ES3009538T3

ES3009538T3 - Rodent cells having a disruption in a c9orf72 locus

Info

Publication number: ES3009538T3
Application number: ES20158032T
Authority: ES
Inventors: Amanda Atanasio; Burcin Ikiz; Guochun Gong; Michael L Lacroix-Fralish; Ka-Man Venus Lai; David M Valenzuela
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2015-05-29
Filing date: 2016-05-26
Publication date: 2025-03-27
Anticipated expiration: 2036-05-26
Also published as: US20190216062A1; EP3302048B1; CA2986048A1; US20160345547A1; KR102190661B1; EP3689139A1; AU2016270587B2; JP2021118745A; EP3302048A1; CA2986048C; MX2017015369A; RU2017145143A3; KR20200140934A; HK1248465A1; IL255385A0; AU2021201827B2; US11547101B2; NZ737000A; JP6619822B2; JP2018518165A

Abstract

Se proporciona un modelo animal no humano para enfermedades neurodegenerativas o inflamatorias, que presenta una alteración en el locus aC9ORF72. En particular, los animales no humanos descritos en este documento presentan una deleción de una secuencia codificante completa del locus aC9ORF72. También se proporcionan métodos para identificar candidatos terapéuticos que puedan utilizarse para prevenir, retrasar o tratar una o más enfermedades neurodegenerativas (p. ej., esclerosis lateral amiotrófica [ELA], también conocida como enfermedad de Lou Gehrig) y demencia frontotemporal (DFT)), autoinmunes o inflamatorias (p. ej., LES, glomerulonefritis). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Células de roedor que tienen una alteración en un locus C9orf72

Antecedentes

Las enfermedades neurodegenerativas son las principales contribuyentes a la discapacidad y la enfermedad. En particular, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA, también denominada como enfermedad de Lou Gehrig) y la demencia frontotemporal (DFT) son trastornos raros del sistema nervioso caracterizados por la pérdida y/o muerte neuronal progresiva. Aunque el envejecimiento se considera como el mayor factor de riesgo para la enfermedad neurodegenerativa, se han descubierto varios componentes genéticos. Por ejemplo, las mutaciones en el gen de la superóxido dismutasa de cobre-cinc (SOD1) se han asociado durante mucho tiempo con la ELA. Además, las repeticiones de hexanucleótidos expandidas de GGGGCC dentro de una región no codificante del genC9ORF72se han relacionado tanto con la ELA como con la DFT. Actualmente, no existe cura para ninguna de ambas enfermedades, pero sí existen tratamientos que ayudan a controlar y/o aliviar los síntomas.

Las enfermedades inflamatorias incluyen una gran diversidad de enfermedades que se caracterizan a menudo por una o más mutaciones genéticas que dan como resultado un sistema inmunitario deteriorado o disfuncional. Aunque los mecanismos de, por ejemplo, la artritis reumatoide, la enfermedad inflamatoria intestinal y la glomerulonefritis no se comprenden completamente, varios componentes genéticos se han relacionado con los diversos signos y síntomas presentados por los pacientes. Dichas enfermedades se caracterizan por inflamación sistémica y muestran diversas anomalías en todo el cuerpo del paciente. Al igual que con la ELA y la DFT, los tratamientos para las enfermedades inflamatorias solo tienen como objetivo mejorar los síntomas y retrasar el progreso de la enfermedad.

Si bien diversos modelos de animales de laboratorio se usan ampliamente en el desarrollo de la mayoría de los agentes terapéuticos, existen pocos que aborden las enfermedades neurodegenerativas e inflamatorias de manera que proporcionen la elucidación del mecanismo molecular exacto por el cual los componentes genéticos identificados provocan la enfermedad. Por lo tanto, la forma en que las mutaciones genéticas provocan enfermedades neurodegenerativas y/o inflamatorias aún es en gran medida desconocida. Los modelos animales ideales contendrían los mismos componentes genéticos y representarían características similares de la enfermedad humana. Dadas las diferencias genéticas entre especies, existe una gran necesidad no satisfecha del desarrollo de modelos animales mejorados que resuman fielmente la enfermedad neurodegenerativa y/o inflamatoria humana. Por supuesto, dichos modelos animales mejorados proporcionan un valor significativo en el desarrollo de agentes terapéuticos y/o profilácticos eficaces.

Naoki Suzukiet al.,Neuroscience, vol. 16, n.° 12, 3 de noviembre de 2013, páginas 1725-1727 divulgan un ratón transgénico que presenta una inserción LacZ dirigida que reemplaza a los exones 2-6 de C9orf72. S.K.Pandaet al.,Genetics, vol. 195, n.° 3, 26 de agosto de 2013, páginas 703-713 divulgan la generación de un ratón con desactivación de C9orf72 en donde la alteración del homólogo de ratón del gen C9orf72 se generó mediante la creación de mutaciones con cambio de marco inducidas por TALEN. Alan Steptoet al.,Acta Neuropathologica, vol. 127, n.° 3, 1 de marzo de 2014, páginas 377-389 proporcionan un análisis sobre si la reducción o la pérdida de la función de C9orf72 contribuye a la enfermedad y resume los resultados mediante el análisis de diversos modelos animales. Los documentos WO2013/030588 y WO2013/041577 divulgan métodos para diagnosticar una enfermedad neurodegenerativa tal como ELA y DLFT.

Sumario

La invención es como se define en las reivindicaciones.

La invención proporciona una neurona motora aislada de roedor cuyo genoma comprende una deleción de la porción codificante del exón 2 a la porción codificante del exón 11 de un locusC9orf72endógeno.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para elaborar una neurona motora de roedor que comprende una deleción de la porción codificante del exón 2 a la porción codificante del exón 11 de un locusC9orf72endógeno, comprendiendo el método cultivar y diferenciar una célula madre embrionaria (ES) de roedor en una neurona motora de roedor, en donde la célula ES de roedor comprende una deleción de la porción codificante del exón 2 a la porción codificante del exón 11 de un locusC9orf72endógeno.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para cribar un agente candidato para reducir la disfunción mitocondrial y/o el estrés oxidativo en una neurona motora, comprendiendo el método:

(a) cultivar la neurona motora de roedor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en presencia o ausencia de un agente;

(b) determinar si el agente previene, inhibe y/o reduce la disfunción mitocondrial y/o el estrés oxidativo en la población de neuronas motoras en comparación con una población de control de neuronas motoras cultivadas en ausencia del agente; en donde la prevención, la inhibición y/o la reducción del estrés oxidativo en las neuronas motoras es indicativa de un agente candidato para reducir la disfunción mitocondrial y/o el estrés oxidativo en una neurona motora de roedor.

La presente divulgación abarca el reconocimiento de que es deseable genomanipular roedores para permitir sistemasin vivomejorados para identificar y desarrollar nuevos agentes terapéuticos y, en algunos ejemplos, pautas terapéuticas, que se puedan usar para el tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones neurodegenerativas. En algunos ejemplos, los sistemasin vivocomo se describen en el presente documento se pueden usar para identificar y desarrollar nuevos agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones inflamatorias. En algunos ejemplos, los sistemasin vivocomo se describen en el presente documento también se pueden usar para identificar y desarrollar nuevos agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones autoinmunitarias. Además, los roedores divulgados en el presente documento que comprenden una alteración en un locusC9ORF72y/o un locusC9ORF72funcionalmente silenciado de otro modo, de modo que no se exprese ni se produzca un polipéptido C9ORF72, son deseables, por ejemplo, para su uso en la identificación y desarrollo de agentes terapéuticos dirigidos a una repetición de hexanucleótidos de GGGGCC, la transcripción y regulación deC9ORF72y/o el aumento o la disminución de los niveles de C9ORF72, que se han asociado con enfermedades en seres humanos. En algunos ejemplos, los roedores como se describen en el presente documento proporcionan sistemas (o modelos)in vivomejorados para enfermedades, trastornos y afecciones neurodegenerativas (por ejemplo, ELA y/o DFT). En algunos ejemplos, los roedores descritos en el presente documento proporcionan sistemas (o modelos)in vivomejorados para enfermedades, trastornos y afecciones inflamatorias.

En el presente documento se divulgan modelos de roedor para esclerosis lateral amiotrófica (ELA), demencia frontotemporal (DFT) y/o glomerulonefritis. En diversos ejemplos, se proporcionan modelos de roedor para ELA y/o DFT, que se caracterizan por una alteración (por ejemplo, una deleción de una región codificante completa) en un locusC9ORF72.En algunos ejemplos, una alteración en un locusC9ORF72afecta a una o más neuronas de un roedor que comprende dicha alteración. En algunos ejemplos, una alteración en un locusC9ORF72afecta a uno o más del bazo, ganglios linfáticos cervicales, médula ósea, riñón y sangre de un roedor que comprende dicha alteración.

En algunos ejemplos, una alteración en un locusC9ORF72de un roedor, como se describe en el presente documento, da como resultado uno o más de los siguientes fenotipos: un fenotipo de tipo ELA; esplenomegalia; linfadenopatía; glomerulonefritis; una infiltración de uno o más de los macrófagos, monocitos y granulocitos en el bazo, ganglios linfáticos cervicales, médula ósea y/o sangre; una infiltración de macrófagos F4/80+ en el riñón y/o el hígado; un agotamiento de los linfocitos B y/o T en la médula ósea; una disminución de los linfocitos en la sangre; y un aumento en la expresión de una o más citocinas (por ejemplo, IL-17, IL-10, TNF-a e IL-12) en el suero.

En algunas realizaciones, una alteración (por ejemplo, una deleción) en un locusC9ORF72de roedor puede ser resultado de una inserción de una secuencia de ácido nucleico que, en algunas realizaciones determinadas, comprende un gen indicador.

En algunos ejemplos, se proporciona un roedor que comprende en su genoma una deleción de la secuencia codificante completa en un locusC9ORF72,es decir, una deleción de una secuencia genómica que codifica todas las isoformas deC9ORF72(es decir, las isoformas V1, V2 y V3).

La invención proporciona neuronas motoras aisladas de roedor cuyo genoma comprende una deleción de la porción codificante del exón 2 a la porción codificante del exón 11 de un locusC9orf72endógeno. En algunos ejemplos, una deleción es de un segmento genómico de aproximadamente 26 kb en un locusC9ORF72de un roedor. La deleción es de un segmento genómico que abarca al menos los exones 2-11 (por ejemplo, los exones 2-11 de V1). En algunas realizaciones, una deleción puede incluir los exones 1-11. En algunas realizaciones, un locusC9ORF72que tiene una deleción comprende un gen indicador. En algunas realizaciones, un gen indicador está unido operativamente a un promotor deC9ORF72.En algunas realizaciones, un promotor deC9ORF72es un promotor endógeno.

En algunas realizaciones, un locusC9ORF72de una neurona motora de roedor descrita en el presente documento carece de la región codificante del exón 2 a la región codificante del exón 11, y comprende un gen indicador. En algunas realizaciones, el gen indicador está unido operativamente a un promotor deC9ORF72. En algunas realizaciones, el gen indicador puede estar unido operativamente a la región no codificante del exón 2 (es decir, parte de la 5' UTR) de un genC9ORF72,colocando así el gen indicador en un enlace operativo con el exón 1 (es decir, exón 1a o exón 1b) y las secuencias reguladoras cadena arriba (incluyendo el promotor) de un locusC9ORF72de un roedor. En realizaciones específicas, el enlace operativo entre un gen indicador y la porción no codificante del exón 2 puede lograrse mediante la deleción dirigida de una secuencia genómica deC9ORF72desde el codón inmediatamente después del codón iniciador ATG en el exón 2 hasta la región codificante del exón 11, y la inserción de una secuencia codificante indicadora sin un codón iniciador ATG en el sitio del locusC9ORF72inmediatamente después del codón iniciador ATG restante en el exón 2 del genC9ORF72.En algunas realizaciones, la expresión de un gen indicador puede parecerse al patrón (o perfil) de expresión de un locusC9ORF72.

En algunas realizaciones, un gen indicador puede seleccionarse del grupo que consiste en p-galactosidasa(lacZ),luciferasa, proteína verde fluorescente (GFP), GFP mejorada (eGFP), proteína cian fluorescente (CFP), proteína amarilla fluorescente (YFP), proteína amarilla fluorescente mejorada (eYFP), proteína azul fluorescente (BFP), proteína azul fluorescente mejorada (eBFP), DsRed y MmGFP. En algunas realizaciones determinadas, un gen indicador puede serlacZ.

En algunos ejemplos, un roedor, como se describe en el presente documento, es homocigoto o heterocigoto para una deleción de la secuencia codificante completa en un locusC9ORF72.

En algunos ejemplos, un roedor, como se describe en el presente documento, desarrolla uno o más fenotipos como se describe en el presente documento; en algunas realizaciones determinadas, los fenotipos son detectables después de aproximadamente 8 semanas de edad.

En algunos ejemplos, un roedor, como se describe en el presente documento, desarrolla uno o más síntomas de ELA y/o DFT durante el desarrollo; en algunos ejemplos determinados, después de aproximadamente 36 semanas de edad; en algunos ejemplos determinados, después de aproximadamente 40 semanas de edad. En algunos ejemplos, un roedor, como se describe en el presente documento, desarrolla déficits motores progresivos después de aproximadamente 36 semanas de edad. En algunos ejemplos, un roedor, como se describe en el presente documento, desarrolla una patología de neurona motora inferior después de aproximadamente 40 semanas de edad. En algunos ejemplos, un roedor, como se describe en el presente documento, desarrolla una disminución en el peso corporal después de aproximadamente 36 semanas de edad. En algunos ejemplos, un roedor, como se describe en el presente documento, desarrolla disfunción mitocondrial en las neuronas motoras durante el desarrollo; en algunos ejemplos determinados, la disfunción mitocondrial se caracteriza por una disminución en uno o más de respiración mitocondrial, respiración basal, respiración máxima, capacidad respiratoria de reserva, producción de ATP y fuga de protones; en algunos ejemplos determinados, la disfunción mitocondrial se caracteriza por un aumento de la relación de ADN mitocondrial con respecto al ADN nuclear en comparación con la relación de ADN mitocondrial con respecto al ADN nuclear de las neuronas motoras de un roedor de control o de referencia.

En algunos ejemplos, un roedor, como se describe en el presente documento, desarrolla uno o más síntomas de glomerulonefritis durante el desarrollo; en algunos ejemplos determinados, después de aproximadamente 35 semanas de edad, después de aproximadamente 35-41 semanas de edad inclusive o después de aproximadamente 35 60 semanas de edad inclusive. En algunos ejemplos, un roedor, como se describe en el presente documento, desarrolla esplenomegalia después de aproximadamente 8 semanas de edad. En algunos ejemplos, un roedor, como se describe en el presente documento, desarrolla linfadenopatía después de aproximadamente 8 semanas de edad. En algunos ejemplos, la linfadenopatía es palpable después de aproximadamente 12-18 semanas de edad inclusive o después de aproximadamente 18-60 semanas de edad inclusive. En algunos ejemplos, un roedor, como se describe en el presente documento, se caracteriza por una infiltración de uno o más de células plasmáticas, monocitos, granulocitos y macrófagos F4/80+; en algunos ejemplos determinados, la infiltración puede detectarse después de aproximadamente 8 semanas de edad; en algunos ejemplos determinados, la infiltración puede detectarse hasta las 60 semanas de edad. En algunos ejemplos, un roedor, como se describe en el presente documento, desarrolla una infiltración de macrófagos F4/80+ en el riñón y/o el hígado después de aproximadamente 8 semanas de edad.

En algunos ejemplos, un roedor, como se describe en el presente documento, desarrolla un nivel sérico aumentado de citocinas de una o más de IL-10, IL-12, IL-17, IFN-<y>, TNF-a y MCP-1 después de aproximadamente 8 semanas de edad. En algunos ejemplos, un roedor, como se describe en el presente documento, desarrolla un nivel sérico aumentado de IL-12 después de aproximadamente 8 semanas de edad que es aproximadamente 6 veces o más en comparación con un roedor de referencia o control.

En algunos ejemplos, un roedor, como se describe en el presente documento, desarrolla una nefropatía caracterizada por una membrana basal engrosada, formación de cilindros (o formación de cilindros hialinos), deposición de complejos inmunitarios, glomerulonefritis membranoproliferativa, inflamación mononuclear intersticial, glomeruloesclerosis, túbulos basófilos o combinaciones de los mismos después de aproximadamente 28-35 semanas de edad inclusive, después de aproximadamente 35-41 semanas de edad inclusive, o después de aproximadamente 35-60 semanas de edad inclusive.

En algunos ejemplos, un roedor, como se describe en el presente documento, desarrolla una población de células dendríticas mieloides aumentada en uno o más del bazo, ganglios linfáticos, médula ósea, riñón y sangre después de aproximadamente 28-35 semanas de edad inclusive. En algunas realizaciones, una población de células dendríticas mieloides se caracteriza como CD45+CD11b+CD11c+MHCII+.

En algunos ejemplos, un roedor, como se describe en el presente documento, desarrolla un nivel sérico aumentado de uno o más autoanticuerpos después de aproximadamente 8 semanas de edad; en algunos ejemplos determinados, después de aproximadamente 28-35 semanas de edad inclusive. En algunos ejemplos, un roedor, como se describe en el presente documento, desarrolla un nivel sérico aumentado de uno o más autoanticuerpos entre aproximadamente 8 semanas y aproximadamente 60 semanas de edad inclusive. En algunos ejemplos, uno o más autoanticuerpos se seleccionan de anticuerpos anti factor reumatoide (anti RF), anticuerpos anti ADNbc, anticuerpos antinucleares (ANA), anticuerpos anti Smith (anti Sm), anticuerpos anti cardiolipina y combinaciones de los mismos.

En algunos ejemplos, un roedor, como se describe en el presente documento, desarrolla un nivel aumentado de macrófagos F4/80+ en uno o más del bazo, ganglios linfáticos, médula ósea, riñón y sangre después de aproximadamente 28-35 semanas de edad inclusive. En algunos ejemplos, los macrófagos F4/80+ se caracterizan como CD45+CD11b+F4/80+Ly6G".

En algunos ejemplos, un roedor, como se describe en el presente documento, desarrolla una población de linfocitos T aumentada en uno o más del bazo, ganglios linfáticos, médula ósea, riñón y sangre después de aproximadamente 28 35 semanas de edad inclusive. En algunos ejemplos, los linfocitos T se caracterizan como CD8+CD44+, CD8+CD69+, CD8+PD1+, CD4+CD44+, CD4+CD69+ o CD4+PD1+. En algunos ejemplos, un roedor, como se describe en el presente documento, desarrolla una población de linfocitos T reguladores aumentada en el bazo y/o los ganglios linfáticos después de aproximadamente 28-35 semanas de edad inclusive, y en donde la población de linfocitos T reguladores se caracteriza como CD4+FoxP3+. En algunos ejemplos, un roedor, como se describe en el presente documento, desarrolla un aumento de linfocitos T foliculares auxiliares (Tfh) en el bazo, los ganglios linfáticos (por ejemplo, ganglios linfáticos cervicales o "CLN", y ganglios linfáticos mesentéricos o "MLN"), y/o la sangre después de aproximadamente 26 semanas de edad, y en donde la población de linfocitos Tfh se caracteriza como CD4+CXCR5+CD44+ICOS+PD-1+Bcl-6+.

En algunos ejemplos, un roedor, como se describe en el presente documento, desarrolla un aumento de la población de células plasmáticas en uno o más del bazo, los ganglios linfáticos y la médula ósea después de aproximadamente 8-60 semanas de edad inclusive. En algunos ejemplos, una población de células plasmáticas se caracteriza como CD45+CD19-B220-CD138+ o CD45+CD19intB220intCD138+.

En algunos ejemplos, un roedor, como se describe en el presente documento, desarrolla síndrome linfoproliferativo autoinmunitario (ALPS, por sus siglas en inglés) durante el desarrollo. En algunos ejemplos, un roedor, como se describe en el presente documento, desarrolla nefritis lúpica durante el desarrollo. En algunos ejemplos, un roedor, como se describe en el presente documento, desarrolla glomerulonefropatía proliferativa. En algunos ejemplos, un roedor, como se describe en el presente documento, desarrolla uno o más fenotipos asociados con lupus eritematoso sistémico (LES) durante el desarrollo. En algunos ejemplos, un roedor, como se describe en el presente documento, desarrolla uno o más fenotipos o síntomas seleccionados del grupo que consiste en valores elevados de autoanticuerpos y citocinas séricas, linfadenopatía, esplenomegalia y expansiones seleccionadas de compartimentos mieloides y linfoides, o una combinación de los mismos. En algunos ejemplos, se observan uno o más fenotipos o síntomas a las 8 semanas. En algunos ejemplos, se observan uno o más fenotipos o síntomas entre aproximadamente 18 semanas y aproximadamente 24 semanas inclusive.

La invención proporciona una neurona motora aislada de roedor cuyo genoma comprende una deleción de la porción codificante del exón 2 a la porción codificante del exón 11 de un locusC9orf72endógeno. En algunos ejemplos, se divulga una célula o tejido aislado de un roedor, como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, una célula o tejido aislado comprende un locusC9ORF72,como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, una célula es una célula neuronal o una célula de un linaje neuronal. En algunos ejemplos, una célula es de un linaje linfoide o mieloide. En algunos ejemplos, una célula se selecciona de un linfocito B, célula dendrítica, macrófago, monocito y un linfocito T. En algunos ejemplos, un tejido se selecciona de adiposo, vejiga, cerebro, mama, médula ósea, ojo, corazón, intestino, riñón, hígado, pulmón, ganglio linfático, músculo, páncreas, plasma, suero, piel, bazo, estómago, timo, testículos, óvulo y una combinación de los mismos.

En algunos ejemplos, se proporciona una línea celular inmortalizada, que se elabora a partir de una célula aislada de un roedor, como se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones, se proporciona una célula madre embrionaria de roedor cuyo genoma comprende un locusC9ORF72o una deleción en un locusC9ORF72como se expone en las reivindicaciones. En algunas realizaciones determinadas, una célula madre embrionaria de roedor es una célula madre embrionaria de ratón y puede ser de una cepa 129, una cepa C57BL o una mezcla de las mismas. En algunas realizaciones determinadas, una célula madre embrionaria de roedor es una célula madre embrionaria de ratón y puede ser una mezcla de las cepas 129 y C57BL.

En algunos ejemplos, se proporciona el uso de una célula madre embrionaria de roedor, como se describe en el presente documento, para crear un roedor modificado genéticamente. En algunos ejemplos determinados, una célula madre embrionaria de roedor es una célula madre embrionaria de ratón y se usa para crear un ratón que comprende un locusC9ORF72,como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos determinados, una célula madre embrionaria de roedor es una célula madre embrionaria de rata y se usa para crear una rata que comprende un locusC9ORF72,como se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones, se proporciona un embrión de roedor que comprende, se crea, se obtiene o se genera a partir de una célula madre embrionaria de roedor que comprende un locusC9ORF72como se expone en las reivindicaciones. En algunas realizaciones determinadas, un embrión de roedor es un embrión de ratón; en algunas realizaciones, un embrión de rata.

En algunos ejemplos, se proporciona el uso de un embrión de roedor, como se describe en el presente documento, para crear un roedor modificado genéticamente. En algunos ejemplos determinados, un embrión de roedor es un embrión de ratón y se usa para crear un ratón que comprende un locusC9ORF72,como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos determinados, un embrión de roedor es un embrión de rata y se usa para crear una rata que comprende un locusC9ORF72,como se describe en el presente documento.

En algunos ejemplos, se proporciona una construcción de ácido nucleico (o construcción de direccionamiento, o vector de direccionamiento) como se describe en el presente documento.

En algunos ejemplos, una construcción de ácido nucleico, como se describe en el presente documento, comprende, de 5' a 3', un brazo de direccionamiento de roedor que comprende un polinucleótido que es homólogo a una porción 5' de un locusC9ORF72de roedor (por ejemplo, tal como un ratón o una rata), un primer sitio de reconocimiento de recombinasa; un primer promotor unido operativamente a un gen de recombinasa, un segundo promotor unido operativamente a un marcador seleccionable, un segundo sitio de reconocimiento de recombinasa, un gen indicador, como se describe en el presente documento, y un brazo de direccionamiento de roedor que comprende un polinucleótido que es homólogo a una porción 3' de un locusC9ORF72de roedor (por ejemplo, tal como un ratón o una rata). En algunos ejemplos, la porción 3' de un locusC9ORF72de roedor incluye una secuencia genómica cadena abajo del codón finalizador en el exón 11 de un genC9ORF72de roedor (por ejemplo, tal como un ratón o una rata). En algunos ejemplos, la porción 5' de un locusC9ORF72incluye una secuencia genómica cadena arriba del codón iniciador en el exón 2 de un genC9ORF72de roedor (por ejemplo, tal como un ratón o una rata). En muchos ejemplos, el primer y segundo sitios de reconocimiento de recombinasa están orientados para dirigir una escisión. En muchos ejemplos, un gen de recombinasa codifica una recombinasa que reconoce el primer y segundo sitios de reconocimiento de recombinasa. En muchos ejemplos, un primer promotor impulsa la expresión del gen de recombinasa en células diferenciadas y no impulsa la expresión del gen de recombinasa en células no diferenciadas. En muchos ejemplos, un primer promotor es transcripcionalmente competente y se regula por el desarrollo.

En algunos ejemplos, los sitios de reconocimiento de recombinasa incluyenloxP, lox511, lox2272, lox2372, lox66, lox71,loxM2,lox5171,FRT, FRT11, FRT71, attp, att, FRT, Dre, rox o una combinación de los mismos. En algunos ejemplos, un gen de recombinasa se selecciona del grupo que consiste en Cre, Flp (por ejemplo, Flpe, Flpo) y Dre. En algunos ejemplos determinados, el primer y segundo sitios de reconocimiento de recombinasa son sitioslox(por ejemplo,loxP),y un gen de recombinasa codifica una recombinasa Cre.

En algunos ejemplos, un primer promotor se selecciona del grupo que consiste en protamina (Prot; por ejemplo, Protl o Prot5), Blimpl, Blimpl (fragmento de 1 kb), Blimpl (fragmento de 2 kb), Gata6, Gata4, Igf2, Lhx2, Lhx5 y Pax3. En algunos ejemplos determinados, un primer promotor se selecciona de un promotor que aparece en la Tabla 2. En algunos ejemplos determinados, un primer promotor es o comprende la SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:7.

En algunos ejemplos, un marcador seleccionable se selecciona del grupo que consiste en neomicina fosfotransferasa (neor), higromicina B fosfotransferasa (hygr), puromicina-N-acetiltransferasa (puror), blasticidina S desaminasa (bst), xantina/guanina fosforribosil transferasa (gpt) y timidina cinasa del virus del herpes simple (HSV-tk).

En algunos ejemplos, un segundo promotor se selecciona del grupo que consiste en un promotor UbC, promotor Ubi, promotor hCMV, promotor mCMV, promotor CAGGS, promotor EF1, promotor pgkl, promotor de beta-actina y un promotor ROSA26. En algunos ejemplos determinados, un marcador seleccionable es neor y un segundo promotor es Ubi.

En algunos ejemplos, se proporciona un método para crear un roedor cuyo genoma comprenda una deleción de la secuencia codificante completa en un locusC9ORF72,comprendiendo el método (a) introducir una secuencia de ácido nucleico en una célula madre embrionaria de roedor de manera que se elimine la secuencia codificante completa en un locusC9ORF72,cuyo ácido nucleico comprende un polinucleótido que es homólogo al locusC9ORF72;(b) obtener una célula madre embrionaria de roedor modificada genéticamente a partir de (a); y (c) crear un roedor usando la célula madre embrionaria de roedor modificada genéticamente de (b). En algunos ejemplos, un método para producir un roedor descrito en el presente documento comprende además una etapa de cría de un roedor generado en (c) de modo que se cree un roedor homocigoto para una deleción.

En algunos ejemplos, una secuencia de ácido nucleico es, comprende o aparece en una construcción de ácido nucleico como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, una secuencia de ácido nucleico comprende uno o más marcadores de selección. En algunos ejemplos, una secuencia de ácido nucleico comprende uno o más sitios de recombinación específicos del sitio. En algunos ejemplos, una secuencia de ácido nucleico comprende un gen de recombinasa y un marcador de selección flanqueado por sitios de reconocimiento de recombinasa, cuyos sitios de reconocimiento de recombinasa están orientados para dirigir una escisión. En algunos ejemplos, una secuencia de ácido nucleico comprende además un gen indicador que se encuentra cadena abajo de un marcador de selección. En algunos ejemplos, una secuencia de ácido nucleico comprende un gen de recombinasa que está unido operativamente a un promotor que impulsa la expresión del gen de recombinasa en células diferenciadas y no impulsa la expresión del gen de recombinasa en células no diferenciadas. En algunos ejemplos, una secuencia de ácido nucleico comprende un gen de recombinasa que está unido operativamente a un promotor que es transcripcionalmente competente y se regula por el desarrollo. En algunos ejemplos, una secuencia de ácido nucleico comprende un gen de recombinasa que está unido operativamente a un promotor que es o comprende la SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:7.

En algunos ejemplos, se proporciona un método para crear un roedor cuyo genoma comprenda una deleción de la secuencia codificante completa en un locusC9ORF72,comprendiendo el método modificar el genoma de un roedor de modo que comprenda una deleción de la secuencia codificante completa en un locusC9ORF72,creando así dicho roedor.

En algunos ejemplos, se proporciona un roedor que se puede obtener, generar o producir a partir de un método como se describe en el presente documento.

En algunos ejemplos, se proporciona un modelo de roedor de esclerosis lateral amiotrófica (ELA) o demencia frontotemporal (DFT), cuyo roedor tiene un genoma que comprende una deleción de la secuencia codificante completa en un locusC9ORF72.

En algunos ejemplos, se proporciona un modelo de roedor de esclerosis lateral amiotrófica (ELA) o demencia frontotemporal (DFT), que se obtiene mediante una deleción de la secuencia codificante completa en un locusC9ORF72,en donde el roedor desarrolla uno o más síntomas de ELA y/o DFT durante el desarrollo.

En algunos ejemplos, se proporciona un modelo de roedor de glomerulonefritis, cuyo roedor tiene un genoma que comprende una deleción de la secuencia codificante completa en un locusC9ORF72.

En algunos ejemplos, se proporciona un modelo de roedor de glomerulonefritis, que se obtiene mediante una deleción de la secuencia codificante completa en un locusC9ORF72,en donde el roedor desarrolla uno o más síntomas de glomerulonefritis durante el desarrollo.

En algunos ejemplos, se proporciona un modelo de roedor de enfermedad linfoproliferativa, cuyo roedor tiene un genoma que comprende una deleción de la secuencia codificante completa en un locusC9ORF72.

En algunos ejemplos, se proporciona un modelo de roedor de enfermedad linfoproliferativa, que se obtiene mediante una deleción de la secuencia codificante completa en un locusC9ORF72,en donde el roedor desarrolla uno o más síntomas de desregulación o disfunción del sistema inmunitario durante el desarrollo.

En algunos ejemplos, se proporciona un método para identificar un candidato terapéutico para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección en un roedor, comprendiendo el método (a) administrar un agente candidato a un roedor cuyo genoma comprende una deleción de la secuencia codificante completa en un locusC9ORF72;(b) realizar uno o más ensayos para determinar si el agente candidato tiene un efecto sobre uno o más signos, síntomas y/o afecciones asociadas con la enfermedad, trastorno o afección; y (c) identificar el agente candidato que tiene un efecto sobre uno o más signos, síntomas y/o afecciones asociadas con la enfermedad, trastorno o afección como candidato terapéutico.

En algunos ejemplos, una enfermedad, trastorno o afección en un roedor es una enfermedad, trastorno o afección neurodegenerativa. En algunos ejemplos, una enfermedad, trastorno o afección en un roedor es una enfermedad, trastorno o afección inflamatoria. En algunos ejemplos, una enfermedad, trastorno o afección en un roedor es una enfermedad, trastorno o afección autoinmunitaria.

En algunos ejemplos, una enfermedad, trastorno o afección en un roedor es el síndrome linfoproliferativo autoinmunitario (ALPS; también conocido como síndrome de Canale-Smith). En algunos ejemplos, el ALPS se caracteriza por un nivel sérico aumentado de IL-10, anticuerpos anti factor reumatoide (anti RF), anticuerpos antinucleares (ANA) o combinaciones de los mismos.

En algunos ejemplos, una enfermedad, trastorno o afección en un roedor es nefritis lúpica. En algunos ejemplos, la nefritis lúpica se caracteriza por proliferación y/o expansión mesangial. En algunos ejemplos, la nefritis lúpica se caracteriza por una o más anomalías tubulares. En algunos ejemplos, una o más anomalías tubulares se seleccionan de dilatación, formación de cilindros, basofilia y combinaciones de las mismas.

En algunos ejemplos, una enfermedad, trastorno o afección en un roedor es lupus eritematoso sistémico (LES). En algunos ejemplos, el LES se caracteriza por uno o más de hiperplasia linfoide, activación de linfocitos T, anticuerpos antinucleares (ANA) séricos elevados e inflamación sistémica que afecta al corazón, pulmones, hígado, piel, articulaciones, sistema nervioso y riñones.

En algunos ejemplos, se proporciona el uso de un roedor, como se describe en el presente documento, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección neurodegenerativa.

En algunos ejemplos, se proporciona el uso de un roedor, como se describe en el presente documento, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección inflamatoria.

En algunos ejemplos, se proporciona el uso de un roedor, como se describe en el presente documento, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección autoinmunitaria.

En algunos ejemplos, se proporciona el uso de un roedor, como se describe en el presente documento, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección linfoproliferativa.

En algunos ejemplos, se proporciona el uso de un roedor, como se describe en el presente documento, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del síndrome linfoproliferativo autoinmunitario (ALPS).

En algunos ejemplos, se proporciona el uso de un roedor, como se describe en el presente documento, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la nefritis lúpica.

En algunos ejemplos, una enfermedad, trastorno o afección neurodegenerativa es esclerosis lateral amiotrófica (ELA). En algunos ejemplos, una enfermedad, trastorno o afección neurodegenerativa es demencia frontotemporal (DFT). En algunos ejemplos, una enfermedad, trastorno o afección inflamatoria es glomerulonefritis. En algunos ejemplos, una enfermedad, trastorno o afección autoinmunitaria es glomerulonefritis, síndrome linfoproliferativo autoinmunitario (ALPS), nefritis lúpica o lupus eritematoso sistémico (LES).

