ES3009668T3 - Methods and compositions for treatment of angiogenic disorders using anti-vegf agents - Google Patents

Abstract

Se proporcionan métodos y composiciones para el tratamiento de trastornos angiogénicos mediante agentes anti-VEGF. Estos agentes comprenden dominios de unión al VEGF y tienen la capacidad de unirse al vítreo. Se proporcionan ejemplos de proteínas de fusión Fc-IgG con dominios de unión al VEGF, con fuertes propiedades de unión a la heparina, una fuerte inhibición de la actividad mitogénica del VEGF y una farmacocinética mejorada, concretamente, una vida media más larga de los agentes anti-VEGF y, en consecuencia, una dosificación menos frecuente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para el tratamiento de trastornos angiogénicos mediante el uso de agentes anti-VEGF

Antecedentes

El desarrollo de un suministro neovascular o angiogénesis cumple funciones homeostáticas cruciales, ya que los vasos sanguíneos transportan nutrientes a tejidos y órganos y eliminan productos catabólicos 1. Sin embargo, el crecimiento incontrolado de los vasos sanguíneos puede favorecer o facilitar numerosos procesos de enfermedades, incluyendo tumores y trastornos vasculares intraoculares 1. Si bien inicialmente se identificaron y caracterizaron varios factores angiogénicos (p. ej, EGF, TGF-a, TGF-p, aFGF, bFGF, angiogenina) 2, las obras realizadas en las tres últimas décadas han establecido el papel crítico del VEGF-A (VEGF en lo sucesivo) en la angiogénesis normal y patológica 34. El VEGF es miembro de una familia de genes que también incluye al PIGF, VEGF-B, VEGF-C y VEGF-D. Se ha informado que tres receptores tirosina cinasa (RTK por sus siglas en inglés) relacionados se unen a los ligandos del VEGF: v Eg FR-1 , VeGfR-2 y VEGFR-35. El PIGF y el VEGF-B interactúan selectivamente con el VEGFR-1, El VEGF se une tanto al VEGFR-1 como al VEGFR-2. Un tercer miembro de esta familia de RTK, VEGFR-3 6, se une a VEGF-C y VEGF-D, que están implicados en la linfangiogénesis. Cada miembro de esta clase de RTK tiene siete dominios similares a la inmunoglobulina (Ig) en la porción extracelular 7. Hay acuerdo en que el VEGFR-2 es el principal receptor de señalización del VEGF 5. Sin embargo, VEGFR-1 se une a VEGF con una afinidad de unión sustancialmente mayor que VEGFR-27.

Los inhibidores del VEGF se han convertido en un estándar terapéutico en múltiples tumores y han revolucionado el tratamiento de los trastornos neovasculares intraoculares, tal como la forma neovascular de la degeneración macular asociada con la edad (DMAE), retinopatía diabética proliferativa y oclusión venosa retiniana, que son las principales causas de pérdida grave de visión y ceguera legal84. En la actualidad, tres medicamentos anti-VEGF se utilizan ampliamente en EE.UU. para indicaciones oftalmológicas: bevacizumab, ranibizumab y aflibercept 4. El bevacizumab es un anticuerpo de IgG de longitud completa dirigido contra el VEGF 9. Aunque el bevacizumab no se desarrolló para indicaciones oftalmológicas, se utiliza mucho fuera de lo indicado debido a su bajo coste. El ranibizumab es un Fab anti-VEGF madurado por afinidad 10. El aflibercept es una proteína de fusión de IgG-Fc 11 12, con elementos de VEGFR-1 y VEGFR-2, que se une al VEGF, PIGF y VEGF-B 13. El conbercept es un receptor soluble del VEGF estructuralmente relacionado con el aflibercept, ampliamente utilizado como tratamiento de la neovascularización intraocular en China14. Millones de pacientes en todo el mundo han sido tratados con estos fármacos. De manera destacada, tras cinco años de tratamiento con ranibizumab o bevacizumab, alrededor de la mitad de los pacientes con DMAE neovascular tenían buena visión, es decir, agudeza visual 20/40 o superior, un resultado que habría estado fuera de su alcance antes de que los agentes anti-VEGF estuvieran disponibles 15.

Sin embargo, en entornos clínicos reales, muchos pacientes reciben menos inyecciones anti-VEGF que en los ensayos clínicos y se ha planteado la hipótesis de que esto puede correlacionarse con malos resultados visuales 16. En efecto, la necesidad de realizar inyecciones intravítreas relativamente frecuentes ha dificultado el cumplimiento por parte del paciente y, en última instancia, los beneficios de la terapia, especialmente en algunos países 16. Por lo tanto, es necesario desarrollar agentes de mayor duración cuando se inyectan en el ojo, reduciendo así la frecuencia de las inyecciones y se han intentado varios enfoques con este fin 1718. El aflibercept (EYLEA) se aprobó sobre la base de ensayos clínicos que demostraron que la administración cada 8 semanas de la dosis de 2 mg podía igualar la eficacia del ranibizumab mensual (0,5 mg). Sin embargo, a pesar de la predicción de que el cambio a aflibercept reduciría el número de inyecciones intravítreas, los estudios recientes sugieren que no es el caso 19. Por lo tanto, todavía existe una necesidad médica no cubierta de agentes anti-VEGF intravítreos con una semivida mejorada.

En 1996 Davis-Smyth et al 20 (véase también la patente de EE. UU. n.° 5.952.199) informaron de que el dominio (D) 2 de VEGFR-1 es el elemento de unión crítico para VEGF y PIGF. La deleción de D2 suprimió completamente la unión. La sustitución de D2 de VEGFR-3 por VEGFR-1 D2 confirió a VEGFR-3 la especificidad de ligando de VEGFR-120. Una obra posterior documentó la interacción entre D2 y VEGF (o PlGF) mediante cristalografía de rayos X 21-23.

Los estudios iniciales condujeron al diseño de una construcción con plenas características de unión al VEGF, que comprende los tres primeros D similares a Ig del VEGFR-1, fusionados con un Fc-lgG (Flt-1 -3-IgG) 20. Flt-1 -3-lgG mostró una potente capacidad para neutralizar el VEGF,in vitroein vivo24-27. Sin embargo, la semivida sistémica de esta molécula se vio obstaculizada por la presencia de D3, que tiene una importante afinidad por la heparina debido a la presencia de residuos básicos, dando como resultado la unión a HSPG en varios tejidos. En 2002 Holash et al 13 (patente de EE. UU. n.° 7.070.959) describieron una construcción de fusión de IgG que comprende D2 de VEGFR-1 (el elemento de unión) y D3 de VEGFR2, que tiene una afinidad por la heparina mucho más débil que el D3 de VEGFR-1. Se informó que esta molécula, conocida hoy como aflibercept (comercializada como EYLEA), tiene una semivida más larga que Flt-(1 -3-lgG) tras su administración sistémica13, claramente una ventaja para la finalidad del tratamiento, por ejemplo, en indicaciones oncológicas.

En 2015, Leeet al.introdujeron sitios de glicosilación en D3 de VEGFR1 de una construcción VEGFR-1 D2-D3-Fc para neutralizar las cargas positivas y eliminar la unión del HSPG mediada por D3, aumentando de este modo la semivida sistémica 45. Las construcciones glicosiladas de Lee fueron investigadas más a fondo por Kim (documento US 2016/024483 A1), quien observó actividad anti-VEGF en un modelo de neovascularización coroidea en ratón.

