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ES3004107T3 - Novel compound, and method for producing regulatory t cells - Google Patents

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ES3004107T3
ES3004107T3 ES18744360T ES18744360T ES3004107T3 ES 3004107 T3 ES3004107 T3 ES 3004107T3 ES 18744360 T ES18744360 T ES 18744360T ES 18744360 T ES18744360 T ES 18744360T ES 3004107 T3 ES3004107 T3 ES 3004107T3
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ES
Spain
Prior art keywords
cells
compound
foxp3
salt
manufactured
Prior art date
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Active
Application number
ES18744360T
Other languages
English (en)
Inventor
Shimon Sakaguchi
Naganari Ohkura
Norihisa Mikami
Shuh Narumiya
Masahiko Akamatsu
Hironori Harada
Naoto Nakamura
Satoru Ujihara
Hisao Hamaguchi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Astellas Pharma Inc
Kyoto University NUC
Original Assignee
Astellas Pharma Inc
Kyoto University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

Se proporciona un nuevo compuesto que tiene actividad inhibidora de CDK8 y/o CDK19, y un método para producir Tregs. Al tratar las células T con un inhibidor de CDK8 y/o CDK19, se induce Foxp3 en las células T. Es posible, in vitro, inducir células Foxp3+T al tratar células Foxp3-T con un inhibidor de CDK8 y/o CDK19, y de ese modo inducir Tregs. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Compuesto novedoso y método para producir células T reguladoras
Campo técnico
La presente invención se refiere a un compuesto novedoso que tiene actividad inhibidora de CDK8 y/o CDK19, y a un método de producción de células T reguladoras.
La presente solicitud reivindica prioridad de la solicitud de patente provisional de EE. UU. núm. 62/451,807 y la solicitud de patente provisional de EE. Uu . núm. 62/491,279.
Técnica anterior
La quinasa dependiente de ciclina 8 (CDK8) y su isoforma relacionada CDK19 regulan cada una la actividad transcripcional a través de la fosforilación de la ARN polimerasa 2 responsable de la transcripción. CDK8 se identificó como un oncogén en melanoma (468, 1105-1109, Nature, 2010) y cáncer colorrectal (Nature 455, 547-551,2008), y también existe un informe de que una alta expresión de CDK8 está asociada con el progreso de los tumores malignos en el cáncer colorrectal (Int. J. Cancer 126, 2863-2873, 2010). Además, se sabe que CDK8 mantiene la pluripotencia de células madre embrionarias, lo que sugiere su relación con un rasgo de las células madre cancerosas (72, 2129 2139, 2012). Por lo tanto, se ha propuesto un gran número de inhibidores de CDK8 e inhibidores de CDK19 como fármacos terapéuticos para diversos cánceres, y como fármacos terapéuticos para enfermedades autoinmunitarias y enfermedades inflamatorias. Específicamente, se proporcionan, por ejemplo, compuestos descritos en el artículo de Malinkova y colaboradores (Malinková V, Vylicil J, Krystof V. Cyclin-dependent kinase inhibitors for cancer therapy: a patent review (2009-2014). 2015; 25(9): 953-70. doi: 10.1517/13543776.2015.1045414. Epub 13 de julio de 2015. PMID: 26161698.) y en los documentos US 8598344 B2, WO 2013/001310 A1, WO 2013/040153 A1, WO 2013/116786 A1, WO 2014/029726 A1, WO 2014/063778 A1, WO 2014/072435 A1, WO 2014/090692 A1, WO 2014/106606 A1, WO 2014/123900 A1, WO 2014/154723 A1, WO 2014/194245 A1, WO 2015/049325 A1, WO 2015/100420 A1, WO 2015/144290 A1, WO 2015/159937 A1, WO 2015/159938 A1 y WO 2016/009076 A1.
En un sistema inmunitario, hay un subconjunto de células T CD4+ denominadas células T reguladoras (Treg) que tienen la función de suprimir respuestas inmunitarias. Las T reg desempeñan papeles importantes en el mantenimiento de la tolerancia inmunitaria y la homeostasis inmunitaria regulando diversas respuestas inmunitarias patológicas, tales como autoinmunidad, inflamación y alergia. Las Treg incluyen Treg de origen natural (nTreg), que se desarrollan en el timo, y Treg inducidas (iTreg), que se inducen por una acción de TGF-p en la periferia. Las funciones supresoras de la respuesta inmunitaria de esas Treg se definen por la expresión y el mantenimiento de un factor de transcripción Foxp3 (Science, 299, 1057-1061 (2003), Immunological Reviews 212, 8-27 (2006), Nat. Immunol., 8, 457-462 (2007)).
Existen propuestas de un método para tratar enfermedades inmunitarias que implica potenciar o atenuar respuestas inmunitarias seleccionando como diana Treg, y un método de terapia celular que usa Treg. Los ejemplos de los mismos incluyen: usar un inmunosupresor que contiene un inhibidor de geranilgeranilación como principio activo para enfermedades autoinmunitarias y enfermedades inflamatorias (documento de patente 1: JP 2009-215284 A); cocultivarin vitrocélulas CD4+ sin tratamiento previo y mastocitos en presencia de interleucina-33 (IL-33) para producir Treg, que se usan como inmunosupresores para suprimir la aparición de enfermedades tales como enfermedades alérgicas y reumatismo y una reacción de rechazo de trasplante de órganos (documento de patente 2: JP 2010-4853 A); poner en contacto células T con el factor de crecimiento transformante beta (TGF-p) y ácido retinoico para estimular o aumentar la diferenciación a Treg, que se usan para enfermedades autoinmunitarias y similares (documento de patente 3: US 20090136470 A1); cultivarin vitrocélulas T CD4+ en presencia de interleucina-2 (IL-2), TGF-p1 y ácido todo-trans-retinoico (atRA o tretinoína) para inducir Treg CD8+, que se usan para enfermedades autoinmunitarias, tumores malignos, infecciones virales y similares (documento de patentes 4: WO 2013/161408 A1); y tratarex vivocélulas T no reguladores con una composición reguladora que contiene un inhibidor de metiltransferasa para producir Treg, que se usan para tratar enfermedades autoinmunitarias y respuestas inmunitarias aberrantes (documento de patente 5: US 20090257988 A1).
Sin embargo, se espera un desarrollo adicional de un método de inducción de Treg.
Sumario de la invención
Problema técnico
La presente invención proporciona un compuesto novedoso que tiene actividad inhibidora de CDK8 y/o CDK19, y un método de producción para Treg.
Solución al problema
Los inventores de la presente invención han realizado investigaciones sobre compuestos novedosos que tienen cada uno actividad inhibidora de CDK8 y/o CDK19, y en el curso de las investigaciones, han encontrado por primera vez que un inhibidor de CDK8 y/o CDK19 induce Foxp3 en células T. Los inventores también han encontrado que pueden inducirse Treg CD4+CD25+Foxp3+ tratando células T CD4+CD25'Foxp3' con el inhibidor de CDK8 y/o CDK19in vitro,Los inventores también han encontrado que pueden inducirse Treg CD8+Foxp3+ tratando células T CD8+Foxp3- con el inhibidor de CDK8 y/o CDK19in vitro,Por lo tanto, los inventores han completado la presente invención.
La presente invención incluye lo siguiente.
(1) Un compuesto seleccionado de 4-[1-(2-metil-1H-bencimidazol-5-il)-1H-imidazo[4,5-c]piridin-2-il]-1,2,5-oxadiazol-3-amina y 3-{1 -[1 -(4-metoxifenil)piperidin-4-il]-4-metil-1 H-imidazo[4,5-c]piridin-2-il}pirazin-2-amina, o una sal, un hidrato o un solvato del mismo.
(2) Una composición farmacéutica que comprende como principio activo un compuesto seleccionado de 4-[1 -(2-metil-1 H-bencimidazol-5-il)-1 H-imidazo[4,5-c]piridin-2-il]-1,2,5-oxadiazol-3-amina y 3-{1 -[1 -(4-metoxifenil)piperidin-4-il]-4-metil-1H-imidazo[4,5-c]piridin-2-il}pirazin-2-amina, o una sal, un hidrato o un solvato de los mismos.
(3) Un inductor de Foxp3 para producir células T reguladoras a partir de células T, que comprende como principio activo un compuesto según el punto (1) mencionado anteriormente, o una sal, un hidrato o un solvato del mismo.
(4) El inductor de Foxp3 según el punto (3) mencionado anteriormente, en donde las células T incluyen células T CD4+Foxp3-.
(5) El inductor de Foxp3 según el punto (3) mencionado anteriormente, en donde las células T incluyen células T CD4+CD25-Foxp3-.
(6) El inductor de Foxp3 según el punto (3) mencionado anteriormente, en donde las células T incluyen células T CD8+Foxp3-.
(7) Un método de producción de células T reguladorasin vitro,que comprende tratar células T con un compuesto según el punto (1) mencionado anteriormente, o una sal, un hidrato o un solvato del mismo. (8) Un método de producción de células T reguladorasin vitro,que comprende someter células T a estimulación del receptor de células T (TCR) en presencia de un compuesto según el punto (1) mencionado anteriormente, o una sal, un hidrato o un solvato del mismo.
(9) El método de producción de células T reguladoras según el punto (8) mencionado anteriormente, en donde la estimulación de TCR se realiza en presencia de TGF-p, rapamicina o ácido retinoico.
(10) El método de producción de células T reguladoras según uno cualquiera de los puntos (7) a (9) mencionados anteriormente, en donde las células T incluyen células T CD4+Foxp3-.
(11) El método de producción de células T reguladoras según uno cualquiera de los puntos (7) a (9) mencionados anteriormente, en donde las células T incluyen células T CD4+CD25-Foxp3-.
(12) El método de producción de células T reguladoras según uno cualquiera de los puntos (7) a (9) mencionados anteriormente, en donde las células T incluyen células T CD8+Foxp3-.
(13) El compuesto según el punto (1) mencionado anteriormente o una sal, hidrato o solvato del mismo para su uso como medicamento.
(14) El compuesto según el punto (1) mencionado anteriormente o una sal, hidrato o solvato del mismo para su uso en el tratamiento de cánceres, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inflamatorias o enfermedades alérgicas.
Efectos ventajosos de la invención
El compuesto novedoso que tiene actividad inhibidora de CDK8 y/o CDK19 de la presente invención puede inducir Foxp3 en células T para que formen Tregin vivo,y por lo tanto puede usarse como composición farmacéutica para tratar cánceres, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inflamatorias o enfermedades alérgicas. Además, puede inducirse Foxp3 tratando células T con el compuesto que tiene actividad inhibidora de CDK8 y/o CDK19in vitro,y por lo tanto, se espera que el compuesto se aplique a una terapia de células T reg y similares.
Breve descripción de los dibujos
Las FIGS. 1 (a) son inmunotransferencias de tipo Western para mostrar la inactivación de las proteínas CDK8 y CDK19 por ARNip de CDK8 y ARNip de CDK19. La F<i>G. 1 (b) es un gráfico para mostrar las cantidades de ARNm de Foxp3 inducidas cuando las proteínas CDK8 y CDK19 se inactivan por ARNip de CDK8 y ARNip de CDK19, respectivamente (ejemplo 3).
Las FIGS. 2(a) son gráficos de análisis de FACS para mostrar las cantidades de Foxp3 inducidas en células T sin tratamiento previo por un diclorhidrato del compuesto 1 (mostrado como “SAL DEL COMPUESTO 1 ” en las FIGS. 2(a), lo mismo se aplica a continuación en el presente documento). Los resultados del análisis en el caso de añadir un anticuerpo anti-TGF-p se muestran a la izquierda de las FIGS. 2(a), y los resultados del análisis en el caso de añadir TGF-p se muestran a la derecha de las FIGS. 2(a). La FIG. 2(b) es un gráfico para mostrar las cantidades de Foxp3 obtenidas mediante el análisis de FACS de las FIGS. 2(a) (ejemplo 5).
