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ES3005933T3 - Probiotic compositions and methods - Google Patents

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ES3005933T3
ES3005933T3 ES18166007T ES18166007T ES3005933T3 ES 3005933 T3 ES3005933 T3 ES 3005933T3 ES 18166007 T ES18166007 T ES 18166007T ES 18166007 T ES18166007 T ES 18166007T ES 3005933 T3 ES3005933 T3 ES 3005933T3
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ES
Spain
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paracasei cba
fermented
supernatant
milk
compositions
Prior art date
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Active
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ES18166007T
Other languages
English (en)
Inventor
Andrea Budelli
Francesca Romana Fasano
Miryam Terzano
Lorenzo Bramati
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HJ Heinz Co Brands LLC
Original Assignee
HJ Heinz Co Brands LLC
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Publication date
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Abstract

La presente invención presenta composiciones y métodos para la modulación del sistema inmunitario de las mucosas. Las composiciones incluyen alimentos fermentados por el organismo probiótico Lactobacillus paracasei CBA L74 (Número de Acceso al Depósito Internacional LMG P-24778). Alternativamente, las composiciones pueden incluir L. paracasei CBA L74 y un vehículo fisiológicamente aceptable. En algunas realizaciones, el L. paracasei CBA L74 puede ser no replicativo. Las composiciones pueden administrarse a un sujeto que padece o está en riesgo de padecer trastornos gastrointestinales relacionados con la inmadurez del sistema inmunitario, una infección o una enfermedad. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos probióticos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a organismos probióticos, a productos alimentarios preparados con el sobrenadante de cultivos de organismos probióticos, y a composiciones farmacéuticas que comprenden dicho sobrenadante. Estas composiciones son útiles para estimular el sistema inmune de las mucosas y para el tratamiento de trastornos asociados con la inmadurez del sistema inmune de las mucosas.
Antecedentes de la invención
El epitelio intestinal está constantemente expuesto a materiales extraños que pueden ser perjudiciales o beneficiosos para el hospedador. Como resultado, el sistema inmunológico intestinal debe lograr un delicado equilibrio entre: 1) respuestas inmunes protectoras inducidas por patógenos o toxinas intestinales y 2) evitación de respuestas inmunes contra tanto antígenos alimentarios como contra los 1014 microorganismos comensales beneficiosos que normalmente residen en el intestino. La alteración de las respuestas protectoras o de las respuestas de tolerancia puede dar lugar a una amplia gama de trastornos que incluyen, por ejemplo, infecciones, inflamación, alergias alimentarias, hipersensibilidad alimentaria, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, celiaquía, enfermedad periodontal, artritis reumatoide, aterosclerosis y cáncer de colon.
La red inmunorreguladora que compone el sistema inmune intestinal cambia con la edad. La red está poco desarrollada en los neonatos humanos, y se establece gradualmente durante los primeros años de vida. La inmadurez del sistema inmune juega un papel en la prevalencia de infecciones y trastornos relacionados con la alimentación en lactantes y niños pequeños. Por el contrario, la capacidad del sistema inmunitario intestinal para responder a nuevos desafíos disminuye en los ancianos.
Los trastornos gastrointestinales, por ejemplo las infecciones, los trastornos inflamatorios y los trastornos relacionados con los alimentos, tales como las alergias alimentarias, la intolerancia alimentaria o la hipersensibilidad alimentaria, tienen un impacto significativo en la salud y la calidad de vida tanto de los niños como de los adultos. La gastroenteritis infecciosa es el trastorno gastrointestinal pediátrico más común. Cada año se producen alrededor de mil millones de episodios en todo el mundo, más comúnmente en países en desarrollo entre niños menores de 5 años. Las tasas de mortalidad mundial por gastroenteritis infecciosa promedian entre 3 y 6 millones de niños por año. En Estados Unidos se producen anualmente de 25 a 35 millones de nuevos casos, que provocan entre 300 y 400 muertes. Además, la gastroenteritis infecciosa en Estados Unidos da lugar a unas 200.000 hospitalizaciones y 1,5 millones de visitas ambulatorias con un coste superior a los 1.000 millones de dólares. Los trastornos relacionados con la alimentación, tales como las alergias, también tienen un efecto sustancial en la salud tanto de los niños como de los adultos. Los síntomas de las alergias alimentarias pueden variar según la gravedad de la alergia, y pueden oscilar desde una leve sensación de hormigueo alrededor de la boca y los labios hasta una anafilaxia potencialmente mortal. Se estima que las alergias alimentarias afectan entre el 110% de la población en los EE. UU. El Centro para el Control de Enfermedades encontró que, en 2007, aproximadamente 3 millones de niños menores de 18 años (3,9%) habían tenido una alergia alimentaria o digestiva en los 12 meses anteriores. Para algunos niños, las alergias alimentarias se vuelven menos severas con la edad, para otros, siguen siendo una preocupación de por vida. Los bebés que sufren de alergia a temprana edad pueden desarrollar una "marcha alérgica". Por ejemplo, muchas personas que tienen reacciones alérgicas graves a la leche de vaca en la infancia corren el riesgo de desarrollar asma más adelante en la niñez. Hay indicios de que la prevalencia de las alergias alimentarias está aumentando en todo el mundo.
Independientemente de la etiología, los trastornos gastrointestinales no sólo afectan negativamente la salud del niño, sino que pueden tener un impacto grave en la economía familiar, las interacciones sociales y la asistencia a la escuela y al trabajo de los padres. Los documentos CA2761691A1, EP1364586A1 y WO99/29833A1 describen composiciones probióticas con efectos inmunomoduladores. Existe una necesidad continua de estrategias terapéuticas que promuevan la salud gastrointestinal, particularmente en individuos que están en riesgo de padecer trastornos gastrointestinales o que los padecen.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona una composición que comprende un sobrenadante de un cultivo fermentado de la bacteria probióticaLactobacillus paracaseiCBA L74, Número de Acceso del Depósito Internacional LMG P-24778, en la que todas o sustancialmente todas las células deLactobacillus paracaseiCBA L74 se han eliminado del sobrenadante, en la que el sobrenadante comprende uno o más componentes bacterianos subcelulares deLactobacillus paracaseiCBA L74. La composición puede comprender además un portador fisiológicamente aceptable. El portador fisiológicamente aceptable puede ser un producto alimentario o un portador farmacéutico.
La presente invención también proporciona un sobrenadante de un cultivo fermentado de la bacteria probióticaLactobacillus paracaseiCBA L74, Número de Acceso del Depósito Internacional LMG P-24778, para uso en el tratamiento de un trastorno gastrointestinal en un sujeto, en el que todas o sustancialmente todas las células deLactobacillus paracaseiCBA L74 se han eliminado del sobrenadante, en el que el sobrenadante comprende uno o más componentes bacterianos subcelulares deLactobacillus paracaseiCBA L74. El trastorno gastrointestinal que se va a tratar con el sobrenadante de cultivo de la presente invención puede ser un déficit del sistema inmune de las mucosas, una alergia alimentaria, un trastorno asociado con diarrea, una infección bacteriana o viral, síndrome del intestino irritable, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, celiaquía, o enterocolitis necrotizante. De acuerdo con el sobrenadante para uso según la invención, el déficit del sistema inmune de la mucosa puede ser un sistema inmune inmaduro. Se prevé que el sujeto a tratar con el sobrenadante para uso según la invención pueda ser un lactante.
No pertenecen a la invención, pero también se describen aquí métodos para obtener una composición nutricional, comprendiendo el método: proporcionar un producto alimentario; combinar el producto alimentario con una cantidad eficaz de la bacteria probiótica,Lactobacillus paracaseiCBA L74, Número de Acceso del Depósito Internacional LMG P-24778, y, opcionalmente, un co-inoculo, para formar una mezcla; e incubar la mezcla a una temperatura y durante un tiempo suficientes para que se produzca la fermentación. La composición nutricional puede secarse. La composición nutricional puede combinarse con uno o más productos alimentarios adicionales. Para cualquiera de las composiciones y métodos descritos aquí, las células deLactobacillus paracaseiCBA L74 pueden someterse a tratamientos que las vuelvan no replicativas. La concentración deLactobacillus paracaseiCBA L74 en las composiciones puede variar dependiendo del uso previsto, por ejemplo como una composición nutricional o una composición farmacéutica. Los intervalos útiles incluyen el equivalente de alrededor de 1 x 102 unidades formadoras de colonias por gramo ("ufc/g") a alrededor de 1 x 1012 unidades formadoras de colonias por gramo ("ufc/g") de peso seco.
También se analizan los artículos de fabricación. Estos pueden incluir kits que comprenden una cantidad medida de una composición nutricional que comprende un producto alimentario fermentado, en los que el producto alimentario ha sido fermentado por la bacteria probiótica,Lactobacillus paracaseiCBA L74, Número de Acceso del Depósito Internacional LMG P-24778, y uno o más elementos seleccionados del grupo que consiste en material de envasado, un prospecto que comprende instrucciones de uso, un fluido estéril, y un recipiente estéril. El kit puede incluir una cantidad medida de una composición farmacéutica que comprendeLactobacillus paracaseiCBA L74, Número de Acceso del Depósito Internacional LMG P-24778, y uno o más elementos seleccionados del grupo que consiste en material de envasado, un prospecto que comprende instrucciones de uso, un fluido estéril, y un recipiente estéril.
Breve descripción de los dibujos
Estas y otras características y ventajas de la presente invención se describirán más completamente, o se harán obvias, mediante la siguiente descripción detallada de la realización preferida de la invención, que se debe considerar junto con los dibujos adjuntos, en los que los números iguales se refieren a las mismas partes, y además en los que:
la FIG. 1 es una tabla que muestra un análisis del efecto deL. paracaseiCBA L74 sobre el fenotipo de células DC.
la FIG. 2a es un gráfico que representa la producción de IL-10 en DC cocultivadas con Caco2 expuestas aL. paracaseiCBA L74. la FIG. 2b es un gráfico que representa la producción de IL-12 en DC cocultivadas con Caco2 expuestas aL. paracaseiCBA L74.
la FIG.3 es un gráfico que representa la proliferación de células T expuestas a DC cocultivadas con células CaCo2.
la FIG. 4 es un gráfico que representa la producción de IL-1 p en la mucosa intestinal de ratones suplementados conL. paracaseiCBA L74.
la FIG. 5 es un gráfico que representa la producción de IL-4 en la mucosa intestinal de ratones suplementados conL. paracaseiCBA L74.
la FIG. 6 es un gráfico que representa la producción de IgA en la mucosa intestinal de ratones suplementados conL. paracaseiCBA L74.
la FIG. 7 muestra un análisis de los niveles de TLR2, TLR4 y TLR9 en la mucosa intestinal de ratones suplementados conL. paracaseiCBA L74.
la FIG. 8 muestra un análisis de los niveles de PPARy en la mucosa intestinal de ratones suplementados conL. paracaseiCBA L74.
la FIG. 9a es un gráfico que representa los niveles séricos de IL-1 p en ratones suplementados conL. paracaseiCBA L74. la FIG. 9b es un gráfico que representa los niveles séricos de IL-4 en ratones suplementados conL.
paracaseiCBA L74.FIG. 10 es una tabla que muestra un análisis del efecto deL. paracaseiCBA L74 sobre el fenotipo de DC en ratones suplementados conL. paracaseiCBA L74.
la FIG. 11a es un gráfico que representa los fenotipos de linfocitos CD4+ intestinales en ratones suplementados conL. paracaseiCBA L74. la FIG. 11b es un gráfico que representa los fenotipos de linfocitos CD8+ intestinales en ratones suplementados conL. paracaseiCBA L74.
la FIG. 12 es un gráfico que representa la producción de IL-10 en la mucosa intestinal de ratones suplementados con leche fermentada porL. paracaseiCBA L74.
la FIG. 13 es un gráfico que representa la producción de IL-1 p en la mucosa intestinal de ratones suplementados con leche fermentada porL. paracaseiCBA L74.
la FIG. 14 es un gráfico que representa la producción de IgA en la mucosa intestinal de ratones suplementados con leche fermentada porL. paracaseiCBA L74.
la FIG. 15 muestra un análisis de los niveles de TLR2, TLR4, TLR9 y PPARy en la mucosa intestinal de ratones suplementados con leche fermentada porL. paracaseiCBA L74.
la FIG. 16 representa un análisis de los niveles de pNF-kB e IKBa en la mucosa intestinal de ratones suplementados con leche fermentada porL. paracaseiCBA.
la FIG. 17 representa un análisis del efecto deL. paracaseiCBA L74 sobre el fenotipo de células DC en ratones suplementados con leche fermentada porL. paracaseiCBA.
la FIG. 18 es un análisis del efecto deL. paracaseiCBA L74 sobre el fenotipo de células DC después de la exposición a LPS o CpG en ratones suplementados con leche fermentada porL. paracaseiCBA.
