritos en el presente documento, por ejemplo, en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia, o en un método de diagnóstico. El método de tratamiento puede ser terapéutico o profiláctico.

Por ejemplo, también se divulgan en el presente documento, pero no forman parte de la invención reivindicada, métodos de tratamiento de infecciones por coronavirus (por ejemplo, SARS- CoV-2), una enfermedad o complicación asociada a la misma, por ejemplo, COVID-19. El método puede comprender la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo, una combinación de anticuerpos o una composición farmacéutica de la invención. El método puede comprender además la identificación de la presencia de coronavirus, o fragmentos del mismo, en una muestra, por ejemplo SARS-CoV-2, del sujeto. La invención también se refiere a un anticuerpo, o una composición farmacéutica según la invención para su uso en un método de tratamiento de infecciones por coronavirus (por ejemplo, SARS-CoV-2), una enfermedad o complicación asociada a la misma, por ejemplo, COVID-19.

También se divulga en el presente documento, pero no forma parte de la invención reivindicada, un método de formulación de una composición para tratar infecciones por coronavirus (por ejemplo, SARS-CoV-2), una enfermedad o complicación asociada a la misma, por ejemplo, COVID-19, en el que dicho método comprende mezclar un anticuerpo, una combinación de anticuerpos o una composición farmacéutica según la invención con un portador aceptable para preparar dicha composición.

También se divulga en el presente documento, pero no forma parte de la invención reivindicada, el uso de un anticuerpo, una combinación de anticuerpos o una composición farmacéutica según la invención para tratar infecciones por coronavirus (por ejemplo, SARS-CoV-2) o una enfermedad o complicación asociada a las mismas, por ejemplo, COVID-19.

También se divulga en el presente documento, pero no forma parte de la invención reivindicada, el uso de un anticuerpo, una combinación de anticuerpos o una composición farmacéutica según la invención para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir infecciones por coronavirus (por ejemplo, SARS-CoV-2) o una enfermedad o complicación asociada a ellas, por ejemplo, COVID-19.

También se divulga en el presente documento, pero no forma parte de la invención reivindicada, la prevención, el tratamiento o el diagnóstico de la infección por coronavirus causada por cualquier cepa de SARS-CoV-2. La infección por coronavirus puede estar causada por cualquier cepa de SARS-CoV-2.

La cepa SARS-CoV-2 puede ser la cepa Wuhan identificada más tempranamente (hCoV-19/Wuhan/WIV04/2019 (WIV04); GISAID accession no. EPI_iSl_402124), y sus variantes. Por ejemplo, la cepa SARS-CoV-2 puede ser miembro del linaje A, A. 1, A.2, A.3, A.5, B, B. 1, B.1.1, B.2, B.3, B.4, B.1.1.7 (alfa), B.1.351 (beta), P.1 (gamma), delta, kappa, y/o lambda. La cepa SARS-CoV-2 puede pertenecer a los linajes A.23.1, B.1.1.7 (alfa), B.1.351 (beta), B.1.258, B.1.526.2, B.1.616, B.1.617.1 (kappa), B.1.617.2 (delta), C.36.3, C.37 (lambda), P1 (gamma), B.1.1.529 (omicron), Omicron BA.1, Omicron BA.1.1, Omicron BA.2 y/u Omicron BA.3.

La cepa SARS-CoV-2 puede comprender una o más mutaciones, por ejemplo en la proteína spike, en relación con el hCoV-19/Wuhan/WIV04/2019 (WIV04) (número de acceso GISAID EPI_ISL_402124). En otras palabras, la cepa SARS-CoV-2 puede ser una cepa hCoV- 19/Wuhan/WIV04/2019 (WIV04) modificada que comprende una o más modificaciones, por ejemplo, en la proteína spike.

Puede tratarse de las mutaciones (por ejemplo, sustituciones) observadas en la cepa Omicron del SARS-CoV-2.

Los anticuerpos Omi02, Omi03, Omi12, Omi18, Omi28, Omi39 y Omi42 son especialmente eficaces para neutralizar la cepa Omicron SARS-Cov-2. Por lo tanto, la presente divulgación puede referirse a estos anticuerpos para su uso en el tratamiento, prevención, tratamiento o diagnóstico de la infección por coronavirus causada por una cepa SARS-Cov-2.

Los métodos y usos aquí divulgados pueden comprender inhibir el estado de enfermedad (tal como COVID-19),por ejemplodetener su desarrollo; y/o aliviar el estado de enfermedad (tal como COVID-19), por ejemplo causar regresión del estado de enfermedad hasta que se alcance un punto final deseado.

Los métodos y usos aquí divulgados pueden comprender la mejora o la reducción de la gravedad, duración o frecuencia de un síntoma del estado de enfermedad (como COVID-19)(por ejemplodisminuir el dolor o malestar), y dicha mejora puede o no afectar directamente a la enfermedad. Los síntomas o complicaciones pueden ser fiebre, dolor de cabeza, fatiga, pérdida de apetito, mialgia, diarrea, vómitos, dolor abdominal, deshidratación, infecciones de las vías respiratorias, tormenta de citoquinas, sepsis del síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS) y/o fallo de órganos (por ejemplo, corazón, riñones, hígado, tubo digestivo, pulmones).

Los métodos y usos aquí divulgados pueden conducir a una disminución de la carga viral de coronavirus (por ejemplo, SARS-CoV-2), por ejemplo, en >10 %, >20 %, >30 %, >40 %, >50 %, >60 %, >70 %, >80 %, >90 %, o 100 % en comparación con el pretratamiento. Los métodos para determinar la carga viral son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, los ensayos de infección.

Los métodos y usos divulgados en el presente documento pueden comprender evitar que la infección por coronavirus se produzca en un sujeto(por ejemplohumano), en particular, cuando dicho sujeto está predispuesto a complicaciones asociadas con la infección por coronavirus.

También se describen aquí, pero no forman parte de la presente invención, métodos de identificación de sujetos que tienen una infección por coronavirus, como por ejemplo por SARS-CoV-2. Por ejemplo, los métodos y usos de la presente divulgación pueden implicar la identificación de la presencia de coronavirus (por ejemplo, SARS-CoV-2), o una proteína o un fragmento de la misma, en una muestra. La detección puede realizarsein vitrooin vivo..También se divulga en el presente documento, pero no forma parte de la invención reivindicada, el cribado de poblaciones.

La invención se refiere a la identificación de cualquier cepa de SARS-CoV-2, tal como se describe en el presente documento. La invención también puede referirse a un método de identificación de mutantes de escape de SARS-CoV-2, que comprende poner en contacto una muestra con una combinación de anticuerpos de la invención e identificar si cada anticuerpo se une al virus. El término "mutantes de escape" hace referencia a variantes del SARS-CoV-2 que comprenden mutaciones no silenciosas que pueden afectar a la eficacia de los tratamientos existentes de la infección por SARS-CoV-2. Típicamente, las mutaciones no silenciosas se encuentran en un epítopo reconocido por un anticuerpo de la técnica anterior y/o anticuerpos descritos en el presente documento que se unen específicamente a un epítopo del SARS-CoV-2, por ejemplo, en la proteína spike del SARS-CoV-2. Si el anticuerpo no se une a la diana, puede indicar que la diana comprende una mutación que puede alterar la eficacia de los tratamientos existentes contra el SARS-CoV-2.

Los métodos y usos de la invención pueden incluir el contacto de una muestra con un anticuerpo o una combinación de los anticuerpos de la invención, y la detección de la presencia o ausencia de un complejo anticuerpo-antígeno, donde la presencia del complejo anticuerpo-antígeno indica que el sujeto está infectado con SARS-CoV-2.

Los métodos para determinar la presencia de un complejo anticuerpo-antígeno son conocidos en la técnica. Por ejemplo, las técnicas de detección in vitro incluyen ensayos inmunoenzimáticos (ELISA), Western blots, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Las técnicas in vivo incluyen la introducción en un sujeto de un anticuerpo proteico antianalito marcado. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con un marcador radiactivo cuya presencia y localización en un sujeto puede detectarse mediante técnicas de imagen estándar. Las técnicas de detección pueden proporcionar una lectura cualitativa o cuantitativa dependiendo del ensayo empleado.

También se divulgan en el presente documento, pero no forman parte de la invención reivindicada, métodos y usos para un sujeto humano que los necesite. Sin embargo, también se contemplan animales no humanos como ratas, conejos, ovejas, cerdos, vacas, gatos o perros. El sujeto puede estar en riesgo de exposición a la infección por coronavirus, como un trabajador sanitario o una persona que haya estado en contacto con un individuo infectado. Un sujeto puede haber visitado o estar planeando visitar un país conocido o sospechoso de tener un brote de coronavirus. Un sujeto también puede estar en mayor riesgo, como un individuo inmunocomprometido, por ejemplo un individuo que recibe terapia inmunosupresora o un individuo que padece el síndrome de inmunodeficiencia humana (VIH) o el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). El sujeto puede ser asintomático o presintomático.

El sujeto puede encontrarse en una fase temprana, media o tardía de la enfermedad.

El sujeto puede estar en el hospital o en la comunidad en el momento de la primera presentación, y/o en momentos posteriores en el hospital.

El sujeto puede ser hombre o mujer.

En algunos casos, el sujeto suele ser varón. El sujeto puede no haber sido infectado por coronavirus, como el SARS-CoV-2. El sujeto puede tener una predisposición a los síntomas o complicaciones más graves asociados a las infecciones por coronavirus. El método o uso aquí divulgado puede comprender un paso de identificación de si un paciente está o no en riesgo de desarrollar los síntomas o complicaciones más graves asociados con el coronavirus.

El sujeto puede o no haber sido diagnosticado de infección por coronavirus, como el SARS-CoV- 2.

La invención se refiere al análisis de muestras de sujetos. La muestra puede consistir en tejidos, células y fluidos biológicos aislados de un sujeto, así como tejidos, células y fluidos presentes dentro de un sujeto. La muestra puede ser sangre y una fracción o componente de la sangre, incluyendo suero sanguíneo, plasma sanguíneo o linfa. Normalmente, la muestra procede de un frotis faríngeo, nasal o salival.

Los ensayos de detección del complejo anticuerpo-antígeno pueden realizarsein situ,en cuyo caso la muestra es una sección de tejido (fijada y/o congelada) del tejido obtenido de biopsias o resecciones de un sujeto.

Las composiciones y combinaciones farmacéuticas de anticuerpos aquí divulgadas pueden administrarse por vía subcutánea, intravenosa, intradérmica, oral, intranasal, intramuscular o intracraneal. Normalmente, las composiciones y combinaciones farmacéuticas de anticuerpos se administran por vía intravenosa o subcutánea.

La dosis de un anticuerpo puede variar en función de la edad y el tamaño del sujeto, así como de la enfermedad, las condiciones y la vía de administración. Los anticuerpos pueden administrarse a una dosis de aproximadamente 0.1 mg/kg de peso corporal a una dosis de aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, como por ejemplo a una dosis de aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Los anticuerpos también pueden administrarse a una dosis de unos 50 mg/kg, 10 mg/kg o unos 5 mg/kg de peso corporal.

Una combinación de la presente divulgación puede administrarse, por ejemplo, a una dosis de aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg para cada anticuerpo, o a una dosis de aproximadamente 10 mg/kg o aproximadamente 5 mg/kg para cada anticuerpo. Alternativamente, una combinación puede administrarse a una dosis de unos 5 mg/kg en total (por ejemplo, una dosis de 1.67 mg/kg de cada anticuerpo en una combinación de tres anticuerpos).

El anticuerpo o combinación de anticuerpos de la presente divulgación puede administrarse en un régimen de dosificación múltiple. Por ejemplo, la dosis inicial puede ir seguida de la administración de una segunda o pluralidad de dosis posteriores. La segunda dosis y las siguientes pueden estar separadas por un tiempo adecuado.

Como se ha comentado anteriormente, los anticuerpos de la invención se utilizan normalmente en una única composición/combinación farmacéutica (coformulada). Sin embargo, también se divulga aquí, pero no forma parte de la invención reivindicada, el uso combinado de anticuerpos de la invención en preparaciones/composiciones separadas. La invención también incluye el uso combinado de los anticuerpos con agentes terapéuticos adicionales, como se ha descrito anteriormente.

La administración combinada de los dos o más agentes y/o anticuerpos puede lograrse de diferentes maneras. En un caso, todos los componentes pueden administrarse juntos en una única composición. En otro caso, cada componente puede administrarse por separado como parte de una terapia combinada.

Por ejemplo, el anticuerpo puede administrarse antes, después o simultáneamente con otro anticuerpo, o fragmento de unión del mismo. Las combinaciones especialmente útiles se han descrito anteriormente, por ejemplo.

Por ejemplo, el anticuerpo de la presente divulgación puede administrarse antes, después o simultáneamente con un agente antivírico o un agente antiinflamatorio.

En las realizaciones en las que la invención se refiere a la detección de la presencia de coronavirus, por ejemplo SARS-CoV-2, o una proteína o un fragmento de la misma, en una muestra, el anticuerpo contiene una etiqueta detectable. Los métodos para fijar una etiqueta a un anticuerpo son conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el etiquetado directo del anticuerpo acoplando (es decir, uniendo físicamente) una sustancia detectable al anticuerpo. Alternativamente, el anticuerpo puede ser marcado indirectamente, por ejemplo, por reactividad con otro reactivo marcado directamente. Ejemplos de marcaje indirecto son la detección de un anticuerpo primario mediante un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia y el marcaje final de una sonda de ADN con biotina para que pueda detectarse con estreptavidina marcada con fluorescencia.

La detección puede comprender además: (i) un agente del que se sabe que es útil para detectar la presencia de coronavirus, , por ejemplo SARS-CoV-2, o una proteína o un fragmento de la misma, por ejemplo un anticuerpo contra otros epítopos de la proteína spike, u otras proteínas del coronavirus, como un anticuerpo antinucleocápside; y/o ii) un agente que se sabe que no es capaz de detectar la presencia de coronavirus, , por ejemplo SARS-CoV-2, o un fragmento del mismo, es decir, que proporciona un control negativo.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo se modifica para aumentar su estabilidad. Las modificaciones adecuadas se explican más arriba.

También se divulgan en el presente documento, pero no forman parte de la invención reivindicada, kits para detectar la presencia de coronavirus, por ejemplo SARS-CoV-2, en una muestra. Por ejemplo, el kit puede comprender: un anticuerpo marcado o una combinación de anticuerpos marcados de la presente divulgación; medios para determinar la cantidad de coronavirus, por ejemplo SARS-CoV-2, en una muestra; y medios para comparar la cantidad de coronavirus, por ejemplo SARS-CoV-2, en la muestra con un estándar. El anticuerpo marcado o la combinación de anticuerpos marcados puede envasarse en un recipiente adecuado. El kit puede comprender además instrucciones para utilizar el kit para detectar coronavirus, por ejemplo SARS-CoV-2, en una muestra. El kit puede comprender además otros agentes conocidos por su utilidad para detectar la presencia de coronavirus, como se ha comentado anteriormente.

Por ejemplo, los anticuerpos o combinaciones de anticuerpos de la presente divulgación se utilizan en un ensayo de flujo lateral. Normalmente, el kit de prueba de flujo lateral es un dispositivo manual con una almohadilla absorbente, que se basa en una serie de lechos capilares, como trozos de papel poroso, polímero microestructurado o polímero sinterizado. La prueba hace pasar la muestra líquida por la superficie de la almohadilla con moléculas reactivas que muestran un resultado visual positivo o negativo. La prueba puede comprender además el uso de otros agentes conocidos por su utilidad para detectar la presencia de coronavirus, por ejemplo SARS-CoV-2, o un fragmento del mismo, como se ha comentado anteriormente, como un anticuerpo antinucleocápside.

Otras

Además, tal como se utilizan en esta especificación y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contenido indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un anticuerpo" incluye dos o más "anticuerpos".

Además, cuando se hace referencia a ">x" en el presente documento, significa igual o mayor que x. Cuando en el presente documento se hace referencia a "<x", significa menor o igual que x.

A efectos de la presente invención, para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias (como dos secuencias polinucleotídicas o dos secuencias polipeptídicas), las secuencias se alinean con fines de comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir brechas en una primera secuencia para una alineación óptima con una segunda secuencia). A continuación, se comparan los residuos de nucleótidos o aminoácidos de cada posición. Cuando una posición de la primera secuencia está ocupada por el mismo nucleótido o aminoácido que la posición correspondiente de la segunda secuencia, entonces los nucleótidos o aminoácidos son idénticos en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = número de posiciones idénticas / número total de posiciones en la secuencia de referencia * 100). Normalmente, la comparación de secuencias se realiza sobre la longitud de la secuencia de referencia. Por ejemplo, si el usuario deseara determinar si una secuencia dada ("de prueba") es idéntica en un 95 % a la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 3 sería la secuencia de referencia. Para evaluar si una secuencia es al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 3 (un ejemplo de secuencia de referencia), la persona experta llevaría a cabo un alineamiento sobre la longitud de la SEQ ID NO: 3, e identificaría cuántas posiciones de la secuencia de prueba eran idénticas a las de la SEQ ID NO: 3. Si al menos el 95 % de las posiciones son idénticas, la secuencia de prueba es al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 3. Si la secuencia es más corta que la SEQ ID NO: 3, las brechas o las posiciones que faltan deben considerarse posiciones no idénticas. El experto conoce diferentes programas informáticos disponibles para determinar la homología o identidad entre dos secuencias. Por ejemplo, la comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede realizarse mediante un algoritmo matemático. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos puede determinarse utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de software GCG de Accelrys (disponible en http://wwv.accelrvs.com/products/gcg/), utilizando una matriz Blosum 62 o una matriz PAM250, y un peso de brecha de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.

Los CDRs de la cadena pesada (CDRH) y del dominio variable de la cadena ligera (CDRL) están situados en los residuos 27-38 (CDR1), 56-65 (CDR2) y 105-117 (CDR3) de cada cadena según el sistema de numeración IMGT (http://www.imgt.org; Lefranc MP, 1997, J, Immunol. Hoy, 18, 509). Este sistema de numeración se utiliza en la presente especificación, salvo que se indique lo contrario.

Los siguientes ejemplos ilustran la presente divulgación.

Ejemplos

Ejemplo 1 Generación de anticuerpos específicos contra cepas pandémicas tempranas de SARS-CoV-2 y Beta SARS-CoV-2

Los anticuerpos de la Tabla 1 se refieren a un conjunto de mAbs generados contra la cepa pandémica temprana de SARS-CoV-2. Los anticuerpos de la Tabla 2 se refieren a un conjunto de mAbs generados contra la cepa Beta del SARS-CoV-2.

Se pueden encontrar más detalles sobre estos anticuerpos en la solicitud internacional No. WO2022167815& WO2022167816. Encontrará más información sobre la generación y las propiedades de estos anticuerpos en los siguientes artículos: Dejnirattisai, Wanwisa, et al. "La anatomía antigénica del dominio de unión al receptor del SARS-CoV-2". Cell 184.8 (2021): 2183-2200. Supasa, Piyada, et al. "Neutralización reducida del SARS-CoV-2 B.

1.1. 7 variante por sueros de convalecientes y de vacunas". Cell 184.8 (2021): 2201-2211.

Liu, Chang, et al. "La respuesta de anticuerpos al SARS-CoV-2 Beta pone de relieve la distancia antigénica con otras variantes". Cell host & microbe (2021).

Zhou, Daming, et al. "Evidencia de escape de la variante B. 1.351 del SARS-CoV-2 de sueros naturales e inducidos por vacunas". Cell 184.9 (2021): 2348-2361.

Dejnirattisai, Wanwisa, et al. "Evasión de anticuerpos por la cepa P. 1 del SARS-CoV-2". Cell 184.11 (2021): 2939 2954.

Liu, Chang, et al. "Neutralización reducida del SARS-CoV-2 B. 1.617 por la vacuna y el suero de convalecientes". Cell 184.16 (2021): 4220-4236.

Dejnirattisai, Wanwisa, et al. "SARS-CoV-2 Omicron-B. 1.1. 529 conduce a un escape generalizado de las respuestas de anticuerpos neutralizantes". Celda (2022).

