ES3005160T3 - Method for detecting and quantifying circulating dna and uses - Google Patents
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Abstract
Español La invención se refiere en particular a un método para detectar y/o cuantificar ADN libre de células de una muestra de fluido biológico de un paciente de interés, que comprende al menos: (i) una etapa de extracción de ADN libre de células de una muestra de fluido biológico al que se añade al menos una cantidad efectiva de un primer fragmento de ADN exógeno que tiene 50-2000 pares de bases, preferiblemente 50-200 pares de bases, preferiblemente 60-160 pares de bases, incluso más preferiblemente 70-150 pares de bases y mejor aún 80-140 pares de bases (ICE); (ii) una etapa de amplificación y cuantificación del ADN libre de células extraído en la etapa (i) y el fragmento de ADN exógeno ICE; y (iii) una etapa de estandarización de la cantidad de ADN libre de células extraído, que comprende el cálculo de una primera relación (Grewis) del número de copias de ADN libre de células con respecto al número de copias del primer fragmento de ADN exógeno (ICE), y sus usos con fines de diagnóstico, pronóstico o teragnóstico, o para monitorear el progreso de un estado fisiológico específico de un paciente de interés que probablemente libere ADN circulante. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimiento de detección y cuantificación de ADN circulante y usos del mismo
Campo de la invención
El campo de la invención se refiere a un procedimiento de detección y cuantificación de ADN libre de todas las células (denominado de otro modo generalmente 'ADN circulante' o 'ADN libre circulante ADNcf') y su uso en particular con fines de diagnóstico, pronóstico o seguimiento del estado fisiológico de un sujeto de interés dado.
Estado de la técnica
Desde hace muchos años se sabe que el plasma sanguíneo contiene pequeñas cantidades de ADN libre circulante, del orden de unos diez nanogramos por mililitro, y que esta concentración aumenta significativamente, hasta 0,5 microgramos por mililitro, en pacientes con cáncer. Varios estudios han demostrado que el ADN circulante puede utilizarse para detectar cambios genéticos específicos de procesos cancerosos, como mutaciones y alteraciones en microsatélites (cánceres de pulmón, colorrectal y de cabeza y cuello). Sin embargo, la prevalencia de estas alteraciones genéticas en el ADN circulante varía según las enfermedades y los genes estudiados (Pierre Hainaut, m/s n°3, vol.16, marzo de 2000).
Si, en la actualidad, las concentraciones de ADN circulante no se utilizan, o se utilizan sólo de forma limitada, como herramienta diagnóstica o pronóstica, ello se debe a la falta de normalización de los procedimientos de extracción y ensayo que permitirían establecer estos umbrales normalizados. Se han publicado "buenas prácticas" preanalíticas específicas para el ADN circulante. En particular, recomiendan trabajar con plasma recogido en tubos (EDTA, Streck, Roche), centrifugar el tubo de sangre a más tardar 6 horas después de la recogida (hasta 24 horas según el centro de análisis), conservar el plasma a -20°C (caducidad 1 mes), conservar el ADN circulante extraído a -20°C (en tubos con tapón de rosca) y evitar ciclos repetidos de descongelación y recongelación.
Sin embargo, las consideraciones preanalíticas que influyen en el resultado analítico deben tener en cuenta otros factores como el volumen de plasma a extraer, que se correlaciona directamente con la cantidad de ADN extraído, el rendimiento de la técnica de extracción para un volumen determinado de líquido, la reproducibilidad de la extracción, la concentración final de ADN y la estandarización inter-ensayos del rendimiento/concentración del eluido obtenido.
Debido a la relativa facilidad de acceso y a la naturaleza de la muestra, desde hace algunos años se presume el uso de ADN libre de células (también denominado ADN circulante) para el seguimiento de la progresión o la respuesta de los pacientes a tratamientos anticancerosos (Aung KL et al., Hugo J 2010) u otros tratamientos. El término "biopsia líquida" ha surgido para describir el seguimiento de la evolución genética tumoral a partir de la sangre (Fatouros IG et al.,ClinBiochem 2010).
Las concentraciones de ADN circulante reflejan de hecho procesos patológicos pero también fisiológicos (Fatouros IG, et al.. ClinBiochem 2010). El ADN extracelular circulante puede detectarse en controles sanos (Fatouros IG, et al.). ClinBiochem 2010) y con malignidad (Oxnard GR et al., Clin Cancer Res 2014; Lipson EJ et al., J Immunother Cancer 2014; Reinert T et al., Gut 2016; ) o no malignidad (Steinman CR.). J Clin Invest 1984; Galeazzi M, et al.. AutoimmunRev 2003). Además, los traumatismos (Laktionov PP, et al., Nucleosides Nucleotides NucleicAcids 2004), los procedimientos terapéuticos (Davis GL, Jr., Davis JS., ArthritisRheum 1973) y la gestación (Lo YM et al, 1997) también pueden provocar la liberación de ADN libre en la circulación. Por tanto, son muchos los factores que pueden influir en el nivel de ADN circulante en el plasma. El seguimiento de la respuesta al tratamiento mediante muestreos sanguíneos periódicos ofrece ventajas reales.
Así pues, si la cantidad de ADN circulante por ml de fluido puede considerarse un biomarcador de una respuesta clínica, la estandarización de la cantidad de ADN circulante extraído de una extracción a otra es primordial.
Además de estandarizar la cantidad de ADN extraído, mantener el perfil de tamaño de las muestras de ADN circulante es de importancia que puede ser crucial para la validación biológica de los resultados. El tamaño de los fragmentos de ADN circulante en los controles sanos procede esencialmente de células apoptóticas. La longitud de los fragmentos de ADN circulante suele ser de 185 a 200 pb (Giacona MB et al., Pancreas 1998). Este ADN circulante uniformemente truncado se produce por escisión enzimática durante la apoptosis (Wyllie AH, Nature 1980). En cuanto al tamaño del ADN circulante de las células malignas, varía mucho, porque además de la apoptosis, la necrosis y la autofagia son responsables de la muerte de las células cancerosas (Jin Z y El-Deiry WS, Cancer BiolTher 2005). El tamaño de los fragmentos de ADN circulante es, por tanto, diferente entre individuos sanos y patológicos.
Es importante que las técnicas de extracción de ADN circulante conserven el perfil de tamaño del ADN circulante, en particular los fragmentos pequeños que pueden eliminarse si la proporción de la mezcla de componentes químicos en la etapa de unión de la columna de sílice, varía. La composición del líquido también puede modificar esta proporción. Por lo tanto, es vital poder comprobar y normalizar la eficacia de la extracción de fragmentos pequeños, especialmente en torno a los 100 pares de bases.
Otros parámetros a tener en cuenta son el rendimiento de la extracción de ADN (cantidad total), el volumen de elución y la concentración de estos ADN circulantes.
De hecho, la cantidad de ADN circulante es directamente proporcional a la cantidad de plasma extraído, por lo que es importante extraer la mayor cantidad de plasma posible. El volumen total a extraer, incluyendo plasma, proteasas y soluciones fijadoras, es por término medio superior a 10 ml (para 4 ml de plasma) y debe ser eluido en columnas de sílice de no más de 1 a 2 cm de altura y 1 cm de diámetro. Obsérvese que cuanto menor sea el diámetro de la columna, menor será el volumen de elución y más concentrado será el extracto de ADN circulante.
Además, el número de análisis a realizar en este tipo de muestras puede ser muy grande; por lo tanto, es esencial obtener volúmenes de elución que permitan realizar numerosos análisis con concentraciones suficientes de ADN circulante. Ambas cosas se excluyen mutuamente.
Por último, la obtención de una solución concentrada es esencial porque la sensibilidad analítica depende directamente de la cantidad de ADN circulante analizada.
El volumen de líquido a extraer, la concentración y el volumen de elución son interdependientes.
Según el leal saber y entender del Solicitante, no existen actualmente kits y dispositivos para extraer, amplificar y cuantificar ADN, en particular ADN libre de todas las células, que aborden estas diversas cuestiones.
Además, desde los trabajos de P Mandel y P Métais en 1948, se ha establecido claramente que la sangre transporta una pequeña cantidad de ADN libre circulante resultante de la liberación de material genético por los tejidos. Este ADN circulante libre (ADNcf) se presenta en forma de ADN bicatenario con un tamaño medio de 150-180 pb, correspondiente al enrollamiento del ADN alrededor del nucleosoma. Los tamaños mayores corresponden a múltiplos de 150-180 pb. Dura menos de dos horas antes de ser filtrada y eliminada del torrente sanguíneo por el bazo, el hígado y los riñones. Todos los estudios coinciden en que el ADNcf se detecta en menor cantidad en individuos sanos y que su aumento está relacionado con diversas situaciones clínicas como el ictus, el infarto de miocardio, el ejercicio muscular intenso, la insuficiencia renal aguda, la citolisis hepática, los traumatismos, la cirugía, el rechazo de trasplantes y el cáncer.
El origen del ADNcf aún no está totalmente dilucidado pero se cree que está relacionado con 3 fenómenos: la apoptosis, la necrosis y, en menor medida, la secreción activa. En individuos sanos, el ADN circulante procede principalmente de células sometidas a apoptosis (Giacona, M. B. et al., Pancreas, 1998). Las longitudes de los fragmentos de ADN en este caso son generalmente de 185 a 200 pb (Wyllie, A. H. et al., Int Rev Cytol, 1980). En el tejido canceroso, en cambio, el tamaño del ADN circulante varía mucho, porque además de la apoptosis, la necrosis y la autofagia son responsables de la muerte de las células cancerosas (Jin, Z. et al., Cancer Biol Ther, 2005). Los fragmentos pueden ser tan grandes como 450-500 pb, lo que corresponde al enrollamiento del ADN alrededor de 3 nucleosomas. Más allá de estos tamaños, también pueden estar presentes fragmentos aún mayores, que suelen considerarse el resultado de la contaminación por a Dn leucocitario. Sin embargo, el origen de estos fragmentos de alto peso sigue sin estar claro. Las poblaciones de ADN circulante pueden distinguirse midiendo el tamaño de los fragmentos largos y cortos. Se trata de enfoques NGS (Next Generation Sequencing) que utilizan procesos bioinformáticos específicos para medir el tamaño de los ADNc. Jiang P y Lo YM muestran interés por numerosas aplicaciones, en particular en el campo de la oncología y los trasplantes (Trends Genet.). 2016). A pesar de ello, actualmente es imposible, en la práctica clínica habitual, determinar el origen somático (tumor, trasplante, etc.) y el proceso por el que se libera el a Dn circulante (apoptosis, necrosis, etc.).
Uno de los principales escollos del análisis de ADNcf se refiere a los procesos preanalíticos (procesamiento de los tubos de sangre y extracción de ADN). Las variaciones en las concentraciones de ADNcf pueden producirse artefactualmente por la liberación de ADN leucocitario antes de la primera centrifugación de los tubos, o en ausencia de una segunda centrifugación a un mínimo de 4000g. Además, con vistas a utilizar las concentraciones de ADNcf expresadas por ml/plasma para el seguimiento de la respuesta a los tratamientos, es importante garantizar la robustez de la técnica de extracción, pero sobre todo proponer un procedimiento para estandarizar las extracciones entre sí y a lo largo del tiempo.
Eini y otros. (Avicenna J Med Biotech 2016; 8(2):84-90) describe un procedimiento de extracción'in house'y un procedimiento de amplificación para ADN circulante en una muestra de plasma de un sujeto sano, implementando un fragmento de ADN exógeno de 167 nucleótidos y calculando un índice de integridad del ADN extraído para una evaluación cualitativa de la etapa de extracción.
El documento WO2014/194113 (Schutz et al.) describe un procedimiento de cuantificación de ADN acelular en un sujeto trasplantado a partir de una muestra de plasma enriquecida con ADN de 320 pb de origen no humano, para la evaluación cualitativa del rendimiento de la extracción.
Pero ninguno de estos documentos describe o sugiere el procedimiento objeto de las reivindicaciones 1 a 6 destinado a coamplificar y cuantificar un ADN circulante extraído de una muestra biológica de un sujeto que padece o desarrolla una afección clínica patológica según se define según la invención, y un fragmento de ADN exógeno de 50-200 pares de bases, con el fin de detectar según la invención variaciones cuantitativas ADN circulante extraído, con fines diagnósticos o pronósticos.
De hecho, los inventores han desarrollado un procedimiento de detección y cuantificación de ADN libre de todas las células (ADN circulante), que comprende una etapa de extracción en la que se añaden calibradores denominados de otro modo estándares (fragmentos de ADN exógeno), lo que permite normalizar las variaciones del ADN circulante en los pacientes y, posiblemente, además, comprobar la reproducibilidad de la extracción de ADN circulante de tamaño pequeño.
Por "calibradores" o "normalizadores" según la invención se entienden controles internos del proceso para detectar y cuantificar ADN circulante extraído, consistiendo dichos calibradores o normalizadores en fragmentos de ADN exógeno definidos a continuación. En el resto de esta descripción, también nos referiremos a esto como fragmento ICE calibrado o fragmento ICE.
Por 'fragmento ICE calibrado' se entiende según la invención un fragmento de ADN exógeno cuya concentración se calibra mediante ddPCR; el uso de este fragmento ICE calibrado permite normalizar la concentración de ADN genómico libre (ADNcf) mediante el cálculo de la relación ADNcf/ICE (Grewis) con el fin de garantizar que sólo se miden las fluctuaciones fisiológicas y/o patológicas de este ADN circulante en un sujeto de interés en comparación con otros puntos de análisis a lo largo del tiempo o en comparación con un control (sujeto sano).
Por 'fragmento de ADN exógeno' se entiende un fragmento de ADN de una especie distinta a la del ADN circulante de interés; preferentemente se elegirá un fragmento de ADN exógeno no humano para la extracción de ADN circulante genómico humano.
Por 'ADN circulante' se entiende ADN libre de todas las células. En el resto de la descripción, nos referiremos al ADN libre de todas las células o ADN circulante (ADNcf). Según una realización particular, se tratará de ADN circulante humano, en particular ADN circulante de un sujeto de interés.
Por 'sujeto de interés' se entiende un sujeto distinto de un sujeto normal o sano. El sujeto de interés según la invención es un sujeto susceptible de liberar ADN libre de todas las células, en particular ligados a fenómenos de apoptosis, necrosis y/o en menor medida de secreción activa. Dicho sujeto de interés según la invención reivindicada es un sujeto que padece o desarrolla cáncer o una afección clínica patológica elegida en particular entre accidente cerebrovascular o infarto de miocardio, insuficiencia renal aguda, citólisis hepática, traumatismo, rechazo de injerto, o un sujeto sometido a tratamiento médico como biopsia, cirugía, radioterapia, quimioterapia, inmunoterapia o principio activo (químico o biológico).
El procedimiento de detección y cuantificación de ADN circulante que implementa una etapa de extracción al que se añaden calibradores o normalizadores según las realizaciones útiles para comprender la invención descritas a continuación, tiene las siguientes ventajas en función de las realizaciones descritas a continuación:
• Recubrimiento superior de ADN fragmentado para aplicaciones sensibles;
• Control del rendimiento de extracción mediante normalización (control interno exógeno ICE utilizando el primer fragmento de ADN exógeno de 50-2000 pares de bases);
• Eventualmente el control de la eficacia de la extracción para tamaños cercanos a 100 pares de bases (LED utilizando el segundo fragmento de ADN exógeno opcional de 50-150 pares de bases);
• Optimización de los rendimientos de elución del ADN circulante (en presencia de albúmina o gelatina); y/o
• Concentración de la elución del ADN circulante (ultrafiltración),
• Co-amplificación según la invención del control interno exógeno y una secuencia de ADN genómico (ej.: ADN mutado, sobre todo en oncología, o ADN de donante en caso de trasplante).