En algunos ejemplos, una enfermedad, trastorno o afección autoinmunitaria, como se describe en el presente documento, se caracteriza por un aumento significativo en la concentración sérica de autoanticuerpos. En algunos ejemplos, una enfermedad, trastorno o afección autoinmunitaria, como se describe en el presente documento, se caracteriza por un aumento significativo en el nivel sérico de una o más citocinas (por ejemplo, IL-10, IL-12, IL-17, TNF-a, etc.).

En algunos ejemplos, una enfermedad, trastorno o afección linfoproliferativa, como se describe en el presente documento, se caracteriza por un aumento significativo en una o más células inmunitarias en uno o más del bazo, médula ósea, uno o más ganglios linfáticos, riñón o sangre. En algunos ejemplos, una enfermedad, trastorno o afección linfoproliferativa, como se describe en el presente documento, se caracteriza por la desregulación de uno o más linfocitos.

En diversas realizaciones, una deleción de la secuencia codificante completa en un locusC9ORF72incluye deleciones como se describe en el presente documento. En diversas realizaciones, un locusC9ORF72de roedor incluye un locusC9ORF72de roedor como se describe en el presente documento. En diversas realizaciones, un locusC9ORF72de roedor es un locusC9orf72murino (por ejemplo, un locusC9orf72de ratón o rata).

En diversos ejemplos, uno o más fenotipos, como se describe en el presente documento, se comparan con una referencia o control. En algunos ejemplos, una referencia o control incluye un roedor que tiene una modificación como se describe en el presente documento, una modificación que es diferente de una modificación como se describe en el presente documento, o ninguna modificación (por ejemplo, un roedor de tipo natural).

La neurona de la invención es una neurona motora aislada de roedor; en algunas realizaciones, una neurona motora de ratón; en algunas realizaciones, una neurona motora de rata.

Como se usa en la presente solicitud, los términos "alrededor de" y "aproximadamente" se usan como equivalentes. Cualquier número usado en la presente solicitud con o sin alrededor de/aproximadamente pretende incluir cualquier fluctuación normal apreciada por un experto en la técnica pertinente.

Otras características, objetos y ventajas de los roedores, las células y los métodos proporcionados en el presente documento son evidentes en la descripción detallada de determinadas realizaciones a continuación.

Breve descripción del dibujo

El dibujo incluido en el presente documento, que está compuesto por las siguientes figuras, tiene fines ilustrativos y no de limitación. El archivo de patente o solicitud contiene al menos un dibujo realizado a color. La oficina proporcionará copias de esta patente o publicación de solicitud de patente con dibujos a color previa solicitud y pago de la tarifa necesaria.

La figura 1A, recuadro superior, muestra una ilustración esquemática, no a escala, de las tres isoformas de transcripción deC9orf72de ratón informadas (V1, V2 y V3) y una estrategia de deleción dirigida para la alteración del locusC9orf72de ratón. Se generó un vector de direccionamiento que incluye un brazo de homología de ratón cadena arriba (o "mHU", que contenía una secuencia genómica cadena arriba y que incluye el codón iniciador en el exón 2 del genC9ORF72de ratón), un gen indicadorlacZ(sin el codón iniciador ATG), un casete de selección de fármacos de autodeleción (que incluye un gen de resistencia a la neomicina y un gen de recombinasaCreunido a un promotor deprotamina1(Prm1)de ratón, flanqueado por sitiosloxP),y un brazo de homología de ratón cadena abajo (o "mHD", que contenía una secuencia genómica 49 pb cadena abajo del codón finalizador del exón 11 del genC9ORF72de ratón). Tras la recombinación homóloga, una región genómica de ratón de aproximadamente 26 kb, que incluía la secuencia codificante deC9orf72para todas las isotermas deC9orf72de ratón previstas (es decir, la secuencia codificante que comienza desde el codón inmediatamente después del codón iniciador ATG en el exón 2 deC9orf72de ratón, a los exones 3-10, los intrones intermedios y 49 pb de la 3' UTR en el exón 11 deC9orf72de ratón), se eliminó; y el gen indicadorlacZ(sin el codón iniciador ATG) se insertó inmediatamente después del codón iniciador ATG endógeno restante deC9orf72de ratón. El locusC9orf72de ratón modificado resultante se representa en la figura 1A, recuadro inferior. Se empleó tecnología de autodeleción para eliminar el casete de neomicina antes del análisis fenotípico, dejando el indicadorlacZy un sitio loxP bajo el control del promotor deC9orf72de ratón. El locusC9orf72de ratón modificado después de que se haya eliminado el casete de neomicina se representa en la figura 1A, recuadro inferior. La secuencia de nucleótidos del locusC9orf72modificado que comienza desde la secuencialacZinsertada hasta el sitio loxP 3' se expone en la SEQ ID NO: 8; y la secuencia de nucleótidos del locusC9orf72modificado que comienza desde el exón 1a hasta la 3' UTR se expone en la SEQ ID NO: 9.

La figura 1B muestra el análisis de expresión TAQMAN® deC9orf72(superior; también conocido como3110043021RIK)y el activador de cinasa MOB 3B(Mob3b;abajo) para ratones de tipo natural (WT),C9orf72+/-(Het) yC9orf72-/-(KO).

Las figuras 2A-2L muestran fenotipos de tipo ELA medidos en ratones de tipo natural (n = 9) yC9orf2-/-(n = 11). Figura 2A: Porcentaje de supervivencia (eje y) en el tiempo (eje x, semanas) de ejemplo; figura 2B: Cambio de peso corporal (eje y, en gramos) en el tiempo (eje x, semanas) de ejemplo; figura 2C: Puntuación media de deterioro motor en el tiempo (eje x, semanas) de ejemplo; figura 2D: Puntuación media de temblor en el tiempo (eje x, semanas) de ejemplo; figura 2E: Puntuación media de rigidez en el tiempo (eje x, semanas) de ejemplo; figura 2F: Tiempo máximo en rotarod (eje y, en segundos) en el tiempo (eje x, semanas) de ejemplo; figura 2G: Conducta locomotora en campo abierto de ejemplo, por ejemplo, inmovilidad (izquierda; eje y, en segundos) y tiempo de exploración vertical (derecha; eje y, en segundos) en el tiempo (eje x, semanas); figura 2H: conducta en pasarela de ejemplo, por ejemplo, longitud media de zancada (superior, izquierda, eje y, centímetros [cm]), coordinación entre extremidades (superior, derecha) presentada como porcentaje del índice de regularidad (eje y) en el tiempo (eje x, semanas), y fase de apoyo (inferior, centro) presentada como parada media (eje y, en segundos) en el tiempo (eje x, semanas); figura 2I: Imágenes de ejemplo de neuronas motoras de ratones de tipo natural (WT, n = 5) yC9orf72r-/(n = 5) de 60 semanas de edad, y recuento de neuronas motoras de ejemplo (inferior, izquierda), área media (en □m2, inferior, centro, p < 0,0001) y área del cuerpo celular (en número de células, inferior, derecha) para ratones de tipo natural (WT) yC9orf72~l~;se midieron 10 neuronas motoras para el área del cuerpo celular por portaobjetos (tres portaobjetos por grupo), la hinchazón indicó hipoxia y daño celular; figura 2J: Porcentaje de supervivencia en el tiempo de ejemplo (superior, izquierda), cambio de peso corporal en gramos (superior, derecha), puntuación media de deterioro motor en el tiempo (inferior, izquierda), puntuación media de temblor en el tiempo (inferior, centro), y puntuación media de rigidez en el tiempo (inferior, derecha) en ratones de tipo natural(C9orf72¥l+;n = 14) yC9orf72- (n= 17) de 32-60 semanas de edad; figura 2K: Tiempo máximo en rotarod en el tiempo (superior, izquierda) de ejemplo, conducta locomotora en campo abierto, por ejemplo, inmovilidad en el tiempo (superior, centro) y tiempo de exploración vertical en el tiempo (superior, derecha), conducta en pasarela, por ejemplo, longitud media de zancada en el tiempo (inferior, izquierda) y coordinación entre extremidades presentada como porcentaje del índice de regularidad en el tiempo (inferior, centro), y distancia total recorrida en el tiempo (inferior, derecha) en ratones de tipo natural(C9orf72¥l+;n = 14) yC9orf72-/-(n = 17) de 32-60 semanas de edad; figura 2L: Puntuación media de deterioro motor en el tiempo (superior, izquierda) de ejemplo, puntuación media de temblor en el tiempo (superior, centro), puntuación media de rigidez en el tiempo (superior, derecha) y fuerza de agarre (en gramos de fuerza) en ratones de tipo natural (C9orf72*l+), heterocigotos(C9orf72+/-)y homocigotos (C9orf72-/-). La significación estadística se determinó mediante la prueba de la t de Student para datos independientes y la prueba de análisis de varianza (ANOVA) unidireccional.

Las figuras 3A-3AL muestran los resultados de inmunofenotipado medidos en ratones de tipo natural (n = >4) y ratones que tienen una alteración en un locusC9orf72(n = >4). Figura 3A: Imágenes de ejemplo de ratones hembra de tipo natural (WT) yC9orf72-/-diseccionados que muestran ganglios linfáticos cervicales agrandados (flechas) en ratonesC9orf72-/-,y peso de los bazos (derecha, en gramos) en ratones hembra de tipo natural (WT),C9orf72+/-(HET) yC9orf72-/-(KO) a las 8 (fila superior) y 18 (fila inferior) semanas; figura 3B: Imágenes de ejemplo de ratones macho de tipo natural (WT) yC9orf72-/-diseccionados que muestran ganglios linfáticos cervicales agrandados (flechas) en ratonesC9orf72-/-,y peso de los bazos (derecha, en gramos) en ratones macho de tipo natural (WT),C9orf72+/-(HET)yC9orf72-/-(KO) a las 9-10 (fila superior) y 18 (fila inferior) semanas; figura 3C: Imágenes de ejemplo de ratonesC9orf72-/-hembra de 37 semanas y macho de 56 semanas que muestran ganglios linfáticos cervicales agrandados (flechas); figura 3D: Imágenes de ejemplo de ratones hembra de 30-35 semanas diseccionados de tipo natural (fila superior) yC9orf72-/-(fila central) que muestran ganglios linfáticos cervicales agrandados (flechas), y peso corporal (en gramos), peso de los bazos (en gramos) y peso del bazo normalizado con respecto al peso corporal (como % del peso corporal) (fila inferior); imagen de ejemplo de bazo diseccionado (inferior, izquierda) de ratones de tipo natural (WT) yC9orf72-/-(-/-); figura 3E: Datos de CBC de ejemplo con diferencial que muestra el recuento total de glóbulos blancos y las poblaciones circulantes de diversos tipos de células inmunes en ratones macho de 34-38 semanas de edad de tipo natural (WT),C9orf72+/-(HET) yC9orf72-/-(KO) (el tipo de célula se indica sobre cada gráfico); figura 3F: Imágenes de ejemplo de tejido seccionado de bazo y ganglio linfático cervical de ratones de tipo natural (WT) yC9orf72-/-a 4x de aumento teñidos con hematoxilina y eosina; figura 3G: Imágenes de ejemplo de tejido seccionado de ganglio linfático cervical de ratonesC9orf72-/-a 60x de aumento teñidos con hematoxilina y eosina (flechas de color azul: células con morfología plasmocitoide; flechas de color amarillo: neutrófilos; flechas de color verde: células de tipo macrófago; flecha de color rojo: célula de Mott); figura 3H: Porcentaje de linfocitos B positivos de ejemplo (CD11b-, CD11c-, CD3-, B220+, CD19+) de bazo, ganglios linfáticos cervicales, médula ósea y sangre en ratones macho de tipo natural de tipo natural (WT) yC9orf72-l~(KO); figura 3I: Células plasmáticas de ejemplo en diversas etapas que expresan antígenos de superficie celular específicos aislados del bazo, ganglios linfáticos cervicales, médula ósea y sangre de ratones macho de tipo natural (WT) yC9orf72rl~(KO) a las 9-10 semanas (barras de color negro), 18 semanas (barras de color gris claro) y 57-60 semanas (barras de color gris oscuro); figura 3J: Células plasmáticas de ejemplo en diversas etapas que expresan antígenos de superficie celular específicos aislados del bazo, ganglios linfáticos cervicales, médula ósea y sangre de ratones hembra de tipo natural (WT) yC9orf72-l~(KO) a las 8 semanas (barras de color negro), 18 semanas (barras de color gris claro) y 30-35 semanas (barras de color gris oscuro); figura 3K: Porcentaje de células mieloides positivas de ejemplo en diversas etapas que expresan antígenos de superficie celular específicos aislados del bazo, ganglios linfáticos cervicales, médula ósea y sangre de ratones macho de tipo natural (WT) yC9orf72-l~(KO) a las 9-10 semanas (barras de color negro), 18 semanas (barras de color gris claro) y 57 60 semanas (barras de color gris oscuro); figura 3L: Porcentaje de células mieloides positivas de ejemplo en diversas etapas que expresan antígenos de superficie celular específicos aislados del bazo, ganglios linfáticos cervicales, médula ósea y sangre de ratones hembra de tipo natural (WT) yC9orf72rl~(KO) a las 8 semanas (barras de color negro), 18 semanas (barras de color gris claro) y 30-35 semanas (barras de color gris oscuro); figura 3M: Porcentaje de células de macrófagos positivas (CD45+, CD11b+, F4I80+, Ly6G') de ejemplo en el bazo, ganglios linfáticos cervicales, médula ósea, riñón y sangre de ratones hembra de 30-35 semanas de tipo natural (WT) yC9orf72~l~;figura 3N: Imágenes de ejemplo de bazo seccionado de ratones de tipo natural (WT) yC9orf72-l~a 4x de aumento teñidos con diversos marcadores (indicados debajo de cada imagen); figura 3O: Imágenes de ejemplo de ganglio linfático cervical seccionado de ratones de tipo natural (WT) yC9orf72~l~a 4x de aumento teñidos con diversos marcadores (indicados debajo de cada imagen; flecha: células teñidas intermitentemente con CD138); figura 3P: Imágenes de ejemplo de bazo y ganglio linfático cervical seccionados de ratones de tipo natural (WT) yC9orf72-l~a 4x y 60x de aumento teñidos con F4l80; figura 3Q: Recuentos celulares totales de ejemplo en el bazo, ganglios linfáticos cervicales, médula ósea y riñón en ratones de tipo natural (WT) yC9orf72rl~.Las células se contaron utilizando un contador de viabilidad celular Cellometer Auto T4 ANTES del análisis FACS. Esto se hizo para calcular el número total de células positivas para los marcadores de superficie de interés además de presentar los datos en porcentaje de células positivas para dichos marcadores. Dado que estos recuentos se realizaron después de la lisis de glóbulos rojos, también son representativos de una enorme infiltración inmunitaria (glóbulos blancos) ya que los recuentos celulares totales aumentaron en ratones nulos en comparación con los de tipo natural; figura 3R: Porcentaje positivo y recuentos celulares de ejemplo de células dendríticas mieloides (izquierda; CD11b+, CD11c+, MHCII+) y linfocitos NK (derecha; NKp46mid, CD49b+) en bazo y médula ósea para ratones de tipo natural (WT) yC9orf72~l~;figura 3S: Porcentaje positivo (fila superior) y recuento celular total (fila inferior) de ejemplo para células CD45+ en diversos tejidos de ratones de tipo natural (WT) yC9orf72rl~;figura 3T: Porcentaje positivo (fila superior) y recuento celular total (fila inferior) de ejemplo para linfocitos T CD8+ en diversos tejidos de ratones de tipo natural (WT) yC9orf72~l~;figura 3U: Porcentaje positivo (fila superior) y recuento celular total (fila inferior) de ejemplo para linfocitos T CD4+ en diversos tejidos de ratones de tipo natural (WT) yC9orf72rl~;figura 3V: Porcentaje positivo (fila superior) y recuento celular total (fila inferior) de ejemplo para linfocitos T CD8+CD44+ en diversos tejidos de ratones de tipo natural (WT) yC9orf72rl~;figura 3W: Porcentaje positivo (fila superior) y recuento celular total (fila inferior) de ejemplo para linfocitos T CD4+CD44+ en diversos tejidos de ratones de tipo natural (WT) yC9orf72~l~;figura 3X: Porcentaje positivo (fila superior) y recuento celular total (fila inferior) de ejemplo para linfocitos T CD8+CD69+ en diversos tejidos de ratones de tipo natural (WT) yC9orf72rl~;figura 3Y: Porcentaje positivo (fila superior) y recuento celular total (fila inferior) de ejemplo para linfocitos T CD4+CD69+ en diversos tejidos de ratones de tipo natural (WT) yC9orf72rl~;figura 3Z: Porcentaje positivo (fila superior) y recuento celular total (fila inferior) de ejemplo para linfocitos T CD8+PD1+ en diversos tejidos de ratones de tipo natural (WT) yC9orf72~l~;figura 3AA: Porcentaje positivo (fila superior) y recuento celular total (fila inferior) de ejemplo para linfocitos T CD4+PD1+ en diversos tejidos de ratones de tipo natural (WT) yC9orf72~l~;figura 3AB: Porcentaje positivo (fila superior) y recuento celular total (fila inferior) de ejemplo para linfocitos T CD4+FoxP3+ en diversos tejidos de ratones de tipo natural (WT) yC9orf72rl~;figura 3AC: Porcentaje positivo (izquierda en cada par) y recuento celular total (derecha en cada par) de ejemplo para poblaciones de linfocitos T CD8+CD62L+ (superior, izquierda), CD4+CD62L+ (inferior, izquierda), CD8+<c>D127+ (superior, derecha) y CD4+CD127+ (inferior, derecha) en brazo de ratones de tipo natural (WT) yC9orf72rl~;figura 3AD: Panel de citocinas de ejemplo que muestra la expresión de diversas citocinas en ratones macho de 18 semanas de edad de tipo natural (WT),C9orf72+l~(Het) yC9orf72~l~(KO) (las citocinas se indican encima de cada gráfico); figura 3AE: Panel de citocinas de ejemplo que muestra la expresión de diversas citocinas en ratones macho de 8-58 semanas de edad de tipo natural (WT),C9orf72+l~(Het) yC9orf72-l~(KO) (las citocinas se indican encima de cada gráfico); figura 3AF: Panel de citocinas de ejemplo que muestra la expresión de diversas citocinas en ratones hembra de 8-38 semanas de edad de tipo natural (WT),C9orf72+l~(Het) yC9orf72rl~(KO) (las citocinas se indican encima de cada gráfico); figura 3AG: Niveles de ejemplo de nitrógeno ureico en sangre (eje y, mgldl), globulina (eje y, gldl) e inmunoglobulina sérica (eje y, IgG, Ulml (izquierda); eje y, IgM, Ulml (derecha)) en ratones de tipo natural (WT),C9orf72+l~yC9orf72-l~(la medición de nitrógeno ureico en sangre y globulina es de ratones macho de 45-56 semanas de edad; la medición del factor reumatoide de IgM e IgG en suero es de ratones macho de 8-58 semanas de edad; se observó un aumento significativo en el RF de IgG e IgM en ratonesC9orf72-l~en todos los puntos temporales a partir de las 8 semanas de edad); figura 3AH: Niveles de ejemplo del factor reumatoide de IgG e IgM en ratones hembra (fila superior) y macho (fila inferior) de tipo natural (WT),C9orf72+l~(Het) yC9orf72-l~(KO); medición sérica en ratones de 810 semanas (machos: 7 WT, 5 Het, 9 KO; hembras: 7 WT, 5 Het, 8 KO), 18 semanas (machos: 9 WT, 6 Het, 13 KO; hembras: 5 WT, 12 Het, 15 KO), 30-41 semanas (machos: 3WT, 4 Het, 4 KO; hembras: 10 WT, 9 Het, 9 KO) y 54-65 semanas (machos: 6WT, 9 Het, 5 KO); figura 3AI: Niveles de ejemplo de IgG e IgM circulantes (en pg/ml, eje y) en ratones hembra (fila superior) y macho (fila inferior) de tipo natural (WT),C9orf72+/-(Het) yC9orf72-/-(KO); figura 3AJ: Niveles de ejemplo de autoanticuerpos circulantes (en U/ml, eje y) en ratones hembra, de 26 34 semanas de vida, (fila superior) y macho, de 26-34 semanas de vida, (fila inferior) de tipo natural (WT),C9orf72+/-(Het)yC9orf72-/-(KO); figura 3AK: Imágenes de ejemplo de riñón (superior) e hígado (inferior) seccionados de ratones de tipo natural (WT) yC9orf72-/-a 100x y 20x de aumento, respectivamente, teñidos con hematoxilina y eosina (H&E) o F4/80 mediante inmunohistoquímica (IHC F4/80); figura 3AL: Imágenes de ejemplo de tejido renal seccionado de ratones de 8-63 semanas de edad de tipo natural (WT) yC9orf72r1-teñido con hematoxilina y eosina (H&E, panel superior), IgG (2.° panel desde arriba), IgM (3.er panel desde arriba) y complemento C3 (panel inferior). La significación estadística se determinó mediante la prueba de la t de Student para datos independientes y la prueba de análisis de varianza (ANOVA) unidireccional.

La figura 4 muestra un porcentaje de ejemplo de neuronas vivas con respecto al control (eje y) en neuronas de tipo natural cultivadas tratadas con diversas concentraciones de toxinas. La parte superior ilustra el diseño experimental como se describe en el Ejemplo 4. DA (ácido domoico; agonista del receptor AMPA/kainato), BMAA (p-metilamino-L-alanina, 100 pM), MK801 (dicocilpina, 10 pM; antagonista del receptor NMDA), NBQX (2,3-dihidroxi-6-nitro-7-sulfamoil-benzoquinoxalina-2,3-diona, 10 pM; antagonista del receptor AMPA/kainato); glutatión (10 pM, antioxidante). La significación estadística se determinó mediante la prueba de la t de Student para datos independientes y la prueba de análisis de varianza (ANOVA) unidireccional, una prueba ANOVA unidireccional. Cox, P.A.et al.,2003, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 100(23): 13380-13383; Murch, S.J.et al.,2004, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 101(33): 12228-12231; Cox, P.A.et al.,2005, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 102(14):5074-5078; Erdner, D.L.et al.,2008, Environmental Health, 7(Supl. 2):S2.

Las figuras 5A-5D muestran la medición de fenotipos de tipo ELA en ratones de tipo natural a los que se les administraron inyecciones i.p. de BMMA (n = 5) o<p>B<s>(control, n = 5). Figura 5A: La parte superior ilustra el diseño experimental y los puntos temporales para el tratamiento, la medición del peso corporal y los estudios de conducta, la parte inferior muestra un cambio del peso corporal (eje y, en gramos) en el tiempo (eje x, semanas) de ejemplo en ratones de control (color negro) y tratados con BMAA (color gris); figura 5B: Tiempo máximo en rotarod (eje y, segundos) en el tiempo (eje x, semanas) de ejemplo en ratones de control (color negro) y tratados con BMAA (color gris); figura 5C: Conducta locomotora en campo abierto de ejemplo, por ejemplo, inmovilidad (izquierda; eje y, en segundos) y tiempo de exploración vertical (derecha; eje y; en segundos) en el tiempo (eje x, semanas) en ratones de control (color negro) y tratados con BMAA (color gris); figura 5D: conducta en pasarela de ejemplo, por ejemplo, longitud media de zancada (superior, izquierda, eje y, centímetros [cm]), coordinación entre extremidades (superior, derecha) presentada como porcentaje del índice de regularidad (eje y) en el tiempo (eje x, semanas), y fase de apoyo (inferior, centro) presentada como parada media (eje y, en segundos) en el tiempo (eje x, semanas) en ratones de control (color negro) y tratados con BMAA (color gris). La significación estadística se determinó mediante la prueba de la t de Student para datos independientes y la prueba de análisis de varianza (ANOVA) unidireccional.

Las figuras 6A-6E muestran la medición de fenotipos de tipo ELA en ratones de tipo natural yC9orf72r/-a los que se les administraron inyecciones i.p. de BMMA (tipo natural con BMAA: 3 machos, 2 hembras; desactivados con BMAA: 3 machos, 3 hembras) o<p>B<s>(control de tipo natural: 4 machos, 1 hembra; control desactivado: 5 machos, 1 hembra). Figura 6A: La parte superior ilustra el diseño experimental y los puntos temporales para el tratamiento, la medición del peso corporal y los estudios de conducta, la parte inferior izquierda muestra el porcentaje de supervivencia (eje y) en el tiempo (eje x, semanas) de ejemplo, la parte inferior derecha muestra el cambio de peso corporal (eje y, en gramos) en el tiempo (eje x, semanas) de ejemplo; figura 6B: La parte superior izquierda muestra la puntuación media de deterioro motor en el tiempo (eje x, semanas) de ejemplo, la parte superior derecha muestra la puntuación media de temblor en el tiempo (eje x, semanas) de ejemplo, la parte inferior muestra la puntuación media de rigidez en el tiempo (eje x, semanas) de ejemplo; figura 6C: Tiempo máximo en rotarod (eje y, segundos) en el tiempo (eje x, semanas) de ejemplo; figura 6D: Conducta locomotora en campo abierto de ejemplo, por ejemplo, inmovilidad (izquierda; eje y, en segundos) y tiempo de exploración vertical (derecha; eje y, en segundos) en el tiempo (eje x, semanas); figura 6E: conducta en pasarela de ejemplo, por ejemplo, longitud media de zancada (superior, izquierda, eje y, centímetros [cm]), coordinación entre extremidades (superior, derecha) presentada como porcentaje del índice de regularidad (eje y) en el tiempo (eje x, semanas), y fase de apoyo (inferior, centro) presentada como parada media (eje y, en segundos) en el tiempo (eje x, semanas). La significación estadística se determinó mediante la prueba de la t de Student para datos independientes y la prueba de análisis de varianza (ANOVA) unidireccional.

La figura 7 muestra la supervivenciain vitro(inferior, izquierda) y el estrés oxidativo (inferior, derecha) de neuronas motoras de tipo natural yC9orf72-/-(desactivadas) tratadas con BMAA. Parte superior, ilustración esquemática del diseño experimental; la supervivencia (inferior, izquierda) se presenta como porcentaje de neuronas vivas con respecto al control de tipo natural (eje y) en neuronas de tipo natural (control) yC9orf72r/~(desactivadas) tratadas con BMAA 100 mM. El estrés oxidativo el día 1 (a la izquierda de la parte inferior derecha) y el día 7 (a la derecha de la parte inferior derecha) se presenta como densidad óptica media de fluorescencia a ~485/520 nm producida por una sonda sensible a ROS, CellROX Green (Life Technologies). La significación estadística se determinó mediante la prueba de la t de Student para datos independientes y la prueba de análisis de varianza (ANOVA) unidireccional.

La figura 8 muestra un ejemplo de supervivencia (superior, izquierda), estrés oxidativo (superior, centro), relación de ADN mitocondrial con respecto a nuclear (superior, derecha) y diversas mediciones de la función mitocondrial (inferior, de izquierda a derecha) en neuronas motoras de tipo natural (WT) yC9orf72rl~.La supervivencia (superior, izquierda) se presenta como número de células como porcentaje con respecto aC9orf72+l+; el estrés oxidativo el día 1 y el día 7 se presenta como especies reactivas de oxígeno (ROS; porcentaje de densidad óptica con respecto aC9orf72+l+);la relación de ADN mitocondrial con respecto a nuclear se presenta como número medio de copias mitocondriales; la respiración mitocondrial se presenta como tasa de consumo de oxígeno calculada como porcentaje con respecto a la 1.a medición deC9orf72+l+;la respiración basal, la producción de ATP, la fuga de protones, la respiración máxima, la capacidad respiratoria de reserva y la respiración no mitocondrial se presentan como tasa de consumo de oxígeno calculada como porcentaje con respecto al control deC9orf72.

Las figuras 9A-9C muestran la glomerulonefropatía progresiva en ratonesC9orf72-l~.La figura 9A muestra gráficos ponderados de la puntuación histopatológica que demuestran que los cambios renales más significativos observados en ratones nulos están asociados con la glomerulonefritis membranoproliferativa. La figura 9B muestra las puntuaciones histopatológicas individuales correspondientes a los gráficos ponderados representados en la figura 9A. Brevemente, las secciones de riñón teñidas con H&E se puntuaron a ciegas para las categorías de nefropatía asociada con glomerulonefropatía inmunomediada: glomerulonefritis membranoproliferativa, inflamación mononuclear intersticial, formación de cilindros hialinos, glomeruloesclerosis y túbulos basófilos. Puntuación de 0 = ningunola, 1 = mínimola, 2 = leve, 3 = moderadola y 4 = grave. Todos los ratones nulos mostraron glomerulonefritis membranoproliferativa mínima a grave con evidencia ocasional de categorías de enfermedad adicionales en animales más gravemente afectados. La figura 9C muestra las mediciones de ACR urinaria ensayadas en los puntos temporales a las 14 semanas (figura 9C, superior) y 24 semanas (figura 9C, inferior) de la misma cohorte de ratones, lo que indica la aparición de albuminuria en ratonesC9orf72rl~con la edad. Los ratones heterocigotos mostraron valores comparables a los WT, lo que es coherente con la ausencia de un fenotipo observado.

La figura 10 demuestra que los linfocitos T foliculares auxiliares (Tfh) (CD4+CXCRS+CD44+ICOS+PD-1+Bcl-6+) aumentaron significativamente en porcentaje y recuento celular total en el bazo, CLN, MLN y sangre deC9orf72rl~. Los gráficos representan la media ± e.e.m. (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 mediante la prueba de la t de Student para datos independientes), hembras de 26 semanas, n = 5 por genotipo. También se observaron linfocitos Tfh elevados en MO deC9orf72-l~que no alcanzaron significación.

Definiciones

Esta invención no se limita a métodos particulares y condiciones experimentales que se describen en el presente documento, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante, ya que el alcance de la presente invención se define por las reivindicaciones.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos y expresiones que se usan en el presente documento incluyen los significados que los términos y las expresiones tienen en la técnica, a menos que se indique claramente lo contrario o sea claramente evidente a partir del contexto en el que se usa el término o expresión. Aunque se puede usar cualquier método y material similar o equivalente a los que se describen en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación, se describen métodos y materiales particulares.

"Administración"incluye la administración de una composición a un sujeto o sistema (por ejemplo, a una célula, órgano, tejido, organismo o componente relevante o conjunto de componentes de los mismos). Los expertos en la técnica apreciarán que la vía de administración puede variar dependiendo, por ejemplo, del sujeto o sistema al que se administra la composición, la naturaleza de la composición, el fin de la administración, etc. Por ejemplo, la administración a un sujeto animal (por ejemplo, a un ser humano o un roedor) puede ser bronquial (incluyendo por instilación bronquial), bucal, entérica, intradérmica, intraarterial, intradérmica, intragástrica, intramedular, intramuscular, intranasal, intraperitoneal, intratecal, intravenosa, intraventricular, mucosa, nasal, oral, rectal, subcutánea, sublingual, tópica, traqueal (incluyendo por instilación intratraqueal), transdérmica, vaginal ylo vítrea. La administración puede implicar una dosificación intermitente. La administración puede implicar una dosificación continua (por ejemplo, perfusión) durante al menos un período de tiempo seleccionado.

"Mejora"incluye la prevención, reducción o paliación de un estado o una mejora en el estado de un sujeto. La mejora incluye, pero no requiere, la recuperación completa o la prevención completa de una enfermedad, trastorno o afección (por ejemplo, lesión por radiación).

"Aproximadamente",según se aplica a uno o más valores de interés, incluye un valor que es similar a un valor de referencia indicado. El término "aproximadamente" o "alrededor de" puede referirse a un intervalo de valores que se encuentran dentro del 25 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o menos en cualquier dirección (superior o inferior) del valor de referencia indicado a menos que se indique lo contrario o sea evidente a partir del contexto (excepto cuando tal número exceda el 100 % de un valor posible).

"Biológicamente activo"incluye una característica de cualquier agente que tenga actividad en un sistema biológico,in vitrooin vivo(por ejemplo, en un organismo). Por ejemplo, un agente que, cuando está presente en un organismo, tiene un efecto biológico dentro de ese organismo, y se considera biológicamente activo. En ejemplos particulares, cuando una proteína o polipéptido es biológicamente activo, una porción de esa proteína o polipéptido que comparte al menos una actividad biológica de la proteína o polipéptido se denomina típicamente porción"biológicamente activa".

"Comparable"incluye dos o más agentes, entidades, situaciones, conjuntos de condiciones, etc., que pueden no ser idénticos entre sí, pero que son lo suficientemente similares para permitir la comparación entre los mismos, de manera que se puedan extraer conclusiones razonablemente basándose en las diferencias o similitudes observadas. Los expertos en la técnica comprenderán, en el contexto, qué grado de identidad se requiere en cualquier circunstancia dada para que dos o más de dichos agentes, entidades, situaciones, conjuntos de condiciones, etc., se consideren comparables.

"Conservadora",cuando se describe una sustitución conservadora de aminoácidos, incluye la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo de aminoácido que tiene un grupo R de cadena lateral con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución conservadora de aminoácidos no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de interés de una proteína, por ejemplo, la capacidad de un receptor para unirse a un ligando. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen: cadenas laterales alifáticas tales como glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; cadenas laterales de hidroxilo alifáticas tales como serina y treonina; cadenas laterales que contienen amida tales como asparagina y glutamina; cadenas laterales aromáticas tales como fenilalanina, tirosina y triptófano; cadenas laterales básicas tales como lisina, arginina e histidina; cadenas laterales ácidas tales como ácido aspártico y ácido glutámico; y cadenas laterales que contienen azufre, tales como cisteína y metionina. Los grupos de sustituciones de aminoácidos conservadoras incluyen, por ejemplo, valina/leucina/isoleucina, fenilalanina/arginina, lisina/arginina, alanina/valina, glutamato/aspartato y asparagina/glutamina. En algunos ejemplos, una sustitución de aminoácidos conservadora puede ser una sustitución de cualquier residuo natural en una proteína con alanina, como se usa en, por ejemplo, mutagénesis por barrido de alanina. En algunos ejemplos, se realiza una sustitución conservadora que tiene un valor positivo en la matriz logarítmica de probabilidades PAM250 divulgada en Gonnet, G.H.et al.,1992, Science 256: 1443-1445. En algunos ejemplos, una sustitución es una sustitución moderadamente conservadora en donde la sustitución tiene un valor no negativo en la matriz logarítmica de probabilidades PAM250.