Ejemplo 2. Generación de anticuerpos específicos contra las cepas Omicron del SARS- CoV-2 Linaje Om icron BA.2.

El Omicron BA.2 se notificó por primera vez en Sudáfrica el 17 de noviembre de 2021, en una fecha similar a la de Omicron BA.1. La BA.2 ha ido aumentando en relación con la BA.1 en una serie de países como Dinamarca, India y el Reino Unido y ahora representa la mayoría de las infecciones por Omicron en Dinamarca y se están acumulando pruebas de que la BA.2 es más transmisible que la BA.1, pero no hay pruebas de que aumente la gravedad de la enfermedad.

BA.2 está relacionado con BA.1 compartiendo 21 sustituciones de aminoácidos repartidas en S, sin embargo hay una serie de diferencias: BA.1, tiene 6 deleciones de aminoácidos, 3 inserciones y 9 sustituciones adicionales en comparación con BA.2 y BA.2 tiene 3 deleciones y 7 sustituciones adicionales en comparación con BA.1. En el RBD, BA.1 contiene las mutaciones únicas S371L, G446S y G496S y, en algunos aislamientos R346K (BA.1.1), mientras que BA.2 porta S371F, T376A, D405N y R408S. Todos estos residuos tienen el potencial de afectar diferencialmente a la unión de anticuerpos y podrían modular la neutralización, en particular BA.1 G446S, G496S, BA.2 D405N, R408S que se encuentran en el borde de la huella de unión de ACE2 y para BA.1.1 el cambio R346K se encuentra cerca del glicano N343 y podría modular la unión de anticuerpos potentes a esta región. BA.3 no contiene mutaciones únicas en relación con BA.1 y BA.2 y parece ser una fusión de los dos, siendo BA.1 como en el N-terminal y cambiando para convertirse en BA.2 como en el C-terminal de la mutación G496S.

Linajes Om icron B A .4 y B A .5

A principios de abril de 2022 se notificaron dos nuevos linajes de Omicron procedentes de Gauteng (Sudáfrica) y designados BA.4 y BA.5. Las secuencias BA.4 y BA.5 S son idénticas y están estrechamente relacionadas con BA.2. La diversidad de secuencias en Omicron S se muestra en laFigura 9.En comparación con BA.2, BA.4 tiene los residuos 69 y 70 eliminados, y contiene 2 sustituciones adicionales en el RBD: L452R y F486V. Por último, BA.4 carece del cambio Q493R observado en BA.1 y BA.2, volviendo a Q493 como en la cepa Victoria/Wuhan.

Las 2 mutaciones adicionales en el RBD son las más preocupantes en términos de escape de anticuerpos: L452R es un cambio químicamente radical y es uno del par de cambios en Delta RBD (el otro, T478K, ya se encuentra en el linaje Omicron). La mutación F486L se encontró en secuencias de SARS-CoV-2 aisladas de Mink a principios de la pandemia y también es un sitio de mutaciones de escape a varios mAbs (Gobeil et al., 2021, "Effect of natural mutations of SARS-CoV-2 on spike structure, conformation, and antigenicity". Science 373, 6555). El cambio F486V en BA.4/5 es también una reducción del volumen de la cadena lateral hidrofóbica como en F486L, pero más significativa. Ambos residuos 452 y 486 se encuentran cerca del borde de la superficie de interacción de ACE2 (Figura 9B) y ambos, junto con la reversión a la secuencia ancestral Q493 que se encuentra dentro de la huella de ACE2, tienen el potencial de modular la afinidad de ACE2 así como modular la capacidad neutralizante de la vacuna o del suero adquirido de forma natural. Es probable que las mutaciones L452R y F486V provoquen un mayor escape de anticuerpos, mientras que la reversión en 493 puede reducir el escape de respuestas a virus anteriores.

E l linaje Om icron B A.2.75

A principios de mayo de 2022, fué reportao en la India un nuevo sublinaje Omicron BA.2 designado BA.2.75. Se ha extendido a múltiples países, como Reino Unido, Estados Unidos, Australia, Alemania y Canadá. BA.2.75 contiene múltiples cambios mutacionales en la proteína S en comparación con BA.2, incluyendo cuatro sustituciones en el NTD (W152R, F157L, I210V y G257S) y cuatro en el RBD: D339H, G446S, N460K y R493Q (Figura 16). Las mutaciones RBD afectan a los principales epítopos de los anticuerpos neutralizantes y es probable que modulen la unión de ACE2. D339H representa una nueva evolución de la mutación G339D que se encuentra en todas las variantes anteriores de Omicron y que se ha descubierto que perjudica la unión de ciertos anticuerpos de "flanco derecho" pertenecientes a la familia IGHV1-69 (por ejemplo, Beta-49 y -50); también cae en la huella de unión de ciertos anticuerpos de clase 3 como S309/sotrovimab (Dejnirattisai et al., 2022; "SARS-CoV-2 Omicron-B.1.1.529 leads to widespread escape from neutralizing antibody responses". Cell 185, 467-484 e415). G446S se encontró en BA.1, BA.1.1 y BA.3 pero no en BA.2 y otras subvariantes de BA.2, y también es capaz de perjudicar la unión de ciertos anticuerpos de Clase 3 que se unen al hombro derecho como REGN10987/ imdevimab (Dejnirattisai et al., 2022). La reversión R493Q también se encontró en BA.4/5, y puede hacer que el virus sea más sensible a la neutralización por una serie de anticuerpos de clase 1 y 2 que se unen al cuello/hombro izquierdo. Esta reversión también puede aumentar la afinidad por ACE2 (véase más adelante).

N460K es una mutación nueva que no se ha visto en sublinajes anteriores de VoC u Omicron, pero se encontró después de la evolución in vitro (visualización en levadura) en RBD-62 que tiene una afinidad por ACE2 ultra alta (KD = 16-18 pM) (Dejnirattisai et al., 2022; Zahradnik et al., 2021 "SARS-CoV-2 variant prediction and antiviral drug design are enabled by RBD in vitro evolution". Nat Microbiol 6, 1188-1198). De hecho, N460K produjo un aumento sustancial de la afinidad por ACE2, sólo superado por el efecto de N501Y (Zahradnik et al., 2021). Además, el análisis in silico predice que N460K puede afectar a la unión de ciertos anticuerpos pertenecientes a la familia IGHV3-53 (por ejemplo, Omi-3) que han demostrado ser capaces de neutralizar potentemente todas las VoC (Nutalai et al., 2022).

Mediante ensayos de neutralización, se demostró que la infección Delta en aislamiento no proporcionaba protección (no neutralización) contra BA.2.75. Las mutaciones en BA.2.75 conducen a una reducción de los títulos de neutralización del suero vacunal en comparación con BA.2. Las mutaciones individuales de BA.2.75 pueden causar una mayor reducción de los títulos de neutralización en comparación con la secuencia BA.2.75 S completa, pero se equilibran con la mutación de reversión R393Q, que puede haber sido seleccionada para aumentar la afinidad a ACE2 y aumentar la transmisibilidad de BA.2.75. Parece inevitable que se produzca una mayor evolución del linaje Omicron y es probable que existan muchas compensaciones posibles entre el escape de anticuerpos y la afinidad a ACE2, que pueden hacerse y se harán, dando lugar a sucesivas oleadas de infección.

Sublinajes em ergentes BA.2, B A .4 y B A .5

Varios linajes están creciendo rápidamente dentro de las ramas BA.2 y BA.5. Lo más sorprendente es el alto grado de evolución convergente, sobre todo en posiciones antigénicas RBD como 346, 444, 452, 460, 486, 490, 493 y 494. Estos linajes incluyen ejemplos de las ramas BA.4/5 (que contienen L452R, F486V y la reversión R493Q), como BA.4.6 y BF.7 (R346T), BA.4.7 (R346S), BQ.1 (K444T, N460K) y BQ.1.1 (R346T, K444T, N460K); de la rama BA.2.75 (que contiene G339h , G446S, N460k y la reversión R493Q), BA.2.75.2 (R346T y F486S y mutaciones BA.2.75), BN.1 (alias BA.2.75.5.1 con mutaciones R346T, K356T, F490S y BA.2.75), BM.1.1.1 (alias BA.2.75.3.1.1.1 con mutaciones R346T, F486S, F490S y BA.2.75). También hay ejemplos de otras líneas variantes BA.2 de segunda generación, como BJ.1 (alias BA.2.10.1.1; G339H, R346T L368i, V445P, G446S, V483A y F490V), BA.2.10.4 (G446S, F486P, S494P y la reversión R493Q), BS.1 (también denominada BA.2.3.2.1; R346T, L452R, N460K, G476S y la reversión Q493R), BA.2.3.20 (K444R, N450D, L452M, N460K, E484R y la reversión Q493R) y, por último, un recombinante BJ.1 x BM.1.1.1 (también conocido como BA.2.75.3.1.1.1), XBB (que, en relación con BA.2, contiene R346T, L368I, V445P, G446S, N460K, F486S, F490S y la reversión q 493R).

Fuera de la RBD, el grado de evolución convergente es menor, pero sigue presente. Muchos de los linajes variantes de BA.2 de segunda generación contienen deleciones o mutaciones en el NTD, a menudo similares a las observadas en las VoCs, por ejemplo A-144 en BJ.1, BS.1 y BA.2.10.4 (observadas previamente en Alfa y BA.1) y NSP12 G671S en BJ.1, XBB y BA.2.10.4 (observadas previamente en Delta).

A nticuerpos p otentem ente neutralizantes aislados después de la in fección p o r Om icron

Se reclutaron cinco voluntarios que se habían recuperado de una infección por Omicron confirmada secuencialmente y se les tomaron muestras 10-14 días después de la aparición de los síntomas; todos los voluntarios habían recibido 2 dosis de la vacuna Pfizer BioNtech antes de infectarse por Omicron. En primer lugar, se realizaron ensayos de neutralización frente a Omicron BA.1 y Victoria (un aislado pandémico temprano de SARS-CoV-2 que contiene una única sustitución aminoacídica en S NTD (S247R) en comparación con la secuencia de la mancha de Wuhan utilizada en todas las vacunas actuales). En todos los casos, el título de neutralización por reducción del foco al 50 % (FRNT50) frente a Omicron fue superior a 100, pero en este primer momento los títulos fueron considerablemente inferiores a los títulos frente a Victoria (Figura 1A).

Las células B de los cinco donantes se tiñeron con el trímero BA.1 de longitud completa y las células individuales se clasificaron mediante FACS (Figura 1B). Tras una reacción RT-PCR degenerada, las secuencias de las cadenas pesada y ligera se ensamblaron en vectores de expresión mediante la reacción de Gibson y los productos se transfectaron en células 293T Se analizaron los sobrenadantes de los cultivos en busca de reactividad frente a BA.1 de longitud completa o de tipo salvaje S (WT Wuhan) junto con BA.1 RBD y NTD. En total, se seleccionaron 1,122 células individuales y se recuperaron 545 mAb.

Todos los mAbs presentaron reacciones cruzadas entre WT y BA.1 S mediante ELISA, lo que sugiere que podrían haberse generado a partir de células B de memoria inducidas por la vacunación. En contraste con un panel anterior de anticuerpos monoclonales se produjeron a partir de casos ingenuos infectados a principios de la pandemia (Dejnirattisai, Wanwisa, et al. "La anatomía antigénica del dominio de unión al receptor del SARS-CoV-2". Cell 184.8 (2021): 2183-2200), se encontró una mayor proporción de mAbs omicron-específicos que reaccionaban al RBD (56 %) en comparación con los mAbs pandémicos tempranos (21 %, p<0.0001) (Figura 1C). Además, 129 de los 545 mAbs aislados se unieron al NTD BA.1.

A islam iento de l potente m A b de Om icron

Se realizaron ensayos de neutralización con todos los mAb ELISA positivos y se eligieron los que mostraban mayor actividad para su estudio posterior. Se seleccionaron los 28 mAbs más potentes para su caracterización completa, todos los cuales mostraron títulos BA.1 FRNT50 <100ng/ml. 27/28 se unieron a la RBD (uno, Omi-41 se unió a la NTD) y ninguno reaccionó de forma cruzada con la proteína S del SARS-CoV-1 mediante ELISA.

El examen del uso de genes (Figura 1D, Tabla 17) reveló que 9/28 mAbs pertenecen a las familias de genes VH3-53 y VH3-66 relacionadas. VH3-53 y VH3-66 se han aislado repetidamente en la infección por SARS-CoV-2, forman una respuesta pública de anticuerpos y se unen a un sitio en el cuello del RBD y funcionan para bloquear la unión de ACE2. Anteriormente se observó que muchos mAbs VH3-53 y VH3-66 pierden actividad en VoCs que contienen la mutación N501Y, aunque algunos anticuerpos VH3-53 (mAb 222 y Beta- 27) fueron totalmente resistentes al cambio N501Y encontrado en Alfa, Beta y Gamma pero sufrieron una reducción de actividad en Omicron BA.1 o BA.2.

Aproximadamente la mitad de las familias de genes observadas en los anticuerpos pandémicos tempranos potentes (Tabla 1) también están representadas en el conjunto Omicron (Figura 1C), quizás la diferencia más notable es que VH1-69 no aparece en los anticuerpos tempranos pero se encuentra en 6/28 del conjunto Omicron potente (2, 24, 30, 31, 34 y 38) y también lo encontramos en 2 anticuerpos Beta, Beta 49 y 50, que se unen a un sitio en proximidad al glicano N343. El análisis del mAb Omicron muestra secuencias CDR3 mucho más largas, lo que sugiere un modo de unión diferente al de Beta 49, 50. En el conjunto Beta de mAb, se encontró que la expansión de una respuesta pública estaba mediada a través de VH 4-39 (6/27 mAb), que se unía a un epítopo alrededor de la mutación 501Y, la mayoría perdía actividad contra BA.1 y cabe destacar que ninguno del conjunto actual de mAb Omicron está codificado por VH4-39.

En comparación con el conjunto de anticuerpos de la pandemia temprana, encontramos niveles más altos de mutación somática tanto en las cadenas pesadas como ligeras en comparación con el conjunto de mAb Omicron de la pandemia temprana (media de 9.00, 6.00 y pandemia temprana 4.55, 4.25 para VH y VL respectivamente). Estos resultados serían coherentes con la evolución de una mayor afinidad por Omicron a través de la mutación somática de las células B de memoria inducidas por la vacuna.

A m plia neutralización de VoC p o r m Ab de Om icron

Se realizaron ensayos de neutralización contra Victoria y todas las variantes de interés Alfa, Beta, Gamma, Delta y Omicron BA.1, para el panel de 28 mAbs potentes (Figura 2A-C, Tablas 13 a 16 y 18). El origen probable de todos estos anticuerpos a partir de células B de memoria inducidas por la vacuna es evidente en que, en casi todos los casos, los títulos FRNT50 frente a Victoria se encuentran en el extremo superior de todos los VoC probados para cada mAb (Figura 2A-C, Tablas 13 a 16 y 18). Cinco de los mAbs neutralizan BA.1 con títulos FRNT50 < 10 ng/ml, mAb Omi- 3, 8, 12, 18 y 24 son los más potentes con títulos FRNT50 de 9, 8, 4, 6, 7 ng/ml y títulos FRNT90 de 67, 42, 20, 18, 35 ng/ml respectivamente.

Los datos proporcionados en las Tablas 13, 14 y 16 incluyen algunos datos de IC50 obtenidos utilizando constructos pseudovirales. Los datos de la Tabla 18 consisten en resultados de IC50 obtenidos exclusivamente a partir de contructos virales auténticas.

17/28 anticuerpos son reactivos cruzados contra todos los VoC con una diferencia <10 veces en los títulos FRNT50 entre todos los virus. Omi-06, 24, 30, 31, 34 y 41 muestran una actividad reducida o ausente frente a Delta, perteneciendo 3/6 de ellas a la familia VH1-69, y pueden tener un epítopo que incide sobre la mutación L452R Delta (Delta comparte T478K con BA.1). Los anticuerpos Omi-09 y 32 funcionan mal en Beta y Gamma y pueden ser sensibles a E484K encontrado en Beta y Gamma, pero pueden tolerar el cambio E484A en Omicron (Omicron comparte N501Y y K417N con Beta mientras que Gamma es N501Y, K417T). Por último, aunque se aislaron 129 mAbs anti-NTD, sólo uno de ellos, Omi-41, mostró títulos FRNT50 < 100 ng/ml, Omi-41 mostró actividad neutralizante contra Victoria, Alfa, Beta y Gamma, pero ninguna actividad contra Delta, presumiblemente como resultado del espectro único de cambios NTD encontrados en Delta.

Neutralización de BA.1 en com paración con BA.1.1, B A .2 y B A .3

Se construyeron reporteros basados en lentivirales pseudotipados con las secuencias del gen S de Victoria, BA.1, BA.1.1, BA.2 y BA.3. Los ensayos de neutralización contra el mAb de Omicron se muestran en la Figura 2B, Tablas 14 y 18, la mayoría de los anticuerpos muestran poca diferencia en la neutralización de BA.1, BA.1.1, BA.2 y BA.3. Sin embargo, hubo algunas excepciones notables; la neutralización de BA.2 se redujo 38.3 y 158 veces en comparación con BA.1 para Omi-8, 29 y 32 respectivamente, mientras que la neutralización de Ba .1.1 se redujo 40.9, 10.8, 7.8 y 6.6 veces en comparación con BA.1 para Omi-6, 24, 34 y 35 respectivamente y se eliminó para Omi-39 y 40. La neutralización de BA.3 por el Omi-mAb reflejó la encontrada con BA.2 con la excepción de Omi-06 y Omi-36 donde los títulos de neutralización de BA.3 fueron considerablemente más bajos que BA.1 o BA.2. Por alguna razón, el mAb de unión a NTD Omi-41 no neutralizó Victoria en el sistema pseudoviral, pero sí neutralizó el virus vivo, lo que también ocurrió con el primer mAb pandémico 159, que mostró una potente actividad sobre el virus vivo, pero no sobre el pseudovirus.

Las curvas de neutralización pseudoviral para paneles de mAb aislados de casos pandémicos tempranos junto con mAb aislados de casos Beta se muestran en las Figuras 4A, B, Tabla 15, en la mayoría de los casos, los títulos de neutralización contra BA.1, BA.1.1 y BA.2 son similares, pero hay algunas diferencias, los mAbs 40, 278 y 318 neutralizan BA.2 > BA.1, mientras que 222, Beta 22, 29, 54, 55 y 56 neutralizan BA.1 mejor que BA.2, mientras que Beta-53 que se une cerca del glicano N343 muestra una neutralización reducida de BA.1.1.

N eutralización p o r anticuerpos desarrollados p ara uso clínico.

Por último, la neutralización de Victoria, BA. 1, BA.1.1, BA.2 y BA.3 se probó utilizando mAbs que se están desarrollando para uso clínico, donde se encontraron varias diferencias (Figura 2C, Tablas 16 y 18). Curiosamente, la actividad del anticuerpo conocido A (REGN 10987) se restauró parcialmente en BA.2, pero todavía 308 veces reducida en comparación con Victoria, la actividad del anticuerpo conocido C (AZD1061) se restauró casi completamente en BA.2, mientras que el anticuerpo conocido D (AZD8895) se redujo 5.4 veces en BA.2 frente a BA.1 y la combinación de ambos anticuerpos conocidos D (AZD8895) y E, sólo se redujo 8 veces en comparación con Victoria. La actividad del anticuerpo conocido K (S309) se redujo 6.8 veces en BA.2 en comparación con BA.1, Finalmente la actividad del anticuerpo conocido G (ADG20) se perdió completamente en BA.2.

En resumen, la neutralización de la mayoría de los anticuerpos monoclonales Omicron no se ve afectada por las diferencias entre las mutaciones BA.1, BA.1.1, BA.2 o BA.3. No obstante, algunos anticuerpos monoclonales muestran diferencias, en particular el anticuerpo conocido A (REGN 10987) y el anticuerpo conocido C (AZD1061), que neutralizan BA.2 más fácilmente que BA.1, y el anticuerpo conocido K (S309), que muestra una neutralización reducida de BA.2, lo que puede alentar la tipificación de sublinajes antes de su uso. Las explicaciones estructurales de las diferencias entre la neutralización BA.1, BA.1.1, BA.2 y BA.3 se analizarán a continuación.