También es ventajoso, en particular para las realizaciones preferentes de la invención, por su practicidad y ahorro de tiempo gracias a los accesorios en la parte superior de las columnas de extracción (lo que permite cargar toda la mezcla muestra/solución de extracción a la vez, lo que limita la contaminación cruzada), su control de calidad interno (medio de cultivo liofilizado como muestra de control), su reproducibilidad (albúmina, gelatina o sustitutos en la etapa de elución) y la concentración del ADN circulante (ultrafiltración).
Sumario de la invención
Los objetos de la invención se definen en las reivindicaciones 1 a 13.
Algunas de las siguientes realizaciones no están cubiertas por el texto de las reivindicaciones pero se consideran útiles para comprender la invención.
Una primera realización útil para comprender la invención es un procedimiento de detección y/o cuantificación de ADN libre de células a partir de una muestra de fluido biológico de un sujeto de interés, que comprende al menos:
(i) una etapa de extracción de ADN libre de todas las células a partir de una muestra de fluido biológico a la que se ha añadido al menos
a) una cantidad efectiva de un primer fragmento de ADN exógeno de 50-2000 pares de bases, preferiblemente de 50-200 pares de bases de acuerdo con la invención reivindicada, preferiblemente de 60-160 pares de bases, aún más preferiblemente de 70-150 pares de bases y mejor de 80-140 pares de bases (ICE), y
b) opcionalmente, una cantidad eficaz de un segundo fragmento de ADN exógeno de 50-150 pares de bases (LED) de secuencia distinta del primer fragmento de ADN exógeno;
(ii) una etapa de amplificación y cuantificación del ADN libre de todas las células y de los fragmentos de ADN exógeno de ICE y/o LED extraídos en la etapa i), y
(iii) una etapa de normalización de la cantidad de ADN libre extraído de todas las células y, opcionalmente, de su perfil de tamaño, que comprende:
o calcular una primera relación entre el número de copias de ADN libre de todas las células y el número de copias de un fragmento de ADN exógeno de 50-2000 pares de bases, preferiblemente de 50-200 pares de bases según la invención reivindicada, preferiblemente de 60-160 pares de bases, aún más preferiblemente de 70-150 pares de bases y mejor aún de 80-140 pares de bases (ICE), y o calcular opcionalmente una segunda relación entre el número de copias del primer fragmento de ADN exógeno de 50-2000 pares de bases (ICE) y el número de copias del segundo fragmento de ADN exógeno de 50-150 pares de bases (LED).
Por 'cantidad efectiva' de fragmento de ADN exógeno se entiende una cantidad (o un número de copias para un tamaño dado de fragmento) de ADN exógeno por ml de muestra de fluido biológico que permite la realización de la etapa de normalización de la cantidad de ADN circulante extraído y opcionalmente su perfil de tamaño.
Según una realización particular, la cantidad de ADN exógeno por ml de muestra de fluido biológico es de al menos 1fg, o incluso 2 fg por ml de muestra (es decir, 10000 a 20000 copias por ml de muestra de plasma para un fragmento de 110 pares de bases), en particular varía entre 1fg o 2 fg y 2ng por ml de muestra.
Estas concentraciones de calibradores, en zonas próximas o incluso inferiores a las concentraciones de copias genéticas de ADN libre de todas las células de un sujeto normal (por ejemplo, inferiores a 8ng/ml), permiten trabajar en los valores fisiológicos de un sujeto sano para medir con precisión las fluctuaciones.
La etapa (i) de extraer ADN libre de todas las células de una muestra de fluido biológico comprenderá generalmente sucesivamente una etapa de proteolizar dicha muestra biológica, una etapa de aislar el ADN libre circulante, y una etapa de eluir, opcionalmente precipitar y opcionalmente concentrar el ADN libre circulante.
La etapa (ii) de amplificación y cuantificación del ADN libre extraído de todas las células en la etapa anterior se llevará a cabo preferentemente según la invención mediante un procedimiento de PCR digital, Q-PCR y/o NGS.
Según una realización particular de la invención, el fragmento de ADN exógeno y una secuencia humana detectada por ddPCR o Taqman QPCR o NGS se coamplifican en el mismo pocillo. Esto se conoce como "coamplificación" o codetección.
El procedimiento según la invención también permite multiplexar en dPCR o NGS este calibrador (ICE) y anomalías génicas (mutaciones, amplificaciones...) con el fin de hacer un seguimiento de los cambios en la concentración de anomalías a lo largo del tiempo o en comparación con un sujeto de referencia (sujeto sano, control).
Por "sujeto de referencia (control, sujeto sano)" se entiende un sujeto "normal", distinto del sujeto de interés, es decir, que no es probable que se vea afectado por o desarrolle una indicación clínica como la descrita para el sujeto de interés.
La etapa de normalización iii), característica del procedimiento de detección y de cuantificación de la invención, permite medir de manera simple y fiable la cantidad de ADN circulante libre extraído y sus variaciones en el tiempo (nuevas extracciones y cuantificaciones a partir de una muestra de fluido biológico del mismo sujeto en momentos definidos t0, t1, t2...) o en comparación con un sujeto de referencia (control, sujeto sano), y eventualmente su perfil de tamaño para comprobar la reproducibilidad de la extracción de ADN circulante en la zona de tamaño específico, en particular ADN circulante de alrededor de 100 pares de bases de tamaño.
Otra realización útil para comprender la invención se refiere al uso del procedimiento de detección y/o cuantificación de ADN libre de todas las células a partir de una muestra de fluido biológico de un sujeto de interés según la invención, en un procedimiento para analizar una muestra biológica de un sujeto de interés susceptible de liberar ADN libre de todas las células, en particular un sujeto de interés que padece o es susceptible de padecer un cáncer o una afección clínica elegida en particular de un accidente cerebrovascular o un infarto de miocardio, una insuficiencia renal aguda, una citólisis hepática, un traumatismo, una intervención quirúrgica, un rechazo de injerto, o un sujeto sometido a un ejercicio muscular intenso, o un sujeto sometido a un tratamiento médico como una biopsia, una intervención quirúrgica, una radioterapia, una quimioterapia, una inmunoterapia o un principio activo.
Otra realización más útil para la comprensión de la invención se refiere a un procedimientoin vitrode análisis, en particular de diagnóstico, pronóstico, teranóstico, o de seguimiento de la evolución de un estado fisiológico específico de un sujeto de interés susceptible de liberar ADN circulante, en particular un sujeto de interés que padezca o pueda padecer un cáncer o una afección clínica seleccionada en particular entre un accidente cerebrovascular o un infarto de miocardio, una insuficiencia renal aguda, una citólisis hepática, un traumatismo, una intervención quirúrgica, un rechazo de injerto, o un sujeto sometido a un ejercicio muscular intenso, o un sujeto sometido a un tratamiento médico como una biopsia, una intervención quirúrgica, una radioterapia, una quimioterapia, una inmunoterapia, o un principio activo., que comprende las siguientes etapas:
(i) en un momento t0, detección y/o cuantificación de ADN libre de todas las células a partir de una muestra de fluido biológico de un sujeto de interés según el procedimiento de la invención descrito anteriormente;
(ii) en un momento t1, reproducción de la etapa i), y
a. comparación de la relación (Grewis) entre el número de copias de ADN circulante y el número de copias de un fragmento de ADN exógeno de 50-2000 pares de bases, preferentemente de 50-200 pares de bases según la invención, preferentemente de 60-160 pares de bases, aún más preferentemente de 70-150 pares de bases y más preferentemente de 80-140 pares de bases (ICE) obtenido en el momento t1 con respecto a la misma relación obtenida en el momento t0.
Etapas (ii) y (iii) pudiendo ser reproducidas tantas veces como sea necesario (por ejemplo en t2, t3, t4...) para seguir la evolución de un estado fisiológico específico de un sujeto de interés, y consecuentemente el efecto de un tratamiento médico (cirugía, fármacos, radioterapia,...) en dicho sujeto.
Estas mediciones podrán realizarse fácilmente a partir de una muestra de sangre recogida de dicho sujeto (análisis de sangre).
La duración del tiempo transcurrido entre dos momentos de medida (t0 y t1, t1 y t2...) puede representar generalmente una o unas horas, días, semanas, meses o años, dependiendo del estado fisiológico del sujeto de interés y del objetivo perseguido por la cuantificación del ADN circulante a partir de una muestra de fluido biológico de dicho sujeto.
El experto sabrá así adaptar esta duración del tiempo transcurrido entre dos momentos de medida en función del estado fisiológico del sujeto de interés y de los eventuales tratamientos médicos seguidos para definir los momentos t1, t2 y siguientes con relación a un t0 dado.
El procedimiento de análisis in vitro según la invención está destinado en particular a:
• analizar las fluctuaciones del ADN libre de todas las células para controlar la respuesta y/o la resistencia a un tratamiento médico como biopsia, cirugía, radioterapia, quimioterapia, inmunoterapia o principio activo, o • analizar las fluctuaciones del ADN libre de todas las células para controlar el inicio del rechazo del injerto, o bien
• analizar las fluctuaciones del ADN libre de todas las células para decidir si tiene interés un análisis posterior de las anomalías genómicas, o bien
• controlar los cambios en la concentración de ADN mutado, o
• monitorizar los cambios en la concentración de ADN del donante en el caso concreto de un sujeto trasplantado de interés con riesgo de rechazo del injerto.
Alternativamente, una realización útil para comprender la invención se refiere a un procedimientoin vitropara el diagnóstico, pronóstico, teranóstico de un sujeto de interés susceptible de liberar ADN circulante, en particular un sujeto de interés afectado por o susceptible de desarrollar cáncer o una afección clínica seleccionada en particular de ictus o infarto de miocardio, insuficiencia renal aguda, citólisis hepática, traumatismo, cirugía, rechazo de injerto, o un sujeto sometido a un ejercicio muscular intenso, o un sujeto sometido a un tratamiento médico como biopsia, cirugía, radioterapia, quimioterapia, inmunoterapia, o principio activo, que comprende las etapas siguientes:
(i) en un momento t, detección y/o cuantificación de ADN libre de todas las células a partir de una muestra de fluido biológico de un sujeto de interés según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5;
(ii) comparación de la relación (Grewis) entre el número de copias de ADN circulante y el número de copias de un fragmento de ADN exógeno de 50-2000 pares de bases, preferentemente de 50-200 pares de bases según la invención, preferentemente de 60-160 pares de bases, aún más preferentemente de 70-150 pares de bases y mejor aún de 80-140 pares de bases (ICE) obtenido en el momento t con respecto a la misma relación obtenida en un sujeto de referencia (sujeto sano, control).
Otra realización útil para comprender la invención es un kit o conjunto para extraer ADN libre de todas las células de una muestra de fluido biológico de un sujeto de interés, que comprende:
(i) Al menos un primer fragmento de ADN exógeno de 50-2000 pares de bases, preferiblemente 50-200 pares de bases según la invención, preferiblemente 60-160 pares de bases, aún más preferiblemente 70-150 pares de bases y más preferiblemente 80-140 pares de bases (ICE);
(ii) Tampones y enzimas, en particular un tampón de proteólisis, una enzima de proteólisis, un tampón de fijación, un tampón de lavado y un tampón de elución para el ADN libre de todas las células,
(iii) dispositivos para aislar el ADN libre de todas las células, en particular columnas de extracción con membrana de sílice y, ventajosamente, columnas de extracción rematadas por accesorios de carga, preferentemente embudos,
(iv) placas de múltiples pocillos, en particular placas DeepWell de 24 pocillos de 25 ml
(v) tubos con tapón de rosca, preferentemente de 1,5 ml, y
(vi) Instrucciones de uso,
dicho fragmento de ADN exógeno ICE se suministra en dicho kit o por separado a dicho kit, formando un kit de extracción.
Según una realización particular, los accesorios de carga utilizados en la etapa (iii) son accesorios que sobrepasan las columnas de extracción y que tienen al menos un diámetro mayor que el diámetro de dicha columna, lo que permite cargar toda la mezcla muestra/solución de extracción de una sola vez. En particular, dichos accesorios pueden utilizarse para cargar la columna con volúmenes comprendidos entre 0,5 y 100 ml, en particular entre 1 ml y 36 ml, preferentemente entre 1 ml y 14 ml. Según una realización particular, el volumen será de 0,5 a 8ml, en particular de 0,5 a 4ml.
Estos accesorios pueden tener diferentes formas. Según un procedimiento particular y preferido, se utilizan embudos como accesorios para cargar toda la mezcla de muestra/solución de extracción.
Por "solución de extracción" se entiende la solución que comprende los tampones y enzimas necesarios para la etapa de extracción de ADN circulante.
Según una realización particular, el kit de extracción de ADN libre de todas las células según la invención se utiliza en asociación con un kit de amplificación y cuantificación de ADN libre de todas las células, suministrados juntos o por separado.
El kit de amplificación y cuantificación de ADN libre de todas las células incluirá típicamente al menos:
(i) cebadores sentido y antisentido específicos respectivamente para el ADN libre de todas las células del sujeto de interés y para el fragmento de ADN exógeno como se define en la invención, para la etapa de amplificación, (ii) sondas marcadas respectivamente para el ADN libre de todas las células del sujeto de interés y para el fragmento de ADN exógeno tal como se define en la invención, para la etapa de detección y cuantificación, (iii) tampones de reacción,
(iv) placas de múltiples pocillos y
(v) instrucciones de uso.
Otra realización útil para comprender la invención se refiere al uso de al menos un primer fragmento de ADN exógeno de 50-2000 pares de bases, preferiblemente 50-200 pares de bases según la invención, preferiblemente 60-160 pares de bases, más preferiblemente 70-150 pares de bases y mejor aún 80-140 pares de bases (ICE), para su uso en la normalización de un procedimiento de extracción y cuantificación de ADN libre de todas las células y/o en un procedimiento de análisis de las fluctuaciones del ADN libre de todas las células de un sujeto de interés a lo largo del tiempo mediante la medición de la relación (Grewis) entre el número de copias de ADN libre de todas las células y el número de copias del primer fragmento de ADN exógeno de 50-2000 pares de bases, preferentemente 50-200 pares de bases según la invención, más preferentemente 60-160 pares de bases, aún más preferentemente 70-150 pares de bases y más preferentemente 80-140 pares de bases (ICE).
Dicho fragmento de ADN exógeno puede utilizarse ventajosamente con cualquier kit de extracción y/o cuantificación de ADN libre de todas las células.
Descripción detallada de la invención
Los objetos de la invención se definen en las reivindicaciones 1 a 13.
Algunas de las siguientes realizaciones no están cubiertas por el texto de las reivindicaciones pero se consideran útiles para comprender la invención.