la FIG. 19 es un gráfico que representa los fenotipos de linfocitos CD4+ intestinales en ratones suplementados con leche fermentada porL. paracaseiCBA L74.
la FIG. 20 es un gráfico que representa los fenotipos de linfocitos CD8+ intestinales en ratones suplementados con leche fermentada porL. paracaseiCBA L74.
la FIG. 21 muestra la evaluación histológica de la mucosa ileal en ratones suplementados con leche fermentada porL. paracaseiCBA L74.
la FIG. 22 es un gráfico que representa la producción de IL-1 p e IL-4 en la mucosa intestinal de ratones suplementados con arroz fermentado porL. paracaseiCBA L74.
la FIG. 23 es un gráfico que representa la producción de IL-10 en la mucosa intestinal de ratones suplementados con arroz fermentado porL. paracaseiCBA L74.
la FIG. 24 es un análisis de los niveles de TLR2 y TLR4 en la mucosa intestinal de ratones suplementados con arroz fermentado porL. paracaseiCBA L74.
la FIG. 25a es un análisis de los niveles de PPARy en la mucosa intestinal de ratones suplementados con arroz fermentado porL. paracaseiCBA L74. la FIG. 25b es un análisis de los niveles de pNF-kB e IKBa en la mucosa intestinal de ratones suplementados con arroz fermentado porL. paracaseiCBA L74.
la FIG. 26 es una tabla que muestra un análisis del efecto deL. paracaseiCBA L74 sobre el fenotipo de DC en ratones suplementados con arroz fermentado porL. paracaseiCBA L74.
la FIG. 27 es una tabla que muestra un análisis del efecto deL. paracaseiCBA L74 sobre el fenotipo de DC después de la exposición a LPS o CpG en ratones suplementados con arroz fermentado porL. paracaseiCBA L74.
la FIG. 28 es un gráfico que representa los fenotipos de linfocitos CD4+ intestinales en ratones suplementados con arroz fermentado porL. paracaseiCBA L74.
la FIG. 29 es un gráfico que representa los fenotipos de linfocitos CD8+ intestinales en ratones suplementados con arroz fermentado porL. paracaseiCBA L74.
la FIG 30 es un gráfico que representa un análisis del efecto de las células deL. paracaseiCBA L74 y el sobrenadante celular sobre la producción de IL-10 en MoDC humanas en presencia deSalmonella typhimurium.
la FIG 31 es un gráfico que representa un análisis del efecto de las células deL. paracaseiCBA L74 y el sobrenadante celular sobre la producción de IL-12p70 en MoDC humanas en presencia deSalmonella typhimurium.
la FIG 32 es un gráfico que representa un análisis del efecto de la leche fermentada conL. paracaseiCBA L74 sobre la producción de IL-10 en MoDC humanas en presencia deSalmonella typhimurium, y el efecto de la inactivación deL. paracaseiCBA L74 sobre la producción de IL-10 en MoDC humanas en presencia deSalmonella typhimurium.
la FIG 33 es un gráfico que representa un análisis del efecto de la leche fermentada conL. paracaseiCBA L74 sobre la producción de IL-12p70 en MoDC humanas en presencia deSalmonella typhimurium, y el efecto de la inactivación deL. paracaseiCBA L74 sobre la producción de IL-12p70 en MoDC humanas en presencia deSalmonella typhimurium.
la FIG 34 es un gráfico que representa un análisis del efecto del arroz fermentado conL. paracaseiCBA L74 sobre IL-1 p, TNF-a e IL-10 en un modelo de explante de tejido intestinal en presencia deSalmonella typhimurium.
Descripción detallada
La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de los inventores de que los alimentos fermentados por el organismo probióticoLactobacillus paracasei, cepa CBA L74, pueden tener propiedades inmunomoduladoras. Esta cepa fue aislada por los inventores y depositada según el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Fines del Procedimiento de Patentes el 9 de septiembre de 2008 en el Laboratorium voor Microbiologie (LMG) de las Colecciones Coordinadas Belgas de Microorganismos (BCCM), Gante, Bélgica. El Depositante fue Plada Industriale srl, de Via Cascina bel Casule 7, 20141 Milán, Italia. El Número de Acceso otorgado por la Autoridad Depositaria Internacional es LMG P-24778. Para facilitar la lectura, no repetiremos la frase "Número de Acceso LMG P-24778" en cada ocasión. Se debe entender que cuando nos referimos aL. paracasei,cepa CBA L74, nos referimos a la cepa depositada que tiene el Número de Acceso LMG P-24778.
Las composiciones de la invención son sobrenadantes de un cultivo fermentado del organismo probiótico,L. paracaseiCBA L74. La Organización Mundial de la Salud ha definido los probióticos como: "Microorganismos vivos que, administrados en cantidades adecuadas, confieren un beneficio a la salud del hospedador''. LaL. paracaseiCBA L74 puede someterse a tratamientos que la hagan no replicativa, por ejemplo exposición al calor, desecación, irradiación Y, o irradiación ultravioleta. UnaL. paracaseiCBA L74 no replicativa puede ser una célula muerta o una célula viva que se ha vuelto incapaz de dividirse celularmente. UnaL. paracaseiCBA L74 no replicativa puede ser una célula intacta o una célula que ha sufrido una lisis parcial o completa. Las células no replicativas pueden incluir una mezcla de células intactas y lisadas.
Si bien creemos que entendemos ciertos eventos que ocurren tras la administración de composiciones obtenidas por fermentación conL. paracaseiCBA L74, las composiciones de la presente invención no se limitan a aquellas que funcionan afectando algún mecanismo celular en particular. Nuestra hipótesis de trabajo es que los organismos probióticos o composiciones fermentadas con organismos probióticos pueden proporcionar una mayor barrera a la translocación de bacterias y productos bacterianos a través de la mucosa, excluir competitivamente patógenos potenciales, modificar la respuesta del hospedador a los productos microbianos, y mejorar la nutrición enteral de manera que inhiba el crecimiento de patógenos. Los efectos beneficiosos de las composiciones pueden derivar, por ejemplo, de metabolitos producidos durante la fermentación, por ejemplo ácidos orgánicos tales como ácido láctico, ácido butírico o ácido acético. Alternativamente o además, el ADN microbiano, por ejemplo dinucleótidos CpG no metilados, fragmentos de la pared celular bacteriana y otros componentes bacterianos subcelulares, tales como proteínas, hidratos de carbono y lípidos, pueden ejercer efectos inmunomoduladores sobre el sistema inmune de las mucosas.
Los inventores han descubierto queL. paracaseiCBA L74 aislada moduló los niveles de marcadores proinflamatorios y antiinflamatorios cuando se analizó in vitro e in vivo. Además, también se observaron efectos inmunomoduladores tras la administración de alimentos que habían sido fermentados porL. paracaseiCBA L74. Se observaron tales efectos inmunomoduladores incluso cuando los alimentos fermentados habían sido tratados, por ejemplo, con calor, para hacer no replicativa a laL. paracaseiCBA L74. En consecuencia, la invención presenta composiciones que pueden utilizarse para estimular el sistema inmune intestinal. Las composiciones pueden incluir productos alimentarios que han sido fermentados porL. paracaseiCBA L74. Los productos alimentarios pueden ser cualquiera de un amplio intervalo de alimentos que son susceptibles de fermentación conL. paracaseiCBA L74. En algunas realizaciones, las composiciones pueden incluir fermentado deL. paracaseiCBA L74 y un portador fisiológico. El portador puede ser un producto alimentario, pero la invención no es tan limitativa, y en algunas realizaciones el portador puede ser un portador farmacológico. También se proporcionan métodos para preparar y utilizar las composiciones. Los métodos de la descripción incluyen métodos para producir composiciones que comprendenL. paracaseiCBA L74, métodos para fermentar productos alimentarios conL. paracaseiCBA L74, y métodos para administrar las composiciones para generar una respuesta inmunomoduladora en un sujeto. Las composiciones pueden ser para administración a un sujeto que tiene un sistema inmune inmaduro, un sujeto en riesgo de sufrir un trastorno gastrointestinal o que tiene un trastorno gastrointestinal. Las composiciones pueden utilizarse en sujetos humanos, por ejemplo lactantes y niños, o en medicina veterinaria.
Composiciones
Alimentos fermentados
Se describen aquí composiciones nutricionales, es decir, productos alimentarios fermentados por el organismo probiótico,L. paracaseiCBA L74. Se podrá utilizar cualquier producto alimentario susceptible de fermentación porL. paracaseiCBA L74. El producto alimentario puede ser un producto lácteo, por ejemplo leche o un producto a base de leche. Entre las fuentes de leche ejemplares se incluyen, sin limitación, el ganado vacuno, las ovejas, las cabras, los yaks, los búfalos de agua, los caballos, los burros, los renos y los camellos. Independientemente de la fuente, la leche o los productos lácteos pueden estar en cualquier forma adecuada para la fermentación porL. paracaseiCBA L74. Por ejemplo, la leche puede ser leche entera o leche que se ha procesado para eliminar parte o toda la grasa de la mantequilla, por ejemplo leche al 2%, leche al 1%, o leche desnatada. Alternativamente o además, la leche se puede pasteurizar y/o homogeneizar previamente, secar y reconstituir, condensar o evaporar. También se pueden utilizar fracciones de productos lácteos que incluyan caseína, proteína de suero o lactosa. En algunas realizaciones, el producto lácteo puede ser alrededor de 1 % a alrededor de 30% de leche desnatada en polvo reconstituida, por ejemplo alrededor de 2%, alrededor de 5%, alrededor de 7%, alrededor de 9%, alrededor de 10%, alrededor de 12%, alrededor de 15%, alrededor de 20%, alrededor de 25%, alrededor de 30% de leche desnatada en polvo reconstituida. Antes de la fermentación, el producto lácteo se puede combinar con uno o más de los siguientes: a) un hidrato de carbono (por ejemplo, un disacárido tal como dextrosa o un almidón; b) un lípido; c) una vitamina y d) un mineral. Por ejemplo, la leche desnatada en polvo se puede combinar con dextrosa hasta alrededor de un 2%, por ejemplo alrededor de un 0,25%, alrededor de un 0,50%, alrededor de un 0,75%, alrededor de un 1,0%, alrededor de un 1,5%, o alrededor de un 2,0%.
El producto alimentario puede ser un producto de cereal, por ejemplo arroz, trigo, avena, cebada, maíz, centeno, sorgo, mijo, o triticale. El producto de cereal puede ser un grano entero o molido para obtener harina. El producto alimentario puede ser un solo tipo de cereal o una mezcla de dos o más tipos de cereales, por ejemplo harina de avena más harina de cebada malteada. Los productos de cereales pueden ser de un grado y tipo adecuados para el consumo humano, o pueden ser productos adecuados para el consumo de animales domésticos. Generalmente, el producto de cereal se hidrata antes de la fermentación. La concentración de cereal puede variar, pero los intervalos útiles incluyen de alrededor de 5% a alrededor de 50% peso/volumen, por ejemplo alrededor de 8% peso/volumen, alrededor de 10% peso/volumen, alrededor de 12% peso/volumen, alrededor de 15% peso/volumen, alrededor de 18% peso/volumen, alrededor de 20% peso/volumen, alrededor de 22% peso/volumen, alrededor de 25% peso/volumen, alrededor de 30% peso/volumen, alrededor de 35% peso/volumen, alrededor de 40% peso/volumen, alrededor de 45% peso/volumen, o alrededor de 50% peso/volumen. Las concentraciones ejemplares incluyen 15% peso/volumen de arroz, o una mezcla de 18,5% peso/volumen de harina de avena más 5% peso/volumen de harina de cebada malteada. El pH de los cereales hidratados se puede ajustar utilizando cualquier ácido apto para el consumo. El ácido puede ser, por ejemplo, un ácido orgánico. Los ácidos orgánicos útiles incluyen ácido acético, ácido cítrico, ácido láctico, ácido adípico, ácido málico y ácido tartárico. Se puede utilizar cualquier combinación de dos o más ácidos. En algunas realizaciones, el pH se puede ajustar a alrededor de 4,0 usando ácido cítrico.
El producto alimentario también puede ser un producto vegetal o de fruta, por ejemplo un zumo, un puré, un concentrado, una pasta, una salsa, un encurtido o un ketchup. Las verduras y frutas ejemplares incluyen, sin limitación, calabazas, por ejemplo calabacín, calabaza amarilla, calabaza de invierno, calabaza; patatas, espárragos, brócoli, coles de Bruselas, judías, por ejemplo judías verdes, habichuelas, habas lima, habas, soja, repollo, zanahorias, coliflor, pepinos, colinabo, puerros, cebolletas, cebollas, guisantes dulces, guisantes ingleses, pimientos, nabos, colinabos, tomates, manzanas, peras, melocotones, ciruelas, fresas, frambuesas, moras, arándanos, arándanos rojos, moras de Boysen, grosellas espinosas, uvas, grosellas, naranjas, limones, pomelo, plátanos, mangos, kiwis, y carambolas.
