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ES3011466T3 - Enhanced adoptive cell therapy - Google Patents

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ES3011466T3
ES3011466T3 ES18204379T ES18204379T ES3011466T3 ES 3011466 T3 ES3011466 T3 ES 3011466T3 ES 18204379 T ES18204379 T ES 18204379T ES 18204379 T ES18204379 T ES 18204379T ES 3011466 T3 ES3011466 T3 ES 3011466T3
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ES
Spain
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cancer
cells
tumor
oncolytic
cell
Prior art date
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Active
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ES18204379T
Other languages
English (en)
Inventor
Akseli Hemminki
Markus Vähä-Koskela
Siri Tähtinen
Vincenzo Cerullo
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Original Assignee
Tilt Biotherapeutics Oy
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Publication date
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Abstract

La presente invención se relaciona con los campos de las ciencias de la vida y la medicina. Específicamente, se relaciona con terapias contra el cáncer en humanos. Más específicamente, se relaciona con vectores adenovirales oncolíticos, solos o junto con composiciones terapéuticas, para usos terapéuticos y métodos terapéuticos contra el cáncer. En un aspecto, se relaciona con la administración por separado de una composición terapéutica de células adoptivas y vectores adenovirales oncolíticos. Además, se relaciona con un kit farmacéutico y una composición farmacéutica, ambos utilizando vectores adenovirales oncolíticos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Terapia celular adoptiva mejorada
Campo de la invención
La presente invención se refiere a los campos de las ciencias de la vida y la medicina. Específicamente, la invención se refiere a terapias contra el cáncer en seres humanos.
Antecedentes de la invención
Se desarrollan nuevas terapias constantemente para el tratamiento del cáncer. Las terapias celulares adoptivas (TCA) son un método potente para tratar el cáncer, pero también para tratar otras enfermedades como las infecciones y la enfermedad de injerto contra huésped. La transferencia celular adoptiva es la transferencia pasiva de células cultivadasex vivo, más frecuentemente células inmunoderivadas, en un anfitrión con el objetivo de transferir la funcionalidad inmunológica y las características del trasplante. La transferencia celular adoptiva puede ser autóloga, como es común en las terapias de linfocitos T adoptivas, o alogénica como es típico en el tratamiento de infecciones o enfermedad de injerto contra huésped. Clínicamente, las realizaciones comunes de este método incluyen transferencia de inmunoestimulación o células tolerógenas tal como linfocitos a pacientes para aumentar la inmunidad contra virus y cáncer o para estimular tolerancia en el marco de las enfermedades autiinmunitarias, tal como la diabetes tipo I o la artritis reumatoide.
Con respecto a la terapia del cáncer, en la década de 1980 fue concebido el método TCA por un pequeño número de grupos que trabajan en los EE. UU., siendo uno de los principales grupos el de Steven Rosenberg y sus colegas que trabajan en el NCI. La transferencia adoptiva de linfocitos infiltrantes de tumores autólogos (TIL) o células mononucleares de la sangre periférica redirigidas genéticamente se ha utilizado para tratar con éxito pacientes con tumores sólidos avanzados como el melanoma, así como pacientes con tumores malignos hematológicos que expresan CD19. En TCA, los tipos de células más comúnmente utilizados son los linfocitos T, a veces clasificados por CD8+, pero otras variaciones incluyen células CD4+, linfocitos citolíticos, linfocitos T 5-<y>, linfocitos T reguladores y células mononucleares de la sangre periférica. Las células pueden estar inalteradas, como en la terapia TIL o modificadas genéticamente. Hay dos formas comunes de conseguir la orientación genética de los linfocitos T a objetivos específicos del tumor. Una es la transferencia de un receptor de linfocitos T con especificidad conocida (terapia con TCR) y con el tipo de antígeno de leucocitos humanos emparejados (HLA, conocido como complejo de histocompatibilidad principal en roedores). La otra es la modificación de células con moléculas artificiales como los receptores de antígenos híbridos (CAR). Este método no depende de HLA y es más flexible con respecto a las moléculas de direccionamiento. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos monocatenarios y los CAR también pueden incorporar dominios coestimuladores. Sin embargo, las dianas de las células CAR necesitan estar en la membrana de los dianocitos, mientras que las modificaciones de TCR pueden utilizar dianas intracelulares.
Durante la primera década del desarrollo de TCA, el planteamiento estaba en los TIL. Los TIL se encuentran en los tumores, lo que sugiere que los tumores desencadenan una respuesta inmunitaria en el anfitrión. Esta llamada inmunogenicidad tumoral está mediada por antígenos tumorales. Estos antígenos distinguen el tumor de las células sanas, proporcionando así un estímulo inmunitario.
Por ejemplo, el documento US2003194804 A1 describe un método para mejorar la reactividad de un linfocito T con una célula tumoral utilizando los TIL. En el documento US2003194804 A1, los linfocitos T se exponen a un agente y se reintroducen en el paciente. El agente es capaz de reducir o prevenir la expresión o interacción de un Notch endógeno o ligando Notch en el linfocito T.
El documento US5126132 A describe un método para tratar el cáncer, en donde se usa una cantidad eficaz de TIL autólogos y una citocina.
Díaz R. M.et al. (Cáncer Res.15 marzo 2007; 67 (6): 2840-8) describen un aumento de las cantidades circulantes de linfocitos T específicos de antígenos tumorales mediante el uso de la terapia de transferencia adoptiva de linfocitos T en combinación con la viroterapia intratumoral del virus de la estomatitis vesicular. Díazet al.utilizaron células OT1, es decir, una estirpe celular monoclonal artificial en la terapia de transferencia adoptiva de linfocitos T. El documento CN102154213 describe un vector adenovírico oncolítico que comprende la secuencia que codifica Interleucina-2 (IL-2) como producto terapéutico, para usar en el tratamiento del cáncer.
Ellebaek et al. (Journal of Translational Medicine, Biomed Central; 21 August 2012; 10(1):169) desvelan la combinación de IL-2 junto con una terapia celular adoptiva independiente, en donde se administra subcutáneamente interleucina-2 (IL-2) y por infusión intravenosa la terapia celular adoptiva por separado (ACT).
El documento CA2423091 describe el suministro de TNF-alfa e interleucina-2 (IL-2) a tumores usando un adenovirus para la destrucción selective del tumor.
Aunque incluso en los primeros ensayos de TCA, hubo ejemplos drásticos de beneficios de tratamiento e incluso curaciones, la mayoría de los pacientes no se beneficiaron y muchos pacientes experimentaron efectos secundarios graves. Durante las dos primeras décadas de terapia celular adoptiva, la seguridad del transferidor de células propiamente dicha fue generalmente buena, pero toxicidades significativas e incluso la mortalidad se asociaron a los tratamientos consiguientes utilizados para mejorar la terapia, incluidas la quimioterapia y la radioterapia de preacondicionamiento, y la IL-2 utilizada después de la transferencia. El preacondicionamiento se usa para destruir células supresoras, como los linfocitos T reguladores y los supresores derivados de mieloides en el anfitrión, para modular el microentorno del tumor y "dejar margen" para el injerto. IL2 se utiliza después de la transferencia para reducir la anergia del injerto y para propagarlo.
Con respecto a la eficacia, queda margen de mejora. Se justifica el aumento de la especificidad y la capacidad suficiente para destruir tumores de las terapias celulares en general. En particular, en la TCA de la técnica anterior, las células transferidas fallan en el tráfico hacia los tumores, e incluso si lo hacen, a menudo se vuelven anérgicas, de lo contrario no pueden destruir células tumorales o no pueden propagarse, dando como resultado un rápido descenso del número de células. Además, los cánceres con frecuencia reducen el antígeno leucocitario humano (HLA), conocido como complejo principal de histocompatibilidad en animales, en células tumorales, produciendo de este modo incapacidad de los linfocitos T para destruir, ya que se requiere HLA para la presentación de los epítopos tumorales al receptor de linfocitos T.
Breve descripción de la invención
Un objeto de la presente invención es proporcionar métodos sencillos y herramientas para superar los problemas anteriores de terapias ineficientes, inseguras e impredecibles contra el cáncer. La invención se caracteriza por lo que se dice en las reivindicaciones independientes. Las realizaciones específicas de la invención se describen en las reivindicaciones dependientes.
La presente solicitud describe el montaje de vectores víricos biotecnológicos.
La invención se basa en la idea de combinar vectores adenovíricos oncolíticos que codifican citocinas IL-2 y TNF-alfa con agentes terapéuticos celulares adoptivos para el tratamiento del cáncer de una manera novedosa e inventiva. La invención se basa en efectos sorprendentes, es decir, en las siguientes mejoras en la terapia adoptiva de linfocitos T: i) selección de células transferidas al tumor, ii) propagación de células transferidas al tumor, iii) reactividad mejorada de las células transferidas al tumor (figura 20). De hecho, dicha combinación de vectores víricos y citocinas IL-2 y TNF-alfa con agentes terapéuticos celulares adoptivos proporciona resultados más eficaces en objetivos más amplios de lo que podría haberse supuesto. Los efectos de dicha combinación de vectores víricos que comprende transgenes de citocinas IL-2 y TNF-alfa con transferencia celular adoptiva son sinérgicos comparados con los efectos de solo efectos víricos que comprenden transgenes de citocinas o solamente transferencias celulares adoptivas.
Las ventajas de las disposiciones de la presente invención son efectos terapéuticos mejorados y efectos secundarios reducidos. Se evitan eventos adversos graves, incluso muertes, debido a que las mejoras en la eficacia y los efectos antisupresores del planteamiento de los inventores, pueden reducir la necesidad de preacondicionar la quimioterapia y/o la radiación utilizadas en los métodos de la técnica anterior para "dejar margen" para las células transferidas y reducir la inmunosupresión tumoral. Además, se evitan eventos adversos graves, incluso muertes, porque la adición independiente de IL2 utilizada en los métodos de la técnica anterior para propagar y mantener las células transferidas después de transferirlas a un paciente no es necesaria si el virus la produce mientras se replica en el tumor. La producción local en el tumor también puede mejorar los efectos deseados de IL-2 (estimulación y propagación del injerto) a la vez que se reduce la exposición general que es la causa de episodios adversos.
Además, la presente invención proporciona efectos terapéuticos sorprendentes al: i) Proporcionar señales de tráfico al tumor, por ejemplo, inyectando los vectores víricos que comprenden citocinas IL-2 y TNF-alfa biotecnológicas en el tumor. La inyección de virus da como resultado la producción de citocinas IL-2 y TNF-alfa adecuadas para este efecto (en reacción a la unión del virus a los receptores de reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos), pero se pueden conseguir efectos mucho mayores mediante la producción adicional de citocinas IL-2 y TNF-alfa como transgenes del virus. ii) Reducir la tolerancia aumentando las señales de peligro. La inyección de virus propiamente dicha puede conseguir esto uniendo a receptores de reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos, pero el efecto puede mejorarse mediante la producción adicional de IL-2 y TNF-alfa como transgenes del virus. iii) Inducir la expresión de<h>L<a>. La infección por virus aumenta la expresión de HLA, ya que las células intentan presentar epítopos víricos para montar una respuesta de linfocitos T antivíricos. Inesperadamente, esto se puede usar para mejorar la terapia con linfocitos T contra los epítopos tumorales, que requiere HLA para actuar. El efecto del virus sobre HLA está mediado en parte por citocinas IL-2 y TNF-alfa; la producción de dichas citocinas a partir del virus también puede inducir la expresión de HLA en células tumorales cercanas. iv) Inducir la propagación de las células elevando la inmunosupresión, mediada por la presencia del virus en sí (de nuevo mediante los receptores de reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos), pero mejorada por la producción de citocinas (figura 37). Por lo tanto, este método puede resolver los obstáculos críticos que actualmente obstaculizan las terapias celulares adaptativas.
Breve descripción de los dibujos
A continuación se describirá la invención con mayor detalle por medio de realizaciones específicas con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
La figura 1 demuestra que el tratamiento con adenovirus oncolíticos híbridos Ad5/3 aumentó la secreción de citocinas y quimiocinas en tumores B16-OVA. El interferón-Y puede aumentar la expresión de HLA (= MHC) clase I, lo que genera un fenotipo de células tumorales que los TIL pueden reconocer de manera eficaz. Varias quimiocinas inducibles por IFN-y (tales como RANTES, MIP-1a y MCP-1) están involucradas en la selección de inmunocitos, lo que podría favorecer la activación y proliferación de TIL. También el tráfico de TIL puede mejorarse aumentando estas quimiocinas.