N eutralización de BA.1, BA.1.1, B A .2 y B A 3 p o r sueros inm unes

Para determinar si las diferencias de transmisibilidad entre BA.1 y BA.2 pueden deberse a una neutralización diferencial y también para determinar si existía la posibilidad de que BA.2 pudiera escapar a la respuesta de anticuerpos de BA.1, se realizaron ensayos de neutralización utilizando sueros de diversas fuentes. En primer lugar, se realizaron ensayos de neutralización en Victoria, BA. 1, BA.1.1, BA.2 y BA.3 utilizando sueros recogidos de vacunados que recibieron las vacunas Oxford/AstraZeneca AZD1222 (n=41) o Pfizer/BioNtech BNT162b2 (n=20) (Figura 3A, B).

Para la AZD1222 se tomaron muestras 4 semanas después de la segunda y tercera dosis de la vacuna. Tras la tercera dosis de AZD1222 hubo diferencias pequeñas pero significativas entre la neutralización pseudoviral con reducciones de los títulos frente a BA.2 frente a BA.1 (1,17 veces p=0.0019) y BA.1.1 frente a BA.1 (1.29 veces p=0,0086). Para BNT162b2 se tomaron muestras 4 semanas y 6 meses después de la segunda dosis de vacuna, antes de la tercera dosis y 4 semanas después de la tercera dosis. Tras la tercera dosis de vacuna, los títulos frente a BA.1, BA.2 y BA.1.1 fueron similares, con diferencias no significativas entre ellos. A continuación, se determinó el perfil de neutralización del suero recogido de los casos infectados con Omicron. Se tomaron muestras tempranas (n=12) < 14 días desde el inicio de los síntomas (mediana de 13 días), posteriormente se tomaron muestras (n=17) > 21 days después de la aparición de los síntomas (mediana de 38 días). Todos los casos habían recibido al menos 2 dosis de vacuna y varios de los casos convalecientes tardíos recibieron una tercera dosis de vacuna tras la infección por Omicron. La neutralización frente a Victoria, Alfa, Beta, Gamma, Delta y Omicron se comprobó mediante ensayos de neutralización de virus vivos (Figura 3C). En los primeros momentos, todos los casos vacunados presentaron títulos elevados frente a Victoria, con una media geométrica de FRNT50 cercana a 1/3000, y mostraron una amplia neutralización de VoC, con FRNT50 > 1/1000 para todos los virus excepto Omicron (FRNT50 = 558). En el momento posterior, los títulos contra Victoria no cambiaron, mientras que aumentaron los títulos contra VoC y Omicron (3 veces, p=0.0123). La comparación por pares de muestras tempranas y tardías tomadas de los mismos individuos confirmó el amplio refuerzo de la respuesta después de la infección por Omicron (Figura 5A).

La neutralización de Victoria, BA.1, BA.1.1, BA.2 y BA.3 se ensayó mediante neutralización pseudoviral. Los títulos de neutralización de BA.1 fueron más altos en los momentos posteriores. Sin embargo, todos los sueros se obtuvieron de casos infectados por BA.1 y hubo pequeñas pero significativas reducciones en los títulos de neutralización de BA.2 frente a bA. 1 (1.7 y 1.5 veces p=0.0034 y 0.0067 a <14 y >21 días respectivamente), los títulos frente a BA.1.1 vs BA.1 no se redujeron significativamente mientras que a > 21 días el título frente a BA.3 vs BA.1 se redujo 1.7 veces (p=0.0012) (Figura 3D, 5B).

En resumen, tras tres dosis de vacuna, en particular de BNT162b2, se inducen buenos títulos neutralizantes de anticuerpos contra Omicron BA.1 BA.1.1, BA.2 y BA.3, con diferencias mínimas entre el título contra BA.1 BA. 1.1, BA.2 y BA.3. Esto puede indicar que la mayor transmisibilidad de BA.2 no se debe a un mayor escape de la vacuna. Tras la infección por Omicron, en individuos previamente vacunados, se produce un refuerzo de una amplia respuesta de anticuerpos a las variantes de interés y la generación de fuertes respuestas a Omicron. Dado que sólo existen pequeñas diferencias en la neutralización entre BA.1 y BA.2, la sobreinfección por BA.2 de los casos expuestos y vacunados con BA.1 es poco probable, al menos a corto plazo.

Neutralización de B A .4 en com paración con BA.1, BA.1.1, B A .2 y B A .3

También se evaluó la neutralización de BA.4/5 en comparación con los linajes BA.1, BA.1.1, BA.2, BA.3 y la cepa Victoria pandémica temprana de Omicron. Se demostró que BA.4/5 tenía un fenotipo de escape de anticuerpos más extremo que BA.1 y BA.2, y el suero de donantes vacunados triplemente presentaba una reducción de ~2-3 veces en los títulos de neutralización en comparación con la neutralización de BA.1 y BA.2. Además, el suero de los vacunados con infecciones intercurrentes de BA.1 mostró una reducción de ~2-3 veces en los títulos de neutralización frente a BA.4/5 en comparación con BA. 1 y BA.2. Esto sugiere que las vacunas y los mAbs actualmente aprobados pueden ser menos eficaces para prevenir la transmisión de BA.4/5. Por lo tanto, es posible que se necesiten nuevos monoclonales y combinaciones para llenar la brecha y proteger a las personas extremadamente vulnerables y a las que no pueden montar respuestas vacunales adecuadas.

N eutralización de B A .4 p o r suero vacunal

Un panel de lentivirus pseudotipados (Di Genova et al., 2020, "Production, titration, neutralisation and storage of SARS-CoV-2 lentiviral pseudotypes". Figshare preprint.) que expresan el gen S de los sublinajes BA.1, BA.1.1, BA.2, BA.3 y BA.4/5 de Omicron, junto con la cepa relacionada con la pandemia temprana de Wuhan, Victoria, utilizada como control.

Los ensayos de neutralización se realizaron utilizando suero obtenido 28 días después de una tercera dosis de la vacuna Oxford-AstraZeneca ADZ1222 (n = 41) ) (Flaxman et al, 2021, "Reactogenicity and immunogenicity after a late second dose or a third dose of ChAdOx1 nCoV-19 in the UK: a substudy of two randomised controlled trials (COV001 and COV002)". Lancet 398, 981-990.) o la vacuna de Pfizer-BioNtech BNT162b2 ) (Cele et al., 2021, "Omicron extensively but incompletely escapes Pfizer BNT162b2 neutralization". Nature 602, 654-666) (n = 20) (Figura 7 A,B). Para AZD1222, los títulos de neutralización para BA.4 se redujeron 2.1 veces en comparación con BA.1 (p=0.0001) y 1.8 veces en comparación con BA.2 (p=0.0001). Para BNT162b2 los títulos de neutralización se redujeron 3.2 veces (p=0.0001) y 3.1 veces (p=0.0001) en comparación con BA.1 y BA.2 respectivamente. Es probable que estas reducciones en los títulos reduzcan la eficacia de la vacuna, sobre todo a más largo plazo, ya que los títulos de anticuerpos disminuyen de forma natural.

N eutralización de B A .4/5 p o r e l suero de una in fección in tercurrente p o r BA.1

Al inicio del brote de Omicron, se reclutó a voluntarios vacunados que habían sufrido infecciones intercurrentes por Omicron. Las primeras muestras se tomaron <14 días desde el inicio de los síntomas (mediana de 13 días), mientras que las muestras tardías se tomaron > 21 días desde el inicio de los síntomas (mediana de 38 días) n=16. Se realizaron ensayos de neutralización pseudoviral contra el panel de pseudovirus que representan las variantes de interés y los sublinajes Omicron (Figura 7 C, D).

La infección por BA.1 tras la vacunación conduce a una amplia respuesta neutralizante, con títulos elevados frente a todas las VoC, que se potencian en momentos posteriores (Nutalai et al. 2022, "Potentes anticuerpos de reacción cruzada tras el avance de Omicron en las vacunas". Cell (en prensa)). Los títulos de neutralización frente a BA.4 fueron significativamente inferiores a los de BA.1 y BA.2; en el primer momento, los títulos de BA.4/5 se redujeron 1.9 veces (p=0.0001) y 1.5 veces (p=0.0015) en comparación con BA.1 y BA.2 respectivamente. En el punto más tardío, los títulos BA.4/5 se redujeron 3.4 veces (p=0.0001) y 2 veces (p=0.0017) en comparación con BA.1 y BA.2 respectivamente.

Así, BA.4/5 muestra un grado de escape inmunitario de la respuesta vacuna/BA.1 en comparación con BA.1 y BA.2. Todas estas muestras se tomaron razonablemente cerca del momento de la infección, lo que significa que un mayor debilitamiento en los meses intermedios puede hacer que los individuos sean susceptibles de reinfectarse con bA.4/5.

Escape de anticuerpos m onoclonales p o r B A .4/5

Sensibilidad a L452R: Se ha informado previamente que Omi-24, 30, 31, 34 y 41 muestran una eliminación completa de la actividad neutralizante contra Delta, con Omi-06 mostrando una reducción severa de la actividad (Nutalai et al., 2022). Puesto que BA.1 y BA.2 albergan sólo una (T478K) de las 2 mutaciones Delta RBD, mientras que BA.4/5 también albergan L452R, se espera que los cinco mAbs dirigidos a L452 sean eliminados en BA.4/5. Efectivamente, esto es lo que se observa (Figura 8A, Tabla 20). Omi-41 tampoco se neutraliza, lo que se atribuye a las diferencias en las mutaciones en el NTD (Figura 9A).

Para confirmar que los efectos de neutralización observados son directamente atribuibles a alteraciones en las interacciones de los RBDs, también se realizaron análisis de unión de anticuerpos seleccionados a los RBDs BA.4/5 y BA.2 mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) (Figuras 10, 15). Se eligió Omi-31 como representante del conjunto de anticuerpos sensibles a L452R y, como era de esperar, la unión se ve gravemente afectada (Figura 10A).

Dado que se dispone de información detallada sobre la interacción de varios anticuerpos que responden a Omicron con el RBD, las mutaciones BA.4/5 RBD se modelaron en el contexto de estructuras conocidas para Fabs Omicron complejas con BA.1 o Delta RBDs (Dejnirattisai et al., 2022, "SARS-CoV-2 Omicron-B.1.1.529 leads to widespread escape from neutralizing antibody responses". Cell 185, 467-484 e415; Nutalai et al., 2022), (Figura 11). El complejo Omi-31 se muestra en la Figura 11Ay muestra L452 metido perfectamente en un bolsillo hidrofóbico, que es incapaz de acomodar la arginina de mayor carga positiva en BA.4/5 y Delta.

L452R mejora la unión: Omi-32 muestra una neutralización 77 veces mayor de BA.4/5 en comparación con BA.2. El análisis cinético de la unión del Fab a los RBDs sugiere que esto se consigue principalmente mediante un aumento de 5 veces en la velocidad de unión (Figura 10B, C). Esto se explica en gran parte por la interacción favorable de la arginina en 452 que hace un puente salino con el residuo 99 de la cadena pesada (HC) CDR3 (Figura 11B), quizás ayudada por la eliminación de interacciones de carga ligeramente desfavorables en el residuo 493. Es posible que estos cambios electrostáticos mejoren la tasa de activación mediante la dirección electrostática del anticuerpo entrante.

Sensibilidad a F486V: Ampliando la lógica utilizada para entender la sensibilidad a Delta, los restantes anticuerpos afectados por BA.4/5 > BA.2, pero que conservan actividad frente a Delta, son probablemente sensibles al cambio F486V, a saber, Omi-02, 09, 12, 23, 25, 26, 29. La sensibilidad de unión se confirmó mediante el análisis SPR de Omi-12 (Figura 10D, E), que mostró una reducción de casi 1,000 veces en la afinidad. Un ejemplo de la base estructural de la sensibilidad lo proporciona el complejo Omi-25 (Figura 11C), que muestra que la cadena lateral de fenilalanina actúa como un punto caliente de unión, enclavado en una cavidad hidrofóbica que crea interacciones favorables de apilamiento en anillo con Y106 de la CDR3 de HC.

A ctiv idad de anticuerpos com erciales contra B A .4 y B A .5

Se probó un panel de anticuerpos que se han desarrollado para uso terapéutico/profiláctico contra BA.4/5 (Figura 8B, Tabla 21). Muchos de estos anticuerpos ya han sufrido severas reducciones o knock out de actividad contra BA.1, BA.1.1 o BA.2. En el caso del AZD1061 de AstraZeneca, la actividad frente a BA.4/5 fue similar a la de BA.2 (< 2 veces la reducción), mientras que en el caso del AZD8895 se eliminó la actividad residual frente a BA.2. La actividad de la combinación de ambos anticuerpos en AZD7442 (Dong et al., 2021, "Genetic and structural basis for recognition of SARS-CoV-2 spike protein by a two-antibody cocktail". Nature Microbiol. 6, 1233-1244) se redujo 8.1 veces en comparación con BA.2. La actividad residual de REG10987 (Weinreich et al., 2021, "REGN-COV2, a Neutralizing Antibody Cocktail, in Outpatients with Covid-19". N Engl J Med 384, 238-251) contra BA.2 se redujo aún más en BA.4/5, del mismo modo que la actividad neutralizante residual de BA.1 se eliminó para ADG20 (Yuan et al., 2022, "A broad and potent neutralization epitope in SARS-related coronaviruses". bioRxiv. https://doi.org/10.1101/2022.03.13.484037) en BA.4/5. Para S309 (VIR-7831/7832) (Sun y Ho, 2020, "Emerging antibody-based therapeutics against SARS-CoV-2 during the global pandemic". Antib Ther 3, 246-256.), la actividad contra B<a>.4/5 se redujo 1.6 veces en comparación con BA.2.

Por ejemplo, en el caso del AZD8895 (un mAb de genotipo IGHV1-58, Figura 11E), F486 forma un punto caliente de interacción hidrofóbica que será anulado por la mutación a una cadena lateral de valina mucho más pequeña. Los residuos de anticuerpos implicados en las interacciones con F486 están muy conservados entre este genotipo de mAbs, incluidos Omi-12, 253 y Beta-47 (Nutalai et al., 2022, "Potent cross-reactive antibodies following Omicron breakthrough in vaccines". Cell (en prensa); Dejnirattisai et al., 2021, "The antigenic anatomy of SARS-CoV-2 receptor binding domain". Cell 184, 2183-2200 e2122; Liu et al., 2021, "The Beta mAb response underscores the antigenic distance to other SARS-CoV-2 variants". Cell, Host and Microbe 30, 53-68), explicando el grave efecto de la mutación F486V sobre la neutralización de estos mAbs (Figuras 8A, 13).

Neutralización de B A .2.75 p o r suero vacunal

Se construyó un panel de lentivirus pseudotipados como se ha indicado anteriormente (Di Genova et al., 2020) que expresan el gen S de los sublinajes Omicron BA.1, BA.1.1, BA.2, BA.2.12.1, BA.4/5, bA.2.75, junto con Victoria, una cepa pandémica temprana relacionada con Wuhan, utilizada como control. D339H, G446S, N460K y R493Q también se incluyeron como mutaciones únicas en el fondo BA.2. Los ensayos de neutralización se realizaron utilizando suero obtenido 28 días después de una tercera dosis de la vacuna AZD1222 de Oxford-AstraZeneca (n = 41) (Flaxman et al., 2021 "Reactogenicity and immunogenicity after a late second dose or a third dose of ChAdOx1 nCoV-19 in the UK: a substudy of two randomised controlled trials (COV001 and COV002)". Lancet 398, 981-990) o de la vacuna BNT162b2 de Pfizer-BioNtech (n = 22) (Cele et al., 2021; "Omicron extensively but incompletely escapes Pfizer BNT162b2 neutralization". Nature 602, 654-666e) (Figura 17). Para AZD1222, la neutralización de BA.2.75 se redujo 1.2 veces en comparación con BA.2 (p=0.0182) y 1.1 veces en comparación con BA.2.12.1 (p=0.0065), pero aumentó 1.5 veces en comparación con BA.4/5 (p<0,0001) (Figura 17B). En general, hay reducciones en los títulos de neutralización de BA.2.75 del suero vacunal en comparación con BA.2, pero no al nivel observado con BA.4/5.

Neutralización de BA.2. 75 p o r suero de vacunas de in fecciones intercurrentes p o r BA.1 o BA.2

Se tomaron muestras de suero de BA.1 intercurrente de voluntarios vacunados > 28 días desde el inicio de los síntomas (mediana de 38 días; n=16). Se realizaron ensayos de neutralización pseudoviral frente al panel de pseudovirus descrito anteriormente (Figura 17C). Los títulos de neutralización de BA.2.75 fueron similares a los de BA.2, y 1.4 veces (p=0.0052) y 2.0 veces (p=0.0001) superiores a los de BA.2.12.1 y BA.4/5, respectivamente, lo que sugiere que BA.2.75 podría tener menos probabilidades de causar reinfecciones en individuos que han sufrido infecciones intercurrentes por BA.1 que por BA.2.12.1 o BA.4/5.

Se tomaron muestras de suero de BA.2 intercurrente de voluntarios vacunados > 12 días desde el inicio de los síntomas (mediana de 29 días; n=23). Se realizaron ensayos de neutralización pseudoviral frente al panel de pseudovirus Victoria, BA.1, BA.1.1, bA.2, BA.2.12.1, BA.4/5 y BA.2.75 (Figura 17D). En este caso, los títulos de neutralización frente a BA.2.75 se redujeron significativamente en comparación con BA.2 (1.4 veces; P=0.0021), de forma similar a BA.2.12.1, pero aún superior a BA.4/5 (1.4 veces; P=0.0123). En conjunto, BA.2.75 muestra un grado de escape de la respuesta humoral inducida por la infección intercurrente BA.2 pero no por la infección BA.1.

Las m utaciones individuales B A .2.75 tienen efectos diferenciales sobre la neutralización.

Para comprender los efectos de las mutaciones individuales en el RBD BA.2.75, estas mutaciones se introdujeron individualmente en el pseudovirus BA.2 de fondo y su neutralización se ensayó utilizando suero Pfizer BNT162b2 vacunado triplemente (Figura 17E). Los títulos de neutralización para BA.2 se redujeron para 3/4 variantes de mutación única de BA.2, con la mayor disminución para N460K (3.1 veces, p<0.0001), seguido por D339H (1.3 veces, p=0.0006), luego por G446S (1.2 veces, p=0.2312), sin embargo los títulos de neutralización aumentaron 1.5 veces por la mutación de reversión R493Q (p<0.0001). Q493 está presente en todas las vacunas, lo que explica el aumento de la actividad del suero vacunal a esta mutación de reversión.

Escape de anticuerpos m onoclonales p o r B A .2.75

Para diseccionar el modo en que BA.2.75 podría afectar a la actividad neutralizante de los anticuerpos, se utilizaron ensayos pseudovirales para probar un panel de potentes mAbs humanos generado a partir de casos de infección intercurrente por Omicron (títulos de BA.1 IC50 < 0.1 |jg/ml) (Nutalai et al., 2022.). (Figura 19A, Tabla 22). Entre los 27 mAbs específicos de RBD, los pertenecientes a las familias IGHV3-53/66 son los más gravemente afectados. Tres (Omi-16, Omi-29 y Omi-36) mostraron una neutralización completamente anulada de BA.2.75; otros cuatro (Omi-18, Omi-20, Omi-27 y Omi-28) mostraron una reducción > 5 veces superior en comparación con BA.2, lo que concuerda con la observación de que N460 interactúa con el motivo GGS/T altamente conservado de CDR-H2 en las estructuras de los complejos RBD/IGHV-3/66 (Figura 21B) (Dejnirattisai et al. 2021, Liu et al. 2021, Nutalai et al. 2022).