Las FIGS. 3(a) son gráficos de análisis de FACS para mostrar las cantidades de Foxp3 inducidas en células T sin tratamiento previo por la sal del compuesto 1. Un caso en el que solo están presentes células presentadoras de antígeno (APC) se muestra a la izquierda de las FIGS. 3(a), un caso en el que están presentes las células presentadoras de antígeno y un antígeno (OVA) se muestra en el centro de las FIGS. 3(a), y un caso en el que está presente un estimulante del receptor de células T (CD3/CD28) se muestra a la derecha de las FIGS. 3(a). Las FIGS.
3(b) son gráficos para mostrar las cantidades de Foxp3 obtenidas mediante el análisis de FACS de las FIGS. 3(a) (ejemplo 6).
Las FIGS. 4 son gráficos de análisis de FACS para mostrar la cantidad de Foxp3 inducida en células T de memoria efectoras por la sal del compuesto 1 ((1) del ejemplo 7).
Las FIGS. 5(a) son gráficos de análisis de FACS para mostrar la cantidad de Foxp3 inducida en células T de memoria efectoras por la sal del compuesto 1. Las FIGS. 5(b) son gráficos para mostrar la comparación entre las acciones supresoras del crecimiento de células T de Treg de origen natural (nTreg) y células T reguladoras inducidas por la sal del compuesto 1 (Treg derivadas de Tem). Una acción supresora del crecimiento de células T en el caso de usar un control (Tconv) se muestra a la izquierda de las FIGS. 5(b), una acción supresora del crecimiento de células T en el caso de usar las Tconv y las nTreg en combinación se muestra en el centro de las FIGS. 5(b), y una acción supresora del crecimiento de células T en el caso de usar las Tconv y las Treg derivadas de Tem en combinación se muestra a la derecha de las FIGS. 5(b). En las FIGS. 5(b), la línea negra representa datos medidos, la línea roja representa un pico de células que no se dividen y la línea azul representa un pico de células que se dividen. Además, Cell Trace Violet representa el número de veces de crecimiento celular al distribuirse a células hijas a través de la división celular ((2) del ejemplo 7).
Las FIGS. 6(a) son gráficos de análisis de FACS para mostrar las cantidades de Foxp3 inducidas en células linfocíticas de ratones a los que se administró la sal del compuesto 1. La cantidad de Foxp3 inducida en el caso de no administrar antígeno a los ratones se muestra a la izquierda de las FIGS. 6(a), y la cantidad de Foxp3 inducida en el caso de administrar un antígeno (OVA) a los ratones se muestra a la derecha de las FIGS. 6(a). La FIG. 6(b) es un gráfico para mostrar las cantidades de Foxp3 obtenidas mediante el análisis de FACS de las FIGS. 6(a) (ejemplo 8).
La FIG. 7(a) es un gráfico para mostrar una acción supresora de la sal del compuesto 1 sobre la hinchazón de la oreja de un modelo de CHS inducida por DNFB. En la FIG. 7(a), “AGOTAMIENTO de Treg” representa un caso en el que las Treg se agotan del cuerpo de un ratón modelo a través de la administración de toxina diftérica. Las FIGS. 7(b) son fotografías teñidas de tejidos de la oreja de los ratones de la FIG. 7(a) (ejemplo 9).
La FIG. 8 es un gráfico para mostrar un cambio dependiente del tiempo en la puntuación patológica (puntuación de EAE) en un modelo de EAE mediante la sal del compuesto 1 (ejemplo 10).
La FIG. 9 es un gráfico para mostrar una acción supresora del compuesto 2 sobre el frotamiento nasal en un modelo de alergia nasal inducida por anticuerpos sensibilizados activamente (ejemplo 11).
La FIG. 10A es un gráfico para mostrar una acción supresora del compuesto 2 sobre el aumento de la reactividad de las vías respiratorias en un modelo de asma inducida por OVA ((1) del ejemplo 12).
La FIG. 10B es un gráfico para mostrar una acción supresora del compuesto 2 sobre el aumento de la reactividad de las vías respiratorias en un modelo de asma de tipo Th1 ((2) del ejemplo 12).
Las FIGS. 11 (a) son gráficos de análisis de FACS para mostrar las cantidades de Foxp3 inducidas en células T Foxp3-negativo CD8+ mediante la sal del compuesto 1. Los resultados del análisis en el caso de añadir un anticuerpo anti-TGF-p se muestran a la izquierda de las FIGS. 11 (a), y los resultados del análisis en el caso de añadir TGF-p se muestran a la derecha de las FIGS. 11 (a). La FIG. 11 (b) es un gráfico para mostrar las cantidades de Foxp3 obtenidas mediante el análisis de FACS de las FIGS. 11 (a) (ejemplo 15).
La FIG. 12 es un gráfico para mostrar los resultados de la inducción de células Foxp3+CD25+ (%) en células T humanas sin tratamiento previo por la sal del compuesto 1 (ejemplo 16).
La FIG. 13 es un gráfico para mostrar los resultados de la inducción de Foxp3 en células T humanas sin tratamiento previo por la sal del compuesto 1 (ejemplo 17).
Las FIGS. 14(a) son gráficos de análisis de FACS para mostrar las cantidades de Foxp3 inducidas en células T CD4+ humanas sin tratamiento previo mediante la sal del compuesto 1. Los resultados del análisis en el caso de añadir un anticuerpo anti-TGF-p se muestran a la izquierda de las FIGS. 14(a), y los resultados del análisis en el caso de añadir TGF-p se muestran a la derecha de las FIGS. 14(a). La FIG. 14(b) es un gráfico para mostrar las cantidades de Foxp3 obtenidas mediante el análisis de FACS de las FIGS. 14(a) ((1) del ejemplo 18).
Las FIGS. 15(a) son gráficos de análisis de FACS para mostrar las cantidades de Foxp3 inducidas en células T CD4+ de memoria efectoras humanas mediante la sal del compuesto 1. Los resultados del análisis en el caso de añadir un anticuerpo anti-TGF-p se muestran a la izquierda de las FIGS. 15(a), y los resultados del análisis en el caso de añadir TGF-p se muestran a la derecha de las FIGS. 15(a). La FIG. 15(b) es un gráfico para mostrar las cantidades de Foxp3 obtenidas mediante el análisis de FACS de las FIGS. 15(a) ((2) del ejemplo 18).
La FIG. 16 es un gráfico para mostrar los resultados de la inducción de Foxp3 en células T CD8+ humanas sin tratamiento previo mediante la sal del compuesto 1 ((1) del ejemplo 19).
La FIG. 17 es un gráfico para mostrar los resultados de la inducción de Foxp3 en células T CD8+ de memoria efectoras humanas mediante la sal del compuesto 1 ((2) del ejemplo 19).
Descripción de las realizaciones
En la presente invención, un compuesto novedoso que tiene actividad inhibidora de CDK8 y/o CDK19 es 4-[1 -(2-metil-1 H-bencimidazol-5-il)-1 H-imidazo[4,5-c]piridin-2-il]-1,2,5-oxadiazol-3-amina (a continuación en el presente documento denominado “compuesto 1”) o 3-{1-[1-(4-metoxifenil)piperidin-4-il]-4-metil-1H-imidazo[4,5-c]piridin-2-il}pirazin-2-amina (a continuación en el presente documento denominado “compuesto 2”), y puede producirse mediante, por ejemplo, un método como se muestra en los ejemplos de síntesis que se describirán más adelante.
El compuesto 1 o el compuesto 2 se aísla y purifica como un compuesto libre o una sal, un hidrato, un solvato o una sustancia cristalina polimórfica del mismo. También puede producirse una sal del compuesto 1 o del compuesto 2 sometiendo el compuesto a una reacción convencional de formación de sales.
El aislamiento y la purificación se realizan aplicando operaciones químicas generales, tales como extracción, cristalización fraccionada y diversos tipos de cromatografía fraccionada.
Pueden producirse diversos isómeros seleccionando compuestos de partida apropiados, o pueden separarse utilizando diferencias en las propiedades fisicoquímicas entre los isómeros. Por ejemplo, se obtiene un isómero óptico mediante un método de resolución óptica general para un compuesto racémico (por ejemplo, cristalización fraccionada para inducir una sal diastereoisomérica con una base o ácido ópticamente activo, o cromatografía usando una columna quiral o similar), y también puede producirse a partir de un compuesto de partida ópticamente activo apropiado.
El compuesto 1 o el compuesto 2 también engloba su profármaco farmacéuticamente aceptable. El profármaco farmacéuticamente aceptable se refiere a un compuesto que tiene un grupo que puede convertirse en, por ejemplo, un grupo amino, un grupo hidroxilo o un grupo carboxilo mediante solvólisis o en condiciones fisiológicas. Los ejemplos del grupo que forma el profármaco incluyen los grupos descritos en Prog. Med. 5, 2157-2161 (1985) y “Pharmaceutical Research and Development” (Hirokawa-Shoten Ltd., 1990), vol. 7 Molecular Design 163-198.
La sal del compuesto 1 o del compuesto 2 se refiere a una sal farmacéuticamente aceptable del compuesto, y el compuesto puede formar una sal de adición de ácido o una sal con una base dependiendo del tipo de sustituyente. Un ejemplo específico de la misma es una sal de adición de ácido con: un ácido inorgánico, tal como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido yodhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico o ácido fosfórico; o un ácido orgánico, tal como ácido fórmico, ácido acético, ácido propiónico, ácido oxálico, ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido láctico, ácido málico, ácido mandélico, ácido tartárico, ácido dibenzoiltartárico, ácido ditoluoiltartárico, ácido cítrico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido aspártico o ácido glutámico.
La presente invención también abarca diversos hidratos o solvatos, y sustancias cristalinas polimórficas del compuesto 1, compuesto 2, o una sal del mismo. La presente invención también engloba compuestos marcados con diversos isótopos radiactivos o no radiactivos.
El compuesto de la presente invención puede inducir Foxp3 en células T para que formen Tregin vivo,y por lo tanto es aplicable a diversas respuestas inmunitarias patológicas, por ejemplo, cánceres, enfermedades autoinmunitarias (por ejemplo, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, diabetes de tipo 1, esclerosis múltiple, anemia perniciosa, pénfigo y vasculitis), enfermedades inflamatorias (por ejemplo, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn) y enfermedades alérgicas.
Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias y similares que contiene el compuesto de la presente invención como principio activo se prepara usando un portador, un excipiente y otros aditivos que se usan generalmente para la formulación de fármacos. La composición farmacéutica puede administrarse por administración oral en forma de un comprimido, una píldora, una cápsula, un gránulo, un polvo, un líquido o similares, o administración parenteral en forma de una inyección, tal como una inyección intravenosa o una inyección intramuscular, un supositorio, una preparación transdérmica, una preparación transnasal, un inhalante o similares.
En general, en el caso de administración oral, una dosis diaria apropiada por peso es de aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, preferiblemente de 0,1 mg/kg a 30 mg/kg, más preferiblemente de 0,1 mg/kg a 10 mg/kg, y la dosis se administra en una o dos a cuatro porciones. En el caso de administración intravenosa, una dosis diaria apropiada por peso es de aproximadamente 0,0001 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, y la dosis diaria se administra en una o una pluralidad de porciones. Además, en el caso de una preparación transmucosa, una dosis diaria por peso es de aproximadamente 0,001 mg/kg a 100 mg/kg, y la dosis diaria se administra en una o una pluralidad de porciones. La dosis se determina apropiadamente dependiendo de casos individuales en consideración de síntomas, edad, sexo y similares.
La composición farmacéutica de la presente invención contiene del 0,01 % en peso al 100 % en peso, y en una determinada realización, del 0,01 % en peso al 50 % en peso de uno o más tipos del compuesto de la presente invención o la sal del mismo como principio activo, aunque el contenido varía dependiendo de una vía de administración, una forma de dosificación, un sitio de administración y los tipos de excipiente y aditivos.