"Contro!"incluye el significado entendido en la técnica de un"contro!'que es un estándar con el que se comparan los resultados. Típicamente, se usan controles para aumentar la integridad en los experimentos mediante el aislamiento de variables con el fin de llegar a una conclusión sobre dichas variables. Un control puede ser una reacción o ensayo que se realiza simultáneamente con una reacción o ensayo de prueba para proporcionar un elemento de comparación. Un"contro!'también incluye un"animal de contro!'.Un"animal de control"puede tener una modificación como se describe en el presente documento, una modificación que es diferente a la descrita en el presente documento, o ninguna modificación (es decir, un animal de tipo natural). En un experimento, se aplica una"prueba"(es decir, una variable que se está ensayando). En un segundo experimento, el"control",la variable que se ensaya no se aplica. Un control puede ser un control histórico (es decir, de una prueba o ensayo realizado previamente, o una cantidad o resultado que se conoce previamente). Un control puede ser o comprender un registro impreso o guardado de otra manera. Un control puede ser un control positivo o un control negativo.

"Alteración"incluye el resultado de un evento de recombinación homóloga con una molécula de ADN (por ejemplo, con una secuencia homóloga endógena tal como un gen o un locus génico). En algunos ejemplos, una alteración puede lograr o representar una inserción, deleción, sustitución, reemplazo, mutación de aminoácido, o un cambio de marco de una o más secuencias de ADN o cualquier combinación de los mismos. Las inserciones pueden incluir la inserción de genes completos o fragmentos de genes, por ejemplo, exones, que pueden ser de un origen distinto de la secuencia endógena (por ejemplo, una secuencia heteróloga). En algunos ejemplos, una alteración puede aumentar la expresión y/o actividad de un gen o producto génico (por ejemplo, de una proteína codificada por un gen). En algunos ejemplos, una alteración puede disminuir la expresión y/o actividad de un gen o producto génico. En algunos ejemplos, una alteración puede alterar la secuencia de un gen o un producto génico codificado (por ejemplo, una proteína codificada). En algunos ejemplos, una alteración puede truncar o fragmentar un gen o un producto génico codificado (por ejemplo, una proteína codificada). En algunos ejemplos, una alteración puede extender un gen o un producto génico codificado. En algunos ejemplos de este tipo, una alteración puede lograr el ensamblaje de una proteína de fusión. En algunos ejemplos, una alteración puede afectar al nivel, pero no a la actividad, de un gen o producto génico. En algunos ejemplos, una alteración puede afectar a la actividad, pero no al nivel, de un gen o producto génico. En algunos ejemplos, una alteración puede no tener un efecto significativo sobre el nivel de un gen o producto génico. En algunos ejemplos, una alteración puede no tener un efecto significativo sobre la actividad de un gen o producto génico. En algunos ejemplos, una alteración puede no tener un efecto significativo sobre el nivel o la actividad de un gen o producto génico.

"Determinar", "medir", "evaluar", "valorar", "ensayar"y"analizar"incluyen cualquier forma de medición e incluyen determinar si un elemento está presente o no. Estos términos incluyen determinaciones tanto cuantitativas como cualitativas. El ensayo puede ser relativo o absoluto."Ensayar la presencia de"puede ser determinar la cantidad de algo presente y/o determinar si está presente o ausente.

"Locus endógeno"o "genendógeno"incluye un locus genético encontrado en un organismo precursor o de referencia antes de la introducción de una alteración, deleción, reemplazo, alteración o modificación como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el locus endógeno tiene una secuencia que se encuentra en la naturaleza. En algunas realizaciones, el locus endógeno es un locus de tipo natural. En algunas realizaciones, el organismo de referencia es un organismo de tipo natural. En algunas realizaciones, el organismo de referencia es un organismo genomanipulado. En algunas realizaciones, el organismo de referencia es un organismo criado en laboratorio (ya sea de tipo natural o genomanipulado).

"Promotor endógeno"incluye un promotor que está asociado de forma natural, por ejemplo, en un organismo de tipo natural, con un gen endógeno.

"Gen"incluye una secuencia de ADN en un cromosoma que codifica un producto (por ejemplo, un producto de ARN y/o un producto polipeptídico). En algunas realizaciones, un gen incluye una secuencia codificante (es decir, una secuencia que codifica un producto particular). En algunas realizaciones, un gen incluye una secuencia no codificante. En algunas realizaciones particulares, un gen puede incluir tanto una secuencia codificante (por ejemplo, exónica) como no codificante (por ejemplo, intrónica). En algunas realizaciones, un gen puede incluir una o más secuencias reguladoras (por ejemplo, promotores, potenciadores, etc.) y/o secuencias intrónicas que, por ejemplo, pueden controlar o afectar a uno o más aspectos de la expresión génica (por ejemplo, expresión específica del tipo de célula, expresión inducible, etc.). Para mayor claridad, se observa que, como se usa en el presente documento, el término "gen" se refiere generalmente a una porción de un ácido nucleico que codifica un polipéptido; el término puede incluir opcionalmente secuencias reguladoras, como resultará evidente a partir del contexto para los expertos en la técnica. Esta definición no pretende excluir la aplicación del término"gen"a las unidades de expresión que no codifcan proteínas, sino más bien para aclarar que, en la mayoría de los casos, el término, como se usa en el presente documento, se refiere a un ácido nucleico que codifica un polipéptido.

"Heterólogo"incluye un agente o entidad de una fuente diferente. Por ejemplo, cuando se usa en referencia a un polipéptido, gen o producto génico presente en una célula u organismo particular, el término aclara que el polipéptido, gen o producto génico relevante: 1) se genomanipuló por la mano del hombre; 2) se introdujo en la célula u organismo (o un precursor de los mismos) a través de la mano del hombre (por ejemplo, ingeniería genética); y/o 3) no se produjo de forma natural por ni está presente en la célula u organismo relevante (por ejemplo, el tipo de célula u organismo relevante)."Heterólogo"también incluye un polipéptido, gen o producto génico que normalmente está presente en una célula u organismo natural particular, pero que ha sido modificado, por ejemplo, por mutación o colocación bajo el control de elementos reguladores no asociados de forma natural y, en algunas realizaciones, elementos reguladores no endógenos (por ejemplo, un promotor).

"Célula hospedadora"incluye una célula en la que se ha introducido un ácido nucleico o una proteína. Tras la lectura de la presente divulgación, los expertos comprenderán que dichos términos se refieren no solo a la célula en cuestión en particular, sino que también se usan para referirse a la descendencia de tal célula. Debido a que determinadas modificaciones pueden producirse en generaciones sucesivas debido a mutaciones o influencias ambientales, dicha progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula precursora, pero aún así está incluida dentro del alcance de la expresión "célula hospedadora". En algunos ejemplos, una célula hospedadora es o comprende una célula procariota o eucariota. En general, una célula hospedadora es cualquier célula que sea adecuada para recibir y/o producir un ácido nucleico heterólogo o proteína, independientemente del Reino de vida al que esté designada la célula. Las células de ejemplo incluyen las de procariotas y eucariotas (unicelulares o pluricelulares), células bacterias (por ejemplo, cepas deEscherichia coli, Bacillusspp.,Streptomycesspp., etc.), células micobacterianas, células fúngicas, células de levadura (por ejemplo,Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Pichia methanolica,etc.), células vegetales, células de insecto (por ejemplo, SF-9, SF-21, células de insecto infectadas por baculovirus,Trichoplusia ni,etc.), células animales no humanas, células humanas, o fusiones de células tales como, por ejemplo, hibridomas o cuadromas. En algunos ejemplos, la célula es una célula humana, mono, simio, hámster, rata o ratón. En algunos ejemplos, la célula es eucariota y se selecciona de las siguientes células: CHO (por ejemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por ejemplo, COS-7), célula de la retina, Vero, CV1, de riñón (por ejemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (por ejemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidérmica), CV-1, U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, célula de Sertoli, célula BRL 3A, célula HT1080, célula de mieloma, célula tumoral y una línea celular procedente de una célula mencionada anteriormente. En algunos ejemplos, la célula comprende uno o más genes víricos, por ejemplo, una célula de la retina que expresa un gen vírico (por ejemplo, una célula PER.C6®). En algunos ejemplos, una célula hospedadora es o comprende una célula aislada. En algunos ejemplos, una célula hospedadora forma parte de un tejido. En algunos ejemplos, una célula hospedadora forma parte de un organismo.

"Identidad",en relación con una comparación de secuencias, incluye la identidad como se determina por una serie de algoritmos diferentes conocidos en la técnica que se pueden usar para medir la identidad de secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos. En algunos ejemplos, las identidades, como se describen en el presente documento, se determinan usando una alineación ClustalW v. 1.83 (lenta) empleando una penalización por hueco abierto de 10,0, una penalización por extensión de hueco de 0,1, y usando una matriz de similitud de Gonnet (MACVECTOR™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008).

"Mejorar", "aumentar", "eliminar'o "reducir' incluyen valores indicados que son relativos a una medición de referencia, tal como una medición en el mismo individuo (o animal) antes del inicio de un tratamiento descrito en el presente documento, o una medición en un individuo (o animal) de control o en múltiples individuos (o animales) de control en ausencia del tratamiento descrito en el presente documento.

"Aislado"incluye una sustancia y/o entidad (1) que se ha separado de al menos algunos de los componentes a los que estaba asociada cuando se produjo inicialmente (ya sea en la naturaleza y/o en un entorno experimental), y/o (2) que se ha diseñado, producido, preparado y/o fabricado por la mano del hombre. Las sustancias y/o entidades aisladas pueden separarse de aproximadamente el 10%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 91 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 93 %, aproximadamente el 94 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 99 % o más de aproximadamente el 99 % de los demás componentes con los que estaban asociadas inicialmente. En algunas realizaciones, los agentes aislados tienen una pureza de aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 91 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 93 %, aproximadamente el 94 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 99 % o más de aproximadamente el 99 %. Una sustancia puede ser "pura" si carece sustancialmente de otros componentes. Como se entenderá por los expertos en la técnica, una sustancia todavía puede considerarse"aislada"o incluso"pura",después de haberse combinado con otros componentes determinados tales como, por ejemplo, uno o más portadores o excipientes (por ejemplo, tampón, disolvente, agua, etc.); en tales realizaciones, el porcentaje de aislamiento o pureza de la sustancia se calcula sin incluir dichos portadores o excipientes. Por proporcionar un solo ejemplo, un polímero biológico tal como un polipéptido o polinucleótido que se produce en la naturaleza se considera"aislado"cuando: a) en virtud de su origen o fuente de derivación no está asociado con alguno o con ninguno de los componentes que lo acompañan en su estado natural en la naturaleza; b) carece sustancialmente de otros polipéptidos o ácidos nucleicos de la misma especie de la especie que lo produce en la naturaleza; o c) se expresa o está asociado de otro modo con componentes de una célula u otro sistema de expresión que no es de la especie que lo produce en la naturaleza. Por lo tanto, por ejemplo, un polipéptido que se sintetiza químicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente del que lo produce en la naturaleza se considera un polipéptido"aislado".Como alternativa, o adicionalmente, un polipéptido que se ha sometido a una o más técnicas de purificación puede considerarse un polipéptido"aislado"en la medida en que se haya separado de otros componentes: a) con los que está asociado en la naturaleza; y/o b) con los que estaba asociado cuando se produjo inicialmente.

"Locus"incluye una o más ubicaciones específicas de un gen (o secuencia significativa), secuencia de ADN, secuencia que codifica un polipéptido, o posición en un cromosoma del genoma de un organismo. Por ejemplo, un"locusC9ORF72" puede referirse a la ubicación específica de un genC9ORF72,secuencia de ADN deC9ORF72,secuencia codificante deC9ORF72o posiciónC9ORF72en un cromosoma del genoma de un organismo que ha sido identificado en cuanto a dónde reside dicha secuencia. Un locusC9ORF72puede comprender un elemento regulador de un genC9ORF72,incluyendo, pero sin limitación, un potenciador, un promotor, 5' y/o 3' UTR, o una combinación de los mismos. Los expertos en la técnica apreciarán que los cromosomas pueden, en algunas realizaciones, contener cientos o incluso miles de genes y demuestran la localización conjunta física de locus genéticos similares cuando se comparan entre diferentes especies. Dichos locus genéticos se pueden describir como que tienen sintenia compartida.

"Animal no humano"incluye cualquier organismo vertebrado que no sea un ser humano. En algunos ejemplos, un animal no humano es un ciclóstomo, un pez óseo, un pez cartilaginoso (por ejemplo, un tiburón o una raya), un anfibio, un reptil, un mamífero y un ave. En algunos ejemplos, un mamífero no humano es un primate, una cabra, una oveja, un cerdo, un perro o una vaca. La neurona motora de la invención es una neurona motora de roedor, tal como una rata o un ratón.

"Ácido nucleico"incluye cualquier compuesto y/o sustancia que se incorpora o puede incorporarse a una cadena oligonucleotídica. En algunos ejemplos, un"ácido nucleico"es un compuesto y/o sustancia que se incorpora o puede incorporarse en una cadena oligonucleotídica a través de un enlace fosfodiéster. Como resultará evidente por el contexto, en algunos ejemplos,"ácido nucleico"se refiere a residuos de ácido nucleico individuales (por ejemplo, nucleótidos y/o nucleósidos); en algunos ejemplos,"ácido nucleico"se refiere a una cadena oligonucleotídica que comprende residuos de ácido nucleico individuales. En algunos ejemplos, un"ácido nucleico"es o comprende a RN; en algunos ejemplos, un"ácido nucleico"es o comprende ADN. En algunos ejemplos, un"ácido nucleico"es, comprende o consiste en uno o más residuos de ácido nucleico naturales. En algunos ejemplos, un"ácido nucleico"es, comprende, o consiste en uno o más análogos de ácido nucleico. En algunos ejemplos, un análogo de ácido nucleico difiere de un"ácido nucleico"en el sentido de que no utiliza una cadena principal fosfodiéster. Por ejemplo, en algunos casos, un"ácido nucleico"es, comprende o consiste en uno o más"ácidos nucleicos peptídicos",que son conocidos en la técnica y tienen enlaces peptídicos en lugar de enlaces fosfodiéster en la cadena principal, y se consideran dentro del alcance de la presente divulgación. Como alternativa, o adicionalmente, en algunos ejemplos, un"ácido nucleico"tiene uno o más enlaces fosforotioato y/o 5'-N-fosforamidito en lugar de enlaces fosfodiéster. En algunos ejemplos, un"ácido nucleico"es, comprende o consiste en uno o más nucleósidos naturales (por ejemplo, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina y desoxicitidina). En algunos ejemplos, un"ácido nucleico"es, comprende o consiste en uno o más análogos de nucleósidos (por ejemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolopirimidina, 3-metil adenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinilcitidina, C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propiniluridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-desazaadenosina, 7-deazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina, 2-tiocitidina, bases metiladas, bases intercaladas y combinaciones de las mismas). En algunos ejemplos, un"ácido nucleico"comprende uno o más azúcares modificados (por ejemplo, 2'-fluororibosa, ribosa, 2'-desoxirribosa, arabinosa y hexosa) en comparación con los de los ácidos nucleicos naturales. En algunos ejemplos, un"ácido nucleico"tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico funcional tal como un ARN o una proteína. En algunos ejemplos, un"ácido nucleico"incluye uno o más intrones. En algunos ejemplos, un"ácido nucleico"incluye uno o más exones. En algunos ejemplos, un"ácido nucleico"se prepara mediante uno o más aislamientos de una fuente natural, síntesis enzimática por polimerización basada en una plantilla complementaria(in vivooin vitro),reproducción en una célula o sistema recombinante y síntesis química. En algunos ejemplos, un "ácido nucleico" tiene al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 o más residuos de longitud. En algunos ejemplos, un"ácido nucleico"es monocatenario; en algunos ejemplos, un"ácido nucleico"es bicatenario. En algunos ejemplos, un"ácido nucleico"tiene una secuencia de nucleótidos que comprende al menos un elemento que codifica, o es el complemento de una secuencia que codifica, un polipéptido. En algunos ejemplos, un"ácido nucleico"tiene actividad enzimática.

"Unido/a operativamente" incluye una yuxtaposición en donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. Una secuencia de control"unida operativamente"a una secuencia codificante se une de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con las secuencias de control. Las secuencias"unidas operativamente"incluyen tanto secuencias de control de expresión que son contiguas al gen de interés como secuencias de control de expresión que actúan entranso a distancia para controlar el gen de interés. La expresión"secuencia de control de expresión"incluye secuencias polinucleotídicas, que son necesarias para afectar a la expresión y procesamiento de secuencias codificantes a las que están unidas. Las"secuencias de control de expresión"incluyen: secuencias de inicio, terminación, promotoras y potenciadoras de la transcripción apropiadas; señales de procesamiento de ARN eficientes tales como las señales de corte y empalme y de poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplásmico; secuencias que potencian la eficacia de la traducción (es decir, secuencia de consenso Kozak); secuencias que mejoran la estabilidad de las proteínas; y cuando se desee, secuencias que mejoran la secreción de proteínas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedador. Por ejemplo, en procariotas, dichas secuencias de control incluyen generalmente un promotor, un sitio de unión ribosomal y una secuencia de terminación de la transcripción, mientras que en eucariotas, típicamente tales secuencias de control incluyen promotores y secuencias de terminación de la transcripción. La expresión"secuencias de control"pretende incluir componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias compañeras de fusión.

"Fenotipo"incluye un rasgo, o una clase o conjunto de rasgos mostrados por una célula u organismo. En algunos ejemplos, un fenotipo particular puede correlacionarse con un alelo o genotipo particular. En algunos ejemplos, un fenotipo puede ser discreto; en algunos ejemplos, un fenotipo puede ser continuo.

"Condiciones fisiológicas"incluye su significado entendido en la técnica que hace referencia a las condiciones en la que las células u organismos viven y/o se reproducen. En algunos ejemplos, el término incluye condiciones del medio externo o interno que pueden producirse en la naturaleza para un organismo o sistema celular. En algunos ejemplos, las condiciones fisiológicas son las condiciones presentes en el cuerpo de un animal humano o no humano, especialmente las condiciones presentes en y/o dentro de un sitio quirúrgico. Las condiciones fisiológicas típicamente incluyen, por ejemplo, un intervalo de temperatura de 20-40 °C, presión atmosférica de 1, pH de 6-8, concentración de glucosa de 1-20 mM, concentración de oxígeno a niveles atmosféricos, y una gravedad como la que se encuentra en la tierra. En algunos ejemplos, las condiciones en un laboratorio se manipulan y/o se mantienen en condiciones fisiológicas. En algunos ejemplos, las condiciones fisiológicas se encuentran en un organismo.

"Polipéptido"incluye cualquier cadena polimérica de aminoácidos. En algunos ejemplos, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que se produce en la naturaleza. En algunos ejemplos, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que no se produce en la naturaleza. En algunos ejemplos, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que contiene porciones que se producen en la naturaleza por separado unas de otras (es decir, de dos o más organismos diferentes, por ejemplo, porciones humanas y no humanas). En algunos ejemplos, un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que está genomanipulada en el sentido de diseñada y/o producida mediante la acción de la mano del hombre.

"Prevenir'o"prevención"en relación con la aparición de una enfermedad, trastorno y/o afección, incluye reducir el riesgo de desarrollar la enfermedad, trastorno y/o afección y/o retrasar la aparición de una o más características o síntomas de la enfermedad, trastorno o afección. La prevención puede considerarse completa cuando la aparición de una enfermedad, trastorno o afección se ha retrasado durante un período de tiempo predefinido.

"Referencia"incluye un agente, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor estándar o de control contra el que se compara un agente, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de interés. En algunos ejemplos, un agente, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de referencia se ensaya y/o se determina de manera sustancialmente simultánea con la prueba o determinación del agente, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de interés. En algunos ejemplos, un agente, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de referencia es una referencia histórica, opcionalmente incorporada en un medio tangible. En algunos ejemplos, una referencia puede referirse a un control. Una"referencia"también incluye un"animal de referencia".Un"animal de referencia"puede tener una modificación como se describe en el presente documento, una modificación que es diferente a la descrita en el presente documento o ninguna modificación (es decir, un animal de tipo natural). Típicamente, como entenderán los expertos en la técnica, un agente, animal, cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de referencia se determina o se caracteriza en condiciones comparables a las usadas para determinar o caracterizar el agente, animal (por ejemplo, un mamífero), cohorte, individuo, población, muestra, secuencia o valor de interés.

"Respuesta"incluye cualquier alteración beneficiosa en la afección de un sujeto que se produce como resultado de o se correlaciona con el tratamiento. Dicha alteración puede incluir la estabilización de la afección (por ejemplo, la prevención del deterioro que habría tenido lugar en ausencia del tratamiento), la mejora de los síntomas de la afección y/o la mejora en las perspectivas de curación de la afección, etc. Puede referirse a la respuesta de un sujeto o a la respuesta de una neurona. La respuesta de una neurona o del sujeto puede medirse de acuerdo con una amplia diversidad de criterios, incluidos los criterios clínicos y los criterios objetivos. El examen del sistema motor de un sujeto puede incluir el examen de uno o más de fuerza, reflejos tendinosos, reflejos superficiales, masa muscular, coordinación, tono muscular, movimientos anómalos, postura y marcha. Las técnicas para evaluar la respuesta incluyen, pero sin limitación, examen clínico, reflejo de estiramiento y flexión (reflejo miotático), reflejo de Hoffmann y/o pruebas de presión. Los métodos y las directrices para evaluar la respuesta al tratamiento se analizan en Brodal, A.: Neurological Anatomy in Relation to Clinical Medicine, ed. 2, Nueva York, Oxford University Press, 1969; Medical Council of the U.K.: Aids to the Examination of the Peripheral Nervous System, Palo Alto, Calif., Pendragon House, 1978; Monrad-Krohn, G.H., Refsum, S.: The Clinical Examination of the Nervous System, ed. 12, Londres, H.K. Lewis & Co., 1964; y Wolf, J.K.: Segmental Neurology, A Guide to the Examination and Interpretation of Sensory and Motor Function, Baltimore, University Park Press, 1981. Los criterios de respuesta exactos se pueden seleccionar de cualquier manera apropiada, siempre que al comparar grupos de neuronas y/o pacientes, los grupos que se van a comparar se evalúen en función de los mismos criterios o de criterios comparables para determinar la tasa de respuesta. Un experto en la materia podrá seleccionar los criterios apropiados.

"Riesgo",como se entenderá a partir del contexto, de una enfermedad, trastorno y/o afección comprende la probabilidad de que un individuo en particular desarrolle una enfermedad, trastorno y/o afección (por ejemplo, una lesión por radiación). En algunos ejemplos, el riesgo se expresa como porcentaje. En algunos ejemplos, el riesgo es del 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y hasta el 100 %. En algunos ejemplos, el riesgo se expresa como un riesgo relativo a un riesgo asociado con una muestra de referencia o un grupo de muestras de referencia. En algunos ejemplos, una muestra de referencia o un grupo de muestras de referencia tienen un riesgo conocido de una enfermedad, trastorno, afección y/o evento (por ejemplo, una lesión por radiación). En algunos ejemplos, una muestra de referencia o un grupo de muestras de referencia son de individuos comparables con un individuo en particular. En algunos ejemplos, el riesgo relativo es de 0,1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más.

"Sustancialmente"incluye la condición cualitativa de exhibir una extensión o grado total o casi total de una característica o propiedad de interés. Un experto en la técnica biológica comprenderá que los fenómenos biológicos y químicos rara vez, o nunca, llegan a completarse y/o transcurren hasta completarse o consiguen o evitan un resultado absoluto. Por lo tanto, el término"sustancialmente"se usa en el presente documento para capturar la posible carencia de completitud inherente a muchos fenómenos biológicos y químicos.

"Homología sustancial'incluye una comparación entre secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos. Como se apreciará por los expertos en la técnica, generalmente se considera que dos secuencias son"sustancialmente homólogas"si contienen residuos homólogos en las posiciones correspondientes. Los residuos homólogos pueden ser residuos idénticos. Como alternativa, los residuos homólogos pueden ser restos no idénticos con características estructurales y/o funcionales apropiadamente similares. Por ejemplo, como se conoce bien por los expertos en la técnica, determinados aminoácidos se clasifican típicamente como aminoácidos"hidrófobos"o"hidrófilos",y/o que tienen cadenas laterales"polares"o"no polares".La sustitución de un aminoácido por otro del mismo tipo con frecuencia puede considerarse una sustitución"homóloga".A continuación se resumen las categorizaciones típicas de aminoácidos.

Alanina Ala A No polar Neutro 1,8

Arginina Arg R Polar Positivo -4,5

Asparagina Asn N Polar Neutro -3,5

Ácido aspártico Asp D Polar Negativo -3,5

Cisteína Cys C No polar Neutro 2,5

Ácido glutámico Glu E Polar Negativo -3,5

Glutamina Gln Q Polar Neutro -3,5

Glicina Gly G No polar Neutro -0,4

Histidina His H Polar Positivo -3,2

Isoleucina Ile I No polar Neutro 4,5

Leucina Leu L No polar Neutro 3,8

Lisina Lys K Polar Positivo -3,9

Metionina Met M No polar Neutro 1,9

Fenilalanina Phe F No polar Neutro 2,8

Prolina Pro P No polar Neutro -1,6

Serina Ser S Polar Neutro -0,8

Treonina Thr T Polar Neutro -0,7

Triptófano Trp W No polar Neutro -0,9

Tirosina Tyr Y Polar Neutro -1,3

Valina Val V No polar Neutro 4,2

Aminoácidos ambiguos 3 letras 1 letra

Asparagina o ácido aspártico Asx B

Glutamina o ácido glutámico Glx Z

Leucina o isoleucina Xle J

Aminoácido no especificado o desconocido Xaa X

Como se conoce bien en la técnica, las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos pueden compararse usando cualquiera de una diversidad de algoritmos, incluidos los disponibles en programas informáticos comerciales tales como BLASTN para secuencias nucleotídicas y BLASTP, gapped BLAST y PSI-BLAST para secuencias de aminoácidos. Se describen programas de ejemplo de este tipo en Altschul, S. F.et al.,1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403 410; Altschul, S. F.et al.,1997, Methods in Enzymology; Altschul, S. F.et al.,1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402; Baxevanis, A.D. y B. F. F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; y Miseneret al.(eds.) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1998. Además de identificar secuencias homólogas, los programas mencionados anteriormente típicamente proporcionan una indicación del grado de homología. En algunos ejemplos, se considera que dos secuencias son sustancialmente homólogas si al menos el 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de sus residuos correspondientes son homólogos en un tramo de residuos relevante. En algunos ejemplos, el tramo relevante es una secuencia completa. En algunos ejemplos, el tramo relevante tiene al menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o más residuos. En algunos ejemplos, el tramo relevante incluye residuos contiguos a lo largo de una secuencia completa. En algunos ejemplos, el tramo relevante incluye residuos discontinuos a lo largo de una secuencia completa, por ejemplo, residuos no contiguos reunidos por la conformación plegada de un polipéptido o una porción del mismo. En algunos ejemplos, el tramo relevante tiene al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más residuos.

"Identidad sustancial'incluye una comparación entre secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos. Como se apreciará por los expertos en la técnica, generalmente se considera que dos secuencias son''sustancialmente idénticas"si contienen residuos idénticos en posiciones correspondientes. Como se conoce bien en la técnica, las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos pueden compararse usando cualquiera de una diversidad de algoritmos, incluidos los disponibles en programas informáticos comerciales tales como BLASTN para secuencias nucleotídicas y BLASTP, gapped BLAST y PSI-BLAST para secuencias de aminoácidos. Se describen programas de ejemplo de este tipo en Altschul, S.F.et al.,1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul, S.F.et al.,1997, Methods in Enzymology; Altschul, S.F.et al.,1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402; Baxevanis, A.D. y B.F.F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; y Miseneret al.(eds.) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1998. Además de identificar secuencias idénticas, los programas mencionados anteriormente típicamente proporcionan una indicación del grado de identidad. En algunos ejemplos, se considera que dos secuencias son sustancialmente idénticas si al menos el 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de sus residuos correspondientes son idénticos en un tramo de residuos relevante. En algunos ejemplos, el tramo relevante es una secuencia completa. En algunos ejemplos, el tramo relevante tiene al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más residuos.

"Vector de direccionamiento"o"construcción de direccionamiento"incluye una molécula polinucleotídica que comprende una región de direccionamiento. Una región de direccionamiento comprende una secuencia que es idéntica o sustancialmente idéntica a una secuencia en una célula diana, tejido o animal diana y permite la integración de la construcción de direccionamiento en una posición dentro del genoma de la célula, tejido o animal mediante recombinación homóloga. También se incluyen las regiones de direccionamiento que se dirigen usando sitios de reconocimiento de recombinasa específicos del sitio (por ejemplo, sitiosloxPo Frt). En algunos ejemplos, una construcción de direccionamiento, como se describe en el presente documento, comprende además una secuencia de ácido nucleico o gen (por ejemplo, un gen indicador o gen homólogo o heterólogo) de particular interés, un marcador seleccionable, secuencias de control y/o reguladoras, y otras secuencias de ácido nucleico que codifican una recombinasa o proteína recombinogénica. Una construcción de direccionamiento puede comprender un gen de interés en su totalidad o en parte, en donde el gen de interés codifica un polipéptido, en su totalidad o en parte, que tiene una función similar a la de una proteína codificada por una secuencia endógena. Una construcción de direccionamiento puede comprender un gen humanizado de interés, en su totalidad o en parte, en donde el gen humanizado de interés codifica un polipéptido, en su totalidad o en parte, que tiene una función similar a la de un polipéptido codificado por una secuencia endógena. Una construcción de direccionamiento puede comprender un gen indicador, en su totalidad o en parte, en donde el gen indicador codifica un polipéptido que se identifica y/o se mide fácilmente usando técnicas conocidas en la técnica.

"Animal transgénico", "animal transgénico no humano"o "Tg+" incluyen cualquier animal no humano de origen no natural en el que una o más de las células del animal no humano contienen un ácido nucleico y/o un gen heterólogos que codifican un polipéptido de interés, en su totalidad o en parte. En algunos ejemplos, se introduce un ácido nucleico y/o gen heterólogo en la célula, directa o indirectamente mediante introducción en una célula precursora, mediante manipulación genética deliberada, tal como por microinyección o por infección con un virus recombinante. La expresión manipulación genética no incluye las técnicas clásicas de reproducción, sino que está dirigida a la introducción de una o más moléculas de ADN recombinante. Esta molécula puede estar integrada dentro de un cromosoma, o puede ser un ADN que se replica extracromosómicamente. El término "Tg+" incluye animales que son heterocigotos u homocigotos para un ácido nucleico y/o gen heterólogos, y/o animales que tienen copias únicas o múltiples de un ácido nucleico y/o gen heterólogos.

"Tratamiento", "Tratar'o"Que trata"incluye cualquier administración de una sustancia (por ejemplo, un candidato terapéutico) que, de forma parcial o total, alivia, mejora, mitiga, inhibe, retrasa la aparición de, reduce la gravedad y/o reduce la incidencia de uno o más síntomas, características y/o causas de una enfermedad, trastorno y/o afección particular. En algunos ejemplos, dicho tratamiento puede administrarse a un sujeto que no exhibe signos de la enfermedad, trastorno y/o afección pertinente y/o de un sujeto que presente solo signos precoces de la enfermedad, trastorno y/o afección. Como alternativa, o adicionalmente, en algunos ejemplos, el tratamiento puede administrarse a un sujeto que exhibe uno o más signos establecidos de la enfermedad, trastorno y/o afección pertinente. En algunos ejemplos, el tratamiento puede ser de un sujeto al que se le ha diagnosticado que padece la enfermedad, trastorno y/o afección pertinente. En algunos ejemplos, el tratamiento puede ser de un sujeto que se sabe que tiene uno o más factores de susceptibilidad que están estadísticamente correlacionados con un mayor riesgo de desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección pertinente.

"Variante"incluye una entidad que muestra una identidad estructural significativa con una entidad de referencia, pero difiere estructuralmente de la entidad de referencia en la presencia o nivel de uno o más restos químicos en comparación con la entidad de referencia. Una"variante"también puede diferir funcionalmente de su entidad de referencia. En general, que una entidad particular se considere apropiadamente como una"variante"de una entidad de referencia se basa en su grado de identidad estructural con la entidad de referencia. Como se apreciará por los expertos en la técnica, cualquier entidad de referencia biológica o química tiene determinados elementos estructurales característicos. Una"variante",por definición, es una entidad química distinta que comparte uno o más de estos elementos estructurales característicos. Por proporcionar algunos ejemplos, una molécula pequeña puede tener un elemento estructural central característico (por ejemplo, un núcleo de macrociclo) y/o uno o más restos colgantes característicos de manera que una variante de la molécula pequeña sea una que comparte el elemento estructural central y los restos colgantes característicos pero difiere en otros restos colgantes y/o en tipos de enlaces presentes (sencillos frente a dobles,Efrente aZ,etc.) dentro del núcleo, un polipéptido puede tener un elemento de secuencia característico compuesto por una pluralidad de aminoácidos que tienen posiciones designadas entre sí en el espacio lineal o tridimensional y/o que contribuyen a una función biológica particular, un ácido nucleico puede tener un elemento de secuencia característico compuesto por una pluralidad de residuos de nucleótidos que tienen posiciones designadas con respecto a otro en un espacio lineal o tridimensional. Por ejemplo, un"polipéptido variante"puede diferir de un polipéptido de referencia como resultado de una o más diferencias en la secuencia de aminoácidos y/o una o más diferencias en los restos químicos (por ejemplo, hidratos de carbono, lípidos, etc.) unidos covalentemente a la cadena principal polipeptídica. En algunos ejemplos, un"polipéptido variante"muestra una identidad de secuencia general con un polipéptido de referencia que es al menos el 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % o el 99 %. Como alternativa, o adicionalmente, en algunos ejemplos, un"polipéptido variante"no comparte al menos un elemento de secuencia característico con un polipéptido de referencia. En algunos ejemplos, el polipéptido de referencia tiene una o más actividades biológicas. En algunos ejemplos, un"polipéptido variante"comparte una o más de las actividades biológicas del polipéptido de referencia. En algunos ejemplos, un"polipéptido variante"carece de una o más de las actividades biológicas del polipéptido de referencia. En algunos ejemplos, un"polipéptido variante"muestra un nivel reducido de una o más actividades biológicas en comparación con el polipéptido de referencia. En muchos ejemplos, un polipéptido de interés se considera una "variante" de un polipéptido precursor o de referencia si el polipéptido de interés tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la del precursor, pero con una pequeña cantidad de alteraciones de secuencia en posiciones particulares. Típicamente, menos del 20 %, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3% o del 2% de los residuos de la variante están sustituidos en comparación con el precursor. En algunos ejemplos, una"variante"tiene 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos sustituidos en comparación con un precursor. Con frecuencia, una"variante"tiene una cantidad muy pequeña (por ejemplo, menos de 5, 4, 3, 2 o 1) de residuos funcionales sustituidos (es decir, residuos que participan en una actividad biológica particular). Además, una"variante"típicamente no tiene más de 5, 4, 3, 2 o 1 adiciones o deleciones, y a menudo no tiene adiciones o deleciones, en comparación con el precursor. Por otra parte, cualquier adición o deleción es típicamente inferiores a aproximadamente 25, aproximadamente 20, aproximadamente 19, aproximadamente 18, aproximadamente 17, aproximadamente 16, aproximadamente 15, aproximadamente 14, aproximadamente 13, aproximadamente 10, aproximadamente 9, aproximadamente 8, aproximadamente 7, aproximadamente 6, y comúnmente es inferior a aproximadamente 5, aproximadamente 4, aproximadamente 3 o aproximadamente 2 residuos. En algunos ejemplos, el polipéptido precursor o de referencia es uno que se encuentra en la naturaleza. Como se entenderá por los expertos en la técnica, una pluralidad de variantes de un polipéptido de interés particular pueden encontrarse comúnmente en la naturaleza, particularmente cuando el polipéptido de interés es un polipéptido de agente infeccioso.