La figura 2 muestra el control del crecimiento del tumor después de múltiples inyecciones de 5/3 adenovirus oncolíticos híbridos con o sin transferencia celular adoptiva. El tratamiento con adenovirus solo (A) tuvo poco efecto sobre el crecimiento del tumor B16-OVA en comparación con el tratamiento con PBS. La transferencia adoptiva de 500.000 (B) o 2.000.000 (C) linfocitos OT-I específicos del tumor en combinación con inyecciones de virus dio como resultado un control significativo del crecimiento del tumor. El escaso efecto terapéutico sobre el crecimiento tumoral usando adenovirus solo o linfocitos OT-I en combinación con PBS resalta las principales deficiencias del virus oncolítico y las terapias de transferencia celular adoptiva utilizadas como agentes únicos, apoyando el propósito de la invención para mejorar la eficacia de la terapia celular adoptiva usando adenovirus.
La figura 3 demuestra que las inyecciones de adenovirus inducen el tráfico de linfocitos T en tumores y aumentan la proliferación de linfocitos T transferidos de forma adoptiva en tumores. A) La cantidad de células CD8+ CFSE+ transferidas de forma adoptiva aumentó en tumores y disminuyó en la sangre, drenando los ganglios linfáticos y el bazo de ratones tratados con Ad el día 1 después del tratamiento, supuestamente debido al tráfico de linfocitos. El recuento global de linfocitos T CD8+ se mantuvo elevado en los tumores tratados con adenovirus durante todo el experimento, lo que sugiere una resistencia de estas células al microentorno del tumor perjudicial y/o una mayor proliferación de linfocitos T CD8+. B) Los días 6 y 14, la proliferación de linfocitos OT-I se mejoró en los tumores tratados con Ad en comparación con el grupo de PBS, visto como una mayor fracción de células que se han sometido a división celular (trasladada hacia M7) que en el grupo de PBS. Por consiguiente, el tratamiento con adenovirus oncolítico induce el tráfico y la proliferación de TIL transferidos de forma adoptiva. C) Ejemplo de cómo se realizó la selección de células positivas a CFSE. M0 indica celdas que no se han dividido, M7 muestra celdas que se han dividido lo suficiente como para diluir la CFSE por debajo de los límites detectables (más de 7 veces).
La figura 4 da a conocer datos de seres humanos tratados con adenovirus oncolítico los días indicados por flechas. La inyección de virus en el tumor provocó una disminución de linfocitos en la sangre, lo que refleja su tráfico hacia los tumores.
La figura 5 da a conocer datos de que la inyección de adenovirus oncolítico en un tumor de un paciente humano con cáncer produjo la afluencia de linfocitos T CD8+. La inyección intratumoral de adenovirus oncolítico produce acumulación de linfocitos T CD8+ en el tumor evaluado a partir de biopsias con aguja antes y después del tratamiento.
La figura 6 muestra los resultados de las inyecciones de adenovirus combinadas con la transferencia adoptiva de linfocitos T. Los ratones con tumores B16-Ova subcutáneos se transfirieron adoptivamente con 5x105 linfocitos OT1 por vía intraperitoneal y los tumores se dejaron sin tratar, o se inyectaron con PBS o Ad5/3 (véase Ejemplos de materiales y métodos). En un modelo inmunosupresor de B16-Ova similar al melanoma humano, la transferencia celular adoptiva anti-Ova OT1 hace poco. Agregar inyecciones de virus aumenta la eficacia drásticamente (a). Aumento de linfocitos T CD8+ (b). Estas células no son linfocitos T anti-Ova (c).
La figura 7 da a conocer un aumento drástico en el número de linfocitos T antitumorales "naturales" debido a la transferencia adoptiva y la inyección de virus. Los ratones con tumores B16-Ova subcutáneos se transfirieron adoptivamente con 5x105 linfocitos OT1 por vía intraperitoneal y los tumores se dejaron sin tratar, o se inyectaron con PBS o Ad5/3 (véase Ejemplos Materiales y métodos). La transferencia adoptiva las inyecciones de virus funcionan como un catalizador para la propagación de "otros" linfocitos T en el tumor y los ganglios linfáticos locales. (a) Células Trp2 CD8+ en la zona del tumor. (b) Célula CD8+ anti-gp100 en la zona del tumor.
La figura 8 muestra las células CD8+ activadas en el tumor y la expresión de TIM-3 en el tumor el día 14. Los ratones con tumores B16-Ova subcutáneos se transfirieron de forma adoptiva con 5x105 linfocitos OT1 por vía intraperitoneal y los tumores se dejaron sin tratar, o se inyectaron con PBS o Ad5/3 (véase Ejemplos Materiales y métodos). Inmunosupresión en inmunoterapia: el aumento en el número de linfocitos T no es suficiente si no se elimina la inmunosupresión. Hay más linfocitos T activadas en los tumores tratados con virus y menos inmunosupresión.
La figura 9 demuestra el aumento en linfocitos T antitumorales y la reducción de los resultados de inmunosupresión en la inmunidad general contra los antígenos tumorales. Los ratones con tumores B16-Ova subcutáneos se transfirieron de manera adoptiva con 5x105 OT1 (a) o 2x106 (b) linfocitos OT1 por vía intraperitoneal y los tumores se dejaron sin tratar, o se inyectaron con PBS o Ad5/3 (véase Ejemplos Materiales y métodos ). La presentación de antígenos está mejorada por virus: los linfocitos T funcionan mejor. Se produce inmunidad general frente a varios resultados de epítopos tumorales. (a) la expresión de moléculas coestimuladoras en células dendríticas (CD11c+ CD80+ CD86+) en el tumor el día 14. (b) IFNg ELISPOT con esplenocitos el día 14.
La figura 10 muestra la distribución de linfocitos T OTI después de la inyección del virus: tendencia al tráfico, pero no suficiente para explicar la eficacia. (a) diagrama, (b) modelo animal, (c) tumor.
La figura 11 da a conocer que la elevación de la inmunosupresión puede inducir la propagación de las células. Los tumores tratados con adenovirus contenían más linfocitos específicos del tumor (linfocitos OT-I). En los tumores tratados con PBS, las células OTI se detuvieron en la fase M5 (flecha izquierda), mientras que en el grupo Ad continuaron proliferando (flecha derecha).
La figura 12 muestra la eficacia de citocinas biotecnológicas (sin virus) en combinación con células OT1.
La figura 13 muestra eficacia antitumoral de los adenovirus armados con citocinas combinados con la transferencia adoptiva de linfocitos T. Ratones C57BL/6 portadores de tumores de melanoma B16-OVA subcutáneos fueron tratados con 1,5 x 106 linfocitos T OT-1 enriquecidos con CD8+ por vía intraperitoneal el día 1. Los adenovirus que codifican citocinas o el virus Ad5-Luc1 de referencia se inyectaron por vía intratumoral el día 1 y cada semana después (1 x 109 partículas víricas por tumor). El volumen tumoral se calculó como se describió anteriormente (Bramanteet al.Serotype chimeric oncolytic adenovirus coding for GM-CSF for treatment of sarcoma in rodents and humans.Int J. Cáncer,24 dic. 2013) y los tamaños de los tumores se indican como porcentaje correspondiente al día 1, que se estableció como 100%. Número en cifra de riesgo: número de animales que quedan en cada grupo experimental en un momento dado. Se sacrificaron los animales de forma humanizada cuando los tumores habían superado el tamaño máximo aceptable o cuando eran evidentes algunos signos de dolor o sufrimiento.
La figura 14 muestra los efectos de diferentes virus en el tamaño del tumor.
La figura 15 muestra excelentes resultados de vectores adenovíricos que comprenden el transgén mTNFa en combinación con linfocitos T OT 1 para reducir el tamaño del tumor.
La figura 16 muestra excelentes resultados de vectores adenovíricos que comprenden el transgén mIL3 en combinación con linfocitos T OT 1 para reducir el tamaño del tumor.
La figura 17 muestra un esquema de adenovirus oncolíticos que expresan C5a o TNF-a. Se muestran algunas características importantes de los virus, incluida la zona donde se insertan los transgenes.
La figura 18 muestra la expresión de TNF-a por adenovirus oncolítico en células A549. Las células se infectaron con 10 PV/célula, el medio se recogió en los puntos de tiempo indicados y se usó ELISA para evaluar la cantidad de TNF-a en el medio. El virus induce la expresión y la secreción de TNF-a de las células infectadas.
La figura 19 muestra la actividad biológica del TNF-alfa producido por el adenovirus oncolítico armado con TNF-alfa oncolítico. En este ensayo, el sobrenadante de las células infectadas se utilizó para provocar a las células WEHI-13VAR sensibles al TNF, corroborando que el adenovirus oncolítico conduce la expresión de citocinas funcionales. La figura 20 muestra la muerte dependiente de la dosis de células cancerosas humanas por adenovirus oncolíticos. Como era de esperar, en las células tumorales A549 o PC3 humanas permisivas a la oncolisis insensibles al TNF-alfa, no se observó diferencia entre el virus de referencia desarmado y el adenovirus oncolítico que expresa TNF-alfa, ya que la simple oncólisis era suficiente para destruir las células. Sin embargo, debido a que el TNF-alfa humano es parcialmente activo en células de ratón, que no son permisivas a la oncólisis por el adenovirus humano, el TNF-alfa contribuyó a la mayor citotoxicidad del virus visto en células de ratón B16-OVA en comparación con el virus desarmado. El virus defectuoso para la replicación muestra una capacidad de destrucción celular insignificante. La figura 21 demuestra que la terapia de radiación es sinérgica con el virus que expresa TNF-alfa. A) Un esquema del programa de tratamiento en este experimento. La radiación (XRT) fue la irradiación de todo el cuerpo a una dosis de 2 X 2Gy y el virus fue 1 x 108 PV/tumor, donde cada ratón lampiño llevaba dos xenoinjertos A549. B) El virus TNF-alfa alberga mayor potencia antitumoral que el virus parental desarmado. Debido a que el virus de replicación defectuosa (RD) no destruyó las células A549 en el cultivo (figura 20), el efecto antitumoral provocado por el virus RDin vivoprobablemente se deba a respuestas inmunitarias innatas, incluidas las citocinas, los linfocitos citolíticos naturales y macrófagos, provocados por inyecciones de virus. C) El virus que expresa TNF-alfa produce mayores efectos antitumorales cuando se combina con dosis clínicamente adecuadas de radiación de haz externo, lo que respalda la traducibilidad clínica de los virus armados con citocinas.
La figura 22 muestra la eficacia antitumoral del adenovirus que codifica hTNF-alfa en tumores B16-OVA. Este experimento es análogo al que se muestra en la figura 26 con el virus de C5a, lo que demuestra que la expresión de TNF-alfa confiere una mayor ventaja terapéutica en comparación con el virus desarmado.
La figura 23 muestra la inducción/expansión mejorada de linfocitos T CD8+ específicas de tumores en tumores tratados con virus armado con citocinas (II). Los tumores en el experimento representado en la figura 20 se extirparon y procesaron para análisis citométrico de flujo, similar al del experimento 11. Se detectó una mayor inducción/número de linfocitos T CD8+ específicos de OVA en tumores tratados con el virus que codifica TNF en comparación con virus de referencia desarmado, lo que sugiere junto con datos de C5a que las citocinas seleccionadas racionalmente expresadas por adenovirus oncolíticos junto con la inflamación producida por el virus forman un entorno tumoral único que apoya fuertemente la expansión y activación de linfocitos T específicos del tumor, por deducción y comparación con las figuras 2B, C también de linfocitos T transferidos adoptivamente.
La figura 24 muestra la expresión de C5a en células A549. Las células se infectaron con 10 PV/célula, el medio se recogió en los puntos de tiempo indicados y se usó ELISA para evaluar la cantidad de C5a en el medio. Se muestran los resultados de dos experimentos individuales.