El producto alimentario también puede ser una "leche" elaborada a partir de cereales ("leche" de cebada, avena o espelta), frutos secos ("leche" de almendras, anacardos, coco, avellanas o nueces), legumbres ("leche" de soja, cacahuete, guisante o altramuz) o semillas ("leche" de quinoa, de sésamo o de girasol).
También se contemplan productos alimentarios que comprenden proteínas animales, por ejemplo carne, por ejemplo embutidos, carnes secas, pescado y productos de pescado seco.
Independientemente del tipo de producto alimentario que se utilice, el producto se combina conL. paracaseiCBA L74 y se incuba a una temperatura y durante un tiempo suficientes para que se produzca la fermentación. Se puede utilizar cualquier método de fermentación estándar conocido en la técnica. Las condiciones de fermentación específicas variarán según muchos factores, incluyendo, por ejemplo, el tipo de producto alimentario, la concentración del producto alimentario, la instrumentación utilizada, el volumen de la muestra, la concentración inicial del inóculo deL. paracaseiCBA L74, la presencia, si la hay, de un co-inóculo, las propiedades organolépticas del alimento fermentado, y el uso previsto del alimento fermentado.
Tanto la instrumentación como el sustrato (es decir, el producto alimentario a fermentar) se esterilizan antes de la inoculación conL. paracaseiCBA L74 para disminuir el nivel de, o eliminar, bacterias viables y/u hongos y/o virus infecciosos. La instrumentación se puede esterilizar utilizando métodos estándar o según las instrucciones del fabricante. La elección de un método particular para la esterilización del sustrato dependerá, en parte, de la estabilidad del sustrato al método de esterilización. Por ejemplo, el sustrato se puede esterilizar con vapor y presión, por ejemplo mediante autoclave, ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento (por ejemplo, tindalización), exposición a altas presiones (por ejemplo, pascalización), ultrafiltración, o radiación (por ejemplo, exposición a rayos gamma, rayos X, rayos E, y/o ultravioleta (longitud de onda de 10 nm a 320 nm, por ejemplo 50 nm a 320 nm, 100 nm a 320 nm, 150 nm a 320 nm, 180 nm a 320 nm, o 200 nm a 300 nm). Se pueden retirar alícuotas del sustrato después del tratamiento y sembrarlas en un medio adecuado para confirmar la ausencia de contaminantes bacterianos y/o fúngicos. Si el sustrato se ha esterilizado mediante exposición a altas temperaturas, debe enfriarse hasta al menos 37 °C antes de la inoculación conL. paracaseiCBA L74.
El sustrato se puede inocular conL. paracaseiCBA L74 según métodos estándar, por ejemplo a partir de un cultivo líquido reciente o un cultivo liofilizado que se ha resuspendido en medio acuoso durante un corto tiempo antes de la inoculación. En general, se añadenL. paracaseiCBA L74 en concentraciones de alrededor de 0,5 x 106 a alrededor de 1 x 106 ufc/ml de sustrato, por ejemplo alrededor de 1 x 106 ufc/ml, alrededor de 2 x 106 ufc/ml, alrededor de 5 x 106 ufc/ml, 7 x 106 ufc/ml, 8 x 106 ufc/ml. El cultivo debe agitarse lo suficiente para producir una distribución relativamente uniforme de bacterias y sustrato, pero no excesivamente ya queL. paracaseiCBA L74 es una bacteria anaerobia. Por ejemplo, un cultivo de cinco litros puede agitarse a alrededor de 150 rpm. La temperatura de fermentación es generalmente 37 °C. Durante la fermentación se pueden monitorizar y ajustar en consecuencia diversos parámetros, por ejemplo el pH, la presión parcial de O<2>, la velocidad del agitador, la temperatura, el mezclamiento de gases, el nivel de espuma y la concentración de sustrato. El crecimiento deL. paracaseiCBA L74 se puede monitorizar utilizando métodos microbiológicos estándar. La fermentación se lleva a cabo hasta que la concentración deL. paracaseiCBA L74 esté entre alrededor de 108/ml y alrededor de 109/ml. Dependiendo del sustrato y otras condiciones, esta concentración puede alcanzarse en alrededor de 10 a alrededor de 30 horas después de la inoculación, por ejemplo alrededor de 12 horas, alrededor de 15 horas, alrededor de 18 horas, alrededor de 24 horas, alrededor de 30 horas.
Se pueden analizar muestras del sustrato antes, durante y después de la fermentación para garantizar la calidad utilizando métodos microbiológicos estándar. Los métodos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, el crecimiento en agar Rogosa paraL. paracaseiCBA L74, el crecimiento en agar de recuento en placa (PCA) para aerobios totales, el crecimiento en agar McConkay para coliformes, y el crecimiento en agar clostridial reforzado (RCM) paraClostridia.Además de los recuentos de colonias, se pueden observar las morfologías de las colonias y compararlas con muestras de referencia.
Se puede añadir un co-inóculo junto conL. paracaseiCBA L74, para ayudar a iniciar la fermentación. Los coinóculos útiles para la fermentación de productos lácteos incluyen, por ejemplo, sin limitación,Streptococcus thermophilus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus salivarious, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei, Lactobacillus lactis, Lactobacillus delbrueckii, subsp. Bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, o Leuconostoc mesenteroides.En general, la concentración del co-inóculo será menor que la deL. paracaseiCBA L74, por ejemplo alrededor de 1 x 104/ml x 105/ml. La concentración final de S.thermophiluspuede oscilar de alrededor de 0,5 x 108/ml a alrededor de 2,5 x 108/ml.
Productos alimentarios
Una vez que se hayan alcanzado concentraciones adecuadas deL. paracaseiCBA L74, el alimento fermentado puede procesarse adicionalmente para su uso. En algunas realizaciones, el pH del alimento fermentado se puede ajustar, por ejemplo de alrededor de 3,0 hasta cerca de la neutralidad, por ejemplo 6,5, con la adición de NaOH o KOH. En algunas realizaciones, el alimento fermentado se puede secar. El producto alimentario fermentado se puede secar mediante cualquier método conocido en la técnica que dé como resultado la retención de las propiedades inmunomoduladoras del alimento fermentado. Los métodos de secado ejemplares incluyen el secado por aspersión, el secado por congelación, por ejemplo la liofilización, o el secado en tambor. El contenido final de agua del producto alimentario fermentado puede variar, pero puede estar entre alrededor de 1% y alrededor de 10% o más. En algunas realizaciones, el procedimiento de secado puede hacer no replicativa a laL. paracaseiCBA L74.
Los alimentos fermentados secos se pueden hidratar antes de su uso. Dependiendo de la cantidad de líquido utilizado en la hidratación, los productos alimentarios fermentados pueden contener el equivalente a alrededor de 102 y 1012 ufc/ml deL. paracaseiCBA L74. LasL. paracaseiCBA L74 secas no forman colonias, por lo que se entiende que esta cantidad se calcula en función del número de bacterias vivas que estaban presentes en los alimentos fermentados antes de la etapa de secado. En algunas realizaciones, los productos alimentarios fermentados pueden incluir el equivalente a alrededor de 107 hasta alrededor de 1012 ufc/g, por ejemplo alrededor de 5 x 107 ufc/g, alrededor de 1 x 108 ufc/g, alrededor de 5 x 108 ufc/g, alrededor de 1 x 109 ufc/g, alrededor de 5 x 109 ufc/g, alrededor de 1 x 1010 ufc/g, alrededor de 5 x 1010 ufc/g, alrededor de 1 x 1011 ufc/g, alrededor de 5 x 1011 ufc/g de peso seco.
Dos o más productos alimentarios fermentados descritos aquí se pueden combinar antes de la administración. Por ejemplo, los productos lácteos fermentados pueden combinarse con productos de cereales fermentados. Alternativamente, el producto alimentario fermentado se puede combinar con otros productos alimentarios, por ejemplo productos alimentarios no fermentados o productos alimentarios fermentados utilizando otras cepas bacterianas. Se puede utilizar cualquier combinación siempre que se conserven las propiedades inmunomoduladoras del alimento fermentado. Los productos alimentarios ejemplares incluyen, sin limitación, productos lácteos, por ejemplo leche, yogur, cuajada, queso y productos a base de queso, leches fermentadas, productos fermentados a base de leche, polvos a base de leche, fórmulas infantiles, alimentos infantiles colados a base de leche, nata, helado italiano, pudines, sopas, salsas, purés, o aderezos, fórmulas nutricionales para personas mayores; productos de cereales, por ejemplo papilla, alimentos infantiles colados a base de cereales, avena, farina, sémola, polenta, pasta, galletas, galletas saladas, barras energéticas; productos vegetales, por ejemplo purés, alimentos infantiles colados a base de vegetales, verduras encurtidas que incluyen pepinos, repollo, zanahorias, habas, pimientos, o condimentos; productos de fruta, por ejemplo alimentos infantiles colados a base de fruta, productos de tomate, purés, salsas, pastas, ketchups, purés de fruta; o productos a base de proteínas, por ejemplo legumbres, salchichas, fiambres, perritos calientes, o carnes en puré. En algunas realizaciones, el alimento fermentado puede combinarse con alimentos para mascotas o piensos para animales.
Las composiciones son fermentos deL. paracaseiCBA L74, de los cuales se han eliminado todas o sustancialmente todas las células deL. paracaseiCBA L74 mediante centrifugación para producir un pelete celular y un sobrenadante de cultivo.
L. paracasei CBA L74 aisladas
Algunas composiciones descritas aquí, pero que no forman parte de la invención, incluyenL. paracaseiCBA L74 que están parcialmente o sustancialmente aisladas del medio en el que se cultivaron. LasL. paracaseiCBA L74 pueden estar vivas o no ser replicativas, es decir, pueden estar inactivadas, por ejemplo mediante tratamiento térmico. Las células se pueden liofilizar o secar por congelación en condiciones que preserven la viabilidad celular. Los métodos de liofilización son bien conocidos en la técnica.
Portadores fisiológicos
En algunas realizaciones, las composiciones de la invención pueden incluir sobrenadante de cultivo deL. paracaseiCBA L74 en combinación con un portador fisiológicamente aceptable.
El portador fisiológicamente aceptable puede ser un alimento o un producto alimentario. El fermentado deL. paracaseiCBA L74 se puede añadir a un alimento o producto alimentario antes del envasado o procesamiento. Alternativamente o además, el fermentado deL. paracaseiCBA L74 se puede añadir a un alimento o producto alimentario antes del consumo. Por ejemplo, el fermentado deL. paracaseiCBA L74 se puede combinar con cualquiera de los alimentos o productos alimentarios descritos anteriormente. El producto alimentario puede ser un producto alimentario fermentado o un producto alimentario no fermentado. Por ejemplo, el fermentado deL. paracaseiCBA L74 se puede añadir a un producto lácteo o de cereal sin fermentar.
Portadores farmacéuticos
Las composiciones también incluyen un portador farmacéuticamente aceptable. Utilizamos las expresiones "farmacéuticamente aceptable" (o "farmacológicamente aceptable") para referirnos a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica o de otro tipo cuando se administran a un animal o a un ser humano, según corresponda. La expresión "portador farmacéuticamente aceptable", como se utiliza aquí, incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos, isotónicos y retardantes de la absorción, amortiguadores, excipientes, aglutinantes, lubricantes, geles, tensioactivos y similares, que pueden utilizarse como medios para una sustancia farmacéuticamente aceptable.
Esta invención también incluye composiciones farmacéuticas que contienen, como ingrediente activo, el sobrenadante de cultivo deL. paracaseiCBA L74 descrito aquí, en combinación con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. Al preparar las composiciones de la invención, el sobrenadante del cultivo deL. paracaseiCBA L74 normalmente se mezcla con un excipiente, se diluye con un excipiente, o se encierra dentro de dicho portador en forma de, por ejemplo, una cápsula, comprimido, sobre, papel, u otro recipiente. Cuando el excipiente actúa como diluyente, puede ser un material sólido, semisólido o líquido (por ejemplo, disolución salina normal), que actúa como vehículo, portador o medio para el ingrediente activo. Así, las composiciones pueden presentarse en forma de comprimidos, píldoras, polvos, pastillas, sobres, sellos, elixires, suspensiones, emulsiones, disoluciones, jarabes, aerosoles (en forma de sólido o en un medio líquido), ungüentos, cápsulas de gelatina blandas y duras, supositorios, disoluciones inyectables estériles, y polvos envasados estériles. Como se sabe en la técnica, el tipo de diluyente puede variar dependiendo de la vía de administración prevista. Las composiciones resultantes pueden incluir agentes adicionales, tales como conservantes. El excipiente o vehículo se selecciona en función del modo y la vía de administración. Los portadores farmacéuticos adecuados, así como los requisitos farmacéuticos para su uso en formulaciones farmacéuticas, se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (E.W. Martin), un conocido texto de referencia en este campo, y en la USP/NF (Farmacopea de los Estados Unidos y Formulario Nacional). Algunos ejemplos de excipientes adecuados incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma arábiga, fosfato de calcio, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua, jarabe, y metilcelulosa. Las formulaciones pueden incluir adicionalmente: agentes lubricantes tales como talco, estearato de magnesio, y aceite mineral; agentes humectantes; agentes emulsionantes y de suspensión; agentes conservantes tales como hidroxi-benzoatos de metilo y de propilo; agentes edulcorantes; y agentes aromatizantes. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de modo que proporcionen una liberación rápida, sostenida o retardada del ingrediente activo después de la administración al paciente empleando procedimientos conocidos en la técnica.