Como composición sólida para administración oral según la presente invención, se usa un comprimido, un polvo, un gránulo o similares. En tal composición sólida, una o más sustancias activas se mezclan con al menos un excipiente inerte, tal como lactosa, manitol, glucosa, hidroxipropilcelulosa, celulosa microcristalina, almidón, polivinilpirrolidona o aluminometasilicato de magnesio. La composición puede contener un aditivo inerte, por ejemplo, un lubricante, tal como estearato de magnesio, o un disgregante, tal como carboximetilalmidón sódico, o un coadyuvante solubilizante según un método convencional. El comprimido o la píldora pueden someterse a recubrimiento de azúcar o recubrimiento gástrico o entérico según se requiera.
Una composición líquida para administración oral incluye una emulsión, una solución, una suspensión, un jarabe, un elixir y similares, y contiene un disolvente inerte usado generalmente, por ejemplo, agua purificada o etanol. La composición puede contener, además del disolvente inerte, un coadyuvante farmacéutico, tal como un solubilizante, un humectante o un agente de suspensión, un agente edulcorante, un agente enmascarador del sabor, un agente aromatizante y un conservante.
Una inyección para administración parenteral incluye una solución, suspensión y emulsión acuosa o no acuosa estéril. Un disolvente acuoso incluye, por ejemplo, agua destilada para inyección y solución salina fisiológica. Un disolvente no acuoso es, por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol, un aceite vegetal, tal como aceite de oliva, un alcohol, tal como etanol, o polisorbato 80 (nombre de la farmacopea japonesa). Tal composición puede contener además un agente de tonicidad, un conservante, un humectante, un emulsionante, un dispersante, un estabilizante y un coadyuvante solubilizante. Tal composición se esteriliza, por ejemplo, por filtración a través de un filtro que retiene bacterias, mezcla de un microbicida o irradiación. Además, tal composición puede usarse produciendo una composición sólida estéril, y disolviendo o suspendiendo la composición sólida estéril en agua estéril o un disolvente inyectable estéril antes de su uso.
En la presente invención, pueden inducirse Tregin vitromediante el compuesto de la presente invención. Por consiguiente, la presente invención es aplicable, por ejemplo, al tratamiento de cánceres, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inflamatorias o enfermedades alérgicas basado en terapia celular y similares.
Los ejemplos del inhibidor de CDK8/CDK19 que va a usarse en la presente invención incluyen el compuesto 1: 4-[1 -(2-metil-1 H-bencimidazol-5-il)-1 H-imidazo[4,5-c]piridin-2-il]-1,2,5-oxadiazol-3-amina, compuesto 2: 3-{1-[1 -(4-metoxifenil)piperidin-4-il]-4-metil-1H-imidazo[4,5-c]piridin-2-il}pirazin-2-amina, o sales, hidratos y solvatos de los mismos.
En la presente invención, las células T que van a tratarse con el inhibidor de CDK8/CDK19 son células T que son un tipo de linfocitos presentes en, por ejemplo, sangre periférica, bazo o ganglios linfáticos. En otra realización, las células T son células T no reguladoras. Las células T no reguladoras incluyen células T a partir de las cuales pueden inducirse células T reguladoras. En todavía otra realización, las células T son células T Foxp3-negativo CD4+ (células T CD4+Foxp3-) o células T CD4+CD25- (células T CD4+CD25-Foxp3-), o células T CD8+ (células T CD8+Foxp3-). Los ejemplos de las mismas incluyen células T sin tratamiento previo que no han recibido estimulación antigénica todavía y expresan un antígeno CD45RA en sus superficies celulares (células T CD4+CD25-CD45RA+Foxp3-). Además, también pueden usarse células T sin tratamiento previo clasificadas por CD44, CCR7 o CD62L. Los ejemplos específicos de las mismas incluyen células T CD4+CD25-CD44-CD62L+Foxp3-. Además, en la presente invención, los ejemplos de las células T que van a tratarse con el compuesto que tiene actividad inhibidora de CDK8 y/o CDK19 incluyen células T de memoria que han recibido estimulación antigénica y expresan un antígeno CD45RO en sus superficies celulares (células T CD4+CD25-CD45RO+Foxp3-). Además, también pueden usarse células T de memoria clasificadas por CD44 o CD62L. Los ejemplos específicos de las mismas incluyen células T de memoria efectoras CD4+CD25-CD44+CD62L-Foxp3-.
El tratamiento de las células T CD4+CD25-Foxp3- solo necesitan realizarse, por ejemplo, en presencia de 0,01 nM a 10.000 nM, preferiblemente de 0,1 nM a 1.000 nM del inhibidor de CDK8/CDK19 y un estimulante del receptor de células T (estimulante de TCR) en una atmósfera que tiene una concentración de CO<2>del 1 % al 10 % o del 5 % a de 30 °C a 42 °C o 37 °C durante de 18 horas a 240 horas o de 40 horas a 120 horas. En la presente invención, se recomienda que se use una combinación de un anticuerpo anti-CD3 y de 1 gg/ml a 100 gg/ml o de 1 gg/ml a 10 gg/ml de un anticuerpo anti-CD28 como estimulante de TCR. Pueden usarse perlas recubiertas con el anticuerpo anti-CD3 y el anticuerpo anti-CD28. Además, también pueden usarse células presentadoras de antígeno (APC) y un antígeno. Además, en la estimulación de TCR, puede usarse en combinación TGF-p, rapamicina o ácido retinoico.
Cuando se tratan las células Tin vitrocon el inhibidor de CDK8/CDK19 según la presente invención, se obtiene una alta eficiencia de inducción de Foxp3 en comparación con TGF-p, que se ha usado generalmente hasta ahora, y puede prepararse un mayor número de Treg (células T CD4+CD25+Foxp3+)in vitro.Específicamente, por ejemplo, la presente invención puede utilizarse para terapia celular que implica separar células T de memoria efectoras de un paciente, tratar las células T de memoria efectoras con el inhibidor de CDK8/CDK19 bajo estimulación de TCR para inducir Foxp3 en las células, realizar adicionalmente de manera apropiada un tratamiento epigenómico conocido según se requiera, y después devolver las células al paciente, para suprimir de ese modo la enfermedad.
Ejemplos
Ahora, la presente invención se describe específicamente por medio de ejemplos de referencia y ejemplos para una mejor comprensión de la presente invención. No es necesario decir, sin embargo, que la presente invención no está limitada de ninguna manera a los mismos. En primer lugar, se muestran los métodos de producción para el compuesto 1 y el compuesto 2 de la presente invención, y además, se describen en detalle diversos ensayos farmacológicos.
(Ejemplo 1) Producción del compuesto 1
En este ejemplo, se describen los métodos de producción para el compuesto 1 y su diclorhidrato (en los siguientes ejemplos y ejemplos de referencia, el diclorhidrato del compuesto 1 se denomina “sal del compuesto 1”). En primer lugar, se describe un método de producción para un compuesto de partida para sintetizar el compuesto 1 en los ejemplos de producción 1 y 2, y se describen un método de síntesis para el compuesto 1 y un método de producción para la sal del compuesto 1 en los ejemplos de síntesis 1 y 2. Los métodos de producción para el compuesto de partida, el compuesto 1 y la sal del compuesto 1 no se limitan a los siguientes métodos, y los compuestos y la sal pueden producirse mediante métodos obvios para un experto en la técnica.
Además, en los ejemplos de síntesis y ejemplos de producción, se usan en algunos casos las siguientes abreviaturas.
Dat.: datos fisicoquímicos.
MASA (ESI, m/z): valor de m/z en ESI-MS. El valor representa [M+H]+ a menos que se indique lo contrario.
1H-RMN: 5 (ppm) de picos en 1H-RMN en DMSO-d6 a temperatura ambiente.
1) Ejemplo de producción 1
A una solución de 2-metil-1 H-bencimidazol-5-amina (8,31 g) en etanol (310 ml), se le añadieron 4-cloro-3-nitropiridina (8,95 g) y N,N-diisopropiletilamina (9,67 ml), y la mezcla se agitó a 80 °C durante 5 horas. La mezcla de reacción se dejó enfriar hasta temperatura ambiente y se concentró a presión reducida. Se añadió agua (100 ml) al residuo, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La materia insoluble se recogió por filtración y se lavó con agua (50 ml) y dietil éter (50 ml). El producto resultante se secó calentando a presión reducida para proporcionar 2-metil-N-(3-nitropiridin-4-il)-1H-bencimidazol-5-amina (14,6 g). Los datos fisicoquímicos del producto se muestran a continuación.
Dat.: MASA (ESI, m/z) 270 [M+H]+
2) Ejemplo de producción 2
Una mezcla de 2-metil-N-(3-nitropiridin-4-il)-1 H-bencimidazol-5-amina (14,6 g) producida en el ejemplo de producción 1, etanol (245 ml) y paladio al 10 %/carbono (humedecido con agua a aprox. el 50 %, 1,46 g) se agitó bajo una atmósfera de hidrógeno de 1 atm a temperatura ambiente durante 21,5 horas. La mezcla de reacción se filtró a través de Celite, y el filtrado se concentró a presión reducida para proporcionar N4-(2-metil-1H-bencimidazol-5-il)piridin-3,4-diamina (14, 6 g). Los datos fisicoquímicos del producto se muestran a continuación.
Dat.: MASA (ESI, m/z) 240 [M+H]+
3) Ejemplo de síntesis 1
En este ejemplo de síntesis, se muestra el método de producción para el compuesto 1.
A una solución de 4-amino-1,2,5-oxadiazol-3-carbonitrilo (9,03 g) en metanol (98,2 ml), se le añadió metóxido de sodio (solución en metanol al 28 %, 1,63 ml) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La mezcla de reacción, metanol (19,6 ml) y ácido acético (4,69 ml) se añadieron a N4-(2-metil-1H-bencimidazol-5-il)piridin-3,4-diamina (11,2 g) producida en el ejemplo de producción 2, y la mezcla se agitó a 70 °C durante 18 horas. Se añadió ácido acético (4,69 ml) a la mezcla de reacción, y la mezcla se agitó adicionalmente a 70 °C durante 22 horas. La mezcla de reacción se filtró, y el filtrado se concentró a presión reducida. El residuo se lavó con metanol (100 ml) y se secó calentando a presión reducida para proporcionar 4-[1-(2-metil-1H-bencimidazol-5-il)-1H-imidazo[4,5-c]piridin-2-il]-1,2,5-oxadiazol-3-amina (7,75 g). Los datos fisicoquímicos del producto se muestran a continuación.
Dat.: 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 52,55 (3H, s), 6,89 (2H, s), 7,21-7,31 (2H, m), 7,56-7,78 (2H, m), 8,45 (1H, d, J = 5,6 Hz), 9,23 (1H, d, J = 0,9 Hz), 12,6 (1H, s).
MASA (ESI, m/z) 333 [M+H]+
4) Ejemplo de síntesis 2
En este ejemplo de síntesis, se muestra el método de producción para la sal del compuesto 1.
A una suspensión de 4-[1 -(2-metil-1 H-bencimidazol-5-il)-1 H-imidazo[4,5-c]piridin-2-il]-1,2,5-oxadiazol-3-amina (37,3 g) producida en el ejemplo de síntesis 1 en 1,4-dioxano (373 ml), se le añadió una solución 4 M de cloruro de hidrógeno/1,4-dioxano (224 ml), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 17 horas. La materia insoluble se recogió por filtración, se lavó con 1,4-dioxano (149 ml) y se secó calentando a presión reducida. Se añadió dietil éter (270 ml) al sólido resultante y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La materia insoluble se recogió por filtración, se lavó con dietil éter (90 ml) y se secó calentando a presión reducida. Se añadió etanol (900 ml) al sólido resultante, y la mezcla se agitó a 90 °C durante 1 hora, después se dejó enfriar hasta temperatura ambiente, y se agitó a la temperatura durante 14 horas. La materia insoluble se recogió por filtración, se lavó con etanol (100 ml) y se secó calentando a presión reducida. Se añadió etil éter (435 ml) al sólido resultante y la mezcla se agitó a 50 °C durante 6 horas. La materia insoluble se recogió por filtración a la temperatura y se lavó con dietil éter (44 ml). El producto resultante se secó calentando a presión reducida para proporcionar diclorhidrato de 4-[1-(2-metil-1H-bencimidazol-5-il)-1H-imidazo[4,5-c]piridin-2-il]-1,2,5-oxadiazol-3-amina (42,0 g). Los datos fisicoquímicos del producto se muestran a continuación.