La figura 25 muestra los resultados de un ensayo de quimiotaxiain vitro.Se cuantificó la cantidad de monocitos humanos THP1 que pasan a través de una membrana semipermeable hacia la cámara inferior, como atraídos por las quimiocinas en los sobrenadantes de prueba, según las instrucciones del fabricante (equipo Millipore QCM). El virus que expresa C5a provoca factores quimiotácticos más fuertes de las células infectadas que el virus de referencia. Los resultados argumentan a favor del uso de virus armados con citocinas en lugar de virus desarmados. La figura 26 muestra la eficacia antitumoral de AdD24-C5ain vivo.Los tumores subcutáneos probados se inyectaron los días 0, 2 y 4 con 1 x 109 PV de cada virus o con 50 gl de PBS y los volúmenes de los tumores se midieron con el calibrador. El virus que expresa C5a proporciona un control superior del tumor en comparación con el virus de referencia. Dado que el adenovirus no se replica ni mata las células del ratón, es decir, no es citolítico en este modelo (Young A. M.et al. Mol. Ther.Sep 2012; 20(9): 1676-88, PMID: 22735379), estos resultados subrayan la robusta capacidad del virus armado con citocinas para mejorar los efectos antitumorales inmunitarios, apoyando firmemente el concepto de usarlo para mejorar la eficacia de la terapia celular adoptiva.
La figura 27 muestra la inducción/expansión mejorada de linfocitos T CD8+ específicos de tumores en tumores tratados con virus armados con citocinas (I). Los tumores en el experimento representado en la figura 26 se extirparon y procesaron para análisis de citometría de flujo. Las suspensiones de células individuales se tiñeron con anticuerpo contra CD8 y con pentámero contra TCR anti-ova. La expresión de C5a por un adenovirus no citolítico produce un mayor número de linfocitos T CD8 CD específicas de OVA en tumores en comparación con virus de referencia, adenovirus desarmados o virus que expresan antagonista de C5a, lo que respalda el uso de virus armados con citocinas para aumentar el número de linfocitos T transferidos de forma adoptiva en tumores. Véase también el experimento 13.
La figura 28 muestra un esquema de la respuesta adaptativa de los linfocitos T.
La figura 29 demuestra que los linfocitos T transferidos adaptativamente funcionan como un catalizador ("chispa") para los linfocitos T preexistentes.
La figura 30 muestra que la "chispa" adaptativa produce un aumento en los linfocitos T antitumorales "naturales". La figura 31 muestra el método de transferencia celular adoptiva.
La figura 32 demuestra que con la tecnología TILT de la presente invención, se puede evitar el preacondicionamiento tóxico (quimio+radiación) y el acondicionamiento posterior (IL2 general). (Para los mecanismos de la tecnología TILT, véase la figura 37).
La figura 33 muestra un esquema de los nuevos montajes de virus que expresan una sola citocina. El eje central del virus es el serotipo 5 del adenovirus humano, aparte del pomo de fibra, que es del serotipo 3. Tanto los transgenes simples como los dobles están bajo control de la transcripción del activador del virus E3. Ambos transgenes se colocan en la región E3 que se elimina paragp19ky6,7k.La proteína E1A se elimina para 24 aminoácidos ("D24"), en la región constante 2, lo que hace que la unión de Rb sea defectuosa. La expresión de E1A está bajo regulación del activador E2F. Algunas regiones genéticas del virus se muestran para referencia.
La figura 34 muestra un esquema de los nuevos montajes de virus que expresan dos citocinas. En una versión, el 'sitio de derivación del ribosoma'/'sitio de omisión del ribosoma'/'elemento de hidrolasa que funciona en cis' (CHYSEL) se coloca como fusiones en el marco entre cada citocina. Las inserciones de citocinas se sintetizarán como una sola poliproteína que se escinde con la traducción para producir ambas citocinas, dando como resultado la adición de varios aminoácidos más en el extremo 3' de la primera citocina, y una sola prolina en el 5' de la última citocina, IL2). En otra versión, un elemento IRES separa las dos citocinas, lo que da como resultado la síntesis de citocinas sin más aminoácidos.
La figura 35 muestra secuencias de nucleótidos y aminoácidos de 2A.
La figura 36 muestra la tecnología de administración de adenovirus intravenoso TILT Biotherapeutics. Los adenovirus TILT descritos anteriormente se administrarán por vía intratumoral a los pacientes para mejorar la terapia con linfocitos T (marcados como 4a, 5a). Sin embargo, no todos los tumores pueden alcanzarse por la vía intratumoral. Por lo tanto, hemos desarrollado un vehículo de administración a base de Ad3 que puede alcanzar tumores por vía intravenosa (marcado como 4b, 5b).
La figura 37 muestra los mecanismos de mejora de la terapia celular adoptiva por el virus doble que expresa citocinas. La infección por virus y la detección innata de partículas víricas induce señales de peligro, que incluyen el aumento de las moléculas HLA/MHC de clase I en las células cancerosas, la activación y maduración de las células presentadoras de antígenos y la secreción de citocinas que captan inmunocitos. Las señales de peligro se amplifican aún más por la muerte de células tumorales con virus oncolíticos, que también liberan antígenos tumorales y aumentan el reconocimiento del tejido tumoral por parte del sistema inmunitario. Los virus expresan dos citocinas: la citocina captadora de linfocitos T atrae linfocitos T transferidos de forma adoptiva al tumor, y la citocina expansora de linfocitos T, en una realización específica la interleucina 2, aumenta y mantiene su proliferación.
La figura 38 muestra esquemas del experimento de tráfico con citocinas biotecnológicas de ratón. Los ratones hembra C57BL/6 que llevan B16-OVA se transfieren de forma adoptiva con 2,0 x 106 linfocitos OT-I enriquecidos con CD8a+ (secuencia) el día 0 y se tratan con inyecciones intratumorales de citocinas murinas biotecnológicas (triángulos) en días laborables. El crecimiento del tumor se controla y registra tres veces por semana (círculos) mediante el uso de calibradores electrónicos. Los ratones se sacrifican (X) en dos puntos de tiempo diferentes (SAC1 y SAC2), los tumores se recogen y las muestras se analizan utilizando qPCR OT-I y análisis de FACS de linfocitos T.
La figura 39 muestra los esquemas del experimento de tráfico con adenovirus que codifican citocinas de ratón. Los ratones hembra C57BL/6 que llevan B16-OVA se transfieren de forma adoptiva con 2,0 x 106 linfocitos OT-I enriquecidos con CD8a+ (secuencia) por vía ip el día 0 y se tratan por vía intratumoral con adenovirus armados con diferentes citocinas de ratón (triángulos rojos) en días laborables. El crecimiento del tumor se controla y registra tres veces por semana (círculos) utilizando calibradores electrónicos. Los ratones se sacrifican (X) en dos puntos de tiempo diferentes (SAC1 y SAC2), los tumores se recogen y las muestras se analizan utilizando qPCR OT-I y análisis de FACS de linfocitos T.
La figura 40 muestra los esquemas del experimento de tráfico utilizando linfocitos OT-I radiomarcados con 111In y diagnóstico por la imagen SPECT/CT. Ratones hembra C57BL/6 que llevan B16-OVA se inyectan por vía intratumoral con 1 x 109 PV de 5/3 virus híbridos (triángulos) en seis días seguidos. El primer grupo de ratones recibirá una transferencia adoptiva de 2,0 x 106 linfocitos OT-I (secuencia) marcados con indio-oxina y enriquecidos con CD8a+, por vía iv en el día 0 y el otro grupo de ratones en el día 7. La acumulación de linfocitos OT-I en tumores se cuantifica por diagnóstico por la imagen SPECT/CT (círculos). Los ratones se sacrifican (X) en dos puntos temporales diferentes (SAC1 y SAC2), se recogen los tumores y se mide su radioactividad final.
Descripción detallada de la invención
Terapia celular adoptiva
El planteamiento general de la presente invención es el desarrollo de un tratamiento para pacientes con cáncer utilizando la transferencia de inmunolinfocitos que son capaces de reaccionar y destruir el cáncer. Los linfocitos infiltrantes de tumores aislados se cultivan en grandes cantidades y se infunden en el paciente. En la presente invención, los vectores adenovíricos que codifican al menos IL-2 y TNF-alfa se utilizan para aumentar el efecto de los linfocitos. Las administraciones independientes de una composición terapéutica celular adoptiva y vectores adenovíricos están frecuentemente precedidas por el acondicionamiento previo mielosupresor o no mielosupresor de quimioterapia y/o radiación. El tratamiento de terapia celular adoptiva está destinado a reducir o eliminar el cáncer en el paciente. (Figura 21).
Esta invención se refiere a terapias con una composición terapéutica celular adoptiva, p. ej., linfocitos infiltrantes de tumores, linfocitos modificados con TCR o linfocitos modificados con CAR. Esta invención se refiere a terapias de linfocitos T en especial, pero también a otras terapias adoptivas como las terapias de linfocitos citolíticos naturales u otras terapias celulares. De hecho, según la presente invención, la composición terapéutica celular adoptiva puede comprender células no modificadas tales como en la terapia de TIL o células modificadas genéticamente. Hay dos materias frecuentes de conseguir la orientación genética de los linfocitos T a objetivos específicos del tumor. Una es la transferencia de un receptor de linfocitos T con especificidad conocida (terapia con TCR) y con el tipo de antígeno leucocitario humano pareado (HLA, conocido como complejo de histocompatibilidad principal en roedores). La otra es la modificación de células con moléculas artificiales tales como los receptores de antígenos híbridos (CAR). Este método no depende del HLA y es más flexible con respecto a las moléculas de direccionamiento. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos monocatenarios y los CAR también pueden incorporar dominios coestimuladores. Sin embargo, los objetivos de las células CAR deben estar en la membrana de los dianocitos, mientras que las modificaciones de TCR pueden utilizar dianas intracelulares.
Como se emplea en la presente memoria, "composición terapéutica celular adoptiva" se refiere a cualquier composición que comprende células adecuadas para la transferencia celular adoptiva. En una realización de la invención, la composición terapéutica celular adoptiva comprende un tipo de célula seleccionada de un grupo que consiste en un linfocito infiltrante de tumor (TIL), linfocitos modificados con TCR (es decir, receptor heterólogo de linfocitos T) y linfocitos modificados con CAR (receptor de antígeno híbrido). En otra realización de la invención, la composición terapéutica celular adoptiva comprende un tipo de célula seleccionado de un grupo que consiste en linfocitos T, células CD8+, células CD4+, linfocitos citolíticos naturales, linfocitos T delta-Y, linfocitos T reguladores y células mononucleares de sangre periférica. En otra realización, los TIL, los linfocitos T, las células CD8+, las células CD4+, los linfocitos citolíticos naturales, linfocitos T delta-Y, los linfocitos T reguladores o las células mononucleares de sangre periférica forman la composición terapéutica celular adoptiva. En una realización específica de la invención, la composición terapéutica celular adoptiva comprende linfocitos T. Tal como se emplea en la presente memoria, "linfocitos infiltrantes de tumores" o TIL se refieren a los glóbulos blancos que han salido del torrente sanguíneo y han migrado a un tumor. Los linfocitos se pueden dividir en tres grupos, incluidos los linfocitos B, los linfocitos T y los linfocitos citolíticos naturales. En otra realización específica de la invención, la composición terapéutica celular adoptiva comprende linfocitos T que se han modificado con receptores de antígenos híbridos específicos para diana o receptores de linfocitos T seleccionados específicamente. Como se emplea en la presente memoria, "linfocitos T" se refiere a células CD3+, incluidos linfocitos T cooperadores CD4+, linfocitos T citotóxicos CD8+ y linfocitos T<y>5.
Además de las células adecuadas, la composición terapéutica celular adoptiva usada en la presente invención puede comprender cualquier otro agente tal como vehículos farmacéuticamente aceptables, amortiguadores, excipientes, adyuvantes, aditivos, antisépticos, agentes de relleno, estabilizantes y/o espesantes, y/o cualquier componente que se encuentre normalmente en los productos correspondientes. La selección de ingredientes adecuados y los métodos de fabricación apropiados para formular las composiciones pertenece al conocimiento general de un experto en la materia.
La composición terapéutica celular adoptiva puede estar en cualquier forma, tal como forma sólida, semisólida o líquida, adecuada para la administración. Una formulación puede seleccionarse de un grupo que consiste en, pero no se limita a, soluciones, emulsiones, suspensiones, comprimidos, granulados y cápsulas. Las composiciones no se limitan a una cierta formulación, en lugar de ello, la composición puede formularse en cualquier formulación farmacéuticamente aceptable conocida. Las composiciones farmacéuticas se pueden producir mediante cualquier procedimiento convencional conocido en la técnica.