Las composiciones farmacéuticamente aceptables para uso en los métodos presentes, incluidas aquellas en las que el sobrenadante del cultivo deL. paracaseiCBA L74 está atrapado en un coloide para administración oral, se pueden preparar según técnicas estándar. En algunas realizaciones, el sobrenadante del cultivo deL. paracaseiCBA L74 se puede combinar con uno o más excipientes, por ejemplo un disgregante, una carga, un deslizante, o un conservante. Las cápsulas adecuadas incluyen tanto cápsulas de cubierta dura como cápsulas de cubierta blanda. Para formar la cápsula, se puede utilizar cualquier coloide a base de lípidos o de polímeros. Los polímeros ejemplares útiles para preparaciones de coloides incluyen gelatina, polisacáridos vegetales o sus derivados tales como carrageninas y formas modificadas de almidón y celulosa, por ejemplo hipromelosa. Opcionalmente, se pueden añadir otros ingredientes a la disolución de agente gelificante, por ejemplo plastificantes tales como glicerina y/o sorbitol para disminuir la dureza de la cápsula, colorantes, conservantes, disgregantes, lubricantes y tratamiento de superficies. En algunas realizaciones, la cápsula no incluye gelatina. En otras realizaciones, la cápsula no incluye polisacáridos vegetales ni sus derivados.
El sobrenadante de cultivo deL. paracaseiCBA L74 de la invención se puede formular según el uso. Estas composiciones se pueden preparar de una manera bien conocida en la técnica farmacéutica, y se pueden administrar por una variedad de vías, dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico y del área a tratar. La administración puede ser oral o tópica (incluida la vía oftálmica y en las membranas mucosas, incluida la vía intranasal, vaginal y rectal). En algunas realizaciones, la administración puede ser pulmonar (por ejemplo, por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluso mediante nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica y transdérmica) u ocular. Los métodos de administración ocular pueden incluir administración tópica (gotas oftálmicas), inyección subconjuntival, periocular o intravítrea, o introducción mediante catéter con balón o insertos oftálmicos colocados quirúrgicamente en el saco conjuntival. La administración parenteral incluye inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; o intracraneal, por ejemplo administración intratecal o intraventricular. La administración parenteral puede realizarse en forma de una dosis única en bolo o, por ejemplo, mediante una bomba de perfusión continua. Las composiciones y formulaciones farmacéuticas para administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, líquidos, polvos, y similares. Pueden ser necesarios o deseables portadores farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo u oleosas, espesantes y similares.
Las composiciones se pueden formular en una forma de dosificación unitaria, conteniendo cada dosificación, por ejemplo, de alrededor de 0,005 mg a alrededor de 2000 mg de sobrenadante de cultivo deL. paracaseiCBA L74 por dosis diaria. La expresión "formas de dosificación unitarias" se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para sujetos humanos y otros mamíferos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con un excipiente farmacéutico adecuado. Para preparar composiciones sólidas tales como comprimidos, el ingrediente activo principal se mezcla con un excipiente farmacéutico para formar una composición de preformulación sólida que contiene una mezcla homogénea de un compuesto de la presente invención. Cuando se hace referencia a estas composiciones de preformulación como homogéneas, el ingrediente activo normalmente se dispersa de manera uniforme en toda la composición, de modo que la composición se puede subdividir fácilmente en formas de dosificación unitarias igualmente efectivas, tales como comprimidos, píldoras y cápsulas. Esta preformulación sólida se subdivide luego en formas de dosificación unitarias del tipo descrito anteriormente que contienen, por ejemplo, 0,005 mg a alrededor de 1000 mg del sobrenadante de cultivo deL. paracaseiCBA L74 de la presente invención.
Las composiciones se pueden formular en una forma de dosificación unitaria, conteniendo cada dosificación, por ejemplo, de alrededor de 0,1 mg a alrededor de 50 mg, de alrededor de 0,1 mg a alrededor de 40 mg, de alrededor de 0,1 mg a alrededor de 20 mg, de alrededor de 0,1 mg a alrededor de 10 mg, de alrededor de 0,2 mg a alrededor de 20 mg, de alrededor de 0,3 mg a alrededor de 15 mg, de alrededor de 0,4 mg a alrededor de 10 mg, de alrededor de 0,5 mg a alrededor de 1 mg; de alrededor de 0,5 mg a alrededor de 100 mg, de alrededor de 0,5 mg a alrededor de 50 mg, de alrededor de 0,5 mg a alrededor de 30 mg, de alrededor de 0,5 mg a alrededor de 20 mg, de alrededor de 0,5 mg a alrededor de 10 mg, de alrededor de 0,5 mg a alrededor de 5 mg; de alrededor de 1 mg a alrededor de 50 mg, de alrededor de 1 mg a alrededor de 30 mg, de alrededor de 1 mg a alrededor de 20 mg, de alrededor de 1 mg a alrededor de 10 mg, de alrededor de 1 mg a alrededor de 5 mg; de alrededor de 5 mg a alrededor de 50 mg, de alrededor de 5 mg a alrededor de 20 mg, de alrededor de 5 mg a alrededor de 10 mg; de alrededor de 10 mg a alrededor de 100 mg, de alrededor de 20 mg a alrededor de 200 mg, de alrededor de 30 mg a alrededor de 150 mg, de alrededor de 40 mg a alrededor de 100 mg, de alrededor de 50 mg a alrededor de 100 mg del ingrediente activo.
En algunas realizaciones, los comprimidos o píldoras de la presente invención pueden recubrirse o combinarse de otro modo para proporcionar una forma de dosificación que ofrezca la ventaja de una acción prolongada. Por ejemplo, el comprimido o píldora puede comprender un componente de dosificación interna y un componente de dosificación externa, estando esta última en forma de una envoltura sobre la primera. Los dos componentes pueden estar separados por una capa entérica que sirve para resistir la disgregación en el estómago y permitir que el componente interno pase intacto al duodeno o que su liberación se retrase. Se puede utilizar una variedad de materiales para dichas capas o recubrimientos entéricos, incluyendo dichos materiales una serie de ácidos poliméricos y mezclas de ácidos poliméricos con materiales tales como goma laca, alcohol cetílico, y acetato de celulosa.
Las formas líquidas en las que se pueden incorporar las composiciones de la presente invención para administración por vía oral o por inyección incluyen disoluciones acuosas, jarabes adecuadamente aromatizados, suspensiones acuosas u oleosas, y emulsiones aromatizadas con aceites comestibles tales como aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de coco o aceite de cacahuete, así como elixires y vehículos farmacéuticos similares.
La proporción o concentración de las composiciones de la invención en una composición farmacéutica puede variar dependiendo de una serie de factores que incluyen la dosis, las características químicas (por ejemplo, la hidrofobia) y la vía de administración. Por ejemplo, el sobrenadante del cultivo deL. paracaseiCBA L74 de la invención se puede proporcionar en una cápsula que contiene de alrededor de 0,005 mg por gramo a alrededor de 1000 mg para administración oral.
Usos médicos
Las composiciones descritas aquí son útiles en general y de diversas formas para la estimulación de una respuesta inmunomoduladora en el sistema inmune de las mucosas. Los sujetos para quienes dicha estimulación es beneficiosa incluyen aquellos que tienen un déficit del sistema inmune de las mucosas, por ejemplo aquellos que tienen un sistema inmune inmaduro, tales como lactantes o niños pequeños, aquellos que tienen un sistema inmune deprimido, tales como los ancianos, pacientes que toman medicamentos inmunosupresores, radiación o quimioterapia, aquellos que tienen un sistema inmune hiperactivado debido a alergias o trastornos autoinmunes, y aquellos que sufren trastornos gastrointestinales. Los trastornos gastrointestinales pueden incluir infecciones debidas a virus, por ejemplo rotavirus; bacterias patógenas, por ejemploSalmonella, Yersinia, Shigella, Listeria, Clostridium, E. coli, E. sakazaki, H,pylori;o protozoos patógenos, por ejemploEntamoeba histolytica, Cryptosporidium spp, Campylobacter spp.Los trastornos gastrointestinales también pueden incluir, por ejemplo, alergias alimentarias, hipersensibilidad alimentaria, síndrome del intestino irritable, enfermedad inflamatoria intestinal, reservoritis, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, celiaquía, enterocolitis necrosante, y envejecimiento, en particular envejecimiento del sistema gastrointestinal.
Un sujeto es tratado eficazmente cuando se obtiene un resultado clínicamente beneficioso. Esto puede significar, por ejemplo, una resolución completa de los síntomas asociados con un déficit del sistema inmune de las mucosas, una disminución en la gravedad de los síntomas asociados con un déficit del sistema inmune de las mucosas, o una ralentización de la progresión de los síntomas asociados con un déficit del sistema inmune de las mucosas. Las composiciones para uso según la invención pueden ser para uso en un sujeto (por ejemplo, un paciente y, más específicamente, un paciente humano) que ha sido identificado por tener un déficit del sistema inmune de las mucosas. Una cantidad de dicha composición proporcionada al sujeto que da como resultado una resolución completa de los síntomas asociados con un déficit del sistema inmune de las mucosas, una disminución en la gravedad de los síntomas asociados con un déficit del sistema inmune de las mucosas, o una ralentización de la progresión de los síntomas asociados con un déficit del sistema inmune de las mucosas se considera una cantidad terapéuticamente eficaz. Los métodos actuales también pueden incluir una etapa de monitorización para ayudar a optimizar la dosificación y la programación, así como predecir el resultado.
Los usos descritos aquí se pueden aplicar a una amplia gama de especies, por ejemplo seres humanos, primates no humanos (por ejemplo, monos), caballos, cerdos, vacas u otro ganado, perros, gatos u otros mamíferos mantenidos como mascotas, ratas, ratones, u otros animales de laboratorio. Las composiciones descritas aquí son útiles en composiciones y regímenes terapéuticos o para la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de afecciones como las descritas aquí (por ejemplo, un déficit del sistema inmune de las mucosas debido a inmadurez, envejecimiento, infección, alergias alimentarias, un trastorno inflamatorio o autoinmune).
Las composiciones nutricionales descritas aquí pueden administrarse por vía oral como parte de la dieta diaria normal de un sujeto. Las composiciones alimentarias pueden administrarse como apoyo nutricional tanto a niños como a adultos. Cuando se formulan como productos farmacéuticos, las composiciones se pueden administrar a cualquier parte del cuerpo del hospedador para su posterior administración a una célula diana. Una composición puede administrarse, sin limitación, al cerebro, al líquido cefalorraquídeo, a las articulaciones, a la mucosa nasal, a la sangre, a los pulmones, a los intestinos, a los tejidos musculares, a la piel, o a la cavidad peritoneal de un mamífero. En términos de vías de administración, una composición puede administrarse por inyección intravenosa, intracraneal, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intramuscular, intrarectal, intravaginal, intratecal, intratraqueal, intradérmica, o transdérmica, por administración oral o nasal, o por perfusión gradual a lo largo del tiempo. En otro ejemplo, una preparación en aerosol de una composición se puede administrar a un hospedador mediante inhalación.
Independientemente de si las composiciones se formulan como productos alimentarios o como productos farmacéuticos, la dosis requerida dependerá de la vía de administración, la naturaleza de la formulación, la naturaleza de la afección del sujeto, por ejemplo inmadurez del sistema inmune o un trastorno gastrointestinal, el tamaño, el peso, la superficie, la edad y el sexo del sujeto, otros medicamentos que se administren, y el criterio de los médicos asistentes. Las dosis adecuadas están en el intervalo de 0,01 -1.000 mg/kg. Algunos intervalos de dosis típicos oscilan de alrededor de 1 pg/kg a alrededor de 1 g/kg de peso corporal por día. En algunas realizaciones, el intervalo de dosis es de alrededor de 0,01 mg/kg a alrededor de 100 mg/kg de peso corporal por día. En algunas realizaciones, la dosis puede ser, por ejemplo, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 50 mg/kg o 100 mg/kg. Es probable que la dosis dependa de variables como el tipo y el grado de progresión de la enfermedad o trastorno, el estado de salud general del paciente en particular, la eficacia biológica relativa del compuesto seleccionado, la formulación del excipiente, y su vía de administración.