Dat.: 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) 52,86 (3H, s), 6,97 (2H, s), 7,74-7,83 (2H, m), 8,00-8,06 (1H, m), 8,22-8,26 (1H, m), 8,73 (1H, d, J=6,5 Hz), 9,71 (1H, s).
MASA (ESI, m/z) 333 [M+H]+
(Ejemplo 2) Producción del compuesto 2
En este ejemplo, se describe el método de producción para el compuesto 2. En primer lugar, se describe un método de producción para un compuesto de partida para sintetizar el compuesto 2 en los ejemplos de producción 3 a 5, y se describe un método de síntesis para el compuesto 2 en el ejemplo de síntesis 3. Los métodos de producción para el compuesto de partida y el compuesto 2 no se limitan a los siguientes métodos, y los compuestos pueden producirse mediante métodos obvios para un experto en la técnica.
1) Ejemplo de producción 3
A una solución de 4-cloro-2-metil-3-nitropiridina (7 g) y 1-(4-metoxifenil)piperidin-4-amina (11 g) en N-metil-2-pirrolidona (70 ml), se le añadió N,N-diisopropiletilamina (21 ml) y la mezcla se agitó a 140 °C durante 2 horas. La mezcla se dejó enfriar hasta temperatura ambiente, y se añadió una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio y agua a la mezcla de reacción, seguido de extracción con acetato de etilo. La capa orgánica se lavó con agua y una solución acuosa saturada de cloruro de sodio y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. Después de eso, el disolvente se eliminó por evaporación a presión reducida. Se añadieron acetato de etilo (50 ml) y hexano (200 ml) al residuo, y se recogió la materia insoluble por filtración. El producto resultante se secó a presión reducida para proporcionar N-[1-(4-metoxifenil)piperidin-4-il]-2-metil-3-nitropiridin-4-amina (11,4 g). Los datos fisicoquímicos del producto se muestran a continuación.
Dat.: MASA (ESI, m/z) 343 [M+H]+
2) Ejemplo de producción 4
Una mezcla de N-[1-(4-metoxifenil)piperidin-4-il]-2-metil-3-nitropiridin-4-amina (11,4 g) producida en el ejemplo de producción 3, acetato de etilo (150 ml), metanol (150 ml) y paladio al 10 %/carbono (humedecido con agua a aprox. el 50 %, 3,54 g) se agitó bajo una atmósfera de hidrógeno de 1 atm a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla de reacción se filtró a través de Celite, y el filtrado se concentró a presión reducida. Se añadió acetato de etilo al residuo, y la mezcla se agitó. Después de eso, se recogió materia insoluble por filtración. El producto resultante se secó a presión reducida para proporcionar N4-[1-(4-metoxifenil)piperidin-4-il]-2-metilpiridin-3,4-diamina (10,3 g). Los datos fisicoquímicos del producto se muestran a continuación.
Dat.: MASA (ESI, m/z) 313 [M+H]+
3) Ejemplo de producción 5
Una mezcla de N4-[1-(4-metoxifenil)piperidin-4-il]-2-metilpiridin-3,4-diamina (5,17 g) producida en el ejemplo de producción 4, ácido 3-aminopirazin-2-carboxílico (2,42 g), N,N-diisopropiletilamina (8 ml), hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (6,5 g) y diclorometano (75 ml) se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se añadieron ácido 3-aminopirazin-2-carboxílico (350 mg), N,N-diisopropiletilamina (850 pl) y hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (950 mg) a la mezcla de reacción, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas. Se añadió una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio a la mezcla de reacción, seguido de extracción con cloroformo. La capa orgánica se lavó con una solución acuosa saturada de cloruro de sodio y el disolvente se retiró por evaporación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice para proporcionar 3-amino-N-(4-{[1-(4-metoxifenil)piperidin-4-il]amino}-2-metilpiridin-3-il)pirazin-2-carboxamida (7,45 g). Los datos fisicoquímicos del producto se muestran a continuación.
Dat.: MASA (ESI, m/z) 434 [M+H]+
4) Ejemplo de síntesis 3
En este ejemplo de síntesis, se muestra el método de producción para el compuesto 2.
Una mezcla de 3-amino-N-(4-{[1-(4-metoxifenil)piperidin-4-il]amino}-2-metilpiridin-3-il)pirazin-2-carboxamida (7,45 g) producida en el ejemplo de producción 5, carbonato de potasio (7,07 g) y etanol (75 ml) se agitó usando un reactor de microondas a 150 °C durante 7 horas. La reacción se realizó en cuatro lotes. La mezcla de reacción se dejó enfriar hasta temperatura ambiente, y se añadió a la misma una solución acuosa saturada de cloruro de amonio, seguido de extracción con cloroformo. La capa orgánica se lavó con una solución acuosa saturada de cloruro de sodio y el disolvente se eliminó por evaporación a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice para proporcionar 3-{1 -[1 -(4-metoxifenil)piperidin-4-il]-4-metil-1 H-imidazo[4,5-c]piridin-2-il}pirazin-2-amina (5,67 g). Los datos fisicoquímicos del producto se muestran a continuación.
Dat.: 1H-RMN (500 MHz, DMSO-d6) 51,98-2,06 (2H, m), 2,51-2,62 (2H, m), 2,70-2,78 (2H, m), 2,77 (3H, s), 3,68-3,73 (2H, m), 3,71 (3H, s), 5,49-5,58 (1H, m), 6,83-6,87 (2H, m), 6,96-7,00 (2H, m), 7,59 (1H, d, J=5,7 Hz), 7,67 (2H, s), 7,97 (1H, d, J=2,4 Hz), 8,16 (1H, d, J=2,4 Hz), 8,21 (1H, d, J=5,7 Hz).
MASA (ESI, m/z) 416 [M+H]+
(Ejemplo 3) Correlaciones entre CDK8 y CDK19, e inducción de ARNm de Foxp3
En este ejemplo, se confirmaron las correlaciones entre CDK8 y CDK19, y la inducción de ARNm de Foxp3 en células de bazo de ratón. Se rompieron células de bazo derivadas de ratones C57BL/6 de 9 a 11 semanas de edad (fabricados por SLC) en una malla de nylon y se filtraron para preparar una suspensión celular. Además, se prepararon células T CD4+ a partir de la suspensión celular usando microperlas de CD4, ratón (fabricadas por Miltenyi Biotec). Las células preparadas se transfectaron con 250 nM de ARNip de control negativo (fabricado por Thermo Fisher Scientific), ARNip de CDK8 (s113914; fabricado por Thermo Fisher Scientific) o ARNip de CDK19 (s95476; fabricado por Thermo Fisher Scientific) usando GenomONE-si (fabricado por Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd.), se estimularon con un anticuerpo anti-CD3 (145-2C11, ATCC CRL-1975; Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 84 (1987), págs. 1374-1378) y un anticuerpo anti-CD28 (37.51; fabricado por BD), y se cultivaron bajo una atmósfera del 5 % de CO<2>a 37 °C. Después de 2 días, las células se transfectaron de nuevo con ARNip de CDK8 o ARNip de CDK19, y se cultivaron bajo una atmósfera del 5 % de CO<2>a 37 °C. Después de 1 día, las células se sometieron a tratamiento de inducción de Foxp3 por cultivo en presencia de 3,3x106 perlas/ml de Gibco Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 (fabricado por Thermo Fisher Scientific), 250 U/ml de mIL-2 (fabricado por R&D) y 5 ng/ml de hTGF-p1 (fabricado por Peprotech) bajo una atmósfera del 5 % de CO<2>a 37 °C. Después de 1 día del tratamiento, se extrajo el ARN total de las células T, se sintetizó ADNc y se midieron la cantidad de expresión de ARNm de Foxp3 y la cantidad de expresión de ARNm de ARNr 18s mediante ensayo Taqman (Foxp3: Mm00475162_m1, 18S: Mm03928990_g1; fabricado por Thermo Fisher Scientific). Después de eso, el valor de expresión de ARNm de Foxp3 se corrigió con el valor de expresión de ARNr 18S. Además, se determinó un valor porcentual con respecto a la muestra tratada con ARNip de control negativo. Los resultados de tres ensayos se muestran en la FIG. 1 (b). Se indujo ARNm de Foxp3 mediante la inactivación de CDK8 o CDK19, revelando que Foxp3 se indujo en células T suprimiendo la función de CDK8 o CDK19.
En las condiciones mencionadas anteriormente, mediante el uso de las células T sometidas al tratamiento de inducción de Foxp3 el día 3, se confirmó la validez de las condiciones de inactivación para las proteínas CDK8 y CDK19 por ARNip de CDK8 o ARNip de CDK19 mediante inmunotransferencia de tipo Western usando un anticuerpo anti-CDK8 (fabricado por Cell Signaling Technology) y un anticuerpo anti-CDK19 (fabricado por SIGMA). Como se muestra en las FIGS. 1(a), se confirmó que las condiciones mencionadas anteriormente eran válidas como condiciones de inactivación para las proteínas CDK8 y CDK19 por ARNip de CDK8 o ARNip de CDK19.
(Ejemplo 4) Actividades inhibidoras de CDK8/19 de la sal del compuesto 1 y el compuesto 2
En este ejemplo, se confirmaron las actividades inhibidoras de CDK8 y CDK19 para la sal del compuesto 1 producida en el ejemplo 1 y el compuesto 2 producido en el ejemplo 2. Se usó el kit CDK8/CycC_ELISA QSS Assist™ (fabricado por Carna Biosciences) para la medición de la actividad quinasa de CDK8. Se añadieron una solución de enzima (10 pl) y una solución de ATP/sustrato/metal (5 pl) cada una incluida con el kit, y una solución de compuesto (preparada con un tampón de ensayo incluido con el kit para tener una concentración de 4 veces con respecto a una concentración final en el momento de la reacción, 5 pl) a una placa recubierta con estreptavidina (fabricada por Thermofisher Scientific), seguido de incubación a temperatura ambiente durante 90 minutos. Después de lavar con un tampón de lavado (Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, Tween-20 al 0,02 %), se añadieron 100 pl de una solución de BSA al 0,1 % a la placa, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se retiró la solución de BSA al 0,1 % y después se añadieron 50 pl de una solución de anticuerpo primario incluida con el kit a la placa, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de lavar con un tampón de lavado, se añadieron 50 pl de una solución de anticuerpo secundario incluida con el kit a la placa, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de lavar con un tampón de lavado, se añadieron 50 pl de solución de cromógeno TMB (fabricada por Lifetechnologies) a la placa, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se añadieron 50 pl de H<2>SO<4>0,1 M a la placa para detener una reacción cromogénica. Mediante el uso de valores medidos para DO450 y DO540, se calcularon los promedios geométricos de valores de CI<50>basándose en los datos obtenidos de cuatro ensayos y tres ensayos, respectivamente, para la sal del compuesto 1 y el compuesto 2. Además, se usó el kit CDC2L6/CycC_ELISA QSS Assist™ (fabricado por Carna Biosciences) para la medición de la actividad quinasa de CDK19. Se añadieron una solución de enzima (10 pl) y una solución de ATP/sustrato/metal (5 pl) cada una incluida con el kit, y una solución de compuesto (preparada con un tampón de ensayo incluido con el kit para tener una concentración de 4 veces con respecto a una concentración final en el momento de la reacción, 5 pl) a una placa recubierta con estreptavidina (fabricada por Thermofisher Scientific), seguido de incubación a temperatura ambiente durante 90 minutos. Después de lavar con un tampón de lavado, se añadieron 100 pl de una solución de BSA al 0, 1 % a la placa, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se retiró la solución de BSA al 0,1 % y después se añadieron 50 pl de una solución de anticuerpo primario incluida con el kit a la placa, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de lavar con un tampón de lavado, se añadieron 50 pl de una solución de anticuerpo secundario incluida con el kit a la placa, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de lavar con un tampón de lavado, se añadieron 50 pl de solución de cromógeno TMB (fabricada por Lifetechnologies) a la placa, seguido de incubación a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se añadieron 50 pl de H<2>SO<4>0, 1 M a la placa para detener una reacción cromogénica. Mediante el uso de valores medidos para DO450 y DO540, se calcularon los promedios geométricos de valores de CI50 basándose en los datos obtenidos de tres ensayos tanto para la sal del compuesto 1 como para el compuesto 2. Los resultados se muestran en la tabla 1. La tabla 1 reveló que la sal del compuesto 1 y el compuesto 2 eran inhibidores dobles para CDK8 y CDK19.