Sumario

La presente invención proporciona un agente anti-VEGF que consiste en los aminoácidos 27 a 459 de la SEQ ID NO: 3 para su uso en el tratamiento de la degeneración macular asociada con la edad neovascular.

Aspectos adicionales de la invención se describen en las reivindicaciones adjuntas.

Métodos para inhibir la angiogénesis y para tratar afecciones asociadas al VEGF, tal como enfermedad ocular, incluyendo, pero sin limitación, degeneración macular asociada con la edad, retinopatía diabética proliferativa, oclusión de la vena retiniana, neovascularización coroidea secundaria a la miopía, retinopatía de prematuridad, edema macular diabético, vasculopatía coroidea polipoidea, comprenden la administración de un agente anti-VEGF que inhibe la actividad del VEGF y, al mismo tiempo, tiene fuertes características de unión a la heparina, proporcionando de este modo una farmacocinética superior, en concreto, que tiene una semivida más larga del agente terapéutico tras la administración intravítrea.

Entre las afecciones en las que resulta ventajosa la administración local directa de un agente anti-VEGF se incluyen, por ejemplo, afecciones proliferativas de células endoteliales o angiogénesis, por ejemplo, tumores sólidos, tales como, pero sin limitación, administración intracraneal en glioblastomas.

La presente invención incluye un agente anti-VEGF, en donde el agente anti-VEGF es una construcción Fc-IgG que fusiona dominios con características de unión a VEGF y dominios que se unen a proteoglicanos de heparina. El agente anti-VEGF es una construcción de Fc-IgG que tiene la capacidad de unirse a la heparina y contiene dominios con características de unión a VEGF. El agente anti-VEGF es una proteína de fusión con perfeccionamiento de la eficacia de unión a VEGF y heparina. El agente anti-VEGF es una proteína de fusión con niveles muy bajos de endotoxinas.

El agente anti-VEGF es una proteína quimérica de IgG que comprende elementos de los receptores VEGF. La proteína quimérica de IgG comprende fragmentos de los siete dominios similares a la inmunoglobulina (Ig) en la porción extracelular de los receptores tirosina cinasa de VEGF. La proteína quimérica de IgG comprende fragmentos de dominio extracelular de VEGFR-1 fusionados con Fc-IgG.

El agente anti-VEGF comprende una porción de unión a VEGF unida operativamente a un Fc-IgG, en donde la porción de unión a VEGF comprende un dominio de unión a VEGF que es un dominio 2 similar a IgG de VEGFR-1, y en donde el agente anti-VEGF tiene una capacidad de inhibición de la mitogénesis estimulada por VEGF mayor que aflibercept. El agente anti-VEGF tiene una capacidad de unión vítrea mayor que aflibercept. El agente anti-VEGF tiene una capacidad de inhibición de la proliferación de células endoteliales estimulada por VEGF unido al vítreo mayor que aflibercept. El agente tiene una semividain vivomayor que aflibercept.

Las composiciones farmacéuticas pueden comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente anti-VEGF y un excipiente farmacéuticamente aceptable. La presente invención proporciona métodos para tratar la degeneración macular asociada con la edad neovascular en un sujeto que lo necesita que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente anti-VEGF como se ha definido. El agente anti-VEGF puede inyectarse directamente en el tejido u órgano afectado, tal como un ojo.

En ocasiones, en un método de tratamiento de una enfermedad ocular, se administra localmente en el ojo un agente anti-VEGF a una dosis correspondiente a una relación molar de 2:1 en comparación con VEGF. En ocasiones, en un método de tratamiento de una enfermedad ocular, se administra un agente anti-VEGF mediante inyección intravítrea. En ocasiones, en un método de tratamiento de una enfermedad ocular, se administra un agente anti-VEGF cada 4-6 semanas, y a veces el tratamiento se prolonga durante al menos un año.

Un método para tratar una enfermedad ocular comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente anti-VEGF localmente en el ojo en donde el tratamiento es eficaz para tratar formas ocultas, mínimamente clásicas y predominantemente clásicas de degeneración macular húmeda, en donde el agente es una proteína de fusión.

En ocasiones, puede tratarse una amplia variedad de trastornos relacionados con el VEGF, incluyendo la degeneración macular asociada con la edad neovascular, neovascularización coroidea secundaria a la miopía, retinopatía diabética proliferativa, edema macular diabético, obstrucción vascular retiniana tal como oclusión venosa retiniana, tumores oculares, síndrome de Von Hippel-Lindau, retinopatía de prematuridad, vasculopatía coroidea polipoidea, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, cáncer cervicouterino, cáncer de endometrio, cáncer de ovario, cáncer de riñón, schwannomas, gliomas, ependimomas y trastornos neoplásicos o no neoplásicos que se benefician de la terapia anti-VEGF.

Una formulación farmacéutica puede comprender un agente anti-VEGF en una formulación de portador farmacéuticamente aceptable para administración local tal como en el ojo.

En ocasiones, las construcciones divulgadas en el presente documento neutralizan potentemente la actividad del VEGF mientras que, al mismo tiempo, tienen fuertes características de unión a la heparina.

Las referencias a métodos de tratamiento en los párrafos posteriores de esta descripción deben interpretarse como referencias a agentes anti-VEGF para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

Breve descripción de los dibujos

Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente divulgación haciendo referencia a la siguiente descripción detallada que expone realizaciones ilustrativas, en la que se utilizan los principios de la divulgación y los dibujos adjuntos de los cuales:

La FIGURA 1 representa una representación esquemática de proteínas de fusión construidas a modo de ejemplo con varios dominios extracelulares similares a Ig de VEGFR-1 (V) fusionados con Fc-IgG (Fc). Se muestran las siguientes construcciones: V<1-2-3>-Fc; V<2-3>-Fc; V<1-2-3-3>-Fc; V<2-3-3>-Fc; V<1-2-3-4>-Fc; V<2-3-4>-Fc; V<1-2-4>-Fc y V<2-4>-Fc.

La FIGURA 2 representa una estrategia de construcción y expresión de plásmidos.

La FIGURA 3 representa la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ácido nucleico de la construcción V<1-2-3>. SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente.

La FIGURA 4 representa la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ácido nucleico de la construcción V<2-3>. SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, respectivamente.

La FIGURA 5 representa la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ácido nucleico de la construcción V<1-2- 3-3>. SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, respectivamente.

La FIGURA 6 representa la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ácido nucleico de la construcción V<2-3- 3>. SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, respectivamente.

La FIGURA 7 representa la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ácido nucleico de la construcción V<1-2- 3-3-4>. SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, respectivamente.

La FIGURA 8 representa la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ácido nucleico de la construcción V<2-3- 4>. SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, respectivamente.

La FIGURA 9 representa la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ácido nucleico de la construcción V<2-4>. SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14, respectivamente.

La FIGURA 10 representa la expresión de las construcciones VEGFR-1 en células 293.

La FIGURA 11 representa geles de PAGE teñidos con plata en condiciones reductoras y no reductoras de 200 ng de cada proteína de fusión VEGFR-1 Fc en comparación con EYLEA.

La FIGURA 12 representa los efectos inhibidores de las proteínas quiméricas del receptor de VEGF sobre la proliferación de células endoteliales estimulada por VEGF.

La FIGURA 13 representa la competencia del VEGF por la unión del VEGF biotinilado (a 100 ng/ml) al receptor soluble de VEGFR1.

La FIGURA 14 representa la unión del receptor soluble de VEGFR-1 al VEGF biotinilado y al vítreo bovino. La FIGURA 15 representa que el V<1-2-3-3>ligado al vítreo bovino es biológicamente activo.