Las dosis efectivas pueden extrapolarse a partir de curvas dosis frente a respuesta derivadas de sistemas de prueba in vitro o de modelos animales. Por ejemplo, el análisis in vitro de la producción de citocinas por células mononucleares de sangre periférica (PBMC) puede ser útil para evaluar respuestas proinflamatorias y antiinflamatorias, por ejemplo la secreción de IL-1 p, IL-12, IL-4, TNF-a o IL-10 respectivamente. Las composiciones también se pueden analizar para determinar sus efectos en modelos animales, por ejemplo la producción de IgA, la producción de citocinas por explantes de placas de Peyer, y las respuestas de células dendríticas y de células T.
Se deben esperar amplias variaciones en la dosis necesaria en vista de la variedad de dianas celulares y las diferentes eficiencias de las diversas vías de administración. Las variaciones en estos niveles de dosificación se pueden ajustar utilizando rutinas empíricas estándar para la optimización, como se entiende bien en la técnica. Las administraciones pueden ser únicas o múltiples (por ejemplo, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 20, 50, 100, 150 o más veces).
La encapsulación de los compuestos en un vehículo de administración adecuado (por ejemplo, micropartículas poliméricas o dispositivos implantables) puede aumentar la eficiencia de la administración.
La duración del tratamiento con cualquier composición proporcionada aquí puede ser desde un día hasta un período de tiempo tan largo como la vida del hospedador (por ejemplo, muchos años). Por ejemplo, una composición puede administrarse una vez a la semana (por ejemplo, durante 4 semanas a muchos meses o años); una vez al mes (por ejemplo, durante tres a doce meses o durante muchos años); o una vez al año durante un período de 5 años, diez años, o más. También se observa que la frecuencia del tratamiento puede ser variable. Por ejemplo, las presentes composiciones pueden administrarse una vez (o dos, tres veces, etc.) al día, semanalmente, mensualmente, o anualmente. Cuando las composiciones se formulan como producto alimentario, por ejemplo, las composiciones se pueden administrar diariamente en cada comida.
Se puede utilizar cualquier método conocido por los expertos en la técnica para determinar si se induce una respuesta particular. Se pueden utilizar métodos clínicos que puedan evaluar el grado de una enfermedad particular para determinar si se induce una respuesta. Por ejemplo, un sujeto se puede monitorizar para detectar alivio sintomático, por ejemplo alivio de cólicos, diarrea, estreñimiento, náuseas, vómitos, dolor abdominal, calambres, acidez estomacal, distensión abdominal, flatulencia, o incontinencia. Alternativamente o además, se pueden utilizar marcadores séricos, técnicas de imagen, por ejemplo ultrasonido, rayos X, y métodos endoscópicos.
Las composiciones también pueden administrarse junto con otras modalidades terapéuticas. Otras modalidades terapéuticas variarán según el trastorno particular, pero pueden incluir, por ejemplo, medicamentos antidiarreicos, antieméticos, agentes anticolinérgicos, agentes antiinflamatorios, antibióticos, antihistamínicos y otros tratamientos dietéticos, por ejemplo fórmulas infantiles hipoalergénicas. La administración concurrente de dos o más agentes terapéuticos no requiere que los agentes se administren al mismo tiempo o por la misma vía, siempre que haya una superposición en el período de tiempo durante el cual los agentes ejercen su efecto terapéutico. Se contempla la administración simultánea o secuencial, así como la administración en días o semanas diferentes.
Artículos de fabricación
Las composiciones descritas aquí también pueden ensamblarse en kits, junto con instrucciones de uso. En consecuencia, los productos envasados (por ejemplo, recipientes que contienen una o más de las composiciones de sobrenadante de cultivo deL. paracaseiCBA L74 descritas aquí y envasadas para almacenamiento, envío o venta en concentraciones concentradas o listas para usar) y los kits, que incluyen al menos un compuesto de la invención e instrucciones de uso, también están dentro del alcance de la invención. Las instrucciones de uso podrán transmitirse por cualquier medio adecuado. Por ejemplo, pueden imprimirse en un inserto de papel en uno o más idiomas o suministrarse de forma audible o visual (por ejemplo, en un disco compacto). Los materiales de envasado pueden incluir materiales de envasado, por ejemplo viales, paquetes, recipientes. En algunas realizaciones, los kits pueden incluir cantidades medidas de una composición que comprende sobrenadante de cultivo deL. paracaseiCBA L74 en un portador fisiológicamente aceptable junto con materiales de envasado e instrucciones de uso en cualquiera de los formatos descritos anteriormente. En algunas realizaciones, los kits pueden incluir recipientes que contienen una o más composiciones de sobrenadante de cultivo deL. paracaseiCBA L74, por ejemplo sobrenadante de cultivo deL. paracaseiCBA L74 y un portador farmacéutico, y uno o más de un estabilizador adecuado, molécula portadora, saborizante, y/o similares, según sea apropiado para el uso previsto. Un producto puede incluir un recipiente (por ejemplo, un vial, frasco, botella, bolsa, o similar) que contiene una o más composiciones de sobrenadante de cultivo deL. paracaseiCBA L74. Además, un artículo de fabricación puede incluir además, por ejemplo, materiales de envasado, instrucciones de uso, jeringas, amortiguadores u otros reactivos de control para tratar o controlar la afección para la que se requiere profilaxis o tratamiento. El producto también puede incluir una leyenda (por ejemplo, una etiqueta impresa o un inserto u otro medio que describa el uso del producto (por ejemplo, una cinta de audio o vídeo)). La leyenda puede estar asociada con el recipiente (por ejemplo, fijada al recipiente) y puede describir la manera en que debe administrarse el compuesto que contiene (por ejemplo, la frecuencia y vía de administración), las indicaciones para ello, y otros usos. Los componentes del kit pueden ser adecuados para su uso inmediato. Los compuestos pueden estar listos para su administración (por ejemplo, presentes en unidades apropiadas para la dosis), y pueden incluir un adyuvante, portador u otro diluyente farmacéuticamente aceptable y/o un agente terapéutico adicional. Sin embargo, la invención abarca kits que incluyen formulaciones concentradas y/o materiales que pueden requerir dilución antes de su uso. Alternativamente, los compuestos pueden proporcionarse en forma concentrada con un diluyente e instrucciones para la dilución. Los componentes del kit pueden ser adecuados para su uso inmediato. Sin embargo, la invención abarca kits que incluyen formulaciones concentradas y/o materiales que pueden requerir dilución antes de su uso.
Ejemplos
Ejemplo 1: Aislamiento y caracterización de L.paracasei CBA-174
Analizamos diferentes cepas deLactobacillipara determinar su capacidad para fermentar suspensiones acuosas que contienen diferentes concentraciones de harina de arroz o harina de trigo. Se seleccionóL.paracaseiCBA L74 para un análisis adicional basándose en los bajos valores de pH y los altos recuentos de UFC. Esta cepa se depositó según el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento de Patentes el 9 de septiembre de 2008 en el Laboratorium voor Microbiologie (LMG) de las Colecciones Coordinadas Belgas de Microorganismos (BCCM), Gante, Bélgica. El Número de Acceso otorgado por la Autoridad Depositaria Internacional es LMG P-24778.
Ejemplo 2: Preparación de leche fermentada por L.paracasei CBA L74 (no según la invención)
Condiciones:
Sustrato: Leche desnatada en polvo reconstituida al 9%, dextrosa añadida al 0,25%
Tratamiento térmico del sustrato: UHT - 135 °C durante 3 s o equivalente F<0>
Co-Inóculo: 5 x 106 paraLactobacillus paracaseiCBA-L74 5 x 104 paraStreptococcus thermophilus(como niciador de la fermentación)
Temperatura de fermentación: 37 °C
Tiempo de fermentación: 15 horas
pH durante la fermentación: sin ajuste
Al final de la fermentación, ajuste el pH a 6,5 con disolución de NaOH.
Secado por pulverización con temperatura de entrada 190 °C y temperatura de salida 90 °C.
Análisis: Las células se cuentan en el fermentado para determinar Streptococcus thermophilus yLactobacillus paracaseiCBA-L74
Crecimiento en placa: Se utilizó agar selectivo para lactobacilos (LBS) para la detección deLactobacillus paracaseiCBA-L74. Se utilizó agar L-M17 para los recuentos deStreptococcus thermophilus.Ambos se incubaron a 37 °C en condiciones anaeróbicas. Se utilizó agar de recuento en placa (PCA) para la detección de contaminantes, y se incubó a 30 °C en condiciones aeróbicas.
Fermentación: Se añadieron co-inoculos deL. paracaseiCBA L74 y S.thermophilus1773 como cultivos recientes. La fermentación se realizó durante 15 horas, hasta una concentración de 108 ufc/ml deL. paracaseiCBA-L74. El pH inicial fue 6,6. Al final de la fermentación, el pH fue 5,1. El pH se ajustó a 6,5 añadiendo NaOH 2,5 N. La concentración inicial de L. paracesei CB-74 fue 5 x 106 UFC/ml; la concentración final fue más de 108 UFC/ml. La concentración inicial deStreptococcus thermophilusfue 5 x 104 UFC/ml; la concentración final fue 1 x 108 UFC/ml. El recuento bacteriano total inicial en PCA fue 0 en la leche antes de la inoculación y a T0 y muy pocas colonias para contar (TFTC) después del período de fermentación de 15 horas fue 5 x 104 UFC/ml; la concentración final fue 1 x 108 UFC/ml.
Secado: El fermentado se secó a una temperatura de entrada de 190 °C y una temperatura de salida de 90 °C. El contenido de humedad del polvo después del secado por pulverización fue 4,87%.
Ejemplo 3: Preparación de harina de avena y cebada fermentada con L.paracasei CBA L74 (no según la invención)
Preparamos una disolución de un litro de 18,5% (p/vol) de harina de avena 5% (p/p) de harina de cebada malteada, utilizando 185 g de harina de avena y 9,25 g de harina de cebada malteada. La mezcla de harina y agua se ajustó a pH 4,00 con ácido cítrico 0,5 M. El fermentador se esterilizó mediante autoclave. Después, la mezcla de harina agua ácido cítrico se añadió al fermentador.
La mezcla se trató térmicamente a 80 °C durante 30 minutos, y después se enfrió hasta 37 °C. Se probaron tres conjuntos diferentes de condiciones de fermentación. Todas las fermentaciones finalizaron después de 16 horas, tiempo que coincidió con el final de la fase de crecimiento logarítmico.
PRUEBA #1 Se añadióL. paracaseiCBA L74 a la disolución de cereal tratada térmicamente hasta una concentración final de 2,3 x 106 UFC/ml, y se incubó con agitación a 37 °C. Después de 16 horas, el recuento en placa en MRS fue 7,6 x 108 UFC/ml (bacterias de ácido láctico); los contaminantes medidos en PCA, MC y SB fueron inferiores a 1000 UFC/ml. El pH final fue 3,8. Después de 20 horas, el recuento de placa en MRS fue 1,2 x 108 UFC/ml (bacterias de ácido láctico); no hubo contaminantes. Después de 24 horas, el recuento de placa en MRS fue 5 x 108 UFC/ml (bacterias de ácido láctico); no hubo contaminantes. Dado que la fase logarítmica se detiene después de 16 horas, fue preferible detener las fermentaciones a las 16 horas.
PRUEBA #2 (pH estabilizado) Esta fermentación se llevó a cabo manteniendo el pH a 4 usando NaOH 2N. Se añadióL. paracaseiCBA L74 a la disolución de cereal tratada térmicamente hasta una concentración final de 2,1 x 106 UFC/ml, y se incubó con agitación a 37 °C. Después de 16 horas, el recuento en placa en MRS fue 7,5 x 108 UFC/ml (bacterias de ácido láctico); los contaminantes medidos en PCA, MC y SB fueron inferiores a 1000 UFC/ml.
PRUEBA #3 (pH estabilizado) Esta fermentación se llevó a cabo manteniendo el pH a 4 usando NaOH 2N. Se añadióL. paracaseiCBA L74 a la disolución de cereal tratada térmicamente hasta una concentración final de 5,1 x 106 UFC/ml, y se incubó con agitación a 37 °C. Después de 16 horas, el recuento en placa en MRS fue 2,1 x 109 UFC/ml (bacterias de ácido láctico); los contaminantes medidos en PCA, MC y SB fueron inferiores a 1000 UFC/ml.
Ejemplo 4: Preparación de harina de arroz y trigo fermentada con Lparacasei CBA L74 (no según la invención)
Preparamos una disolución de un litro de 15% peso/volumen de arroz combinando 150 g de arroz y 900 ml de agua. La mezcla se preparó a temperatura ambiente, y se mezcló agitando durante varios minutos a 1000-1300 rpm. La mezcla de arroz se trató mediante tindalización calentando la mezcla dentro del instrumento a 70 °C, inanición a 70 °C durante 20-30 minutos, enfriando a 30-37 °C, inanición a 30-37 °C durante 20-30 minutos, calentando a 70 °C, inanición a 70 °C durante 20-30 minutos, enfriando a la temperatura de fermentación (37 °C) mientras se agitaba a 150-600 rpm.