Tabla 1
(Ejemplo 5) Inducciónin vitrode Foxp3 por la sal del compuesto 1
En este ejemplo, se confirmó la capacidad de inducir Foxp3 en células sin tratamiento previo para la sal del compuesto 1 producida en el ejemplo 1.
Se recogieron los ganglios linfáticos de ratones KI con proteína de fusión Foxp3-GFP de 6 a 8 semanas de edad (ratones eFox), y el tejido se disgregó usando vidrio molido, y se filtró a través de una malla de nylon para preparar una suspensión de células linfocíticas totales. Los ratones eFox se generaron según un método descrito en Science.
17 de octubre de 2014; 346(6207): 363-8. doi: 10.1126/science.1259077. Las células linfocíticas totales preparadas se tiñeron con un anticuerpo anti-CD4 (RM-4.5; fabricado por BD), un anticuerpo anti-CD62L (MEL-14; fabricado por BD) y un anticuerpo anti-CD44 (IM7; fabricado por BD) y se prepararon células T sin tratamiento previo CD4+CD25-Foxp3-CD62L+CD44- usando FACSAria™ II (fabricado por BD).
Como se muestra en los siguientes puntos (i) a (iv), las células T sin tratamiento previo preparadas (2x105 células) se estimularon usando 5 pl de un anticuerpo anti-CD3/CD28 (Gibco Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28; fabricado por Thermo Fisher Scientific) en presencia/ausencia de 2 ng/ml de hTGF-p1 (fabricado por R&D) o 10 pg/ml de un anticuerpo anti-TGF-p (fabricado por R&D) y 1 pM de sal del compuesto 1, y se trataron bajo una atmósfera del 5 % de CO<2>a 37 °C durante 72 horas.
(i) Anticuerpo anti-TGF-p (control)
(ii) Anticuerpo anti-TGF-p sal del compuesto 1
(iii) hTGF-p1 (control)
(iv) hTGF-p1 sal del compuesto 1
Las células después del tratamiento se tiñeron con un anticuerpo anti-CD4 (fabricado por BD), y se analizó una proporción de células positivas para Foxp3-GFP mediante un método de citometría de flujo. Los resultados se muestran en las FIGS. 2(a). Además, el número (%) de esas células positivas para Foxp3-GFP se muestra en la FIG.
2(b).
Los resultados de las FIGS. 2(a) y la FIG. 2(b) revelaron que, incluso en una condición tal que el TGF-p se bloqueó por la adición del anticuerpo anti-TGF-p, se indujo Foxp3 significativamente en las células T sin tratamiento previo por la sal del compuesto 1 solo (control: 2,51 %, tratamiento con la sal del compuesto 1: 25,9 %). Los resultados también revelaron que Foxp3 se indujo sinérgicamente en las células T sin tratamiento previo usando la sal del compuesto 1 y TGF-p en combinación (TGF-p: 44,3%, tratamiento con TGF-p compuesto 1: 81,1 %).
(Ejemplo 6) Inducción de Foxp3 específica de antígeno por la sal del compuesto 1
En este ejemplo, se confirmó la capacidad de inducir Foxp3 en células sin tratamiento previo de una manera específica de antígeno para la sal del compuesto 1 producida en el ejemplo 1.
Se prepararon células T sin tratamiento previo CD4+CD25-Foxp3-CD62L+CD44- a partir de ratones DO11.10/eFox de 6 a 10 semanas de edad de la misma manera que en el ejemplo 5. Los ratones DO11.10/eFox se generaron cruzando ratones DO11.10 con ratones eFox. Además, se separaron células de ganglios linfáticos totales de ratones BALB/c de 6 a 10 semanas de edad (fabricados por SLC) y se tiñeron con un anticuerpo anti-CD11 c (HL3; fabricado por BD) para preparar células presentadoras de antígeno (células positivas para CD11c).
Como se muestra en los siguientes puntos (i) a (vi), las células T sin tratamiento previo preparadas (1x105 células) se trataron en presencia/ausencia de 2x104 células presentadoras de antígeno (APC), 5 pM de OVA (péptido de ovoalbúmina, OVA<323-339>; fabricado por MLB), o 5 pl de un anticuerpo anti-CD3/CD28 (Gibco Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28; fabricado por Thermo Fisher Scientific) y 1 pM de sal del compuesto 1 bajo una atmósfera del 5 % de CO<2>a 37 °C durante 72 horas.
(i) APC (control)
(ii) APC sal del compuesto 1
(iii) APC OVA (control)
(iv) APC OVA sal del compuesto 1
(v) Anticuerpo anti-CD3/CD28 (control)
(vi) Anticuerpo anti-CD3/CD28 sal del compuesto 1
Las células después de cada tratamiento se tiñeron con un anticuerpo anti-DO11.10 (KJ1-26, fabricado por BD), y se analizaron una proporción de células positivas para Foxp3-GFP y la expresión de TCR DO11.10 mediante un método de citometría de flujo. Los resultados se muestran en las FIGS. 3(a). Además, el número (%) de esas células positivas para Foxp3-KJ1-26 se muestra en las FIGS. 3(b).
A partir de los resultados de las FIGS. 3(a) y 3(b), solo cuando las células T sin tratamiento previo se coestimularon con las APC y OVA, las células T Foxp3+ que expresan TCR DO11.10, que se reconocía por KJ1-26, aumentaron con la sal del compuesto 1 (APC OVA sal del compuesto 1: 13,3 %). Mientras tanto, cuando las células se estimularon con el anticuerpo anti-CD3 y el anticuerpo anti-CD28, las células T Foxp3+ que no expresan TCR DO11.10 también aumentaron (CD3 CD28 sal del compuesto 1: 19,9 %). Esos resultados revelaron que la sal del compuesto 1 indujo células T Foxp3+ de una manera específica de antígeno (OVA).
(Ejemplo 7) Influencias de la sal del compuesto 1 sobre la inducción de Foxp3 y el crecimiento celular
En este ejemplo, se confirmaron la inducción de Foxp3 en células T de memoria efectoras y una acción supresora del crecimiento celular de Treg inducidas a partir de las células T de memoria efectoras para la sal del compuesto 1 producida en el ejemplo 1.
(1) Inducción de Foxp3 en células T de memoria efectoras
Se preparó una suspensión de células linfocíticas totales a partir de ratones eFox de la misma manera que en el ejemplo 5. Las células linfocíticas totales preparadas se tiñeron con un anticuerpo anti-CD4 (RM-4.5; fabricado por BD), un anticuerpo anti-CD62L (MEL-14; fabricado por BD) y un anticuerpo anti-CD44 (IM7; fabricado por BD) y se prepararon células T de memoria efectoras (CD4+Foxp3-CD25-CD44hiCD62L-) usando FACSAria™ II (fabricado por BD). Las células T de memoria efectoras resultantes (2x105 células) se estimularon usando 5 pl de un anticuerpo antiCD3/CD28 (Gibco Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28; fabricado por Thermo Fisher Scientific) en presencia de hTGF-p1 (5 ng/ml) y sal del compuesto 1 (1|jM), y se trataron bajo una atmósfera del 5 % de CO<2>a 37 °C durante 72 horas. Se analizó una proporción de células Foxp3-GFP-positivas después del tratamiento mediante un método de citometría de flujo. Los resultados se muestran en la FIG. 4. Se usó un sistema libre de la sal del compuesto 1 como control.
Los resultados revelaron que Foxp3 se indujo significativamente en el caso del tratamiento con la sal del compuesto 1 en comparación con el control (control: 1,86 %, sal del compuesto 1: 17,0 %).
(2) Supresión del crecimiento celular por T reg inducidas a partir de células T de memoria efectoras
Se trataron células T de memoria efectoras (2x105 células) preparadas de la misma manera que en la sección (1) en presencia de 5 ng/ml de hTGF-p1 y 1jM de sal del compuesto 1. Los resultados se muestran en las FIGS. 5(a). Se usó un sistema libre de la sal del compuesto 1 como control.
Los resultados revelaron que se indujeron significativamente (17,2 %) células T reguladoras CD4+CD25+Foxp3+ (Treg derivadas de Tem) en el caso del tratamiento con la sal del compuesto 1 en comparación con el control (2,97 %).
A continuación, se compararon entre sí las acciones supresoras del crecimiento de células T de las Treg derivadas de Tem y las Treg de origen natural (nTreg). Se usaron nTreg preparadas a partir de ratones eFox mediante la misma técnica que la del ejemplo 5 como nTreg. Además, se usaron como células T células T sin tratamiento previo (Tconv) preparadas a partir de ratones BALB/c mediante el mismo método que el del ejemplo 5. Las Tconv se marcaron con un colorante de marcaje de división Cell Tracer Violet (fabricado por Thermo Fisher Scientific). Se cultivaron células que contienen las Tconv y las nTregs en una relación de 2:1 (6x104 células) o células que contienen las Tconv y las Treg derivadas de Tem en una relación de 10:1 (4,4x104) en presencia de células presentadoras de antígeno (4x104 células) y 1 jg/m l de un anticuerpo anti-CD3 bajo una atmósfera del 5 % de CO<2>a 37 °C durante 72 horas. Después de eso, se midió el colorante de marcaje de división con FACSAria™ II (fabricado por BD) para examinar el estado de crecimiento de las células Tconv. Se usaron las Tconv (4x104 células) solas como control.
Los resultados se muestran en las FIGS. 5(b). En las FIGS. 5(b), la línea negra representa datos medidos, la línea roja (indicada por la flecha discontinua en las FIGS. 5(b)) representa un pico de células que no se dividen, y la línea azul (indicada por la flecha continua en las FIGS. 5(b)) representa un pico de células que se dividen. Los resultados de las FIGS. 5(b) revelaron que, en el sistema (control) en el que ninguna de las nTreg ni las Treg derivadas de Tem se añadieron a las Tconv, se encontró la atenuación del colorante de marcaje de división en las Tconv y se observaron cinco veces la división celular (línea azul: indicada por las flechas 1a a 5a a la izquierda de las FIGS. 5(b)), y por tanto las células Tconv crecieron. En contraste, se reveló que tanto en Tconv nTreg (2:1) como Tconv Treg derivadas de Tem (10:1), el crecimiento de las células Tconv se suprimió sustancialmente al mismo nivel. Esto reveló que las Treg derivadas de Tem tenían un efecto supresor del crecimiento de células T comparable al de las nTreg en una cantidad correspondiente a 1/5 del de las nTreg.
(Ejemplo 8) Inducción de Foxp3in vivo
Se inmunizaron ratones DO11.10/RAG2 KO/eFox de seis a diez semanas de edad con una emulsión mixta de OVA (OVA<323-339>; fabricado por MLB) y adyuvante completo de Freund (CFA; fabricado por BD) (100 jg de OVA/ratón), y sal del compuesto 1 administrada por vía oral (30 mg/kg en cuanto a forma libre) durante 1 semana desde el día de la inmunización. Se usó como control un sistema en el que no se administró la sal del compuesto 1. Además, también se investigó de manera similar un sistema no inmunizado (sin inmunización). Los ratones DO11.10/RAG2 KO/eFox se generaron cruzando los ratones DO11.10/eFox del ejemplo 6 con ratones RAG2 KO.