Al igual que BA.2 y BA.4/5, BA.2.75 no es neutralizada por el mAb anti-NTD Omi-41, que sólo interactúa con el NTD de BA.1, BA. 1,1 y BA.3.

Los mAbs Omi también se probaron contra los pseudovirus que codifican mutaciones puntuales únicas en el RBD BA.2 descritas anteriormente (Figura 23, Tabla 24). Los mAbs VH3-53/66 que perdieron la neutralización frente a BA.2.75 también se vieron afectados por la mutación N460K, confirmando la predicción de que este residuo era crítico para la unión de varios miembros de esta familia de genes públicos. Curiosamente, la mutación BA.2+N460K aislada muestra un mayor impacto que la BA.2.75 en la actividad de varios mAbs: el título de neutralización de Omi-03 (IGHV3-53) se redujo 50 veces con BA.2+N460K, pero sólo 2 veces con BA.2.75; Omi-17 (IGHV3-66) se anuló por completo con BA.2+N460K, pero sólo se redujo 4 veces con BA.2.75; y Omi-33 (IGHV3-33) se redujo 7 veces con BA.2+N460K, pero no se observó ningún cambio con BA.2.75. Así pues, otras mutaciones en BA.2.75 podrían haber mitigado el efecto de la mutación N460K, en particular la mutación R493Q.

Curiosamente, BA.2.75 es más sensible a Omi-32 (IGHV-3-33) que BA.2, con un aumento de 8 veces en el título de neutralización. El aumento de la actividad de Omi-32 se debe probablemente a una mayor interacción del anticuerpo con el RBD a través de la mutación G446S (Figura 19A, Tabla 22).

Para confirmar que el cambio observado en las actividades neutralizantes está asociado a alteraciones en la interacción de los RBDs, se realizaron análisis de unión de anticuerpos seleccionados a los RBDs BA.2.75 y BA.2 mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) (Figura 24). La unión de Omi-29 (IGHV3-53) y Omi-36 (lGHV3-66) a BA.2.75 se vio gravemente afectada, y Omi-18 y Omi-20 mostraron reducciones de 8 veces en comparación con BA.2. Por otra parte, se observó un aumento de 2 veces en la afinidad de unión de Omi-32 para BA.2.75 en comparación con BA.2, en línea con el título de neutralización mejorado observado.

Escape de m onoclonales com erciales contra B A .2.75

Se evaluó la sensibilidad de un panel de mAbs que han sido desarrollados como terapéuticos contra BA.2.75 (Figura 19B, Tabla 23). Los perfiles de neutralización son en general similares entre BA.2.75 y BA.2; sin embargo, además de los 6/12 mAbs (REGN10933, ADG10, ADG20, ADG30, Ly-CoV555, Ly-CoV16) que ya han sufrido una pérdida completa de actividad neutralizante para BA.2, la actividad residual de REG10987 (Weinreich et al., 2021, "REGN-COV2, a Neutralizing Antibody Cocktail, in Outpatients with Covid-19". N Engl J Med 384, 238-251) contra BA.2 se eliminó además para BA.2.75 debido a la mutación G446S (Dejnirattisai et al, 2022). Para el AZD1061 de AstraZeneca, la actividad contra BA.2.75 fue similar a la de BA.2 (reducción <3 veces); mientras que el título de AZD8895 se restauró a 0.008 |jg/ml para BA.2.75 desde 1.333 |jg/ml para BA.2, un aumento de 167 veces en la actividad. Como resultado, AZD7442 (una combinación de AZD8895 y AZD1061) (Dong et al., 2021, "Genetic and structural basis for recognition of SARS-CoV-2 spike protein by a two-antibody cocktail". Nature Microbiol. 6, 1233 1244) mostró una actividad similar contra BA.2.75 y BA.2 (reducción de 2 veces). Los resultados pueden explicarse por la estructura del complejo ternario del ancestral SARS-CoV-2 RBD/AZD1061/AZD8895 (Dong et al., 2021). G446 tiene contactos con CDR-L2 Y55 y W56 de AZD1061, la mutación G446S inducirá choques estéricos (Figuras 21D, E). Mientras que el CDR-H2 del AZD8895 se sitúa por encima y establece un enlace de hidrógeno con Q493 del RBD, una arginina en 493 chocaría severamente con el CDR-H2 del mAb (Figuras 21F, G). La actividad de S309 (Sun y Ho, 2020, "Emerging antibody-based therapeutics against SARS-CoV-2 during the global pandemic". Antib Ther 3, 246-256) se multiplica por 3 en BA.2.75 en comparación con BA.2, lo que sugiere que la mutación D339H en BA.2.75 reduce el impacto de la mutación G339D precedente en BA.2 sobre la actividad de S309 . LY-CoV1404 (bebtelovimab) (Westendorf et al., 2022, "LY-CoV1404 (bebtelovimab) potently neutralizes SARS-CoV-2 variants". Cell Rep 39, 110812) es el único mAb en el que la neutralización se mantiene por completo en todos los sublinajes de Omicron.

Escape de los anticuerpos m onoclonales p o r parte de los sublinajes BA.2, B A .4 y B A .5

También se observó desgaste de la actividad de mAb con los nuevos sublinajes BA.2, BA.4 y BA.5 (incluidos BA.4.6, BA.2.75, BA.2.75.2, BA.2.3.20, BJ.1, BQ.1, BQ.1.1, XBB, XBB.1 y XBB.1.5) (Figura 34), siendo XBB el que presentó el escape más extremo. La actividad de los 9 mAbs IGHV3-53/66 se redujo >100 veces, con una eliminación completa de la actividad en 5/9 por BA.2.75.2. Sólo un único mAb, Omi-42, no se vio afectado por todas las variantes. Omi-42 es inusual, ya que se une en la parte posterior del hombro izquierdo de la RBD (Nutalai et al., 2022) en una región que aún no ha sido objeto de mutación por el conjunto de variantes BA.2 de reciente aparición, tal vez debido a la relativa rareza de los anticuerpos que se unen en esta región.

Más datos en Nutalai, et al. (2022) "Potent cross-reactive antibodies following Omicron breakthrough in vaccinees", Cell 185(12), 2116-2131; Huo et al. (2022) "Humoral responses against SARS-CoV-2 Omicron BA.2.11, BA.2.12.1 and BA.2.13 from vaccine and BA.1 serum", Cell discovery 8, 119; y Huo, et al. (2022) "A delicate balance between antibody evasion and ACE2 affinity for Omicron BA.2.75" Cell Reports, 42(1).2023.

N eutralización de las subvariantes BA.2.11, B A .2.12 y BA .2.13 de BAA p o r e l suero de la vacuna

También se evaluó la capacidad de unión al receptor de las subvariantes BA.2 BA.2.11, BA.2.12 y BA.2.13. Se generó una estructura cristalina de alta resolución de BA.2.12.1 RBD, que muestra una sensibilidad diferencial de las nuevas subvariantes BA.2 BA.2.11, BA.2.12 y BA.2.13 a muestras de suero y anticuerpos monoclonales (mAbs) en comparación con BA.2.

Teniendo en cuenta las propiedades fisicoquímicas de la cadena lateral del residuo 452, se esperaría que BA.2.13 fuera un cambio relativamente modesto; L a M aumentará el tamaño de la cadena lateral pero sigue siendo hidrofóbica. L a Q en BA.2.12.1 introduce cierto carácter polar, mientras que BA.2.11 es la más radical con L a R introduciendo un gran aminoácido básico.

N eutralización de las subvariantes BA.2.11, B A .2.12 y BA .2.13 de B A.2 p o r suero vacunal

Para evaluar la susceptibilidad de las subvariantes BA.2 a la neutralización por sueros inmunes, se realizaron ensayos de neutralización con lentivirus pseudotipados que expresaban el gen Spike de BA.2.11, BA.2.12 y BA.2.13, utilizando una serie de muestras de suero.

En primer lugar, se observó el perfil de neutralización con sueros recogidos 4 semanas después de una tercera dosis de la vacuna AZD1222 de Oxford-AstraZeneca (n = 41) o de la vacuna BNT162b2 de Pfizer-BioNtech (n = 18). No se observó ninguna pérdida significativa del título de neutralización en comparación con BA.2. De hecho, BA.2.13 mostró un aumento significativo (1.6 veces, p<0.0001) para los vacunados con AZD1222 (Figura 27a, b). Esto contrasta con un informe reciente (Cao, Y., et al., "BA.2.12.1, BA.4 and BA.5 escape antibodies elicited by Omicron infection". Nature, 2022), donde los sueros recogidos de vacunados con dosis triples (4 semanas después de una tercera dosis de la vacuna inactivada CoronaVac o un refuerzo de ZF2001 después de dos dosis de CoronaVac) mostraron reducciones significativas del título de neutralización tanto para BA.2.12.1 como para BA.2.13 (no se analizó BA.2.11).

N eutralización de las subvariantes BA.2.11, BA .2.12 y BA .2.13 de B A.2 p o r e l suero de vacunas de in fecciones intercurrentes BA.1 o B A .2

A continuación, se examinó el perfil de neutralización de las muestras de suero recogidas de vacunados infectados con BA.1. Se tomaron muestras (n = 14) >28 días después del inicio de los síntomas (mediana de 38 días); todos los individuos convalecientes habían recibido al menos 2 dosis de vacuna, 3 de ellos recibieron una tercera dosis de vacuna tras la infección por Omicron. Hubo reducciones significativas en el título de neutralización para las tres variantes en comparación con BA.2, con la mayor disminución para BA.2.11 (1.6 veces, P = 0.0067), seguida de BA.2.12.1 (1.4 veces, P = 0.0085) y BA.2.13 (1.2 veces, P = 0.0085) (Figura 27c). En conjunto, estas observaciones sugieren que, en comparación con BA.2, sus subvariantes no muestran un escape inmunitario humoral más fuerte en individuos vacunados con tres dosis de AZD1222 o BNT162b2. Sin embargo, en el caso de los vacunados que sufrieron una infección intercurrente por la variante BA.1, independientemente del tipo de vacuna que hubieran recibido, las variantes BA.2 son más capaces de evadir la respuesta humoral, aunque se induce una amplia respuesta de anticuerpos neutralizantes, con títulos elevados frente a todas las variantes de interés (Nutalai, R., et al., "Potent cross-reactive antibodies following Omicron breakthrough in vaccines". Cell, 2022. 185(12): p. 2116 2131 e18). Esto puede indicar la diferente presión selectiva sobre BA.2 y sus subvariantes en un fondo elevado de infección intercurrente. Dado que los títulos de anticuerpos disminuyen de forma natural a lo largo del tiempo, se espera que las personas con infecciones intercurrentes por la subvariante BA.1 sean más susceptibles a la reinfección por la subvariante BA.2.

Para dilucidar aún más las respuestas diferenciales entre BA.2 y sus subvariantes, se realizaron ensayos pseudovirales con un panel de potentes anticuerpos monoclonales humanos (mAbs) generados a partir de casos de infección intercurrente por BA.1 (Nutalai, et al., 2022). (Figura 29). En consonancia con la observación estructural y los resultados de neutralización, la mayor reducción del título de neutralización se observó para BA.2.11, seguido de BA.2.12.1 y BA.2.13, la neutralización de BA.2.11 se anuló completamente para 5/27 mAbs (Omi-06, Omi-24, Omi-30, Omi-31 y Omi-34). La actividad neutralizante frente a BA.2.12.1 también se redujo en diversos grados para el mismo conjunto de mAbs, mientras que los perfiles se mantuvieron prácticamente inalterados frente a BA.2.13. Entre ellos, Omi-06 pertenece a la familia IGVH4-4, y los otros cuatro mAbs pertenecen a la familia IGVH1-69. De hecho, estudios estructurales previos predijeron que Omi-06 y Omi-31 eran sensibles a la mutación L452R en Delta (Nutalai, et al., 2022). Para confirmar que los efectos diferenciales de neutralización observados son directamente atribuibles a los cambios en la unión de RBD, se utilizó la resonancia de plasmón superficial (SPR) para comparar el comportamiento de unión de BA.2 y BA.2.12.1 RBD, utilizando Omi-06 y Omi-31 como ejemplos. Como era de esperar, las afinidades se redujeron; para Omi-06, la unión de BA.2.12.1 RBD fue 15 veces más débil que la de bA.2 y, sorprendentemente, la unión de BA.2.12.1 RBD a Omi-31 fue aproximadamente 1300 veces más débil (Figura 30).

Las mutaciones de spike de las variantes BA.2.11, BA.2.12 y BA.2.13 podrían hacerla ligeramente más transmisible que la BA.2. Sin embargo, en comparación con BA.2, no parecen haber adquirido un mayor escape inmunitario humoral en los vacunados sanos que han recibido tres dosis de la vacuna Oxford-AstraZeneca o Pfizer-BioNtech BNT162b2. Este resultado difiere del de los vacunados que han recibido la vacuna CoronaVac de triple dosis, en los que se observaron reducciones significativas de los títulos de neutralización (Cao, Y, et al., BA.2.12.1, BA.4 y BA.5 anticuerpos de escape provocados por la infección Omicron. Nature, 2022). No obstante, se observaron reducciones significativas de los títulos de neutralización en los vacunados que habían sufrido infecciones irruptivas de BA.1, independientemente del tipo de vacuna recibida, quizás debido en parte a la anulación parcial o completa de la actividad neutralizante de los anticuerpos pertenecientes a la familia IGVH1-69, muchos de los cuales son sensibles a la mutación en la leucina 452 del RBD de Spike. Esto sugiere que los sublinajes Omicron en continua evolución son capaces de evadir las respuestas inmunes humorales montadas por BA.1, lo que implica que el spike o RBD de BA.1 podría no ser un inmunógeno sustancialmente mejor que el de la cepa ancestral Wuhan para el desarrollo de la vacuna SARS-CoV-2 de nueva generación.

BA.2.12.1 Estructuras cristalinas

La estructura cristalina de RBD BA.2.12.1 se determinó a 2.38 A como un complejo ternario con un Fab neutralizante y un nanobody (Figura 27h-m), demostrando que las diferencias estructurales se restringen esencialmente a la cadena lateral del residuo 452.

Neutralización de B A .2.75.2 p o r m A bs fabricados después de la infección p o r BA.1

Se invirtió en la neutralización de BA.2.75.2 por un panel de mAbs realizados tras la infección por BA.1 (Nutalai et al., 2022). Se observó un desgaste de la actividad mAb frente a BA.2.75.2 (Tabla 32a). La actividad de los 9 mAbs IGVH3-53/66 se redujo >100 veces, con una eliminación completa de la actividad en 4/9 por BA.2.75.2. Sólo un único mAb, Omi-42 no se vio afectado por todas las variantes mostrando neutralización de las mutaciones BA.4 14 descritas con IC50 de 11ng/ml. Omi-42 es inusual, ya que se une en la parte posterior del hombro izquierdo de la RBD (Nutalai et al., 2022) en una región que aún no ha sido objeto de mutación, tal vez debido a la relativa rareza de los anticuerpos que se unen en esta región.

También se probó un panel de mAb que se han desarrollado para uso clínico (Dong et al., 2021; Sun y Ho, 2020; Weinreich et al., 2021; Yuan et al., 2022). Muchos de ellos se vieron gravemente afectados por diversas variantes. La actividad de todos los mAbs excepto S309 fue eliminada por una o más variantes incluyendo Ly-CoV1404 (Westendorf et al., 2022) (ver Tabla 32b).

Títulos de neutralización sérica de la vacuna P fizer B N T162b2 p ara BA.2. 75.2 y EA.2.3.20.

Neutralización en suero recogido 28 días después de una tercera dosis de la vacuna Pfizer BNT162b2 (Polack et al., 2020) y en casos infectados con BA. 1, BA.2 de BA.4/5 las características de estos sujetos se describen en los métodos.

Utilizando suero obtenido 28 días después de BNT162b, los títulos de infección a BA.2.75.2 mostraron grandes reducciones en comparación con BA.2 y BA.4, y fueron los más bajos de todas las variantes probadas en comparación con la cepa ancestral Victoria. La reducción de los títulos a BA.2.75.2 contrastó con BA.2.75, que sólo mostró una modesta reducción en comparación con BA.2. También se produjeron grandes reducciones de los títulos a BA.2.3.20.

Utilizando suero obtenido después de BA. 1, BA.2 y BA.4/5, se produjeron grandes reducciones similares en los títulos de neutralización de BA.2.75.2 y BA.2.3.20 en comparación con BA.4/5. La neutralización de las mutaciones BA.4 14 RBD descritas anteriormente también se redujo en comparación con BA.2 y BA.4/5 pero no mucho más que BA.2.75.2 lo que indica un efecto dominante de las mutaciones en BA.2.75.2

Neutralización de BA4.6 p o r e l suero de vacunas de infecciones irruptivas BA.1 o BA.2

Aquí estudiamos el perfil de neutralización de BA.4.6 utilizando: Suero vacunal Pfizer-BioNtech, suero inmunitario de ruptura vacunal BA.1, BA.2 y BA.4/5, así como paneles de anticuerpos monoclonales. Sorprendentemente, mostramos una mayor evasión de anticuerpos de BA.4.6, proporcionando orientación para el diseño de vacunas y el uso de monoclonales terapéuticos.

Para evaluar la capacidad de evasión de anticuerpos de BA.4.6, construimos un panel de lentivirus pseudotipados (Di Genova, C., et al., Production, titration, neutralisation and storage of SARS-CoV-2 lentiviral pseudotypes. figshare, 2020.) que expresaban el gen S de BA.4.6 y otras variantes de SARS-CoV-2 junto con la cepa relacionada con la pandemia temprana de Wuhan, Victoria, utilizada como control. En primer lugar, se examinó el perfil de neutralización con sueros recogidos 4 semanas después de una tercera dosis de la vacuna BNT162b2 de Pfizer-BioNtech (n = 22). En comparación con BA.4/5, los títulos de neutralización frente a BA.4.6 se redujeron 2 veces (p<0.0001) para los sueros BNT162b2 (Figura 28a).

Se evaluó el perfil de neutralización de muestras de suero recogidas de vacunados infectados con BA.1. Se tomaron muestras (n = 16) >28 días después del inicio de los síntomas. Las muestras BA.2 (n = 23) se tomaron >12 días después del inicio de los síntomas o BA.4/5. Las muestras (n = 11; todos vacunados menos uno) se tomaron > 23 días después de la aparición de los síntomas (Figura 28b-d). Los títulos de neutralización frente a BA.4.6 se redujeron significativamente en comparación con BA.4/5 tanto en las muestras de suero de BA.1 de ruptura (1.5 veces; P=0.0006) como en las de BA.2 (1.2 veces; P=0.0384). En particular, BA.4.6 fue capaz de escapar eficazmente a la neutralización por muestras de suero de infecciones de ruptura BA.1, mostrando una reducción sustancial de los títulos en comparación con BA.1 (4.4 veces; p=0,0001), BA.2 (3 veces; p=0.0009) y BA.4/5 (1.5 veces; p=0.0006). Se observó un pequeño aumento no significativo de los títulos de neutralización frente a BA.4.6 en la cohorte de avance de la infección BA.4/5 en comparación con BA.4/5.

Para caracterizar aún más las propiedades antigénicas de escape de BA.4.6, se realizaron ensayos pseudovirales con un panel de potentes mAbs humanos generados a partir de convalecientes que habían superado la infección por BA.1 (Nutalai et al., 2022) (Figura 28e). En general, los perfiles de neutralización de BA.4.6 eran similares a los de BA.4/5. Sin embargo, la actividad residual de Omi-35 (IC50 = 1.687 pg/mL) se redujo aún más para BA.4.6, y la potencia de Omi-32 y Omi-33 contra BA.4/5 (IC50 = 0.035 y 0.013 pg/ml, respectivamente) se redujo por completo para BA.4.6. La pérdida de actividad de Omi-32 podría explicarse por la interrupción de la interacción entre H1 y R346, tal y como ilustra un análisis estructural previo (Nutalai et al., 2022).