La FIGURA 16 representa los efectos de la IgG de control, EYLEA, o proteínas de fusión VEGFR-1 Fc en el área de neovascularización coroidea (NVC). Cada proteína se inyectó por vía intravítrea en el ratón a la dosis de 2,5 mg un día antes del tratamiento con láser. EYLEA se probó también con 25 mg. Los asteriscos denotan diferencias significativas (prueba t de Student) en comparación con los grupos de control de IgG correspondientes (*p < 0,01, *p < 0,05).

Las FIGURAS 17A y 17B representan los efectos de EYLEA, V<1,2,3,3>o IgG de control en el área de la NVC tras una única administración intravítrea (2,5 mg), 1 día, 7 días o 14 días antes del tratamiento con láser. Los asteriscos indican diferencias significativas (p<0,05), prueba t de Student) en comparación con el grupo de control de IgG. La figura 17B representa imágenes representativas de inmunofluorescencia para CD31 de los grupos de la FIGURA 17A.

Descripción detallada

Se entiende que los aspectos y realizaciones de la invención descritos en el presente documento incluyen "que consiste/n en" y/o "que consiste/n esencialmente en" aspectos y realizaciones. Otros objetos, ventajas y rasgos distintivos de la presente invención, se pondrán de manifiesto a partir de la siguiente memoria descriptiva junto con las figuras que se adjuntan.

Cuando se introducen elementos de la presente invención o la o las realizaciones preferidas de la misma, los artículos "un/a", "uno", "el/la", y "dicho/dicha", pretenden referirse a que hay uno o más de los elementos. Las expresiones "que comprende(n)", "que incluye(n)", y "que tiene(n)" pretenden ser incluyentes y hacen referencia a que puede haber elementos adicionales además de los elementos enumerados.

Como se utilizan en el presente documento, los términos y expresiones "comprende", "que comprende(n)", "incluye", "que incluye(n)", "tiene", "que tiene(n)", "contiene", "que contiene(n)", "caracterizado por" o cualquier otra variación de los mismos, pretenden abarcar una inclusión no excluyente, sujeta a cualquier limitación indicada explícitamente de otro modo, de los componentes citados. Por ejemplo, una proteína de fusión, una composición farmacéutica, y/o un método que "comprende" una lista de elementos (p. ej, componentes, rasgos o etapas) no se limita necesariamente sólo a esos elementos (o componentes o etapas), sino que puede incluir otros elementos (o componentes o etapas) no enumerados expresamente o inherentes a la proteína de fusión, composición farmacéutica y/o métodos.

Como se utilizan en el presente documento, las expresiones de transición "consiste en" y "que consiste en" excluyen cualquier elemento, etapa o componente no especificado. Por ejemplo, la expresión "consiste en" o "que consiste en" usada en una reivindicación limitaría la reivindicación a los componentes, materiales o etapas enumerados específicamente en la reivindicación, excepto las impurezas habitualmente asociadas a los mismos (es decir, las impurezas dentro de un componente dado). Cuando la expresión "consiste en" o "que consiste en" aparece en una cláusula del cuerpo de una reivindicación, en lugar de seguir inmediatamente al preámbulo, la expresión "consiste en" o "que consiste en" limita únicamente los elementos (o componentes o etapas) expuestos en esa cláusula; no se excluyen otros elementos (o componentes) de la reivindicación en su conjunto.

Como se utilizan en el presente documento, las expresiones de transición "consiste prácticamente en" y "consiste esencialmente en" se utilizan para definir una proteína de fusión, composición farmacéutica, y/o método que incluye materiales, etapas, rasgos, componentes o elementos, además de los desvelados literalmente, a condición de que estos materiales adicionales, etapas, rasgos, componentes o elementos no afectan materialmente a la característica o características básicas y novedosas de la invención reivindicada. La expresión "que consiste esencialmente en" ocupa un término medio entre "que comprende" y "que consiste en".

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "composición farmacéutica" contempla composiciones que comprenden uno o más agentes terapéuticos o fármacos como se describe a continuación, y uno o más excipientes, portadores o vehículos farmacéuticamente aceptables.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "excipientes, portadores o vehículos farmacéuticamente aceptables" comprende cualquiera de los materiales aceptables y/o uno o más aditivos conocidos en la técnica. Como se utilizan en el presente documento, los términos "excipientes", "portadores", o "vehículo" se refieren a materiales adecuados para la administración del fármaco a través de diversas vías de administración convencionales conocidas en la técnica. Los excipientes, portadores y vehículos útiles en el presente documento incluyen cualquiera de los materiales conocidos en la técnica, que no son tóxicos y no interactúan con otros componentes de la composición de forma perjudicial, y generalmente se denominan excipiente, diluyente, conservante, solubilizante, emulsionante, adyuvante y/o vehículo con el que se administra un agente activo o fármaco. Dichos portadores pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos aquellos de origen en el petróleo, animal, vegetales o sintéticos, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos. Los agentes antibacterianos, tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes, tales como ácido etilendiaminatetraacético; y agentes para el ajuste de la tonicidad, tales como el cloruro sódico o la dextrosa, pueden ser también portadores. Los métodos para producir composiciones en combinación con portadores son conocidos por los expertos en la materia. En algunas realizaciones, la expresión "portador farmacéuticamente aceptable" pretende incluir todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la materia.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a aquellas cantidades que, cuando se administran a un sujeto en particular, en vista de la naturaleza y gravedad de su estado, tendrán un efecto terapéutico deseado, p. ej., una cantidad que curará, prevendrá, inhibirá, o al menos parcialmente detendrá o prevendrá una afección objetivo. En algunas realizaciones, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de un agente terapéutico o fármaco que cuando se administra solo o en combinación con otro agente terapéutico o fármaco adicional a una célula, tejido, órgano o sujeto es eficaz para prevenir o mejorar las enfermedades oculares y los cánceres, incluyendo, pero sin limitación, degeneración macular asociada con la edad, retinopatía diabética proliferativa, oclusión de la vena retiniana, neovascularización coroidea secundaria a la miopía; retinopatía de prematuridad, edema macular diabético, vasculopatía coroidea polipoidea, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de páncreas y cáncer de próstata. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere además a la cantidad del agente terapéutico o fármaco suficiente para dar como resultado la mejora de síntomas, p. ej., el tratamiento, curación, prevención o mejora de la afección médica relevante, o un aumento de la tasa de tratamiento, curación, prevención o mejora de dichas afecciones. Cuando se aplica a un principio activo individual administrado solo, una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a ese ingrediente solo. Cuando se aplica a una combinación, una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a cantidades combinadas de los principios activos que dan como resultado el efecto terapéutico, ya se administren en combinación, en serie o de manera simultánea.

Como se utilizan en el presente documento, los términos "tratar", "tratamiento", o "alivio" se refiere al tratamiento terapéutico en donde el objetivo es ralentizar (disminuir), cuando no curar, la afección o trastorno patológico objetivo o prevenir la reaparición de la afección. Un sujeto es "tratado" con éxito si, tras recibir una cantidad terapéutica de un agente o fármaco terapéutico, el sujeto muestra una reducción observable y/o mensurable o ausencia de uno o más signos y síntomas de la afección particular. La reducción de los signos o síntomas de una afección también puede ser percibida por el sujeto. También se considera que un sujeto ha sido tratado si experimenta un estado estable. En algunas realizaciones, el tratamiento con un agente terapéutico o fármaco es eficaz para que los sujetos estén libres de síntomas 3 meses después del tratamiento, preferentemente 6 meses, más preferentemente un año, y aún más preferentemente 2 o más años después del tratamiento. Estos parámetros para evaluar el éxito del tratamiento y la mejora de la enfermedad pueden medirse fácilmente mediante procedimientos rutinarios conocidos por un médico experto en la materia.