"Vector'incluye una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que está asociado. En algunos ejemplos, los vectores son capaces de realizar la replicación y/o expresión extracromosómica de los ácidos nucleicos a los que están unidos en una célula hospedadora, tal como una célula eucariota y/o procariota. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes unidos operativamente se denominan en el presente documento"vectores de expresión".

"Tipo natural" incluye una entidad que tiene una estructura y/o actividad como la que se encuentra en la naturaleza en un estado o contexto"norma!'(en contraste con mutante, enferma, alterada, etc.). Los expertos en la técnica apreciarán que los genes y polipéptidos de tipo natural a menudo existen en múltiples formas diferentes (por ejemplo, alelos).

Descripción detallada de determinadas realizaciones

Se divulgan roedores que tienen una alteración en un locusC9ORF72.En particular, los roedores descritos en el presente documento tienen una deleción de una secuencia codificante completa en un locusC9ORF72,es decir, una deleción de un segmento genómico que codifica todas las isoformas deC9ORF72(por ejemplo, una deleción de la porción codificante del exón 2 a la porción codificante del exón 11 de la isoforma V1). Los roedores, como se describen en el presente documento, muestran pérdida de peso y anomalías motoras de tipo ELA, tales como, por ejemplo, inactividad motora y deterioro de la marcha. Además, los roedores descritos en el presente documento muestran esplenomegalia y/o linfadenopatía aproximadamente a las ocho (8) semanas de edad. Además, los roedores descritos en el presente documento muestran glomerulonefritis aproximadamente a las 35 semanas de edad. Por lo tanto, los roedores divulgados son particularmente útiles para el desarrollo e identificación de candidatos terapéuticos para el tratamiento y/o mejora de enfermedades, trastornos y afecciones neurodegenerativas y, en algunas realizaciones, enfermedades, trastornos y afecciones autoinmunitarias y/o inflamatorias. En particular, los roedores descritos en el presente documento abarcan la introducción de un gen indicador en un locusC9ORF72endógeno que da como resultado la expresión del gen indicador (es decir, un polipéptido indicador) en los sistemas nervioso e inmunitario del roedor. Dichos roedores transgénicos proporcionan una fuente de células para determinar la eficacia de los candidatos terapéuticos para mejorar la ELA y/o la DFT. Además, dichos roedores transgénicos proporcionan un sistema modelo animal útil para el desarrollo de agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones neurodegenerativas, autoinmunitarias y/o inflamatorias.

En algunos ejemplos, los roedores descritos en el presente documento desarrollan una enfermedad de tipo ELA y/o DFT debido a la ausencia, falta o disminución del nivel deC9ORF72(por ejemplo, ARN, polipéptido, etc.) en las células de los roedores. En algunos ejemplos, los roedores descritos en el presente documento desarrollan glomerulonefritis debido a la ausencia, falta o disminución del nivel deC9ORF72(por ejemplo, ARN, polipéptido, etc.). En algunos ejemplos, los roedores descritos en el presente documento son heterocigotos para una alteración en un locusC9ORF72como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, los roedores descritos en el presente documento son homocigotos para una alteración en un locusC9ORF72como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, los roedores, como se describen en el presente documento, comprenden un gen indicador, en su totalidad o en parte, en donde dicho gen indicador está unido operativamente a un promotor deC9ORF72. En algunas realizaciones, los promotores deC9ORF72incluyen promotores deC9ORF72endógenos.

La presente divulgación proporciona un análisis fenotípico completo de una línea de roedor con ablación global deC9orf72y el descubrimiento de una función única paraC9orf72en la homeostasis del sistema inmunitario. La presente divulgación demuestra específicamente que una ablación completa deC9orf72dio como resultado anomalías de la marcha y una indicación de debilidad de las extremidades traseras que sugiere la posible aparición de patología de la neurona motora inferior a partir de aproximadamente las 40 semanas de edad. Como se describe en el presente documento, el fenotipo inmunitario exhibido por los roedoresC9orf72r/~consistió en expansiones seleccionadas tanto en los compartimentos mieloides como linfoides, con una mayor activación de los linfocitos T y un aumento de las células plasmáticas. La neutrofilia y la monocitosis dieron como resultado infiltrados mixtos en los órganos inmunitarios que se expandieron, pero no destruyeron la arquitectura básica. Los roedoresC9orf72r/~demostraron niveles séricos elevados de citocinas (por ejemplo, IL-12) y firmas de ARN tisular compatibles con la regulación positiva mieloide. La nefropatía con cambios patológicos adjuntos, tales como, por ejemplo, engrosamiento de la membrana basal y formación de cilindros, estaba presente en la mayoría de los roedores aproximadamente a las 35 semanas de edad. A nivel microscópico, los glomérulos se tiñeron intensamente con anticuerpos IgG e IgM y complemento C3 en un patrón que indicó la deposición de complejos inmunitarios. También se describe en el presente documento que los roedoresC9orf72r/~demostraron un alto valor de autoanticuerpos, incluyendo anti RF, ANA, anti Sm y anti cardiolipina, lo que indicó que la pérdida de la expresión deC9orf72altera profundamente la homeostasis inmunitaria. Ninguna de las características fenotípicas relacionadas con el sistema inmunitario se observó en roedores de tipo natural oC9orf72+l~(heterocigotos). Por lo tanto, en el presente documento se divulga, entre otras cosas, la creación de un sistemain vivomejorado para el desarrollo de nuevas terapias y/o la identificación de nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento de diversas enfermedades, trastornos o afecciones que no se pueden lograr mediante el uso de sistemasin vivoestablecidos debido, en parte, a la inexistencia de fenotipos particulares en dichos sistemas establecidos.

En las siguientes secciones se describen en detalle diversos aspectos de la invención. El uso de secciones no pretende limitar la invención. Cada sección puede aplicarse a cualquier aspecto de la invención. En la presente solicitud, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario.

C9ORF72

La esclerosis lateral amiotrófica (ELA), también conocida como enfermedad de Lou Gehrig, es el trastorno paralítico de inicio en la edad adulta más frecuente, caracterizado por la pérdida de neuronas motoras superiores y/o inferiores. La ELA se presenta en hasta 20.000 personas en los Estados Unidos y cada año se producen aproximadamente 5.000 casos nuevos. La demencia frontotemporal (DFT), originalmente conocida como enfermedad de Pick en honor al médico Arnold Pick, es un grupo de trastornos causados por la degeneración celular progresiva en los lóbulos frontales o temporales del cerebro. Se informa que la DFT representa entre el 10-15 % de todos los casos de demencia. La expansión de la repetición de hexanucleótidos de GGGGCC entre dos exones no codificantes deC9ORF72se ha vinculado tanto con la ELA como con la DFT (DeJesus-Hemandez, M.et al.,2011, Neuron 72:245-256; Renton, A.E.et al.,2011, Neuron 72:257-268; Majounie, E.et al.,2012, Lancet Neurol. 11:323-330; Waite, A.J.et al.,2014, Neurobiol. Aging 35:1779.e5-1779.e13). Sin embargo, el mecanismo a través del cual dichas mutaciones repetidas causan una enfermedad, ya sea a través de una pérdida o ganancia de función de toxicidad, sigue sin estar claro. Por ejemplo, los peces cebra con una expresión reducida de C9ORF72 a partir de una reducción o desactivación dirigidas muestran axonopatía y déficits en la función locomotora (Ciura, S.et al.,2013, Ann. Neurol. 74(42): 180-187), mientras que los ratones con una expresión reducida de C9ORF72 no muestran ninguna característica conductual o patológica asociada con la enfermedad de ELA (Lagier-Tourenne, C.et al.,2013, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. E4530-E4539). Además, los ratones con inserción génica que se han generado para contener 66 expansiones de repeticiones deC9ORF72exhiben focos de ARN y agregados de proteínas dipeptídicas en sus neuronas. Estos ratones mostraron pérdida de neuronas corticales y mostraron déficits conductuales y motores a los 6 meses de edad (Chew, J.et al.,2015, Science, 14 de mayo. Pii:aaa9344).

Se han informado muchos aspectos patológicos relacionados con las expansiones de repeticiones de hexanucleótidos de GGGGCC enC9ORF72, tales como, por ejemplo, la formación dependiente de la longitud de repetición de focos de ARN, el secuestro de proteínas de unión a ARN específicas y la acumulación y agregación de proteínas de repetición de dipéptidos (por ejemplo, revisado en Stepto, A.et al.,2014, Acta Neuropathol. 127:377-389; véanse también Almeida, S.et al.,2013, Acta Neuropathol. 126:385-399; Bieniek, K.F.et al.,2014, JAMA Neurol. 71(6): 775 781; van Blitterswijk, M.et al.,2014, Mol. Neurodegen. 9:38, 10 páginas). Aunque se ha informado que C9ORF72 regula el tráfico endosómico (Farg, M.A.et al.,2014, Human Mol. Gen. 23(13):3579-3595), gran parte de la función celular de C9ORF72 sigue siendo desconocida. De hecho,C9ORF72es un gen que codifica una proteína no caracterizada con una función desconocida. A pesar de la falta de comprensión que rodea aC9ORF72, se han desarrollado varios modelos animales, incluidas líneas celulares genomanipuladas, para ELA y/o DFT (Roberson, E.D., 2012, Ann. Neurol. 72(6):837-849; Panda, S.K.et al.,2013, Genetics 195:703-715; Suzuki, N.et al.,2013, Nature Neurosci. 16(12):1725-1728; Xu, Z.et al.,2013, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 110(19):7778-7783; Hukema, R.K.et al.,2014, Acta Neuropathol. Comm. 2:166, 4 páginas). Por ejemplo, se han producido ratones transgénicos que tienen una inserción del genlacZque reemplazó los exones 2-6 deC9orf72 (311004O21Rik)mediante esfuerzos de direccionamiento génico genes del Knockout Mouse Project (véase las figura 1d de Suzuki, N.et al.,2013, anteriormente; para KOMP, véase Skarnes, W.C.et al.,2011, Nature 474(7351):337-342). Se observó tinción de X-gal en el cerebro, la médula espinal, los testículos y los centros germinales del bazo en estos ratones, sin embargo, no en el músculo (tibial anterior), corazón, pulmón, hígado y riñón. Sin embargo, no está claro si los exones restantes no eliminados (es decir, 7-11) producen alguna expresión y, en consecuencia, función. Otro informe que usó una cepa de ratón transgénico que contenía 80 repeticiones de GGGGCC unidas operativamente con un indicador fluorescente y controladas por un elemento sensible a la tetraciclina sin ninguna secuenciaC9orf72circundante demostró inclusiones citoplasmáticas neuronales similares a las observadas en pacientes con ELA-DFT, lo que sugiere que la expansión de repeticiones en sí misma puede ser responsable de la enfermedad (Hukema, R.K.et al.,2014, Acta Neuropathol. Comm. 2:166, 4 páginas). Estos ratones han sido útiles para establecer un perfil de expresión inicial deC9orf72en células del SNC y proporcionar cierta comprensión del mecanismo de acción asociado con la expansión de repeticiones; sin embargo, sigue sin estar claro si el diseño específico de estas construcciones en estos ratones indica funciones específicas que se pueden atribuir con seguridad aC9orf72o son resultado de algo más, no relacionado con la función deC9orf72.

En algunos casos, sin embargo, el diseño de la construcción puede influir en el fenotipo del animal transgénico resultante (véase, por ejemplo, Muller, U., 1999, Mech. Develop. 81:3-21). Debido a que los ratones con alteración deC9orf72como se han descrito anteriormente usaron un vector de direccionamiento con un casete de selección impulsado por promotor (véase la figura 1d de Suzuki, N.et al.,2013, anteriormente; figura 1 de Skarnes, W.C.et al.,2011, anteriormente), no está claro si el patrón de expresión mostrado se correlaciona correctamente con la expresión normal deC9ORF72.De hecho, no se ha determinado la expresión de los exones restantes 7-11 impulsados por el promotor asociado al casete de selección o el propio promotor deC9ORF72.Como resultado, los fenotipos, y quizás la expresión de C9ORF72 a través delacZ,observados en dichos ratones pueden modificarse o distorsionarse de otro modo debido a aspectos del vector de direccionamiento. Además, se diseñó una cepa de ratón transgénico que contenía una repetición de GGGGCC inducible (Hukema, 2014, anteriormente) sin una secuencia flanqueante humana, presumiblemente debido al hecho de que se pensaba que dicha secuencia circundante afectaba a la traducción de secuencias de repetición. Por lo tanto, dichos sistemasin vivoque aprovechan la biología mediada por C9ORF72 para aplicaciones terapéuticas están incompletos.

Como se describe en el presente documento, la presente divulgación describe específicamente un modelo de roedor para ELA y/o DFT, cuyo roedor comprende una alteración en un locusC9ORF72.En particular, la presente divulgación describe específicamente un modelo de roedor para ELA y/o DFT, en donde el roedor comprende una deleción de la secuencia codificante completa para todas las isoformas deC9orf72(por ejemplo, la porción codificante del exón 2 a la porción codificante del exón 11 de V1) de un genC9orf72mediante la inserción de un gen indicadorlacZ.El vector de direccionamiento empleado por los presentes inventores fue diseñado para contener un casete de selección de fármacos de autodeleción (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE. UU. N.° 8.697.851, 8.518.392 y 8.354.389), que permite la eliminación del casete de selección de fármacos de una manera dependiente del desarrollo, eliminando así cualquier posibilidad de efectos del promotor o expresión aberrante de los exones restantes o efectos del propio casete de selección. Como se describe en el presente documento, los presentes inventores lograron la ablación completa deC9orf72.Además, los presentes inventores midieron las conductas motoras de estos roedores usando ensayos de rotarod, de campo abierto y pasarela hasta las 60 semanas de edad y los déficits neurológicos durante el mismo período. Sin desear quedar ligados a ninguna teoría en particular, la presente divulgación demuestra que solo el 40 % de los roedores con desactivación deC9orf72sobrevivieron más allá de las 60 semanas de edad y los roedores dejaron de ganar peso corporal a partir de aproximadamente 40 semanas de edad. Si bien las pruebas de rotarod no mostraron cambios significativos debido a la deleción deC9orf72,los roedores descritos en el presente documento mostraron paresia significativa de las extremidades traseras, deterioro motor, disminución de la movilidad y anomalías en la marcha aproximadamente a las 50 semanas de edad. Además, la presente divulgación demuestra específicamente que el silenciamiento genético deC9orf72murino da como resultado múltiples anomalías motoras y neurológicas similares a las encontradas en las enfermedades de las neuronas motoras humanas. Por lo tanto, los roedores descritos en el presente documento proporcionan, al menos en algunos ejemplos, sistemasin vivomejorados para el desarrollo de candidatos terapéuticos para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas tales como, por ejemplo, ELA y/o DFT. Además, los roedores descritos en el presente documento superan los déficits en los modelos animales existentes caracterizados por una deleción subóptima deC9orf72para el desarrollo de terapias dirigidas a C9orf72.

Secuencias de C9ORF72

Se han informado variantes de transcripción deC9ORF72de ratón en la técnica (por ejemplo, Kopperset al.,Ann Neurol (2015); 78: 426-438; Atkinsonet al.,Acta Neuropathologica Communications (2015) 3: 59), y también se representan en la figura 1A. La información genómica de las tres variantes de transcripción deC9ORF72de ratón notificadas también está disponible en el sitio web de Ensembl bajo las designaciones de ENSMUST00000108127 (V1), ENSMUST00000108126 (V2) y ENSMUST00000084724 (V3). En la Tabla 1 se exponen secuencias de ARNm y aminoácidos deC9ORF72no humanas (por ejemplo, de roedor) de ejemplo. Para las secuencias de ARNm, la fuente en negrita contenida entre paréntesis indica la secuencia codificante y los exones consecutivos, cuando se indica, están separados por letras mayúsculas y minúsculas alternadas. Para las secuencias de aminoácidos, las secuencias de polipéptidos maduros, cuando se indica, están en negrita.

Se conocen en la técnica variantes de transcripción deC9ORF72humanas. Una variante de transcripción deC9ORF72humana carece de múltiples exones en las regiones codificantes central y 3', y su exón en el extremo 3' se extiende más allá de un sitio de corte y empalme que se usa en la variante 3 (véase a continuación), lo que da como resultado una región no traducida 3' (UTR) novedosa en comparación con la variante 3. Esta variante codifica un polipéptido significativamente más corto y su aminoácido en el extremo C es distinto en comparación con el que está codificado por otras dos variantes. Las secuencias de ARNm y aminoácidos de esta variante se pueden encontrar con los números de acceso de GenBank NM_145005.6 y NP_659442.2, respectivamente. Una segunda variante de transcripción deC9ORF72humana (2) difiere en la región no traducida (UTR) 5' en comparación con la variante 3. Las secuencias de ARNm y aminoácidos de esta variante se pueden encontrar con los números de acceso de GenBank NM_018325.4 y NP_060795.1, respectivamente. Una tercera variante de transcripción deC9ORF72humana (3) contiene la secuencia más larga entre las tres variantes informadas y codifica la isoforma más larga. Las secuencias de ARNm y aminoácidos de esta variante se pueden encontrar con los números de acceso de GenBank NM_001256054.2 y n P_001242983.1, respectivamente. Las variantes 2 y 3 codifican la misma proteína.

_____________________________________________ TABLA 1______________________________________________ARNm de C9orf72 de Mus musculus (NM 001081343; SEQ ID NO:1)

gtgtccggggcggggcggtcccggggcggggcccggagcgggctgcggttgcggtccctgcgccggcggtgaaggcgc agcagcggcgagtggCTATTGCAAGCGTTCGGATAATGTGAGACCTGGAATGCAGTGAGACCTGGGATGCAGGG(ATGTCGACTATCTGCCCCCCACCATCTCCTGCT GTTGCCAAGACAGAGATTGCTTTAAGTGGTGAATCACCCTTGTTGGCGG CTACCTTT GCTT ACTGGGATA ATATTCTT GGTCCT AGAGT AAGGC ATATT TGGGCTCCAAAGACAGACCAAGTGCTTCTCAGTGATGGAGAAATAACTT TTCTTGCCAACCACACTCTAAATGGAGAAATTCTTCGAAATGCAGAGAG TGGGGCTATAGATGTAAAATTTTTTGTCTTATCTCAAAAAGGGGTAATTA TTGTTTCATTAATCTTCGACGGAAACTGGAATGGAGATCGGAGCACTTA TGGACTATCAATTATACTGCCGCAGACAGAGCTGAGCTTCTACCTCCCA CTTCACAGAGTGTGTGTTGACAGGCTAACACACATTATTCGAAAAGGAA GAAT ATG G A TGCAT A AG gaaagacaagaaaatgtccagaaaattgtcttggaaggcacagagaggat ggaagatcagGGTCAGAGTATCATTCCCATGCTTACTGGGGAAGTCATTCCTG TAATGGAGCTGCTTGCATCTATGAAATCCCACAGTGTTCCTGAAGACAT TGATatagctgatacagtgctcaatgatgatgacattggtgacagctgtcacgaaggctttcttctcaaTGCCAT CAGCTCACACCTGCAGACCTGTGGCTGTTCCGTTGTAGTTGGCAGCAGT GCAGAGAAAGTAAATAAGatagtaagaacgctgtgcctttttctgacaccagcagagaggaaatgctc caggctgtgtgaagcagaatcgtcctttaagtacgaatcgggactctttgtgcaaggcttgctaaagGATGCAAC AGGCAGTTTTGTCCTACCCTTCCGGCAAGTTATGTATGCCCCGTACCCC ACCACGCACATTGATGTGGATGTCAACACTGTCAAGCAGATGCCACCGT GTCATGAACATATTTATAATCAACGCAGATACATGAGGTCAGAGCTGAC AGCCTTCTGGAGGGCAACTTCAGAAGAGGACATGGCGCAGGACACCAT CAT CTACACAGATGAGAGCTT CACTCCTG ATTT gaatattttccaagatgtcttacacaga gacactctagtgaaagccttcctggatcagGTCTTCCATTTGAAGCCTCGCCTGTCTCTCA GG AGTACTTTCCTTGCAC AGTTC CTCCTCATTCTTCACAGAAAAGCCTT G ACACTAATCAAGTACATCGAGGATGATACgcagaaggggaaaaagccctttaagtctcttc ggaacctgaagatagatcttgatttaacagcagagggcgatcttaacataataatggctctagctgagaaaattaagcc aggcctacactctttcatctttgggagacctttctacactagtgtacaagaacgtgatgttctaatgaccttttga)ccgtgt___________________________________________(continuación)_____________________________________ ggtttgctgtgtctgtctcttcacagtcacacctgctgttacagtgtctcagcagtgtgtgggcacatccttcctcccgagtcctgct gcaggacagggtacactacacttgtcagtagaagtctgtacctgatgtcaggtgcatcgttacagtgaatgactcttcctagaata gatgtactcttttagggccttatgtttacaattatcctaagtactattgctgtcttttaaagatatgaatgatggaatatacacttgaccat aactgctgattggttttttgttttgttttgtttgttttcttggaaacttatgattcctggtttacatgtaccacactgaaaccctcgttagcttt acagataaagtgtgagttgacttcctgcccctctgtgttctgtggtatgtccgattacttctgccacagctaaacattagagcatttaa agtttgcagttcctcagaaaggaacttagtctgactacagattagttcttgagagaagacactgatagggcagagctgtaggtga aatcagttgttagcccttcctttatagacgtagtccttcagattcggtctgtacagaaatgccgaggggtcatgcatgggccctgag tatcgtgacctgtgacaagttttttgttggtttattgtagttctgtcaaagaaagtggcatttgtttttataattgttgccaacttttaaggtt aattttcattatttttgagccgaattaaaatgcgcacctcctgtgcctttcccaatcttggaaaatataatttcttggcagagggtcaga tttcagggcccagtcactttcatctgaccaccctttgcacggctgccgtgtgcctggcttagattagaagtccttgttaagtatgtca gagtacattcgctgataagatctttgaagagcagggaagcgtcttgcctctttcctttggtttctgcctgtactctggtgtttcccgtgt cacctgcatcataggaacagcagagaaatctgacccagtgctatttttctaggtgctactatggcaaactcaagtggtctgtttctgt tcctgtaacgttcgactatctcgctagctgtgaagtactgattagtggagttctgtgcaacagcagtgtaggagtatacacaaacac aaatatgtgtttctatttaaaactgtggacttagcataaaaagggagaatatatttattttttacaaaagggataaaaatgggccccgt tcctcacccaccagatttagcgagaaaaagctttctattctgaaaggtcacggtggctttggcattacaaatcagaacaacacaca ctgaccatgatggcttgtgaactaactgcaaggcactccgtcatggtaagcgagtaggtcccacctcctagtgtgccgctcattg ctttacacagtagaatcttatttgagtgctaattgttgtctttgctgctttactgtgttgttatagaaaatgtaagctgtacagtgaataag ttattgaagcatgtgtaaacactgttatatatcttttctcctagatggggaattttgaataaaatacctttgaaattctgtgtAminoácido de C9orf72 de Mus musculus (NM_001081343; SEQ ID NO: 2)

M STICPPPSPAVAKTEIALSGESPLLAATFAYW DNILGPRVRHIW APKTDQV LLSDGEITFLANHTLNGEILRNAESGAIDVKFFVLSEKGVI1VSLIFDGNW NG DRSTYGLSIILPQTELSFYLPLHRVCVDRLTHIIRKGRIW M HKERQENVQKI VLEGTERM EDQGQSIIPM LTGEVIPVM ELLASM KSHSVPEDIDIADTVLNDD DIGDSCHEGFLLNAISSHLQTCGCSVVVGSSAEKVNKIVRTLCLFLTPAERK CSRLCEAESSFKYESGLFVQGLLKDATGSFVLPFRQVM YAPYPTTHIDVDVN TVKQM PPCHEHIYNQRRYM RSELTAFW RATSEEDM AQDTI1YTDESFTPDL NIFQDVLHRDTLVKAFLDQVFHLKPGLSLRSTFLAQFLLILHRKALTLIKYIEDDTQKGKKPFKSLRNLKIDLDLTAEGDLNIIMALAEKIKPGLHSFIFGRPFYTSVQ ERDVLMTF

ARNm de C9orf72 de Rattus norvegicus (NM 001007702; SEQ ID NO: 3)

__________________________________________ (continuación)_____________________________________ CGTTTGTAGTGTCAGCCATCCCAATTGCCTGTTCCTTCTCTGTGGGAGTGGTG TCT AG AC AGTCC AGGC AGGGT AT GCT AGGC AGGT GC GTTTTGGTT GC CTC AG ATCGCAACTTGACTCCATAACGGTGACCAAAGACAAAAGAAGGAAACCAGA TTAAAAAGAACCGGACACAGACCCCTGCAGAATCTGGAGCGGCCGTGGTTG GGGGCGGGGCTACGACGGGGCGGACTCGGGGGCGTGGGAGGGCGGGGCCG GGGCGGGGC C C GG AGC C GGC T GC GGTT GC GGTC C CT GCGC C GGC GGT G A AG GCGC AGCGGC GGCG AGT GGCT ATTGC A AGCGTTT GG ATA AT GT GAG ACCTGGGATGCAGGG(ATGTCGACTATCTGCCCCCCACCATCTCCTGCTGTTGCCA AGACAGAGATTGCTTTAAGTGGTGAATCACCCTTGTTGGCGGCTACCTT TGCTTACTGGGATAATATTCTTGGTCCTAGAGTAAGGCACATTTGGGCT CCAAAGACAGACCAAGTACTCCTCAGTGATGGAGAAATCACTTTTCTTG CCAACCACACTCTGAATGGAGAAATTCTTCGGAATGCGGAGAGTGGGGC AATAGATGTAAAGTTTTTTGTCTTATCTGAAAAGGGCGTCATTATTGTTT CATTAATCTTCGACGGGAACTGGAACGGAGATCGGAGCACTTACGGACT ATCAATTATACTGCCGCAGACGGAGCTGAGTTTCTACCTCCCACTGCAC AGAGTGTGTGTTGACAGGCTAACGCACATCATTCGAAAAGGAAGGATAT GGATGCACAAGGAAAGACAAGAAAATGTCCAGAAAATTGTCTTGGAAGG CACCGAGAGGATGGAAGATCAGGGTCAGAGTATCATCCCTATGCTTACT GGGGAGGTCATCCCTGTGATGGAGCTGCTTGCGTCTATGAGATCACACA GTGTTCCTGAAGACCTCGATATAGCTGATACAGTACTCAATGATGATGA CATTGGTGACAGCTGTCATGAAGGCTTTCTTCTCAATGCCATCAGCTCA CATCTGCAGACCTGCGGCTGTTCTGTGGTGGTAGGCAGCAGTGCAGAGA AAGTAAATAAGATAGTAAGAACACTGTGCCTTTTTCTGACACCAGCAGA GAGGAAGTGCTCCAGGCTGTGTGAAGCCGAATCGTCCTTTAAATACGAA TCTGGACTCTTTGTACAAGGCTTGCTAAAGGATGCGACTGGCAGTTTTG TACTACCTTTCCGGCAAGTTATGTATGCCCCTTATCCCACCACACACATC GATGTGGATGTCAACACTGTCAAGCAGATGCCACCGTGTCATGAACATA TTTATAATCAACGCAGATACATGAGGTCAGAGCTGACAGCCTTCTGGAGGGCAACTTCAGAAGAGGACATGGCTCAGGACACCATCATCTACACAGAT GAGAGCTTCACTCCTGATTTGAATATTTTCCAAGATGTCTTACACAGAGA CACTCTAGTGAAAGCCTTTCTGGATCAGGTCTTCCATTTGAAGCCTGGC CTGTCTCTCAGGAGTACTTTCCTTGCACAGTTCCTCCTCATTCTTCACAG AAAAGCCTTGACACTAATCAAGTACATAGAGGATGACACGCAGAAGGGG AAAAAGCCCTTTAAGTCTCTTCGGAACCTGAAGATAGATCTTGATTTAAC AGCAGAGGGCGACCTTAACATAATAATGGCTCTAGCTGAGAAAATTAAG CCAGGCCTACACTCTTTCATCTTCGGGAGACCTTTCTACACTAGTGTCCA AGAACGTGATGTTCTAATGACTTTTTAA)ACATGTGGTTTGCTCCGTGTGTC TCATGACAGTCACACTTGCTGTTACAGTGTCTCAGCGCTTTGGACACATCCTT CCTCCAGGGTCCTGCCGCAGGACACGTTACACTACACTTGTCAGTAGAGGTC TGTACCAGATGTCAGGTACATCGTTGTAGTGAATGTCTCTTTTCCTAGACTAG AT GT ACCCTCGT AGGG ACTT ATGTTT AC A ACCCTCCT AAGT ACT AGTGCTGTC TT GT AAGG AT ACGA AT GAAGGGAT GT A AACTTC ACC AC A ACTGCTGGTTGGT TTTGTTGTTTTTGTTTTTTGAAACTTATAATTCATGGTTTACATGCATCACACT GAAACCCT AGTT AGCTTTTT AC AGGT AAGCT GTGAGTT GACTGCCTGTCCCTG TGTTCTCTGGCCTGTACGATCTGTGGCGTGTAGGATCACTTTTGCAACAACTA AAAACTAAAGCACTTTGTTTGCAGTTCTACAGAAAGCAACTTAGTCTGTCTG C AG ATTCGTTTTT GA A AG A AG AC ATGAGA A AGCGG AGTTTT AGGT GA AGTC A GTTGTTGGATCTTCCTTTATAGACTTAGTCCTTTAGATGTGGTCTGTATAGAC ATGCCCAACCATCATGCATGGGCACTGAATATCGTGAACTGTGGTATGCTTT TT GTT GGTTT ATT GT ACTTCTGTC AAAG AA AGT GGC ATTGGTTTTT AT AATTG TTGCCAAGTTTTAAGGTTAATTTTCATTATTTTTGAGCCAAATTAAAATGTGC ACCTCCTGTGCCTTTCCCAATCTTGGAAAATATAATTTCTTGGCAGAAGGTCA GATTTCAGGGCCCAGTCACTTTCGTCTGACTTCCCTTTGCACAGTCCGCCATG GGCC T GGC TT AG A AGTTC TT GT A A AC T ATGC C AG AG AGT AC ATT C GC T G AT A AAATCTTCTTTGCAGAGCAGGAGAGCTTCTTGCCTCTTTCCTTTCATTTCTGC C T GG AC TTT GGT GTTCTCCACGTTCCCTGCATCCT A AGG AC AGC AGG AG A AC TCTGACCCCAGTGCTATTTCTCTAGGTGCTATTGTGGCAAACTCAAGCGGTCC GTCTCTGTCCCTGTAACGTTCGTACCTTGCTGGCTGTGAAGTACTGACTGGTA AAGCTCCGTGCTACAGCAGTGTAGGGTATACACAAACACAAGTAAGTGTTTT ATTTA AA ACTGT GGACTT AGC AT A A A AAGGG AGACT AT ATTT ATTTTTT ACA AAAGGGATAAAAATGGAACCCTTTCCTCACCCACCAGATTTAGTCAGAAAAA AACATTCTATTCTGAAAGGTCACAGTGGTTTTGACATGACACATCAGAACAA CGCACACTGTCCATGATGGCTTATGAACTCCAAGTCACTCCATCATGGTAAA TGGGTAGATCCCTCCTTCTAGTGTGCCACACCATTGCTTCCCACAGTAGAATC TT ATTT AAGT GCT AAGT GTT GTCTCTGC T GGTTT AC TCTGTTGTTTT AG AG A AT GT AAGTTGT AT AGT G A AT A AGTT ATT G A AGC AT GT GT A A AC ACT GTT AT ACA TCTTTTCTCCTAGATGGGGAATTTGGAATAAAATACCTTTAAAATTCAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAA

___________________________________________ (continuación)___________________________________________Aminoácido de C9orf72 de Rattus norvegicus (NP_001007703; SEQ ID NO: 4)

MSTICPPPSPAVAKTEIALSGESPLLAATFAYWDNILGPRVRHIWAPKTDQVLLS

DGEITFLANHTLNGEILRNAESGAIDVKFFVLSEKGVIIVSLIFDGNWNGDRSTYG

LSIILPQTELSFYLPLHRVCVDRLTHIIRKGRIWMHKERQENVQKIVLEGTERMED

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GDLNIIMALAEKIKPGLHSFIFGRPFYTSVQERDVLMTF

Vectores de direccionamiento de C9ORF72 y producción de animales no humanos que tienen una alteración en un locus C9ORF72

En el presente documento se divulgan vectores de direccionamiento o construcciones de direccionamiento para la producción de roedores que tienen una alteración en un locusC9ORF72como se describe en el presente documento.