N eutralización de BA.4.6, p o r m A bs de uso clínico

Por último, se evaluaron las actividades de neutralización de varios mAbs de uso clínico (Figura 28f). La potencia de AZ1061/cilgavimab frente a BA.4/5 quedó completamente anulada frente a BA.4.6, lo que condujo a una pérdida total de la actividad de AZ7742/Evusheld (una combinación de AZ1061/cilgavimab y AZ8895/tixagevimab que ya es inactiva frente a BA.4/5). La actividad de S309/sotrovimab (que ya no está autorizado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE.UU. FDA para el tratamiento de COVID-19 desde abril de 2022 debido a su ineficacia contra BA.2) se redujo aún más en comparación con BA.2 y BA.4/5. Por lo tanto, esto deja a Ly-Cov1404 / bebtelovimab como la única opción para el tratamiento de BA.4.6.

En resumen, BA.4.6 mostró una mayor reducción de la neutralización por el suero de los vacunados con triple dosis de Pfizer, así como de BA. 1 y Ba .2 en convalecientes vacunados recuperados en comparación con BA.4/5. En particular, BA.4.6 no parece ser más resistente a la neutralización por el suero de BA.4/5 en caso de infección intercurrente en comparación con otras variantes. Todo ello sugiere que existe una gran probabilidad de infección o de infección intercurrente por BA.4.6 a menos que uno haya sido vacunado triplemente y se haya recuperado de infecciones por BA.4/5, lo que parece proporcionar cierta protección frente a BA.4.6.

A partir de septiembre de 2022, la vacunación de refuerzo bivalente, que combina la cepa ancestral con Omicron BA.1, se está implantando en el Reino Unido, y ha sido autorizada recientemente por la FDA. Queda por ver la eficacia de estos refuerzos bivalentes para prevenir la infección por BA.4.6. Por último, BA.4.6 ha mermado aún más la actividad de Evusheld, que permaneció activo frente a BA.4/5; como resultado, ahora sólo LY-CoV1404/bebtelovimab conserva su potencia frente a todas las variantes circulantes de SARS-CoV-2.

Tem as sistem áticos en las in teracciones m Ab

Tanto Omi-3 (representante de la familia de genes IGVH3-53) como AZD8895 (IGVH1-58) establecen contactos con F486. Mientras que la mutación F486V tiene poco efecto sobre Omi-3 (Figura 10F, G, 11F), reduce seriamente la neutralización de AZD8895 y otros mAbs IGVH1-58, por ejemplo Omi-12 (Figura 10D, E, 11E). Es notable que mientras que los numerosos anticuerpos de la serie Omi pertenecientes a las familias de genes IGVH3-53 e IGVH3-66 estrechamente relacionadas (9/28 en total Figura 8A Tabla 21) son casi totalmente resistentes a los cambios BA.4/5, la gran mayoría de los anticuerpos de estas familias de genes provocados contra variantes anteriores son eliminados en BA.1 y BA.2 (Nutalai et al., 2022), lo que concuerda con la selección de un subconjunto de anticuerpos por la infección intercurrente Omicron que son insensibles a las mutaciones BA.4/5 adicionales.

Los efectos sobre los anticuerpos con epítopos muy similares pueden variar drásticamente, y esto es igualmente cierto para los anticuerpos que tienen 452 o 486 en el centro de su huella de unión. Así, Omi-31 (IGVH1-69) y Omi-32 (IGVH3-33), ambas se unen delante del hombro derecho con su CDR-H3 posicionado cerca de 452, mientras que la actividad de Omi-31 está abolida por L452R (como se ha detallado anteriormente), Omi-32 está marcadamente aumentada (Figura 8A, 11A, B). Del mismo modo, Omi-25 y Omi-42 pertenecen a la familia de genes IGVH3-9 y sus huellas se encuentran en la región 486 (Figura 11C, D). Omi-25 entra en contacto con F486, por lo que se suprime la neutralización de BA.4/5. Por el contrario, Omi-42 no contacta con ninguno de los dos sitios de mutación y la neutralización se mantiene completamente para BA.4/5 (Figura 10H, I, 11D).

M apeo fino de la unión de anticuerpos R BD m ediante m ediciones de com petición.

Se utilizó una matriz de mediciones BLI por pares para mapear los potentes mAbs Omicron de unión RBD y varios mAbs prepandémicos de posición de unión conocida.

El método arrojó una predicción coherente. Los mAbs se segregan en un conjunto restringido de epítopos, que parecen ser un subconjunto de los epítopos observados para el virus pandémico temprano, y son bastante distintos del foco observado para Beta. Esencialmente, los anticuerpos se agrupan en dos regiones, una que incluye los anticuerpos de tipo VH3-53 y VH3-66 está hacia la parte posterior del cuello/hombro izquierdo, extendiéndose hasta la parte superior del hombro izquierdo, mientras que la otra está en la parte frontal de la región del cuellohombro derecho, extendiendose hacia el sitio de unión del anticuerpo conocido S309. Esta región está ocupada por los anticuerpos de la familia VH1-69, con la excepción de Omi-2 que se sitúa en el otro cluster mAb Omi-09 que muestra una neutralización reducida de las posiciones Beta y Gamma cerca del residuo 484 que está mutado de Glu a Lys en BetalGamma y Ala en Omicron. VH1-69 mAb Omi-24, 30, 31 y 34, que muestran una neutralización reducida de Delta se sitúan cerca del residuo 452 que está mutado de Leu a Arg en Delta.

E structuras de com plejos anti-O m icron Fab/RED.

Se realizaron análisis estructurales de potentes mAbs Omicron seleccionados. Se determinaron las estructuras cristalinas de complejos de Omicron BA.1 RBD con 3 Fabs diferentes: Omi- 3, 9 y 12. El complejo de Omi-12 estaba a baja resolución (5.5 A), por lo que la estructura del Fab solo se determinó a alta resolución y se ajustó a cuerpo rígido para obtener la estructura del complejo.

Omi-3 pertenece a la familia de genes VH3-53 y demuestra cómo esta familia de genes puede adaptarse para ser ampliamente neutralizante contra todas las variantes principales del SARS-CoV-2 (pero, como todos los potentes anticuerpos Omicron, no se une al RBD del SARS-CoV-1). Un problema fundamental para estos anticuerpos es que la mayoría de los VoC albergan la mutación N501Y, que introduce un choque estérico con la CDR1 de LC (L1) capaz de anular la unión de la gran mayoría de los anticuerpos que contienen VH3-53. Sin embargo, se han descrito previamente dos mecanismos para desplazar L1 y evitar este choque (Dejnirattisai et al., 2021b; Liu et al., 2021b). En mAb-222, aislado de individuos infectados con cepas pandémicas tempranas, se inserta una prolina en el residuo 30 que puede empaquetarse contra Tyr-501 sin chocar (Dejnirattisai et al., 2021b), lo que le permite neutralizar eficazmente las variantes Alfa, Beta y Gamma. Beta-27 utiliza un mecanismo alternativo, alargando el bucle HC CDR3 (H3) a 11 residuos desde los 9 habituales, desplazando L1 para producir suficiente espacio para permitir que 501Y se estabilice mediante interacciones de cadena principal que confieren una reactividad cruzada similar (Liu et al., 2021b).

Omi-3 utiliza el mismo mecanismo que Beta-27 para acomodar la mutación N501Y, aunque el H3 de Omi-3 es de nuevo un residuo más largo. Otros anticuerpos VH3-53 Omicron (Omi-18 y Omi-29) tienen H3s muy similares a Beta-27 y presumiblemente utilizan el mismo mecanismo. Esta configuración L1 también es compatible con la mutación Y505H en Omicron. Sin embargo, ni 222 ni Beta-27 pueden neutralizar eficazmente a Omicron y esto puede deberse a características específicas del bucle H3 que entra en estrecho contacto con la mutación Q493R de Omicron.

Omi-9 es uno de los tres mAbs VH3-30 y se une a través del hombro izquierdo del RBD. Omi-9 muestra una neutralización relativamente débil de Beta y Gamma (Figura 2). Otros anticuerpos con un alto grado de similitud de secuencia se unen de forma similar, con H3 contactando con el residuo 484. Aunque el complejo Omi-9/BA.1 es de menor resolución (4.2 A), está claro que H3 contacta con el residuo 484 explicando la sensibilidad a E484K en Beta y Gamma mientras que E484A en Omicron es tolerado.

Omi-12 pertenece a la familia genética VH1-58 (es el único miembro de esta familia entre los 28 potentes anticuerpos Omicron). Al igual que Omi-12, varios miembros de esta familia de genes tienen un sitio de glicosilación en el residuo 102 de la CDR3 de la cadena pesada, cuya función no está clara. Los anticuerpos VH1-58 provocados durante la pandemia temprana o la infección por virus beta muestran una capacidad reducida para neutralizar Omicron, por ejemplo, mAb 253, Beta-47 y el anticuerpo conocido D (AZD8895) muestran una reducción de la actividad de Omicron BA.1 vs Victoria respectivamente.

En cambio, Omi-12 se ha adaptado y puede neutralizar potentemente a Omicron y a todas las VoC (Figura 2 A, B). Los anticuerpos VH1-58 se unen a un epítopo del hombro izquierdo, H3 contacta con S477N, pero una mutación en esta posición en Iota no tuvo ningún efecto sobre la neutralización mAb VH1-58 utilizando un ensayo de pseudovirus. Además, el mAb 253 sigue siendo capaz de neutralizar Delta a pesar de la mutación T478K.BA.2 con mAb pandémico temprano 150 (VH3-53).Se observó actividad residual detectable con BA.1, BA.1.1 y BA.2 (BA.3 no se sometió a ensayo). Se obtuvieron dos estructuras complejas en diferentes grupos espaciales que eran muy similares y proporcionaron 3 vistas independientes del complejo. mAb 150 se une en una pose similar a la observada anteriormente para el virus pandémico temprano, sin embargo, se traduce y forma interacciones más flojas, consistentes con la pérdida casi completa de la actividad de neutralización. Esto demuestra el dramático impacto de las mutaciones acomodaticias encontradas en Omi-3.

Curiosamente, en BA.2 los tres residuos de serina mutados en BA.1 RBD: S371L, S373P y S375F en el bucle adyacente al bolsillo de unión a lípidos también están silenciados en BA.2, pero la mutación en 371 es a una Phe, lo que significa que es probable que se trate de una mutación puntual única de la pandemia temprana, mientras que la mutación S317L en BA.1 requiere dos mutaciones. Por lo tanto, BA.2 puede tener características comunes a versiones anteriores del linaje Omicron. Además, las distintas vistas proporcionadas de esta parte de la estructura muestran que adopta una serie de conformaciones diferentes. Esto se debe probablemente a los diferentes contactos cristalinos y refleja la flexibilidad en esta región de bucle. Es probable que esto tenga una función biológica, ya que la mutación Ser requería un cambio de doble codón y posiblemente afecte a la presentación de los RBDs. Dado que tenemos múltiples vistas de este bucle en el virus pandémico temprano, VoC, Omicron BA.1 y BA.2 podemos ver que la flexibilidad se mantiene en todas las variantes.

M odelización de los efectos sobre anticuerpos com erciales conocidos seleccionados, pandem ia tem prana y Beta m A b p ara los cam bios en BA.1, BA.1.1 y B A .2

Anticuerpo conocido A (REGN 10987) y B (10933):El anticuerpo conocido B (REGN 10933) se une a la parte posterior del hombro izquierdo y el REG<n>10987 al hombro derecho. La actividad de ambos es eliminada por el linaje Omicron aparte del Anticuerpo Conocido A (REGN 10987) con BA.2. El Anticuerpo Conocido B (REGN 10933) H2 contacta con el residuo 493 y como Q493R está presente en todas las cepas de Omicron, la actividad neutralizante frente a Omicron se pierde universalmente. El Anticuerpo Conocido A (REGN 10987) H2 contacta con el residuo 446. BA.2 carece únicamente de la mutación G446S, por lo que regn10987 conserva cierta capacidad de neutralización.

Anticuerpos Conocidos C (AZD1061) y D (AZD8895):Los anticuerpos conocidos C (AZD1061) y D (AZD8895) se unen a la parte posterior del hombro izquierdo y a la parte anterior del hombro derecho respectivamente, ambos muestran una neutralización reducida. El anticuerpo conocido C (AZD1061) sigue siendo capaz de neutralizar BA.2 y BA.3 (~ 10 veces menos), pero la neutralización de BA.1 se reduce > 100 veces en comparación con Victoria y BA.1.1 >1000 veces en comparación con Victoria. El anticuerpo conocido C (AZD1061) está afectado debido a los contactos con las mutaciones G446S (ausente en BA.2 y bA.3) y R346K (Ba .1.1) (contactadas por L2 y H3). El anticuerpo conocido D (AZD8895) es un anticuerpo VH1-58 y contacta con los residuos 477 (H3) y 493 (H2) y está comprometido por las mutaciones S477N y Q493R universalmente presentes en el linaje Omicron. El anticuerpo conocido E (AZD7442) (una combinación de C y D) mantiene cierta actividad neutralizante contra las cepas Omicron como suma de sus componentes.

Anticuerpos ConocidosFG y H:Todos los anticuerpos conocidos F, G y H sufren una considerable pérdida de actividad contra Omicron. La actividad de los anticuerpos conocidos F y H se pierde completamente, mientras que la actividad del anticuerpo conocido G (ADG20) en Omicron se reduce 276 veces.

Anticuerpos Conocidos I y J:Se elimina la actividad de ambos anticuerpos en todo el linaje Omicron. El Anticuerpo Conocido J (Ly-CoV16) (VH3-53) realiza amplias interacciones con N501 e Y505 a través de L1 y L3, lo que lo hace sensible a mutaciones en estos residuos. El Anticuerpo Conocido I (Ly-CoV-555) es vulnerable a la mutación E484K en delta, pero probablemente tolera la E484A; sin embargo, también contacta con el residuo 493, por lo que el anticuerpo es universal.

La mutación Q493R de Omicron anulará la unión en todos los casos.

Anticuerpo Conocido K (S309):El Anticuerpo Conocido K (S309) conserva una actividad razonable en todo el linaje Omicron. S309 se une en el flanco derecho con H3 contactando con los glicanos G339 y N343, este último cerca de las mutaciones Serina 371, 373 y 375. La mutación S371F en BA.2 (a diferencia de S371L) puede afectar a la unión, lo que resulta en una actividad ligeramente más débil con este virus.

Estructura de la afin idad de B A .2 R BD y A CE2

La afinidad de los RBDs Omicron BA.1, BA.1.1, BA.2 y BA.3 por ACE2 se midió mediante SPR y BLI. La afinidad de BA.1 estaba a la par con la del virus temprano, 8 nM y 7 nM respectivamente (afinidades de unión para Omicron RBDs mostradas enTablas 14y18), lo que implica que el aumento de afinidad impartido por S477N, Q498R y N501Y está contrabalanceado por otras mutaciones en la huella de ACE2. La afinidad de BA.2 aumentó ligeramente en comparación con el virus temprano (~1.5 veces x e Y nM respectivamente). Sobre la base de mediciones anteriores de las contribuciones de las mutaciones individuales a la afinidad de unión, G496S y la triple mutación S371L, S373P y S375F reducen la unión en 2 veces y 2.2 veces respectivamente, mientras que BA.2 carece de G496S y tiene S371F. Esto puede explicar parte de la diferencia, pero lo más probable es que las mutaciones en BA.2 en el borde de la huella de ACE2 aumenten la unión. Así lo confirma la estructura del BA.2/ACE2.

Afinidad de B A .4/5 R BD y ACE2.

La afinidad de BA.4/5 RBD por ACE2 también se midió mediante SPR (Figura 12A-D). La afinidad de BA.4/5 RBD aumentó en comparación con el virus ancestral (Wuhan), BA.1 y BA.2 (aproximadamente 3 veces , 3 veces y 2 veces, respectivamente (BA.4/5/ACE2 KD = 2.4 nM) (Dejnirattisai et al., 2022; Nutalai et al., 2022), lo que se atribuye principalmente a un aumento de la semivida de unión. La modelización del complejo ACE2/RBD sugiere que la mayor parte de este efecto procede del complemento electrostático entre ACE2 y el RBD aportado por la mutación L452r (Figura 12E-G).

Afinidad de BA.2.75 R BD y A CE2

También se utilizó la resonancia de plasmón superficial (SPR) para caracterizar la interacción entre ACE2 y el RBD BA.2.75. La tasa de desactivación fue muy lenta, lo que condujo a una afinidad subnanomolar (BA.2.75/ACE2 KD = 0.45 nM) (Figuras 18A, B). Esto representa un aumento considerable de la afinidad en comparación con BA.2 (9 veces) (Figura 18C), e incluso mayor que BA.4/5 (5 veces) (Figura 18D), que se une a ACE2 con mayor afinidad que BA.2 (Tuekprakhon et al., 2022). BA.2.75 resultó ser el ligando más potente de ACE2 entre todos los VoC de SARS-CoV-2, incluido Alfa (KD de Alfa/ACE2 = 1.5 nM; Figura 18E), y el primer VoC de SARS-CoV-2 en tener una afinidad subnanomolar.

No se pudo expresar BA.2+N460K RBD, pero también se midió la afinidad de unión de BA.2+R493Q RBD a ACE2 (Figura 18F) (KD = 0.55 nM). Esto confirma que la mutación de reversión R493Q contribuye a la alta afinidad de BA.2.75 RBD.

Im pacto de las m utaciones en B A .2.75

La constelación de mutaciones en BA.2.75 en comparación con BA.2 tiene efectos opuestos sobre la neutralización. La mutación de reversión R493Q hace que el virus sea más fácil de neutralizar utilizando suero vacunal (la vacuna contiene Q493), mientras que N460K reduce los títulos de neutralización en mayor medida cuando se expresa de forma aislada en comparación con la combinación de mutaciones observada en BA.2.75. N460K es una nueva sustitución que no ha aparecido en variantes precedentes del SARS-CoV-2. Esta mutación se introdujo en el esqueleto BA.2 y se evaluó su impacto en la neutralización por el suero BNT162b2. Llamativamente, los títulos de BA.2+N460K se redujeron 3.1 veces en comparación con BA.2, mayor que la reducción observada con BA.2.75, y a la par con la reducción observada con BA.4/5.

Utilizando un panel de mAbs potentes derivados de individuos vacunados que sufrieron la infección intercurrente por la vacuna BA.1, se demostró que la actividad de varios mAbs pertenecientes a la familia IGHV3-53/66 se reduce o se anula frente a BA.2.75. IGHV3-53/66 son los mAbs aislados con más frecuencia en SARS-CoV-2, y se unen a un epítopo en el "cuello". Así pues, el IGHV53/66 forma una importante respuesta pública de anticuerpos y no es de extrañar que el virus haya evolucionado para escapar a esta respuesta.

Aunque la RBD BA.2+N460K no pudo expresarse, un estudio previo utilizando la visualización en levadura mostró que la N460K puede mejorar la unión de la RBD a ACE2, un efecto similar al observado con la mutación N501Y descrita por primera vez en Alfa (Zahradnik et al., 2021). Por lo tanto, N460K puede tanto mejorar el escape de anticuerpos como aumentar la afinidad de unión al receptor.

Curiosamente, BA.2.75 también ha adquirido la reversión R493Q (Q493R se adquirió en BA.1 y está presente en todos los demás sublinajes de Omicron excepto BA.4/5). BA.2.75 RBD fue capaz de unirse a ACE2 con una afinidad 9 veces mayor que BA.2 y más estrechamente que BA.4/5 (Dejnirattisai et al., 2022; Tuekprakhon et al., 2022). A ello contribuye en parte la mutación R493Q. BA.2.75 RBD tiene la mayor afinidad de unión al receptor entre todas las variantes de SARS-CoV-2 medidas hasta la fecha.

Estos datos sugieren que puede existir un delicado equilibrio entre el escape de anticuerpos y la afinidad del receptor ACE2. Las mutaciones en BA.2.75 conducen a una reducción de los títulos de neutralización del suero vacunal en comparación con BA.2. Las mutaciones individuales de BA.2.75 pueden causar una mayor reducción de los títulos de neutralización en comparación con la secuencia BA.2.75 S completa, pero se equilibran con la mutación de reversión R393Q, que puede haber sido seleccionada para aumentar la afinidad a ACE2 y aumentar la transmisibilidad de BA.2.75.