Como se utiliza en el presente documento, se entiende por tratamiento "preventivo" el aplazamiento del desarrollo de una afección o de un síntoma de una afección, suprimiendo los síntomas que puedan aparecer o reduciendo el riesgo de aparición o recaída de una afección o síntoma. Tratamiento "curativo" incluye reducir la gravedad de o suprimir el empeoramiento de un síntoma o afección existente.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "agente terapéutico", "agente anti-VEGF", "proteína de fusión", "proteína quimérica", o "proteína recombinante" comprende un primer polipéptido unido operativamente a un segundo polipéptido, en donde el "agente terapéutico", "agente anti-VEGF", "proteína de fusión", "proteína quimérica", o "proteína recombinante" inhibe la actividad del VEGF. Las proteínas quiméricas pueden comprender opcionalmente un tercer, cuarto o quinto u otro polipéptido unido operativamente a un primer o segundo polipéptido. Las proteínas quiméricas pueden comprender dos o más polipéptidos diferentes. Las proteínas quiméricas pueden comprender múltiples copias del mismo polipéptido. Las proteínas quiméricas también pueden comprender una o más mutaciones en uno o más de los polipéptidos. Los métodos para fabricar proteínas quiméricas se conocen bien en la técnica. En algunas realizaciones la expresión "agente terapéutico", "proteína de fusión", "proteína quimérica", o "proteína recombinante" se refiere a cualquier construcción expresada o sintetizada, incluyendo, pero sin limitación, péptidos o proteínas que unen operativamente uno o más de los dominios o fragmentos de dominio similares a Ig de VEGFR-1 y/o VEGFR-2 con Fc-IgG.

La expresión "dominios similares a Ig" se refiere a los dominios 1-7 similares a Ig de VEGFR-1 y VEGFR-2. El término "fragmentos de dominio similares a Ig" comprende una porción de un dominio de longitud completa, generalmente la heparina y/o la región de unión a VEGF o variable de la misma. Ejemplos de fragmentos de dominio incluyen secuencias de aminoácidos que comprenden un segmento de al menos un 75 %, más preferentemente al menos un 80 %, un 90 %, un 95 %, y lo más preferentemente un 99 % del dominio de longitud completa con un 100 % de identidad de secuencia y variaciones de la misma. Las variaciones en las secuencias de aminoácidos de las proteínas de fusión se contemplan como incluidas en la presente divulgación, siempre que las variaciones en la secuencia de aminoácidos mantengan al menos un 75 %, más preferentemente al menos un 80 %, un 90 %, un 95 %, y lo más preferentemente un 99 %. Se incluyen algunos porcentajes intermedios, tal como un 75 %, un 76 %, un 77 %, un 78 %, un 79 %, un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % y un 99 % de identidad de secuencia. En particular, se contemplan reemplazos conservadores de aminoácidos. Los reemplazos conservadores son aquellos que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos codificados genéticamente se dividen generalmente en familias: (1) aminoácidos ácidos son aspartato, glutamato; (2) aminoácidos básicos son lisina, arginina, histidina; (3) aminoácidos no polares son alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) aminoácidos polares no cargados son glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Los aminoácidos hidrófilos incluyen arginina, asparagina, aspartato, glutamina, glutamato, histidina, lisina, serina y treonina. Los aminoácidos hidrófobos incluyen alanina, cisteína, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptófano, tirosina y valina. Otras familias de aminoácidos incluyen (i) serina y treonina, que son la familia hidroxialifática; (ii) asparagina y glutamina, que son la familia que contiene amida; (ii) alanina, valina, leucina e isoleucina, que son la familia alifática; y (iv) fenilalanina, triptófano y tirosina, que son la familia aromática. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido relacionado estructuralmente no tenga un efecto principal sobre la unión o las propiedades de la molécula resultante, especialmente si el reemplazo no implica un aminoácido dentro de un sitio marco conservado. Se puede determinar sin inconvenientes si el cambio de aminoácido da como resultado una proteína de fusión funcional mediante la evaluación de la actividad específica del derivado de la proteína de fusión. Los fragmentos o análogos de las proteínas de fusión se pueden preparar sin inconvenientes por los expertos en la materia. Los extremos amino y carboxilo terminales preferidos de los fragmentos o análogos se producen cerca de los límites de los dominios funcionales.

Como se utiliza en el presente documento, una proteína de fusión "aislada" o "purificada" significa que la proteína de fusión es la especie predominante presente (es decir, sobre una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición), y preferentemente una fracción sustancialmente purificada es una composición en donde la proteína de fusión comprende al menos aproximadamente un 50 % (sobre una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Generalmente, una composición purificada comprenderá más de aproximadamente un 80 % de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, más preferentemente más de un 85 %, un 90 %, un 95 % y un 99 %. Lo más preferentemente, la proteína de fusión se purifica hasta alcanzar una homogeneidad esencial (las especies contaminantes no pueden detectarse en la composición mediante métodos de detección convencionales) en donde la composición consiste prácticamente en una única especie macromolecular.

Los valores o intervalos pueden expresarse en el presente documento como "aproximadamente", de "aproximadamente" un valor particular y/o a "aproximadamente" otro valor particular. Cuando tales valores o intervalos se expresan, otras realizaciones desveladas incluyen el valor específico citado, desde un valor particular y/o al otro valor particular. De manera similar, cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante el uso del antecedente "aproximadamente", se entenderá que el valor particular constituye otra realización. Se comprenderá además que hay una serie de valores desvelados en el mismo, y que cada valor también se desvela en el presente documento como "aproximadamente" ese valor particular además del propio valor. En realizaciones, "aproximadamente" se puede usar para significar, por ejemplo, dentro del 10 % del valor indicado, dentro del 5 % del valor citado o dentro del 2 % del valor citado.

A veces, una composición comprende un agente terapéutico, donde el agente terapéutico comprende uno o más dominios de unión a heparina de VEGFR-1 o VEGFR-2, y uno o más dominios de unión a VEGF, inhibiendo de este modo la unión del VEGF a su receptor asociado.

A veces, un agente anti-VEGF comprende una porción de unión a VEGF unida operativamente a un Fc-IgG, en donde la porción de unión a VEGF comprende al menos un dominio de unión a VEGF que es un dominio similar a IgG 2 de VEGFR-1, y en donde el agente anti-VEGF tiene una capacidad de inhibición de la mitogénesis estimulada por VEGF mayor que aflibercept. El agente anti-VEGF puede tener una capacidad de unión vitrea mayor que aflibercept. El agente anti-VEGF puede tener una capacidad de inhibición de la proliferación de células endoteliales estimulada por VEGF unido al vitreo mayor que aflibercept. El agente puede tener una semividain vivomayor en comparación con aflibercept.

En ocasiones, una porción de unión a VEGF consiste prácticamente en los dominios similares a IgG 2 y 3 de VEGFR-1 (V<2-3>). En realizaciones, el agente anti-VEGF comprende la secuencia de aminoácidos definida en la SEQ ID No: 3.