Se pueden usar secuencias de ADN para preparar vectores de direccionamiento para animales desactivados (por ejemplo, unC9ORF72KO). Típicamente, una molécula polinucleotídica (por ejemplo, un ácido nucleico de inserción) que codifica un gen indicador y/o un marcador seleccionable se inserta en un vector, preferentemente un vector de ADN, para replicar la molécula polinucleotídica en una célula hospedadora adecuada.

Una molécula polinucleotídica (o ácido nucleico de inserción) comprende un segmento de ADN que se desea integrar en un locus diana. En algunos ejemplos, un ácido nucleico de inserción comprende uno o más polinucleótidos de interés. En algunos ejemplos, un ácido nucleico de inserción comprende uno o más casetes de expresión. En algunos ejemplos determinados, un casete de expresión comprende un polinucleótido de interés, un polinucleótido que codifica un marcador de selección y/o un gen indicador junto con, en algunos ejemplos determinados, diversos componentes reguladores que influyen en la expresión. Prácticamente cualquier polinucleótido de interés puede estar contenido dentro de un ácido nucleico de inserción y, por lo tanto, integrado en un locus genómico diana. Los métodos divulgados en el presente documento proporcionan al menos 1,2, 3, 4, 5, 6 o más polinucleótidos de interés a integrar en un locus genómicoC9ORF72diana.

En algunos ejemplos, un polinucleótido de interés contenido en un ácido nucleico de inserción codifica un indicador. En algunos ejemplos, un polinucleótido de interés codifica un marcador seleccionable.

En algunos ejemplos, un polinucleótido de interés está flanqueado por o comprende sitios de recombinación específicos del sitio (por ejemplo, loxP, Frt, etc.). En algunas realizaciones determinadas, los sitios de recombinación específicos del sitio flanquean un segmento de ADN que codifica un indicador y/o un segmento de ADN que codifica un marcador seleccionable. En el presente documento se describen polinucleótidos de interés de ejemplo, incluyendo marcadores de selección y genes indicadores que se pueden incluir en los ácidos nucleicos de inserción.

Se conocen en la técnica diversos métodos empleados en la preparación de plásmidos, construcciones de ADN y/o vectores de direccionamiento y transformación de organismos hospedadores. Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procariotas como para células eucariotas, así como procedimientos recombinantes generales, véanse Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.a Ed., ed. de Sambrook, J.et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989.

Como se ha descrito anteriormente, en la Tabla 1 se proporcionan secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos deC9ORF72no humanos (por ejemplo, de roedor) de ejemplo para su uso en la construcción de vectores de direccionamiento para animales desactivados. También se pueden encontrar otras secuencias deC9ORF72no humanas en la base de datos GenBank. Los vectores de direccionamiento deC9ORF72pueden comprender secuencias de ADN que codifican un gen indicador y/o un marcador seleccionable, flanqueados por secuencias que son idénticas o sustancialmente homólogas a las secuencias flanqueantes de una región diana (también denominadas "brazos de homología") para su inserción en el genoma de un roedor transgénico. Por proporcionar un solo ejemplo, un punto de inicio de deleción puede establecerse cadena arriba (5') de un primer exón, un primer exón codificante, o el primer o segundo codones, para permitir que un ácido nucleico insertado se una operativamente a una secuencia reguladora endógena (por ejemplo, un promotor). La figura 1A ilustra una estrategia de direccionamiento para realizar una deleción dirigida de la secuencia codificante completa de un genC9orf72murino y el reemplazo con un casete que contiene una secuencia de un genlacZque codifica p-galactosidasa y un casete de selección de fármacos (Neo) que codifica neomicina fosfotransferasa para la selección de colonias de células madre embrionarias (ES) resistentes a G418. El vector de direccionamiento también incluye una secuencia que codifica una recombinasa (por ejemplo, Cre) regulada por un miARN específico de células ES o un promotor específico de células germinales (por ejemplo, promotor de protamina 1; Prot-Cre-SV40). El casete de selección de fármacos y las secuencias codificantes de recombinasa Cre están flanqueados por sitios de reconocimiento de la recombinasaloxP(LP) que permiten la escisión mediada por Cre del casete de selección de fármacos de una manera dependiente del desarrollo, por ejemplo, la progenie procedente de roedores cuyas células germinales que contienen el genC9orf72alterado descrito anteriormente desprenderán el marcador seleccionable (Neo) durante el desarrollo (véanse las Patentes de EE. UU. N.° 8.697.851, 8.518.392, 8.354.389, 8.946.505 y 8.946.504). Esto permite, entre otras cosas, la escisión automática del casete de selección de células diferenciadas o de células germinales. Por lo tanto, antes del análisis fenotípico, se elimina el casete de selección de fármacos, dejando solo el gen indicadorlacZunido operativamente al promotorC9orf72murino.

Como se describe en el presente documento, la alteración de un locusC9orf72puede comprender un reemplazo o una inserción/adición al locusC9orf72o una porción del mismo con un ácido nucleico de inserción. Un ácido nucleico de inserción puede comprender un gen indicador. Un gen indicador puede estar posicionado en un enlace operativo con un promotor deC9orf72endógeno. Tal modificación permite la expresión de un gen indicador impulsado por un promotor deC9orf72endógeno. Como alternativa, un gen indicador no está colocado en un enlace operativo con un promotor deC9orf72endógeno.

Se puede usar una diversidad de genes indicadores (o restos detectables) en los vectores de direccionamiento descritos en el presente documento. Los genes indicadores de ejemplo incluyen, por ejemplo, p-galactosidasa (genlacZcodificado), proteína verde fluorescente (GFP), proteína verde fluorescente mejorada (eGFp), MmGFP, proteína azul fluorescente (BFP), proteína azul fluorescente mejorada (eBFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, proteína amarilla fluorescente (YFP), proteína amarilla fluorescente mejorada (eYFP), Emerald, CyPet, proteína cian fluorescente (CFP), Cerulean, T-Sapphire, luciferasa, fosfatasa alcalina o una combinación de las mismas. Los métodos descritos en el presente documento demuestran la construcción de vectores de direccionamiento que emplean el uso de un gen indicadorlacZque codifica pgalactosidasa, sin embargo, tras la lectura de esta divulgación, los expertos comprenderán que los roedores descritos en el presente documento se pueden generar en ausencia de un gen indicador o con cualquier gen indicador conocido en la técnica.

Cuando sea apropiado, la región codificante del material genético o una o más secuencias de polinucleótidos que codifican un polipéptido indicador, en su totalidad o en parte, pueden modificarse para incluir codones que estén optimizados para la expresión en el roedor (por ejemplo, véanse las Patentes de EE. UU. N.° 5.670.356 y 5.874.304). Las secuencias con codones optimizados son secuencias sintéticas y preferentemente codifican el polipéptido idéntico (o un fragmento biológicamente activo de un polipéptido de longitud completa que tiene sustancialmente la misma actividad que el polipéptido de longitud completa) codificado por el polinucleótido precursor sin codones optimizados. En algunas realizaciones, la región codificante del material genético que codifica un polipéptido indicador (por ejemplo,lacZ),en su totalidad o en parte, puede incluir una secuencia alterada para optimizar el uso de codones para un tipo de célula particular (por ejemplo, una célula de roedor). Por ejemplo, los codones del gen indicador a insertar en el genoma de un roedor pueden optimizarse para la expresión en una célula del roedor. Tal secuencia puede describirse como una secuencia con codones optimizados.

Se describen composiciones y métodos para crear roedores que comprenden una alteración en un locusC9ORF72como se divulga en el presente documento, incluyendo composiciones y métodos para crear roedores que expresen un gen indicador a partir de un promotor deC9ORF72y una secuencia reguladora deC9ORF72.También se divulgan composiciones y métodos para crear roedores que expresen un gen indicador a partir de un promotor endógeno y una secuencia reguladora endógena. Los métodos incluyen la inserción de un vector de direccionamiento, como se describe en el presente documento, que codifica un gen indicador (por ejemplo,lacZ) en el genoma de un roedor de manera que se elimine una secuencia codificante completa de un locusC9ORF72,en su totalidad o en parte. Los métodos pueden incluir la inserción de un vector de direccionamiento en el genoma de un roedor de manera que se elimine la secuencia codificante completa de todas las isoformas deC9ORF72en un locusC9ORF72.

La inserción de un gen indicador unido operativamente a un promotor deC9ORF72(por ejemplo, un promotor deC9ORF72endógeno) emplea una modificación relativamente mínima del genoma y da como resultado la expresión del polipéptido indicador de una manera específica deC9ORF72en el roedor. En algunos ejemplos, un roedor descrito en el presente documento comprende un locusC9ORF72que comprende un vector de direccionamiento como se describe en el presente documento.

Los vectores de direccionamiento descritos en el presente documento pueden introducirse en células ES y cribarse para determinar clones de ES que alberguen una alteración en un locusC9orf72como se describe en Frendewey, D.,et al.,2010, Methods Enzymol. 476:295-307. Se puede emplear una diversidad de embriones hospedadores en los métodos y composiciones divulgados en el presente documento. Por ejemplo, las células pluripotentes y/o totipotentes que tienen la modificación genética dirigida se pueden introducir en un embrión en fase de premórula (por ejemplo, un embrión en fase de 8 células) de un organismo correspondiente. Véanse, por ejemplo, los documentos US 7.576.259, US 7.659.442, US 7.294.754 y US 2008/0078000 A1. En otros casos, las células ES del donante pueden implantarse en un embrión hospedador en la fase de 2 células, fase de 4 células, fase de 8 células, fase de 16 células, fase de 32 células o fase de 64 células. El embrión hospedador también puede ser un blastocisto o puede ser un embrión preblastocisto, un embrión en fase de premórula, un embrión en fase de mórula, un embrión en fase de mórula no compactada o un embrión en fase de mórula compactada.

El método VELOCIMOUSE® (Poueymirou, W.T.et al.,2007, Nat. Biotechnol. 25:91-99) puede aplicarse para inyectar células ES positivas en un embrión de 8 células para generar ratones heterocigotos de generación F0 completamente obtenidos de células ES listos para el perfil de expresión delacZo la reproducción hasta la homocigosidad. En el Ejemplo 1 se proporcionan métodos de ejemplo para generar roedores con una alteración en un locusC9orf72.

Los métodos para generar roedores transgénicos, incluidos desactivados y con inserción, se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Gene Targeting: A Practical Approach, Joyner, ed., Oxford University Press, Inc. (2000)). Por ejemplo, la generación de roedores transgénicos puede implicar opcionalmente la alteración de los locus genéticos de un gen endógeno de roedor y la introducción de un gen indicador en el genoma de roedor, en algunas realizaciones, en la misma ubicación que el gen endógeno de roedor.

En la figura 1A se proporciona una ilustración esquemática (no a escala) de la organización genómica de unC9orf72de ratón. En la figura 1A también se proporciona una estrategia de direccionamiento de ejemplo para la deleción de una secuencia codificante completa del locusC9orf72murino usando un gen indicador. Como se ilustra, el ADN genómico que contiene la porción codificante del exón 2 a la porción codificante del exón 11 de un locusC9orf72murino se elimina y se reemplaza por un gen indicador y un casete de selección de fármacos flanqueado por sitios de reconocimiento de recombinasa específicos del sitio. El vector de direccionamiento usado en esta estrategia incluye una secuencia codificante de recombinasa que está unida operativamente a un promotor que está regulado por el desarrollo de modo que la recombinasa se expresa en células no diferenciadas. En la Tabla 2 se proporcionan promotores de ejemplo que se pueden incluir en los vectores de direccionamiento descritos en el presente documento. Los promotores adecuados adicionales que se pueden usar en los vectores de direccionamiento descritos en el presente documento incluyen los descritos en las Patentes de EE. UU. N.° 8.697.851, 8.518.392 y 8.354.389. Tras la recombinación homóloga, la secuencia codificante completa (por ejemplo, la porción codificante del exón 2 a la porción codificante del exón 11) de un locusC9orf72murino endógeno se reemplaza por la secuencia contenida en el vector de direccionamiento. El casete de selección de fármacos se elimina de una manera dependiente del desarrollo, es decir, la progenie procedente de ratones cuyas células de la línea germinal que contienen una alteración en un locusC9orf72descrito anteriormente desprenderá el marcador seleccionable de las células diferenciadas durante el desarrollo (véanse las Patentes de EE. UU. N.° 8.697.851, 8.518.392 y 8.354.389).

_____________________________________________ TABLA 2______________________________________________ Promotor Prot (SEQ ID NO:5) CCAGTAGCAGCACCCACGTCCACCTTCTGTCTAGTAATGTCCAACACCTCCCT CAGTCCAAACACTGCTCTGCATCCATGTGGCTC'CCATTTATACCTGAAGCACT TGATGGGGCCTCAATGTTTTACTAGAGCCCACCCCCCTGCAACTCTGAGACC

CTCTGGATTTGTCTGTCAGTGCCTCACTGGGGCGTTGGATAATTTCTTAAAAG GTCAAGTTCCCTCAGCAGCATTCTCTGAGCAGTCTGAAGATGTGTGCTTTTCA CAGTTCAAATCCATGTGGCTGTTTCACCCACCTGCCTGGCCTTGGGTTATCTA TCAGGACCTAGCCTAGAAGCAGGTGTGTGGCACTTAACACCTAAGCTGAGTG ACTAACTGAACACTCAAGTGGATGCCATCTTTGTCACTTCTTGACTGTGACAC AAGCAACTCCTGATGCCAAAGCCCTGCCCACCCCTCTCATGCCCATATTTGG ACATGGTACAGGTCCTCACTGGCCATGGTCTGTGAGGTCCTGGTCCTCTTTGA CTTC AT AATTCCT AGGGGCC ACT AGT ATCT AT AAGAGGA AGAGGGTGCTGGC TCCCAGGCCACAGCCCACAAAATTCCACCTGCTCACAGGTTGGCTGGCTCGA CCCAGGTGGTGTCCCCTGCTCTGAGCCAGCTCCCGGCCAAGCCAGCACC __________________________________________ (continuación)_____________________________________ Promotor Blimpl de 1 kb (SEQ ID NO:6)

T GC C ATC AT C AC AGGAT GTC C TTC C TT C TCC AGA AGAC AGACT GGGGC T GA A GGAAAAGCCGGCCAGGCTCAGAACGAGCCCCACTAATTACTGCCTCCAACA GCTTTCCACTCACTGCCCCCAGCCCAACATCCCCTTTTTAACTGGGAAGCATT CCTACTCTCCATTGTACGCACACGCTCGGAAGCCTGGCTGTGGGTTTGGGCA TGAGAGGC AGGGAC AAC AAAACC AGTAT AT ATGATTATAAC TTTTTCCTGTT TCCCTATTTCCAAATGGTCGAAAGGAGGAAGTTAGGTCTACCTAAGCTGAAT GTATTCAGTTAGCAGGAGAAATGAAATCCTATACGTTTAATACTAGAGGAGA ACCGCCTTAGAATATTTATTTCATTGGCAATGACTCCAGGACTACACAGCGA A ATTGT ATT GC ATGT GCT GCC A AA AT ACTTT AGCTCTTTCCTTCGA AGT ACGT CGGATCCTGTAATTGAGACACCGAGTTTAGGTGACTAGGGTTTTCTTTTGAG GAGGAGTCCCCCACCCCGCCCCGCTCTGCCGCGACAGGAAGCTAGCGATCCG GAGGACTT AGAATAC AATCGT AGTGTGGGTAAAC ATGGAGGGC AAGC GCC T GC AAAGGGAAGTAAGAAGATTCCCAGTCCTTGTTGAAATCC ATTT GC AAAC A GAGGAAGCTGCCGCGGGTCGCAGTCGGTGGGGGGAAGCCCTGAACCCCACG CTGCACGGCTGGGCTGGCCAGGTGCGGCCACGCCCCCATCGCGGCGGCTGGT AGG AGT GA AT C AGAC C GTC AGT ATT GGT A A AGA AGTC T GC GGC AGGGC AGG GAGGGGGA AGAGT AGTC AGT C GC TCGC TC ACT C GC TC GC T C GC AC AGAC AC T GCTGCAGTGACACTCGGCCCTCCAGTGTCGCGGAGACGCAAGAGCAGCGCG CAGCACCTGTCCGCCCGGAGCGAGCCCGGCCCGCGGCCGTAGAAAAGGAGG GACCGCCGAGGTGCGCGTCAGTACTGCTCAGCCCGGCAGGGACGCGGGAGG ATGT GGACT GGGT GGAC

Promotor Blimp1 de 2 kb (SEQ ID NO:7)

GTGGTGCTGACTCAGCATCGGTTAATAAACCCTCTGCAGGAGGCTGGATTTC TTTTGTTTAATTATCACTTGGACCTTTCTGAGAACTCTTAAGAATTGTTCATTC GGGTTTTTTTGTTTTGTTTTGGTTTGGTTTTTTTGGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTGGT TTTT GG A G A C AGGGT TTCT C TGT AT A T AGC C C TGGC A C A AG AGC A A GCTAACAGCCTGTTTCTTCTTGGTGCTAGCGCCCCCTCTGGCAGAAAATGAA ATAACAGGTGGACCTACAACCCCCCCCCCCCCCCCCAGTGTATTCTACTCTTG TCCCCGGT AT AAATTTGATTGTTCCGAACT ACAT AAATTGT AGA AGGATTTTT TAGATGCACATATCATTTTCTGTGATACCTTCCACACACCCCTCCCCCCCAAA A A A ATT TTT C TG GG A A AGTTT C TT G A A AGG A A AAC AG A AG AAC A AGC CT GTC TTTATGATTGAGTTGGGCTTTTGTTTTGCTGTGTTTCATTTCTTCCTGTAAACA A AT AC TC AA AT GTCC AC TTC ATT GT AT GAC T AAGTTGGT ATC ATT AGGTT GGG TC T GGGT GT GT GA AT GT GGGT GT GG AT C T GG AT GTGGG T GGGT GT GT AT GCC CCGTGTGTTTAGAAT ACT AGAAAAGAT ACC AC ATCGT AAACTTTTGGGAGAG ATGATTTTT A A A A AT GGGGGT GGGGGT GAGGGGA ACCTGCGAT GAGGC A AG ___________________________________________ (continuación)___________________________________________ CAAGATAAGGGGAAGACTTGAGTTTCTGTGATCTAAAAAGTCGCTGTGATGG GATGCTGGCTATAAATGGGCCCTTAGCAGCATTGTTTCTGTGAATTGGAGGA TCCCTGCTGAAGGCAAAAGACCATTGAAGGAAGTACCGCATCTGGTTTGTTT TGT A AT G AG A AG C AG G AAT GC A AG GT C C AC GC TC TT AAT A AT A AAC A A AC A GGACATTGTATGCCATCATCACAGGATGTCCTTCCTTCTCCAGAAGACAGAC TGGGGCTGAAGGAAAAGCCGGCCAGGCTCAGAACGAGCCCCACTAATTACT GCCTCCAACAGCTTTCCACTCACTGCCCCCAGCCCAACATCCCCTTTTTAACT GGGAAGCATTCCTACTCTCCATTGTACGCACACGCTCGGAAGCCTGGCTGTG GGT TT GGGC AT GAG AGGC AGGGAC A AC A A A AC C AGT AT AT AT GATT AT AAC TTTTTCCTGTTTCCCTATTTCCAAATGGTCGAAAGGAGGAAGTTAGGTCTACC TAAGCTGAATGTATTCAGTTAGCAGGAGAAATGAAATCCTATACGTTTAATA C T AGAGGAGA AC CGC C T T AG A AT ATTTATTTCATT GGC A AT GAC T C C AGGAC TACACAGCGAAATTGTATTGCATGTGCTGCCAAAATACTTTAGCTCTTTCCTT CG AAGT ACGTCGG ATCCTGT AATT G AGAC ACCG AGTTT AGGT GACT AGGGTT TTCTTTTGAGGAGGAGTCCCCCACCCCGCCCCGCTCTGCCGCGACAGGAAGC TAGCGATCCGGAGGACTTAGAATACAATCGTAGTGTGGGTAAACATGGAGG GCAAGCGCCTGCAAAGGGAAGTAAGAAGATTCCCAGTCCTTGTTGAAATCCA TTT GC A A AC AGAGGA AGC TGC C GC GGGT C GC AGT C GGT GGGGGGA AGC C C T GAACCCCACGCTGCACGGCTGGGCTGGCCAGGTGCGGCCACGCCCCCATCGC GGCGGC T GGT AGG A GT G A AT C A G ACCGT C AGT ATT GGT A A A G A A GTCT GC G GC AGGGC AGGGAGGGGGA AG AGT AGTC AGT C GC TC GC TC AC T C GC T C GC T C GCACAGACACTGCTGCAGTGACACTCGGCCCTCCAGTGTCGCGGAGACGCAA GAGCAGCGCGCAGCACCTGTCCGCCCGGAGCGAGCCCGGCCCGCGGCCGTA GAAAAGGAGGGACCGCCGAGGTGCGCGTCAGTACTGCTCAGCCCGGCAGGG AC GC GGG AGG AT GT GG ACTGGGTGG AC

Un roedor fundador transgénico se puede identificar basándose en la presencia de un gen indicador (o ausencia de C9ORF72) en su genoma y/o la expresión de un indicador en tejidos o células del roedor (o falta de expresión de C9ORF72). A continuación, un roedor fundador transgénico se puede usar para criar roedores adicionales que lleven el gen indicador, creando así una serie de roedores que lleven cada uno una o más copias de un locusC9ORF72como se describe en el presente documento.

Los roedores transgénicos también pueden producirse para que contengan sistemas seleccionados que permitan la expresión regulada o dirigida del transgén. Los sistemas de ejemplo incluyen el sistema de recombinasa Cre/loxP del bacteriófago P1 (véase, por ejemplo, Lakso, M.et al.,1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236) y el sistema de recombinasa FLP/Frt de S.cerevisiae(O'Gorman, S.et al.,1991, Science 251:1351-1355). Dichos animales pueden obtenerse mediante la construcción de animales transgénicos"dobles",por ejemplo, mediante el emparejamiento de dos animales transgénicos, uno que contiene un transgén que codifica un polipéptido seleccionado (por ejemplo, un gen indicador) y otro que contiene un transgén que codifica una recombinasa (por ejemplo, una recombinasa Cre).

Aunque en el presente documento se analizan ampliamente ejemplos que emplean una alteración en un locusC9ORF72en un ratón (es decir, un ratón con una deleción de una secuencia codificante deC9orf72completa), también se divulgan otros roedores que comprenden una alteración en un locusC9ORF72.En algunos ejemplos, dichos roedores comprenden una alteración en un locusC9ORF72caracterizada por la inserción de un indicador unido operativamente a un promotor de C9ORF72 endógeno. Dichos roedores incluyen cualquiera de aquellos que se pueden modificar genéticamente para eliminar una secuencia codificante completa de un locusC9ORF72como se divulga en el presente documento. Por ejemplo, para los roedores para los que no están fácilmente disponibles células ES genéticamente modificables adecuadas, se emplean otros métodos para producir un roedor no humano que comprenda la modificación genética. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, modificar un genoma de células no ES (por ejemplo, un fibroblasto o una célula pluripotente inducida) y emplear la transferencia nuclear de células somáticas (SCNT, por sus siglas en inglés) para transferir el genoma modificado genéticamente a una célula adecuada, por ejemplo, un ovocito enucleado, y gestar la célula modificada (por ejemplo, el ovocito modificado) en un roedor en condiciones adecuadas para formar un embrión.

Brevemente, los métodos para transferencia nuclear incluyen las etapas de: (1) enuclear un ovocito; (2) aislar una célula donante o núcleo a combinar con el ovocito enucleado; (3) insertar la célula o núcleo en el ovocito enucleado para formar una célula reconstituida; (4) implantar la célula reconstituida en el útero de un animal para formar un embrión; y (5) permitir que el embrión se desarrolle. En dichos métodos, los ovocitos generalmente se recuperan de animales fallecidos, aunque pueden aislarse también de oviductos y/u ovarios de animales vivos. Los ovocitos pueden madurarse en una diversidad de medios conocidos por los expertos en la técnica antes de la enucleación. La enucleación del ovocito se puede realizar de una diversidad de maneras conocidas por los expertos en la técnica. La inserción de una célula donante o núcleo en un ovocito enucleado para formar una célula reconstituida se logra típicamente mediante microinyección de una célula donante bajo la zona pelúcida antes de la fusión. La fusión puede inducirse mediante la aplicación de un pulso eléctrico de CC a través del plano de contacto/fusión (electrofusión), mediante la exposición de las células a agentes químicos promotores de la fusión, tales como polietilenglicol, o por medio de un virus inactivado, tal como el virus Sendai. Una célula reconstituida típicamente se activa por medios eléctricos y/o no eléctricos antes, durante y/o después de la fusión del donante nuclear y el ovocito receptor. Los métodos de activación incluyen pulsos eléctricos, choque inducido químicamente, penetración por esperma, aumento de los niveles de cationes divalentes en el ovocito y reducción de la fosforilación de proteínas celulares (por ejemplo, mediante inhibidores de cinasas) en el ovocito. Las células reconstituidas activadas, o embriones, se cultivan típicamente en un medio conocido por los expertos en la técnica y a continuación se transfieren al útero de un animal. Véanse, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N.° 2008-0092249 A1, el documento WO 1999/005266 A2, la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. N.° 2004-0177390 A1, el documento WO 2008/017234 A1 y la Patente de EE. UU. N.° 7.612.250.

Los métodos para modificar un genoma de roedor incluyen, por ejemplo, emplear una nucleasa de dedos de cinc (ZFN) o una nucleasa efectora similar a un activador de transcripción (TALEN) para modificar un genoma para incluir una alteración en un locusC9ORF72como se describe en el presente documento.

En algunos ejemplos, un animal no humano descrito en el presente documento es un mamífero. En algunos ejemplos, un animal no humano descrito en el presente documento es un mamífero pequeño, por ejemplo, de la superfamiliaDipodoideaoMuroidea.La invención proporciona una neurona motora de roedor como se expone en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, un roedor puede seleccionarse de un ratón, una rata y un hámster. En algunas realizaciones, un roedor puede seleccionarse de la superfamiliaMuroidea.En algunas realizaciones, un roedor puede ser de una familia seleccionada deCalomyscidae(por ejemplo, hámsteres similares a ratones),Cricetidae(por ejemplo, hámsteres, ratas y ratones del nuevo mundo, campañoles),Muridae(ratones y ratas auténticos, jerbos, ratones espinosos, ratas con cresta),Nesomyidae(ratones trepadores, ratones de abazón de las rocas, ratas coliblancas, ratas y ratones de Madagascar),Platacanthomyidae(por ejemplo, lirón espinoso), ySpalacidae(por ejemplo, ratas topo, ratas del bambú, y zokores). En algunas realizaciones determinadas, un roedor puede seleccionarse de un ratón o rata auténticos (familiaMuridae),un jerbo, un ratón espinoso y una rata con cresta. En algunas realizaciones determinadas, un ratón puede ser de un miembro de la familiaMuridae.En algunas realizaciones determinadas, un roedor se selecciona de un ratón y una rata. En algunas realizaciones, un roedor es un ratón.

En algunas realizaciones, un roedor puede ser un ratón de una cepa C57BL seleccionada de C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr y C57BL/Ola. En algunas realizaciones determinadas, un ratón puede ser una cepa 129 seleccionada del grupo que consiste en una cepa que es 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (por ejemplo, 129S1/SV, 12951/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (véanse, por ejemplo, Festinget al.,1999, Mammalian Genome 10:836; Auerbach, W.et al.,2000, Biotechniques 29(5): 1024-1028, 1030, 1032). En algunas realizaciones determinadas, un ratón modificado genéticamente puede ser una mezcla de una cepa 129 mencionada anteriormente y una cepa C57BL/6 mencionada anteriormente. En algunas realizaciones determinadas, un ratón puede ser una mezcla de las cepas 129 mencionadas anteriormente, o una mezcla de las cepas BL/6 mencionadas anteriormente. En algunas realizaciones determinadas, una cepa 129 de la mezcla como se describe en el presente documento es una cepa 129S6 (129/SvEvTac). En algunas realizaciones, un ratón puede ser una cepa BALB, por ejemplo, la cepa BALB/c. En algunas realizaciones, un ratón puede ser una mezcla de una cepa BALB y otra cepa mencionada anteriormente.

En algunas realizaciones, un roedor es una rata. En algunas realizaciones determinadas, una rata puede seleccionarse de una rata Wistar, una cepa LEA, una cepa Sprague Dawley, una cepa Fischer, F344, F6 y Dark Agouti. En algunas realizaciones determinadas, una cepa de rata puede ser una mezcla de dos o más cepas seleccionadas del grupo que consiste en Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 y Dark Agouti.

Una célula pluripotente y/o totipotente de rata puede ser de cualquier cepa de rata, incluyendo, por ejemplo, una cepa de rata ACI, una cepa de rata Agutí Negro (DA), una cepa de rata Wistar, una cepa de rata LEA, una cepa de rata Sprague Dawley (SD), o una cepa de rata Fischer tal como Fisher F344 o Fisher F6. También se pueden obtener células pluripotentes y/o totipotentes de rata a partir de una cepa procedente de una mezcla de dos o más cepas enumeradas anteriormente. Por ejemplo, la célula pluripotente y/o totipotente de rata puede ser de una cepa DA o una cepa ACI. La cepa de rata ACI se caracteriza por tener agutí negro, con vientre y patas blancas y un haplotipoRT1av1.Dichas cepas están disponibles en una diversidad de fuentes incluyendo Harlan Laboratories. Un ejemplo de una línea de células ES de rata de una rata ACI es una célula ES de rata ACI.G1. La cepa de rata Agutí negro (DA) se caracteriza por tener un pelaje agutí y un haplotipoRT1av1.Dichas ratas están disponibles a partir de una diversidad de fuentes que incluyen Charles River y Harlan Laboratories. Los ejemplos de una línea de células ES de rata de una rata DA son la línea de células ES de rata DA.2B y la línea de células ES de rata DA.2C. En algunos casos, las células pluripotentes y/o totipotentes de rata son de una cepa de rata endogámica. Véase, por ejemplo, el documento U.S.

2014/0235933 A1, presentado el 20 de febrero de 2014.

Se divulgan roedores que comprenden una alteración en un locusC9ORF72.En algunos ejemplos, una alteración en un locusC9ORF72da como resultado una pérdida de función. En particular, las mutaciones de pérdida de función incluyen mutaciones que dan como resultado una disminución o falta de expresión de C9ORF72 y/o una disminución o falta de actividad/función de C9ORF72. En algunos ejemplos, las mutaciones de pérdida de función dan como resultado uno o más fenotipos como se describe en el presente documento. La expresión de C9ORF72 puede medirse directamente, por ejemplo, ensayando el nivel de C9ORF72 en una célula o tejido de un roedor como se describe en el presente documento.

Típicamente, el nivel de expresión y/o actividad de C9ORF72 disminuye si el nivel de expresión y/o actividad de C9ORF72 es estadísticamente menor (p<0,05) que el nivel de C9ORF72 en una célula o roedor de control apropiado que no comprende la misma alteración (por ejemplo, deleción). En algunas realizaciones, la concentración y/o actividad de C9ORF72 disminuye al menos un 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o más en relación con una célula o roedor de control que carece de la misma alteración (por ejemplo, deleción).

En otras realizaciones, las células u organismos que tienen una alteración en un locusC9ORF72que reduce el nivel de expresión y/o la actividad de C9ORF72 pueden seleccionarse usando métodos que incluyen, pero sin limitación, análisis de transferencia Southern, secuenciación de ADN, análisis por PCR o análisis fenotípico. A continuación, dichas células o roedores pueden emplearse en los diversos métodos y composiciones descritos en el presente documento.

En algunos ejemplos, un locusC9ORF72endógeno no se elimina (es decir, está intacto). La porción codificante del exón 2 a la porción codificante del exón 11 de un locusC9ORF72endógeno se elimina como se expone en las reivindicaciones. En algunos ejemplos, la totalidad o sustancialmente la totalidad de un locusC9ORF72endógeno se reemplaza por un ácido nucleico de inserción; en algunos ejemplos determinados, el reemplazo incluye el reemplazo de una secuencia codificante completa de un locusC9ORF72endógeno con un gen indicadorlacZde manera que el gen indicadorlacZesté en unión operativa con un promotor deC9ORF72(por ejemplo, un promotor deC9ORF72endógeno). En algunas realizaciones, una porción de un gen indicador (por ejemplo, un fragmento funcional del mismo) se inserta en un locusC9ORF72endógeno. En algunas realizaciones, el gen indicador puede ser un genlacZ.En algunos ejemplos, un gen indicador se inserta en una de las dos copias del locusC9ORF72endógeno, dando lugar a un roedor que es heterocigoto con respecto al gen indicador. En algunos ejemplos, se divulga un roedor que es homocigoto para un gen indicador.

Métodos que emplean animales no humanos que tienen una alteración en un locus C9ORF72

Los roedores, como se describen en el presente documento, proporcionan modelos animales mejorados para enfermedades, trastornos y afecciones neurodegenerativas. En particular, los roedores, como se describen en el presente documento, proporcionan modelos animales mejorados que se traducen en enfermedades humanas tales como, por ejemplo, ELA y/o DFT, caracterizadas por síntomas de neuronas motoras superiores y/o pérdida de neuronas no motoras.