Procedimiento de detección y/o cuantificación de ADN circulante
Una primera realización útil para comprender la invención se refiere a un procedimiento de detección y/o cuantificación de ADN libre de todas las células de una muestra de fluido biológico de un sujeto de interés, comprende al menos:
(i) una etapa de extracción de ADN libre de todas las células a partir de una muestra de fluido biológico a la que se ha añadido al menos una cantidad eficaz de un primer fragmento de ADN exógeno de 50-2000 pares de bases, preferentemente de 50-200 pares de bases según la invención, más preferentemente de 60-160 pares de bases, aún más preferentemente de 70-150 pares de bases y más preferentemente de 80-140 pares de bases (ICE); (ii) una etapa de amplificación y cuantificación del ADN libre de todas las células y del fragmento de ADN exógeno de ICE extraído en la etapa i), y
(iii) una etapa de normalización de la cantidad de ADN libre de todas las células extraído que comprende el cálculo de una primera relación (Grewis) entre el número de copias de ADN libre de todas las células y el número de copias del primer fragmento de ADN exógeno de 50-2000 pares de bases, preferentemente de 50-200 pares de bases, más preferentemente de 60-160 pares de bases, aún más preferentemente de 70-150 pares de bases y más preferentemente de 80-140 pares de bases (ICE).
Según la invención, el sujeto de interés es un sujeto que padece o desarrolla cáncer o una afección clínica seleccionada entre accidente cerebrovascular o infarto de miocardio, insuficiencia renal aguda, citólisis hepática, traumatismo, rechazo de injerto, o un sujeto sometido a tratamiento médico como biopsia, cirugía, radioterapia, quimioterapia, inmunoterapia o principio activo (químico o biológico).
Según una realización particular de la invención, el sujeto de interés padece o desarrolla cáncer. Según otra realización particular de la invención, el sujeto de interés es susceptible al rechazo del injerto.
Según otra realización particular de la invención, el sujeto de interés se somete a un tratamiento médico seleccionado entre biopsia, cirugía, radioterapia, quimioterapia, inmunoterapia o un principio activo (químico o biológico).
Según una realización particular de la invención, el fluido biológico se selecciona del grupo que consiste en sangre total, suero, plasma, orina, saliva, efluente de médula ósea, linfa, líquido cefalorraquídeo, líquido lacrimal, sudor, leche, humor acuoso, líquido sinovial, líquido pleural, líquido peritoneal, líquido amniótico, bilis, líquido seminal, esputo.
Preferentemente según la invención, el fluido biológico es plasma.
Las muestras de plasma suelen prepararse a partir de sangre total.
Con el fin de limitar la liberación de ADN celular (células circulantes) causando la dilución del ADN libre de todas las células, deben utilizarse preferentemente protocolos que incluyan dos centrifugaciones. Según un procedimiento preferido, se recoge sangre total, por ejemplo en tubos Cell-Free DNA BCT® (Streck), tubos Roche (Ariosa) y tubos EDTA K3 según las recomendaciones de los proveedores.
Ventajosamente, se consigue:
• una 1a centrifugación (1200-1600g) a temperatura ambiente (20°C /- 5°C) efectuada en un plazo máximo de 6 horas después de la toma de muestras; el plasma (sumageant) se recupera sin eliminar la torta de células que separa el plasma de los glóbulos rojos;
• une 2a centrifugación (3000-16000g) a temperatura ambiente (20°C /- 5°C); el plasma se aspira sin retirar el sedimento formado.
Independientemente de los tubos mencionados, el plasma puede almacenarse a -20°C durante un máximo de 1 mes o a -80°C durante periodos superiores a 1 mes.
A continuación se detallan las principales etapas del proceso según las realizaciones útiles para comprender la invención descrita.
Extracción de ADN circulante
En particular, la etapa de extracción (i) según la invención comprenderá las etapas siguientes:
(11) Proteólisis de dicha muestra de fluido biológico procedente de un sujeto de interés tras la adición a dicha muestra de al menos una cantidad efectiva de un primer fragmento de ADN exógeno de 50-200 pares de bases, preferiblemente de 60-160 pares de bases, más preferiblemente de 70-150 pares de bases y más preferiblemente de 80-140 pares de bases (ICE) y opcionalmente una cantidad efectiva de un segundo fragmento de ADN exógeno de 50-150 pares de bases (LED),
(12) Aislamiento del ADN libre de todas las células, en particular por afinidad sobre un soporte de membrana, preferentemente un soporte de membrana de sílice en una columna de extracción,
(13) Elución del ADN libre de todas las células aislado en la etapa (i2) en una fase acuosa,
(14) Precipitación eventual del ADN libre de todas las células,
(15) Ventajosamente concentración de ADN libre de todas las células,
(16) Posiblemente conservación y/o almacenamiento de dicho ADN libre de todas las células.
Según una realización particular, la etapa de extracción (i) no comprende una etapa de precipitación (i4).
Según una realización particular de la invención, el procedimiento de la invención comprende la co-amplificación de un ADN libre de todas las células, un fragmento de ICE exógeno y una secuencia de<a>D<n>genómico seleccionada de una secuencia de ADN mutada o una secuencia de ADN 'donante'.
Por 'secuencia de ADN mutada' se entiende según la invención una secuencia que presenta una mutación. Por ejemplo, en el caso del cáncer, el objetivo es detectar/cuantificar mutaciones activadoras o resistentes a una terapia dirigida. En el caso del cáncer de próstata, el objetivo será detectar/cuantificar las mutaciones en el gen que codifica el receptor androgénico que son resistentes al tratamiento con Abiraterona u otras terapias dirigidas. En el caso del cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), el objetivo es detectar/cuantificar mutaciones en el gen que codifica el EGFR que sean activadoras o resistentes al osimertinib u otras terapias dirigidas.
Por ''secuencia de ADN donante'' o ''secuencia de ADN del donante'' se entiende según la invención una secuencia de ADN del donante (caso de trasplante) en contraposición al ADN del receptor, dirigiéndose a SNP u otras secuencias HLA.
Cada una de las etapas del procedimiento de extracción se especifica en la siguiente descripción.
(i1) Proteólisis de dicha muestra biológica
El estándar o estándares (fragmentos de ADN exógeno antes mencionados), que caracterizan el procedimiento de extracción, amplificación y cuantificación de ADN circulante de la invención, se añaden a la muestra de fluido biológico de un sujeto de interés antes de la etapa de proteólisis.
Según una realización útil para comprender la invención, se añaden al menos el primer fragmento de ADN exógeno de 50-2000 pares de bases, preferentemente 50-200 pares de bases según la invención, preferentemente 60-160 pares de bases, aún más preferentemente 70-150 pares de bases y más preferentemente 80-140 pares de bases (ICE) y opcionalmente el segundo fragmento de ADN exógeno de 50-150 pares de bases (LED). Un procedimiento concreto consiste en utilizar una mezcla de ellos. Según otra realización particular y preferente, sólo se utiliza el primer fragmento ICE, siempre que sea de tamaño pequeño, es decir, de 50 a 200 pares de bases según la invención, preferiblemente de 60 a 160 pares de bases, más preferiblemente de 70 a 150 pares de bases, y más preferiblemente de 80 a 140 pares de bases. En estos tamaños pequeños, el fragmento ICE también puede desempeñar el papel del fragmento l Ed .
El primer fragmento de ADN exógeno de 50-2000 pares de bases, preferiblemente de 50-200 pares de bases según la invención, preferiblemente de 60-160 pares de bases, más preferiblemente de 70-150 pares de bases y más preferiblemente de 80-140 pares de bases sirve como control interno exógeno (ICE).
El experto en la materia definirá el tamaño del primer fragmento de ADN exógeno a utilizar en función del sujeto de interés cuyo ADN circulante se desea cuantificar y en función de la técnica analítica (cuantificación) disponible.
Según la invención, este primer fragmento de ADN exógeno tiene un tamaño que varía entre 50 y 200 pares de bases, preferentemente entre 60 y 160 pares de bases, más preferentemente entre 70 y 150 pares de bases, y más preferentemente entre 80 y 140 pares de bases.
Según otra realización no cubierta por el texto de las reivindicaciones, el primer fragmento de ADN exógeno (ICE) es un fragmento preferentemente de 200 a 1000 pares de bases, más preferentemente de 250 a 350 pares de bases.
Según una realización particular no cubierta por el texto de las reivindicaciones, el primer fragmento de ADN exógeno es un fragmento de ADN no humano de 300 pares de bases.
Según una realización particular y preferente de la invención, el primer fragmento de ADN exógeno es un fragmento de ADN no humano de 110 pares de bases.
Este estándar inter-ensayos (ICE) permite normalizar la cantidad de ADN circulante extraído y sus variaciones inter ensayos (y en particular a lo largo del tiempo para el mismo sujeto de interés) o comparativamente con respecto a la cantidad de<a>D<n>circulante extraído de un sujeto de referencia (sujeto sano, control) calculando la relación (Grewis) entre el número de copias de ADN circulante y el número de copias del primer fragmento de ADN exógeno de 50-2000 pares de bases, preferentemente de 50-200 pares de bases según la invención, preferentemente de 60-160 pares de bases, aún más preferentemente de 70-150 pares de bases y mejor aún de 80-140 pares de bases (ICE). Estos valores se obtienen tras la extracción, amplificación y cuantificación de dichos fragmentos de ADN exógeno, en paralelo con la amplificación y cuantificación del ADN circulante, tal y como se describe a continuación.
El valor de la relación se expresa en Unidades Arbitrarias (Grewis). Este enfoque elimina la necesidad de realizar cálculos basados en los volúmenes de eluido.
Según una realización útil para comprender la invención, el primer fragmento de ADN exógeno de 50-2000 pares de bases puede utilizarse solo o en combinación con el segundo fragmento de ADN exógeno de 50-150 pares de bases, distinto del primer fragmento.
El segundo fragmento de ADN exógeno de 50-150 pares de bases, distinto del primer fragmento, se utiliza para el control de fragmentos pequeños (LED).
Según una realización particular, el segundo fragmento de ADN exógeno es un fragmento de ADN exógeno de 80-120 pares de bases.
Según una realización particular, el segundo fragmento de ADN exógeno es un fragmento de ADN no humano de 110 pares de bases.
Este segundo fragmento de ADN exógeno (LED) permite comprobar la reproducibilidad de la extracción de ADN circulante en la zona de tamaño específico, es decir, normalizar el perfil de tamaño del ADN circulante extraído, y contrarrestar la influencia de la composición química/biológica del plasma en la eficacia de extracción de fragmentos de tamaño pequeño. Se calcula la relación entre el número de copias del primer fragmento de ADN exógeno de 50 2000 pares de bases (ICE) y el número de copias del segundo fragmento de ADN exógeno de 50-150 pares de bases (LED).
Según una realización particular y preferente de la invención, sólo se utilizará un primer fragmento ICE de 50 a 200 pares de bases, preferentemente de 60 a 160 pares de bases, más preferentemente de 70 a 150 pares de bases, y más preferentemente de 80 a 140 pares de bases, que también actuará como fragmento LED.
La etapa de proteólisis o hidrólisis de proteínas bajo la acción de enzimas se lleva a cabo generalmente en presencia de un tampón y enzimas.
Según una realización particular, se utilizará una enzima (proteinasa K) y un tampón de lisis (LYS). Los expertos en la materia determinarán las cantidades de enzima y tampón de lisis que deben utilizarse en función del volumen de muestra que se vaya a procesar. Según un procedimiento particular, la mezcla, una vez agitada en vórtex, se incuba a una temperatura de activación enzimática, en particular a una temperatura de 56°C /- 5°C durante 30 minutos a 1 hora con agitación.
Según una realización particular, el tampón de lisis contiene sales caotrópicas (clorhidrato de guanidinio); estas sales aportan CaO a las macromoléculas y permiten alejar las moléculas de agua de la sílice y los ADN una vez que las moléculas se han cargado. Esto puede crear un puente favorable a la unión de los ADN y los patrones a la sílice. Según una realización preferente, el procedimiento de detección y/o cuantificación de ADN libre de todas las células según una realización útil para comprender la invención, implementa también en la etapa de extracción (i) al menos una muestra de control que consiste preferentemente en un liofilizado de medio de cultivo de una línea celular mutada o no mutada, que se rehidratará para imitar la muestra de fluido biológico.
Por línea celular mutada se entiende en particular una línea celular cuyo genoma presenta modificaciones tales como SNV por Single Nucleotide Variant, deleciones, inserciones, CNV por Copy Number Variation,...).
Este control de calidad del rendimiento de extracción permite comprobar la reproducibilidad inter-ensayos de la extracción calculando los mismos 2 cocientes sobre esta muestra de control, es decir, respectivamente, la relación entre el número de copias de ADN circulante y el número de copias del primer fragmento de ADN exógeno de 50-2000 pares de bases y la relación entre el número de copias del primer fragmento de ADN exógeno de 50-2000 pares de bases (ICE) y el número de copias del segundo fragmento de ADN exógeno de 50-150 pares de bases (LED), que no deben variar de una serie de extracción a otra.
La muestra de control según la invención se somete a las mismas reacciones que la muestra de fluido biológico del sujeto de interés cuyo ADN circulante se va a extraer, en particular la adición de los estándares (fragmentos de ADN exógeno ICE y LED, extracción, amplificación, cuantificación y control).
(i2) Aislamiento del ADN circulante
El aislamiento del ADN circulante puede realizarse en particular según uno de los procedimientos siguientes:
a. Por afinidad del ADN circulante por un soporte (membrana de sílice, perlas magnéticas, etc.), preferentemente un soporte de membrana de sílice, o bien
b. Por procedimiento de extracción entre 2 fases líquidas inmiscibles (procedimientos Fenol/cloroformos, Trizol, Piotr Chomczynski y Nicoletta Sacchi).
c. Por gradiente de densidad (por ejemplo, cloruro de cesio).
Según una realización particular de la invención, el procedimiento de afinidad se utilizará sobre un soporte de membrana, preferentemente un soporte de membrana de sílice en una columna de extracción. Preferiblemente, las columnas MIDI se utilizan de acuerdo con las recomendaciones del proveedor, en presencia de tampones de activación y fijación.
Según una realización particular, la etapa de aislar y fijar el ADN circulante sobre el soporte de membrana de sílice consiste en:
• aplicar tampón de activación de membrana de sílice a cada columna MIDI, incubar y, a continuación, aplicar vacío (-0,4 bar);
• añadir un tampón de fijación por ml de plasma a cada muestra lisada;
• mezclar el contenido del tubo mediante un mínimo de 5 operaciones de aspiración/recarga;
• colocar los embudos en cada columna;
• aplicar la mezcla de muestra lisada a las columnas MIDI;
• aplicar un vacío de -0,4 bares durante 5 minutos, asegurándose de que todo el lisado ha pasado a través de la columna.
Los tampones de activación y fijación son los tampones utilizados en los protocolos de extracción usuales.
Según una realización particular, se utilizará un tampón de fijación de clorhidrato de guanidinio y etanol.
Según una realización preferente del procedimiento de detección y/o cuantificación de ADN libre de todas las células según la invención, la columna de extracción en la etapa (i2) para aislar ADN libre de todas las células está superpuesta por un accesorio de carga, preferiblemente un embudo que permite cargar toda la mezcla de muestra/solución de extracción, es decir, un volumen que varía preferiblemente entre 1 ml y 14 ml.
Esta configuración permite manipular toda (manual) o la mitad (automatizada) de la mezcla de solución tampón de plasma-proteólisis-fijación en una sola operación de pipeteo.