Después de la administración oral durante 1 semana, se recogieron linfocitos de los ratones para preparar una suspensión celular mediante la misma técnica que la del ejemplo 5. A continuación, las células linfocíticas se tiñeron con un anticuerpo anti-CD4 (fabricado por BD) y un anticuerpo anti-DO11.10 (fabricado por BD), y se analizó una proporción de células Foxp3-GFP-positivas mediante un método de citometría de flujo. Los resultados se muestran en las FIGS. 6(a). Además, el número (%) de esas células Foxp3-GFP-positivas se muestra en la FIG. 6(b).
Los resultados de las FIGS. 6(a) y la FIG. 6(b) revelaron que se indujeron células T Foxp3-positivas por la sal del compuesto 1 solo en los ratones a los que se les administró OVA (3,79 %).
(Ejemplo 9) Efecto terapéutico de la sal del compuesto 1 sobre la hipersensibilidad por contacto (CHS)
En este ejemplo, se confirmó un efecto terapéutico de la sal del compuesto 1 sobre la hipersensibilidad por contacto en un modelo de CHS inducida por dinitrofluorobenceno (DNFB). El modelo de CHS inducida por DNFB se generó mediante el siguiente método. Se aplicaron 100 j l de DNFB (DNFB al 0,5 % (p/v) en acetona/aceite de oliva (4/1)) al abdomen de ratones Foxp3-DTR-GFP KI de 6 a 10 semanas de edad (ratones FDG) (Nat. Immunol. Febrero de 2007; 8(2): 191-7) dos veces a un intervalo de 1 semana para sensibilizar los ratones. Después de 1 semana, se aplicaron 20 j l de DNFB adicionalmente a la oreja para inducir hipersensibilidad por contacto (CHS) inducida por DNFB. Por tanto, se generaron ratones modelo de CHS.
A los ratones modelo de CHS se les administró por vía oral la sal del compuesto 1 (30 mg/kg en cuanto a forma libre) durante 14 días (caso normal). Además, a los ratones modelo de CHS a los que se les administró por vía intraperitoneal 50 ng de toxina diftérica de antemano también se les administró por vía oral de manera similar sal del compuesto 1 (en el caso de agotamiento de Treg). Esos ratones modelo de CHS se criaron cada uno durante 14 días, y después se midió la hinchazón de la oreja con un medidor de grosor de dial (Peacock). Los resultados se muestran en la FIG.
7(a). Además, los tejidos de la oreja de los respectivos ratones se sometieron a tinción con hematoxilina-eosina. Los resultados se muestran en las FIGS. 7(b).
Los resultados de la FIG. 7(a) y las FIGS. 7(b) revelaron que la administración de la sal del compuesto 1 redujo la hinchazón de la oreja de los ratones modelo de CHS. Además, los resultados de la tinción de los tejidos de la oreja también mostraron resultados similares. Mientras tanto, cuando los ratones se sometieron al tratamiento de agotamiento de Treg que implica la administración de toxina diftérica, la hinchazón de la oreja de los ratones no se redujo incluso administrando la sal del compuesto 1. Los resultados de la tinción de los tejidos de la oreja también mostraron resultados similares. Esos resultados revelaron que el efecto terapéutico de la sal del compuesto 1 sobre CHS era dependiente de Treg.
(Ejemplo 10) Efecto terapéutico de la sal del compuesto 1 sobre la esclerosis múltiple
En este ejemplo, se confirmó un efecto terapéutico de la sal del compuesto 1 en ratones modelo con encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) que sirven como modelo de esclerosis múltiple. El modelo de EAE se generó mediante el siguiente método. Una emulsión producida mezclando cantidades iguales de péptido de glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG) (MOG)35-55 y adyuvante completo de Freund (CFA; fabricado por BD) se inyectó por vía subcutánea en el lomo de ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad (fabricados por SLC) (MOG<35-55>200 pg/ratón). A continuación, a los ratones se les administraron por vía intraperitoneal 200 ng de toxina pertussis (Ptx) (el día 0). El día 2, a los ratones se les administró adicionalmente por vía intraperitoneal 200 ng de Ptx para inducir EAE.
A los ratones modelo de EAE se les administró la sal del compuesto 1 (30 mg/kg en cuanto a forma libre) durante un período del día 1 al día 14. Se midieron las puntuaciones patológicas (puntuaciones de EAE) de los ratones con el tiempo según Int. Immunol. Noviembre de 2012; 24(11): 681-91. doi: 10.1093/intimm/dxs075. Los resultados se muestran en la FIG. 8.
Los resultados de la FIG. 8 revelaron que se encontró que las puntuaciones de EAE mejoraban significativamente con la sal del compuesto 1 en comparación con el control (vehículo).
(Ejemplo 11) Efecto terapéutico del compuesto 2 sobre la alergia nasal
En este ejemplo, se confirmó un efecto terapéutico del compuesto 2 en un modelo de alergia nasal inducida por anticuerpos sensibilizados activamente de ratón que sirve como modelo de alergia nasal. El modelo de alergia nasal inducida por anticuerpos sensibilizados activamente de ratón se generó mediante el siguiente método. Se sensibilizaron inicialmente ratones BALB/c de siete semanas de edad (fabricados por SLC, macho) mediante administración intraperitoneal de 200 pl de un líquido mixto de OVA (fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (0,5 mg/ml) (100 pg/ratón), 5 mg/ml de hidróxido de aluminio (ALUM; fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) y 1,5 pg/ml de toxina pertussis (fabricada por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). A continuación, 5 días después de la sensibilización inicial, como sensibilización adicional, se administró OVA (50 pg/ratón) en la piel dorsal de los ratones para realizar la sensibilización sistémica. Después de eso, se administró OVA (100 pg/ratón) a los ratones como gotas nasales a una frecuencia de una vez al día como sensibilización local durante 8 días desde el día 18 después de la sensibilización inicial para provocar un síntoma de alergia nasal debido a la sensibilización activa.
Al modelo se le administró por vía oral el compuesto 2 (de 0,3 mg/kg a 3,0 mg/kg) diariamente desde 3 días antes de la sensibilización inicial, y el día final de la sensibilización local, se evaluó el efecto de la sustancia de prueba usando el número de veces de comportamiento de frotamiento nasal en 1 hora como indicador. Se usó una solución de metilcelulosa al 0,5 % (p/v) que sirve como vehículo para un grupo de control de vehículo, y se usó dexametasona (fabricada por Tokio Chemical Industry Co., Ltd.) para un control positivo. Los resultados se muestran en la FIG. 9.
Los resultados de la FIG. 9 revelaron que la administración del compuesto 2 (1,0 mg/kg o 3,0 mg/kg) suprimió significativamente el número de veces de frotamiento nasal.
(Ejemplo 12) Efectos terapéuticos del compuesto 2 sobre el aumento de la resistencia de las vías respiratorias (asma)
En este ejemplo, se confirmaron los efectos terapéuticos del compuesto 2 sobre un modelo de asma inducida por OVA y un modelo de asma de tipo Th1 que sirven como modelos de asma.
(1) Asma inducida por OVA
El modelo de asma inducida por OVA se generó mediante el siguiente método. Se sensibilizaron ratones Balb/c de ocho semanas de edad (fabricados por Charles River Laboratories) mediante administración intraperitoneal de 200 pl de solución salina fisiológica que contenía OVA (fabricado por SIGMA) (20 pg/ratón) e hidróxido de aluminio (Alum; fabricado por LMS Co., Ltd.) (2,25 mg) el día de la sensibilización inicial y el día 8 y el día 15 después de la sensibilización inicial. Después de eso, los ratones se sensibilizaron por inhalación de OVA al 1 % una vez al día mediante el uso de un nebulizador ultrasónico (fabricado por OMRON Corporation) para inducir inflamación durante 6 días consecutivos desde el día 29 después de la sensibilización inicial. Un grupo normal recibió de manera similar administración intraperitoneal e inhalación de solución salina fisiológica.
El modelo generado recibió administración oral repetida del compuesto 2 a una dosis de 0,5 mg/kg una vez al día durante un período de 34 días desde el primer día de la sensibilización hasta el día de inducción final. De manera similar, un grupo de control de vehículo y un control positivo recibieron administración oral repetida de una solución de metilcelulosa al 0,5 % (p/v) que sirve como vehículo y 1 mg/kg de dexametasona (fabricada por SIGMA), respectivamente. Al día siguiente de la inducción con antígeno final, para todos los ratones, se midió la reactividad de las vías respiratorias en estado de vigilia usando la resistencia de las vías respiratorias después de la inhalación de solución de metacolina como indicador. Los ratones se colocaron en una cámara de inhalación acrílica y recibieron inhalación sucesiva de solución salina fisiológica y soluciones de 1,56 mg/ml, 3,125 mg/ml, 6,25 mg/ml, 12,5 mg/ml y 25 mg/ml de metacolina durante 1 minuto cada una mediante el uso de un nebulizador presurizado (fabricado por PARI). Después de la inhalación de cada solución, se midió la resistencia de las vías respiratorias (resistencia específica de las vías respiratorias: sRaw). Se adoptó un promedio de 100 respiraciones como sRaw individual en cada punto de medición. La sRaw se midió en estado de vigilia mediante un método de pletismógrafo de doble flujo usando un sistema de medición de la función respiratoria exhaustivo (Pulmos-1; fabricado por M.I.P.S ). Los resultados de la medición de la resistencia de las vías respiratorias en el momento de la inhalación de la solución de 25 mg/ml de metacolina se muestran en la FIG. 10A.
Los resultados de la FIG. 10A revelaron que la administración del compuesto 2 suprimió un aumento en la reactividad de las vías respiratorias.
(2) Asma de tipo Th1
El modelo de asma de tipo Th1 se generó mediante el siguiente método. Se sensibilizaron inicialmente ratones Balb/c de ocho semanas de edad (fabricados por Charles River Laboratories) mediante administración intraperitoneal única de 200 gl de solución salina fisiológica que contenía OVA libre de endotoxinas (fabricado por Hyglos) (50 gg/ratón) y adyuvante completo de Freund (FCA; fabricado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Después de eso, a los ratones se les administró por vía intranasal 50 gl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía OVA libre de endotoxinas (100 gg/ratón) y lipopolisacárido (LPS, fabricado por SIGMA) (5 gg/ratón) para inducir inflamación durante 3 días consecutivos desde el día 15 después de la sensibilización inicial. Un grupo normal recibió la administración intraperitoneal de solución salina fisiológica y la administración intranasal de PBS.
El modelo generado recibió administración oral repetida del compuesto 2 a una dosis de 0,5 mg/kg una vez al día durante un período de 17 días desde el primer día de la sensibilización hasta el día de inducción final. De manera similar, un grupo de control y un control positivo recibieron administración oral repetida de una solución de metilcelulosa al 0,5 % (p/v) que sirve como vehículo y 1 mg/kg de dexametasona (fabricada por SIGMA), respectivamente. Al día siguiente de la inducción con antígeno final (día 18), se midió la reactividad de las vías respiratorias de la misma manera que en la sección (1). Los resultados de la medición de la resistencia de las vías respiratorias en el momento de la inhalación de la solución de 25 mg/ml de metacolina se muestran en la FIG. 10B.
Los resultados de la FIG. 10B revelaron que la administración del compuesto 2 suprimió un aumento en la reactividad de las vías respiratorias.
(Ejemplo 13) Efecto terapéutico de la infusión de Treg inducidasex vivosobre la hipersensibilidad por contacto
En este ejemplo, se confirmó un efecto terapéutico de la infusión de Treg inducidasex vivoen un modelo de hipersensibilidad por contacto inducida por DNFB.