Por ejemplo, una alteración en un locusC9ORF72como se describe en el presente documento puede dar como resultado diversos síntomas (o fenotipos) en los roedores divulgados en el presente documento. En algunos ejemplos, la deleción de un locusC9ORF72da como resultado roedores que son macroscópicamente normales al nacer, pero que desarrollan síntomas de tipo ELA tras envejecer, por ejemplo, después de aproximadamente 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 13 semanas, 14 semanas, 15 semanas, 16 semanas, 17 semanas, 18 semanas, 19 semanas, 20 semanas, 21 semanas, 22 semanas, 23 semanas, 24 semanas, 25 semanas, 26 semanas, 27 semanas, 28 semanas, 29 semanas, 30 semanas, 31 semanas, 32 semanas, 33 semanas, 34 semanas, 35 semanas, 36 semanas, 37 semanas, 38 semanas, 39 semanas, 40 semanas, 41 semanas, 42 semanas, 43 semanas, 44 semanas, 45 semanas, 46 semanas, 47 semanas, 48 semanas, 49 semanas, 50 semanas, 51 semanas, 52 semanas, 53 semanas, 54 semanas, 55 semanas, 56 semanas, 57 semanas, 58 semanas, 59 semanas, 60 semanas, etc. En algunas realizaciones, la deleción de un locusC9ORF72da como resultado funciones anómalas de uno o más tipos de células, por ejemplo, una neurona y/o una porción de la misma. Una neurona incluye una neurona sensorial o una neurona motora. Otros fenotipos asociados con la ELA y/o la DFT pueden estar presentes en los roedores descritos en el presente documento. Por ejemplo, un fenotipo de tipo ELA puede implicar el deterioro de una o más neuronas, por ejemplo, neuronas motoras y/o neuronas sensoriales. Además, un fenotipo de tipo ELA que afecta a las neuronas motoras superiores puede provocar espasticidad (por ejemplo, parálisis espástica, rigidez), reflejos aumentados y/o anómalos (por ejemplo, señal de Babinski), temblores y una combinación de los mismos. Un fenotipo de tipo ELA que afecta a las neuronas motoras inferiores puede provocar debilidad y atrofia muscular, fasciculaciones y una combinación de los mismos, y/o deterioro bulbar dando como resultado una incapacidad para tragar y fasciculaciones en la lengua. Un síntoma de tipo ELA también puede comprender uno o más de los siguientes fenotipos: a) cifosis; b) agarrotamiento anómalo de las extremidades posteriores, arrastre o curvado de dedo; c) deficiencia en la coordinación motora y la capacidad de aprendizaje motor, deficiencia en una o más pruebas de rotarod, pasarela y/o campo abierto; d) pérdida de neuronas motoras en la médula espinal; e) astrocitosis en la médula espinal; f) pérdida de peso en comparación con un roedor control; g) acumulación de proteínas poliubiquitinadas y/o (h) aumento de la puntuación neurológica usando el sistema de puntuación neurológica de ALS-TDI (Tabla 3).

Sistema de puntuación neurológica ALS-TDI

Puntuación de 0: Extensión completa de las patas posteriores más allá de la línea media lateral cuando el ratón se suspende por su cola, y el ratón puede mantener esto durante dos segundos, suspendido de dos a tres veces.

Puntuación de 1: Colapso o colapso parcial de la extensión de la pata hacia la línea media lateral (debilidad) o temblor de las patas posteriores durante la suspensión por la cola.

Puntuación de 2: Los dedos de los pies se curvan hacia abajo al menos dos veces durante la marcha de 12 pulgadas, o cualquier parte del pie se arrastra por el fondo de la jaula/mesa.

Puntuación de 3: Parálisis rígida o mínimo movimiento de articulación, no se está usando el pie para generar movimiento hacia delante.

Puntuación de 4: El ratón no puede enderezarse por sí mismo en 30 segundos después de colocarlo sobre cualquier lateral.

Por lo tanto, en al menos algunos ejemplos, los roedores descritos en el presente documento proporcionan modelos animales mejorados para enfermedades, trastornos o afecciones neurodegenerativas (por ejemplo, ELA y/o DFT) y se pueden usar para el desarrollo y/o identificación de agentes terapéuticos para el tratamiento, prevención y/o inhibición de uno o más fenotipos (o síntomas) de enfermedades, trastornos o afecciones neurodegenerativas. En algunos ejemplos, uno o más síntomas (o fenotipos) en roedores descritos en el presente documento aparecen en la Tabla 3.

Los roedores, como se divulgan en el presente documento, también proporcionan un sistemain vivopara identificar un agente terapéutico para tratar, prevenir y/o inhibir uno o más síntomas de enfermedades, trastornos o afecciones neurodegenerativas (por ejemplo, ELA y/o DFT). En algunos ejemplos, un efecto inhibidor de un agente terapéutico se determinain vivo,mediante la administración de dicho agente terapéutico a un roedor que tiene una alteración deC9ORF72como se describe en el presente documento, y desarrolla síntomas neurodegenerativos después de las 38 semanas de edad.

Los roedores, como se divulgan en el presente documento, también proporcionan modelos animales mejorados para enfermedades, trastornos y afecciones inflamatorias o autoinmunitarios. En particular, los roedores divulgados en el presente documento proporcionan modelos animales mejorados que se traducen en una enfermedad inflamatoria humana caracterizada por la infiltración de células inmunitarias en diversos órganos (por ejemplo, riñón, hígado, bazo, etc.). Además, los roedores divulgados en el presente documento proporcionan modelos animales mejorados que se traducen en una enfermedad autoinmunitaria humana caracterizada por la presencia aumentada de autoanticuerpos (por ejemplo, IgG e IgM) en el suero.

Por ejemplo, una alteración en un locusC9ORF72como se describe en el presente documento puede dar como resultado diversas afecciones (o fenotipos) en los roedores divulgados en el presente documento. En algunos ejemplos, la deleción de un locusC9ORF72da como resultado roedores que son macroscópicamente normales al nacer, pero que desarrollan afecciones inflamatorias y/o autoinmunitarias al envejecer, por ejemplo, después de aproximadamente 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 13 semanas, 14 semanas, 15 semanas, 16 semanas, 17 semanas, 18 semanas, 19 semanas, 20 semanas, 21 semanas, 22 semanas, 23 semanas, 24 semanas, 25 semanas, 26 semanas, 27 semanas, 28 semanas, 29 semanas, 30 semanas, 31 semanas, 32 semanas, 33 semanas, 34 semanas, 35 semanas, 36 semanas, 37 semanas, 38 semanas, 39 semanas, 40 semanas, 41 semanas, 42 semanas, 43 semanas, 44 semanas, 45 semanas, 46 semanas, 47 semanas, 48 semanas, 49 semanas, 50 semanas, 51 semanas, 52 semanas, 53 semanas, 54 semanas, 55 semanas, 56 semanas, 57 semanas, 58 semanas, 59 semanas, 60 semanas, etc. En algunos ejemplos, la eliminación de un locusC9ORF72da como resultado una infiltración de uno o más tipos de células inmunitarias, por ejemplo, células plasmáticas, monocitos, granulocitos y/o macrófagos. Otros fenotipos asociados con una afección inflamatoria y/o autoinmunitaria pueden estar presentes en los roedores descritos en el presente documento. Por ejemplo, una afección inflamatoria o autoinmunitaria puede implicar el agrandamiento de uno o más del bazo, ganglios linfáticos, riñón y/o hígado. Además, una afección inflamatoria o autoinmunitaria que afecte a la sangre puede dar como resultado un aumento de la presencia de autoanticuerpos. Una afección inflamatoria o autoinmunitaria que afecte al hígado puede dar como resultado hepatitis.

Por lo tanto, en al menos algunos ejemplos, los roedores divulgados en el presente documento proporcionan modelos animales mejorados para enfermedades, trastornos o afecciones inflamatorias y/o autoinmunitarias y se pueden usar para el desarrollo y/o identificación de agentes terapéuticos para el tratamiento, prevención y/o inhibición de uno o más fenotipos (o síntomas) de una enfermedad, trastorno o afección inflamatoria y/o autoinmunitaria. En algunos ejemplos, una enfermedad, trastorno o afección inflamatoria y/o autoinmunitaria está presente en uno o más órganos o tejidos de un roedor descrito en el presente documento. En algunos ejemplos determinados, uno o más órganos o tejidos incluyen bazo, hígado, ganglios linfáticos, riñón, médula ósea y sangre.

Los roedores divulgados en el presente documento también proporcionan un sistemain vivopara identificar un agente terapéutico para tratar, prevenir y/o inhibir uno o más síntomas de una enfermedad, trastorno o afección inflamatoria y/o autoinmunitaria. En algunos ejemplos, un efecto inhibidor de un agente terapéutico se determinain vivo,administrando dicho agente terapéutico a un roedor que tiene una alteración deC9ORF72como se describe en el presente documento, y desarrolla una enfermedad, trastorno o afección inflamatoria y/o autoinmunitaria después de las 8 semanas de edad. En diversos ejemplos, una enfermedad, trastorno o afección inflamatoria y/o autoinmunitaria es o comprende glomerulonefritis o hepatitis.

A los roedores se les puede administrar un agente terapéutico a ensayar por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por inyección sistémica, bombas para exposición a largo plazo, o inyección intracerebral directa. Dichos animales pueden incluirse en un estudio conductual, a fin de determinar el efecto del agente terapéutico sobre la conducta, por ejemplo, conducta motora, de los animales no humanos en comparación con animales no humanos de control apropiados que no recibieron el agente terapéutico. También puede realizarse una biopsia o evaluación anatómica de la médula espinal, músculo y/o tejido cerebral del animal, y/o puede recogerse una muestra de sangre o CSP.

Los roedores, como se describen en el presente documento, proporcionan un sistemain vivomejorado y una fuente de materiales biológicos (por ejemplo, células) que carecen de expresión de C9ORF72 que son útiles para una diversidad de ensayos. Los roedores descritos en el presente documento pueden usarse para desarrollar agentes terapéuticos que traten, prevengan y/o inhiban uno o más síntomas asociados con una falta de expresión y/o actividad de C9ORF72. En diversos ejemplos, los roedores descritos en el presente documento se usan para identificar, cribar y/o desarrollar agentes terapéuticos candidatos (por ejemplo, anticuerpos, ARNip, etc.) que se unen a C9ORF72. En diversos ejemplos, los roedores descritos en el presente documento se usan para cribar y desarrollar agentes terapéuticos candidatos (por ejemplo, anticuerpos, ARNip, etc.) que bloquean la actividad de C9ORF72. En diversos ejemplos, los roedores descritos en el presente documento se usan para determinar el perfil de unión de antagonistas y/o agonistas de un polipéptido (o transcrito) C9ORF72 de un roedor como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, los roedores descritos en el presente documento se usan para determinar el epítopo o epítopos de uno o más anticuerpos terapéuticos candidatos que se unen a C9ORF72.

Los roedores descritos en el presente documento pueden usarse para determinar los perfiles farmacocinéticos de un fármaco dirigido a C9ORF72. En diversos ejemplos, uno o más roedores descritos en el presente documento y uno o más roedores de control o de referencia se exponen cada uno a uno o más fármacos candidatos dirigidos a C9ORF72 en diversas dosis (por ejemplo, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/mg, 7,5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg o 50 mg/kg o más). Los anticuerpos terapéuticos candidatos pueden dosificarse mediante cualquier vía de administración deseada, incluyendo las vías de administración parenteral y no parenteral. Las vías parenterales incluyen, por ejemplo, intravenosa, intraarterial, intraportal, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, intraespinal, intratecal, intracerebroventricular, intracraneal, intrapleural u otras vías de inyección. Las vías no parenterales incluyen, por ejemplo, oral, nasal, transdérmica, pulmonar, rectal, bucal, vaginal, ocular. La administración también puede ser por infusión continua, administración local, liberación sostenida a partir de implantes (geles, membranas o similares) y/o inyección intravenosa. La sangre se aísla de roedores (humanizados y de control) en diversos puntos temporales (por ejemplo, 0 h, 6 h, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días o hasta 30 o más días). Pueden realizarse diversos ensayos para determinar los perfiles farmacocinéticos de fármacos administrados que se dirigen a C9ORF72 usando muestras obtenidas de roedores como se describe en el presente documento, incluyendo, pero sin limitación, IgG total, respuesta de anticuerpos antiterapéuticos, aglutinación, etc.

En diversos ejemplos, los roedores, como se describen en el presente documento, se usan para medir el efecto terapéutico de bloquear, modular y/o inhibir la actividad de C9ORF72 (o la señalización de C9ORF72, o interacciones mediadas por C9ORF72) y el efecto sobre la expresión génica como resultado de los cambios celulares. En diversos ejemplos, un roedor, como se describe en el presente documento, o células aisladas del mismo se exponen a un fármaco que se dirige a C9ORF72 del roedor y, después de un período de tiempo posterior, se analizan para determinar los efectos sobre los procesos (o interacciones) dependientes de C9ORF72, por ejemplo, el tráfico endosómico, la homeostasis inmunitaria o la función de neuronas motoras y/o neuronas no motoras.

Las células de roedores, como se describen en el presente documento, se pueden aislar y usar de formaad hoc,o se pueden mantener en cultivo durante muchas generaciones. En diversos ejemplos, las células de un roedor, como se describe en el presente documento, se inmortalizan (por ejemplo, mediante el uso de un virus) y se mantienen en cultivo indefinidamente (por ejemplo, en cultivos en serie).

En diversas realizaciones, las células y/o roedores, como se describen en el presente documento, pueden usarse en diversas pautas de inmunización para determinar las funciones mediadas por C9ORF72 en la respuesta inmunitaria para un antígeno (por ejemplo, una respuesta de linfocitos B). En algunos ejemplos, los agentes terapéuticos candidatos que se unen o bloquean una o más funciones de C9ORF72 se caracterizan en un roedor descrito en el presente documento. Las mediciones adecuadas incluyen diversos ensayos celulares, ensayos de proliferación, análisis de inmunoglobulina sérica (por ejemplo, valor de anticuerpos), ensayos de citotoxicidad, caracterización de interacciones ligando-receptor (por ejemplo, ensayos de inmunoprecipitación) y caracterización de interacciones ligando-ligando. En algunos ejemplos, los roedores descritos en el presente documento se usan para caracterizar las funciones mediadas por C9ORF72 que regulan una respuesta inmunitaria a un antígeno. En algunos ejemplos, el antígeno está asociado con una enfermedad, trastorno o afección autoinmunitaria. En algunos ejemplos, el antígeno está asociado con una enfermedad, trastorno o afección inflamatoria. En algunos ejemplos, el antígeno está asociado con una enfermedad, trastorno o afección neurológica. En algunos ejemplos, el antígeno está asociado con un agente infeccioso (por ejemplo, una bacteria). En algunos ejemplos, el antígeno es un antígeno de prueba (por ejemplo, ovoalbúmina u OVA). En algunos ejemplos, el antígeno es una diana asociada con una enfermedad o afección que padecen uno o más pacientes humanos que necesitan tratamiento.

En diversos ejemplos, los roedores, como se describen en el presente documento, se usan para la exposición con uno o más antígenos para determinar el potencial terapéutico de compuestos o agentes biológicos para modular la regulación dependiente de C9ORF72 de una respuesta inmunitaria, incluyendo, pero sin limitación, las respuestas dependientes de linfocitos B específicas a un antígeno determinado.

Los roedores, como se describen en el presente documento, proporcionan un sistemain vivopara el análisis y ensayo de un fármaco o vacuna. En diversos ejemplos, un fármaco o vacuna candidato puede suministrarse a uno o más roedores descritos en el presente documento, seguido de una monitorización de los roedores para determinar una o más de las respuestas inmunitarias al fármaco o vacuna, el perfil de seguridad del fármaco o vacuna, o el efecto sobre una enfermedad o afección y/o uno o más síntomas de una enfermedad o afección. Los métodos de ejemplo usados para determinar el perfil de seguridad incluyen mediciones de toxicidad, concentración de dosis óptima, eficacia del fármaco o vacuna y posibles factores de riesgo. Dichos fármacos o vacunas pueden mejorarse y/o crearse en dichos roedores.

La eficacia de la vacuna puede determinarse de varias formas. Brevemente, los roedores descritos en el presente documento pueden vacunarse usando métodos conocidos en la técnica y a continuación exponerse a una vacuna o se administra una vacuna a roedores ya infectados. La respuesta de uno o más roedores a una vacuna se puede medir monitorizando y/o realizando uno o más ensayos en, el uno o más roedores (o las células aisladas de los mismos) para determinar la eficacia de la vacuna. A continuación, la respuesta de uno o más roedores a la vacuna se compara con animales de control, usando una o más medidas conocidas en la técnica y/o descritas en el presente documento.

La eficacia de la vacuna puede determinarse además mediante ensayos de neutralización vírica. Brevemente, los roedores, como se describen en el presente documento, pueden inmunizarse y el suero se recoge diversos días después de la inmunización. Se incuban previamente diluciones en serie de suero con un virus, tiempo durante el cual los anticuerpos en el suero que son específicos para el virus se unirán a este. A continuación, se añade la mezcla de virus/suero a células permisivas para determinar la infectividad mediante un ensayo de placa o ensayo de microneutralización. Si los anticuerpos en el suero neutralizan el virus, hay menos placas o unidades de luciferasa relativas más bajas en comparación con un grupo de control.

Los roedores descritos en el presente documento proporcionan un sistemain vivopara evaluar las propiedades farmacocinéticas y/o la eficacia de un fármaco (por ejemplo, un fármaco dirigido a C9ORF72). En diversas realizaciones, un fármaco puede suministrarse o administrarse a una o más células de roedor de la invención, seguido de la monitorización o realización de uno o más ensayos en las células para determinar el efecto del fármaco. Las propiedades farmacocinéticas incluyen, pero sin limitación, la forma en que un animal procesa el fármaco en diversos metabolitos (o la detección de la presencia o ausencia de uno o más metabolitos del fármaco, incluyendo, pero sin limitación, los metabolitos tóxicos), la semivida del fármaco, los niveles circulantes del fármaco después de la administración (por ejemplo, la concentración sérica del fármaco), la respuesta antifármaco (por ejemplo, anticuerpos antifármaco), la absorción y distribución del fármaco, la vía de administración, las vías de excreción y/o la depuración del fármaco. En algunas realizaciones, las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de los fármacos (por ejemplo, moduladores de C9ORF72) se monitorizan en o mediante el uso de roedores descritos en el presente documento.

En algunos ejemplos, la realización de un ensayo incluye la determinación del efecto sobre el fenotipo y/o genotipo del roedor al que se administra el fármaco. En algunos ejemplos, la realización de un ensayo incluye la determinación de la variabilidad de lote a lote de un fármaco (por ejemplo, un modulador de C9ORF72 tal como, por ejemplo, un antagonista o un agonista). En algunos ejemplos, la realización de un ensayo incluye la determinación de las diferencias entre los efectos de un fármaco administrado a un roedor descrito en el presente documento y un roedor de referencia. En diversos ejemplos, los roedores de referencia pueden tener una modificación como se describe en el presente documento, una modificación que es diferente a la descrita en el presente documento (por ejemplo, una que tiene un locusC9ORF72alterado, interrumpido, eliminado, insertado, modificado, etc. o de otro modo no funcional) o ninguna modificación (es decir, un roedor de tipo natural).

Los parámetros de ejemplo que pueden medirse en roedores (o en y/o usando células aisladas de los mismos) para evaluar las propiedades farmacocinéticas de un fármaco incluyen, pero sin limitación, aglutinación, autofagia, división celular, muerte celular, hemólisis mediada por complemento, integridad del ADN, valor de anticuerpos específicos del fármaco, metabolismo del fármaco, matrices de expresión génica, actividad metabólica, actividad mitocondrial, estrés oxidativo, fagocitosis, biosíntesis de proteínas, degradación de proteínas, secreción de proteínas, respuesta al estrés, concentración del fármaco en el tejido diana, concentración del fármaco en el tejido no diana, actividad transcripcional y similares. En diversos ejemplos, los roedores descritos en el presente documento se usan para determinar una dosis farmacéuticamente eficaz de un fármaco (por ejemplo, un fármaco dirigido a C9ORF72).

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan con el fin de describir para los expertos en la técnica como preparar y usar los métodos y composiciones de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores de la presente invención consideran como su invención. A menos que se indique lo contrario, la temperatura se indica en grados Celsius y la presión es la atmosférica o casi atmosférica.

Ejemplo 1. Generación de una alteración en un locus C9ORF72 no humano

Este ejemplo ilustra una alteración dirigida en un locusC9orf72de un roedor. En particular, este ejemplo describe específicamente la deleción de la secuencia codificante completa de un locusC9orf72de ratón usando una construcción indicadoralacZcolocada en un enlace operativo con un promotor deC9orf72de ratón. El vector de direccionamiento deC9orf72-lacZpara crear una alteración en un locusC9orf72de ratón endógeno se creó como se ha descrito previamente (véanse, por ejemplo, la Patente de EE. UU. N.° 6.586.251; Valenzuelaet al.,2003, Nature Biotech. 21(6):652-659; y Adams, N.C. y N.W. Gale, en Mammalian and Avian Transgenesis-New Approaches, ed. Lois, S.P.a.C., Springer Verlag, Berlin Heidelberg, 2006). El locusC9orf72modificado resultante se representa en la figura 1A, recuadro inferior.

Brevemente, se generó un vector de direccionamiento usando clones de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) de una biblioteca de BAC RP23 de ratón (Adams, D.J.et al.,2005, Genomics 86:753-758) y se introdujo en células madre embrionarias (ES) híbridas F1 (129S6SvEvTac/C57BL6NTac) seguido de cultivo en medio de selección que contenía G418. Se seleccionaron colonias resistentes a fármacos 10 días después de la electroporación y se cribaron para determinar el direccionamiento correcto como se ha descrito previamente (Valenzuelaet al.,anteriormente; Frendewey, D.et al.,2010, Methods Enzymol. 476:295-307). Se usó el método VELOCIMOUSE® (DeChiara, T.M.et al.,2010, Methods Enzymol. 476:285-294; Dechiara, T.M., 2009, Methods Mol. Biol. 530:311-324; Poueymirouet al.,2007, Nat. Biotechnol. 25:91-99), en el que se inyectaron células ES dirigidas en embriones Swiss Webster en fase de 8 células sin compactar, para producir ratones de generación F0 sanos completamente procedentes de células ES heterocigotos para la deleción deC9orf72.Se cruzaron machos heterocigotos de generación F0 con hembras C57Bl6/NTac para generar heterocigotos F1 que se cruzaron para producir ratones de generación F2C9orf72rl~, C9orf72+l'y de tipo natural para análisis fenotípicos. Se generó una segunda cohorte de ratones de generación N2F2 mediante fertilizaciónin vitro(FIV) usando esperma y ovocitos heterocigotos F1 congelados de hembras donantes C57Bl6/NTac. A continuación, se cruzaron crías heterocigotas N2F1 para generar ratones N2F2C9orf72rl~, C9orf72+l~y de tipo natural para el análisis fenotípico.

Los estudios fenotípicos de los ratones F2 y N2F2 comenzaron a las seis (6) semanas de edad. Se observó a los ratones desde el nacimiento para detectar diversos hitos del desarrollo (daño fetal, respiración, anomalías faciales y de las extremidades, color de la piel, postura, enderezamiento y apertura de los ojos) hasta las 6 semanas de edad, cuando se alojaron de 2-5 por jaula en 12 horas de luz al día a 20-23 °C y al 40-60 % de humedad para el estudio. Los ratones se alojaron en jaulas de 95,6 x 309,1 x 133,4 mm (Thoren) con lecho de mazorcas (The Andersons Lab Bed) y un nido de algodón para enriquecimiento (Ancare). En el alojamiento, se monitorizó el estado de salud de los ratones dos veces al día y tuvieron acceso a pienso normal (LabDiet) y agua a voluntad. Todos los procedimientos con los animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guide for the Care and Use of Laboratory Animals de los National Institutes of Health. El protocolo fue aprobado por el Regeneron Pharmaceuticals Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), y se hicieron todos los esfuerzos posibles para minimizar el sufrimiento.

Análisis de expresión TAQMAN®: Se diseccionaron tejidos frescos de ganglios linfáticos axilares, braquiales y cervicales, almohadilla de grasa gonadal, corteza frontal, diafragma, médula espinal, bazo y timo en reactivo de estabilización RNALater (QIAgen) y se almacenaron a -20 °C. Los tejidos se homogeneizaron en reactivo TRIZOL® y se separaron en fases con cloroformo. La fase acuosa, que contenía el ARN total, se purificó usando el kit miRNeasy Mini (QIAgen) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. El ADN genómico se eliminó usando el tampón DNasa MAg Ma X™ TURBO™ y DNasa TURBO™ (Ambion). El ARNm se transcribió de forma inversa en ADNc usando una mezcla maestra SUPERSCRIPT® VILO™ (SuperScript® III RT, RNaseOUT™, inhibidor de ribonucleasa recombinante, proteína auxiliar patentada, cebadores aleatorios, MgCh, dNTP; Invitrogen de Life Technologies). El ADNc se amplificó con la mezcla maestra de expresión génica TAQMAN® (Applied Biosystems) usando el sistema de detección de secuencias ABI 7900HT (Applied Biosystems). Se usó beta-actina como gen de control interno para normalizar las diferencias de entrada de ADNc. Se usó el timo de ratones de tipo natural como muestra de referencia para calcular el factor de diferencia de ARNm entre muestras (n = 5 hembras por tejido por genotipo). Los resultados de ejemplo se exponen en la figura 1B.

Perfil de expresión deLacZ:Los ratones se anestesiaron profundamente mediante una inyección IP de ketamina/xilazina (120/5 mg/kg) y se fijaron mediante perfusión cardíaca usando una solución de glutaraldehído al 0,2 % y paraformaldehído al 4 %. Se diseccionaron tejidos de cerebro, caja torácica, ganglios linfáticos, glándulas salivales, timo, corazón, pulmón, hígado, bazo, estómago, riñón, intestino, urogenital, músculo y extremidades traseras, se aclararon en PBS y se fijaron posteriormente durante 30 minutos en una solución de glutaraldehído al 0,2 % y paraformaldehído al 4 %. Los tejidos se lavaron y se incubaron en una solución de tinción X-gal (1 mg/ml) durante 1-24 horas a 37 °C. Después de la tinción, los tejidos se lavaron, se fijaron posteriormente en paraformaldehído al 4 % y se aclararon en una serie de glicerol del 50 %, 70 % y 100 %. Las fotografías se tomaron con un estereomicroscopio Nikon SMZ1500 y una cámara digital Nikon DS-Ri1 usando el software NIS-Elements D Imaging (Nikon).

El perfil de expresión se registró el día embrionario 12,5 (E12,5), 6 semanas y 28 semanas. A continuación se proporcionan datos representativos del perfil de expresión relativo de la p-galactosidasa (lacZ) en embriones E12,5 (Tabla 4) y ratonesC9orf72rl~de 6 y 28 semanas de edad (Tabla 5) (- = sin expresión; = baja expresión; + = expresión moderada; ++ = alta expresión; wt = C57BL/6N de tipo natural; nd = no determinado).

Como se muestra en la figura 1B, se detectaron altos niveles de expresión deC9orf72en la almohadilla de grasa gonadal, la corteza frontal y la médula espinal de tipo natural (WT), con niveles más bajos en el timo, el bazo y el ganglio linfático. Los ratonesC9orf72+/~(Het) tenían aproximadamente la mitad del nivel de expresión de ratones de tipo natural (WT), como se esperaba, y los ratonesC9orf72~l~(KO) no tenían expresión detectable deC9orf72.No se observó ninguna diferencia en los niveles de transcripción de los locus cercanosMob3b, Ak045932eIfnkentre los genotipos ensayados, lo que indicó que la inserción delacZsolo (es decir, la ablación de la secuencia codificante) afectó a la expresión deC9orf72.

En consonancia con los datos que se muestran en la figura 1B, la tinción delacZen animalesC9orf72r/~(KO) de 6 y 28 semanas reveló la actividad enzimática en varias regiones del cerebro y la médula espinal, así como en el bazo, los testículos y el riñón (Tablas 4 y 5), lo que es coherente con otros informes (Suzuki, N.et al.,2013, Nat. Neurosci.

16(12): 1725-8; Koppers, M.et al.,2015, Am. Neurol. 78(3):425-38). Además, se observó una tinción menos prominente en otros tejidos. La actividad del indicador fue más limitada en intensidad y alcance en los tejidosC9orf72+/~, como se esperaba para un único alelo de reemplazo delacZ.

En conjunto, este ejemplo demuestra que el C9orf72 murino se expresa en diversos tejidos de los sistemas nervioso e inmunitario. Además, este ejemplo demuestra que, al menos en algunos tejidos, la expresión aumenta con la edad del animal y se correlaciona directamente con los fenotipos neurológicos e inmunitarios descritos en los siguientes ejemplos (véase a continuación).

______________ TABLA 4______________

Genotipo del embrión Expresión delacZ

wt -C9oif2+/-+++

C9orf72-/-+++

TABLA 5

C9orf72-/-Tejido wt macho de 6 s macho de 28 s

Cerebro -

Médula espinal - ++ ++

Corazón - ++

Caja torácica - ++

Extremidades traseras - + ++

Hígado - + ++

Pulmón - + ++

Timo - +

Bazo - ++

Ejemplo 2. Análisis conductual de animales no humanos que tienen una alteración en un locus C9orf72

Este ejemplo demuestra, entre otras cosas, que los animales no humanos (por ejemplo, roedores) descritos en el presente documento desarrollan síntomas de tipo ELA, tales como, por ejemplo, disminución del peso corporal y anomalías motoras significativas resultantes de una alteración en un locusC9orf72de roedor (por ejemplo, de ratón) como se describe en el Ejemplo 1.

Se realizaron estudios fenotípicos de ratones que tenían una alteración enC9orf72como se ha descrito anteriormente a las 8, 18, 37 (hembras) y 57-60 semanas (machos). El peso corporal se midió quincenalmente y la composición corporal se analizó mediante una exploración |jCT (Dynamic 60). Se usó una exploración estándar 24 para visualizar la masa de la región cervical de la columna vertebral. Todos los procedimientos con animales se realizaron de conformidad con los protocolos aprobados por el Regeneron Pharmaceuticals Institutional Animal Care and Use Committee.

La evaluación de la función motora general se realizó usando ensayos de puntuación subjetiva a ciegas. El análisis del deterioro motor se realizó usando pruebas de rotarod, locomotoras de campo abierto y de pasarela. La puntuación del deterioro motor se midió usando el sistema desarrollado por el ALS Therapy Development Institute (ALSTDI, Gill A.et al.,2009, PLoS One 4:e6489). Durante el ensayo de pasarela, los sujetos caminan a través de una plataforma de vidrio iluminada mientras que una cámara de vídeo graba desde abajo. Los parámetros relacionados con la marcha, tales como patrón de zancada, velocidad de balanceo de la pata individual, la duración de apoyo y la presión se informan para cada animal. Esta prueba se usa para fenotipificar ratones y evaluar entidades químicas novedosas por su efecto sobre el rendimiento motor. CatWalk XT es un sistema para la evaluación cuantitativa de pisadas y marcha en ratas y ratones. Se usa para evaluar la capacidad locomotora de roedores en casi cualquier tipo de modelo experimental de anomalías del sistema nervioso central, nervioso periférico, muscular o esquelético.

Análisis de la marcha en pasarela: Los animales se colocan al principio de la pista de Noldus CatWalk XT 10, con el extremo abierto delante de los mismos. Los ratones corren espontáneamente hasta el final de la pista para intentar escapar. La cámara registra y el software del sistema mide las huellas. Las huellas se analizan para detectar anomalías en la colocación de las patas.

Prueba de campo abierto: Los ratones se colocan en el sistema de campo abierto de Kinder Scientific y se evalúan durante 60 minutos. El aparato usa rayos infrarrojos y un software informático para calcular movimientos finos, deambulación X+Y, distancia recorrida, número de eventos de exploración vertical, tiempo dedicado a la exploración vertical y tiempo de inmovilidad.

Rotarod: La prueba de rotarod (IITC Life Science, Woodland Hills, CA) mide la latencia para que un ratón caiga de un rodillo giratorio. El rotarod se configura en el régimen experimental que comienza a 1 rpm y acelera hasta 15 rpm durante 180 segundos. A continuación, se registra la latencia de los animales hasta caer después del régimen incremental. Para evaluar la latencia hasta la caída, se usa el promedio y el máximo de las tres duraciones de tiempo más largas que los animales permanecen en el rodillo sin caerse. Los animales que logran permanecer en el rodillo más de 180 segundos se consideran asintomáticos.

El deterioro de la neurona motora superior se presenta como espasticidad (es decir, rigidez), reflejos aumentados, temblor, bradicinesia y signos de Babinski. El deterioro de la neurona motora inferior se presenta como debilidad muscular, atrofia, agarrotamiento, curvado y arrastre de los pies, y fasciculaciones. El deterioro bulbar se presenta como dificultad al tragar, mala pronunciación y fasciculaciones de la lengua. La Tabla 6 expone la metodología de puntuación relacionada con el deterioro motor, el temblor y la rigidez de los animales durante la prueba. Los resultados de ejemplo se exponen en las figuras 2A-2H.

Como se muestra en las figuras 2A-2H, los ratonesC9orf72rl~demostraron fenotipos de tipo a ELA, tales como, por ejemplo, disminución del peso corporal, inactividad motora y deterioro de la marcha. En particular, la disminución del peso corporal en los ratonesC9orf72rl~en comparación con los ratones de control de tipo natural comenzó aproximadamente a las 30 semanas de edad (figura 2B). Además, con la excepción del rotarod, se observó un deterioro motor significativo (por ejemplo, debilidad significativa y colapso de las extremidades traseras hacia la línea media lateral, así como temblor leve y músculos rígidos de las extremidades traseras, p<0,0001) para los ratonesC9orf72r1'en todos los tipos de pruebas (figuras 2C-2H) que comenzaron aproximadamente a las 40 semanas de edad, lo que indicó el inicio de la patología de las neuronas motoras superiores e inferiores. No se observaron defectos similares en animales de tipo natural o heterocigotos(C9orf72+l~).

El análisis de la marcha con Rotarod y CatWalk en ratonesC9orf72rl~demostró una disminución significativa de las conductas locomotoras y menos eventos de exploración vertical, lo que indica un deterioro de las extremidades traseras. Los análisis de la marcha con CatWalk revelaron signos de una coordinación entre las extremidades inferiores deteriorada y una longitud de zancada reducida, así como bradicinesia y arrastre de las extremidades traseras. Estos datos indicaron anomalías significativas en la marcha en comparación con el tipo natural. No se observó ninguna diferencia entre los ratones de tipo natural y los ratonesC9orf72rl~en lo que respecta al tiempo máximo en el Rotarod. Ya a las 36 semanas de edad, los ratonesC9orf72rl~demostraron déficits motores significativos y progresivos.

En otro experimento, se recogió la porción lumbar de las médulas espinales de ratones de tipo natural yC9orf72rl~(n = 5, 60 semanas de edad) para el análisis histopatológico. No se observó ninguna diferencia en el número total de neuronas motoras en las médulas espinales (figura 2I). Sin embargo, el área media del cuerpo celular de las neuronas motoras deC9orf72rl~fue significativamente mayor en comparación con el tipo natural (p<0,0001). En particular, las neuronas motoras de los ratonesC9orf72rl~demostraron características hipertróficas evidenciadas por un área media del cuerpo celular significativamente mayor en comparación con el tipo natural (figura 2I). Por lo tanto, estos datos indicaron un posible inicio de la patología de la neurona motora inferior a partir de las 40 semanas de edad.