Vectores víricos
Los vectores adenovíricos oncolíticos utilizados en la presente invención pueden ser cualquier vector adenovírico adecuado para el tratamiento de un humano o animal. En una realización de la invención, los vectores adenovíricos son vectores de virus humanos, y pueden seleccionarse de un grupo que consiste en vectores Ad5, Ad3 y Ad5/3. En otra realización, el vector es un vector Ad5 o Ad5/3.
Como se emplea en la presente memoria, un vector adenovírico oncolítico se refiere a un vector adenovírico capaz de infectar y destruir células cancerosas por replicación selectiva en células tumorales frente a células normales. Los vectores se pueden modificar de cualquier forma conocida en la técnica, p. ej., eliminando, insertando, mutando o modificando cualquiera de las áreas víricas. Los vectores se hacen específicos de tumores con respecto a la replicación. Por ejemplo, el vector adenovírico puede comprender modificaciones en E1, E3 y/o E4, como la inserción de activadores específicos del tumor (p. ej., para conducir E1), eliminaciones de áreas (p. ej., la región constante 2 de E1 como se usa en "D24", E3/gp19k, E3/6,7k) e inserción de transgenes. Además, se pueden modificar las áreas del pomo de fibra del vector. En una realización de la invención, el vector adenovírico es Ad5/3 que comprende un eje central de ácido nucleico Ad5 y un pomo de fibra Ad3 o un pomo híbrido de fibra Ad5/3. Como se emplea en la presente memoria, la expresión "eje central de ácido nucleico de adenovirus serotipo 5 (Ad5)" se refiere al genoma de Ad5. Asimismo, "eje central de ácido nucleico de adenovirus serotipo 3 (Ad3)" se refiere al genoma de Ad3. "Vector Ad5/3" se refiere a un vector híbrido que tiene partes de ambos vectores Ad5 y Ad3. En una realización específica de la invención, la modificación de la cápside del vector es el hibridismo Ad5/3. Como se emplea en la presente memoria, "pomo híbrido de fibra de Ad5/3" se refiere a un hibridismo, en donde la parte del pomo de fibra es de Ad serotipo 3, y el resto de la fibra es de Ad serotipo 5. Específicamente, en una realización, el montaje tiene el pomo de fibra de Ad3 mientras que el resto del genoma es de Ad5. (Véase las figuras 17, 33 y 34). Un método para la generación de un adenovirus oncolítico específico de tumor está diseñando una eliminación de 24 pares de bases (D24) que afecta a la región constante 2 (CR2) de E1. En el adenovirus CR2 natural es responsable de la unión de la proteína supresora del tumor celular Rb/proteína reguladora del ciclo celular para la inducción de la fase de síntesis (S), es decir, la fase de síntesis del ADN o de replicación. La interacción entre pRb y E1A requiere ocho aminoácidos 121 a 127 de la región conservada de la proteína E1A, que se eliminan en la presente invención. El vector de la presente invención comprende una eliminación de nucleótidos correspondientes a los aminoácidos 122 a 129 del vector según Heise C.et al.(2000,Nature Med.6, 1134-1139). Se sabe que los virus con la D24 tienen una capacidad reducida para superar el punto de control de G1-S y se replican de manera eficiente solo en células donde esta interacción no es necesaria, p. ej., en células tumorales defectuosas en la ruta Rb-p16, que incluye la mayoría, si no todos, los tumores humanos. (Véanse las figuras 17, 33 y 34).
También es posible reemplazar el activador vírico endógeno E1A, por ejemplo, por un activador específico del tumor. En una realización específica de la invención, se utiliza el activador hTERT en lugar del activador vírico endógeno E1A. La región E3 no es esencial para la replicación víricain vitro,pero las proteínas E3 desempeñan una función importante en la regulación de la respuesta inmunitaria del anfitrión, es decir, en la inhibición de las respuestas inmunitarias tanto innatas como específicas. La eliminación de gp19k/6,7k en E3 se refiere a una eliminación de 965 pares de bases de la región E3A adenovírica. En un montaje adenovírico resultante, se eliminan los genes gp19k y 6,7k (Kanerva A.et al.2005,Gene Therapy12, 87-94). Se sabe que el producto génico gp19k se une y retiene las moléculas del complejo de histocompatibilidad principal I (MHC1, conocido como HLA1 en seres humanos) en el retículo endoplásmico, y evita el reconocimiento de células infectadas por los linfocitos T citotóxicos. Dado que muchos tumores carecen de HLA1/MHC1, la eliminación de gp19k aumenta la selectividad tumoral de los virus (el virus se elimina más rápido que el virus natural de las células normales, pero no hay diferencia en las células tumorales). Las proteínas 6,7k se expresan en las superficies celulares y participan en la disminución del receptor 2 (TRAIL) del ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (véanse las figuras 17, 33 y 34).
Ambas eliminaciones proporcionan una ventaja. Dado que los inventores están intentando recuperar la expresión de HLA/MHC para la presentación de epítopos tumorales a los linfocitos T transferidos de forma adoptiva, la expresión de la proteína gp19k es contraproducente y, de hecho, la regulación positiva de HLA/MHC requiere la eliminación de gp19k. Con respecto a 6,7k, dado que una realización de nuestra invención es la producción de TNFa e IL-2 a partir del virus, y una de las actividades antitumorales de TNFa es un efecto proapoptótico antitumoral directo (tanto en células transeúntes transducidas como en las no transducidas), la presencia de 6,7k es contraproducente.
En una realización de la invención, los transgenes de TNFa e IL-2 se colocan en una región E3 eliminada por gp19k/6,7k, bajo el activador E3. Esto restringe la expresión del transgén a las células tumorales que permiten la replicación del virus y la activación posterior del activador E3. El activador E3 puede ser cualquier activador exógeno (p. ej., activador de CMV o E2F) o endógeno conocido en la técnica, específicamente el activador E3 endógeno. Aunque el activador E3 se activa principalmente por replicación, se produce alguna expresión cuando se expresa E1. Como la selectividad de los virus de tipo D24 se produce después de la expresión de E1 (cuando E1 no puede unirse a Rb), estos virus expresan E1 también en células normales transducidas. Por lo tanto, es de importancia crítica regular también la expresión de E1 para restringir la expresión del transgén mediada por el activador E3 a células tumorales.
En otra realización de la invención, E3 gp19k/6,7k se mantiene en el vector pero una o muchas otras áreas de E3 se han eliminado (p. ej., E39-kDa, E310,2 kDa, E315,2 kDa y/o E315,3 kDa).
En una realización específica de la invención, el vector adenovírico oncolítico se basa en un eje central de ácido nucleico de adenovirus serotipo 5 (Ad5) que comprende un pomo híbrido de fibra 5/3, y que comprende lo siguiente: Activador E2F1 para la expresión específica de tumor de E1A, una eliminación de 24 pb (D24) en la región 2 constante que se une a Rb de E1 adenovírico, una eliminación de la secuencia de ácido nucleico de gp19k vírico y marcos de lectura de 6,7k, con una inserción del transgén en la región eliminada, dando como resultado un control asociado a la replicación de la expresión del transgén bajo el activador E3 vírico y una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos los transgenes IL-2 y TNF-alfa en lugar de los genes adenovíricos gp19k/6,7k eliminados en la región E3 (figura 17). En una realización de la invención, el vector adenovírico se basa en un adenovirus humano. (Véanse las figuras 17, 33 y 34).
No se conocen las funciones exactas de las proteínas de la región inicial (E3) en el adenovirus 3. En general, en los adenovirus no parecen afectar la replicación cuando se eliminan y parecen afectar la respuesta del anfitrión antivírico a los adenovirus (Woldet al.,1999). El E3 del genoma del adenovirus humano contiene el nivel más alto de diversidad genética entre las seis especies (A-F) de adenovirus que se encuentran en seres humanos. Esta diversidad en el contenido genético está localizada principalmente entre los marcos abiertos de lectura (ORF) E3-gp19K y E3-RIDa muy conservados donde se codifican matrices de genes específicas de cada especie (Burgert y Blusch, 2000).
E3-gp19K modula la muerte de células infectadas por virus mediada por linfocitos T citotóxicas. Esto se consigue bloqueando el transporte de MHC clase I a la membrana plasmática e inhibiendo la formación del complejo TAP-MHC clase I (Anderssonet al.,1985; Anderssonet al.,1987; Burgert y Kvist, 2002, Bennetet al.,1999).
Por lo tanto, en un aspecto de la invención, la importante molécula E3-gp19K está comprendida en el vector adenovírico para hacer que la replicación del virus sea más robusta y permita más tiempo para la oncolisis y sus beneficiosos efectos. Además, retener E3-gp19K puede reducir la producción de linfocitos T citotóxicos antiadenovirus, lo que produce más linfocitos T antitumorales.
Las citocinas participan en la respuesta inmunitaria actuando por diversos mecanismos incluida la selección de linfocitos T hacia el tumor. La secuencia de nucleótidos que codifica un transgén de citocina puede ser de cualquier animal como un ser humano, simio, rata, ratón, hámster, perro o gato, pero específicamente está codificada por una secuencia humana. La secuencia de nucleótidos que codifica el transgén puede modificarse para mejorar sus efectos, o no modificarse, es decir, natural.
Las realizaciones particulares de la presente invención incluyen vectores víricos que codifican al menos IL-2 y TNF-alfa. Los vectores víricos de la invención pueden codificar dos, tres, cuatro, cinco o más citocinas. En una realización de la invención el vector adenovírico oncolítico codifica IL-2 y TNF-alfa y una citocina o citocinas adicionales, seleccionadas de un grupo de citocinas que consiste en interferón a, interferón p, interferón y, complemento C5a, GMCSF, CD40L, IL12, IL-23, IL15, IL17, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14-1, CCL14-2, CCL14-3, CCL15-1, CCL15-2, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-2, CCL24, CCL25- 1, CCL25-2, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL4, CCL4L1, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCR10, CCR2, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCRL1, CCRL2, CX3CL1, CX3CR, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL9, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7, y XCL2. La otra citocina funciona atrayendo y activando los linfocitos T y reducir la inmunosupresión del tumor, mientras que IL-2 induce la propagación del injerto de linfocitos T. Por lo tanto, la IL-2 se produce localmente en el tumor donde se necesita, en lugar de inyectarse sistemáticamente como se hace normalmente en el tratamiento con linfocitos T, lo que puede producir efectos secundarios, y por lo tanto un problema importante de los tratamientos de la técnica anterior (es decir, la toxicidad de IL-2 general) puede evitarse mediante esta realización.
La señalización de peligro proporcionada por la replicación del virus oncolítico y la activación de los receptores de reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos por el ADN vírico, junto con la acción del transgén o transgenes puede reducir la inmunosupresión del tumor en un grado tal que la terapia de preacondicionamiento se pueda omitir. En consecuencia, y un problema importante en la técnica anterior, se puede evitar la toxicidad debida a la quimioterapia y la radioterapia de acondicionamiento previo.
En una realización de la invención, el vector de virus comprende un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) u opcionalmente un sitio de derivación 2A del ribosoma entre los dos transgenes IL-2 y TNF-alfa. Como se emplea en la presente memoria, "IRES" se refiere a una secuencia de nucleótidos que permite el inicio de la traducción en medio de una secuencia de ARN mensajero en la síntesis de proteínas. El IRES puede ser de cualquier virus, pero en una realización de la invención, el IRES es del virus de la encefalomiocarditis (EMCV). Como se emplea en la presente memoria, "un sitio de derivación 2A del ribosoma " se refiere a una secuencia de iniciación de la traducción en la que los ribosomas derivan físicamente partes de la región no traducida 5' para alcanzar el codón de iniciación. Tanto los virus con IRES como los 2A permiten producir dos transgenes a partir de un activador (el activador E3). Los esquemas de los diseños generales de los genomas de virus, se muestran en las figuras 17, 33 y 34. Las secuencias de nucleótidos de los vectores víricos que comprenden los transgenes C5a, hCD40L, hIFNa2, hIFNb1, hIFNg1, hIL2 o TNFa se muestran en las SEQ ID n.°s 1-7, respectivamente (transgén Ad5/3-E2F-D24). Además, las secuencias de nucleótidos de los vectores víricos que comprenden dos transgenes, siendo uno IL-2 y el otro C5a, CD40L, IFNa2, IFNb, IFNg, GMCSF o TNFa, se muestran en las SEQ ID n.°s 8-21 (SEQ ID n.°: 8 C5a-2A-IL2, SEQ ID n.°: 9 IFNa-2A-IL2, SEQ ID n.°: 10 TNFa-2A-IL2, SEQ ID n.°: 11 CD40L-2A-IL2, SEQ ID n.°: 12 IFNb-2A-IL2, SEQ ID n.°: 13 GMCSF-2A-IL2, SEQ ID n.°: 14 IFNg-2A-IL2, SEQ ID n.°: 15 C5a-IRES-IL2, SEQ ID n.°: 16 IFNa-IRES-IL2, ID n.°: 17 TNFa-IRES-IL2, SEQ ID n.°: 18 CD40L-IRES-IL2, SEQ ID n.°: 19 IFNb-IRES-IL2, SEQ ID n.°: 20 GMCSF-IRES-IL2, SEQ ID n.°: 21 IFNg-IRES-IL2) (Ad5/3-E2F-D24-transgén-IRES/2A-transgén).