Las Treg se generaron mediante el siguiente método. Se rompieron células de bazo derivadas de ratones eFox de 12 semanas de edad en una malla de nylon y se filtraron para preparar una suspensión celular. Además, se cultivaron células T CD4+ (1x105 células) preparadas a partir de la suspensión celular usando microperlas de CD4, ratón (fabricadas por Miltenyi Biotec) en presencia de un anticuerpo anti-CD3/CD28 (Gibco Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28; fabricado por Thermo Fisher Scientific) (1x105 perlas/ml), hTGF-p1 (fabricado por Peprotech) (5 ng/ml), mIL-2 (fabricado por R&D) (250 U/ml) y sal del compuesto 1 (1 gM) bajo una atmósfera del 5 % de CO<2>a 37 °C durante 3 días. Después de eso, se adquirieron células T CD25 y Foxp3-GFP-positivas como Treg con FACSAria™ II (fabricado por BD).
El modelo de hipersensibilidad por contacto inducida por DNFB se generó mediante el siguiente método. Se afeitaron en el abdomen ratones Balb/c de ocho semanas de edad (fabricados por SLC, hembra) y después se aplicaron a los mismos 25 gl de DNFB (DNFB al 0,5 % (p/v) en acetona/aceite de oliva (4/1), fabricado por Nacalai Tesque, Inc.). El día 5 después de la aplicación de DNFB, las Tregs (2x104 células o 2x105 células) adquiridas anteriormente se infundieron de la vena de la cola. A continuación, se aplicaron 20 gl de DNFB (DNFB al 0, 3% (p/v) en acetona/aceite de oliva (4/1)) a la aurícula para inducir una reacción de hipersensibilidad por contacto. La reacción de hipersensibilidad por contacto se evaluó midiendo un cambio en el grosor auricular usando un medidor de grosor de presión constante (fabricado por Teclock, PG-20).
Como resultado, cuando las Treg inducidas por la sal del compuesto 1 se administraron a 2x105 células, se encontró una hinchazón de la oreja de 220 pm en los ratones el día 2 después de la inducción de la reacción de hipersensibilidad por contacto. Por el contrario, se encontró una hinchazón de la oreja de 285 pm cuando no se añadieron las células. A través de la administración de las Treg inducidas por la sal del compuesto 1 al modelo de hipersensibilidad por contacto inducida por DNFB, se encontró que las Treg inducidasex vivotienen un efecto supresor sobre una respuesta de hipersensibilidad por contacto usando una hinchazón de la oreja como indicador de una manera estadísticamente significativa (P<0,05; prueba de comparaciones múltiples de Dunnett).
(Ejemplo 14) Inducción de células T sin tratamiento previo a T reg por diversos fármacos inhibidores de CDK8/19
En este ejemplo, se confirmó la inducción de células T sin tratamiento previo a T reg por diversos fármacos inhibidores de CDK8/19, y se confirmó una acción inductora de Treg para un compuesto que tiene actividad inhibidora de CDK8 y/o CDK19.
Las células T sin tratamiento previo se generaron mediante el siguiente método. Se recogió el bazo de ratones C57BL6 de 8 a 12 semanas de edad (fabricados por SLC), y de la misma manera que en el ejemplo 13, se rompieron las células de bazo en una malla de nylon y se filtraron para preparar una suspensión celular. Se prepararon células Th sin tratamiento previo a partir de la suspensión celular usando el kit de aislamiento de células T CD4+ sin tratamiento previo, ratón (fabricado por Miltenyi Biotec). Se añadió cóctel de biotina-anticuerpo incluido con el kit a las células de bazo suspendidas en medio esencial mínimo Eagle (MEM, fabricado por SIGMA), seguido de incubación a 4 °C durante 5 minutos. Además, se añadieron microperlas anti-biotina y microperlas de CD44, seguido de incubación a 4 °C durante 10 minutos y después una operación de centrifugación (300xg, 10 minutos). Después de la eliminación del sobrenadante, las células se resuspendieron en MEM y se aplicaron a una columna LS (fabricada por Miltenyi Biotech). Las células contenidas en el líquido de fracción no retenida se usaron en los experimentos posteriores. Las células Th sin tratamiento previo preparadas (2x105 células) se estimularon con un anticuerpo anti-CD3/CD28 (Gibco Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28; fabricado por Thermo Fisher Scientific) en presencia de diversos fármacos inhibidores de CDK8/19 (cantidad de uso: de 1 nM a 10.000 nM) al 5 % de CO<2>a 37 °C. Después de haberse cultivado durante 44 horas, las células se tiñeron usando un anticuerpo anti-CD4 (RM4-5; fabricado por eBioscience), un anticuerpo anti-CD25 (7D4; fabricado por BD), un anticuerpo anti-Foxp3 (FJK-16s; fabricado por eBioscience) y un colorante de viabilidad flexible (fabricado por eBioscience). Las células teñidas se midieron usando Canto II (fabricado por BD) mediante un método de citometría de flujo, y se analizó una proporción de células CD25+Foxp3+ en células viables CD4+ usando FlowJo (fabricado por FlowJo). Además, cuando una proporción de células CD25+Foxp3+ en una muestra a la que se añadió disolvente (DMSO al 0,1 %) se definieron como el 100 %, una concentración de compuesto a la que se obtuvo el 150 % de las células CD25+Foxp3+ se definió como CE<150>, se calculó un valor de CE<150>de cada compuesto y se calculó un promedio geométrico basándose en los datos obtenidos de tres ensayos. Los resultados se muestran en la tabla 2.
La tabla 2 reveló que las Treg se indujeron en las células Th sin tratamiento previo por los diversos fármacos inhibidores de CDK8/19.
Tabla 2
Senexin A: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 13799-13804 (2012)
(R)-2-[5-(3-Cloro-4-hidroxifenil)-piridin-3-ilamino]-2-fenilacetamida: Ejemplo 3 del documento WO 2014/029726 A1
(Ejemplo 15) Inducciónin vitrode Foxp3 por la sal del compuesto 1
En este ejemplo, se confirmó la capacidad de inducir Foxp3 en células T CD8+ para la sal del compuesto 1 producida en el ejemplo 1.
Se recogieron los ganglios linfáticos de ratones KI con proteína de fusión Foxp3-GFP de 6 a 8 semanas de edad (ratones eFox), y el tejido se disgregó usando vidrio molido, y se filtró a través de una malla de nylon para preparar una suspensión de células linfocíticas totales. Se usaron ratones eFox generados según el método descrito en Science. 17 de octubre de 2014; 346(6207): 363-8. doi: 10.1126/science.1259077 como ratones eFox. Las células linfocíticas totales preparadas se tiñeron con un anticuerpo anti-CD8 (53-6.7; fabricado por BD) y se prepararon células T CD8+ usando FACSAria™ II (fabricado por BD).
Como se muestra en los siguientes puntos (i) a (iv), las células T CD8+ preparadas (2x105 células) se estimularon usando 5 gl de un anticuerpo anti-CD3/CD28 (Gibco Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28; fabricado por Thermo Fisher Scientific) en presencia/ausencia de 2 ng/ml de hTGF-p1 (fabricado por R&D) o 10 gg/ml de un anticuerpo anti-TGF-p (fabricado por R&D) y 1 gM de sal del compuesto 1, y se trataron bajo una atmósfera del 5 % de CO<2>a 37 °C durante 72 horas.
(i) Anticuerpo anti-TGF-p (control)
(ii) Anticuerpo anti-TGF-p sal del compuesto 1
(iii) hTGF-p1 (control)
(iv) hTGF-p1 sal del compuesto 1
Las células después del tratamiento se tiñeron con un anticuerpo anti-CD8 (fabricado por BD), y se analizó una proporción de células Foxp3-GFP-positivas mediante un método de citometría de flujo. Los resultados se muestran en las FIGS. 11 (a). Además, en la FIG. 11 (b) se muestra un gráfico para mostrar los resultados del número (%) de esas células Foxp3-GFP-positivas.
Los resultados de las FIGS. 11 (a) y la FIG.11 (b) revelaron que, incluso en una condición tal que TGF-p se bloqueaba mediante la adición del anticuerpo anti-TGF-p, se indujo significativamente Foxp3 en las células T CD8+ mediante la sal del compuesto 1 sola. Los resultados también revelaron que se indujo sinérgicamente Foxp3 en las células T CD8+ usando la sal del compuesto 1 y TGF-p en combinación.
(Ejemplo 16) Inducción de Foxp3 por la sal del compuesto 1 en células T humanas
En este ejemplo, se confirmó la capacidad de inducir Foxp3 en células sin tratamiento previo humanas (CD4+CCR7+CD45RA+) para la sal del compuesto 1 producida en el ejemplo 1.
Se prepararon células T CD4+ sin tratamiento previo humanas (CD4+CCR7+CD45RA+) a partir de células de sangre periférica humana (fabricadas por Lifeline cell technology, fabricadas por Stemcell technologies) usando el kit de aislamiento de células T CD4+ sin tratamiento previo humanas (fabricado por Miltenyi Biotec). Las células T sin tratamiento previo humanas preparadas (2x105 células) se estimularon usando un anticuerpo anti-CD3/CD28 (Gibco Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28; fabricado por Thermo Fisher Scientific) (2x105 perlas) y se trataron en presencia/ausencia de la sal del compuesto 1 (10 nM, 100 nM o 1.000 nM) bajo una atmósfera del 5 % de CO<2>a 37 °C durante 4 días.
Las células después del tratamiento se tiñeron con colorante de viabilidad Fixable (fabricado por eBioscience), un anticuerpo anti-CD4 (RPA-T4: fabricado por eBioscience), un anticuerpo anti-CD25 (BC96: fabricado por eBioscience) y un anticuerpo anti-Foxp3 (236A/E7: fabricado por eBioscience) y se midieron usando Canto II (fabricado por BD) mediante un método de citometría de flujo. Además, una proporción de células Foxp3+CD25+ en células viables CD4+ se analizaron usando FlowJo (fabricado por FlowJo). La proporción (%) de células Foxp3+CD25+ se muestran en la FIG. 12. Los resultados de la FIG. 12 revelaron que la sal del compuesto 1 indujo Foxp3 en las células T CD4+ sin tratamiento previo humanas.
(Ejemplo 17) Inducción de Foxp3 por la sal del compuesto 1 en células T humanas
En este ejemplo, se confirmó la capacidad de inducir Foxp3 en células sin tratamiento previo humanas (CD4+CD25-CD45RA+Foxp3-) para la sal del compuesto 1 producida en el ejemplo 1.
Se tiñeron células mononucleares de sangre periférica humana (fabricadas por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) usando un anticuerpo anti-CD4 (RPA-T4; fabricado por BD), un anticuerpo anti-CD25 (M-A251; fabricado por BD) y un anticuerpo anti-CD45RA (HI100; fabricado por BD) y se prepararon células T CD4+ sin tratamiento previo humanas (CD4+CD25-CD45RA+Foxp3-) usando FACSAria™ II (fabricado por BD). Las células T sin tratamiento previo humanas preparadas (1x105) se estimularon usando un anticuerpo anti-CD3/CD28 (Gibco Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28; fabricado por Thermo Fisher Scientific) (2x105 perlas), y se trataron en presencia/ausencia de hIL-2 (fabricada por Shionogi & Co., Ltd.) (50 U/ml) y sal del compuesto 1 (10 nM o 100 nM) bajo una atmósfera del 5 % de CO<2>a 37 °C durante 4 días.
Las células después del tratamiento se tiñeron con colorante de viabilidad Fixable (fabricado por eBioscience), un anticuerpo anti-CD4 (fabricado por BD) y un anticuerpo anti-Foxp3 (fabricado por eBioscience), y una proporción de células Foxp3-positivas en las células T CD4+ se analizaron mediante un método de citometría de flujo. La proporción (%) de células Foxp3-positivas se muestra en la FIG. 13. Los resultados de la FIG. 13 revelaron que la sal del compuesto 1 indujo Foxp3 en las células T CD4+ sin tratamiento previo humanas.
(Ejemplo 18) Inducción de Foxp3 por la sal del compuesto 1 en células T CD4+ humanas
En este ejemplo, se confirmó la capacidad de inducir Foxp3 en células CD4+ humanas para la sal del compuesto 1 producida en el ejemplo 1.