En ocasiones, una porción de unión a VEGF consiste prácticamente en los dominios similares a IgG 1, 2, 3 y 3 de VEGFR-1 (V<1-2-3-3>). En ocasiones, el agente anti-VEGF comprende la secuencia de aminoácidos definida en la SEQ ID No: 5.

En ocasiones, la porción de unión a VEGF consiste prácticamente en los dominios similares a IgG 2, 3 y 3 de VEGFR-1 (V<2-3-3>). En ocasiones, el agente anti-VEGF comprende la secuencia de aminoácidos definida en la SEQ ID No: 7.

Las composiciones farmacéuticas pueden comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente anti-VEGF y un excipiente farmacéuticamente aceptable. La presente invención proporciona métodos para tratar la degeneración macular asociada con la edad neovascular en un sujeto que lo necesita que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente anti-VEGF, como se ha definido. El agente anti-VEGF puede inyectarse directamente en el tejido u órgano afectado, tal como un ojo.

En ocasiones, puede tratarse una amplia variedad de trastornos relacionados con el VEGF, incluyendo la degeneración macular asociada con la edad neovascular, neovascularización coroidea secundaria a la miopía, retinopatía diabética proliferativa, edema macular diabético, obstrucción vascular retiniana tal como oclusión venosa retiniana, tumores oculares, síndrome de Von Hippel-Lindau, retinopatía de prematuridad, vasculopatía coroidea polipoidea, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, cáncer cervicouterino, cáncer de endometrio, cáncer de ovario, cáncer de riñón, schwannomas, gliomas, ependimomas y trastornos neoplásicos o no neoplásicos que se benefician de la terapia anti-VEGF.

En algunas realizaciones, el agente terapéutico para su uso está en una forma farmacéutica administrable, que comprende el agente terapéutico, y un excipiente adicional, portador, adyuvante, disolvente o diluyente.

En ocasiones, una composición farmacéutica es adecuada para tratar y/o tratar de manera preventiva a un sujeto, en donde el agente terapéutico está contenido en una cantidad eficaz para lograr su finalidad prevista.

En algunas realizaciones, el agente terapéutico para su uso divulgado en el presente documento se administra mediante inyección. En determinadas realizaciones, los agentes terapéuticos para su uso se inyectan directamente en el órgano o tejido enfermo. En algunas realizaciones, el agente terapéutico para su uso puede administrarse por vía tópica, por ejemplo, mediante parche o aplicación directa en el órgano o tejido enfermo, o por iontoforesis. Los agentes terapéuticos para su uso pueden suministrarse en composiciones de liberación sostenida, tales como los descritos en, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.672.659 y 5.595.760. El uso de composiciones de liberación inmediata o sostenida depende de la naturaleza de la afección tratada. Si la enfermedad consiste en un trastorno agudo o sobreagudo, se preferirá el tratamiento con una forma de liberación inmediata frente a una composición de liberación prolongada. Como alternativa, para determinados tratamientos preventivos o a largo plazo, una composición de liberación sostenida puede ser apropiada.

El agente terapéutico para su uso también puede administrarse mediante un implante, tal como, aunque no de forma limitativa, un implante intraocular. Dichos implantes pueden ser biodegradables y/o biocompatibles, o no biodegradables. Los implantes pueden ser permeables o impermeables al agente activo. Los implantes específicos para la administración del agente terapéutico para su uso dependen tanto del tejido u órgano afectado como de la naturaleza de la afección tratada. El uso de dichos implantes es bien conocido en la técnica.

Los inhibidores descritos en esta memoria descriptiva pueden formularse en nanopartículas u otras formulaciones de fármacos para proporcionar una administración justamente en tejidos específicos y también proporcionar una terapia de liberación controlada.

Los inhibidores descritos en la presente solicitud pueden administrarse no sólo como proteínas recombinantes purificadas, sino también mediante un enfoque de terapia génica. Pueden usarse vectores adenoasociados recombinantes (rAAV) u otros vectores adecuados para administrar el inhibidor de VEGF por vía subretiniana o intravítrea43’44.

Un método para tratar un trastorno relacionado con VEGF o neovascular en un sujeto consiste en administrar al sujeto: (a) una cantidad eficaz de una proteína de fusión capaz de unirse a la heparina y disminuir o prevenir el desarrollo de neovasculatura no deseada. La proteína de fusión puede combinarse con otros agentes anti-VEGF, incluyendo, pero sin limitación: anticuerpos o fragmentos de anticuerpos específicos para VEGF; anticuerpos específicos de los receptores de VEGF; compuestos que inhiben, regulan y/o modulan la transducción de señales tirosina cinasa; polipéptidos de VEGF; oligonucleótidos que inhiben la expresión de VEGF a nivel del ácido nucleico, por ejemplo, ARN antisentido; y diversos compuestos orgánicos y otros agentes con actividad inhibidora de la angiogénesis.

La unión a heparina mediada por D3 (u otro dominio similar a Ig) de VEGFRl<28>, mientras que es una desventaja para la administración sistémica, puede conferir importantes ventajas para la administración intravítrea (u otra administración local). En efecto, la capacidad de unirse a HGPSG, componentes clave de la matriz extracelular<29>, favorece la acumulación en el vítreo, así como la penetración en la retina<30>. Se proporciona una serie de construcciones de fusión de VEGFR-1 Fc que tiene capacidades diferenciales para interactuar con HSPG. Esto permite elegir inhibidores de VEGF con diferente duración/semivida en el ojo, que son útiles en condiciones clínicas diferentes.

Las características y otros detalles se describirán y señalarán más particularmente en los siguientes ejemplos que describen las técnicas preferidas y los resultados experimentales. Los ejemplos se facilitan con el fin de ilustrar la divulgación y no deben considerarse limitativos.

Ejemplos

Los agentes anti-VEGF divulgados en el presente documento son novedosos y mejoran los agentes anti-VEGF existentes, incluyendo el aflibercept, debido a su elevada potencia biológica junto con fuertes características de unión a la heparina. La unión a la heparina predice una semivida más larga y, por consiguiente, una menor frecuencia de administración.

La unión a heparina mediada por D3 (u otro dominio similar a Ig) de VEGFRl<28>, mientras que es una desventaja para la administración sistémica, puede conferir importantes ventajas para la administración intravítrea (u otra administración local). En efecto, la capacidad de unirse a HGPSG, componentes clave de la matriz extracelular<29>, puede favorecer la acumulación en el vítreo, así como la penetración en la retina<30>. Se proporciona una serie de construcciones de fusión de VEGFR-1 Fc que tiene capacidades diferenciales para interactuar con HSPG.

La Fig. 1 proporciona una representación esquemática de las construcciones empleadas en el presente documento. La Fig. 2 ilustra el vector empleado y la estrategia de clonación. Las Figs. 3-9 muestran las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de las construcciones generadas.

Los ejemplos muestran que los niveles de expresión de la mayoría de las construcciones eran bajos; V<1-2-3-4>, V<1-2-3-3>, V<2-3-4>y V<1-2-4>eran casi completamente indetectables en los medios acondicionados. Estudios anteriores habían demostrado que las isoformas de VEGF con alta afinidad por la heparina (VEGF<189>o VEGF<206>) son indetectables en los medios acondicionados de las células transfectadas, estando fuertemente unidas a la superficie de las células o a la matriz extracelular<31 32>. Sin embargo, podrían liberarse en forma soluble mediante la adición de heparina o heparinasa, lo que indica que el sitio de unión consiste en HSPG<31 32>. Con este ejemplo se pretendía determinar si la adición de heparina podía afectar también a los niveles de proteínas de fusión de VEGFR-1 recombinantes. En efecto, la adición de heparina al medio de las células transfectadas en placas de 6 pocillos produjo aumentos dependientes de la dosis en las concentraciones de proteína recombinante en el medio (Fig. 10).