En resumen, las ventajas clave de la presente invención que utilizan vectores víricos que comprenden al menos citocinas IL-2 y TNF-alfa como transgenes son: i) las citocinas y los virus de por si causan una señal de peligro que atrae linfocitos T y otros inmunocitos a los tumores, ii) las citocinas inducen proliferación de linfocitos T tanto en el tumor como en los órganos linfoides locales, iii) las citocinas y los virus de por sí pueden inducir a que las linfocitos T (tanto el injerto de linfocitos T adoptivos como las linfocitos T naturales, antitumorales innatos) se propaguen en el tumor, iv) las citocinas y virus inducen el aumento de las moléculas presentadoras de antígenos (HLA) en las células cancerosas, haciéndolas sensibles al reconocimiento y la destrucción por los linfocitos T, y v) la replicación de citocinas y virus alteran favorablemente el microentorno del tumor al reducir la inmunosupresión y la anergia celular. Los vectores víricos utilizados en las presentes invenciones también pueden comprender otras modificaciones además de las descritas anteriormente. Cualquier componente o modificación adicional puede usarse opcionalmente pero no es obligatorio para la presente invención.
La inserción de elementos exógenos puede potenciar los efectos de los vectores en las células diana. El uso de tejido exógeno o activadores específicos de tumores es frecuente en vectores biotecnológicos y también pueden utilizarse en la presente invención.
En resumen, la presente invención da a conocer que la replicación del virus oncolítico puede atraer linfocitos T e producir señales de peligro en el tumor, reduciendo la inmunosupresión y la anergia celular. Estos efectos están mediados por receptores de reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos, un mecanismo conservado evolutivamente para inducir inmunidad y no sujeto a tolerancia. La presente invención también da a conocer que un beneficio añadido de la plataforma oncolítica, capaz de replicarse en tumores pero no en células normales, es la autoamplificación en el tumor. Además, el efecto oncolítico de por sí, puede sumarse al efecto antitumoral general en los seres humanos.
Cáncer
Los vectores biotecnológicos de la presente invención son competentes para la replicación en células tumorales. En una realización de la invención, los vectores son competentes para la replicación en células, que tienen defectos en la ruta Rb, específicamente la ruta Rb-p16. Estas células defectuosas incluyen todas las células tumorales en animales y seres humanos. Como se emplea en la presente memoria, "defectos en la ruta de Rb" se refiere a mutaciones y/o cambios epigenéticos en cualquier gen o proteína de la ruta. Debido a estos defectos, las células tumorales sobreexpresan E2F y, por lo tanto, la unión de Rb por E1A CR2, que normalmente se necesita para una replicación eficaz, es innecesaria. Además la selectividad está mediada por el activador E2F, que solo se activa en presencia de E2F libre, como se ve en las células defectuosas de la ruta Rb/p16. En ausencia de E2F libre, no se produce la transcripción de E1A y el virus no se replica. La inclusión del activador E2F es importante para evitar la expresión de E1A en tejidos normales, que puede producir toxicidad tanto directa como indirectamente al permitir la expresión de transgenes del activador e3.
La presente invención se refiere a métodos para tratar el cáncer en un sujeto. En una realización de la invención, el sujeto es un ser humano o un animal, específicamente un animal o un paciente humano, más específicamente un ser humano o un animal que padece cáncer.
El método puede usarse para tratar cualquier cáncer o tumor, incluidos los tumores tanto malignos como benignos, tanto los tumores primarios como las metástasis pueden ser objetivos del método. En una realización de la invención, el cáncer presenta linfocitos infiltrantes de tumores. Las herramientas de la presente invención son particularmente atractivas para el tratamiento de tumores sólidos metastásicos que presentan linfocitos infiltrantes de tumores. En otra realización, el injerto de linfocitos T ha sido modificado por un receptor de linfocitos T específico para tumores o tejidos del receptor de antígeno híbrido.
Como se emplea en la presente memoria, el término "tratamiento" se refiere a la administración de al menos vectores adenovíricos oncolíticos o al menos vectores adenovíricos oncolíticos y composición terapéutica celular adoptiva a un sujeto, preferiblemente un sujeto mamífero o humano, para fines que Incluyen no solo la cura completa, sino también la profilaxis, la mejora o el alivio de trastornos o síntomas relacionados con un cáncer o un tumor. El efecto terapéutico se puede evaluar controlando los síntomas de un paciente, los marcadores tumorales en la sangre o, por ejemplo, el tamaño de un tumor o la duración de la supervivencia del paciente.
En otra realización de la invención, el cáncer se selecciona de un grupo que consiste en cáncer nasofaríngeo, cáncer sinovial, cáncer hepatocelular, cáncer renal, cáncer de tejidos conectivos, melanoma, cáncer de pulmón, cáncer intestinal, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, cáncer cerebral, cáncer de garganta, cáncer bucal, cáncer de hígado, cáncer de huesos, cáncer de páncreas, coriocarcinoma, gastrinoma, feocromocitoma, prolactinoma, leucemia de linfocitos T/linfoma, neuroma, enfermedad de von Hippel-Lindau, síndrome de Zollinger-Ellison, cáncer suprarrenal, cáncer anal cáncer del conducto biliar, cáncer de vejiga, cáncer de uréter, cáncer cerebral, oligodendroglioma, neuroblastoma, meningioma, tumor de la médula espinal, cáncer de huesos, osteocondroma, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, cáncer de sitio primario desconocido, carcinoide, carcinoide del aparato digestivo, fibrosarcoma, cáncer de mama, enfermedad de Paget, cáncer de cuello uterino, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer de esófago, cáncer de vesícula biliar, cáncer de cabeza, cáncer de ojo, cáncer de cuello, cáncer de riñón, tumor de Wilms, cáncer de hígado, sarcoma de Kaposi, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer testicular, enfermedad de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano, cáncer bucal, cáncer de piel, mesotelioma, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer endocrino pancreático, glucagonoma, cáncer pancreático, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de pituitaria, sarcoma de tejido blando, retinoblastoma, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer de timo, cáncer de tiroides, cáncer trofoblástico, mola hidatiforme, cáncer de útero, cáncer de endometrio, cáncer de vagina, cáncer de vulva, neuroma acústico, micosis fungoide, insulinoma, síndrome carcinoide, somatostatinoma, cáncer de encía, cáncer de corazón, cáncer de labios, cáncer de meninges, cáncer de boca, cáncer de nervios, cáncer de paladar, cáncer de glándula parótida, cáncer de peritoneo, cáncer de faringe, cáncer pleural, cáncer glándulas salivales, cáncer de lengua y cáncer de amígdalas.
Antes de clasificar a un paciente humano o animal como adecuado para el tratamiento de la presente invención, el médico puede examinar a un paciente. En función de los resultados que se desvían de lo normal y ponen de manifiesto un tumor o cáncer, el médico puede sugerir el tratamiento de la presente invención para un paciente.
Composición farmacéutica
Una composición farmacéutica de la presente invención comprende al menos un tipo de vectores víricos de la invención. Además, la composición puede comprender al menos dos, tres o cuatro vectores diferentes. Además del vector, una composición farmacéutica también puede comprender otros agentes terapéuticamente eficaces, cualesquiera otros agentes tales como vehículos, amortiguadores, excipientes, adyuvantes, aditivos, antisépticos, cargas, estabilizantes y/o espesantes farmacéuticamente aceptables, y/o cualquier componente normalmente encontrado en los productos correspondientes. La selección de ingredientes adecuados y los métodos de fabricación apropiados para formular las composiciones pertenecen al conocimiento general de un experto en la técnica.
La composición terapéutica celular adoptiva puede estar en cualquier forma, tal como forma sólida, semisólida o líquida, adecuada para su administración. Una formulación puede seleccionarse de un grupo que consiste en, pero no se limita a, soluciones, emulsiones, suspensiones, comprimidos, granulados y cápsulas. Las composiciones de la presente invención no se limitan a una determinada formulación, en lugar de ello, la composición puede formularse en cualquier formulación farmacéuticamente aceptable conocida. Las composiciones farmacéuticas se pueden producir por cualquier procedimiento convencional conocido en la técnica.
En una realización de la invención, el vector vírico o la composición farmacéutica funciona como un vehículoin situpara la captación de linfocitos T, potenciando su efecto terapéutico y permitiendo su propagación en el tumor.
Un equipo farmacéutico de la presente invención comprende una composición terapéutica celular adoptiva y vectores adenovíricos oncolíticos que codifican al menos IL-2 y TNF-alfa. La composición terapéutica celular adoptiva se formula en una primera formulación y los vectores adenovíricos oncolíticos que codifican al menos IL-2 y TNF-alfa se formulan en una segunda formulación. En otra realización de la invención, la primera y la segunda formulaciones son para administración simultánea o secuencial, en cualquier orden, a un sujeto.
Administración
El vector o composición farmacéutica de la invención se puede administrar a cualquier sujeto eucariótico seleccionado de un grupo que consiste en plantas, animales y seres humanos. En una realización específica de la invención, el sujeto es un ser humano o un animal. Un animal puede seleccionarse de un grupo que consiste en mascotas, animales domésticos y animales de producción.
Se puede usar cualquier método convencional para la administración del vector o composición a un sujeto. La vía de administración depende de la formulación o forma de la composición, la enfermedad, la localización de los tumores, el paciente, las morbilidades asociadas y otros factores.
En una realización de la invención, la administración o las administraciones separadas de la composición terapéutica celular adoptiva y los vectores adenovíricos oncolíticos que codifican al menos IL-2 y TNF-alfa a un sujeto se llevan a cabo de manera simultánea o consecutiva, en cualquier orden. Tal como se emplea en la presente memoria, "administración separada" o "separada" se refiere a una situación, en la que la composición terapéutica celular adoptiva y los vectores adenovíricos oncolíticos son dos productos o composiciones diferentes que se distinguen entre sí.
Sólo una administración de la composición terapéutica celular adoptiva y los vectores adenovíricos oncolíticos que codifican al menos IL-2 y TNF-alfa de la invención pueden tener efectos terapéuticos. Puede haber cualquier período entre las administraciones dependiendo, por ejemplo, del paciente y del tipo, grado o localización del cáncer. En una realización de la invención hay un período de tiempo de un minuto a cuatro semanas, específicamente de 1 a 10 días, más específicamente de 1 a 5 días, entre la administración consecutiva de la composición terapéutica adoptiva y los vectores adenovíricos oncolíticos que codifican al menos IL-2 y TNF-alfa y/o existen varias administraciones de composición terapéutica celular adoptiva y vectores adenovíricos oncolíticos. El número de tiempos de administración de la composición terapéutica celular adoptiva y los vectores adenovíricos oncolíticos también puede ser diferente durante el período de tratamiento. Los vectores adenovíricos oncolíticos o las composiciones de células farmacéuticas o adoptivas pueden administrarse, por ejemplo, de 1 a 10 veces en las primeras 2 semanas, 4 semanas, mensualmente o durante el período de tratamiento. En una realización específica de la invención, la administración de vectores o cualquier composición se realiza de tres a siete veces en las primeras 2 semanas, luego a las 4 semanas y luego mensualmente. En una alternativa específica, la administración se realiza cuatro veces en las primeras 2 semanas, luego a las 4 semanas y a continuación mensualmente. La duración del período de tratamiento puede variar y, por ejemplo, puede durar de dos a 12 meses o más.