A fin idad de BA.2.11, B A .2.12 y B A .2.13 R BD y A CE2

Para evaluar el posible cambio en la transmisibilidad de las subvariantes BA.2 se realizaron experimentos SPR para analizar su unión de RBD a ACE2 (Figura 27d-g). Las tres variantes de la RBD tienen una afinidad de aproximadamente 3 nM por ACE2, ligeramente superior a la de la BA.2 RBD (KD = 4 nM) según se informó anteriormente (Nutalai et al., 2022). La modelización del complejo ACE2/RBD sugiere que este aumento de la afinidad puede deberse a una complementariedad ligeramente mejorada entre ACE2 y el RBD aportada por la mutación en la leucina 452. Por lo tanto, estas variantes podrían tener una sutil ventaja en la transmisión sobre BA.2.

C artografía antigénica de B A .3 y BA.4/5.

Los datos de neutralización anteriores se han utilizado para situar BA.3 y BA.4/5 en un mapa antigénico. Se repitió el método utilizado para el análisis de las variantes Delta y Omicron (Liu et al., 2021, "Reduced neutralization of SARS-CoV-2 B.1.617 by vaccine and convalescent serum". Cell 184, 4220-4236 e4213), donde los virus individuales se modelaron de forma independiente, lo que permitió escalar las respuestas en función del suero. Las respuestas medidas y modelizadas se muestran en la figura 13A (con 1551 observaciones y 340 parámetros, el error residual es del 23 %). Los resultados se visualizan mejor en tres dimensiones (véanse las proyecciones 2D de la Figura 13B). Esto muestra, como era de esperar, que los sublinajes Omicron están agrupados pero bien separados del virus pandémico temprano y del VoC anterior. Entre el clúster Omicron BA.4/5 es el más distante de los virus pre-Omicron.

Cartografía antigénica de BA. 2.75

La neutralización de BA.2.75 se probó utilizando suero de individuos previamente infectados durante el transcurso de la pandemia. Estos incluían suero obtenido al principio de la pandemia (antes de la aparición de Alfa) junto con suero obtenido después de la infección Alfa, Beta, Gamma, Delta, BA.1 y BA.2 (Figura 25). Como era de esperar, los títulos de neutralización de BA.2.75 fueron inferiores a los de la cepa infectante homóloga (por ejemplo, suero Alfa sobre virus Alfa). Lo más sorprendente, sin embargo, fue la pérdida completa de neutralización de BA.2.75 utilizando suero Delta (cero muestras alcanzaron el 50 % de neutralización a una dilución 1/20). Sin embargo, los títulos frente a BA.2.75 fueron mucho más elevados en los casos que habían sido vacunados antes o después de la infección por Delta.

Estos datos se utilizaron para situar BA.2.75 en un mapa antigénico tridimensional utilizando el método previamente descrito en Tuekprakhon et al., 2022 (Figuras 22A, B). Inicialmente se incluyeron todos los VoC (Figura 22A); esto mostró que BA.2.75 estaba agrupado con los otros virus Omicron, que se segregaron en un hemisferio del gráfico 3D. BA.2.75 parecía bien separada de otros sublinajes de Omicron y especialmente de BA.4/5. También cabe destacar que BA.2.75 y Delta son diametralmente opuestos en el diagrama, lo que pone de relieve la distancia antigénica entre estos dos virus. Dado que los datos son de mayor dimensión, es probable que la proyección en 3D distorsione las distancias reales, por lo que sólo se calcularon para los virus Omicron y pandémico temprano (pero conservando la información serológica completa para cada uno de ellos). Los resultados se muestran en la Figura 22B y recapitulan las principales características del gráfico completo, pero permiten que los sublinajes de Omicron se distribuyan más ampliamente en el espacio 3D. Notablemente, si los pares agrupados de pandemia temprana y BA.2/BA.3 se fusionan, entonces los puntos se distribuyen como una bipirámide trigonal maximizando su separación, consistente con que el escape antigénico es un factor significativo en su evolución.

Ejemplo 3. Ejemplos de anticuerpos que pueden crearse intercambiando la cadena ligera entre anticuerpos derivados del mismo gen V de cadena pesada

Como se ha comentado en la descripción detallada anterior, los anticuerpos derivados del mismo gen V de cadena pesada pueden intercambiar cadenas ligeras para dar lugar a un anticuerpo que comprenda la región variable de cadena pesada de un primer anticuerpo y una región variable de cadena ligera de un segundo anticuerpo, y tales nuevos anticuerpos pueden tener una neutralización mejorada y/u otras características en comparación con los anticuerpos "parentales".

Las Tablas 4 a 12 proporcionan ejemplos de tales anticuerpos que pueden crearse intercambiando la cadena ligera entre anticuerpos derivados del mismo gen V de cadena pesada. La Tabla 17 proporciona información sobre los genes V de la cadena pesada y de la cadena ligera de los que derivan los 28 mAbs específicos de Omicron, junto con su especificidad para el<r>B<d>o NTD de la proteína spike del SARS-CoV-2.

Ejemplo 4. Materiales y métodos

Stocks virales

SARS-CoV-2/human/AUS/VIC01/2020 (Calyet al,2020), Alfa y Beta fueron proporcionados por Public Health England, Gamma se cultivó a partir de un frotis faríngeo de Brasil, Delta fue un regalo de Wendy Barclay y Thushan de Silva, del consorcio UK G2P genotype to phenotype y Omicron se cultivó a partir de un frotis faríngeo positivo (IRAS Project ID: 269573, Ref. ética 19/NW/0730. Brevemente, las células VeroE6/TMPRSS2 (NIBSC) se mantuvieron en Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) alto en glucosa suplementado con 1% de suero bovino fetal, 2mM de Glutamax, 100 IU/ml de penicilina-estreptomicina y 2.5 ug/ml de anfotericina B, a 37 °C en presencia de 5 % de CO2 antes de la inoculación con 200 ul de fluido de hisopo. Las células se mantuvieron a 37°C y se observaron diariamente para detectar el efecto citopático (CPE). Los virus que contenían sobrenadante se clarificaron al 80 % CPE mediante centrifugación a 3,000 r.p.m. a 4 °C antes de ser almacenados a -80 °C en alícuotas de un solo uso. Los títulos virales se determinaron mediante un ensayo de formación de focos en células Vero CCL-81 (ATCC).

La secuenciación de la cepa Omicron muestra los cambios consensuados esperados en el gen S (A67V, A69-70, T95I, G142D/A143-145, A211/L212I, ins214EPE, G339D, S371L, S373P, S375F, K417N, N440K, G446S, S477N, T478K, E484A, Q493R, G496S, Q498R, N501Y, Y505H, T547K, D614G, H655Y, N679K, P681H, N764K, D796Y, N856K, Q954H, N969K, L981F), un sitio de escisión de furina intacto y una única mutación adicional A701V.

Las células se infectaron con el virus SARS-CoV-2 utilizando una MOI de 0.0001.

El sobrenadante que contenía virus se recogió al 80 % de CPE y se centrifugó a 3000 rpm a 4 °C antes de almacenarlo a -80°C. Los títulos virales se determinaron mediante un ensayo de formación de focos en células Vero. Se secuenciaron los stocks Victoria pasaje 5, Alfa pasaje 2 y Beta pasaje 4, Gamma pasaje 1, Delta pasaje 3 y Omicron pasaje 1 para verificar que contenían la secuencia esperada de la proteína spike y ningún cambio en los sitios de escisión de la furina.

Cepas bacterianas y cultivo celu lar

Las células Vero (ATCC CCL-81) y VeroE6/TMPRSS2 se cultivaron a 37 °C en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) alto en glucosa (Sigma-Aldrich) suplementado con un 10 % de suero bovino fetal (FBS), 2 mM de GlutaMAX (Gibco, 35050061) y 100 U/ml de penicilina-estreptomicina. Los mAbs humanos se expresaron en células HEK293T cultivadas en medio sin proteínas UltraDOMA P<f>(Cat# 12-727F, LONZA) a 37 °C con un 5 % de CO2. Las células HEK293T (ATCC CRL-11268) se cultivaron en DMEM alto en glucosa (Sigma- Aldrich) suplementado con 10 % FBS, 1 % 100X Mem Neaa (Gibco) y 1 % 100X L- Glutamina (Gibco) a 37 °C con 5 % de<c>O2. Para expresar RBD, las variantes de RBD y ACE2, las células HEK293T se cultivaron en DMEM con alto contenido en glucosa (Sigma) suplementado con un 2 % de FBS, un 1 % de Mem Neaa 100X y un 1 % de L-Glutamina 100X a 37 °C para la transfección. Los mAbs Omicron RBD y humanos también se expresaron en células HEK293T (ATCC CRL-11268) cultivadas en FreeStyle 293 Expression Medium (ThermoFisher, 12338018) a 37 °C con un 5 % de CO2. Se utilizaron bacteriasE.coli DH5apara la transformación y preparación a gran escala de plásmidos. Se recogió una sola colonia y se cultivó en caldo LB a 37 °C a 200 rpm en un agitador durante toda la noche.

Suero de vacunados de P fizer

El suero de la vacuna Pfizer se obtuvo de voluntarios que habían recibido una o dos dosis de la vacuna BNT162b2. Los vacunados eran Trabajadores Sanitarios, con base en Oxford University Hospitals NHS Foundation Trust, de los que no se sabía que tuvieran infección previa por SARS-CoV-2 y que se inscribieron en el Estudio OPTIC como parte del Estudio 16/YH/0247 del Biobanco GI de la Unidad Gastrointestinal Traslacional de Oxford [comité ético de investigación (REC) en Yorkshire & The Humber - Sheffield] que ha sido modificado para este propósito el 8 de junio de 2020. El estudio se llevó a cabo de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki (2008) y las directrices de Buenas Prácticas Clínicas (GCP) de la Conferencia Internacional sobre Armonización (ICH). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes en el estudio. Se estudió a los participantes después de recibir dos dosis de la vacuna, y se tomaron muestras aproximadamente 28 días (intervalo 25-38), 180 días (intervalo 178-221) y 270 días (intervalo 243- 273) después de recibir dos dosis de la Vacuna ARNm BNT162b2 de Pfizer/BioNtech, 30 microgramos, administrada por vía intramuscular después de la dilución (0.3 ml cada una), con un intervalo de 17-28 días, y luego aproximadamente 28 días (intervalo 25-56) después de recibir una tercera "dosis de refuerzo de la vacuna BNT162B2". La edad media de los vacunados era de 37 años (intervalo 22-66), 21 hombres y 35 mujeres.

P lasm a de casos de pandem ia tem prana y A lfa

Los participantes de la primera oleada de SARS-CoV2 en el Reino Unido y aquellos cuya secuencia se confirmó con linaje B. 1.1.7 en diciembre de 2020 y febrero de 2021 fueron reclutados a través de tres estudios: Sepsis Immunomics [Oxford REC C, referencia:19/SC/0296]), ISARIC/WHO Clinical Characterisation Protocol for Severe Emerging Infections [Oxford REC C, referencia 13/SC/0149] y la Gastrointestinal illness in Oxford: Subestudio COVID [Sheffield REC, referencia: 16/YH/0247]. El diagnóstico se confirmó mediante la notificación de síntomas compatibles con COVID-19 y una prueba positiva para SARS-CoV-2 utilizando la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) a partir de un hisopo del tracto respiratorio superior (nariz/garganta) analizado en laboratorios acreditados. Se tomó una muestra de sangre previo consentimiento al menos 14 días después del inicio de los síntomas. Se recogió información clínica de todos los individuos en el momento de la toma de muestras, incluida la gravedad de la enfermedad (infección leve, grave o crítica según las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud), el tiempo transcurrido entre el inicio de los síntomas y la toma de muestras y la edad del participante. Tras la inactivación térmica de las muestras de plasma/suero, éstas se alicuotaron de modo que no se realizaran más de 3 ciclos de congelación-descongelación para la generación de datos.

Sueros de casos infectados Beta, Gam m a y D elta y BA.1

Las muestras beta y delta de los casos infectados en el Reino Unido se recogieron en el marco del protocolo "Innate and adaptive immunity against SARS-CoV-2 in healthcare worker family and household members" (Inmunidad innata y adaptativa frente al SRAS-CoV-2 en familiares y miembros de hogares de trabajadores sanitarios), afiliado al Gastro-intestinal illness de Oxford: Subestudio COVID comentado anteriormente y aprobado por el Comité de Ética de la Investigación de la Universidad Central de Oxford. Todos los individuos presentaban infección por Beta/Delta confirmada por secuencia o enfermedad sintomática confirmada por PCR ocurrida mientras estaban aislados y en contacto directo con casos de BetalDelta confirmados por secuencia. Se obtuvo suero infectado Beta adicional (secuencia confirmada) de Sudáfrica. En el momento de la recogida de frotis, los pacientes firmaron un consentimiento informado para la recogida de datos y muestras de sangre seriadas. El estudio fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Humana de la Universidad de Witwatersrand (número de referencia 200313) y se llevó a cabo de acuerdo con las directrices de Buenas Prácticas Clínicas. Las muestras gamma fueron suministradas por el Laboratorio Internacional de Referencia para Coronavirus de la FIOCRUZ (OMS) como parte de la vigilancia nacional de coronavirus y contaban con la aprobación del comité ético de la FIOCRUZ (CEP 4.128.241) para recibir y analizar continuamente muestras de casos sospechosos de COVID-19 para la vigilancia virológica. Las muestras clínicas se compartieron con la Universidad de Oxford, Reino Unido, en el marco del MTAIOC FIOCRUZ 21-02.

Sueros de casos infectados p o r BA.1, su jetos de estudio

Tras el consentimiento informado, los individuos con omicron BA.1 se inscribieron conjuntamente en el protocolo ISARIC/WHO de caracterización clínica de infecciones emergentes graves [Oxford REC C, referencia 13/SC/0149] y en el protocolo "Innate and adaptive immunity against SARS-CoV-2 in healthcare worker family and household members" (Inmunidad innata y adaptativa frente al SARS-CoV-2 en familiares y miembros de la familia de trabajadores sanitarios), afiliado a la enfermedad Gastrointestinal de Oxford: Subestudio COVID [Sheffield REC, referencia: 16/YH/0247] aprobado además por el Comité Central de Ética de la Investigación de la Universidad de Oxford. El diagnóstico se confirmó mediante la notificación de síntomas compatibles con COVID-19 o un contacto positivo de un caso Omicron conocido, y una prueba positiva para SARS-CoV-2 utilizando la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) de un hisopo del tracto respiratorio superior (nariz/garganta) analizado en laboratorios acreditados y la secuencia de linaje confirmada a través de laboratorios nacionales de referencia. Se tomó una muestra de sangre previo consentimiento al menos 10 días después de la confirmación de la prueba PCR. Se recogió información clínica de todos los individuos en el momento de la toma de muestras, incluida la gravedad de la enfermedad (infección leve, grave o crítica según las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud), el tiempo transcurrido entre el inicio de los síntomas y la toma de muestras y la edad del participante.

Procedim ientos del estudio de vacunas A straZeneca-O xford y procesam iento de m uestras

Los detalles completos del ensayo controlado aleatorizado de ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222) se publicaron anteriormente (<p>M<i>D: 33220855/PMID: 32702298). Estos estudios se registraron en ISRC<t>N (15281137 y 89951424 ) y C l i n i c a l T r i a l s . g o v ( N C T 04324606 y N C T 04400838 ) . U n a c o p ia d e lo s p r o t o c o lo s s e in c lu y ó e n p u b l i c a c io n e s a n t e r i o r e s ( F o le g a t t i e t a l . , 2020 , L a n c e t 396 , 467 - 478 . ) .

L o s d a t o s d e lo s v o l u n t a r i o s v a c u n a d o s q u e r e c ib i e r o n d o s v a c u n a s s e in c lu y e n e n lo s E j e m p lo s . L a s d o s i s d e v a c u n a f u e r o n d e 5 * 1010 p a r t í c u l a s v i r a l e s ( d o s is e s t á n d a r ; c o h o r t e S D / S D n = 21 ) o m e d ia d o s i s c o m o p r im e r a d o s i s ( d o s is b a j a ) y u n a d o s i s e s t á n d a r c o m o s e g u n d a d o s i s ( c o h o r t e L D / S D n = 4 ) . E l in t e r v a l o e n t r e la p r im e r a y la s e g u n d a d o s i s o s c i l ó e n t r e 8 y 14 s e m a n a s . S e t o m a r o n m u e s t r a s d e s a n g r e y s e s e p a r ó e l s u e r o e l d í a d e la v a c u n a c ió n y e n d í a s p r e v ia m e n t e e s p e c i f i c a d o s d e s p u é s d e la v a c u n a c ió n , p o r e j e m p lo 14 y 28 d í a s d e s p u é s d e l r e f u e r z o .

Ensayo de neutralización p o r reducción de foco (FRNT)

T a m b ié n s e u t i l i z ó e l m is m o m é t o d o p a r a c o n s t r u i r B A .2.12.1 , y B A .2.75 , a ñ a d ie n d o m á s m u t a c io n e s e n e l c o n s t r u c t o B A .2. P a r a g e n e r a r B A .2.75 , s e a ñ a d ie r o n K 147 E , W 152 R , F 157 L , I 210 V , G 275 S , G 446 S y N 460 K a<u n a c o l u m n a v e r t e b r a l B A .2 . L a 3 3 9 D t a m b ié n s e c a m b ió e n B A .2 S a 3 3 9 H , y la 4 9 3 R s e in v i r t i ó e n>bA.2<a 4 9 3 Q>c o m o e n la c e p a a n c e s t r a l . P a r a c o m p r o b a r e l im p a c t o d e u n a s o la m u t a c ió n , s e in t r o d u j e r o n i n d i v i d u a l m e n t e<D 3 3 9 H , G 4 4 6 S , N 4 6 0 K y R 4 9 3 Q e n u n e s q u e le t o>Ba .2.<E l p l á s m i d o p c D N A 3 .1 r e s u l t a n t e p o r t a d o r d e l g e n S s e>u t i l i z ó p a r a g e n e r a r p a r t í c u l a s p s e u d o v i r a l e s j u n t o c o n e l v e c t o r d e e m p a q u e t a m ie n t o l e n t i v i r a l y e l v e c t o r d e t r a n s f e r e n c i a q u e c o d i f i c a u n

Prueba de neutralización pseudovira l

L o s d e t a l le s d e la p r u e b a d e n e u t r a l i z a c ió n p s e u d o v i r a l s e d e s c r ib ie r o n p r e v ia m e n t e ( L iu , C h a n g , e t a l. " N e u t r a l i z a c i ó n r e d u c i d a d e l S A R S - C o V - 2 B . 1.617 p o r la v a c u n a y e l s u e r o d e c o n v a le c ie n t e s " . C e l l 184 .16 ( 2021 ) :

P a r a d e t e r m i n a r la a c t i v i d a d n e u t r a l i z a n t e d e la s m u e s t r a s d e p l a s m a / s u e r o d e c o n v a le c i e n t e s o d e lo s s u e r o s d e v a c u n a s , S e i n c u b a r o n d i l u c i o n e s s e r ia d a s d e 3 v e c e s la s m u e s t r a s c o n la s p a r t í c u l a s p s e u d o v i r a l e s d u r a n t e 1 h y s e a p l i c ó la m is m a e s t r a t e g i a q u e c o n e l m A b .

M anipulaciones de l A D N

L a c lo n a c ió n s e r e a l i z ó m e d ia n t e u n e n f o q u e l ib r e d e r e s t r i c c i o n e s ( P e le g y U n g e r , 2014 ) . L o s m e g a p r im e r s m u t a g é n i c o s s e a m p l i f i c a r o n p o r P C R ( K A P A H iF i H o t S t a r t R e a d y M ix , R o c h e , S u iz a , c a t . K K 3605 ) , p u r i f i c a d o m e d ia n t e N u c le o S p in ® G e l a n d P C R C l e a n - u p k i t ( N a c h e r e y - N a g e l , A l e m a n ia , R E F 740609.50 ) y c lo n a d o e n p J Y D C 1 ( A d g e n e ID : 162458 ) ( Z a h r a d n i k e t a l . , 2021 a ) . L a s m o lé c u la s p J Y D C 1 p a r e n t a l e s s e e s c i n d ie r o n m e d ia n t e t r a t a m ie n t o c o n D p n l (1 h , N E B , E E . U U . , c a t . R 0176 ) y la m e z c la d e r e a c c ió n f u é e le c t r o p o r a d a e n c é lu la s E . c o l i C lo n i® 10 G ( L u c ig e n , E E . U U . ) . L a c o r r e c c ió n d e la m u t a g é n e s i s s e v e r i f i c ó m e d ia n t e s e c u e n c ia c i ó n .