Al tratar de purificar las proteínas recombinantes, la cromatografía de afinidad convencional de proteína A (PA) produjo por sí sola una banda principal de la masa esperada, pero con numerosas bandas menores, probablemente reflejando la interacción de las proteínas recombinantes con las HSPG derivadas de la célula huésped y otras moléculas. Se desarrolló un protocolo que eliminaba tales impurezas, como se describe en Métodos. Un lavado a pH elevado (por ejemplo 9,2) en presencia de NaCl 1,2 M mientras la proteína está unida a PA, dio como resultado la liberación de numerosos contaminantes. La siguiente etapa, cromatografía de intercambio aniónico con Hi-Trap Q, fue muy eficaz para eliminar la mayor parte de los contaminantes y agregados, mientras que las proteínas purificadas se encontraban en el flujo continuo. Los niveles de LPS en las preparaciones purificadas finales fueron < 0,1 EU/mg (intervalo 0,02-0,08), un nivel muy bajo compatible con los estudios preclínicos<33>. Como se muestra en la fig. 11, la pureza de las proteínas recombinantes fue >95 %, según se evaluó mediante gel SDS/PAGE teñido con plata y fue similar a la del fármaco EYLEA aprobado por la FDA.

Se comprobó la capacidad de las proteínas recombinantes para inhibir la mitogénesis estimulada por VEGF (10 ng/ml) en células endoteliales coroideas bovinas. Las proteínas recombinantes tuvieron efectos inhibidores, con valores de CI<50>en el intervalo de ~1 nM, excepto para V1-2-4 y V2-4, que fueron menos potentes (Fig. 12). Curiosamente, EYLEA, incluso a la concentración más alta probada, no inhibió más del -80 % de la proliferación estimulada por VEGF (Fig. 12). En cambio, las presentes construcciones de VEGFR-1, (excepto, V<1-2-4>y V<2-4>), bloquearon completamente la proliferación inducida por VEGF (Fig. 12). Los ensayos de unión documentaron la interacción entre los receptores solubles del VEGF y el VEGF biotinilado y la capacidad del VEGF para desplazar la unión (Fig. 13, 14).

Para definir mejor las interacciones terapéuticamente relevantes, se trató de evaluar si las proteínas recombinantes se unen al vítreo bovinoin vitro.Como se ilustra en la fig. 14, mientras que EYLEA o la IgG de control tenían poca o ninguna unión, las presentes proteínas mostraron una unión significativa. Los aglutinantes más fuertes fueron V1-2-3-3, V2-3-3 y V1-2-3-4 seguido de V1-2-3. V2-3 tuvo características de unión intermedias, entre EYLEA (o IgG de control) y V<1-2-3-3>. AVASTIN, un anticuerpo monoclonal<9>utilizado habitualmente para tratar la neovascularización intraocular, también tuvo poca o ninguna unión.

Para determinar si la fusión de VEGFR-1 FC unido al vítreo puede ser biológicamente activa, se recubrieron las placas con vítreo bovino. La adición de V<1-2-3-3>, pero no EYLEA o IgG de control, inhibió la capacidad del VEGF añadido exógenamente para estimular la proliferación de células endoteliales (Fig. 15).

Las proteínas recombinantes se probaron en el ensayo de NVC en ratones y se compararon con IgG de control o EYLEA. Cada proteína se inyectó por vía intravítrea a la dosis de 2,5 pg un día antes del tratamiento con láser. EYLEA se probó también a 25 pg. V<1-2-3>, V<2-3>, V<1-2-3-3>y V<2-3-3>a la dosis de 2,5 pg demostraron un grado de inhibición similar o superior al alcanzado con 25 pg de EYLEA. Sin embargo, ninguna de las construcciones que contenían D4 demostró una inhibición significativa en las circunstancias probadas (Fig. 16).

Para determinar si la unión a la heparina puede traducirse en efectos terapéuticos duraderos tras una única administración, V<1-2-3-3>, EYLEA o IgG de control, se inyectaron por vía intravítrea (2,5 pg) 1 día, 7 días o 14 días antes de la lesión inducida por láser. Como se muestra en la fig. 17, EYLEA produjo una inhibición significativa sólo cuando se administró 1 día antes de la lesión. Sin embargo, V<1-2-3-3>produjo una inhibición significativa también cuando se administró 7 días o 14 días antes de la lesión.

Se divulgan varias construcciones novedosas de VEGFR-1 -Fc evaluadas en una variedad de ensayosin vitroein vivo.Para purificar las proteínas recombinantes, se utilizó un protocolo de múltiples etapas. Esto se debió en gran medida a los niveles de expresión relativamente bajos en las células 293 de expresión transitoria, que requieren la adición de heparina a los medios para perfeccionar la liberación. Sin embargo, la necesidad de usar heparina puede ser en parte o totalmente obviada por diferentes células huésped (es decir, teniendo una composición diferente de HSPG o mutantes de la misma) o por niveles de expresión más altos, tal como en líneas celulares amplificadas y estables.

Todas las construcciones, excepto V2-4, neutralizaron potentemente la actividad de VEGF y, al mismo tiempo, tuvieron fuertes características de unión a heparina, lo que puede predecir una semivida larga tras la administración intravítrea. El ejemplo documenta que estas proteínas se unen al vítreo bovino. Los aglutinantes más fuertes fueron V1-2-3-3, V2-3-3, V1-2-3-4, seguido de V1-2-3. V2-3 tuvo una unión vítrea significativa pero inferior. La IgG de control, EYLEA, o AVASTIN tuvieron en cambio una unión mínima. Uno de los aglutinantes vítreos más fuertes, V1-2-3-3, se seleccionó para probar la hipótesis de que una construcción de VEGFR1 Fc unida a la matriz vítrea puede ser biológicamente activa. Como se muestra en la fig. 15, en placas recubiertas con vítreo bovino, la adición de V1-2-3-3, pero no EYLEA o IgG de control, inhibió la capacidad del VEGF añadido exógenamente para estimular la proliferación de células endoteliales.

A continuación, se probó la capacidad de las proteínas recombinantes para inhibir la neovascularización inducida por láser en el modelo de NVC de ratón. Se utilizó EYLEA como control positivo e IgG1 humana como control negativo. Se eligió una dosis relativamente baja para las pruebasin vivo, siendo la más adecuada para revelar las diferencias de potencia entre las distintas construcciones. Asimismo, se ha informado que la administración intravítrea de dosis relativamente altas de anticuerpos del isotipo de IgG1 puede tener efectos inhibidores colaterales, mediados por FcgRI (CD64) y c-Cbl, cuando se inyectan por vía intravítrea 34. La dosis empleada debe evitar tales efectos colaterales y detectar efectos verdaderamente específicos.