En una realización específica de la invención una composición terapéutica celular adoptiva y vectores adenovíricos oncolíticos se administran el mismo día y, posteriormente, se administran vectores adenovíricos oncolíticos cada semana, dos semanas, tres semanas o todos los meses durante un período de tratamiento que puede durar por ejemplo de uno a 6 o 12 meses o más.
En una realización de la invención, la administración de virus oncolíticos se realiza mediante una inyección intratumoral, intraarterial, intravenosa, intrapleural, intravesicular, intracavitaria o peritoneal, o una administración oral. También es posible cualquier combinación de administraciones. El método puede dar eficacia general a pesar de la inyección local. La composición terapéutica celular adoptiva se puede administrar por vía intravenosa o intratumoral. En una realización, la administración de la composición terapéutica celular adoptiva y/o los vectores víricos oncolíticos que codifican al menos IL-2 y TNF-alfa se realiza a través de una inyección intratumoral, intraarterial, intravenosa, intrapleural, intravesicular, intracavitaria o peritoneal, o una administración oral. En una realización específica de la invención los TIL o linfocitos T se administran por vía intravenosa y los vectores víricos por vía intratumoral y/o intravenosa. Es de destacar que el virus se administra al tumor por separado de la administración de linfocitos T; el virus no se utiliza para modificar el injerto de linfocitos Tex vivo.En esencia, el virus modifica el tumor de tal manera que el injerto de linfocitos T puede funcionar mejor.
La dosis eficaz de vectores depende de al menos el sujeto que necesita el tratamiento, el tipo de tumor, la localización del tumor y la fase del tumor. La dosis puede variar, por ejemplo, de aproximadamente 1 x 108 partículas víricas (PV) a aproximadamente 1 x 1014 PV, específicamente de aproximadamente 5 x 109 PV a aproximadamente 1 x 1013 PV y más específicamente desde aproximadamente 8 x 109 PV hasta aproximadamente 1 x 1012 PV. En una realización, los vectores adenovíricos oncolíticos que codifican al menos IL-2 y TNF-alfa se administran en una cantidad de 1 x 1010 - 1 x 1014 partículas víricas. En otra realización de la invención, la dosis está comprendida en el intervalo de aproximadamente 5 x 1010 - 5 x 1011 PV.
La cantidad de células transferidas también dependerá del paciente, pero las cantidades típicas varían de 1 x 109 a 1 x 1012 células por inyección. El número de inyecciones también varía, pero las realizaciones típicas incluyen 1 o 2 rondas de tratamiento con varias semanas de diferencia (p. ej., de 2 a 4).
Se puede usar cualquier otro tratamiento o combinación de tratamientos además de las terapias de la presente invención. En una realización específica el método o el uso de la invención comprende además la administración de radioterapia simultánea o secuencial, anticuerpos monoclonales, quimioterapia u otros fármacos o intervenciones contra el cáncer (incluida la cirugía) a un sujeto.
Los términos "tratar" o "aumentar", así como las palabras que se derivan de los mismos, como se emplean en la presente memoria, no implican necesariamente un 100% o un tratamiento completo o un aumento. Más bien, hay grados variables de los cuales un experto en la técnica reconoce que tiene un beneficio potencial o efecto terapéutico. A este respecto, los métodos de la presente invención pueden proporcionar cualquier aumento en la eficacia de la terapia con linfocitos T o cualquier grado de tratamiento o prevención de una enfermedad.
Las figs. 28-32, 36 y 37 ilustran los métodos y mecanismos de la presente invención.
Será obvio para un experto en la materia que, a medida que avanza la tecnología, el concepto de la invención puede realizarse de varias maneras. La invención y sus realizaciones no se limitan a los ejemplos descritos anteriormente, sino que pueden variar dentro del alcance de las reivindicaciones.
Ejemplos
Materiales y métodos
Modelo animal B16-OVA: las células B16 que expresan ovoalbúmina (B16-OVA) se mantuvieron en RPMI, FBS al 10%, 5 mg/ml de G418, L-glutamina 20 mM, solución 1x Pen/Strep (GIBCO). A ratones hembra inmunocompetentes C57BL/6 de 4 a 7 semanas de edad se les implantó por vía subcutánea 2,5 x 105 células B16-OVA en 50 pl de RPMI, 0% de FBS, en el costado derecho, un tumor por ratón. Aproximadamente diez días después de la implantación del tumor (cuando los tumores se volvieron inyectables ~3 mm de diámetro mínimo), los ratones se dividieron en grupos y se trataron en algunos experimentos en seis días consecutivos con inyecciones intratumorales de 50 pl de PBS o 1 x 109 partículas víricas (PV) de adenovirus oncolíticos en 50 pl de PBS. En otros experimentos, se administraron tres inyecciones los días 0, 2 y 4. Como las células murinas no son permisivas para adenovirus humano, se usaron múltiples inyecciones de virus intratumoral para simular la inflamación inducida por la replicación del virus (Blairetal., 1989).
Transferencia adoptiva: El primer día de tratamiento intratumoral, los ratones también recibieron por transferencia adoptiva en la cavidad intraperitoneal 5 x 105 a 2 x 106 esplenocitos enriquecidos con CD8a y expandidos en reposo durante la noche de ratones C57BL/6-Tg (TcraTcrb) 1100Mjb/J (OT-1) de 4 a 8 semanas de edad, modificados genéticamente para tener solo receptores de linfocitos T CD8 específicas de ovalbúmina (OVA), en 100 pl de RPMI, 0% de FBS. El enriquecimiento con CD8a se realizó con CD8a de ratón (Ly-2) MicroBeads 5 días antes de la transferencia, según las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotech, EE. UU., n.° en cat. 130-049-401). Las células enriquecidas se expandieron en números durante cinco días en medio de linfocitos (RPMI, FBS al 10%, L-glutamina 20 mM, solución 1x Pen/Strep, HEPES 15 mM, 2-mercaptoetanol 50 pM, piruvato Na 1 mM) en presencia de IL-2 murina biotecnológica (160 ng/ml) y anticuerpo anti-CD3s de ratón soluble (0,3 pg/ml, Abcam, clon 145-2C11). Tratamiento de tejidos para citometría de flujo: Se sacrificaron ratones y los bazos, los ganglios linfáticos de drenaje y los tumores se recogieron en 1 a 10 ml de RPMI, FBS al 10%, y la sangre se extrajo mediante sangrado cardíaco terminal en la cavidad pleural y se transfirió con una jeringa desechable en tubos de microcentrifugadora que contenían EDTA y se trató para su análisis: los tejidos sólidos se disociaron toscamente con bisturí y se trituraron en una punta de pipeta estéril desechable de 10 ml en 5 a 10 ml de amortiguador de lisado ACK (NH4Cl 150 mM, KHCO<3>10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,2) y se incubaron a temperatura ambiente (TA) durante ~20 minutos, tras lo cual las células se sedimentaron a 1200 rpm 5 min 4°C, después de lo cual las células se volvieron a poner en suspensión en 1 a 10 ml de RPMI, FBS al 10%, dependiendo en la cantidad estimada de células, y se pasaron a través de un filtro estéril de 40 pm para crear una solución unicelular. En algunos experimentos, el tejido tumoral en su lugar se procesó directamente después del corte con el bisturí (antes de la adición de ACK) en un volumen total de 1 ml de mezcla de proteasa (RPMI enriquecido con colagenasa tipo A, H o P, Roche, a 1 mg/ml y benzonasa, 125 unidades/ml de conc. final, Sigma, E1014-25KU) durante 1-2 horas a 37°C, 5% de CO<2>, tras de lo cual se agregaron 10 ml de amortiguador de lisado ACK y las células se trataron como anteriormente. Se pipetearon 200 pl de sangre completa en 5 ml de amortiguador de lisado ACK y se trataron como anteriormente. Las células se incubaron durante la noche a 37°C, CO<2>al 5%, o se analizaron directamente mediante inmunotinción y citometría de flujo.
Preparación de tejidos para el análisis de citocinas: Se sacrificaron los ratones y las piezas tumorales de ~2-10 mm3 se congelaron en tubos de microcentrifugadora de 2 ml en hielo seco y se almacenaron a -80°C. Las piezas tumorales se pesaron y se añadieron 200 pl de PBS enfriado con hielo. Las piezas se homogeneizaron con un rotor Tissue Master 125, 1x mezcla inhibidora de proteasa (Sigma) y BSA al 0,1% de conc. final se agregó y los tubos se mantuvieron en hielo. El homogeneizado tumoral se centrifugó a 2.000 rpm 10 min a 4°C y el sobrenadante se analizó con perlas Flex Set CBA de citocinas (BD, EE. UU.) en BD FACSArray, según las instrucciones del fabricante.
Ejemplos de referencia y experimentos que apoyan la invención
Experimento 1 (citocinas y quimiocinas inducidas por inyección intratumoral de adenovirus) (ejemplo de referencia):
Para estudiar si la infección por adenovirus podría dar lugar a la expresión de citocinas y quimiocinas, se inyectaron ratones portadores de tumores subcutáneos B16-OVA por vía intratumoral con PBS o adenovirus oncolíticos híbrido 5/3 los días 0, 1,2, 3, 4 y 5. Se extrajeron los tumores de tres ratones por grupo de tratamiento y se prepararon para el análisis de citocinas el día 0 (antes de la inyección del virus = control inicial), y de otros tres ratones por punto de tiempo los días 6, 10, 14 y 18.
Los resultados mostraron, extraordinariamente, un aumento inducido por el virus en la secreción de IFN-y y el posterior incremento de quimiocinas inducibles por IFN-y RANTES, MIP-1a y MCP-1 el día 10 (figura 1).
Para mejorar la eficacia terapéutica de la terapia celular adoptiva, estos resultados son importantes.
En base a estos datos, el tratamiento con adenovirus armados con citocinas oncolíticas da como resultado una alteración favorable del microentorno tumoral, un aumento de la quimiotaxia de los inmunocitos transferidos de forma adoptiva y un mayor reconocimiento de las células tumorales por los linfocitos T CD8+ citotóxicos.
Experimento 2 (potenciación mediada por adenovirus de la terapia adoptiva con linfocitos T) (ejemplo de referencia):
Para estudiar el impacto del tratamiento con adenovirus en la terapia adoptiva con linfocitos T, los tumores de melanoma B16-OVA murinos se trataron con adenovirus oncolíticos híbridos 5/3 solos o en combinación con la transferencia adoptiva de linfocitos OT-I específicos de tumores y se compararon con ratones que reciben inyecciones de PBS intratumoral. Los resultados de tres experimentos independientes resumidos en la figura 2 dan a conocer, por un lado, que las inyecciones de virus por sí mismas (teniendo en cuenta que el adenovirus humano no se replica productivamente en células de ratón) dieron como resultado un menor control del crecimiento tumoral, que se prolongó hasta el día 14 después del tratamiento y disminuyendo después de éste (figura 2A). Por otro lado, cuando los ratones tratados se transfirieron de forma adoptiva con 5 x 105 o 2 x 106 linfocitos OT-I, se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos con PBS y Ad en dos experimentos independientes (figura 2B y 2C, respectivamente).
Por lo tanto, la presencia de virus en el tumor tuvo un fuerte efecto potenciador en la terapia celular adoptiva. Seis inyecciones de virus intratumorales en 1 x 109 PV cada una en manos de los inventores dieron en combinación con la transferencia adoptiva de linfocitos OT-I una eficacia antitumoral igual o superior en comparación con lo publicado por Songet al.(2011,Mol. Ther.)para una sola inyección intramuscular de 1 x 1010 PV de adenovirus defectuosos de replicación que expresan OVA (Ad-OVA) mezclados con una cantidad igual de adenovirus que expresan conjuntamente un ARN de horquilla corta específico para A20 y una forma secretora de flagelina que estimula el receptor 5 toll-like (Ad-shAF) en el modelo de melanoma B16.o Va (Song X. T.et al. Mol. Ther.enero 2011; 19 (1): 211-7, PMID: 20959814). A la luz de estos resultados, un nuevo aspecto de nuestra invención es apuntar a la inyección del virus en el tumor, donde los inventores pueden conseguir incluso con virus desarmados un control del tumor superior a los virus armados funcionales multiinmunitarios administrados por vía intramuscular.