La etapa de aislamiento y fijación del ADN circulante va seguida de una etapa de lavado de la membrana de acuerdo con las recomendaciones estándar del proveedor (varios ciclos de lavado, aplicación de vacío a -0,4 bares durante 5 minutos).
(13) Elución del ADN circulante
Según una realización particular, antes de proceder a la elución del ADN circulante, se aplica un vacío, por ejemplo de al menos -0,6 bar durante 10 minutos, para secar completamente la membrana de cualquier rastro de etanol.
A continuación, se añade tampón de elución según las recomendaciones del proveedor.
Según una realización preferente del procedimiento de detección y/o cuantificación de ADN libre de todas las células según la invención, la etapa (i3) de eluir ADN libre de todas las células aislado en la etapa (i2) se lleva a cabo en presencia de un tampón de elución suplementado con albúmina, gelatina o sustitutos.
Esto aumenta ventajosamente el rendimiento de extracción y estabiliza la reproducibilidad del volumen eluido.
Según una primera realización, la etapa de elución se lleva a cabo en presencia de un tampón de elución suplementado con albúmina, tal como BSA (albúmina de suero bovino), preferentemente a 0,5 mg/ml de eluido.
Según otra realización preferente, la etapa de elución se lleva a cabo en presencia de un tampón de elución suplementado con gelatina, como el comercializado por SIGMA con el nombre comercial Prionex®, utilizado preferentemente al 1%.
(14) Posible precipitación y (i5) concentración de ADN circulante
Según una realización particular, el proceso de extracción no comprende una etapa de precipitación (i4).
Según una realización preferente del procedimiento de detección y/o cuantificación de ADN libre de todas las células según la invención, la etapa (i5) de concentrar ADN puro libre de todas las células se lleva a cabo en una placa de concentración por ultrafiltración.
Esta etapa de concentración puede realizarse por exclusión de la fase acuosa, y ventajosamente sin adición de sales caotrópicas para la fijación y el lavado alcohólico del ADN circulante.
El volumen a concentrar puede variar entre 20-300pl, el volumen a recuperar puede variar entre 25-300pl.
(i6) Conservación y/o almacenamiento del ADN circulante
Los ADN circulante obtenidos deben almacenarse a 5°C ± 3°C si a continuación se realiza la dPCR (PCR digital) o la ddPCR (PCR digital de gotitas) o la Q-PCR (PCR cuantitativa); de lo contrario, los ADN circulante deben almacenarse a -80°C para un almacenamiento más prolongado.
Según una realización particular preferente de la invención, la etapa de extracción de ADN libre de todas las células se lleva a cabo según las etapas siguientes:
(11) Proteólisis del plasma, y paralelamente de la muestra de control (CQI), a la que se han añadido el patrón o patrones (fragmentos de<a>DN exógeno ICE y LED), con proteinasa K y tampones de lisis que contienen sales caotrópicas de clorhidrato de guanidinio;
(12) aislamiento del ADN libre de todas las células en una membrana de sílice, en presencia de un tampón de fijación de clorhidrato de guanidinio y etanol, añadido en gran volumen para unir el ADN a la sílice, influyendo el % de etanol en el tamaño de los fragmentos retenidos. El volumen se añade a la columna de sílice provista de un embudo extraíble en 1 etapa manual y 2 etapas automáticas. Se requieren 3 etapas de lavado para eliminar los inhibidores y las sales. A continuación, se elimina el etanol de la membrana de sílice secándola durante 10 minutos;
(13) elución del ADN libre mediante una primera etapa en la que el ADN libre se desorbe utilizando un tampón débilmente tamponado sin EDTA a pH 8,5. Ventajosamente, la etapa de extracción según la invención no implica la adición de ARN de arrastre, que podría interferir con ciertas aplicaciones posteriores como la amplificación mediante el procedimiento NGS. La elución se realiza preferentemente en tampón suplementado con albúmina o gelatina, lo que optimiza el volumen y el rendimiento del ADN extraído.
(14) y (i5) el eluido puede concentrarse por ultrafiltración si es necesario para aplicaciones posteriores.
También se han desarrollado procesos con una etapa de extracción para los tubos de recogida de sangre Cell-Free DNA BCT® de Streck. Los reactivos estabilizadores de los tubos BCT requieren una proteólisis prolongada para aislar eficazmente el ADN circulante.
Amplificación y cuantificación del ADN circulante
Esta etapa de amplificación y cuantificación del ADN libre de todas las células y del fragmento o fragmentos de ADN exógeno (ICE y opcionalmente patrones LED) extraídos en la etapa anterior, puede llevarse a cabo por procedimientos bien conocidos por el experto.
Según una realización particular, el procedimiento de la invención permite la co-amplificación, en particular en el mismo pocillo, de un fragmento de ICE exógeno y de una secuencia genómica que presenta una mutación o de una secuencia de ADN donante (trasplante), lo que permite el seguimiento de los cambios en la concentración de ADN mutado o de ADN donante entre dos extracciones a lo largo del tiempo.
Según realizaciones preferentes de la invención, puede llevarse a cabo mediante un procedimiento de PCR digital, Q-PCR (PCR cuantitativa en tiempo real) y/o Nuevas Generaciones de Secuenciadores de ADN (NGS), según las recomendaciones de los proveedores.
Preferentemente se utilizará la PCR digital (dPCR) por su capacidad para multiplexar amplificaciones, su sensibilidad, su cuantificación absoluta, su alta resolución para variaciones de cantidad obtenidas mediante la ley de Poisson.
La Q-PCR se utilizará como sustituto en los casos en que la dPCR no esté disponible.
Finalmente utilizaremos en su lugar NGS utilizando su capacidad de profundidad de lectura para cuantificar ADN exógeno (ICE y LED) y ADN genómico.
De acuerdo con una realización particular, los ADN se cuantificarán absolutamente usando un sistema de dPCR que comprende:
• Un sistema para amplificar ADN circulante extraído que comprende cebadores en sentido y antisentido para amplificar una región del genoma humano y sondas específicas, ventajosamente marcadas con fluoróforos, para detectar el ADN circulante amplificado;
• Un sistema para amplificar el primer fragmento de ADN exógeno extraído (ICE) que comprende cebadores en sentido y antisentido para amplificar dicho primer fragmento y sondas específicas, ventajosamente marcadas con fluoróforos, para detectar dicho primer fragmento de ADN exógeno amplificado (ICE);
• Opcionalmente, un sistema de amplificación del segundo fragmento de ADN exógeno (LED) extraído que comprende cebadores sentido y antisentido para amplificar dicho segundo fragmento y sondas específicas, ventajosamente marcadas con fluoróforos, para detectar dicho segundo fragmento de ADN exógeno (LED) amplificado.
Los valores absolutos cuantificados para cada ADN (ADN circulante, fragmentos de ADN exógeno ICE y opcionalmente LED), respectivamente extraídos de una muestra de fluido biológico de un sujeto de interés, de un sujeto de referencia (sujeto sano, control) o de una muestra de control, permitirán calcular los cocientes según la etapa de normalización de la cantidad de ADN libre extraído de todas las células y opcionalmente de su perfil de tamaño descrito a continuación.
Normalización de la cantidad de ADN libre extraído de todas las células
Según una realización útil para comprender la invención, la etapa de normalización de la cantidad de ADN libre extraído de todas las células y opcionalmente su perfil de tamaño, característico del procedimiento de detección y cuantificación de ADN circulante comprende, para los ADN extraídos de la muestra de fluido biológico y ventajosamente en paralelo, para los ADN extraídos de la muestra de control:
• calcular una primera relación (Grewis) entre el número de copias de ADN libre de todas las células y el número de copias del primer fragmento de ADN exógeno de 50-2000 pares de bases, preferiblemente de 50-200 pares de bases según la invención, preferiblemente de 60-160 pares de bases, aún más preferiblemente de 70-150 pares de bases y mejor aún de 80-140 pares de bases (ICE), y
• opcionalmente, calcular una segunda relación entre el número de copias del primer fragmento de ADN exógeno de 50-2000 pares de bases (ICE) y el número de copias del segundo fragmento de ADN exógeno de 50-150 pares de bases (LED),
De este modo, después de cada extracción, amplificación y cuantificación de ADN, para la muestra de fluido biológico (por ejemplo, plasma) y para la muestra de control, se calcula el Grewis (primera relación) y, si es necesario, se comprueba la eficacia de extracción de fragmentos pequeños en torno a 80-120bases (segunda relación).
El valor del primer cociente (Grewis) sirve como referencia que puede compararse entre cada extracción y así definir las variaciones en la cantidad de ADN circulante en un sujeto dado a lo largo del tiempo o en un sujeto de interés comparado con una referencia (sujeto sano, control).
Si el valor de la primera proporción (Grewis) aumenta entre dos extracciones, esto significa que la cantidad de ADN circulante en el sujeto ha aumentado entre la primera y la segunda extracción.
Si el valor de la primera proporción (Grewis) disminuye entre dos extracciones, esto significa que la cantidad de ADN circulante en el sujeto ha disminuido entre la primera y la segunda extracción. Si el valor del primer cociente (Grewis) para un sujeto de interés es mayor que el mismo cociente para una referencia (sujeto sano, control), significa que la cantidad de ADN circulante en el sujeto de interés es mayor, lo que indica apoptosis, necrosis y/o secreción activa.
Por otra parte, el valor de la segunda relación no debe variar de una extracción a otra.
Los valores numéricos no son importantes; por ejemplo, elegiríamos un valor para la segunda relación igual a 1, es decir, proporciones idénticas del primer fragmento de ADN exógeno (ICE) y del segundo fragmento de ADN exógeno (LED).
Si esta segunda proporción aumenta, significa que los ADN de pequeño tamaño no se han extraído correctamente, y que los resultados obtenidos sobre la cuantificación del ADN circulante están sesgados.
Usos
Otra realización útil para comprender la invención se refiere al uso de un procedimiento de detección y/o cuantificación de ADN libre de todas las células a partir de una muestra de fluido biológico de un sujeto de interés según la invención, en un procedimiento para analizar una muestra biológica de un sujeto de interés susceptible de liberar ADN libre de todas las células, en particular un sujeto que padece o es susceptible de padecer un cáncer o una afección clínica elegida en particular por un accidente cerebrovascular o un infarto de miocardio, una insuficiencia renal aguda, una citolisis hepática, un traumatismo, una intervención quirúrgica, un rechazo de injerto, o un sujeto sometido a un ejercicio muscular intenso, o un sujeto sometido a un tratamiento médico como una biopsia, una intervención quirúrgica, una radioterapia, una quimioterapia, una inmunoterapia, o un principio activo (químico o biológico).
Este procedimiento de detección y/o cuantificación de ADN libre de todas las células puede utilizarse en particular en procedimientos para el análisisin vitrode muestras de fluido biológico (por ejemplo, plasma sanguíneo) de un sujeto de interés para aplicaciones en diagnóstico, pronóstico, teranóstica, o seguimiento de la evolución de un estado fisiológico específico de un individuo.
Según una realización preferente particular, este procedimiento de detección y/o cuantificación del ADN libre de todas las células se utilizará para el seguimiento de la evolución de un estado fisiológico específico de un individuo bajo tratamiento, por ejemplo tratamiento quirúrgico, o tratamiento medicinal (por ejemplo fármacos), o tratamiento mediante radioterapia o cualquier otro proceso que cause la muerte celular induciendo la variación en la cantidad de ADN libre de todas las células.
A modo de ejemplo, será posible medir, para un sujeto de interés susceptible de liberar ADN circulante, por ejemplo un sujeto que padezca o pueda desarrollar cáncer, y a partir de una muestra de fluido biológico (plasma), en un momento t0 de su vida, el valor de la primera relación (Grewis).
Este valor en t0 puede tener un valor biológico de diagnóstico de una patología, pronóstico de un evento médico (metástasis, recurrencia de la enfermedad, muerte,...), en particular en comparación con un sujeto de referencia (control, sujeto sano) y/o respuesta a un tratamiento médico (cirugía, fármacos, radioterapia,...).
De esta manera, midiendo esta relación (Grewis) en diferentes momentos t1, t2, t3... durante la vida de dicho sujeto de interés, será posible monitorizar variaciones en esta relación, indicando un aumento o disminución en la cantidad de ADN circulante en dicho sujeto. Se trata de variaciones longitudinales (a lo largo del tiempo) de la cantidad de ADN circulante en el sujeto de interés.
Por lo tanto, otra realización útil para comprender la invención también se refiere a un procedimientoin vitrode diagnóstico, pronóstico, teranóstico o seguimiento de la evolución de un estado fisiológico específico de un sujeto de interés susceptible de liberar ADN circulante, en particular un sujeto que padece o es susceptible de desarrollar cáncer o una afección clínica seleccionada en particular entre ictus o infarto de miocardio, insuficiencia renal aguda, citólisis hepática, traumatismo, cirugía, rechazo de injerto, o un sujeto sometido a un ejercicio muscular intenso, o un sujeto sometido a un tratamiento médico como biopsia, cirugía, radioterapia, quimioterapia, inmunoterapia, o principio activo (químico o biológico) que comprenda las etapas siguientes:
(i) en un momento t0, detección y/o cuantificación de ADN libre de todas las células a partir de una muestra de fluido biológico de un sujeto de interés según el procedimiento de la invención descrito anteriormente;
(ii) en un momento t1, reproducción de la etapa (i), y
(iii) comparación de la relación (Grewis) entre el número de copias de ADN circulante y el número de copias del fragmento de ADN exógeno de 50-2000 pares de bases, preferiblemente 50-200 pares de bases según la invención, preferiblemente 60-160 pares de bases, aún más preferiblemente 70-150 pares de bases y más preferiblemente 80-140 pares de bases (ICE) obtenido en el momento t1 con respecto a la misma relación obtenida en el momento t0.
Pudiendo ser reproducidas las etapas (ii) y (iii) tantas veces como sea necesario (por ejemplo en t2, t3, t4...) para seguir la evolución de un estado fisiológico específico de un sujeto de interés, y consecuentemente el efecto de un tratamiento médico (cirugía, fármacos, radioterapia,...) sobre dicho sujeto.
Alternativamente, otra realización útil para la comprensión de la invención se refiere a un procedimientoin vitropara el diagnóstico, pronóstico, teranóstico de un sujeto de interés susceptible de liberar ADN circulante, en particular un sujeto que padece o es susceptible de desarrollar cáncer o una afección clínica seleccionada en particular de ictus o infarto de miocardio, insuficiencia renal aguda, citólisis hepática, traumatismo, cirugía, rechazo de injerto, o un sujeto sometido a un ejercicio muscular intenso, o un sujeto sometido a un tratamiento médico como biopsia, cirugía, radioterapia, quimioterapia, inmunoterapia, o principio activo (químico o biológico) que comprenda al menos las etapas siguientes:
(i) en un momento t, detección y/o cuantificación de ADN libre de todas las células a partir de una muestra de fluido biológico de un sujeto de interés según el procedimiento de detección y/o cuantificación de ADNcf según la invención; y
(ii) comparación de la relación (Grewis) entre el número de copias de ADN circulante y el número de copias de un fragmento de ADN exógeno de 50-2000 pares de bases, preferentemente de 50-200 pares de bases según la invención, preferentemente de 60-160 pares de bases, aún más preferentemente de 70-150 pares de bases y mejor aún de 80-140 pares de bases (ICE) obtenido en el momento t con respecto a la misma relación obtenida en un sujeto de referencia (sujeto sano, control).