Como se muestra en la fig. 16, EYLEA produjo una inhibición de aproximadamente un 30 % a la dosis de 2,5 pg y de ~ 50 % a la de 25 pg. Estos resultados concuerdan en gran medida con la bibliografía publicada. Saishin et al informaron que la inyección intravítrea de ~5 pg de aflibercept dio como resultado una inhibición del área de la NVC de -30 % en el ratón 35. En efecto, la dosis de 40 pg se utiliza habitualmente para conseguir un efecto máximo en el modelo de NVC en ratón 36. Un hallazgo inesperado de nuestro estudio fue la mayor potencia de algunas de nuestras construcciones: V1-2-3, V2-3, Vl-2-3-3 y V2-3-3. La administración de 2,5 pg de estas construcciones un día antes de la lesión igualó o incluso superó el nivel de inhibición conseguido con 25 pg de EYLEA. El hallazgo de que V1-2-3-3, pero no EYLEA, tiene un efecto significativo en la prevención de la NVC cuando se administra 7 días o 14 días antes de la lesión (Fig. 17), documenta la durabilidad del efecto y el valor terapéutico.

Un hallazgo inesperado es que ninguna de las construcciones que contienen D4 (Vl-2-3-4, V2-3-4, Vl-2-4, V2-4) dieron como resultado una marcada inhibiciónin vivo(al menos a la dosis probada), a pesar de que estas moléculas (a excepción de V2-4) demostraron capacidad para bloquear la mitogénesis estimulada por VEGFin vitro.Sin embargo, todas estas construcciones demostraron propensión a formar multímeros o agregados, como se evaluó mediante gel SDS/PAGE en condiciones no reductoras (Fig. 11) o cromatografía de exclusión por tamaño (no mostrado). Aunque trabajos anteriores 37 identificaron D4 (junto con D7) como un requisito para la dimerización de VEGFR-1, se conoce que tal efecto depende del ligando. Los estudios de estructura cristalina revelaron un bucle en D4 responsable de tales interacciones homotípicas 23. Es posible que las altas concentraciones y/o la dimerización forzada impuesta por la construcción de Fc puedan dar lugar a interacciones independientes del ligando, dando como resultado la agregación. En cualquier caso, los agregados no son productos farmacéuticos deseables dada la posibilidad de inflamación e inmunogenicidad 3839. Por lo tanto, un aspecto de la presente invención es la identificación de construcciones que tienen D2/D3 de VEGFR-1, pero no D4, en realizaciones.

Cabe destacar que las mutaciones en Fc bien caracterizadas, bien conocidas por el experto en la materia, que reducen las funciones efectoras podrían ser adiciones útiles a la invención para minimizar la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC) así como las interacciones con C1q y el inicio de la cascada del complemento40.

En conclusión, aflibercept se diseñó para eliminar el dominio de heparina de unión a la heparina con el fin de mejorar la semivida sistémica para indicaciones oncológicas. En cambio, las construcciones descritas en el presente estudio están diseñadas para promover la unión y la retención en el vítreo con el fin de garantizar interacciones más sostenidas y terapéuticamente relevantes.

Métodos

Para la construcción de plásmidos de expresión de VEGFR-1ECD-FC, los fragmentos de ácido nucleico codificaron el péptido señal y una variedad de dominios uno a cuatro extracelulares similares a Ig 20 de VEGRF-1 (Gene ID: 2321) fueron sintetizados por GenScript USA Inc. La variedad de las construcciones de dominio similar a Ig extracelular es la siguiente: V123 contiene D 1,2 y 3; V23, D1 y D2; V1234, D 1,2, 3 y 4; V1233, D 1,2, 3 y 3; V234, D 2, 3 y 4; V124, D1, 2 y 4; V24, D2 y 4; F7 es ECD2, 2 y 3 y F8 es ECD2 y 3. Los fragmentos sintetizados se insertaron en el vector pFUSE-hIgG1-Fc (InvivoGen, n.° pfuse-hgifc1) en los sitios EcoRI y BgIII, generando los plásmidos que contienen los distintos ECD de Flt1. Entonces, utilizando el kit PrineSTAR Mutagenesis Basal Kit (Takara, R046A), se eliminó el intervalo de aminoácidos R y S (sitio Bg 111) entre los ECD y el fragmento Fc, generando los plásmidos (F1-F8) que expresan las proteínas de fusión de los ECD de Flt1 con una IgG1-Fc humana de 227 aminoácidos.

Transfección y preparación del medio acondicionado

Se utilizó el sistema de expresión Expi293 (Life technologies, A14524) para generar los medios acondicionados para la purificación, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, las células Expi293F™ (ThermoFisher) se cultivaron en suspensión en medio de expresión Expi293™ a 37 0C en una atmósfera humidificada con un 8 % de CO2. Cuando la densidad celular alcanzó los 2,5 millones/ml, se mezcló el ADN de los plásmidos y el reactivo ExpiFectamine™ 293, se incubó 5 min y se añadió a las células. La concentración final del ADN y del reactivo transfectado fue de 1 pg y 2,7 pl por mililitro, respectivamente. Cinco horas después de la transfección, se añadieron a las células 100 pg/ml de heparina (Sigma, H3149) y cóctel inhibidor de proteasa, 1:400 (Sigma, P1860). 16 horas después de la transfección, se añadieron los reactivos potenciadores 1 y 2. Noventa y seis horas después de la transfección, se recogieron los medios acondicionados. Se analizaron alícuotas para determinar las concentraciones de proteínas de fusión de Fc utilizando un kit ELISA de Fc humano (Syd Labs, EK000095-HUFC-2) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se añadieron inhibidores de proteasa (1:500) a la masa, que se almacenó a -80 °C hasta su uso posterior.

Purificación de proteínas recombinantes

Se emplearon reactivos sin pirógenos. Antes de su uso, las columnas y el equipo (Akta Explorer System) se desinfectaron mediante exposición a NaOH 0,5 N durante aproximadamente 45 minutos. Los medios acondicionados de las células transfectadas se ajustaron a PBS, polisorbato (PS) 20 al 0,01 %. Se añadió PS20 a los tampones en todas las etapas. Después de centrifugar a 20000 xg durante 30 minutos, los sobrenadantes se sometieron a cromatografía de afinidad con proteína A (PA) utilizando un Hi-Trap MabSelect SuRe (5 ml, GE Healthcare). Tras la carga, la columna se lavó con dietanolamina 20mM, pH 9,2, NaCl 1,2 M, antes de la elución con ácido cítrico 0,1 M, pH 3,0, que se neutralizó inmediatamente. A continuación, el grupo de elución de PA se diluyó en dietanolamina 20 mM, pH 9,2, y se aplicó a la columna de intercambio aniónico Hi-Trap Q (5 ml, GE Healthcare). El material unido se eluyó con un gradiente de NaCl. El flujo continuo, que contenía la proteína recombinante purificada, se ajustó inmediatamente a Tris 20 mM, pH 6,8, y a continuación se concentró mediante la unión a heparina-sefarosa (Hi-Trap™-HS). Después de un lavado con NaCl 0,2-0,45 M (dependiendo de la construcción), la proteína de fusión de VEGFR1 recombinante se eluyó con NaCl 1 M. La etapa final de pulido consistió en la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), usando, por ejemplo, Superdex 200 Increase, 10/300 GL o Hi-Load 16/600 Superdex 200 pg, GE Healthcare. Para finalizar, las proteínas se cambiaron de tampón por diálisis en Tris 10 mM, pH 6,8, histidina 10 mM, trealosa al 1 %, NaCl 40 mM, PS20 al 0,01 %. Para determinar los niveles de endotoxinas, se utilizó el kit ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit (GenScript, L00350) según el protocolo del fabricante.