Experimento 3 (alteraciones mediadas por adenovirus en la calidad y cantidad de poblaciones de inmunocitos in vivo) (ejemplo de referencia):
Para estudiar el tráfico y la proliferación de células transferidas de forma adoptiva del experimento 2, los linfocitos OT-I se tiñeronex vivocon éster succinimidílico de carboxifluoresceína 5 pM (CFSE). Este colorante fluorescente de tinción de células se diluye con cada división celular y, por lo tanto, permite rastrear la proliferación de linfocitos por citometría de flujo al analizar ~1/2 de la reducción fraccional de la intensidad de la señal de fluorescencia en cada división celular (hasta 7 divisiones, aquí rotuladas M0-7). El primer día después de la transferencia, los resultados mostraron una acumulación inducida por el virus de linfocitos OT-I transferidos (doble población positiva de CD8+ CFSE+) en los tumores, simultánea con la reducción de estas células en la sangre (figura 3A). En puntos temporales posteriores, también el recuento total de linfocitos T CD8+ apareció más alto en los tumores tratados con el virus en comparación con los tumores inyectados con PBS, y el día 14 el recuento de linfocitos T CD8+ aumentó en órganos linfoides de los ratones tratados con virus.
Las cantidades de divisiones de linfocitos OT-I en diferentes puntos de tiempo se representan en la figura 3B. Dado que el estado de proliferación de los linfocitos OT-I fue el mismo entre ambos grupos en el día 1, las diferencias en el recuento de linfocitos T CD8+ en diversos órganos eran debidas al tráfico de inmunocitos inducido por adenovirus. En momentos posteriores, sin embargo, la situación había cambiado y el aumento de linfocitos OT-I en el tumor tratado con adenovirus era debido al aumento de la proliferación de linfocitos. El 6° día la mayoría de los linfocitos OT-I en tumores tratados con PBS se detuvieron en la fase M5, mientras que las células transferidas al grupo de adenovirus continuaron proliferando (divisiones M6-M7). Estos datos sugieren que la infección por virus de la viroterapia oncolítica o no citolítica produce aumento de tráfico y proliferación de linfocitos transferidos de forma adoptiva por rotura de la supresión inmunitaria en los tumores, atrayendo inmunocitos que contribuyen a la activación de linfocitos CD8+ y/o por algunos otros importantes mecanismos que ayudan a superar la anergia de los linfocitos T.
Como apoyo a nuestros resultados en modelos animales, hemos observado una depresión transitoria de los recuentos de linfocitos sanguíneos durante el primer día después de la administración del virus oncolítico a pacientes con cáncer avanzado (figura 4), lo que sugiere la movilización de linfocitos T circulantes en respuesta a la Infección aguda por adenovirus en el tumor.
Además, en apoyo de los linfocitos T captadores de la infección por adenovirus en tumores, los inventores detectamos un mayor número de linfocitos T CD8+ en las secciones de tejido de biopsia tumoral después del tratamiento que antes (figura 5).
La figura 6 muestra los resultados de las inyecciones de adenovirus combinadas con la transferencia adoptiva de linfocitos T.
La figura 7 da a conocer un aumento drástico en el número de linfocitos T antitumorales "naturales" debido a la transferencia adoptiva y la inyección de virus.
La figura 8 muestra linfocitos CD8+ activados en el tumor y la expresión de TIM-3 en el tumor el 14° día.
La figura 9 muestra el aumento de linfocitos T antitumorales y la reducción de los resultados de inmunosupresión en la inmunidad general contra los antígenos tumorales.
La figura 10 muestra la distribución de linfocitos T OTI después de la inyección del virus.
La figura 11 da a conocer que la elevación de la inmunosupresión puede inducir la propagación de las células. La figura 12 muestra la eficacia de citocinas biotecnológicas (sin virus) en combinación con células OT1.
Experimento 4 (Linfocitos T transferidos adoptivamente adenovirus Ad5 armado con citocinas murinas):
Modelo:
[C57BL/6 con B16-OVA (0,25 x 106 células por animal)
Grupos:
Sin inyección
Ad5-Luc
Ad5-CMV-mTNFa
Ad5-CMV-mIFNg
Ad5-CMV-mIL2
Ad5-CMV-mIFNb1
Sin inyección OT1
Ad5-Luc OT1
Ad5-CMV-mTNFa OT1
Ad5-CMV-mIFNg OT1
Ad5-CMV-mIL2 OT1
Ad5-CMV-mIFNb1 OT1
El vector Ad5 es un vector de adenovirus no replicativo humano que codifica un transgén de ratón. Los montajes se realizaron con tecnología AdEasy (Agilent Inc); el casete de transgén (dirigido por un activador de CMV) está en la región E1 eliminada (véase, p. ej., Diaconu Iet al. Cáncer Res.1 mayo 2012; 72(9): 2327-38).
Tamaño del grupo:
n = 7, 12x7 = 84 (+ 20% más = 100)
Programa de tratamiento:
Células OT1: 2 x 106 por animal ip el 1er día
Inyecciones de virus: 1 x 109 partículas de virus (OD260) en el 1er día y semanalmente después Criterio de valoración:
Volumen del tumor (medido cada 2 días durante la primera semana y luego cada 3 días)
Recolección de tumores y bazos cuando los ratones mueren o son sacrificados; para FACS y/o ELISPOT (centrarse en los ensayos más adecuados según los datos de Siri).
Los mejores transgenes en combinación con la terapia con linfocitos T fueron TNFa e IL2 (figura 13). Consolidando los datos, las mismas citocinas estaban implicadas en el experimento sin virus.
La figura 14 muestra los resultados de diferentes virus (sin terapia con linfocitos T) en el tamaño del tumor (figura 14). La figura 15 muestra los excelentes resultados de la terapia con linfocitos T en combinación con el vector Ad5-CMV-mTNFa.
La figura 16 muestra los excelentes resultados de la terapia con linfocitos T en combinación con el vector Ad5-CMV-mIL2.
Nuevos montajes de virus
Los nuevos montajes de virus siguientes se presentan como ejemplos de nuestra tecnología propuesta:
Virus oncolíticos que expresan C5a y TNF-a
Los inventores generaron nuevos adenovirus Ad5/3 oncolíticos que llevan la porción activa del componente del complemento C5a o TNF-a humano como transgenes en lugar de las regiones del gen 6,7k/gp19 (figura 17).
Experimento 5 (expresión del transgén del vector de adenovirus que codifica C5a) (ejemplo de referencia):
A fin de confirmar, como demostración conceptual, que los adenovirus oncolíticos son capaces de expresar las citocinas elegidas propuestas para aumentar la terapia celular adoptiva, los inventores infectaron células A549 humanas en cultivo a 10 PV/célula de adenovirus que codifica C5a (figura 24), y evaluaron las concentraciones de C5a en el sobrenadante de cultivo celular en diferentes puntos de tiempo posteriores a la infección por ELISA. De hecho, los resultados validan el supuesto y apoyan la generación de montajes de adenovirus patentados que albergan citocinas seleccionadas.
Experimento 6 (efecto sobre la migración de monocitos por nuevos vectores de adenovirus) (ejemplo de referencia):
Los inventores probaron la capacidad de C5a de captar monocitos utilizando un ensayo de quimiotaxiain vitro:se infectaron células A549 con adenovirus que expresan C5a o con el virus de referencia desarmado (10 PV/unidades de células infecciosas entre virus similares) o se trataron con PBS y se recogió el medio 48 h después de la infección y se usó para captar la estirpe celular monocítica THP1 humana en un ensayo de quimiotaxia Transwell según las instrucciones del fabricante (Millipore QCM, n.° en cat. ECM512). Los resultados ponen de manifiesto una atracción significativamente mayor de los monocitos por el sobrenadante de las células infectadas por el virus que expresan C5a que por el medio de las células no infectadas o las células infectadas con el virus de referencia desarmado (figura 25).
Experimento 7 (eficacia antitumoral del adenovirus armado con C5a) (ejemplo de referencia):
Para evaluar la potencia antitumoral de C5a en el contexto de la infección tumoral no citolítica, los inventores trataron tumores B16-OVA creados en ratones C57BL/6 los días 0, 2 y 4 con PBS, que expresan C5a o con virus de referencia desarmados. Los resultados dan a conocer un fuerte efecto antitumoral por el virus que expresa C5a (figura 26).
Experimento 8 (aumento de la expansión de linfocitos T antitumorales por el virus de C5a) (ejemplo de referencia):
Para evaluar si el aumento observado en la eficacia antitumoral del virus que expresa C5a (figura 24) estaba relacionado con linfocitos T, se analizaron los tumores por citometría de flujo para detectar linfocitos T CD8+ específicos de ovoalbúmina, detectados por tinción con pentámero conjugado con APC específico para TCR que reconoce MHC I cargado con el péptido de ovoalbúmina inmunodominante SIINFEKL (Prolmmune, EE. UU.). De hecho, los tumores en el grupo de virus de C5a contenían una fracción significativamente mayor de linfocitos T CD8 específicos para tumores que los tumores inyectados con virus de referencia o PBS (figura 27).
Experimento 9 (expresión del transgén de adenovirus que codifica TNF-a):
En forma similar al virus de C5a (figura 24 y experimento 5), los inventores probaron la capacidad del adenovirus oncolítico que expresa hTNF-a para mediar la secreción del transgén de elección. Los resultados confirman la expresión (figura 18).
Experimento 10 (efecto biológico del transgén expresado se conserva en el adenovirus oncolítico):
Para evaluar si el transgén expresado en adenovirus conserva sus efectos biológicos, el sobrenadante libre de virus (filtrado a 100 kD) de células A549 infectadas con el virus de referencia armado o con el virus de expresión de TNF-alfa (PV variables / células, 72 h pi) se aplicó a células WEHI-13VAR (ATCC CRL-2148), que son sensibles al TNF-alfa, y se evaluó la viabilidad de estas células 72 horas después de la exposición al sobrenadante. (Por ejemplo, el método de Espevik T.et al. J. Immunol. Methods.1986; 95 (1): 99-105 describe el método). Los resultados dan a conocer que el TNF-alfa expresado a partir de adenovirus oncolíticos conserva efectos biológicos potentes (figura 19).
Experimento 11 (los virus que expresan citocinas oncolíticas conservan la capacidad de destruir células in vitro):
Debido a que el TNF-alfa puede tener efectos antivíricos, era importante confirmar que el efecto oncolítico de los adenovirus que expresan TNF-a retienen su capacidad para infectar y destruir células cancerosas. Varias estirpes celulares de cáncer en cultivo se infectaron con virus que expresan TNF-alfa o con virus de referencia y se evaluó su viabilidad mediante el ensayo CelltiterGlo AQ MTS, según las instrucciones del fabricante (Promega, EE. UU.). Los resultados muestran que el virus es oncolíticoin vitro(figuras 19-20).
Experimento 12 (sinergia entre la radioterapia y el virus oncolítico que expresa TNF a):
Se trataron ratones lampiños portadores de xenoinjertos subcutáneos A549 por vía intratumoral con virus con o sin radiación de haz externo enfocado concomitante (XRT) (figura 21). RD indica virus con replicación defectuosa y el virus desarmado es un virus oncolítico sin TNFa.
Experimento 13 (aumento de la eficacia antitumoral del adenovirus que expresa TNF-alfa en anfitriones inmunocompetentes):
Para probar si el adenovirus oncolítico, que no se replica en células murinas, podría ser capaz de causar efectos antitumoralesin vivoen ratones inmunocompetentes, ratones con tumores B16.OVA creados se inyectaron por vía intratumoral con virus que expresan TNF-alfa o virus de referencia desarmado o PBS, de manera similar a como se muestra en la figura 26. Los resultados muestran un mayor control total del tumor con el virus que expresa TNF-alfa en comparación con las referencias (figura 22), lo que sugiere que el TNF-alfa humano es parcialmente activo en ratones y apoya la noción de virus que se arman para conseguir mayores efectos antitumorales.
Experimento 14 (aumento de la expansión de linfocitos T antitumorales por TNFa-virus):
Al igual que en el experimento 11, los inventores quisimos probar si el efecto antitumoral observado del virus que expresa TNF-alfa estaba asociado con la inducción de respuestas de linfocitos T citolíticos específicos para el tumor. Se extrajeron los tumores y se prepararon para el análisis de citometría de flujo, como en el experimento 11. Los resultados (figura 23) confirman de hecho que la expresión de TNF-alfa facilita la expansión de los linfocitos T específicos para el tumor en la zona del tumor, argumentando fuertemente a favor de la tecnología propuesta. Las figuras 28-32, 36 y 37 ilustran los métodos y mecanismos de la presente descripción.