Se añadióL.paracaseiCBA L74 de una muestra liofilizada hasta una concentración final de 1x106 UFC/ml. La muestra liofilizada se resuspendió en agua y se incubó brevemente a 37 °C para activar las bacterias. Después de la inoculación, la mezcla se homogeneizó agitando brevemente a 300-600 rpm; durante la fermentación, la disolución se agitó a 150 rpm. La fermentación se realizó a 37 °C durante 24 horas a una pO2 de < 15%. Se recogieron alícuotas en el momento de la inoculación (T0), a las 16 horas (T16), a las 18 horas (T18), a las 21 horas (T21) y a las 24 horas (T24). Después de la fermentación, el cereal se calentó a 50 °C con mezclamiento continuo. A continuación, el cereal calentado se secó por pulverización a una temperatura de entrada de 80 °C y una temperatura de salida de 210 °C. El contenido de humedad final fue 6%.
Las muestras se analizaron en agar Rogosa (+ vancomicina 12 microgr./ml) (48 h a 37°C), para cuantificación de laL.paracaseiCBA-174), en PCA para aerobios totales (24 h a 37°C), en agar McConkay para coliformes, y en agar RCM para clostridios.
Los resultados de esta fermentación fueron los siguientes:
inóculo(L.paracaseiCBA-174): 1x106 (+/- / log) UFC/ml (en el instrumento)
Concentración deL.paracaseiCBA L74 después de 24 horas de fermentación: 1 x 108 (+/- / log) UFC/ml
Contaminantes en PCA antes del inóculo: < 104 UFC/ml
Contaminantes en McConkay antes del inóculo: < 104 UFC/ml
Contaminantes en RCM antes del inóculo: <10 UFC/ml
Contaminantes en PCA después del inóculo: < 104 UFC/ml
Contaminantes en PCA después de 24 horas de fermentación: < 104 UFC/ml
pH antes de la adición del inóculo: 6 (+/- 0,20)
pH a las 16-18 horas: 3,70 (+/-0,20)
pH a las 24 horas: 3,60 (+/-0,20).
Ejemplo 5: Efectos de L.paracasei CBA L74 sobre células dendríticas en un sistema de co-cultivo de células Caco2 (no según la invención)
Analizamos el efecto deL.paracaseiCBA L74 viva y no replicativa en un cocultivo de células epiteliales intestinales (células Caco2) y células dendríticas humanas (DC). Las células Caco2 se sembraron en una membrana transwell, y después de alrededor de 3 semanas, cuando la resistencia transepitelial fue adecuada, se suplementaron conL. paracaseiCBA L74 durante 96 horas. Las DC humanas se diferenciaron de los monocitos de sangre periférica, y se sembraron en el compartimento basal de la cámara de cocultivo. La resistencia transepitelial se mantuvo constante durante el experimento.
Para caracterizar el fenotipo de las DC, monitorizamos la expresión de moléculas coestimuladoras (CD80 y CD86), MHC-II y moléculas de adhesión (CD40) en la superficie celular de las DC mediante análisis citofluorimétrico. Para determinar el perfil de citocinas producido por las DC cocultivadas con células epiteliales intestinales expuestas aL. paracaseiCBA L74, recolectamos el medio de cultivo y cuantificamos IL-10 e IL-12p70 mediante ELISA. Para verificar la capacidad de las células Caco2 expuestas aL. paracaseiCBA L74 para condicionar las DC para promover la proliferación de células T, realizamos análisis de FACS y cultivos de linfocitos mixtos.
Como se muestra en la Tabla de la Figura 1, la incubación de células Caco2 durante 24 horas conL. paracaseiCBA L74 viva o inactivada (inactivación térmica) modificó el fenotipo de las células dendríticas co-cultivadas. Además, la presencia deL. paracaseiCBA L74 moduló los cambios mediados por LPS en el fenotipo de DC.
Cuantificamos entonces las citocinas liberadas de las DC cocultivadas con células Caco2 acondicionadas conL. paracasei(viva o inactivada). Como se muestra en la Figura 2a, las DC cocultivadas con Caco2 expuestas aL. paracaseiCBA L74 viva o inactivada mostraron un aumento estadísticamente significativo en la producción de IL-10. No observamos un aumento significativo en la producción de IL-12 en ausencia de LPS (Figura 2b). Sin embargo, las DC conservaron la capacidad de responder a la exposición de LPS mediante una mayor producción de IL-12, lo que sugiere que la exposición aL. paracaseiCBA L74 no afectó la capacidad general de las DC para responder a los patógenos.
Realizamos entonces un ensayo funcional para verificar la capacidad de las células DC expuestas a CaCo2 cultivadas en presencia de medio o medio suplementado conL. paracaseipara modular la capacidad de las células T de proliferar después de una reacción linfocítica mixta. Como se muestra en la Figura 3, no observamos diferencias significativas en la capacidad de las DC co-cultivadas con células CaCo2 para modificar la proliferación de células T.
En conjunto, los datos in vitro indican queL. paracaseiCBA L74, viva o inactivada por calor, pueden influir en el entorno generado por las células epiteliales intestinales que a su vez modulan la actividad de otras células inmunes tales como las DC. El panorama general indica que las DC expuestas a un medio acondicionado con Caco2 reducen la expresión de marcadores de activación, producen citocinas antiinflamatorias como IL-10, y al mismo tiempo conservan la capacidad de responder a LPS al mejorar la producción de IL-12.
Ejemplo 6: Efectos de L.paracasei CBA L74 sobre la morfología, la expresión de citocinas, y la inmunidad innata en la mucosa intestinal completa (no según la invención)
Examinamos los efectos in vivo administrandoL.paracaseiCBA L74 (viva o inactivada por calor) como suplemento dietético en ratones. Después de dos semanas de suplementación, los animales se sacrificaron, y se analizó toda la mucosa intestinal.
Morfología de la mucosa: Realizamos una tinción con hematoxilina y eosina de secciones ileales embebidas en parafina. Ninguno de los suplementos tuvo efectos significativos sobre la arquitectura intestinal ni provocó una infiltración de células inflamatorias.
Expresión de citocinas e IgA: Después, determinamos si la administración deL. paracaseiCBA L74 (viva o inactivada) afectó el nivel de citocinas antiinflamatorias y proinflamatorias en la mucosa intestinal. Como se muestra en la Figura 4, la administración deL. paracaseiCBA L74 viva o inactivada disminuyó significativamente el nivel de IL-1 p, un potente mediador proinflamatorio, en la mucosa intestinal de ratones. Como se muestra en la Figura 5, también observamos una reducción en el nivel basal de IL-4 en la mucosa después de la administración deL. paracaseiCBA L74 viva o inactivada. Finalmente, determinamos el efecto de diferentes regímenes de suplementación sobre el nivel de IgA en la mucosa. Después de dos semanas de suplementación de la dieta conL. paracaseiCBA L74, los animales se sacrificaron, y se recogió y homogeneizó la mucosa intestinal. Después, la IgA total se midió mediante ELISA, y los valores se normalizaron a las proteínas mucosas totales. Como se muestra en la Figura 6, elL. paracaseiCBA L74 destruidas por calor aumentó significativamente la IgA de la mucosa.
Inmunidad innata: Analizamos el efecto de la suplementación dietética sobre los niveles de los receptores 2, 4 y 9 similares a Toll. Estos receptores están involucrados en el reconocimiento de estructuras bacterianas conservadas, y por lo tanto juegan un papel clave en la modulación de la reactividad de las células inmunes y no inmunes hacia las estructuras microbianas conservadas. Como se muestra en la Figura 7, la suplementación de la dieta conL. paracaseiCBA L74, viva o inactivada por calor, aumentó los niveles de expresión de proteínas de TLR2 y TLR4. También analizamos el efecto de la suplementación dietética sobre los niveles de PPARy en la mucosa. Como se muestra en la Figura 8,L. paracaseiCBA L74 viva aumentó significativamente el nivel de PPARy.
Ejemplo 7: Efectos de L.paracasei CBA L74 sobre los niveles de citocinas circulantes (no según la invención)
Para evaluar si los suplementos dietéticos fueron capaces de modificar el nivel de citocinas circulantes, medimos los efectos de la administración dietética de la cepa (viva o inactivada) sobre el nivel de citocinas antiinflamatorias y proinflamatorias en el suero. Como se muestra en las Figuras 9a y 9b,L.paracaseiCBA L74 viva indujo una disminución estadísticamente significativa en IL-1 p y un aumento modesto en IL-4 circulante, respectivamente.
Ejemplo 8: Efectos de L.paracasei CBA L74 sobre la actividad de las células dendríticas y de los linfocitos T (no según la invención)
A continuación, nos centramos en el impacto de la suplementación dietética conL. paracaseiCBA L74 sobre las células inmunes relevantes para la actividad del sistema inmune asociado a las mucosas, es decir, las células dendríticas y los linfocitos. Evaluamos el fenotipo de las DC dentro de las placas de Peyers (PP), ya que estas células son fundamentales para establecer el destino de un antígeno y contribuyen al entorno que determinará la naturaleza de la respuesta inmune adaptativa.
Como se muestra en la Tabla de la Figura 10, la suplementación conL. paracaseiCBA L74 (viva o inactivada) disminuyó la expresión de la molécula coestimuladora CD80 y de la molécula de adhesión CD40, mientras que aumentó la expresión de MHCII. Estos datos sugirieron que las DC de los animales suplementados conL. paracaseiCBA L74 parecían menos preparadas para interactuar con las células T y generar una respuesta inmune, pero su capacidad para procesar y presentar antígenos estaba preservada.
Después, determinamos la capacidad de la suplementación de la dieta conL. paracaseiCBA L74 para modificar la reactividad de las DC a los estímulos proinflamatorios (tales como LPS bacteriano y CpG). La exposición de las DC de los ratones de control a LPS o CpG indujo un fuerte aumento de CD80 en las DC de control. La suplementación conL. paracaseiCBA L74 DC inactivada por calor no modificó la reactividad a los estímulos inflamatorios. La suplementación con bacterias vivas redujo significativamente el aumento de CD80 inducida por LPS y CpG.
Por último, investigamos si la suplementación dietética conL. paracaseiCBA L74 (viva o inactivada) afectó la polarización de los linfocitos T intestinales (CD4+ y CD8+) hacia un fenotipo Th1 o Th2. Para estos estudios, las placas de Peyer se expusieron a PHA, un estímulo fuerte y no específico, y después se evaluó la polarización de los linfocitos mediante tinción intraquina para IL-4 e IFN-y. Como se muestra en la Figura 11a, en ausencia de PHA (la "condición basal") en los linfocitos CD4+, IL-4 e IFN estaban casi en equilibrio. Alrededor de 10-12% de las células resultaron positivas para estas citocinas. Como se muestra en la Figura 11 b, para los linfocitos CD8+ en la condición basal, hubo un ligero predominio de IL-4 sobre las células que expresaban IFN. La exposición de linfocitos CD4+ o CD8+ a PHA provocó un fuerte aumento en la tinción intracelular de IL-4 e IFN-y, con sesgo hacia la producción de IFN-y.
En las células CD4+, la suplementación dietética conL. paracaseiCBA L74 viva aumentó los niveles de IFN-y en la condición basal. Después de la exposición a PHA, no hubo diferencias significativas en la respuesta entre los grupos suplementados (Figura 11a). En los linfocitos CD8+, la suplementación oral conL. paracaseiCBA L74 inactivada favoreció un perfil de Th2 con una estimulación de la producción de IL-4 sobre la producción de IFN-y (Figura 11b). El perfil antiinflamatorio se ve respaldado además por la respuesta atenuada a PHA. También se observó una tendencia similar en los linfocitos CD8+ aislados de ratones suplementados conL. paracaseiCBA-L74 viva, aunque menos pronunciada.
Ejemplo 9: Efecto de la leche fermentada por L. paracasei CBA L74 sobre marcadores del sistema inmune en la mucosa intestinal (no según la invención)
A los ratones se les administró suplementos dos veces al día durante dos semanas con: 1) Control (PBS); 2) Leche desnatada (no fermentada); 3) Leche desnatada fermentada conL. paracaseiCBA L74 (1x108 ufc/ml); 4) Leche desnatada fermentada con S.thermophilus(6,7x106 ufc/ml); 5) Leche desnatada fermentada conL. paracaseiCBA L74 (1x108 ufc/ml) y S.thermophilus(1,18x107 ufc/ml); 6) Leche desnatada fermentada conL. paracaseiCBA L74 (1,9x109 ufc/ml) y S.thermophilus(2,2x108 ufc/ml). Al final del tratamiento, los animales se sacrificaron, y la mucosa intestinal y las placas de Peyer se recolectaron y se procesaron para su análisis como se describe a continuación.