La descripción ilustrará ahora algunas aplicaciones del procedimiento según la invención.
Aplicaciones en el campo de la oncología
En los últimos años se han producido importantes avances terapéuticos con el desarrollo de inhibidores de la MAP-quinasa (inhibidores de la tirosina quinasa: TKIs) e inhibidores de los puntos de control inmunitarios (anti-CTLA4 y anti-PD1; Inmunoterapias). Dado el coste y la toxicidad de estos fármacos, y la creciente complejidad de los regímenes de tratamiento, cada vez es más esencial tener acceso a biomarcadores que guíen las decisiones terapéuticas para optimizar el tratamiento y limitar la toxicidad. Hace menos de 10 años, varios equipos demostraron altos niveles de ADN circulante en pacientes con cáncer gástrico, de ovario o de próstata. Debido a la relativa facilidad de acceso y a la naturaleza de la muestra, durante algunos años se ha presumido que el uso de ADNcf se convertiría en una herramienta para ayudar al seguimiento de la progresión o la respuesta de los pacientes a los tratamientos contra el cáncer (Aung, K. L et al., Hugo J; 2010). En la actualidad, el ADNcf puede utilizarse en investigación clínica para analizar mutaciones somáticas en genes de interés terapéutico en determinadas enfermedades como: cáncer bronquial de células no pequeñas, cáncer de colon, cáncer de tiroides y melanoma. Sin embargo, a día de hoy, sólo Osimertinib (Astra Zeneca) está autorizado para el tratamiento de pacientes adultos con cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) localmente avanzado o metastásico con mutación EGFR T790M. La autorización de comercialización especifica que el estado de la mutación EGFR T790M se determina mediante un procedimiento analítico validado utilizando ADN tumoral circulante (ADNtc) obtenido a partir de una muestra de plasma. Se pueden utilizar numerosos procedimientos analíticos (dirigidos o no dirigidos) para buscar anomalías genéticas utilizando ADNcf. Esto permite detectar variaciones en los números (CNA), mutaciones puntuales, inserciones, deleciones, inserciones/deleciones y metilaciones en el genoma mediante procedimientos selectivos: QPCR, pirosecuenciación, curva de fusión de alta resolución (HRM), Mass-array, snap shot, dPCR... o técnicas no dirigidas: CGH-array, SNP-array, secuenciación de Sanger, NGS,.... Estos análisis pueden utilizarse para pronosticar, diagnosticar o predecir la respuesta al tratamiento curativo. Aparte de los problemas de sensibilidad, que no son inherentes únicamente al rendimiento analítico, sino también a la concentración de ADNcf y a la mutación, actualmente no es posible obtener un resultado de análisis tipificado "normal", ya que no existen procedimientos clínicos de rutina para garantizar la presencia de ADN tumoral. En este caso, el resultado se considera "no contributivo" y se requiere una nueva biopsia sólida o líquida. El ADNcf puede detectarse en controles sanos y en sujetos con afecciones no malignas, los traumatismos (Laktionov, P P et al., 2004.), los procedimientos terapéuticos (Davis, G. L. et al., Arthritis Rheum, 1973) y la práctica deportiva (Velders M. et al., Clinical Biochemistry, 2014) también pueden dar lugar a la liberación de ADN circulante. Como resultado, la identificación de marcadores genéticos específicos del cáncer es una garantía de que se seguirá exclusivamente el ADN tumoral (Luke, J. J. et al., J Natl Cancer Inst, 2014). El enfoque utilizado por algunos laboratorios para garantizar el análisis del ADNcf tumoral consiste en buscar anomalías genómicas somáticas individuales como marcadores de patología tumoral. Si tomamos como ejemplo el melanoma, la variante BRAF V600E puede permitir así monitorizar los tratamientos con inhibidores específicos de BRAF (Sanmamed, M. F. et al., Clin Chem, 2015). En este caso, la elección de la diana es evidente, pero no permite un enfoque global de la enfermedad, ya que sólo alrededor del 50% de los pacientes presentan la mutación V600 y la variante controlada es la diana del tratamiento y, por tanto, está sometida a la presión del fármaco. También pueden analizarse otras mutaciones más raras. Sin embargo, este enfoque es complejo, costoso y difícil de utilizar en diagnósticos rutinarios, ya que debe adaptarse al perfil molecular de cada paciente, lo que implica realizar análisis NGS de tipo exoma. En consecuencia, no se puede utilizar ninguna técnica preanalítica o postanalítica para garantizar la presencia de material contribuyente, por lo que para cada nueva biopsia líquida se realiza un análisis sin ningún criterio selectivo.
El procedimiento de la invención encuentra así tres aplicaciones en el campo de la oncología:
1- seguimiento de la respuesta al tratamiento midiendo las fluctuaciones del ADNcf total a lo largo del tiempo:
Análisis de las fluctuaciones del ADNcf para monitorizar la respuesta al tratamiento (cirugía, radioterapia, quimioterapias y otros principios activos, incluidas las terapias dirigidas, incluidas las inmunoterapias) mediante la cuantificación del ADN circulante liberado por la muerte/lisis celular del tumor, sus metástasis o en su periferia. IDXtract (ID-Solutions, Francia), la técnica de extracción utilizada en esta invención, supera las limitaciones anteriores añadiendo ADN exógeno calibrado al plasma que se va a extraer: ICE (secuencia no humana). El fragmento ICE se somete a las etapas de extracción para garantizar que ésta sea eficaz. El kit IDQuant QPCR/dPCR (ID-Solutions, Francia) co-amplifica ADN exógeno de ICE con una o más secuencias del genoma humano. Es posible determinar la cantidad de ADNcf e ICE en la misma muestra problema y calcular el valor de la relación ADNcf/ICE y expresarlo por ml de plasma (ADNcf/ICE/ml de plasma = Grewis). La variación de Grewis a lo largo del tiempo para el mismo sujeto de interés garantiza que las fluctuaciones del ADNcf de origen fisiológico/patológico puedan seguirse longitudinalmente sin artefactos.
2- seguimiento de una mutación:
La detección/cuantificación de anomalías genómicas concomitante con la medición de Grewis y/o de la secuencia ICE exógena sola, permite seguir la evolución de la concentración de ADN mutado entre las diferentes biopsias líquidas realizadas longitudinalmente. Los resultados se normalizan con el fragmento ICE (añadido al plasma antes de la extracción del ADNcf) calibrado por dPCR, expresado por ml de plasma y/o Grewis. Las variaciones en el mutante permiten, por ejemplo, controlar el aumento en el tiempo de la secuencia de ADNcf mutado vinculado directa o indirectamente a la aparición de clones de células tumorales resistentes al tratamiento dirigido o no dirigido en curso. Por ejemplo, es posible definir un valor umbral de decisión para cambiar la línea terapéutica.
3- el papel de "centro" analítico previo al análisis genómico:
El análisis de anomalías genómicas somáticas a partir de tejidos se realiza sólo después de asegurarse de la presencia de células tumorales en la muestra. Como se ha explicado anteriormente, en el caso de las biopsias líquidas, en particular del plasma, no existe ningún procedimiento para garantizar la presencia de ADN tumoral circulante en la muestra de ADN libre total (ADNcf). No existe ningún procedimiento para garantizar que los resultados serán contributivos antes de proceder al análisis genómico. El uso de variaciones de Grewis según la invención permite actuar como un "centro" analítico:
• Variación reducida o nula del Grewis: no requiere análisis genómico;
• Aumento del Grewis: se recomienda un análisis genómico.
Aplicaciones en el campo de los trasplantes
Aunque el éxito a corto plazo tras el trasplante de órganos sólidos es convincente, la incidencia de rechazo agudo varía entre los distintos tipos de trasplante. El rechazo agudo se observa en los trasplantes de intestino, corazón y pulmón (en torno al 55%, 30-45% y 35-40% respectivamente). En los trasplantes de hígado, riñón-páncreas simultáneos y riñón agudo, el rechazo es menos frecuente, con incidencias, 2 años después del trasplante, del 4-6%, 13-30%, 20% y 12-14%, respectivamente.
Así pues, incluso para el trasplante a largo plazo, la supervivencia del receptor sigue siendo insatisfactoria. A pesar de la prescripción de fármacos inmunosupresores (ISDS), puede producirse una inmunosupresión excesiva o insuficiente. En el caso de los trasplantes de páncreas, riñón e hígado, se recomienda la medición de marcadores sanguíneos como la lipasa/amilasa, la creatinina sérica y las enzimas hepáticas, respectivamente, para el seguimiento rutinario postrasplante. Sin embargo, en el trasplante renal, el deterioro de la función del injerto no puede detectarse hasta que se ha producido un daño significativo. Tras un trasplante cardíaco, no se recomienda la seguimiento de las enzimas cardíacas debido a la baja sensibilidad de estos marcadores en el diagnóstico del rechazo agudo.
La detección no invasiva del rechazo parece aún más interesante en el caso del rechazo subclínico, que actualmente sólo es detectable a partir de biopsias. Actualmente, AlloMap® es la única prueba de vigilancia de trasplantes de órganos no invasiva disponible en el mercado. Se trata de una prueba RT-QPCR para el perfil de expresión de 11 genes utilizando células mononucleares de sangre periférica (PBMC), validada en pacientes con trasplante de corazón. Se utiliza en el seguimiento de trasplantes cardíacos para detectar el rechazo agudo en pacientes entre 6 meses y 5 años después del trasplante. En el riñón se está validando el mismo tipo de enfoque.
Desde el descubrimiento de ADN acelular (ADNcf) derivado del donante (ADNddcf) en sangre y orina del receptor, el interés clínico del ADNdcf en el trasplante se ha desarrollado rápidamente.
En la actualidad, el trasplante de pulmón es una terapia establecida para pacientes con enfermedad pulmonar avanzada. Aunque la supervivencia tras un trasplante de pulmón ha mejorado estadísticamente en la última década, sigue habiendo complicaciones como:
• Complicaciones relacionadas con la isquemia-reperfusión durante el procedimiento de trasplante, definidas como disfunción primaria del injerto (DPI). Esta complicación es la principal causa de muerte en el primer mes tras el trasplante de pulmón (TP);
• Rechazo agudo, que se produce en el 33% de los receptores durante el primer año tras el trasplante. Los receptores jóvenes tienen una mayor tasa de rechazo agudo, en torno al 36%;
• Complicaciones infecciosas vinculadas tanto a la inmunosupresión como a la interfaz directa pulmón-entorno externo;
• Rechazo crónico, que afecta al 49% y al 76% de los receptores al cabo de 5 y 10 años respectivamente.
Las fases tempranas del rechazo se diagnostican mediante biopsia pulmonar transbronquial tras broncoscopia, que es altamente sensible y específica. Sin embargo, esta técnica es cara, invasiva y tiene un valor predictivo limitado. Por lo tanto, la detección no invasiva del rechazo reviste interés, sobre todo en el caso del rechazo subclínico, que actualmente sólo puede detectarse mediante biopsia.
La identificación de marcadores no invasivos predictivos de complicaciones en receptores de trasplante pulmonar se ha convertido actualmente en un verdadero reto.
En comparación con las firmas moleculares de expresión génica órgano-específicas predictivas del rechazo, la cuantificación del ADNcf del donante puede ser un marcador universal de cualquier tipo de trasplante de órgano sólido. Un aumento persistente o un nivel elevado de ADN circulante puede ser un signo de rechazo agudo confirmado por biopsia en pacientes con trasplante de riñón, páncreas o corazón. En el caso del trasplante de hígado, los niveles de ADNcf aumentan en caso de rechazo, pero también en caso de estrés, inflamación y con el número de transfusiones.
En 2015, De Vlaminck et al. realizaron un estudio prospectivo de 51 pacientes con trasplante de pulmón (398 muestras). El nivel de ADN circulante del donante se estima en el receptor mediante la técnica de amplificación en tiempo real para polimorfismos SNP. La cuantificación del ADNcf del donante fue significativamente mayor en el grupo de rechazo celular agudo "moderado" o "grave" en comparación con el grupo "estable". En 2017, Zou et al. confirmaron estos datos en 18 receptores de trasplante pulmonar mediante la detección de ADNcf del donante utilizando la amplificación digital por PCR de polimorfismos HLA. A pesar de todos estos resultados prometedores, el análisis rutinario todavía no es eficaz porque se descuida la variabilidad artefactual inducida por los procesos preanalíticos, en particular las etapas de extracción del ADNcf, en los que los coeficientes de variación se aproximan al 20%.
Aparte del pulmón, todos los trasplantes pueden ser controlados para detectar rechazos: corazón, riñón, médula ósea,...
El procedimiento de la invención permite ventajosamente dos aplicaciones en este campo del trasplante:
1- seguimiento de la aparición del rechazo del injerto:
Análisis de fluctuación de ADN para detectar y controlar el inicio del rechazo del injerto mediante la cuantificación del ADN circulante liberado por la muerte/lisis celular del órgano o células trasplantadas (donante). La técnica de extracción IDXtract (ID-Solutions, Francia) supera estas limitaciones añadiendo ADN exógeno calibrado al plasma que se va a extraer: ICE (secuencia no humana). El fragmento ICE se somete a las etapas de extracción para garantizar que ésta sea eficaz. El kit IDQuant QPCR/dPCR (ID-Solutions, Francia) co-amplifica ADN exógeno de ICE con una o más secuencias del genoma humano. Es posible determinar la cantidad de ADNcf e ICE en la misma muestra problema y calcular el valor de la relación ADNcf/ICE y expresarlo por ml de plasma (ADNcf/ICE/ml de plasma = Grewis). La variación de Grewis a lo largo del tiempo para el mismo sujeto de interés garantiza que las fluctuaciones del ADNcf de origen fisiológico/patológico puedan seguirse longitudinalmente sin artefactos. Así pues, la variación del ADNcf total detectada mediante PCR cuantitativa en tiempo real o PCR digital puede reflejar un proceso de rechazo;
2- seguimiento de la evolución en la concentración de ADN "donante":
La detección/cuantificación de una firma de ADN donante a partir de ADNcf mediante ddPCR concomitante con la medición de Grewis y/o la secuencia exógena de ICE permite el seguimiento de los cambios en la concentración de ADN "donante" entre diferentes biopsias líquidas realizadas longitudinalmente. Los resultados se normalizan con el fragmento ICE (añadido al plasma antes de la extracción del ADNcf) calibrado por dPCR, expresado por ml de plasma y/o Grewis. Las variaciones en las secuencias de ADN del donante o el quimerismo, por ejemplo, permiten controlar el aumento de estas secuencias a lo largo del tiempo, lo que puede relacionarse directa o indirectamente con el rechazo agudo o subclínico. Por ejemplo, puede:
• Detectar el aumento del ADN circulante del donante que puede señalar un evento de rechazo agudo, sea cual sea el tipo de trasplante de órganos.
• Definir un umbral de decisión para cambiar la práctica terapéutica
• Ver su interés como biomarcadores de la integridad del órgano (Kanzow P et al., Transplantation 2014) con un seguimiento longitudinal estandarizado.