Clonación de Spike y R BD

Producción de RBD

R esonancia de P lasm ón Superfic ia l

L o s e x p e r i m e n t o s d e r e s o n a n c ia d e p la s m ó n s u p e r f i c i a l s e r e a l i z a r o n c o n u n B ia c o r e T 200 ( G E H e a l t h c a r e ) . T o d o s lo s e n s a y o s s e r e a l i z a r o n c o n u n t a m p ó n d e f u n c io n a m ie n t o d e H B S - E P ( C y t i v a ) a 25 ° C .

P a r a d e t e r m i n a r la c i n é t i c a d e u n ió n e n t r e lo s S p ik e s d e S A R S - C o V - 2 y A C E 2 , s e u t i l i z ó u n c h ip s e n s o r C M 5. E l c h ip s e n s o r s e a c t i v ó e n p r im e r lu g a r m e d ia n t e u n a i n y e c c ió n d e u n a m e z c la d e E D C y N H S ( C y t i v a ) a ig u a l v o l u m e n a 20 u l / m in d u r a n t e 300 s , s e g u id a d e u n a in y e c c ió n d e m u e s t r a S p ik e a 20 u g / m l e n a c e t a t o d e s o d io 10 m M p H 5.0 ( C y t i v a ) e n la c e ld a d e f lu j o d e m u e s t r a d e l c h ip s e n s o r a 10 u l / m in , y , p o r ú l t im o , c o n u n a in y e c c ió n d e e t a n o l a m in a - H C l 1.0 M , p H 8.5 ( C y t i v a ) a 20 u l / m in d u r a n t e 180 s . L a c e ld a d e f lu j o d e r e f e r e n c ia s e d e jó e n b la n c o . S e in y e c t ó A C E 2 e n la s d o s c e l d a s d e f lu j o e n u n i n t e r v a l o d e c in c o c o n c e n t r a c i o n e s p r e p a r a d a s p o r d i lu c i o n e s

T o d o s lo s d a t o s s e a ju s t a r o n a u n m o d e lo d e u n ió n 1 :1 u t i l i z a n d o e l S o f t w a r e d e E v a lu a c ió n B ia c o r e T 200 3.1. P a r a 5 d e t e r m i n a r la c i n é t i c a d e u n ió n e n t r e lo s R B D s y e l m A b O m i - 32 / O m i - 42 , s e u t i l i z ó u n K i t d e C a p t u r a d e B io t in a ( C y t i v a ) . E l R B D b io t i n i l a d o s e in m o v i l i z ó e n la c e l d a d e f lu j o d e m u e s t r a s d e l c h ip s e n s o r . L a c e ld a d e f lu j o d e r e f e r e n c ia s e d e jó e n b la n c o . E l m A b F a b s e in y e c t ó e n la s d o s c e l d a s d e f lu j o e n u n i n t e r v a l o d e c in c o c o n c e n t r a c i o n e s p r e p a r a d a s p o r d i lu c i o n e s d o b le s s e r ia d a s , a u n a t a s a d e f lu j o d e 30 j l m in - 1 u t i l i z a n d o u n p r o g r a m a d e c in é t i c a d e c ic l o ú n ic o . T a m b ié n s e in y e c t ó t a m p ó n d e f u n c io n a m ie n t o u t i l i z a n d o e l m is m o p r o g r a m a 10 p a r a la s u s t r a c c ió n d e f o n d o . T o d o s lo s d a t o s s e a j u s t a r o n a u n m o d e l o d e u n ió n 1 :1 u t i l i z a n d o e l s o f t w a r e d e e v a l u a c i ó n B ia c o r e T 200 3.1.

P a r a d e t e r m i n a r la a f in i d a d d e u n ió n d e B A .4 / 5 R B D y m A b O m i - 12 , s e u t i l i z ó u n c h ip s e n s o r d e p r o t e í n a A ( C y t i v a ) . L a Ig O m i - 12 s e in m o v i l i z ó e n la c e l d a d e f lu j o d e m u e s t r a s d e l c h ip s e n s o r . L a c e ld a d e f lu j o d e r e f e r e n c ia s e d e jó 15 e n b la n c o . E l R B D s e i n y e c t ó e n la s d o s c e l d a s d e f lu j o e n u n in t e r v a l o d e s ie t e c o n c e n t r a c i o n e s p r e p a r a d a s m e d ia n t e d i lu c i o n e s d o b le s s e r ia d a s , a u n c a u d a l d e 30 j l m in - 1. T a m b ié n s e in y e c t ó t a m p ó n d e f u n c io n a m ie n t o u t i l i z a n d o e l m is m o p r o g r a m a p a r a la s u s t r a c c ió n d e f o n d o . T o d o s lo s d a t o s s e a j u s t a r o n a u n m o d e l o d e u n ió n 1 :1 u t i l i z a n d o P r is m 9 ( G r a p h P a d ) .

P a r a c o m p a r a r lo s p e r f i l e s d e u n ió n e n t r e B A .2 y B A .4 / 5 R B D p a r a m A b O m i - 02 / O m i - 23 / O m i - 31 , s e u t i l i z ó u n B io t in C A P t u r e K i t ( C y t i v a ) . L o s B A .2 y B A .4 / 5 R B D b i o t i n i l a d o s s e i n m o v i l i z a r o n e n la c e l d a d e f lu j o d e m u e s t r a s d e l c h ip s e n s o r h a s t a u n n i v e l s im i l a r ( ~ 120 R U ) . L a c e l d a d e f lu j o d e r e f e r e n c ia s e d e jó e n b la n c o . S e r e a l i z ó u n a 30 ú n i c a i n y e c c ió n d e m A b F a b e n la s d o s c e l d a s d e f lu j o a 200 n M , a u n c a u d a l d e 30 j l m in - 1. T a m b ié n s e i n y e c t ó t a m p ó n d e f u n c io n a m ie n t o u t i l i z a n d o e l m is m o p r o g r a m a p a r a la s u s t r a c c ió n d e f o n d o . L o s s e n s o r g r a m a s s e t r a z a r o n c o n P r is m 9 ( G r a p h P a d ) .

P a r a d e t e r m i n a r la c in é t i c a d e u n ió n e n t r e B A .2.75 o B A .2 R 493 Q R B D y A C E 2 , s e u t i l i z ó u n c h ip s e n s o r d e 35 P r o t e í n a A ( C y t i v a ) . A C E 2 - F c s e in m o v i l i z ó e n la c e ld a d e f lu j o d e m u e s t r a s d e l c h ip s e n s o r . L a c e l d a d e f lu j o d e r e f e r e n c ia s e d e jó e n b la n c o . E l R B D s e in y e c t ó e n la s d o s c e l d a s d e f lu j o e n u n a g a m a d e c in c o c o n c e n t r a c i o n e s p r e p a r a d a s m e d ia n t e d i lu c i o n e s d o b le s e n s e r ie , a u n c a u d a l d e 30 j l m in - 1 u t i l i z a n d o u n p r o g r a m a c in é t i c o d e c ic l o ú n ic o . T a m b ié n s e in y e c t ó t a m p ó n d e f u n c io n a m ie n t o u t i l i z a n d o e l m is m o p r o g r a m a p a r a la s u s t r a c c ió n d e f o n d o . T o d o s lo s d a t o s s e a j u s t a r o n a u n m o d e l o d e u n ió n 1 :1 u t i l i z a n d o e l s o f t w a r e d e e v a l u a c i ó n B i a c o r e T 200 40 3.1.

P a r a c o n f i r m a r la c in é t i c a d e u n ió n e n t r e e l R B D B A .2.75 y A C E 2 , s e u t i l i z ó u n k i t d e c a p t u r a d e b io t i n a ( C y t iv a ) . E l A C E 2 b io t i n i l a d o ( b io - A C E 2 ) s e in m o v i l i z ó e n la c e l d a d e f l u j o d e m u e s t r a s d e l c h ip s e n s o r . L a c e l d a d e f lu j o d e r e f e r e n c ia s e d e jó e n b la n c o . E l B A .2.75 R B D s e i n y e c t ó e n la s d o s c e l d a s d e f lu j o e n u n i n t e r v a l o d e c in c o 45 c o n c e n t r a c i o n e s p r e p a r a d a s m e d ia n t e d i l u c i o n e s d o b le s s e r ia d a s , a u n c a u d a l d e 30 j l m i n '1 u t i l i z a n d o u n p r o g r a m a c in é t i c o d e c ic l o ú n ic o . T a m b ié n s e i n y e c t ó t a m p ó n d e f u n c io n a m ie n t o u t i l i z a n d o e l m is m o p r o g r a m a p a r a la s u s t r a c c ió n d e f o n d o . T o d o s lo s d a t o s s e a ju s t a r o n a u n m o d e lo d e u n ió n 1 :1 u t i l i z a n d o e l s o f t w a r e d e e v a lu a c ió n B ia c o r e T 200 3.1.

50 P a r a d e t e r m i n a r la c in é t i c a d e u n ió n e n t r e e l B A .2.75 o e l B A .2 R B D y lo s m A b s , s e u t i l i z ó u n k i t d e c a p t u r a d e b io t i n a ( C y t iv a ) . E l R B D b io t i n i l a d o s e in m o v i l i z ó e n la c e l d a d e f lu j o d e m u e s t r a s d e l c h ip s e n s o r . L a c e l d a d e f lu j o d e r e f e r e n c ia s e d e jó e n b la n c o . E l F a b d e O m i - 18 u O m i - 32 s e i n y e c t ó e n la s d o s c e l d a s d e f lu j o e n u n a g a m a d e c in c o c o n c e n t r a c i o n e s p r e p a r a d a s p o r d i l u c i o n e s d o b le s s e r ia d a s , a u n c a u d a l d e 30 j l m in -1 u t i l i z a n d o u n p r o g r a m a d e c in é t i c a d e c ic l o ú n ic o . P a r a la u n ió n d e O m i - 20 p a r a b i o - B A .2 R B D , e l F a b d e O m i - 20 s e in y e c t ó s o b r e la s d o s 55 c e ld a s d e f lu j o e n u n in t e r v a lo d e c in c o c o n c e n t r a c i o n e s p r e p a r a d a s p o r d i lu c i o n e s d o b le s s e r ia d a s , a u n a v e l o c id a d d e f lu j o d e 30 j l m in -1 u t i l i z a n d o u n p r o g r a m a d e c in é t i c a d e c ic l o ú n ic o . P a r a la u n ió n d e O m i - 20 p a r a b i o - B A .2.75 R B D , s e in y e c t ó e l F a b d e O m i - 20 s o b r e la s d o s c e ld a s d e f lu j o e n u n in t e r v a lo d e o c h o c o n c e n t r a c i o n e s p r e p a r a d a s p o r d i l u c i o n e s d o b le s s e r ia d a s , a u n a v e l o c id a d d e f lu j o d e 30 j l m in -1. T a m b ié n s e in y e c t ó t a m p ó n d e f u n c io n a m ie n t o u t i l i z a n d o e l m is m o p r o g r a m a p a r a la s u s t r a c c ió n d e f o n d o . T o d o s lo s d a t o s s e a j u s t a r o n a u n 60 m o d e l o d e u n ió n 1 :1 u t i l i z a n d o e l s o f t w a r e d e e v a l u a c i ó n B i a c o r e T 200 3.1.

P a r a c o m p a r a r lo s p e r f i l e s d e u n ió n e n t r e B A .2 y B A .2.75 R B D p a r a m A b O m i - 29 , s e u t i l i z ó u n k i t d e c a p t u r a d e b io t i n a ( C y t i v a ) . L o s B A .2 y B A .2.75 R B D b i o t i n i l a d o s s e in m o v i l i z a r o n e n la c e ld a d e f lu j o d e m u e s t r a d e l c h ip s e n s o r a u n n iv e l s im i l a r ( - 110 R U ) . L a c e ld a d e f lu j o d e r e f e r e n c ia s e d e jó e n b la n c o . S e r e a l i z ó u n a ú n ic a in y e c c ió n 65 d e m A b F a b e n la s d o s c e l d a s d e f lu j o a 1 j M , a u n c a u d a l d e 30 j l m in -1. T a m b ié n s e in y e c t ó t a m p ó n d e funcionamiento utilizando el mismo programa para la sustracción de fondo. Los sensorgramas se trazaron con Prism9 (GraphPad).

Para comparar los perfiles de unión entre BA.2 y BA.2.75 RBD para mAb Omi-36, se utilizó un chip sensor de Proteína A (Cytiva). El mAb Omi-36 en forma IgG se inmovilizó en la celda de flujo de muestra del chip sensor. La celda de flujo de referencia se dejó en blanco. Se realizó una única inyección de RBD en las dos celdas de flujo a 200 nM, a un caudal de 30 |jl min-1. También se inyectó tampón de funcionamiento utilizando el mismo programa para la sustracción de fondo. Los sensorgramas se trazaron con Prism9 (GraphPad).

Producción de m A bs IgG y Fabs

Los anticuerpos de AstraZeneca y Regeneron fueron proporcionados por AstraZeneca, los anticuerpos de Vir, Lilly y Adagio fueron proporcionados por Adagio, LY-CoV1404 fue proporcionado por LifeArc. Para los anticuerpos propios, las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos indicados se transfectaron transitoriamente en células 293Y o 293T y el anticuerpo se purificó del sobrenadante en proteína A como se describió previamente (Nutalai et al., 2022). Los Fabs se digirieron a partir de IgGs purificadas con papaína utilizando un Pierce Fab Preparation Kit (Thermo Fisher), siguiendo el protocolo del fabricante.

C uantificación y análisis estadístico

Los análisis estadísticos se presentan en los resultados y en las leyendas de las figuras. La neutralización se midió mediante FRNT Se calculó el porcentaje de reducción del foco y se determinó el IC50 (FRNT50) utilizando el programa probit del paquete SPSS. Para el análisis se utilizó la prueba de rangos con signo de pares emparejados de Wilcoxon y se calcularon valores P de dos colas sobre los valores medios geométricos.

Cristalización

Las proteínas RBD se deglicosilaron con Endoglicosidasa F1 antes de utilizarlas para la cristalización. Omicron BA.1-RBD se mezcló con Omi-12 y beta-54 Fabs, por separado, en una proporción molar 1:1:1, con una concentración final de 7 mg ml-1. Estos complejos se incubaron por separado a temperatura ambiente durante 30 min. El cribado inicial de cristales se realizó en placas Crystalquick de 96 pocillos X (Greiner Bio-One) con un Robot Cartesiano utilizando el método de difusión de vapor gota sentada nanolitro, con 100 nl de proteína más 100 nl de reservorio en cada gota, como se describió previamente (Walter et al., 2003, Journal of Applied Crystallography 36, 308-314).

Se formaron cristales de BA.1-RBD/Omi-12/beta-54 en la condición PEGRx 1-46 de Hampton Research, que contiene citrato de sodio tribásico dihidratado 0.1 M pH 5.0 y 18 %(p/v) de PEG 20000. El complejo de BA.1-RBD/Omi-12/beta-54 se tamizó en el tamiz C2 de sulfato amónico de Hampton Research, que contiene 2.4 M (NH4)2SO4 y 0.1 M de ácido cítrico pH 5.0, pero únicamente los cristales de Fab Omi-12 solamente se formaron en esta condición.

Cristalización de B A .2.75 RBD

La BA.2.75 RBD purificada se deglicosiló con endoglicosidasa H1 y se mezcló con ACE2 en una proporción molar 1:1, con una concentración final de 13.0 mg ml-1. El cribado inicial de cristales se estableció en placas Crystalquick de 96 pocillos X (Greiner Bio-One) con un Robot Cartesiano utilizando el método de difusión de vapor gota sentada nanolitro, con 100 nl de proteína más 100 nl de reservorio en cada gota, como se describió previamente (Walter et al., 2003). Los cristales del complejo BA.2.75 RBD-ACE2 se formaron en la condición PEGRx 2-25 de Hampton Research , que contiene 0.1% (p/v) de n-Octil-b-D-glucósido, 0.1 M de citrato sódico tribásico dihidratado pH 5.5 y 22 % (p/v) de PEG 3350. Los datos de difracción se recogieron a 100 K en la línea de luz I03 de Diamond Light Source, Reino Unido, utilizando el sistema automatizado de colas que permite la recogida automatizada de datos sin supervisión (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/103/103-Manual/Unattended-Data-Collections.html).

R ecopilación de datos de rayos X , determ inación y refinam iento de la estructura

Los datos de difracción se recogieron a 100 K en la línea de luz I03 de Diamond Light Source, Reino Unido. Todos los datos se recogieron en el marco de un sistema automatizado de colas que permite la recogida automatizada de datos sin supervisión (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/I03/I03- Manual/Unattended-Data-Collections.html). Los cristales se precongelaron montándolos en asas y se sumergieron durante un segundo en crioprotector que contenía un 25 % de glicerol y un 75 % de licor madre. Se registraron imágenes de difracción de 0.1° de rotación en un detector Eiger2 XE 16M (tiempo de exposición de 0.018 s por imagen, tamaño del haz 80*20 jm , transmisión del haz del 10 % y longitud de onda de 0.9762 A). Los datos se indexaron, integraron y escalaron con el programa automatizado de procesamiento de datos Xia2-dials (Winter, 2010, Journal of applied crystallography 43, 186-190; Winter et al., 2018, Acta Crystallogr D Struct Biol 74, 85-97). Se recogieron 360° de datos de un solo cristal para cada uno de los conjuntos de datos.

Las estructuras se determinaron mediante sustitución molecular con PHASER (McCoy et al., 2007, J Appl Crystallogr 40, 658-674). Los dominios VhVl y ChCl que presentan la mayor similitud de secuencia con las estructuras RBD/Fab del SARS-CoV-2 previamente determinadas (Dejnirattisai et al., 2021, Cell 184, 2183-2200 e2122; Dejnirattisai et al., 2021, Cell 184, 2939-2954 e2939; Huo et al., 2020, Cell Host Microbe 28, 445-454; Liu et al., 2021, Cell 184, 4220-4236 e4213; Supasa et al., , 2021, Cell 184, 2201-2211 e2207; Zhou et al., 2021,Cell 184, 2348-2361 e2346; Zhou et al., 2020, Nature structural & molecular biology 27, 950-958) se utilizaron como modelos de búsqueda para cada una de las determinaciones de estructura actuales.

Para todas las estructuras se utilizó la reconstrucción de modelos con COOT (Emsley et al., 2010, Biological Crystallography 66, 486-501) y el refinamiento con Phenix (Liebschner et al., 2019, Acta Crystallogr D Struct Biol 75, 861-877). Debido a su menor resolución, solo se realizó el refinamiento de cuerpo rígido y factor de grupo B para las estructuras del complejo BA.1-RBD/O-12/Beta-54.

Las estadísticas de recogida de datos y refinamiento de estructuras figuran en las tablas 19 y 25. Para las comparaciones estructurales se utilizó s Hp (Stuart et al., 1979, J Mol Biol 134, 109-142), los residuos que forman la interfaz RBD/Fab se identificaron con PISA (Krissinel y Henrick, 2007, J Mol Biol 372, 774-797) y las figuras se prepararon con PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.2r3pre, Schrodinger, LLC).