Niveles de citocinas en la mucosa intestinal
Como se muestra en la Figura 12, la suplementación con leche desnatada fermentada conL. paracaseiCBA L74 provocó un aumento significativo de los niveles de IL-10 en la mucosa intestinal. La administración de leche desnatada fermentada con S.thermophilusindujo una ligera reducción en comparación con los controles. La administración de leche fermentada con ambas cepas en dosis más altas indujo un aumento de 2,1 veces en la IL-10 mucosa. Ninguno de los tratamientos tuvo un efecto significativo sobre la IL-1 p de la mucosa, aunque la suplementación con leche desnatada fermentada conL. paracaseiCBA L74 provocó un ligero aumento en los niveles de esta citocina en la mucosa.
Actividad de la mieloperoxidasa en la mucosa intestinal
Se analizó la actividad de la mieloperoxidasa (MPO) en homogeneizados de mucosa intestinal. La administración de leche no fermentada o fermentada con diferentes bacterias no indujo diferencias estadísticamente significativas en la actividad de la mieloperoxidasa, aunque se observó un ligero aumento en la actividad de MPO en la mucosa de los animales que recibieron leche no fermentada.
Niveles de IgA en la mucosa intestinal
Como se muestra en la Figura 14, la suplementación con leche desnatada no fermentada provocó un aumento significativo en la IgA de la mucosa intestinal. Este aumento no se observó en animales suplementados con leche desnatada fermentada conL. paracaseiCBA L74 o S.thermophilussola. La administración de leche fermentada con ambas cepas en dosis más altas indujo un aumento de la IgA de la mucosa.
Niveles de TLR2, TLR4, TLR9 y PPARv en la mucosa intestinal
A continuación, determinamos mediante WB los niveles mucosales de los receptores clave del sistema inmune innato. Como se muestra en la Figura 15, ninguno de los tratamientos tuvo un efecto significativo sobre la expresión del receptor TLR4. La leche no fermentada provocó un aumento modesto en TLR2. La administración de leche desnatada fermentada conL. paracaseiCBA L74 o S. thermophilus sola o en combinación en la dosis más baja previno este efecto. También se observó un aumento modesto, comparable al de la leche sola, en TLR2 en ratones que recibieron leche fermentada con ambas cepas en dosis más altas. La administración de leche desnatada sola tuvo efectos profundos en los niveles de TLR9, mientras que la administración de leche fermentada con ambas cepas restableció niveles mucosales comparables a los de los controles. Como se muestra en la Figura 15, la administración de leche no fermentada por sí sola provocó un fuerte aumento del PPARv mucosal. Se evidenció un efecto similar en ratones suplementados con leche desnatada fermentada conL. paracaseiCBA L74 y la dosis más baja de leche fermentada con ambas cepas.
Niveles de pNF-kB e IKB en la mucosa intestinal
Determinamos el estado de activación de NF-kB, un factor de transcripción clave involucrado tanto en la inflamación intestinal como en la supervivencia de las células epiteliales. Como se muestra en la Figura 16, NF-kB activado (pNF-kB) fue detectable en la mucosa de control normal. Después de los diferentes tratamientos, observamos sólo un ligero aumento en los niveles de pNF-kB en la mucosa de los ratones tratados con leche desnatada fermentada conL. paracaseiCBA L74 o S.thermophilussola, mientras que en los ratones que recibieron leche desnatada fermentada con ambas cepas,<p>NF-kB fue comparable a los controles. El aumento de<p>NF-kB fue paralelo a la desaparición de la subunidad inhibidora de NF-kB, IKB, que no fue detectable en la mucosa de ratones suplementados con leche desnatada fermentada conL. paracaseiCBA L74 o S.thermophilussola. Los ratones que recibieron leche desnatada fermentada con ambas cepas mostraron niveles de IkB comparables a los controles.
Ejemplo 10: Efecto de la leche fermentada por L. paracasei CBA L74 sobre el fenotipo de células dendríticas en la mucosa intestinal (no según la invención)
Fenotipo de células dendríticas extraídas de las placas de Peyer
Examinamos el efecto de la suplementación de la dieta sobre el fenotipo de las DC intestinales. Los resultados de este análisis se muestran en la Figura 17. La administración de leche fermentada conL. paracaseisola, así como conL. paracaseiy S.thermophilusen dosis más bajas y más altas produjo una disminución estadísticamente significativa en la expresión de CD80 y CD86 en comparación con los ratones de control (* significa p<0,05 frente al control), mientras que los niveles de HLAII y CD40 en general se mantuvieron estables. Los datos de la Figura 17 se expresan como media ± S.E. de tres experimentos separados.
Respuestas de células dendríticas expuestas a LPS/CpG
Determinamos la capacidad de la suplementación dietética para modificar la reactividad de las DC a los estímulos proinflamatorios (tales como LPS bacteriano y CpG). Como se muestra en la Figura 18, la exposición de DC aisladas de animales de control a LPS y CpG provocó un aumento significativo en la expresión de CD80 (* significa p<0,05 frente a DC no estimuladas de ratones de control). Se observó un efecto similar en las DC purificadas de ratones que recibieron leche no fermentada (° media p<0,05 frente a las DC no estimuladas de ratones tratados con leche no fermentada). La administración de leche desnatada fermentada conL. paracaseiCBA L74 sola previno completamente los efectos mediados por LPS en ratones tratados con leche no fermentada, aunque fue menos efectiva en el aumento de CD80 inducido por CpG. La leche desnatada fermentada con S.thermophilussola previno los efectos de LPS y CpG y redujo la expresión de CD80. Finalmente, la administración de leche desnatada fermentada con ambas cepas previno el aumento de CD80 inducido por LPS y CpG, y mantuvo la expresión de CD80 en niveles basales. Los datos de la Figura 18 se expresan como media ± S.E. de tres experimentos separados.
Ejemplo 11: Efecto de la leche fermentada por L. paracasei CBA L74 sobre el fenotipo de los linfocitos T en la mucosa intestinal (no según la invención)
Respuestas de los linfocitos intestinales CD4+ y CD8+ expuestos a PHA. Nos preguntamos si la suplementación dietética con leche (fermentada o no fermentada) afectaría la polarización de los linfocitos T intestinales (CD4+ y CD8+) hacia un fenotipo Th1 o Th2. Los linfocitos derivados de las placas de Peyer se expusieron a PHA, y entonces se evaluó la polarización de los linfocitos mediante tinción para IL-4 e IFN-y intracelulares.
Como se muestra en la Figura 19, la exposición a PHA aumentó significativamente la producción de IL4 e IFNy en los linfocitos CD4+ de los ratones de control (* significa p<0,05 frente a los linfocitos no estimulados de los ratones de control). Esta inducción no se observó en ratones tratados con leche no fermentada o fermentada. Después de la suplementación con leche no fermentada, los linfocitos CD4+ mostraron niveles basales aumentados de IL4 e IFN-y en comparación con los animales de control (° significa p<0,05 frente a linfocitos no estimulados de ratones de control). Estos datos sugirieron que la suplementación con leche fermentada previno la activación no específica y mantuvo la producción de IL4 e IFN-y en niveles basales.
Como se muestra en la Figura 20, la exposición a PHA en los linfocitos intestinales CD8+ de los ratones de control aumentó la producción de IL4 e IFNy (* significa p<0,05 frente a los linfocitos no estimulados de los ratones de control). Esta inducción no se observó en ratones tratados con leche no fermentada o fermentada. La administración de leche fermentada conL. paracaseiy S.thermophilusen dosis más altas disminuyó la producción basal de IL4, mientras que después de la estimulación con PHA, los niveles tanto de IL4 como de IFNy se redujeron en comparación con los linfocitos estimulados de los ratones de control (§ significa p<0,05).
Ejemplo 12: Efecto de la leche fermentada por L. paracasei CBA L74 sobre la histología de la mucosa intestinal (no según la invención)
Para determinar la distribución de células proliferantes en la mucosa intestinal, realizamos un análisis inmunohistoquímico de la expresión de Ki67, un antígeno expresado por células en división. En los ratones de control, se observó una clara inmunorreactividad en las criptas intestinales, mientras que no hubo tinción en las vellosidades. En el tejido de los ratones que recibieron leche no fermentada, hubo una expresión más fuerte en las criptas, aunque no hubo expresión ectópica del antígeno. En los ratones que recibieron diferentes tipos de leche fermentada, observamos patrones de tinción comparables. Hemos realizado una evaluación histológica de la mucosa ileal de los diferentes grupos experimentales. Los resultados de este estudio se muestran en la Figura 21. La administración de leche no fermentada redujo el número y la longitud de las vellosidades intestinales, mientras que la morfología intestinal se conservó en los animales que recibieron las diversas formas de leche fermentada.
Ejemplo 13: Efecto del arroz fermentado por L. paracasei CBA L74 sobre marcadores del sistema inmune en la mucosa intestinal (no según la invención)
Estos experimentos se diseñaron para evaluar las propiedades inmunomoduladoras de los cereales fermentados porL. paracaseiCBA-L74. Los estudios incluyeron la administración intragástrica diaria durante dos semanas de: 1) Arroz no fermentado; 2) Arroz fermentado (conL. paracaseiCBA L74) 100 mg día (correspondiente a 2 x108 ufc/l de L.paracasei CBA-L74) y 3) Arroz fermentado (conL. paracaseiCBA L74) 500 mg día (correspondiente a 109 ufc/l de L.paracasei CBA-L74) Los ratones durante el período de tratamiento no mostraron ningún signo de enfermedad o diarrea. Al final del tratamiento, los ratones se sacrificaron, y las placas de Peyer (PP) se recolectaron asépticamente. Las células epiteliales se eliminaron de las PP mediante incubación en HBSS sin Ca2+ más EDTA, y después los tejidos se sometieron a digestión enzimática. La suspensión de células individuales se lavó, se resuspendió en RMPI frío, y se utilizó para las siguientes pruebas.
Inicialmente examinamos el efecto de diferentes suplementos dietéticos sobre toda la mucosa intestinal. En primer lugar, realizamos tinción con hematoxilina y eosina de secciones ileales embebidas en parafina. Ninguno de los suplementos dietéticos utilizados tuvo efectos significativos sobre la arquitectura intestinal, ni provocó un infiltrado de células inflamatorias.
Después, determinamos si la administración de arroz fermentado porL. paracaseiCBA L74 afectaba el nivel de citocinas antiinflamatorias y proinflamatorias en la mucosa intestinal. Como se muestra en la Figura 22, la administración de arroz o arroz fermentado aumentó tanto IL-1 p como IL-4 mucosales. La suplementación con arroz fermentado en la dosis más alta provocó una reducción de IL-10, como se muestra en la Figura 23.
Después, determinamos el efecto de diferentes regímenes de suplementación sobre el nivel de IgA mucosal. Tras dos semanas de suplementación de la dieta, los animales se sacrificaron, y la mucosa intestinal se recogió y se homogeneizó. La IgA total se midió mediante ELISA, y los valores se normalizaron a las proteínas mucosales totales. Ninguno de los suplementos tuvo efectos significativos sobre la IgA mucosal.
Analizamos los efectos del arroz o del arroz fermentado porL. paracaseiCBA L74 sobre la inmunidad innata de la mucosa intestinal. Como se muestra en la Figura 24, la suplementación de la dieta con arroz y arroz fermentado (dosis baja) sólo tuvo efectos moderados sobre los TLR de la mucosa. Como se muestra en la Figura 25a, la suplementación de la dieta con arroz no fermentado aumentó drásticamente los niveles de PPARy mucosal. Las dosis altas de arroz fermentado también aumentaron los niveles de PPARy mucosal. Como se muestra en la Figura 25b, dos semanas de suplementación de la dieta con arroz no fermentado redujeron la activación de NF-kB y aumentaron el IKB en la mucosa. La suplementación con arroz fermentado en dosis bajas no tuvo efecto en comparación con el control, mientras que la dosis más alta tuvo efectos comparables a los observados con el arroz no fermentado.
También medimos los efectos de la administración dietética sobre el nivel de citocinas antiinflamatorias y proinflamatorias en el suero. La suplementación dietética con arroz o arroz fermentado (dosis baja) no tuvo influencia en los niveles séricos de IL-1 p e IL-4.
Ejemplo 14: Efecto del arroz fermentado por L. paracasei CBA L74 sobre el fenotipo de células dendríticas en la mucosa intestinal (no según la invención)
A continuación, nos centramos en el impacto de la suplementación dietética con arroz no fermentado o arroz fermentado conL. paracaseiCBA L74 sobre las células inmunes relevantes para la actividad del sistema inmune asociado a las mucosas, es decir, las células dendríticas y los linfocitos. Primero, marcamos la suspensión de células individuales con anti-CD1 (para identificar DC) y con anti CD-80 y CD-86, MHC-II y CD-40 para determinar el nivel de actividad y madurez de las DC intestinales en estos órganos linfoides. Como se muestra en la tabla de la Figura 26, observamos un efecto significativo del arroz fermentado en dosis altas sobre el fenotipo de las DC. La suplementación con arroz no fermentado (en estos experimentos utilizamos dos dosis diferentes) no tuvo efecto, mientras que los efectos del arroz fermentado sobre el nivel de CD80, CD40 y MHC-II fueron evidentes a 100 mg/día, y más pronunciados a 500 mg/día.