Diagnóstico de una enfermedad patológica
En comparación con los valores medios de la cantidad de ADNcf obtenidos de sujetos de referencia (por ejemplo, sujetos sanos: n=24 sujetos, media=9,38ng/ml de plasma /-4,47 ng/, mediana=8,94 ng/ml, min=3,21 ng/ml, max= 23.38 ng/ml), los valores de Grewis "anormales", es decir, valores superiores o muy superiores a los de los sujetos de referencia, indican un estado patológico, y el paciente puede ser remitido a consultas más especializadas para afinar el diagnóstico.
Sin embargo, otra realización útil para comprender la invención se refiere al uso de al menos un primer fragmento de ADN exógeno de 50-2000 pares de bases, preferiblemente 50-200 pares de bases según la invención, preferiblemente 60-160 pares de bases, aún más preferiblemente 70-150 pares de bases y mejor aún 80-140 pares de bases (ICE), para su uso en la normalización de un procedimiento de extracción y cuantificación de ADN libre de todas las células y/o en un procedimiento de análisis de las fluctuaciones del ADN libre de todas las células de un sujeto de interés a lo largo del tiempo, midiendo la relación (Grewis) entre el número de copias de ADN libre de todas las células y el número de copias del primer fragmento de ADN exógeno de 50-2000 pares de bases, preferentemente 50-200 pares de bases según la invención, más preferentemente 60-160 pares de bases, aún más preferentemente 70-150 pares de bases y más preferentemente 80-140 pares de bases (ICE).
Kits y conjuntos para la extracción, amplificación- cuantificación de ADN circulante
Otra realización útil para comprender la invención es un kit o conjunto para extraer ADN libre de todas las células de una muestra de fluido biológico de un sujeto de interés, que comprende:
(i) Al menos un primer fragmento de ADN exógeno de 50-2000 pares de bases, preferiblemente 50-200 pares de bases según la invención, preferiblemente 60-160 pares de bases, aún más preferiblemente 70-150 pares de bases y más preferiblemente 80-140 pares de bases (ICE);
(ii) Tampones y enzimas, en particular un tampón de proteólisis, una enzima de proteólisis, un tampón de fijación, un tampón de lavado y un tampón de elución para el ADN libre de todas las células,
(iii) dispositivos para aislar el ADN libre de todas las células, en particular columnas de extracción con membrana de sílice y, ventajosamente, columnas de extracción rematadas por accesorios de carga, preferentemente embudos,
(iv) placas de múltiples pocillos, en particular placas DeepWell de 24 pocillos de 25 ml
(v) tubos con tapón de rosca, preferentemente de 1,5 ml, y
(vi) Instrucciones de uso,
dicho fragmento de ADN exógeno ICE se suministra en dicho kit o por separado a dicho kit, formando un kit de extracción.
Según una realización no comprendida en el texto de las reivindicaciones, el kit de extracción de ADN circulante comprende:
(i) Al menos un primer fragmento de ADN exógeno no humano de 300 pares de bases y, opcionalmente, un segundo fragmento de ADN exógeno no humano de 110 pares de bases, siendo ambos secuencias de ADN que codifican el precursor de una proteasa de serina pro-agregadora deCerastes cerastes.
(ii) Tampones y enzimas: un tampón de proteólisis ventajosamente suplementado con albúmina de suero bovino (BSA) y/o gelatina purificada de cerdo (Prionex®), una enzima de lisis, preferentemente proteinasa K, un tampón de fijación, un tampón de lavado y un tampón de elución,
(iii) Columnas de extracción con membrana de sílice, placas DeepWell de 24 pocillos de 25 mL, embudos, tubos con tapón de rosca de 1,5 mL y
(iv) Instrucciones de uso.
Según una realización particular no cubierta por el texto de las reivindicaciones, el kit de extracción de ADN circulante según la invención comprende:
(i) Al menos un primer fragmento de ADN exógeno no humano (ICE) de 110 pares de bases, que codifica el precursor de una proteasa de serina pro-agregadora deCerastes cerastes.
(ii) Tampones y enzimas: un tampón de proteólisis ventajosamente suplementado con albúmina de suero bovino (BSA) y/o gelatina purificada de cerdo (Prionex®), una enzima de lisis, preferentemente proteinasa K, un tampón de fijación, un tampón de lavado y un tampón de elución,
(iii) Columnas de extracción con membrana de sílice, placas DeepWell de 24 pocillos de 25 mL, embudos, tubos de mira de 1,5 mL y
(iv) Instrucciones de uso.
Según una realización particular no cubierta por el texto de las reivindicaciones, un kit puede caracterizarse por los parámetros definidos en la siguiente Tabla 1:
Tabla 1
Según una realización particular no contemplada en el texto de las reivindicaciones, será un kit para la extracción de ADN libre de todas las células a partir de plasma sanguíneo.
Este kit permite la purificación de ADN libre de todas las células a partir de un volumen de hasta 100ml de plasma, en particular 10ml de plasma, en particular 5ml de plasma.
El kit contiene columnas Midi, preferiblemente con accesorios para cargar dichas columnas, preferiblemente embudos que permiten cargar toda la mezcla muestra/solución de extracción a la vez y permite procesar de 1 a 24 muestras en paralelo.
La fijación, el lavado, el secado y la elución del ADN libre de todas las células se realizan con un dispositivo de cámara de vacío, y soportes de columna (Starter S y Midi ).
La extracción se realiza ventajosamente sin arrastre de ADN o ARN (formación de un complejo con el ADN para facilitar su aislamiento). De hecho, estos arrastrantes de ADN o ARN conducen a una sobreestimación de las concentraciones de ADN libre de todas las células cuando se utilizan técnicas de cuantificación de ADN total, doble o monocatenario.
Según una realización particular, el kit de extracción de ADN libre de todas las células según la invención se utiliza en asociación con un kit de amplificación y cuantificación de ADN libre de todas las células, suministrados juntos o por separado.
Según una primera realización, el kit de extracción de ADN libre de todas las células según la invención y el kit de amplificación y cuantificación de ADN libre de todas las células se envasan juntos.
Según una primera realización, el kit de extracción de ADN libre de todas las células según la invención y el kit de amplificación y cuantificación de ADN libre de todas las células se envasan por separado.
El kit de amplificación y cuantificación de ADN libre de todas las células incluirá típicamente al menos:
(i) cebadores sentido y antisentido específicos, respectivamente, para el ADN libre de todas las células del sujeto de interés y para el fragmento o fragmentos de ADN exógeno definidos en la invención, para la etapa de amplificación,
(ii) sondas marcadas respectivamente para el ADN libre de todas las células del sujeto de interés y para el fragmento o fragmentos de ADN exógeno según se define en la invención para la etapa de detección y cuantificación,
(iii) tampones de reacción,
(iv) placas de múltiples pocillos y
(v) instrucciones de uso.
Figuras
Figura 1: representación gráfica de la variabilidad del ADN circulante tras la extracción y de la normalización de la extracción y cuantificación utilizando un fragmento exógeno de ICE según el procedimiento de la invención; Figura 2: representación gráfica del análisis concomitante de las anomalías genómicas (mutaciones del EGFR) y de la secuencia exógena ICE y/o Grewis;
Figura 3: representación gráfica del análisis concomitante de las anomalías genómicas (mutaciones del EGFR) y Grewis.
La presente invención se detallará en los siguientes ejemplos ilustrativos y no limitativos.
Ejemplos
Las muestras de plasma se preparan de acuerdo con el siguiente protocolo:
• El plasma se prepara a partir de sangre total recogida en tubos BCT (Streck), tubos de recogida de ADN sin células (Roche) o tubos EDTA. Para los tubos EDTA, el plasma debe prepararse en las 4 horas siguientes a la extracción de la muestra de sangre;
• Los tubos se centrifugan a 1600 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente;
• Se recoge el sobrenadante (correspondiente al plasma) y se transfiere a un tubo cónico de 15 ml;
• El plasma recuperado se centrifuga a 4500 g durante 10 minutos a temperatura ambiente;
• El plasma se transfiere a un tubo cónico y se mide su volumen;
• El volumen de plasma se ajusta al mililitro siguiente si es necesario con tampón fosfato y luego se transfiere a un tubo de 50 ml o se coloca en un DeepWell de 25 ml.
Preferentemente, las muestras de plasma se preparan a partir de un sujeto de interés susceptible de liberar ADNcf, es decir, un sujeto que padece o puede padecer cáncer o una afección clínica seleccionada en particular entre accidente cerebrovascular o infarto de miocardio, insuficiencia renal aguda, citólisis hepática, traumatismo, cirugía, rechazo de injerto, o un sujeto sometido a ejercicio muscular intenso, o un sujeto sometido a tratamiento médico como biopsia, cirugía, radioterapia, quimioterapia, inmunoterapia, o principio activo (químico o biológico).
Ejemplo 1: Extracción normalizada de ADN circulante a partir de una muestra de plasma
1.1 Proteólisis de plasmas
La proteólisis de las muestras de plasma preparadas anteriormente se lleva a cabo de acuerdo con el siguiente protocolo:
• Además de las muestras de plasma, se utiliza una muestra de control IQC (liofilizado de medio de cultivo de línea celular pulmonar humana referenciado NCI-H1975, CRL-5908) también conocido como control de calidad de extracción según la invención para controlar la calidad de la extracción;
• A cada muestra de plasma y a cada muestra de control se añaden 30 pl de proteinasa K líquida por ml de muestra;
• Según un procedimiento no comprendido en el texto de las reivindicaciones, se añaden entonces a cada muestra por ml (plasma y muestra de control) 20.000 copias del primer fragmento de ADN exógeno de 300 pares de bases (ICE) representado por la SEQ ID N°1 descrita a continuación y 20.000 copias del segundo fragmento de ADN exógeno de 110 pares de bases (LED) representado por la SEQ ID N°2 descrita a continuación, siendo ambas secuencias de ADN que codifican el precursor de una serina proteasa proagregadora deCerastescerastes;
• Mezclar brevemente con un vórtex e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente;
• A continuación, se añaden a cada muestra 400 μl de tampón de lisis (LYS) por ml de plasma o de control;
• Vortex brevemente e incubar a 56°C durante 30 minutos con agitación o 1 hora para tubos Streck.
SEQ ID NO:1:
CCTAATGACACTTATCCCAAAGTCCCTCATTGTGCTAACATTAACATACTTGAGCATTCGC
TGTGTGAAAGAGCTTACAATGATCTTTCGGCGAGTAGCAGAACATTGTGTGCAGGTATC
GAAAAAGGAGGCATAGATACATGTAAGGGTGACTCTGGGGGACCCCTCATCTGTAATGG
ACAAATCCAGGGCATTGTATCTTGGG GAG AT GAAGTTT GTGGTAAACCTAATAAG CCTG
GCGTCTATACCAAGGTCTTTGATTATACTGACTGGATCCGGAACATTATTGCAGGAAATA
CA SEQ ID NO:2:
GCTGAACAAACCAGTTAACAACAGTACACACATCGCGCCTCTCAGCTTGCCTTCCAGTC
CTCCCAGTGTGGGCTCAGATTGCCGTATTATGGGATGGGGCACAATCACAT
1.2 Aislamiento del ADN circulante en las columnas:
El aislamiento y la unión del ADN circulante a columnas se realiza de acuerdo con el siguiente protocolo:
• Durante la incubación de la lisis, se aplica 1 ml de tampón de activación de la membrana de sílice (ACTIVB) a cada columna MIDI, se incuba durante 1 minuto y, a continuación, se evacua a -0,4 bares durante 1 minuto;
• Se añaden 2 ml de tampón de fijación (BB) por ml de plasma a cada muestra lisada;
• El contenido del tubo se mezcla mediante un mínimo de 5 operaciones de aspiración/recarga;
• Los embudos se colocan en cada columna;
• La mezcla de la muestra lisada se aplica a las columnas MIDI;
• Por último, se aplica un vacío de -0,4 bares durante 5 minutos, asegurándose de que todo el lisado ha pasado a través de la columna.
1.3 Lavado de la membrana:
La etapa de lavado de la membrana se realiza de acuerdo con el siguiente protocolo:
• Añadir 4 ml de tampón de lavado Wash 1 a cada columna e incubar durante 1 minuto;
• El vacío se aplica a -0,4 bares durante 5 minutos;
• Añadir 2 ml de tampón Wash 2 a cada columna e incubar durante 1 minuto;
• El vacío se aplica a -0,4 bares durante 2 minutos;
• Añadir 2 ml de tampón Wash 2 a cada columna e incubar durante 1 minuto;
• Por último, se aplica el vacío a -0,4 bares durante 2 minutos.
1.4 Elución del ADN circulante
Antes de proceder a la elución del ADN circulante, se aplica vacío, al menos -0,6 bar durante 10 minutos para secar completamente la membrana de cualquier resto de etanol.
La elución del ADN circulante se realiza entonces de acuerdo con el siguiente protocolo:
• A continuación, se añaden a cada columna 150 j l de tampón de elución suplementado extemporáneamente con 1% de Prionex (ELU) y previamente calentado a 70°C;
• Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente;
• El vacío se aplica a -0,5 bares durante 30 segundos;
• Por último, se aplica de nuevo el vacío a -0,5 bar durante 10 s.
1.5 Concentración opcional de muestras de ADN circulante para un único análisis
La concentración de ADN circulante se realiza de acuerdo con el siguiente protocolo:
• Todos los eluidos se cargan en la placa de ultrafiltración;
• El vacío se aplica a -0,5 bares durante 10 minutos (etapa completa del volumen);
• Se añaden 50 j l de tampón de elución a cada pocillo que contenga las muestras;
• Agitar durante 5 minutos a temperatura ambiente;
• Por último, las muestras se transfieren a un nuevo tubo etiquetado previamente.
1.6 Almacenamiento y/o conservación del ADN circulante extraído
El ADN circulante obtenido debe almacenarse a 5°C ± 3°C si a continuación se realiza ddPCR o Q-PCR, de lo contrario el ADN circulante debe almacenarse a -80°C para un almacenamiento más prolongado.
Según una realización alternativa según la invención, se añaden a cada muestra por ml (plasma y muestra de control) entre 10.000 y 20.000 copias de un primer fragmento de ADN exógeno de 110 pares de bases (ICE) representado por SEQ ID N° 2 que codifica el precursor de una proteasa de serina pro-agregadora deCerastes cerastesy que actúa como ICE y LED.