(1) Inducción de Foxp3 en células T sin tratamiento previo
Se prepararon células T CD4+ sin tratamiento previo humanas (CD4+CD25CD45RA+Foxp3-) a partir de células mononucleares de sangre periférica humana (fabricadas por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) de la misma manera que en el ejemplo 17. Como se muestra en los siguientes puntos (i) a (iv), las células T sin tratamiento previo preparadas (2x105) se estimularon usando 5 pl de un anticuerpo anti-CD3/CD28 (Gibco Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28; fabricado por Thermo Fisher Scientific) en presencia/ausencia de 2 ng/ml de hTGF-p1 (fabricado por R&D) o 10 pg/ml de un anticuerpo anti-TGF-p (fabricado por R&D), hIL-2 (fabricada por Shionogi & Co., Ltd.) (50 U/ml) y 100 nM de sal del compuesto 1, y se trataron bajo una atmósfera del 5 % de CO<2>a 37 °C durante 72 horas.
(i) Anticuerpo anti-TGF-p (control)
(ii) Anticuerpo anti-TGF-p sal del compuesto 1
(iii) hTGF-p1 (control)
(iv) hTGF-p1 sal del compuesto 1
Las células después del tratamiento se tiñeron con un anticuerpo anti-CD4 (fabricado por BD) y un anticuerpo anti-Foxp3 (fabricado por eBioscience), y se analizó una proporción de células Foxp3-positivas mediante un método de citometría de flujo. Los resultados se muestran en las FIGS. 14(a). Además, el número (%) de esas células Foxp3-positivas se muestra en la FIG. 14(b).
Los resultados de las FIGS. 14(a) y la FIG. 14(b) revelaron que, incluso en una condición tal que el TGF-p se bloqueaba mediante la adición del anticuerpo anti-TGF-p, se indujo Foxp3 significativamente en las células T sin tratamiento previo por la sal del compuesto 1 sola (control: 10,8 %, tratamiento con la sal del compuesto 1: 30,7 %). Los resultados también revelaron que se indujo Foxp3 sinérgicamente en las células T sin tratamiento previo usando la sal del compuesto 1 y TGF-p en combinación (TGF-p: 26,9 %, tratamiento con TGF-p compuesto 1: 44,6 %).
(2) Inducción de Foxp3 en células T de memoria efectoras
Se tiñeron células mononucleares de sangre periférica humana (fabricadas por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) usando un anticuerpo anti-CD4 (RPA-T4; fabricado por BD), un anticuerpo anti-CD25 (M-A251; fabricado por BD) y un anticuerpo anti-CD45RA (HI100; fabricado por BD) y se prepararon células T CD4+ de memoria efectoras humanas (CD4+CD25-CD45RA-Foxp3-) usando FACSAria™ II (fabricado por BD). Como se muestra en los siguientes puntos (i) a (iv), las células T de memoria efectoras preparadas (2x105 células) se estimularon usando 5 pl de un anticuerpo anti-CD3/CD28 (Gibco Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28; fabricado por Thermo Fisher Scientific) en presencia/ausencia de 2 ng/ml de hTGF-p1 (fabricado por R&D) o 10 pg/ml de un anticuerpo anti-TGF-p (fabricado por R&D), hIL-2 (fabricada por Shionogi & Co., Ltd.) (50 U/ml) y 100 nM de sal del compuesto 1, y se trataron bajo una atmósfera del 5 % de CO<2>a 37 °C durante 72 horas.
(i) Anticuerpo anti-TGF-p (control)
(ii) Anticuerpo anti-TGF-p sal del compuesto 1
(iii) hTGF-p1 (control)
(iv) hTGF-p1 sal del compuesto 1
Las células después del tratamiento se tiñeron con un anticuerpo anti-CD4 (fabricado por BD) y un anticuerpo anti-Foxp3 (fabricado por eBioscience), y se analizó una proporción de células Foxp3-positivas mediante un método de citometría de flujo. Los resultados se muestran en las FIGS. 15(a). Además, el número (%) de esas células Foxp3-positivas se muestra en la FIG. 15(b).
Los resultados de las FIGS. 15(a) y 15(b) revelaron que incluso, en una condición tal que el TGF-p se bloqueaba mediante la adición del anticuerpo anti-TGF-p, se indujo Foxp3 significativamente en las células T de memoria efectoras mediante la sal del compuesto 1 sola (control: 21,1 %, tratamiento con la sal del compuesto 1: 34,5 %). Los resultados también revelaron que se indujo Foxp3 sinérgicamente en las células T de memoria efectoras mediante el uso de la sal del compuesto 1 y TGF-p en combinación (TGF-p: 28,5 %, tratamiento con TGF-p compuesto 1: 45,2 %).
(Ejemplo 19) Inducción de Foxp3 por la sal del compuesto 1 en células T CD8+ humanas
En este ejemplo, se confirmó la capacidad de inducir Foxp3 en células T CD8+ humanas para la sal del compuesto 1 producida en el ejemplo 1.
(1) Inducción de Foxp3 en células T sin tratamiento previo
Se tiñeron células mononucleares de sangre periférica humana (fabricadas por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) usando un anticuerpo anti-CD8 (53-6.7; fabricado por BD), un anticuerpo anti-CD25 (M-A251; fabricado por BD) y un anticuerpo anti-CD45RA (HI100; fabricado por BD), y se prepararon células T CD8+ sin tratamiento previo humanas (CD8+CD25-CD45RA+Foxp3-) usando FACSAria™ II (fabricado por BD). Como se muestra en los siguientes puntos (i) a (iv), las células T sin tratamiento previo preparadas (1x105 células) se estimularon usando 5 pl de un anticuerpo anti-CD3/CD28 (Gibco Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28; fabricado por Thermo Fisher Scientific) en presencia/ausencia de 2 ng/ml de hTGF-p1 (fabricado por R&D) o 10 pg/ml de un anticuerpo anti-TGF-p (fabricado por R&D), hIL-2 (fabricada por Shionogi & Co., Ltd.) (50 U/ml) y 100 nM de sal del compuesto 1, y se trataron bajo una atmósfera del 5 % de CO<2>a 37 °C durante 72 horas.
(i) Anticuerpo anti-TGF-p (control)
(ii) Anticuerpo anti-TGF-p sal del compuesto 1
(iii) hTGF-p1 (control)
(iv) hTGF-p1 sal del compuesto 1
Las células después del tratamiento se tiñeron con un anticuerpo anti-CD8 (fabricado por BD) y un anticuerpo anti-Foxp3 (fabricado por eBioscience), y se analizó una proporción de células Foxp3-positivas mediante un método de citometría de flujo. La proporción (%) de células Foxp3-positivas se muestra en la FIG. 16.
Los resultados de la FIG. 16 revelaron que, incluso en una condición tal que el TGF-p se bloqueaba mediante la adición del anticuerpo anti-TGF-p, se indujo Foxp3 significativamente en las células T sin tratamiento previo mediante la sal del compuesto 1 sola. Los resultados también revelaron que se indujo Foxp3 sinérgicamente en las células T sin tratamiento previo usando la sal del compuesto 1 y TGF-p en combinación.
(2) Inducción de Foxp3 en células T de memoria efectoras
Se tiñeron células mononucleares de sangre periférica humana (fabricadas por Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) usando un anticuerpo anti-CD8 (53-6.7; fabricado por BD), un anticuerpo anti-CD25 (M-A251; fabricado por BD) y un anticuerpo anti-CD45RA (HI100; fabricado por BD), y se prepararon células T CD8+ de memoria efectoras humanas (CD8+CD25-CD45RA-Foxp3-) usando FACSAria™ II (fabricado por BD). Como se muestra en los siguientes puntos (i) a (iv), las células T de memoria efectoras preparadas (1x105 células) se estimularon usando 5 pl de un anticuerpo anti-CD3/CD28 (Gibco Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28; fabricado por Thermo Fisher Scientific) en presencia/ausencia de 2 ng/ml de hTGF-p1 (fabricado por R&D) o 10 pg/ml de un anticuerpo anti-TGF-p (fabricado por R&D), hIL-2 (fabricado por Shionogi & Co., Ltd.) (50 U/ml) y 100 nM de sal del compuesto 1, y se trataron bajo una atmósfera del 5 % de CO<2>a 37 °C durante 72 horas.
(i) Anticuerpo anti-TGF-p (control)
(ii) Anticuerpo anti-TGF-p sal del compuesto 1
(iii) hTGF-p1 (control)
(iv) hTGF-p1 sal del compuesto 1
Las células después del tratamiento se tiñeron con un anticuerpo anti-CD8 (fabricado por BD) y un anticuerpo anti-Foxp3 (fabricado por eBioscience), y se analizó una proporción de células Foxp3-positivas mediante un método de citometría de flujo. La proporción (%) de esas células Foxp3-positivas se muestra en la FIG. 17.
Los resultados de la FIG. 17 revelaron que, incluso en una condición tal que el TGF-p se bloqueaba mediante la adición del anticuerpo anti-TGF-p, se indujo Foxp3 significativamente en las células T de memoria efectoras mediante la sal del compuesto 1 sola. Los resultados también revelaron que se indujo Foxp3 sinérgicamente en las células T de memoria efectoras mediante el uso de la sal del compuesto 1 y TGF-p en combinación.

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    I. Un compuesto seleccionado de 4-[1-(2-metil-1H-bencimidazol-5-il)-1H-imidazo[4,5-c]piridin-2-il]-1,2,5-oxadiazol-3-amina y 3-{1-[1-(4-metoxifenil)piperidin-4-il]-4-metil-1H-imidazo[4,5-c]piridin-2-il}pirazin-2-amina, o una sal, un hidrato 0 un solvato del mismo.
  2. 2. Una composición farmacéutica, que comprende como principio activo un compuesto seleccionado de 4-[1 -(2-metil-1 H-bencimidazol-5-il)-1 H-imidazo[4,5-c]piridin-2-il]-1,2,5-oxadiazol-3-amina y 3-{1 -[1 -(4-metoxifenil)piperidin-4-il]-4-metil-1H-imidazo[4,S-c]piridin-2-il}pirazin-2-amina, o una sal, un hidrato o un solvato de los mismos.
  3. 3. Un inductor de Foxp3 para producir células T reguladoras a partir de células T, que comprende como principio activo un compuesto según la reivindicación 1, o una sal, un hidrato o un solvato del mismo.
  4. 4. El inductor de Foxp3 según la reivindicación 3, en donde las células T comprenden células T CD4+Foxp3-.
  5. 5. El inductor de Foxp3 según la reivindicación 3, en donde las células T comprenden células T CD4+CD25-Foxp3-.
  6. 6. El inductor de Foxp3 según la reivindicación 3, en donde las células T comprenden células T CD8+Foxp3-.
  7. 7. Un método de producción de células T reguladorasin vitro,que comprende tratar células T con un compuesto según la reivindicación 1, o una sal, un hidrato o un solvato del mismo.
  8. 8. Un método de producción de células T reguladorasin vitro,que comprende someter las células T a estimulación del receptor de células T (TCR) en presencia de un compuesto según la reivindicación 1, o una sal, un hidrato o un solvato del mismo.
  9. 9. El método de producción de células T reguladoras según la reivindicación 8, en donde la estimulación de TCR se realiza en presencia de TGF-p, rapamicina o ácido retinoico.
  10. 10. El método de producción de células T reguladoras según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde las células T comprenden células T CD4+Foxp3-.
  11. I I . El método de producción de células T reguladoras según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde las células T comprenden células T CD4+CD25-Foxp3-.
  12. 12. El método de producción de células T reguladoras según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde las células T comprenden células T CD8+Foxp3-.
  13. 13. El compuesto de la reivindicación 1 o una sal, hidrato o solvato del mismo para su uso como medicamento.
  14. 14. El compuesto de la reivindicación 1 o una sal, hidrato o solvato del mismo para su uso en el tratamiento de cánceres, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inflamatorias o enfermedades alérgicas.
ES18744360T 2017-01-30 2018-01-30 Novel compound, and method for producing regulatory t cells Active ES3004107T3 (en)

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