Experimento 15 (experimento de combinación con dos vectores adenovíricos diferentes y OT1 (AdmTNFa/Ad-mIL2+ OT1)):
Modelo:
C57BL/6 con B16-OVA (0,25 x 106 células por animal)
Grupos:
Ad5-CMV-mTNFa (1 x 109 PV)
Ad5-CMV-mIL2 (1 x 109 PV)
Ad5-CMV-mTNFa+ Ad5-CMV-mIL2 (0,5+ 0,5 x 109 PV)
Ad5-CMV- mTNFa+ OT1
Ad5-CMV-mIL2+ OT1
Ad5-CMV-mTNFa+ Ad5-CMV-mIL2+ OT1
Ad5Luc1+ OT1
Sin inyección (simulados)
El vector Ad5 es un vector de adenovirus humano no replicativo que codifica un transgén de ratón. Los montajes se realizaron con tecnología AdEasy (Agilent Inc); el casete de transgén (dirigido por un activador de CMV) está en la región E1 eliminada (véase, por ejemplo, Diaconu Iet al. Cáncer Res.1 mayo 2012; 72(9):2327-38).
Tamaño del grupo:
n = 9
100 ordenados
Programa de tratamiento:
Células OT1: 1,5 x 106 por animal ip el 1er día (la misma cantidad que en el experimento anterior, no 2x106) Inyecciones de virus: para agentes individuales: 1 x 109 partículas de virus (OD260) el 1er día y semanalmente a partir de entonces; para combinación: 0,5 x 109 PV+ 0,5 x 109 PV el 1er día y semanalmente a partir de entonces Criterio de valoración: Volumen del tumor (medido cada 2 días durante la primera semana y luego cada 3 días)Otros experimentos que respaldan la invención:
Varios experimentos con animales apoyan la invención. En primer lugar, seleccionamos candidatos óptimos de citocinas para combinarlos con la transferencia adoptiva de linfocitos T utilizando formas murinas biotecnológicas de citocinas (figura 38). Se selecciona(n) una(s) citocina(s) del siguiente grupo: interferón a, interferón p, interferón<y>, complemento C5a, GMCSF, IL-2, TNFa, CD40L, IL12, IL-23, IL15, IL17, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14-1, CCL14-2, CCL14-3, CCL15-1, CCL15-2, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-2, CCL24, CCL25-1, CCL25-2, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL4,CCL4L1, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCR10, CCR2, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCRL1, CCRL2, CX3CL1, CX3CR, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL9, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7 y XCL2. En las figuras 33 y 34 se muestra un esquema de la distribución general del genoma del virus que comprende el transgén o dos transgenes de citocinas. La figura 35 muestra secuencias de nucleótidos y aminoácidos de 2A. Las secuencias de nucleótidos de los vectores víricos que comprenden los transgenes C5a, hCD40L, hIFNa2, hIFNb1, hIFNg1, hIL2 o TNFa se muestran en las SEQ ID n.os 1-7, respectivamente (Ad5/3-E2F-D24-transgén). Además, las secuencias de nucleótidos de los vectores víricos que comprenden dos transgenes, siendo uno IL-2 y el otro C5a, CD40L, IF-Na2, IFNb, IFNg, GMCSF o TNFa, se muestran en las SEQ ID nos 8-21 (SEQ ID ID n.°: 8 C5a-2A-IL2, SEQ ID n.°: 9 IFNa-2A-IL2, SEQ ID n.2: 10 TNFa-2A-IL2, SEQ ID n.2: 11 CD40L-2A-IL2, SEQ ID n.2: 12 IFNb-2A-IL2, SEQ ID n.2: 13 GMCSF-2A-IL2, SEQ ID n.2: 14 IFNg-2A-IL2, SEQ ID n.2: 15 C5a-IRES-IL2, SEQ ID n.2: 16 IFNa-IRES-IL2, SEQ ID n.2: 17 TNFa-IRES-IL2, SEQ ID n.2: 18 CD40L-IRES-IL2, SEQ ID n.2: 19 IFNb-IRES-IL2, SEQ ID n.2: 20 GMCSF-IRES-IL2, SEQ ID n.2: 21 IFNg-IRES-IL2) (Ad5/3-E2F-D24-transgén-IRES/2A-transgén).
Se eligieron varios de los mejores candidatos para un experimento de combinación de citocinas/virus, donde el régimen se mantiene aproximadamente igual y todos los ratones reciben inyección intraperitoneal de linfocitos OT-I enriquecidos con CD8a+ y tratamientos intratumorales de citocinas seleccionadas mezcladas con adenovirus. Además, se realizó un experimento de tráfico por separado utilizando los adenovirus deficientes en la replicación de los inventores que codifican citocinas de ratón o citocinas humanas con actividad probada en ratones (figura 39). RD indica virus con replicación deficiente. Sobre la base de estos experimentos, se puede elegir un candidato o candidatos finales de citocinas y analizarlos aún más, incluso en la clínica.
Los resultados de los experimentos indican que a) la inyección del virus en los tumores da como resultado un aumento del tráfico de linfocitos T al tumor, b) la inyección del virus da como resultado una mayor expresión de MHC1 en los tumores, c) la señalización de peligro se activa y produce menos tolerancia e inmunosupresión, d) los linfocitos T se propagan en el tumor después de las inyecciones de virus. Significativamente, la adición de una citocina como un transgén mejoró cada uno de estos efectos. A destacar que los transgenes dobles aumentaron el efecto aún más. Por lo tanto, la inyección intratumoral de adenovirus oncolíticos armados con citocinas potenció el efecto de la transferencia celular adoptiva de manera sinérgica, sobre lo que podría conseguirse con los vectores de virus o la transferencia celular adoptiva solo.
Para estudiar el tráfico de linfocitos T y la biodistribución después de la transferencia adoptiva, se realizó un experimento de diagnóstico por la imagen SPECT/CT (figura 40). Los linfocitos OT-I enriquecidos con CD8a+ se marcaron con radiactividad con 111In y se transfirieron de forma adoptiva a ratones receptores.
Dado que la vida media de la oxina de indio es relativamente corta (2,83 días), el período de vigilancia máximo para el diagnóstico por la imagen se limitó a 7 días. Debido a esta restricción, las células se marcaron en dos lotes y se transfirieron a ratones en dos puntos de tiempo diferentes. Los datos de diagnóstico por la imagen del primer lote cubren los episodios de tráfico de los días 0 a 7, mientras que el segundo lote nos permite observar episodios en tumores durante los días 8 a 14 posteriores al virus.
Referencias
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un vector adenovírico oncolítico que codifica al menos IL-2 y TNF-alfa junto con una composición terapéutica celular adoptiva independiente para su uso en el tratamiento del cáncer.
2. El vector adenovírico oncolítico para su uso según la reivindicación 1, en donde la composición terapéutica celular adoptiva comprende un tipo de célula seleccionado de un grupo que consiste en un linfocito infiltrante de tumores (TIL), linfocitos modificados del receptor de linfocitos T y linfocitos modificados del receptor de antígeno híbrido.
3. El vector adenovírico oncolítico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde la composición terapéutica celular adoptiva comprende un tipo de célula seleccionado de un grupo que consiste en linfocitos T, células CD8+, células CD4+, linfocitos citolíticos, linfocitos T 5-y, linfocitos T reguladores y células mononucleares de la sangre periférica.
4. El vector adenovírico oncolítico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la composición terapéutica celular adoptiva comprende linfocitos T.
5. El vector adenovírico oncolítico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el cáncer se selecciona de un grupo que consiste en cáncer nasofaríngeo, cáncer sinovial, cáncer hepatocelular, cáncer renal, cáncer de tejidos conectivos, melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de intestino, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer colorrectal, cáncer de cerebro, cáncer de garganta, cáncer bucal, cáncer de hígado, cáncer de huesos, cáncer pancreático, coriocarcinoma, gastrinoma, feocromocitoma, prolactinoma, leucemia de linfocitos T/linfoma, neuroma, enfermedad de von Hippel-Lindau, síndrome de Zollinger-Ellison, cáncer suprarrenal, cáncer anal, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer de uréter, cáncer cerebral, oligodendroglioma, neuroblastoma, meningioma, tumor de la médula espinal, cáncer de huesos, osteocondroma, condrosarcoma, Sarcoma de Ewing, cáncer de sitio primario desconocido, carcinoide, carcinoide del aparato digestivo, fibrosarcoma, cáncer de mama, enfermedad de Paget, cáncer de cuello uterino, cáncer colorrectal, cáncer de recto, cáncer de esófago, cáncer de vesícula biliar, cáncer de cabeza, cáncer ocular, cáncer de cuello, cáncer de riñón, tumor de Wilms, cáncer de hígado, sarcoma de Kaposi, cáncer de próstata, cáncer pulmonar, cáncer testicular, enfermedad de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano, cáncer bucal, cáncer de piel, mesotelioma, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer pancreático endocrino, glucagonoma, cáncer pancreático, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de pituitaria, sarcoma de tejidos blandos, retinoblastoma, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer de timo, cáncer de tiroides, cáncer trofoblástico, mola hidatiforme, cáncer de útero, cáncer de endometrio, cáncer de vagina, cáncer de vulva, neuroma acústico, micosis fungoide, insulinoma, síndrome carcinoide, somatostatinoma, cáncer de encías, cáncer de corazón, cáncer de labios, cáncer de meninges, cáncer de boca, cáncer de nervios, cáncer de paladar, cáncer de glándula parótida, cáncer de peritoneo, cáncer de faringe, cáncer pleural, cáncer de las glándulas salivales, cáncer de lengua y el cáncer de amígdalas.
6. El vector adenovírico oncolítico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la administración de la composición terapéutica celular adoptiva y los vectores víricos oncolíticos que codifican al menos IL-2 y TNF-alfa a un sujeto se lleva a cabo simultánea o consecutivamente, en cualquier orden.
7. El vector adenovírico oncolítico para su uso según la reivindicación 6, en el que hay un período de tiempo de un minuto a cuatro semanas, entre la administración consecutiva de la composición terapéutica celular adoptiva y los vectores víricos oncolíticos que codifican al menos IL-2 y TNF-alfa y/o existen varias administraciones de la composición terapéutica celular adoptiva y los vectores víricos oncolíticos
8. El vector adenovírico oncolítico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la administración de la composición terapéutica celular adoptiva y/o los vectores víricos oncolíticos que codifican al menos IL-2 y TNF-alfa se lleva a cabo mediante una inyección intratumoral, intrarterial, intravenosa, intrapleural, intravesicular, intracavitaria o peritoneal, o una administración oral.
9. El vector adenovírico oncolítico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el vector adenovírico se selecciona entre Ad5, Ad3 y Ad5/3.
10. El vector adenovírico oncolítico para su uso según la reivindicación 9, en el que el vector adenovírico es Ad5/3 que comprende un eje central de ácido nucleico Ad5 y un pomo de fibra Ad3 o un pomo híbrido de fibra Ad5/3.
11. El vector adenovírico oncolítico para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el vector vírico oncolítico codifica más de dos citocinas.
12. El vector adenovírico oncolítico para su uso según la reivindicación 11, en el que el vector vírico oncolítico codifica IL-2 y TNF-alfa y una citocina o citocinas seleccionadas de un grupo de citocinas que consiste en interferón a, interferón p, interferón y, complemento C5a, GMCSF, CD40L, IL12, IL-23, IL15, IL17, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14-1, CCL14-2, CCL14-3, CCL15-1, CCL15-2, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-2, CCL24, CCL25-1, CCL25-2, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL4, CCL4L1, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCR10, CCR2, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCRL1, CCRL2, CX3CL1, CX3CR, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7 y XCL2.
13. El vector adenovírico oncolítico para su uso según la reivindicación 11 o 12, en el que el vector adenovírico comprende un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) u opcionalmente un sitio de derivación 2A del ribosoma entre los transgenes.
14. Un equipo farmacéutico que comprende una composición terapéutica celular adoptiva y vectores adenovíricos oncolíticos que codifican al menos IL-2 y TNF-alfa, en el que la composición terapéutica celular adoptiva se formula en una primera formulación y los vectores adenovíricos oncolíticos que codifican al menos IL-2 y TNF-alfa se formulan en una segunda formulación.
15. Un vector adenovírico oncolítico que codifica al menos IL-2 y TNF-alfa.
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