Ensayos de proliferación celular

Los ensayos de proliferación de células endoteliales bovinas se realizaron prácticamente como se ha descrito anteriormente 41. Se tripsinizaron células endoteliales coroideas bovinas (BCEC) en crecimiento en fase logarítmica (pasaje <10), se resuspendieron y se sembraron en placas de 96 pocillos (sin recubrimiento) en DMEM bajo en glucosa suplementado con suero de ternera bovina al 10 %, glutamina 2 mM y antibióticos, a una densidad de 1000 células por pocillo en un volumen de 200 pl. Se añadió rhVEGF165 (Peprotech) a una concentración de 10 ng/ml. Se adquirió aflibercept (EYLEA) en una farmacia. Los inhibidores se añadieron a la célula a distintas concentraciones, como se indica en las figuras, antes de añadir los ligandos. Después de 5 o 6 días, las células se incubaron con Alamar Blue durante 4 h. La fluorescencia se midió a una longitud de onda de excitación de 530 nm y a una longitud de onda de emisión de 590 nm.

Ensayos de unión de variantes de VEGFR-1 en fase sólida

Se recubrieron las tiras de pocillos de EIA/RIA de 96 pocillos de Costar (n.° 2592, Corning Incorporated, Kennebunk, ME) durante la noche a 4 °C con proteínas receptoras de VEGF purificadas (250 ng/pocillo) en tampón de recubrimiento (Biolegend, San Diego, CA, n.° 421701). Los sitios de unión inespecíficos se bloquearon incubando las tiras con BSA al 2 % (Sigma, A6003) en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente (TA) tras un único lavado con tampón de lavado ELISA (R&D systems 895003). A continuación, las tiras se lavaron 3 veces, seguido de la adición de VEGF165 humano biotinilado (G&P Biosciences, Santa Clara, CA) en diluyente de ensayo (Biolegend, n.° 421203) solo o en combinación con diversas concentraciones de VEGF165 humano no biotinilado (R&D systems) a 37 0C durante 2 horas. Después de tres lavados, la unión de VEGF165 humano biotinilado a VEGFR1 se detectó mediante incubación con estreptavidina HRP (1:1000, Biolegend, n.° 405210) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las tiras se lavaron 5 veces antes de incubarlas con solución de sustrato de alta sensibilidad TMB (Biolegend, n.° 421501) durante 30 min, y se midió la absorbancia a 450 nm tras añadir la misma cantidad de solución de parada (Biolegend, n.° 77316). Todos los experimentos se realizaron en pocillos duplicados y se repitieron al menos dos veces.

Uniónin vitroal vítreo bovino

El vítreo bovino (In Vision BioResource, Seattle, WA) se descongeló a 4 0C. El material se diluyó primero 1:1 con PBS y se filtró a través de un filtro de 0,22 pm, se alicuotó y se almacenó a -80 0C. La concentración total de proteínas del material vítreo bovino se midió mediante el ensayo de proteínas BCA de Pierce. Las tiras de pocillos de EIA/RIA de 96 pocillos de Costar se recubrieron con vítreo bovino (1 pg/pocillo) durante 4 h a TA, seguido de un lavado con tampón de lavado ELISA. Los sitios de unión inespecíficos se bloquearon añadiendo BSA al 2 % en PBS durante 1 hora a TA, seguido de tres lavados con PBS-T al 0,01 %. A cada pocillo, se añadieron 50 ul de VEGFR1 o proteínas de control durante la noche a 4 0C. Al día siguiente, las placas se lavaron tres veces con PBS-T al 0,01 %, seguido de una incubación con 100 ul de anti Fc humano caprino conjugado con AP (1:2000, Invitrogen, n.° A18832)) durante 1 h a TA. Las placas se lavaron cinco veces más con PBS-T al 0,01 % antes de añadir 50 ul de sustrato PNPP de 1 etapa (Thermo Scientific, Rockford, IL, n.° 37621) durante 15-30 min a TA. La DO se midió a 405 nm.

Los efectos del VEGFR1 unido al vitreo en la proliferación de células endoteliales estimulada por VEGF en tiras de pocillos de EIA/RIA de 96 pocillos de Costar, se esterilizaron primero con UV durante 1 h, seguido de un recubrimiento con 1 pg/pocillo de vitreo bovino, se diluyeron en PBS durante 4 h a TA. Las placas se lavaron una vez con PBS, se bloquearon con BSA al 2 % a 4 0C, y se lavaron dos veces con PBS en campana de bioseguridad. Se añadieron a las placas cantidades iguales de receptores solubles o de IgG de control, se diluyeron en PBS D/N a 4 0C (50 pl/pocillo). A continuación, las placas se lavaron una vez con PBS, seguido de un lavado con medio de ensayo que contenia BCS al 10 %. Se añadieron a cada pocillo 100 pl de medio, seguido de la adición de VEGF a 5 ng/ml o solo PBS como control sin VEGF. Las placas se incubaron con VEGF o PBS durante 1 h, seguido de la adición de 100pl de suspensión de células BCEC (2500 células/pocillo finales). 48 h más tarde, la proliferación se midió añadiendo Alamar Blue.

Neovascularización coroidea (NVC) inducida por láser

Se anestesiaron ratones macho C57BL/6J (6-8 semanas) con un cóctel de ketamina/Xilacina antes del tratamiento con láser. Se indujeron lesiones de NVC mediante fotocoagulación láser utilizando un láser de diodo (IRIDEX, Oculight GL) y una lámpara de hendidura (Zeiss) con un tamaño de punto de 50 um, potencia de 180 mW y duración de la exposición de 100 ms. 3642. Se indujeron normalmente cuatro quemaduras láser en las posiciones 3, 6, 9 y 12 alrededor del disco óptico en cada ojo. Se inyectaron por via intravitrea diferentes construcciones o un control de isotipo de IgG, a la dosis de 2,5 pg por ojo, en un volumen de 1 pl. EYLEA se utilizó como control positivo a 2,5 o 25 pg. Un dia después de la inyección, se realizó el tratamiento con láser y se enuclearon los ojos y se fijaron en paraformaldehido al 4 % (PFA) durante 15 minutos, 7 dias después del tratamiento con láser. En un conjunto de estudios separado, las construcciones seleccionadas se inyectaron una vez al dia, 7 dias o 14 dias antes del tratamiento con láser. Se separaron los complejos de coroides-esclerótica y las retinas y se realizó inmunofluorescencia (IF) anti-CD31 para evidenciar la vasculatura mediante tinción de montaje completo tanto de la retina como de los tejidos coroideos. Para la IF para CD31, el anticuerpo antimurino de rata BD 550274 se diluyó a 1:100 y se incubó toda la noche a 4 0C. Tras 4 horas de incubación con un anticuerpo antimurino secundario (Life Technologies A11006), se tomaron imágenes de los montajes completos a 488 nm. La cuantificación de la neovascularización en el área de la lesión y de la densidad vascular en la retina se llevó a cabo mediante Image J. Los valores p se evaluaron mediante la prueba t de Student (cambio significativo, p<0,05).

Referencias

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Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Un agente anti-VEGF que consiste en los aminoácidos 27 a 459 de la SEQ ID NO: 3 para su uso en el tratamiento de la degeneración macular asociada con la edad neovascular.

2. El agente anti-VEGF para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el agente anti-VEGF tiene una capacidad de inhibición de la proliferación de células endoteliales estimulada por VEGF unido al vítreo mayor que aflibercept.

3. El agente anti-VEGF para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el agente anti-VEGF tiene una mayor duración tras la administración intravítrea en comparación con aflibercept.

4. El agente anti-VEGF para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el agente anti-VEGF está formulado para una inyección intravítrea.