En un experimento similar, se evaluaron las anomalías motoras en ratones de tipo natural(C9orf72+l+,n = 14; 11 hembras, 3 machos) yC9or72~l~(n = 17; 12 hembras, 5 machos) a partir de las 32 semanas hasta las 60 semanas de edad como porcentaje de animales vivos en una semana determinada. Los ratones se pesaron semanalmente y se realizó una evaluación de la función motora general usando ensayos de puntuación subjetiva a ciegas (como se ha descrito anteriormente). Se realizaron exámenes neurológicos clínicos semanales o bimensuales en los dos grupos de ratones para observar su deterioro motor, temblor y rigidez de los músculos de las extremidades traseras. Para el deterioro motor, se siguió una escala de puntuación neurológica a ciegas (descrita anteriormente) de cero (sin síntomas) a cuatro (el ratón no puede enderezarse por sí solo dentro de los 30 segundos posteriores a ser colocado de lado). Para el temblor y la rigidez, se creó un sistema de puntuación con una escala de cero (sin síntomas) a tres (grave). Todos los datos se indican como media ± EEM. Los resultados representativos se exponen en la figura 2J.

Se evaluaron las conductas locomotoras durante 60 minutos cada dos semanas usando el sistema automatizado de campo abierto (Kinder Scientific), la prueba de rotarod (Rota Rod, IITC Life Science, Woodland Hills, CA) y el análisis de la marcha (CatWalk XT 10, Noldus) como se ha descrito anteriormente. Todos los datos se indican como media ± EEM. Los resultados representativos se exponen en la figura 2K.

Usando las escalas de puntuación descritas anteriormente, los inventores observaron que aproximadamente a las 40 semanas de edad, los ratonesC9or72~l~comenzaron a mostrar debilidad significativa y colapso de sus patas traseras hacia la línea media lateral, así como temblor leve y músculos rígidos de las extremidades traseras (P < 0,0001), lo que sugiere el inicio de la patología de las neuronas motoras superiores e inferiores. Además, todos los ratones de tipo natural vivieron más allá de las 60 semanas de edad, pero solo ~53 % de los ratonesC9orf72-~(9 de 17; 5 hembras, 4 machos) estaban vivos a las 60 semanas de edad (figura 2J, superior, izquierda). A partir de aproximadamente las 36 semanas de edad, los ratonesC9or72~l~dejaron de aumentar de peso corporal, en contraste con la cohorte de ratones de tipo natural.

A partir del ensayo de campo abierto, los inventores observaron que los ratonesC9orf72-~muestran conductas locomotoras significativamente disminuidas en comparación con sus homólogos de tipo natural (P = 0,0008). Estos ratones también mostraron significativamente menos conductas de exploración vertical (P = 0,0009), lo que indicó un deterioro de sus extremidades traseras. No se observó ningún cambio significativo en el tiempo máximo que los ratones permanecían en un rodillo giratorio en ningún momento durante el estudio entre los ratones de tipo natural y los ratonesC9orf72~l~.A partir del análisis de la marcha CatWalk, los inventores observaron que los ratonesC9orf72-~tienen una coordinación entre las extremidades inferiores (P = 0,0005) y una longitud de zancada (P = 0,0013) significativamente deterioradas, así como bradicinesia y arrastre de las extremidades traseras. Estos datos indicaron anomalías significativas en la marcha en los ratonesc9orf72~l~en comparación con los de tipo natural. Por lo tanto, el ejemplo demuestra que, a partir de las 36 semanas de edad, los ratonesC9orf72-~muestran déficits motores significativos y progresivos en comparación con los de tipo natural.

En otro experimento, se examinaron ratones heterocigotos(C9or72+l~)y homocigotos(C9orf72- )usando una prueba de fuerza de agarre. Brevemente, la fuerza de agarre mide la función neuromuscular como fuerza muscular máxima de las extremidades anteriores, y se evalúa mediante el agarre aplicado por un ratón sobre una rejilla que está conectada a un sensor. Se realizaron tres ensayos en sucesión midiendo solo la fuerza de las extremidades anteriores. Todos los valores de fuerza de agarre obtenidos se normalizaron en función del peso corporal del ratón. La prueba de fuerza de agarre se realizó en trece ratones de tipo natural, siete ratonesC9orf72+l~y dieciocho ratonesC9orf72-~a las 20 semanas de edad (antes de la aparición de los síntomas motores) y en doce ratones de tipo natural, cuatro ratonesC9orf72+l~y trece ratonesC9orf72-~a las 60 semanas de edad. Los datos representativos se exponen en la figura 2L.

Como se muestra en la figura 2L, los ratones heterocigotos (C9or72+l~) no mostraron ningún deterioro motor significativo, temblor o rigidez a las 60 semanas. Además, los ratones heterocigotos (C9orf72+l~) no mostraron ningún cambio en la fuerza de agarre a las 60 semanas en comparación con los de tipo natural.

En conjunto, este ejemplo demuestra que los animales no humanos descritos anteriormente muestran un fenotipo neurodegenerativo medible y, por lo tanto, proporcionan modelos útiles de esclerosis lateral amiotrófica (ELA) ylo demencia frontotemporal (DFT), cuyos animales no humanos tienen un genoma que comprende una deleción de la secuencia codificante completa (es decir, exones 2-10) de un locusC9orf72endógeno resultante de la inserción de un gen indicador (por ejemplo,lacZ).Estos modelos animales proporcionan un sistemain vivoútil para el desarrollo y el cribado de candidatos terapéuticos para el tratamiento de e La ylo DFT.

TABLA 6

Deterioro motor _________ 0___________________1___________________ 2____________________ 3__________ Temblor sin fenotipo ninguno espasmo leve leve espasmo y arrastre parálisis grave grave Rigidez ninguno moderado moderado

Ejemplo 3. Análisis inmunofenotípico de animales no humanos que tienen una alteración en un locus C9orf72

Este ejemplo demuestra que los animales no humanos creados de acuerdo con el Ejemplo 1 demuestran un fenotipo inmunológico caracterizado por, en algunas realizaciones, esplenomegalia y linfadenopatía resultantes de la infiltración de diversas poblaciones de células inmunitarias. Además, este ejemplo demuestra específicamente que dichos animales no humanos desarrollan glomerulonefritis caracterizada por la infiltración de poblaciones de células inmunitarias en el riñón. Sin desear quedar ligados a ninguna teoría en particular, los presentes inventores proponen que el producto del locusC9ORF72desempeña un papel crítico en la función inmunitaria y que la pérdida del polipéptido C9ORF72 en animales no humanos descritos en el presente documento no es el mecanismo principal de la enfermedad ELA y/o DFT. Se extrajeron diversos tejidos de ratonesC9orf72rl~y de tipo natural para su análisis (n = 4-6 animales por genotipo a las 8, 18 y 37 semanas para las hembras, y a las 9-10, 18 y 57-60 semanas para los machos).

Preparación de células y análisis de citometría de flujo: Se recogió el volumen máximo de sangre en tubos recubiertos con EDTA mediante punción cardíaca inmediatamente después de la eutanasia con CO<2>y se transfirieron aproximadamente 200 pl a tubos recubiertos con heparina para la preparación de FACS. Se extrajeron células del bazo, la médula ósea y los ganglios linfáticos cervicales, se disociaron en suspensiones de células individuales en PBS 1X de Dulbecco con suero fetal bovino al 2 % (Stem Cell Technologies) más EDTA 2 mM (Ambion) y se filtraron usando métodos conocidos en la técnica. Se realizó la lisis de glóbulos rojos (RBC) en sangre, bazo y médula ósea usando un tampón de lisis de glóbulos rojos (eBioscience) o tampón de lisis ACK (Life Technologies). Se contaron las células de los ganglios linfáticos, el bazo y la médula ósea usando un contador de viabilidad celular Cellometer Auto T4 (Nexcelom Bioscience) y se sembraron en placas a razón de aproximadamente 10 millones de células por pocillo para el bazo y 1 millón de células por pocillo o el volumen máximo para los ganglios linfáticos y la médula ósea. La sangre se sembró en placas en el volumen máximo (aproximadamente 250 pl) por pocillo. Las células se trataron con tinción Aqua fijable LIVE/DEAD (Life Technologies) a temperatura ambiente, se centrifugaron y se suspendieron de nuevo en una solución de bloqueo (mAb anti CD16/CD32 de ratón purificado, BD Pharmingen, 1:100 en tampón FACS) durante 15 minutos sobre hielo. Las células se tiñeron con anticuerpos conjugados durante 30 minutos en hielo, se lavaron, se fijaron (kit BD Cytofix/cytoperm) y se lavaron de nuevo. Finalmente, las células se suspendieron de nuevo en tampón FACS (PBS 1X de Dulbecco con suero fetal bovino al 2 %, Stem Cell Technologies, más EDTA 2 mM, Ambion) y se analizaron en un citómetro de flujo BD FACSCanto II o un citómetro de flujo LSRFortessa (BD Biosciences). La tinción Foxp3 (eBioscience) se realizó de acuerdo con las especificaciones del fabricante.

Panel de tinción de células plasmáticas: CD11b (M1/70; Biolegend), CD11c (N418; Biolegend), CD3 (145-2C11; Biolegend), B220 (RA3-6B2; Biolegend), CD19 (1D3; BD Pharmingen), CD138 (281-2; BD Pharmingen) y CD45 (30-F11; BD Pharmingen). Panel de tinción de células mieloides: F4/80 (BM8; Biolegend), CD115 (AFS98; eBioscience), Ly6G (RB6-8C5; eBioscience), CD11b (M1/70; eBioscience), CD45 (30-F11; BD Biosciences) y Ly6C (AL-21; BD Biosciences). Los anticuerpos contra c D8, CD25, CD62L, CD69, CD127, PD1 (RPMI-30), NKp46 se obtuvieron en BioLegend (San Diego, CA). El anticuerpo Foxp3 se obtuvo en eBioscience (San Diego, CA). El anticuerpo CD49b se obtuvo en BD Biosciences (San Jose, CA). Los datos se analizaron usando el software FlowJo (Tree Star). Se realizaron recuentos de células positivas y totales en el bazo, ganglios linfáticos cervicales, médula ósea y riñón de hembras de 30-35 semanas de edad (tipo natural: n = 4;C9orf72r/~n = 4) en un contador de viabilidad celular Nexelcom Bioscience Cellometer Auto 2000 con colorante de viabilidad AO/PI (naranja de acridina y yoduro de propidio). Los recuentos celulares se usaron para determinar el número absoluto de poblaciones celulares observadas mediante tinción de superficie y se representaron gráficamente en consecuencia.

Histología: Los tejidos se recogieron en paraformaldehído al 4 % (PFA, Electron Microscopy Sciences) o se recogieron tras una perfusión transcardíaca con 50 ml de solución salina, 50 ml de PFA al 4 % en tampón de acetato a pH 6,5 y, por último, 50 ml de solución de PFA al 4 % en tampón de borato a pH 9,5. Las médulas espinales se recogieron en una solución de sacarosa al 15 % seguida de una solución de sacarosa al 30 % en tampón de borato hasta que se desplomaron. Todos los demás tejidos se fijaron posteriormente en PFA al 4 % y se transfirieron a etanol al 70 % después de 24 o 48 horas. La inclusión en parafina, el corte y la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) se realizaron en un laboratorio de histología comercial (Histoserv, Inc.; Germantown, MD). La inmunohistoquímica para IgM, IgG, factor del complemento C3, CD45R, CD3, CD138 y F4/80 se completó por un laboratorio comercial (Histotox Labs; Boulder, CO). El recuento de neuronas motoras y el área del cuerpo celular se cuantificaron usando Image J. El recuento de neuronas motoras representa el promedio de tres portaobjetos por animal, n = 5 ratones y el área del cuerpo celular representa el promedio de tres portaobjetos por animal, 10 neuronas motoras por portaobjetos, n = 5 ratones. La inmunohistoquímica del factor del complemento C3 se cuantificó usando Halo.

Ensayos hematológicos: Se recogieron muestras de sangre a través de hemorragias oculares retroorbitales bajo anestesia con isoflurano o mediante punción cardíaca después de la eutanasia por inhalación de CO<2>de acuerdo con el protocolo IACUC de Regeneron. Se realizó un hemograma completo (CBC, por sus siglas en inglés) con diferencial en 20 |jl de sangre completa usando Hemavet 950 (Drew Scientific Group) y se realizó una química clínica en muestras de suero usando el sistema de química ADVIA 1800 (Siemans Medical Solutions EE. UU.). Se realizaron análisis ELISA en muestras de plasma usando lo siguiente: Kit de ELISA del factor reumatoide de IgG de ratón y kit de ELISA del factor reumatoide de IgM de ratón (Shibayagi Co., Ltd.), kit de ELISA de Ig total anti ADNbc de ratón, kit de ELISA de Ig total de anticuerpos antinucleares (ANA) de ratón, kit de ELISA de Ig total anti Sm (antígeno Smith) de ratón, kit de ELISA de Ig total anti cardiolipina de ratón (Alpha Diagnostic Intl.) y kit de ELISA de IgG e IgM de ratón (Abcam) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Las muestras se leyeron en un lector de microplacas Spectramax M5 a 450 nm (Molecular Devices). Las muestras se analizaron por duplicado y se promediaron para obtener el valor medio. IFN-<y>, IL-1p, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12 total, IL-17, MCP-1 y TNF-a se midieron en muestras de plasma usando un ensayo de detección de electroquimioluminiscencia Multi-Spot® 10-plex (Meso Scale Discovery) de acuerdo con las especificaciones del fabricante y se leyeron en un lector de placas Meso Sector S 600 a 620 nm (Meso Scale Discovery). Las muestras se analizaron por duplicado y se promediaron para obtener el valor medio.

Aislamiento, secuenciación y análisis de ARN: El bazo y los ganglios linfáticos cervicales se diseccionaron frescos en el reactivo de estabilización RNALater (Qiagen) y se almacenaron a -20 °C. El ARN total se aisló usando el kit de aislamiento de ácidos nucleicos MagMAX™ (Ambion) según las especificaciones del fabricante. El ARN se cuantificó usando un espectrofotómetro UV y la integridad del ARN se evaluó con Qiaxcel (Qiagen). El ARNm poliA se purificó a partir del ARN total usando el kit de ARNm Dynabeads (Invitrogen) y las bibliotecas de ARN-Seq específicas de la cadena se prepararon con el kit de preparación de biblioteca de ARN-seq ScriptSeq (Illumina). Las bibliotecas de ARN-Seq se secuenciaron hasta una longitud de 33 pb usando el secuenciador Hiseq 2000 NGS (Illumina). Los niveles de expresión génica se obtuvieron a partir de lecturas de secuenciación sin procesar usando Nimbus2, un software de ARN-Seq desarrollado por Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

Método de análisis de orina; las muestras de orina se obtuvieron mediante recolección puntual y la concentración de albúmina urinaria se determinó con el kit ELISA competitivo indirecto Albuwell M (Exocell, Filadelfia, PA). La concentración de creatinina urinaria se ensayó usando el kit Creatinine Companion (Exocell). Los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante y los datos obtenidos se usaron para calcular la relación albúmina-creatinina urinaria (ACR).

Análisis estadístico: Los análisis estadísticos y gráficos se realizaron usando el software GraphPad Prism (versión 3.0). Los datos se analizaron usando la prueba de la t de Student para datos independientes y un análisis de varianza (ANOVA) unidireccional. Los resultados se consideraron estadísticamente significativos con valores de p <0,05 (las barras de error representan el e.e.m). Los resultados de ejemplo se exponen en las figuras 3A-3AL.

Como se muestra en las figuras 3A-3D, los ratonesC9orf72~l~desarrollaron un agrandamiento significativo del bazo en comparación con los ratones de tipo natural yC9orf72+l~.Además, los ganglios linfáticos cervicales fueron progresivamente más grandes con la edad (figuras 3A-3D). Por lo tanto, ya a las 8 semanas de edad, los ratonesC9orf72r1'demostraron bazos y ganglios linfáticos cervicales agrandados. Dichos agrandamientos eran palpables en las regiones cervicales de todos los ratonesC9orf72rl~,pero no de los ratones de tipo natural oC9orf72+l-.Tras una investigación adicional, dichas masas eran palpables a las 12 semanas de edad en ratones hembraC9orf72rl~,y tanto en ratones hembra como machoC9orf72rl~a las 18 semanas. Tras la disección, se demostró que las masas se originaban en los ganglios linfáticos cervicales, observándose un agrandamiento ya a las 8 semanas de edad (figura 3A). Una disección completa también reveló ganglios linfáticos agrandados adicionales en todo el cuerpo, más particularmente ganglios linfáticos mesentéricos en ratonesC9orf72rl~mayores (>35 semanas). Las placas de Peyer también estaban particularmente agrandadas y la esplenomegalia era evidente en ratonesC9orf72rl~a las 8 semanas de edad (figura 3D, inferior, izquierda). Solo nueve de los 17 ratonesC9orf72rl~vivieron más allá de las 60 semanas de edad, mientras que todos los ratones de tipo natural sometidos a pruebas periódicas de función neurológica sobrevivieron hasta el final del período experimental. Aproximadamente a las 18-24 semanas de edad, la esplenomegalia y la hiperplasia de los ganglios linfáticos cervicales estaban bien establecidas en todos los ratonesC9orf72r1'y las curvas de peso corporal de ratonesC9orf72rl~comenzaron a aplanarse en comparación con los ratones de tipo natural yC9orf72¥l~(por ejemplo, figura 2B).

Los datos de CBC con diferencial de sangre completa muestran que los ratonesC9orf72rl~desarrollan un aumento significativo de neutrófilos, eosinófilos y monocitos circulantes en comparación con los de tipo natural, al tiempo que demuestran una disminución significativa de los linfocitos circulantes (figura 3E). Los datos de CBC de ratonesC9orf72rl- (por ejemplo, de 34-38 semanas de edad) también demostraron que el diferencial de glóbulos blancos circulantes se alteró en comparación con los ratones de tipo natural. Los inventores observaron que el aumento significativo de monocitos y neutrófilos, y una disminución de linfocitos en ratonesC9orf72rl~en comparación con los ratones de tipo natural eran detectables ya a las 8 semanas de edad.

La tinción con H&E reveló una población mixta de células con múltiples morfologías en el bazo y los ganglios linfáticos cervicales de ratonesC9orf72rl~(figuras 3F, 3G). Específicamente, los ganglios linfáticos cervicales observados a 4x de aumento mostraron una abundancia de células grandes y redondas caracterizadas por bordes celulares variablemente distintos y con características eosinófilas de moderadas a abundantes (figura 3F). Ocasionalmente, se observó citoplasma espumoso en la población celular expandida. Cuando se observaron a 60x de aumento, las células dentro de los ganglios linfáticos cervicales demostraron una morfología plasmocitoide (flechas de color azul) entremezclada con neutrófilos (flechas de color amarillo) y otros linfocitos maduros (figura 3G). También estaban presentes células que parecían ser consistentes con macrófagos (flechas de color verde), así como células de Mott (de manera intermitente, flecha de color rojo; células plasmáticas anómalas con inmunoglobulinas condensadas), todo lo cual indicó una inflamación crónica en los ganglios linfáticos cervicales de ratonesC9orf72r-'(figura 3G).

El agrandamiento observado de los bazos y los ganglios linfáticos en ratonesC9orf72r-'indicó un proceso patológico neoplásico o de desregulación inmunitaria, que no se había informado previamente en pacientes con ELA-DFT. El análisis histopatológico de los tejidos linfoidesC9orf72r-'(es decir, la tinción de secciones de ganglios linfáticos y bazo de ratones de 8-60 semanas de edad con hematoxilina y eosina (H&E)) confirmó que se conservaba la organización celular básica de los ganglios linfáticos agrandados. Además, la tinción IHC confirmó la presencia de linfocitos B (CD45R+) en la corteza y linfocitos T (CD3+) entre los folículos y en la zona de la paracorteza. Sin embargo, hubo expansión de la arquitectura nodal cortical y medular por una población celular que consistía principalmente en células redondas grandes con bordes variablemente distintos, y con un solo núcleo redondo rodeado de citoplasma eosinófilo y espumoso. También estaba presente un infiltrado celular similar en el bazo, ubicado predominantemente dentro de la pulpa roja, que expandió la arquitectura esplénica y, como resultado, los pesos esplénicos en los ratonesC9orf72~l~. También se observó que había una abundancia de células plasmocitoides que contenían halos perinucleares, consistentes con la morfología de las células plasmáticas, junto con células de Mott ocasionales. No se observaron infiltrados mixtos similares en ratones de tipo natural yC9orf72+l~(heterocigotos).

La población de células grandes y redondas no se tiñó de manera consistente con CD45R, CD3 o CD138, pero fue fuertemente positiva para F4I80, un marcador de linaje de macrófagos. La señal de IHC fue predominante en la membrana celular pero escasa en el citoplasma debido al citoplasma altamente vacuolado. Por el contrario, la tinción de F4I80 WT y de control heterocigoto fue característica del patrón de tinción citoplasmática y membranosa esperado para los macrófagos, con una señal F4I80 general más intensa que la observada en ratonesC9orf72~l~(véase a continuación, por ejemplo, figura 3P).

Los análisis de H&E e IHC de órganos adicionales de ratones de 8-60 semanas de edad revelaron hiperplasia medular del timo esporádica y fibrosis focal de la médula ósea ylo hiperplasia mieloide en determinados ratonesC9orf72r-'.Una observación más común fue la presencia de una población prominente de células dendríticas encontradas en el hígado y los riñones de ratones nulos. Estas células alargadas a angulares eran F4I80+ y morfológicamente se parecían a las células dendríticas (CD) típicas, aunque de mayor tamaño y más numerosas. Eran más pronunciadas en el hígadoC9orf72~l~ya a las 8 semanas en comparación con el tipo natural, aunque no hubo evidencia de hepatopatía asociada. También se observó un aumento en las células F4l8o+ en el riñónC9orf72~l~a las 8 semanas que se volvió más prominente con la edad. Las CD se ubicaron principalmente en la médula externa, donde formaron agregados en las proximidades de la mácula densa y los túbulos adyacentes, junto con manguitos prominentes alrededor de los glomérulos en asociación con los linfocitos. Se observó un aumento de los infiltrados de leucocitos mixtos en el riñón a medida que los ratones envejecían, acompañados de diversos grados de enfermedad glomerular inmunomediada que estaba bien establecida a las 35-60 semanas de edad. No se observó evidencia de inflamación en el tejido cerebral o de la médula espinal en ninguno de los animales examinados. Por lo tanto, el bazo y los ganglios linfáticos fueron los principales sitios de patología inmunitaria en los ratonesC9orf72~l~con indicaciones de enfermedad glomerular progresiva secundaria en el riñón.

Como se muestra en la figura 3H, los ratones machoC9orf72r-'demuestran un número creciente de linfocitos B CD11b-CD11cCD3-B220+CD19+ en los ganglios linfáticos cervicales, mientras que muestran porcentajes comparables o disminuidos de estos mismos linfocitos B en el bazo, la médula ósea y la sangre en comparación con los de tipo natural. Los linfocitos B que están en transición a células plasmáticas (B220midllowCD19midllow) y células plasmáticas maduras (B220lowl'CD19lowl'CD45+CD138midl+) parecieron aumentar con la edad en el bazo, los ganglios linfáticos cervicales y la médula ósea de los ratones machoC9orf72r-'en comparación con los de tipo natural (figura 3I).

El porcentaje de linfocitos B (CD45+CD19+) no se modificó ni se redujo en ratones hembraC9orf72r-'en comparación con los de tipo natural, dependiendo del órgano examinado (por ejemplo, ganglios linfáticos cervicales). Los ratones hembraC9orf72r-'demuestran porcentajes crecientes de linfocitos B en transición a células plasmáticaslblastos plasmáticos (CD45+CD19intB220intCD138+) y células plasmáticas maduras (CD45+CD19'B220'CD138+) en el bazo, ganglio linfático y médula ósea en comparación con los de tipo natural (figuras 3J). No se observó ninguna diferencia consistente entre los ratonesC9orf72r-'y los ratones de control en estos tipos de células en la sangre. En conjunto, estos datos demostraron una respuesta inmunitaria adaptativa en avance en los ratonesC9orf72r-'.

Como se muestra en las figuras 3K y 3L, se observaron porcentajes crecientes de neutrófilos (CD11b+Ly6G+Ly6C+) en el bazo de ratones macho y hembraC9orf72~l~a medida que envejecían. También se observaron aumentos en los ganglios linfáticos cervicales de ratones machoC9orf72r-'entre las 9-18 semanas y de ratones hembraC9orf72r-'en todos los puntos temporales examinados. Las poblaciones de granulocitos también aumentaron en la médula ósea y la sangre con una significación variable en la mayoría de los puntos temporales. Los monocitos inflamatorios (CD11b+, CD115+, Ly6Glowl-, Ly6Chigh) aumentaron significativamente en ratonesC9orf72r-'en comparación con los de tipo natural para el bazo, ganglios linfáticos cervicales, médula ósea y sangre durante al menos un punto temporal de la prueba (figuras 3K y 3L, fila central). También se observaron aumentos similares de monocitos residentes (CD11b+CD115+Ly6Glowl'Ly6Cmidl‘) en el tiempo en ratonesC9orf72r-~en el bazo, la médula ósea y la sangre, con disminuciones observadas en los ganglios linfáticos cervicales (figuras 3K y 3L, fila inferior, respectivamente). Como se muestra en la figura 3M, se observaron poblaciones aumentadas de macrófagos F4/80+ en el bazo, ganglios linfáticos cervicales, riñón y médula ósea en ratonesC9orf72~l~en comparación con los de tipo natural.

También se analizó el análisis histopatológico en el contexto de la expresión de CD45R, CD3 y CD138 en el bazo y los ganglios linfáticos cervicales de ratones de tipo natural yC9orf72r/~(figuras 3N, 3O). Las secciones se observaron a 4x y 60x de aumento. En el bazo, los ratonesC9orf72r/~demostraron una pérdida de la morfología folicular normal (figura 3N). Las áreas de pulpa blanca estaban agrandadas y displásicas con bordes mal definidos. Se observó una acumulación de células con abundante citoplasma rosa claro (células de tipo plasma). La tinción con CD138 no difirió notablemente de la de los ratones de tipo natural y algunas de las células proliferantes en el centro de la pulpa blanca no se tiñeron con CD45R, CD3 ni CD 138. Los bazos de los ratones de tipo natural demostraron una morfología esencialmente normal con áreas de pulpa blanca compuestas por linfocitos T centrales (IHC anti CD3) rodeadas por un borde de linfocitos B (IHC anti CD45R), y la tinción con CD138 para células plasmáticas fue mínima (figura 3<n>, izquierda).

En los ganglios linfáticos cervicales, los ratonesC9orf72r/~demostraron islas de tejidos linfoides esparcidas entre grandes agregados de células redondas con un solo núcleo y abundante citoplasma eosinófilo (figura 3O). Estas células reemplazaron la arquitectura normal, pero permanecieron áreas de linfocitos B y linfocitos T relativamente normales (evidentes en el centro de las secciones teñidas con CD3 y CD45R). Las células anómalas se tiñeron intermitentemente con CD3, CD138 (flecha en la imagen inferior derecha de la figura 3O) y CD45R, pero fueron generalmente negativas para los tres marcadores. Los ratones de tipo natural mostraron una morfología normal de los ganglios linfáticos (figura 3O, derecha). Se encontró inmunotinción con CD45R (linfocito B) en la periferia que rodea las zonas de linfocitos T (CD3) y CD138 rara vez tiñó células en la médula.

También se analizó el análisis histopatológico en el contexto de la expresión de F4/80 en el bazo y los ganglios linfáticos cervicales de ratones de tipo natural yC9orf72r/~(figura 3P). Las secciones se observaron a 4x y 60x de aumento. Los datos demostraron una tinción positiva de F4/80 (macrófagos) en ratonesC9orf72rl~,que se correlaciona con el gran infiltrado celular espumoso observado en la tinción con H&E (descrita anteriormente). También se observó tinción extracelular de F4/80 en la pulpa roja del bazo en ratonesC9orf72~l~.El número de células F4/80+ aumentó con la edad de 8-58 semanas en ratonesC9orí72rl~,y aumentó en los ganglios linfáticosC9orf72r/~en comparación con los ganglios linfáticos de tipo natural.

Los recuentos totales de células CD45+ (antígeno leucocitario común) aumentaron en todos los tejidos examinados de ratonesC9orf72rl~,lo que fue coherente con la infiltración inmunitaria observada. Sin embargo, los porcentajes de CD45+ en comparación con las poblaciones de células totales analizadas no cambiaron o se redujeron en comparación con el tipo natural (figura 3S). Se emplearon paneles de anticuerpos específicos para determinar si se alteró la homeostasis dentro de los subconjuntos de leucocitos. Los porcentajes de neutrófilos (CD45+CD11b+Ly6G+Ly6CintCD115-) y monocitos totales (CD45+CD11b+CD115+) aumentaron de forma variable en los ganglios linfáticos, el bazo y la médula ósea de ratonesC9orf72r/~en comparación con los de tipo natural (figura 3K y 3L). También se observó un aumento de macrófagos F4/80+ (CD45+CD11b+F4/80+Ly6G-) en el bazo, ganglio linfático, riñón y sangre (figura 3M). Curiosamente, aunque más células se tiñeron positivamente con F4/80 en los tejidos de ratonesC9orf72rl~,la señal general fue menos intensa que la observada en ratones de tipo natural, lo que indica un perfil de IHC F4/80 más extendido pero menos concentrado (figura 3P). La tinción de Ly6G y Ly6C reveló un mayor porcentaje de monocitos inflamatorios (CD45+CD11b+CD115+Ly6G-Ly6Chi) en el bazo, ganglio linfático, riñón y sangre de ratonesC9orf72rl~.

Se realizó un análisis FACS adicional en hembras de 30-35 semanas de edad, un punto temporal de interés específico, ya que la mayoría de los ratones nulos desarrollaron patología renal pero permanecieron viables. Como se muestra en la figura 3Q, los recuentos celulares totales realizados en todo el tejido demostraron un aumento significativo en los recuentos celulares absolutos por citometría de flujo para diversos compartimentos en ratonesC9orf72rl~.La identidad de dichos aumentos se determinó mediante citometría de flujo empleando diversos marcadores para células dendríticas mieloides, linfocitos NK y linfocitos T (figuras 3R-3AC). Las células dendríticas mieloides (CD45+CD11b+CD11c+MHCII+) aumentaron en porcentaje y el recuento celular total en ratonesC9orf72~l~en comparación con los de tipo natural, mientras que la fracción de linfocitos NK (NKp46+CD49b+) disminuyó (figura 3R). El porcentaje de células CD45+ (antígeno leucocitario común; tiñe todos los glóbulos blancos) es comparable entre los tejidos de ratones de tipo natural yC9orf72rl~,sin embargo, los recuentos celulares totales aumentan significativamente, lo que indica una infiltración significativa de células inmunitarias (figura 3S). La tinción con marcadores específicos de linfocitos T CD4+ (población de linfocitos T auxiliares) y CD8+ (población de linfocitos T citotóxicas) demostró porcentajes reducidos de poblaciones de linfocitos T (figuras 3T-3AC). Como se muestra mediante los resultados de IHC, perfil molecular y CBC, las disminuciones observadas en las poblaciones de linfocitos pueden reflejar el aumento en la proporción de células mieloides.

Como se ha mostrado anteriormente, los porcentajes de células CD45+CD8+ y CD45+CD4+ se redujeron en general en ratonesC9orf72r/~en comparación con ratones de tipo natural, lo que probablemente fue una consecuencia del aumento en la proporción de células mieloides consistente con los datos de la firma genética. Por el contrario, los recuentos celulares totales para estas poblaciones de linfocitos T aumentaron en ratonesC9orf72~1-.Esto fue un reflejo de la expansión bruta del tejido linfoide y la infiltración inmunitaria manifiesta observada. Las poblaciones de linfocitos T CD8+ y CD4+ se subdividieron aún más en función de la expresión de marcadores de activación de superficie adicionales (figuras 3V-3AC). Para los linfocitos T CD8+, se observó un porcentaje significativamente mayor de los marcadores de linfocitos T de activación temprana y de memoria efectora CD69 y CD44, respectivamente, en ratonesC9orf72'1'en comparación con los de tipo natural (figuras 3V y 3X). Además, se observó un mayor porcentaje de linfocitos T que expresaban PD-1, un receptor coinhibitorio que se regula positivamente en las células activadas y desempeña un papel importante en la regulación negativa del sistema inmunitario, en ratonesC9orf72rl~en comparación con los de tipo natural (figura 3Z). Los ganglios linfáticos cervicales demostraron una mayor expresión de CD44 y PD-1, aunque la expresión de CD69 disminuyó (figuras 3V-3AA). Para los linfocitos T CD4+, se observaron aumentos significativos en el porcentaje de CD44 y<p>D1 en el bazo, los ganglios linfáticos, el riñón y la sangre en ratonesC9orf72rl~en comparación con los de tipo natural, con valores comparables a los del tipo natural en la médula ósea (figuras 3U, 3W, 3AA). El porcentaje de expresión de CD69 aumentó en el bazo, los ganglios linfáticos cervicales y el riñón con una importancia variable (figura 3Y). Junto con el aumento de los linfocitos T activados, se observó un aumento de los porcentajes de linfocitos T reguladores CD4+FoxP3+ en los bazos y los ganglios linfáticos en ratonesC9orf72~l~en comparación con los de tipo natural (figura 3AB). Además, el compartimento esplénico demostró una expresión reducida de CD62L y CD127 (figura 3AC), que se expresan en linfocitos T sin tratar o de memoria central y se regulan negativamente una vez que los linfocitos T se activan. Las mediciones del recuento celular también demostraron aumentos significativos en los ratonesC9orf72rl~con diferente significación.