Ejemplo 5

Estructura de los anticuerpos

La estructura del complejo ternario BA.1 RBD/Fab Omi-12/Fab Beta-54 se determinó con una resolución de 5.5 A (Tabla 19, Figura 6A). Se observó un ligero choque entre los dos Fabs a pesar de que el experimento BLI no mostró una competencia significativa por la unión entre ellos. Se ha modelizado una estructura de alta resolución de Omi-12 fab no complejado (resolución de 2.1 A,Tabla 19) en la densidad electrónica del complejo (Figura 6B, 6C). La superposición del Fab 253 sobre el Fab Omi-12 sugiere que Q493R chocaría con el bucle h 2 del Fab 253, mientras que en Omi-12, el H2 adopta una estructura ligeramente aplanada. Este cambio estructural es atribuible a la maduración del anticuerpo a través de la mutación somática V53P en la región variable de la cadena pesada de Omi-12, que forma una interacción de apilamiento con Y489 (Figura 6D).

Omi-12 y el anticuerpo 253 derivan ambos de la cadena pesada de la línea germinal IGHV1- 58. Curiosamente, de forma similar al anticuerpo 253, otros anticuerpos derivados de la cadena pesada de la línea germinal IGHV1-58 descritos en el presente documento, es decir, Beta-47, Beta-25, anticuerpo 55, anticuerpo 165 y anticuerpo 318, también tienen una valina (V) en la posición 53 en la región variable de la cadena pesada, es decir, valina (V) en la posición 53 en la SEQ ID NO: 262 (anticuerpo 253), SEQ ID NO: 591 (Beta- 47), SEQ ID NO: 461 (Beta-25), SEQ ID NO: 62 (anticuerpo 55), SEQ iD NO: 182 (anticuerpo 165) y SEQ iD NO: 332 (anticuerpo 318). La posición 53 de estas secuencias corresponde a la posición 58 según la numeración IMGT Basándose en los datos, la modificación de cualquiera de estos anticuerpos mediante la sustitución de la valina en la posición 53 por prolina (es decir, numeración absoluta V53P, o V58P según la numeración IMGT) daría lugar a un anticuerpo que sería eficaz contra Omicron.

Además, el anticuerpo AZD8895 (secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada proporcionadas en la SEQ ID NO: 963 y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera proporcionada en la SEQ ID NO: 965) también se deriva de la cadena pesada de la línea germinal IGHV1-58 (por ejemplo, véase Dong et al. Nat Microbiol 6, 1233-1244 (2021)). El AZD8895 tiene una isoleucina (I) en la posición 53 de la región variable de la cadena pesada, que corresponde a la posición 58 según la numeración IMGT Basándose en los datos aquí expuestos, la modificación de la región variable de la cadena pesada AZD8895 (SEQ ID NO: 963) mediante la sustitución de la isoleucina en la posición 53 por prolina (es decir, I53P) utilizando la numeración absoluta, o I58P utilizando la numeración IMGT, daría lugar a un anticuerpo que sería eficaz contra Omicron.

Por consiguiente, los datos indican que la modificación de los anticuerpos VH1-58 de modo que una prolina esté presente en la posición 53 (correspondiente a la posición 58 según la numeración IMGT) en la región variable de la cadena pesada los haría particularmente eficaces contra Omicron.

Estructura A C E 2/B A .2.75 RBD

Para dilucidar el mecanismo molecular de la alta afinidad, se determinó por cristalografía la estructura del RBD BA.2.75 con ACE2 (según los métodos descritos en el Ejemplo 4 ). Como era de esperar, el modo de unión era esencialmente indistinguible del observado anteriormente (Figura 20A), aunque se produjeron reordenamientos significativos fuera de la huella de ACE2, con el bucle flexible RBD 371-375 reordenándose y parte de la etiqueta C-terminal 6xHis ordenándose. La Figura 20B muestra un primer plano de la interfaz de unión, comparada con el complejo ACE2/BA.2 RBD. En otros complejos (con R o Q en RBD 493) K31 de ACE2 tiende a estar desordenado, mientras que está bien ordenado en el complejo BA.2.75, lo que permite a K31 formar un enlace de hidrógeno potencial con la cadena lateral de glutamina, aumentando posiblemente la afinidad de ACE2.

Tablas

Tabla 1 - SEC ID NOs de los anticuerpos producidos contra las primeras cepas pandémicas

Tabla 2 - SEC ID NOs de los anticuerpos obtenidos contra la Betastrain

Tabla 3 - SEC ID NOs de los anticuerpos obtenidos contra la cepa Omicron

Continúa...

Tabla 6 - Ejemplos de anticuerpos de cadena mixta generados a partir de anticuerpos derivados de la misma n rmin l I HV1-

Tabla 7 - Ejemplos de anticuerpos de cadena mixta generados a partir de anticuerpos derivados de la misma cadena pesada germinal IGHV1-69

Tabla 8 - Ejemplos de anticuerpos de cadena mixta generados a partir de anticuerpos derivados de la misma n rmin l I HV -

Tabla 9 - Ejemplos de anticuerpos de cadena mixta generados a partir de anticuerpos derivados de la misma n rmin l I HV -

Tabla 10 - Ejemplos de anticuerpos de cadena mixta generados a partir de anticuerpos derivados de la misma cadena pesada germinal IGHV1-18

Tabla 11 - Ejemplos de anticuerpos de cadena mixta generados a partir de anticuerpos derivados de la misma n rmin l I HV -

Tabla 12 - Ejemplos de anticuerpos de cadena mixta generados a partir de anticuerpos derivados de la misma cadena esada erminal IGHV4-31

Tabla 13 - Títulos IC50 de 22 mAbs humanos específicos del SARS-CoV-2 Omicron contra cepas vivas del virus Vi ri Alf B mm D l v mir n BA.1.

Tabla 14 - Títulos IC50 de 22 mAbs humanos específicos del SARS-CoV-2 de Omicron contra las cepas de seudovirus Victoria Omicron BA.1 Omicron BA.1.1 Omicron BA.2 v Omicron BA.3.

Tabla 15 - Títulos IC50 de mAbs humanos específicos del SARS-CoV-2 pandémico temprano y mAbs humanos específicos del SARS-CoV-2 Beta contra cepas de pseudovirus Victoria, Omicron BA. 1, Omicron BA.1.1 y Omicron

Tabla 16 - Títulos IC50 de mAbs comerciales contra las cepas de pseudovirus Victoria, Omicron BA.1, Omicron

Tabla 17 - Pro iedades de los anticuer os omicrón

Tabla 18 - Títulos IC50 de 22 mAbs humanos específicos del SARS-CoV-2 de Omicron o mAbs comerciales frente a diversas cepas del SARS-CoV-2.

Tabla 19 - Recolección de datos de rayos X y estadísticas de refinamiento de la estructura para BA. 1 RBD/Omi-12-Beta54 Omi-12 Fab

T a b la 20 - E n s a y o s p s e u d o v i r a l e s q u e c o m p a r a n la n e u t r a l i z a c ió n d e B A .4 c o n la n e u t r a l i z a c ió n d e B A .1 , B A .1.1 , B A .2 y B A .3

Tabla 21 - Actividad de los anticuerpos comerciales contra BA.4 BA.5

Tabla 22 - IC50 de los mAbs B A .l frente a PV BA.2.75 y BA.2 N460K

mAbs Victoria BA.l BA.1.3 BA.2 8A.3 BA,4/5 BA.IL75 SA.2+N450K Omt-ftó 0.002 i 0.001 0.004 ± 0=001 0,004 ±0.001 0,003 ±0.001 0.019+ 0.00? >10 0.009 ±«3„í>02 0.025i0.OO3<O>(3<m>-5<i->3<0>)<3>0.003í0.000 O.0C5 ± 0.002 0.003 ±0.001 0.-008 ± 0.001 D.C22 ±0.003 0.017 0,005 0.037iO.OOO 0.401 i 0.026 Ümi-06 0.007 ± 0.000 0.027 0.001 0-139 ±0.033 0.09940,008 0.695 0.1-06 >10 0.063+0.005 0.025±-0.002 Omi-OS 0.003 i 0.004 0.003 ±orna-0.002 0.000 0.114+ 0.-045 0.032 ± 0.001 o,oM±aoo5 0.035 ±0.002 .0.55220.090 Osnr-09 0.006 ± 0.002 0.0C5+ 0.003 0.00540.0020.DOSs 0.002 0.017 ta.002 0.166+0.007 0.003 0,000 O.Ü10 ± 0.002 0-005 A 0.OT7 0-002+0.000 0-CK52 ±0,001 a 003 ±0,001 0.006 0- COI 0,429 a060 0,003 0,001 0,013 ¿ 0,002<GmMfi>0014±0.003 0.032 ± 0.002 0,011 ±0.003 Q.-&34 ±0,012 0.111 ±0,033 0,O2-9±Q,OC7 >10 >10<O>(3<m>-6<i->6<1>)<7>tí 023 A o.rm aois cun? 0.0?? 0-009 0.7+0 0.00* 0-773 y.002<0>.0??,Q.&.VI0.755 *0.169 >30<Omitís>

O<(3>m<»W>i-2<)>P<0.00310.003 0.002 OJMO 0.002 ±0.000 0.005 ±-0.000 0.006 0.002 0.005 ±0,001 0.03510.0C7 0.014 i 0.002>(-3-66) 0.009 0.002 0,006 0.003 0,005 0.033 0.015 ± -O.OG3 0,0.20 ± 0,004 o,ow±aoos 0.3.78 0.075 0315 0.142Omí-23OXfQS± 0.002 0.029iÜ.OO& 0.023 ±0.22 0.019- i 0.005 0.011 0.000 >10 C+0.1X ±CIOOS 0.02220.005 •Gmi-M 0,005 ±0.000 O.ÜCS ± 0.002 0,054 ±0.015 0.007 ± 0.001 0.GÜ5 ±0.002 >10 0,008 ± 0.004 0.014 ± 0.000 OmMS 0.005±0-002 0,023 04305 0-027±0,005 0,024 ±0.00* 9-050 0,004 >10 0-014 *0,005 0.050 0-010 Omt-26 0.002 0.002 0,00& G43G2 0.005 0,001 0.013 O.OOl 0.02S 0.002 >10 0.010+0,004 0.010 0,000Gmt'27

<3<J>m<-Í-6>í-<&>2<)>B<0.00810.00$- 0.025 x aoos 0.034 ± 0.B09 0.034 ±0,005 0.026 0007 0.069 ±0.023 5.672 4.4&6 >10>0.02220.000 0,011 i 5.004 0.009+0,002 0,008+0.000 0,019+ 0X00 0.038+-0,003 0-I331Q.ÍÍS2 0.103+0,043<■>(<O>3<m>-5<i->3<2>)<9>0-01410.006. 0.027 ± 0-003 0.016 ± 0.009 0.056 0,014 0.064 ± 0-017 O3S6 0.OG7 >10 >10 Oílit-30 0.032±0.002 0.008<±>0.003 0.003 0.004 0.011 0.Ü02 0.015 ± 0.003 >10 O.00S ± 0.002 O.OiS 0.0C1 Onii-íl 0.27610-090 0.029+ 0.002 0,031+0.012 O.013 tU»2 0.013 O.Ü04 >10 0,014 0.003 0.013 ± 0.001 Omí-32 0.01020.006 0.017 i 5.000 >10 2.682 ±0.5S3 1.0:18 0.139 0-035 ±0.016 0,354+0-064 2341i0.232 Oml-33 0,027 ± 0.011 0-014 Ü.C05 0,042 0.01S- 0.0084=0.022 0.133 ± 0.021 0.013 ± 0.Q&4 0.053 ±0,006 0.4,90i0.156 Omí-34 0.00? 40.004- 0,008 0.001. 0.062.t 0.004 0,009 O.W3 0.014 0.000>m0.005 S 0-000 .0,020 ± 0,001 Omí 35 0.01340.004 0.0584 O<l>OOS 0,581+0.0S1 0.094 ± 0,004 0,044 O.CSS 51387+0,441 0.020 0-000 0.035+0.012<O>(3<m>6<í->6<S>)<tv>0.022t0.004 0.009 ± 0-GQ3 0,009 0,003 0,-930+ 0,014 0,178 ± 0.0=43 0.024.+ 0.OQ 6 >10 >10 O<ü>5Í-3& 0.0154 aíX>4 0,024 02015 >10 0-9Ü5 i Q<l>OOO -actost0-002 0-063 Ü.001 0,011x0-005 0,010 0-001 Onní-39 0.014 0-002 0-ÍX19 0,004 0.026 ¿0.011 0.0.54 ±Q. ooi 0.035 0,003 0,0'27 * Q.0Q3 0.043 á 0-017 ■Gsm-4.1 >10 0.053. ± 0.028 0,037 0,002 >10 0.032 ± 0.CO7 >10 >19 >10 Onw-42 0.013 0.004 0.007<+>0.004 0,095 ± 0,002 0,021 ±0.011 0.025<±>Ü.C32 0.0Í3 ± 0,001 0,003*0.000 0.007<±>0.002

Tabla 23 - IC50 de mAbs comerciales contra PV BA.2.75

Tabla 24

a b la 25 : R e c o p i l a c ió n d e d a t o s d e r a y o s X y e s t a d í s t i c a s d e r e f i n a m ie n t o d e e s t r u c t u r a p a r a B A .2.75 R B D / A C E 2

a L o s v a l o r e s e n t r e p a r é n t e s i s c o r r e s p o n d e n a la c a p a d e m a y o r r e s o lu c ió n . a b la 26. V a lo r e s I C 50 a r a m A b s O m i c r o n

T a b la 27. S e c u e n c i a s d e c e b a d o r e s u t i l i z a d a s p a r a g e n e r a r p s e u d o v i r u s . R e la c i o n a d o c o n C o n s t r u c c i ó n d e p lá s m i d o s y p r o d u c c i ó n d e p a r t í c u l a s l e n t i v i r a le s p s e u d o t i p a d a s .

T a b la 28 , r e c o p i l a c i ó n d e d a t o s X - r a v y e s t a d í s t i c a s d e r e f i n a m ie n t o d e e s t r u c t u r a L o s v a l o r e s a e n t r e p a r é n t e s i s c o r r e s p o n d e n a la c a p a d e m a y o r r e s o lu c ió n .

Tabla 29. Valores IC50 para mAbs Omicron y monoclonales comerciales

a

Tabla 30. Secuencias de cebadores utilizadas para generar pseudovirus. Relacionadas con construcción de plásmidos v producción de partículas lentivirales pseudotipadas

Tabla 32. Valores IC50 para mAbs B A .l y mAbs com erciales

Lista de secuencias

ı22

���

���

���

���

���

���

���

ı32

ı33

���

Secuencias de aminoácidos de CDRs

Secuencia de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera de anticuerpos seleccionados

Secuencia de nucleótidos de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de anticuerpos seleccionados

Secuencias de aminoácidos de CDRs

Secuencia de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera de anticuerpos seleccionados

ı75

ı76

ı77

���

���

ı82

ı83

ı84

ı85

ı86

ı87

ı88

���

ı92

ı93

ı94

ı95

ı96

ı97

Secuencias de aminoácidos de CDRs

SEQ ID NO: 961 - secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia del gen V de la línea germinal IGHV1-58 MQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGFTFTSSAVQWVRQARGQRLEWIGWIVVGS GNTNYAQKFQERVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAA SEQ ID NO: 962 - Secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena pesada del AZD8895 (COV2-2196)

Genbank: MT763531.1

CAAATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGCCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGACCTCAGT

GAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATTCACCTTTATGAGCTCTGCTGTGCAGTG

GGTGCGACAGGCTCGTGGACAACGCCTTGAGTGGATAGGATGGATCGTCATTG

GCAGTGGTAACACAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGAAAGAGTCACCATTACC

AGGGACATGTCCACAAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCCG AGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGGCCCCATATTGTAGTAGTATCAGCTGC AATGATGGTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA SEQ ID NO: 963 - Secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del AZD8895 (COV2-2196):

GenBank: QLI33947.1 QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGFTFMSSAVQWVRQARGQRLEWIGWIVIG SGNTNYAQKFQERVTITRDMSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAAPYCSS1SCNDGF DIWGQGTMVTVSS

SEQ ID NO: 964 - Secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena ligera del AZD8895 (COV2-2196):

GenBank: MT763532.1

GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAGAG AGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCT GGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCC AGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAG ACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACT GTCAGCACTATGGTAGCTCACGGGGTTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTG GAAATCAAA SEQ ID NO: 965 - Secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera del AZD8895 (COV2-2196): GenBank: QLI33948.1

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAT GIPDRESGSGSGTDFTLT1SRLEPEDFAVYYCQHYGSSRGWTFGQGTKVE1K

SEQ ID NO: 966 - Secuencia de aminoácidos de la Glicoproteína Spike del aislado WIV04 Referencia Genbank QHR63260.2 MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFL PFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSN1IRGWIFGTTLDSK TQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTF EYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALE PLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYN ENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPF GEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFT NVY ADSFVIRGDEVRQIAPGQTG KIADYNYKLPDDFTGCVIAWN SNNLD SKV GGN YNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVG YQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKF LPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVN CTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICA SYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVS MTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQV KQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIRQYGDCLGD IAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFA MQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLTANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQ NAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDK.VEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQ LIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVT YVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFV SGNCDVVTGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNT QKEIDRLNEVAKNLNESL1DLQELGKYEQYIKVVPWY1WLGFIAGL1A1VMVTIMLC CMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLFtYT

SEQ ID NO: 967 - Secuencia de aminoácidos codificada por la línea germinal IGLV Kappa 3-20

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAT GIPDRESGSGSGTDFTLT1SRLEPEDFAVYYCQQYGSSP

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo capaz de unirse a la proteína spike del coronavirus SARS-CoV-2, en el que el anticuerpo comprende:

(a) un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 952; y

(b) un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 954.

2. El anticuerpo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende una región Fc.

3. El anticuerpo según la reivindicación 1 o 2, en el que el anticuerpo comprende una región constante IgG1.

4. El anticuerpo según la reivindicación 2 o 3, en el que la región Fc comprende al menos una modificación tal que se prolonga la semivida sérica.

5. El anticuerpo según la reivindicación 4, en el que la región Fc comprende las mutaciones M252Y/S254T/T256E (YTE).

6. El anticuerpo según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo de cadena simple, Fab, Fab modificado, Fab', Fab' modificado, F(ab')2, Fv, Fab-Fv, Fab-dsFv o scFv.

7. Un polinucleótido que codifica el dominio variable de cadena ligera y el dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Un vector que comprende uno o más polinucleótidos según la reivindicación 7.

9. Una célula hospedante que comprende uno o más polinucleótidos según la reivindicación 7 o uno o más vectores según la reivindicación 8.

10. Un método para producir un anticuerpo capaz de unirse a la proteína spike del coronavirus SARS-CoV-2, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 9 y aislar el anticuerpo de dicho cultivo.

11. Una composición farmacéutica, que comprende:

(a) el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6

(b) al menos un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.

12. El anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o la composición farmacéutica según la reivindicación 11, para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.

13. El anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o la composición farmacéutica según la reivindicación 11, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o complicación asociada a la infección por SARS-CoV-2, o una enfermedad o complicación asociada a la misma, como COVID-19.

14. El anticuerpo para uso según la reivindicación 13, en el que la infección por SARS-CoV-2 está causada por una cepa de SARS-CoV-2 del linaje alfa, beta, gamma, delta u omicron, opcionalmente en el que el linaje de la cepa omicron es Omicron BA.2.11, Omicron BA.2.12.1, Omicron BA.2.13, Omicron BA.2.3.20, Omicron BA.2.10.4, Omicron BA.1, Omicron BA.1.1, Omicron BA.2, Omicron BA.2.75, BA.2.75.2, Omicron BA.3, Omicron BA.4.6, Omicron BA.4/5, Omicron BJ.1, Omicron B S. 1, Omicron BN.1, Omicron BF.7, Omicron BQ.1, Omicron BQ.1.1 Omicron XBB, y/u Omicron XBB.1.

15. Un método para identificar la presencia de SARS-CoV-2 en una muestra, que comprende:

poner en contacto la muestra con el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y detectar la presencia o ausencia de un complejo anticuerpo-antígeno, en el que la presencia del complejo anticuerpo-antígeno indica la presencia de SARS-CoV-2 en la muestra.