Ejemplo 2: Detección y cuantificación de ADN circulante con control interno (ICE) fragmento de 300 pares de bases (realización no cubierta por el texto de las reivindicaciones)
La detección del ADN circulante extraído en el Ejemplo 1 y su cuantificación se realiza mediante PCR digital en gotitas (ddPCR) de acuerdo con el siguiente protocolo, para un volumen de reacción de 20 pl/muestra:
• añadir 10 μL de ddPCR Supermix para sondas (sin dUTP) (BioRad)
• Se añaden 0,1 μL de un cebador sentido dirigido contra el primer fragmento de ADN exógeno para el control interno exógeno ICE (TGG-ACA-AGG-ACA-TCA-TGC-TGA-T correspondiente a SEQ ID N°3) a 100 pM; • Se añaden 0,1 μL de un cebador antisentido dirigido contra el primer fragmento de ADN exógeno para el control interno exógeno ICE (GAC-TGG-AAG-GCA-AGC-TGA-GA correspondiente a SEQ ID N°4) a 100 pM;
• Se añaden 0,06 μL de sonda marcada con HEX y BHQ1 dirigida contra el control interno exógeno ICE (AAC-CAG-TTA-ACA-ACA-GTA-CAC-ACA-TCG-CGC correspondiente a SEQ ID N°5) a 100 pM;
• Se añaden 0,1 μL de un cebador en sentido dirigido contra el gen RPP-30 humano (GAT-TTG-GAC-CTG-CGA-GCG correspondiente a SEQ ID N°6) a 100 pM;
• Se añaden 0,1 pl de un cebador antisentido 100 pM dirigido contra el gen RPP-30 humano (GAG-CGG-CTG-TCT-CCA-CAA-GT correspondiente a SEQ ID N°7);
• Se añaden 0,06 μL de sonda marcada con FAM y MGB dirigida contra el gen RPP-30 humano (CTG-ACC-TGA-AGG-CTC-T correspondiente a SEQ ID N°8) a 100 pM;
• Se añaden 1,48 pl de H2O de calidad para biología molecular;
• Se añaden 8 pl de ADN extraído (ADN circulante extraído y fragmento de ADN exógeno);
• la mezcla se homogeneiza y se carga en un pocillo de cartuchos DG8 (Biorad)
• Se añaden 70 μL de aceite para la generación de gotas a los cartuchos DG8 (Biorad)
• se coloca la junta DG8 (Biorad) y se generan gotas con el generador de gotas de Biorad;
• La muestra se transfiere a una placa de 96 pocillos, se sella y se realiza una PCR tiempo real según el programa que se indica a continuación:
Etapa 1: 95°C 10 min
Etapa 2: 94°C 30 s
Etapa 3: 60°C 1 min
Repetir las etapas 2 y 340 veces
Etapa 4: 98°C 10 minutos
Etapa 5: 12°C 1 s.
Al final de la PCR, la placa de 96 pocillos se transfiere al lector de gotas Biorad y se leen las gotas.
Se realiza la misma etapa de amplificación y cuantificación para los ADN extraídos de la muestra de plasma y para los ADN extraídos de la muestra de control.
Los resultados obtenidos para el gen RPP30 representan el número de copias de ADN circulante extraído. Los resultados obtenidos para el fragmento de ADN exógeno extraído (ICE) representan el número de copias de ICE extraídas.
El Grewis se calcula dividiendo el valor obtenido para RPP30 por el valor obtenido para ICE. Este valor sirve como valor de referencia que puede compararse entre cada extracción del mismo sujeto y determinar así la variación de la cantidad de ADN libre en el sujeto a lo largo del tiempo.
Se obtiene una proporción (Grewis) representativa de la cantidad de ADN circulante en la muestra del sujeto de interés.
Ejemplo 3: Detección y cuantificación de ADN circulante con control adicional del perfil de tamaño (LED) -fragmento ICE de 300 pares de bases y fragmento LED de 110 pares de bases (realización no cubierta por el texto de las reivindicaciones)
La detección del ADN circulante extraído en el Ejemplo 1 y su cuantificación se realiza mediante PCR digital en gotitas (ddPCR) de acuerdo con el siguiente protocolo, para un volumen de reacción de 20 pl/muestra:
• añadir 10 μL de ddPCR Supermix para sondas (sin dUTP) (BioRad)
• Se añaden 0,1 μL de un cebador sentido dirigido contra el primer fragmento de ADN exógeno para el control interno exógeno ICE (TGG-ACA-AGG-ACA-TCA-TGC-TGA-T correspondiente a SEQ ID N°3) a 100 pM; • Se añaden 0,1 μL de un cebador antisentido dirigido contra el primer fragmento de ADN exógeno para el control interno exógeno ICE (GAC-TGG-AAG-GCA-AGC-TGA-GA correspondiente a SEQ ID N°4) a 100 pM;
• Se añaden 0,06 μL de sonda marcada con HEX y BHQ1 dirigida contra el control interno exógeno ICE (AAC-CAG-TTA-ACA-ACA-GTA-CAC-ACA-TCG-CGC correspondiente a SEQ ID N°5) a 100 pM;
• Se añaden 0,1 μL de un cebador de sentido dirigido contra el segundo fragmento de ADN exógeno para el control de extracción de los fragmentos pequeños LED (ATG-ACA-CTT-ATC-CCA-AAG-TCC-CTC correspondiente a SEQ ID N°9) a 100 pM;
• Se añaden 0,1 μL de un cebador antisentido dirigido contra el segundo fragmento de ADN exógeno para el control de extracción de los fragmentos pequeños LED (CAA-TGT-TCT-GCT-ACT-CGC-CGA correspondiente a SEQ ID N°10) a 100 pM;
• Se añaden 0,06 μL de sonda marcada con FAM y MGB dirigida contra el control LED interno exógeno (CAT-ACT-TGA-GCA-TTC-GCT-GT correspondiente a SEQ ID N°11) a 100 pM;
• Se añaden 1,48 pl de H2O de calidad para biología molecular;
• Se añaden 8 pl de ADN extraído (ADN circulante extraído y segundo fragmento de ADN exógeno);
• la mezcla se homogeneiza y se carga en un pocillo de cartuchos DG8 (Biorad)
• Se añaden 70 μL de aceite para la generación de gotas a los cartuchos DG8 (Biorad)
• se coloca la junta DG8 (Biorad) y se generan gotas con el generador de gotas de Biorad;
• La muestra se transfiere a una placa de 96 pocillos, se sella y se realiza una PCR tiempo real según el programa que se indica a continuación:
Etapa 1: 95°C 10 min
Etapa 2: 94°C 30 s
Etapa 3: 60°C 1 min
Repetir las etapas 2 y 340 veces
Etapa 4: 98°C 10 minutos
Etapa 5: 12°C 1 s.
Al final de la PCR, la placa de 96 pocillos se transfiere al lector de gotas Biorad y se leen las gotas.
Se realizan las mismas etapas de extracción, amplificación y cuantificación para los ADN extraídos de la muestra de plasma y para los ADN extraídos de la muestra de control.
Los resultados obtenidos para el fragmento de ADN exógeno extraído (ICE) representan el número de copias de ICE extraído. Los resultados obtenidos para el segundo fragmento de ADN exógeno extraído (LED) representan el número de copias de LED extraídas.
El control de extracción de fragmentos pequeños se calcula dividiendo el valor obtenido para ICE por el valor obtenido para LED.
Obtenemos relaciones ICE/LED cercanas a 1, que deberían permanecer estables de una extracción a otra. Si esta proporción aumenta, significa que los ADN de pequeño tamaño no se han extraído correctamente y que los resultados obtenidos sobre la cuantificación del ADN circulante están sesgados.
La amplificación y cuantificación también pueden realizarse usando las 3 dianas (ADN circulante, ICE y LED) simultáneamente como se describe en los ejemplos 2 y 3 anteriores, respectivamente.
Ejemplo 4: Detección y cuantificación de ADN circulante con control interno (ICE) de 110 pares de bases que actúa también como LED (realización según la invención reivindicada).
El Ejemplo 2 anterior se reproduce utilizando, como fragmento ICE exógeno, el fragmento de 110 pares de bases correspondiente a la secuencia SEQ ID NO:2.
La detección del ADN circulante extraído en el Ejemplo 1 y su cuantificación se realiza mediante PCR digital en gotitas (ddPCR) de acuerdo con el siguiente protocolo, para un volumen de reacción de 20 pl/muestra:
• colocar 10 μL de ddPCR Supermix para sondas (sin dUTP) (BioRad)
• añadir 0,1 μL de un cebador sentido dirigido contra el fragmento de ADN exógeno para el control interno exógeno ICE (ATG-ACA-CTT-ATC-CCA-AAG-TCC-CTC correspondiente a SEQ ID N°9) a 100 pM; • añadir 0,1 μL de un cebador antisentido dirigido contra el fragmento de ADN exógeno para el control interno exógeno ICE (CAA-TGT-TCT-GCT-ACT-CGC-CGA correspondiente a SEQ ID N°10) a 100 pM;
• añadir 0,06 pl de sonda marcada con FAM y MGB dirigida contra el control interno exógeno ICE (CAT-ACT-TGA-GCA-TTC-GCT-GT correspondiente a SEQ ID N°11) a 100 pM;
• añadir 0,1 μL de un cebador en sentido dirigido contra el gen RPP-30 humano (GAT-TTG-GAC-CTG-CGA-GCG correspondiente a SEQ ID N°6) a 100 pM;
• añadir 0,1 pl de un cebador antisentido 100 pM dirigido contra el gen RPP-30 humano (GAG-CGG-CTG-TCT-CCA-CAA-GT correspondiente a SEQ ID N°7);
• añadir 0,06 μL de sonda marcada con FAM y MGB dirigida contra el gen RPP-30 humano (CTG-ACC-TGA-AGG-CTC-T correspondiente a SEQ ID N°8) a 100 pM;
• añadir 1,48 pl de H2O de calidad de Biología Molecular;
• añadir 8 pl de ADN extraído (ADN circulante extraído y fragmento de ADN exógeno);
• la mezcla se homogeneiza y se carga en un pocillo de cartuchos DG8 (Biorad)
• añadir 70 μL de aceite para la generación de gotas a los cartuchos DG8 (Biorad)
• colocar la junta de estanqueidad DG8 (Biorad) y generar gotas con el generador de gotas de Biorad;
• transferir la muestra a una placa de 96 pocillos, se sella y se realiza una PCR tiempo real según el programa que se indica a continuación:
Etapa 1: 95°C 10 min
Etapa 2: 94°C 30 s
Etapa 3: 60°C 1 min
Repetir las etapas 2 y 340 veces
Etapa 4: 98°C 10 minutos
Etapa 5: 12°C 1 s.
Al final de la PCR, la placa de 96 pocillos se transfiere al lector de gotas Biorad y se leen las gotas.
Se realiza la misma etapa de amplificación y cuantificación para los ADNs extraídos de la muestra de plasma y para los ADNs extraídos de la muestra de control.
Los resultados obtenidos para el gen RPP30 representan el número de copias de ADN circulante extraído. Los resultados obtenidos para el fragmento de ADN exógeno extraído (ICE) representan el número de copias de ICE extraídas.
El Grewis se calcula dividiendo el valor obtenido para RPP30 por el valor obtenido para ICE. Este valor sirve como valor de referencia que puede compararse entre cada extracción del mismo sujeto y determinar así la variación de la cantidad de ADN libre en el sujeto a lo largo del tiempo.
Obtenemos una proporción (Grewis) representativa de la cantidad de ADN circulante en la muestra del sujeto de interés.
En la Figura 1a se observa la variabilidad intraensayo de los ADNcf tras la extracción, en ausencia de un fragmento de ADN ICE exógeno. En presencia de un fragmento exógeno de ICE, calibrado por ddPCR y añadido al plasma antes de la extracción, la Figura 1b muestra que el valor de la relación ADN genómico/ICE (Grewis) es homogéneo. El fragmento ICE se utiliza para estandarizar la extracción y la cuantificación.
La variación de Grewis por sí sola a lo largo del tiempo para el mismo sujeto de interés garantiza que las fluctuaciones en el ADNcf de origen fisiológico/patológico puedan seguirse longitudinalmente sin artefactos.
Ejemplo 5: Procedimiento de seguimiento del estado fisiológico de un sujeto de interés con búsqueda concomitante de mutación EGFR en cánceres bronquiales de células no pequeñas
Se utiliza, en asociación con un kit de extracción y detección de ADNcf como se describe en los Ejemplos 1 y 4, un kit IDEGFR para la detección y cuantificación mediante PCR digital de mutaciones EGFR implicadas en la estratificación de pacientes para terapias dirigidas utilizando inhibidores de tirosina quinasa y resistencias asociadas.
Se trata de un sistema de cuantificación multiplex que permite, para cada muestra, la amplificación simultánea en 2 reacciones de mutaciones activadoras (L858R y Del19- 1st reacción) y mutaciones de resistencia (T790M y C797S-2th reacción). Las mutaciones activadoras del gen que codifica el EGFR se producen principalmente en el cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) y provocan la activación constitutiva de la actividad cinasa de la proteína EGFR, contribuyendo así al proceso oncogénico. Las mutaciones más comunes incluyen una variedad de deleciones en el exón 19 y una sustitución L858R en el exón 21. Estas mutaciones representan el 85% de las mutaciones del EGFR observadas en el CPNM. Las mutaciones T790M y C797S representan 2 mutaciones descritas que confieren resistencia a las terapias dirigidas Erlotinib y Osimertinib respectivamente.
El kit IDEGFR contiene los siguientes reactivos:
• Un control positivo diana (TPC-IDEGFR) compuesto por una mezcla de ADN sintético portador de las diferentes mutaciones y calibrado a la concentración indicada en la hoja de control de calidad asociada; • Una mezcla de reacción de amplificación (ARM-IDEGFR sensi) que contiene Taq Polimerasa y oligonucleótidos para la detección de las mutaciones EGFR (FAM/HEX) y L858R (FAM) y Exon 19 (HEX);
• Una mezcla de reacción de amplificación (ARM-IDEGFR resist) que contiene polimerasa Taq y oligonucleótidos para la detección de las mutaciones EGFR (FAM low) y T790M (FAM high) y C797S (HEX);
• Un control negativo de extracción (NEC) preparado y extraído de la misma manera que las muestras de ensayo, pero sin muestra (sustituido por PBS);
• Un control negativo de amplificación (NAC) correspondiente a 13 μl de mezcla de reacción de amplificación y 8 μl de agua libre de nucleasas.
El ADN circulante se extrae de las muestras según el protocolo descrito en el Ejemplo 4, antes de la amplificación.
La reacción de amplificación PCR en tiempo finito (Biorad QX200 digital PCR) se realiza en cada pocillo en presencia de 13 μl de ARM-IDEGFR (Sensi o Resist) para cada muestra, así como para los controles positivo y negativo. A cada mezcla de reacción se añade:
• 8 μl de ADN extraído de cada muestra a analizar
• 8 μl ADN TPC-IDEGFR
• 8 μl de extracto NEC
• 8 μl de agua libre de nucleasas (NAC).
La fase de amplificación se lleva a cabo según el programa siguiente:
1) Activación de la polimerasa (10min a 95°C, 1 ciclo);
2) Desnaturalización/elongación del ADN (15 segundos a 95°C y 60 segundos a 60°C, 40 ciclos);
3) Consolidación de las gotas (10 minutos a 98°C, 1 ciclo);
4) Enfriamiento (tiempo infinito a 12°C, 1 ciclo).
Los resultados se analizan mediante el software QuantaSoft™ Analysis Pro.
Una mutación se considera positiva si el valor en gotas positivo es mayor o igual a 2.
Una mutación se considera no detectada si su valor es cero o inferior a 2 gotas positivas.
Los resultados de la co-amplificación de cfDNA (RPP30) e ICE mediante dPCR se observan en la Figura 2a. La figura 2b muestra el análisis de las mutaciones del EGFR mediante el kit de mutaciones del tubo IDEGFRARM-IDEGFR sensi..
La Figura 3a ilustra el análisis de mutaciones EGFR mediante el kit de tubo IDEGFRARM-IDEGFR resistmutaciones con coamplificación de ICE. Y la figura 3b ilustra el análisis de las mutaciones del EGFR mediante el kit de mutaciones del tubo IDEGFRARM-IDEGFR resist..