Los datos de los paneles de citocinas (figuras 3AD, 3AE y 3AF) demostraron citocinas elevadas en el suero de ratonesC9orf72~l~de 8-58 semanas de edad. En particular, a las 18 semanas de edad, los niveles de IL-17, IL-10, TNF-a e IL-12 (total) aumentaron significativamente en el suero de ratones machoC9orf72~l~en comparación con los de tipo natural (figura 3AD). Para estas mismas citocinas, se observaron niveles significativamente elevados en ratonesC9orf72~l~en comparación con ratonesC9orf72*l~.Estos datos indicaron una activación sistémica de los macrófagos en estos ratones. En todos los ratones macho analizados (8-58 semanas de edad), los ratonesC9orf72~l~demostraron un aumento significativo en los niveles circulantes de IFN-y, IL-10, IL-12 (total), IL-17 y TNF-a en comparación con los ratones de tipo natural. En ratones hembraC9orf72rl~de 8-38 semanas de edad, se observó un aumento significativo en los niveles circulantes de IL-10, IL-12 (total), IL-17, TNF-a y MCP-1, así como una tendencia creciente para IFN-y, en comparación con los ratones de tipo natural. IL-12 (total) aumentó aproximadamente 6 veces en ratonesC9orf72rl~en comparación con los ratones de tipo natural. IL-10, IL-17a y TNF-a también estaban elevados, aunque en menor medida. No se observaron cambios en los niveles de IL-1p, IL-2 o IL-4, y si bien hubo un aumento de IL-6 en algunos ratonesC9orf72rl~en comparación con los de tipo natural, esta diferencia no alcanzó la significación. Los niveles de la quimiocina MCP-1 aumentaron significativamente en ratones hembra, pero no en ratones machoC9orf72~l~(figuras 3AE y 3AF), e IFN-y aumentó significativamente en los machos, y algunas hembras mostraron un ligero aumento (figuras 3AE y 3AF). Por lo tanto, se observan niveles generales aumentados de citocinas proinflamatorias a las 8 semanas en ratonesC9orf72~l~con una significación variable en comparación con los ratones de tipo natural.

Como se muestra en las figuras 3AG-3AK, los ratonesC9orf72rl~que envejecen desarrollan una mayor gravedad de la glomerulonefritis. Este resultado se confirmó en la tinción con H&E y la IHC F4I80 en el hígado y el riñón (figura 3AK). Por ejemplo, el aumento de la tinción F4I80 por IHC en el hígado de ratonesC9orf72rl~de 8 semanas demostró una mayor infiltración de macrófagos, mientras que se observó una gran infiltración de células de macrófagos F4I80+ en el riñón de ratones hembra de 38 semanas de edad (figura 3AK). El aumento del nitrógeno ureico en sangre por química sérica se correlacionó con la nefropatía en ratonesC9orf72~l~,mientras que el aumento del contenido de globulina sérica indicó una afección inflamatoria. El nitrógeno ureico en sangre normal en ratones varía de 8-33 mgldl, mientras que los niveles de globulina normalmente varían de 1-4 gldl (véase, por ejemplo, Zaias, J.et al.,2009, J. Am. Assoc. Lab. Animal Sci. 48(4):387-390).

Un análisis posterior de los riñones reveló células mononucleares F4I80+ grandes que tenían características de células dendríticas presentes en grandes cantidades orientadas alrededor de los glomérulos de ratonesC9orf72rl~de 35 41 semanas de edad (figura 3AK). Se observaron grados de leves a moderados de glomerulonefritis en los riñones de ratonesC9orf72rl~de 35-60 semanas de edad mediante tinción con H&E (figura 3AK). En los animales más gravemente afectados, los glomérulos estaban agrandados, eran hipercelulares y mostraban proliferación mesangial e infiltración leucocítica. La manifestación de la enfermedad inmunomediada fue diversa, observándose un engrosamiento de las paredes capilares y proliferación del epitelio parietal en algunos glomérulos, mientras que otros mostraron una expansión del mesangio con un material hialino acelular, eosinófilo, consistente con glomeruloesclerosis y un grado variable de fibrosis periglomerular. Curiosamente, estas áreas no resultaron positivas para la deposición de amiloide tras la tinción con rojo Congo. Los cambios tubulares incluyeron dilatación tubular cortical y medular y la presencia de cilindros proteínicos hialinos y basofilia tubular con degeneraciónlregeneración. Dichos cambios no se observaron en ratones de tipo natural. Un panel de química sérica que reveló nitrógeno ureico en sangre elevado (por ejemplo, figura 3AG) y albúmina sérica disminuida fue consistente con una filtración glomerular alterada que se correlacionó con hallazgos renales histológicos en ratonesC9orf72~l~en comparación con ratones de tipo natural.

Para medir aún más la gravedad de la nefropatía observada en ratones nulos, se puntuaron a ciegas secciones de riñón teñidas con H&E para determinar glomerulonefritis membranoproliferativa, inflamación mononuclear intersticial, formación de cilindros hialinos, glomeruloesclerosis y túbulos basófilos; categorías de nefropatía asociadas con glomerulonefropatía inmunomediada. Como se muestra en la figura 9A, los gráficos ponderados de los resultados de la puntuación histopatológica demuestran que los cambios renales más significativos observados en ratones nulos están asociados con la glomerulonefritis membranoproliferativa. Las puntuaciones de histopatía individuales se representan (figura 9B) para mostrar que todos los ratones nulos muestran una glomerulonefritis membranoproliferativa mínima a grave con evidencia ocasional de categorías de enfermedad adicionales en animales más gravemente afectados. Puntuación de 0 = ninguno/a, 1 = mínimo/a, 2 = leve, 3 = moderado/a y 4 = grave. Las mediciones de ACR urinaria ensayadas en los puntos temporales a las 14 semanas (figura 9C, superior) y 24 semanas (figura 9C, inferior) de la misma cohorte de ratones indican la aparición de albuminuria en ratones C9orf72-/- con la edad. Los ratones heterocigotos mostraron valores comparables a los WT, lo que es coherente con la ausencia de un fenotipo observado.

Además, los ratonesC9orf72r/~demostraron mayores niveles de autoanticuerpos IgG e IgM totales mediante ELISA en comparación con los ratones de tipo natural, lo que indicó enfermedad autoinmunitaria (figura 3AI) y corresponde a mayores niveles de globulina sérica observados mediante química sérica (figura 3AG, panel superior). Además, el análisis ELISA sérico de ratonesC9orf72r/~indicó niveles significativamente elevados de anticuerpos circulantes de ADN bicatenario (ADNbc), anticuerpos antinucleares (ANA), anticuerpos anti Smith (anti Sm) y anticuerpos anti cardiolipina en comparación con los ratones de tipo natural. Los ANA son autoanticuerpos que se unen al contenido del núcleo celular. Los anticuerpos anti ADNbc son un tipo de anticuerpo ANA que se une específicamente al ADN bicatenario y los anticuerpos anti cardiolipina se dirigen contra los componentes fosfolípidos de la membrana mitocondrial.

Además, los ratonesC9orf72r/~demostraron un aumento significativo de los anticuerpos circulantes contra el factor reumatoide (RF) a las 8 semanas de edad (figura 3AH). Un mayor contenido de globulina sérica y de autoanticuerpos puede indicar una cualquiera de diversas afecciones, por ejemplo, trastorno de la médula ósea, enfermedad autoinmunitaria, una o más afecciones inflamatorias crónicas, hepatopatía, nefropatía, infecciones, etc. Por proporcionar un solo ejemplo, el lupus eritematoso sistémico (LES) se caracteriza por altos valores de autoanticuerpos contra muchos antígenos intracelulares y de membrana celular. Por ejemplo, los anticuerpos anti Sm, que se dirigen contra unidades centrales de ribonucleoproteínas nucleares pequeñas (snRNP), son un marcador específico para el LES.

Los valores de autoanticuerpos aumentados en pacientes con lupus se correlacionan positivamente con una mayor frecuencia de linfocitos T foliculares auxiliares (Tfh) circulantes (Xu, H.et al.Cell Immunol 295, 46-51 (2015)). La interrogación de esta población celular específica (CD4+CXCRS+CD44+ICOS+PD-1+Bcl-6+) en el bazo, ganglios linfáticos cervicales, ganglios linfáticos mesentéricos y sangre mediante análisis FACS reveló poblaciones de linfocitos Tfh significativamente aumentadas en los tejidosC9orf72r/~en comparación con los controles (figura 10). También se observaron linfocitos Tfh elevados en la médula óseaC9orf72r/~que no alcanzaron la significación (figura 10). En conjunto, estas observaciones respaldan la noción de que se produce una respuesta inmunitaria similar al LES humano en ausencia de la expresión deC9orf72.

Las expansiones en células plasmáticas y linfocitos B en transición/plasmablastos pueden estar asociadas con neoplasias específicas tales como mieloma múltiple y plasmacitoma, así como también con afecciones autoinmunitarias. El bazo y el ganglio linfático de ratonesC9orí72rl~estaban agrandados y un infiltrado inmunitario era notablemente obvio, sin embargo las células infiltrantes eran negativas para marcadores de linfocitos B (CD45R), y eran F4/80+ con características de macrófagos espumosos. Si bien la población de estas células era grande, ocupaban áreas regionales de estos tejidos consideradas apropiadas para el linaje, y no borraban la arquitectura básica de estos tejidos. Además, el índice mitótico era bajo, y solo se observaron mitosis raras. Por lo tanto, la neoplasia parecía poco probable. Sin embargo, había una población de células plasmáticas y células de Mott ocasionales presentes en estos tejidos, y evidencia de glomerulonefritis, lo que indicaba autoinmunidad en ratonesC9orf72rl~.Como se ha mostrado anteriormente, los valores de anti RF de tipo IgG e IgM estaban significativamente elevados en ratonesC9orf72r/~en comparación con ratones de tipo natural yC9orf72+/-(heterocigotos) (figura 3AH). Además, los niveles séricos totales de IgG e IgM estaban significativamente elevados en ratonesC9orf72r/~a partir de las 8 semanas de edad (figuras 3AG y 3AI), lo que era consistente con los paneles de química sérica que mostraban niveles elevados de globulina en ratonesc9orf72~'~.

Se ha informado que los autoanticuerpos contra la membrana basal glomerular o la deposición de complejos inmunitarios solubles dentro de los capilares glomerulares, seguidos de fijación del complemento e inflamación, causan nefropatía (glomerulonefritis inmunomediada). Para determinar si el aumento observado en los niveles totales de inmunoglobulina y autoanticuerpos contribuía a la glomerulonefritis, se realizó IHC en secciones de riñón de ratonesC9orf72r/~y de tipo natural de 8-63 semanas de edad para IgG e IgM totales (figura 3AL). Como se describe en el presente documento, los ratonesC9orf2r/~demuestran evidencia clara de glomerulonefritis tanto a nivel sérico como histológico. En particular, los riñones de ratonesC9orf72r/~demostraron un aumento de la inmunotinción de IgG en comparación con los ratones de tipo natural en todos los puntos temporales examinados. Además, a las 8 semanas, los riñonesC9orf72r/~mostraron una señal IHC intensa y difusa en la vasculatura y el epitelio tubular de la médula y la corteza. En correlación con el inicio de la patología de la glomerulonefritis, se observó un marcado aumento en la tinción glomerular de IgG e IgM a las 38 semanas. La tinción de IgG e IgM también se asoció frecuentemente con la capa parietal de la cápsula de Bowman. Ocasionalmente se observó tinción de IgG en el espacio urinario y/o dentro de los túbulos renales proximales, lo que indica una función de filtración glomerular alterada (es decir, fuga que excede la capacidad de reabsorción). Se observó una tinción intensa de IgG en las células epiteliales de los túbulos en animales con enfermedad grave, en consonancia con la reabsorción de IgG abundante. Se observó una tinción similar pero menos intensa para IgM con menor frecuencia. La tinción en glomérulos escleróticos disminuyó en comparación con el tipo natural, lo que fue consistente con un flujo sanguíneo alterado a estas unidades (es decir, las asas vasculares habían sido reemplazadas por células de la matriz o mesangiales). Sin embargo, los glomérulos que conservaban asas vasculares claras tendían a tener un aumento de IgG en comparación con el tipo natural. Con frecuencia se observaron depósitos granulares finos y/o tinción lineal de IgG e IgM asociados con las membranas vasculares con gran aumento, lo que sugiere un depósito de complejos inmunitarios.

La deposición del factor del complemento C3 se asocia comúnmente con depósitos de inmunoglobulina en las membranas basales del riñón. La IHC para el factor del complemento C3 reveló una tinción aumentada en los mechones glomerulares de ratonesC9orf72rl~en comparación con los de tipo natural (figura 3AL). La tinción granular y lineal fue más prominente en las membranas de la capa visceral de la cápsula glomerular, delineando prominentemente las asas capilares y los podocitos.

Los datos de la firma genética del perfil molecular en el bazo y los ganglios linfáticos cervicales (ratones de tipo natural yC9orf72~l~de 8-10 y 35 semanas) indicaron infiltración de poblaciones de células de macrófagos, monocitos y granulocitos. También se observó una disminución de los linfocitos T y B, lo que puede reflejar el aumento en la proporción de células mieloides presentes. Los análisis jerárquicos globales separaron principalmente las muestras de cerebro por género y edad, en lugar de genotipo, lo que indica que las diferencias en el perfil en este tejido se debían a la biología básica de las muestras y al genotipo. Solo la expresión deC9orf72fue consistentemente diferente en el tejido cerebral en ambas edades y géneros. Por el contrario, las muestras de bazo y ganglio linfático se agruparon en función del genotipo, siendo la edad y el sexo solo secundarios, lo que indicó que las diferencias del transcriptoma en estos órganos fueron el resultado de cambios en la expresión deC9orf72.Además, más de 100 locus asociados con la función inmunitaria demostraron diferencias de expresión significativas en ratonesC9orf72rl~en comparación con los de tipo natural, tanto para machos como para hembras, en puntos temporales tempranos y tardíos. Las firmas genéticas del bazo y los ganglios linfáticos en ratonesC9orf72r/~indicaron infiltración mieloide con una disminución simultánea en la huella linfocítica, en consonancia con los datos de CBC (véase anteriormente) que demuestran recuentos totales de leucocitos comparables entre cepas debido a un equilibrio entre células mieloides elevadas y linfocitos disminuidos. En una comparación de bioconjuntos, las coincidencias de perfil más fuertes fueron con firmas de respuesta inmunitaria, modelos de ratón de diversas afecciones inflamatorias y enfermedades infecciosas humanas. Como se muestra en este ejemplo, los datos de inmunofenotipado demostraron que los ratones que tienen una alteración en un locusC9orf72 (C9orf72~'~)desarrollan esplenomegalia y linfadenopatía a las 8 semanas de edad. En particular, los datos de CBC mostraron un aumento de monocitos, neutrófilos y eosinófilos circulantes en ratonesC9orf72~l~,así como una disminución de los linfocitos en la sangre a partir de las 8 semanas. Además, los ganglios linfáticos cervicales se hacen progresivamente más grandes con la edad en ratonesC9orf72r/~macho (58 semanas) y hembra (37 semanas). Este ejemplo también demuestra específicamente que los ratonesC9orf72r/~desarrollan glomerulonefritis (es decir, infiltración de macrófagos F4/80+ en el riñón) y enfermedad autoinmunitaria (es decir, niveles significativamente elevados de autoanticuerpos IgM e IgG) a medida que envejecen. Por lo tanto, este ejemplo describió específicamente que los roedores que tienen una alteración en un locusC9orf72como se describe en el Ejemplo 1 demuestran anomalías detectables en la periferia y la circulación ya aproximadamente a las 8 semanas de edad. En particular, la ablación deC9orf72conduce a una respuesta inmunitaria sistémica crónica que da como resultado citocinas inflamatorias elevadas y expansión mieloide en varios compartimentos.

Ejemplo 4. Administración de neurotoxinas a animales no humanos que tienen una alteración en un locusC9orf72

Este experimento demuestra que la administración de diversas toxinas a animales no humanos descritos en el presente documento puede exacerbar aspectos del fenotipo de tipo ELA observado. En particular, este ejemplo demuestra específicamente que la administración de diversas toxinas a ratonesC9orf72r/~exacerba levemente el fenotipo motor de tipo ELA y aumenta el estrés oxidativo en las neuronas motoras, pero no afecta al aumento de la inactividad y las anomalías de la marcha en estos ratones. Este ejemplo también demuestra que las neuronas motoras de ratonesC9orf72r/~desarrollan una disfunción mitocondrial significativa.

Brevemente, las células madre embrionarias de ratón se cultivan y se diferencian en neuronas motoras durante un período de ocho días. El primer día, las células madre embrionarias de ratón previamente congeladas se descongelan y se añaden a un tubo Falcon de 15 ml con 5 ml de medio de células madre embrionarias (medio ES: DMEM con FBS al 15 %, pen./estrep. al 1 %, glutamina al 1 %, aminoácidos no esenciales al 1 %, nucleósidos al 1 %, p-mercaptoetanol al 0,1 %, piruvato de sodio al 1 % y LIF a 10000 unidades/ml). A continuación, el tubo se centrifuga durante cinco minutos a 800 rpm. El sobrenadante se aspira y las células se suspenden en 10 ml de medio ES. A continuación, las células se siembran en placas en un matraz T75 recubierto con 10 ml de gelatina al 0,1 % y se incuban durante 30 minutos a 37 °C para facilitar la adhesión al fondo del matraz. A continuación, las células se incuban durante una noche. Al día siguiente, el medio se intercambia con medio fresco para su supervivencia.

Al día siguiente, el medio se aspira del matraz. El matraz se lava con 10 ml de PBS y, a continuación, se añaden 5 ml de tripsina para desprender las células del fondo del matraz. Las células se incuban durante cinco minutos a 37 °C. El desprendimiento se confirma comprobando el matraz con un microscopio. Se añade medio de diferenciación (10 ml de medio DFNK: DMEM/F12 avanzado al 44%, neurobasal al 44%, pen./estrept. al 1 %, glutamina al 1 %, pmercaptoetanol al 0,1 %, reemplazo de suero desactivado al 10 %) al matraz para detener la reacción de tripsina. La solución del matraz se recoge en un tubo Falcon y se centrifuga durante cinco minutos a 800 rpm. El sobrenadante se aspira y las células se suspenden en 12 ml de medio DFNK. A continuación, las células se siembran en placas de cultivo celular y se colocan en una incubadora durante una noche a 37 °C. Al día siguiente, la solución con las células se transfiere a un tubo Falcon y se centrifuga durante dos minutos a 500 rpm. El sobrenadante se aspira y las células se suspenden en 12 ml de medio DFNK. A continuación, las células se siembran en placas de cultivo celular nuevas y se colocan en una incubadora durante una noche. Al día siguiente, el medio de la placa se recoge y se transfiere a un tubo Falcon. A continuación, el tubo se centrifuga durante dos minutos a 500 rpm y, a continuación, el sobrenadante se aspira. Las células se suspenden en 36 ml de medio DFNK, con ácido retinoico a 1 pM y antagonista suavizado a una concentración final de 0,25 pM, para la diferenciación de las neuronas motoras. El medio se divide a 12 ml por placa en tres placas.

Después de tres días, los cuerpos embrionarios (EB) que se forman se disocian. En primer lugar, se recogen los EB y se transfieren a un tubo Falcon. A continuación, las células se centrifugan durante dos minutos a 500 rpm y el sobrenadante se aspira. A continuación, las células se lavan con 4 ml de PBS-glucosa. A continuación, se añaden 4 ml de tripsina a las células para la disociación química y se incuban durante cinco minutos. A continuación, se añade 1 ml de suero de caballo para detener la reacción de tripsina. Los EB se sedimentan durante cinco minutos y el sobrenadante se aspira. Se añaden 2 ml de PBS-glucosa-DNasa y las células se disocian mecánicamente diez veces. Las células sedimentan durante 5 minutos y las células disociadas se transfieren a un tubo aparte. Se añaden 2 ml de PBS-glucosa-DNasa a las células no disociadas y la disociación mecánica se repite. Las células sedimentan durante cinco minutos y, a continuación, las células disociadas se transfieren a un tubo aparte. Las células disociadas se centrifugan durante cinco minutos a 800 rpm y, a continuación, el sobrenadante se aspira. Las células disociadas se suspenden en 5 ml de medio de neurona motora de células madre embrionarias (medio ESMN: neurobasal, B27 al 2 %, suero de caballo al 2 %, pen./estrept. al 1 %, glutamina al 0,25 %, p-mercaptoetanol al 0,01 %, 10 ng/ml de BDNF, 10 ng/ml de CNTF, 10 ng/ml de GDNF). Las células se centrifugan durante cinco minutos a 800 rpm. El sobrenadante se aspira y las células se suspenden en medio ESMN. A continuación, las células se cuentan usando un contador celular automático Countess (Life Technologies) y de 0,5 a 1 millón de células se siembran en placas con 2 ml de medio ESMN por pocillo en cada placa de seis pocillos. Las células permanecen en ESMN (control) o ESMN con BMAA a concentraciones de 0,1-100 pM. Los recuentos de células se tomaron usando azul de tripano al 0,4 % usando un ajuste de diámetro celular medio de >20 pm (neuronas motoras). Los resultados de ejemplo se exponen en la figura 4.

En otro experimento, a ratones de tipo natural se les administraron inyecciones i.p. semanales de BMAA (500 mg/kg) o PBS (control) durante seis semanas a partir de la semana 1 (figura 5A, superior). Las mediciones del peso corporal se registraron cada semana hasta las 6 semanas, la semana 14 y la semana 18. El análisis del deterioro motor mediante pruebas de rotarod, locomotoras en campo abierto y de pasarela (como se ha descrito anteriormente) se registró al inicio del experimento (semana 0, 10 semanas de edad), cada dos semanas hasta las 6 semanas, la semana 14 y la semana 18. Los resultados de ejemplo se exponen en las figuras 5A-5D.

En el caso de los ratones de tipo natural, los datos demostraron que la BMAA destruye neuronas motoras de tipo natural cultivadas de una manera dependiente de la dosis a través de la vía mediada por el receptor AMPA/kainato. Además, las inyecciones semanales (i.p.) de BMAA no indujeron un fenotipo de tipo ELA en ratones de tipo natural (figuras 5A-5D). Se observaron resultados similares al usar 100 mg/kg de BMAA.

En otro experimento, a ratones de tipo natural yC9orf72r/~de edad avanzada (es decir, de 32 semanas de edad) se les administraron inyecciones i.p. semanales de BMAA (500 mg/kg) o PBS (control) durante seis semanas. Se registraron las mediciones del peso corporal cada semana hasta las 38 semanas a partir del día cero (es decir, 32 semanas). El análisis del deterioro motor mediante pruebas de rotarod, locomotoras en campo abierto y de pasarela (como se ha descrito anteriormente) también se registró al inicio del experimento (semana 0, 10 semanas de edad) y cada dos semanas hasta las 38 semanas. La Tabla 6 expone la metodología de puntuación relacionada con el deterioro motor, el temblor y la rigidez de los animales durante la prueba. Los resultados de ejemplo se exponen en las figuras 6A-6E. Los datos demostraron que la administración de BMAA a ratonesC9orf72r/~exacerba levemente el fenotipo motor de tipo ELA, pero no afecta al aumento de la inactividad y las anomalías de la marcha de estos ratones.

En otro experimento, las neuronas motoras de ratonesC9orf72r/~se cultivaron como se ha descrito anteriormente (véase también la figura 7) y se trataron con oligonucleótidos no codificantes que se dirigen selectivamente a los ARN que contienen repeticiones de la hebra codificante y reducen los focos de a Rn orientados a la hebra codificante sin afectar a la expresión general deC9orf72.El tratamiento vino seguido de la adición de BMAA 100 mM. La supervivencia y el estrés oxidativo de las neuronas motoras cultivadas se midieron los días 1 y 7. Brevemente, el estrés oxidativo de las neuronas motoras procedentes de células madre embrionarias sembradas en placas (descritas anteriormente) se evaluó midiendo los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) en las células usando el reactivo verde de estrés oxidativo CellROX de Life Technologies a una concentración final de 5 pM y con incubación durante 30 minutos a 37 °C. Después de la incubación, las células se lavaron tres veces con PBS y se midió la fluorescencia usando una fluorometría de microplaca estándar. Los resultados de ejemplo se exponen en la figura 7. Los datos demostraron que la exposición de las neuronas motorasC9orf72r/~a BMAa provoca un aumento del estrés oxidativo.

En otro experimento, se determinó la función mitocondrial en ratones de tipo natural yC9orf72rl\Brevemente, la relación de ADN mitocondrial con respecto a nuclear de neuronas motoras procedente de células madre embrionarias (descritas anteriormente) se midió mediante el aislamiento de ADN usando el reactivo DNAzol (Invitrogen). La pureza y la cantidad de ADN se evaluaron usando el espectrofotómetro Nanodrop 2000 (Thermo Scientific) y el kit de relación mitocondrial con respecto a nuclear de ratón NovaQUANT (Novagen) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Se utilizó el analizador Seahorse Bioscience XFe96 para evaluar la respiración mitocondrial de las neuronas motoras procedentes de células madre embrionarias. El porcentaje de la tasa de consumo de oxígeno hasta la primera medición de ratones de tipo natural se registró para 12 mediciones usando el analizador de flujo extracelular XFe96. La media de las tres primeras mediciones representó la respiración basal, las tres siguientes después de la adición de oligomicina (1<j>M) representaron la fuga de protones, la diferencia entre la respiración basal y la fuga de protones representó la producción de ATP, las tres siguientes mediciones después de la adición de FCCP (1<j>M) representaron la respiración máxima, la diferencia entre la respiración máxima y basal representó la capacidad respiratoria de reserva y las tres finales después de la adición de rotenona/antimicina A (0,5 j M) representaron la respiración no mitocondrial. Todos los datos se recopilaron de al menos tres experimentos independientes y se informan como media ± EEM. Se realizó la prueba de la t de Student para el análisis estadístico comparando los valores de los ratones de tipo natural con los ratonesC9orf72r'~con * para P < 0,05, ** para P < 0,01 y *** para P < 0,001. Los resultados de ejemplo se exponen en la figura 8.

Informes anteriores han demostrado que el agotamiento de ATP da como resultado la acumulación intracelular de Na+, lo que conduce a una hipertrofia celular patológica (Liang D.et al.,2007, Neurosurg. Focus 22(5):E2). Como se muestra en la figura 8, usando neuronas motoras diferenciadas de células madre de ratones de tipo natural yC9orf72/- (descritos anteriormente; véase también Wichterle H.et al.,2002, Cell 110(3):385-97), los ratonesC9orf72'~demostraron un fallo en la bomba Na-K ATPasa debido a la falta de ATP y/o al compromiso de la membrana celular. Por el contrario, no se observó ninguna diferencia en la supervivencia y el estrés oxidativo en las neuronas de tipo natural oC9orf72r/~(figura 8, superior). Curiosamente, se observó una mayor cantidad de ADN mitocondrial con respecto a nuclear en las neuronas motoras de ratonesC9orf72r/~(figura 8, superior, derecha), así como una tasa de respiración mitocondrial significativamente menor (P < 0,0001) en comparación con las neuronas motoras de tipo natural (figura 8, inferior, izquierda). Además, la respiración basal, la producción de ATP, la respiración máxima, la fuga de protones y la capacidad respiratoria de reserva fueron significativamente menores en las neuronas motorasC9orf72r/~en comparación con las de tipo natural (figura 8, inferior, derecha). Por lo tanto, las neuronas motoras de ratonesC9orf72rl~demuestran una disfunción mitocondrial significativa que probablemente conduce a daño celular e hipertrofia.

El presente ejemplo demuestra específicamente que los ratonesC9orf72r/~muestran déficits motores de tipo ELA. Además, este ejemplo destaca que, si bien la BMAA destruye neuronas motoras en una vía de excitotoxicidad de glutamato mediada por AMPA/kainato, la exposición a BMAA no es suficiente para inducir la enfermedadin vivo.Por otra parte, la exposición a BMAA solo exacerba levemente el fenotipo de la enfermedad de ELA en ratonesC9orf72r/~. Por lo tanto, los datos presentados en el presente documento sugieren que, al menos en algunas realizaciones, la pérdida de la proteína C9orf72 en ratonesC9orf72r/~no es el mecanismo principal de la enfermedad de ELA-DFT.

En conjunto, la presente divulgación demuestra específicamente que los ratonesC9orf72-/- creados de acuerdo con el Ejemplo 1 demuestran la ablación completa del locusC9orf72.Además, como se describe en el presente documento, los ratonesC9orf72r/~desarrollan varios fenotipos distintos a lo largo del desarrollo caracterizados por, por ejemplo, déficits motores significativos y una alteración en el sistema inmunitario y la función mitocondrial. Por ejemplo, los ratonesC9orf72r/~desarrollan un fenotipo autoinmunitario caracterizado por un aumento significativo en la concentración de autoanticuerpos en suero y la infiltración de diversas células inmunitarias en el bazo, los ganglios linfáticos, la médula ósea, los riñones y la sangre. Curiosamente, los datos de inmunofenotipado descritos en el presente documento ilustran que el producto génicoC9orf72desempeña un papel fundamental en la homeostasis del sistema inmunitario y la salud neuronal. En particular, la esplenomegalia y la linfadenopatía en los ratonesC9orf72r/~son el resultado de la infiltración de varias poblaciones celulares, incluyendo las células plasmáticas, monocitos, granulocitos y, más notablemente, macrófagos F4/80+ desde las 8 semanas de edad y progresivamente hasta las 60 semanas de edad. El panel de citocinas y los datos de perfiles moleculares sugieren en gran medida una vía de activación de Th1/macrófagos aumentada en ratonesC9orf72r/~.Por lo tanto, la presente divulgación demuestra específicamente que es poco probable que la haploinsuficiencia sea la causa principal de la patología de ELA-DFT en el contexto deC9orf72y proporciona un papel novedoso paraC9orf72en la función inmunitaria y la homeostasis en un análisis fenotípico completo de un animal no humano con ablación global deC9orf72.

EQUIVALENTES

El uso de términos ordinales tales como "primero/a", "segundo/a", "tercero/a", etc., en las reivindicaciones para modificar un elemento de una reivindicación no representa por sí mismo ninguna prioridad, precedencia u orden de un elemento de una reivindicación respecto de otro, o el orden temporal para llevar a cabo los actos de un método, sino que se usan simplemente como marcadores para distinguir un elemento de una reivindicación que tiene un determinado nombre de otro elemento que tiene el mismo nombre (salvo por el uso del término ordinal) para distinguir los elementos de la reivindicación.

Debe entenderse que los artículos "un" y "una" en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, a menos que se indique claramente lo contrario, incluyen las referencias en plural. Las reivindicaciones o descripciones que incluyen "o" entre uno o más miembros de un grupo se consideran satisfechas si uno, más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes en, se emplean en, o son de otro modo relevantes para un producto o un proceso dado a menos que se indique lo contrario o sea evidente de otro modo a partir del contexto. La invención incluye realizaciones en las que exactamente un miembro del grupo está presente en, se emplea en, o es de otro modo relevante, para un producto o proceso dado. La invención también incluye realizaciones en las que más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes en, se emplean en, o son de otro modo relevantes, para un producto o proceso dado. Además, debe entenderse que la invención abarca todas las variaciones, combinaciones y permutaciones en las que una o más limitaciones, elementos, cláusulas, términos descriptivos, etc., de una o más de las reivindicaciones enumeradas se introducen en otra reivindicación dependiente de la misma reivindicación base (o, según sea pertinente, en cualquier otra reivindicación) a menos que se indique lo contrario o a menos que sea evidente para un experto en la técnica que surge una contradicción o inconsistencia. Cuando los elementos se presentan como listados, (por ejemplo, en el grupo Markush o en un formato similar), debe entenderse que también se divulga cada subgrupo de los elementos, y que puede eliminarse cualquier elemento del grupo. Debe entenderse que, en general, cuando la invención o aspectos de la invención, se refiere, o se refieren, a comprender elementos particulares, características, etc., determinadas realizaciones de la invención o aspectos de la invención consisten, o consisten esencialmente en, dichos elementos, características, etc. Por motivos de simplicidad, estas realizaciones no se han expuesto específicamente en todos los casos en el presente documento con tantas palabras.

Los expertos en la técnica apreciarán los estándares típicos de desviación o error atribuibles a los valores obtenidos en ensayos u otros procesos descritos en el presente documento.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una neurona motora aislada de roedor cuyo genoma comprende una deleción de la porción codificante del exón 2 a la porción codificante del exón 11 de un locusC9orf72endógeno.

2. La neurona motora aislada de roedor de la reivindicación 1, en donde el locusC9orf72comprende un gen indicador.

3. La neurona motora aislada de roedor de la reivindicación 2, en donde el gen indicador está unido operativamente a un promotor deC9orf72.

4. La neurona motora aislada de roedor de la reivindicación 3, en donde el promotor deC9orf72es un promotor endógeno.

5. La neurona motora aislada de roedor de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la neurona motora de roedor es

(i) una neurona motora de rata o

(ii) una neurona motora de ratón.

6. Un método para elaborar una neurona motora de roedor que comprende una deleción de la porción codificante del exón 2 a la porción codificante del exón 11 de un locusC9orf72endógeno, comprendiendo el método cultivar y diferenciar una célula madre embrionaria (ES) de roedor en una neurona motora de roedor, en donde la célula ES de roedor comprende una deleción de la porción codificante del exón 2 a la porción codificante del exón 11 de un locusC9orf72endógeno.

7. El método de la reivindicación 6, en donde los cuerpos embrionarios se forman a partir de la célula ES de roedor, y los cuerpos embrionarios se diferencian en la neurona motora de roedor.

8. El método de las reivindicaciones 6 o 7, en donde la neurona motora de roedor exhibe disfunción mitocondrial y/o estrés oxidativo en comparación con una neurona motora de tipo natural.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en donde el locusC9orf72endógeno comprende un gen indicador.

10. El método de la reivindicación 9, en donde el gen indicador está unido operativamente a un promotor deC9orf72.

11. El método de la reivindicación 10, en donde el promotor deC9orf72es un promotor endógeno.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6-11, en donde la célula ES de roedor es una célula ES de rata.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6-11, en donde la célula ES de ratón es una célula ES de ratón.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6-13, en donde la célula ES de roedor es homocigota o heterocigota para la deleción.

15. Un método para cribar un agente candidato para reducir la disfunción mitocondrial y/o el estrés oxidativo en una neurona motora, comprendiendo el método:

a) cultivar la neurona motora de roedor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en presencia o ausencia de un agente;

b) determinar si el agente previene, inhibe y/o reduce la disfunción mitocondrial y/o el estrés oxidativo en la población de neuronas motoras en comparación con una población de control de neuronas motoras cultivadas en ausencia del agente; en donde la prevención, la inhibición y/o la reducción del estrés oxidativo en las neuronas motoras es indicativa de un agente candidato para reducir la disfunción mitocondrial y/o el estrés oxidativo en una neurona motora de roedor.