A continuación, determinamos la capacidad de la suplementación de la dieta con arroz o arroz fermentado conL. paracaseiCBA L74 para modificar la reactividad de las DC a los estímulos proinflamatorios (tales como LPS bacteriano y CpG). Como se muestra en la tabla de la Figura 27, la exposición de las DC de los ratones de control a LPS o CpG indujo un aumento de CD80 en las DC de control. La suplementación con arroz no fermentado no modificó la reactividad a los estímulos inflamatorios. La suplementación con la dosis probada de arroz fermentado redujo el aumento de CD80 inducido por LPS y CpG.
Ejemplo 15: Efecto del arroz fermentado por L. paracasei CBA L74 sobre el fenotipo de linfocitos T en la mucosa intestinal (no según la invención)
Investigamos si la suplementación dietética con arroz o arroz fermentado conL. paracaseiCBA L74 podía influir en la polarización de los linfocitos T intestinales (ya sea CD4+ y CD8+) hacia un fenotipo Th1 o Th2. Los linfocitos derivados de las placas de Peyer se expusieron a p Ha , y entonces se evaluó la polarización de los linfocitos mediante tinción intraquinasa para IL-4 e IFN-y.
Los resultados de este experimento para los linfocitos CD4+ y CD8+ se muestran en las Figuras 28 y 29, respectivamente. Como se muestra en la Figura 28, en la condición basal, en los linfocitos CD4+, IL-4 e IFNy estaban casi en equilibrio ya que alrededor de 10-12% de las células son positivas para estas citocinas. Como se muestra en la Figura 29, en CD8+, en la condición basal, hubo un ligero predominio de IL-4 sobre las células que expresaban IFNy. La exposición de linfocitos CD4+ o CD8+ a PHA provocó un fuerte aumento en la tinción intracelular de IL-4 e IFNy, con un predominio de la producción de IFNy.
En ratones que recibieron arroz no fermentado, observamos una preponderancia de la producción de IL-4 (fenotipo Th2) tanto en condición basal como después de la estimulación con PHA, tanto para linfocitos CD4+ como CD8+. Sin embargo, la producción de IL-4 se asoció a una persistencia de la producción de IFNy en condición basal y, después de la estimulación con PHA, observamos una mayor expresión de esta citocina, aunque la respuesta estaba atenuada en comparación con la respuesta en las células de control. En los ratones que recibieron el arroz fermentado en condición basal observamos una preponderancia de células IFNy positivas sobre IL-4, aunque en condición basal el porcentaje fue comparable (para CD4+) o ligeramente inferior (para CD8+) en comparación con los controles. Después de la estimulación con PHA, en ambas poblaciones celulares la respuesta de las citocinas se redujo en comparación con los ratones de control, aunque se dirigió hacia un fenotipo Th1 (preponderancia de células positivas a IFNy).
Ejemplo 16: Efecto de L. paracasei CBA L74 sobre la producción de IL-10 en células dendríticas derivadas de monocitos (MoDCs) en presencia de Salmonella typhimuriumProbamos la capacidad tanto de las células deL. paracasei<c>B<a>L74 como de los sobrenadantes de células deL. paracaseiCBA L74 para inducir la producción de la citocina antiinflamatoria, IL-10, en las MoDC humanas en presencia del patógeno bacteriano,Salmonella typhimurium.Los MoDC humanas se obtuvieron de al menos cuatro, y en algunos casos, siete donantes. Como se muestra en la Figura 30, las células deSalmonella typhimurium("FB62"), de la cepa de control deLactobacillus, L. paracasei21060 ("B21060"), y deL. paracaseiCBA L74 ("CBAL74") indujeron la producción de IL-10. Por el contrario, aunque el sobrenadante deSalmonella typhimurium("sn fb62") indujo la producción de IL-10, los sobrenadantes de ambos Lactobacilli, cepa deLactobacillus, L. paracasei21060 ("sn b21060") yL. paracaseiCBA L74 ("sn cbal74"), no lo hicieron. La co-incubación del sobrenadante deL. paracaseiCBA L74 conSalmonella typhimurium("sn cbal74 FB62") indujo IL-10 a niveles de alrededor de y por encima de los observados conSalmonella typhimuriumsola ("sn fb62 FB62"). Curiosamente, se observó un efecto similar incluso si las MoDC se preacondicionaron con sobrenadante deL. paracaseiCBA L74 durante sólo una hora y luego se lavaron para eliminar el sobrenadante ("1 h sn cbal74 FB62").
Ejemplo 17: Efecto de L. paracasei CBA L74 sobre la producción de IL-12p70 en células dendríticas derivadas de monocitos (MoDC) en presencia de Salmonella typhimurium
Probamos la capacidad de las células deL. paracaseiCBA L74 y de los sobrenadantes de células deL. paracaseiCBA L74 para inducir la producción de la citocina proinflamatoria, IL-12p70, en MoDC humanas en presencia del patógeno bacteriano,Salmonella typhimurium.Los MoDC humanas se obtuvieron de al menos cuatro, y en algunos casos, siete donantes. Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 31. En contraste con los resultados obtenidos en el Ejemplo 16 para la citocina antiinflamatoria, encontramos queSalmonella typhimurium("FB62") indujo altos niveles de IL-12p70 mientras que las células de la cepa de control deLactobacillus, L.paracasei21060 ("B21060") yL. paracaseiCBA L74 ("CBAL74") indujeron sólo niveles bajos de IL-12p70. Aquí nuevamente, el sobrenadante deSalmonella typhimurium("sn fb62") indujo la producción de IL-12p70, pero los sobrenadantes de ambas cepas deLactobacillus, L. paracasei21060 ("sn b21060") yL. paracaseiCBA L74 ("sn cbal74"), no lo hicieron. La coincubación del sobrenadante deL. paracaseiCBA L74 conSalmonella typhimurium("sn cbal74 FB62") provocó una sorprendente reducción en la producción de IL-12p70. El efecto se observó incluso si las MoDC se preacondicionaron con sobrenadante deL. paracaseiCBA L74 durante sólo una hora y luego se lavaron para eliminar el sobrenadante ("1h sn cbal74 FB62"). Esta reducción superó la observada para Lactobacillus de control,L.paracasei21060 ("1h sn b21060 FB62"). Estos datos sugieren que tantoL. paracaseiCBA L74 como el sobrenadante de cultivo deL. paracaseiCBA L74 tienen propiedades antiinflamatorias que pueden mitigar la inflamación inducida por el patógeno bacteriano,Salmonella typhimurium.
Ejemplo 18: Efecto de la leche fermentada por L. paracasei CBA L74 sobre la producción de IL-10 en células dendríticas derivadas de monocitos (MoDC) en presencia de Salmonella typhimurium (no según la invención)
Probamos la capacidad de la leche fermentada porL. paracaseiCBA L74 para inducir la producción de la citocina antiinflamatoria, IL-10, en MoDC humanas en presencia del patógeno bacteriano,Salmonella typhimurium.Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 32. Aunque las MoDC no activadas normalmente no producen IL-10, descubrimos que la incubación de MoDC con leche fermentada porL. paracaseiCBA L74 indujo una producción de IL-10 dependiente de la dosis (véase "matrice CBAL74 1.41 gr/100ml" y "matrice CBAL74 0.14gr/100ml"). La capacidad se mantuvo incluso en presencia deSalmonella typhimurium(véase "matrice CBAL74 1,41 gr/100ml FB62" y "matrice CBAL740,14gr/100ml FB62").
La Figura 32 también muestra queL. paracaseiCBA L74 que se había activado por calor ("6,3*106 UFC CBA74 hervida"), tratamiento con paraformaldehído ("6,3*106 UFC CBA74 PFA") o congelación-descongelación ("6,3*106 UFC CBA74 F&T") retuvo la capacidad de inducir IL-10.
Como observamos para los medios de cultivo deL. paracaseiCBA L74, la leche fermentada porL. paracaseiCBA L74 provocó una reducción significativa, dependiente de la dosis, en la producción de IL-12p70 inducida porSalmonella typhimurium.(Figura 33). La leche fermentada por S.thermophilusprovocó un aumento en la producción de IL-12p70 en presencia de Salmonella typhimurium. Sin embargo, la leche fermentada porL. paracaseiCBA L74 no estimuló la producción de IL-12p70, lo que es consistente con las propiedades antiinflamatorias deL. paracaseiCBA L74. Estos datos sugieren queL. paracaseiCBA L74 conservó sus propiedades antiinflamatorias incluso en presencia de especies más proinflamatorias.
Ejemplo 19: Efecto de los sobrenadantes de células de L. paracasei CBA L74 sobre la producción de IL-10 e IL12p70 en células dendríticas derivadas de monocitos (MoDC) en presencia de Enterobacter sakazaki
Probamos la capacidad de los sobrenadantes de células deL. paracaseiCBA L74 para inducir la producción de la citocina antiinflamatoria, IL-10, y la citocina proinflamatoria, IL-12p70, en MoDC humanas en presencia del patógeno bacteriano,Enterobacter sakazaki.Probamos dos cepas deE. sakazaki,N9 y N13. E. sakazaki indujo la producción tanto de IL-10 como de IL-12p70 en MoDC humanas. La adición de sobrenadantes de célulasL. paracaseiCBA L74 dio como resultado un aumento de IL-10 y una disminución significativa de IL-12p70.
Ejemplo 20: Efecto del arroz fermentado con L. paracasei CBA L74 sobre la producción de citocinas en un modelo de explante de tejido en presencia de Salmonella typhimurium (no según la invención)
Se usó epitelio intestinal de ratón para establecer un sistema de cocultivo tridimensional como se describe en Abud (Exp. Cell Res. 303: 252-262 (2005)). Los explantes de tejido se cultivaron durante 24 horas en presencia de O<2>al 100% con una presión de una atmósfera. La cámara inferior contenía 1 ml de hEC DMEM más ITS-X y EGF. La cámara superior contenía 200 ml de medio másS.typhimurium,arroz fermentado conL. paracaseiCBA L74, o una combinación deS.typhimuriumy arroz fermentado conL. paracaseiCBA L74. Se recolectaron los sobrenadantes, y los niveles de IL-1 p, TNF-a e IL-10 se analizaron mediante ELISA. Como se muestra en la Figura 33, la adición de arroz fermentado redujo significativamente la producción de las citocinas proinflamatorias, IL-1 p y TNF-a en presencia de S.typhimurium,con sólo un efecto moderado sobre los niveles de la citocina antiinflamatoria, IL-10.

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende un sobrenadante de un cultivo fermentado de la bacteria probióticaLactobacillus paracaseiCBA L74, Número de Acceso del Depósito Internacional LMG P-24778, en la que todas o sustancialmente todas las células deLactobacillus paracaseiCBA L74 se han eliminado del sobrenadante, en la que el sobrenadante comprende uno o más componentes bacterianos subcelulares deLactobacillus paracaseiCBA L74.
2. La composición según la reivindicación 1, que comprende además un portador fisiológicamente aceptable.
3. La composición de la reivindicación 2, en la que el portador fisiológicamente aceptable es un producto alimentario.
4. Un sobrenadante de un cultivo fermentado de la bacteria probióticaLactobacillus paracaseiCBA L74, Número de Acceso del Depósito Internacional LMG P-24778, para uso en el tratamiento de un trastorno gastrointestinal en un sujeto, en el que todas o sustancialmente todas las células deLactobacillus paracaseiCBA L74 se han eliminado del sobrenadante, en el que el sobrenadante comprende uno o más componentes bacterianos subcelulares deLactobacillus paracaseiCBA L74.
5. El sobrenadante de un cultivo fermentado de la bacteria probióticaLactobacillus paracaseiCBA L74, Número de Acceso del Depósito Internacional LMG P-24778, para uso según la reivindicación 4, en el que el trastorno gastrointestinal es un déficit del sistema inmunitario de las mucosas, una alergia alimentaria, un trastorno asociado con diarrea, una infección bacteriana o viral, síndrome del intestino irritable, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, celiaquía, o enterocolitis necrotizante.
6. El sobrenadante de un cultivo fermentado de la bacteria probióticaLactobacillus paracaseiCBA L74, Número de Acceso del Depósito Internacional LMG P-24778, para uso según la reivindicación 5, en el que el déficit del sistema inmune de las mucosas es un sistema inmune inmaduro.
7. El sobrenadante de un cultivo fermentado de la bacteria probióticaLactobacillus paracaseiCBA L74, Número de Acceso del Depósito Internacional LMG P-24778, para uso según la reivindicación 4, en el que el sujeto es un lactante.
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