La detección/cuantificación de anomalías genómicas concomitante con la medición de Grewis y/o la secuencia ICE exógena permite el seguimiento de cambios en la concentración de ADN mutado entre diferentes biopsias líquidas realizadas longitudinalmente.
En función de la fluctuación del % mutante normalizado por Grewis, se adapta el tratamiento dirigido.
Ejemplo 6: Procedimiento de detección/cuantificación de una firma de ADN del donante a partir de ADNcf mediante ddPCR concomitante con la medición de Grewis y/o la secuencia ICE exógena.
En asociación con un kit de extracción y detección de ADNcf como el descrito en los Ejemplos 1 y 4, se utiliza un kit de detección y cuantificación digital por PCR del ADN del donante (postrasplante). El protocolo es similar al descrito en el ejemplo 5 para el ADN mutado, salvo que las sondas utilizadas son específicas para el ADN donante en lugar del A d N mutado.
La variación en el tiempo de Grewis es consecutiva, en un estado patológico, a una fluctuación del ADNcf fisiológico/patológico:
• Un aumento de la proporción indica rechazo del injerto;
• Una disminución de la proporción indica que se ha tomado el injerto;
• Un estado estable significa que el injerto está intacto.
La detección/cuantificación de ADN "donante" concomitante con la medición de Grewis y/o la secuencia ICE exógena también permite el seguimiento de los cambios en la concentración de ADN "donante" entre diferentes biopsias líquidas realizadas longitudinalmente.
Ejemplo 7: Uso de la medida Grewis y/o de la secuencia ICE exógena en un proceso analítico de análisis genómico analítico (función del “centro”).
Se utiliza un kit de extracción, detección y amplificación de ANDcf según los protocolos descritos en los Ejemplos 1 y 4, en presencia de un fragmento ICE.
La variación de Grewis consecutiva, en un estado patológico, a una fluctuación en el ADNcf fisiológico/patológico, permite decidir la conveniencia o no de realizar un análisis genómico posterior:
• Sin fluctuación ni aumento de Grewis: análisis genómico innecesario;
• Si aumento de Grewis: análisis genómico útil; el ADNcf se concentra al final de la etapa de extracción antes de la amplificación o de cualquier otro análisis genómico mediante técnicas de secuenciación dirigidas o no dirigidas (NGS y otras).
Ejemplo 8: Procedimiento in vitro de ayuda al diagnóstico de un estado patológico
En comparación con los valores medios obtenidos en sujetos sanos y una persistencia de valores de grewis "anormales", es posible remitir al sujeto de interés a consultas más especializadas para afinar el diagnóstico:
• Reducción de la proporción (Grewis): respuesta a un tratamiento médico de cualquier tipo (cirugía, principio activo, etc.), lo que sugiere que el tratamiento es eficaz y, por lo tanto, debe continuarse;
• Aumento de la proporción (Grewis): respuesta insuficiente o falta de respuesta a un tratamiento, lo que sugiere un cambio de tratamiento;
• Estado estacionario de la relación (Grewis): el tratamiento sigue siendo eficaz.
Claims (13)
1. Procedimiento de detección y/o cuantificación de ADN libre de todas las células a partir de una muestra de fluido biológico de un sujeto de interés distinto de un sujeto normal o sano que comprende al menos:
(i) una etapa de extracción de ADN libre de todas las células a partir de una muestra de fluido biológico al que se ha añadido al menos una cantidad eficaz de un primer fragmento de ADN exógeno de 50-200 pares de bases, preferentemente de 60-160 pares de bases, más preferentemente de 70-150 pares de bases y mejor de 80-140 pares de bases (ICE);
(ii) una etapa de co-amplificación y cuantificación del ADN libre de todas las células y del fragmento de ADN exógeno ICE extraído en la etapa (i), y
(iii) una etapa de normalización de la cantidad de ADN libre extraído de todas las células que comprende el cálculo de una primera relación, por ml de muestra de fluido biológico, entre el número de copias de ADN libre de todas las células y el número de copias del primer fragmento de ADN exógeno de 50-200 pares de bases, preferentemente de 60-160 pares de bases, más preferentemente de 70-150 pares de bases y mejor de 80-140 pares de bases (ICE),
caracterizado porqueel sujeto de interés tiene o está desarrollando cáncer o una afección patológica seleccionada entre accidente cerebrovascular o infarto de miocardio, insuficiencia renal aguda, citólisis hepática, traumatismo, rechazo de injerto o tratamiento médico como biopsia, cirugía, radioterapia, quimioterapia, inmunoterapia o principio activo.
2. Procedimiento de detección y/o cuantificación de ADN libre de todas las células a partir de una muestra de fluido biológico según la reivindicación 1,caracterizado porqueel sujeto de interés distinto de un sujeto normal o sano tiene 0 está desarrollando cáncer.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2,caracterizado porqueel fluido biológico se selecciona del grupo que consiste en sangre total, suero, plasma, orina, saliva, efluente de médula ósea, linfa, líquido cefalorraquídeo, líquido lacrimal, sudor, leche, humor acuoso, líquido sinovial, líquido pleural, líquido peritoneal, líquido amniótico, bilis, líquido seminal, esputo, preferentemente plasma.
4. Procedimiento de detección y/o cuantificación de ADN libre de todas las células a partir de una muestra de fluido biológico según una de las reivindicaciones 1 a 3,caracterizado porquela etapa de extracción (i) comprende las siguientes etapas:
(11) Proteólisis de dicha muestra de fluido biológico procedente de un sujeto de interés distinto de un sujeto normal o sano al que se ha añadido al menos un primer fragmento de<a>D<n>exógeno de 50-200 pares de bases, preferiblemente de 60-160 pares de bases, aún más preferiblemente de 70-150 pares de bases y mejor de 80 140 pares de bases (ICE),
(12) Aislamiento del ADN libre de todas las células, en particular por afinidad sobre un soporte de membrana, preferentemente un soporte de membrana de sílice en una columna de extracción,
(13) Elución del ADN libre de todas las células aislado en la etapa (i2) en una fase acuosa,
(14) Eventualmente precipitación del ADN libre de todas las células,
(15) Ventajosamente concentración del ADN libre de todas las células,
(16) Eventualmente conservación y/o almacenamiento de dicho ADN libre de todas las células.
5. Procedimiento de detección y/o cuantificación de ADN libre de todas las células a partir de una muestra de fluido biológico de un sujeto de interés distinto de un sujeto normal o sano según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,caracterizado porquecomprende una co-amplificación, en particular en el mismo pocillo, de un ADN libre de todas las células, de un fragmento de ADN exógeno (ICE) y de una secuencia de ADN genómico seleccionada entre una secuencia de ADN mutado, o una secuencia de ADN del donante en el caso particular de un sujeto de interés trasplantado susceptible de presentar rechazo del injerto.
6. Procedimiento de detección y/o cuantificación de ADN libre de todas las células a partir de una muestra de fluido biológico de un sujeto de interés distinto de un sujeto normal o sano según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5,caracterizado porquela etapa (ii) de amplificación y cuantificación del ADN libre de todas las células extraído en la etapa anterior se lleva a cabo mediante un procedimiento de PCR digital, Q-PCR y/o NGS, en particular PCR digital.
7. Uso del procedimiento de detección y/o cuantificación de ADN libre de todas las células a partir de una muestra de fluido biológico de un sujeto de interés distinto de un sujeto normal o sano según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en un procedimiento para analizar una muestra biológica de un sujeto de interés distinto de un sujeto normal o sano susceptible de liberar ADN libre de todas las células, en el que dicho sujeto de interés padece o está desarrollando cáncer o una afección clínica patológica seleccionada entre accidente cerebrovascular o infarto de miocardio, insuficiencia renal aguda, citólisis hepática, traumatismo, rechazo de injerto, o un sujeto sometido a tratamiento médico como biopsia, cirugía, radioterapia, quimioterapia, inmunoterapia o principio activo.
8. Procedimientoin vitrode análisis, en particular diagnóstico, pronóstico, teranóstico o seguimiento de la evolución de un estado fisiológico específico de un sujeto de interés distinto de un sujeto normal o sano susceptible de liberar ADN circulante, en el que dicho sujeto de interés padece o está desarrollando cáncer o una afección clínica patológica seleccionada entre accidente cerebrovascular o infarto de miocardio, insuficiencia renal aguda, citólisis hepática, traumatismo, rechazo de injerto, o un sujeto sometido a tratamiento médico como biopsia, cirugía, radioterapia, quimioterapia, inmunoterapia, o principio activo., que comprende las siguientes etapas:
(i) en un momento t0, detección y/o cuantificación de ADN libre de todas las células a partir de una muestra de fluido biológico de un sujeto de interés distinto de un sujeto normal o sano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6;
(ii) en un momento t1, reproducción de la etapa i), y
(iii) comparación de la relación, por ml de muestra de fluido biológico, entre el número de copias de ADN circulante y el número de copias de un fragmento de ADN exógeno de 50-200 pares de bases, preferiblemente de 60-160 pares de bases, aún más preferiblemente de 70-150 pares de bases y mejor de 80-140 pares de bases (ICE) obtenido en el momento t1 con respecto a la misma relación obtenida en el momento t0.
9. Procedimientoin vitrode análisis según reivindicación 8, destinado en particular a:
- analizar las fluctuaciones del ADN libre de todas las células para controlar la respuesta y/o la resistencia a un tratamiento médico como biopsia, cirugía, radioterapia, quimioterapia, inmunoterapia o principio activo, o - analizar las fluctuaciones del ADN libre de todas las células para controlar el inicio del rechazo del injerto, o bien
- analizar las fluctuaciones del ADN libre de todas las células para decidir si tiene interés un análisis posterior de las anomalías genómicas, o bien
- controlar los cambios en la concentración de ADN mutado, o
- controlar la evolución de la concentración de ADN del donante en el caso concreto de un sujeto de interés trasplantado susceptible de presentar rechazo del injerto.
10. Procedimientoin vitropara el diagnóstico, pronóstico, teranóstico de un sujeto de interés distinto de un sujeto normal o sano susceptible de liberar ADN circulante, en el que dicho sujeto de interés padece o está desarrollando cáncer o una afección clínica patológica seleccionada entre accidente cerebrovascular o infarto de miocardio, insuficiencia renal aguda, citólisis hepática, traumatismo, rechazo de injerto, o un sujeto sometido a un tratamiento médico como biopsia, cirugía, radioterapia, quimioterapia, inmunoterapia o principio activo, que comprende las etapas siguientes:
(i) en un momento t, detección y/o cuantificación de ADN libre de todas las células a partir de una muestra de fluido biológico de un sujeto de interés distinto de un sujeto normal o sano según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6;
(ii) comparación de la relación, por ml de muestra de fluido biológico, entre el número de copias de ADN circulante y el número de copias de un fragmento de ADN exógeno de 50-200 pares de bases, preferiblemente de 60-160 pares de bases, aún más preferiblemente de 70-150 pares de bases y mejor de 80-140 pares de bases (ICE) obtenido en el momento t con respecto a la misma relación obtenida en un sujeto de referencia (sujeto sano, control).
11. Uso, en un procedimiento de detección y/o cuantificación de ADN libre de todas las células a partir de una muestra de fluido biológico de un sujeto de interés distinto de un sujeto normal o sano según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o en un procedimientoin vitrode análisis según la reivindicación 8 o en un procedimientoin vitrode diagnóstico, pronóstico, teranóstico de un sujeto de interés distinto de un sujeto normal o sano según la reivindicación 10, un kit o conjunto para extraer ADN libre de todas las células a partir de una muestra de fluido biológico de un sujeto de interés distinto de un sujeto normal o sano, en el que dicho sujeto de interés padece o está desarrollando cáncer o una afección clínica patológica seleccionada entre accidente cerebrovascular o infarto de miocardio, insuficiencia renal aguda, citólisis hepática, traumatismo, rechazo de injerto, o un sujeto sometido a tratamiento médico como biopsia, cirugía, radioterapia, quimioterapia, inmunoterapia, o un principio activo que comprende:
(i) Al menos un primer fragmento de ADN exógeno de 50-200 pares de bases, preferiblemente de 60-160 pares de bases, más preferiblemente de 70-150 pares de bases y mejor de 80-140 pares de bases (ICE);
(ii) Tampones y enzimas, en particular un tampón de proteólisis, una enzima de proteólisis, un tampón de fijación, un tampón de lavado y un tampón de elución del ADN libre de todas las células,
(iii) Dispositivos para aislar el ADN libre de todas las células, en particular columnas de extracción con membrana de sílice y, ventajosamente, columnas de extracción rematadas por accesorios de carga, preferentemente embudos,
(iv) Placas de múltiples pocillos, en particular placas DeepWell de 24 pocillos de 25 ml
(v) Tubos con tapón de rosca, preferentemente de 1,5 ml, y
(vi) Instrucciones de uso,
suministrándose dicho fragmento de ADN exógeno ICE en dicho kit o aportado por separado a dicho kit, formando un conjunto de extracción.
12. Uso según la reivindicación 11, en un procedimientoin vitrosegún una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, de un kit o conjunto de extracción de ADN libre de todas las células según la reivindicación 11, en asociación con un kit de amplificación y cuantificación de ADN libre de todas las células, proporcionados juntos o por separado, comprendiendo dicho kit de amplificación y cuantificación de ADN libre de todas las células, al menos:
(i) cebadores sentido y antisentido específicos, respectivamente, para el ADN libre de todas las células del sujeto de interés distinto de un sujeto normal o sano y para el fragmento de ADN exógeno según la reivindicación 1, (ii) sondas marcadas respectivamente para el ADN libre de todas las células del sujeto de interés distinto de un sujeto normal o sano y para el fragmento de ADN exógeno según la reivindicación 1,
(iii) tampones de reacción
(iv) placas de múltiples pocillos y
(v) instrucciones de uso.
13. Uso, en un procedimiento de detección y/o cuantificación de ADN libre de todas las células a partir de una muestra de fluido biológico de un sujeto de interés distinto de un sujeto normal o sano según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o en un procedimientoin vitrode análisis según la reivindicación 8 o en un procedimientoin vitrode diagnóstico, pronóstico, teranóstico de un sujeto de interés distinto de un sujeto normal o sano según la reivindicación 10, de al menos un primer fragmento de ADN exógeno de 50-200 pares de bases, preferentemente de 60-160 pares de bases, aún más preferentemente de 70-150 pares de bases y mejor aún de 80-140 pares de bases (ICE), que permite estandarizar un procedimiento de extracción y cuantificación del ADN libre de todas las células y/o analizar las fluctuaciones del ADN libre de todas las células de un sujeto de interés distinto de un sujeto normal o sano, en el que dicho sujeto de interés padece o está desarrollando cáncer o una afección clínica patológica seleccionada entre accidente cerebrovascular o infarto de miocardio, insuficiencia renal aguda, citólisis hepática, traumatismo, rechazo de injerto, o un sujeto sometido a tratamiento médico como biopsia, cirugía, radioterapia, quimioterapia, inmunoterapia, o principio activo, a lo largo del tiempo midiendo la relación, por ml de muestra de fluido biológico, entre el número de copias de ADN libre de todas las células y el número de copias del primer fragmento de ADN exógeno de 50-200 pares de bases, preferiblemente de 60-160 pares de bases, aún más preferiblemente de 70-150 pares de bases y mejor aún de 80-140 pares de bases (ICE).
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